KR20220167282A - 핵산 올리고머를 포함하는 조성물 - Google Patents

핵산 올리고머를 포함하는 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20220167282A
KR20220167282A KR1020227035338A KR20227035338A KR20220167282A KR 20220167282 A KR20220167282 A KR 20220167282A KR 1020227035338 A KR1020227035338 A KR 1020227035338A KR 20227035338 A KR20227035338 A KR 20227035338A KR 20220167282 A KR20220167282 A KR 20220167282A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
group
nucleic acid
hydrogen atom
chch
methionine
Prior art date
Application number
KR1020227035338A
Other languages
English (en)
Inventor
유야 모리야마
Original Assignee
스미또모 가가꾸 가부시끼가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 스미또모 가가꾸 가부시끼가이샤 filed Critical 스미또모 가가꾸 가부시끼가이샤
Publication of KR20220167282A publication Critical patent/KR20220167282A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 포스포로티오에이트 결합을 갖는 핵산 올리고머를 포함하는 안정적인 조성물, 그 제조 방법 및 당해 조성물로부터의 상기 핵산 올리고머의 효율적인 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은, 식 (1) (식 중, 기호는 명세서 중에 정의한 바와 같음.) 로 나타내는 포스포로티오에이트 결합을 갖는 핵산 올리고머, 알킬암모늄염, 수용성 유기 용매, 물, 및, 명세서 중에 기재된 적어도 1 개의 화합물을 포함하는 첨가제를 포함하는 조성물을 제공한다.
Figure pct00019

Description

핵산 올리고머를 포함하는 조성물
본 특허출원은 일본 특허출원 2020-072234호 (2020년 4월 14일 출원) 에 기초하는 파리 조약상의 우선권 및 이익을 주장하는 것이며, 여기에 인용함으로써, 상기 출원에 기재된 내용의 전체가 본 명세서 중에 도입되는 것으로 한다.
본 발명은 핵산 올리고머를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 더욱 상세하게는, 포스포로티오에이트를 포함하는 핵산 올리고머를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
최근, 핵산 올리고머의 의료 분야에 대한 응용에 관심이 높아지고 있다. 예를 들어, 안티센스 핵산, 앱타머, 리보자임, 및 siRNA 등의 RNA 간섭 (RNAi) 을 유도하는 핵산 등을 들 수 있으며, 이들은 핵산 의약품으로 불리고 있다.
핵산 올리고머는, 고상 합성법에 의해 합성되는 것이 알려져 있으며, 포스포로티오에이트 결합을 갖는 핵산 올리고머도 고상법으로 합성되는 유용한 화합물로서 알려져 있다 (특허문헌 1).
국제 공개공보 제2017/068377호
포스포로티오에이트 결합을 갖는 핵산 올리고머는, 그 제조 과정에서의 안정성이 문제가 되는 경우가 있다. 본 발명은, 포스포로티오에이트 결합을 갖는 핵산 올리고머를 포함하는 안정적인 조성물, 그 제조 방법, 및 당해 조성물로부터의 상기 핵산 올리고머의 효율적인 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 상기 목적을 달성하기 위해서 예의 연구를 거듭한 결과, 고상 합성법에 있어서의 포스포아미다이트법에 의해 생성되는, 포스포로티오에이트 결합을 갖는 핵산 올리고머의 미정제 생성물을 역상 크로마토그래피 처리에 의해 얻어지는 핵산 올리고머를, 알킬암모늄염, 수용성 유기 용매, 물, 및 어느 첨가제를 혼합하여 얻어지는 조성물이 안정화될 수 있는 것을 알아내었다. 따라서, 본 발명은, 당해 조성물, 그 제조 방법, 및 당해 조성물로부터의 핵산 올리고머의 효율적인 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 이하의 양태를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
항 1. 식 (1) :
[화학식 1]
Figure pct00001
(식 중,
BC 는, 각각 독립적으로 동일하거나 또는 상이한 핵산 염기를 나타내고,
R 은, 각각 독립적으로 동일하거나 또는 상이하고, 수소 원자, 불소 원자, 또는 OQ 기를 나타내고,
Q 는, 각각 독립적으로 동일하거나 또는 상이하고, 수소 원자, 메틸기, 2-메톡시에틸기, 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합하고 있는 메틸렌기, 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합하고 있는 에틸렌기, 또는 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합하고 있는 에틸리덴기를 나타내고,
X 는, 각각 독립적으로 동일하거나 또는 상이하고, 산소 원자 또는 황 원자를 나타내고,
Y 는, 수소 원자 또는 수산기의 보호기를 나타내고,
G 는, 암모늄 이온, 알킬암모늄 이온, 알칼리 금속 이온, 수소 이온 또는 하이드록시알킬암모늄 이온을 나타내고,
n 은, 식 (2) :
15 ≤ n (2) 를 만족하는 정수이다.)
로 나타내는 포스포로티오에이트 결합을 갖는 핵산 올리고머, 알킬암모늄염, 수용성 유기 용매, 물, 및 첨가제를 포함하는 조성물이며, 그 첨가제가, 하기 식 (3) 또는 (4) 로 나타내는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 첨가제인, 조성물.
식 (3) :
Ra(Rc)CH-L-CH(Rd)Rb (3)
(식 중,
L 은, -S-, 또는 -SS- 를 나타내고,
Ra 및 Rb 는, 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로, 수소 원자, 또는 하기의 Z1 및 Z2 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 기로 치환되어 있어도 되는 C1-6 의 알킬기를 나타내고,
Z1 : -CH(NHR1)COR2
Z2 : -COR2
(Z1 및 Z2 에 있어서,
R1 은, 수소 원자, 아미노기의 보호기, 또는 C(O)-R11 기를 나타내고,
R11 은, 아미노기 및 카르복실기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 기로 치환되어 있어도 되는 C1-6 의 알킬기, 또는 아미노기 및 카르복실기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 기로 치환되어 있어도 되는 페닐기를 나타내고,
R2 는, 보호되어 있어도 되는 카르복실기로 치환되어 있어도 되는 C1-6 의 알킬이미노기, 또는 -OR20 기 (R20 은, 수소 원자 또는 카르복실기의 보호기를 나타낸다.) 를 나타내고),
Rc 및 Rd 는, 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로, 수소 원자, 또는 C1-6 의 알킬기를 나타낸다.) 으로 나타내는 화합물,
식 (4) :
[화학식 2]
Figure pct00002
(식 중,
L 은, 상기와 동일한 의미를 갖고,
Re 및 Rf 는, 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로, 수소 원자, C1-6 알콕시-카르보닐기, 카르복실기, 또는 C1-6 알콕시카르보닐기 또는 카르복실기로 치환되어 있어도 되는 C1-6 의 알킬기를 나타내고,
X, L 및 그것들이 결합하는 탄소 원자는, 5 원 혹은 6 원의 고리 구조를 형성하고,
X 는, CH2, CH2CH2, (CH3)CHCH2, (CH3CH2)CHCH2, CH2CH2CH2, (CH3)CHCH2CH2, CH2(CH3)CHCH2, CH=N, (CH3)C=N, CH2NH, (CH3)CHNH, (CH3)2CNH, (COOH)CHNH, CH2OCH2, CH2NHCH2, 및 CH2COCH2 로부터 선택되는 어느 것의 기를 나타낸다.) 로 나타내는 화합물.
항 2. R1 이, 수소 원자, 아미노기의 보호기, 또는 C(O)-R11 기를 나타내고,
R11 은, 아미노기 및 카르복실기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 기로 치환되어 있어도 되는 C1-6 의 알킬기를 나타내고, 그리고,
X 가, CH2, CH2CH2, (CH3)CHCH2, (CH3CH2)CHCH2, CH2CH2CH2, (CH3)CHCH2CH2, CH2(CH3)CHCH2, CH=N, (CH3)C=N, CH2NH, (CH3)CHNH, (COOH)CHNH, CH2OCH2 및 CH2COCH2 로부터 선택되는 어느 것의 기를 나타내는, 전항 1 에 기재된 조성물.
항 3. R1 이, 수소 원자, 벤조일기, 4-메톡시벤조일기, 포르밀기, 아세틸기, 프로피오닐기, 부티릴기, 이소부티릴기, 페닐아세틸기, 페녹시아세틸기, 4-tert-부틸페녹시아세틸기, 4-이소프로필페녹시아세틸기, 벤질옥시카르보닐기, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기, 또는 C(O)-R11 기를 나타내고,
R11 이, 아미노기 및 카르복실기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 기로 치환되어 있어도 되는 C1-6 의 알킬기를 나타내고,
R2 가, 메틸기, 벤질기, 알릴기 및 tert-부틸기로 보호되어 있어도 되는 카르복실기로 치환되어 있어도 되는 C1-6 의 알킬이미노기, 또는 -OR20 기 (R20 은, 수소 원자, 메틸기, 벤질기, 알릴기 또는 tert-부틸기를 나타낸다.) 를 나타내고, 그리고,
X 가, CH2, CH2CH2, (CH3)CHCH2, (CH3CH2)CHCH2, CH2CH2CH2, (CH3)CHCH2CH2, CH2(CH3)CHCH2, CH=N, (CH3)C=N, CH2NH, (COOH)CHNH, CH2OCH2, 및 CH2COCH2 로부터 선택되는 어느 것의 기를 나타내는, 전항 1 또는 2 에 기재된 조성물.
항 4. Re 및 Rf 가, 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로, 수소 원자, 카르복실기, 또는, C1-6 의 알킬기를 나타내고, 그리고,
X 가, CH2, (CH3)C=N, CH2NH, CH2OCH2, 및 CH2COCH2 로부터 선택되는 어느 것의 기를 나타내는, 전항 1 내지 3 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
항 5. R1 이, 수소 원자, 벤조일기, 포르밀기, 아세틸기, 벤질옥시카르보닐기 및 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기, 또는 C(O)-R11 기를 나타내고,
R11 이, 아미노기 및 카르복실기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 기로 치환되어 있어도 되는 C1-6 의 알킬기를 나타내고, 그리고,
R2 가, 메틸기로 보호되어 있어도 되는 카르복실기로 치환되어 있어도 되는 C1-6 의 알킬이미노기, 또는 -OR20 기 (R20 은, 수소 원자 또는 메틸기를 나타낸다.) 를 나타내는, 전항 1 내지 4 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
항 6. 첨가제가,
α-리포산,
메티오닌,
N-포르밀-메티오닌,
N-아세틸-메티오닌,
N-벤조일-메티오닌,
N-카르보벤족시-메티오닌,
N-Fmoc-메티오닌,
메티오닌메틸염산염,
디부틸술파이드,
디헥실술파이드,
티아졸리딘-2-카르복실산,
2-이소부틸-4,5-디메틸-3-티아졸린 (이성체 혼합물),
4-옥소티안,
1,4-티옥산, 및
산화형 글루타티온, 으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 화합물인, 전항 1 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
항 7. 상기 첨가제가, 리포산, 산화형 글루타티온 및 메티오닌으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 화합물인, 전항 1 내지 6 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
항 8. 상기 알킬암모늄염이 모노알킬암모늄염 및 디알킬암모늄염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 알킬암모늄염인, 전항 1 내지 7 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
항 9. 상기 수용성 유기 용매가, 알코올계 수용성 유기 용매 및 니트릴계 수용성 유기 용매로 이루어지는 군에서 선택되는 수용성 유기 용매인, 전항 1 내지 8 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
항 10. 상기 식 (1) 에 있어서, R 이, 각각 독립적으로, 하이드록시기 또는 메톡시기인, 전항 1 내지 9 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
항 11. 상기 식 (1) 에 있어서, R 이 하이드록시기인, 전항 1 내지 9 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
항 12. 전항 1 내지 11 중 어느 한 항에 기재된 조성물과, 산소 원자를 적어도 1 개 갖는 C1-C4 의 유기 용매를 혼합하여, 석출한 핵산 올리고머를 단리하는 것을 포함하는, 핵산 올리고머의 제조 방법.
항 13. 고상 합성법으로 합성된 식 (1) 의 핵산 올리고머의 미정제 생성물을 역상 칼럼 크로마토그래피 처리에 의해 얻어진 식 (1) 로 나타내는 핵산 올리고머, 알킬암모늄염, 수용성 유기 용매 및 물을 포함하는 칼럼 용출액을 첨가제와 혼합하는 것을 포함하는, 전항 1 내지 12 중 어느 한 항에 기재된 조성물의 제조 방법.
본 발명에 의해, 포스포로티오에이트 결합을 갖는 핵산 올리고머를 포함하는 안정적인 조성물, 그것을 사용한 상기 핵산 올리고머의 효율적인 제조 방법이 제공된다.
도 1 은, 포스포아미다이트법에 의한 핵산 올리고머의 합성의 예를 나타내는 도면이다.
상기 식 (1) 로 나타내는 포스포로티오에이트 결합을 갖는 핵산 올리고머, 알킬암모늄염, 수용성 유기 용매, 물, 및 첨가제를 포함하는 조성물이며, 그 첨가제가, 디술파이드 결합을 갖는 화합물 및술파이드 결합을 갖는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물에 대해서 설명한다.
상기 식 (1) 에 있어서, BC 로 나타내는 핵산 염기 (이하, 「염기」 라고 기재하기도 한다.) 는, 천연 또는 비천연의 핵산 염기여도 된다. 이러한 비천연의 핵산 염기로는, 천연 또는 비천연의 핵산 염기의 수식 아날로그가 예시된다. 핵산 염기로는, 전형적으로는, 푸린 화합물 및 피리미딘 화합물이 예시되며, 예를 들어, 미국 특허 제3,687,808호, 「Concise Encyclopedia Of Polymer Scie nce And Engineering」, 858 ∼ 859 페이지, 크로슈비츠 제이 아이 (Kroschwitz J. I.) 편, John Wiley ＆ Sons, 1990, 및 잉글리쉬 등 (Englisch 등), Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30 권, p.613 에 개시되는 핵산 염기가 예시된다.
구체적으로는, 예를 들어, 아데닌, 이소구아닌, 크산틴, 히포크산틴 및 구아닌 등의 푸린 염기 ; 및, 시토신, 우라실 및 티민 등의 피리미딘 염기 등이 예시된다.
또한, BC 로 나타내는 핵산 염기로는, 예를 들어, 2-아미노아데닌, 2-아미노 푸린, 2,6-디아미노푸린 등의 아미노 유도체 ; 5-메틸우라실, 5-메틸시토신, 7-메틸구아닌, 6-메틸푸린, 2-프로필푸린 등의 알킬 유도체 ; 5-할로우라실 및 5-할로시토신 ; 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신 ; 6-아자우라실, 6-아자시토신 및 6-아자티민 ; 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 5-(2-아미노프로필)우라실, 5-아미노알릴우라실 ; 8-할로화, 아미노화, 티올화, 티오알킬화, 하이드록실화 및 다른 8-치환 푸린 ; 5-트리플루오로메틸화 및 다른 5-치환 피리미딘 ; 6-아자피리미딘 ; N-2, N-6 및 O-6 치환 푸린 (2-아미노프로필아데닌을 포함한다) ; 디하이드로우라실 ; 3-데아자-5-아자시토신 ; 7-데아자아데닌 ; N6-메틸아데닌, N6,N6-디메틸아데닌 ; 5-아미노-알릴-우라실 ; N3-메틸우라실 ; 치환 1,2,4-트리아졸 ; 2-피리디논 ; 5-니트로인돌 ; 3-니트로피롤 ; 5-메톡시우라실 ; 우라실-5-옥시아세트산 ; 5-메톡시카르보닐메틸우라실 ; 2-티오우라실, 5-메틸-2-티오우라실 ; 5-메톡시카르보닐메틸-2-티오우라실 ; 5-메틸아미노메틸-2-티오우라실 ; 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우라실 ; 3-메틸시토신 ; N4-아세틸시토신 ; 2-티오시토신 ; N6-메틸아데닌 ; N6-이소펜틸아데닌 ; 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌 ; N-메틸구아닌 ; O-알킬화 염기 등이 예시된다.
R 이 OQ 기를 나타내고, Q 가 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합하고 있는 메틸렌기, 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합하고 있는 에틸렌기, 또는 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합하고 있는 에틸리덴기를 나타낼 때, 당해 구조는, 하기의 식 (3) 에 있어서 나타내는 LNA-1, LNA-2 및 LNA-3 의 구조로 나타내어진다.
[화학식 3]
Figure pct00003
(식 중, BC 는, 상기와 같은 핵산 염기를 나타낸다.)
Y 로 나타내는 수산기의 보호기로는, 아미다이트법에 있어서, 보호기로서 기능할 수 있는 것이면 특별히 제한없이 사용할 수 있으며, 예를 들어, 아미다이트 화합물에 대하여 사용되는 공지된 보호기를 널리 사용할 수 있다. Y 로 나타내는 수산기의 보호기는, 바람직하게는, 이하의 기이다.
[화학식 4]
Figure pct00004
(식 중, R1, R2 및 R3 은, 각각 독립적으로, 동일하거나 또는 상이하고 수소 또는 알콕시기를 나타낸다.)
상기 알콕시기로는, 예를 들어, 메톡시기가 예시된다.
식 (1) 의 핵산 올리고머의 사슬 길이는, n ≥ 15 이다. 사슬 길이의 상한으로는, 예를 들어, n ≤ 200 이 예시된다. 상기 핵산 올리고머에 있어서는, n 개 있는 X 의 적어도 1 개가 황 원자이고, X 가 모두 황 원자여도 된다. 예를 들어, n = 103 의 경우, 황 원자의 수는 6, 12 또는 20 이 예시된다.
식 (1) 의 핵산 올리고머는, 예를 들어, DNA 또는 RNA 올리고머, 혹은 이들의 올리고머에 비천연형의 핵산 염기를 포함하는 것이어도 된다. 상기 핵산 올리고머는, 전형적으로는, 한 개 사슬의 DNA 또는 RNA 올리고머이다. 상기 식 (1) 의 핵산 올리고머에 있어서, 치환기 R 은, 바람직하게는, 각각 독립적으로, 하이드록시기 또는 메톡시기이다. 상기 핵산 올리고머로는, 치환기 R 이, 각각 독립적으로, 하이드록시기 또는 메톡시기인 식 (1) 의 핵산 올리고머인 RNA 가 바람직하다. 더욱 상세하게는, 치환기 R 이 하이드록시기인 뉴클레오티드와 메톡시기인 뉴클레오티드의 양방을 포함하는 핵산 올리고머가 바람직하다.
상기 조성물 중의 핵산 올리고머의 농도는, 통상적으로 0.05 mg/mL ∼ 5 mg/mL 이고, 바람직하게는 0.05 mg/mL ∼ 1 mg/mL 이며, 보다 바람직하게는 0.1 mg/ mL ∼ 0.5 mg/mL 이다.
상기 알킬암모늄염으로는, 통상적으로, 모노알킬암모늄염, 디알킬암모늄염 및 트리알킬암모늄염이 사용되며, 바람직하게는 모노알킬암모늄염 및 디알킬암모늄염, 보다 바람직하게는 디알킬암모늄염이 사용된다. 모노알킬암모늄염을 형성하는 모노알킬아민의 탄소수는, 바람직하게는 3 ∼ 10 이고, 보다 바람직하게는 4 ∼ 6 이며, 더욱 바람직하게는 헥실아민이다. 디알킬암모늄염을 형성하는 디알킬아민의 탄소수는, 바람직하게는 4 ∼ 10 이며, 보다 바람직하게는 5 ∼ 9 이다. 바람직한 디알킬아민은, 디부틸아민이다. 트리알킬암모늄염을 형성하는 트리알킬아민은, 탄소수 6 ∼ 12 의 것이 바람직하고, 6 ∼ 9 의 것이 보다 바람직하며, 구체적으로는 트리에틸아민이 예시된다.
상기 모노알킬암모늄염, 디알킬암모늄염 및 트리알킬암모늄염을 형성하는 산으로는, 예를 들어, 탄산, 아세트산, 포름산, 트리플루오로아세트산 및 프로피온산이 예시된다.
상기 암모늄염의 농도로는, 통상적으로 1 ∼ 200 mM 이고, 바람직하게는 5 ∼ 150 mM 이며, 보다 바람직하게는 20 ∼ 100 mM 이다.
상기 수용성 용매로는, 알코올계 유기 용매 및 니트릴계 유기 용매가 예시된다. 상기 조성물 중의 알코올계 유기 용매의 양은, 통상적으로 0 ∼ 20 % 이고, 바람직하게는 0 ∼ 15 % 이며, 보다 바람직하게는 0 % ∼ 10 % 이다. 역상 칼럼 크로마토그래피로 얻어진 용리액 획분에는, 통상적으로, 물, 수용성 용매 (예를 들어, 알코올계 유기 용매, 니트릴계 유기 용매), 알킬암모늄염, 및 식 (1) 의 핵산 올리고머가 포함된다. 상기 용리액 중의 니트릴계 유기 용매의 양은, 통상적으로 10 ∼ 70 % 이고, 바람직하게는 20 ∼ 60 % 이며, 보다 바람직하게는 30 ∼ 50 % 이다 (이상 % 는, 모두 질량% 를 나타낸다.).
물의 양은, 상기의 성분의 농도 범위를 만족시키도록 밸런스를 취하는 양이면 되며, 통상적으로 90 % ∼ 30 % 이고, 바람직하게는 80 % ∼ 40 % 이고, 보다 바람직하게는 70 % ∼ 40 % 이다.
상기 식 (3) 으로 나타내는 첨가제에 대해서 이하 설명한다.
Z1 에 있어서, R1 로 나타내는 아미노기의 보호기로서 특별히 한정되지 않고, 공지된 보호기를 사용할 수 있다. 구체적인 보호기로는, 예를 들어, 벤조일기, 4-메톡시벤조일기, 포르밀기, 아세틸기, 프로피오닐기, 부티릴기, 이소부티릴기, 페닐아세틸기, 페녹시아세틸기, 4-tert-부틸페녹시아세틸기, 4-이소프로필페녹시아세틸기, 벤질옥시카르보닐기 및 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기 (Fmoc 기) 등이 예시된다. 바람직한 보호기로는, 벤조일기, 포르밀기, 벤질옥시카르보닐기, 및 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기가 예시된다.
R11 로 나타내는, 아미노기 및 카르복실기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 기로 치환되어 있어도 되는 C1-6 의 알킬기로는, 예를 들어, (CH2)2CH(NH2)(COOH) 기가 예시되고, 아미노기 및 카르복실기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 기로 치환되어 있어도 되는 페닐기로는, 페닐기, 아미노 페닐기, 및 카르복시페닐기 등이 예시된다.
바람직한 R11 은, 아미노기 및 카르복실기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 기로 치환되어 있어도 되는 C1-6 의 알킬기 (예를 들어, (CH2)2CH(NH2)(COOH) 기) 가 예시된다.
Z1 및 Z2 에 있어서, COR2 기로는, COOH 기 및 COOR20 기가 예시되고, R20 으로 나타내는 카르복실기의 보호기는, 특별히 한정되지 않고, 공지된 보호기를 사용할 수 있으며, 그러한 보호기로는, 예를 들어, 메틸기, 벤질기, 알릴기 및 tert-부틸기 등이 예시된다.
R2 로 나타내는 보호되어 있어도 되는 카르복실기로 치환되어 있어도 되는 C1-6 의 알킬이미노기로는, 예를 들어, 메틸이미노기, 에틸이미노기, 프로필이미노기, 부틸이미노기, 펜틸이미노기, 및 헥실이미노기, 혹은 이들 기에, 메틸기, 벤질기, 알릴기, 또는, tert-부틸기로 보호되어 있어도 되는 카르복실기가 치환한 기가 예시된다. 메틸기로 보호되어 있어도 되는 카르복실기로 치환되어 있어도 되는 C1-6 의 알킬이미노기가 바람직하고, 예를 들어, NHCH2CO2H 기가, 바람직한 기로서 예시된다.
식 (3) 으로 나타내는 첨가제로는, 구체적으로는, 메티오닌, 산화형 글루타티온, N-포르밀메티오닌, N-아세틸-DL-메티오닌, N-벤조일-DL-메티오닌, N-카르보벤족시-DL-메티오닌, N-Fmoc-L-메티오닌, L-메티오닌메틸염산염, 디부틸술파이드, 및 디헥실술파이드가 예시된다.
이어서, 식 (4) 로 나타내는 화합물의 정의에 대해서 설명한다.
먼저, Re 및 Rf 로 나타내는 기에 있어서, C1-6 의 알콕시카르보닐기 및 C1-6 의 알킬기를 구성하는 C1-6 의 알킬기 또는 알킬 부분으로는, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소부틸기, n-부틸기, 펜틸기 및 헥실기가 예시된다.
Re 및 Rf 로 나타내는 기로는, 수소 원자, 카르복실기, 또는 C1-6 의 알킬기가 바람직하다.
Re 및 Rf 로 나타내는 기의 구체예로는, 카르복실기, 이소부틸기, (CH2)4CO2H, 및 CO2C2H5 가 예시된다.
X 로는, 상기와 같은 식 (4) 에 있어서, 기재한 기가 예시되며, 바람직한 X 는, CH2, CH2CH2, (CH3)CHCH2, (CH3CH2)CHCH2, CH2CH2CH2, (CH3)CHCH2CH2, CH2(CH3)CHCH2, CH=N, (CH3)C=N, CH2NH, (CH3)CHNH, (COOH)CHNH, CH2OCH2, 및 CH2COCH2 이고,
더욱 바람직하게는, CH2, (CH3)C=N, CH2NH, CH2OCH2 및 CH2COCH2 이다.
식 (4) 로 나타내는 화합물로는, 구체적으로는, α-리포산, 티아졸리딘-2-카르복실산, 2-이소부틸-4,5-디메틸-3-티아졸린 (이성체 혼합물) 등이 예시된다.
이들 첨가제는, 통상적으로, 수용액 혹은 수용성 유기 용매의 용액으로서 사용된다.
상기 첨가제의 농도로는, 통상적으로 0.1 μM ∼ 100 mM 이며, 바람직하게는 1 mM ∼ 10 mM 이다.
상기 첨가제는, 구입하는 것 외에, 예를 들어, 일본 특허공보 제4,476,386호, 일본 특허공보 제5,317,836호, 및 「Fundamentals of modern peptide synthesis」, 3 ∼ 24 페이지, John Howl 편, Muriel Amblard, Jean-Alain Fehrentz, Jean Martinez, Methods in Molecular Biology (상표) book series, volume 298, 2005 에 개시되는 방법으로 입수할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 통상적으로, 고상 합성법으로 합성된 식 (1) 의 핵산 올리고머의 미정제 생성물을, 알킬암모늄염, 수용성 유기 용매, 및 물을 함유하는 이동상을 사용한 역상 칼럼 크로마토그래피 처리함으로써 얻어진 칼럼 용출액에, 상기의 첨가제를 첨가하여 얻어진다. 혹은, 미리 상기 첨가제를 함유하는 이동상을 사용함으로써, 역상 칼럼 크로마토그래피의 용리 획분으로서 본 발명의 조성물을 조제해도 된다.
역상 칼럼 크로마토그래피에 의해 얻어지는 용리 획분은, 일반적으로 핵산의 분리 분석에 사용하는 크로마토그래피의 조건하에서, 파장 260 ㎚ 의 UV 흡수로, 조성을 분석하여, 선택되고 모아진다. 모아진 획분으로부터 정제된 목적물인 소정량의 포스포로티오에이트 결합을 갖는 핵산 올리고머가 얻어진다. 상기 분석법으로는, 예를 들어, 비특허문헌 (Handbook of Analysis of Oligonucleotides and Related Products, CRC Press) 에 기재된 방법을 사용할 수 있다.
상기 역상 칼럼 크로마토그래피의 충전제로는, 소수성의 고정상이 되는 실리카 또는 폴리머로서, 예를 들어, 페닐기, 탄소수 1 ∼ 20 의 알킬기 및 시아노프로필기로부터 선택되는 어느 1 종 이상이 고정된 실리카 또는 폴리머가 예시된다. 이러한 충전제인 실리카 또는 폴리머로는, 예를 들어, 입자경이, 2 ㎛ 이상, 혹은, 5 ㎛ 이상인 것이 사용된다.
역상 칼럼 크로마토그래피의 이동상으로는, 예를 들어, 상기와 같은 농도 및 pH 의 암모늄염의 수용액을 포함하는 이동상 및 상기의 수용성 유기 용매를 포함하고, 그 농도를 순차 증대시키는 구배를 가하여 사용하는 이동상이 사용된다. 역상 칼럼 크로마토그래피의 온도는, 통상적으로 20 ∼ 100 ℃ 이고, 바람직하게는 30 ∼ 80 ℃ 이며, 보다 바람직하게는 40 ∼ 70 ℃ 이다. 본 발명의 조성물은, 전형적으로는, 상기와 같은 역상 칼럼 크로마토그래피의 용리액 획분으로서 얻어진다.
본 발명의 조성물은, 예를 들어, 보관 공정의 후에, 핵산 올리고머를 단리 하기 위해서 재침전 공정, 분액 공정, 한외 여과 공정, 탈보호 공정, 및 동결 건조 공정과 같은 후처리 공정으로부터 선택되는 단일 혹은 복수의 공정에 제공해도 된다. 보관 공정에서는, 불활성 가스를 사용함으로써 보관 용기 내의 분위기를 치환해도 된다. 불활성 가스로는, 예를 들어, 질소 가스, 아르곤 가스, 헬륨 가스가 예시된다.
재침전 공정에서는, 안정화 된 용액을, 빈용매와 접촉시키고, 핵산 올리고머를 석출시키고, 단리할 수 있다. 필요하다면, 고액 분리한 상태로부터, 액체부를 제거하고 나서, 여과 등에 의해 석출된 핵산 올리고머를 모아 단리해도 된다. 재침전 공정의 빈용매로는, 산소 원자를 적어도 1 개 갖는 C1-C4 의 유기 용매 (예를 들어, C1-C4 알코올, 테트라하이드로푸란, 디옥산) 를 들 수 있다. 이러한 용매로는, 에탄올 또는 이소프로판올이 바람직하다.
분액 공정에서는, 안정화 된 용액에 아세트산 수용액 등의 산성 수용액, 물, 및 식염수 등 중의 적어도 1 종을 혼합하고, 추가로 물과 혼화하지 않는 유기 용매를 첨가함으로써 수층과 유기층으로 분액하고, 원하는 핵산 올리고머를 포함하는 수층을 취득할 수 있다.
한외 여과 공정에서는, 한외 여과막을 사용하여 보관 공정 후의 용액 중에 존재하는 핵산 올리고머를 원하는 분자량 이하의 저분자 성분과 분리할 수 있다.
핵산 올리고머의 5' 말단 부위에 보호기가 있는 경우에는, 이것을 탈보호하기 위해서, 보관 공정 후의 용액에 아세트산 수용액 등의 산성 수용액, 혹은 아세트산 등의 산성 물질을 유기 용매에 용해한 용액을 혼합함으로써, 핵산 올리고머의 보호기를 탈보호할 수 있다.
동결 건조 공정에서는, 동결시킨 핵산 올리고머의 수용액을 감압함으로써 물을 승화시키고, 핵산 올리고머와 수분을 분리할 수 있다.
포스포아미다이트법에 의한 핵산 올리고머의 합성은, 공지된 방법 (예를 들어, 상기의 일본 특허공보 제5157168호 또는 일본 특허공보 제5554881호에 기재된 방법) 에 따라서, 핵산 신장 반응을 실시할 수 있다. 포스포아미다이트법에 의한 핵산 올리고머의 제조에 대해서는, 도 1 에 나타내는 스킴의 RNA 의 합성을 예로 들어, 이하에 나타내는 반응 경로 (축합 반응, 산화, 탈보호) 를 참조하면서 핵산 올리고머의 제조 방법에 대해서 설명한다.
반응 경로를 나타내는 상기 화학 식 중, Ba 는, 보호되어 있어도 되는 핵산 염기 ; Tr 은 보호기 ; 이고, X 는, 상기 정의한 바와 같고, SP 는 무기 다공질 담체의 뉴클레오시드 구조 이외의 부분을 각각 나타내고 있다.
뉴클레오시드 구조를 갖는 무기 다공질 담체 (Sp-Nu) 및 아미다이트 모노머 (Am-1) 의 뉴클레오시드를 구성하는 핵산 염기는, 상기와 같은 핵산 염기 혹은 보호기로 보호된 핵산 염기이다.
적합한 아미다이트 모노머 (Am-1) 의 예로는, 하기 화학식 (Am-1') 로 나타내는 화합물에 있어서, R 이, 보호된 수산기를 나타낼 때, 구체적인 보호기로는, tert-부틸디메틸실릴 (TBDMS) 기, 비스(2-아세톡시)메틸 (ACE) 기, (트리이소프로필실릴옥시)메틸 (TOM) 기, (2-시아노에톡시)에틸 (CEE) 기, (2-시아노에톡시)메틸 (CEM) 기, 파라-톨루일술포닐에톡시메틸 (TEM) 기, (2-시아노에톡시)메톡시메틸 (EMM) 기 등으로 보호된, TBDMS 아미다이트 (TBDMS RNA Amidites, 상품명, ChemGenes Corporation), ACE 아미다이트, TOM 아미다이트, CEE 아미다이트, CEM 아미다이트, TEM 아미다이트 (Chakhmakhcheva 의 총설 : Protective Groups in the Chemical Synthesis of Oligoribonucleotides, Rus sian Journal of Bioorganic Chemistry, 2013, Vol.39, No.1, pp.1-21.), EMM 아미다이트 (국제 공개 제2013/027843호에 기재) 등이 예시된다.
[화학식 5]
Figure pct00005
(식 중, R 은, 상기와 같은 기를 나타내고, Ba 는, 보호되어 있어도 되는 핵산 염기를 나타낸다.)
[RNA 의 고상 합성]
무기 다공질 담체 (Sp-Nu) 의 Tr 기를 탈보호하여, 고상 담체 (Am-2) 를 얻는다. 이 후, 아미다이트 모노머 (Am-1) 과, 고상 담체 (Am-2) 를 축합 반응시켜, 반응 생성물 (Am-3) 을 얻는다. 이 후, 반응 생성물 (Am-3) 을 산화하여, 생성물 (Am-4) 를 얻는다. 이 후, 생성물 (Am-4) 를 탈보호 (-Tr) 하여, 생성물 (Am-5) 를 얻는다. 이어서, 아미다이트 모노머 (Am-1) 과 생성물 (Am-5) 를 추가로 축합 반응시켜, 포스포디에스테르 결합을 신장해 간다. 이와 같이, 신장한 올리고 뉴클레오티드 사슬 말단의 5' 위치의 하이드록실기를, 원하는 서열이 되도록, 일련의 탈보호, 축합 반응, 산화의 사이클을 필요한 만큼 반복하고, 이 후, 고상 담체로부터 잘라냄으로써, 원하는 서열의 핵산 분자를 제조할 수 있다. 이러한 합성은, 포스포아미다이트법을 채용하는 핵산 자동 합성 장치 등을 사용하여 실시해도 된다. 여기서는, RNA 를 예로 들어 설명하지만, 리보뉴클레오티드 이외의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 화합물에도 적용할 수 있는 것이다.
Tr 기를 탈보호하는 공정에서는, 고상 담체 상에 담지되는 RNA 사슬 말단의 5'' 위치의 하이드록실기의 보호기를 탈보호한다. 보호기로는, 트리틸계 보호기 (전형적으로는, DMTr 기) 가 사용된다. 탈보호는, 산을 사용하여 실시할 수 있다. 탈보호용의 산으로는, 예를 들어, 트리플루오로아세트산, 트리클로로아세트산, 디클로로아세트산, 트리플루오로메탄술폰산, 메탄술폰산, 염산, 아세트산, 및 p-톨루엔술폰산 등을 들 수 있다.
축합 공정에서는, 상기의 탈보호하는 공정에 의해 탈보호한 RNA 사슬 말단의 5 위치의 하이드록실기에 대하여, 뉴클레오시드 포스포아미다이트를 결합시켜, 포스파이트를 생성한다. 상기 뉴클레오시드 포스포아미다이트로는, 5' 위치의 하이드록실기가 보호기 (예를 들어 DMTr 기) 로 보호된 것을 사용한다.
또, 축합 공정은, 상기 뉴클레오시드 포스포아미다이트를 활성화하는 활성화제를 사용하여 실시할 수 있다. 활성화제로는, 예를 들어, 5-벤질티오-1H-테트라졸 (BTT), 1H-테트라졸, 4,5-디시아노이미다졸 (DCI), 5-에틸티오-1H-테트라졸 (ETT), N-메틸벤즈이미다졸륨 트리플레이트 (N-MeBIT), 벤즈이미다졸륨 트리플레이트 (BIT), N-페닐이미다졸륨 트리플레이트 (N-PhIMT), 이미다졸륨 트리플레이트 (IMT), 5-니트로벤즈이미다졸륨 트리플레이트 (NBT), 1-하이드록시벤조트리아졸 (HOBT), 및 5-(비스-3,5-트리플루오로메틸페닐)-1H-테트라졸 (Activator-42) 등을 들 수 있다.
축합 공정 후에는, 적절히, 미반응의 5' 위치의 하이드록실기를 캐핑해도 된다. 캐핑은, 무수 아세트산-테트라하이드로푸란 용액, 페녹시아세트산 무수물/N-메틸이미다졸 용액 등의 공지된 캐핑 용액을 사용하여 실시할 수 있다.
산화 공정은, 상기 축합 공정에 의해 형성된 포스파이트를 산화하는 공정이다. 산화 공정은, 산화제를 사용하여 실시할 수 있다. 산화제로는, 요오드, m-클로로과벤조산, tert-부틸하이드로퍼옥사이드, 2-부타논퍼옥사이드, 비스(트리메틸실릴)퍼옥사이드, 1,1-디하이드로퍼옥시시클로도데칸, 및 과산화수소 등을 들 수 있다.
아인산트리에스테르기를 티오인산트리에스테르기로 변환하는 경우에는, 「산화제」 로서, 예를 들어, 황, 3H-1,2-벤조디티올-3-온-1,1-디옥사이드 (Beaucage 시약), 3-아미노-1,2,4-디티아졸-5-티온 (A DTT), 5-페닐-3H-1,2,4-디티아졸-3-온 (POS), [(N,N-디메틸아미노메틸리덴)아미노]-3H-1,2,4-디티아졸린-3-티온 (DDTT), 및 페닐아세틸디술파이드 (PADS) 를 사용할 수 있다. 그 산화제는, 0.001 ∼ 2 M 의 농도가 되도록 적당한 용매로 희석하여 사용할 수 있다. 반응에 사용하는 용매로는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 피리딘 또는 이들의 임의 비율의 혼합 용매를 들 수 있다.
산화 공정은, 상기 캐핑 조작 후에 실시해도 되고, 반대로, 산화 공정 후에 캐핑 조작을 실시해도 되며, 이 순번은 한정되지 않는다.
산화 공정 후에는, 탈보호 공정으로 되돌아와, 합성해야 할 핵산 올리고머의 뉴클레오티드 서열에 따라, 상기의 축합 반응, 산화, 탈보호의 일련의 공정을 반복함으로써, 원하는 서열을 갖는 RNA 를 합성할 수 있다.
원하는 서열을 갖는 핵산 올리고머의 합성이 완료된 후에는, 암모니아 또는 아민 화합물을 사용하여, 고상 담체로부터 RNA 사슬을 절단하여 회수한다.
여기서의 아민 화합물로는, 예를 들어, 메틸아민, 에틸아민, 이소프로필아민, 에틸렌디아민, 디에틸아민, 및 트리에틸아민 등을 들 수 있다.
이렇게 하여 얻어지는 핵산 올리고머의 사슬 길이는, 예를 들어, n ≥ 60, n ≥ 80 또는 n ≥ 100, 또한, n ≤ 200 의 것이 예시된다. 바람직하게는, n ≥ 60 이다. 구체적으로는, 예를 들어, n = 67, 100 또는 120 이다.
인산 보호기를 탈보호하는 공정은, 원하는 서열을 갖는 핵산의 합성이 완료된 후에는, 인산 부분의 보호기를 탈보호하기 위해서 아민 화합물을 작용시킨다. 아민 화합물로는, 예를 들어, 기재되는 디에틸아민 등을 들 수 있다.
리보스의 2' 위치 혹은 3' 위치의 수산기의 보호기가 있는 경우에는, 국제 공개공보 제2006/022323호), 국제 공개공보 제2013/027843호, 또는 국제 공개공보 제2019/208571호에 기재된 방법에 따라서 제외할 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하는데, 본 발명은 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
측정 방법
이하의 시험에서 사용한 각 측정 방법을 이하에 나타낸다.
(측정 방법 1 : RNA 의 순도의 측정 방법)
분취 후 용액 중의 RNA 의 순도 측정은, HPLC 에 의해 실시하였다. 분취한 RNA 를 HPLC (파장 260 ㎚, 칼럼 DNAPacTM PA200, 4.0 ㎜ × 250 ㎜, 8.0 ㎛) 에 의해 각 성분으로 분리하고, 얻어진 크로마토그램의 피크의 총면적값에 있어서의 주생성물의 피크의 면적값으로부터 RNA 의 순도를 산출하였다. HPLC 측정 조건을 하기 표 1 에 나타낸다.
Figure pct00006
[참고예 1]
RNA 의 아미다이트법에 의한 고상 합성
이하에 나타내는 I 의 핵산 서열을 갖는 RNA 를 합성하였다. 당해 사슬은 103 염기 길이로 이루어진다.
Figure pct00007
상기 서열의 표기에 있어서, 뉴클레오티드 사이의 기호 * 는, 뉴클레오티드를 잇는 인산 결합이, 포스포로티오에이트인 것을 나타낸다.
당해 RNA 는, 포스포아미다이트법에 기초하여, 핵산 합성기 (AKTA oligopi lot plus100 GE 헬스케어사) 를 사용하여 3' 측으로부터 5' 측을 향하여 합성하였다. 합성은 63 μmol 스케일로 실시하였다. 또, 당해 합성에는 RNA 아미다이트로서, 각각 하기의 식의 우리딘 EMM 아미다이트 (국제 공개 제2013/027843호의 실시예 2 에 기재), 시티딘 EMM 아미다이트 (동 (同) 실시예 3 에 기재), 아데노신 EMM 아미다이트 (동 실시예 4 에 기재), 및 구아노신 EMM 아미다이트 (동 실시예 5 에 기재) 를 사용하고, 고상 담체로서 다공질 유리를 사용하고, 디블로킹 용액으로서 디클로로아세트산톨루엔 용액을 사용하고, 축합제로서 5-벤질티오-1H-테트라졸을 사용하고, 산화제로서 요오드 용액을 사용하고, 황화제로서 3-아미노-1,2,4-디티아졸 5-티온을 사용하고, 캐핑 용액으로서 무수 페녹시아세트산 용액과 N-메틸이미다졸 용액을 사용하여 실시하였다. 핵산 신장 종료 후 담체 상의 핵산에 디에틸아민 용액을 작용시킴으로써 인산 부분의 시아노에틸 보호기를 선택적으로 탈보호하였다. 여기서, EMM 은, (2-시아노에톡시)메톡시메틸기의 약호이다.
[화학식 6]
Figure pct00008
고상 합성 후의 고상 담체로부터의 잘라내기와 탈보호는, 국제 공개 제2013/027843호에 기재된 방법에 따랐다. 즉, 암모니아 수용액과 에탄올을 첨가하고, 잠시 정치 (靜置) 한 후에 고상 담체를 여과하고, 용매를 증류 제거하였다. 그 후, 테트라부틸암모늄플루오리드를 사용하여 수산기의 탈보호를 실시하였다. 얻어진 RNA 를, 주사용 증류수를 사용하여 원하는 농도가 되도록 용해하였다.
RNA 의 분취 정제
하기 표 2 의 조건으로 칼럼 크로마토그래피 정제를 실시하였다. 단, 정제 전에 칼럼 내에 이동상 A 를 유속 4.7 mL/min 으로 12.5 분간 통액한 후에 샘플을 첨가하였다. 유지 시간 94.2 분 - 95.8 분까지를 분취하고, 얻어진 용액을 HPLC 로 분석하였다. 또한, 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법으로 순도를 산출하였다. 그 결과, 순도는 94.2 % 였다. 이 분취 정제한 RNA 용액을 사용하여 이하의 실시예 및 비교예의 실험을 실시하였다.
Figure pct00009
[실시예 1]
참고예 1 에 있어서 역상 칼럼 크로마토그래피로 분취 정제한 RNA 용액 99 μL 를 용량 300 mL 의 폴리프로필렌제 바이알 (써모피셔사) 에 넣고, 첨가제 용액으로서, 리포산의 아세토니트릴 용액을 1 μL 혼합하고, 소정 농도의 시료를 조제하였다. 혼합 용액이 들어간 바이알을 60 ℃ 로 온조된 인큐베이터 (케니스사) 에 넣고, 8 시간 정치하였다. 정치 후, 인큐베이터로부터 꺼낸 폴리프로필렌제 바이알을 실온까지 냉각시키고, 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법으로 순도를 산출하였다. 결과를 표 3 에 나타낸다.
리포산의 농도가, 3 mM (0.07 %) 로 조제된 조성물은, 계산에 의하면, 이하의 조성을 갖는다. 물 : 63.79 %, 아세토니트릴 : 34.89 %, 디부틸아민 0.84 %, 아세트산 : 0.39 %, (디부틸암모늄아세트산으로서 1.23 %), 핵산 농도 : 0.21 mg/mL (0.02 %).
[실시예 2]
실시예 1 의 실험에 있어서, 첨가제 용액으로서, 리포산의 아세토니트릴 용액 대신에, 메티오닌 수용액을 사용하여 메티오닌의 농도를 3 mM (0.05 %) 의 액으로서 조제하는 것 이외에는 동일한 조건으로 실험을 실시하고, 실험 후의 RNA 의 순도를 측정하였다. 결과를 표 3 에 나타낸다.
[실시예 3]
실시예 1 의 실험에 있어서, 첨가제 용액으로서, 리포산의 아세토니트릴 용액 대신에, 산화형 글루타티온 수용액을 첨가하여, 산화형 글루타티온의 농도를 0.15 mM (0.01 %) 의 액으로서 조제하는 것 이외에는 동일한 조건으로 실험을 실시하고, 실험 후의 RNA 의 순도를 측정하였다. 결과를 표 3 에 나타낸다.
[비교예 1]
참고예 1 에 있어서 역상 칼럼 크로마토그래피로 분취 정제한 RNA 용액 100 μL 를 용량 300 mL 의 폴리프로필렌제 바이알 (써모피셔사) 에 넣고, 용액이 들어간 바이알을 60 ℃ 로 온조된 인큐베이터 (케니스사) 에 넣고, 8 시간 정치하였다. 정치 후, 인큐베이터로부터 꺼낸 폴리프로필렌제 바이알을 실온까지 냉각시키고, 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법으로 순도를 산출하였다. 결과를 표 3 에 나타낸다.
[비교예 2]
실시예 1 의 실험에 있어서, 첨가제 용액으로서, 리포산의 아세토니트릴 용액 대신에, 시스테인 수용액, N-아세틸시스테인의 아세토니트릴 용액, 환원형 글루타티온 수용액, 디티오트레이톨 수용액, L-아스코르브산 수용액, 또는 차아황산나트륨 수용액을 각각 소정의 농도로 사용하는 것 이외에는, 동일한 조건으로 실험을 실시하였다. 결과를 표 3 에 나타낸다.
Figure pct00010
1) 참고예 1 에서 조제한 핵산 (순도 94.2 %) 을 60 ℃/8 시간 정치한 후의 핵산의 순도를 나타낸다.
2) 핵산 유지율 (%) = 정치 후의 핵산 순도/정치 전의 핵산 순도
[실시예 4] (분취 정제한 RNA 용액으로부터의 RNA 의 회수)
실시예 1 에 있어서 리포산의 농도가 3 mM 가 되도록 혼합하고, 60 ℃ 에서 8 시간 정치한 용액을 사용하여 이하의 처리를 하였다. 용액 80 μL 를 용량 15 mL 의 폴리프로필렌제 코니컬 튜브 (Corning 사) 에 넣고, 아세트산나트륨 수용액 (3M, pH = 5.2) 을 40 μL, 에탄올을 240 μL 추가하였다. 얻어진 슬러리 용액을 10 분간, 3000 g, 25 ℃ 에서 원심하고, 상청을 제거하였다. 계속해서 70 % 에탄올 수용액을 200 μL 넣고, 10 분간, 3000 g, 25 ℃ 에서 원심하고, 상청을 제거하는 조작을 2 회 반복하여 RNA 를 얻었다. 얻어진 RNA 를 물 80 μL 에 용해하고, 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법으로 RNA 의 순도를 산출하면, 순도는 85.8 % 였다.
[비교예 3]
비교예 1 에 있어서 60 ℃ 에서 8 시간 정치한 용액을 사용하여 이하의 처리를 하였다. 용액 80 μL 를 용량 15 mL 의 폴리프로필렌제 코니컬 튜브 (Corning 사) 에 넣고, 아세트산나트륨 수용액 (3M, pH = 5.2) 을 40 μL, 에탄올을 240 μL 추가하였다. 얻어진 슬러리 용액을 10 분간, 3000 g, 25 ℃ 에서 원심하고, 상청을 제거하였다. 계속해서 70 % 에탄올 수용액을 200 μL 넣고, 10 분간, 3000 g, 25 ℃ 에서 원심하고, 상청을 제거하는 조작을 2 회 반복하여 RNA 를 얻었다. 얻어진 RNA 를 물 80 μL 에 용해하고, 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법으로 획분 중의 RNA 의 순도를 산출하면, 순도는 70.9 % 였다.
[참고예 2]
RNA 의 아미다이트법에 의한 고상 합성
이하에 나타내는 II 의 핵산 서열을 갖는 RNA 를 합성하였다. 당해 사슬은 67 염기 길이로 이루어진다.
Figure pct00011
상기 서열의 표기에 있어서, 뉴클레오티드 사이의 기호 * 는, 뉴클레오티드를 잇는 인산 결합이, 포스포로티오에이트인 것을 나타낸다. 알파벳 Am, Um, Cm, Gm 은 2' 수산기가 메톡시기로 치환된 뉴클레오티드를 나타낸다. 당해 RNA 는, 포스포아미다이트법에 기초하여, 핵산 합성기 (AKTA oligopi lot plus100 GE 헬스케어사) 를 사용하여 3' 측으로부터 5' 측을 향하여 합성하였다. 합성은 53 μmol 스케일로 실시하였다. 또, 당해 합성에는 RNA 아미다이트로서, 우리딘 EMM 아미다이트 (국제 공개 제2013/027843호의 실시예 2 에 기재), 시티딘 EMM 아미다이트 (동 실시예 3 에 기재), 아데노신 EMM 아미다이트 (동 실시예 4 에 기재), 및 구아노신 EMM 아미다이트 (동 실시예 5 에 기재) 와, 각각 하기의 식의 우리딘 2'OMe 아미다이트, 시티딘 2'OMe 아미다이트, 아데노신 2'OMe 아미다이트, 및 구아노신 2'OMe 아미다이트를 사용하고, 고상 담체로서 다공질 유리를 사용하고, 디블로킹 용액으로서 디클로로아세트산톨루엔 용액을 사용하고, 축합제로서 5-벤질티오-1H-테트라졸을 사용하고, 산화제로서 요오드 용액을 사용하고, 황화제로서 3-아미노-1,2,4-디티아졸-5-티온을 사용하고, 캐핑 용액으로서 무수 페녹시아세트산 용액과 N-메틸이미다졸 용액을 사용하여 실시하였다. 핵산 신장 종료 후 담체 상의 핵산에 디에틸아민 용액을 작용시킴으로써 인산 부분의 시아노에틸 보호기를 선택적으로 탈보호하였다. 여기서, EMM 은, (2-시아노에톡시)메톡시메틸기의 약호이다.
[화학식 7]
Figure pct00012
고상 합성 후의 고상 담체로부터의 잘라내기와 탈보호는, 국제 공개 제2013/027843호에 기재된 방법에 따랐다. 즉, 암모니아 수용액과 에탄올을 첨가하고, 잠시 정치한 후에 고상 담체를 여과하고, 용매를 증류 제거하였다. 그 후, 테트라부틸암모늄플루오리드를 사용하여 수산기의 탈보호를 실시하였다. 얻어진 RNA 를, 주사용 증류수를 사용하여 원하는 농도가 되도록 용해하였다.
RNA 의 분취 정제
하기 표 4 의 조건으로 칼럼 크로마토그래피 정제를 실시하였다. 단, 정제 전에 칼럼 내에 이동상 A 를 유속 4.7 mL/min 으로 12.5 분간 통액한 후에 샘플을 첨가하였다. 유지 시간 66.7 분 - 70.9 분까지를 분취하고, 얻어진 용액을 HPLC 로 분석하였다. 또한, 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법으로 순도를 산출하였다. 그 결과, 순도 94.2 % 였다. 이 분취 정제한 RNA 용액을 사용하여 이하의 실시예 및 비교예의 실험을 실시하였다.
Figure pct00013
[실시예 5]
참고예 2 에 있어서 역상 칼럼 크로마토그래피로 분취 정제한 RNA 용액 99 μL 를 용량 300 mL 의 폴리프로필렌제 바이알 (써모피셔사) 에 넣고, 첨가제 용액으로서, L-메티오닌의 수용액을 1 μL 혼합하고, L-메티오닌의 농도가 1.5 mM 인 시료를 조제하였다. 혼합 용액이 들어간 바이알을 60 ℃ 로 온조된 인큐베이터 (케니스사) 에 넣고, 8 시간 정치하였다. 정치 후, 인큐베이터로부터 꺼낸 폴리프로필렌제 바이알을 실온까지 냉각시키고, 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법으로 순도를 산출하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
L-메티오닌의 농도가, 1.5 mM (0.02 %) 로 조제된 조성물은, 계산에 의하면, 이하의 조성을 갖는다. 물 : 62.95 %, 아세토니트릴 : 32.21 %, 메탄올 : 3.59 %, 디부틸아민 0.82 %, 아세트산 : 0.38 %, (디부틸암모늄아세트산으로서 1.20 %), 핵산 농도 : 0.31 mg/mL (0.03 %).
[실시예 6]
실시예 5 의 실험에 있어서, 첨가제 용액으로서, L-메티오닌의 수용액 대신에, N-포르밀-L-메티오닌의 메탄올 용액을 사용하여 N-포르밀-L-메티오닌의 농도를 3 mM (0.06 %) 의 액으로서 조제하는 것 이외에는 동일한 조건으로 실험을 실시하고, 실험 후의 RNA 의 순도를 측정하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
[실시예 7]
실시예 5 의 실험에 있어서, 첨가제 용액으로서, L-메티오닌의 수용액 대신에, N-아세틸-DL-메티오닌의 메탄올 용액을 사용하여 N-아세틸-DL-메티오닌의 농도를 3 mM (0.06 %) 의 액으로서 조제하는 것 이외에는 동일한 조건으로 실험을 실시하고, 실험 후의 RNA 의 순도를 측정하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
[실시예 8]
실시예 5 의 실험에 있어서, 첨가제 용액으로서, L-메티오닌의 수용액 대신에, N-벤조일-DL-메티오닌의 메탄올 용액을 사용하여 N-벤조일-DL-메티오닌의 농도를 3 mM (0.08 %) 의 액으로서 조제하는 것 이외에는 동일한 조건으로 실험을 실시하고, 실험 후의 RNA 의 순도를 측정하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
[실시예 9]
실시예 5 의 실험에 있어서, 첨가제 용액으로서, L-메티오닌의 수용액 대신에, N-카르보벤족시-DL-메티오닌의 메탄올 용액을 사용하여 N-카르보벤족시-DL-메티오닌의 농도를 3 mM (0.12 %) 의 액으로서 조제하는 것 이외에는 동일한 조건으로 실험을 실시하고, 실험 후의 RNA 의 순도를 측정하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
[실시예 10]
실시예 5 의 실험에 있어서, 첨가제 용액으로서, L-메티오닌의 수용액 대신에, N-Fmoc-L-메티오닌을 메탄올과 아세토니트릴의 혼합 용매 (혼합비 50 : 50 (v/v)) 에 용해한 용액을 사용하여 N-Fmoc-L-메티오닌의 농도를 3 mM (0.10 %) 의 액으로서 조제하는 것 이외에는 동일한 조건으로 실험을 실시하고, 실험 후의 RNA 의 순도를 측정하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
[실시예 11]
실시예 5 의 실험에 있어서, 첨가제 용액으로서, L-메티오닌의 수용액 대신에, L-메티오닌메틸염산염의 수용액을 사용하여 L-메티오닌메틸염산염의 농도를 3 mM (0.07 %) 의 액으로서 조제하는 것 이외에는 동일한 조건으로 실험을 실시하고, 실험 후의 RNA 의 순도를 측정하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
[실시예 12]
실시예 5 의 실험에 있어서, 첨가제 용액으로서, L-메티오닌의 수용액 대신에, 디부틸술파이드의 아세토니트릴 용액을 사용하여 디부틸술파이드의 농도를 3 mM (0.05 %) 의 액으로서 조제하는 것 이외에는 동일한 조건으로 실험을 실시하고, 실험 후의 RNA 의 순도를 측정하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
[실시예 13]
실시예 5 의 실험에 있어서, 첨가제 용액으로서, L-메티오닌의 수용액 대신에, 디헥실술파이드의 아세토니트릴 용액을 사용하여 디부틸술파이드의 농도를 3 mM (0.07 %) 의 액으로서 조제하는 것 이외에는 동일한 조건으로 실험을 실시하고, 실험 후의 RNA 의 순도를 측정하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
[실시예 14]
실시예 5 의 실험에 있어서, 첨가제 용액으로서, L-메티오닌의 수용액 대신에 티아졸리딘-2-카르복실산의 수용액을 사용하여 티아졸리딘-2-카르복실산의 농도를 3 mM (0.04 %) 의 액으로서 조제하는 것 이외에는 동일한 조건으로 실험을 실시하고, 실험 후의 RNA 의 순도를 측정하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
[실시예 15]
실시예 5 의 실험에 있어서, 첨가제 용액으로서, L-메티오닌의 수용액 대신에 2-이소부틸-4,5-디메틸-3-티아졸린 (이성체 혼합물) 의 아세토니트릴 용액을 사용하여 2-이소부틸-4,5-디메틸-3-티아졸린 (이성체 혼합물) 의 농도를 3 mM (0.06 %) 의 액으로서 조제하는 것 이외에는 동일한 조건으로 실험을 실시하고, 실험 후의 RNA 의 순도를 측정하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
[실시예 16]
실시예 5 의 실험에 있어서, 첨가제 용액으로서, L-메티오닌의 수용액 대신에 4-옥소티안의 아세토니트릴 용액을 사용하여 4-옥소티안의 농도를 3 mM (0.04 %) 의 액으로서 조제하는 것 이외에는 동일한 조건으로 실험을 실시하고, 실험 후의 RNA 의 순도를 측정하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
[실시예 17]
실시예 5 의 실험에 있어서, 첨가제 용액으로서, L-메티오닌의 수용액 대신에 1,4-티옥산의 아세토니트릴 용액을 사용하여 1,4-티옥산의 농도를 3 mM (0.03 %) 의 액으로서 조제하는 것 이외에는 동일한 조건으로 실험을 실시하고, 실험 후의 RNA 의 순도를 측정하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
[비교예 4]
참고예 2 에 있어서 역상 칼럼 크로마토그래피로 분취 정제한 RNA 용액 100 μL 를 용량 300 mL 의 폴리프로필렌제 바이알 (써모피셔사) 에 넣고, 용액이 들어간 바이알을 60 ℃ 로 온조된 인큐베이터 (케니스사) 에 넣고, 8 시간 정치하였다. 정치 후, 인큐베이터로부터 꺼낸 폴리프로필렌제 바이알을 실온까지 냉각시키고, 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법으로 순도를 산출하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
Figure pct00014
1) 참고예 2 에서 조제한 핵산 (순도 94.2 %) 을 60 ℃/8 시간 정치한 후의 핵산의 순도를 나타낸다.
2) 핵산 유지율 (%) = 정치 후의 핵산 순도/정치 전의 핵산 순도
[참고예 3]
RNA 의 분취정제
참고예 2 에서 얻어진 테트라부틸암모늄플루오리드를 사용하여 수산기의 탈보호를 실시한 RNA 에 대해, 하기 표 6 의 조건으로 칼럼 크로마토그래피 정제를 실시하였다. 단, 정제 전에 칼럼 내에 이동상 A 를 유속 4.7 mL/min 으로 12.5 분간 통액한 후에 샘플을 첨가하였다. 유지 시간 91.7 분 - 94.2 분까지를 분취하고, 얻어진 용액을 HPLC 로 분석하였다. 또한, 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법으로 순도를 산출하였다. 그 결과, 순도 95.1 % 였다. 이 분취 정제한 RNA 용액을 사용하여 이하의 실시예 및 비교예의 실험을 실시하였다.
Figure pct00015
[실시예 18]
참고예 3 에 있어서 역상 칼럼 크로마토그래피로 분취 정제한 RNA 용액 99 μL 를 용량 300 mL 의 폴리프로필렌제 바이알 (써모피셔사) 에 넣고, 첨가제 용액으로서, α-리포산의 아세토니트릴 용액을 1 μL 혼합하고, α-리포산의 농도가 3 mM 인 시료를 조제하였다. 혼합 용액이 들어간 바이알을 60 ℃ 로 온조된 인큐베이터 (케니스사) 에 넣고, 14 시간 정치하였다. 정치 후, 인큐베이터로부터 꺼낸 폴리프로필렌제 바이알을 실온까지 냉각시키고, 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법으로 순도를 산출하였다. 결과를 표 7 에 나타낸다.
α-리포산의 농도가, 3.0 mM (0.07 %) 로 조제된 조성물은, 계산에 의하면, 이하의 조성을 갖는다. 물 : 59.69 %, 아세토니트릴 : 35.38 %, 메탄올 : 3.84 %, 헥실아민 0.61 %, 아세트산 : 0.36 %, (헥실암모늄아세트산으로서 0.97 %), 핵산 농도 : 0.35 mg/mL (0.04 %).
[실시예 19]
실시예 18 의 실험에 있어서, 첨가제 용액으로서, α-리포산의 아세토니트릴 용액 대신에, L-메티오닌의 수용액을 사용하여 L-메티오닌의 농도를 3 mM (0.05 %) 의 액으로서 조제하는 것 이외에는 동일한 조건으로 실험을 실시하고, 실험 후의 RNA 의 순도를 측정하였다. 결과를 표 7 에 나타낸다.
[실시예 20]
실시예 18 의 실험에 있어서, 첨가제 용액으로서, α-리포산의 아세토니트릴 용액 대신에, DL-메티오닌의 수용액을 사용하여 DL-메티오닌의 농도를 3 mM (0.05 %) 의 액으로서 조제하는 것 이외에는 동일한 조건으로 실험을 실시하고, 실험 후의 RNA 의 순도를 측정하였다. 결과를 표 7 에 나타낸다.
[실시예 21]
실시예 18 의 실험에 있어서, 첨가제 용액으로서, α-리포산의 아세토니트릴 용액 대신에, 산화형 글루타티온의 수용액을 사용하여 산화형 글루타티온의 농도를 3 mM (0.01 %) 의 액으로서 조제하는 것 이외에는 동일한 조건으로 실험을 실시하고, 실험 후의 RNA 의 순도를 측정하였다. 결과를 표 7 에 나타낸다.
[비교예 5]
참고예 3 에 있어서 역상 칼럼 크로마토그래피로 분취 정제한 RNA 용액 100 μL 를 용량 300 mL 의 폴리프로필렌제 바이알 (써모피셔사) 에 넣고, 용액이 들어간 바이알을 60 ℃ 로 온조된 인큐베이터 (케니스사) 에 넣고, 14 시간 정치하였다. 정치 후, 인큐베이터로부터 꺼낸 폴리프로필렌제 바이알을 실온까지 냉각시키고, 상기 측정 방법 1 에 기재된 방법으로 순도를 산출하였다. 결과를 표 7 에 나타낸다.
[비교예 6]
실시예 18 의 실험에 있어서, 첨가제 용액으로서, 리포산의 아세토니트릴 용액 대신에, 이소부틸렌술파이드의 아세토니트릴 용액 또는 4-tert-부틸디페닐술파이드의 아세토니트릴 용액을 각각 소정의 농도로 사용하는 것 이외에는, 동일한 조건으로 실험을 실시하였다. 결과를 표 7 에 나타낸다.
Figure pct00016
1) 참고예 3 에서 조제한 핵산 (순도 95.1 %) 을 60 ℃/8 시간 정치한 후의 핵산의 순도를 나타낸다.
2) 핵산 유지율 (%) = 정치 후의 핵산 순도/정치 전의 핵산 순도
본 발명에 의하면 포스포로티오에이트 결합을 갖는 핵산 올리고머를 안정화 시킨 조성물을 얻을 수 있고, 따라서, 당해 조성물을 효율적으로 제조할 수 있다.
서열표 프리 텍스트
서열표의 서열 번호 1 및 2 는, 본 발명의 제조 방법에 따라서 제조되는 올리고 뉴클레오티드의 염기 서열을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> SUMITOMO CHEMICAL COMPANY, LIMITED <120> COMPOSITION COMPRISING NUCLEIC ACID OLIGOMER <130> S44665WO01 <150> JP 2020-072234 <151> 2020-04-14 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 1 auaacucaau uuguaaaaaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103 <210> 2 <211> 67 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (4)..(4), (6)..(6), (14)..(14), (25)..(25), (37)..(37), (42)..(46) <223> am <220> <221> modified_base <222> (2)..(2), (7)..(7), (22)..(22), (41)..(41), (47)..(47), (55)..(55), (61)..(61), (63)..(63) <223> gm <220> <221> modified_base <222> (29)..(29), (38)..(38), (53)..(54) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (5)..(5), (39)..(40), (48)..(48), (62)..(62) <223> um <220> <221> modified_base <222> (23)..(23), (28)..(28) <223> phosphorothioate derivative of cytosine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24), (27)..(27) <223> phosphorothioate derivative of uracil <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> phosphorothioate derivative of guanine <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> phosphorothioate derivative of 2'-O-methyladenosine <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> phosphorothioate derivative of 2'-O-methyllguanosine <220> <221> modified_base <222> (3)..(3), (64)..(64) <223> phosphorothioate derivative of 2'-O-methyllcytidine <220> <221> modified_base <222> (65)..(66) <223> phosphorothioate derivative of 2'-O-methylluridine <400> 2 nnnnnnncaa guunaaauaa gnnnnnnnng uuaucannnn nnnnnnnngg cannnagucg 60 nnnnnnu 67

Claims (13)

  1. 식 (1) :
    Figure pct00017

    (식 중,
    BC 는, 각각 독립적으로 동일하거나 또는 상이한 핵산 염기를 나타내고,
    R 은, 각각 독립적으로 동일하거나 또는 상이하고, 수소 원자, 불소 원자 또는 OQ 기를 나타내고,
    Q 는, 각각 독립적으로 동일하거나 또는 상이하고, 수소 원자, 메틸기, 2-메톡시에틸기, 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합하고 있는 메틸렌기, 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합하고 있는 에틸렌기, 또는 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합하고 있는 에틸리덴기를 나타내고,
    X 는, 각각 독립적으로 동일하거나 또는 상이하고, 산소 원자 또는 황 원자를 나타내고,
    Y 는, 수소 원자 또는 수산기의 보호기를 나타내고,
    G 는, 암모늄 이온, 알킬암모늄 이온, 알칼리 금속 이온, 수소 이온 또는 하이드록시알킬암모늄 이온을 나타내고,
    n 은, 식 (2) :
    15 ≤ n (2) 를 만족하는 정수이다.)
    로 나타내는 포스포로티오에이트 결합을 갖는 핵산 올리고머, 알킬암모늄염, 수용성 유기 용매, 물, 및 첨가제를 포함하는 조성물이며, 그 첨가제가, 하기 식 (3) 또는 (4) 로 나타내는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 첨가제인, 조성물.
    식 (3) :
    Ra(Rc)CH-L-CH(Rd)Rb (3)
    (식 중,
    L 은, -S-, 또는 -SS- 를 나타내고,
    Ra 및 Rb 는, 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로, 수소 원자, 또는 하기의 Z1 및 Z2 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 기로 치환되어 있어도 되는 C1-6 의 알킬기를 나타내고,
    Z1 : -CH(NHR1)COR2
    Z2 : -COR2
    (Z1 및 Z2 에 있어서,
    R1 은, 수소 원자, 아미노기의 보호기, 또는 C(O)-R11 기를 나타내고,
    R11 은, 아미노기 및 카르복실기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 기로 치환되어 있어도 되는 C1-6 의 알킬기, 또는 아미노기 및 카르복실기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 기로 치환되어 있어도 되는 페닐기를 나타내고,
    R2 는, 보호되어 있어도 되는 카르복실기로 치환되어 있어도 되는 C1-6 의 알킬이미노기, 또는 -OR20 기 (R20 은, 수소 원자 또는 카르복실기의 보호기를 나타낸다.) 를 나타내고,
    Rc 및 Rd 는, 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로, 수소 원자, 또는 C1-6 의 알킬기를 나타낸다.) 으로 나타내는 화합물,
    식 (4) :
    Figure pct00018

    (식 중,
    L 은, 상기와 동일한 의미를 갖고,
    Re 및 Rf 는, 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로, 수소 원자, C1-6 알콕시-카르보닐기, 카르복실기, 또는 C1-6 알콕시카르보닐기 또는 카르복실기로 치환되어 있어도 되는 C1-6 의 알킬기를 나타내고,
    X, L 및 그것들이 결합하는 탄소 원자는, 5 원 혹은 6 원의 고리 구조를 형성하고, 그리고,
    X 는, CH2, CH2CH2, (CH3)CHCH2, (CH3CH2)CHCH2, CH2CH2CH2, (CH3)CHCH2CH2, CH2(CH3)CHCH2, CH=N, (CH3)C=N, CH2NH, (CH3)CHNH, (CH3)2CNH, (COOH)CHNH, CH2OCH2, CH2NHCH2, 및 CH2COCH2 로부터 선택되는 어느 것의 기를 나타낸다.) 로 나타내는 화합물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    R1 이, 수소 원자, 아미노기의 보호기, 또는 C(O)-R11 기를 나타내고,
    R11 은, 아미노기 및 카르복실기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 기로 치환되어 있어도 되는 C1-6 의 알킬기를 나타내고, 그리고,
    X 가, CH2, CH2CH2, (CH3)CHCH2, (CH3CH2)CHCH2, CH2CH2CH2, (CH3)CHCH2CH2, CH2(CH3)CHCH2, CH=N, (CH3)C=N, CH2NH, (CH3)CHNH, (COOH)CHNH, CH2OCH2 및 CH2COCH2 로부터 선택되는 어느 것의 기를 나타내는, 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    R1 이, 수소 원자, 벤조일기, 4-메톡시벤조일기, 포르밀기, 아세틸기, 프로피오닐기, 부티릴기, 이소부티릴기, 페닐아세틸기, 페녹시아세틸기, 4-tert-부틸페녹시아세틸기, 4-이소프로필페녹시아세틸기, 벤질옥시카르보닐기, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기, 또는 C(O)-R11 기를 나타내고,
    R11 이, 아미노기 및 카르복실기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 기로 치환되어 있어도 되는 C1-6 의 알킬기를 나타내고,
    R2 가, 메틸기, 벤질기, 알릴기 및 tert-부틸기로 보호되어 있어도 되는 카르복실기로 치환되어 있어도 되는 C1-6 의 알킬이미노기, 또는 -OR20 기 (R20 은, 수소 원자, 메틸기, 벤질기, 알릴기 또는 tert-부틸기를 나타낸다.) 를 나타내고, 그리고,
    X 가, CH2, CH2CH2, (CH3)CHCH2, (CH3CH2)CHCH2, CH2CH2CH2, (CH3)CHCH2CH2, CH2(CH3)CHCH2, CH=N, (CH3)C=N, CH2NH, (COOH)CHNH, CH2OCH2, 및 CH2COCH2 로부터 선택되는 어느 것의 기를 나타내는, 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Re 및 Rf 가, 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로, 수소 원자, 카르복실기, 또는, C1-6 의 알킬기를 나타내고, 그리고,
    X 가, CH2, (CH3)C=N, CH2NH, CH2OCH2, 및 CH2COCH2 로부터 선택되는 어느 것의 기를 나타내는, 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    R1 이, 수소 원자, 벤조일기, 포르밀기, 아세틸기, 벤질옥시카르보닐기 및 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기, 또는 C(O)-R11 기를 나타내고,
    R11 이, 아미노기 및 카르복실기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 기로 치환되어 있어도 되는 C1-6 의 알킬기를 나타내고, 그리고,
    R2 가, 메틸기로 보호되어 있어도 되는 카르복실기로 치환되어 있어도 되는 C1-6 의 알킬이미노기, 또는 -OR20 기 (R20 은, 수소 원자 또는 메틸기를 나타낸다.) 를 나타내는, 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    첨가제가,
    α-리포산,
    메티오닌,
    N-포르밀-메티오닌,
    N-아세틸-메티오닌,
    N-벤조일-메티오닌,
    N-카르보벤족시-메티오닌,
    N-Fmoc-메티오닌,
    메티오닌메틸염산염,
    디부틸술파이드,
    디헥실술파이드,
    티아졸리딘-2-카르복실산,
    2-이소부틸-4,5-디메틸-3-티아졸린 (이성체 혼합물),
    4-옥소티안,
    1,4-티옥산, 및
    산화형 글루타티온
    으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 화합물인, 조성물.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 첨가제가, 리포산, 산화형 글루타티온 및 메티오닌으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 화합물인, 조성물.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 알킬암모늄염이 모노알킬암모늄염 및 디알킬암모늄염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 알킬암모늄염인, 조성물.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수용성 유기 용매가, 알코올계 수용성 유기 용매 및 니트릴계 수용성 유기 용매로 이루어지는 군에서 선택되는 수용성 유기 용매인, 조성물.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식 (1) 에 있어서, R 이, 각각 독립적으로, 하이드록시기 또는 메톡시기인, 조성물.
  11. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식 (1) 에 있어서, R 이 하이드록시기인, 조성물.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 조성물과, 산소 원자를 적어도 1 개 갖는 C1-C4 의 유기 용매를 혼합하여, 석출한 핵산 올리고머를 단리하는 것을 포함하는, 핵산 올리고머의 제조 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    고상 합성법으로 합성된 식 (1) 의 핵산 올리고머의 미정제 생성물을 역상 칼럼 크로마토그래피 처리에 의해 얻어진 식 (1) 로 나타내는 핵산 올리고머, 알킬암모늄염, 수용성 유기 용매 및 물을 포함하는 칼럼 용출액을 첨가제와 혼합하는 것을 포함하는, 조성물의 제조 방법.
KR1020227035338A 2020-04-14 2021-03-31 핵산 올리고머를 포함하는 조성물 KR20220167282A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020072234 2020-04-14
JPJP-P-2020-072234 2020-04-14
PCT/JP2021/014017 WO2021210409A1 (ja) 2020-04-14 2021-03-31 核酸オリゴマーを含む組成物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220167282A true KR20220167282A (ko) 2022-12-20

Family

ID=78084944

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227035338A KR20220167282A (ko) 2020-04-14 2021-03-31 핵산 올리고머를 포함하는 조성물

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20230192755A1 (ko)
EP (1) EP4137501A4 (ko)
JP (1) JPWO2021210409A1 (ko)
KR (1) KR20220167282A (ko)
CN (1) CN115397831A (ko)
WO (1) WO2021210409A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4368627A1 (en) * 2021-07-06 2024-05-15 Sumitomo Chemical Company, Limited Composition containing nucleic acid oligomer
WO2023182274A1 (ja) * 2022-03-23 2023-09-28 住友化学株式会社 核酸オリゴマーの製造方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017068377A1 (en) 2015-10-23 2017-04-27 Silence Therapeutics (London) Ltd Modified guide rnas, methods and uses

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
JPH07170981A (ja) * 1993-12-17 1995-07-11 Res Dev Corp Of Japan オリゴヌクレオチドの製造法
JP4476386B2 (ja) 1999-08-03 2010-06-09 長谷川香料株式会社 環状ジスルフィド類の製法
US6586586B1 (en) * 2000-01-31 2003-07-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Purification of oligonucleotides
US20030096770A1 (en) * 2001-07-11 2003-05-22 Krotz Achim H. Enhancement of the stability of oligonucleotides comprising phosphorothioate linkages by addition of water-soluble antioxidants
JP4580870B2 (ja) * 2003-09-02 2010-11-17 株式会社キラルジェン リボヌクレオチド又はリボヌクレオチド誘導体の製造方法
KR101281836B1 (ko) 2004-08-26 2013-07-03 니뽄 신야쿠 가부시키가이샤 포스포라미다이트 화합물 및 올리고 ｒｎａ의 제조 방법
JP5317836B2 (ja) 2009-06-12 2013-10-16 住友精化株式会社 アルキルスルフィド化合物の製造方法
BR122020014853B8 (pt) 2011-08-25 2023-02-28 Bonac Corp Éter, e, método de produção de um éter
WO2018141908A1 (en) * 2017-02-03 2018-08-09 Gene Signal International Sa Sterile formulation comprising a stable phosphorothioate oligonucleotide
JP7280248B2 (ja) 2018-04-24 2023-05-23 住友化学株式会社 アミダイト化合物及び該化合物を用いたポリヌクレオチドの製造方法
JP7431498B2 (ja) 2018-11-02 2024-02-15 株式会社東海理化電機製作所 電子機器、およびフレキシブルプリント基板
CN113631564A (zh) * 2019-03-28 2021-11-09 味之素株式会社 具有硫代磷酸酯化部位的寡核苷酸的制造方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017068377A1 (en) 2015-10-23 2017-04-27 Silence Therapeutics (London) Ltd Modified guide rnas, methods and uses

Also Published As

Publication number Publication date
US20230192755A1 (en) 2023-06-22
JPWO2021210409A1 (ko) 2021-10-21
CN115397831A (zh) 2022-11-25
EP4137501A4 (en) 2024-05-22
WO2021210409A1 (ja) 2021-10-21
EP4137501A1 (en) 2023-02-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4731324B2 (ja) Ｎ−ｏ結合性架橋構造型新規人工核酸
JP3368352B2 (ja) オリゴヌクレオチド合成に有用な保護基
KR20220167282A (ko) 핵산 올리고머를 포함하는 조성물
NO303018B1 (no) AnalogifremgangsmÕte for fremstilling av terapeutisk aktive oligonukleotider
KR102190852B1 (ko) 변형된 커플링 프로토콜을 이용하는 올리고머 화합물의 제조 방법
FI115400B (fi) Menetelmä oligoribonukleotidi- ja ribotsyymianalogien valmistamiseksi, joissa on terminaaliset 3 &#39;-3&#39;- tai 5&#39;-5&#39;-sidokset
HUE033843T2 (en) Purification of triphosphorylated oligonucleotides using affinity markers
CN111684073B (zh) 核酸分子的制造方法
Umemoto et al. Oligoribonucleotide Synthesis by the use of 1-(2-cyanoethoxy) ethyl (CEE) as a 2′-hydroxy protecting group
WO2022009959A1 (ja) 核酸オリゴマーの製造方法
KR20220133878A (ko) 핵산 올리고머의 제조 방법
JP6828219B1 (ja) 核酸分子の製造方法
US20230322842A1 (en) Composition containing nucleic acid oligomer
Flür et al. Chemical synthesis of RNA with site-specific methylphosphonate modifications
EP4368627A1 (en) Composition containing nucleic acid oligomer
CN113474353A (zh) 5′位修饰核苷和使用其的核苷酸
WO2021210408A1 (ja) 核酸オリゴマーの製造方法
WO2021193954A1 (ja) 核酸オリゴマーの製造方法
Decuypere et al. Increased Affinity of 2′‐O‐(2‐Methoxyethyl)‐Modified Oligonucleotides to RNA through Conjugation of Spermine at Cytidines
KR20230074205A (ko) 핵산 올리고머의 제조 방법
US6054568A (en) Nucleobase oligomers
WO2023054350A1 (ja) 精製ジクロロ酢酸の製造方法
WO2024024873A1 (ja) チオ化溶液
KR20240082343A (ko) 정제 디클로로아세트산의 제조 방법
KR20220079832A (ko) 핵산 올리고머의 제조 방법