WO2020196890A1 - ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法 - Google Patents

ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法 Download PDF

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WO2020196890A1
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oligonucleotide
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泰介 市丸
高橋　大輔
邦博 平井
山下　健
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味の素株式会社
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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
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    • C12P19/28—N-glycosides
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    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
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    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
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    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
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    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an oligonucleotide having a phosphorothioation site, and is useful in the field of nucleic acid synthesis.
  • Nucleic acid drugs such as antisense, siRNA (small interfering RNA), and aptamer are attracting attention as next-generation drugs following antibody drugs.
  • Nucleic acid drugs are expected to have high specificity and efficacy like antibody drugs, but can be produced by chemical synthesis like conventional drugs composed of low molecular weight compounds.
  • modified nucleic acids in which the phosphorus atom at the binding site between nucleic acids is modified have been studied.
  • Nucleic acid drugs of the type having a phosphorothioateization site (phosphorothioate nucleic acid-to-nucleic acid binding site) in which a phosphorus atom is S-modified are typical examples thereof, for example, Fomivirsen, Mipomersen, Oblimersen. , Alicaforsen and the like.
  • Solid-phase synthesis (solid-phase method) and liquid-phase method are used as methods for producing oligonucleotides having a phosphorothioated site, and a pseudo-solid-phase protecting group is used to eliminate the drawbacks of the solid-phase method and the liquid-phase method.
  • a liquid phase method has also been developed (Patent Documents 1 to 9).
  • the phosphoramidite method and the H-phosphonate method are currently widely used, and the dihalophosphine method and the oxazaphosphoridine method are also known.
  • the phosphoramidite method, dihalophosphine method and oxazaphosphoridine method synthesize a phosphite form
  • the H-phosphonate method synthesizes a phosphite diester form, each of which is further subjected to a sulfide reaction to form a phosphorothioate, which is a target substance. It is practiced to obtain an oligonucleotide having a conversion site.
  • This "PO impurity" is an impurity that is originally a phosphorothioated site and is oxidized to a phosphotriester or phosphodiester.
  • An object of the present invention is to solve this newly discovered problem and to provide a method capable of producing an oligonucleotide having a desired phosphorothioation site in a higher yield.
  • the present inventors synthesize a phosphite form using a method for forming a phosphite form (for example, a phosphoramidite method, a dihalophosphine method and an oxazaphosphoridine method), or a phosphite diester.
  • a method for forming a phosphite form for example, a phosphoramidite method, a dihalophosphine method and an oxazaphosphoridine method
  • a phosphite diester for example, a phosphoramidite method, a dihalophosphine method and an oxazaphosphoridine method
  • Nucleotides (hereinafter sometimes referred to as "nucleic acid A") and 3'-hydroxyl groups or 3'-amino groups are modified by methods for the formation of phosphite or phosphite diesters, and others.
  • Nucleotides, nucleotides or oligonucleotides (hereinafter sometimes referred to as "nucleic acid B"), which may be protected by a protecting group used in nucleic acid synthesis, are condensed in the presence of an antioxidant to form a phos.
  • a method for producing an oligonucleotide having a phosphorothioated site which comprises a step (step (1)) of obtaining a phyto form or a phosphite diester form.
  • nucleic acid B the 3'-hydroxyl group or the 3'-amino group is modified by a method selected from the phosphoramidite method, the H-phosphonate method, the dihalophosphine method and the oxazaphosphoridine method.
  • step (2) The phosphorothioate according to the above [1] or [2], further comprising a step (step (2)) of reacting the phosphite or phodiester obtained in the step (1) with a sulfide agent.
  • Nucleotide in which the 5'-position hydroxyl group is not protected and other groups may be protected by a protective group used for nucleic acid synthesis, or may be bound to a solid phase carrier.
  • Nucleotides or oligonucleotides hereinafter sometimes referred to as "nucleic acid A"
  • 3'-hydroxyl groups or 3'-amino groups are phosphoromidite method, H-phosphonate method, dihalophosphine method and oxazaphosphoridine method.
  • Nucleotides, nucleotides or oligonucleotides (hereinafter, may be referred to as "nucleic acid B") which are modified by a method selected from the above and whose other groups may be protected by a protective group used for nucleic acid synthesis. , The step of condensing in the presence of an antioxidant to obtain a phosphite or nucleoic acid diester, and (2) the step of reacting the obtained phosphite or nucleod diester with a sulfide agent.
  • a method for producing an oligonucleotide having a phosphorothioation site which comprises.
  • R represents an aryl group or a lower alkyl group which may be the same or different and may be independently substituted, and two Rs are bonded to each other and they are used. May form a ring with other adjacent atoms;
  • the antioxidant may be a dimer in which the R portions of the same or different antioxidants are bonded.
  • Phosphorus antioxidants selected from, (8) RSR, and (9)
  • R may be the same or different, and independently represents a lower alkyl group or an aryl group which may be substituted;
  • the antioxidant may be a dimer in which the R portions of the same or different antioxidants are bonded.
  • Sulfur-based antioxidants selected from, and (10) (OR) 2 P (S) -SMSP (S) (OR) 2 In the formula, R represents the same or different, independently lower alkyl group or optionally substituted aryl group, and M represents Zn, Ni or Cu;
  • the antioxidant may be a dimer in which the R portions of the same or different antioxidants are bonded.
  • R may be the same or different and independently represents a lower alkyl group or an aryl group which may be substituted;
  • the antioxidant may be a dimer in which the R portions of the same or different antioxidants are bonded.
  • Antioxidants are triphenylphosphine, methyldiphenylphosphine, triethyl phosphine, ethoxydiphenylphosphine, diethoxyphenylphosphine, 9,10-dihydro-9-oxa-10-phosphaphenanthrene 10-oxide (phosphorus).
  • the method for producing an oligonucleotide having a phosphorothioation site according to any one of the above [1] to [4], which is selected from isobutylene sulfide (sulfur-based antioxidant).
  • Nucleic acid A is a nucleoside, nucleotide or oligonucleotide in which the 5'-hydroxyl group is not protected and other groups may be protected by protecting groups used in nucleic acid synthesis, as described above [1].
  • Nucleic acid A has an unprotected 5'-hydroxyl group, an amino group and an imino group of a nucleic acid base, a 2'-hydroxyl group of a ribose residue, a 3'-hydroxyl group and a 3'-amino group, and deoxyribose. At least one group selected from the 3'-hydroxyl group and the 3'-amino group of the residue is a protecting group that is not removed under acidic conditions and can be removed under basic conditions (hereinafter, "pseudo-solid-phase protecting group").
  • nucleosides, nucleotides or oligonucleotides (hereinafter sometimes referred to as “nucleic acid a") which are protected by (sometimes referred to as) and other groups may be further protected by protecting groups used in nucleic acid synthesis) (hereinafter, may be referred to as “nucleic acid a").
  • nucleic acid a the 3'position of the ribose residue and the deoxyribose residue is a hydroxyl group), or the 5'-hydroxyl group is not protected and one OH of the phosphate group at the 3'-terminal is -OLn1-OH.
  • Ln1 indicates an organic group.
  • the hydroxyl group of -OLn1-OH is not removed under acidic conditions, is protected by a protecting group that can be removed under basic conditions, and other groups.
  • Is a nucleoside, nucleotide or oligonucleotide hereinafter, may be referred to as “nucleic acid ⁇ ”) which may be further protected by a protecting group used for nucleic acid synthesis, and nucleic acid B is a hydroxyl group at the 3'position or 3'.
  • a method in which the amino group at the'position is selected from a method for forming a phosphite form or a phosphite diester form (preferably a phosphoroamide method, an H-phosphonate method, a dihalophosphine method and an oxazaphosphoridine method). ), And the 5'-hydroxyl group is protected by a temporary protecting group that can be removed under acidic conditions, and other groups are not further removed under acidic conditions and can be removed under basic conditions.
  • nucleic acid b Nucleic acid, nucleotides or oligonucleotides (hereinafter, “nucleic acid b") which may be protected by a protecting group (hereinafter, may be referred to as “pseudo-solid phase protecting group”) and a protecting group selected from the protecting groups used in nucleic acid synthesis.
  • a protecting group hereinafter, may be referred to as “pseudo-solid phase protecting group”
  • the method for producing an oligonucleotide having a phosphorothioation site according to any one of the above [1] to [11].
  • Nucleic acid B is a method for forming a phosphite form or a phosphite diester form having a hydroxyl group at the 3'position (preferably, a phosphoramidite method, an H-phosphonate method, a dihalophosphine method and an oxazaphosphoridine).
  • a phosphoramidite method preferably, an H-phosphonate method, a dihalophosphine method and an oxazaphosphoridine.
  • the above [1] to [12] wherein the nucleoside, nucleotide or oligonucleotide is modified by a method selected from the method) and the other group may be protected by a protective group used for nucleic acid synthesis.
  • the method for producing an oligonucleotide having the phosphorothioateization site according to any one.
  • the sulfurizing agent used in step (2) is 5-[(N, N-dimethylaminomethylidene) amino] -3H-1,2,4-dithiazole-3-thione (DDTT), 3H-. 1,2-benzodithiol-3-one-1,1-dioxide (Beaucage reagent), 3H-1,2-benzodithiol-3-one, phenylacetyldisulfide (PADS), tetraethylthiuram disulfide (TETD), dipenta Methylenethiuram tetrasulfide, 5-phenyl-3H-1,2,4-dithiazole-3-one (POS), 3-amino-1,2,4-dithiazol-5-thione (ADTT, xanthanhydride), N- [(2-Cyanoethyl) thio]
  • PADS phenylacetyldisulfide
  • TETD tetraethylthiuram disul
  • the above [1] to [14] further include a step of isolating the oligonucleotide having an unprotected phosphorothioate site after removing all the protecting groups of the obtained oligonucleotide having the phosphorothioate site.
  • the method for producing an oligonucleotide having a phosphorothioation site according to any one of.
  • nucleic acid A-1 preferably the 3'position in nucleic acid A-1 is a hydroxyl group
  • nucleic acid A-1 preferably the 3'position in nucleic acid A-1 is a hydroxyl group
  • 5'position hydroxyl group are phosphite or phosphite diesters. It has been modified by a method for formation (preferably a method selected from phosphoramidite method, H-phosphonate method, dihalophosphin method and oxazaphosphoridine method), and other groups are used for nucleic acid synthesis.
  • (1-1)) A method for producing an oligonucleotide having a phosphorothioation site containing.
  • the step (step (2-1)) of reacting the phosphite form or the phosphorous acid diester form obtained in the step (1-1) with the sulfide agent is included.
  • the method for producing an oligonucleotide having the phosphorothioation site according to the above [16].
  • a phosphite form or a subphosphate form is used by a method widely used in the art for forming a phosphite form or a phosphite diester form, such as a phosphoroamide method or an H-phosphonate method.
  • a specific antioxidant can suppress the by-product of the phosphodiester or phosphodiester (“PO impurity”), and the subsequent sulfide reaction can be carried out. It can be done more efficiently.
  • This "PO impurity” is an impurity that is originally a phosphorothioated site and is oxidized and converted into a phosphodiester.
  • the present invention in all the condensation steps or the necessary condensation steps in the nucleic acid chain extension in oligonucleotide synthesis, it is possible to produce an oligonucleotide having the desired phosphorothioation site in a higher yield. it can.
  • the cycle of nucleic acid extension is appropriately repeated, so that even if a trace amount of impurity by-product of 1% or less is produced in the reaction step for each base extension, the desired oligonucleotide When it becomes an elongated body, a large amount of impurities are produced.
  • the production method of the present invention is a method for producing an oligonucleotide having a phosphorothioation site including the following step (1) and further including step (2).
  • Nucleotides, nucleotides or oligonucleotides (nucleic acids) whose 5'-hydroxyl group may not be protected and other groups may be protected by a protective group used in nucleic acid synthesis or may be attached to a solid phase carrier.
  • A) and methods for the formation of phosphite or phosphite diesters with a 3'-hydroxyl or 3'-amino group eg, phosphoromidite, H-phosphonate, dihalophosphine, and oxa).
  • Nucleotides, nucleotides or oligonucleotides (nucleic acid B) that have been modified by the phosphoridine method) and other groups may be protected by protective groups used in nucleic acid synthesis.
  • protective groups used in nucleic acid synthesis To obtain a phosphite form or a phosphite diester form by condensing in the presence of
  • step (1) and further step (2) of the present invention in the extension step in which a phosphorothioated site is desired to be introduced, all of them are performed. , Or the required internucleic acid binding site, can be phosphorothioated in high yield.
  • the method for producing the oligonucleotide of the present invention and the method for producing an oligonucleotide in which the inter-nucleic acid binding site usually used in the field of nucleic acid synthesis is a phosphodiester bond or a phosphodiester bond (hereinafter, "a method for producing an ordinary oligonucleotide”).
  • a method for producing an ordinary oligonucleotide By appropriately repeating the cycle of nucleic acid elongation according to the oligonucleotide having the target phosphorothioation site, the oligonucleotide having the phosphorothioation site is extended and the target is obtained. Oligonucleotides having a phospholothioatetization site can be produced. Such embodiments are also included in the scope of the present invention.
  • steps (1) and (2) can be carried out under either solid phase or liquid phase reaction conditions, but are more preferably carried out under liquid phase conditions.
  • Modifications for the formation of a phosphite or phosphite diester of the 3'-hydroxyl group or 3'-amino group of nucleic acid B in step (1) include, for example, phosphoramidite method, H-phosphonate method, dihalo. It can be carried out by a method known in the art selected from the phosphine method, the oxazaphosphodiester method and the like. These methods are widely known to those skilled in the art, and those skilled in the art also easily understand the phosphite form or the phosphodiester form formed in the process of the condensation reaction.
  • the phosphoramidite method, the H-phosphonate method, the dihalophosphine method, and the oxazaphosphoridine method are used by using the nucleic acid B having an amino group at the 3'position instead of the nucleic acid B having a hydroxyl group at the 3'position.
  • a condensate is obtained by applying a method such as, the bond between the 3'position and the phosphorus atom becomes an -NP bond instead of the -OP bond, but in this case as well,-
  • it will be referred to as a "phosphite form” or a "phosphorous acid diester form" as in the case of an OP bond.
  • nucleic acid B the hydroxyl group at the 3'position is modified by a method for forming a phosphite form or a phodiester form, and other groups are protected by a protecting group used for nucleic acid synthesis. It is also preferably a nucleoside, nucleotide or oligonucleotide.
  • dihalophosphine method Modifications using a dihalophosphine derivative can be carried out by referring to, for example, the Chemical Society of Japan, 4th Edition, Experimental Chemistry Course 22, Metal Complex / Transition Metal Cluster, 1999, pp. 426-431. it can.
  • nucleic acid B modified by is condensed with nucleic acid A in the presence of an antioxidant to lead to the corresponding phosphite or phosphite diester.
  • Many improved methods for forming the above-mentioned phosphite form or phosphite diester form are also known in the art (see, for example, International Publication No.
  • nucleic acid B modified by the method for forming a phosphite form or a phosphite diester form is commercially available, the commercially available product can also be used in the practice of the present invention.
  • the antioxidant used is to prevent the by-product of the phosphodiester or phosphodiester (“PO impurity”) due to the oxidation of the phosphorus atom of the produced phosphite or phosphite diester.
  • nucleic acid B phospholoamideite, H-phosphonate, etc.
  • the subsequent reaction is not adversely affected and the by-product of impurities is not induced. It is preferable to select one.
  • preferable antioxidants include, for example, phosphorus-based antioxidants, sulfur-based antioxidants, and phosphorus-sulfur-based antioxidants. Specific examples include antioxidants represented by the following formulas.
  • Examples of the phosphorus-based antioxidant include the following. (1) P- (R) 3 (sometimes referred to as “phosphines”) (2) P- (OR) 3 (sometimes referred to as “phosphite esters (phosphites)”) (3) P (R) 2 (OR) (sometimes referred to as “subphosphinic acid ester”) (4) PR (OR) 2 (sometimes referred to as “phosphorous acid esters”) (5) PH (O) (R) 2 (sometimes referred to as “phosphine oxides”) (6) PH (O) (OR) 2 (sometimes referred to as “phosphonate esters”) (7) PH (O) R (OR) (sometimes referred to as "phosphinic acid esters”) (In the above formulas (1) to (7), R represents an aryl group or a lower alkyl group which may be the same or different and may be substituted independently, and two Rs are bonded to each other and they are bonded to each other. It may form a ring with other adjacent atoms;
  • examples of the "aryl group” include “C 6-14 aryl groups", and examples thereof include phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, 1-anthryl, 2-anthryl, and 9-antryl. ..
  • the "aryl group” may be substituted with 1 to 3 substituents selected from lower alkyl groups, lower alkoxy groups and lower cycloalkyl groups (eg, toluoil, methoxyphenyl).
  • examples of the "lower alkyl” include “C 1-6 alkyl groups", for example, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, and the like. Examples thereof include neopentyl, 1-ethylpropyl, hexyl, isohexyl, 1,1-dimethylbutyl, 2,2-dimethylbutyl, 3,3-dimethylbutyl and 2-ethylbutyl.
  • examples of the "lower alkoxy group” include “C 1-6 alkoxy group”, for example, methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy, sec-butoxy, tert-butoxy, pentyloxy. , Hexyloxy.
  • examples of the "lower cycloalkyl group” include “C 3-10 cycloalkyl group”, for example, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, bicyclo [2.2. 1] Heptyl, bicyclo [2.2.2] octyl, bicyclo [3.2.1] octyl, adamantyl. The same applies to the following other antioxidants.
  • Examples of the sulfur-based antioxidant include the following. (8) RSR (9)
  • R may be the same or different, and independently represents a lower alkyl group or an aryl group which may be substituted;
  • the antioxidant may be a dimer in which the R portions of the same or different antioxidants are bonded.
  • Examples of the phosphorus / sulfur-based antioxidant include the following. (10) (OR) 2 P (S) -SMSP (S) (OR) 2 (In the formula, R represents the same or different, independently lower alkyl group or optionally substituted aryl group, and M represents Zn, Ni or Cu; Here, the antioxidant may be a dimer in which the R portions of the same or different antioxidants are bonded. )
  • Examples thereof include sulfur-based antioxidants represented by.
  • phosphines represented by the formula: P- (R) 3 for example, triphenylphosphine and methyldiphenylphosphine are preferable. Of these, triphenylphosphine is more preferable.
  • phosphite ester (or phosphite) represented by the formula: P- (OR) 3 for example, triethyl phosphate (P (OEt) 3 ) is preferable.
  • subphosphine acid esters represented by the formula: P (R) 2 (OR) for example, ethoxydiphenylphosphine is preferable.
  • phosphorous acid esters represented by the formula: PR (OR) 2 for example, diethoxyphenylphosphine is preferable.
  • Examples of phosphinic acid esters represented by PH (O) R (OR) include, for example.
  • Isobutylene sulfide represented by is preferable.
  • the amount of the antioxidant used is preferably as small as possible in consideration of the influence on the subsequent reaction, but is usually preferably 0.1 to 2 mol, more preferably 0, with respect to 1 mol of the nucleic acid A used in the condensation reaction. It is 2 to 1 mol.
  • the solvent used when this step is carried out under liquid phase conditions is not particularly limited as long as it is a solvent in which nucleic acid A, nucleic acid B, antioxidant and the like are dissolved and does not adversely affect the reaction, but for example, chloride.
  • examples thereof include methylene, acetonitrile, chloroform, tetrahydrofuran, acetone, ethyl acetate, CPME, toluene, cyclohexane, and a mixed solvent thereof.
  • chloroform, tetrahydrofuran, toluene, methylene chloride, acetonitrile, and a mixed solvent thereof are preferable.
  • the concentrations of nucleic acid A and nucleic acid B used in this step in the solution are not particularly limited as long as they are dissolved in a solvent.
  • the amount of nucleic acid B used is preferably 1 to 3 mol, more preferably 1.2 to 2.5 mol, based on 1 mol of nucleic acid A used.
  • the condensation reaction in this step can be carried out by adding an activator.
  • an activator of the phosphoramidite method for example, a tetrazole derivative (for example, 5-ethylthio-1H-tetrazole (ETT), 5-benzylthio-1H-tetrazole, etc.) and an imidazole derivative (eg, 5-ethylthio-1H-tetrazole, etc.), which are widely used in the art, are used.
  • ETT 5-ethylthio-1H-tetrazole
  • an imidazole derivative eg, 5-ethylthio-1H-tetrazole, etc.
  • It is preferably a tetrazole derivative, and more preferably 5-ethylthio-1H-tetrazole.
  • Examples of the activator of the H-phosphonate method include only a condensing agent, a combination of a condensing agent and a condensing additive, pivaloyl chloride and the like.
  • HATU O- (7-azabenzotriazole-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate
  • HCTU O- (1H-6-chlorobenzo)
  • Pybop hexafluorophosphoric acid (benzotriazole-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium
  • BopCl bis (2-yl) Oxo-3-oxazolidinyl) phosphinic acid chloride
  • TBTU O- (benzotriazole-1-yl) -N, N, N', N'-te
  • Examples of the combination with the condensing agent and the condensing additive include DIC (diisopropylcarbodiimide), EDC / HCl (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, WSC / HCl), DCC (dicyclohexylcarbodiimide) and the like.
  • HOAt (1-hydroxy-7-azabenzotriazole), HOCt (1-hydroxy-1H-1,2,3-triazole-5-carboxylic acid ethyl ester), HOBt (1-hydroxybenzotriazole) , HOOBt (3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazole), DMAP (N, N-dimethyl-4-aminopyridine) and other condensing additives. Be done.
  • the reaction temperature of the condensation reaction in this step is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but is preferably ⁇ 10 ° C. to 60 ° C., more preferably 5 ° C. to 35 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of oligonucleotide used, the type of antioxidant and the type of solvent, the reaction temperature, etc., but is, for example, 5 minutes to 24 hours.
  • This step can be performed, for example, by adding nucleic acid B and an antioxidant to a solution in which nucleic acid A is dissolved, and then adding an activator.
  • This is one embodiment, and the present invention is the present invention. It is not limited to this aspect.
  • a step of quenching the nucleic acid B activated by the phosphoramidite method or the like is further included before the step (2). it can.
  • quenching agent those known in the art can be used as the quenching agent in this step. Only one type of quenching agent may be used, or two or more types may be used in combination.
  • the quenching agent include alcohols (eg, methanol, 2-propanol, t-butanol, 2,2,2-trifluoroethanol (TFE), tetrahydrofurfuryl alcohol, furfuryl alcohol, 2,3-O. -Isopropanol-D-ribofuranose, 3'-O-triisopropylsilyl-thymidine and other halogenated monohydric alcohols, ethylene glycol, diethylene glycol and other halogenated polyhydric alcohols, etc. ), Phenols (eg, 4-nitrophenol, pentafluorophenol, etc.) and amines (eg, morpholin, etc.).
  • alcohols eg, methanol, 2-propanol, t-butanol, 2,2,2-tri
  • the quenching agent is preferably at least one selected from alcohols and amines, more preferably methanol, 2-propanol, t-butanol, 2,2,2-trifluoroethanol, tetrahydrofurfuryl alcohol, and At least one selected from morpholine. Of these, 2,2,2-trifluoroethanol is preferable.
  • the amount of the quenching agent used in this step is preferably 1 to 20 mol, more preferably 1 to 15 mol, still more preferably 1 to 10 mol, based on 1 mol of the amount of nucleic acid B used in the step (1). ..
  • the temperature of the reaction solution after the addition of the quenching agent is not particularly limited as long as the nucleic acid B can be quenched, but is preferably 5 ° C to 40 ° C, more preferably 15 ° C to 30 ° C.
  • the sulfurizing agent used in this step is not particularly limited as long as it has the ability to convert a phosphite bond or a phosphite diester bond into a phosphorothioate bond, but is not limited to 5-[(N, N-dimethylaminomethi).
  • Such a sulfurizing agent can be used by diluting it with an appropriate solvent so as to have a concentration of 0.05 to 2M.
  • the diluting solvent is not particularly limited as long as it is a solvent inert to the reaction, and examples thereof include dichloromethane, acetonitrile, pyridine, and any mixed solvent thereof.
  • the amount of the sulfurizing agent used is, for example, 1 to 50 mol, preferably 1 to 5 mol, with respect to 1 mol of the amount of nucleic acid A used in the step (1).
  • the reaction temperature is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 0 ° C to 60 ° C, more preferably 10 ° C to 40 ° C.
  • the reaction time varies depending on the type of phosphite or phosphorous acid diester, the type of sulfurizing agent used, the reaction temperature, etc., but is, for example, 1 minute to 3 hours.
  • the sulfurization reaction with the nucleoside in step (2) may be carried out for each condensation reaction in the presence of the antioxidant in step (1), or in several steps (1) of the antioxidant.
  • the condensation reaction in the presence of the nucleoside, nucleotide, or oligonucleotide may be carried out collectively after the elongation.
  • a person skilled in the art can carry out the present invention by appropriately selecting it according to the reaction conditions such as the method for forming the phosphite form or the phosphorous acid diester form to be used.
  • steps (1) and / or step (2) can be carried out regardless of the presence or absence of a protecting group for the hydroxyl group at the 5'position of nucleic acid B.
  • separation described later after step (1) The step can be carried out, or it is also possible to carry out the step (2) following the step (1), and further the separation step described later.
  • the deprotection of the protecting group is an arbitrary step and can be appropriately carried out according to the synthesis plan.
  • the steps (1) and (2) of the present invention have been described in detail above.
  • the drawbacks of the conventional method can be improved, and the desired phosphorothioation site can be introduced into the nucleic acid-to-nucleic acid binding of the oligonucleotide more efficiently.
  • the present invention is excellent as a method for producing an oligonucleotide having a phosphorothioation site.
  • each step the product can be isolated for each step and then the next step can be carried out, or each step can be carried out continuously as appropriate.
  • step (2) the protecting group of the 5'-hydroxyl group of the oligonucleotide having the phosphorothioated site obtained in step (2) is removed by an acid, and the oligonucleotide having the phosphorothioated site in which the 5'-hydroxyl group is not protected is obtained. It is a process to obtain.
  • This step can be performed by methods commonly practiced in the art (see, eg, International Publication No. 2012/157723, International Publication No. 2013/12223, International Publication No. 2017/104836).
  • a base may be added to the reaction solution to neutralize the acid used.
  • the acid used in the deprotection step can be removed from the reaction system by performing [solid-liquid separation or extraction] and washing described later, if necessary. Therefore, the neutralization step is not essential. This step can be performed by methods commonly practiced in the art (see, eg, International Publication No. 2012/157723, International Publication No. 2013/12223, International Publication No. 2017/104836).
  • Solid-liquid separation or extraction process In this step, the protecting group (protecting group) obtained above in which any group of the oligonucleotide having an unprotected phosphorothioated site at the 5'position is not removed under acidic conditions and can be removed under basic conditions.
  • a polar solvent is added to the reaction solution containing the oligonucleotide to precipitate and purify the oligonucleotide (solid-liquid separation), or the reaction solution contains a polar solvent. Is added, the layers are separated between the polar solvent and the non-polar solvent, and the oligonucleotide is transferred to the non-polar solvent layer for purification (extraction).
  • This step can be performed, for example, by the methods detailed in International Publication No. 2012/157723, International Publication No. 2013/12223, and International Publication No. 2017/104836.
  • the oligonucleotide having the phosphorothioation site obtained in step (2) finally has the desired nucleic acid sequence, it can be subsequently subjected to "deprotection step” and "isolation step". it can. That is, it can further include a step of removing all protecting groups of the oligonucleotide having a phosphorothioation site obtained in step (2) and then isolating the oligonucleotide having an unprotected phosphorothioation site. This step can be performed, for example, by the methods detailed in International Publication No. 2012/157723, International Publication No. 2013/12223, and International Publication No. 2017/104836.
  • the same method as the general liquid-phase organic synthesis reaction can be applied to confirm the progress of the reaction in each of the above steps. That is, the reaction can be traced using thin layer silica gel chromatography, high performance liquid chromatography, or the like.
  • a feature of the present invention is that a condensation reaction is carried out between nucleic acid A and nucleic acid B, which are appropriately protected, in the presence of a specific antioxidant in the introduction of a phosphorothioation site, as long as this feature can be utilized.
  • the production method of the present invention can be widely applied to appropriately protected nucleosides, nucleotides or oligonucleotides (which may have a phosphorothioation site) regardless of the structure of nucleic acid.
  • the oligonucleotide produced in the present invention includes not only oligonucleotides (All PS form) in which all phosphorus atoms are S-modified phosphorothioated sites, but also phosphorothioated sites in which only a specific partial phosphorus atom is S-modified.
  • the remaining phosphorus atom also contains an oligonucleotide (mixed backbone Oligonucleotide (generally sometimes referred to as "MBO”)) which is an unsylated phosphate.
  • MBO mixed backbone Oligonucleotide
  • nucleic acid A and nucleic acid B to which the production method of the present invention is applied will be described in detail.
  • Nucleic acid A may have an unprotected 5'hydroxyl group and other groups protected by protecting groups used in nucleic acid synthesis, or may be attached to a solid phase carrier, a nucleoside, nucleotide or It is an oligonucleotide and Nucleic acid B is a method for the formation of a phosphite or phosphite diester with a 3'hydroxyl or 3'amino group (eg, phosphoramidite method, H-phosphonate method, dihalophosphine method, and oxa.
  • a nucleoside, nucleotide or oligonucleotide that has been modified by a method selected from the phosphoridine method) and other groups may be protected by protecting groups used in nucleic acid synthesis.
  • the nucleic acid B is a protecting group in which the hydroxyl group at the 3'position is modified by a method for forming a phosphite form or a phodiester form, and the other group is used for nucleic acid synthesis.
  • nucleoside which is a constituent unit of an oligonucleotide means that a nucleobase is bonded to a sugar (for example, 2-deoxyribose, ribose, a 2-position carbon atom and a 4-position carbon atom are bonded by a divalent organic group. It means a compound bound to the 1-position of 2-deoxyribose or ribose by N-glycosidation.
  • sucrose also includes amino sugars in which a hydroxyl group is replaced with an amino group, ribose in which a hydroxyl group at a 2-position is replaced with a halogen atom, and ribose (LNA; BNA) having an intramolecular cross-linking structure.
  • LNA ribose
  • Examples of 2-deoxyribose or ribose in which a 2-position carbon atom and a 4-position carbon atom are bonded by a divalent organic group include the following compounds.
  • R indicates a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted hydrocarbon group, a substituted or unsubstituted hydroxyl group, or a substituted or unsubstituted amino group
  • R' is a hydrogen atom or a hydroxyl group. Shown.
  • amino sugars examples include 2-deoxyribose in which the 3-position hydroxyl group is replaced with an amino group and ribose in which the 3-position hydroxyl group is replaced with an amino group, and ribose in which the 3-position hydroxyl group is replaced with an amino group and the 2-position hydroxyl group is an amino group.
  • Ribose replaced with halogen can be mentioned (in the following formula, Xs represents a halogen atom).
  • the "phosphate group” is not only -OP (O) (OH) 2, but also a group in which an oxygen atom is replaced with a sulfur atom or NH (for example, -OP (S) (OH). ) 2 , -NH-P (O) (OH) 2 , -NH-P (S) (OH) 2 ) are also included.
  • a group in which the hydroxyl group (-OH) in the phosphate group is replaced with -ORp in the formula, Rp indicates an organic group such as a protecting group of the phosphate group) (for example, a protected phosphate group) is also present.
  • Rp indicates an organic group such as a protecting group of the phosphate group
  • nucleotide means a compound in which a phosphate group is attached to a nucleoside.
  • examples of the nucleotide in which the 3'position hydroxyl group or the 5'position hydroxyl group is replaced with a phosphoric acid group include compounds shown in the following formulas (in the following formula, R m1 and R m2 are independently hydrogen atoms or Indicates an organic group (excluding nucleoside residues), X m indicates a hydrogen atom, a hydroxyl group or a halogen atom, R 1 and R 2 indicate a hydrogen atom or an alkyl group, and R 1 and R 2 indicate each other. They may be bonded together to form a 5- or 6-membered ring with other adjacent atoms, where R 3 and R 4 represent a hydrogen atom or a phenyl group).
  • nucleotide in which the 3'-hydroxyl group or the 5'-hydroxyl group is replaced with a phosphoric acid group for example, those represented by the following formulas (I'), (II') and (III') are mentioned as another preferable one.
  • Ring A' is a 3- to 20-membered, monocyclic, bicyclic ring with 1 to 10 heteroatoms independently selected from oxygen, nitrogen, sulfur, phosphorus and silicon, which may be substituted.
  • a polycyclic ring showing a ring containing the -N (R 6 ) -part; L represents a C 1-6 alkylene that may be covalently bonded or substituted, where one or more methylene units may be independently substituted with -L'-;
  • Each L' is independently covalently bonded, optionally substituted divalent C 1-3 alkylene, -C (R 3 ) (R 4 )-, -C (R 3 ) (R 4 )- Indicates C (R 3 ) (R 4 )-, -Cy- or -C (R 3 ) [C (R 4 ) 3 ]-;
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and R 5 independently contain hydrogen, -L s-
  • Carbon atoms may be independently replaced by Cy L ;
  • Each -Cy- has 1 to 10 heteroatoms independently selected from the C 3-20 alicyclic ring, C 6-20 aryl ring, oxygen, nitrogen, sulfur, phosphorus and silicon.
  • Each Cy L has 1 to 10 heteroatoms independently selected from the C 3-20 alicyclic ring, C 6-20 aryl ring, oxygen, nitrogen, sulfur, phosphorus and silicon 5 May be substituted, selected from ⁇ 20 membered heteroaryl rings and 3-20 membered heterocyclyl rings having 1-10 heteroatoms independently selected from oxygen, nitrogen, sulfur, phosphorus and silicon.
  • Each R'independently represents -R, -C (O) R, -CO 2 R or -SO 2 R; t indicates 0 to 20; R 6 indicates R'; R 7 indicates -OH or -SH; R 8 indicates -L-R 7 , -LC (R 1 ) (R 2 ) -R 7 or -L s- R 7 ; At least one of R 1 , R 2 , R 3 and R 4 is not hydrogen; Each R is a C 1-30 heteroatom having 1 to 10 heteroatoms independently selected from hydrogen, or C 1-30 aliphatic groups, oxygen, nitrogen, sulfur, phosphorus and silicon.
  • R 1 and R 2 are not the same, and R 3 and R 4 are not the same.
  • oligonucleotide means a compound in which one or more nucleotides are linked to a nucleoside.
  • oligonucleotides include phosphorothioated oligonucleotides in which the oxygen atom of the phosphate group is replaced with a sulfur atom, and oligonucleotides in which -O- of the phosphate group is replaced with -NH-. Also included are oligonucleotides in which the hydroxyl group (-OH) in the phosphate group is replaced by -ORp (where Rp represents an organic group in the formula).
  • the number of nucleosides of the oligonucleotide in the present invention is not particularly limited, but is preferably 3 to 50, more preferably 5 to 30.
  • amino group at the 3'position means an amino group bonded to the carbon atom at the 3'position of a nucleoside, nucleotide or oligonucleotide.
  • amino group at the 3'position means an amino group bonded to the carbon atom at the 3'position of a nucleoside, nucleotide or oligonucleotide.
  • 5'-amino group means an amino group attached to a carbon atom at the 5'-position of a nucleoside, nucleotide or oligonucleotide.
  • the "3'-position phosphate group” means a phosphate group bonded to a carbon atom at the 3'-position of a nucleotide or an oligonucleotide.
  • the term "5'-phosphate group” means a phosphate group bonded to the 5'carbon atom of a nucleotide or oligonucleotide.
  • nucleobase is not particularly limited as long as it is used for the synthesis of nucleic acid, and for example, a pyrimidine base such as a cytosyl group, a uracil group, a timyl group, an adenyl group, a guanyl group and the like. Purine bases can be mentioned.
  • the nucleic acid base includes any substituent (for example, halogen atom, alkyl group, aralkyl group, alkoxy group, acyl group, alkoxyalkyl group, hydroxyl group, amino group, monoalkylamino, etc.
  • Modified nucleic acid bases eg, 8-bromoadenyl group, 8-bromoguanyl group, 5-bromocitosyl group, 5-iodocitosyl group
  • Modified nucleic acid bases substituted with 1 to 3 at arbitrary positions with dialkylamino, carboxy, cyano, nitro, etc.
  • nucleobase which may be protected means, for example, in an adenyl group, a guanyl group, or a cytosyl group which is a nucleobase having an amino group, the amino group is protected by the "protecting group of the amino group” described later. It means that the nucleobase may be protected, and the nucleobase in which the amino group of the nucleobase is protected by a protecting group capable of withstanding the deprotection condition at the 5'position of the nucleotide is preferable.
  • the "protecting group used for nucleic acid synthesis” is not particularly limited as long as it is usually used in the field of nucleic acid synthesis, and examples thereof include the following.
  • Hydroxy group protecting group (The hydroxyl group protecting group of the nucleobase portion is described in the nucleobase protecting group described later) Unless otherwise specified, the "hydroxyl protecting group” is not particularly limited, and is, for example, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition, John Willy and Sons. Any protecting group described in (JOHN WILLY & SONS) Publishing (1999) and the like can be mentioned.
  • the protecting group of the hydroxyl group which may be protected is preferably a triethylsilyl group, a triisopropylsilyl group, or a tert-butyldimethylsilyl group, and from the viewpoint of economy and availability, tert-butyldimethylsilyl is preferable. It is particularly preferable that it is a group.
  • the "protecting group for an amino group” is not particularly limited, and for example, Greens Protective Groups in Organic Synthesis (Greene's PROTECIVE GROUPS in ORGANIC SYNTHESIS), 4th Edition, Willy. Protecting groups described in Wiley-Interscience Publishing (2006) and the like can be mentioned.
  • Specific examples of the protective group include pivaloyl group, pivaloyloxymethyl group, acetyl group, trifluoroacetyl group, phenoxyacetyl group, 4-isopropylphenoxyacetyl group, 4-tert-butylphenoxyacetyl group, benzoyl group and isobutylyl.
  • Examples include a group, a (2-hexyl) decanoyyl group, a dimethylformamidinyl group, a 1- (dimethylamino) ethylidene group, and a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group.
  • an acetyl group, a phenoxyacetyl group, a 4-isopropylphenoxyacetyl group, a benzoyl group, an isobutyryl group, a (2-hexyl) decanoyyl group, a dimethylformamidinyl group, and a 1- (dimethylamino) ethylidene group are preferable.
  • nucleic acid base In an adenyl group, a guanyl group, or a cytosyl group which is a nucleic acid base having an amino group, the amino group may be protected by the above-mentioned "protecting group of amino group".
  • a nucleobase in which the amino group of the nucleobase is protected by a protecting group capable of withstanding the deprotection conditions at the 5'position of the nucleotide is preferable.
  • the carbonyl group of the nucleobase may also be protected.
  • Phenol, 4-acetylaminophenol, pentafluorophenol, 4-pivalyloxybenzyl alcohol, 4-nitrophenethyl alcohol, 2- (methylsulfonyl) ethanol, 2- (phenylsulfonyl) ethanol, 2-cyanoethanol, 2-( Trimethylsilyl) ethanol, dimethylcarbamic acid chloride, diethylcarbamic acid chloride, ethylphenylcarbamic acid chloride, 1-pyrrolidincarboxylic acid chloride, 4-morpholinecarboxylic acid chloride, diphenylcarbamic acid chloride, etc. are reacted to obtain the carbonyl group of the nucleic acid base. Can be protected. Here, it may not be necessary to introduce a
  • a more preferred embodiment to which the production method of the present invention is applied is In nucleic acid A, the 5'-hydroxyl group is not protected, and the amino group and imino group of the nucleic acid base, the 2'-hydroxyl group of the ribose residue, the 3'-hydroxyl group and the 3'-amino group, and the deoxyribose residue At least one group selected from the 3'-hydroxyl group and the 3'-amino group is not removed under acidic conditions, but is protected by a protecting group (pseudo-solid phase protecting group) that can be removed under basic conditions, and others.
  • a protecting group prseudo-solid phase protecting group
  • nucleobases nucleotides or oligonucleotides (hereinafter sometimes referred to as "nucleobase a"), or hydroxyl groups at the 5'position, which may be further protected with protecting groups used in nucleic acid synthesis, are not protected.
  • Nucleic acid B is modified by a method in which the 3'-hydroxyl group or 3'-amino group is selected from the phosphoroamidite method, the H-phosphonate method, the dihalophosphine method, and the oxazaphosphoridine method, and 5'.
  • nucleic acid b nucleic acid b
  • nucleic acid a examples include the same protecting groups as described above for nucleic acid A and nucleic acid B.
  • protective groups that are not removed under acidic conditions but can be removed under basic conditions
  • nucleic acids a, nucleic acid ⁇ and nucleic acid b each of them is a direct group having 10 or more carbon atoms.
  • protective groups having a chain of aliphatic hydrocarbon groups or having at least one aliphatic hydrocarbon group having one or more branched chains and having an organic group having a total carbon number of 14 or more and 300 or less. Be done.
  • the pseudo-solid phase protecting group imparts hydrophobicity to nucleic acid a, nucleic acid ⁇ , nucleic acid b, and the oligonucleotide having the phosphorothioation site obtained in steps (1) and (2), and dissolves in a non-polar solvent. Improve sex. It can also reduce the solubility in polar solvents.
  • the nucleoside, nucleotide or oligonucleotide protected by such a pseudo-solid-phase protecting group can undergo a condensation reaction even in a liquid phase of a non-polar solvent (step (1)), and the reaction obtained in step (2).
  • an oligonucleotide having a phosphorothioation site protected by a pseudo solid-phase protecting group is precipitated, and solid-liquid separation thereof can be performed.
  • the polar solvent is added to the reaction solution obtained in step (2), the layers are separated between the polar solvent and the non-polar solvent, and the oligonucleotide having a phosphorothioation site is transferred to the non-polar solvent to extract the mixture. It can be performed.
  • pseudo-solid phase protecting groups include International Publication No. 2012/157723, International Publication No. 2013/12223, International Publication No. 2017/104836, International Publication No. 2013/179421, and International Publication No. 2014 / Those described in 077292 and International Publication No. 2017/086337 can be used.
  • the "protecting group used for nucleic acid synthesis” is not particularly limited as long as it is usually used in the field of nucleic acid synthesis, and the above-mentioned low molecular weight protecting group is also included, but it is solid or liquid after the step (2).
  • the pseudo-solid-solid protecting group is preferably a protecting group having a linear aliphatic hydrocarbon group having 10 or more carbon atoms, and purification by extraction is performed after the step (2).
  • the pseudo-solid-solid protecting group is preferably a protecting group having at least one aliphatic hydrocarbon group having one or more branched chains and having an organic group having a total carbon number of 14 or more and 300 or less.
  • Suitable pseudo-solid-state protecting groups for solid-liquid separation include, for example, a hydrocarbon group in which a linear aliphatic hydrocarbon group having 10 or more carbon atoms is single-bonded or bonded via a linker. Included are protecting groups with bound C 6-14 hydrocarbon rings.
  • the linear aliphatic hydrocarbon group having 10 or more carbon atoms is preferably a group selected from a linear C 10-40 alkyl group and a linear C 10-40 alkenyl group, and more preferably. It is a linear C 10-40 alkyl group, more preferably a linear C 10-30 alkyl group, particularly preferably a linear C 12-28 alkyl group, and most preferably a linear. C 14-26 alkyl group in the form.
  • the C 6-14 hydrocarbon ring is preferably selected from a benzene ring, a naphthalene ring and a cyclohexane ring, more preferably a benzene ring and a cyclohexane ring, and even more preferably a benzene ring.
  • Suitable pseudo-solid protecting groups for solid-liquid separation are preferably hydrocarbon groups with linear C 10-40 alkyl groups attached via a single bond or —O— via —O—. It is a protecting group having a bonded benzene ring.
  • the "branched chain” in the "organic group having at least one aliphatic hydrocarbon group having one or more branched chains and having a total carbon number of 14 or more and 300 or less” is linear or branched saturated. It is an aliphatic hydrocarbon group, preferably a C 1-6 alkyl group, more preferably a C 1-4 alkyl group, and even more preferably a methyl group or an ethyl group. Further, the "branched chain” may be substituted with one or more halogen atoms.
  • the "aliphatic hydrocarbon group" in the "organic group having at least one aliphatic hydrocarbon group having one or more branched chains and having a total carbon number of 14 or more and 300 or less” is linearly saturated or It is an unsaturated aliphatic hydrocarbon group, which is a C 2-300 alkyl group (preferably a C 3-100 alkyl group, more preferably a C 3-60 alkyl group), a C 2-300 alkenyl group (preferably a C 2-300 alkyl group).
  • the site of the "aliphatic hydrocarbon group having one or more branched chains" in the "organic group having at least one aliphatic hydrocarbon group having one or more branched chains and having a total carbon number of 14 or more and 300 or less” is , Not particularly limited, and may be present at the terminal (monovalent group) or at other sites (for example, divalent group).
  • Examples of the "aliphatic hydrocarbon group having one or more branched chains" include a propyl group, a butyl group, a pentyl group, a hexyl group, a heptyl group, an octyl group, a nonyl group, a decyl group, an undecyl group and a dodecyl group (lauryl group). ), Tridecyl group, myristyl group, cetyl group, stearyl group, araquil group, behenyl group, oleyl group, linoleyl group, lignoceryl group and other branched isomers, from monovalent groups having one or more branched chains and from them.
  • Examples include the induced divalent group.
  • the "aliphatic hydrocarbon group having one or more branched chains” is preferably a 3,7,11-trimethyldodecyl group or a 3,7,11,15-tetramethylhexadecyl group (hereinafter, 2,3-dihydrophyll). It may be a tyl group), 2,2,4,8,10,10-hexamethylundecane-5-yl group and the like.
  • a plurality of "aliphatic hydrocarbon groups having one or more branched chains” are included in "organic groups having at least one aliphatic hydrocarbon group having one or more branched chains and having a total carbon number of 14 or more and 300 or less". If present, each of them may be the same or different.
  • aliphatic hydrocarbon group having 1 or more branched chains in "organic group having at least one aliphatic hydrocarbon group having 1 or more branched chains and total carbon number of 14 or more and 300 or less"
  • the part can be set arbitrarily. For example, it has sites such as -O-, -S-, -CO-, -NH-, -COO-, -OCONH-, -CONH-, -NHCO-, and a hydrocarbon group (monovalent group or divalent group). You may be doing it.
  • hydrocarbon group examples include an aliphatic hydrocarbon group, an aromatic aliphatic hydrocarbon group, a monocyclic saturated hydrocarbon group and an aromatic hydrocarbon group, and specific examples thereof include an alkyl group. , Alkenyl group, alkynyl group, cycloalkyl group, aryl group, aralkyl group and other monovalent groups and divalent groups derived from them are used.
  • alkyl group is preferably a C 1-6 alkyl group, and examples thereof include methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, and hexyl.
  • alkenyl group is preferably a C 2-6 alkenyl group, and examples thereof include vinyl, 1-propenyl, allyl, isopropenyl, butenyl, isobutenyl and the like.
  • alkynyl group is preferably a C 2-6 alkynyl group, and examples thereof include ethynyl, propargyl, and 1-propynyl.
  • cycloalkyl group is preferably a C 3-6 cycloalkyl group, and examples thereof include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, and cyclohexyl.
  • the "aryl group” is preferably a C6-14 aryl group, and examples thereof include phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, biphenylyl, and 2-anthryl. Of these, the C 6-10 aryl group is more preferable, and phenyl is particularly preferable.
  • the "aralkyl group” is preferably a C7-20 aralkyl group, and examples thereof include benzyl, 1-phenylethyl, 2-phenylethyl, 1-phenylpropyl, naphthylmethyl, 1-naphthylethyl, 1-naphthylpropyl and the like. Be done.
  • a C 7-16 aralkyl group (C 6-10 aryl-C 1-6 alkyl group) is more preferable, and benzyl is particularly preferable.
  • the "hydrocarbon group” may be substituted with a substituent selected from a halogen atom (chlorine atom, bromine atom, fluorine atom, iodine atom), an oxo group and the like.
  • the "total carbon number" in the "organic group having at least one aliphatic hydrocarbon group having one or more branched chains and having a total carbon number of 14 or more and 300 or less” is 14 or more, preferably 16 or more, and more. It is preferably 18 or more, 300 or less, preferably 200 or less, and more preferably 160 or less.
  • the number of branched chains in the "organic group having at least one aliphatic hydrocarbon group having one or more branched chains and having a total carbon number of 14 or more and 300 or less” is not particularly limited, but 2 or more is preferable. 3 or more is more preferable, 4 or more is more preferable, 8 or more is more preferable, and 10 or more is further preferable.
  • oligonucleotide chain As the number of branched chains increases, even when the oligonucleotide chain becomes a long chain, it has at least one aliphatic hydrocarbon group having one or more branched chains and has a total carbon number of 14 or more and 300 or less. Nucleosides or oligonucleotides protected by pseudosolid-phase protecting groups with organic groups are well soluble in organic solvents, especially non-polar solvents.
  • R 14 and R 15 each independently represent a hydrogen atom or a C 1-4 alkyl group; and X 1 represents a single bond or a C 1-4 alkylene group. However, both R 14 and R 15 are not hydrogen atoms.
  • Groups having the same or different divalent groups represented by are preferred.
  • Examples of the group having a divalent group represented by the formula (A) include a group represented by any of the following formulas (B) to (D).
  • the number of carbon atoms in the definition of each symbol in the formulas (B) to (D), the number of repeating units (m 1 , n 0 to n 2 ), etc. are shown for convenience, and the total number of carbon atoms is 14.
  • the above preferably 16 or more, more preferably 18 or more
  • 300 or less preferably 200 or less, more preferably 160 or less
  • the formulas (B) to (D) will be described in order.
  • Equation (B) is as follows.
  • n 0 represents an integer from 2 to 40;
  • n 0 R 18 and R 19 each independently represent a hydrogen atom or a C 1-4 alkyl group;
  • n 0 pieces of X 2 are each independently a single bond or a C 1-4 alkylene group;
  • R 20 represents a hydrogen atom or a C 1-4 alkyl group;
  • R 21 represents a C 1-4 alkyl group.
  • R 20 represents a C 1-4 alkyl group.
  • R 16 and R 17 are hydrogen atoms; n 0 is an integer from 2 to 40; n 0 one R 18 and R 19 are each independently a hydrogen atom, a methyl group or an ethyl group; n 0 pieces of X 2 are each independently a single bond, is methylene group or an ethylene group; and R 20 is a hydrogen atom, a group is a methyl group or an ethyl group (wherein, R 18 and R 19 together When it is not a hydrogen atom and n 0 is 2, R 20 represents a methyl or ethyl group).
  • a more preferable group of the formula (B) is a branched isomer having 14 to 160 carbon atoms such as a myristyl group, a cetyl group, a stearyl group, an araquil group and a behenyl group, among which 2,3-dihydrophytyl group and 3 , 7,11-trimethyldodecyl group, 2,2,4,8,10,10-hexamethyl-5-dodecanoyl group is particularly preferable.
  • Equation (C) is as follows.
  • R 22 is more preferably a group which is a branched isomer having 14 to 30 carbon atoms such as a myristyl group, a cetyl group, a stearyl group, an arakil group and a behenyl group, and among them, 2,3-dihydro. Phytyl groups and 3,7,11-trimethyldodecyl groups are particularly preferred.
  • Equation (D) is as follows.
  • n 1 represents an integer from 1 to 10
  • n 2 represents an integer from 1 to 10
  • n 1 R 26 and R 27 each independently represent a hydrogen atom or a C 1-4 alkyl group
  • n 1 X 3 each independently represents a single bond or C 1-4 alkylene group
  • n Two R 28 and R 29 each independently represent a hydrogen atom or a C 1-4 alkyl group
  • the n 2 X 5 each independently represents a single bond or a C 1-4 alkylene group
  • X 4 indicates a single bond or C 1-4 alkylene group
  • R 23 , R 24 , R 25 , R 30 , R 31 and R 32 are independent hydrogen atoms or C 1-4 alkyl groups, respectively.
  • R 26 and R 27 , and / or R 28 and R 29 are not both hydrogen atoms, and n 1 + n 2 is 2, two or more of R 23 , R 24, and R 25.
  • R 30 , R 31 and R 32 each independently indicate a C 1-4 alkyl group.
  • R 23 , R 24 and R 25 Two or more independently indicate a C 1-4 alkyl group, or two or more of R 30 , R 31 and R 32 each independently indicate a C 1-4 alkyl group). preferable.
  • a particularly suitable base of the formula (D) is n 1 is an integer from 1 to 5; n 2 is an integer from 1 to 5; n One R 26 and R 27 are independently hydrogen atoms or methyl groups; n 1 X 3 is an independent single bond or methylene group; n The two R 28 and R 29 are independently hydrogen atoms or methyl groups; the n 2 X 5 are each independently a single bond or a methylene group; X 4 is a single bond or a methylene group; and R 23 , R 24 , R 25 , R 31 , R 31 and R 32 are groups that are methyl groups (where R 26 and R 27 , and / or R). 28 and R 29 are not both hydrogen atoms).
  • organic group having at least one aliphatic hydrocarbon group having one or more branched chains and having a total carbon number of 14 or more and 300 or less include the following groups. * In each group indicates a bond position; n 3 in the equation indicates an integer of 3 or more; n 4 can be appropriately set so that the total carbon number of the group is 14 or more and 300 or less.
  • an organic group having at least one aliphatic hydrocarbon group having one or more branched chains and having a total carbon number of 14 or more and 300 or less include the following groups: 3,7,11,15-Tetramethylhexadecyl group (also known as 2,3-dihydrophytyl group); 3,7,11-trimethyldodecyl group; 2,2,4,8,10,10-hexamethyl-5-dodecanoyl group; 3,4,5-Tri (3', 7', 11', 15'-tetramethylhexadecyloxy) benzyl group; and 3,5-di (3', 7', 11', 15'-tetramethyl Hexadecyloxy) benzyl group.
  • the pseudo-solid-phase protecting group is more preferably a group represented by the following formula (g-I) (hereinafter, may be abbreviated as "pseudo-solid-phase protecting group (g-I)"). ** LYZ (gI) [During the ceremony, ** indicates the position of bond with the protected group; L is a single bond, or formula (a1) or (a1'):
  • R 3 and R 5 each independently show a hydrogen atom or a C 1-22 alkyl group, or R 3 and R 5 together to form a ring.
  • Good indicates a group represented by.
  • R 6 is a hydrogen atom or R b is a group represented by the following formula (a3)
  • R 6 of ring A or ring B is single-bonded together with R 8.
  • it may indicate —O— to form a fused ring with ring A or ring B and ring C
  • k represents an integer from 1 to 4
  • the k R 7 have each independently a hydrocarbon group which is straight-chain aliphatic hydrocarbon group having 10 or more carbon atoms linked through a single bond or a linker, or branched one or more of Shows an organic group having at least one aliphatic hydrocarbon group and having a total carbon number of 14
  • j represents an integer from 0 to 4;
  • the j Qs are independently synonymous with the above;
  • the j R 9 have independently, or a hydrocarbon group which is straight-chain aliphatic hydrocarbon group having 10 or more carbon atoms linked through a single bond or a linker, or branched one or more of Shows an organic group having at least one aliphatic hydrocarbon group and having a total carbon number of 14 or more and 300 or less;
  • R 8 represents a hydrogen atom or, together with R 6 of ring A or ring B, shows a single bond or —O—, forming a fused ring with ring A or ring B and ring C.
  • ring C may be further substituted with a halogen atom, a C 1-6 alkyl group optionally substituted with a halogen atom, and a C 1- algebra optionally substituted with a halogen atom, in addition to j QR 9. It may have a substituent selected from the group consisting of 6 alkoxy groups. ), Or Ra and R b together to form an oxo group. ] Indicates a group represented by. ]
  • the linear aliphatic hydrocarbon groups having 10 or more carbon atoms of R 7 in the formula (a2), the formula (a2') and the formula (a2 ′′), and R 9 in the formula (a3) are independent of each other.
  • a group selected from a linear C 10-40 alkyl group and a linear C 10-40 alkenyl group is preferable, and a linear C 10-40 alkyl group is more preferable. It is preferably a linear C 10-30 alkyl group, particularly preferably a linear C 12-28 alkyl group, and most preferably a linear C 14-26 alkyl group.
  • Equation (a2), the formula (a2 ') and the formula (a2 ") R 7 in, and the formula (a3) in R 9 of the" aliphatic hydrocarbon group having 10 or more straight is a single bond or
  • the "hydrocarbon group bonded via the linker” is preferably a linear C 10-40 alkyl group to which 1 to 3 linear C 10-40 alkyl groups are bonded via -O-. It is a benzyl group, or a cyclohexylmethyl group in which 1 to 3 linear C 10-40 alkyl groups are bonded via —O—.
  • Each of the "organic groups having 14 or more and having a total carbon number of 14 or more and 300 or less” is a group having a divalent group represented by the above formula (A), and more preferably the above.
  • L 1 is a divalent C 1-22 hydrocarbon group; and L 2 is a single bond. Is the basis.
  • L 1 is an ethylene group
  • L 1 is an ethylene group
  • a particularly preferred embodiment of L represented by the formula (a1) is an easily available and inexpensive succinyl group.
  • L 1 in the formula (a1') is preferably a divalent C 6-10 aromatic hydrocarbon group, more preferably a phenylene group.
  • L 2 in formula (a1') is preferably a single bond.
  • a preferred combination of L 1 and L 2 in formula (a1') is one in which L 1 is a divalent C 6-10 aromatic hydrocarbon group and L 2 is a single bond.
  • a more preferable combination of L 1 and L 2 in the formula (a1') is a combination in which L 1 is a phenylene group and L 2 is a single bond.
  • R 1 and R 2 in the formula (a1') are independently C 1-22 alkyl groups, more preferably C 1-10 alkyl groups, respectively.
  • L represented by the formula (a1') is R 1 and R 2 are independently C 1-22 alkyl groups; L 1 is a divalent C 6-10 aromatic hydrocarbon group; and L 2 is a single bond. Is the basis.
  • L represented by the formula (a1') is R 1 and R 2 are independently C 1-10 alkyl groups; L 1 is a phenylene group; and L 2 is a single bond, Is the basis.
  • the R is preferably a hydrogen atom, a C 1-6 alkyl group or a C 7-16 aralkyl group, more preferably a hydrogen atom, methyl, ethyl or It is benzyl, more preferably a hydrogen atom.
  • Y is preferably a single bond, an oxygen atom or NR, and more preferably a single bond or an oxygen atom.
  • Z in the formula (g-I) is preferably a group represented by the formula (a2) or the formula (a2 "), and more preferably a group represented by the formula (a2").
  • a solid-phase protecting group By using a solid-phase protecting group, the solubility in a non-polar solvent such as nucleoside, nucleotide or oligonucleotide (a) can be dramatically improved, whereby the production method of the present invention can be produced at a higher concentration. It can be executed and productivity is greatly improved.
  • R 6 is preferably a hydrogen atom. Further, in the formula (a2), it is preferable that Ra and R b are hydrogen atoms or together to form an oxo group.
  • a preferred embodiment of Z represented by the formula (a2) for solid-liquid separation is R a and R b are hydrogen atoms; R 6 is a hydrogen atom; k is an integer from 1 to 3; the k Q is -O-; and k pieces of R 7 are each independently a linear C 10-40 alkyl group, Is the basis.
  • R a and R b are hydrogen atoms;
  • R 6 is a hydrogen atom;
  • k is an integer from 1 to 3;
  • k Qs are -O-;
  • Each of k R 7s is independently a benzyl group in which 1 to 3 linear C 10-40 alkyl groups are bonded via -O-, or 1 to 3 linear Cs.
  • a 10-40 alkyl group is a cyclohexylmethyl group attached via —O—; and ring A may be further substituted with halogen atoms, halogen atoms in addition to k QR 7 C 1-. It may have a substituent selected from the group consisting of 6 alkyl groups and C 1-6 alkoxy groups which may be substituted with halogen atoms. Is the basis.
  • R a is a hydrogen atom
  • R b is equation (a3) (in the equation, * is a bond position, j is an integer of 0 to 3, and j Qs are ⁇ O ⁇ .
  • j-number of R 9 are each independently a linear C 10-40 alkyl group, R 6 and R 8 are both a group represented by a.) a hydrogen atom, Is the basis.
  • R a is a hydrogen atom
  • R b is equation (a3) (in the equation, * is a bond position, j is an integer of 0 to 3, and j Qs are ⁇ O ⁇ .
  • j-number of R 9 are each independently a linear C 10-40 alkyl group
  • R 8 is a single bond or -O- together with R 6, ring a
  • a group represented by ring C which forms a fused ring. Is the basis.
  • Ra and R b together form an oxo group
  • R 6 is a hydrogen atom
  • k is an integer from 1 to 3
  • the k Q is -O-
  • k pieces of R 7 are each independently a linear C 10-40 alkyl group, Is the basis.
  • Z represented by formula (a2) for solid-liquid separation is Ra and R b together form an oxo group;
  • R 6 is a hydrogen atom;
  • k is an integer from 1 to 3;
  • k Qs are -O-;
  • Each of k R 7s is independently a benzyl group in which 1 to 3 linear C 10-40 alkyl groups are bonded via -O-, or 1 to 3 linear Cs.
  • a 10-40 alkyl group is a cyclohexylmethyl group attached via —O—; and ring A may be further substituted with halogen atoms, halogen atoms in addition to k QR 7 C 1-. It may have a substituent selected from the group consisting of 6 alkyl groups and C 1-6 alkoxy groups which may be substituted with halogen atoms. Is the basis.
  • R 6 is preferably a hydrogen atom, and in formula (a2”), Ra and R b are hydrogen atoms or together to form an oxo group. Is preferable.
  • a preferred embodiment of Z represented by the formula (a2 ") for solid-liquid separation is R a and R b are hydrogen atoms; R 6 is a hydrogen atom; k is an integer from 1 to 3; the k Q is -O-; and k pieces of R 7 are each independently a linear C 10-40 alkyl group, Is the basis.
  • R a and R b are hydrogen atoms;
  • R 6 is a hydrogen atom;
  • k is an integer from 1 to 3;
  • k Qs are -O-;
  • Each of k R 7s is independently a benzyl group in which 1 to 3 linear C 10-40 alkyl groups are bonded via -O-, or 1 to 3 linear Cs.
  • a 10-40 alkyl group is a cyclohexylmethyl group attached via —O—; and ring B may be further substituted with halogen atoms, halogen atoms in addition to k QR 7 C 1-. It may have a substituent selected from the group consisting of 6 alkyl groups and C 1-6 alkoxy groups which may be substituted with halogen atoms. Is the basis.
  • Ra is a hydrogen atom
  • R b is the equation (a3) (in the equation, * is the coupling position, j is an integer of 0 to 3, j Q is -O-, and j R 9 are each. Independently, it is a C 10-40 alkyl group, and R 6 and R 8 are both hydrogen atoms.) Is the basis.
  • Ra is a hydrogen atom
  • R b is the equation (a3) (in the equation, * is the bond position, j is an integer of 0 to 3, j Q is ⁇ O ⁇ , and j R 9 are each. Independently, it is a linear C 10-40 alkyl group, and R 8 shows a single bond or —O— together with R 6 to form a condensed ring with rings B and C. ), Which is the group Is the basis.
  • Ra and R b together form an oxo group
  • R 6 is a hydrogen atom
  • k is an integer from 1 to 3
  • the k Q is -O-
  • k pieces of R 7 are each independently a linear C 10-40 alkyl group, Is the basis.
  • Z represented by the formula (a2 ") for solid-liquid separation is Ra and R b together form an oxo group;
  • R 6 is a hydrogen atom;
  • k is an integer from 1 to 3;
  • k Qs are -O-;
  • Each of k R 7s is independently a benzyl group in which 1 to 3 linear C 10-40 alkyl groups are bonded via -O-, or 1 to 3 linear Cs.
  • a 10-40 alkyl group is a cyclohexylmethyl group attached via —O—; and ring B may be further substituted with halogen atoms, halogen atoms in addition to k QR 7 C 1-. It may have a substituent selected from the group consisting of 6 alkyl groups and C 1-6 alkoxy groups which may be substituted with halogen atoms. Is the basis.
  • L is a succinyl group, or R 1 and R 2 are independently C 1-10 alkyl groups in the group represented by the formula (a1') (in the formula (a1'), L. 1 is a divalent phenylene group, L 2 is a single bond), and YY is a 3,4,5-tris (octadecyloxy) benzyloxy group, 3,5-bis.
  • Pseudo-solid-phase protecting groups (GI) suitable for solid-liquid separation are more preferably L is the succinyl group, and YZ is the 3,4,5-tris (octadecyloxy) benzyloxy group, 3,5-bis (docosyloxy) benzyloxy group, 3,5-bis [3', 4', 5'-tris (octadecyloxy) benzyloxy] benzyloxy group, 3,4,5-tris [3', 4', 5'-tris (octadecyloxy) benzyloxy] benzyloxy group, 3,4 , 5-tris (octadecyloxy) benzylamino group, 2,4-bis (docosyloxy) benzylamino group, 3,5-bis (docosyloxy) benzylamino group, bis (4-docosyloxyphenyl) methylamino group, 4 -Methoxy-2- [3',
  • Pseudo-solid-phase protecting groups (GI) suitable for solid-liquid separation are more preferably L is a succinyl group, and YZ is a 3,4,5-tris (octadecyloxy) benzyloxy group, 3,4,5-tris (octadecyloxy) cyclohexylmethyloxy group, 3,5-bis.
  • Pseudo-solid-phase protecting groups (GI) suitable for solid-liquid separation are particularly preferably.
  • L is the succinyl group
  • YZ is the 3,4,5-tris (octadecyloxy) benzyloxy group, 3,4,5-tris (octadecyloxy) cyclohexylmethyloxy group or phenyl (2,3).
  • a group, or LY is a succinyl-1,4-piperazindiyl group
  • Z is a 3,4,5-tris (octadecyloxy) benzoyl group. Is the basis.
  • Pseudo-solid phase protecting groups (GI) suitable for solid-liquid separation are most preferably L is a succinyl group, and YZ is a 3,4,5-tris (octadecyloxy) benzyloxy group, or a 3,4,5-tris (octadecyloxy) cyclohexylmethyloxy group.
  • a group, or LY is a succinyl-1,4-piperazindiyl group, and Z is a 3,4,5-tris (octadecyloxy) benzoyl group. Is the basis.
  • Suitable pseudo-solid phase protective groups (g—I) for extraction are preferably 2- ⁇ 2,4-di (2', 3'-dihydrophytyloxy) benzylaminocarbonyl ⁇ ethylcarbonyl groups; 3 , 5-Di (2', 3'-dihydrophytyloxy) benzyloxysuccinyl group; 4- (2', 3'-dihydrophytyloxy) benzyloxysuccinyl group; 2- ⁇ 1-[(2-chloro -5- (2', 3'-dihydrophytyloxy) phenyl)] benzylaminocarbonyl ⁇ ethylcarbonyl group; 3,4,5-tri (2', 3'-dihydrophytyloxy) benzyloxysuccinyl group; 2- ⁇ 3,4,5-tri (2', 3'-dihydrophytyloxy) benzylaminocarbonyl ⁇ ethylcarbonyl
  • the "temporary protecting group that can be removed under acidic conditions” that protects the 5'-position hydroxyl group in nucleic acid b is such that it can be deprotected under acidic conditions and is used as a hydroxyl group protecting group.
  • a trityl group a 9- (9-phenyl) xanthenyl group, a 9-phenylthioxanthenyl group, a 1,1-bis (4-methoxyphenyl) -1-phenylmethyl group (dimethoxytrityl group).
  • the temporary protecting group for the hydroxyl group is preferably a monomethoxytrityl group or a dimethoxytrityl group, and more preferably a dimethoxytrityl group.
  • the organic group of L n1 means a hydrocarbon group or a group in which a carbon atom in the hydrocarbon group is replaced with a heteroatom.
  • the hetero atom include an oxygen atom, a nitrogen atom, a sulfur atom and the like.
  • the hydroxyl groups and amino groups that the organic group can have are preferably protected by a protecting group.
  • the shape of the organic group may be chain-like (linear or branched-chain), cyclic, or a combination thereof.
  • the organic group may have a group having functionality for cells.
  • the group having functionality for cells is preferably attached to the end of the main chain or side chain of the organic group.
  • Examples of the group having functionality for cells include "a group that improves the cell membrane permeability of a compound by improving the lipophilicity of the compound” and “the uptake of the compound into the cell via a cell membrane receptor". "Groups for improving” and the like.
  • Examples of the “group that improves the cell membrane permeability of the compound by improving the lipophilicity of the compound” include cholesterol residues, tocopherol residues and the like.
  • Examples of the “group that improves the uptake of the compound into the cell via the cell membrane receptor” include N-acetylgalactosamine residue and the like. Groups having functionality for these cells are described in WO 2017/104836.
  • -OL n1- OH examples include the following (* in the following formula indicates a bond position with a phosphorus atom, and Ac indicates an acetyl group).
  • L n1 is preferably a C 2-6 alkylene group, more preferably an ethylene group.
  • nucleic acid a nucleic acid ⁇ and nucleic acid b suitable for carrying out the production method of the present invention will be described in detail below.
  • nucleic acid a used in the step (1) of the present invention examples include compounds represented by the following formula (a-I) (that is, nucleosides or oligonucleotides).
  • m indicates an integer greater than or equal to 0;
  • Each m + 1 Base independently represents a nucleobase that may be protected;
  • the m + 1 Xs independently represent a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group that may be protected, or a divalent organic group that binds to a carbon atom at the 2-position and a carbon atom at the 4-position;
  • m + 1 X n1s independently represent an oxygen atom or NH;
  • the m R 10s independently represent oxygen or sulfur atoms;
  • Each of the m R p1s independently represents a protecting group for a phosphate group; L, Y and Z are synonymous with the above.
  • the amino group of the nucleobase is preferably protected by a protecting group.
  • a 5- or 6-membered nitrogen-containing hydrocarbon ring may be formed together with the carbon atom and the nitrogen atom to which they are bonded.
  • the amino group protecting group may be only one kind or two or more kinds.
  • compound (a-I) is a nucleoside, and when m is 1 or more, compound (a-I) is an oligonucleotide.
  • m is preferably 49 or less, more preferably 29 or less, further preferably 19 or less, particularly preferably 4 or less, and most preferably 2 or less.
  • halogen atom of X a fluorine atom and a chlorine atom are preferable, and a fluorine atom is more preferable.
  • the protecting group for the hydroxyl group that may be protected by X is not particularly limited, and for example, PROTECIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, 3rd edition, John Willy and. Any protecting group described in JOHN WILLY & SONS Publishing (1999) and the like can be mentioned.
  • the protecting group of the hydroxyl group which may be protected is preferably a triethylsilyl group, a triisopropylsilyl group, or a tert-butyldimethylsilyl group, and from the viewpoint of economy and availability, tert-butyldimethylsilyl is preferable. It is particularly preferable that it is a group.
  • the "divalent organic group bonded to the 2-position carbon atom and the 4-position carbon atom" of X is not particularly limited as long as it is bonded to the 2-position carbon atom and the 4-position carbon atom of the nucleoside.
  • the divalent organic group for example, an optionally substituted C 2-7 alkylene group, and -O -, - NR 33 - ( R 33 represents a hydrogen atom or a C 1-6 alkyl group), -S -, - CO -, - COO -, - OCONR 34 - (R 34 represents a hydrogen atom or a C 1-6 alkyl group), and -CONR 35 - (R 35 is a hydrogen atom or a C 1-6 alkyl group
  • a divalent organic group composed of a divalent linker selected from) and a C 1-7 alkylene group which may be substituted can be mentioned. Examples of the substituent that the C 1-7 alkylene group and the C 2-7 alkylene group may have include
  • a C 2-7 alkylene group which may be substituted a C 2-7 alkylene group which may be substituted, -OR i- (R i is bonded to the 4-position carbon atom).
  • the C 1-6 alkylene group represented by R i , R j , R k and R l is preferably a methylene group or an ethylene group, respectively.
  • Each of m + 1 X is independently, preferably a hydrogen atom, a halogen atom, or a hydroxyl group which may be protected, and more preferably a hydrogen atom or a hydroxyl group which may be protected.
  • the protecting group for the phosphate group of R p1 is not particularly limited as long as it can be removed under basic conditions and is used as the protecting group for the phosphate group, but is not particularly limited, but -CH 2 CH 2 WG (WG). Indicates an electron-withdrawing group.) Is preferably a group represented by. Examples of the electron-withdrawing group of WG include a cyano group and a nitro group, and a cyano group is preferable.
  • the m R p1s are preferably groups, each independently represented by -CH 2 CH 2 WG. m + 1 X n1 is preferably an oxygen atom.
  • L, Y and Z is as described above.
  • Compound (a-I) is preferably a compound represented by the following formula (ai) (definition and description of symbols in the following formula are as described above).
  • Compound (a-I) can be produced by a method known per se or a method similar thereto. For example, it can be produced according to the method described in International Publication No. 2017/104836.
  • the compound represented by the formula (a-II) (that is, a nucleoside or an oligonucleotide) is preferable.
  • m, m Base, m + 1 X, m R 10 , m R p1 , L, Y and Z are independently synonymous with the above;
  • R 11 represents a methyl group,
  • R 12 and R 13 each independently represent a C 1-5 alkyl group, or
  • R 11 and R 12 are combined to bond carbon atoms and nitrogen It may form a 5- or 6-membered nitrogen-containing hydrocarbon ring with the atom.
  • m R p1s are independently represented by -CH 2 CH 2 WG.
  • m is preferably 0. That is, among the compounds (a-II), the compound represented by the formula (a-III) (that is, the nucleoside) is preferable (the definitions and explanations of the symbols in the following formulas are as described above).
  • R 11 is a methyl group and R 12 and R 13 are independently C 1-5 alkyl groups, respectively, and R 11 and R are R 11 . More preferably, 12 and R 13 are methyl groups. Descriptions of the other symbols in formula (a-II) and formula (a-III) are as described above.
  • the compound (a-II) when an oligonucleotide having a phosphorothioation site in which the first residue has adenine as a nucleobase is produced, the compound (a-II) (particularly, the compound (a)) is used as a starting material such as a nucleoside, a nucleotide or an oligonucleotide.
  • -III) can be used to suppress the formation of branched compounds.
  • the branched form refers to a by-product produced by the loss of the protecting group of the amino group in the nucleobase of the target compound and the binding of the amino group and the monomer.
  • the compound represented by the formula (a-IV) that is, a nucleoside or an oligonucleotide is preferable.
  • j represents an integer from 0 to 4;
  • the j Qs are independently synonymous with the above;
  • the j R 9 have independently, or a hydrocarbon group which is straight-chain aliphatic hydrocarbon group having 10 or more carbon atoms linked through a single bond or a linker, or branched one or more of Shows an organic group having at least one aliphatic hydrocarbon group and having a total carbon number of 14 or more and 300 or less;
  • R 8 may represent a hydrogen atom or, together with R 6 , show a single bond or —O— to form a fused ring with rings B and C; and
  • ring C may be j.
  • m R p1s are independently represented by -CH 2 CH 2 WG.
  • m is preferably 0. Descriptions of the other symbols in formula (a-IV) are as described above.
  • the compound represented by the following formula (a-V) that is, the nucleoside is preferable (the definitions and explanations of the symbols in the following formula are as described above).
  • -V) is more soluble in non-polar solvents than other compounds (a-I) having Z (ie, benzyl group structure) represented by the formula (a2) in the pseudo-solid protecting group. Therefore, by using the compound (a-IV) (particularly, the compound (aV)), the production method of the present invention can be carried out at a higher concentration, and the productivity is greatly improved.
  • the description of Z'represented by ") is the same as the description of Z represented by the above formula (a2").
  • L is a succinyl group, or R 1 and R 2 are independently C 1-10 alkyl groups in the group represented by the formula (a1') (in the formula (a1'), L. 1 is a divalent phenylene group, L 2 is a single bond), and YZ'is a 3,4,5-tris (octadecyloxy) cyclohexylmethyloxy group, 3,5.
  • L is the succinyl group
  • YZ' is the 3,4,5-tris (octadecyloxy) cyclohexylmethyloxy group, 3,5-bis (docosyloxy) cyclohexylmethyloxy group, 3,5-bis [ 3', 4', 5'-tris (octadecyloxy) cyclohexylmethyloxy] cyclohexylmethyloxy group, 3,4,5-tris [3', 4', 5'-tris (octadecyloxy) cyclohexylmethyloxy] cyclohexyl Methyloxy group, 3,4,5-tris (octadecyloxy) cyclohexylmethylamino group, 2,4-bis (docosyloxy) cyclohexylmethylamino group, 3,5-bis (docosyloxy) cyclohexylmethylamino group, 4-me
  • L is a succinyl group
  • YZ' is a 3,4,5-tris (octadecyloxy) cyclohexylmethyloxy group, 3,5-bis (docosyloxy) cyclohexylmethyloxy group, 3,5-bis [ 3', 4', 5'-tris (octadecyloxy) cyclohexylmethyloxy] cyclohexylmethyloxy group, or 3,4,5-tris [3', 4', 5'-tris (octadecyloxy) cyclohexylmethyloxy] It is a cyclohexylmethyloxy group, The combination is more preferred for solid-liquid separation.
  • L is a succinyl group and YZ'is a 3,4,5-tris (octadecyloxy) cyclohexylmethyloxy group.
  • the combination is particularly preferred for solid-liquid separation.
  • nucleic acid a for example, a compound represented by the following formula (a-VI) (that is, a nucleoside or an oligonucleotide) can be mentioned.
  • At least one of the m + 1 Base 1 indicates a nucleobase protected by -LYZ, the rest indicates a nucleobase that may be protected;
  • the m X n1s independently represent an oxygen atom or NH;
  • X n2 indicates a protected hydroxyl or amino group;
  • m, m + 1 X, m R 10 , m R p1 , L, Y and Z are independently synonymous with the above.
  • At least one of the formula (a-VI), m + 1 pieces of Base 1 is a nucleobase that is protected by -L-Y-Z.
  • the description of the nucleobase and —LYZ is as described above.
  • the description of the nucleobase that may be protected is also as described above.
  • the protecting group for the protected hydroxyl group (X n2 ) is not particularly limited, for example, PROTECIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, 3rd Edition, John Willy and. Any protecting group described in JOHN WILLY & SONS Publishing (1999) and the like can be mentioned. Specifically, methyl group, benzyl group, p-methoxybenzyl group, tert-butyl group, methoxyethyl group, ethoxyethyl group, cyanoethyl group, cyanoethoxymethyl group, phenylcarbamoyl group, 1,1-dioxothio.
  • Morpholine-4-thiocarbamoyl group acetyl group, pivaloyl group, benzoyl group, triethylsilyl group, triisopropylsilyl group, tert-butyldimethylsilyl group, [(triisopropylsilyl) oxy] methyl (Tom) group, 1-( 4-Chlorophenyl) -4-ethoxypiperidin-4-yl (Cpep) group and the like can be mentioned.
  • the hydroxyl protecting group is preferably a triethylsilyl group, a triisopropylsilyl group or a tert-butyldimethylsilyl group, and more preferably a tert-butyldimethylsilyl group from the viewpoint of economy and availability.
  • the protection and deprotection of hydroxyl groups are well known, and can be performed by, for example, the method described in Protective Groups in Organic Syntheses described above.
  • the protected group of the amino group (X n2 ) is not particularly limited, and for example, Greens Protective Groups in Organic Synthesis (Greene's PROTECIVE GROUPs in ORGANIC SYNTHESIS), 4th edition, Protecting groups described in Wiley-Interscience Publishing (2006) and the like can be mentioned.
  • Specific examples of each protective group include pivaloyl group, pivaloyloxymethyl group, acetyl group, trifluoroacetyl group, phenoxyacetyl group, 4-isopropylphenoxyacetyl group, 4-tert-butylphenoxyacetyl group, benzoyl group and isobutylyl.
  • Examples include a group, a (2-hexyl) decanoyyl group, a dimethylformamidinyl group, a 1- (dimethylamino) ethylidene group, and a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group.
  • Amino group protecting groups are preferably acetyl groups, phenoxyacetyl groups, 4-isopropylphenoxyacetyl groups, benzoyl groups, isobutyryl groups, (2-hexyl) decanoyyl groups, dimethylformamidinyl groups, or 1- (dimethylamino). ) Acetyl group.
  • the protection and deprotection of amino groups are well known and can be performed by, for example, the method described in Protective Groups in Organic Synthesis described above.
  • the m X n1s in formula (a-VI) are preferably oxygen atoms.
  • X n2 in the formula (a-VI) is preferably a protected hydroxyl group.
  • the m R p1s in formula (a-VI) are preferably groups independently represented by -CH 2 CH 2 WG. Descriptions of the other symbols in formula (a-VI) are as described above.
  • the compound (a-VI) is preferably a compound represented by the following formula (a-vi).
  • R n4 represents a hydroxyl protecting group
  • R n4 in the formula (a-vi) is the same as the description of the hydroxyl protecting group in X n2 . Descriptions of the other symbols in formula (a-vi) are as described above.
  • nucleic acid ⁇ for example, a compound represented by the following formula (a-VII) (that is, a nucleotide or an oligonucleotide) can be mentioned.
  • m + 1 X n1s independently represent an oxygen atom or NH; L n1 indicates an organic group; m, m + 1 Base, m + 1 X, m + 1 R 10 , m + 1 R p1 , L, Y and Z are independently synonymous with the above. ]
  • L n1 in the formula (a-VII) is preferably a C 2-6 alkylene group, more preferably an ethylene group.
  • the m + 1 X n1 in the formula (a-VII) is preferably an oxygen atom.
  • the m + 1 R p1s in the formula (a-VII) are preferably groups independently represented by -CH 2 CH 2 WG. Descriptions of the other symbols in formula (a-VII) are as described above.
  • the compound (a-VII) is preferably a compound represented by the following formula (a-vii) (definition and description of symbols in the following formula are as described above).
  • Compound (a-VII) can be produced by a method known per se or a method similar thereto.
  • the compound (a-VII) in which m is 0, X n1 is an oxygen atom, and L is a succinyl group can be produced, for example, by the following steps.
  • (Ii) A compound represented by the formula: HO-L n1- OQ "in the presence of a condensing agent for the obtained ZZ-CO (CH 2 ) 2 COOH (in the above formula, Q" is a temporary protecting group.
  • the same reaction is carried out by using the corresponding acid anhydride, the corresponding dicarboxylic acid halide, the corresponding active ester of the dicarboxylic acid, etc. instead of the succinic anhydride. It can be manufactured by performing. Further, the compound (a-VII) in which X n1 is NH can be produced by carrying out the same reaction using a nucleoside in which the 3'-amino group is phosphoramidite-ized. Further, the compound (a-VII) having m of 1 or more can be produced by repeating the extension process using the compound (a-VII) having m of 0 as a starting material.
  • the nucleic acid a or nucleic acid ⁇ used in the step (1) of the present invention is preferably compound (a-I), compound (a-VI) or compound (a-VII), and more preferably compound (a-i). ), Compound (a-vi) or compound (a-vi), even more preferably compound (ai) or compound (a-vi), and even more preferably compound (ai). Even more preferably, it is compound (a-II) or compound (a-IV), and particularly preferably compound (a-III) or compound (a-V).
  • the 5'-hydroxyl group is protected by a protecting group (temporary protecting group).
  • the hydroxyl-protecting group is not particularly limited as long as it can be deprotected under acidic conditions and is used as a hydroxyl-protecting group.
  • a trityl group and 9- (9-phenyl) xanthenyl are used.
  • 9-phenylthioxanthenyl group bis (C 1-6 alkoxy) trityl group such as 1,1-bis (4-methoxyphenyl) -1-phenylmethyl group (dimethoxytrityl group), 1- (4- (4-methoxyphenyl) Examples thereof include a mono (C 1-18 alkoxy) trityl group such as a methoxyphenyl) -1,1-diphenylmethyl group (monomethoxytrityl group).
  • the temporary protecting group for the hydroxyl group is preferably a monomethoxytrityl group or a dimethoxytrityl group, and more preferably a dimethoxytrityl group.
  • nucleic acid b examples include compounds represented by the following formula (b-I) (that is, nucleosides or oligonucleotides).
  • q indicates an integer greater than or equal to 0;
  • the q + 1 Base 2 each independently represents a nucleobase that may be protected by -LXX and a protecting group selected from the protecting groups used in nucleic acid synthesis;
  • q + 1 X, q + 1 R p1 , q R 10 , L, X and Z are independently synonymous with the above;
  • the q + 1 X n1s independently represent an oxygen atom or NH;
  • Q indicates a temporary protecting group for hydroxyl groups that can be removed under acidic conditions;
  • R 36 and R 37 each independently represent an alkyl group or represent a 5- or 6-membered saturated cyclic amino group formed together with adjacent nitrogen atoms, such saturated cyclic amino group being nitrogen. In addition to the atom, it may have one oxygen atom or one sulfur atom as a ring-constituting atom.
  • R 36 and R 37 are each independently, preferably a C 1-10 alkyl group, or a 5- or 6-membered saturated cyclic amino group formed together with adjacent nitrogen atoms, more preferably. Is a C 1-10 alkyl group, more preferably a C 1-6 alkyl group.
  • Q is preferably a monomethoxytrityl group or a dimethoxytrityl group, and more preferably a dimethoxytrityl group.
  • the amino group of the nucleobase in formula (b-I) is preferably protected by a protecting group.
  • the protecting group include -LXX and a protecting group selected from the protecting groups used for nucleic acid synthesis.
  • the description of L, X and Z is as described above.
  • R 11 represents a methyl group and R 12 and R 13 each independently represent a C 1-5 alkyl group, or R 11 and R 12 may be combined to form a 5- or 6-membered nitrogen-containing hydrocarbon ring with the carbon and nitrogen atoms to which they are attached.
  • Examples of the NC (R 11 ) -N (R 12 ) (R 13 ) group include a 1- (dimethylamino) ethylidene group.
  • the amino group protecting group may be only one kind or two or more kinds.
  • compound (b-I) is a nucleoside, and when q is 1 or more, compound (b-I) is an oligonucleotide.
  • q is preferably 49 or less, more preferably 29 or less, further preferably 19 or less, particularly preferably 4 or less, and most preferably 2 or less.
  • the q + 1 Xs are each independently, preferably a hydrogen atom, a halogen atom, or a hydroxyl group that may be protected, and more preferably a hydrogen atom or a hydroxyl group that may be protected.
  • Base 2 is a nucleobase that may be independently and preferably protected by a protecting group selected from the protecting groups used in nucleic acid synthesis.
  • the q + 1 R p1s are independent groups, preferably CH 2 CH 2 WG.
  • the q + 1 X n1 is preferably an oxygen atom.
  • the description of L, X and Z is as described above.
  • the compound (bi) is preferably a compound represented by the following formula (bi).
  • q + 1 pieces of Base 3 each independently represents a nucleic acid base which may be protected by protecting groups used in nucleic acid synthesis, q, q + 1 X, q + 1 R p1 , q R 10 , Q ", R 36 and R 37 are independently synonymous with the above.]
  • the combination of nucleic acid a or nucleic acid ⁇ and nucleic acid b used in the step (1) of the present invention is Preferably, it is compound (a-I), compound (a-VI) or a combination of compound (a-VII) and compound (b-I). More preferably, it is a compound (ai), a compound (a-vi) or a combination of the compound (a-vi) and the compound (bi). Even more preferably, it is a compound (ai) or a combination of the compound (a-vi) and the compound (bi). More preferably, it is a combination of compound (ai) and compound (bi). Even more preferably, it is a combination of compound (a-II) or compound (a-IV) and compound (bi). Particularly preferred is compound (a-III) or a combination of compound (aV) and compound (bi).
  • the method for producing an oligonucleotide having a phosphorothioation site of the present invention has been described in detail above.
  • This production method is a method for producing an oligonucleotide having a phosphorothioatetization site by extending a nucleic acid chain from the "3'side to the 5'side", which is currently common in the chain extension reaction of a nucleic acid chain in the art.
  • Nucleic acid A is preferably a nucleoside, nucleotide or oligonucleotide in which the 5'-hydroxyl group is unprotected and other groups may be protected by a protective group used in nucleic acid synthesis, but of the present invention.
  • the method for producing an oligonucleotide having a phosphorothioate site is also applied to the production of an oligonucleotide having a phosphorothioate site by extending a nucleic acid chain in the opposite direction "from the 5'side to the 3'side". Can be done.
  • the production of an oligonucleotide having a phosphorothioated site by extending the nucleic acid chain from the "5'side to the 3'side” can be carried out by the method shown below.
  • the 3'position hydroxyl group or the 3'position amino group may not be protected, and other groups may be protected by a protective group used for nucleic acid synthesis, or may be bound to a solid phase carrier.
  • a good nucleoside, nucleotide or oligonucleotide (nucleic acid A-1) (preferably the 3'position in nucleic acid A-1 is a hydroxyl group) and a 5'position hydroxyl group for the formation of a phosphite or phosphite diester.
  • the 3'position hydroxyl group or the 3'position amino group may not be protected, and other groups may be protected by a protective group used for nucleic acid synthesis, or may be bound to a solid phase carrier.
  • a good nucleoside, nucleotide or oligonucleotide (nucleic acid A-1) (preferably the 3'position in nucleic acid A-1 is a hydroxyl group) and a 5'position hydroxyl group for the formation of a phosphite or phosphite diester.
  • a method for producing an oligonucleotide having a phosphorothioated site which comprises a step of reacting the obtained phosphite form or phosphite diester form with a sulfide agent (step (2-1)).
  • the phosphoramidite method, the H-phosphonate method, the dihalophosphine method, and the oxa are used instead of the nucleic acid A-1 having a hydroxyl group at the 3'position and the nucleic acid A-1 having an amino group at the 3'position.
  • a condensate is obtained by applying a method such as the phosphoridine method, the bond between the 3'position and the phosphorus atom becomes an -NP bond instead of the -OP bond.
  • phosphite form or "phosphorous acid diester form” for convenience, as in the case of -OP bond.
  • the corresponding "PO impurities” will also be referred to as “phosphodiesters” or “phosphodiesters” in the same manner.
  • each component such as "antioxidant”, “sulfurizing agent”, “nucleic acid A-1”, and “nucleic acid B-1" in the production method including the above two steps and the detailed reaction conditions of the two steps are described.
  • those skilled in the art can appropriately produce an oligonucleotide having a phosphorothioated site by extending a nucleic acid chain in the "direction from the 5'side to the 3'side”.
  • nucleic acid A Nucleotide, nucleotide or oligonucleotide (hereinafter referred to as "nucleic acid A"). Nucleosides, nucleotides or oligonucleotides in which the 3'-hydroxyl group or 3'-amino group may be unprotected and other groups may be attached to a solid phase carrier used for nucleic acid synthesis. Also included is a method of producing an oligonucleotide having a phosphorothioation site using (nucleic acid A-1).
  • one group of nucleic acid A or nucleic acid A-1 binds to the solid phase carrier.
  • the solid phase support or resin used as the solid phase carrier can be any support known in the art suitable for use in solid phase synthesis.
  • solid phase includes the binding or linking of nucleosides, nucleotides or oligonucleotides to the solid phase support or resin described above via a commonly used functional linker or handle group. Therefore, when we say “solid phase” in this context, we also imply such a linker.
  • solid phases include, for example, polystyrene supports (eg, which may be further functionalized by p-methylbenzyl-hydrylamine), or diatomaceous earth-encapsulated polydimethylacrylamide (pepsin K), silica, or rigid glass such as microporous glass. It is a functional support.
  • the solid-phase resin matrix may be composed of an amphoteric polystyrene-PEG resin or PEG-polyamide or PEG-polyester resin.
  • the solid phase carrier include Wang-PEG resin and Link-amide PEG resin.
  • Piv-TOB 3,4,5-tris (octadecyloxy) benzyl pivalate
  • PADS phenylacetyldisulfide
  • DMTr 4,4'-dimethoxytrityl
  • LC-TOF MS: liquid chromatograph-time-of-flight mass spectrometer
  • DBU 1, 8-Diazabicyclo [5.4.0] -7-Undecene
  • PivCl Pivaloyl Chromalide
  • CMPT N- (Cyanomethyl) Pyrrolidinium Trifurate
  • LNA-A (Bz) -CE Phosphoramidite 5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -N 6 -benzoyl-2'-O, 4'-C-methylene-adenosine-3'-[ O- (2-cyanoethyl)-(N, N-diisopropyl)]-Phosphoramidite
  • dT-H-phosphonate TEA salt 5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -deoxythymidine-3'-H-phosphonate, triethylamine salt
  • HO-T-SUC-TOB Deoxycytidine-3'-yl 3,4,5-tris (octadecyloxy) benzyl succinate HO-C-SUC-TOB: N 4 -benzoyl-deoxycytidine-3'-yl- [ 3,4,5-Tris (octadecyloxy) benzyl] succinate HO-TC-SUC-TOB: deoxythymidine-3'-[O- (2-cyanoethyl)] phosphorothionyl N 4 -benzoyl-deoxycytidine-3'-yl -[3,4,5-Tris (octadecyloxy) benzyl] succinate
  • HO-CmT-SUC-TOB N 4 -benzoyl-2'-O-methyl-citidine-3'-[O- (2-cyanoethyl)] phosphorothionyl deoxythymidine-3'-yl- [3,4,5- tris (octadecyloxy) benzyl] succinate HO-GmCmT-SUC-TOB: N 2 - isobutyryl -2'-O-methyl - guanosine 3 '- [O- (2- cyanoethyl) phosphoryl N 4 - benzoyl-2'- O-Methyl-thymidine 3'-[O- (2-cyanoethyl)] phosphorothionyl deoxythymidine-3'-yl- [3,4,5-tris (octadecyloxy) benzyl] succinate HO-2'-OMe-U- SUC-TOB: 2'-O-methyl-ur
  • the TOB addition compound was synthesized by the method described in International Publication No. 2012/157723. Further, as the phosphoramidite monomer such as 2'-OMe-C-CE phosphoramidite used in Examples and Comparative Examples, a commercially available one was used.
  • Example 1 Synthesis of phosphorothioated 2-5 mer (with antioxidant) HO-T-SUC-TOB (248.2 mg, 0.20 mmol) was placed in a 50 mL two-necked flask under an argon atmosphere, and dehydrated dichloromethane (10.0 mL) and dehydrated acetonitrile (1.0 mL) were added and dissolved. , 2'-OMe-C-CE phosphoramidite (518.5 mg, 0.60 mmol) and methyldiphenylphosphine (37.8 ⁇ L, 0.20 mmol) were added, and the mixture was stirred for 30 minutes.
  • trimer HO-CmT-SUC-TOB 279.6 mg, 0.16 mmol
  • 2'-OMe-C-CE phosphoramidite 419.2 mg, 0.485 mmol
  • a trimer HO-CmCmT-SUC-TOB was synthesized (290.8 mg). When the obtained trimer was analyzed, the PO impurity was 0.25%.
  • Comparative Example 1 Synthesis of phosphorothioated 2 to pentameric (without antioxidant) HO-T-SUC-TOB (247.6 mg, 0.20 mmol) was placed in a 50 mL two-necked flask under an argon atmosphere, and dehydrated dichloromethane (10.0 mL) and dehydrated acetonitrile (1.0 mL) were added and dissolved. , 2'-OMe-C-CE phosphoramidite (518.4 mg, 0.60 mmol) and ETT (5-ethylthio-1H-tetrazole, 78.1 mg, 0.60 mmol) were sequentially added and stirred at room temperature for 1 hour.
  • Example 2 Synthesis of a trimer from a phosphorothioated dimer (with various antioxidants) HO synthesized in the same manner as in Example 1 by using T-CE phosphoramidite instead of 2'-OMe-C-CE phosphoramidite in Example 1 in a 20 mL two-mouthed flask under an argon atmosphere.
  • Comparative Example 2 Synthesis of phosphorothioated dimer to trimer (without antioxidant) The procedure was carried out in the same manner as in Example 2 except that the various antioxidants (0.035 mmol) of Example 2 were not contained. Table 3 shows the results regarding the content ratio of PO impurities.
  • Example 3 Synthesis of phosphorothioated tetramer (phosphoroamidite method) Elongation reaction Under an argon atmosphere, HO-T-SUC-TOB (300 mg, 242 ⁇ mol) and Piv-TOB (450 mg, 451 ⁇ mol) were placed in a 200 mL two-necked flask, and dehydrated dichloromethane (12.1 mL) and dehydrated acetonitrile (3.6 mL) were placed. ) was added and dissolved.
  • triphenylphosphine (31.8 mg, 121 ⁇ mol), LNA-A (Bz) -CE phosphoramidite (644 mg, 727 ⁇ mol) and 5-ethylthio-1H-tetrazole (94.6 mg, 727 ⁇ mol) were sequentially added and 1 at room temperature. Stirred for 0.0 hours. Subsequently, 2,2,2-trifluoroethanol (265 ⁇ L, 3.6 mmol) was added to the reaction solution, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes, followed by 2,6-xylidine (506 ⁇ L, 4.1 mmol) and DDTT (174 mg, 848 ⁇ mol). ) was added sequentially, and the mixture was stirred at room temperature for 1.7 hours.
  • Example 4 Synthesis of phosphorothioated dimer (phosphoroamidite method) Under an argon atmosphere, put HO-C-SUC-TOB (3.0 g, 2.3 mmol) and Piv-TOB (3.0 g, 3 mmol) in a 1000 mL three-necked flask, and dehydrate chloroform (113 mL) and dehydrated acetonitrile (34 mL). was added and dissolved.
  • triphenylphosphine (296 mg, 1.1 mmol), dT-CE phosphoramidite (3.7 g, 5.0 mmol) and 5-ethylthio-1H-tetrazole (648 mg, 5.0 mmol) were added in that order at room temperature. The mixture was stirred for 5 hours. Subsequently, 2,2,2-trifluoroethanol (1.8 mL, 24.9 mmol) was added to the reaction solution, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes, and then 2,6-xylidine (2.2 mL, 17.6 mmol) and POS. (1.2 g, 6.1 mmol) were sequentially added, and the mixture was stirred at room temperature for 1.5 hours.
  • Example 5 Synthesis of phosphorothioated trimers (phosphoroamidite method) Instead of the extension reaction HO-T-SUC-TOB HO- (CH 2) in the same manner as in Example 3 using 2 -SUC-TOB (256mg), HO-A L (CH 2) 2 -SUC-TOB , Subsequently, the dimer HO-C f A L (CH 2 ) 2- SUC-TOB, and finally the trimer HO-rCC f A L (CH 2 ) 2- SUC-TOB was obtained as a white solid. (691 mg) m / z: calcd.
  • Example 6 Synthesis of phosphorothioated 20-mer (phosphoroamidite method) Elongation reaction Using dichloromethane instead of chloroform, the same operation as in Example 4 was repeated 18 times, and the 20-mer DMTrO-A, T, C, G, A, C, T, C, T, C, G, A. -G-C-G-T-T-C-T-C-SUC-TOB (in the formula, ".” Means phosphorothiol bond) was obtained as a white solid. (8.5g) Deprotection reaction The obtained white solid (5 mg) and 28% aqueous ammonia (5 mL) were placed in an autoclave, heated at 65 ° C.
  • the mixture was concentrated under reduced pressure with a centrifugal evaporator. Then, the concentrate was lyophilized and the target product, 5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -deoxyadenosin-3'-phosphorothionyl-deoxythymidine-3'-phosphorothionyl-deoxycytidine-3'-phosphorothionyl.
  • Example 7 Synthesis of phosphorothioated dimer (H-phosphonate method) Under an argon atmosphere, HO-T-SUC-TOB (100 mg, 80.8 ⁇ mol), dTH-phosphonate TEA salt (116.0 mg, 163 ⁇ mol) and triphenylphosphine (10.0 mg, 38 ⁇ mol) were placed in a 50 mL two-necked flask. 1 ⁇ mol) was added, and dehydrated dichloromethane (2.0 mL) and dehydrated pyridine (2.0 mL) were added and dissolved. Then, PivCl (29.5 ⁇ l, 242 ⁇ mol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1.0 hour.
  • Example 8 Synthesis of phosphorothioated dimer (H-phosphonate method) Under an argon atmosphere, HO-T-SUC-TOB (101 mg, 81.3 ⁇ mol), dTH-phosphonate TEA salt (115.4 mg, 163 ⁇ mol) and triphenylphosphine (10.8 mg, 41. Mol) were placed in a 50 mL two-necked flask. 1 ⁇ mol) was added, and dehydrated dichloromethane (2.0 mL) and dehydrated pyridine (2.0 mL) were added and dissolved. Then, PivCl (29.5 ⁇ l, 242 ⁇ mol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1.0 hour.
  • Example 9 Synthesis of phosphorothioated dimer (sulfide: PADS) Under an argon atmosphere, HO-T-SUC-TOB (98.8 mg, 79.6 ⁇ mol) and Piv-TOB (102 mg, 103 ⁇ mol) were placed in a 50 mL two-necked flask, and dehydrated dichloromethane (4.0 mL) and dehydrated acetonitrile (1) were placed. .2 mL) was added and dissolved.
  • HO-T-SUC-TOB 98.8 mg, 79.6 ⁇ mol
  • Piv-TOB 102 mg, 103 ⁇ mol
  • triphenylphosphine (13.2 mg, 50.3 ⁇ mol), 2'-OMe-G-CE phosphoramidite (144 mg, 165 ⁇ mol) and 5-ethylthio-1H-tetrazole (21.2 mg, 163 ⁇ mol) were sequentially added at room temperature.
  • 2,2,2-trifluoroethanol 58.9 ⁇ L, 810 ⁇ mol was added to the reaction solution, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes, followed by 2,6-xylidine (71.2 ⁇ L, 577 ⁇ mol) and bisphenylacetyldisulfide (57.9 ⁇ L, 577 ⁇ mol).
  • Example 10 Synthesis of phosphorothioated dimer (sulfide: xanthan hydride) Under an argon atmosphere, put HO-T-SUC-TOB (96.8 mg, 78.2 ⁇ mol) and Piv-TOB (99.3 mg, 99.5 ⁇ mol) in a 50 mL two-necked flask, and add dehydrated dichloromethane (4.0 mL). Dehydrated acetonitrile (1.2 mL) was added and dissolved.
  • triphenylphosphine (11.5 mg, 43.8 ⁇ mol), 2'-OMe-G-CE phosphoramidite (140 mg, 161 ⁇ mol) and 5-ethylthio-1H-tetrazole (20.9 mg, 161 ⁇ mol) were sequentially added at room temperature.
  • 2,2,2-trifluoroethanol 58.9 ⁇ L, 810 ⁇ mol was added to the reaction solution, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes, followed by 2,6-xylidine (71.2 ⁇ L, 577 ⁇ mol) and xanthan hydride (31.
  • Example 11 Synthesis of phosphorothioated dimer (sulfide: sulfur) Under an argon atmosphere, HO-T-SUC-TOB (101 mg, 81.3 ⁇ mol) and Piv-TOB (98.7 mg, 98.9 ⁇ mol) were placed in a 50 mL two-necked flask, and dehydrated dichloromethane (4.0 mL) and dehydrated acetonitrile were placed. (1.2 mL) was added and dissolved.
  • triphenylphosphine (12.0 mg, 45.8 ⁇ mol), 2'-OMe-G-CE phosphoramidite (141 mg, 162 ⁇ mol) and 5-ethylthio-1H-tetrazole (21.9 mg, 168 ⁇ mol) were sequentially added at room temperature.
  • 2,2,2-trifluoroethanol 58.9 ⁇ L, 810 ⁇ mol was added to the reaction solution, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes, followed by 2,6-xylidine (71.2 ⁇ L, 577 ⁇ mol) and sulfur (13.0 mg). , 405 ⁇ mol) were sequentially added, and the mixture was stirred at room temperature for 1.0 hour.
  • Example 12 Synthesis of phosphorothioated dimer (deprotection: trichloroacetic acid) Under an argon atmosphere, HO-Um-SUC-TOB (102.4 mg, 81.7 ⁇ mol) and Piv-TOB (105 mg, 105 ⁇ mol) were placed in a 50 mL two-necked flask, and dehydrated dichloromethane (4.0 mL) and dehydrated acetonitrile (1) were placed. .2 mL) was added and dissolved.
  • triphenylphosphine (9.8 mg, 37.3 ⁇ mol), dG-CE phosphoramidite (135.1 mg, 161 ⁇ mol) and 5-ethylthio-1H-tetrazole (21.4 mg, 164 ⁇ mol) were sequentially added at room temperature. The mixture was stirred for 0 hours. Subsequently, 2,2,2-trifluoroethanol (58.1 ⁇ L, 797 ⁇ mol) was added to the reaction solution, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes, followed by 2,6-xylidine (118 ⁇ L, 955 ⁇ mol) and DDTT (40.9 mg, 199 ⁇ mol). ) was added sequentially, and the mixture was stirred at room temperature for 1.0 hour.
  • Example 13 Synthesis of phosphorothioated dimer (deprotection: dichloroacetic acid) Under an argon atmosphere, put HO-Um-SUC-TOB (99.6 mg, 79.4 ⁇ mol) and Piv-TOB (97.9 mg, 98.0 ⁇ mol) in a 50 mL two-necked flask, and add dehydrated dichloromethane (4.0 mL). Dehydrated acetonitrile (1.2 mL) was added and dissolved.
  • triphenylphosphine (10.8 mg, 41.1 ⁇ mol), dG-CE phosphoramidite (134.2 mg, 160 ⁇ mol) and 5-ethylthio-1H-tetrazole (20.9 mg, 161 ⁇ mol) were sequentially added at room temperature. The mixture was stirred for 0 hours. Subsequently, 2,2,2-trifluoroethanol (58.1 ⁇ L, 797 ⁇ mol) was added to the reaction solution, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes, followed by 2,6-xylidine (118 ⁇ L, 955 ⁇ mol) and DDTT (40.9 mg, 199 ⁇ mol). ) was added sequentially, and the mixture was stirred at room temperature for 1.0 hour.
  • the coexistence of a specific antioxidant suppresses the by-production of the phosphotriester form or the phosphodiester form (“PO impurity”).
  • This is useful as a method for producing an oligonucleotide having a phosphorothioated site, because the sulfurization reaction can be carried out more efficiently.

Abstract

５'位水酸基が保護されておらず、かつその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよく、もしくは固相担体に結合していてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと、３'位水酸基または３'位アミノ基がホスファイト体または亜リン酸ジエステル体の形成のための方法により修飾されており、かつその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを、酸化防止剤の存在下に縮合させて、ホスファイト体または亜リン酸ジエステル体を得る工程を含む、ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。

Description

ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法
　本発明は、ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法に関するものであり、核酸合成の分野において有用である。
　アンチセンス、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ）、アプタマーなどの核酸医薬品は、抗体医薬品に続く次世代医薬品として注目されている。核酸医薬品は抗体医薬品と同様に高い特異性と有効性が期待される一方で、従来の低分子化合物からなる医薬品と同じく化学合成により製造することができる。新規な核酸医薬の研究・開発に当たって、核酸間の結合部位のリン原子を修飾した修飾核酸の検討が行われてきた。リン原子がＳ化されたホスホロチオエート化部位（ホスホロチオエート核酸間結合部位）を有するタイプの核酸医薬がその代表的なものであり、例えば、ホミビルセン（Ｆｏｍｉｖｉｒｓｅｎ）、ミポメルセン（Ｍｉｐｏｍｅｒｓｅｎ）、オブリメルメルセン（Ｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎ）、アリカホルセン（Ａｌｉｃａｆｏｒｓｅｎ）などが挙げられる。
　ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法として、固相合成（固相法）や液相法があり、さらに固相法と液相法の欠点を解消するため、擬似固相保護基を使用した液相法も開発されている（特許文献１～９）。
国際公開第２０１２／１５７７２３号 国際公開第２０１３／１２２２３６号 国際公開第２０１７／１０４８３６号 国際公開第２００５／０７０８５９号 国際公開第２０１３／１７９４１２号 国際公開第２０１４／０７７２９２号 国際公開第２０１７／０８６３９７号 国際公開第２０１８／２０３５７４号 国際公開第２０１８／２１２２３６号
　ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド合成にあたっては、現在ホスホロアミダイト法やＨ－ホスホネート法などが汎用されており、ジハロホスフィン法やオキサザホスホリジン法も知られている。ホスホロアミダイト法、ジハロホスフィン法およびオキサザホスホリジン法ではホスファイト体を合成し、Ｈ－ホスホネート法では亜リン酸ジエステル体を合成し、各々さらに硫化反応に付して目的物であるホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドを得ることが行われている。ところが、発明者は、検討の結果このような方法に従って合成した場合には、上記ホスファイト体または亜リン酸ジエステル体が生成する段階で、リン原子の酸化反応が併せて進行し、ホスホトリエステル体またはホスホジエステル体（以下、「ＰＯ不純物」と称する場合がある）が副生することにより、その後の硫化反応が阻害され、目的とするホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドを効率良く合成できないという問題点が存在することを新たに見出した。この「ＰＯ不純物」は、本来ホスホロチオエート化部位であるところが酸化されてホスホトリエステル体またはホスホジエステル体になっている不純物である。本発明の課題は、この新たに見出された問題点を解決し、より高収率で目的とするホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドを製造できる方法を提供することである。
　本発明者らは、ホスファイト体の形成のための方法（例えば、ホスホロアミダイト法、ジハロホスフィン法およびオキサザホスホリジン法）を用いてホスファイト体を合成する段階、または亜リン酸ジエステル体の形成のための方法（例えば、Ｈ－ホスホネート法）を用いて亜リン酸ジエステル体を合成する段階で、特定の酸化防止剤を共存させることにより、この新たな課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は以下の通りである。
［１］５’位水酸基が保護されておらず、かつその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよく、もしくは固相担体に結合していてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（以下、「核酸Ａ」と称する場合がある）と、３’位水酸基または３’位アミノ基がホスファイト体または亜リン酸ジエステル体の形成のための方法により修飾されており、かつその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（以下、「核酸Ｂ」と称する場合がある）を、酸化防止剤の存在下に縮合させて、ホスファイト体または亜リン酸ジエステル体を得る工程（工程（１））を含む、ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
［２］核酸Ｂにおいて、３’位水酸基または３’位アミノ基がホスホロアミダイト法、Ｈ－ホスホネート法、ジハロホスフィン法およびオキサザホスホリジン法から選択される方法により修飾されている、上記［１］に記載のホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
［３］さらに、工程（１）で得られたホスファイト体または亜リン酸ジエステル体を硫化剤と反応させる工程（工程（２））を含む、上記［１］又は［２］に記載のホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
［４］（１）５’位水酸基が保護されておらず、かつその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよく、もしくは固相担体に結合していてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（以下、「核酸Ａ」と称する場合がある）と、３’位水酸基または３’位アミノ基がホスホロアミダイト法、Ｈ－ホスホネート法、ジハロホスフィン法およびオキサザホスホリジン法から選択される方法により修飾されており、かつその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（以下、「核酸Ｂ」と称する場合がある）を、酸化防止剤の存在下に縮合させて、ホスファイト体または亜リン酸ジエステル体を得る工程、および
（２）得られたホスファイト体または亜リン酸ジエステル体を硫化剤と反応させる工程、を含む、ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
［５］酸化防止剤が、リン系酸化防止剤、硫黄系酸化防止剤、およびリン・硫黄系酸化防止剤から選択される、上記［１］～［４］のいずれかに記載のホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
［６］酸化防止剤が、
（１）Ｐ－（Ｒ）３　
（２）Ｐ－（ＯＲ）３　
（３）Ｐ（Ｒ）２（ＯＲ）　
（４）ＰＲ（ＯＲ）２　
（５）ＰＨ（Ｏ）（Ｒ）２　
（６）ＰＨ（Ｏ）（ＯＲ）２　、および
（７）ＰＨ（Ｏ）Ｒ（ＯＲ）　
（上記式（１）～（７）中、Ｒは、同じでも異なってもよく、独立して、置換されていてもよいアリール基、または低級アルキル基を表し、２つのＲが互いに結合しそれらが隣接する他の原子と一緒になって環を形成してもよい；
ここで上記酸化防止剤は、同一または異なる酸化防止剤のＲ部分が結合した２量体であってもよい。）
から選択されるリン系酸化防止剤、
（８）Ｒ－Ｓ－Ｒ　、および
（９）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
（上記式（８）、（９）中、Ｒは、同じでも異なってもよく、独立して、低級アルキル基または置換されていてもよいアリール基を表す；
ここで上記酸化防止剤は、同一または異なる酸化防止剤のＲ部分が結合した２量体であってもよい。）
から選択される硫黄系酸化防止剤、および
（１０）（ＯＲ）２Ｐ（Ｓ）－Ｓ－Ｍ－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲ）２
（式中、Ｒは、同じでも異なってもよく、独立して、低級アルキル基または置換されていてもよいアリール基を表し、およびＭは、Ｚｎ、ＮｉまたはＣｕを表す；
ここで上記酸化防止剤は、同一または異なる酸化防止剤のＲ部分が結合した２量体であってもよい。）
で示されるリン・硫黄系酸化防止剤、から選択される、上記［１］～［４］のいずれかに記載のホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
［７］酸化防止剤が、
（１）Ｐ－（Ｒ）３　
（２）Ｐ－（ＯＲ）３　
（３）Ｐ（Ｒ）２（ＯＲ）　
（４）ＰＲ（ＯＲ）２　、および
（５）ＰＨ（Ｏ）Ｒ（ＯＲ）　
（上記式（１）～（５）中、Ｒは、同じでも異なってもよく、独立して、置換されていてもよいアリール基または低級アルキル基を表し、２つのＲが互いに結合しそれらが隣接する他の原子と一緒になって環を形成してもよい；
ここで上記酸化防止剤は、同一または異なる酸化防止剤のＲ部分が結合した２量体であってもよい。）
から選択されるリン系酸化防止剤、および
（６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
（上記式（６）中、Ｒは、同じでも異なってもよく、独立して、低級アルキル基または置換されていてもよいアリール基を表す；
ここで上記酸化防止剤は、同一または異なる酸化防止剤のＲ部分が結合した２量体であってもよい。）
で示される硫黄系酸化防止剤、から選択される、上記［１］～［４］のいずれかに記載のホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
［８］酸化防止剤が、トリフェニルホスフィン、メチルジフェニルホスフィン、亜リン酸トリエチル、エトキシジフェニルホスフィン、ジエトキシフェニルホスフィン、９，１０－ジヒドロ－９－オキサ－１０－ホスファフェナントレン　１０－オキシド（リン系酸化防止剤）；および、イソブチレンスルフィド（硫黄系酸化防止剤）から選択される、上記［１］～［４］のいずれかに記載のホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
［９］酸化防止剤が、リン系酸化防止剤である、上記［１］～［４］のいずれかに記載のホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
［１０］酸化防止剤が、Ｐ－（Ｒ）３で表されるホスフィン類である、上記［１］～［５］のいずれかに記載のホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
［１１］核酸Ａが、５’位水酸基が保護されておらず、かつその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである、上記［１］～［１０］のいずれかに記載のホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
［１２］核酸Ａが、５’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の２’位水酸基、３’位水酸基および３’位アミノ基、並びにデオキシリボース残基の３’位水酸基および３’位アミノ基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基（以下、「擬似固相保護基」と称する場合がある）で保護され、かつその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（以下、「核酸ａ」と称する場合がある）（好ましくは、リボース残基並びにデオキシリボース残基の３’位は水酸基である）、または
５’位水酸基が保護されておらず、３’位末端のリン酸基の一つのＯＨが－ＯＬｎ１－ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示す。）に置き換わっており、－ＯＬｎ１－ＯＨの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、かつその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（以下、「核酸α」と称する場合がある）であり、かつ、核酸Ｂが、３’位水酸基または３’位アミノ基が、ホスファイト体または亜リン酸ジエステル体の形成のための方法（好ましくは、ホスホロアミダイト法、Ｈ－ホスホネート法、ジハロホスフィン法およびオキサザホスホリジン法から選択される方法）により修飾されており、かつ５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、かつその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基（以下、「擬似固相保護基」と称する場合がある）および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（以下、「核酸ｂ」と称する場合がある）である、上記［１］～［１１］のいずれかに記載のホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
［１３］核酸Ｂが、３’位水酸基がホスファイト体または亜リン酸ジエステル体の形成のための方法（好ましくは、ホスホロアミダイト法、Ｈ－ホスホネート法、ジハロホスフィン法およびオキサザホスホリジン法から選択される方法）により修飾されており、かつその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである、上記［１］～［１２］のいずれかに記載のホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
［１４］工程（２）で使用される硫化剤が、５－［（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－チオン（ＤＤＴＴ）、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン－１，１－ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン、フェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）、テトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）、ジペンタメチレンチウラムテトラスルフィド、５－フェニル－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－オン（ＰＯＳ）、３－アミノ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオン（ＡＤＴＴ、キサンタンヒドリド）、Ｎ－［（２－シアノエチル）チオ］フタルイミドおよび硫黄から選択される、上記［３］～［１３］のいずれかに記載のホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
［１５］得られたホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの保護基を全て除去した後、保護されていないホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドを単離する工程をさらに含む、上記［１］～［１４］のいずれかに記載のホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
［１６］（１）３’位水酸基または３’位アミノ基が保護されておらず、かつその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよく、もしくは固相担体に結合していてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（核酸Ａ－１）（好ましくは、核酸Ａ－１における３’位は水酸基である）と、５’位水酸基がホスファイト体または亜リン酸ジエステル体の形成のための方法（好ましくは、ホスホロアミダイト法、Ｈ－ホスホネート法、ジハロホスフィン法およびオキサザホスホリジン法から選択される方法）により修飾されており、かつその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（核酸Ｂ－１）とを、酸化防止剤の存在下に縮合させて、ホスファイト体または亜リン酸ジエステル体を得る工程（工程（１－１））、
を含むホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
［１７］さらに、工程（１－１）で得られたホスファイト体または亜リン酸ジエステル体を硫化剤と反応させる工程（工程（２―１））を含む、
上記［１６］に記載のホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
　本発明によれば、ホスホロアミダイト法、Ｈ－ホスホネート法などの、ホスファイト体または亜リン酸ジエステル体の形成のために当技術分野で広く用いられている方法を用いてホスファイト体または亜リン酸ジエステル体を合成する段階で、特定の酸化防止剤を共存させることによりホスホトリエステル体またはホスホジエステル体（「ＰＯ不純物」）の副生を抑制することができ、これに続く硫化反応をより効率良く行うことができる。この「ＰＯ不純物」は、本来ホスホロチオエート化部位であるところが酸化されてホスホジエステル体に変換されている不純物である。従って、本発明をオリゴヌクレオチド合成における核酸鎖伸長に際して全ての縮合工程、または必要とする縮合工程で実施することにより、目的とするホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドをより高収率で製造することができる。ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造においては、核酸伸長のサイクルを適宜繰り返すことから、塩基伸長毎の反応工程でたとえ１％以下の微量な不純物副生であっても、目的物となるオリゴヌクレオチド伸長体になると不純物が多量になってしまう。そのため、高純度のオリゴヌクレオチドを取得するには各反応単工程の不純物副生を抑制することが肝要であり、「ＰＯ不純物」の副生を抑制する本発明の意義は極めて大きい。
　文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと同様または同等の任意の方法および材料は、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及したすべての刊行物および特許は、例えば、記載された発明に関連して使用されうる刊行物に記載されている、構築物および方法論を記載および開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。
［ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法］
　本発明の製造方法は、以下の工程（１）を含み、さらに工程（２）を含むホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法である。
工程（１）
　５’位水酸基が保護されておらず、かつその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよく、もしくは固相担体に結合していてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（核酸Ａ）と、３’位水酸基または３’位アミノ基がホスファイト体または亜リン酸ジエステル体の形成のための方法（例えば、ホスホロアミダイト法、Ｈ－ホスホネート法、ジハロホスフィン法、およびオキサザホスホリジン法から選択される方法）により修飾されており、かつその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（核酸Ｂ）を、酸化防止剤の存在下に縮合させて、ホスファイト体または亜リン酸ジエステル体を得る工程
工程（２）
　得られたホスファイト体または亜リン酸ジエステル体を硫化剤と反応させる工程
　当技術分野で公知のホスホロアミダイト法などによるヌクレオチド鎖を伸長させる工程において、ホスホロチオエート化部位を導入したい伸長ステップで本発明の上記工程（１）、さらに工程（２）を実施することにより、全ての、または必要な核酸間結合部位を、高収率でホスホロチオエート化することができる。本発明の当該オリゴヌクレオチドの製造方法と核酸合成の分野で通常使用されている核酸間結合部位がホスホトリエステル結合またはホスホジエステル結合であるオリゴヌクレオチドの製造方法（以下「通常のオリゴヌクレオチドの製造方法」と称する場合がある）とを組み合わせ、目的とするホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドに応じてその核酸伸長のサイクルを適宜繰り返すことにより、ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドを伸長させて、目的とするホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドを製造することができる。このような実施態様もまた、本発明の範囲に包含される。
　以下、本発明の上記工程（１）と工程（２）について詳述する。
　上記工程（１）および工程（２）は、固相もしくは液相のいずれの反応条件下でも実施することができるが、液相条件下で実施することがより好ましい。
工程（１）酸化防止剤の存在下での縮合反応
　工程（１）における核酸Ｂの３’位水酸基または３’位アミノ基のホスファイト体または亜リン酸ジエステル体の形成のための修飾は、例えば、ホスホロアミダイト法、Ｈ－ホスホネート法、ジハロホスフィン法、およびオキサザホスホリジン法などから選択される当技術分野で公知の方法により行うことができる。
　これらの方法は、当業者に広く知られており、縮合反応の過程で形成されるホスファイト体または亜リン酸ジエステル体についても、当業者には容易に理解されるものである。
　なお、３’位に水酸基を有する核酸Ｂに代えて、３’位にアミノ基を有する核酸Ｂを用いて、ホスホロアミダイト法、Ｈ－ホスホネート法、ジハロホスフィン法、およびオキサザホスホリジン法などの方法を適用して縮合体を得る場合、３’位とリン原子との結合が、－Ｏ－Ｐ結合に代わって－Ｎ－Ｐ結合となるが、この場合も本明細書中では－Ｏ－Ｐ結合である場合に準じて便宜上「ホスファイト体」または「亜リン酸ジエステル体」と称することとする。また対応する「ＰＯ不純物」についても、同様に「ホスホトリエステル体」または「ホスホジエステル体」と称することとする。
　ここで、核酸Ｂは、３’位水酸基がホスファイト体または亜リン酸ジエステル体の形成のための方法により修飾されており、かつその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである場合が好ましい。
　ホスホロアミダイト法による修飾については、例えば、Ｓ．　Ｌ．　Ｂｅａｕｃａｇｅ，　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｓ　（Ｃｈａｐｔｅｒ　３）　１９９３年，３３－６２頁；Ｍ．　Ｈ．　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１９８７，　１５４，　２８７－３１３；　Ｓ．　Ｌ．　Ｂｅａｕｃａｇｅ　ａｎｄ　Ｍ．　Ｈ．　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１９８１，　２２，　１８５９－１８６２；日本化学会編　第５版　実験化学講座１６　有機化合物ＩＶ　２０１０年　３７７－３８１頁などを参照して実施することができる。
　Ｈ－ホスホネート法を用いる修飾については、例えば、Ｂ．　Ｆ．　Ｆｒｏｅｈｌｅｒ，　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｓ　（Ｃｈａｐｔｅｒ　４）　１９９３年，６３－８０頁；日本化学会編　第５版　実験化学講座１６　有機化合物ＩＶ　２０１０年　３８１－３８４頁などを参照して実施することができる。
　ジハロホスフィン誘導体（ジハロホスフィン法）を用いる修飾については、例えば、日本化学会編　第４版　実験化学講座２２　金属錯体・遷移金属クラスター　１９９９年　４２６－４３１頁などを参照して実施することができる。
　オキサザホスホリジン法を用いる修飾については、例えば、Ｎ．Ｏｋａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００８年，１３０，１６０３１－１６０３７頁；　Ｎ．Ｏｋａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｌｅｔｔｅｒｓ．，２００９年，Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．４，９６７－９７０頁；国際公開第２０１１／０８６８２号などを参照して実施することができる。
　このように３’位水酸基または３’位アミノ基がホスファイト体または亜リン酸ジエステル体の形成のための方法（例えば、ホスホロアミダイト法、Ｈ－ホスホネート法、ジハロホスフィン法、およびオキサザホスホリジン法から選択される方法）により修飾された核酸Ｂは、核酸Ａと酸化防止剤の存在下に縮合させて、対応するホスファイト体または亜リン酸ジエステル体へと導かれる。
　なお、上記のホスファイト体または亜リン酸ジエステル体の形成のための方法には多くの改良法も当技術分野では知られており（例えば、国際公開第２０１４／０１０２５０号参照）、これらも本発明の実施において用いることができる。また、ホスファイト体または亜リン酸ジエステル体の形成のための方法により修飾された核酸Ｂが市販されている場合には、当該市販品を本発明の実施において用いることもできる。
　使用される酸化防止剤とてしては、生成したホスファイト体または亜リン酸ジエステル体のリン原子の酸化によるホスホトリエステル体またはホスホジエステル体（「ＰＯ不純物」）の副生を防止するに十分な酸化防止効果を有するものを選択し、かつ、縮合工程で酸化防止剤が核酸Ｂ（ホスホロアミダイト体やＨ－ホスホネート体等）と反応し、縮合工程自体で悪影響を及ぼさないものを選択することが好ましい。更に、液相条件下での実施で、縮合反応に続く工程（２）を同一反応器内で行うことを企図する場合には、後続する反応に悪影響を及ぼさず、不純物の副生を誘発しないものを選択することが好ましい。このような観点から好ましい酸化防止剤としては、例えば、リン系酸化防止剤、硫黄系酸化防止剤、およびリン・硫黄系酸化防止剤が挙げられる。具体例としては、以下の式で表される酸化防止剤が挙げられる。
　リン系酸化防止剤としては、下記が挙げられる。
（１）Ｐ－（Ｒ）３　（「ホスフィン類」と称する場合がある）
（２）Ｐ－（ＯＲ）３　（「亜リン酸エステル類（ホスファイト類）」と称する場合がある）
（３）Ｐ（Ｒ）２（ＯＲ）　（「亜ホスフィン酸エステル」と称する場合がある）
（４）ＰＲ（ＯＲ）２　（「亜ホスホン酸エステル類」と称する場合がある）
（５）ＰＨ（Ｏ）（Ｒ）２　（「ホスフィンオキシド類」と称する場合がある）
（６）ＰＨ（Ｏ）（ＯＲ）２　（「ホスホン酸エステル類」と称する場合がある）
（７）ＰＨ（Ｏ）Ｒ（ＯＲ）　（「ホスフィン酸エステル類」と称する場合がある）
（上記式（１）～（７）中、Ｒは、同じでも異なってもよく、独立して、置換されていてもよいアリール基または低級アルキル基を表し、２つのＲが互いに結合しそれらが隣接する他の原子と一緒になって環を形成してもよい；
ここで上記酸化防止剤は、同一または異なる酸化防止剤のＲ部分が結合した２量体であってもよい。）
　上記の２量体としては、例えば以下の構造式で示されるものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　本明細書中、「アリール基」としては、「Ｃ６－１４アリール基」が挙げられ、例えば、フェニル、１－ナフチル、２－ナフチル、１－アントリル、２－アントリル、９－アントリルが挙げられる。
　当該「アリール基」は、低級アルキル基、低級アルコキシ基および低級シクロアルキル基から選択される１～３個の置換基で置換されていてもよい（例えば、トルオイル、メトキシフェニル）。
　本明細書中、「低級アルキル」としては、「Ｃ１－６アルキル基」が挙げられ、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１－エチルプロピル、ヘキシル、イソヘキシル、１，１－ジメチルブチル、２，２－ジメチルブチル、３，３－ジメチルブチル、２－エチルブチルが挙げられる。
　本明細書中、「低級アルコキシ基」としては、「Ｃ１－６アルコキシ基」が挙げられ、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシが挙げられる。
　本明細書中、「低級シクロアルキル基」としては、「Ｃ３－１０シクロアルキル基」が挙げられ、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［２．２．２］オクチル、ビシクロ［３．２．１］オクチル、アダマンチルが挙げられる。
　以下の他の酸化防止剤についても、同様である。
　硫黄系酸化防止剤としては、下記が挙げられる。
（８）Ｒ－Ｓ－Ｒ
（９）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
（上記式（８）、（９）中、Ｒは、同じでも異なってもよく、独立して、低級アルキル基または置換されていてもよいアリール基を表す；
ここで上記酸化防止剤は、同一または異なる酸化防止剤のＲ部分が結合した２量体であってもよい。）
　リン・硫黄系酸化防止剤としては、下記が挙げられる。
（１０）（ＯＲ）２Ｐ（Ｓ）－Ｓ－Ｍ－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲ）２
（式中、Ｒは、同じでも異なってもよく、独立して、低級アルキル基または置換されていてもよいアリール基を表し、およびＭは、Ｚｎ、ＮｉまたはＣｕを表す；
ここで上記酸化防止剤は、同一または異なる酸化防止剤のＲ部分が結合した２量体であってもよい。）
　上記の酸化防止剤の中で、より好ましいものとしては、式：Ｐ－（Ｒ）３で表されるホスフィン類、式：Ｐ－（ＯＲ）３で表される亜リン酸エステル（又はホスファイト）類、式：Ｐ（Ｒ）２（ＯＲ）で表される亜ホスフィン酸エステル類、式：ＰＲ（ＯＲ）２で表される亜ホスホン酸エステル類、式：ＰＨ（Ｏ）Ｒ（ＯＲ）で表されるホスフィン酸エステル類、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
で表される硫黄系酸化防止剤が挙げられる。
　式：Ｐ－（Ｒ）３で表されるホスフィン類としては、例えば、トリフェニルホスフィン、メチルジフェニルホスフィンが好ましい。なかでもトリフェニルホスフィンがより好ましい。式：Ｐ－（ＯＲ）３で表される亜リン酸エステル（又はホスファイト）類としては、例えば、亜リン酸トリエチル（Ｐ（ＯＥｔ）３）が好ましい。
　式：Ｐ（Ｒ）２（ＯＲ）で表される亜ホスフィン酸エステル類としては、例えば、エトキシジフェニルホスフィンが好ましい。式：ＰＲ（ＯＲ）２で表される亜ホスホン酸エステル類としては、例えば、ジエトキシフェニルホスフィンが好ましい。
　式：ＰＨ（Ｏ）Ｒ（ＯＲ）で表されるホスフィン酸エステル類としては、例えば、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
で表される９，１０－ジヒドロ－９－オキサ－１０－ホスファフェナントレン　１０－オキシドが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
で表される硫黄系酸化防止剤としては、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
で表されるイソブチレンスルフィドが好ましい。
　酸化防止剤の使用量は、後続の反応への影響を考慮すると少ない程好ましいが、縮合反応に使用される核酸Ａ１モルに対して通常０．１～２モルが好ましく、より好ましくは、０．２～１モルである。
　本工程が液相条件下で行われる場合に使用される溶媒は、核酸Ａ、核酸Ｂ、酸化防止剤などが溶解し、反応に悪影響を及ぼさない溶媒であれば特に限定されないが、例えば、塩化メチレン、アセトニトリル、クロロホルム、テトラヒドロフラン、アセトン、酢酸エチル、ＣＰＭＥ、トルエン、シクロヘキサン、それらの混合溶媒などが挙げられる。中でも、クロロホルム、テトラヒドロフラン、トルエン、塩化メチレン、アセトニトリル、それらの混合溶媒が好ましい。
　本工程で使用する核酸Ａおよび核酸Ｂの溶液中の濃度は、それらが溶媒に溶解していれば特に限定されない。
　核酸Ｂの使用量は、使用される核酸Ａ１モルに対して、１～３モルが好ましく、より好ましくは１．２～２．５モルである。
　本工程の縮合反応を行うに当たっては、活性化剤を添加して実施することができる。例えば、ホスホロアミダイト法の活性化剤としては、当技術分野で汎用されるテトラゾール誘導体（例えば、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）、５－ベンジルチオ－１Ｈ－テトラゾール、など）、イミダゾール誘導体（例えば、４，５－ジシアノイミダゾール、など）などが挙げられる。好ましくは、テトラゾール誘導体であり、より好ましくは、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾールである。Ｈ－ホスホネート法の活性化剤としては、縮合剤のみ、縮合剤および縮合添加剤との組み合わせ、またはピバロイルクロライド等が挙げられる。縮合剤のみとしては、ＨＡＴＵ（Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウム　ヘキサフルオロホスフェート）、ＨＣＴＵ（Ｏ－（１Ｈ－６－クロロベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウム　ヘキサフルオロホスフェート）、Ｐｙｂｏｐ（ヘキサフルオロリン酸（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム）、ＢｏｐＣｌ（ビス(２－オキソ－３－オキサゾリジニル)ホスフィン酸クロリド）、ＴＢＴＵ（Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム　テトラフルオロボレート）、ＨＢＴＵ（２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウム　ヘキサフルオロホスフェート）等が挙げられる。縮合剤および縮合添加剤との組み合わせとしては、ＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、ＷＳＣ・ＨＣｌ）、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）等の縮合剤および、ＨＯＡｔ（１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール）、ＨＯＣｔ（１－ヒドロキシ－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－５－カルボン酸エチルエステル）、ＨＯＢｔ（１－ヒドロキシベンゾトリアゾール）、ＨＯＯＢｔ（３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン）、ＤＭＡＰ（Ｎ，Ｎ－ジメチル－４－アミノピリジン）等の縮合添加剤との組み合わせが挙げられる。
　本工程の縮合反応の反応温度は、反応が進行しさえすれば特に限定されないが、－１０℃～６０℃が好ましく、５℃～３５℃がより好ましい。反応時間は、使用するオリゴヌクレオチドの種類、酸化防止剤の種類および溶媒の種類、反応温度等により異なるが、例えば５分～２４時間である。
　本工程は、例えば、核酸Ａを溶解した溶液に、核酸Ｂと酸化防止剤を添加した後、活性化剤を添加することにより行うことができるが、これは一実施態様であり、本発明はこの態様に限定されるものではない。
　本発明では、工程（２）の際の副生成物の生成を抑制するために、工程（２）の前にホスホロアミダイト法などにより活性化された核酸Ｂをクエンチする工程をさらに含むことができる。
　クエンチ剤としては、当技術分野で公知のものを、本工程におけるクエンチ剤として使用することができる。クエンチ剤は、１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。クエンチ剤としては、例えば、アルコール類（例えば、メタノール、２－プロパノール、ｔ－ブタノール、２，２，２，－トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）、テトラヒドロフルフリルアルコール、フルフリルアルコール、２，３－Ｏ－イソプロピリデン－Ｄ－リボフラノース、３’－Ｏ－トリイソプロピルシリル－チミジン等のハロゲン化されていてもよい１価アルコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール等のハロゲン化されていてもよい多価アルコール、など）、フェノール類（例えば、４－ニトロフェノールやペンタフルオロフェノール、など）およびアミン類（例えば、モルホリン、など）が挙げられる。
　クエンチ剤は、好ましくは、アルコール類およびアミン類から選ばれる少なくとも一つであり、より好ましくはメタノール、２－プロパノール、ｔ－ブタノール、２，２，２－トリフルオロエタノール、テトラヒドロフルフリルアルコール、およびモルホリンから選ばれる少なくとも一つである。なかでも、２，２，２－トリフルオロエタノールが好ましい。
　本工程におけるクエンチ剤の使用量は、工程（１）における核酸Ｂの使用量１モルに対して、好ましくは１～２０モル、より好ましくは１～１５モル、さらに好ましくは１～１０モルである。
　クエンチ剤の添加後の反応液の温度は、核酸Ｂがクエンチできさえすれば特に限定されないが、５℃～４０℃が好ましく、１５℃～３０℃がより好ましい。
工程（２）硫化剤による硫化反応
　本工程に使用する硫化剤としては、ホスファイト結合または亜リン酸ジエステル結合を、ホスホロチオエート結合に変換しうる能力がありさえすれば、特に限定されないが、５－［（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－チオン（ＤＤＴＴ）、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン－１，１－ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン、フェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）、テトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）、ジペンタメチレンチウラムテトラスルフィド、５－フェニル－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－オン（ＰＯＳ）、３－アミノ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオン（ＡＤＴＴ、キサンタンヒドリド）、硫黄、シアノエチルメチルチオスルホネート、Ｎ－［（２－シアノエチル）チオ］コハク酸イミド、Ｎ－［（２－シアノエチル）チオ］モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－［（２－シアノエチル）チオ］フタルイミドが好ましい。
　良好な反応が進行しうるという観点で、５－［（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－チオン（ＤＤＴＴ）、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン－１，１－ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン、フェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）、５－フェニル－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－オン（ＰＯＳ）、シアノエチルメチルチオスルホネート、Ｎ－［（２－シアノエチル）チオ］フタルイミドがより好ましく、５－［（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－チオン（ＤＤＴＴ）、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン－１，１－ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）、５－フェニル－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－オン（ＰＯＳ）シアノエチルメチルチオスルホネート、Ｎ－［（２－シアノエチル）チオ］フタルイミドがさらに好ましく、５－［（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－チオン（ＤＤＴＴ）、５－フェニル－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－オン（ＰＯＳ）、シアノエチルメチルチオスルホネート、Ｎ－［（２－シアノエチル）チオ］フタルイミドが特に好ましい。かかる硫化剤は、０．０５～２Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することができる。かかる希釈溶媒としては、反応に不活性な溶媒であれば特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、ピリジンまたはこれら任意の混合溶媒が挙げられる。
　硫化剤の使用量は、工程（１）における核酸Ａの使用量１モルに対して、例えば１～５０モル、好ましくは１～５モルである。
　反応温度は、反応が進行しさえすれば特に限定されないが、０℃～６０℃が好ましく、１０℃～４０℃がより好ましい。反応時間は、ホスファイト体または亜リン酸ジエステル体の種類、使用する硫化剤の種類、反応温度等によって異なるが、例えば１分～３時間である。
　工程（２）の硫化剤による硫化反応は、工程（１）の酸化防止剤の存在下での縮合反応ごとにその都度行ってもよく、あるいは何回かの工程（１）の酸化防止剤の存在下での縮合反応によりヌクレオシド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドが伸長した後にまとめて行ってもよい。当業者であれば、用いるホスファイト体または亜リン酸ジエステル体の形成のための方法等の反応条件に応じて、適宜選択して本発明を実施することができる。
　以上の工程（１）および／または工程（２）は、核酸Ｂの５’位の水酸基の保護基の有無にかかわらず実施することが可能であり、例えば、工程（１）の後に後述の分離工程を実施することもでき、あるいは、工程（１）に続けて工程（２）、さらに後述の分離工程を実施することも可能である。このように核酸の伸長工程において、核酸Ｂの５’位の水酸基が保護されている場合においては保護基の脱保護は任意の工程であり、適宜合成計画に従って行うことができる。
　以上、本発明の工程（１）と工程（２）について詳述した。本発明を実施することにより従来法の欠点が改善され、より効率良く目的とするホスホロチオエート化部位をオリゴヌクレオチドの核酸間結合に導入することができる。本発明は、ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法として優れたものである。
　本発明を実施するに当たっては、当技術分野でオリゴヌクレオチドの製造過程で必要により実施される以下の諸工程も併せて実施することができる。
　なお、各工程は、工程ごとに生成物を単離してから次の工程を実施することも可能であり、あるいは、各工程を適宜連続して実施することも可能である。
［脱保護工程］
　本工程は、工程（２）で得られたホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの５’位水酸基の保護基を酸によって除去し、５’位水酸基が保護されていないホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドを得る工程となる。本工程は、当技術分野で通常行われる方法により行うことができる（例えば、国際公開第２０１２／１５７７２３号、国際公開第２０１３／１２２２３６号、国際公開第２０１７／１０４８３６号参照）。
［中和工程］
　上記脱保護工程の後に、使用した酸を中和するため、反応液に塩基を添加してもよい。但し、本発明の製造方法では、必要に応じて、後述の［固液分離または抽出］および洗浄を行うことによって、脱保護工程で使用した酸を反応系から除去することが可能である。そのため、当該中和工程は必須ではない。本工程は、当技術分野で通常行われる方法により行うことができる（例えば、国際公開第２０１２／１５７７２３号、国際公開第２０１３／１２２２３６号、国際公開第２０１７／１０４８３６号参照）。
［固液分離または抽出工程］
　本工程は、上記で得られた５’位水酸基が保護されていないホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドのいずれかの基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基（擬似固相保護基）で保護されている場合に、当該オリゴヌクレオチドを含む反応液に極性溶媒を添加し、当該オリゴヌクレオチドを沈殿させて精製するか（固液分離）、または反応液に極性溶媒を添加し、極性溶媒－非極性溶媒間で分層させ、非極性溶媒層に当該オリゴヌクレオチドを移行させて精製する（抽出）工程である。本工程は、例えば、国際公開第２０１２／１５７７２３号、国際公開第２０１３／１２２２３６号、国際公開第２０１７／１０４８３６号に詳述された方法により行うことができる。
　工程（２）で得られたホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドが最終的に目的とする核酸配列を有するものである場合には、続けて「脱保護工程」および「単離工程」に付すことができる。すなわち、工程（２）で得られたホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの保護基を全て除去した後、保護されていないホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドを単離する工程をさらに含むことができる。本工程は、例えば、国際公開第２０１２／１５７７２３号、国際公開第２０１３／１２２２３６号、国際公開第２０１７／１０４８３６号に詳述された方法により行うことができる。
　上記各工程における反応の進行の確認は、いずれも一般的な液相有機合成反応と同様の方法を適用できる。即ち、薄層シリカゲルクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を用いて反応を追跡することができる。
　以上、本発明の工程（１）および工程（２）を詳述し、核酸伸長の過程で目的とする部位に効率良くホスホロチオエート化部位を導入できる方法について説明した。本発明の特徴は、ホスホロチオエート化部位の導入に当たって、特定の酸化防止剤の存在下に、適宜保護された核酸Ａと核酸Ｂとの間で縮合反応を行う点にあり、この特徴を活用できる限り、本発明の製造方法は、核酸の構造などを問わず、適宜保護されたヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ホスホロチオエート化部位を有していてもよい）に広く適用することができる。本発明で製造されるオリゴヌクレオチドは、全てのリン原子がＳ化されたホスホロチオエート化部位となるオリゴヌクレオチド（Ａｌｌ　ＰＳ体）のみならず、特定の一部リン原子のみＳ化されたホスホロチオエート化部位を有し、残りのリン原子はＳ化されていないホスフェートであるオリゴヌクレオチド（Ｍｉｘｅｄ　Ｂａｃｋｂｏｎｅ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（一般に、「ＭＢＯ」と称する場合がある））も含む。
　以下、本発明の製造方法が適用される、核酸Ａおよび核酸Ｂについて詳述する。
　本発明の製造方法が適用される一つの態様では、
核酸Ａが、５’位水酸基が保護されておらず、かつその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよく、もしくは固相担体に結合していてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドであり、
核酸Ｂが、３’位水酸基または３’位アミノ基がホスファイト体または亜リン酸ジエステル体の形成のための方法（例えば、ホスホロアミダイト法、Ｈ－ホスホネート法、ジハロホスフィン法、およびオキサザホスホリジン法から選択される方法）により修飾されており、かつその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである。
　ここにおいてより好ましい態様では、核酸Ｂが、３’位水酸基がホスファイト体または亜リン酸ジエステル体の形成のための方法により修飾されており、かつその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである。
　本明細書において、オリゴヌクレオチドの構成単位となる「ヌクレオシド」とは、核酸塩基が糖（例えば、２－デオキシリボース、リボース、２位炭素原子および４位炭素原子が２価の有機基により結合された２－デオキシリボースまたはリボースなど）の１位にＮ－グリコシド化により結合された化合物を意味する。
　本明細書における「糖」は、水酸基がアミノ基に置き換わったアミノ糖、および２位水酸基がハロゲン原子に置き換わったリボースや分子内で架橋する構造を有するリボース（ＬＮＡ；ＢＮＡ）も包含する。
　２位炭素原子および４位炭素原子が２価の有機基により結合された２－デオキシリボースまたはリボースとしては、例えば、以下の化合物が挙げられる。
　下記式中、Ｒは水素原子、置換または無置換の炭化水素基、置換または無置換の水酸基、置換または無置換のアミノ基のいずれかを示し、Ｒ’は、水素原子、水酸基のいずれかを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　アミノ糖としては、例えば、以下に示すような３位水酸基がアミノ基に置き換わった２－デオキシリボース、３位水酸基がアミノ基に置き換わったリボース、および３位水酸基がアミノ基に、２位水酸基がハロゲンに置き換わったリボースが挙げられる（下記式中、Ｘｓはハロゲン原子を示す。）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　本明細書中、「リン酸基」は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２だけでなく、酸素原子が硫黄原子またはＮＨに置き換わった基（例えば、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）２、－ＮＨ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、－ＮＨ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）２）も包含する。また、リン酸基中の水酸基（－ＯＨ）が－ＯＲｐ（式中、Ｒｐは、リン酸基の保護基などの有機基を示す）に置き換わった基（例えば、保護されたリン酸基）も、「リン酸基」に包含される。
　本明細書中、「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドにリン酸基が結合した化合物を意味する。３’位水酸基または５’位水酸基がリン酸基に置き換わったヌクレオチドとしては、例えば、下記式に示す化合物が挙げられる（下記式中、Ｒｍ１およびＲｍ２は、それぞれ独立して、水素原子または有機基（但し、ヌクレオシド残基を除く）を示し、Ｘｍは、水素原子、水酸基またはハロゲン原子を示し、Ｒ１およびＲ２は、水素原子またはアルキル基を示し、Ｒ１およびＲ２は互いに結合してそれらが隣接する他の原子と一緒になって５または６員環を形成してもよく、Ｒ３およびＲ４は、水素原子またはフェニル基を示す）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　３’位水酸基または５’位水酸基がリン酸基に置き換わったヌクレオチドとしては、例えば、下記式（Ｉ’）、（ＩＩ’）および（ＩＩＩ’）に示すものが別の好ましいものとして挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
［上記式（Ｉ’）、（ＩＩ’）および（ＩＩＩ’）中において、
＊は３’位水酸基または３’位アミノ基との結合位置を示し；
Ｌ７は、－Ｏ－または－Ｓ－を示し；
Ｌ８は、－Ｌ－Ｏ－、－Ｌ－Ｓ－、－Ｌ－Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）－Ｏ－、－Ｌ－Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）－Ｓ－、－Ｌｓ－Ｏ－または－Ｌｓ－Ｓ－を示し；
環Ａは、置換されていてもよい、酸素、窒素、硫黄、リンおよびケイ素から独立して選ばれる０～１０個のヘテロ原子を有する、３～２０員の、単環式、二環式または多環式の環を示し；
環Ａ’は、置換されていてもよい、酸素、窒素、硫黄、リンおよびケイ素から独立して選ばれる１～１０個のヘテロ原子を有する、３～２０員の、単環式、二環式または多環式の環であって、－Ｎ（Ｒ６）－部分を含む環を示し；
Ｌは、共有結合、または置換されていてもよいＣ１－６アルキレンを示し、ここで、１以上のメチレン単位は、独立して、－Ｌ’－で置き換えられてもよく；
各Ｌ’は、独立して、共有結合、置換されていてもよい二価のＣ１－３アルキレン、－Ｃ（Ｒ３）（Ｒ４）－、－Ｃ（Ｒ３）（Ｒ４）－Ｃ（Ｒ３）（Ｒ４）－、－Ｃｙ－または－Ｃ（Ｒ３）［Ｃ（Ｒ４）３］－を示し；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、独立して、水素、－Ｌｓ－Ｒ、ハロゲン、－ＣＮ、－ＮＯ２、－Ｌｓ－Ｓｉ（Ｒ）３、－ＯＲ、－ＳＲまたは－Ｎ（Ｒ）２を示し；
各Ｌｓは、独立して、共有結合であるか、またはＣ１－３０脂肪族基、および酸素、窒素、硫黄、リンおよびケイ素から独立して選ばれる１～１０個のヘテロ原子を有するＣ１－３０ヘテロ脂肪族基から選ばれる、置換されていてもよい二価の直鎖または分枝鎖の基を示し、ここで、１以上のメチレン単位は、独立して、Ｃ１－６アルキレン、Ｃ１－６アルケニレン、－Ｃ≡Ｃ－、酸素、窒素、硫黄、リンおよびケイ素から独立して選ばれる１～５個のヘテロ原子を有する二価のＣ１－Ｃ６ヘテロ脂肪族基、－Ｃ（Ｒ’）２－、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ’）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（ＮＲ’）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ’）－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＳＲ’）－、－Ｐ（Ｏ）（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’）－、－Ｐ（Ｓ）（ＯＲ’）－、－Ｐ（Ｓ）（ＳＲ’）－、－Ｐ（Ｓ）（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｓ）（ＮＲ’）－、－Ｐ（Ｒ’）－、－Ｐ（ＯＲ’）－、－Ｐ（ＳＲ’）－、－Ｐ（ＮＲ’）－、－Ｐ（ＯＲ’）［Ｂ（Ｒ’）３］－、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－ＯＰ（Ｏ）（ＳＲ’）Ｏ－、－ＯＰ（Ｏ）（Ｒ’）Ｏ－、－ＯＰ（Ｏ）（ＮＲ’）Ｏ－、－ＯＰ（ＯＲ’）Ｏ－、－ＯＰ（ＳＲ’）Ｏ－、－ＯＰ（ＮＲ’）Ｏ－、－ＯＰ（Ｒ’）Ｏ－および－ＯＰ（ＯＲ’）［Ｂ（Ｒ’）３］Ｏ－から選ばれる、置換されていてもよい基で置き換えられてもよく、そして１以上の炭素原子は、独立して、ＣｙＬで置き換えられてもよく；
各－Ｃｙ－は、独立して、Ｃ３－２０脂環式環、Ｃ６－２０アリール環、酸素、窒素、硫黄、リンおよびケイ素から独立して選ばれる１～１０個のヘテロ原子を有する５～２０員のヘテロアリール環、および酸素、窒素、硫黄、リンおよびケイ素から独立して選ばれる１～１０個のヘテロ原子を有する３～２０員のヘテロシクリル環から選ばれる、置換されていてもよい二価の基を示し；
各ＣｙＬは、独立して、Ｃ３－２０脂環式環、Ｃ６－２０アリール環、酸素、窒素、硫黄、リンおよびケイ素から独立して選ばれる１～１０個のヘテロ原子を有する５～２０員のヘテロアリール環、および酸素、窒素、硫黄、リンおよびケイ素から独立して選ばれる１～１０個のヘテロ原子を有する３～２０員のヘテロシクリル環から選ばれる、置換されていてもよい四価の基を示し；
各Ｒ’は、独立して、－Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｒ、－ＣＯ２Ｒまたは－ＳＯ２Ｒを示し；
ｔは、０～２０を示し；
Ｒ６は、Ｒ’を示し；
Ｒ７は、－ＯＨまたは－ＳＨを示し；
Ｒ８は、－Ｌ－Ｒ７、－Ｌ－Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）－Ｒ７または－Ｌｓ－Ｒ７を示し；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つは、水素ではなく；
各Ｒは、独立して、水素、またはＣ１－３０脂肪族基、酸素、窒素、硫黄、リンおよびケイ素から独立して選ばれる１～１０個のヘテロ原子を有するＣ１－３０ヘテロ脂肪族基、Ｃ６－３０アリール基、Ｃ６－３０アリール脂肪族基、酸素、窒素、硫黄、リンおよびケイ素から独立して選ばれる１～１０個のヘテロ原子を有するＣ６－３０アリールヘテロ脂肪族基、酸素、窒素、硫黄、リンおよびケイ素から独立して選ばれる１～１０個のヘテロ原子を有する５～３０員のヘテロアリール基、および酸素、窒素、硫黄、リンおよびケイ素から独立して選ばれる１～１０個のヘテロ原子を有する３～３０員のヘテロシクリル基から選ばれる、置換されていてもよい基を示すか、あるいは２つのＲ基は、独立して、一緒になって共有結合を形成してもよく；あるいは
同一原子上の２個以上のＲは、独立して、当該原子と一緒になって、当該原子に加えて、酸素、窒素、硫黄、リンおよびケイ素から独立して選ばれる０～１０個のヘテロ原子を有する、置換されていてもよい、３～３０員の、単環式、二環式または多環式の環を形成してもよく；あるいは
２個以上の原子上の２個以上のＲ基は、独立して、介在している原子と一緒になって、介在している原子に加えて、酸素、窒素、硫黄、リンおよびケイ素から独立して選ばれる０～１０個のヘテロ原子を有する、置換されていてもよい、３～３０員の、単環式、二環式または多環式の環を形成してもよい。
但し、Ｒ１とＲ２は同一ではなく、Ｒ３とＲ４は同一ではない。］
　本明細書中、「オリゴヌクレオチド」とは、ヌクレオシドにヌクレオチドが１個以上連結した化合物を意味する。なお、特に断らない場合、「オリゴヌクレオチド」には、リン酸基の酸素原子が硫黄原子に置き換わったホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチド、リン酸基の－Ｏ－が－ＮＨ－に置き換わったオリゴヌクレオチド、リン酸基中の水酸基（－ＯＨ）が－ＯＲｐ（式中、Ｒｐは有機基を示す）に置き換わったオリゴヌクレオチドも包含される。本発明におけるオリゴヌクレオチドのヌクレオシドの数は特に限定されないが、好ましくは３～５０、より好ましくは５～３０である。
　本明細書中、「３’位アミノ基」とは、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの３’位の炭素原子に結合したアミノ基を意味する。
　本明細書中、「５’位アミノ基」とは、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’位の炭素原子に結合したアミノ基を意味する。
　本明細書中、「３’位リン酸基」とは、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの３’位の炭素原子に結合したリン酸基を意味する。
　本明細書中、「５’位リン酸基」とは、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’位の炭素原子に結合したリン酸基を意味する。
　本明細書中、「核酸塩基」とは、核酸の合成に使用されるものであれば特に制限されず、例えば、シトシル基、ウラシル基、チミニル基等のピリミジン塩基、アデニル基、グアニル基等のプリン塩基を挙げることができる。核酸塩基には、上記した基の他に、核酸塩基が任意の置換基（例えば、ハロゲン原子、アルキル基、アラルキル基、アルコキシ基、アシル基、アルコキシアルキル基、水酸基、アミノ基、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ等）により任意の位置に１～３個置換されている修飾核酸塩基（例えば、８－ブロモアデニル基、８－ブロモグアニル基、５－ブロモシトシル基、５－ヨードシトシル基、５－ブロモウラシル基、５－ヨードウラシル基、５－フルオロウラシル基、５－メチルシトシル基、８－オキソグアニル基、ヒポキサンチニル基等）も包含される。
また、「保護されていてもよい核酸塩基」とは、例えば、アミノ基を有する核酸塩基であるアデニル基、グアニル基、またはシトシル基において、アミノ基が後述の「アミノ基の保護基」により保護されていてもよいことを意味し、核酸塩基のアミノ基が、ヌクレオチドの５’位の脱保護条件に耐え得る保護基により保護されている核酸塩基が好ましい。
　本明細書において「核酸合成に用いられる保護基」は、核酸合成の分野で通常使用されるものであれば特に制限されないが、例えば以下のものが挙げられる。
１）水酸基の保護基（核酸塩基部の水酸基の保護基は、後述の核酸塩基部の保護基に記載する）
　特に断らない限り、「水酸基の保護基」としては、特に限定されず、例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ　ＧＲＯＵＰＳ　ＩＮ　ＯＲＧＡＮＩＣ　ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第３版、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（ＪＯＨＮ　ＷＩＬＬＹ＆ＳＯＮＳ）出版（１９９９年）等に記載されている任意の保護基を挙げることができる。具体的には、メチル基、ベンジル基、ｐ－メトキシベンジル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、メトキシメチル基、メトキシエチル基、２－テトラヒドロピラニル基、エトキシエチル基、シアノエチル基、シアノエトキシメチル基、フェニルカルバモイル基、１，１－ジオキソチオモルホリン－４－チオカルバモイル基、アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル（Ｔｏｍ）基、１－（４－クロロフェニル）－４－エトキシピペリジン－４－イル（Ｃｐｅｐ）基等を挙げることができる。保護されていてもよい水酸基の保護基は、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、またはｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基であることが好ましく、経済性および入手の容易さの観点から、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基であることが特に好ましい。
２）アミノ基の保護基　
　特に断らない限り、「アミノ基の保護基」としては、特に限定されず、例えば、グリーンズ・プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ　ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ　ＧＲＯＵＰＳ　ｉｎ　ＯＲＧＡＮＩＣ　ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第４版、ウィリー・インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）出版（２００６年）等に記載されている保護基を挙げることができる。該保護基の具体例としては、ピバロイル基、ピバロイロキシメチル基、アセチル基、トリフルオロアセチル基、フェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、（２－ヘキシル）デカノイル基、ジメチルホルムアミジニル基、１－（ジメチルアミノ）エチリデン基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基を挙げることができる。これらの中でも、アセチル基、フェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、（２－ヘキシル）デカノイル基、ジメチルホルムアミジニル基、および１－（ジメチルアミノ）エチリデン基が好ましい。
３）核酸塩基の保護基
　アミノ基を有する核酸塩基であるアデニル基、グアニル基、またはシトシル基において、アミノ基は前述の「アミノ基の保護基」により保護されていてもよい。核酸塩基のアミノ基が、ヌクレオチドの５’位の脱保護条件に耐え得る保護基により保護されている核酸塩基が好ましい。
　核酸塩基のカルボニル基も保護されていてもよい。例えば、フェノール、２，５－ジクロロフェノール、３－クロロフェノール、３，５－ジクロロフェノール、２－ホルミルフェノール、２－ナフトール、４－メトキシフェノール、４－クロロフェノール、２－ニトロフェノール、４－ニトロフェノール、４－アセチルアミノフェノール、ペンタフルオロフェノール、４－ピバロイロキシベンジルアルコール、４－ニトロフェネチルアルコール、２－（メチルスルホニル）エタノール、２－（フェニルスルホニル）エタノール、２－シアノエタノール、２－（トリメチルシリル）エタノール、ジメチルカルバミン酸クロライド、ジエチルカルバミン酸クロライド、エチルフェニルカルバミン酸クロライド、１－ピロリジンカルボン酸クロライド、４－モルホリンカルボン酸クロライド、ジフェニルカルバミン酸クロライド等を反応させて、核酸塩基のカルボニル基を保護することができる。ここで、カルボニル基の保護基については、特に導入しなくてもよい場合がある。
　本発明の製造方法が適用されるより好ましい態様は、
核酸Ａが、５’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の２’位水酸基、３’位水酸基および３’位アミノ基、並びにデオキシリボース残基の３’位水酸基および３’位アミノ基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基（擬似固相保護基）で保護され、かつその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（以下、「核酸ａ」と称する場合がある）、または
５’位水酸基が保護されておらず、３’位末端のリン酸基の一つのＯＨが－ＯＬｎ１－ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示す。）に置き換わっており、－ＯＬｎ１－ＯＨの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基（擬似固相保護基）で保護され、かつその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（以下、「核酸α」と称する場合がある）であり、
核酸Ｂが、３’位水酸基または３’位アミノ基がホスホロアミダイト法、Ｈ－ホスホネート法、ジハロホスフィン法、およびオキサザホスホリジン法から選択される方法により修飾されており、かつ５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、かつその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基（擬似固相保護基）および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（以下、「核酸ｂ」と称する場合がある）である。　
　核酸ａ、核酸αおよび核酸ｂにおける「核酸合成に用いられる保護基」としては、核酸Ａおよび核酸Ｂについて上記で説明されたものと同じ保護基を挙げることができる。
　核酸ａ、核酸αおよび核酸ｂにおける「酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基（擬似固相保護基）」としては、それぞれ独立して、炭素数１０以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基を有するか、または分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基を有する保護基が挙げられる。擬似固相保護基は、核酸ａ、核酸α、核酸ｂ、および工程（１）および工程（２）により得られたホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドに疎水性を付与して、非極性溶媒に対する溶解性を向上させる。また極性溶媒に対する溶解性を低下させることもできる。このような擬似固相保護基で保護されたヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、非極性溶媒の液相中でも縮合反応を行うことができ（工程（１））、工程（２）で得られた反応液に極性溶媒を添加することによって、擬似固相保護基で保護されたホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドが沈殿し、その固液分離を行うことができる。または工程（２）で得られた反応液に極性溶媒を添加して、極性溶媒－非極性溶媒間で分層させ、非極性溶媒にホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドを移行させることにより、その抽出を行うことができる。このような擬似固相保護基としては、例えば、国際公開第２０１２／１５７７２３号、国際公開第２０１３／１２２２３６号、国際公開第２０１７／１０４８３６号、国際公開第２０１３／１７９４１２号、国際公開第２０１４／０７７２９２号、国際公開第２０１７／０８６３９７号に記載されているものを使用することができる。
　「核酸合成に用いられる保護基」は、核酸合成の分野で通常使用されるものであれば特に制限されず、上記の低分子量の保護基も含まれるが、工程（２）の後で固液分離による精製を行う場合、擬似固相保護基は、炭素数１０以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基を有する保護基であることが好ましく、工程（２）の後で抽出による精製を行う場合、擬似固相保護基は、分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基を有する保護基であることが好ましい。
　まず、固液分離のために好適な擬似固相保護基について説明する。固液分離のために好適な擬似固相保護基としては、例えば、炭素数１０以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基がリンカーを介して結合したＣ６－１４炭化水素環を有する保護基が挙げられる。
　前記炭素数１０以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基は、好ましくは直鎖状のＣ１０－４０アルキル基および直鎖状のＣ１０－４０アルケニル基から選ばれる基であり、より好ましくは直鎖状のＣ１０－４０アルキル基であり、さらに好ましくは直鎖状のＣ１０－３０アルキル基であり、特に好ましくは直鎖状のＣ１２－２８アルキル基であり、最も好ましくは直鎖状のＣ１４－２６アルキル基である。
　前記リンカーは、好ましくは－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）－、－Ｓ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、および－Ｓｉ（Ｒ’）（Ｒ”）Ｏ－、－Ｓｉ（Ｒ’）（Ｒ”）－（Ｒ’、Ｒ”は、それぞれ独立して、水素原子またはＣ１－２２炭化水素基を示す。）から選ばれ、より好ましくは－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－および－ＮＨＣ（＝Ｏ）－から選ばれ、より好ましくは－Ｏ－である。
　前記Ｃ６－１４炭化水素環は、好ましくはベンゼン環、ナフタレン環およびシクロヘキサン環から選ばれ、より好ましくはベンゼン環およびシクロヘキサン環から選ばれ、さらに好ましくはベンゼン環である。
　固液分離のために好適な擬似固相保護基は、好ましくは、直鎖状のＣ１０－４０アルキル基が単結合または－Ｏ－を介して結合した炭化水素基が－Ｏ－を介して結合したベンゼン環を有する保護基である。
　次に、抽出のために好適な擬似固相保護基について説明する。「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基」における「分岐鎖」としては、直鎖状または分岐鎖状の飽和脂肪族炭化水素基であり、Ｃ１－６アルキル基が好ましく、Ｃ１－４アルキル基がより好ましく、メチル基またはエチル基が一層好ましい。また、該「分岐鎖」は、１個以上のハロゲン原子で置換されていてもよい。
　「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基」における「脂肪族炭化水素基」とは、直鎖状の飽和または不飽和の脂肪族炭化水素基であり、Ｃ２－３００アルキル基（好ましくは、Ｃ３－１００アルキル基、より好ましくは、Ｃ３－６０アルキル基）、Ｃ２－３００アルケニル基（好ましくは、Ｃ３－１００アルケニル基、より好ましくは、Ｃ３－６０アルケニル基）またはＣ２－３００アルキニル基（好ましくは、Ｃ３－１００アルキニル基、より好ましくは、Ｃ３－６０アルキニル基）である。
　「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基」における「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基」の部位は、特に限定されず、末端に存在しても（１価基）、それ以外の部位に存在してもよい（例えば２価基）。
　「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基」としては、例えば、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基（ラウリル基）、トリデシル基、ミリスチル基、セチル基、ステアリル基、アラキル基、ベヘニル基、オレイル基、リノリル基、リグノセリル基等の分岐異性体であって、１以上の分岐鎖を有する１価基およびそれらから誘導される２価基が挙げられる。「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基」は、好ましくは、３，７，１１－トリメチルドデシル基、３，７，１１，１５－テトラメチルヘキサデシル基（以下、２，３－ジヒドロフィチル基ということもある。）、２，２，４，８，１０，１０－ヘキサメチルウンデカン－５－イル基等である。
　「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基」中に「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基」が複数存在する場合には、その各々は同一のものであっても、異なるものであってもよい。
　「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基」中の「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基」以外の部位は任意に設定することができる。例えば－Ｏ－、－Ｓ－、－ＣＯ－、－ＮＨ－、－ＣＯＯ－、－ＯＣＯＮＨ－、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、炭化水素基（１価基または２価基）等の部位を有していてもよい。「炭化水素基」としては、例えば、脂肪族炭化水素基、芳香脂肪族炭化水素基、単環式飽和炭化水素基および芳香族炭化水素基等が挙げられ、具体的には、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基等の１価基およびそれらから誘導される２価基が用いられる。「アルキル基」としては、Ｃ１－６アルキル基が好ましく、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。「アルケニル基」としては、Ｃ２－６アルケニル基が好ましく、例えば、ビニル、１－プロペニル、アリル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル等が挙げられる。「アルキニル基」としては、Ｃ２－６アルキニル基が好ましく、例えば、エチニル、プロパルギル、１－プロピニル等が挙げられる。「シクロアルキル基」としては、Ｃ３－６シクロアルキル基が好ましく、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルが挙げられる。「アリール基」は、Ｃ６－１４アリール基が好ましく、例えば、フェニル、１－ナフチル、２－ナフチル、ビフェニリル、２－アンスリル等が挙げられる。中でもＣ６－１０アリール基がより好ましく、フェニルが特に好ましい。「アラルキル基」としては、Ｃ７－２０アラルキル基が好ましく、例えば、ベンジル、１－フェニルエチル、２－フェニルエチル、１－フェニルプロピル、ナフチルメチル、１－ナフチルエチル、１－ナフチルプロピル等が挙げられる。中でも、Ｃ７－１６アラルキル基（Ｃ６－１０アリール－Ｃ１－６アルキル基）がより好ましく、ベンジルが特に好ましい。該「炭化水素基」は、ハロゲン原子（塩素原子、臭素原子、フッ素原子、ヨウ素原子）、オキソ基等から選択される置換基で置換されていてもよい。
　「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基」における「総炭素数」は、１４以上、好ましくは１６以上、より好ましくは１８以上であり、３００以下、好ましくは２００以下、より好ましくは１６０以下である。また、「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基」における分岐鎖の数は特に制限されないが、２以上が好ましく、３以上がより好ましく、４以上がより好ましく、８以上がより好ましく、１０以上がさらに好ましい。この分岐鎖の数が多いほど、オリゴヌクレオチド鎖が長鎖になった場合でも、分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基を有する擬似固相保護基で保護されたヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドは、有機溶媒（特に、非極性溶媒）に対して良好に溶解する。
　「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基」としては、式（Ａ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
［式中、
　＊は、隣接原子との結合位置を示し；
　Ｒ１４およびＲ１５は、それぞれ独立して、水素原子またはＣ１－４アルキル基を示し；および
　Ｘ１は、単結合またはＣ１－４アルキレン基を示す。
　但し、Ｒ１４およびＲ１５が共に水素原子であることはない。］
で表される同一または異なる２価の基を有する基が好ましい。
　式（Ａ）で表される２価の基を有する基としては、例えば、下記式（Ｂ）～（Ｄ）のいずれかで表される基が挙げられる。なお、式（Ｂ）～（Ｄ）における各記号の定義中の炭素数、繰り返し単位の数（ｍ１、ｎ０～ｎ２）等は便宜上示されたものであって、総炭素数が１４以上（好ましくは１６以上、より好ましくは１８以上）、３００以下（好ましくは２００以下、より好ましくは１６０以下）になるよう上記した定義の範囲内で適宜変更することができる。以下、式（Ｂ）～（Ｄ）について、順に説明する。
　式（Ｂ）は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
［式中、
　＊は、隣接原子との結合位置を示し；
　Ｒ１６およびＲ１７は、水素原子を示すか、または一緒になって＝Ｏを示し；
　ｎ０は、２～４０の整数を示し；
　ｎ０個のＲ１８およびＲ１９は、それぞれ独立して、水素原子またはＣ１－４アルキル基を示し；
　ｎ０個のＸ２は、それぞれ独立して、単結合またはＣ１－４アルキレン基を示し；
　Ｒ２０は、水素原子またはＣ１－４アルキル基を示し；および
　Ｒ２１は、Ｃ１－４アルキル基を示す。
　但し、Ｒ１８およびＲ１９が共に水素原子であることはなく、且つｎ０が２の場合には、Ｒ２０はＣ１－４アルキル基を示す。］
　式（Ｂ）の基としては、
　Ｒ１６およびＲ１７は、共に水素原子であり；
　ｎ０は、２～４０の整数であり；
　ｎ０個のＲ１８およびＲ１９は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基またはエチル基であり；
　ｎ０個のＸ２は、それぞれ独立して、単結合、メチレン基またはエチレン基であり；および
　Ｒ２０は、水素原子、メチル基またはエチル基である
基（但し、Ｒ１８およびＲ１９が共に水素原子であることはなく、且つｎ０が２の場合には、Ｒ２０はメチルまたはエチル基を示す。）が好ましい。
　より好適な式（Ｂ）の基は、ミリスチル基、セチル基、ステアリル基、アラキル基、ベヘニル基等の炭素数１４～１６０の分岐異性体であり、中でも２，３－ジヒドロフィチル基、３，７，１１－トリメチルドデシル基、２，２，４，８，１０，１０－ヘキサメチル－５－ドデカノイル基が特に好ましい。
　式（Ｃ）は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
［式中、
　＊は、隣接原子との結合位置を示し；
　ｍ１個のＯＲ２２は、それぞれ独立して、式（Ｂ）で表される基により置換された水酸基を示し；および
　ｍ１は、１～３の整数を示す。］
　なお、式（Ｃ）中の「式（Ｂ）で表される基」は、その＊がＯ（即ち、隣接原子）との結合位置を示すこと以外は上述した通りである。
　式（Ｃ）の基において、Ｒ２２は、ミリスチル基、セチル基、ステアリル基、アラキル基、ベヘニル基等の炭素数１４～３０の分岐異性体である基がより好ましく、中でも２，３－ジヒドロフィチル基、３，７，１１－トリメチルドデシル基が特に好ましい。
　式（Ｄ）は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
［式中、
　＊は、Ｑとの結合位置を示し；
　ｎ１は、１～１０の整数を示し；
　ｎ２は、１～１０の整数を示し；
　ｎ１個のＲ２６およびＲ２７は、それぞれ独立して、水素原子またはＣ１－４アルキル基を示し；
　ｎ１個のＸ３は、それぞれ独立して、単結合またはＣ１－４アルキレン基を示し；
　ｎ２個のＲ２８およびＲ２９は、それぞれ独立して、水素原子またはＣ１－４アルキル基を示し；
　ｎ２個のＸ５は、それぞれ独立して、単結合またはＣ１－４アルキレン基を示し；
　Ｘ４は、単結合またはＣ１－４アルキレン基を示し；および
　Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ３０、Ｒ３１およびＲ３２は、それぞれ独立して、水素原子またはＣ１－４アルキル基を示す。
　但し、Ｒ２６およびＲ２７、および／またはＲ２８およびＲ２９が共に水素原子であることはなく、且つｎ１＋ｎ２が２の場合には、Ｒ２３、Ｒ２４およびＲ２５の２個以上がそれぞれ独立して、Ｃ１－４アルキル基を示すか、またはＲ３０、Ｒ３１およびＲ３２の２個以上がそれぞれ独立して、Ｃ１－４アルキル基を示す。］
　式（Ｄ）の基としては、
　ｎ１は、１～５の整数であり；
　ｎ２は、１～５の整数であり；
　ｎ１個のＲ２６およびＲ２７は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基またはエチル基であり；
　ｎ１個のＸ３は、それぞれ独立して、単結合、メチレン基またはエチレン基であり；
　ｎ２個のＲ２８およびＲ２９は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基またはエチル基であり；
　ｎ２個のＸ５は、それぞれ独立して、単結合、メチレン基またはエチレン基であり；
　Ｘ４は、単結合、メチレン基またはエチレン基であり；および
　Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ３０、Ｒ３１およびＲ３２は、それぞれ独立して、水素原子またはＣ１－４アルキル基である
基（但し、Ｒ２６およびＲ２７、および／またはＲ２８およびＲ２９が共に水素原子であることはなく、且つｎ１＋ｎ２が２の場合には、Ｒ２３、Ｒ２４およびＲ２５の２個以上がそれぞれ独立して、Ｃ１－４アルキル基を示すか、またはＲ３０、Ｒ３１およびＲ３２の２個以上がそれぞれ独立して、Ｃ１－４アルキル基を示す。）がより好ましい。
　特に好適な式（Ｄ）の基としては、
　ｎ１は、１～５の整数であり；
　ｎ２は、１～５の整数であり；
　ｎ１個のＲ２６およびＲ２７は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基であり；
　ｎ１個のＸ３は、それぞれ独立して、単結合またはメチレン基であり；
　ｎ２個のＲ２８およびＲ２９は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基であり；
　ｎ２個のＸ５は、それぞれ独立して、単結合またはメチレン基であり；
　Ｘ４は、単結合またはメチレン基であり；および
　Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ３１、Ｒ３１およびＲ３２は、メチル基である
基（但し、Ｒ２６およびＲ２７、および／またはＲ２８およびＲ２９が、共に水素原子であることはない）が挙げられる。
　「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基」の具体例として、以下の基が挙げられる。各基中の＊は結合位置を示し；式中のｎ３は、３以上の整数を示し；ｎ４は、該基の総炭素数が１４以上３００以下になるように適宜設定され得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基」の好ましい具体例として、以下の基が挙げられる：
　３，７，１１，１５－テトラメチルヘキサデシル基（別名：２，３－ジヒドロフィチル基）；
　３，７，１１－トリメチルドデシル基；
　２，２，４，８，１０，１０－ヘキサメチル－５－ドデカノイル基；
　３，４，５－トリ（３’，７’，１１’，１５’－テトラメチルヘキサデシルオキシ）ベンジル基；および
　３，５－ジ（３’，７’，１１’，１５’－テトラメチルヘキサデシルオキシ）ベンジル基。
　擬似固相保護基は、より好ましくは、下記式（ｇ－Ｉ）で表される基（以下「擬似固相保護基（ｇ－Ｉ）」と略称することがある。）である。
＊＊Ｌ－Ｙ－Ｚ　　　（ｇ－Ｉ）
［式中、
　＊＊は保護される基との結合位置を示し；
　Ｌは、単結合、または式（ａ１）若しくは（ａ１’）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
（式中、
　＊は、Ｙとの結合位置を示し；
　＊＊は前記と同義であり；
　Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ１－２２炭化水素基を示し；
　Ｌ１は、置換されていてもよい２価のＣ１－２２炭化水素基を示し；
　Ｌ２は、単結合を示すか、＊＊＊Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｒ４－Ｎ（Ｒ５）＊＊＊＊または＊＊＊Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ３）－Ｒ４－Ｎ（Ｒ５）＊＊＊＊（式中、＊＊＊は、Ｌ１との結合位置を示し、＊＊＊＊は、Ｃ＝Ｏとの結合位置を示し、Ｒ４は、Ｃ１－２２アルキレン基を示し、Ｒ３およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子若しくはＣ１－２２アルキル基を示すか、またはＲ３およびＲ５が一緒になって、環を形成していてもよい。）で表される基を示す。）で表される基を示し；
　Ｙは、単結合、酸素原子、またはＮＲ（Ｒは、水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。）を示し；および
　Ｚは、式（ａ２）、式（ａ２’）または式（ａ２”）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
［式中、
　＊は、結合位置を示し；
　Ｒ６は、水素原子であるか、あるいはＲｂが、下記式（ａ３）で表される基である場合には、環Ａまたは環ＢのＲ６は、Ｒ８と一緒になって単結合または－Ｏ－を示して、環Ａまたは環Ｂおよび環Ｃと共に縮合環を形成していてもよく；
　ｋは、１～４の整数を示し；
　ｋ個のＱは、それぞれ独立して、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ７－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－または－ＮＨＣ（＝Ｏ）－を示し；
　ｋ個のＲ７は、それぞれ独立して、炭素数１０以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基を示し；
　環Ａおよび環Ｂは、それぞれ独立して、ｋ個のＱＲ７に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１－６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１－６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく；
　Ｒａは、水素原子を示し；および
　Ｒｂは、水素原子、または式（ａ３）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
（式中、
　＊は、結合位置を示し；
　ｊは、０～４の整数を示し；
　ｊ個のＱは、それぞれ独立して、前記と同義であり；
　ｊ個のＲ９は、それぞれ独立して、炭素数１０以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基を示し；
　Ｒ８は、水素原子を示すか、または環Ａまたは環ＢのＲ６と一緒になって単結合または－Ｏ－を示して、環Ａまたは環Ｂおよび環Ｃと共に縮合環を形成していてもよく；および
　環Ｃは、ｊ個のＱＲ９に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１－６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１－６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。）で表される基を示すか、或いは
　ＲａおよびＲｂが、一緒になってオキソ基を形成する。］で表される基を示す。］
　式（ａ２）、式（ａ２’）および式（ａ２”）中のＲ７、並びに式（ａ３）中のＲ９が有する炭素数１０以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基は、それぞれ独立して、好ましくは直鎖状のＣ１０－４０アルキル基および直鎖状のＣ１０－４０アルケニル基から選ばれる基であり、より好ましくは直鎖状のＣ１０－４０アルキル基であり、さらに好ましくは直鎖状のＣ１０－３０アルキル基であり、特に好ましくは直鎖状のＣ１２－２８アルキル基であり、最も好ましくは直鎖状のＣ１４－２６アルキル基である。
　式（ａ２）、式（ａ２’）および式（ａ２”）中のＲ７、並びに式（ａ３）中のＲ９が有するリンカーは、それぞれ独立して、好ましくは－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－または－ＮＨＣ（＝Ｏ）－であり、より好ましくは－Ｏ－である。
　式（ａ２）、式（ａ２’）および式（ａ２”）中のＲ７、並びに式（ａ３）中のＲ９の「炭素数１０以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基」は、好ましくは、直鎖状のＣ１０－４０アルキル基、１～３個の直鎖状のＣ１０－４０アルキル基が－Ｏ－を介して結合したベンジル基、または１～３個の直鎖状のＣ１０－４０アルキル基が－Ｏ－を介して結合したシクロヘキシルメチル基である。
　式（ａ２）、式（ａ２’）および式（ａ２”）中のＲ７、並びに式（ａ３）中のＲ９の一態様である「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基」は、それぞれ独立して、好ましくは上記式（Ａ）で表される２価の基を有する基であり、より好ましくは上記式（Ｂ）～（Ｄ）のいずれかで表される基であり、さらに好ましくは上記式（Ｂ）で表される基であり、特に好ましくは２，３－ジヒドロフィチル基、３，７，１１－トリメチルドデシル基、または２，２，４，８，１０，１０－ヘキサメチル－５－ドデカノイル基である。
　式（ａ２）、式（ａ２’）、式（ａ２”）および式（ａ３）中のＱは、好ましくは－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－または－ＮＨＣ（＝Ｏ）－であり、より好ましくは－Ｏ－である。
　式（ｇ－Ｉ）において、式（ａ１）で表されるＬの好ましい態様は、
　Ｌ１が、２価のＣ１－２２炭化水素基（ここで、当該炭化水素基を構成する１または２以上の-ＣＨ２-は、－Ｏ－、－Ｃ（=Ｏ）－等で置換されていても良い）、またはＣＨ２－Ｏ－１，４－フェニレン－Ｏ－ＣＨ２であり；および
　Ｌ２が、単結合であるか、または＊＊＊Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ３）－Ｒ４－Ｎ（Ｒ５）＊＊＊＊（式中、＊＊＊は、Ｌ１との結合位置を示し、＊＊＊＊は、Ｃ＝Ｏとの結合位置を示し、Ｒ４は、Ｃ１－６アルキレン基を示し、Ｒ３およびＲ５は、それぞれ独立して水素原子、若しくは置換されていてもよいＣ１－６アルキル基を示すか、またはＲ３およびＲ５が一緒になって、置換されていてもよいＣ１－６アルキレン基を形成していてもよい。）で表される基である、
基である。
　式（ａ１）で表されるＬの別の好ましい態様は、
　Ｌ１が、２価のＣ１－２２炭化水素基であり；および
　Ｌ２が単結合である、
基である。
　式（ａ１）で表されるＬの別の好ましい態様は、
　Ｌ１が、エチレン基であり；および
　Ｌ２が、＊＊＊Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ３）－Ｒ４－Ｎ（Ｒ５）＊＊＊＊（式中、＊＊＊は、Ｌ１との結合位置を示し、＊＊＊＊は、Ｃ＝Ｏとの結合位置を示し、Ｒ４は、Ｃ１－２２アルキレン基を示し、Ｒ３およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子若しくはＣ１－２２アルキル基を示すか、またはＲ３およびＲ５が一緒になって、環を形成していてもよい。）で表される基を示す。）で表される基である、
基である。
　式（ａ１）で表されるＬの別の好ましい態様は、
　Ｌ１が、エチレン基であり；および
　Ｌ２が、＊＊＊Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ３）－Ｒ４－Ｎ（Ｒ５）＊＊＊＊（式中、＊＊＊は、Ｌ１との結合位置を示し、＊＊＊＊は、Ｃ＝Ｏとの結合位置を示し、Ｎ（Ｒ３）－Ｒ４－Ｎ（Ｒ５）部分が、１，４－ピペラジンジイル基を形成する。）で表される基である、
基である。
　式（ａ１）で表されるＬの別の好ましい態様は、
　Ｌ１が、エチレン基であり；および
　Ｌ２が、＊＊＊Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ３）－Ｒ４－Ｎ（Ｒ５）＊＊＊＊（式中、＊＊＊は、Ｌ１との結合位置を示し、＊＊＊＊は、Ｃ＝Ｏとの結合位置を示し、Ｒ４は、ペンチレン基、またはヘキシレン基を示し、Ｒ３およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基を示す。）で表される基である、
基である。
　式（ａ１）で表されるＬの特に好ましい態様は、入手が容易で安価なスクシニル基である。
　次に、式（ｇ－Ｉ）において式（ａ１’）で表されるＬについて説明する。
　式（ａ１’）中のＬ１は、好ましくは２価のＣ６－１０芳香族炭化水素基であり、より好ましくはフェニレン基である。
　式（ａ１’）中のＬ２は、好ましくは単結合である。
　式（ａ１’）中のＬ１およびＬ２の好ましい組合せとしては、Ｌ１が２価のＣ６－１０芳香族炭化水素基であり、Ｌ２が単結合である、組合せである。式（ａ１’）中のＬ１およびＬ２のより好ましい組合せとしては、Ｌ１がフェニレン基であり、Ｌ２が単結合である、組合せである。
　式（ａ１’）中のＲ１およびＲ２は、それぞれ独立して、好ましくはＣ１－２２アルキル基であり、より好ましくはＣ１－１０アルキル基である。
　式（ａ１’）で表されるＬの好ましい態様は、
　Ｒ１およびＲ２が、それぞれ独立して、Ｃ１－２２アルキル基であり；
　Ｌ１が、２価のＣ６－１０芳香族炭化水素基であり；および
　Ｌ２が、単結合である、
基である。
　式（ａ１’）で表されるＬの別の好ましい態様は、
　Ｒ１およびＲ２が、それぞれ独立して、Ｃ１－１０アルキル基であり；
　Ｌ１が、フェニレン基であり；および
　Ｌ２が、単結合である、
基である。
　式（ｇ－Ｉ）におけるＹがＮＲである場合、前記Ｒは、好ましくは、水素原子、Ｃ１－６アルキル基またはＣ７－１６アラルキル基であり、より好ましくは水素原子、メチル、エチルまたはベンジルであり、さらに好ましくは水素原子である。Ｙは、好ましくは単結合、酸素原子またはＮＲであり、より好ましくは単結合または酸素原子である。
　式（ｇ－Ｉ）におけるＺは、好ましくは、式（ａ２）または式（ａ２”）で表される基であり、より好ましくは式（ａ２”）で表される基である。式（ａ２）で表されるＺ（即ち、ベンジル基の構造）を有する擬似固相保護基に比べて、式（ａ２”）で表されるＺ（即ち、シクロヘキシルメチル基の構造）を有する擬似固相保護基を使用することにより、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）等の非極性溶媒に対する溶解性を飛躍的に向上することができる。それによって、本発明の製造方法をより高濃度で実行でき、生産性が大きく向上する。
　式（ａ２）において、Ｒ６は水素原子であることが好ましい。また、式（ａ２）において、ＲａおよびＲｂが、水素原子であるか、または一緒になってオキソ基を形成することが好ましい。
　式（ａ２）で表されるＺの、固液分離のために好ましい態様は、
　ＲａおよびＲｂが、水素原子であり；
　Ｒ６が、水素原子であり；
　ｋが、１～３の整数であり；
　ｋ個のＱが、－Ｏ－であり；および
　ｋ個のＲ７が、それぞれ独立して、直鎖状のＣ１０－４０アルキル基である、
基である。
　式（ａ２）で表されるＺの、固液分離のために好ましい別の態様は、
　ＲａおよびＲｂが、水素原子であり；
　Ｒ６が、水素原子であり；
　ｋが、１～３の整数であり；
　ｋ個のＱが、－Ｏ－であり；
　ｋ個のＲ７が、それぞれ独立して、１～３個の直鎖状のＣ１０－４０アルキル基が－Ｏ－を介して結合したベンジル基、または１～３個の直鎖状のＣ１０－４０アルキル基が－Ｏ－を介して結合したシクロヘキシルメチル基であり；および
　環Ａが、ｋ個のＱＲ７に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１－６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１－６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい、
基である。
　式（ａ２）で表されるＺの、固液分離のために好ましい別の態様は、
　Ｒａが、水素原子であり；および
　Ｒｂが、式（ａ３）（式中、＊は結合位置であり、ｊが、０～３の整数であり、ｊ個のＱが、－Ｏ－であり、ｊ個のＲ９が、それぞれ独立して、直鎖状のＣ１０－４０アルキル基であり、Ｒ６およびＲ８が、共に水素原子である。）で表される基である、
基である。
　式（ａ２）で表されるＺの、固液分離のために好ましい別の態様は、
　Ｒａが、水素原子であり；および
　Ｒｂが、式（ａ３）（式中、＊は結合位置であり、ｊが、０～３の整数であり、ｊ個のＱが、－Ｏ－であり、ｊ個のＲ９が、それぞれ独立して、直鎖状のＣ１０－４０アルキル基であり、Ｒ８は、Ｒ６と一緒になって単結合または－Ｏ－を示して、環Ａおよび環Ｃと共に縮合環を形成する。）で表される基である、
基である。
　式（ａ２）で表されるＺの、固液分離のために好ましい別の態様は、
　ＲａおよびＲｂが、一緒になってオキソ基を形成し；
　Ｒ６が、水素原子であり；
　ｋが、１～３の整数であり；
　ｋ個のＱが、－Ｏ－であり；および
　ｋ個のＲ７が、それぞれ独立して、直鎖状のＣ１０－４０アルキル基である、
基である。
　式（ａ２）で表されるＺの、固液分離のために好ましい別の態様は、
　ＲａおよびＲｂが、一緒になってオキソ基を形成し；
　Ｒ６が、水素原子であり；
　ｋが、１～３の整数であり；
　ｋ個のＱが、－Ｏ－であり；
　ｋ個のＲ７が、それぞれ独立して、１～３個の直鎖状のＣ１０－４０アルキル基が－Ｏ－を介して結合したベンジル基、または１～３個の直鎖状のＣ１０－４０アルキル基が－Ｏ－を介して結合したシクロヘキシルメチル基であり；および
　環Ａが、ｋ個のＱＲ７に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１－６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１－６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい、
基である。
　式（ａ２”）において、Ｒ６は水素原子であることが好ましい。また、式（ａ２”）において、ＲａおよびＲｂが、水素原子であるか、または一緒になってオキソ基を形成することが好ましい。
　式（ａ２”）で表されるＺの、固液分離のために好ましい態様は、
　ＲａおよびＲｂが、水素原子であり；
　Ｒ６が、水素原子であり；
　ｋが、１～３の整数であり；
　ｋ個のＱが、－Ｏ－であり；および
　ｋ個のＲ７が、それぞれ独立して、直鎖状のＣ１０－４０アルキル基である、
基である。
　式（ａ２”）で表されるＺの、固液分離のために好ましい別の態様は、
　ＲａおよびＲｂが、水素原子であり；
　Ｒ６が、水素原子であり；
　ｋが、１～３の整数であり；
　ｋ個のＱが、－Ｏ－であり；
　ｋ個のＲ７が、それぞれ独立して、１～３個の直鎖状のＣ１０－４０アルキル基が－Ｏ－を介して結合したベンジル基、または１～３個の直鎖状のＣ１０－４０アルキル基が－Ｏ－を介して結合したシクロヘキシルメチル基であり；および
　環Ｂが、ｋ個のＱＲ７に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１－６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１－６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい、
基である。
　式（ａ２”）で表されるＺの、固液分離のために好ましい別の態様は、
　Ｒａが、水素原子であり；
　Ｒｂが、式（ａ３）（式中、＊は結合位置であり、ｊが、０～３の整数であり、ｊ個のＱが、－Ｏ－であり、ｊ個のＲ９が、それぞれ独立して、Ｃ１０－４０アルキル基であり、Ｒ６およびＲ８が、共に水素原子である。）で表される基である、
基である。
　式（ａ２”）で表されるＺの、固液分離のために好ましい別の態様は、
　Ｒａが、水素原子であり；
　Ｒｂが、式（ａ３）（式中、＊は結合位置であり、ｊが、０～３の整数であり、ｊ個のＱが、－Ｏ－であり、ｊ個のＲ９が、それぞれ独立して、直鎖状のＣ１０－４０アルキル基であり、Ｒ８は、Ｒ６と一緒になって単結合または－Ｏ－を示して、環Ｂおよび環Ｃと共に縮合環を形成する。）で表される基である、
基である。
　式（ａ２”）で表されるＺの、固液分離のために好ましい別の態様は、
　ＲａおよびＲｂが、一緒になってオキソ基を形成し；
　Ｒ６が、水素原子であり；
　ｋが、１～３の整数であり；
　ｋ個のＱが、－Ｏ－であり；および
　ｋ個のＲ７が、それぞれ独立して、直鎖状のＣ１０－４０アルキル基である、
基である。
　式（ａ２”）で表されるＺの、固液分離のために好ましい別の態様は、
　ＲａおよびＲｂが、一緒になってオキソ基を形成し；
　Ｒ６が、水素原子であり；
　ｋが、１～３の整数であり；
　ｋ個のＱが、－Ｏ－であり；
　ｋ個のＲ７が、それぞれ独立して、１～３個の直鎖状のＣ１０－４０アルキル基が－Ｏ－を介して結合したベンジル基、または１～３個の直鎖状のＣ１０－４０アルキル基が－Ｏ－を介して結合したシクロヘキシルメチル基であり；および
　環Ｂが、ｋ個のＱＲ７に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１－６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１－６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい、
基である。
　固液分離のために好適な擬似固相保護基（ｇ－Ｉ）は、好ましくは、
　Ｌが、スクシニル基であるか、または式（ａ１’）で表される基（式（ａ１’）中、Ｒ１およびＲ２が、それぞれ独立して、Ｃ１－１０アルキル基であり、Ｌ１が、２価のフェニレン基であり、Ｌ２が、単結合である。）であり、および
　Ｙ－Ｚが、３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ基、３，５－ビス（ドコシルオキシ）ベンジルオキシ基、３，５－ビス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルオキシ基、３，４，５－トリス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルオキシ基、３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアミノ基、２，４－ビス（ドコシルオキシ）ベンジルアミノ基、３，５－ビス（ドコシルオキシ）ベンジルアミノ基、ビス（４－ドコシルオキシフェニル）メチルアミノ基、４－メトキシ－２－［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルアミノ基、４－メトキシ－２－［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアミノ基、２，４－ビス（ドデシルオキシ）ベンジルアミノ基、フェニル（２，３，４－トリス（オクタデシルオキシ）フェニル）メチルアミノ基、ビス［４－（１２－ドコシルオキシドデシルオキシ）フェニル］メチルアミノ基、３，５－ビス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルアミノ基、３，４，５－トリス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルアミノ基、３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ基、３，５－ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ基、３，５－ビス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルオキシ基、３，４，５－トリス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルオキシ基、３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、２，４－ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、３，５－ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、ビス（４－ドコシルオキシシクロへキシル）メチルアミノ基、４－メトキシ－２－［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基、４－メトキシ－２－［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基、２，４－ビス（ドデシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、フェニル（２，３，４－トリス（オクタデシルオキシ）シクロへキシル）メチルアミノ基、ビス［４－（１２－ドコシルオキシドデシルオキシ）シクロへキシル］メチルアミノ基、３，５－ビス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基、または３，４，５－トリス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基である、
基であるか、または
　Ｌ－Ｙが、単結合またはスクシニル－１，４－ピペラジンジイル基であり、および
　Ｚが、３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル基、３，５－ビス（ドコシルオキシ）ベンゾイル基、３，５－ビス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンゾイル基、または３，４，５－トリス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンゾイル基である、
基である。
　固液分離のために好適な擬似固相保護基（ｇ－Ｉ）は、より好ましくは、
　Ｌが、スクシニル基であり、および
　Ｙ－Ｚが、３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ基、３，５－ビス（ドコシルオキシ）ベンジルオキシ基、３，５－ビス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルオキシ基、３，４，５－トリス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルオキシ基、３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアミノ基、２，４－ビス（ドコシルオキシ）ベンジルアミノ基、３，５－ビス（ドコシルオキシ）ベンジルアミノ基、ビス（４－ドコシルオキシフェニル）メチルアミノ基、４－メトキシ－２－［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルアミノ基、４－メトキシ－２－［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアミノ基、２，４－ビス（ドデシルオキシ）ベンジルアミノ基、フェニル（２，３，４－トリス（オクタデシルオキシ）フェニル）メチルアミノ基、ビス［４－（１２－ドコシルオキシドデシルオキシ）フェニル］メチルアミノ基、３，５－ビス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルアミノ基、３，４，５－トリス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルアミノ基、３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ基、３，５－ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ基、３，５－ビス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルオキシ基、３，４，５－トリス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルオキシ基、３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、２，４－ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、３，５－ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、ビス（４－ドコシルオキシシクロへキシル）メチルアミノ基、４－メトキシ－２－［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基、４－メトキシ－２－［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基、２，４－ビス（ドデシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、フェニル（２，３，４－トリス（オクタデシルオキシ）シクロへキシル）メチルアミノ基、ビス［４－（１２－ドコシルオキシドデシルオキシ）シクロへキシル］メチルアミノ基、３，５－ビス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基、または３，４，５－トリス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基である、
基であるか、または
　Ｌ－Ｙが、単結合またはスクシニル－１，４－ピペラジンジイル基であり、および
　Ｚが、３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル基、３，５－ビス（ドコシルオキシ）ベンゾイル基、３，５－ビス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンゾイル基、または３，４，５－トリス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンゾイル基である。
　固液分離のために好適な擬似固相保護基（ｇ－Ｉ）は、さらに好ましくは、
　Ｌが、スクシニル基であり、および
　Ｙ－Ｚが、３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ基、３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ基、３，５－ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ基、３，５－ビス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルオキシ基、３，４，５－トリス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルオキシ基、３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、２，４－ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、３，５－ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、４－メトキシ－２－［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基、４－メトキシ－２－［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基、２，４－ビス（ドデシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、３，５－ビス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基、または３，４，５－トリス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基である、
基であるか、または
　Ｌ－Ｙが、単結合またはスクシニル－１，４－ピペラジンジイル基であり、および
　Ｚが、３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル基である基である。
　固液分離のために好適な擬似固相保護基（ｇ－Ｉ）は、特に好ましくは、
　Ｌが、スクシニル基であり、および
　Ｙ－Ｚが、３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ基、３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ基またはフェニル（２，３，４－トリス（オクタデシルオキシ）フェニル）メチルアミノ基である、
基であるか、または
　Ｌ－Ｙが、スクシニル－１，４－ピペラジンジイル基であり、および
　Ｚが、３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル基である、
基である。
　固液分離のために好適な擬似固相保護基（ｇ－Ｉ）は、最も好ましくは、
　Ｌが、スクシニル基であり、および
　Ｙ－Ｚが、３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ基、または３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ基である、
基であるか、または
　Ｌ－Ｙが、スクシニル－１，４－ピペラジンジイル基であり、および
　Ｚが、３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル基である、
基である。
　抽出のために好適な擬似固相保護基（ｇ－Ｉ）は、好ましくは、２－｛２，４－ジ（２’，３’－ジヒドロフィチルオキシ）ベンジルアミノカルボニル｝エチルカルボニル基；３，５－ジ（２’，３’－ジヒドロフィチルオキシ）ベンジルオキシスクシニル基；４－（２’，３’－ジヒドロフィチルオキシ）ベンジルオキシスクシニル基；２－｛１－［（２－クロロ－５－（２’，３’－ジヒドロフィチルオキシ）フェニル）］ベンジルアミノカルボニル｝エチルカルボニル基；３，４，５－トリ（２’，３’－ジヒドロフィチルオキシ）ベンジルオキシスクシニル基；２－｛３，４，５－トリ（２’，３’－ジヒドロフィチルオキシ）ベンジルアミノカルボニル｝エチルカルボニル基；２－｛４－（２’，３’－ジヒドロフィチルオキシ）ベンジルアミノカルボニル｝エチルカルボニル基；２－｛２－［３’，４’，５’－トリ（２”，３”－ジヒドロフィチルオキシ）ベンジルオキシ］－４－メトキシベンジルアミノカルボニル｝エチルカルボニル基；２－｛４－（２’，３’－ジヒドロフィチルオキシ）－２－メトキシベンジルアミノカルボニル｝エチルカルボニル基；４－（２’，３’－ジヒドロフィチルオキシ）－２－メチルベンジルオキシスクシニル基；２－｛４－（２’，３’－ジヒドロフィチルオキシ）－２－メチルベンジルアミノカルボニル｝エチルカルボニル基；４－［２，２，４，８，１０，１０－ヘキサメチル－５－ドデカノイルアミノ］ベンジルオキシスクシニル基；２－｛４－［２，２，４，８，１０，１０－ヘキサメチル－５－ドデカノイルアミノ］ベンジルアミノカルボニル｝エチルカルボニル基；４－（３，７，１１－トリメチルドデシルオキシ）ベンジルオキシスクシニル基；２－｛４－（３，７，１１－トリメチルドデシルオキシ）ベンジルアミノカルボニル｝エチルカルボニル基；２－｛３，５－ジ（２’，３’－ジヒドロフィチルオキシ）ベンジルアミノカルボニル｝エチルカルボニル基；２－｛１－［２，３，４－トリ（２’，３’－ジヒドロフィチルオキシ）フェニル］ベンジルアミノカルボニル｝エチルカルボニル基；２－｛１－［４－（２’，３’－ジヒドロフィチルオキシ）フェニル］－４’－（２’，３’－ジヒドロフィチルオキシ）ベンジルアミノカルボニル｝エチルカルボニル基；３，４，５－トリス［３，４，５－トリ（２’，３’－ジヒドロフィチルオキシ）ベンジル］ベンジルオキシスクシニル基；または２－｛３，４，５－トリス［３，４，５－トリ（２’，３’－ジヒドロフィチルオキシ）ベンジル］ベンジルアミノカルボニル｝エチルカルボニル基である。
　核酸ｂにおける５’位の水酸基を保護する「酸性条件下で除去可能な一時保護基」としては、酸性条件下で脱保護が可能であり、且つ水酸基の保護基として用いられるものであれば、特に限定はされないが、例えば、トリチル基、９－（９－フェニル）キサンテニル基、９－フェニルチオキサンテニル基、１，１－ビス（４－メトキシフェニル）－１－フェニルメチル基（ジメトキシトリチル基）等のビス（Ｃ１－６アルコキシ）トリチル基、１－（４－メトキシフェニル）－１，１－ジフェニルメチル基（モノメトキシトリチル基）等のモノ（Ｃ１－１８アルコキシ）トリチル基等を挙げることができる。これらの中でも、脱保護のしやすさ、入手の容易さの観点から、水酸基の一時保護基は、モノメトキシトリチル基またはジメトキシトリチル基であることが好ましく、ジメトキシトリチル基であることがより好ましい。
　Ｌｎ１の有機基とは、炭化水素基、または炭化水素基中の炭素原子がヘテロ原子で置き換わった基を意味する。ヘテロ原子としては、例えば、酸素原子、窒素原子、硫黄原子等が挙げられる。また、有機基は、水酸基、アミノ基、オキソ基（＝Ｏ）等の置換基を有していてもよい。有機基が有し得る水酸基およびアミノ基は、保護基で保護されていることが好ましい。有機基の形状は、鎖状（直鎖状または分岐鎖状）、環状またはこれらの組合せのいずれでもよい。
　有機基は、細胞に対して機能性を有する基を有していてもよい。細胞に対して機能性を有する基は、有機基の主鎖または側鎖の末端に結合していることが好ましい。細胞に対して機能性を有する基としては、例えば、「化合物の脂溶性を向上させることによって、化合物の細胞膜透過性を向上させる基」、「細胞膜受容体を介して細胞内への化合物の取込みを向上させる基」等が挙げられる。「化合物の脂溶性を向上させることによって、化合物の細胞膜透過性を向上させる基」としては、例えば、コレステロール残基、トコフェロール残基等が挙げられる。「細胞膜受容体を介して細胞内への化合物の取込みを向上させる基」としては、例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン残基等が挙げられる。これら細胞に対して機能性を有する基は、国際公開第２０１７／１０４８３６号に記載されている。
　－ＯＬｎ１－ＯＨの具体例としては、以下のものが挙げられる（下記式中の＊は、リン原子との結合位置を示し、Ａｃはアセチル基を示す）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　Ｌｎ１は、好ましくはＣ２－６アルキレン基、より好ましくはエチレン基である。
　本発明の製造方法を実施するに当たっての好適な核酸ａ、核酸αおよび核酸ｂについて、以下に詳述する。　
　本発明の工程（１）で使用する核酸ａとしては、例えば、下記式（ａ－Ｉ）で表される化合物（即ち、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド）が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
［式中、
　ｍは、０以上の整数を示し；
　ｍ＋１個のＢａｓｅは、それぞれ独立して、保護されていてもよい核酸塩基を示し；
　ｍ＋１個のＸは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、または２位炭素原子および４位炭素原子と結合する２価の有機基を示し；
　ｍ＋１個のＸｎ１は、それぞれ独立して、酸素原子またはＮＨを示し；
　ｍ個のＲ１０は、それぞれ独立して、酸素原子または硫黄原子を示し；
　ｍ個のＲｐ１は、それぞれ独立して、リン酸基の保護基を示し；
　Ｌ、ＹおよびＺは、前記と同義である。］
　以下では、式（ａ－Ｉ）で表される化合物を「化合物（ａ－Ｉ）」と略称することがある。他の式で表される化合物も同様に略称することがある。
　核酸塩基のアミノ基は、保護基で保護されていることが好ましい。該保護基としては、アセチル基、フェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、（２－ヘキシル）デカノイル基、ジメチルホルムアミジニル基、および＝ＮＣ（Ｒ１１）－Ｎ（Ｒ１２）（Ｒ１３）基（式中、Ｒ１１は、メチル基を示し、Ｒ１２およびＲ１３は、それぞれ独立してＣ１－５アルキル基を示すか、またはＲ１１およびＲ１２が一緒になって、それらが結合する炭素原子および窒素原子と共に５員または６員の含窒素炭化水素環を形成していてもよい。）が好ましい。なお、前記＝ＮＣ（Ｒ１１）－Ｎ（Ｒ１２）（Ｒ１３）基としては、例えば、１－（ジメチルアミノ）エチリデン基が挙げられる。化合物（ａ－Ｉ）が複数のアミノ基を有する場合、アミノ基の保護基は１種のみでもよく、２種以上でもよい。
　ｍが０である場合、化合物（ａ－Ｉ）はヌクレオシドであり、ｍが１以上である場合、化合物（ａ－Ｉ）はオリゴヌクレオチドである。ｍは、４９以下が好ましく、２９以下がより好ましく、１９以下がさらに好ましく、４以下が特に好ましく、２以下が最も好ましい。
　Ｘのハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子が好ましく、フッ素原子がより好ましい。
　Ｘの保護されていてもよい水酸基の保護基としては、特に限定されず、例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ　ＧＲＯＵＰＳ　ＩＮ　ＯＲＧＡＮＩＣ　ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第３版、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（ＪＯＨＮ　ＷＩＬＬＹ＆ＳＯＮＳ）出版（１９９９年）等に記載されている任意の保護基を挙げることができる。具体的には、メチル基、ベンジル基、ｐ－メトキシベンジル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、メトキシメチル基、メトキシエチル基、２－テトラヒドロピラニル基、エトキシエチル基、シアノエチル基、シアノエトキシメチル基、フェニルカルバモイル基、１，１－ジオキソチオモルホリン－４－チオカルバモイル基、アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル（Ｔｏｍ）基、１－（４－クロロフェニル）－４－エトキシピペリジン－４－イル（Ｃｐｅｐ）基等を挙げることができる。保護されていてもよい水酸基の保護基は、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、またはｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基であることが好ましく、経済性および入手の容易さの観点から、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基であることが特に好ましい。
　Ｘの「２位炭素原子および４位炭素原子と結合する２価の有機基」としては、ヌクレオシドの２位炭素原子および４位炭素原子と結合する限り特に限定はない。この２価の有機基としては、例えば、置換されていてもよいＣ２－７アルキレン基、並びに－Ｏ－、－ＮＲ３３－（Ｒ３３は水素原子またはＣ１－６アルキル基を示す）、－Ｓ－、－ＣＯ－、－ＣＯＯ－、－ＯＣＯＮＲ３４－（Ｒ３４は水素原子またはＣ１－６アルキル基を示す）および－ＣＯＮＲ３５－（Ｒ３５は水素原子またはＣ１－６アルキル基を示す）から選ばれる２価のリンカーと、置換されていてもよいＣ１－７アルキレン基とから構成される２価の有機基等が挙げられる。Ｃ１－７アルキレン基およびＣ２－７アルキレン基が有していてもよい置換基としては、例えば、メチリデン基（ＣＨ２＝）が挙げられる。
　「２位炭素原子および４位炭素原子と結合する２価の有機基」としては、置換されていてもよいＣ２－７アルキレン基、－ＯＲｉ－（Ｒｉは４位炭素原子と結合するＣ１－６アルキレン基を示す）、－Ｏ－ＮＲ３３－Ｒｊ－（Ｒｊは４位炭素原子と結合するＣ１－６アルキレン基を示し、Ｒ３３は前記と同義を示す）、－Ｏ－Ｒｋ－Ｏ－Ｒｌ－（ＲｋはＣ１－６アルキレン基を示し、Ｒｌは４位炭素原子と結合架橋するＣ１－６アルキレン基を示す）が好ましく、－ＯＲｉ－（Ｒｉは前記と同義を示す）、－Ｏ－ＮＲ３３－Ｒｊ－（ＲｊおよびＲ３３は前記と同義を示す）、－Ｏ－Ｒｋ－Ｏ－Ｒｌ－（ＲｋおよびＲｌは前記と同義を示す）がより好ましい。Ｒｉ、Ｒｊ、ＲｋおよびＲｌで示されるＣ１－６アルキレン基としては、それぞれ独立して、メチレン基またはエチレン基が好ましい。
　「２位炭素原子および４位炭素原子と結合する２価の有機基」としては、－Ｏ－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＮＲ３３－ＣＨ２－（Ｒ３３は前記と同義を示す）、－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－がより好ましく、－Ｏ－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＮＨ－ＣＨ２－、－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－（それぞれ、左側が２位炭素原子に結合し、右側が４位炭素原子に結合する。）がさらに好ましい。
　ｍ＋１個のＸは、それぞれ独立して、好ましくは水素原子、ハロゲン原子、または保護されていてもよい水酸基であり、より好ましくは水素原子または保護されていてもよい水酸基である。
　Ｒｐ１のリン酸基の保護基としては、塩基性条件下で除去可能であり、リン酸基の保護基として用いられるものであれば、特に限定はされないが、－ＣＨ２ＣＨ２ＷＧ（ＷＧは、電子吸引性基を示す。）で表される基が好ましい。
　ＷＧの電子吸引性基としては、例えば、シアノ基、ニトロ基等が挙げられ、好ましくはシアノ基である。
　ｍ個のＲｐ１は、好ましくは、それぞれ独立して－ＣＨ２ＣＨ２ＷＧで表される基である。
　ｍ＋１個のＸｎ１は、好ましくは酸素原子である。
　Ｌ、ＹおよびＺの説明は、前記の通りである。
　化合物（ａ－Ｉ）は、好ましくは下記式（ａ－ｉ）で表される化合物である（下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　化合物（ａ－Ｉ）は、自体公知の方法またはこれに準ずる方法で製造することができる。例えば、国際公開第２０１７／１０４８３６号公報に記載された方法に従って製造することができる。　
　化合物（ａ－ｉ）の中で、式（ａ－ＩＩ）で表される化合物（即ち、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド）が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
［式中、
　ｍ、ｍ個のＢａｓｅ、ｍ＋１個のＸ、ｍ個のＲ１０、ｍ個のＲｐ１、Ｌ、ＹおよびＺは、それぞれ独立して、前記と同義であり；
　Ｒ１１は、メチル基を示し、Ｒ１２およびＲ１３は、それぞれ独立してＣ１－５アルキル基を示すか、またはＲ１１およびＲ１２が一緒になって、それらが結合する炭素原子および窒素原子と共に５員または６員の含窒素炭化水素環を形成していてもよい。］
　式（ａ－ＩＩ）において、ｍ個のＲｐ１が、それぞれ独立して－ＣＨ２ＣＨ２ＷＧで表される基であることが好ましい。
　式（ａ－ＩＩ）において、ｍが０であることが好ましい。即ち、化合物（ａ－ＩＩ）の中で、式（ａ－ＩＩＩ）で表される化合物（即ち、ヌクレオシド）が好ましい（下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　式（ａ－ＩＩ）および式（ａ－ＩＩＩ）において、Ｒ１１がメチル基であり、Ｒ１２およびＲ１３は、それぞれ独立してＣ１－５アルキル基であることが好ましく、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３が、メチル基であることがより好ましい。
　式（ａ－ＩＩ）および式（ａ－ＩＩＩ）における他の記号の説明は、前記の通りである。
　本発明において、最初の残基がアデニンを核酸塩基として有するホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドを製造する場合、出発物質であるヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとして化合物（ａ－ＩＩ）（特に、化合物（ａ－ＩＩＩ））を使用することで、ブランチ体の生成等を抑制できる。ここで、ブランチ体とは、目的化合物の核酸塩基におけるアミノ基の保護基が脱落し、該アミノ基とモノマーとが結合して生成した副生成物をいう。
　また、化合物（ａ－ｉ）の中で、式（ａ－ＩＶ）で表される化合物（即ち、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド）が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
［式中、
　ｍ、ｍ＋１個のＢａｓｅ、ｍ＋１個のＸ、ｍ個のＲ１０、ｍ個のＲｐ１、ＬおよびＹは、それぞれ独立して、前記と同義であり；
　Ｚ’は、式（ａ２”）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
［式中、
　＊は、結合位置を示し；
　Ｒ６は、水素原子であるか、あるいはＲｂが、下記式（ａ３）で表される基である場合には、Ｒ８と一緒になって単結合または－Ｏ－を示して、環Ｂおよび環Ｃと共に縮合環を形成していてもよく；
　ｋは、１～４の整数を示し；
　ｋ個のＱは、それぞれ独立して、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－または－ＮＨＣ（＝Ｏ）－を示し；
　ｋ個のＲ７は、それぞれ独立して、炭素数１０以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基を示し；
　環Ｂは、ｋ個のＱＲ７に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１－６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１－６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく；
　Ｒａは、水素原子を示し；および
　Ｒｂは、水素原子、または式（ａ３）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
（式中、＊は、結合位置を示し；
　ｊは、０～４の整数を示し；
　ｊ個のＱは、それぞれ独立して、前記と同義であり；
　ｊ個のＲ９は、それぞれ独立して、炭素数１０以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基を示し；
　Ｒ８は、水素原子を示すか、またはＲ６と一緒になって単結合または－Ｏ－を示して、環Ｂおよび環Ｃと共に縮合環を形成していてもよく；および
　環Ｃは、ｊ個のＱＲ９に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１－６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１－６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。）で表される基を示すか、或いは
　ＲａおよびＲｂが、一緒になってオキソ基を形成する。］で表される基を示す。］
　式（ａ－ＩＶ）において、ｍ個のＲｐ１が、それぞれ独立して－ＣＨ２ＣＨ２ＷＧで表される基であることが好ましい。
　式（ａ－ＩＶ）において、ｍが０であることが好ましい。
　式（ａ－ＩＶ）における他の記号の説明は、前記の通りである。
　化合物（ａ－ＩＶ）の中で、下記式（ａ－Ｖ）で表される化合物（即ち、ヌクレオシド）が好ましい（下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　化合物（ａ－Ｉ）の中でも、擬似固相保護基中に式（ａ２”）で表されるＺ’（即ち、シクロヘキシルメチル基の構造）を有する化合物（ａ－ＩＶ）（特に、化合物（ａ－Ｖ））は、擬似固相保護基中に式（ａ２）で表されるＺ（即ち、ベンジル基の構造）を有する他の化合物（ａ－Ｉ）に比べて、非極性溶媒に対する溶解性が高い。そのため、化合物（ａ－ＩＶ）（特に、化合物（ａ－Ｖ））を使用することによって、本発明の製造方法をより高濃度で実行でき、生産性が大きく向上する。式（ａ２”）で表されるＺ’の説明は、上述の式（ａ２”）で表されるＺの説明と同じである。
　式（ａ－ＩＶ）および（ａ－Ｖ）において、
　Ｌが、スクシニル基であるか、または式（ａ１’）で表される基（式（ａ１’）中、Ｒ１およびＲ２が、それぞれ独立して、Ｃ１－１０アルキル基であり、Ｌ１が、２価のフェニレン基であり、Ｌ２が、単結合である。）であり、および
　Ｙ－Ｚ’が、３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ基、３，５－ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ基、３，５－ビス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルオキシ基、３，４，５－トリス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルオキシ基、３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、２，４－ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、３，５－ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、４－メトキシ－２－［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基、４－メトキシ－２－［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基、２，４－ビス（ドデシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、３，５－ビス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基、または３，４，５－トリス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基である、
組合せが、固液分離のために好ましい。
　式（ａ－ＩＶ）および（ａ－Ｖ）において、
　Ｌが、スクシニル基であり、および
　Ｙ－Ｚ’が、３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ基、３，５－ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ基、３，５－ビス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルオキシ基、３，４，５－トリス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルオキシ基、３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、２，４－ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、３，５－ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、４－メトキシ－２－［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基、４－メトキシ－２－［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基、２，４－ビス（ドデシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、３，５－ビス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基、または３，４，５－トリス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基である、
組合せが、固液分離のためにより好ましい。
　式（ａ－ＩＶ）および（ａ－Ｖ）において、
　Ｌが、スクシニル基であり、および
　Ｙ－Ｚ’が、３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ基、３，５－ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ基、３，５－ビス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルオキシ基、または３，４，５－トリス［３’，４’，５’－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルオキシ基である、
組合せが、固液分離のためにさらに好ましい。
　式（ａ－ＩＶ）および（ａ－Ｖ）において、
　Ｌが、スクシニル基であり、および
　Ｙ－Ｚ’が、３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ基である、
組合せが、固液分離のために特に好ましい。
　また、核酸ａとしては、例えば、下記式（ａ－ＶＩ）で表される化合物（即ち、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド）が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
［式中、
　ｍ＋１個のＢａｓｅ１の少なくとも一つは、－Ｌ－Ｙ－Ｚで保護されている核酸塩基を示し、残りは保護されていてもよい核酸塩基を示し；
　ｍ個のＸｎ１は、それぞれ独立して、酸素原子またはＮＨを示し；
　Ｘｎ２は、保護されている水酸基またはアミノ基を示し；
　ｍ、ｍ＋１個のＸ、ｍ個のＲ１０、ｍ個のＲｐ１、Ｌ、ＹおよびＺは、それぞれ独立して、前記と同義である。］
　式（ａ－ＶＩ）中、ｍ＋１個のＢａｓｅ１の少なくとも一つは、－Ｌ－Ｙ－Ｚで保護されている核酸塩基である。核酸塩基および－Ｌ－Ｙ－Ｚの説明は、前記の通りである。
　また、保護されていてもよい核酸塩基の説明も、前記の通りである。
　保護されている水酸基（Ｘｎ２）の保護基としては、特に限定されず、例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ　ＧＲＯＵＰＳ　ＩＮ　ＯＲＧＡＮＩＣ　ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第３版、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（ＪＯＨＮ　ＷＩＬＬＹ＆ＳＯＮＳ）出版（１９９９年）等に記載されている任意の保護基を挙げることができる。具体的には、メチル基、ベンジル基、ｐ－メトキシベンジル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、メトキシエチル基、、エトキシエチル基、シアノエチル基、シアノエトキシメチル基、フェニルカルバモイル基、１，１－ジオキソチオモルホリン－４－チオカルバモイル基、アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル（Ｔｏｍ）基、１－（４－クロロフェニル）－４－エトキシピペリジン－４－イル（Ｃｐｅｐ）基等を挙げることができる。水酸基の保護基は、好ましくは、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基またはｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基であり、経済性および入手の容易さの観点から、より好ましくはｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基である。なお、水酸基の保護および脱保護は周知であり、例えば上述のプロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシスに記載の方法によって行うことができる。
　保護されているアミノ基（Ｘｎ２）の保護基としては、特に限定されず、例えば、グリーンズ・プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ　ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ　ＧＲＯＵＰＳ　ｉｎ　ＯＲＧＡＮＩＣ　ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第４版、ウィリー・インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）出版（２００６年）等に記載されている保護基を挙げることができる。各保護基の具体例としては、ピバロイル基、ピバロイロキシメチル基、アセチル基、トリフルオロアセチル基、フェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、（２－ヘキシル）デカノイル基、ジメチルホルムアミジニル基、１－（ジメチルアミノ）エチリデン基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基を挙げることができる。アミノ基の保護基は、好ましくは、アセチル基、フェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、（２－ヘキシル）デカノイル基、ジメチルホルムアミジニル基、または１－（ジメチルアミノ）エチリデン基である。なお、アミノ基の保護および脱保護は周知であり、例えば上述のプロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシスに記載の方法によって行うことができる。
　式（ａ－ＶＩ）中のｍ個のＸｎ１は、好ましくは酸素原子である。
　式（ａ－ＶＩ）中のＸｎ２は、好ましくは保護されている水酸基である。
　式（ａ－ＶＩ）中のｍ個のＲｐ１は、好ましくは、それぞれ独立して－ＣＨ２ＣＨ２ＷＧで表される基である。
　式（ａ－ＶＩ）中の他の記号の説明は、前記の通りである。
　化合物（ａ－ＶＩ）は、好ましくは下記式（ａ－ｖｉ）で表される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
［式中、
　Ｒｎ４は、水酸基の保護基を示し；
　ｍ、ｍ＋１個のＢａｓｅ１、ｍ＋１個のＸ、ｍ個のＲ１０、ｍ個のＲｐ１、Ｌ、ＹおよびＺは、それぞれ独立して、前記と同義である。］
　式（ａ－ｖｉ）中のＲｎ４の説明は、Ｘｎ２における水酸基の保護基の説明と同じである。
　式（ａ－ｖｉ）中の他の記号の説明は、前記の通りである。
　また、核酸αとしては、例えば、下記式（ａ－ＶＩＩ）で表される化合物（即ち、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド）が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
［式中、
　ｍ＋１個のＸｎ１は、それぞれ独立して、酸素原子またはＮＨを示し；
　Ｌｎ１は有機基を示し；
　ｍ、ｍ＋１個のＢａｓｅ、ｍ＋１個のＸ、ｍ＋１個のＲ１０、ｍ＋１個のＲｐ１、Ｌ、ＹおよびＺは、それぞれ独立して、前記と同義である。］
　式（ａ－ＶＩＩ）中のＬｎ１は、好ましくはＣ２－６アルキレン基、より好ましくはエチレン基である。
　式（ａ－ＶＩＩ）中のｍ＋１個のＸｎ１は、好ましくは酸素原子である。
　式（ａ－ＶＩＩ）中のｍ＋１個のＲｐ１は、好ましくは、それぞれ独立して－ＣＨ２ＣＨ２ＷＧで表される基である。
　式（ａ－ＶＩＩ）中の他の記号の説明は、前記の通りである。
　化合物（ａ－ＶＩＩ）は、好ましくは下記式（ａ－ｖｉｉ）で表される化合物である（下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
　化合物（ａ－ＶＩＩ）は、自体公知の方法またはこれに準ずる方法で製造することができる。ｍが０であり、Ｘｎ１が酸素原子であり、Ｌがスクシニル基である化合物（ａ－ＶＩＩ）は、例えば、以下のような工程によって製造することができる。
　（ｉ）化合物Ｚ－Ｙ－Ｈとコハク酸無水物とを縮合させて、Ｚ－Ｙ－ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＯＨを製造する、
　（ｉｉ）得られたＺ－Ｙ－ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＯＨを、縮合剤の存在下、式：ＨＯ－Ｌｎ１－ＯＱ”で表される化合物（前記式中、Ｑ”は一時保護基を示し、Ｌｎ１は有機基を示す。）と縮合させた後、脱保護して、Ｚ－Ｙ－ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯ－Ｏ－Ｌｎ１－ＯＨを製造する、
　（ｉｉｉ）得られたＺ－Ｙ－ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯ－Ｏ－Ｌｎ１－ＯＨにホスホロアミダイト化されたヌクレオシドを反応させて、ｍが０であり、Ｘｎ１が酸素原子であり、Ｌがスクシニル基である化合物（ａ－ＶＩＩ）を製造する。
　上述のような縮合反応および脱保護反応は当業者にとって周知であり、当業者は、適宜条件を設定して行うことができる。
　Ｌがスクシニル基以外である化合物（ａ－ＶＩＩ）も、コハク酸無水物に代えて、対応する酸無水物、対応するジカルボン酸ハライド、対応するジカルボン酸の活性エステル等を用いて、同様の反応を行うことにより製造することができる。また、Ｘｎ１がＮＨである化合物（ａ－ＶＩＩ）は、３’位アミノ基がホスホロアミダイト化されたヌクレオシドを用いて、同様の反応を行うことにより製造することができる。また、ｍが１以上である化合物（ａ－ＶＩＩ）は、ｍが０である化合物（ａ－ＶＩＩ）を出発原料として用いて伸長プロセスを繰り返すことによって製造することができる。
　本発明の工程（１）で使用する核酸ａまたは核酸αは、好ましくは化合物（ａ－Ｉ）、化合物（ａ－ＶＩ）または化合物（ａ－ＶＩＩ）であり、より好ましくは化合物（ａ－ｉ）、化合物（ａ－ｖｉ）または化合物（ａ－ｖｉｉ）であり、より一層好ましくは化合物（ａ－ｉ）または化合物（ａ－ｖｉ）であり、さらに好ましくは化合物（ａ－ｉ）であり、さらに一層好ましくは化合物（ａ－ＩＩ）または化合物（ａ－ＩＶ）であり、特に好ましくは化合物（ａ－ＩＩＩ）または化合物（ａ－Ｖ）である。
　本発明の工程（１）で使用する核酸ｂは、５’位水酸基が保護基（一時保護基）で保護されている。水酸基の保護基としては、酸性条件下で脱保護が可能であり、且つ水酸基の保護基として用いられるものであれば、特に限定はされないが、例えば、トリチル基、９－（９－フェニル）キサンテニル基、９－フェニルチオキサンテニル基、１，１－ビス（４－メトキシフェニル）－１－フェニルメチル基（ジメトキシトリチル基）等のビス（Ｃ１－６アルコキシ）トリチル基、１－（４－メトキシフェニル）－１，１－ジフェニルメチル基（モノメトキシトリチル基）等のモノ（Ｃ１－１８アルコキシ）トリチル基等を挙げることができる。これらの中でも、脱保護のしやすさ、入手の容易さの観点から、水酸基の一時保護基は、モノメトキシトリチル基またはジメトキシトリチル基であることが好ましく、ジメトキシトリチル基であることがより好ましい。
　核酸ｂにおける３’位水酸基または３’位アミノ基がホスホロアミダイト法、Ｈ－ホスホネート法、ジハロホスフィン法およびオキサザホスホリジン法から選択される方法による修飾は、前記工程（１）の説明中で述べられた通り、当技術分野で公知の方法に従って行うことができる。
　核酸ｂの製造方法の一例としてホスホロアミダイト法を適用する場合については、例えば、国際公開第２０１７／１０４８３６号の記載を参照することができる。
　核酸ｂとしては、例えば、下記式（ｂ－Ｉ）で表される化合物（即ち、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド）が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
［式中、
　ｑは、０以上の整数を示し；
　ｑ＋１個のＢａｓｅ２は、それぞれ独立して、－Ｌ－Ｘ－Ｚおよび核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよい核酸塩基を示し；
　ｑ＋１個のＸ、ｑ＋１個のＲｐ１、ｑ個のＲ１０、Ｌ、ＸおよびＺは、それぞれ独立して、前記と同義であり；
　ｑ＋１個のＸｎ１は、それぞれ独立して、酸素原子またはＮＨを示し；
　Ｑ”は、酸性条件下で除去可能な水酸基の一時保護基を示し；
　Ｒ３６およびＲ３７は、それぞれ独立して、アルキル基を示すか、または隣接する窒素原子と一緒になって形成する５または６員の飽和環状アミノ基を示し、かかる飽和環状アミノ基は、窒素原子の他に環構成原子として酸素原子または硫黄原子を１個有していてもよい。］
　Ｒ３６およびＲ３７は、それぞれ独立して、好ましくはＣ１－１０アルキル基であるか、または隣接する窒素原子と一緒になって形成する５または６員の飽和環状アミノ基であり、より好ましくはＣ１－１０アルキル基であり、さらに好ましくはＣ１－６アルキル基である。
　酸性条件下で除去可能な水酸基の一時保護基の説明は、前記の通りである。Ｑ”は、好ましくはモノメトキシトリチル基またはジメトキシトリチル基であり、より好ましくはジメトキシトリチル基である。
　式（ｂ－Ｉ）中の核酸塩基のアミノ基は、保護基で保護されていることが好ましい。該保護基としては、－Ｌ－Ｘ－Ｚおよび核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基が挙げられる。Ｌ、ＸおよびＺの説明は、前記の通りである。核酸合成に用いられる保護基としては、アセチル基、フェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、（２－ヘキシル）デカノイル基、ジメチルホルムアミジニル基、および＝ＮＣ（Ｒ１１）－Ｎ（Ｒ１２）（Ｒ１３）基（式中、Ｒ１１は、メチル基を示し、Ｒ１２およびＲ１３は、それぞれ独立してＣ１－５アルキル基を示すか、またはＲ１１およびＲ１２が一緒になって、それらが結合する炭素原子および窒素原子と共に５員または６員の含窒素炭化水素環を形成していてもよい。）が好ましい。なお、前記＝ＮＣ（Ｒ１１）－Ｎ（Ｒ１２）（Ｒ１３）基としては、例えば１－（ジメチルアミノ）エチリデン基が挙げられる。化合物（ｂ－Ｉ）が複数のアミノ基を有する場合、アミノ基の保護基は１種のみでもよく、２種以上でもよい。
　ｑが０である場合、化合物（ｂ－Ｉ）はヌクレオシドであり、ｑが１以上である場合、化合物（ｂ－Ｉ）はオリゴヌクレオチドである。本工程で使用する化合物（ｂ－Ｉ）において、ｑは、４９以下が好ましく、２９以下がより好ましく、１９以下がさらに好ましく、４以下が特に好ましく、２以下が最も好ましい。
　ｑ＋１個のＸは、それぞれ独立して、好ましくは水素原子、ハロゲン原子、または保護されていてもよい水酸基であり、より好ましくは水素原子または保護されていてもよい水酸基である。
　Ｂａｓｅ２は、それぞれ独立して、好ましくは核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよい核酸塩基である。
　ｑ＋１個のＲｐ１は、それぞれ独立して、好ましくはＣＨ２ＣＨ２ＷＧで表される基である。
　ｑ＋１個のＸｎ１は、好ましくは酸素原子である。
　Ｌ、ＸおよびＺの説明は、前記の通りである。
　化合物（ｂ－Ｉ）は、好ましくは下記式（ｂ－ｉ）で表される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
［式中、
　ｑ＋１個のＢａｓｅ３は、それぞれ独立して、核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい核酸塩基を示し、
　ｑ、ｑ＋１個のＸ、ｑ＋１個のＲｐ１、ｑ個のＲ１０、Ｑ”、Ｒ３６およびＲ３７は、それぞれ独立して、前記と同義である。］
　式（ｂ－ｉ）中、核酸合成に用いられる保護基、ｑ、ｑ＋１個のＸ、ｑ＋１個のＲｐ１、ｑ個のＲ１０、Ｑ”、Ｒ３６およびＲ３７の説明は、前記の通りである。
　本発明の工程（１）で使用する核酸ａあるいは核酸αと核酸ｂとの組合せは、
　好ましくは化合物（ａ－Ｉ）、化合物（ａ－ＶＩ）または化合物（ａ－ＶＩＩ）と化合物（ｂ－Ｉ）との組合せであり、
　より好ましくは化合物（ａ－ｉ）、化合物（ａ－ｖｉ）または化合物（ａ－ｖｉｉ）と化合物（ｂ－ｉ）との組合せであり、
　より一層好ましくは化合物（ａ－ｉ）または化合物（ａ－ｖｉ）と化合物（ｂ－ｉ）との組合せであり、
　さらに好ましくは化合物（ａ－ｉ）と化合物（ｂ－ｉ）との組合せであり、
　さらに一層好ましくは化合物（ａ－ＩＩ）または化合物（ａ－ＩＶ）と化合物（ｂ－ｉ）との組合せであり、
　特に好ましくは化合物（ａ－ＩＩＩ）または化合物（ａ－Ｖ）と化合物（ｂ－ｉ）との組合せである。
　以上、本発明のホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法について詳述した。この製造方法は、現在当技術分野の核酸鎖の鎖伸長反応において一般的である「３’側から５’側の方向」への核酸鎖の伸長によるホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法となる。核酸Ａが、５’位水酸基が保護されておらず、かつその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである場合が好ましいが、本発明のホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法は、これとは逆方向の「５’側から３’側の方向」への核酸鎖の伸長によるホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造にも適用することができる。この「５’側から３’側の方向」への核酸鎖の伸長によるホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造は、以下に示される方法によって行うことができる。
［Ａ］３’位水酸基または３’位アミノ基が保護されておらず、かつその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよく、もしくは固相担体に結合していてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（核酸Ａ－１）（好ましくは、核酸Ａ－１における３’位は水酸基である）と、５’位水酸基がホスファイト体または亜リン酸ジエステル体の形成のための方法（例えば、ホスホロアミダイト法、Ｈ－ホスホネート法、ジハロホスフィン法およびオキサザホスホリジン法から選択される方法）により修飾されており、かつその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（核酸Ｂ－１）とを、酸化防止剤の存在下に縮合させて、ホスファイト体または亜リン酸ジエステル体を得る工程（工程（１－１））、
を含むホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
［Ｂ］３’位水酸基または３’位アミノ基が保護されておらず、かつその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよく、もしくは固相担体に結合していてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（核酸Ａ－１）（好ましくは、核酸Ａ－１における３’位は水酸基である）と、５’位水酸基がホスファイト体または亜リン酸ジエステル体の形成のための方法（例えば、ホスホロアミダイト法、Ｈ－ホスホネート法、ジハロホスフィン法、およびオキサザホスホリジン法から選択される方法）により修飾されており、かつその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（核酸Ｂ－１）とを、酸化防止剤の存在下に縮合させて、ホスファイト体または亜リン酸ジエステル体を得る工程（工程（１－１））、さらに、
得られたホスファイト体または亜リン酸ジエステル体を硫化剤と反応させる工程（工程（２－１））、を含む、ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
　なお、３’位に水酸基を有する核酸Ａ－１に代えて、３’位にアミノ基を有する核酸Ａ－１を用いて、ホスホロアミダイト法、Ｈ－ホスホネート法、ジハロホスフィン法、およびオキサザホスホリジン法などの方法を適用して縮合体を得る場合、３’位とリン原子との結合が、－Ｏ－Ｐ結合に代わって－Ｎ－Ｐ結合となるが、この場合も本明細書中では－Ｏ－Ｐ結合である場合に準じて便宜上「ホスファイト体」または「亜リン酸ジエステル体」と称することとする。また対応する「ＰＯ不純物」についても、同様に「ホスホトリエステル体」または「ホスホジエステル体」と称することとする。
　上記の２工程を含む製造方法における「酸化防止剤」、「硫化剤」、「核酸Ａ－１」、「核酸Ｂ－１」などの各構成要素の定義や２工程の詳細な反応条件などは、上記「３’側から５’側の方向」への核酸鎖の伸長によるホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法において詳述された各構成要素の定義や各工程の反応条件と同様である。これらを参照して、当業者であれば「５’側から３’側の方向」への核酸鎖の伸長によるホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造を適宜行うことができる。
　本発明においては、５’位水酸基が保護されておらず、かつその他の基が核酸合成に用いられる固相担体に結合していてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（以下、「核酸Ａ」と称する場合がある）や、３’位水酸基または３’位アミノ基が保護されておらず、かつその他の基が核酸合成に用いられる固相担体に結合していてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（核酸Ａ－１）を使用して、ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドを製造する方法も含む。固相条件下で本発明の製造方法が実施される場合には、核酸Ａまたは核酸Ａ－１の一つの基は固相担体に結合する。固相担体として用いられる固相支持体または樹脂は、固相合成での使用に適した当技術分野において知られているあらゆる支持体でありうる。本明細書中、「固相」という用語は、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが慣用される機能的リンカー又はハンドル基を介して上記の固相支持体又は樹脂に結合又はリンクされることを含んでおり、本文脈で「固相」と言うときにはこのようなリンカーも含意している。固相の例は、例えば、ポリスチレン支持体（例えばｐ－メチルベンジル－ヒドリルアミンによってさらに機能化されてもよい）、又は、珪藻土封入ポリジメチルアクリルアミド（ペプシンＫ）、シリカ又は微細孔性ガラスなどの剛直な機能化支持体である。固相の樹脂マトリクスは、両親媒性のポリスチレン－ＰＥＧ樹脂又はＰＥＧ－ポリアミド又はＰＥＧ－ポリエステル樹脂によって構成されてもよい。固相担体として、例えば、Ｗａｎｇ－ＰＥＧ レジンやＲｉｎｋ－アミド ＰＥＧ レジンが含まれる。
　以下、実施例に沿って本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。また、本発明において使用する試薬や装置、材料は特に言及されない限り、商業的に入手可能である。また、本明細書において、アミノ酸等を略号で表示する場合、各表示は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものである。
　後述の実施例等で使用する略号の意味は、以下の通りである。
ＳＵＣ：　スクシニル
ＴＯＢ：　３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ
２’－ＯＭｅ－Ｃ－ＣＥ　ホスホロアミダイト：　５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－メチル－シチジン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト
ＤＤＴＴ：　５－［（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－チオン
ＥＴＴ：　５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール
ＴＦＥ：　２，２，２－トリフルオロエタノール
ＴＯＦ－ＭＳ：　飛行時間型質量分析計
ＨＯ－ＣｍＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢ：　（２’－Ｏ－メチル－シチジン　３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　チミジン－３’－イル－［３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート）
ＨＯ－ＣｍＣｍＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢ：　（２’－Ｏ－メチル－シチジン　３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　２’－Ｏ－メチル－シチジン　３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　チミジン－３’－イル－［３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート）
ＨＯ－ＣｍＣｍＣｍＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢ：　（２’－Ｏ－メチル－シチジン　３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　２’－Ｏ－メチル－シチジン　３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　２’－Ｏ－メチル－シチジン　３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　チミジン－３’－イル－［３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート）
ＨＯ－ＣｍＣｍＣｍＣｍＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢ：　（２’－Ｏ－メチル－シチジン　３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル（２’－Ｏ－メチル－シチジン　３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　２’－Ｏ－メチル－シチジン　３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　２’－Ｏ－メチル－シチジン　３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　チミジン－３’－イル－［３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート）
Ｔ－ＣＥ　ホスホロアミダイト：　５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－チミジン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト
ＨＯ－ＴＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢ：　（チミジン　３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　チミジン－３’－イル－［３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート）
ＰＯＳ：５－フェニル－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－オン
Ｐｉｖ－ＴＯＢ：　３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル　ピバレート
ＰＡＤＳ：　フェニルアセチルジスルフィド
ＤＭＴｒ：　４，４’－ジメトキシトリチル
ＬＣ－ＴＯＦ　ＭＳ：　液体クロマトグラフ－飛行時間型質量分析計
ＤＢＵ：　１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン
ＰｉｖＣｌ：　ピバロイルクロリド
ＣＭＰＴ：Ｎ－（シアノメチル）ピロリジニウムトリフラート
２’－ＯＭｅ－Ｃ－ＣＥ　ホスホロアミダイト：　５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－Ｎ４－ベンゾイル－２’－Ｏ－メチル－シチジン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト
２’－ＯＭｅ－Ｇ－ＣＥ　ホスホロアミダイト：　５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－Ｎ２－イソブチリル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト
５－Ｍｅ－ｄＣ（Ｂｚ）－ＣＥ　ホスホロアミダイト：　５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－Ｎ４－ベンゾイル－２’－デオキシ－５－メチルシチジン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト
ｄＧ－ＣＥ　ホスホロアミダイト：　５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－Ｎ２－イソブチリル－デオキシグアノシン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト
ｄＴ－ＣＥ　ホスホロアミダイト：　５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－デオキシグチミジン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト
２’－Ｏ－ＴＢＤＭＳ－Ｃ（Ａｃ）-ＣＥ　ホスホロアミダイト：　５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－Ｎ４－アセチル－２’－Ｏ－（tert－ブチルジメチルシリル）－シチジン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト
ＬＮＡ－Ａ(Ｂｚ)－ＣＥ　ホスホロアミダイト：　５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－Ｎ６－ベンゾイル－２ ’－Ｏ，４ ’－Ｃ－メチレン－アデノシン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト
２’－Ｆ－Ｃ（Ｂｚ）－ＣＥ　ホスホロアミダイト：　５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－Ｎ４－ベンゾイル－２’－フルオロ－シチジン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホロアミダイト
ｄＴ－Ｈ－ホスホネート　ＴＥＡ 塩：　５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－デオキシチミジン－３’－Ｈ－ホスホネート，トリエチルアミン塩
ＨＯ－Ｔ－ＳＵＣ－ＴＯＢ：　デオキシチミジン－３’－イル　３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル　スクシネート
ＨＯ－Ｃ－ＳＵＣ－ＴＯＢ：　Ｎ４－ベンゾイル－デオキシシチジン－３’－イル－［３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート
ＨＯ－ＴＣ－ＳＵＣ－ＴＯＢ：　デオキシチミジン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　Ｎ４－ベンゾイル－デオキシシチジン－３’－イル－［３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート
ＤＭＴｒＯ－Ａ・Ｔ・Ｃ・Ｇ・Ａ・Ｃ・Ｔ・Ｃ・Ｔ・Ｃ・Ｇ・Ａ・Ｇ・Ｃ・Ｇ・Ｔ・Ｔ・Ｃ・Ｔ・Ｃ－ＳＵＣ－ＴＯＢ（式中、「・」は、ホスホロチオニル結合を意味する。）：
５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－　Ｎ６－[１－（ジメチルアミノ）エチリデン]－デオキシアデノシン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル－デオキシチミジン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　Ｎ４－ベンゾイル－デオキシシチジン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　Ｎ２－イソブチリル－デオキシグアノシン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　Ｎ６－[１－（ジメチルアミノ）エチリデン]－－デオキシアデノシン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　Ｎ４－ベンゾイル－デオキシシチジン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル－デオキシチミジン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　Ｎ４－ベンゾイル－デオキシシチジン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル－デオキシチミジン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　Ｎ４－ベンゾイル－デオキシシチジン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　Ｎ２－イソブチリル－デオキシグアノシン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　Ｎ６－[１－（ジメチルアミノ）エチリデン]－－デオキシアデノシン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　Ｎ２－イソブチリル－デオキシグアノシン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　Ｎ４－ベンゾイル－デオキシシチジン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　Ｎ２－イソブチリル－デオキシグアノシン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル－デオキシチミジン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル－デオキシチミジン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　Ｎ４－ベンゾイル－デオキシシチジン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル－デオキシチミジン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　Ｎ４－ベンゾイル－デオキシシチジン－３’－イル－［３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート
ＨＯ－ＣｍＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢ：　Ｎ４－ベンゾイル－２’－Ｏ－メチル－シチジン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　デオキシチミジン－３’－イル－［３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート
ＨＯ－ＧｍＣｍＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢ：　Ｎ２－イソブチリル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン　３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホリル　Ｎ４－ベンゾイル－２’－Ｏ－メチル－シチジン　３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　デオキシチミジン－３’－イル－［３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート
ＨＯ－２’－ＯＭｅ－Ｕ－ＳＵＣ－ＴＯＢ：　２’－Ｏ－メチル－ウリジン－３’－イル　３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル　スクシネート
ＨＯ－Ｕｍ－ＳＵＣ－ＴＯＢ：　２’－Ｏ－メチル－ウリジン－３’－イル　３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル　スクシネート
ＨＯ－ＣｍＵｍ－ＳＵＣ－ＴＯＢ：　Ｎ４－ベンゾイル－２’－Ｏ－メチル－シチジン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　２’－Ｏ－メチル－ウリジン－３’－イル－［３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート
ＨＯ－ＧＵｍ－ＳＵＣ－ＴＯＢ：　Ｎ２－イソブチリル－デオキシグアノシン　３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　２’－Ｏ－メチル－ウリジン－３’－イル－［３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート
ＨＯ－ＡＬＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢ：　Ｎ６－ベンゾイル－２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン－アデノシン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　デオキシチミジン－３’－イル－［３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート
ＨＯ－ＣｆＡＬＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢ：　Ｎ４－ベンゾイル－２’－フルオロ－シチジン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　Ｎ６－ベンゾイル－２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン－アデノシン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　デオキシチミジン－３’－イル－［３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート
ＨＯ－ｒＣＣｆＡＬＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢ：　Ｎ４－アセチル－２’－Ｏ－（tert－ブチルジメチルシリル）－シチジン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　Ｎ４－ベンゾイル－２’－フルオロ－シチジン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　Ｎ６－ベンゾイル－２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン－アデノシン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　デオキシチミジン－３’－イル－［３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート
ＨＯ－（ＣＨ２）２－ＳＵＣ－ＴＯＢ：　３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル　２－ヒドロキシエチル　スクシネート
ＨＯ－ＡＬ（ＣＨ２）２－ＳＵＣ－ＴＯＢ：　Ｎ６－ベンゾイル－２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン－アデノシン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　エチルオキシ－［３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート
ＨＯ－ＣｆＡＬ（ＣＨ２）２－ＳＵＣ－ＴＯＢ：　Ｎ４－ベンゾイル－２’－フルオロ－シチジン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　Ｎ６－ベンゾイル－２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン－アデノシン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　エチルオキシ－［３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート
ＨＯ－ｒＣＣｆＡＬ（ＣＨ２）２－ＳＵＣ－ＴＯＢ：　Ｎ４－アセチル－２’－Ｏ－（tert－ブチルジメチルシリル）－シチジン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　Ｎ４－ベンゾイル－２’－フルオロ－シチジン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　Ｎ６－ベンゾイル－２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン－アデノシン－３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　エチルオキシ－［３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート
ＨＯ－ＴＨＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢ：　デオキシチミジン－３’－ホスホネート　デオキシチミジン－３’－イル－［３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート
ＨＯ－ＴＯＨＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢ：デオキシチミジン－３’－ホスホロチオニル　デオキシチミジン－３’－イル－［３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート
ＨＯ－ＧｍＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢ：　Ｎ２－イソブチリル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン　３’－［Ｏ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　デオキシチミジン－３’－イル－［３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート
ＨＯ－ＴＳＣＮＥｔＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢ：デオキシチミジン－３’－［Ｓ－（２－シアノエチル）］ホスホロチオニル　デオキシチミジン－３’－イル－［３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート
　以下、ＴＯＢ付加化合物は、国際公開第２０１２／１５７７２３号に記載された方法により合成した。また、実施例や比較例で使用する２’－ＯＭｅ－Ｃ－ＣＥ　ホスホロアミダイト等のホスホロアミダイトモノマーは、市販のものを用いた。
実施例１：ホスホロチオエート化２～５量体の合成（酸化防止剤有りの場合）
　アルゴン雰囲気下、５０ｍＬの二口フラスコにＨＯ－Ｔ－ＳＵＣ－ＴＯＢ（２４８．２ｍｇ, ０．２０ｍｍｏｌ）を入れ、脱水ジクロロメタン（１０．０ｍＬ）と脱水アセトニトリル（１．０ｍＬ）を加え溶解させた後、２’－ＯＭｅ－Ｃ－ＣＥ　ホスホロアミダイト（５１８．５ｍｇ, ０．６０ｍｍｏｌ）とメチルジフェニルホスフィン（３７．８μＬ, ０．２０ｍｍｏｌ）を加え、３０分間撹拌した。その後、ＥＴＴ（５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール 、７８．１ｍｇ, ０．６０ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間撹拌した。
　続いて、反応溶液にＴＦＥ（２，２，２－トリフルオロエタノール、２１９μＬ, ３．０１ｍｍｏｌ）を加え室温で３０分間撹拌した後、２，６－キシリジン（６３８μＬ, ５．１８ｍｍｏｌ）とＤＤＴＴ（５－［（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－チオン、２１５．６ｍｇ, １．０５ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１時間撹拌した。得られた２量体（２ｍｅｒのように表記する場合がある。以下同様。）を分析したところ、ＰＯ不純物は０．０９％であった。
ｍ／ｚ（ＴＯＦ－ＭＳ）：Ｃａｌｃｄ．１７２９．０７, Ｆｏｕｎｄ　１７３０．０８　［Ｍ＋Ｈ］＋
　上記と同様にして伸長した２量体ＨＯ－ＣｍＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢ（２７９．６ｍｇ, ０．１６ｍｍｏｌ）と２’－ＯＭｅ－Ｃ－ＣＥ　ホスホロアミダイト（４１９．２ｍｇ, ０．４８５ｍｍｏｌ）を用いて３量体ＨＯ－ＣｍＣｍＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢを合成した（２９０．８ｍｇ）。得られた３量体を分析したところ、ＰＯ不純物は０．２５％であった。
ｍ／ｚ（ＴＯＦ－ＭＳ）：Ｃａｌｃｄ．２２２１．１６, Ｆｏｕｎｄ　２２２２．１７　［Ｍ＋Ｈ］＋
　同様にして伸長した３量体ＨＯ－ＣｍＣｍＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢ（２９０．８ｍｇ, ０．１３ｍｍｏｌ）と２’－ＯＭｅ－Ｃ－ＣＥ　ホスホロアミダイト（３４０．３ｍｇ, ０．３９４ｍｍｏｌ）を用いて４量体ＨＯ－ＣｍＣｍＣｍＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢを合成した（２８３．０ｍｇ）。得られた４量体を分析したところ、０．２７％のＰＯ不純物が含まれていた。
ｍ／ｚ（ＴＯＦ－ＭＳ）：Ｃａｌｃｄ．２７１３．２４, Ｆｏｕｎｄ　２７１４．２３　［Ｍ＋Ｈ］＋
　同様にして伸長した４量体ＨＯ－ＣｍＣｍＣｍＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢ（２８３．０ｍｇ, ０．１０ｍｍｏｌ）と２’－ＯＭｅ－Ｃ－ＣＥ　ホスホロアミダイト（２７０．１ｍｇ, ０．３１３ｍｍｏｌ）を用いて５量体ＨＯ－ＣｍＣｍＣｍＣｍＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢを合成した（２５４ｍｇ）。得られた５量体を分析したところ、０．３０％のＰＯ不純物が含まれていた。
ｍ／ｚ（ＴＯＦ－ＭＳ）：Ｃａｌｃｄ．３２０５．３３, Ｆｏｕｎｄ　１６０４．６９　［Ｍ＋２Ｈ］２＋
　酸化防止剤有りの場合における、各鎖長でのＰＯ不純物の含有割合を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
比較例１：ホスホロチオエート化２～５量体の合成（酸化防止剤無しの場合）
　アルゴン雰囲気下、５０ｍＬの二口フラスコにＨＯ－Ｔ－ＳＵＣ－ＴＯＢ（２４７．６ｍｇ, ０．２０ｍｍｏｌ）を入れ、脱水ジクロロメタン（１０．０ｍＬ）と脱水アセトニトリル（１．０ｍＬ）を加え溶解させた後、２’－ＯＭｅ－Ｃ－ＣＥ　ホスホロアミダイト（５１８．４ｍｇ, ０．６０ｍｍｏｌ）とＥＴＴ（５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール 、７８．１ｍｇ, ０．６０ｍｍｏｌ）を順次加え室温で１時間撹拌した。続いて、反応溶液にＴＦＥ（２，２，２－トリフルオロエタノール、２１８．６μＬ, ３．０ｍｍｏｌ）を加え室温で３０分間撹拌した後、２，６－キシリジン（３８０．６μＬ, ３．０ｍｍｏｌ）とＤＤＴＴ（５－［（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－チオン、１２９．３ｍｇ, ０．６３ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１時間撹拌した。得られた２量体を分析したところ、ＰＯ不純物は０．１１％であった。
ｍ／ｚ（ＴＯＦ－ＭＳ）：Ｃａｌｃｄ．１７２９．０７, Ｆｏｕｎｄ　１７３０．０８　［Ｍ＋Ｈ］＋
　上記と同様にして２量体ＨＯ－ＣｍＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢ（２９７．４ｍｇ, ０．１７ｍｍｏｌ）と２’－ＯＭｅ－Ｃ－ＣＥ　ホスホロアミダイト（４４５．５ｍｇ, ０．５２ｍｍｏｌ）を用いて３量体ＨＯ－ＣｍＣｍＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢを合成した（３４９．１ｍｇ）。得られた３量体を分析したところ、ＰＯ不純物は０．４６％であった。
ｍ／ｚ（ＴＯＦ－ＭＳ）：Ｃａｌｃｄ．２２２１．１６, Ｆｏｕｎｄ　２２２２．１７　［Ｍ＋Ｈ］＋
　同様にして３量体ＨＯ－ＣｍＣｍＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢ（３４９．１ｍｇ, ０．１６ｍｍｏｌ）と２’－ＯＭｅ－Ｃ－ＣＥ　ホスホロアミダイト（４０７．５ｍｇ, ０．４７ｍｍｏｌ）を用いて４量体ＨＯ－ＣｍＣｍＣｍＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢを合成した（４１５．３ｍｇ）。得られた４量体を分析したところ、ＰＯ不純物は０．６８％であった。
ｍ／ｚ（ＴＯＦ－ＭＳ）：Ｃａｌｃｄ．２７１３．２４, Ｆｏｕｎｄ　２７１４．２３　［Ｍ＋Ｈ］＋
　同様にして４量体ＨＯ－ＣｍＣｍＣｍＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢ（４１５．３ｍｇ, ０．１５ｍｍｏｌ）と２’－ＯＭｅ－Ｃ－ＣＥ　ホスホロアミダイト（３９９．２ｍｇ, ０．４６ｍｍｏｌ）を用いて５量体ＨＯ－ＣｍＣｍＣｍＣｍＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢを合成した（４３９．３ｍｇ）。得られた５量体を分析したところ、ＰＯ不純物は０．９９％であった。
ｍ／ｚ（ＴＯＦ－ＭＳ）：Ｃａｌｃｄ．３２０５．３３, Ｆｏｕｎｄ　１６０４．６９　［Ｍ＋２Ｈ］２＋
　酸化防止剤無しの場合における、各鎖長でのＰＯ不純物の含有割合を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
実施例２：ホスホロチオエート化２量体からの３量体の合成（各種酸化防止剤有りの場合）
　アルゴン雰囲気下、２０ｍＬの二口フラスコに、実施例１において２’－ＯＭｅ－Ｃ－ＣＥ　ホスホロアミダイトの代わりにＴ－ＣＥ　ホスホロアミダイトを用いることにより、実施例１と同様にして合成したＨＯ－ＴＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢ（５６．４ｍｇ, ０．０３５ｍｍｏｌ）を入れ、脱水ジクロロメタン（１．８ｍＬ）と脱水アセトニトリル（０．５ｍＬ）を加え溶解させた後、２’－ＯＭｅ－Ｃ－ＣＥ　ホスホロアミダイト（９１．８ｍｇ, ０．１０５ｍｍｏｌ）と各種酸化防止剤(０．０３５ｍｍｏｌ）を加え、３０分間撹拌した。その後、ＥＴＴ（５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール 、１４ｍｇ, ０．１０５ｍｍｏｌ）を加え室温で３時間撹拌した。続いて、反応溶液にＴＦＥ（２，２，２－トリフルオロエタノール、３８．４μL, ０．５３ｍｍｏｌ）を加え室温で２時間撹拌した後、２，６－キシリジン（５０．２μＬ, ０．４０７ｍｍｏｌ）とＰＯＳ（５－フェニル－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－オン、３３．３ｍｇ, ０．１７１ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１時間撹拌後、各反応溶液を分析した。ＰＯ不純物の含有割合に関する結果を表３に示す。
比較例２：ホスホロチオエート化２量体から３量体の合成（酸化防止剤無しの場合）
　実施例２の各種酸化防止剤(０．０３５ｍｍｏｌ）を含まないこと以外は、実施例２と同様にして行った。ＰＯ不純物の含有割合に関する結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000041
　以下、酸化防止剤の存在下における種々のホスホロチオエート化オリゴマーの合成例を示す。
実施例３：ホスホロチオエート化４量体の合成（ホスホロアミダイト法）
伸長反応
　アルゴン雰囲気下、２００ｍＬの二口フラスコにＨＯ－Ｔ－ＳＵＣ－ＴＯＢ（３００ｍｇ，２４２μｍｏｌ）とＰｉｖ－ＴＯＢ （４５０ｍｇ，４５１μｍｏｌ）を入れ、脱水ジクロロメタン（１２．１ｍＬ）と脱水アセトニトリル（３．６ｍＬ）を加え溶解させた。その後、トリフェニルホスフィン（３１．８ｍｇ，１２１μｍｏｌ）とＬＮＡ－Ａ(Ｂｚ)－ＣＥ　ホスホロアミダイト（６４４ｍｇ，７２７μｍｏｌ）と５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール （９４．６ｍｇ，７２７μｍｏｌ）を順次加え室温で１．０時間撹拌した。
　続いて、反応溶液に２，２，２－トリフルオロエタノール （２６５μＬ，３．６ｍｍｏｌ）を加え室温で３０分撹拌した後、２，６－キシリジン （５０６μＬ，４．１ｍｍｏｌ）とＤＤＴＴ （１７４ｍｇ，８４８μｍｏｌ）を順次加え、室温で１．７時間撹拌した。その後、インドール（４２４ｍｇ，３．６ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（１．１ｍＬ，１４．４ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１．０時間撹拌した。続いて反応溶液にピリジン（３．５ｍＬ，４３．０ｍｍｏｌ）と水（１８０μＬ）を順次加え、室温にて１．０時間撹拌した。その後、アセトニトリル（１１２ｍＬ）を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥し、２量体ＨＯ－ＡＬＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢを白色固体として得た。（８２９．９ｍｇ、９５％）
ｍ／ｚ：Ｃａｌｃｄ．１７５１．０７，　Ｆｏｕｎｄ　１７５３．０９[Ｍ＋Ｈ]＋
　上記と同様にして、上記で得られた白色固体（８３０ｍｇ）と２’－Ｆ－Ｃ（Ｂｚ）－ＣＥ　ホスホロアミダイト、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾールの代わりに４，５－ジシアノイミダゾールを用いて３量体ＨＯ－ＣｆＡＬＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢを白色固体として得た。（７８０．１ｍｇ、８３％）
ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ．２２３１．１３，　ｆｏｕｎｄ　１１１７．０７[Ｍ＋２Ｈ]２＋
　同様にして、上記で得られた白色固体（７１８ｍｇ）と２’－Ｏ－ＴＢＤＭＳ－Ｃ（Ａｃ）-ＣＥ　ホスホロアミダイト、４，５－ジシアノイミダゾール５－の代わりにエチルチオ－１Ｈ－テトラゾールを用いて４量体ＨＯ－ｒＣＣｆＡＬＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢを白色固体として得た。（７５８．５ｍｇ、９４％）
ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ．２７６１．２７，　ｆｏｕｎｄ　１３８２．１５ [Ｍ＋２Ｈ]２＋
脱保護反応
　上記で得られた白色固体（１０ｍｇ）と２８％アンモニア水（５ｍＬ）をオートクレーブに入れて、６５℃で４時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルターにより反応液中の不溶物を除去した後、遠心エバポレーターで減圧濃縮した。その後、濃縮液を凍結乾燥し目的物である２’－Ｏ－（tert－ブチルジメチルシリル）－シチジン－３’－ホスホロチオニル－２’－フルオロ－シチジン－３’－ホスホロチオニル－２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン－アデノシン－３’－ホスホロチオニル－デオキシチミジンを得た。
ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ．１３５７．２４，ｆｏｕｎｄ　１３５６．２３[Ｍ－Ｈ]－
実施例４：ホスホロチオエート化２量体の合成（ホスホロアミダイト法）
　アルゴン雰囲気下、１０００ｍＬの三口フラスコにＨＯ－Ｃ－ＳＵＣ－ＴＯＢ（３．０ｇ，２．３ｍｍｏｌ）とＰｉｖ－ＴＯＢ （３．０ｇ，３ｍｍｏｌ）を入れ、脱水クロロホルム（１１３ｍＬ）と脱水アセトニトリル（３４ｍＬ）を加え溶解させた。その後、トリフェニルホスフィン（２９６ｍｇ，１．１ｍｍｏｌ）とｄＴ－ＣＥ　ホスホロアミダイト（３．７ｇ，５．０ｍｍｏｌ）と５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール （６４８ｍｇ，５．０ｍｍｏｌ）を順次加え室温で１．５時間撹拌した。
　続いて、反応溶液に２，２，２－トリフルオロエタノール （１．８ｍＬ，２４．９ｍｍｏｌ）を加え室温で３０分撹拌した後、２，６－キシリジン （２．２ｍＬ，１７．６ｍｍｏｌ）とＰＯＳ（１．２ｇ，６．１ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１．５時間撹拌した。
　その後、２，３－ジメチルフラン（２．６ｍＬ，２４．８ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（５．６ｍＬ，７２．８ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１．５時間撹拌した。続いて反応溶液にピリジン（４４．１ｍＬ，５４６ｍｍｏｌ）と水（９６０μＬ）を順次加え、室温にて１．５時間撹拌した。その後、アセトニトリル（１Ｌ）を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥し、２量体ＨＯ－ＴＣ－ＳＵＣ－ＴＯＢを白色固体として得た。（６．７ｇ、９９％）
実施例５：ホスホロチオエート化３量体の合成（ホスホロアミダイト法）
伸長反応
　ＨＯ－Ｔ－ＳＵＣ－ＴＯＢの代わりにＨＯ－（ＣＨ２）２－ＳＵＣ－ＴＯＢ（２５６ｍｇ）を用いて実施例３と同様にして、ＨＯ－ＡＬ（ＣＨ２）２－ＳＵＣ－ＴＯＢ、続いて２量体ＨＯ－ＣｆＡＬ（ＣＨ２）２－ＳＵＣ－ＴＯＢ、最後に３量体ＨＯ－ｒＣＣｆＡＬ（ＣＨ２）２－ＳＵＣ－ＴＯＢを白色固体として得た。（６９１ｍｇ）
ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ．２５８１．２２，　ｆｏｕｎｄ　１２９２．１１ [Ｍ＋２Ｈ]２＋
脱保護反応
　上記で得られた白色固体（１０ｍｇ）と２８％アンモニア水（５ｍＬ）をオートクレーブに入れて、６５℃で４時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルターにより反応液中の不溶物を除去した後、遠心エバポレーターで減圧濃縮した。その後、濃縮液を凍結乾燥し目的物である２－［２’－Ｏ－（tert－ブチルジメチルシリル）－シチジン－３’－ホスホロチオニル－２’－フルオロ－シチジン－３’－ホスホロチオニル－２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン－アデノシン－３’－ホスホロチオニル］エタノールを得た。
ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ．１１７７．１８，ｆｏｕｎｄ　１１７６．１８[Ｍ－Ｈ]－
実施例６：ホスホロチオエート化２０量体の合成（ホスホロアミダイト法）
伸長反応
　クロロホルムの代わりにジクロロメタンを用い、実施例４と同様の操作を１８回繰り返し、２０量体ＤＭＴｒＯ－Ａ・Ｔ・Ｃ・Ｇ・Ａ・Ｃ・Ｔ・Ｃ・Ｔ・Ｃ・Ｇ・Ａ・Ｇ・Ｃ・Ｇ・Ｔ・Ｔ・Ｃ・Ｔ・Ｃ－ＳＵＣ－ＴＯＢ（式中、「・」は、ホスホロチオニル結合を意味する。）を白色固体として得た。（８．５ｇ）
脱保護反応
　得られた白色固体（５ｍｇ）と２８％アンモニア水（５ｍＬ）をオートクレーブに入れて、６５℃で４時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルターにより反応液中の不溶物を除去した後、遠心エバポレーターで減圧濃縮した。その後、濃縮液を凍結乾燥し目的物である５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－デオキシアデノシン－３’－ホスホロチオニル－デオキシチミジン－３’－ホスホロチオニル－デオキシシチジン－３’－ホスホロチオニル－デオキシグアノシン－３’－ホスホロチオニル－デオキシアデノシン－３’－ホスホロチオニル－デオキシシチジン－３’－ホスホロチオニル－デオキシチミジン－３’－ホスホロチオニル－デオキシシチジン－３’－ホスホロチオニル－デオキシチミジン－３’－ホスホロチオニル－デオキシシチジン－３’－ホスホロチオニル－デオキシグアノシン－３’－ホスホロチオニル－デオキシアデノシン－３’－ホスホロチオニル－デオキシグアノシン－３’－ホスホロチオニル－デオキシシチジン－３’－ホスホロチオニル－デオキシグアノシン－３’－ホスホロチオニル－デオキシチミジン－３’－ホスホロチオニル－デオキシチミジン－３’－ホスホロチオニル－デオキシシチジン－３’－ホスホロチオニル－デオキシチミジン－３’－ホスホロチオニル－デオキシシチジンを得た。
ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ．６６４８．７３，ｆｏｕｎｄ　１６６１．６７[Ｍ－４Ｈ]４ー
実施例７：ホスホロチオエート化２量体の合成（Ｈ－ホスホネート法）
　アルゴン雰囲気下、５０ｍＬの二口フラスコにＨＯ－Ｔ－ＳＵＣ－ＴＯＢ（１００ｍｇ，８０．８μｍｏｌ）とｄＴ－Ｈ－ホスホネート　ＴＥＡ 塩（１１６．０ｍｇ，１６３μｍｏｌ）とトリフェニルホスフィン（１０．０ｍｇ，３８．１μｍｏｌ）を入れ、脱水ジクロロメタン（２．０ｍＬ）と脱水ピリジン（２．０ｍＬ）を加え溶解させた。その後、ＰｉｖＣｌ（２９．５μｌ，２４２μｍｏｌ）を加え室温で１．０時間撹拌した。
　続いて、反応溶液にＤＢＵ（４８．４μＬ，３２４μｍｏｌ）とＤＤＴＴ（３４．３ｍｇ，１６７μｍｏｌ）を加え室温で３０分撹拌した。その後、アセトニトリル（３０ｍＬ）を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥し白色固体（１４５．７ｍｇ）を得た。得られた固体をアルゴン雰囲気下、５０ｍＬの二口フラスコに入れ、脱水ジクロロメタン（４．０ｍＬ）と脱水アセトニトリル（１．２ｍＬ）を加え溶解させた。
　その後、インドール（４６．３ｍｇ，３９５μｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（７２．６μＬ，９４８μｍｏｌ）を順次加え、室温で１．０時間撹拌した。続いて反応溶液にピリジン（２２０μＬ，２．７ｍｍｏｌ）と水（４２μＬ）を順次加え、室温にて１．０時間撹拌した。その後、アセトニトリル（３０ｍＬ）を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥し２量体ＨＯ－ＴＯＨＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢを白色固体として得た。（８５．９ｍｇ、７１％）
ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ．１５５７．０１，　ｆｏｕｎｄ　１５５８．０２ [Ｍ＋Ｈ]＋
実施例８：ホスホロチオエート化２量体の合成（Ｈ－ホスホネート法）
　アルゴン雰囲気下、５０ｍＬの二口フラスコにＨＯ－Ｔ－ＳＵＣ－ＴＯＢ（１０１ｍｇ，８１．３μｍｏｌ）とｄＴ－Ｈ－ホスホネート　ＴＥＡ 塩（１１５．４ｍｇ，１６３μｍｏｌ）とトリフェニルホスフィン（１０．８ｍｇ，４１．１μｍｏｌ）を入れ、脱水ジクロロメタン（２．０ｍＬ）と脱水ピリジン（２．０ｍＬ）を加え溶解させた。その後、ＰｉｖＣｌ（２９．５μｌ，２４２μｍｏｌ）を加え室温で１．０時間撹拌した。その後、アセトニトリル（３０ｍＬ）を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過し白色固体（１４５．２ｍｇ）を得た。得られた固体をアルゴン雰囲気下、５０ｍＬの二口フラスコに入れ、脱水ジクロロメタン（４．０ｍＬ）と脱水アセトニトリル（１．２ｍＬ）を加え溶解させた。
　その後、インドール（４７．２ｍｇ，４０３μｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（７３．０μＬ，９５３μｍｏｌ）を順次加え、室温で１．０時間撹拌した。続いて反応溶液にピリジン（２３０μＬ，２．８ｍｍｏｌ）と水（４２μＬ）を順次加え、室温にて１．０時間撹拌した。その後、アセトニトリル（３０ｍＬ）を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥し２量体ＨＯ－ＴＨＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢを白色固体として得た。（１０４ｍｇ、８６％）
ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ．１５２５．０３，　ｆｏｕｎｄ　１５２６．０５[Ｍ＋Ｈ]＋
実施例９：ホスホロチオエート化２量体の合成（硫化剤：ＰＡＤＳ）
　アルゴン雰囲気下、５０ｍＬの二口フラスコにＨＯ－Ｔ－ＳＵＣ－ＴＯＢ（９８．８ｍｇ，７９．６μｍｏｌ）とＰｉｖ－ＴＯＢ （１０２ｍｇ，１０３μｍｏｌ）を入れ、脱水ジクロロメタン（４．０ｍＬ）と脱水アセトニトリル（１．２ｍＬ）を加え溶解させた。その後、トリフェニルホスフィン（１３．２ｍｇ，５０．３μｍｏｌ）と２’－ＯＭｅ－Ｇ－ＣＥ　ホスホロアミダイト（１４４ｍｇ，１６５μｍｏｌ）と５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（２１．２ｍｇ，１６３μｍｏｌ）を順次加え室温で１．０時間撹拌した。
　続いて、反応溶液に２，２，２－トリフルオロエタノール（５８．９μＬ，８１０μｍｏｌ）を加え室温で３０分撹拌した後、２，６－キシリジン（７１．２μＬ，５７７μｍｏｌ）とビスフェニルアセチルジスルフィド（６２．９ｍｇ，２０８μｍｏｌ）を順次加え、室温で１．０時間撹拌した。その後、インドール（９８．２ｍｇ，８３８μｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（２２０μＬ，２．８７ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１．０時間撹拌した。
　続いて、反応溶液にピリジン（６９０μＬ，８．６ｍｍｏｌ）とメタノール（５７μＬ）を順次加え、室温にて１．０時間撹拌した。その後、アセトニトリル（３７ｍＬ）を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥し２量体ＨＯ－ＧｍＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢを白色固体として得た。（２２２．７ｍｇ、９３％）
ｍ／ｚ（ＴＯＦ－ＭＳ）：Ｃａｌｃｄ．１７３５．０９，　Ｆｏｕｎｄ　１７３７．１１[Ｍ＋Ｈ]＋
実施例１０：ホスホロチオエート化２量体の合成（硫化剤：キサンタンヒドリド）
　アルゴン雰囲気下、５０ｍＬの二口フラスコにＨＯ－Ｔ－ＳＵＣ－ＴＯＢ（９６．８ｍｇ，７８．２μｍｏｌ）とＰｉｖ－ＴＯＢ （９９．３ｍｇ，９９．５μｍｏｌ）を入れ、脱水ジクロロメタン（４．０ｍＬ）と脱水アセトニトリル（１．２ｍＬ）を加え溶解させた。その後、トリフェニルホスフィン（１１．５ｍｇ，４３．８μｍｏｌ）と２’－ＯＭｅ－Ｇ－ＣＥ　ホスホロアミダイト（１４０ｍｇ，１６１μｍｏｌ）と５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（２０．９ｍｇ，１６１μｍｏｌ）を順次加え室温で１．０時間撹拌した。
　続いて、反応溶液に２，２，２－トリフルオロエタノール（５８．９μＬ，８１０μｍｏｌ）を加え室温で３０分撹拌した後、２，６－キシリジン（７１．２μＬ，５７７μｍｏｌ）とキサンタンヒドリド（３１．２ｍｇ，２０８μｍｏｌ）を順次加え、室温で１．０時間撹拌した。
　その後、インドール（９６．５ｍｇ，８２４μｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（２２０μＬ，２．８７ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１．０時間撹拌した。続いて、反応溶液にピリジン（６９０μＬ，８．６ｍｍｏｌ）とメタノール（５７μＬ）を順次加え、室温にて１．０時間撹拌した。その後、アセトニトリル（３７ｍＬ）を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥し２量体ＨＯ－ＧｍＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢを白色固体として得た。（２１７．９ｍｇ、９１％）
ｍ／ｚ（ＴＯＦ－ＭＳ）：Ｃａｌｃｄ．１７３５．０９，　Ｆｏｕｎｄ　１７３７．１１[Ｍ＋Ｈ]＋
　実施例１１：ホスホロチオエート化２量体の合成（硫化剤：硫黄）
　アルゴン雰囲気下、５０ｍＬの二口フラスコにＨＯ－Ｔ－ＳＵＣ－ＴＯＢ（１０１ｍｇ，８１．３μｍｏｌ）とＰｉｖ－ＴＯＢ（９８．７ｍｇ，９８．９μｍｏｌ）を入れ、脱水ジクロロメタン（４．０ｍＬ）と脱水アセトニトリル（１．２ｍＬ）を加え溶解させた。その後、トリフェニルホスフィン（１２．０ｍｇ，４５．８μｍｏｌ）と２’－ＯＭｅ－Ｇ－ＣＥ　ホスホロアミダイト（１４１ｍｇ，１６２μｍｏｌ）と５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（２１．９ｍｇ，１６８μｍｏｌ）を順次加え室温で１．０時間撹拌した。
　続いて、反応溶液に２，２，２－トリフルオロエタノール（５８．９μＬ，８１０μｍｏｌ）を加え室温で３０分撹拌した後、２，６－キシリジン（７１．２μＬ，５７７μｍｏｌ）と硫黄（１３．０ｍｇ，４０５μｍｏｌ）を順次加え、室温で１．０時間撹拌した。
　その後、インドール（９６．０ｍｇ，８１９μｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（２２０μＬ，２．８７ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１．０時間撹拌した。続いて反応溶液にピリジン（６９０μＬ，８．６ｍｍｏｌ）とメタノール（５７μＬ）を順次加え、室温にて１．０時間撹拌した。その後、アセトニトリル（３７ｍＬ）を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥し２量体ＨＯ－ＧｍＴ－ＳＵＣ－ＴＯＢを白色固体として得た。（２２１．２ｍｇ、９２％）
ｍ／ｚ（ＴＯＦ－ＭＳ）：Ｃａｌｃｄ．１７３５．０９，　Ｆｏｕｎｄ　１７３７．１１[Ｍ＋Ｈ]＋
　実施例１２：ホスホロチオエート化２量体の合成（脱保護：トリクロロ酢酸）
　アルゴン雰囲気下、５０ｍＬの二口フラスコにＨＯ－Ｕｍ－ＳＵＣ－ＴＯＢ（１０２．４ｍｇ，８１．７μｍｏｌ）とＰｉｖ－ＴＯＢ （１０５ｍｇ，１０５μｍｏｌ）を入れ、脱水ジクロロメタン（４．０ｍＬ）と脱水アセトニトリル（１．２ｍＬ）を加え溶解させた。その後、トリフェニルホスフィン（９．８ｍｇ，３７．３μｍｏｌ）とｄＧ－ＣＥ　ホスホロアミダイト（１３５．１ｍｇ，１６１μｍｏｌ）と５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（２１．４ｍｇ，１６４μｍｏｌ）を順次加え室温で１．０時間撹拌した。
　続いて、反応溶液に２，２，２－トリフルオロエタノール（５８．１μＬ，７９７μｍｏｌ）を加え室温で３０分撹拌した後、２，６－キシリジン（１１８μＬ，９５５μｍｏｌ）とＤＤＴＴ（４０．９ｍｇ，１９９μｍｏｌ）を順次加え、室温で１．０時間撹拌した。
　その後、インドール（９３．６ｍｇ，７９９μｍｏｌ）とトリクロロ酢酸（６９８ｍｇ，４．２７ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１．０時間撹拌した。続いて反応溶液にピリジン（１．０１ｍＬ，１２．６ｍｍｏｌ）と水（６６μＬ）を順次加え、室温にて１．０時間撹拌した。その後、アセトニトリル（４２ｍＬ）を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥し２量体ＨＯ－ＧＵｍ－ＳＵＣ－ＴＯＢを白色固体として得た。（２４１．５ｍｇ）
ｍ／ｚ（ＴＯＦ－ＭＳ）：ｃａｌｃｄ．１７２１．０７，　ｆｏｕｎｄ　１７２３．１０[Ｍ＋Ｈ]＋
　実施例１３：ホスホロチオエート化２量体の合成（脱保護：ジクロロ酢酸）
　アルゴン雰囲気下、５０ｍＬの二口フラスコにＨＯ－Uｍ－ＳＵＣ－ＴＯＢ（９９．６ｍｇ，７９．４μｍｏｌ）とＰｉｖ－ＴＯＢ （９７．９ｍｇ，９８．０μｍｏｌ）を入れ、脱水ジクロロメタン（４．０ｍＬ）と脱水アセトニトリル（１．２ｍＬ）を加え溶解させた。その後、トリフェニルホスフィン（１０．８ｍｇ，４１．１μｍｏｌ）とｄＧ－ＣＥ　ホスホロアミダイト（１３４．２ｍｇ，１６０μｍｏｌ）と５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（２０．９ｍｇ，１６１μｍｏｌ）を順次加え室温で１．０時間撹拌した。
　続いて、反応溶液に２，２，２－トリフルオロエタノール（５８．１μＬ，７９７μｍｏｌ）を加え室温で３０分撹拌した後、２，６－キシリジン（１１８μＬ，９５５μｍｏｌ）とＤＤＴＴ（４０．９ｍｇ，１９９μｍｏｌ）を順次加え、室温で１．０時間撹拌した。
　その後、インドール（９３．２ｍｇ，７９６μｍｏｌ）とジクロロ酢酸（４７８μｌ，５．７８ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１．０時間撹拌した。続いて反応溶液にピリジン（１．４０ｍＬ，１７．４ｍｍｏｌ）と水（６１μＬ）を順次加え、室温にて１．０時間撹拌した。その後、アセトニトリル（４０ｍＬ）を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥し２量体ＨＯ－ＧＵｍ－ＳＵＣ－ＴＯＢを白色固体として得た。（２２８．７ｍｇ、９６％）
ｍ／ｚ（ＴＯＦ－ＭＳ）：ｃａｌｃｄ．１７２１．０７，　ｆｏｕｎｄ　１７２３．１０[Ｍ＋Ｈ]＋
　本発明によれば、ホスファイト体または亜リン酸ジエステル体を合成する段階で、特定の酸化防止剤を共存させることによりホスホトリエステル体またはホスホジエステル体（「ＰＯ不純物」）の副生を抑制することができ、これに続く硫化反応をより効率良く行うことができるため、ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法として有用である。
　本出願は、日本で出願された特願２０１９－０６５１５８（出願日：２０１９年３月２８日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (14)

  1. 　５’位水酸基が保護されておらず、かつその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよく、もしくは固相担体に結合していてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（以下、「核酸Ａ」と称する場合がある）と、３’位水酸基または３’位アミノ基がホスファイト体または亜リン酸ジエステル体の形成のための方法により修飾されており、かつその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（以下、「核酸Ｂ」と称する場合がある）を、酸化防止剤の存在下に縮合させて、ホスファイト体または亜リン酸ジエステル体を得る工程（工程（１））を含む、ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
  2. 　核酸Ｂにおいて、３’位水酸基または３’位アミノ基がホスホロアミダイト法、Ｈ－ホスホネート法、ジハロホスフィン法およびオキサザホスホリジン法から選択される方法により修飾されている、請求項１に記載のホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
  3. 　さらに、工程（１）で得られたホスファイト体または亜リン酸ジエステル体を硫化剤と反応させる工程（工程（２））を含む、請求項１または２に記載のホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
  4. 　酸化防止剤が、リン系酸化防止剤、硫黄系酸化防止剤、およびリン・硫黄系酸化防止剤から選択される、請求項１～３のいずれかに記載のホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
  5. 　酸化防止剤が、
    （１）Ｐ－（Ｒ）３　
    （２）Ｐ－（ＯＲ）３　
    （３）Ｐ（Ｒ）２（ＯＲ）　
    （４）ＰＲ（ＯＲ）２　
    （５）ＰＨ（Ｏ）（Ｒ）２　
    （６）ＰＨ（Ｏ）（ＯＲ）２　、および
    （７）ＰＨ（Ｏ）Ｒ（ＯＲ）　
    （上記式（１）～（７）中、Ｒは、同じでも異なってもよく、独立して、置換されていてもよいアリール基または低級アルキル基を表し、２つのＲが互いに結合しそれらが隣接する他の原子と一緒になって環を形成してもよい；
    ここで上記酸化防止剤は、同一または異なる酸化防止剤のＲ部分が結合した２量体であってもよい。）
    から選択されるリン系酸化防止剤、
    （８）Ｒ－Ｓ－Ｒ　、および
    （９）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （上記式（８）、（９）中、Ｒは、同じでも異なってもよく、独立して、低級アルキル基または置換されていてもよいアリール基を表す；
    ここで上記酸化防止剤は、同一または異なる酸化防止剤のＲ部分が結合した２量体であってもよい。）
    から選択される硫黄系酸化防止剤、および
    （１０）（ＯＲ）２Ｐ（Ｓ）－Ｓ－Ｍ－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲ）２
    （式中、Ｒは、同じでも異なってもよく、独立して、低級アルキル基または置換されていてもよいアリール基を表し、およびＭは、Ｚｎ、ＮｉまたはＣｕを表す；
    ここで上記酸化防止剤は、同一または異なる酸化防止剤のＲ部分が結合した２量体であってもよい。）
    で示されるリン・硫黄系酸化防止剤、から選択される、請求項１～３のいずれかに記載のホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
  6. 　酸化防止剤が、
    （１）Ｐ－（Ｒ）３　
    （２）Ｐ－（ＯＲ）３　
    （３）Ｐ（Ｒ）２（ＯＲ）　
    （４）ＰＲ（ＯＲ）２　、および
    （５）ＰＨ（Ｏ）Ｒ（ＯＲ）　
    （上記式（１）～（５）中、Ｒは、同じでも異なってもよく、独立して、置換されていてもよいアリール基または低級アルキル基を表し、２つのＲが互いに結合しそれらが隣接する他の原子と一緒になって環を形成してもよい；
    ここで上記酸化防止剤は、同一または異なる酸化防止剤のＲ部分が結合した２量体であってもよい。）
    から選択されるリン系酸化防止剤、および
    （６）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （上記式（６）中、Ｒは、同じでも異なってもよく、独立して、低級アルキル基または置換されていてもよいアリール基を表す；
    ここで上記酸化防止剤は、同一または異なる酸化防止剤のＲ部分が結合した２量体であってもよい。）
    で示される硫黄系酸化防止剤、から選択される、請求項１～３のいずれかに記載のホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
  7. 　酸化防止剤が、トリフェニルホスフィン、メチルジフェニルホスフィン、亜リン酸トリエチル、エトキシジフェニルホスフィン、ジエトキシフェニルホスフィン、９，１０－ジヒドロ－９－オキサ－１０－ホスファフェナントレン　１０－オキシド（リン系酸化防止剤）；および、イソブチレンスルフィド（硫黄系酸化防止剤）から選択される、請求項１～３のいずれかに記載のホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
  8. 　酸化防止剤が、リン系酸化防止剤である、請求項１～３のいずれかに記載のホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
  9. 　酸化防止剤が、Ｐ－（Ｒ）３で表されるホスフィン類である、請求項１～３のいずれかに記載のホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
  10. 　核酸Ａが、５’位水酸基が保護されておらず、かつその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである、請求項１～９のいずれかに記載のホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
  11. 　核酸Ａが、５’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の２’位水酸基、３’位水酸基および３’位アミノ基、並びにデオキシリボース残基の３’位水酸基および３’位アミノ基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基（以下、「擬似固相保護基」と称する場合がある）で保護され、かつその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（以下、「核酸ａ」と称する場合がある）、または
    ５’位水酸基が保護されておらず、３’位末端のリン酸基の一つのＯＨが－ＯＬｎ１－ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示す。）に置き換わっており、－ＯＬｎ１－ＯＨの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、かつその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（以下、「核酸α」と称する場合がある）であり、かつ、核酸Ｂが、３’位水酸基または３’位アミノ基が、ホスファイト体または亜リン酸ジエステル体の形成のための方法により修飾されており、かつ５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、かつその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基（以下、「擬似固相保護基」と称する場合がある）および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（以下、「核酸ｂ」と称する場合がある）である、請求項１～１０のいずれかに記載の製造方法。
  12. 　核酸Ｂが、３’位水酸基がホスファイト体または亜リン酸ジエステル体の形成のための方法により修飾されており、かつその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである、請求項１～１１のいずれかに記載のホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
  13. 　工程（２）で使用される硫化剤が、５－［（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－チオン（ＤＤＴＴ）、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン－１，１－ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン、フェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）、テトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）、ジペンタメチレンチウラムテトラスルフィド、５－フェニル－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－オン（ＰＯＳ）、３－アミノ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオン（ＡＤＴＴ、キサンタンヒドリド）、Ｎ－［（２－シアノエチル）チオ］フタルイミドおよび硫黄から選択される、請求項３～１２のいずれかに記載のホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
  14. 　得られたホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの保護基を全て除去した後、保護されていないホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドを単離する工程をさらに含む、請求項１～１３のいずれかに記載のホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの製造方法。
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