CN113631564A - 具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法 - Google Patents
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Abstract
一种具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,包含下述的工序:使5'位羟基未被保护、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护、或可结合于固相载体的核苷、核苷酸或寡核苷酸,与3'位羟基或3'位氨基通过用于形成亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的方法被修饰、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸,在抗氧化剂的存在下缩合,得到亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的工序。
Description
技术领域
本发明涉及具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,可用于核酸合成的领域。
背景技术
反义核酸、siRNA(小干扰,small interfering RNA)、适体(aptamer)等核酸药物作为继抗体药物之后的下一代药物受到关注。核酸药物被期待与抗体药物同样高的特异性和有效性,同时可与以往的由小分子化合物形成的药物同样通过化学合成来制造。新型核酸药物的研发中,进行了对核酸间的结合部位的磷原子修饰而得的修饰核酸的探讨。具有磷原子被硫化的硫代磷酸酯化部位(硫代磷酸酯核酸间结合部位)的类型的核酸药物即为其代表,可例举例如福米韦生(Fomivirsen)、米泊美生(Mipomersen)、奥利默森(Oblimersen)、阿利福生(Alicaforsen)等。作为具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,有固相合成(固相法)和液相法,为了进一步消除固相法和液相法的缺点,还开发有使用拟固相保护基(pseudo solid phaseprotectinggroup)的液相法(专利文献1~9)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2012/157723号
专利文献2:国际公开第2013/122236号
专利文献3:国际公开第2017/104836号
专利文献4:国际公开第2005/070859号
专利文献5:国际公开第2013/179412号
专利文献6:国际公开第2014/077292号
专利文献7:国际公开第2017/086397号
专利文献8:国际公开第2018/203574号
专利文献9:国际公开第2018/212236号。
发明内容
发明所要解决的技术问题
合成具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸时,目前广泛采用亚磷酰胺法和H-膦酸酯法(H-phosphonate)等,还已知二卤代膦(dihalophosphine)法和氧氮磷杂环戊烷(oxazaphospholidine)法。亚磷酰胺法、二卤代膦法和氧氮磷杂环戊烷法中合成亚磷酸酯体,H-膦酸酯法中合成亚磷酸二酯体,分别进一步供于硫化反应来获得作为目标物的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸。然而,发明人研究的结果是,发现存在新的问题,即,按照这样的方法合成的情况下,在上述亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体生成的阶段,同时发生磷原子的氧化反应,作为副产物生成磷酸三酯体或磷酸二酯体(以下也称“PO杂质”),因而其后的硫化反应受到阻碍,无法高效地合成作为目标的硫代磷酸酯化寡核苷酸。该“PO杂质”是原本应为硫代磷酸酯化部位,但被氧化而形成磷酸三酯体或磷酸二酯体的杂质。本发明的课题是解决该新发现的问题,提供可更高效地制造作为目标的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的方法。
解决技术问题所采用的技术方案
本发明人等发现通过在使用用于形成亚磷酸酯体的方法(例如,亚磷酰胺法、二卤代膦法和氧氮磷杂环戊烷法)合成亚磷酸酯体的阶段、或者使用用于形成亚磷酸二酯体的方法(例如,H-膦酸酯法)合成亚磷酸二酯体的阶段,使特定的抗氧化剂共存,可解决该新课题,从而完成了本发明。本发明如下。
[1]一种具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,包含下述的工序(1):使5'位羟基未被保护、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护、或可结合于固相载体的核苷、核苷酸或寡核苷酸(以下有时称为“核酸A”)与3'位羟基或3'位氨基通过用于形成亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的方法被修饰、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸(以下有时称为“核酸B”)在抗氧化剂的存在下缩合,得到亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的工序。
[2]根据上述[1]所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,核酸B中,3'位羟基或3'位氨基通过选自亚磷酰胺法、H-膦酸酯法、二卤代膦法和氧氮磷杂环戊烷法中的方法被修饰;
[3]根据上述[1]或[2]所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,还包括:使工序(1)中得到的亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体与硫化剂反应的工序(工序(2));
[4]一种具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,包括:
(1)使5'位羟基未被保护、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护、或可结合于固相载体的核苷、核苷酸或寡核苷酸(以下也称“核酸A”)与3'位羟基或3'位氨基通过选自亚磷酰胺法、H-膦酸酯法、二卤代膦法和氧氮磷杂环戊烷法中的方法被修饰、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸(以下也称“核酸B”)在抗氧化剂的存在下缩合,获得亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的工序;以及
(2)使所得的亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体与硫化剂反应的工序。
[5]根据上述[1]~[4]中的任一项所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,抗氧化剂选自磷类抗氧化剂、硫类抗氧化剂、和磷硫类抗氧化剂。
[6]根据上述[1]~[4]中的任一项所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,抗氧化剂选自:
从(1)P-(R)3
(2)P-(OR)3
(3)P(R)2(OR)
(4)PR(OR)2
(5)PH(O)(R)2
(6)PH(O)(OR)2、和
(7)PH(O)R(OR)
中选择的磷类抗氧化剂
(上述式(1)~(7)中,R可相同或不同,独立地表示任选被取代的芳基、或低级烷基,2个R可以相互结合并与它们所邻接的其他原子一起形成环,
在此,上述抗氧化剂可以是相同或不同的抗氧化剂的R部分进行结合而成的二聚体),从(8)R-S-R、和
(9)
[化学式1]
中选择的硫类抗氧化剂
(上述式(8)、(9)中,R可相同或不同,独立地表示低级烷基或任选被取代的芳基,在此,上述抗氧化剂可以是相同或不同的抗氧化剂的R部分进行结合而成的二聚体),以及(10)以(OR)2P(S)-S-M-S-P(S)(OR)2表示的磷硫类抗氧化剂(上述式(10)中,R可相同或不同,独立地表示低级烷基或任选被取代的芳基,且M表示Zn、Ni或Cu,
在此,上述抗氧化剂可以是相同或不同的抗氧化剂的R部分进行结合而成的二聚体)。
[7]根据上述[1]~[4]中的任一项所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,抗氧化剂选自:
从(1)P-(R)3
(2)P-(OR)3
(3)P(R)2(OR)
(4)PR(OR)2、和
(5)PH(O)R(OR)
中选择的磷类抗氧化剂
(上述式(1)~(5)中,R可相同或不同,独立地表示任选被取代的芳基、或低级烷基,2个R可以相互结合并与它们所邻接的其他原子一起形成环,
在此,上述抗氧化剂可以是相同或不同的抗氧化剂的R部分进行结合而成的二聚体),以及(6)以
[化学式2]
表示的硫类抗氧化剂
(上述式(6)中,R可相同或不同,独立地表示低级烷基或任选被取代的芳基;
在此,上述抗氧化剂可以是相同或不同的抗氧化剂的R部分进行结合而成的二聚体)。
[8]根据上述[1]~[4]中的任一项所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,抗氧化剂选自:三苯基膦、甲基二苯基膦、亚磷酸三乙酯、二苯基乙氧基膦、苯基膦酸二乙酯(Diethoxyphenylphosphine)、9,10-二氢-9-氧杂-10-磷杂菲-10-氧化物(磷类抗氧化剂);以及异丁烯基硫醚(硫类抗氧化剂)。
[9]根据上述[1]~[4]中的任一项所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,抗氧化剂为磷类抗氧化剂;
[10]根据上述[1]~[5]中的任一项所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,抗氧化剂为以P-(R)3表示的膦类;
[11]根据上述[1]~[10]中的任一项所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,核酸A为5'位羟基未被保护、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸。
[12]根据上述[1]~[11]中的任一项所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,
核酸A为:
5'位羟基未被保护,选自核酸碱基的氨基和亚氨基、核糖残基的2'位羟基、3'位羟基和3'位氨基、以及脱氧核糖残基的3'位羟基和3'位氨基中的至少一个基团被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基(以下有时称为“拟固相保护基”)保护,且其他基团可进一步被用于核酸合成的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸(以下有时称为“核酸a”)(较好是核糖残基以及脱氧核糖残基的3'位为羟基);或者
5'位羟基未被保护,3'位末端的磷酸基的一个OH被置换为-OLn1-OH(式中,Ln1表示有机基团),-OLn1-OH的羟基被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基保护,且其他基团可进一步被用于核酸合成的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸(以下有时称为“核酸α”),
并且,
核酸B为:
3'位羟基或3'位氨基通过用于形成亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的方法(较好是选自亚磷酰胺法、H-膦酸酯法、二卤代膦法和氧氮磷杂环戊烷法中的方法)被修饰,且5'位羟基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护,且其他基团可进一步被选自在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基(以下有时称为“拟固相保护基”)及用于核酸合成的保护基中的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸(以下有时称为“核酸b”)。
[13]根据上述[1]~[12]中的任一项所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,核酸B为3'位羟基通过用于形成亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的方法(较好是选自亚磷酰胺法、H-膦酸酯法、二卤代膦法和氧氮磷杂环戊烷法中的方法)被修饰、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸。
[14]根据上述[3]~[13]中的任一项所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,工序(2)中所使用的硫化剂选自5-[(N,N-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT)、3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物(Beaucage试剂)、3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮、苯乙酰二硫化物(PADS)、二硫化四乙基秋兰姆(TETD)、四硫化双五亚甲基秋兰姆、5-苯基-3H-1,2,4-二噻唑-3-酮(POS)、3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(ADTT,氢化黄原素)、N-[(2-氰基乙基)硫代]邻苯二甲酰亚胺和硫。
[15]根据上述[1]~[14]中的任一项所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,还包括:将所得的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的保护基全部除去后,分离未被保护的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的工序。
[16]一种具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,包括:
(1)使3'位羟基或3'位氨基未被保护、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护、或可结合于固相载体的核苷、核苷酸或寡核苷酸(核酸A-1)(较好是核酸A-1中的3'位为羟基),与5'位羟基通过用于形成亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的方法(较好是选自亚磷酰胺法、H-膦酸酯法、二卤代膦法和氧氮磷杂环戊烷法中的方法)被修饰、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸(核酸B-1),在抗氧化剂的存在下缩合,获得亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的工序(工序(1-1))。
[17]根据上述[16]所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,还包括:使工序(1-1)中得到的亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体与硫化剂反应的工序(工序(2-1))。
发明的效果
如果采用本发明,通过在使用亚磷酰胺法、H-膦酸酯法等为了形成亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体而在本技术领域中广泛采用的方法来合成亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的阶段,使特定的抗氧化剂共存,可抑制作为副产物的磷酸三酯体或磷酸二酯体(“PO杂质”)的产生,能够更高效地进行其后的硫化反应。该“PO杂质”是原本应为硫代磷酸酯化部位、但被氧化而转化为磷酸二酯体的杂质。因此,通过寡核苷酸合成中的核酸链延伸时在所有的缩合工序、或者所需的缩合工序中实施本发明,能够以更高的收率制造作为目标的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸。具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造中,会适当重复核酸延伸的循环,所以每个碱基延伸的反应工序中即使作为副产物生成1%以下的微量杂质,生成作为目标物的寡核苷酸延伸体时也会产生大量杂质。因此,为了获得高纯度的寡核苷酸,重要的是抑制各单个反应工序的副产物杂质生成,抑制作为副产物的“PO杂质”生成的本发明的意义重大。
具体实施方式
只要文中没有特别说明,本说明书中使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属技术领域的技术人员通常的理解同样的含义。与本说明书所记载的同样或同等的任意的方法和材料可在本发明的实施或试验中使用,以下记载优选的方法和材料。对于本说明书中提及的所有刊物和专利,例如,可为了记载和揭示的目的而将能够与所记载的发明相关地使用的刊物中记载的构建物和方法论作为参照纳入本说明书中。
[具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法]
本发明的制造方法是包括以下的工序(1),还包括工序(2)的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法。
工序(1)
使5'位羟基未被保护、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护、或可结合于固相载体的核苷、核苷酸或寡核苷酸(核酸A),与3'位羟基或3'位氨基通过用于形成亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的方法(例如,选自亚磷酰胺法、H-膦酸酯法、二卤代膦法和氧氮磷杂环戊烷法中的方法)被修饰、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸(核酸B),在抗氧化剂的存在下缩合,获得亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的工序。
工序(2)
使所得的亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体与硫化剂反应的工序。
采用本技术领域中公知的亚磷酰胺法等的使核苷酸链延伸的工序中,通过在希望引入硫代磷酸酯化部位的延伸步骤中实施本发明的上述工序(1)、以及工序(2),可对所有、或者所需的核酸间结合部位以高收率进行硫代磷酸酯化。通过将本发明的该寡核苷酸的制造方法与核酸合成领域中常用的核酸间结合部位为磷酸三酯键或磷酸二酯键的寡核苷酸的制造方法(以下也称“通常的寡核苷酸的制造方法”)组合,根据作为目标的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸适当重复其核酸延伸的循环,可使具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸延伸,制造作为目标的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸。这样的实施方式也包含在本发明的范围内。
以下,对本发明的上述工序(1)和工序(2)进行详细说明。
上述工序(1)和工序(2)可在固相或液相中的任一种反应条件下实施,但更好是在液相条件下实施。
工序(1)在抗氧化剂的存在下的缩合反应
工序(1)中用于形成核酸B的3'位羟基或3'位氨基的亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的修饰例如可通过选自亚磷酰胺法、H-膦酸酯法、二卤代膦法和氧氮磷杂环戊烷法等的本技术领域中公知的方法进行。
这些方法被本领域技术人员所周知,关于缩合反应的过程中所形成的亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体,也可被本领域技术人员容易地理解。
其中,使用3'位具有氨基的核酸B来代替3'位具有羟基的核酸B,使用亚磷酰胺法、H-膦酸酯法、二卤代膦法和氧氮磷杂环戊烷法等方法获得缩合体的情况下,3'位与磷原子的键由-O-P键替代为-N-P键,但该情况下,本说明书中也为了便于说明而按照-O-P键的情况称为“亚磷酸酯体”或“亚磷酸二酯体”。此外,关于对应的“PO杂质”,也同样称为“磷酸三酯体”或“磷酸二酯体”。
在此,核酸B较好是3'位羟基通过用于形成亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的方法被修饰、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸的情况。
关于采用亚磷酰胺法的修饰,可参照例如S.L.Beaucage,《寡核苷酸及类似物的实验方法(Protocols for Oligonucleotides and Analogs)》(第3章)1993年,33-62页;M.H.Caruthers等,《酶学中的方法(Method in Enzymology)》1987,154,287-313;S.L.Beaucage和M.H.Caruthers,Tetrahedron Letters 1981,22,1859-1862;日本化学会编第5版实验化学讲座16有机化合物IV 2010年377-381页等实施。
关于采用H-膦酸酯法的修饰,可参照例如B.F.Froehler,《寡核苷酸及类似物的方法》(第4章)1993年,63-80页;日本化学会编第5版实验化学讲座16有机化合物IV 2010年381-384页等实施。
关于采用二卤代膦衍生物(二卤代膦法)的修饰,可参照例如日本化学会编第4版实验化学讲座22金属配合物/过渡金属簇1999年426-431页等实施。
关于采用氧氮磷杂环戊烷法的修饰,可参照例如N.Oka等,J.Am.Chem.Soc.,2008年,130,16031-16037页;N.Oka等,Organic Letters.,2009年,Vol.11,No.4,967-970页;国际公开第2011/08682号等实施。
这样的3'位羟基或3'位氨基通过用于形成亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的方法(例如,选自亚磷酰胺法、H-膦酸酯法、二卤代膦法和氧氮磷杂环戊烷法中的方法)修饰的核酸B,在抗氧化剂的存在下与核酸A缩合,衍生为对应的亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体。应予说明,上述的用于形成亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的方法中,本技术领域中还已知大量的改良方法(参照例如国际公开第2014/010250号),它们也可在本发明的实施中使用。此外,通过用于形成亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的方法修饰的核酸B为市售的情况下,在本发明的实施中也可使用该市售品。
作为所使用的抗氧化剂,较好是选择具有足以防止因生成的亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的磷原子氧化导致的磷酸三酯体或磷酸二酯体(“PO杂质”)作为副产物生成的抗氧化效果,且缩合工序中抗氧化剂不会与核酸B(亚磷酰胺体或H-膦酸酯体等)反应而在缩合工序本身中产生不良影响的抗氧化剂。另外,液相条件下的实施中,希望在同一反应器内进行缩合反应之后的工序(2)的情况下,较好是选择不会对后续的反应产生不良影响且不会诱发杂质作为副产物生成的抗氧化剂。作为从这样的观点来看优选的抗氧化剂,可例举例如磷类抗氧化剂、硫类抗氧化剂、和磷硫类抗氧化剂。作为具体例子,可例举以下式表示的抗氧化剂。
作为磷类抗氧化剂,可例举下述化合物:
(1)P-(R)3(有时称为“膦类”)
(2)P-(OR)3(有时称为“亚磷酸酯类”)
(3)P(R)2(OR)(有时称为“亚膦酸酯(亜ホスフィン酸エステル)”)
(4)PR(OR)2(有时称为“次膦酸酯类(亜ホスホン酸エステル類)”)
(5)PH(O)(R)2(有时称为“氧化膦类”)
(6)PH(O)(OR)2(有时称为“次磷酸酯类(ホスホン酸エステル類)”)
(7)PH(O)R(OR)(有时称为“膦酸酯类(ホスフィン酸エステル類)”)
(上述式(1)~(7)中,R可相同或不同,独立地表示任选被取代的芳基、或低级烷基,2个R可以相互结合并与它们所邻接的其他原子一起形成环,
在此,上述抗氧化剂可以是相同或不同的抗氧化剂的R部分进行结合而成的二聚体)。
作为上述的二聚体,可例举例如以下的结构式表示的化合物:
[化学式3]
本说明书中,作为“芳基”,可例举“C6-14芳基”,例如苯基、1-萘基、2-萘基、1-蒽基、2-蒽基、9-蒽基。
该“芳基”可被选自低级烷基、低级烷氧基和低级环烷基中的1~3个取代基取代(例如,甲苯酰基、甲氧基苯基)。
本说明书中,作为“低级烷基”,可例举“C1-6烷基”,例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、1-乙基丙基、己基、异己基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、2-乙基丁基。
本说明书中,作为“低级烷氧基”,可例举“C1-6烷氧基”,例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基。
本说明书中,作为“低级环烷基”,可例举“C3-10环烷基”,例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、双环[2.2.1]庚烷基、双环[2.2.2]辛烷基、双环[3.2.1]辛烷基、金刚烷基。
对于以下的其他抗氧化剂,也同样。
作为硫类抗氧化剂,可例举下述化合物:
(8)R-S-R
(9)
[化学式4]
(上述式(8)、(9)中,R可相同或不同,独立地表示低级烷基或任选被取代的芳基,在此,上述抗氧化剂可以是相同或不同的抗氧化剂的R部分进行结合而成的二聚体)。
作为磷硫类抗氧化剂,可例举下述化合物:
(10)(OR)2P(S)-S-M-S-P(S)(OR)2
(式(10)中,R可相同或不同,独立地表示低级烷基或任选被取代的芳基,且M表示Zn、Ni或Cu,
在此,上述抗氧化剂可以是相同或不同的抗氧化剂的R部分进行结合而成的二聚体)。
上述的抗氧化剂中,作为更优选的化合物,可例举以式:P-(R)3表示的膦类、以式:P-(OR)3表示亚磷酸酯类(或者phosphite)、以式:P(R)2(OR)表示的亚膦酸酯类、以式:PR(OR)2表示的次膦酸酯类、以式:PH(O)R(OR)表示的膦酸酯类、以
[化学式5]
表示的硫类抗氧化剂。
作为以式:P-(R)3表示的膦类,较好是例如三苯基膦、甲基二苯基膦。其中,更好是三苯基膦。作为以式:P-(OR)3表示亚磷酸酯类,较好是例如亚磷酸三乙酯(P(OEt)3)。
作为以式:P(R)2(OR)表示的亚膦酸酯类,较好是例如二苯基乙氧基膦。作为以式:PR(OR)2表示的次膦酸酯类,较好是例如苯基膦酸二乙酯。
作为以式:PH(O)R(OR)表示的膦酸酯类,较好是例如以
[化学式6]
表示的9,10-二氢-9-氧杂-10-磷杂菲-10-氧化物。
作为以
[化学式7]
表示的硫类抗氧化剂,较好是以
[化学式8]
表示的异丁烯基硫醚。
如果考虑对后续反应的影响,抗氧化剂的使用量越少越好,但相对于1摩尔的缩合反应中所用的核酸A,通常较好是0.1~2摩尔,更好是0.2~1摩尔。
本工序在液相条件下进行的情况下所用的溶剂只要是核酸A、核酸B、抗氧化剂等溶解且不对反应产生不良影响的溶剂即可,无特别限定,可例举例如二氯甲烷、乙腈、氯仿、四氢呋喃、丙酮、乙酸乙酯、CPME、甲苯、环己烷、它们的混合溶剂等。其中,较好是氯仿、四氢呋喃、甲苯、二氯甲烷、乙腈、它们的混合溶剂。
本工序中使用的核酸A和核酸B的溶液中的浓度,只要它们溶解于溶剂中即可,无特别限定。相对于1摩尔所用的核酸A,核酸B的使用量较好是1~3摩尔,更好是1.2~2.5摩尔。
进行本工序的缩合反应时,可添加活化剂实施。例如,作为亚磷酰胺法的活化剂,可例举本技术领域中所广泛采用的四唑衍生物(例如,5-乙硫基-1H-四唑(ETT)、5-苄硫基-1H-四唑等)、咪唑衍生物(例如,4,5-二氰基咪唑等)等。较好是四唑衍生物,更好是5-乙硫基-1H-四唑。作为H-膦酸酯法的活化剂,可例举仅缩合剂、与缩合剂及缩合添加剂的组合、或者新戊酰氯等。作为仅缩合剂,可例举HATU(O-(7-偶氮苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐)、HCTU(O-(1H-6-氯苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐)、Pybop(六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻)、BopCl(双(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯)、TBTU(O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐)、HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐)等。作为与缩合剂及缩合添加剂的组合,可例举与DIC(二异丙基碳二亚胺)、EDC·HCl(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)、WSC·HCl、DCC(二环己基碳二亚胺)等缩合剂、及HOAt(1-羟基-7-氮杂苯并三唑)、HOCt(1-羟基-1H-1,2,3-三唑-5-羧酸乙酯)、HOBt(1-羟基苯并三唑)、HOOBt(3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪)、DMAP(N,N-二甲基-4-氨基吡啶)等缩合添加剂的组合。
本工序的缩合反应的反应温度,只要反应进行即可,无特别限定,但较好是-10℃~60℃,更好是5℃~35℃。反应时间根据使用的寡核苷酸的种类、抗氧化剂的种类和溶剂的种类、反应温度等而不同,例如为5分钟~24小时。
本工序例如可通过向溶解了核酸A的溶液中添加核酸B和抗氧化剂后,添加活化剂来进行,但这是一种实施方式,本发明并不仅限于该方式。
本发明中,为了抑制工序(2)时的副产物生成,可在工序(2)之前进一步包括对通过亚磷酰胺法等活化的核酸B进行淬灭的工序。
作为淬灭剂,可将本技术领域中公知的试剂用作本工序中的淬灭剂。淬灭剂可仅使用1种,也可将2种以上并用。
作为淬灭剂,可例举例如醇类(例如,甲醇、2-丙醇、叔丁醇、2,2,2-三氟乙醇(TFE)、四氢糠醇、糠醇、2,3-O-亚异丙基-D-呋喃核糖、3'-O-三异丙基甲硅烷基胸苷等可卤代的一元醇,乙二醇、二乙二醇等可卤代的多元醇等)、酚类(例如,4-硝基苯酚和五氟苯酚等)和胺类(例如,吗啉等)。
淬灭剂较好是选自醇类和胺类的至少一种,更好是选自甲醇、2-丙醇、叔丁醇、2,2,2-三氟乙醇、四氢糠醇和吗啉中的至少一种。其中,较好是2,2,2-三氟乙醇。
相对于工序(1)中的核酸B的使用量1摩尔,本工序中的淬灭剂的使用量较好是1~20摩尔,更好是1~15摩尔,进一步更好是1~10摩尔。
添加淬灭剂后的反应液的温度,只要可淬灭核酸B即可,无特别限定,但较好是5℃~40℃,更好是15℃~30℃。
工序(2)采用硫化剂的硫化反应
作为本工序中使用的硫化剂,只要具有能将亚磷酸酯键或亚磷酸二酯键转化为硫代磷酸酯键的能力即可,无特别限定,较好是5-[(N,N-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT)、3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物(Beaucage试剂)、3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮、苯乙酰二硫化物(PADS)、二硫化四乙基秋兰姆(TETD)、四硫化双五亚甲基秋兰姆、5-苯基-3H-1,2,4-二噻唑-3-酮(POS)、3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(ADTT,氢化黄原素)、硫、硫代磺酸氰基乙基甲基酯、N-[(2-氰基乙基)硫代]琥珀酰亚胺、N-[(2-氰基乙基)硫代]吗啉-3,5-二酮、N-[(2-氰基乙基)硫代]邻苯二甲酰亚胺。
从可进行良好的反应的观点来看,更好是5-[(N,N-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT)、3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物(Beaucage试剂)、3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮、苯乙酰二硫化物(PADS)、5-苯基-3H-1,2,4-二噻唑-3-酮(POS)、硫代磺酸氰基乙基甲基酯、N-[(2-氰基乙基)硫代]邻苯二甲酰亚胺,进一步更好是5-[(N,N-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT)、3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物(Beaucage试剂)、5-苯基-3H-1,2,4-二噻唑-3-酮(POS)、硫代磺酸氰基乙基甲基酯、N-[(2-氰基乙基)硫代]邻苯二甲酰亚胺,特别好是5-[(N,N-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT)、5-苯基-3H-1,2,4-二噻唑-3-酮(POS)、硫代磺酸氰基乙基甲基酯、N-[(2-氰基乙基)硫代]邻苯二甲酰亚胺。所述硫化剂可用适当的溶剂稀释至0.05~2M的浓度后使用。作为所述稀释溶剂,只要是对反应惰性的溶剂即可,无特别限定,可例举例如二氯甲烷、乙腈、吡啶或它们的任意的混合溶剂。
相对于工序(1)中的核酸A的使用量1摩尔,硫化剂的使用量例如为1~50摩尔,较好是1~5摩尔。
关于反应温度,只要反应进行即可,无特别限定,但较好是0℃~60℃,更好是10℃~40℃。反应时间根据亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的种类、使用的硫化剂的种类、反应温度等而不同,例如为1分钟~3小时。
工序(2)的采用硫化剂的硫化反应,可对应于每次工序(1)的抗氧化剂的存在下的缩合反应而分别进行,或者在核苷、核苷酸或寡核苷酸通过若干次的工序(1)的抗氧化剂的存在下的缩合反应而延伸后,合并进行。只要是本领域技术人员,均可根据使用的用于形成亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的方法等反应条件,适当选择来实施本发明。
以上的工序(1)和/或工序(2),不论核酸B的5'位羟基是否有保护基均可实施,例如可在工序(1)之后实施后述的分离工序,或者在工序(1)之后接着实施工序(2),再实施后述的分离工序。由此,核酸的延伸工序中,核酸B的5'位羟基被保护的情况下,保护基的脱保护为任意的工序,可适当根据合成计划进行。
以上,对本发明的工序(1)和工序(2)进行了详细说明。以往方法的缺点通过实施本发明而得到改善,能够更高效地将作为目标的硫代磷酸酯化部位引入寡核苷酸的核酸间结合。本发明作为具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法是优异的。
实施本发明时,可一并实施本技术领域的寡核苷酸的制造过程中根据需要实施的以下的各工序。其中,各工序可对于每个工序在分离产物后实施下一工序,或者适当连续进行各工序来实施。
[脱保护工序]
本工序是通过酸将工序(2)中得到的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的5'位羟基的保护基除去,获得5'位羟基未被保护的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的工序。本工序可通过本技术领域中常用的方法进行(参照例如国际公开第2012/157723号、国际公开第2013/122236号、国际公开第2017/104836号)。
[中和工序]
上述脱保护工序之后,可为了中和所使用的酸而向反应液添加碱。但是,本发明的制造方法中,可根据需要通过进行后述的[固液分离或萃取]和清洗,将脱保护工序中使用的酸从反应体系中除去。因此,该中和工序非必需。本工序可通过本技术领域中常用的方法进行(参照例如国际公开第2012/157723号、国际公开第2013/122236号、国际公开第2017/104836号)。
[固液分离或萃取工序]
本工序是上述中得到的5'位羟基未被保护的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的任意基团被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基(拟固相保护基)保护的情况下,向含该寡核苷酸的反应液中添加极性溶剂,使该寡核苷酸沉淀来进行纯化(固液分离),或者向反应液中添加极性溶剂,使其在极性溶剂-非极性溶剂间分层,使该寡核苷酸移动至非极性溶剂层来进行纯化(萃取)的工序。本工序可通过例如国际公开第2012/157723号、国际公开第2013/122236号、国际公开第2017/104836号中所详细记载的方法来进行。
工序(2)中得到的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸具有作为最终目标的核酸序列的情况下,可接着供于“脱保护工序”和“分离工序”。即,可进一步包括将工序(2)中得到的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的保护基全部除去后,分离未被保护的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的工序。本工序可通过例如国际公开第2012/157723号、国际公开第2013/122236号、国际公开第2017/104836号中所详细记载的方法进行。
上述各工序中的反应进行的确认,均可适用与一般的液相有机合成反应同样的方法。即,可使用薄层硅胶色谱法、高效液相色谱法等跟踪反应。
以上,对本发明的工序(1)和工序(2)进行了详细说明,对可在核酸延伸的过程中向作为目标的部位高效地引入硫代磷酸酯化部位的方法进行了说明。本发明的特征在于,引入硫代磷酸酯化部位时,在特定的抗氧化剂的存在下,在被适当保护的核酸A与核酸B之间进行缩合反应这一点,只要可灵活运用该特征,不论核酸的结构等如何,本发明的制造方法均可广泛适用于被适当保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸(可具有硫代磷酸酯化部位)。通过本发明所制造的寡核苷酸不仅是所有磷原子为被硫化的硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸(全PS体),还包括作为具有仅特定的一部分磷原子被硫化的硫代磷酸酯化部位且剩余的磷原子未被硫化的磷酸酯的寡核苷酸(混合骨架寡核苷酸,Mixed BackboneOligonucleotide(一般有时称为“MBO”))。
以下,对适用本发明的制造方法的核酸A和核酸B进行详细说明。
适用本发明的制造方法的一种方式中,
核酸A为5'位羟基未被保护,且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护,或可结合于固相载体的核苷、核苷酸或寡核苷酸,核酸B为3'位羟基或3'位氨基通过用于形成亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的方法(例如,选自亚磷酰胺法、H-膦酸酯法、二卤代膦法和氧氮磷杂环戊烷法中的方法)被修饰、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸。
在此,更优选的形态中,核酸B为3'位羟基通过用于形成亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的方法被修饰、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸。
本说明书中,作为寡核苷酸的构成单元的“核苷”是指核酸碱基通过N-糖苷化(glycosidation)结合于糖(例如,2-脱氧核糖、核糖、2位碳原子和4位碳原子通过2价有机基团结合而成的2-脱氧核糖或核糖等)的1位而成的化合物。本说明书中的“糖”还包括羟基替换为氨基的氨基糖、以及2位羟基替换为卤素原子的核糖、和具有分子内交联的结构的核糖(LNA,BNA)。
作为2位碳原子和4位碳原子通过2价有机基团结合而成的2-脱氧核糖或核糖,可例举例如以下的化合物。下述式中,R表示氢原子、取代或未取代的烃基、取代或未取代的羟基、取代或未取代的氨基中的任一种,R'表示氢原子、羟基中的任一种。
[化学式9]
作为氨基糖,可例举例如以下所示的3位羟基替换为氨基的2-脱氧核糖、3位羟基替换为氨基的核糖、和3位羟基替换为氨基且2位羟基替换为卤素的核糖(下述式中,Xs表示卤素原子)。
[化学式10]
本说明书中,“磷酸基”不仅限于-O-P(O)(OH)2,还包括氧原子替换为硫原子或NH的基团(例如,-O-P(S)(OH)2、-NH-P(O)(OH)2、-NH-P(S)(OH)2)。此外,磷酸基中的羟基(-OH)替换为-ORp的基团(例如被保护的磷酸基)也包括在“磷酸基”内;式中,Rp表示磷酸基的保护基等有机基团。
本说明书中,“核苷酸”是指核苷上结合磷酸基而得的化合物。作为3'位羟基或5'位羟基替换为磷酸基的核苷酸,可例举例如下述式所示的化合物;下述式中,Rm1和Rm2分别独立表示氢原子或有机基团(但核苷残基除外),Xm表示氢原子、羟基或卤素原子,R1和R2表示氢原子或烷基,R1和R2可相互结合并与它们邻接的其他原子一起形成五或六元环,R3和R4表示氢原子或苯基,Base为碱基(下文中同样)。
[化学式11]
[化学式12]
作为3'位羟基或5'位羟基替换为磷酸基的核苷酸,其他优选的例子可例举例如下述式(I')、(II')和(III')所示的化合物。
[化学式13]
[上述式(I')、(II')和(III')中,
*表示与3'位羟基或3'位氨基的结合位置;
L7表示-O-或-S-;
L8表示-L-O-、-L-S-、-L-C(R1)(R2)-O-、-L-C(R1)(R2)-S-、-Ls-O-或-Ls-S-;
环A表示可取代的具有独立选自氧、氮、硫、磷和硅中的0~10个杂原子的三~二十元的单环式、双环式或多环式的环;
环A'表示作为可取代的具有独立选自氧、氮、硫、磷和硅中的1~10个杂原子的三~二十元的单环式、双环式或多环式的环,且包含-N(R6)-部分的环;
L表示共价键、或可取代的C1-6亚烷基,在此,1个以上的亚甲基单元可独立被-L'-替换;各L'独立表示共价键、可取代的2价C1-3亚烷基、-C(R3)(R4)-、-C(R3)(R4)-C(R3)(R4)-、-Cy-或-C(R3)[C(R4)3]-;
R1、R2、R3、R4和R5分别独立表示氢、-Ls-R、卤素、-CN、-NO2、-Ls-Si(R)3、-OR、-SR或-N(R)2;
各Ls独立为共价键,或者表示选自C1-30脂肪族基团、以及具有独立选自氧、氮、硫、磷和硅中的1~10个杂原子的C1-30杂脂肪族基团中的可取代的二价直链或支链基团,在此,1个以上的亚甲基单元可独立被选自C1-6亚烷基、C1-6亚烯基、-C≡C-、二价C1-6杂脂肪族基团(所述二价C1-6杂脂肪族基团具有独立选自氧、氮、硫、磷和硅中的1~5个杂原子)、-C(R')2-、-Cy-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R')-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR')-、-C(O)N(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R')-、-C(O)S-、-C(O)O-、-P(O)(OR')-、-P(O)(SR')-、-P(O)(R')-、-P(O)(NR')-、-P(S)(OR')-、-P(S)(SR')-、-P(S)(R')-、-P(S)(NR')-、-P(R')-、-P(OR')-、-P(SR')-、-P(NR')-、-P(OR')[B(R')3]-、-OP(O)(OR')O-、-OP(O)(SR')O-、-OP(O)(R')O-、-OP(O)(NR')O-、-OP(OR')O-、-OP(SR')O-、-OP(NR')O-、-OP(R')O-以及-OP(OR')[B(R')3]O-中的可取代的基团替换,并且1个以上的碳原子可独立被CyL替换;
各-Cy-独立表示选自C3-20脂环族环,C6-20芳环,具有独立选自氧、氮、硫、磷和硅中的1~10个杂原子的五~二十元杂芳环,以及具有独立选自氧、氮、硫、磷和硅中的1~10个杂原子的三~二十元杂环中的可取代的二价基团;
各CyL独立表示选自C3-20脂环族环,C6-20芳环,具有独立选自氧、氮、硫、磷和硅中的1~10个杂原子的五~二十元杂芳环,以及具有独立选自氧、氮、硫、磷和硅中的1~10个杂原子的三~二十元杂环中的可取代的四价基团;
各R'独立表示-R、-C(O)R、-CO2R或-SO2R;
t表示0~20;
R6表示R';
R7表示-OH或-SH;
R8表示-L-R7、-L-C(R1)(R2)-R7或-Ls-R7;
R1、R2、R3和R4中的至少1个不为氢;
各R独立表示氢,或选自C1-30脂肪族基团,具有独立选自氧、氮、硫、磷和硅中的1~10个杂原子的C1-30杂脂肪族基团,C6-30芳环,C6-30芳基脂肪族基团,具有独立选自氧、氮、硫、磷和硅中的1~10个杂原子的C6-30芳基杂脂肪族基团,具有独立选自氧、氮、硫、磷和硅中的1~10个杂原子的五~三十元杂芳基,以及具有独立选自氧、氮、硫、磷和硅中的1~10个杂原子的三~三十元杂环基中的可取代的基团,或者2个R基可独立地一起形成共价键;或者
同一原子上的2个以上的R可独立地与该原子一起,形成除该原子之外还具有独立选自氧、氮、硫、磷和硅中的0~10个杂原子的可取代的三~三十元的单环式、双环式或多环式的环;或者
2个以上的原子上的2个以上的R基可独立地与介于其间的原子一起,形成除介于其间的原子之外还具有独立选自氧、氮、硫、磷和硅中的0~10个杂原子的可取代的三~三十元的单环式、双环式或多环式的环;
但,R1与R2不相同,R3与R4不相同]。
本说明书中,“寡核苷酸”是指核苷上连结1个以上的核苷酸而得的化合物。应予说明,没有特别说明的情况下,“寡核苷酸”中还包括:磷酸基的氧原子替换为硫原子的硫代磷酸酯化的寡核苷酸、磷酸基的-O-替换为-NH-的寡核苷酸、磷酸基中的羟基(-OH)替换为ORp的寡核苷酸,式中,Rp表示有机基团。本发明中的寡核苷酸的核苷的数目无特别限定,较好是3~50,更好是5~30。
本说明书中,“3'位氨基”表示结合于核苷、核苷酸或寡核苷酸的3'位碳原子的氨基。本说明书中,“5'位氨基”表示结合于核苷、核苷酸或寡核苷酸的5'位碳原子的氨基。
本说明书中,“3'位磷酸基”表示结合于核苷酸或寡核苷酸的3'位碳原子的磷酸基。本说明书中,“5'位磷酸基”表示结合于核苷酸或寡核苷酸的5'位碳原子的磷酸基。
本说明书中,“核酸碱基”只要是用于核酸合成的碱基则无特别限定,可例举例如胞嘧啶基、尿嘧啶基、胸腺嘧啶基等嘧啶碱基,腺嘌呤基、鸟嘌呤基等嘌呤碱基。除上述的基团以外,核酸碱基中还包括核酸碱基在任意的位置被1~3个任意的取代基(例如卤素原子、烷基、芳烷基、烷氧基、酰基、烷氧基烷基、羟基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基、硝基等)取代而得的修饰核酸碱基(例如8-溴腺嘌呤基、8-溴鸟嘌呤基、5-溴胞嘧啶基、5-碘胞嘧啶基、5-溴尿嘧啶基、5-碘尿嘧啶基、5-氟尿嘧啶基、5-甲基胞嘧啶基、8-氧代鸟嘌呤基、次黄嘌呤基(hypoxanthinyl)等)。此外,“可被保护的核酸碱基”是指例如作为具有氨基的核酸碱基的腺嘌呤基、鸟嘌呤基、或胞嘧啶基中氨基可被后述的“氨基的保护基”保护,较好是核酸碱基的氨基被可耐受核苷酸的5'位的脱保护条件的保护基保护的核酸碱基。
本说明书中,“用于核酸合成的保护基”只要是核酸合成领域中通常所使用的保护基则无特别限定,可例举例如以下的基团。
1)羟基的保护基(核酸碱基部分的羟基的保护基记载于后述的核酸碱基部分的保护基)只要没有特别说明,作为“羟基的保护基”,无特别限定,可例举例如《有机合成中的保护基(PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS)》、第3版、约翰威立父子出版公司(JOHNWILLY&SONS)出版(1999年)等中所记载的任意的保护基。具体来说,可例举甲基、苄基、对甲氧基苄基、叔丁基、甲氧基甲基、甲氧基乙基、2-四氢吡喃基、乙氧基乙基、氰基乙基、氰基乙氧基甲基、苯基氨甲酰基、1,1-二氧代硫代吗啉-4-硫代氨甲酰基、乙酰基、新戊酰基、苯甲酰基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、[(三异丙基甲硅烷基)氧基]甲基(Tom)、1-(4-氯苯基)-4-乙氧基哌啶-4-基(Cpep)等。可被保护的羟基的保护基较好是三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、或叔丁基二甲基甲硅烷基,从经济性和获得容易性的观点来看,特别好是叔丁基二甲基甲硅烷基。
2)氨基的保护基
只要没有特别说明,作为“氨基的保护基”,无特别限定,可例举例如《有机合成中的保护基(Greene's PROTECTIVE GROUPS in ORGANIC SYNTHESIS)》、第4版、威立国际科学(Wiley-Interscience)出版(2006年)等中所记载的保护基。作为该保护基的具体例子,可例举新戊酰基、新戊酰氧甲基、乙酰基、三氟乙酰基、苯氧乙酰基、4-异丙基苯氧乙酰基、4-叔丁基苯氧乙酰基、苯甲酰基、异丁酰基、(2-己基)癸酰基、二甲基甲脒基、1-(二甲基氨基)亚乙基、9-芴基甲氧羰基。其中,较好是乙酰基、苯氧乙酰基、4-异丙基苯氧乙酰基、苯甲酰基、异丁酰基、(2-己基)癸酰基、二甲基甲脒基、和1-(二甲基氨基)亚乙基。
3)核酸碱基的保护基
作为具有氨基的核酸碱基的腺嘌呤基、鸟嘌呤基、或胞嘧啶基中,氨基可被上述的“氨基的保护基”保护。较好是核酸碱基的氨基被可耐受核苷酸的5'位的脱保护条件的保护基保护的核酸碱基。核酸碱基的羰基也可被保护。例如,可与苯酚、2,5-二氯苯酚、3-氯苯酚、3,5-二氯苯酚、2-甲酰苯酚、2-萘酚、4-甲氧基苯酚、4-氯苯酚、2-硝基苯酚、4-硝基苯酚、4-乙酰氨基苯酚、五氟苯酚、4-新戊酰氧基苄醇、4-硝基苯乙醇、2-(甲磺基)乙醇、2-(苯磺基)乙醇、2-氰基乙醇、2-(三甲基甲硅烷基)乙醇、二甲基氨基甲酰氯、二乙基氨基甲酰氯、乙基苯基氨基甲酰氯、1-吡咯烷碳酰氯、4-吗啉碳酰氯、二苯基氨基甲酰氯等反应,从而保护核酸碱基的羰基。在此,关于羰基的保护基,有时也可不特别引入。
适用本发明的制造方法的更优选的形态中,
核酸A为5'位羟基未被保护,选自核酸碱基的氨基和亚氨基、核糖残基的2'位羟基、3'位羟基和3'位氨基、以及脱氧核糖残基的3'位羟基和3'位氨基中的至少一个基团被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基(拟固相保护基)保护,且其他基团可进一步被用于核酸合成的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸(以下有时称为“核酸a”),或者5'位羟基未被保护,3'位末端的磷酸基的一个OH替换为-OLn1-OH(式中,Ln1表示有机基团),-OLn1-OH的羟基被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基(拟固相保护基)保护,且其他基团可进一步被用于核酸合成的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸(以下有时称为“核酸α”),核酸B为3'位羟基或3'位氨基通过选自亚磷酰胺法、H-膦酸酯法、二卤代膦法和氧氮磷杂环戊烷法中的方法被修饰,且5'位羟基被可在酸性条件下除去的临时保护基保护,且其他基团可进一步被选自在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基(拟固相保护基)和用于核酸合成的保护基中的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸(以下有时称为“核酸b”)。
作为核酸a、核酸α和核酸b中的“用于核酸合成的保护基”,可例举关于核酸A和核酸B在上文中说明的例子同样的保护基。
作为核酸a、核酸α和核酸b中的“在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基(拟固相保护基)”,分别独立可例举:具有碳数为10以上的直链状的脂肪族烃基、或者具有有机基团的保护基;所述有机基团具有至少一个含1条以上的支链的脂肪族烃基、且总碳数为14以上且300以下。拟固相保护基对于核酸a、核酸α、核酸b、以及通过工序(1)和工序(2)得到的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸赋予疏水性,使在非极性溶剂中的溶解性提高。此外,还可使在极性溶剂中的溶解性降低。被这样的拟固相保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸在非极性溶剂的液相中也可进行缩合反应(工序(1)),通过向由工序(2)得到的反应液中添加极性溶剂,被拟固相保护基保护的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸沉淀,可进行其固液分离。或者,通过向由工序(2)得到的反应液中添加极性溶剂,在极性溶剂-非极性溶剂间使其分层,使具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸移动至非极性溶剂,可进行其萃取。作为这样的拟固相保护基,可使用例如国际公开第2012/157723号、国际公开第2013/122236号、国际公开第2017/104836号、国际公开第2013/179412号、国际公开第2014/077292号、国际公开第2017/086397号中所记载的基团。
“用于核酸合成的保护基”只要是核酸合成领域中通常所使用的基团即可,无特别限定,也包括上述的低分子量的保护基,但在工序(2)之后进行采用固液分离的纯化的情况下,拟固相保护基较好是具备碳数为10以上的直链状的脂肪族烃基的保护基;在工序(2)之后进行采用萃取的纯化的情况下,拟固相保护基较好是具备有机基团的保护基,该有机基团具有至少一个含1条以上的支链的脂肪族烃基、且总碳数为14以上且300以下。
首先,对用于固液分离时优选的拟固相保护基进行说明。作为用于固液分离时优选的拟固相保护基,可例举例如:具有“碳数10以上的直链状的脂肪族烃基介以单键或连接基团结合的烃基介以连接基团结合的C6-14烃环”的保护基。
所述碳数为10以上的直链状的脂肪族烃基较好是选自直链状的C10-40烷基和直链状的C10-40烯基中的基团,更好是直链状的C10-40烷基,进一步更好是直链状的C10-30烷基,特别好是直链状的C12-28烷基,最好是直链状的C14-26烷基。
所述连接基团较好是选自-O-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-C(=O)NH-、-NHC(=O)-、-S-、-SO-、-SO2-、和-Si(R')(R”)O-、-Si(R')(R”)-(R'、R”分别独立表示氢原子或C1-22烃基),更好是选自-O-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-C(=O)NH-和-NHC(=O)-,进一步更好是-O-。
所述C6-14烃环较好是选自苯环、萘环和环己烷环,更好是选自苯环和环己烷环,进一步更好是苯环。
用于固液分离时优选的拟固相保护基较好是具有“直链状的C10-40烷基介以单键或-O-结合的烃基介以-O-结合的苯环”的保护基。
接着,对用于萃取时优选的拟固相保护基进行说明。作为“具有至少1个含1条以上的支链的脂肪族烃基、且总碳数为14以上且300以下的有机基团”中的“支链”,为直链状或支链状的饱和脂肪族烃基,较好是C1-6烷基,更好是C1-4烷基,进一步更好是甲基或乙基。此外,该“支链”可被1个以上的卤素原子取代。
“具有至少1个含1条以上的支链的脂肪族烃基、且总碳数为14以上且300以下的有机基团”中的“脂肪族烃基”是指直链状的饱和或不饱和的脂肪族烃基,为C2-300烷基(较好是C3-100烷基,更好是C3-60烷基)、C2-300烯基(较好是C3-100烯基,更好是C3-60烯基)或C2-300炔基(较好是C3-100炔基,更好是C3-60炔基)。
“具有至少1个含1条以上的支链的脂肪族烃基、且总碳数为14以上且300以下的有机基团”中的“含1条以上的支链的脂肪族烃基”的部位无特别限定,可存在于末端(一价基团),也可存在于除此以外的部位(例如二价基团)。
作为“含1条以上的支链的脂肪族烃基”,可例举例如:作为丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、肉豆蔻基、鲸蜡基、硬脂基、二十烷基、山萮基、油基、亚油基、二十四烷基等的分支异构体的含1条以上的支链的一价基团及由它们衍生的二价基团。“含1条以上的支链的脂肪族烃基”较好是3,7,11-三甲基十二烷基、3,7,11,15-四甲基十六烷基(以下也称2,3-二氢植基)、2,2,4,8,10,10-六甲基十一烷-5-基等。
“具有至少1个含1条以上的支链的脂肪族烃基、且总碳数为14以上且300以下的有机基团”中存在多个“含1条以上的支链的脂肪族烃基”的情况下,这些基团分别可相同或不同。
“具有至少1个含1条以上的支链的脂肪族烃基、且总碳数为14以上且300以下的有机基团”中的除“含1条以上的支链的脂肪族烃基”以外的部位可任意设定。例如,可具有-O-、-S-、-CO-、-NH-、-COO-、-OCONH-、-CONH-、-NHCO-、烃基(一价基团或二价基团)等部位。作为“烃基”,可例举例如脂肪族烃基、芳香脂肪族烃基、单环饱和烃基和芳香族烃基等,具体可使用例如烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、芳烷基等一价基团及由它们衍生的二价基团。作为“烷基”,较好是C1-6烷基,可例举例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等。作为“烯基”,较好是C2-6烯基,可例举例如乙烯基、1-丙烯基、烯丙基、异丙烯基、丁烯基、异丁烯基等。作为“炔基”,较好是C2-6炔基,可例举例如乙炔基、炔丙基、1-丙炔基等。作为“环烷基”,较好是C3-6环烷基,可例举例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基。“芳基”较好是C6-14芳基,可例举例如苯基、1-萘基、2-萘基、联苯基、2-蒽基等。其中,更好是C6-10芳基,特别好是苯基。作为“芳烷基”,较好是C7-20芳烷基,可例举例如苄基、1-苯基乙基、2-苯基乙基、1-苯基丙基、萘基甲基、1-萘基乙基、1-萘基丙基等。其中,更好是C7-16芳烷基(C6-10芳基-C1-6烷基),特别好是苄基。该“烃基”可被选自卤素原子(氯原子、溴原子、氟原子、碘原子)、氧代基等中的取代基取代。
“具有至少1个含1条以上的支链的脂肪族烃基、且总碳数为14以上且300以下的有机基团”中的“总碳数”为14以上,较好是16以上,更好是18以上,为300以下,较好是200以下,更好是160以下。此外,“具有至少1个含1条以上的支链的脂肪族烃基、且总碳数为14以上且300以下的有机基团”中的支链的数量无特别限定,较好是2条以上,更好是3条以上,更好是4条以上,更好是8条以上,进一步更好是10条以上。该支链的数量越多,则即使寡核苷酸链为长链的情况下,被具备“具有至少1个含1条以上的支链的脂肪族烃基、且总碳数为14以上且300以下的有机基团”的拟固相保护基保护的核苷或寡核苷酸在有机溶剂(特别是非极性溶剂)中也越好地溶解。
作为“具有至少1个含1条以上的支链的脂肪族烃基、且总碳数为14以上且300以下的有机基团”,较好是具有以式(A):
[化学式14]
表示的相同或不同的二价基团的基团。
[式中,
*表示与邻接原子的结合位置,
R14和R15分别独立表示氢原子或C1-4烷基,且
X1表示单键或C1-4亚烷基,
但是R14和R15不同时为氢原子]。
作为具有以式(A)表示的二价基团的基团,可例举例如以下述式(B)~(D)中的任一个表示的基团。
应注意,式(B)~(D)中的各符号的定义中的碳数、重复单元的数量(m1、n0~n2)等为了方便而示出,可按照总碳数为14以上(较好是16以上,更好是18以上)且300以下(较好是200以下,更好是160以下)的条件在上述的定义的范围内适当变更。以下,对式(B)~(D)依次进行说明。
式(B)如下。
[化学式15]
[式中,
*表示与邻接原子的结合位置,
R16和R17表示氢原子,或者一起表示=O,
n0表示2~40的整数,
n0个R18和R19分别独立表示氢原子或C1-4烷基,
n0个X2分别独立表示单键或C1-4亚烷基,
R20表示氢原子或C1-4烷基,且
R21表示C1-4烷基,
但是R18和R19不同时为氢原子,且n0为2时,R20表示C1-4烷基]。
作为式(B)的基团,较好是
R16和R17同为氢原子,
n0为2~40的整数,
n0个R18和R19分别独立为氢原子、甲基或乙基,
n0个X2分别独立为单键、亚甲基或亚乙基,且
R20为氢原子、甲基或乙基的基团,
(但是R18和R19不同时为氢原子,且n0为2时,R20表示甲基或乙基)。
更优选的式(B)的基团为肉豆蔻基、鲸蜡基、硬脂基、二十烷基、山萮基等的碳数14~160的分支异构体,其中,特别好是2,3-二氢植基、3,7,11-三甲基十二烷基、2,2,4,8,10,10-六甲基-5-十二烷酰基。
式(C)如下。
[化学式16]
[式中,
*表示与邻接原子的结合位置,
m1个OR22分别独立表示被以式(B)表示的基团取代的羟基,且
m1表示1~3的整数。]
应注意,式(C)中的“以式(B)表示的基团”,除其*表示与O(即,邻接原子)的结合位置以外,如上所述。
式(C)的基团中,R22更好是作为肉豆蔻基、鲸蜡基、硬脂基、二十烷基、山萮基等碳数14~30的分支异构体的基团,其中,特别好是2,3-二氢植基、3,7,11-三甲基十二烷基。
式(D)如下。
[化学式17]
[式中,
*表示与Q的结合位置,
n1表示1~10的整数,
n2表示1~10的整数,
n1个R26和R27分别独立表示氢原子或C1-4烷基,
n1个X3分别独立表示单键或C1-4亚烷基,
n2个R28和R29分别独立表示氢原子或C1-4烷基,
n2个X5分别独立表示单键或C1-4亚烷基,
X4表示单键或C1-4亚烷基,且
R23、R24、R25、R30、R31和R32分别独立表示氢原子或C1-4烷基,
但是R26和R27、以及/或者R28和R29不同时为氢原子,且n1+n2为2时,R23、R24和R25的2个以上分别独立表示C1-4烷基,或者R30、R31和R32的2个以上分别独立表示C1-4烷基]。
作为式(D)的基团,更好是
n1为1~5的整数,
n2为1~5的整数,
n1个R26和R27分别独立为氢原子、甲基或乙基,
n1个X3分别独立为单键、亚甲基或亚乙基,
n2个R28和R29分别独立为氢原子、甲基或乙基,
n2个X5分别独立为单键、亚甲基或亚乙基,
X4为单键、亚甲基或亚乙基,且
R23、R24、R25、R30、R31和R32分别独立为氢原子或C1-4烷基的基团
(但是R26和R27、以及/或者R28和R29不同时为氢原子,且n1+n2为2时,R23、R24和R25的2个以上分别独立表示C1-4烷基,或者R30、R31和R32的2个以上分别独立表示C1-4烷基)。
作为特别优选的式(D)的基团,可例举
n1为1~5的整数,
n2为1~5的整数,
n1个R26和R27分别独立为氢原子或甲基,
n1个X3分别独立为单键或亚甲基,
n2个R28和R29分别独立为氢原子或甲基,
n2个X5分别独立为单键或亚甲基,
X4为单键或亚甲基,且
R23、R24、R25、R30、R31和R32为甲基的基团
(但是R26和R27、以及/或者R28和R29不同时为氢原子)。
作为“具有至少1个含1条以上的支链的脂肪族烃基、且总碳数为14以上且300以下的有机基团”的具体例子,可例举以下的基团。各基团中的*表示结合位置,式中的n3表示3以上的整数,n4可按照该基团的总碳数为14以上且300以下的条件适当设定。
[化学式18]
作为“具有至少1个含1条以上的支链的脂肪族烃基、且总碳数为14以上且300以下的有机基团”的优选的具体例子,可例举以下的基团:
3,7,11,15-四甲基十六烷基(别名:2,3-二氢植基)、
3,7,11-三甲基十二烷氧基、
2,2,4,8,10,10-六甲基-5-十二烷酰基、
3,4,5-三(3',7',11',15'-四甲基十六烷氧基)苄基、和
3,5-二(3',7',11',15'-四甲基十六烷氧基)苄基。
拟固相保护基更好是以下述式(g-I)表示的基团(以下也简称“拟固相保护基(g-I)”)。
**L-Y-Z(g-I)
式中,
**表示与被保护的基团的结合位置。
L表示单键、或者以式(a1)或(a1'):
[化学式19]
表示的基团,
式中,
*表示与Y的结合位置,
**与上述同义,
R1和R2分别独立表示C1-22烃基,
L1表示任选被取代的二价C1-22烃基,
L2表示单键,或者表示以***C(=O)O-R4-N(R5)****或***C(=O)N(R3)-R4-N(R5)****表示的基团(式中,***表示与L1的结合位置,****表示与C=O的结合位置,R4表示C1-22亚烷基,R3和R5分别独立表示氢原子或C1-22烷基,或者R3和R5可一起形成环)。
Y表示单键、氧原子、或NR(R表示氢原子、烷基或芳烷基);且
Z表示以式(a2)、式(a2')或式(a2”):
[化学式20]
表示的基团。
式中,
*表示结合位置,
R6为氢原子,或者Rb为以下述式(a3)表示的基团的情况下,环A或环B的R6可与R8一起表示单键或-O-、与环A或环B以及环C一起形成稠环,
k表示1~4的整数;
k个Q分别独立表示-O-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-NR7-、-C(=O)NH-或-NHC(=O)-,
k个R7分别独立表示碳数为10以上的直链状的脂肪族烃基介以单键或连接基团结合的烃基,或者表示具有至少1个含1条以上的支链的脂肪族烃基、且总碳数为14以上且300以下的有机基团,
环A和环B除具有k个QR7之外,可分别独立进而具有选自卤素原子、可被卤素原子取代的C1-6烷基、和可被卤素原子取代的C1-6烷氧基中的取代基。
Ra表示氢原子,且
Rb表示氢原子、或以式(a3):
[化学式21]
表示的基团,或者
Ra和Rb一起形成氧代基。
式(a3)中,
*表示结合位置,
j表示0~4的整数,
j个Q分别独立与上述同义,
j个R9分别独立表示碳数为10以上的直链状的脂肪族烃基介以单键或连接基团结合的烃基,或者表示具有至少1个含1条以上的支链的脂肪族烃基、且总碳数为14以上且300以下的有机基团,
R8表示氢原子,或者可与环A或环B的R6一起表示单键或-O-、并与环A或环B以及环B一起形成稠环,且
环C除具有j个QR9之外,可进而具有选自卤素原子、可被卤素原子取代的C1-6烷基、和可被卤素原子取代的C1-6烷氧基中的取代基。
式(a2)、式(a2')和式(a2”)中的R7、以及式(a3)中的R9所具有的碳数为10以上的直链状的脂肪族烃基,分别独立较好是选自直链状的C10-40烷基和直链状的C10-40烯基中的基团,更好是直链状的C10-40烷基,进一步更好是直链状的C10-30烷基,特别好是直链状的C12-28烷基,最好是直链状的C14-26烷基。式(a2)、式(a2')和式(a2”)中的R7、以及式(a3)中的R9所具有的连接基团分别独立较好是-O-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-C(=O)NH-或-NHC(=O)-,更好是-O-。
式(a2)、式(a2')和式(a2”)中的R7、以及式(a3)中的R9的“碳数为10以上的直链状的脂肪族烃基介以单键或连接基团结合的烃基”较好是:直链状的C10-40烷基、1~3个直链状的C10-40烷基介以-O-结合的苄基、或1~3个直链状的C10-40烷基介以-O-结合的环己基甲基。
作为式(a2)、式(a2')和式(a2”)中的R7、以及式(a3)中的R9的一种方式的“具有至少1个含1条以上的支链的脂肪族烃基、且总碳数为14以上且300以下的有机基团”,分别独立较好是具有以上述式(A)表示的二价基团的基团,更好是以上述式(B)~(D)中的任一个表示的基团,进一步更好是以上述式(B)表示的基团,特别好是2,3-二氢植基、3,7,11-三甲基十二烷基、或2,2,4,8,10,10-六甲基-5-十二烷酰基。
式(a2)、式(a2')、式(a2”)和式(a3)中的Q较好是-O-、-C(=O)NH-或-NHC(=O)-,更好是-O-。
式(g-I)中,以式(a1)表示的L的优选形态是
L1为二价C1-22烃基(在此,构成该烃基的1个或2个以上的-CH2-可被-O-、-C(=O)-等取代)、或CH2-O-1,4-亚苯基-O-CH2,且
L2为单键,或者以***C(=O)N(R3)-R4-N(R5)****表示的基团(式中,***表示与L1的结合位置,****表示与C=O的结合位置,R4表示C1-6亚烷基,R3和R5分别独立表示氢原子或可取代的C1-6烷基,或者R3和R5可一起形成可取代的C1-6亚烷基)的基团。
以式(a1)表示的L的另一优选形态是
L1为二价的C1-22烃基,且
L2为单键的基团。
以式(a1)表示的L的另一优选形态是
L1为亚乙基,且
L2为以***C(=O)N(R3)-R4-N(R5)****表示的基团(式中,***表示与L1的结合位置,****表示与C=O的结合位置,R4表示C1-22亚烷基,R3和R5分别独立表示氢原子或C1-22烷基,或者R3和R5可一起形成环)的基团。
以式(a1)表示的L的另一优选形态是
L1为亚乙基,且
L2为以***C(=O)N(R3)-R4-N(R5)****表示的基团(式中,***表示与L1的结合位置,****表示与C=O的结合位置,N(R3)-R4-N(R5)部分形成1,4-哌嗪二基)的基团。
以式(a1)表示的L的另一优选形态是
L1为亚乙基,且
L2为以***C(=O)N(R3)-R4-N(R5)****表示的基团(式中,***表示与L1的结合位置,****表示与C=O的结合位置,R4表示亚戊基或亚己基,R3和R5分别独立表示氢原子或甲基)的基团。
以式(a1)表示的L的特别优选的形态为容易获得且廉价的琥珀酰基。
接着,对式(g-I)中以式(a1')表示的L进行说明;
式(a1')中的L1较好是二价的C6-10芳香族烃基,更好是亚苯基;
式(a1')中的L2较好是单键;
作为式(a1')中的L1和L2的优选组合,是L1为二价的C6-10芳香族烃基、L2为单键的组合;
作为式(a1')中的L1和L2的更优选组合,是L1为亚苯基、L2为单键的组合;
式(a1')中的R1和R2分别独立较好是C1-22烷基,更好是C1-10烷基。
以式(a1')表示的L的优选形态是
R1和R2分别独立为C1-22烷基,
L1为二价的C6-10芳香族烃基,且
L2为单键的基团。
以式(a1')表示的L的另一优选形态是
R1和R2分别独立为C1-10烷基,
L1为亚苯基,且
L2为单键的基团。
式(g-I)中的Y为NR的情况下,所述R较好是氢原子、C1-6烷基或C7-16芳烷基,更好是氢原子、甲基、乙基或苄基,进一步更好是氢原子。Y较好是单键、氧原子或NR,更好是单键或氧原子。
式(g-I)中的Z较好是以式(a2)或式(a2”)表示的基团,更好是以式(a2”)表示的基团。与具有以式(a2)表示的Z(即,苄基的结构)的拟固相保护基相比,通过使用具有以式(a2”)表示的Z(即,环己基甲基的结构)的拟固相保护基,可使核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)等在非极性溶剂中的溶解性飞跃性地提高。由此,可在更高浓度下实施本发明的制造方法,生产性大幅提升。
式(a2)中,R6较好是氢原子。此外,式(a2)中,Ra和Rb较好是氢原子,或者一起形成氧代基。
以式(a2)表示的Z的用于固液分离的优选形态是
Ra和Rb为氢原子,
R6为氢原子,
k为1~3的整数,
k个Q为-O-,且
k个R7分别独立为直链状的C10-40烷基的基团。
以式(a2)表示的Z的用于固液分离的另一优选形态是
Ra和Rb为氢原子,
R6为氢原子,
k为1~3的整数,
k个Q为-O-,
k个R7分别独立为1~3个直链状的C10-40烷基介以-O-结合的苄基、或1~3个直链状的C10-40烷基介以-O-结合的环己基甲基,且
环A除具有k个QR7之外,可进而具有选自卤素原子、可被卤素原子取代的C1-6烷基、和可被卤素原子取代的C1-6烷氧基中的取代基的基团。
以式(a2)表示的Z的用于固液分离的另一优选形态是
Ra为氢原子,且
Rb为以式(a3)表示的基团(式中,*为结合位置,j为0~3的整数,j个Q为-O-,j个R9分别独立为直链状的C10-40烷基,R6和R8同为氢原子)的基团。
以式(a2)表示的Z的用于固液分离的另一优选形态是
Ra为氢原子,且
Rb为以式(a3)表示的基团(式中,*为结合位置,j为0~3的整数,j个Q为-O-,j个R9分别独立为直链状的C10-40烷基,R8与R6一起表示单键或-O-,与环A和环C一起形成稠环)的基团。
以式(a2)表示的Z的用于固液分离的另一优选形态是
Ra和Rb一起形成氧代基,
R6为氢原子,
k为1~3的整数,
k个Q为-O-,且
k个R7分别独立为直链状的C10-40烷基的基团。
以式(a2)表示的Z的用于固液分离的另一优选形态是
Ra和Rb一起形成氧代基,
R6为氢原子,
k为1~3的整数,
k个Q为-O-,
k个R7分别独立为1~3个直链状的C10-40烷基介以-O-结合的苄基、或1~3个直链状的C10-40烷基介以-O-结合的环己基甲基,且
环A除具有k个QR7之外,可进而具有选自卤素原子、可被卤素原子取代的C1-6烷基、和可被卤素原子取代的C1-6烷氧基中的取代基的基团。
式(a2”)中,R6较好是氢原子。此外,式(a2”)中,Ra和Rb较好是氢原子、或者一起形成氧代基。
以式(a2”)表示的Z的用于固液分离的优选形态是
Ra和Rb为氢原子,
R6为氢原子,
k为1~3的整数,
k个Q为-O-,且
k个R7分别独立为直链状的C10-40烷基的基团。
以式(a2”)表示的Z的用于固液分离的另一优选形态是
Ra和Rb为氢原子,
R6为氢原子,
k为1~3的整数,
k个Q为-O-,
k个R7分别独立为1~3个直链状的C10-40烷基介以-O-结合的苄基、或1~3个直链状的C10-40烷基介以-O-结合的环己基甲基,且
环B除具有k个QR7之外,可进而具有选自卤素原子、可被卤素原子取代的C1-6烷基、和可被卤素原子取代的C1-6烷氧基中的取代基的基团。
以式(a2”)表示的Z的用于固液分离的另一优选形态是
Ra为氢原子,
Rb为以式(a3)表示的基团(式中,*为结合位置,j为0~3的整数,j个Q为-O-,j个R9分别独立为C10-40烷基,R6和R8同为氢原子)的基团。
以式(a2”)表示的Z的用于固液分离的另一优选形态是
Ra为氢原子,
Rb为以式(a3)表示的基团(式中,*为结合位置,j为0~3的整数,j个Q为-O-,j个R9分别独立为直链状的C10-40烷基,R8与R6一起表示单键或-O-、并与环B和环C一起形成稠环)的基团。
以式(a2”)表示的Z的用于固液分离的另一优选形态是
Ra和Rb一起形成氧代基,
R6为氢原子,
k为1~3的整数,
k个Q为-O-,且
k个R7分别独立为直链状的C10-40烷基的基团。
以式(a2”)表示的Z的用于固液分离的另一优选形态是
Ra和Rb一起形成氧代基,
R6为氢原子,
k为1~3的整数,
k个Q为-O-,
k个R7分别独立为1~3个直链状的C10-40烷基介以-O-结合的苄基、或1~3个直链状的C10-40烷基介以-O-结合的环己基甲基,且
环B除具有k个QR7之外,可进而具有选自卤素原子、可被卤素原子取代的C1-6烷基、和可被卤素原子取代的C1-6烷氧基中的取代基的基团。
用于固液分离的优选的拟固相保护基(g-I)较好是
L为琥珀酰基、或以式(a1')表示的基团(式(a1')中,R1和R2分别独立为C1-10烷基,L1为二价亚苯基,L2为单键),且
Y-Z为3,4,5-三(十八烷氧基)苄氧基、3,5-双(二十二烷氧基)苄氧基、3,5-双[3',4',5'-三(十八烷氧基)苄氧基]苄氧基、3,4,5-三[3',4',5'-三(十八烷氧基)苄氧基]苄氧基、3,4,5-三(十八烷氧基)苄基氨基、2,4-双(二十二烷氧基)苄基氨基、3,5-双(二十二烷氧基)苄基氨基、双(4-二十二烷氧基苯基)甲基氨基、4-甲氧基-2-[3',4',5'-三(十八烷氧基)苄氧基]苄基氨基、4-甲氧基-2-[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]苄基氨基、2,4-双(十二烷氧基)苄基氨基、苯基(2,3,4-三(十八烷氧基)苯基)甲基氨基、双[4-(12-二十二烷氧基十二烷氧基)苯基]甲基氨基、3,5-双[3',4',5'-三(十八烷氧基)苄氧基]苄基氨基、3,4,5-三[3',4',5'-三(十八烷氧基)苄氧基]苄基氨基、3,4,5-三(十八烷氧基)环己基甲氧基、3,5-双(二十二烷氧基)环己基甲氧基、3,5-双[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲氧基、3,4,5-三[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲氧基、3,4,5-三(十八烷氧基)环己基甲基氨基、2,4-双(二十二烷氧基)环己基甲基氨基、3,5-双(二十二烷氧基)环己基甲基氨基、双(4-二十二烷氧基环己基)甲基氨基、4-甲氧基-2-[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、4-甲氧基-2-[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、2,4-双(十二烷氧基)环己基甲基氨基、苯基(2,3,4-三(十八烷氧基)环己基)甲基氨基、双[4-(12-二十二烷氧基十二烷氧基)环己基]甲基氨基、3,5-双[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、或3,4,5-三[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基的基团;
或者
L-Y为单键或琥珀酰基-1,4-哌嗪二基,且
Z为3,4,5-三(十八烷氧基)苯甲酰基、3,5-双(二十二烷氧基)苯甲酰基、3,5-双[3',4',5'-三(十八烷氧基)苄氧基]苯甲酰基、或3,4,5-三[3',4',5'-三(十八烷氧基)苄氧基]苯甲酰基的基团。
用于固液分离的优选的拟固相保护基(g-I)更好是
L为琥珀酰基,且
Y-Z为3,4,5-三(十八烷氧基)苄氧基、3,5-双(二十二烷氧基)苄氧基、3,5-双[3',4',5'-三(十八烷氧基)苄氧基]苄氧基、3,4,5-三[3',4',5'-三(十八烷氧基)苄氧基]苄氧基、3,4,5-三(十八烷氧基)苄基氨基、2,4-双(二十二烷氧基)苄基氨基、3,5-双(二十二烷氧基)苄基氨基、双(4-二十二烷氧基苯基)甲基氨基、4-甲氧基-2-[3',4',5'-三(十八烷氧基)苄氧基]苄基氨基、4-甲氧基-2-[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]苄基氨基、2,4-双(十二烷氧基)苄基氨基、苯基(2,3,4-三(十八烷氧基)苯基)甲基氨基、双[4-(12-二十二烷氧基十二烷氧基)苯基]甲基氨基、3,5-双[3',4',5'-三(十八烷氧基)苄氧基]苄基氨基、3,4,5-三[3',4',5'-三(十八烷氧基)苄氧基]苄基氨基、3,4,5-三(十八烷氧基)环己基甲氧基、3,5-双(二十二烷氧基)环己基甲氧基、3,5-双[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲氧基、3,4,5-三[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲氧基、3,4,5-三(十八烷氧基)环己基甲基氨基、2,4-双(二十二烷氧基)环己基甲基氨基、3,5-双(二十二烷氧基)环己基甲基氨基、双(4-二十二烷氧基环己基)甲基氨基、4-甲氧基-2-[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、4-甲氧基-2-[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、2,4-双(十二烷氧基)环己基甲基氨基、苯基(2,3,4-三(十八烷氧基)环己基)甲基氨基、双[4-(12-二十二烷氧基十二烷氧基)环己基]甲基氨基、3,5-双[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、或3,4,5-三[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基的基团;
或者
L-Y为单键或琥珀酰基-1,4-哌嗪二基,且
Z为3,4,5-三(十八烷氧基)苯甲酰基、3,5-双(二十二烷氧基)苯甲酰基、3,5-双[3',4',5'-三(十八烷氧基)苄氧基]苯甲酰基、或3,4,5-三[3',4',5'-三(十八烷氧基)苄氧基]苯甲酰基。
用于固液分离的优选的拟固相保护基(g-I)进一步更好是
L为琥珀酰基,且
Y-Z为3,4,5-三(十八烷氧基)苄氧基、3,4,5-三(十八烷氧基)环己基甲氧基、3,5-双(二十二烷氧基)环己基甲氧基、3,5-双[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲氧基、3,4,5-三[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲氧基、3,4,5-三(十八烷氧基)环己基甲基氨基、2,4-双(二十二烷氧基)环己基甲基氨基、3,5-双(二十二烷氧基)环己基甲基氨基、4-甲氧基-2-[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、4-甲氧基-2-[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、2,4-双(十二烷氧基)环己基甲基氨基、3,5-双[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、或3,4,5-三[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基的基团,
或者
L-Y为单键或琥珀酰基-1,4-哌嗪二基,且
Z为3,4,5-三(十八烷氧基)苯甲酰基的基团。
用于固液分离的优选的拟固相保护基(g-I)特别好是
L为琥珀酰基,且
Y-Z为3,4,5-三(十八烷氧基)苄氧基、3,4,5-三(十八烷氧基)环己基甲氧基、或苯基(2,3,4-三(十八烷氧基)苯基)甲基氨基的基团;或者
L-Y为琥珀酰基-1,4-哌嗪二基,且
Z为3,4,5-三(十八烷氧基)苯甲酰基的基团。
用于固液分离的优选的拟固相保护基(g-I)最好是
L为琥珀酰基,且
Y-Z为3,4,5-三(十八烷氧基)苄氧基、或3,4,5-三(十八烷氧基)环己基甲氧基的基团;或者
L-Y为琥珀酰基-1,4-哌嗪二基,且
Z为3,4,5-三(十八烷氧基)苯甲酰基的基团。
用于萃取的优选的拟固相保护基(g-I)较好是:2-{2,4-二(2',3'-二氢植基氧基)苄基氨基羰基}乙基羰基、3,5-二(2',3'-二氢植基氧基)苄氧基琥珀酰基、4-(2',3'-二氢植基氧基)苄氧基琥珀酰基、2-{1-[(2-氯-5-(2',3'-二氢植基氧基)苯基)]苄基氨基羰基}乙基羰基、3,4,5-三(2',3'-二氢植基氧基)苄氧基琥珀酰基、2-{3,4,5-三(2',3'-二氢植基氧基)苄基氨基羰基}乙基羰基、2-{4-(2',3'-二氢植基氧基)苄基氨基羰基}乙基羰基、2-{2-[3',4',5'-三(2”,3”-二氢植基氧基)苄氧基]-4-甲氧基苄基氨基羰基}乙基羰基、2-{4-(2',3'-二氢植基氧基)-2-甲氧基苄基氨基羰基}乙基羰基、4-(2',3'-二氢植基氧基)-2-甲基苄氧基琥珀酰基、2-{4-(2',3'-二氢植基氧基)-2-甲基苄基氨基羰基}乙基羰基、4-[2,2,4,8,10,10-六甲基-5-十二烷酰基氨基]苄氧基琥珀酰基、2-{4-[2,2,4,8,10,10-六甲基-5-十二烷酰基氨基]苄基氨基羰基}乙基羰基、4-(3,7,11-三甲基十二烷氧基)苄氧基琥珀酰基、2-{4-(3,7,11-三甲基十二烷氧基)苄基氨基羰基}乙基羰基、2-{3,5-二(2',3'-二氢植基氧基)苄基氨基羰基}乙基羰基、2-{1-[2,3,4-三(2',3'-二氢植基氧基)苯基]苄基氨基羰基}乙基羰基、2-{1-[4-(2',3'-二氢植基氧基)苯基]-4'-(2',3'-二氢植基氧基)苄基氨基羰基}乙基羰基、3,4,5-三[3,4,5-三(2',3'-二氢植基氧基)苄基]苄氧基琥珀酰基、或2-{3,4,5-三[3,4,5-三(2',3'-二氢植基氧基)苄基]苄基氨基羰基}乙基羰基。
作为保护核酸b中的5'位羟基的“在酸性条件下可除去的临时保护基”,只要在酸性条件下可脱保护、且能用作羟基的保护基即可,无特别限定,可例举例如:三苯甲基、9-(9-苯基)呫吨基、9-苯基硫代呫吨基、1,1-双(4-甲氧基苯基)-1-苯基甲基(二甲氧基三苯甲基)等双(C1-6烷氧基)三苯甲基、1-(4-甲氧基苯基)-1,1-二苯基甲基(单甲氧基三苯甲基)等单(C1-18烷氧基)三苯甲基等。其中,从脱保护的容易性、获得的容易性的观点来看,羟基的临时保护基较好是单甲氧基三苯甲基或二甲氧基三苯甲基,更好是二甲氧基三苯甲基。
Ln1的有机基团是指烃基、或烃基中的碳原子被杂原子替代的基团。作为杂原子,可例举例如氧原子、氮原子、硫原子等。此外,有机基团可具有羟基、氨基、氧代基(=O)等取代基。有机基团可具有的羟基和氨基较好是被保护基保护。有机基团的形状可以是链状(直链状或支链状)、环状或它们的组合中的任一种。
有机基团可具有对细胞具功能性的基团。对细胞具功能性的基团较好是结合于有机基团的主链或侧链的末端。作为对细胞具功能性的基团,可例举例如“通过使化合物的脂溶性提高而提高化合物的细胞膜透过性的基团”、“介以细胞膜受体使化合物向细胞内的摄入提高的基团”等。作为“通过使化合物的脂溶性提高而提高化合物的细胞膜透过性的基团”,可例举例如胆固醇残基、生育酚残基等。作为“介以细胞膜受体使化合物向细胞内的摄入提高的基团”,可例举例如N-乙酰半乳糖胺残基等。对细胞具功能性的基团在WO2017/104836号公报中有记载。
作为-OLn1-OH的具体例子,可以例举以下的例子(下述式中的*表示与磷原子的结合位置,Ac表示乙酰基)。
[化学式22]
Ln1较好是C2-6亚烷基,更好是亚乙基。
以下,关于实施本发明的制造方法时的优选的核酸a、核酸α和核酸b,进行详细说明。
作为本发明的工序(1)中使用的核酸a,可例举例如以下述式(a-I)表示的化合物(即,核苷或寡核苷酸)。
[化学式23]
式中,
m表示0以上的整数,
m+1个Base分别独立表示可被保护的核酸碱基,
m+1个X分别独立表示氢原子、卤素原子、可被保护的羟基、或与2位碳原子和4位碳原子结合的二价有机基团,
m+1个Xn1分别独立表示氧原子或NH,
m个R10分别独立表示氧原子或硫原子,
m个Rp1分别独立表示磷酸基的保护基,
L、Y和Z与上述同义。
以下,也将以式(a-I)表示的化合物简称为“化合物(a-I)”。以其他式表示的化合物有时也同样简称。
核酸碱基的氨基较好是被保护基保护。作为该保护基,较好是乙酰基、苯氧乙酰基、4-异丙基苯氧乙酰基、苯甲酰基、异丁酰基、(2-己基)癸酰基、二甲基甲脒基、和=NC(R11)-N(R12)(R13)基(式中,R11表示甲基,R12和R13分别独立表示C1-5烷基,或者R11和R12可一起与它们所结合的碳原子和氮原子共同形成五元或六元含氮烃环)。应予说明,作为所述=NC(R11)-N(R12)(R13)基,可例举例如1-(二甲基氨基)亚乙基。化合物(a-I)有多个氨基的情况下,氨基酸的保护基可以是仅1种,也可以是2种以上。
m为0的情况下,化合物(a-I)为核苷;m为1以上的情况下,化合物(a-I)为寡核苷酸。m较好是49以下,更好是29以下,进一步更好是19以下,特别好是4以下,最好是2以下。
作为X的卤素原子,较好是氟原子、氯原子,更好是氟原子。
作为X的可被保护的羟基的保护基,无特别限定,可例举例如《有机合成中的保护基(PROTECTIVE GROUPS in ORGANIC SYNTHESIS)》、第3版、约翰威立父子出版公司(JOHNWILLY&SONS)出版(1999年)等中所记载的任意的保护基。具体来说,可例举甲基、苄基、对甲氧基苄基、叔丁基、甲氧基甲基、甲氧基乙基、2-四氢吡喃基、乙氧基乙基、氰基乙基、氰基乙氧基甲基、苯基氨甲酰基、1,1-二氧代硫代吗啉-4-硫代氨甲酰基、乙酰基、新戊酰基、苯甲酰基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、[(三异丙基甲硅烷基)氧基]甲基(Tom)、1-(4-氯苯基)-4-乙氧基哌啶-4-基(Cpep)等。可被保护的羟基的保护基较好是三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、或叔丁基二甲基甲硅烷基,从经济性和获得容易性的观点来看,特别好是叔丁基二甲基甲硅烷基。
作为X的“与2位碳原子和4位碳原子结合的二价有机基团”,只要与核苷的2位碳原子和4位碳原子结合,则无特别限定。作为该二价有机基团,可例举例如任选被取代的C2-7亚烷基、以及由选自-O-、-NR33-(R33表示氢原子或C1-6烷基)、-S-、-CO-、-COO-、-OCONR34-(R34表示氢原子或C1-6烷基)和-CONR35-(R35表示氢原子或C1-6烷基)中的二价连接基团与任选被取代的C1-7亚烷基所构成的二价有机基团等。作为C1-7亚烷基和C2-7亚烷基可具有的取代基,可例举例如亚甲基(CH2=)。
作为“与2位碳原子和4位碳原子结合的二价有机基团”,较好是任选被取代的C2-7亚烷基、-ORi-(Ri表示与4位碳原子结合的C1-6亚烷基)、-O-NR33-Rj-(Rj表示与4位碳原子结合的C1-6亚烷基,R33表示与上述同样的含义)、-O-Rk-O-Rl-(Rk表示C1-6亚烷基,Rl表示与4位碳原子交联结合的C1-6亚烷基),更好是-ORi-(Ri表示与上述同样的含义)、-O-NR33-Rj-(Rj和R33表示与上述同样的含义)、-O-Rk-O-Rl-(Rk和Rl表示与上述同样的含义)。作为以Ri、Rj、Rk和Rl表示的C1-6亚烷基,分别独立较好是亚甲基或亚乙基。
作为“与2位碳原子和4位碳原子结合的二价有机基团”,更好是-O-CH2-、-O-CH2-CH2-、-O-NR33-CH2-(R33表示与上述同样的含义)、-O-CH2-O-CH2-,进一步更好是-O-CH2-、-O-CH2-CH2-、-O-NH-CH2-、-O-N(CH3)-CH2-、-O-CH2-O-CH2-(分别是左侧与2位碳原子结合,右侧与4位碳原子结合)。
m+1个X分别独立较好是氢原子、卤素原子、或可被保护的羟基,更好是氢原子或可被保护的羟基。
作为Rp1的磷酸基的保护基,只要是在碱性条件下可除去的能用作磷酸基的保护基的基团即可,无特别限定,较好是以-CH2CH2WG表示的基团,WG表示吸电子基团。作为WG的吸电子基团,可例举例如氰基、硝基等,较好是氰基。
m个Rp1较好是分别独立为以-CH2CH2WG表示的基团;
m+1个Xn1较好是氧原子;
L、Y和Z的说明如上所述。
化合物(a-I)较好是以下述式(a-i)表示的化合物(下述式中的符号的定义和说明如上所述)。
[化学式24]
化合物(a-I)可通过本身公知的方法或基于其的方法制造。例如,可按照国际公开第2017/104836号公报中所记载的方法制造。
化合物(a-i)中,较好是以式(a-II)表示的化合物(即,核苷或寡核苷酸)。
[化学式25]
式中,
m、m个Base、m+1个X、m个R10、m个Rp1、L、Y和Z分别独立与上述同义,
R11表示甲基,R12和R13分别独立表示C1-5烷基,或者R11和R12可一起与它们所结合的碳原子和氮原子共同形成五元或六元含氮烃环。
式(a-II)中,m个Rp1分别独立较好是以-CH2CH2WG表示的基团。式(a-II)中,m较好是0。即,化合物(a-II)中,较好是以式(a-III)表示的化合物(即,核苷),下述式中的符号的定义和说明如上所述。
[化学式26]
式(a-II)和式(a-III)中,较好是R11为甲基,R12和R13分别独立为C1-5烷基,更好是R11、R12和R13为甲基。式(a-II)和式(a-III)中的其他符号的说明如上所述。
本发明中,在制造最初的残基具有腺嘌呤作为核酸碱基的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的情况下,通过将化合物(a-II)(特别是化合物(a-III))用作作为起始物质的核苷、核苷酸或寡核苷酸,可抑制分支体的生成等。在此,分支体是指目标化合物的核酸碱基中的氨基的保护基脱落,该氨基与单体结合而生成的副产物。
此外,化合物(a-i)中,较好是以式(a-IV)表示的化合物(即,核苷或寡核苷酸)。
[化学式27]
式中,
m、m+1个Base、m+1个X、m个R10、m个Rp1、L和Y分别独立与上述同义。
Z'表示以式(a2”):
[化学式28]
表示的基团。
式(a2”)中,
*表示结合位置,
R6为氢原子,或者在Rb为以下述式(a3)表示的基团的情况下,可与R8一起表示单键或-O-、并与环B和环C一起形成稠环,
k表示1~4的整数;
k个Q分别独立表示-O-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-C(=O)NH-或-NHC(=O)-,
k个R7分别独立表示碳数为10以上的直链状的脂肪族烃基介以单键或连接基团结合的烃基,或者表示具有至少1个含1条以上的支链的脂肪族烃基、且总碳数为14以上且300以下的有机基团,
环B除具有k个QR7之外,可进而具有选自卤素原子、可被卤素原子取代的C1-6烷基、和可被卤素原子取代的C1-6烷氧基中的取代基。
Ra表示氢原子,且
Rb表示氢原子、或以式(a3):
[化学式29]
表示的基团,或者
Ra和Rb一起形成氧代基。
式(a3)中,*表示结合位置,
j表示0~4的整数,
j个Q分别独立与上述同义,
j个R9分别独立表示碳数为10以上的直链状的脂肪族烃基介以单键或连接基团结合的烃基,或者表示具有至少1个含1条以上的支链的脂肪族烃基、且总碳数为14以上且300以下的有机基团,
R8表示氢原子,或者可与R6一起表示单键或-O-、并与环B和环C一起形成稠环,且
环C除具有j个QR9之外,可进而具有选自卤素原子、可被卤素原子取代的C1-6烷基、和可被卤素原子取代的C1-6烷氧基中的取代基。
式(a-IV)中,m个Rp1分别独立较好是以-CH2CH2WG表示的基团;
式(a-IV)中,m较好是0;
式(a-IV)中的其他符号的说明如上所述;
化合物(a-IV)中,较好是以下述式(a-V)表示的化合物(即,核苷),下述式中的符号的定义和说明如上所述。
[化学式30]
化合物(a-I)中,拟固相保护基中具有以式(a2”)表示的Z'(即,环己基甲基的结构)的化合物(a-IV)(特别是化合物(a-V))与拟固相保护基中具有以式(a2)表示的Z(即,苄基的结构)的其他化合物(a-I)相比,在非极性溶剂中的溶解性更高。因此,通过使用化合物(a-IV)(特别是化合物(a-V)),可在更高浓度下实施本发明的制造方法,生产性大幅提升。以式(a2”)表示的Z'的说明与上述的以式(a2”)表示的Z的说明相同。
式(a-IV)和式(a-V)中,
L为琥珀酰基、或以式(a1')表示的基团(式(a1')中,R1和R2分别独立为C1-10烷基,L1为二价亚苯基,L2为单键),且
Y-Z'为3,4,5-三(十八烷氧基)环己基甲氧基、3,5-双(二十二烷氧基)环己基甲氧基、3,5-双[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲氧基、3,4,5-三[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲氧基、3,4,5-三(十八烷氧基)环己基甲基氨基、2,4-双(二十二烷氧基)环己基甲基氨基、3,5-双(二十二烷氧基)环己基甲基氨基、4-甲氧基-2-[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、4-甲氧基-2-[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、2,4-双(十二烷氧基)环己基甲基氨基、3,5-双[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、或3,4,5-三[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基的组合在用于固液分离时优选。
式(a-IV)和式(a-V)中,
L为琥珀酰基,且
Y-Z'为3,4,5-三(十八烷氧基)环己基甲氧基、3,5-双(二十二烷氧基)环己基甲氧基、3,5-双[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲氧基、3,4,5-三[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲氧基、3,4,5-三(十八烷氧基)环己基甲基氨基、2,4-双(二十二烷氧基)环己基甲基氨基、3,5-双(二十二烷氧基)环己基甲基氨基、4-甲氧基-2-[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、4-甲氧基-2-[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、2,4-双(十二烷氧基)环己基甲基氨基、3,5-双[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、或3,4,5-三[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基的组合在用于固液分离时更优选。
式(a-IV)和式(a-V)中,
L为琥珀酰基,且
Y-Z'为3,4,5-三(十八烷氧基)环己基甲氧基、3,5-双(二十二烷氧基)环己基甲氧基、3,5-双[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲氧基、或3,4,5-三[3',4',5'-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲氧基的组合在用于固液分离时进一步优选。
式(a-IV)和式(a-V)中,
L为琥珀酰基,且
Y-Z'为3,4,5-三(十八烷氧基)环己基甲氧基的组合在用于固液分离时特别优选。
此外,作为核酸a,可例举例如以下述式(a-VI)表示的化合物(即,核苷或寡核苷酸)。
[化学式31]
式中,
m+1个Base1的至少一个表示被-L-Y-Z保护的核酸碱基,其余表示可被保护的核酸碱基,
m个Xn1分别独立表示氧原子或NH,
Xn2表示被保护的羟基或氨基,
m、m+1个X、m个R10、m个Rp1、L、Y和Z分别独立与上述同义。
式(a-VI)中,m+1个Base1的至少一个为被-L-Y-Z保护的核酸碱基。核酸碱基和-L-Y-Z的说明如上所述。此外,可被保护的核酸碱基的说明也如上所述。
作为被保护的羟基(Xn2)的保护基,无特别限定,可例举例如《有机合成中的保护基(PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS)》、第3版、约翰威立父子出版公司(JOHNWILLY&SONS)出版(1999年)等中所记载的任意的保护基。具体来说,可例举甲基、苄基、对甲氧基苄基、叔丁基、甲氧基乙基、乙氧基乙基、氰基乙基、氰基乙氧基甲基、苯基氨甲酰基、1,1-二氧代硫代吗啉-4-硫代氨甲酰基、乙酰基、新戊酰基、苯甲酰基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、[(三异丙基甲硅烷基)氧基]甲基(Tom)、1-(4-氯苯基)-4-乙氧基哌啶-4-基(Cpep)等。羟基的保护基较好是三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基或叔丁基二甲基甲硅烷基,从经济性和获得容易性的观点来看,更好是叔丁基二甲基甲硅烷基。应注意,羟基的保护和脱保护为周知,可通过例如上述的《有机合成中的保护基(PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS)》中记载的方法进行。
作为被保护的氨基(Xn2)的保护基,无特别限定,可例举例如《有机合成中的保护基(Greene's PROTECTIVE GROUPS in ORGANIC SYNTHESIS)》、第4版、威立国际科学(Wiley-Interscience)出版(2006年)等中所记载的保护基。作为各保护基的具体例子,可例举新戊酰基、新戊酰氧甲基、乙酰基、三氟乙酰基、苯氧乙酰基、4-异丙基苯氧乙酰基、4-叔丁基苯氧乙酰基、苯甲酰基、异丁酰基、(2-己基)癸酰基、二甲基甲脒基、1-(二甲基氨基)亚乙基、9-芴基甲氧羰基。氨基的保护基较好是乙酰基、苯氧乙酰基、4-异丙基苯氧乙酰基、苯甲酰基、异丁酰基、(2-己基)癸酰基、二甲基甲脒基、或1-(二甲基氨基)亚乙基。应注意,氨基的保护和脱保护为周知,可通过例如上述的《有机合成中的保护基(PROTECTIVE GROUPS inORGANIC SYNTHESIS)》中记载的方法进行。
式(a-VI)中的m个Xn1较好是氧原子;
式(a-VI)中的Xn2较好是被保护的羟基;
式(a-VI)中的m个Rp1较好是分别独立为以-CH2CH2WG表示的基团;
式(a-VI)中的其他符号的说明如上所述。
化合物(a-VI)较好是以下述式(a-vi)表示的化合物。
[化学式32]
式中,
Rn4表示羟基的保护基,
m、m+1个Base1、m+1个X、m个R10、m个Rp1、L、Y和Z分别独立与上述同义。
式(a-vi)中的Rn4的说明与Xn2中的羟基的保护基的说明相同。式(a-vi)中的其他符号的说明如上所述。
此外,作为核酸α,可例举例如以下述式(a-VII)表示的化合物(即,核苷酸或寡核苷酸)。
[化学式33]
式中,
m+1个Xn1分别独立表示氧原子或NH,
Ln1表示有机基团,
m、m+1个Base、m+1个X、m+1个R10、m+1个Rp1、L、Y和Z分别独立与上述同义。
式(a-VII)中的Ln1较好是C2-6亚烷基,更好是亚乙基;
式(a-VII)中的m+1个Xn1较好是氧原子;
式(a-VII)中的m+1个Rp1较好是分别独立为以-CH2CH2WG表示的基团;
式(a-VII)中的其他符号的说明如上所述。
化合物(a-VII)较好是以下述式(a-vii)表示的化合物(下述式中的符号的定义和说明如上所述)。
[化学式34]
化合物(a-VII)可通过本身公知的方法或基于其的方法制造。m为0、Xn1为氧原子、L为琥珀酰基的化合物(a-VII)例如可通过以下的工序制造:
(i)使化合物Z-Y-H与琥珀酸酐缩合,制造Z-Y-CO(CH2)2COOH;
(ii)在缩合剂的存在下,使所得的Z-Y-CO(CH2)2COOH与以式:HO-Ln1-OQ”表示的化合物缩合后,脱保护,制造Z-Y-CO(CH2)2CO-O-Ln1-OH,所述式中,Q”表示临时保护基,Ln1表示有机基团;
(iii)使亚磷酰胺化的核苷与所得的Z-Y-CO(CH2)2CO-O-Ln1-OH反应,制造m为0、Xn1为氧原子、L为琥珀酰基的化合物(a-VII)。
如上所述的缩合反应和脱保护反应对于本领域技术人员周知,本领域技术人员可适当设定条件进行。
L为除琥珀酰基以外的化合物(a-VII)也可通过使用对应的酸酐、对应的二羧酸酰卤、对应的二羧酸的活性酯等代替琥珀酸酐,进行同样的反应来制造。此外,Xn1为NH的化合物(a-VII)可通过使用3'位氨基被亚磷酰胺化的核苷,进行同样的反应来制造。此外,m为1以上的化合物(a-VII)可通过使用m为0的化合物(a-VII)作为起始原料反复进行伸长过程来制造。
本发明的工序(1)中使用的核酸a或核酸α较好是化合物(a-I)、化合物(a-VI)或化合物(a-VII),更好是化合物(a-i)、化合物(a-vi)或化合物(a-vii),进一步更好是化合物(a-i)或化合物(a-vi),又更好是化合物(a-i),再进一步更好是化合物(a-II)或化合物(a-IV),特别好是化合物(a-III)或化合物(a-V)。
本发明的工序(1)中使用的核酸b的5'位羟基被保护基(临时保护基)保护。作为羟基的保护基,只要在酸性条件下可脱保护、且能用作羟基的保护基即可,无特别限定,可例举例如三苯甲基、9-(9-苯基)呫吨基、9-苯基硫代呫吨基、1,1-双(4-甲氧基苯基)-1-苯基甲基(二甲氧基三苯甲基)等双(C1-6烷氧基)三苯甲基、1-(4-甲氧基苯基)-1,1-二苯基甲基(单甲氧基三苯甲基)等单(C1-18烷氧基)三苯甲基等。其中,从脱保护的容易性、获得的容易性的观点来看,羟基的临时保护基较好是单甲氧基三苯甲基或二甲氧基三苯甲基,更好是二甲氧基三苯甲基。
核酸b中的3'位羟基或3'位氨基的基于选自亚磷酰胺法、H-膦酸酯法、二卤代膦法和氧氮磷杂环戊烷法中的方法的修饰,如上述工序(1)的说明中所述,可按照本技术领域中公知的方法进行。
作为核酸b的制造方法的一例,对于适用亚磷酰胺法的情况,例如,可参照国际公开第2017/104836号的记载。
作为核酸b,可例举例如以下述式(b-I)表示的化合物(即,核苷或寡核苷酸)。
[化学式35]
式中,
q表示0以上的整数,
q+1个Base2分别独立表示可被选自-L-X-Z和用于核酸合成的保护基中的保护基保护的核酸碱基,
q+1个X、q+1个Rp1、q个R10、L、X和Z分别独立与上述同义,
q+1个Xn1分别独立表示氧原子或NH,
Q”为在酸性条件下可除去的羟基的临时保护基,
R36和R37分别独立表示烷基,或者表示与邻接的氮原子一起形成的五或六元的饱和环状氨基,所述饱和环状氨基除具有氮原子之外还可具有1个氧原子或硫原子作为成环原子。
R36和R37分别独立较好是C1-10烷基,或者与邻接的氮原子一起形成的五或六元的饱和环状氨基,更好是C1-10烷基,进一步更好是C1-6烷基。
在酸性条件下可除去的羟基的临时保护基的说明如上所述。Q”较好是单甲氧基三苯甲基或二甲氧基三苯甲基,更好是二甲氧基三苯甲基。
式(b-I)中的核酸碱基的氨基较好是被保护基保护。作为该保护基,可例举选自-L-X-Z和用于核酸合成的保护基中的保护基。L、X和Z的说明如上所述。作为用于核酸合成的保护基,较好是乙酰基、苯氧乙酰基、4-异丙基苯氧乙酰基、苯甲酰基、异丁酰基、(2-己基)癸酰基、二甲基甲脒基、和=NC(R11)-N(R12)(R13)基(式中,R11表示甲基,R12和R13分别独立表示C1-5烷基,或者R11和R12可一起与它们所结合的碳原子和氮原子共同形成五元或六元含氮烃环)。其中,作为所述=NC(R11)-N(R12)(R13)基,可例举例如1-(二甲基氨基)亚乙基。化合物(b-I)有多个氨基的情况下,氨基酸的保护基可以是仅1种,也可以是2种以上。
q为0的情况下,化合物(b-I)为核苷;q为1以上的情况下,化合物(b-I)为寡核苷酸。本工序中使用的化合物(b-I)中,q较好是49以下,更好是29以下,进一步更好是19以下,特别好是4以下,最好是2以下。
q+1个X分别独立较好是氢原子、卤素原子、或可被保护的羟基,更好是氢原子或可被保护的羟基;
Base2分别独立较好是可被选自用于核酸合成的保护基的保护基保护的核酸碱基;
q+1个Rp1分别独立较好是以CH2CH2WG表示的基团;
q+1个Xn1较好是氧原子;
L、X和Z的说明如上所述。
化合物(b-I)较好是以下述式(b-i)表示的化合物。
[化学式36]
式中,
q+1个Base3分别独立表示可被用于核酸合成的保护基保护的核酸碱基,
q、q+1个X、q+1个Rp1、q个R10、Q”、R36和R37分别独立与上述同义。
式(b-i)中,用于核酸合成的保护基、q、q+1个X、q+1个Rp1、q个R10、Q”、R36和R37的说明如上所述。
本发明的工序(1)中使用的核酸a或核酸α与核酸b的组合
较好是化合物(a-I)、化合物(a-VI)或化合物(a-VII)与化合物(b-I)的组合,
更好是化合物(a-i)、化合物(a-vi)或化合物(a-vii)与化合物(b-i)的组合,
进一步更好是化合物(a-i)或化合物(a-vi)与化合物(b-i)的组合,
又更好是化合物(a-i)与化合物(b-i)的组合,
再进一步更好是化合物(a-II)或化合物(a-IV)与化合物(b-i)的组合,
特别好是化合物(a-III)或化合物(a-V)与化合物(b-i)的组合。
以上,对本发明的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法进行了详细说明。该制造方法是目前本技术领域的核酸链的链延伸反应中通常的基于沿着“自3'侧至5'侧的方向”的核酸链延伸的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法。核酸A较好是5'位羟基未被保护且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸的情况,但本发明的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法也可适用于基于与其相反方向的沿着“自5'侧至3'侧的方向”的核酸链延伸的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造。该基于沿着“自5'侧至3'侧的方向”的核酸链延伸的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造可通过以下所示的方法进行。
[A]具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其包括:
工序(1-1):使3'位羟基或3'位氨基未被保护、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护、或可结合于固相载体的核苷、核苷酸或寡核苷酸(核酸A-1)(较好是核酸A-1中的3'位为羟基),与5'位羟基通过用于形成亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的方法(例如,选自亚磷酰胺法、H-膦酸酯法、二卤代膦法和氧氮磷杂环戊烷法中的方法)被修饰、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸(核酸B-1),在抗氧化剂的存在下缩合,获得亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的工序;
[B]具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其包括:
工序(1-1):使3'位羟基或3'位氨基未被保护、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护、或可结合于固相载体的核苷、核苷酸或寡核苷酸(核酸A-1)(较好是核酸A-1中的3'位为羟基),与5'位羟基通过用于形成亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的方法(例如,选自亚磷酰胺法、H-膦酸酯法、二卤代膦法和氧氮磷杂环戊烷法中的方法)被修饰、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸(核酸B-1),在抗氧化剂的存在下缩合,获得亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的工序,以及
工序(2-1):使所得的亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体与硫化剂反应的工序。
应予说明,使用3'位具有氨基的核酸A-1代替3'位具有羟基的核酸A-1,适用亚磷酰胺法、H-膦酸酯法、二卤代膦法和氧氮磷杂环戊烷法等方法来获得缩合体的情况下,3'位与磷原子的结合由-O-P键替代为-N-P键,但该情况下,本说明书中也为了便于说明而按照-O-P键的情况称为“亚磷酸酯体”或“亚磷酸二酯体”。此外,关于对应的“PO杂质”,也同样称为“磷酸三酯体”或“磷酸二酯体”。
上述的包括2个工序的制造方法中的“抗氧化剂”、“硫化剂”、“核酸A-1”、“核酸B-1”等各构成要素的定义和2个工序的详细的反应条件等,与上述基于沿着“自3'侧至5'侧的方向”的核酸链延伸的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法中详述的各构成要素的定义和各工序的反应条件相同。参照这些说明,只要是本领域技术人员,就可适当进行基于沿着“自5'侧至3'侧的方向”的核酸链延伸的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造。
本发明中,还包括:使用5'位羟基未被保护、且其他基团可结合于用于核酸合成的固相载体的核苷、核苷酸或寡核苷酸(以下有时称为“核酸A”),或者3'位羟基或3'位氨基未被保护、且其他基团可结合于用于核酸合成的固相载体的核苷、核苷酸或寡核苷酸(核酸A-1),制造具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的方法。在固相条件下实施本发明的制造方法的情况下,核酸A或核酸A-1的一个基团结合于固相载体。作为固相载体使用的固相支承体或树脂可以是适合于固相合成中的使用的本技术领域中已知的任何支承体。本说明书中,术语“固相”包括核苷、核苷酸或寡核苷酸介以惯用的功能性连接基团或柄状基团(handlegroup)结合或连接于上述的固相支承体或树脂,本文(上下文)中提及“固相”时也涵盖这样的连接基团(linker)的意思。关于固相的例子,例如:聚苯乙烯支承体(例如可通过对甲基二苯甲胺(p-methylbenzyl-hydrylamine)进一步功能化)、或者包封有硅藻土的聚二甲基丙烯酰胺(蛋白酶K(pepsin K))、二氧化硅或微孔性玻璃等刚性功能化支承体。固相的树脂基质可由两亲性的聚苯乙烯-PEG树脂或PEG-聚酰胺或PEG-聚酯树脂构成。作为固相载体,包括例如Wang-PEG树脂或Rink-酰胺PEG树脂。
实施例
以下,按照实施例对本发明进行更详细的说明,但这些实施例不对本发明的范围造成任何限定。此外,只要未特别提及,本发明中使用的试剂和装置、材料可通过商业途径获得。此外,本说明书中,以缩写符号表示氨基酸等的情况下,各表示形式基于IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature)所规定的缩写符号或本领域中的惯用缩写符号。
后述的实施例等中使用的缩写符号的含义如下:
SUC:琥珀酰基
TOB:3,4,5-三(十八烷氧基)苄氧基
2'-OMe-C-CE亚磷酰胺:5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2'-O-甲基-胞苷-3'-[O-(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺
DDTT:5-[(N,N-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮
ETT:5-乙硫基-1H-四唑
TFE:2,2,2-三氟乙醇
TOF-MS:飞行时间型质谱分析仪
HO-CmT-SUC-TOB:(2'-O-甲基-胞苷3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基胸苷-3'-基-[3,4,5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯)
HO-CmCmT-SUC-TOB:(2'-O-甲基-胞苷3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基2'-O-甲基-胞苷3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基胸苷-3'-基-[3,4,5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯)
HO-CmCmCmT-SUC-TOB:(2'-O-甲基-胞苷3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基2'-O-甲基-胞苷3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基2'-O-甲基-胞苷3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基胸苷-3'-基-[3,4,5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯)
HO-CmCmCmCmT-SUC-TOB:(2'-O-甲基-胞苷3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基(2'-O-甲基-胞苷3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基2'-O-甲基-胞苷3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基2'-O-甲基-胞苷3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基胸苷-3'-基-[3,4,5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯)
T-CE亚磷酰胺:5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-胸苷-3'-[O-(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺
HO-TT-SUC-TOB:(胸苷3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基胸苷-3'-基-[3,4,5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯)
POS:5-苯基-3H-1,2,4-二噻唑-3-酮。
Piv-TOB:3,4,5-三(十八烷氧基)苄基新戊酸酯
PADS:苯乙酰二硫化物
DMTr:4,4'-二甲氧基三苯甲基
LC-TOF MS:液相色谱-飞行时间型质谱分析仪
DBU:1,8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一烯
PivCl:新戊酰氯
CMPT:N-(氰基甲基)吡咯烷三氟甲磺酸盐。
2'-OMe-C-CE亚磷酰胺:5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-N4-苯甲酰-2'-O-甲基-胞苷-3'-[O-(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺
2'-OMe-G-CE亚磷酰胺:5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-N2-异丁酰-2'-O-甲基-鸟苷-3'-[O-(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺。
5-Me-dC(Bz)-CE亚磷酰胺:5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-N4-苯甲酰-2'-脱氧-5-甲基胞苷-3'-[O-(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺
dG-CE亚磷酰胺:5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-N2-异丁酰-脱氧鸟苷-3'-[O-(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺
dT-CE亚磷酰胺:5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-脱氧胸苷-3'-[O-(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺。
2'-O-TBDMS-C(Ac)-CE亚磷酰胺:5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-N4-乙酰-2'-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-胞苷-3'-[O-(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺。
LNA-A(Bz)-CE亚磷酰胺:5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-N6-苯甲酰-2'-O,4'-C-亚甲基-腺苷-3'-[O-(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺。
2'-F-C(Bz)-CE亚磷酰胺:5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-N4-苯甲酰-2'-氟-胞苷-3'-[O-(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺。
dT-H-膦酸酯TEA盐:5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-脱氧胸苷-3'-H-膦酸酯,三乙胺盐。
HO-T-SUC-TOB:脱氧胸苷-3'-基3,4,5-三(十八烷氧基)苄基琥珀酸酯
HO-C-SUC-TOB:N4-苯甲酰-脱氧胞苷-3'-基-[3,4,5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯
HO-TC-SUC-TOB:脱氧胸苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基N4-苯甲酰-脱氧胞苷-3'-基-[3,4,5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯。
DMTrO-A·T·C·G·A·C·T·C·T·C·G·A·G·C·G·T·T·C·T·C-SUC-TOB(式中,“·”表示硫代磷酰基键):
5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-N6-[1-(二甲基氨基)亚乙基]-脱氧腺苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基N4-苯甲酰-脱氧胞苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基N2-异丁酰-脱氧鸟苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基N6-[1-(二甲基氨基)亚乙基]-脱氧腺苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基N4-苯甲酰-脱氧胞苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基N4-苯甲酰-脱氧胞苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基N4-苯甲酰-脱氧胞苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基N2-异丁酰-脱氧鸟苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基N6-[1-(二甲基氨基)亚乙基]-脱氧腺苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基N2-异丁酰-脱氧鸟苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基N4-苯甲酰-脱氧胞苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基N2-异丁酰-脱氧鸟苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基N4-苯甲酰-脱氧胞苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基N4-苯甲酰-脱氧胞苷-3'-基-[3,4,5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯。
HO-CmT-SUC-TOB:N4-苯甲酰-2'-O-甲基-胞苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3'-基-[3,4,5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯
HO-GmCmT-SUC-TOB:N2-异丁酰-2'-O-甲基-鸟苷3'-[O-(2-氰基乙基)]磷酰基N4-苯甲酰-2'-O-甲基-胞苷3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3'-基-[3,4,5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯
HO-2'-OMe-U-SUC-TOB:2'-O-甲基-尿苷-3'-基3,4,5-三(十八烷氧基)苄基琥珀酸酯
HO-Um-SUC-TOB:2'-O-甲基-尿苷-3'-基3,4,5-三(十八烷氧基)苄基琥珀酸酯
HO-CmUm-SUC-TOB:N4-苯甲酰-2'-O-甲基-胞苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基2'-O-甲基-尿苷-3'-基-[3,4,5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯
HO-GUm-SUC-TOB:N2-异丁酰-脱氧鸟苷3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基2'-O-甲基-尿苷-3'-基-[3,4,5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯
HO-ALT-SUC-TOB:N6-苯甲酰-2'-O,4'-C-亚甲基-腺苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3'-基-[3,4,5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯
HO-CfALT-SUC-TOB:N4-苯甲酰-2'-氟-胞苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基N6-苯甲酰-2'-O,4'-C-亚甲基-腺苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3'-基-[3,4,5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯
HO-rCCfALT-SUC-TOB:N4-乙酰-2'-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-胞苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基N4-苯甲酰-2'-氟-胞苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基N6-苯甲酰-2'-O,4'-C-亚甲基-腺苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3'-基-[3,4,5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯
HO-(CH2)2-SUC-TOB:3,4,5-三(十八烷氧基)苄基2-羟基乙基琥珀酸酯
HO-AL(CH2)2-SUC-TOB:N6-苯甲酰-2'-O,4'-C-亚甲基-腺苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基乙氧基-[3,4,5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯
HO-CfAL(CH2)2-SUC-TOB:N4-苯甲酰-2'-氟-胞苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基N6-苯甲酰-2'-O,4'-C-亚甲基-腺苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基乙氧基-[3,4,5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯
HO-rCCfAL(CH2)2-SUC-TOB:N4-乙酰-2'-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-胞苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基N4-苯甲酰-2'-氟-胞苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基N6-苯甲酰-2'-O,4'-C-亚甲基-腺苷-3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基乙氧基-[3,4,5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯
HO-THT-SUC-TOB:脱氧胸苷-3'-膦酸酯脱氧胸苷-3'-基-[3,4,5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯
HO-TOHT-SUC-TOB:脱氧胸苷-3'-硫代磷酰基脱氧胸苷-3'-基-[3,4,5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯
HO-GmT-SUC-TOB:N2-异丁酰-2'-O-甲基-鸟苷3'-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3'-基-[3,4,5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯
HO-TSCNEtT-SUC-TOB:脱氧胸苷-3'-[S-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3'-基-[3,4,5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯。
以下,TOB加成化合物通过国际公开第2012/157723号中所记载的方法合成。此外,实施例和比较例中使用的2′-OMe-C-CE亚磷酰胺等的亚磷酰胺单体使用了市售品。
实施例1:硫代磷酸酯化二~五聚体的合成(存在抗氧化剂的情况)
氩气气氛下,向50mL的二口烧瓶中加入HO-T-SUC-TOB(248.2mg,0.20mmol),加入脱水二氯甲烷(10.0mL)和脱水乙腈(1.0mL)使其溶解后,加入2′-OMe-C-CE亚磷酰胺(518.5mg,0.60mmol)和甲基二苯基膦(37.8μL,0.20mmol),搅拌30分钟。然后,加入ETT(5-乙硫基-1H-四唑,78.1mg,0.60mmol)并在室温下搅拌1小时;
接着,向反应溶液中加入TFE(2,2,2-三氟乙醇,219μL,3.01mmol)并在室温下搅拌30分钟后,依次加入2,6-二甲基苯胺(638μL,5.18mmol)和DDTT(5-[(N,N-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮,215.6mg,1.05mmol),在室温下搅拌1小时。对所得的二聚体(有时表示为2mer,下同)进行了分析,其结果是,PO杂质为0.09%;
m/z(TOF-MS):计算值1729.07,实测值1730.08[M+H]+
与上述同样地操作,使用延伸得到的二聚体HO-CmT-SUC-TOB(279.6mg,0.16mmol)和2′-OMe-C-CE亚磷酰胺(419.2mg,0.485mmol)合成了三聚体HO-CmCmT-SUC-TOB(290.8mg)。对所得的三聚体进行了分析,其结果是,PO杂质为0.25%;
m/z(TOF-MS):计算值2221.16,实测值2222.17[M+H]+
同样地操作,使用延伸得到的三聚体HO-CmCmT-SUC-TOB(290.8mg,0.13mmol)和2′-OMe-C-CE亚磷酰胺(340.3mg,0.394mmol)合成了四聚体HO-CmCmCmT-SUC-TOB(283.0mg)。对所得的四聚体进行了分析,其结果是,含有0.27%的PO杂质;
m/z(TOF-MS):计算值2713.24,实测值2714.23[M+H]+
同样地操作,使用延伸得到的四聚体HO-CmCmCmT-SUC-TOB(283.0mg,0.10mmol)和2′-OMe-C-CE亚磷酰胺(270.1mg,0.313mmol)合成了五聚体HO-CmCmCmCmT-SUC-TOB(254mg)。对所得的五聚体进行了分析,其结果是,含有0.30%的PO杂质;
m/z(TOF-MS):计算值3205.33,实测值1604.69[M+2H]2+
在存在抗氧化剂的情况下的各链长时的PO杂质的含有比例示于表1。
[表1]
各链长时的PO杂质的含有比例(存在抗氧化剂的情况)
链长 | 2mer | 3mer | 4mer | 5mer |
PO杂质的含有比例 | 0.09% | 0.25% | 0.27% | 0.30% |
。
比较例1:硫代磷酸酯化二~五聚体的合成(不存在抗氧化剂的情况)
氩气气氛下,向50mL的二口烧瓶中加入HO-T-SUC-TOB(247.6mg,0.20mmol),加入脱水二氯甲烷(10.0mL)和脱水乙腈(1.0mL)使其溶解后,依次加入2′-OMe-C-CE亚磷酰胺(518.4mg,0.60mmol)和ETT(5-乙硫基-1H-四唑,78.1mg,0.60mmol)并在室温下搅拌1小时。接着,向反应溶液中加入TFE(2,2,2-三氟乙醇,218.6μL,3.0mmol)并在室温下搅拌30分钟后,依次加入2,6-二甲基苯胺(380.6μL,3.0mmol)和DDTT(5-[(N,N-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮,129.3mg,0.63mmol),在室温下搅拌1小时。对所得的二聚体进行了分析,其结果是,PO杂质为0.11%;
m/z(TOF-MS):计算值1729.07,实测值1730.08[M+H]+
与上述同样地操作,使用二聚体HO-CmT-SUC-TOB(297.4mg,0.17mmol)和2′-OMe-C-CE亚磷酰胺(445.5mg,0.52mmol)合成了三聚体HO-CmCmT-SUC-TOB(349.1mg)。对所得的三聚体进行了分析,其结果是,PO杂质为0.46%;
m/z(TOF-MS):计算值2221.16,实测值2222.17[M+H]+
同样地操作,使用三聚体HO-CmCmT-SUC-TOB(349.1mg,0.16mmol)和2′-OMe-C-CE亚磷酰胺(407.5mg,0.47mmol)合成了四聚体HO-CmCmCmT-SUC-TOB(415.3mg)。对所得的四聚体进行了分析,其结果是,PO杂质为0.68%;
m/z(TOF-MS):计算值2713.24,实测值2714.23[M+H]+
同样地操作,使用四聚体HO-CmCmCmT-SUC-TOB(415.3mg,0.15mmol)和2′-OMe-C-CE亚磷酰胺(399.2mg,0.46mmol)合成了五聚体HO-CmCmCmCmT-SUC-TOB(439.3mg)。对所得的五聚体进行了分析,其结果是,PO杂质为0.99%;
m/z(TOF-MS):计算值3205.33,实测值1604.69[M+2H]2+
在不存在抗氧化剂的情况下的各链长时的PO杂质的含有比例示于表2。
[表2]
各链长时的PO杂质的含有比例(不存在抗氧化剂的情况)
链长 | 2mer | 3mer | 4mer | 5mer |
PO杂质的含有比例 | 0.11% | 0.46% | 0.68% | 0.99% |
。
实施例2:由硫代磷酸酯化二聚体合成三聚体(存在各种抗氧化剂的情况)
氩气气氛下,向20mL的二口烧瓶中,加入通过在实施例1中使用T-CE亚磷酰胺代替2′-OMe-C-CE亚磷酰胺而与实施例1同样地操作所合成的HO-TT-SUC-TOB(56.4mg,0.035mmol),加入脱水二氯甲烷(1.8mL)和脱水乙腈(0.5mL)使其溶解后,加入2′-OMe-C-CE亚磷酰胺(91.8mg,0.105mmol)和各种抗氧化剂(0.035mmol),搅拌30分钟。然后,加入ETT(5-乙硫基-1H-四唑,14mg,0.105mmol)并在室温下搅拌3小时。接着,向反应溶液中加入TFE(2,2,2-三氟乙醇,38.4μL,0.53mmol)并在室温下搅拌2小时后,依次加入2,6-二甲基苯胺(50.2μL,0.407mmol)和POS(5-苯基-3H-1,2,4-二噻唑-3-酮,33.3mg,0.171mmol),在室温下搅拌1小时后,对各反应溶液进行了分析。关于PO杂质的含有比例的结果示于表3。
比较例2:由硫代磷酸酯化二聚体合成三聚体(不存在抗氧化剂的情况)
除不含实施例2的各种抗氧化剂(0.035mmol)以外,与实施例2同样地进行。关于PO杂质的含有比例的结果示于表3。
[表3]
以下,示出抗氧化剂的存在下的各种硫代磷酸酯化寡聚物的合成例。
实施例3:硫代磷酸酯化四聚体的合成(亚磷酰胺法)
延伸反应
氩气气氛下,向200mL的二口烧瓶中加入HO-T-SUC-TOB(300mg,242μmol)和Piv-TOB(450mg,451μmol),加入脱水二氯甲烷(12.1mL)和脱水乙腈(3.6mL)使其溶解。然后,依次加入三苯基膦(31.8mg,121μmol)、LNA-A(Bz)-CE亚磷酰胺(644mg,727μmol)和5-乙硫基-1H-四唑(94.6mg,727μmol)并在室温下搅拌1.0小时;
接着,向反应溶液中加入2,2,2-三氟乙醇(265μL,3.6mmol)并在室温下搅拌30分钟后,依次加入2,6-二甲基苯胺(506μL,4.1mmol)和DDTT(174mg,848μmol),在室温下搅拌1.7小时。然后,依次加入吲哚(424mg,3.6mmol)和三氟乙酸(1.1mL,14.4mmol),在室温下搅拌1.0小时。接着,向反应溶液中依次加入吡啶(3.5mL,43.0mmol)和水(180μL),在室温下搅拌1.0小时。然后,添加乙腈(112mL),将析出的固体用桐山漏斗抽滤后,进行干燥,作为白色固体获得二聚体HO-ALT-SUC-TOB(829.9mg,95%);
m/z:计算值1751.07,实测值1753.09[M+H]+
与上述同样地操作,使用上述中得到的白色固体(830mg)和2'-F-C(Bz)-CE亚磷酰胺、并使用4,5-二氰基咪唑代替5-乙硫基-1H-四唑,作为白色固体获得三聚体HO-CfALT-SUC-TOB(780.1mg,83%);
m/z:计算值2231.13,实测值1117.07[M+2H]2+
同样地操作,使用上述中得到的白色固体(718mg)和2'-O-TBDMS-C(Ac)-CE亚磷酰胺、并使用5-乙硫基-1H-四唑代替4,5-二氰基咪唑,作为白色固体获得四聚体HO-rCCfALT-SUC-TOB(758.5mg,94%);
m/z:计算值2761.27,实测值1382.15[M+2H]2+
脱保护反应
将上述中得到的白色固体(10mg)和28%氨水(5mL)加入高压釜中,在65℃加热4小时后,冷却至室温。通过针头式过滤器(Syringe Filter)除去反应液中的不溶物后,通过离心蒸发器减压浓缩。然后,将浓缩液冷冻干燥而获得作为目标物的2'-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-胞苷-3'-硫代磷酰基-2'-氟-胞苷-3'-硫代磷酰基-2'-O,4'-C-亚甲基-腺苷-3'-硫代磷酰基-脱氧胸苷;
m/z:计算值1357.24,实测值1356.23[M-H]-。
实施例4:硫代磷酸酯化二聚体的合成(亚磷酰胺法)
氩气气氛下,向1000mL的三口烧瓶中加入HO-C-SUC-TOB(3.0g,2.3mmol)和Piv-TOB(3.0g,3mmol),加入脱水氯仿(113mL)和脱水乙腈(34mL)使其溶解。然后,依次加入三苯基膦(296mg,1.1mmol)、dT-CE亚磷酰胺(3.7g,5.0mmol)和5-乙硫基-1H-四唑(648mg,5.0mmol)并在室温下搅拌1.5小时;
接着,向反应溶液中加入2,2,2-三氟乙醇(1.8mL,24.9mmol)并在室温下搅拌30分钟后,依次加入2,6-二甲基苯胺(2.2mL,17.6mmol)和POS(1.2g,6.1mmol),在室温下搅拌1.5小时;
然后,依次加入2,3-二甲基呋喃(2.6mL,24.8mmol)和三氟乙酸(5.6mL,72.8mmol),在室温下搅拌1.5小时。接着,向反应溶液中依次加入吡啶(44.1mL,546mmol)和水(960μL),在室温下搅拌1.5小时。然后,添加乙腈(1L),将析出的固体用桐山漏斗抽滤后,进行干燥,作为白色固体获得二聚体HO-TC-SUC-TOB(6.7g,99%)。
实施例5:硫代磷酸酯化三聚体的合成(亚磷酰胺法)
延伸反应
使用HO-(CH2)2-SUC-TOB(256mg)代替HO-T-SUC-TOB,与实施例3同样地操作,获得HO-AL(CH2)2-SUC-TOB,接着获得二聚体HO-CfAL(CH2)2-SUC-TOB,最后作为白色固体获得三聚体HO-rCCfAL(CH2)2-SUC-TOB(691mg);
m/z:计算值2581.22,实测值1292.11[M+2H]2+
脱保护反应
将上述中得到的白色固体(10mg)和28%氨水(5mL)加入高压釜中,在65℃加热4小时后,冷却至室温。通过针头式过滤器(Syringe Filter)除去反应液中的不溶物后,通过离心蒸发器减压浓缩。然后,将浓缩液冷冻干燥而获得作为目标物的2-[2'-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-胞苷-3'-硫代磷酰基-2'-氟-胞苷-3'-硫代磷酰基-2'-O,4'-C-亚甲基-腺苷-3'-硫代磷酰基]乙醇;
m/z:计算值1177.18,实测值1176.18[M-H]-。
实施例6:硫代磷酸酯化二十聚体的合成(亚磷酰胺法)
延伸反应
使用二氯甲烷代替氯仿,重复18次与实施例4同样的操作,作为白色固体获得二十聚体DMTrO-A·T·C·G·A·C·T·C·T·C·G·A·G·C·G·T·T·C·T·C-SUC-TOB(式中,“·”表示硫代磷酰基键)(8.5g);
脱保护反应
将得到的白色固体(5mg)和28%氨水(5mL)加入高压釜中,在65℃加热4小时后,冷却至室温。通过针头式过滤器(Syringe Filter)除去反应液中的不溶物后,通过离心蒸发器减压浓缩。然后,将浓缩液冷冻干燥而作为目标物获得5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-脱氧腺苷-3'-硫代磷酰基-脱氧胸苷-3'-硫代磷酰基-脱氧胞苷-3'-硫代磷酰基-脱氧鸟苷-3'-硫代磷酰基-脱氧腺苷-3'-硫代磷酰基-脱氧胞苷-3'-硫代磷酰基-脱氧胸苷-3'-硫代磷酰基-脱氧胞苷-3'-硫代磷酰基-脱氧胸苷-3'-硫代磷酰基-脱氧胞苷-3'-硫代磷酰基-脱氧鸟苷-3'-硫代磷酰基-脱氧腺苷-3'-硫代磷酰基-脱氧鸟苷-3'-硫代磷酰基-脱氧胞苷-3'-硫代磷酰基-脱氧鸟苷-3'-硫代磷酰基-脱氧胸苷-3'-硫代磷酰基-脱氧胸苷-3'-硫代磷酰基-脱氧胞苷-3'-硫代磷酰基-脱氧胸苷-3'-硫代磷酰基-脱氧胞苷;
m/z:计算值6648.73,实测值1661.67[M-4H]4-。
实施例7:硫代磷酸酯化二聚体的合成(H-膦酸酯法)
氩气气氛下,向50mL的二口烧瓶中加入HO-T-SUC-TOB(100mg,80.8μmol)、dT-H-膦酸酯TEA盐(116.0mg,163μmol)和三苯基膦(10.0mg,38.1μmol),加入脱水二氯甲烷(2.0mL)和脱水吡啶(2.0mL)使其溶解。然后,加入PivCl(29.5μL,242μmol)并在室温下搅拌1.0小时;
接着,向反应溶液中加入DBU(48.4μL,324μmol)和DDTT(34.3mg,167μmol),在室温下搅拌30分钟。然后,添加乙腈(30mL),将析出的固体用桐山漏斗抽滤后,进行干燥而获得白色固体(145.7mg)。将所得的固体在氩气气氛下加入50mL的二口烧瓶中,加入脱水二氯甲烷(4.0mL)和脱水乙腈(1.2mL)使其溶解;
然后,依次加入吲哚(46.3mg,395μmol)和三氟乙酸(72.6μL,948μmol),在室温下搅拌1.0小时。接着,向反应溶液中依次加入吡啶(220μL,2.7mmol)和水(42μL),在室温下搅拌1.0小时。然后,添加乙腈(30mL),将析出的固体用桐山漏斗抽滤后,进行干燥而作为白色固体获得二聚体HO-TOHT-SUC-TOB(85.9mg,71%);
m/z:计算值1557.01,实测值1558.02[M+H]+。
实施例8:硫代磷酸酯化二聚体的合成(H-膦酸酯法)
氩气气氛下,向50mL的二口烧瓶中加入HO-T-SUC-TOB(101mg,81.3μmol)、dT-H-膦酸酯TEA盐(115.4mg,163μmol)和三苯基膦(10.8mg,41.1μmol),加入脱水二氯甲烷(2.0mL)和脱水吡啶(2.0mL)使其溶解。然后,加入PivCl(29.5μL,242μmol)并在室温下搅拌1.0小时。然后,添加乙腈(30mL),将析出的固体用桐山漏斗抽滤而获得白色固体(145.2mg)。将所得的固体在氩气气氛下加入50mL的二口烧瓶中,加入脱水二氯甲烷(4.0mL)和脱水乙腈(1.2mL)使其溶解;
然后,依次加入吲哚(47.2mg,403μmol)和三氟乙酸(73.0μL,953μmol),在室温下搅拌1.0小时。接着,向反应溶液中依次加入吡啶(230μL,2.8mmol)和水(42μL),在室温下搅拌1.0小时。然后,添加乙腈(30mL),将析出的固体用桐山漏斗抽滤后,进行干燥而作为白色固体获得二聚体HO-THT-SUC-TOB(104mg,86%);
m/z:计算值1525.03,实测值1526.05[M+H]+。
实施例9:硫代磷酸酯化二聚体的合成(硫化剂:PADS)
氩气气氛下,向50mL的二口烧瓶中加入HO-T-SUC-TOB(98.8mg,79.6μmol)和Piv-TOB(102mg,103μmol),加入脱水二氯甲烷(4.0mL)和脱水乙腈(1.2mL)使其溶解。然后,依次加入三苯基膦(13.2mg,50.3μmol)、2'-OMe-G-CE亚磷酰胺(144mg,165μmol)和5-乙硫基-1H-四唑(21.2mg,163μmol)并在室温下搅拌1.0小时;
接着,向反应溶液中加入2,2,2-三氟乙醇(58.9μL,810μmol)并在室温下搅拌30分钟后,依次加入2,6-二甲基苯胺(71.2μL,577μmol)和双苯乙酰基二硫化物(62.9mg,208μmol),在室温下搅拌1.0小时。然后,依次加入吲哚(98.2mg,838μmol)和三氟乙酸(220μL,2.87mmol),在室温下搅拌1.0小时;
接着,向反应溶液中依次加入吡啶(690μL,8.6mmol)和甲醇(57μL),在室温下搅拌1.0小时。然后,添加乙腈(37mL),将析出的固体用桐山漏斗抽滤后,进行干燥而作为白色固体获得二聚体HO-GmT-SUC-TOB(222.7mg,93%);
m/z(TOF-MS):计算值1735.09,实测值1737.11[M+H]+。
实施例10:硫代磷酸酯化二聚体的合成(硫化剂:氢化黄原素)
氩气气氛下,向50mL的二口烧瓶中加入HO-T-SUC-TOB(96.8mg,78.2μmol)和Piv-TOB(99.3mg,99.5μmol),加入脱水二氯甲烷(4.0mL)和脱水乙腈(1.2mL)使其溶解。然后,依次加入三苯基膦(11.5mg,43.8μmol)、2'-OMe-G-CE亚磷酰胺(140mg,161μmol)和5-乙硫基-1H-四唑(20.9mg,161μmol)并在室温下搅拌1.0小时;
接着,向反应溶液中加入2,2,2-三氟乙醇(58.9μL,810μmol)并在室温下搅拌30分钟后,依次加入2,6-二甲基苯胺(71.2μL,577μmol)和氢化黄原素(31.2mg,208μmol),在室温下搅拌1.0小时;
然后,依次加入吲哚(96.5mg,824μmol)和三氟乙酸(220μL,2.87mmol),在室温下搅拌1.0小时。接着,向反应溶液中依次加入吡啶(690μL,8.6mmol)和甲醇(57μL),在室温下搅拌1.0小时。然后,添加乙腈(37mL),将析出的固体用桐山漏斗抽滤后,进行干燥而作为白色固体获得二聚体HO-GmT-SUC-TOB(217.9mg,91%);
m/z(TOF-MS):计算值1735.09,实测值1737.11[M+H]+。
实施例11:硫代磷酸酯化二聚体的合成(硫化剂:硫)
氩气气氛下,向50mL的二口烧瓶中加入HO-T-SUC-TOB(101mg,81.3μmol)和Piv-TOB(98.7mg,98.9μmol),加入脱水二氯甲烷(4.0mL)和脱水乙腈(1.2mL)使其溶解。然后,依次加入三苯基膦(12.0mg,45.8μmol)、2'-OMe-G-CE亚磷酰胺(141mg,162μmol)和5-乙硫基-1H-四唑(21.9mg,168μmol)并在室温下搅拌1.0小时;
接着,向反应溶液中加入2,2,2-三氟乙醇(58.9μL,810μmol)并在室温下搅拌30分钟后,依次加入2,6-二甲基苯胺(71.2μL,577μmol)和硫(13.0mg,405μmol),在室温下搅拌1.0小时;
然后,依次加入吲哚(96.0mg,819μmol)和三氟乙酸(220μL,2.87mmol),在室温下搅拌1.0小时。接着,向反应溶液中依次加入吡啶(690μL,8.6mmol)和甲醇(57μL),在室温下搅拌1.0小时。然后,添加乙腈(37mL),将析出的固体用桐山漏斗抽滤后,进行干燥而作为白色固体获得二聚体HO-GmT-SUC-TOB(221.2mg,92%);
m/z(TOF-MS):计算值1735.09,实测值1737.11[M+H]+。
实施例12:硫代磷酸酯化二聚体的合成(脱保护:三氯乙酸)
氩气气氛下,向50mL的二口烧瓶中加入HO-Um-SUC-TOB(102.4mg,81.7μmol)和Piv-TOB(105mg,105μmol),加入脱水二氯甲烷(4.0mL)和脱水乙腈(1.2mL)使其溶解。然后,依次加入三苯基膦(9.8mg,37.3μmol)、dG-CE亚磷酰胺(135.1mg,161μmol)和5-乙硫基-1H-四唑(21.4mg,164μmol)并在室温下搅拌1.0小时;
接着,向反应溶液中加入2,2,2-三氟乙醇(58.1μL,797μmol)并在室温下搅拌30分钟后,依次加入2,6-二甲基苯胺(118μL,955μmol)和DDTT(40.9mg,199μmol),在室温下搅拌1.0小时;
然后,依次加入吲哚(93.6mg,799μmol)和三氯乙酸(698mg,4.27mmol),在室温下搅拌1.0小时。接着,向反应溶液中依次加入吡啶(1.01mL,12.6mmol)和水(66μL),在室温下搅拌1.0小时。然后,添加乙腈(42mL),将析出的固体用桐山漏斗抽滤后,进行干燥而作为白色固体获得二聚体HO-GUm-SUC-TOB(241.5mg);
m/z(TOF-MS):计算值1721.07,实测值1723.10[M+H]+。
实施例13:硫代磷酸酯化二聚体的合成(脱保护:二氯乙酸)
氩气气氛下,向50mL的二口烧瓶中加入HO-Um-SUC-TOB(99.6mg,79.4μmol)和Piv-TOB(97.9mg,98.0μmol),加入脱水二氯甲烷(4.0mL)和脱水乙腈(1.2mL)使其溶解。然后,依次加入三苯基膦(10.8mg,41.1μmol)、dG-CE亚磷酰胺(134.2mg,160μmol)和5-乙硫基-1H-四唑(20.9mg,161μmol)并在室温下搅拌1.0小时;
接着,向反应溶液中加入2,2,2-三氟乙醇(58.1μL,797μmol)并在室温下搅拌30分钟后,依次加入2,6-二甲基苯胺(118μL,955μmol)和DDTT(40.9mg,199μmol),在室温下搅拌1.0小时;
然后,依次加入吲哚(93.2mg,796μmol)和三氯乙酸(478μL,5.78mmol),在室温下搅拌1.0小时。接着,向反应溶液中依次加入吡啶(1.40mL,17.4mmol)和水(61μL),在室温下搅拌1.0小时。然后,添加乙腈(40mL),将析出的固体用桐山漏斗抽滤后,进行干燥而作为白色固体获得二聚体HO-GUm-SUC-TOB(228.7mg,96%);
m/z(TOF-MS):计算值1721.07,实测值1723.10[M+H]+。
工业上利用的可能性
根据本发明,通过在合成亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的阶段,使特定的抗氧化剂共存,从而可抑制作为副产物的磷酸三酯体或磷酸二酯体(“PO杂质”)的生成,能够更加效率良好地进行其后的硫化反应,因此作为具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法有用。
本申请以在日本提交申请的日本特愿2019-065158(申请日:2019年3月28日)为基础,其内容全部包含在本说明书内。
Claims (14)
1.一种具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,包含下述的工序(1):
使5'位羟基未被保护、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护、或可结合于固相载体的核苷、核苷酸或寡核苷酸(以下有时称为“核酸A”)与3'位羟基或3'位氨基通过用于形成亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的方法被修饰、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸(以下有时称为“核酸B”)在抗氧化剂的存在下缩合,得到亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的工序。
2.根据权利要求1所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,
核酸B中,3'位羟基或3'位氨基通过选自亚磷酰胺法、H-膦酸酯法、二卤代膦法和氧氮磷杂环戊烷法中的方法被修饰。
3.根据权利要求1或2所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,还包含工序(2):使工序(1)中得到的亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体与硫化剂反应的工序。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,抗氧化剂选自磷类抗氧化剂、硫类抗氧化剂及磷硫类抗氧化剂。
5.根据权利要求1~3中任一项所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,抗氧化剂选自磷类抗氧化剂、硫类抗氧化剂及磷硫类抗氧化剂,
所述磷类抗氧化剂选自以下的式(1)~(7):
(1)P-(R)3、
(2)P-(OR)3、
(3)P(R)2(OR)、
(4)PR(OR)2、
(5)PH(O)(R)2、
(6)PH(O)(OR)2、及
(7)PH(O)R(OR),
上述式(1)~(7)中,R可以相同或不同,并独立地表示任选被取代的芳基或低级烷基,2个R可以相互结合并与它们所邻接的其他原子一起形成环,
在此,上述抗氧化剂可以是相同或不同的抗氧化剂的R部分进行结合而成的二聚体;
所述硫类抗氧化剂选自以下的式(8)和(9):
(8)R-S-R、及
(9)
上述式(8)、(9)中,R可以相同或不同,并独立地表示低级烷基或任选被取代的芳基,
在此,上述抗氧化剂可以是相同或不同的抗氧化剂的R部分进行结合而成的二聚体;
所述磷硫类抗氧化剂由以下的式(10)表示:
(10)(OR)2P(S)-S-M-S-P(S)(OR)2
上述式(10)中,R可以相同或不同,并独立地表示低级烷基或任选被取代的芳基,以及M表示Zn、Ni或Cu,
在此,上述抗氧化剂可以是相同或不同的抗氧化剂的R部分进行结合而成的二聚体。
6.根据权利要求1~3中任一项所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,抗氧化剂选自磷类抗氧化剂及硫类抗氧化剂,
所述磷类抗氧化剂选自以下的式(1)~(5):
(1)P-(R)3、
(2)P-(OR)3、
(3)P(R)2(OR)、
(4)PR(OR)2、及
(5)PH(O)R(OR),
上述式(1)~(5)中,R可以相同或不同,并独立地表示任选被取代的芳基或低级烷基,2个R可以相互结合并与它们所邻接的其他原子一起形成环,
在此,上述抗氧化剂可以是相同或不同的抗氧化剂的R部分进行结合而成的二聚体;
所述硫类抗氧化剂由以下的式(6)表示:
(6)
上述式(6)中,R可以相同或不同,并独立地表示低级烷基或任选被取代的芳基,
在此,上述抗氧化剂可以是相同或不同的抗氧化剂的R部分进行结合而成的二聚体。
7.根据权利要求1~3中任一项所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,抗氧化剂选自:三苯基膦、甲基二苯基膦、亚磷酸三乙酯、二苯基乙氧基膦、苯基膦酸二乙酯、9,10-二氢-9-氧杂-10-磷杂菲-10-氧化物(磷类抗氧化剂);以及异丁烯基硫醚(硫类抗氧化剂)。
8.根据权利要求1~3中任一项所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,抗氧化剂为磷类抗氧化剂。
9.根据权利要求1~3中任一项所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,抗氧化剂为由P-(R)3表示的膦类。
10.根据权利要求1~9中任一项所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,核酸A为5'位羟基未被保护、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸。
11.根据权利要求1~10中任一项所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,
核酸A为:
5'位羟基未被保护,选自核酸碱基的氨基和亚氨基、核糖残基的2'位羟基、3'位羟基和3'位氨基、以及脱氧核糖残基的3'位羟基和3'位氨基中的至少一个基团被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基(以下有时称为“拟固相保护基”)保护,且其他基团可进一步被用于核酸合成的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸(以下有时称为“核酸a”);或者
5'位羟基未被保护,3'位末端的磷酸基的一个OH被置换为-OLn1-OH,式-OLn1-OH中,Ln1表示有机基团,-OLn1-OH的羟基被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基保护,且其他基团可进一步被用于核酸合成的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸(以下有时称为“核酸α”),
并且,
核酸B为:
3'位羟基或3'位氨基通过用于形成亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的方法被修饰,且5'位羟基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护,且其他基团可进一步被选自在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基(以下有时称为“拟固相保护基”)及用于核酸合成的保护基中的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸(以下有时称为“核酸b”)。
12.根据权利要求1~11中任一项所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,核酸B为:3'位羟基通过用于形成亚磷酸酯体或亚磷酸二酯体的方法被修饰、且其他基团可被用于核酸合成的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸。
13.根据权利要求3~12中任一项所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,工序(2)中所使用的硫化剂选自5-[(N,N-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT)、3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物(Beaucage试剂)、3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮、苯乙酰二硫化物(PADS)、二硫化四乙基秋兰姆(TETD)、四硫化双五亚甲基秋兰姆、5-苯基-3H-1,2,4-二噻唑-3-酮(POS)、3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(ADTT,氢化黄原素)、N-[(2-氰基乙基)硫代]邻苯二甲酰亚胺以及硫。
14.根据权利要求1~13中任一项所述的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法,其中,还包括:将所得的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的保护基全部除去后,分离未被保护的具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的工序。
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