WO2023182274A1 - 核酸オリゴマーの製造方法 - Google Patents

核酸オリゴマーの製造方法 Download PDF

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WO2023182274A1
WO2023182274A1 PCT/JP2023/010891 JP2023010891W WO2023182274A1 WO 2023182274 A1 WO2023182274 A1 WO 2023182274A1 JP 2023010891 W JP2023010891 W JP 2023010891W WO 2023182274 A1 WO2023182274 A1 WO 2023182274A1
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WO
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group
formula
oligonucleotide
nucleic acid
manufacturing
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PCT/JP2023/010891
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English (en)
French (fr)
Inventor
卓也 宮川
Original Assignee
住友化学株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a nucleic acid oligomer containing ribose, and more particularly to a method for deprotecting a hydroxyl protecting group of ribose contained in a nucleic acid oligomer.
  • nucleic acid oligomers include antisense nucleic acids, aptamers, ribozymes, and nucleic acids that induce RNA interference (RNAi) such as siRNA, and these are called nucleic acid drugs.
  • RNAi RNA interference
  • Nucleic acid oligomers can be synthesized by solid phase synthesis, in which nucleoside phosphoramidites (hereinafter referred to as "amidites") are used as raw materials.
  • a nucleic acid oligomer synthesized by elongating a nucleic acid on a solid phase carrier is excised from the solid phase carrier, and then the ribose-containing nucleic acid oligomer is removed by deprotecting the hydroxyl group at the 2' position of the ribose. , the desired nucleic acid oligomer has been produced.
  • the purity of the nucleic acid oligomers synthesized in this way is determined by the multi-step process including the elongation reaction of the nucleic acid on a solid support, the cutting out process from the solid support, and the deprotection process of each protecting group. It was not always satisfactory and the synthesis was not efficient (Patent Documents 1 and 2).
  • An object of the present invention is to provide an efficient method for producing nucleic acid oligomers.
  • the present inventors have discovered that by contacting a nucleic acid oligomer with fluoride ions in the presence of a radical reaction inhibitor, the hydroxyl group of ribose contained in the nucleic acid oligomer can be removed.
  • protecting groups can be efficiently deprotected.
  • an efficient method for producing nucleic acid oligomers can be provided.
  • the present invention has been completed based on these findings, and includes, but is not limited to, the following aspects.
  • G 4 represents a hydrogen atom or a hydroxyl group protecting group
  • G9 represents ammonium ion, alkylammonium ion, alkali metal ion, hydrogen ion or hydroxyalkylammonium ion
  • B c each independently represent the same or different nucleobases
  • R is each independently the same or different and represents a hydrogen atom, a fluorine atom or an OQ group
  • Q is each independently the same or different and represents a tert-butyldimethylsilyl group, a methyl group, a 2-methoxyethyl group, a methylene group bonded to the 4'-position carbon atom of ribose, or a tert-butyldimethylsilyl group, a methyl group, a 2-methoxyethyl group, a methylene group bonded to the 4'-position carbon atom of ribose, or a tert-butyldimethyl
  • ) represents a protecting group of Y is each independently the same or different and represents an oxygen atom or a sulfur atom, m represents any integer from 2 to 300, W and X are defined in either (a) or (b) below, (a) When W is a hydroxyl group, X has the same definition as the above R group. (b) When X is a hydroxyl group, W represents an OV group, V represents a tert-butyldimethylsilyl group or a group of the above formula (1). However, at least one group among R, W, and X represents a hydroxyl group protected with the protecting group of formula (1).
  • nucleic acid oligomers represented by formula (3) between the nucleotides at the 5' and 3' ends (where p is the formula: m-1>p It is a nucleic acid oligomer in which a non-nucleotide linker may be incorporated in place of the nucleotide (a positive integer that satisfies the above).
  • nucleic acid oligomers represented by formula (4) between the nucleotides at the 5' end and 3' end (where p is the formula: m-1>
  • a positive integer satisfying p) is a nucleic acid oligomer in which a non-nucleotide linker may be incorporated in place of the nucleotide.
  • a method for producing a nucleic acid oligomer represented by hereinafter referred to as "the production method of the present invention” or “the production method of the present embodiment” in this specification). 2. The manufacturing method according to item 1 above, wherein n in formula (1) is 0 or 1. 3. The manufacturing method according to item 1 above, wherein n in formula (1) is 0.
  • n in formula (1) is 1. 5.
  • the non-nucleotide linker is a linker consisting of an amino acid skeleton.
  • the linker consisting of an amino acid skeleton is a linker having a structure of the following formula (A14-1), (A14-2) or (A14-3). (In the formula, 5' and 3' indicate the 5' end and 3' end of the nucleic acid oligomer, respectively.) 7. 7.
  • the radical reaction inhibitor is a radical scavenger.
  • the radical scavenger is a phenolic antioxidant or a hindered amine light stabilizer.
  • the radical scavenger is a phenolic antioxidant.
  • the phenolic antioxidant is a compound represented by the following formula (8).
  • R 10 , R 11 , R 12 , and R 13 are the same or different and are a chain hydrocarbon group, a carbocyclyl group, a heterocyclyl group, an alkoxy group, an alkylsulfanyl group ⁇ the chain hydrocarbon group,
  • the carbocyclyl group, the heterocyclyl group, the alkoxy group, and the alkylsulfanyl group may have one or more substituents ⁇ , SiR 51 R 52 R 53 , amide group, C(O)R 61 , OC (O) R 61 represents a hydroxyl group or a hydrogen atom;
  • R 51 , R 52 and R 53 are the same or different and represent an alkyl group, an alkoxy group, or a hydrogen atom;
  • R 61 is a chain hydrocarbon (indicates the group) 15.
  • R 14 represents OC(O)R 20 , NHR 20 , or a hydrogen atom
  • R 19 represents an alkyl group, an alkoxy group, an oxygen free radical, a hydroxyl group, or a hydrogen atom
  • R 15 , R 16 , R 17 and R 18 are the same or different and represent an alkyl group or a hydrogen atom
  • R 20 is a chain hydrocarbon group, carbocyclyl group, heterocyclyl group, alkoxy group, alkylsulfanyl group ⁇ the chain formula
  • the hydrocarbon group, the carbocyclyl group, the heterocyclyl group, the alkoxy group, and the alkylsulfanyl group may have one or more substituents ⁇ , SiR 54 R 55 R 56 , amide group, hydroxyl group, or hydrogen
  • R 54 , R 55 and R 56 are the same or different and represent an alkyl group, an alkoxy group, or a hydrogen atom.
  • the radical reaction inhibitor is a peroxide decomposer. 18. 18. The manufacturing method according to item 17 above, wherein the peroxide decomposer is a phosphorus-based antioxidant or a sulfur-based antioxidant. 19. 18. The manufacturing method according to item 17, wherein the peroxide decomposer is a phosphorous antioxidant. 20. 18. The manufacturing method according to item 17 above, wherein the peroxide decomposer is a sulfur-based antioxidant. 21. 10. The production method according to any one of items 1 to 9 above, wherein the radical reaction inhibitor is a radical chain initiation inhibitor. 22. 22.
  • the manufacturing method according to item 21 above, wherein the radical chain initiation inhibitor is a metal deactivator or an ultraviolet absorber. 23. 22. The manufacturing method according to item 21 above, wherein the radical chain initiation inhibitor is a metal deactivator. 24. 22. The manufacturing method according to item 21 above, wherein the radical chain initiation inhibitor is an ultraviolet absorber. 25.
  • the amount of the radical reaction inhibitor to be used is the number of moles of the nucleic acid oligomer represented by formula (3) multiplied by the number in which R in formula (3) is a group represented by formula (1), 1 mole. 25.
  • the manufacturing method according to any one of items 1 to 24 above, wherein the amount is 9 mol or less. 26.
  • the present invention provides an efficient method for producing nucleic acid oligomers. It is expected that the purity of the produced nucleic acid oligomer will be improved.
  • a halogen atom means a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom.
  • a substituent is substituted with two or more halogen atoms or substituents, those halogen atoms or substituents may be the same or different.
  • the chain hydrocarbon group refers to an alkyl group, an alkenyl group, or an alkynyl group.
  • alkyl group examples include methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, 1,1-dimethylpropyl group, 1,2-dimethylpropyl group, 1-ethylpropyl group, butyl group, sec-butyl group, and isobutyl group. tert-butyl, pentyl, and hexyl groups.
  • alkenyl group examples include vinyl group, 1-propenyl group, 2-propenyl group, 1-methyl-1-propenyl group, 1-methyl-2-propenyl group, 1,2-dimethyl-1-propenyl group, -ethyl-2-propenyl group, 3-butenyl group, 4-pentenyl group, and 5-hexenyl group.
  • alkynyl group examples include ethynyl group, 1-propynyl group, 2-propynyl group, 1-methyl-2-propynyl group, 1,1-dimethyl-2-propynyl group, 1-ethyl-2-propynyl group, 2 -butynyl group, 4-pentynyl group, and 5-hexynyl group.
  • alkoxy group examples include methoxy group, ethoxy group, propoxy group, isopropoxy group, butoxy group, tert-butoxy group, pentyloxy group, hexyloxy group, and octyloxy group.
  • alkylsulfanyl group examples include a methylsulfinyl group, an ethylsulfinyl group, a propylsulfinyl group, an isopropylsulfinyl group, a butylsulfinyl group, a tert-butylsulfinyl group, a pentylsulfinyl group, a hexylsulfinyl group, and an octylsulfinyl group.
  • alkenyloxy group examples include 2-propenyloxy group, 2-butenyloxy group, and 5-hexenyloxy group.
  • alkynyloxy group examples include 2-propynyloxy group, 2-butynyloxy group, and 5-hexynyloxy group.
  • the carbocyclyl group refers to an aromatic carbocyclic group and an alicyclic hydrocarbon group. Examples of aromatic carbocyclic groups include phenyl and naphthyl groups.
  • the alicyclic hydrocarbon group refers to a cycloalkyl group, a cycloalkenyl group, and the like. Examples of the cycloalkyl group include a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, and a cycloheptyl group.
  • cycloalkenyl group examples include a cyclopropenyl group, a cyclobutenyl group, a cyclopentenyl group, a cyclohexenyl group, and a cycloheptenyl group.
  • heterocyclyl group means a cyclic group having one or more heteroatoms as ring constituent atoms, and includes an aromatic heterocyclic group and a non-aromatic heterocyclic group.
  • heterocyclyl group examples include pyrrolyl group, furyl group, thienyl group, pyrazolyl group, imidazolyl group, triazolyl group, tetrazolyl group, oxazolyl group, isoxazolyl group, thiazolyl group, isothiazolyl group, oxadiazolyl group, thiadiazolyl group, pyridyl group, and pyridazinyl group.
  • pyrimidinyl group pyrazinyl group, triazinyl group, tetrazinyl group, pyrrolidinyl group, imidazolinyl group, imidazolidinyl group, piperidinyl group, tetrahydropyrimidinyl group, hexahydropyrimidinyl group, piperazinyl group, oxazolidinyl group, isoxazolidinyl group, 1, Examples include 3-oxazinanyl group, morpholinyl group, thiazolidinyl group, isothiazolidinyl group, 1,3-thiazinanyl group, and thiomorpholinyl group.
  • the nucleic acid oligomer represented by the formula (3) is brought into contact with fluoride ions to obtain the nucleic acid oligomer represented by the formula (4) from which the protecting group of the following formula (1) has been deprotected.
  • the method of manufacturing will be explained.
  • n is any integer greater than or equal to 0, more preferably an integer of 0 to 3, more preferably an integer of 0 to 2, still more preferably 0 or 1, particularly preferably 1. be.
  • At least one group among R, W, and X in formula (3) represents a hydroxyl group protected with the protecting group of formula (1).
  • the proportion of formula (1) may be 1% or more, more preferably 5% or more, more preferably 10% or more, more preferably 20% or more, and more Preferably it is 30% or more, more preferably 40% or more, more preferably 50% or more, more preferably 60% or more, more preferably 70% or more, and even more preferably 80% or more. It is more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more.
  • the length of the nucleic acid chain to be synthesized is preferably 10 or more, more preferably 20 or more, more preferably 30 or more, and more preferably preferably has a chain length of 40 or more, and even more preferably has a chain length of 50 or more.
  • tetraalkylammonium fluoride is typically used as a fluoride ion source.
  • tetraalkylammonium fluoride include tetrabutylammonium fluoride and tetramethylammonium fluoride. Among them, tetrabutylammonium fluoride (TBAF) is more preferred.
  • the amount of fluoride ion used is usually 1 to 1000 mol, preferably 1 to 500, more preferably 2 to 200 mol, more preferably 4 to 100 mol per mol of protecting group removed.
  • radical reaction inhibitors examples include radical chain initiation inhibitors, radical scavengers, and peroxide decomposers.
  • radical chain initiation inhibitor examples include metal deactivators, ultraviolet absorbers, and quenchers.
  • metal deactivators include amide compounds, hydrazide compounds, etc. Specifically, n-octanohydrazide, succinic acid dihydrazide, 2-Hydroxy-N-1H-1,2,4-triazol- 3-ylbenzamide, N'1,N'12-Bis(2-hydroxybenzoyl)dodecanedihydrazide, N,N'-Bis[3-(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl)propionyl]hydrazine, or 1 , 3,5-Triazine-2,4,6-triamine, etc.
  • Examples of the ultraviolet absorber include triazole compounds, triazine compounds, and benzophenone compounds. Specifically, benzophenone, 2-(2H-Benzotriazol-2-yl)-4,6-bis(1- methyl-1-phenylethyl)phenol, 2-(2H-benzotriazol-2-yl)-4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol, 2,2'-Methylenebis[6-(2H-benzotriazol-2 -yl)-4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol], 2-(2H-Benzotriazol-2-yl)-p-cresol, 2-(5-chloro-2H-benzotriazol-2-yl )-6-tert-butyl-4-methylphenol, 2-(4,6-Diphenyl-1,3,5-triazin-2-yl)-5-[2-(2-ethylhexanoyloxy)ethoxy]phenol, 2, Examples include 4,6-tri
  • examples of the quencher include organic nickel compounds. Specifically, examples include bis(1,2-bis(2-methoxyphenyl)-1,2-ethylenedithiolat) nickel complex, Raney nickel, tetracarbonickel, NiX 2 (PR 3 ) [wherein, X is a halogen atom] and PR 3 represents a phosphine ligand (for example, a tertiary phosphine such as triphenylphosphine).
  • examples include bis(1,2-bis(2-methoxyphenyl)-1,2-ethylenedithiolat) nickel complex, Raney nickel, tetracarbonickel, NiX 2 (PR 3 ) [wherein, X is a halogen atom] and PR 3 represents a phosphine ligand (for example, a tertiary phosphine such as triphenylphosphine).
  • radical scavenger examples include phenolic antioxidants, hindered amine light stabilizers (HALS), and the like.
  • phenolic antioxidants include hindered phenol compounds, semi-hindered phenol compounds, and unhindered phenol compounds.
  • phenolic antioxidant examples include the following compounds, but any compound that is generally used as a phenolic antioxidant can be used in this embodiment.
  • a compound in which R 12 is a hydrogen atom in formula (8) can also be represented by the following formula (8a).
  • a compound in which R 11 is a hydrogen atom in formula (8) can also be represented by the following formula (8b).
  • R 10 is preferably a tert-butyl group, a sec-butyl group, or a methyl group
  • R 11 and R 12 are the same or different.
  • R 13 is preferably a tert-butyl group, a sec-butyl group, a methyl group, or a hydrogen atom
  • R 13 is preferably a tert-butyl group, a sec-butyl group, a methyl group, a hydroxyl group, or a hydrogen atom.
  • R 10 , R 11 , and R 12 are the same as those in formula (8), and R 10' , R 11' , R 12' , R 21 , R 22 , and R 23 are The same or different, a chain hydrocarbon group, a carbocyclyl group, a heterocyclyl group, an alkoxy group, an alkylsulfanyl group ⁇ the chain hydrocarbon group, the carbocyclyl group, the heterocyclyl group, the alkoxy group, the alkylsulfanyl group, may have one or more substituents ⁇ , SiR 51 R 52 R 53 , amide group, C(O)R 61 , OC(O)R 61 , hydroxyl group, or hydrogen atom, and R 24 is oxygen atom, sulfur atom, S(O), or S(O) 2 , R 25 represents an oxygen atom or a sulfur atom, and n 1 , n 2 ,
  • R 10 , R 11 , R 12 , R 10' , R 11' , R 12' , and n 1 are the same as those in the formula (13a)
  • R 10'' , R 11 " , R 12" , R 21' , R 22' , R 21" , and R 22" are the same or different and each represents a chain hydrocarbon group, a carbocyclyl group, a heterocyclyl group, an alkoxy group, an alkylsulfanyl group ⁇ the The chain hydrocarbon group, the carbocyclyl group, the heterocyclyl group, the alkoxy group, and the alkylsulfanyl group may have one or more substituents ⁇ , SiR 51 R 52 R 53 , amide group, C( O)R 61 , OC(O)R 61 represents a hydroxyl group, or a hydrogen atom, and n 1' and n 1'' each
  • 22'' , n 1 , n 1' , and n 1'' are the same as those in the formula (13c)
  • R 10'' , R 11'' , R 12'' , R 21''' , and R 22''' are the same or different and are a chain hydrocarbon group, a carbocyclyl group, a heterocyclyl group, an alkoxy group, an alkylsulfanyl group ⁇ the chain hydrocarbon group, the carbocyclyl group, the heterocyclyl group, the alkoxy group , the alkylsulfanyl group may have one or more substituents ⁇ , SiR 51 R 52 R 53 ,
  • 22'' , n 1 , n 1' , and n 1'' are the same as those in the formula (13c), and R 21'' , R 22'' , and R 23'' are the same or different.
  • a chain hydrocarbon group, a carbocyclyl group, a heterocyclyl group, an alkoxy group, an alkylsulfanyl group may have a substituent ⁇ , SiR 51 R 52 R 53 , amide group, C(O)R 61 , OC(O)R 61 , hydroxyl group, or hydrogen atom
  • substituents that the chain hydrocarbon group, carbocyclyl group, heterocyclyl group, alkoxy group, and alkylsulfanyl group may have include a halogen atom, a carbocyclyl group, a heterocyclyl group, a hydroxyl group, an amino group, Alkoxy group, sulfanyl group, alkylsulfanyl group, SiR 51 R 52 R 53 , O(SiR 51 R 52 R 53 ), C(O)R 61
  • the phenolic antioxidants include 2,6-di-tert-butyl-p-cresol, 4-sec-butyl-2,6-di-tert-butylphenol, and 6-tert-butyl-2 ,4-xylenol, 4,6-di-tert-butyl-m-cresol, 1,4-dihydroxybenzene, 2,6-Di-tert-butyl-4-ethylphenol, 4,4'-Dihydroxy-3,3 ',5,5'-tetraisopropylbiphenyl, 3-(3,5-Di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl)-N'-[3-(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl)propanoyl] propanehydrazide, Methyl 3-(3,5-Di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl)propionate, 2,2'-Methylenebis(6-tert-butyl-4-
  • HALS hindered amine light stabilizers
  • R 15 , R 16 , R 17 and R 18 are preferably methyl groups.
  • R 15 , R 16 , R 17 , R 18 , and R 19 are the same as those in formula (12) above, and R 19' is an alkyl group, an alkoxy group, an oxygen free radical, Represents a hydroxyl group or a hydrogen atom, and R 15' , R 16' , R 17' , R 18' , R 26 , R 27 , R 28 , and R 29 are the same or different and represent an alkyl group or a hydrogen atom.
  • n5 indicates any 0 or positive integer.
  • R 15 , R 16 , R 17 , R 18 , R 19 , R 15 ' , R 16' , R 17' , R 18' , R 19' , R 28 and R 29 are defined as above.
  • the definition is the same as in formula (12a), and R 30 , R 31 , R 32 , and R 33 are the same or different and represent an alkyl group or a hydrogen atom.
  • substituents that the chain hydrocarbon group, carbocyclyl group, heterocyclyl group, alkoxy group, and alkylsulfanyl group in R 20 may have include a halogen atom, a carbocyclyl group, a heterocyclyl group, a hydroxyl group, and an amino group.
  • alkoxy group, sulfanyl group, alkylsulfanyl group, SiR 54 R 55 R 56 , O(SiR 51 R 52 R 53 ), C(O)R 63 , OC(O)R 63 , and P(O)(OR 64 ) 2 can be mentioned.
  • R 63 represents a chain hydrocarbon group
  • R 62 represents a chain hydrocarbon group.
  • the alkyl groups in R 15 , R 16 , R 17 , R 18 , R 19 , R 15 ' , R 16' , R 17' , R 18' , R 26 , R 27 , R 28 , and R 29 are substituents.
  • an alkyl group, a hydroxyl group may have a substituent such as a phenyl group.
  • hindered amine light stabilizers include bis(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidyl) sebacate, 2,2,6,6-tetramethyl-4 methacrylate, -Piperidyl, or 2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl-free radical (TEMPO free radical), N,N'-Bis(2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl)hexane- 1,6-diamine, 2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl, Bis(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidyl-1-oxyl) Sebacate, Bis(1,2,2,6 ,6-pentamethyl-4-piperidyl) Sebacate, Bis(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidyl) Sebacate, 1,2,2,6,6-Pentamethyl-4-piperidyl Methacrylate, N 1 ,N 3 -Bis(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidy
  • peroxide decomposers include phosphorus-based antioxidants and sulfur-based antioxidants.
  • phosphorus antioxidants include phosphine compounds and phosphite compounds, and specifically, triphenylphosphine, triphenyl phosphite, 3,9-Bis(octadecyloxy)-2,4,8, 10-tetraoxa-3,9-diphosphaspiro[5.5]undecane, 3,9-Bis(2,6-di-tert-butyl-4-methylphenoxy)-2,4,8,10-tetraoxa-3,9-diphosphaspiro [5.5]undecane, 2,2'-Methylenebis(4,6-di-tert-butylphenyl) 2-ethylhexyl phosphite, Tris(2,4-ditert-butylphenyl) phosphite, Tris(nonylphenyl) phosphite, Tetra-C
  • sulfur-based antioxidants include sulfide-based compounds, and specifically, dioctadecyl sulfide, 2,2-Bis ⁇ [3-(dodecylthio)-1-oxopropoxy]methyl ⁇ propane-1,3- Examples include diyl bis[3-(dodecylthio)propionate] and Di(tridecyl) 3,3'-thiodipropionate.
  • the amount of the radical reaction inhibitor used is usually the number of moles obtained by multiplying the number of moles of the nucleic acid oligomer represented by formula (3) by the number in which R in formula (3) is a group represented by formula (1).
  • R in formula (3) is a group represented by formula (1) relative to the number of moles of the nucleic acid oligomer represented by formula (3).
  • R in formula (3) is a group represented by formula (1) relative to the number of moles of the nucleic acid oligomer represented by formula (3).
  • R in formula (3) is a group represented by formula (1) relative to the number of moles of the nucleic acid oligomer represented by formula (3).
  • organic solvents that are inert to the reaction are usually used, such as sulfoxide solvents, nitrile solvents, ether solvents, amide solvents, ketone solvents, aliphatic hydrocarbon solvents, ester solvents, aromatic Examples include solvents and mixed solvents of two or more of these, and among these solvents, sulfoxide solvents are preferred.
  • the sulfoxide solvent include dimethyl sulfoxide.
  • the nitrile solvent include acetonitrile and propionitrile.
  • the ether solvent include tetrahydrofuran.
  • the amide solvent include N-methyl-2-pyrrolidone and the like.
  • Examples of the ketone solvent include acetone and methyl ethyl ketone.
  • Examples of the aliphatic hydrocarbon solvent include hexane and heptane.
  • Examples of the ester solvent include methyl acetate and ethyl acetate.
  • Examples of the aromatic solvent include toluene and pyridine. Among these, dimethyl sulfoxide or a mixed solvent of dimethyl sulfoxide and acetonitrile is preferred.
  • the fluoride ion source which is a reagent used in the step of deprotecting the protecting group represented by formula (1), is usually used after being dissolved in a solvent and dehydrated.
  • the dehydrating agent include molecular sieves and sulfates, and preferably molecular sieve 4A is used.
  • the amount of solvent used is usually 5 to 8,000 L, preferably 50 to 2,000 L, and more preferably 100 to 1,600 L per mole of nucleic acid oligomer to be subjected to the deprotection step.
  • a compound that reacts with the compound represented by the following formula (2), which is a byproduct in this step, and captures the compound can be added.
  • the compound to be captured include nitroalkanes, alkylamines, amidines, thiols, thiol derivatives, or mixtures of two or more thereof.
  • nitroalkanes include nitromethane.
  • alkylamine include linear alkylamines having 1 to 6 carbon atoms and cyclic amines having 1 to 8 carbon atoms.
  • amidine include benzamidine and formamidine.
  • thiol include linear thiols having 1 to 6 carbon atoms. Specific examples include methanethiol, ethanethiol, 1-propanethiol, 1-butanethiol, 1-pentanethiol, and 1-hexanethiol.
  • the "thiol derivative” include alcohols or ethers having the same or different linear alkylthiol groups having 1 to 6 carbon atoms.
  • 2-mercaptoethanol 4-mercapto-1-butanol, 6-mercapto-1-hexanol, mercaptomethyl ether, 2-mercaptoethyl ether, 3-mercaptopropyl ether, 4-mercaptobutyl ether, 5 -mercaptopentyl ether, 6-mercaptohexyl ether, and the like. More preferably nitromethane is used.
  • the amount of the compound used to capture the by-product compound represented by formula (2) is 0.1 to 100.0 with respect to the fluoride ion source that deprotects the hydroxyl protecting group represented by formula (1). It can be used in mol%, preferably 1.0 to 50.0 mol%, more preferably 2.0 to 40.0 mol%.
  • fluoride ions may be added to the nucleic acid oligomer represented by formula (3), or conversely, fluoride ions may be reacted with
  • the nucleic acid oligomer shown in may be added, or both may be added at the same time.
  • a method of adding fluoride ions to the nucleic acid oligomer represented by formula (3) is preferred.
  • the time required to add the entire amount of fluoride ions to the nucleic acid oligomer represented by formula (3) is preferably 5 minutes or more, more preferably 10 minutes or more, more preferably 15 minutes or more, and even more preferably 30 minutes or more. More preferably, it is added dropwise over one hour or more.
  • Such addition is preferably carried out dropwise over 5 minutes or more, more preferably 10 minutes or more, and added dropwise over 15 minutes or more into the surface or into the solution containing the nucleic acid oligomer represented by formula (3). It is more preferable to drop the solution over a period of 30 minutes or more, and still more preferably to add it dropwise over a period of 1 hour or more.
  • the radical reaction inhibitor is preferably present in the reaction system before adding fluoride ions.
  • the temperature of both or one of the solutions when adding fluoride ions to the nucleic acid oligomer represented by formula (3) may be 80°C or lower, preferably both are 40°C or lower, and preferably both are 35°C or lower. More preferably, both are 30°C or lower, more preferably both are 25°C or lower, more preferably both are 20°C or lower, more preferably both are 15°C or lower, and more preferably both are 15°C or lower. Both are below 10°C, even more preferably both are below 5°C.
  • the mixture may be kept warm for 1 minute or more, preferably for 5 minutes or more, more preferably for 10 minutes or more, and more preferably for 15 minutes or more. It is kept warm for at least 30 minutes, more preferably for at least 30 minutes, and still more preferably for at least 1 hour.
  • the temperature may be raised, and the temperature may be raised to 5°C or more and 80°C or less, preferably 10°C or more and 40°C or less, and preferably 10°C or more and 35°C or less. , preferably from 15°C to 35°C, more preferably from 20°C to 35°C, even more preferably from 25°C to 35°C.
  • the time for the deprotection reaction varies depending on the type of deprotecting agent used and the reaction temperature, but is usually 1 hour to 100 hours, preferably 1 to 24 hours, more preferably 2 to 12 hours. More preferably, the time is 3 to 6 hours. Note that fluoride ions may be added at any timing.
  • stirring is usually performed at a stirring power Pv of 0.0 to 0.5 kW/ m3 , and when Pv is 0.1 to 0.3 kW/m3. Stirring of m 3 is preferred.
  • nucleic acid oligomers can be isolated by means such as precipitation of the nucleic acid oligomers used, dialysis, or ultrafiltration.
  • the isolated nucleic acid oligomer is usually obtained as a nucleic acid oligomer whose 5'-terminal hydroxyl group is protected.
  • the reaction for obtaining the nucleic acid oligomer represented by the following formula (4) by deprotecting the protecting group represented by the formula (1) from the nucleic acid oligomer represented by the formula (3) is as follows. (Scheme 1).
  • G 4 in the formula represents a hydrogen atom or a hydroxyl group protecting group
  • G9 represents ammonium ion, alkylammonium ion, alkali metal ion, hydrogen ion or hydroxyalkylammonium ion
  • B c each independently represent the same or different nucleobases
  • R is each independently the same or different and represents a hydrogen atom, a fluorine atom or an OQ group
  • Q is each independently the same or different and represents a tert-butyldimethylsilyl group, a methyl group, a 2-methoxyethyl group, a methylene group bonded to the carbon atom at the 4' position of ribose, or a 4' position of rib
  • Nucleosides (ribose and deoxyribose) contained in the nucleic acid oligomer used in this embodiment include DNA, RNA, 2'-O-MOE (2'-O-methoxyethyl), 2'-O-Me , 2'-F RNA, or the above-mentioned LNA, but the nucleoside is not limited thereto.
  • the nucleic acid oligomer represented by formula (3) can be obtained, for example, by cutting out the nucleic acid oligomer produced by solid phase synthesis represented by formula (5) from a solid phase carrier, as shown in Scheme 2 below.
  • the nucleic acid oligomer of formula (5) synthesized on a solid phase carrier will be explained.
  • the substituents B a each independently represent a nucleobase which may be the same or different protected.
  • G 4 and Y are as defined in the above formula (3), G 2 each independently represent the same or different phosphoric acid protecting groups;
  • X 1 represents OZ
  • W 1 represents an OV group
  • V represents a tert-butyldimethylsilyl group or a group of the above formula (1).
  • X 1 represents an R group
  • W 1 represents a group represented by OZ
  • Z represents a group consisting of a solid phase carrier and a linking part that connects the solid phase carrier and the oxygen atom of the hydroxyl group at the 2' position or 3' position of the ribose at the 3' end of the nucleic acid oligomer.
  • Z represents a structure schematically represented by the following formula (6).
  • Sp represents a spacer.
  • Examples of the spacer (Sp) include those having the structural formula shown in formula (7) below.
  • Linker represents a structure that becomes a linker (junction structure).
  • the structure of Linker is, for example, the following formula (8-1) (8-2) (8-3) (8-4) (8-5) (8-6) (8-7) or (8-8)
  • the structure shown in may be used.
  • Solid support indicates a structure that serves as a solid support.
  • the solid support include inorganic porous carriers and organic resin carriers.
  • Inorganic porous carriers include, for example, controlled pore glass (CPG) and zeolites.
  • organic resin carriers include carriers made of polystyrene.
  • A may each independently be a hydroxyl group, an alkoxy group, or an alkyl group.
  • alkoxy group include a methoxy group and an ethoxy group.
  • alkyl group include a methyl group, an ethyl group, Examples include isopropyl group and n-propyl group.Si indicates bonding with oxygen of hydroxyl group on the surface of the carrier.
  • G 4 represents a protecting group for a hydrogen atom or a hydroxyl group, and when it represents a protecting group, it represents the same protecting group as G 1 .
  • G 4 is a hydrogen atom when deprotected, and the nucleotide compound in that case is also subjected to a series of nucleic acid extension reaction steps.
  • G9 represents ammonium ion, alkylammonium ion, alkali metal ion, hydrogen ion, hydroxyalkylammonium ion, or the like.
  • alkyl moieties for the alkylammonium ion include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, dibutyl, isobutyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, and hexyl.
  • More specific examples include diethylammonium ion, triethylammonium ion, tetrabutylammonium ion, hexylammonium ion, and dibutylammonium ion.
  • examples of the alkali metal ions include sodium ions and lithium ions.
  • examples of hydroxyalkylammonium ion specific examples of hydroxyalkyl moieties include hydroxymethyl, hydroxyethyl, hydroxy-n-propyl, hydroxyisopropyl, hydroxy-n-butyl, or trishydroxymethyl.
  • more specific examples of hydroxyalkylammonium ions include trishydroxymethylammonium ions and the like.
  • the compound of formula (5) is produced, for example, by an amidite method using an amidite compound of formula (A13) below.
  • R represents a hydrogen atom, a fluorine atom, or an OQ group
  • Q is a tert-butyldimethylsilyl group, a methyl group, a 2-methoxyethyl group, a methylene group bonded to the 4' carbon atom, an ethylene group bonded to the 4' carbon atom, an ethylidene group bonded to the 4' carbon atom
  • B a represents an optionally protected nucleobase
  • G 1 represents a hydroxyl protecting group
  • G 2 represents a phosphoric acid protecting group
  • G 3 represents an alkyl group or a cyclic structure by bonding to each other at their terminals.
  • B a represents a nucleobase represented by B c or a nucleobase protected with a protecting group.
  • the nucleobase in B a is not particularly limited. Examples of the nucleobase include adenine, cytosine, guanine, uracil, thymine, 5-methylcytosine, pseudouracil, 1-methylpseudouracil, and the like. Further, the nucleobase may be substituted with a substituent.
  • substituents include halogen atoms such as fluoro, chloro, bromo, or iodo groups, acyl groups such as acetyl, alkyl groups such as methyl or ethyl, and arylalkyl such as benzyl. groups, alkoxy groups such as methoxy groups, alkoxyalkyl groups such as methoxyethyl groups, cyanoalkyl groups such as cyanoethyl groups, hydroxy groups, hydroxyalkyl groups, acyloxymethyl groups, amino groups, monoalkylamino groups, dialkylamino groups, carboxy group, a cyano group, a nitro group, and a combination of two or more of these substituents.
  • substituents include halogen atoms such as fluoro, chloro, bromo, or iodo groups, acyl groups such as acetyl, alkyl groups such as methyl or ethyl, and arylalky
  • the protecting group for the amino group is not particularly limited, and any protecting group used in known nucleic acid chemistry can be used, and such protecting groups include: For example, benzoyl group, 4-methoxybenzoyl group, acetyl group, propionyl group, butyryl group, isobutyryl group, phenylacetyl group, phenoxyacetyl group, 4-tert-butylphenoxyacetyl group, 4-isopropylphenoxyacetyl group, or (dimethyl Examples include amino)methylene groups, and combinations of two or more of these protecting groups.
  • R 4 represents a hydrogen atom, a methyl group, a phenoxyacetyl group, a 4-tert-butylphenoxyacetyl group, a 4-isopropylphenoxyacetyl group, a phenylacetyl group, an acetyl group, or a benzoyl group
  • R 5 represents a hydrogen atom, an acetyl group, an isobutyryl group, or a benzoyl group
  • R 6 represents a hydrogen atom, a phenoxyacetyl group, a 4-tert-butylphenoxyacetyl group, a 4-isopropylphenoxyacetyl group, a phenylacetyl group, an acetyl group, or an isobutyryl group
  • R 7 represents a 2-cyanoethyl group
  • R 8 represents a hydrogen atom, a methyl group, a benzoyl group, a 4-methoxybenzoyl group
  • G 1 can be used without particular limitation as long as it can function as a protecting group, and a wide variety of known protecting groups used in amidite compounds can be used.
  • G 1 is preferably the following group.
  • R 1 , R 2 and R 3 are the same or different and represent hydrogen or an alkoxy group.
  • R 1 , R 2 and R 3 is hydrogen, and the remaining two are the same or different (preferably the same) alkoxy groups, and the alkoxy group is particularly preferably a methoxy group.
  • G 2 can be used without particular limitation as long as it can function as a protecting group, and a wide variety of known protecting groups used in amidite compounds can be used.
  • Examples of G2 include an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, a cycloalkyl group, a haloalkyl group, an aryl group, a heteroaryl group, an arylalkyl group, a cycloalkenyl group, a cycloalkylalkyl group, a cyclylalkyl group, and a hydroxyalkyl group.
  • silyl group aminoalkyl group, alkoxyalkyl group, heterocyclylalkenyl group, heterocyclylalkyl group, heteroarylalkyl group, silyl group, silyloxyalkyl group, mono, dialkylsilyl group or trialkylsilyl group, or monoalkylsilyloxyalkyl group , dialkylsilyloxyalkyl group, or trialkylsilyloxyalkyl group, which may be substituted with one or more electron-withdrawing groups.
  • G 2 is preferably an alkyl group substituted with an electron-withdrawing group.
  • the electron-withdrawing group include a cyano group, a nitro group, an alkylsulfonyl group, a halogen atom, an arylsulfonyl group, a trihalomethyl group, or a trialkylamino group, and preferably a cyano group.
  • G 2 Particularly preferred as G 2 are the following groups.
  • G 3s may be bonded to each other to form a cyclic structure.
  • both are preferably isopropyl groups.
  • the alkyl group in the above definitions of R 1 , R 2 , R 3 and G 2 may be linear or branched, preferably having 1 to 12 carbon atoms, more preferably 1 to 6 carbon atoms.
  • Specific examples of alkyl groups include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, and hexyl.
  • the alkyl group moiety constituting the alkoxy group in the above definition has the same definition as the alkyl group herein.
  • nucleobase refers to a group having a natural or non-natural nucleobase skeleton.
  • the nucleobases also include modified forms in which the backbone of a natural or non-natural nucleobase is modified. More specific examples of the nucleobase represented by B C include the following structures.
  • R 4' represents a hydrogen atom or a methyl group
  • R 5' represents a hydrogen atom or an acetyl group
  • R 6' represents a hydrogen atom
  • R 8' represents a hydrogen atom or a methyl group.
  • non-nucleotide linkers that can be introduced in place of nucleotides.
  • non-nucleotide linkers include linkers consisting of amino acid skeletons (for example, linkers consisting of amino acid skeletons described in Japanese Patent No. 5157168 or Japanese Patent No. 5554881).
  • linkers consisting of amino acid skeletons for example, linkers consisting of amino acid skeletons described in Japanese Patent No. 5157168 or Japanese Patent No. 5554881.
  • the following formula (A14-1), (A14-2) or (14-3) for example, described in Japanese Patent No.
  • a linker represented by is exemplified.
  • linkers described in International Publication No. 2012/005368, International Publication No. 2018/182008, or International Publication No. 2019/074110 are exemplified.
  • Nucleotides and amidites in which the R group in formula (3) and the R' group in formula (4) are substituents other than hydroxyl groups can be prepared using known methods such as those described in Japanese Patent No. 3745226, and International Publication No. 2001/053528. It can also be produced from nucleosides synthesized by No. 2014-221817 or JP-A-2014-221817 and the known methods cited therein, and furthermore, by using commercially available nucleosides, It can be produced according to the methods described or by methods with appropriate modifications made to these methods.
  • Excision of a nucleic acid oligomer (hereinafter also referred to as oligonucleotide) from a solid phase support
  • the excision step was carried out using concentrated ammonia water as an excision agent for a nucleic acid oligomer of a desired chain length.
  • each step of a deprotection step, a condensation step, and an oxidation step is repeated according to a generally known method (for example, the method described in the above-mentioned Japanese Patent No. 5157168 or Japanese Patent No. 5554881). By doing this, a nucleic acid elongation reaction is performed.
  • nucleic acid elongation reaction refers to a reaction in which oligonucleotides are elongated by sequentially bonding nucleotides via phosphodiester bonds.
  • the nucleic acid elongation reaction can be carried out according to the general phosphoramidite method.
  • the nucleic acid elongation reaction may be performed using an automatic nucleic acid synthesizer or the like that employs the phosphoramidite method.
  • the chain length of the nucleic acid oligomer may be, for example, 2 to 200 mer, 10 to 150 mer, or 15 to 110 mer.
  • the 5' deprotection step is a step of deprotecting the protecting group of the 5' hydroxyl group at the end of the RNA chain supported on the solid phase support.
  • general protecting groups 4,4'-dimethoxytrityl group (DMTr group), 4-monomethoxytrityl group, and 4,4',4''-trimethoxytrityl group are used.
  • deprotecting acids include trifluoroacetic acid, dichloroacetic acid, trifluoromethanesulfonic acid, trichloroacetic acid, methanesulfonic acid, hydrochloric acid, acetic acid, and p-toluenesulfonic acid. .
  • the condensation step is a reaction in which a nucleoside phosphoramidite represented by formula (A13) is bonded to the 5' hydroxyl group at the end of the oligonucleotide chain deprotected in the deprotection step.
  • a nucleoside phosphoramidite represented by formula (A13) is bonded to the 5' hydroxyl group at the end of the oligonucleotide chain deprotected in the deprotection step.
  • an amidite compound represented by formula (A13) or (A12) is used as the phosphoramidite used for nucleic acid elongation.
  • nucleoside phosphoramidites include 2'-OMe, 2'-F, 2'-O-tert-butyldimethylsilyl group, 2'-O-methoxyethyl group, 2'-H, 2' -Fluoro-2'-deoxy- ⁇ -D-arabinofuranosyl and the like.
  • a protecting group eg, DMTr group
  • the condensation step can be carried out using an activator that activates the nucleoside phosphoramidite.
  • Examples of the activator include 5-(benzylthio)-1H-tetrazole (BTT), 1H-tetrazole, 4,5-dicyanoimidazole (DCI), 5-(ethylthio)-1H-tetrazole (ETT), N- Methylbenzimidazolium triflate (N-MeBIT), benzimidazolium triflate (BIT), N-phenylimidazolium triflate (N-PhIMT), imidazolium triflate (IMT), 5-nitrobenzimidazolium triflate (NBT), or Examples include 1-hydroxybenzotriazole (HOBT) and 5-(bis-3,5-trifluoromethylphenyl)-1H-tetrazole.
  • Capping can be performed using a known capping solution such as an acetic anhydride-tetrahydrofuran solution or a phenoxyacetic anhydride/N-methylimidazole solution.
  • the oxidation step is a step of converting the phosphorous acid group formed by the condensation step into a phosphoric acid group or a thiophosphoric acid group.
  • This step is a reaction that converts trivalent phosphorus into pentavalent phosphorus using an oxidizing agent, and can be carried out by allowing an oxidizing agent to act on the oligonucleic acid derivative supported on a solid phase support. .
  • the "oxidizing agent" is, for example, iodine, peracid such as tert-butyl hydroperoxide or hydrogen peroxide, or (1S)-(+)-( 10-camphorsulfonyl)-oxaziridine (CSO), or mixtures of two or more thereof can be used.
  • the oxidizing agent can be used after being diluted with an appropriate solvent to a concentration of 0.005 to 2M.
  • the solvent used in the reaction is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, but examples include pyridine, THF, water, acetonitrile, and any mixed solvent of two or more thereof.
  • iodine/water/pyridine/acetonitrile or iodine/water/pyridine, or iodine/water/pyridine/acetonitrile/NMI, or iodine/water/pyridine/THF, or iodine/water/pyridine/THF/NMI, or CSO /acetonitrile, or iodine/pyridine-acetic acid or peracid (tert-butyl hydroperoxide/methylene chloride)
  • iodine/pyridine-acetic acid or peracid tert-butyl hydroperoxide/methylene chloride
  • examples of the "oxidizing agent" include sulfur, 3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,1-dioxide (Beaucage reagent), 3-amino-1,2,4-dithiazol-5-thione (ADTT), 5-phenyl-3H-1,2,4-dithiazol-3-one (POS), [(N,N-dimethylaminomethylidene) )-3H-1,2,4-dithiazoline-3-thione (DDTT), phenylacetyl disulfide (PADS), etc.
  • sulfur 3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,1-dioxide
  • ADTT 3-amino-1,2,4-dithiazol-5-thione
  • POS 5-phenyl-3H-1,2,4-dithiazol-3-one
  • DDTT phenylacetyl disulfide
  • PADS phenylacetyl disulfide
  • the oxidizing agent can be used after being diluted with an appropriate solvent to a concentration of 0.01 to 2M.
  • the solvent used in the reaction is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, acetonitrile, pyridine, or any mixed solvent thereof.
  • the oxidation step may be performed after the capping operation, or conversely, the capping operation may be performed after the oxidation step, and the order is not limited.
  • amines are used to deprotect the protecting group of the phosphate moiety.
  • examples of amines include diethylamine described in Japanese Patent No. 4705716.
  • the protecting group for the 5' hydroxyl group of the nucleoside introduced at the end of elongation is used for column purification using the 5' protecting group as a tag after cleavage from the solid phase support and deprotection of the protecting group as described below. Alternatively, after column purification, the protecting group for the 5' hydroxyl group may be deprotected.
  • oligonucleotide chain is cleaved from the solid support and recovered.
  • amines include methylamine, ethylamine, propylamine, isopropylamine, ethylenediamine, and diethylamine.
  • Nucleic acid oligomers that can be produced using the production method of this embodiment include RNA, DNA, 2'-O-MOE, 2'-O-Me, and 2'-F in which the nucleosides contained in the nucleic acid oligomer are Examples include, but are not limited to, nucleic acid oligomers that are RNA or LNA.
  • nucleic acid oligomers that are RNA or LNA.
  • nucleic acid oligomers that can be used in the production method of this embodiment are shown below in addition to the examples described in Examples, but are not limited thereto.
  • U represents uridine
  • C represents cytidine
  • A represents adenosine
  • G represents guanosine.
  • nucleic acid oligomers having the following sequences (B) and (C) described in International Publication No. 2019/060442. Sequence (B): 5'-AUGGAAUmACUCUUGGUUmACdTdT-3' (Antisense) (SEQ ID NO: 3) 21mer Sequence (C): 5'-GUmAACmCmAAGAGUmAUmUmCmCmAUmdTdT-3' (Sense) (SEQ ID NO: 4) 21mer In sequences (B) and (C), Um represents 2'-O-methyluridine, Cm represents 2'-O-methylcytidine, and dT represents thymidine.
  • nucleic acid oligomers examples include the nucleic acid oligomers described in Daniel O'Reilly et al., Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No. 2, 546-558 (see page 553).
  • a typical example is a nucleic acid oligomer having the following sequence (D). Sequence (D): 5'-AGAGCCAGCCUUCUUAUUGUUUUAGAGCUAUGCUGU-3' (SEQ ID NO: 5) 36mer
  • nucleic acid oligomers described in Japanese Patent No. 4965745.
  • a typical example is a nucleic acid oligomer having the following sequence (E). Sequence (E): 5'-CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-P-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU-3' 49mer. This sequence consists of CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC (SEQ ID NO: 6) and GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU (SEQ ID NO: 7).
  • "P” is represented by a partial structure separated by a wavy line in the following formula (A5).
  • Nucleic acid oligomers having the following sequence (F) described in Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No. 2: 547 can be mentioned. Sequence (F): 5'-ACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3' (SEQ ID NO: 8) 67mer
  • nucleic acid oligomer having the following sequence (G) described in JP 2015-523856, page 173. Sequence (G): 5'-GUUUUCCCUUUUCAAAGAAAUCUCCUGGGCACCUAUCUUCUUAGGUGCCCUCCCUUGUUUAAAACCUGACCAGUUAACCGGCUGGUUAGGUUUU-3' (SEQ ID NO: 9) 94mer
  • nucleic acid oligomers described in JP 2017-537626 examples include nucleic acid oligomers having the following sequences (H), (J), (K), and (L). Sequence (H): 5'-AGUCCUCAUCUCCCUCAAGCGUUUUAGAGCUAGUAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3' (SEQ ID NO: 10) 100mer sequence (J): 5'-GCAGAUGUAGUGUUUCCACAGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCC GUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU-3' (SEQ ID NO: 11) 113mer Sequence (K): 5'-dAdGdTdCdCdTdCdTdCdCdTdCdCdAdGdAdG
  • sequence (I) consists of AGCAGAGUAC ACACAGCAUA UACC (SEQ ID NO: 1) and GGUAUAUGCU GUGUGUACUC UGCUUC (SEQ ID NO: 2) linked by the above "P".
  • CPG Controlled Pore Glass
  • AKTA oligopilot plus 100 manufactured by GE Healthcare
  • a nucleic acid synthesizer Using Controlled Pore Glass (CPG) as a solid phase carrier and AKTA oligopilot plus 100 (manufactured by GE Healthcare) as a nucleic acid synthesizer, the phosphoramidite solid phase synthesis method was used. An oligonucleotide consisting of the above sequence (I) was synthesized from the 3' side to the 5' side. Synthesis was performed on a 77.89 ⁇ mol scale.
  • uridine EMM amidite (A11) described in Example 2 of International Publication No. 2013/027843 cytidine EMM amidite (A9) described in Example 3
  • adenosine EMM amidite described in Example 4.
  • oligonucleotide (nucleic acid oligomer) manufactured by the manufacturing method of this embodiment.
  • the reaction was carried out under air (oxygen concentration 21%).
  • the oligonucleotides produced by the production method of this embodiment are oligonucleotides having the sequences (I) shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 above.
  • the guanosine derivative described in the following Examples and Comparative Examples means a compound represented by the following structural formula.
  • the circle illustrated in the structural formula below schematically represents CPG.
  • Example 1 of sequence (I) using CPG carrying 93.79 ⁇ mol of a guanosine derivative and an amidite represented by formula (A15), formula (A16), formula (A17), formula (A18), or formula (A12).
  • Solid phase synthesis was performed on an AKTA oligopilot plus100. Thereafter, the CPG carrier supporting 30.03 ⁇ mol of oligonucleotide was collected, and the oligonucleotide was released from the solid support using 10.15 g of ammonia water and 3.07 g of ethanol, and then the carrier was filtered to release the oligonucleotide. The filtrate containing the oligonucleotide was concentrated to dryness.
  • Example 2 of sequence (I) using CPG carrying 93.79 ⁇ mol of a guanosine derivative and an amidite represented by formula (A15), formula (A16), formula (A17), formula (A18), or formula (A12).
  • Solid phase synthesis was performed on an AKTA oligopilot plus100. Thereafter, the CPG carrier supporting 30.03 ⁇ mol of oligonucleotide was collected, and the oligonucleotide was released from the solid support using 10.15 g of ammonia water and 3.07 g of ethanol, and then the carrier was filtered to release the oligonucleotide. The filtrate containing the oligonucleotide was concentrated to dryness.
  • Example 7 of sequence (I) using CPG carrying 93.79 ⁇ mol of a guanosine derivative and an amidite shown in formula (A15), formula (A16), formula (A17), formula (A18), or formula (A12).
  • Solid phase synthesis was performed on an AKTA oligopilot plus100. Thereafter, the CPG carrier supporting 30.03 ⁇ mol of oligonucleotide was collected, and the oligonucleotide was released from the solid support using 10.15 g of ammonia water and 3.07 g of ethanol, and then the carrier was filtered to release the oligonucleotide. The filtrate containing the oligonucleotide was concentrated to dryness.
  • 6-tert-butyl-2,4-xylenol was added (the amount of 6-tert-butyl-2,4-xylenol was 0.9 mol per mol of protecting group), dissolved, and further molecular 0.76 g of a dimethyl sulfoxide solution of 1 M tetra-n-butylammonium fluoride (TBAF) (the amount of TBAF is 28.6 mol per 1 mol of protecting group), which has been dehydrated with sieve 4A, is introduced into the vortex mixer.
  • the 2'-cyanoethoxymethoxy (CEM) protecting group was removed by stirring the mixture uniformly and then keeping the mixture warm at 30° C. for 4 hours.
  • the crude product was obtained by a precipitation operation.
  • the yield was 4.1 mg and the purity was 56%.
  • the purity of the oligonucleotide was measured using the method described in measurement method 1 above, and the yield of oligonucleotide was measured using the method described in measurement method 2 above.
  • Example 9 of sequence (I) using CPG carrying 93.79 ⁇ mol of a guanosine derivative and an amidite represented by formula (A15), formula (A16), formula (A17), formula (A18), or formula (A12).
  • Solid phase synthesis was performed on an AKTA oligopilot plus100. Thereafter, the CPG carrier supporting 30.03 ⁇ mol of oligonucleotide was collected, and the oligonucleotide was released from the solid support using 10.15 g of ammonia water and 3.07 g of ethanol, and then the carrier was filtered to release the oligonucleotide. The filtrate containing the oligonucleotide was concentrated to dryness.
  • the yield was 4.3 mg and the purity was 52%.
  • the purity of the oligonucleotide was measured using the method described in measurement method 1 above, and the yield of oligonucleotide was measured using the method described in measurement method 2 above.
  • the yield was 4.3 mg and the purity was 54%.
  • the purity of the oligonucleotide was measured using the method described in measurement method 1 above, and the yield of oligonucleotide was measured using the method described in measurement method 2 above.
  • Example 15 of sequence (I) using CPG carrying 93.79 ⁇ mol of a guanosine derivative and an amidite represented by formula (A15), formula (A16), formula (A17), formula (A18), or formula (A12).
  • Solid phase synthesis was performed on an AKTA oligopilot plus100. Thereafter, the CPG carrier supporting 30.03 ⁇ mol of oligonucleotide was collected, and the oligonucleotide was released from the solid support using 10.15 g of ammonia water and 3.07 g of ethanol, and then the carrier was filtered to release the oligonucleotide. The filtrate containing the oligonucleotide was concentrated to dryness.
  • Example 16 of sequence (I) using CPG carrying 93.79 ⁇ mol of a guanosine derivative and an amidite represented by formula (A15), formula (A16), formula (A17), formula (A18), or formula (A12).
  • Solid phase synthesis was performed on an AKTA oligopilot plus100. Thereafter, the CPG carrier supporting 30.03 ⁇ mol of oligonucleotide was collected, and the oligonucleotide was released from the solid support using 10.15 g of ammonia water and 3.07 g of ethanol, and then the carrier was filtered to release the oligonucleotide. The filtrate containing the oligonucleotide was concentrated to dryness.
  • Example 17 of sequence (I) using CPG carrying 93.79 ⁇ mol of a guanosine derivative and an amidite represented by formula (A15), formula (A16), formula (A17), formula (A18), or formula (A12).
  • Solid phase synthesis was performed on an AKTA oligopilot plus100. Thereafter, the CPG carrier supporting 30.03 ⁇ mol of oligonucleotide was collected, and the oligonucleotide was released from the solid support using 10.15 g of ammonia water and 3.07 g of ethanol, and then the carrier was filtered to release the oligonucleotide. The filtrate containing the oligonucleotide was concentrated to dryness.
  • Example 18 of sequence (I) using CPG carrying 93.79 ⁇ mol of a guanosine derivative and an amidite shown in formula (A15), formula (A16), formula (A17), formula (A18), or formula (A12).
  • Solid phase synthesis was performed on an AKTA oligopilot plus100. Thereafter, the CPG carrier supporting 30.03 ⁇ mol of oligonucleotide was collected, and the oligonucleotide was released from the solid support using 10.15 g of ammonia water and 3.07 g of ethanol, and then the carrier was filtered to release the oligonucleotide. The filtrate containing the oligonucleotide was concentrated to dryness.
  • Example 20 of sequence (I) using CPG carrying 93.79 ⁇ mol of a guanosine derivative and an amidite represented by formula (A15), formula (A16), formula (A17), formula (A18), or formula (A12).
  • Solid phase synthesis was performed on an AKTA oligopilot plus100. Thereafter, the CPG carrier supporting 30.03 ⁇ mol of oligonucleotide was collected, and the oligonucleotide was released from the solid support using 10.15 g of ammonia water and 3.07 g of ethanol, and then the carrier was filtered to release the oligonucleotide. The filtrate containing the oligonucleotide was concentrated to dryness.
  • Example 21 of sequence (I) using CPG carrying 93.79 ⁇ mol of a guanosine derivative and an amidite represented by formula (A15), formula (A16), formula (A17), formula (A18), or formula (A12).
  • Solid phase synthesis was performed on an AKTA oligopilot plus100. Thereafter, the CPG carrier supporting 30.03 ⁇ mol of oligonucleotide was collected, and the oligonucleotide was released from the solid support using 10.15 g of ammonia water and 3.07 g of ethanol, and then the carrier was filtered to release the oligonucleotide. The filtrate containing the oligonucleotide was concentrated to dryness.
  • the 2'-cyanoethoxymethoxy (CEM) protecting group was removed by stirring uniformly with a vortex mixer and then keeping the mixture at 30° C. for 4 hours.
  • the crude product was obtained by a precipitation operation.
  • the yield was 4.1 mg and the purity was 48%.
  • the purity of the oligonucleotide was measured using the method described in measurement method 1 above, and the yield of oligonucleotide was measured using the method described in measurement method 2 above.
  • BHT 2,6-di-tert-butyl-p-cresol
  • the crude product was obtained by a precipitation operation.
  • the yield was 4.2 mg and the purity was 53%.
  • the purity of the oligonucleotide was measured using the method described in measurement method 1 above, and the yield of oligonucleotide was measured using the method described in measurement method 2 above.
  • BHT 2,6-di-tert-butyl-p-cresol
  • the crude product was obtained by a precipitation operation.
  • the yield was 4.0 mg and the purity was 53%.
  • the purity of the oligonucleotide was measured using the method described in measurement method 1 above, and the yield of oligonucleotide was measured using the method described in measurement method 2 above.
  • BHT 2,6-di-tert-butyl-p-cresol
  • the crude product was obtained by a precipitation operation.
  • the yield was 4.3 mg and the purity was 55%.
  • the purity of the oligonucleotide was measured using the method described in measurement method 1 above, and the yield of oligonucleotide was measured using the method described in measurement method 2 above.
  • BHT 2,6-di-tert-butyl-p-cresol
  • the crude product was obtained by a precipitation operation.
  • the yield was 4.4 mg and the purity was 55%.
  • the purity of the oligonucleotide was measured using the method described in measurement method 1 above, and the yield of oligonucleotide was measured using the method described in measurement method 2 above.
  • BHT 2,6-di-tert-butyl-p-cresol
  • the crude product was obtained by a precipitation operation.
  • the yield was 4.3 mg and the purity was 54%.
  • the purity of the oligonucleotide was measured using the method described in measurement method 1 above, and the yield of oligonucleotide was measured using the method described in measurement method 2 above.
  • the yield was 4.2 mg and the purity was 50%.
  • the purity of the oligonucleotide was measured using the method described in measurement method 1 above, and the yield of oligonucleotide was measured using the method described in measurement method 2 above.
  • Example 30 of sequence (I) using CPG carrying 93.86 ⁇ mol of a guanosine derivative and an amidite shown in formula (A8), formula (A9), formula (A10), formula (A11), or formula (A12).
  • Solid phase synthesis was performed on an AKTA oligopilot plus100. Thereafter, the CPG carrier supporting 30.02 ⁇ mol of oligonucleotide was collected, and the oligonucleotide was released from the solid support using 10.18 g of ammonia water and 3.03 g of ethanol, and then the carrier was filtered to release the oligonucleotide. The filtrate containing the oligonucleotide was concentrated to dryness.
  • the yield was 4.0 mg, and the purity was 52%.
  • the purity of the oligonucleotide was measured using the method described in measurement method 1 above, and the yield of oligonucleotide was measured using the method described in measurement method 2 above.
  • the crude product was obtained by a precipitation operation.
  • the yield was 4.1 mg and the purity was 49%.
  • the purity of the oligonucleotide was measured using the method described in measurement method 1 above, and the yield of oligonucleotide was measured using the method described in measurement method 2 above.
  • the crude product was obtained by a precipitation operation.
  • the yield was 4.2 mg, and the purity was 49%.
  • 4.7 mL of an aqueous solution containing the entire amount of the obtained crude product was purified by affinity chromatography.
  • the entire amount of the nucleic acid aqueous solution was applied to a commercially available affinity column (SkillPak Toyopearl AF-Chelate-650M, 1 mL, Tosoh Corporation), water was used as the mobile phase, and the flow rate was 0. 20 mL of liquid was fed at a rate of 6 mL/min.
  • the UV (260 nm) of the eluate could be confirmed by a monitor, and the entire amount of the portion in which eluted nucleic acid was observed was collected and concentrated by membrane filtration to obtain a purified nucleic acid.
  • the amount of the radical reaction inhibitor used is the value obtained by multiplying 1 mol of the compound supported on the solid phase carrier by the number in which R in formula (3) is a group represented by formula (1). means the amount used for.
  • nucleic acid oligomers can be efficiently produced.
  • SEQ ID NOS: 1 to 13 in the sequence listing represent the base sequences of oligonucleotides produced according to the production method of the present invention.

Abstract

本発明は、核酸オリゴマーの効率的な製造方法、とりわけ、ラジカル反応阻害剤の存在下で、特定の核酸オリゴマーを、フッ化物イオンと接触させることを特徴とする、核酸オリゴマーの製造方法を提供する。

Description

核酸オリゴマーの製造方法
　本特許出願は、日本国特許出願２０２２－０４７３４１号（２０２２年３月２３日出願）に基づくパリ条約上の優先権および利益を主張するものであり、ここに引用することによって、上記出願に記載された内容の全体が本明細書中に組み込まれるものとする。
　本発明は、リボースを含む核酸オリゴマーの製造方法に関するものであり、さらに詳しくは、核酸オリゴマーに含まれるリボースの水酸基の保護基の脱保護方法に関する。
　近年、核酸オリゴマーの医療分野への応用に関心が高まっている。例えば、アンチセンス核酸、アプタマー、リボザイム、およびｓｉＲＮＡなどのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導する核酸などが挙げられ、これらは核酸医薬品と呼ばれている。
　核酸オリゴマーは、固相合成法により合成可能であり、固相合成法ではヌクレオシドのホスホロアミダイト（以下、「アミダイト」と称する）が原料として用いられる。固相担体上で、核酸を伸長して合成された核酸オリゴマーは、固相担体から切り出し、次いで、リボースを含む核酸オリゴマーは、リボースの２’位の水酸基の保護基を脱保護して除いて、目的とする核酸オリゴマーが製造されている。このようにして合成された核酸オリゴマーの純度は、核酸の固相担体上での伸長反応工程、固相担体からの切り出し工程、各保護基の脱保護工程などの多段階の工程を経ているため必ずしも満足いくものではなく、合成は効率的ではなかった（特許文献１、２）。
国際公開第２００６／０２２３２３号公報 国際公開第２０１３／０２７８４３号公報
　本発明は、核酸オリゴマーの効率的な製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、核酸オリゴマーに、ラジカル反応阻害剤の存在下で、フッ化物イオンを接触させることにより、該核酸オリゴマーに含まれるリボースの水酸基の保護基を効率よく脱保護することができるという知見を得た。結果として、核酸オリゴマーの効率的な製造方法を提供することができる。
　本発明は、これら知見に基づき本発明を完成させたものであり、以下の態様を包含するが、これらに限定されるものではない。
１．　ラジカル反応阻害剤の存在下で、下記式（３）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （式中、
　Ｇ４は、水素原子または水酸基の保護基を表し、
　Ｇ９は、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、アルカリ金属イオン、水素イオンまたはヒドロキシアルキルアンモニウムイオンを表し、
　Ｂｃは、それぞれ独立して同一又は相異なる核酸塩基を表し、
　Ｒは、それぞれ独立して同一又は相異なって、水素原子、フッ素原子またはＯＱ基を表し、
　Ｑは、それぞれ独立して同一又は相異なって、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、メチル基、２－メトキシエチル基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基、または下記式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （式中、
　＊印のついた結合は、ＯＱ基の酸素原子との結合であることを表し、
　ｎは０以上の何れかの整数を表す。）
の保護基を表し、
　Ｙは、それぞれ独立して同一又は相異なって、酸素原子または硫黄原子を表し、
　ｍは、２以上３００までの何れかの整数を表し、
　ＷおよびＸは、下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかで定義され、
（ａ）Ｗが水酸基であるときは、Ｘは前記Ｒ基と同じ定義である。
（ｂ）Ｘが水酸基であるときは、ＷはＯＶ基を表し、
　Ｖは、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、または前記式（１）の基を表す。
　ただし、前記Ｒ、ＷおよびＸのうち少なくとも一つの基は、前記式（１）の保護基で保護された水酸基を表す。そして
　ｍが３以上の整数のとき、式（３）で示される核酸オリゴマーは、それぞれの５’末端と３’末端のヌクレオチドの間のｐ個（ただし、ｐは、式：ｍ－１＞ｐを満たす正の整数である。）のヌクレオチドの代わりに、非ヌクレオチドリンカーが組み込まれていてもよい核酸オリゴマーである。）
で示される核酸オリゴマーを、フッ化物イオンと接触させることを特徴とする、下記式（４）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 （式中、Ｒ’は、それぞれ独立して同一又は相異なって、水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、
　Ｑ’は、それぞれ独立して同一又は相異なって、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、または４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表し、
　式（４）の置換基Ｇ４、Ｇ９、Ｙ、Ｂｃおよびｍの定義は、前記式（３）における定義と同じであり、
　Ｗ０は、水酸基であり、
　Ｘ０は、前記Ｒ’基と同じ定義である。
　そして、ｍが３以上の整数のとき、式（４）で示される核酸オリゴマーは、それぞれの５’末端と３’末端のヌクレオチドの間のｐ個（ただし、ｐは、式：ｍ－１＞ｐを満たす正の整数である。）のヌクレオチドの代わりに、非ヌクレオチドリンカーが組み込まれていてもよい核酸オリゴマーである。）
で示される核酸オリゴマーの製造方法（以下、本明細書中、「本発明の製造方法」、「本実施形態の製造方法」と呼称する）。
２．　式（１）中のｎが０または１である、前項１に記載の製造方法。
３．　式（１）中のｎが０である、前項１に記載の製造方法。
４．　式（１）中のｎが１である、前項１に記載の製造方法。
５．　非ヌクレオチドリンカーが、アミノ酸骨格からなるリンカーである、前項１～４の何れか１項に記載の製造方法。
６．　アミノ酸骨格からなるリンカーが、下記式（Ａ１４－１）、（Ａ１４－２）または（Ａ１４－３）の構造を有するリンカーである、前項５に記載の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 （式中、５’および３’は、核酸オリゴマーの５’末端側および３’末端側をそれぞれ示す。）
７．　Ｗが水酸基であり、ＸがＲ基であり、Ｗ０が水酸基であり、そしてＸ０がＲ’基である、前項１～６の何れか１項に記載の製造方法。
８．　フッ化物イオン源が、フッ化テトラアルキルアンモニウムである、前項１～７の何れか１項に記載の製造方法。
９．フッ化物イオン源が、フッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウムである、前項１～８の何れか１項に記載の製造方法。
１０．　ラジカル反応阻害剤が、ラジカル連鎖開始阻止剤、ラジカル捕捉剤、又は過酸化物分解剤である、前項１～９の何れか１項に記載の製造方法。
１１．　ラジカル反応阻害剤が、ラジカル捕捉剤である、前項１～９の何れか１項に記載の製造方法。
１２．　ラジカル捕捉剤が、フェノール系酸化防止剤又はヒンダードアミン系光安定剤である、前項１１に記載の製造方法。
１３．　ラジカル捕捉剤が、フェノール系酸化防止剤である、前項１１に記載の製造方法。
１４．　フェノール系酸化防止剤が、下記式（８）で示される化合物である、前項１２又は１３に記載の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 （式中、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ１３は、同一又は相異なって、鎖式炭化水素基、カルボシクリル基、ヘテロシクリル基、アルコキシ基、アルキルスルファニル基｛該鎖式炭化水素基、該カルボシクリル基、該ヘテロシクリル基、該アルコキシ基、該アルキルスルファニル基は、１以上の置換基を有していてもよい｝、ＳｉＲ５１Ｒ５２Ｒ５３、アミド基、Ｃ（Ｏ）Ｒ６１、ＯＣ（Ｏ）Ｒ６１、水酸基、又は水素原子を示し、Ｒ５１、Ｒ５２及びＲ５３は、同一又は相異なって、アルキル基、アルコキシ基、又は水素原子を示し、Ｒ６１は、鎖式炭化水素基を示す。）
１５．　ラジカル捕捉剤が、ヒンダードアミン系光安定剤である、前項１２に記載の製造方法。
１６．　ヒンダードアミン系光安定剤が、式（１２）で示される化合物である、前項１２、１４、又は１５に記載の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 （式中、Ｒ１４は、ＯＣ（Ｏ）Ｒ２０、ＮＨＲ２０、又は水素原子を示し、Ｒ１９は、アルキル基、アルコキシ基、酸素フリーラジカル、水酸基、又は水素原子を示し、Ｒ１5、Ｒ１6、Ｒ１7、及びＲ１８は、同一又は相異なって、アルキル基又は水素原子を示し、Ｒ２０は、鎖式炭化水素基、カルボシクリル基、ヘテロシクリル基、アルコキシ基、アルキルスルファニル基｛該鎖式炭化水素基、該カルボシクリル基、該ヘテロシクリル基、該アルコキシ基、該アルキルスルファニル基は、１以上の置換基を有していてもよい｝、ＳｉＲ５４Ｒ５５Ｒ５６、アミド基、水酸基、又は水素原子を示し、Ｒ５４、Ｒ５５及びＲ５６は、同一又は相異なって、アルキル基、アルコキシ基、又は水素原子を示す。）
１７．　ラジカル反応阻害剤が、過酸化物分解剤である、前項１～９の何れか１項に記載の製造方法。
１８．　過酸化物分解剤が、リン系酸化防止剤又は硫黄系酸化防止剤である、前項１７に記載の製造方法。
１９．　過酸化物分解剤が、リン系酸化防止剤である、前項１７に記載の製造方法。
２０．　過酸化物分解剤が、硫黄系酸化防止剤である、前項１７に記載の製造方法。
２１．　ラジカル反応阻害剤が、ラジカル連鎖開始阻止剤である、前項１～９の何れか１項に記載の製造方法。
２２．　ラジカル連鎖開始阻害剤が、金属不活性化剤又は紫外線吸収剤である、前項２１に記載の製造方法。
２３．　ラジカル連鎖開始阻害剤が、金属不活性化剤である、前項２１に記載の製造方法。
２４．　ラジカル連鎖開始阻害剤が、紫外線吸収剤である、前項２１に記載の製造方法。２５．　ラジカル反応阻害剤の使用量が、式（３）で示される核酸オリゴマーのモル数に対して、式（３）におけるＲが式（１）で示される基である数を乗じたモル数１モルに対して、９モル以下である、前項１～２４の何れか１項に記載の製造方法。
２６．　式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が１０％以上であり、かつ、核酸鎖長が１０鎖長以上である、前項１～２５の何れか１項に記載の製造方法。
　本発明は、効率的な核酸オリゴマーの製造方法を提供する。製造される核酸オリゴマーの純度向上が期待できる。
　本発明を実施するための形態として、実施態様を示して説明するが、本発明は以下の態様に限定されるものではない。
　置換基について説明する。
　ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子を意味する。　置換基が２以上のハロゲン原子又は置換基で置換されている場合、それらのハロゲン原子又は置換基は、各々同一でも異なっていてもよい。
　鎖式炭化水素基とは、アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基を示す。
　アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、１，１－ジメチルプロピル基、１，２－ジメチルプロピル基、１－エチルプロピル基、ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、及びヘキシル基が挙げられる。
　アルケニル基としては、例えば、ビニル基、１－プロペニル基、２－プロペニル基、１－メチル－１－プロペニル基、１－メチル－２－プロペニル基、１，２－ジメチル－１－プロペニル基、１－エチル－２－プロペニル基、３－ブテニル基、４－ペンテニル基、及び５－ヘキセニル基が挙げられる。
　アルキニル基としては、例えば、エチニル基、１－プロピニル基、２－プロピニル基、１－メチル－２－プロピニル基、１，１－ジメチル－２－プロピニル基、１－エチル－２－プロピニル基、２－ブチニル基、４－ペンチニル基、及び５－ヘキシニル基が挙げられる。
　アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、及びオクチルオキシ基が挙げられる。
　アルキルスルファニル基としては、例えば、メチルスルフィニル基、エチルスルフィニル基、プロピルスルフィニル基、イソプロピルスルフィニル基、ブチルスルフィニル基、ｔｅｒｔ－ブチルスルフィニル基、ペンチルスルフィニル基、ヘキシルスルフィニル基、及びオクチルスルフィニル基が挙げられる。
　アルケニルオキシ基としては、例えば、２－プロぺニルオキシ基、２－ブテニルオキシ基、及び５－ヘキセニルオキシ基が挙げられる。
　アルキニルオキシ基としては、例えば、２－プロピニルオキシ基、２－ブチニルオキシ基、及び５－ヘキシニルオキシ基が挙げられる。
　カルボシクリル基とは、環芳香族炭素環基及び脂環式炭化水素基を示す。
　芳香族炭素環基としては、例えば、フェニル基及びナフチル基が挙げられる。
　脂環式炭化水素基とは、シクロアルキル基、シクロアルケニル基等を示す。
　シクロアルキル基としては、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、及びシクロヘプチル基が挙げられる。
　シクロアルケニル基としては、例えば、シクロプロペニル基、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基、及びシクロヘプテニル基が挙げられる。
　ヘテロシクリル基とは、１以上のヘテロ原子を環構成原子として有する環式基を意味し、芳香族複素環基及び非芳香族複素環基を示す。
　ヘテロシクリル基としては、例えば、ピロリル基、フリル基、チエニル基、ピラゾリル基、イミダゾリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、オキサジアゾリル基、チアジアゾリル基、ピリジル基、ピリダジニル基、ピリミジニル基、ピラジニル基、トリアジニル基、テトラジニル基、ピロリジニル基、イミダゾリニル基、イミダゾリジニル基、ピペリジニル基、テトラヒドロピリミジニル基、ヘキサヒドロピリミジニル基、ピペラジニル基、オキサゾリジニル基、イソオキサゾリジニル基、１，３－オキサジナニル基、モルホリニル基、チアゾリジニル基、イソチアゾリジニル基、１，３－チアジナニル基、及びチオモルホリニル基が挙げられる。
　以下、ラジカル反応阻害剤の存在下で、式（３）で示される核酸オリゴマーにフッ化物イオンを接触させ、下記式（１）の保護基が脱保護された式（４）で示される核酸オリゴマーを製造する方法について説明する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　式（１）において、ｎは、０以上のいずれかの整数であり、より好ましくは０～３の整数、より好ましくは、０～２の整数、更に好ましくは０又は１、特に好ましくは１である。
　式（３）のＲ、ＷおよびＸのうち少なくとも一つの基は、前記式（１）の保護基で保護された水酸基を表す。Ｒ、ＷおよびＸのうち、式（１）の割合は、１％以上でもよく、より好ましくは５％以上であり、より好ましくは１０％以上であり、より好ましくは２０％以上であり、より好ましくは３０％以上であり、より好ましくは４０％以上であり、より好ましくは５０％以上であり、より好ましくは６０％以上であり、より好ましくは７０％以上であり、より好ましくは８０％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、更により好ましくは９５％以上である。また、合成する核酸鎖長（塩基長、核酸の重合数、量体）は、１０鎖長以上が好ましく、より好ましくは２０鎖長以上が好ましく、より好ましくは３０鎖長以上が好ましく、より好ましくは４０鎖長以上が好ましく、更により好ましくは、５０鎖長以上である。
　この式（１）で示される保護基を脱保護する工程では、フッ化物イオン源として、典型的には、フッ化テトラアルキルアンモニウムが使用される。
　フッ化テトラアルキルアンモニウムとしては、テトラブチルアンモニウムフルオリド、又はテトラメチルアンモニウムフルオリド等が挙げられる。中でもテトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）がより好ましい。
　使用するフッ化物イオンの量は、通常、除去される保護基１モル当たり１～１０００モル、好ましくは１～５００、より好ましくは２～２００モル、より好ましくは４～１００モルである。
　ラジカル反応阻害剤としては、例えば、ラジカル連鎖開始阻止剤、ラジカル捕捉剤、又は過酸化物分解剤等が挙げられる。
　ラジカル連鎖開始阻止剤としては、例えば、金属不活性化剤、紫外線吸収剤、又はクエンチャー等が挙げられる。
　金属不活性化剤としては、アミド化合物、ヒドラジド系化合物等が挙げられ、具体的には、ｎ－オクタノヒドラジド、コハク酸ジヒドラジド、2-Hydroxy-N-1H-1,2,4-triazol-3-ylbenzamide、N'1,N'12-Bis(2-hydroxybenzoyl)dodecanedihydrazide、N,N'-Bis[3-(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl)propionyl]hydrazine、又は1,3,5-Triazine-2,4,6-triamine等が挙げられる。
　紫外線吸収剤としては、トリアゾール系化合物、トリアジン系化合物、又はベンゾフェノン系化合物等が挙げられ、具体的には、ベンゾフェノン、2-(2H-Benzotriazol-2-yl)-4,6-bis(1-methyl-1-phenylethyl)phenol、2-(2H-Benzotriazol-2-yl)-4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol、2,2'-Methylenebis[6-(2H-benzotriazol-2-yl)-4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol]、2-(2H-Benzotriazol-2-yl)-p-cresol、2-(5-chloro-2H-benzotriazol-2-yl)-6-tert-butyl-4-methylphenol、2-(4,6-Diphenyl-1,3,5-triazin-2-yl)-5-[2-(2-ethylhexanoyloxy)ethoxy]phenol、2,4,6-tris(2-hydroxy-4-hexyloxy-3-methylphenyl)-1,3,5-triazine、又は[2-hydroxy-4-(octyloxy)phenyl](phenyl)methanone等が挙げられる。
　クエンチャーとしては、有機ニッケル系化合物等が挙げられる。具体的には、ビス（１，２－ビス（２－メトキシフェニル）－１，２－エチレンジチオラト）ニッケル錯体、ラネーニッケル、テトラカルボニッケル、ＮｉＸ２（ＰＲ３）〔式中、Ｘはハロゲン原子を表し、ＰＲ３はホスフィン配位子（例えば、トリフェニルホスフィン等の三級ホスフィン）等を表す〕が挙げられる。
　ラジカル捕捉剤としては、フェノール系酸化防止剤、又はヒンダードアミン系光安定剤（Hindered Amine Light Stabilizers；ＨＡＬＳ）等が挙げられる。
　フェノール系酸化防止剤としては、ヒンダードフェノール系化合物、セミヒンダードフェノール系化合物、又はレスヒンダードフェノール系化合物等が挙げられる。
　フェノール系酸化防止剤としては、例えば、以下の化合物が挙げられるが、一般にフェノール系酸化防止剤として用いられるものであれば、本実施形態に用いることができる。
　下記式（８）で示される化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　式（８）においてＲ１２が水素原子である化合物は、下記式（８ａ）で示すこともできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　式（８）においてＲ１１が水素原子である化合物は、下記式（８ｂ）で示すこともできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　式（８）、式（８ａ）及び式（８ｂ）において、Ｒ１０は、好ましくは、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、又はメチル基であり、Ｒ１１及びＲ１２は、同一又は相異なって、好ましくは、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、メチル基、又は水素原子であり、Ｒ１３は、好ましくは、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、メチル基、水酸基、又は水素原子である。
　下記式（１３ａ）で示される化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 （式中、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２の定義は、式（８）における定義と同じであり、Ｒ１０‘、Ｒ１１’、Ｒ１２‘、Ｒ２１、Ｒ２２、及びＲ２３は、同一又は相異なって、鎖式炭化水素基、カルボシクリル基、ヘテロシクリル基、アルコキシ基、アルキルスルファニル基｛該鎖式炭化水素基、該カルボシクリル基、該ヘテロシクリル基、該アルコキシ基、該アルキルスルファニル基は、１以上の置換基を有していてもよい｝、ＳｉＲ５１Ｒ５２Ｒ５３、アミド基、Ｃ（Ｏ）Ｒ６１、ＯＣ（Ｏ）Ｒ６１、水酸基、又は水素原子を示し、Ｒ２４は酸素原子、硫黄原子、Ｓ（Ｏ）、又はＳ（Ｏ）２を示し、Ｒ２５は、酸素原子又は硫黄原子を示し、ｎ１、ｎ２、ｎ３、及びｎ４は、各々、任意の０若しくは正の整数を示し、［］内の（ＣＲ２１Ｒ２２）ｎ１、（ＮＲ２３）ｎ２、（Ｒ２４）ｎ３、及び（Ｃ＝Ｒ２５）ｎ４の並びは任意であり、それぞれが複数存在する場合、連続して存在していなくてもよい。）
　下記式（１３ｂ）で示される化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 （式中、記号の定義は、式（１３ａ）における定義と同じである。）
　下記式（１３ｃ）で示される化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 （式中、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１０‘、Ｒ１１’、Ｒ１２’、及びｎ１の定義は、前記式（１３a）における定義と同じであり、Ｒ１０”、Ｒ１１”、Ｒ１２”、Ｒ２１’、Ｒ２２‘、Ｒ２１”、及びＲ２２”は、同一又は相異なって、鎖式炭化水素基、カルボシクリル基、ヘテロシクリル基、アルコキシ基、アルキルスルファニル基｛該鎖式炭化水素基、該カルボシクリル基、該ヘテロシクリル基、該アルコキシ基、該アルキルスルファニル基は、１以上の置換基を有していてもよい｝、ＳｉＲ５１Ｒ５２Ｒ５３、アミド基、Ｃ（Ｏ）Ｒ６１、ＯＣ（Ｏ）Ｒ６１、水酸基、又は水素原子を示し、ｎ１’及びｎ１”は、各々、任意の０若しくは正の整数を示す。）
　下記式（１３ｄ）で示される化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 （式中、記号の定義は、式（１３ｃ）における定義と同じである。）
　下記式（１３ｅ）で示される化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 （式中、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１０‘、Ｒ１１’、Ｒ１２’ 、Ｒ１０”、Ｒ１１”、Ｒ１２”、Ｒ２１’、Ｒ２２‘、Ｒ２１”、Ｒ２２”、ｎ１、ｎ１’、及びｎ１”の定義は、前記式（１３ｃ）における定義と同じであり、Ｒ１０”’、Ｒ１１”’、Ｒ１２”’、Ｒ２１’”、及びＲ２２‘”は、同一又は相異なって、鎖式炭化水素基、カルボシクリル基、ヘテロシクリル基、アルコキシ基、アルキルスルファニル基｛該鎖式炭化水素基、該カルボシクリル基、該ヘテロシクリル基、該アルコキシ基、該アルキルスルファニル基は、１以上の置換基を有していてもよい｝、ＳｉＲ５１Ｒ５２Ｒ５３、アミド基、Ｃ（Ｏ）Ｒ６１、ＯＣ（Ｏ）Ｒ６１、水酸基、又は水素原子を示し、ｎ１”’は任意の０若しくは正の整数を示す。）
　下記式（１３ｆ）で示される化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 （式中、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１０‘、Ｒ１１’、Ｒ１２’、Ｒ１０”、Ｒ１１”、Ｒ１２”、Ｒ２１’、Ｒ２２‘、Ｒ２１”、Ｒ２２”、ｎ１、ｎ１’、及びｎ１”の定義は、前記式（１３ｃ）における定義と同じであり、Ｒ２１””、Ｒ２２””、及びＲ２３””は、同一又は相異なって、鎖式炭化水素基、カルボシクリル基、ヘテロシクリル基、アルコキシ基、アルキルスルファニル基｛該鎖式炭化水素基、該カルボシクリル基、該ヘテロシクリル基、該アルコキシ基、該アルキルスルファニル基は、１以上の置換基を有していてもよい｝、ＳｉＲ５１Ｒ５２Ｒ５３、アミド基、Ｃ（Ｏ）Ｒ６１、ＯＣ（Ｏ）Ｒ６１、水酸基、又は水素原子を示す。）
　Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１０‘、Ｒ１１’、Ｒ１２‘、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ１０”、Ｒ１１”、Ｒ１２”、Ｒ２１’、Ｒ２２‘、Ｒ２１”、Ｒ２２”、Ｒ１０”’、Ｒ１１”’、Ｒ１２”’、Ｒ２１’”、Ｒ２２‘”、Ｒ２１””、Ｒ２２””、及びＲ２３””における、鎖式炭化水素基、カルボシクリル基、ヘテロシクリル基、アルコキシ基、及びアルキルスルファニル基が有していてもよい置換基としては、例えば、ハロゲン原子、カルボシクリル基、ヘテロシクリル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基、スルファニル基、アルキルスルファニル基、ＳｉＲ５１Ｒ５２Ｒ５３、Ｏ（ＳｉＲ５１Ｒ５２Ｒ５３）、Ｃ（Ｏ）Ｒ６１、ＯＣ（Ｏ）Ｒ６１、及びＰ（Ｏ）（ＯＲ６２）２が挙げられる。ここで、Ｒ６２は、鎖式炭化水素基を示す。
　フェノール系酸化防止剤としては、具体的には、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール、4-sec-ブチル-2,6-ジ-tert-ブチルフェノール、6-tert-ブチル-2,4-キシレノール、4,6-ジ-tert-ブチル-m-クレゾール、1,4-ジヒドロキシベンゼン、2,6-Di-tert-butyl-4-ethylphenol、4,4'-Dihydroxy-3,3',5,5'-tetraisopropylbiphenyl、3-(3,5-Di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl)-N'-[3-(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl)propanoyl]propanehydrazide、Methyl 3-(3,5-Di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl)propionate、2,2'-Methylenebis(6-tert-butyl-4-ethylphenol)、2,2'-Methylenebis[6-(1-methylcyclohexyl)-p-cresol]、1,3,5-Tris(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxybenzyl)-1,3,5-triazinane-2,4,6-trione、2,5-Bis(1,1,3,3-tetramethylbutyl)hydroquinone、2,5-Di-tert-butylhydroquinone、4,4'-Butylidenebis(6-tert-butyl-m-cresol)、4-(Hexyloxy)-2,3,6-trimethylphenol、N,N'-(Hexane-1,6-diyl)bis[3-(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl)propanamide]、2,2',6,6'-Tetra-tert-butyl-4,4'-dihydroxybiphenyl、2,5-Di-tert-amylhydroquinone、2,4-Bis[(dodecylthio)methyl]-6-methylphenol、4-[[4,6-Bis(n-octylthio)-1,3,5-triazin-2-yl]amino]-2,6-di-tert-butylphenol、Galvinoxyl Free Radical、Pentaerythritol Tetrakis[3-(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl)propionate]、Hexadecyl 3,5-Di-tert-butyl-4-hydroxybenzoate、4,4'-Thiobis(6-tert-butyl-m-cresol)、3,3',5,5'-Tetra-tert-butyl-4,4'-stilbenequinone、2,4,6-Tris(3',5'-di-tert-butyl-4'-hydroxybenzyl)mesitylene、2,6-Di-tert-butyl-4-methoxyphenol、2,2'-Methylenebis(6-cyclohexyl-p-cresol)、[Oxalylbis(azanediyl)]bis(ethane-2,1-diyl) Bis[3-(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl)propanoate]、3,6-Dihydroxybenzonorbornane、2-Methyl-4,6-bis[(n-octylthio)methyl]phenol、2,6-Di-tert-butylphenol、2,4,8,10-Tetraoxaspiro[5.5]undecane-3,9-diylbis(2-methylpropane-2,1-diyl) Bis[3-[3-(tert-butyl)-4-hydroxy-5-methylphenyl]propanoate]、Diethyl 3,5-Di-tert-butyl-4-hydroxybenzylphosphonate、2,4,6-Tris(2,4-dihydroxyphenyl)-1,3,5-triazine、2-tert-Butyl-6-(3-tert-butyl-2-hydroxy-5-methylbenzyl)-4-methylphenyl Acrylate、Triethylene Glycol Bis[3-(3-tert-butyl-4-hydroxy-5-methylphenyl)propionate]、3-(3,5-Di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl)propionic Acid、Stearyl 3-(3,5-Di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl)propionate、4,6-Di-tert-butylresorcinol、1,3,5-tris(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxybenzyl)-1,3,5-triazine-2,4,6(1H,3H,5H)-trione、4,4',4''-(1-methylpropanyl-3-ylidene)tris(6-tert-butyl-m-cresol)、6,6'-di-tert-butyl-4,4'-butylidenedi-m-cresol、Octadecyl 3-(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl)propionate、Pentaerythritol tetrakis[3-(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl)propionate]、3,9-Bis{2-[3-(3-tert-butyl-4-hydroxy-5-methylphenyl)propionyloxy]-1,1-dimethylethyl}-2,4,8,10-tetraoxaspiro[5.5]undecane、又は1,3,5-tris(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenylmethyl)-2,4,6-trimethylbenzene等が挙げられる。
　ヒンダードアミン系光安定剤（ＨＡＬＳ）としては、例えば、以下の化合物が挙げられるが、一般にフェノール系酸化防止剤として用いられるものであれば、本実施形態に用いることができる
　下記式（１２）で示される化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 　式（１２）において、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、及びＲ１８は、好ましくはメチル基である。
　式（１２）において、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、及びＲ１８がメチル基である化合物は、下記式（１２Ａ）で示すこともできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　下記式（１２ａ）で示される化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 （式中、Ｒ１5、Ｒ１6、Ｒ１7、Ｒ１８、及びＲ１９の定義は、前記式（１２）における定義と同じであり、Ｒ１９‘は、アルキル基、アルコキシ基、酸素フリーラジカル、水酸基、又は水素原子を示し、Ｒ１5’、Ｒ１6‘、Ｒ１7’、Ｒ１８‘、Ｒ２６、Ｒ２７、Ｒ２８、及びＲ２９は、同一又は相異なって、アルキル基又は水素原子を示し、ｎ５は任意の０若しくは正の整数を示す。）
　下記式（１２ｂ）で示される化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 （式中、記号の定義は、前記式（１２ａ）における定義と同じである。）
　下記式（１２ｃ）で示される化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 （式中、Ｒ１5、Ｒ１6、Ｒ１7、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ１5’、Ｒ１6‘、Ｒ１7’、Ｒ１８‘、Ｒ１９‘、Ｒ２８、及びＲ２９の定義は、前記式（１２ａ）における定義と同じであり、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、及びＲ３３は、同一又は相異なって、アルキル基又は水素原子を示す。）
　Ｒ２０における、鎖式炭化水素基、カルボシクリル基、ヘテロシクリル基、アルコキシ基、及びアルキルスルファニル基が有していてもよい置換基としては、例えば、ハロゲン原子、カルボシクリル基、ヘテロシクリル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基、スルファニル基、アルキルスルファニル基、ＳｉＲ５４Ｒ５５Ｒ５６、Ｏ（ＳｉＲ５１Ｒ５２Ｒ５３）、Ｃ（Ｏ）Ｒ６３、ＯＣ（Ｏ）Ｒ６３、及びＰ（Ｏ）（ＯＲ６４）２が挙げられる。ここで、Ｒ６３は、鎖式炭化水素基を示し、Ｒ６２は、鎖式炭化水素基を示す。
　Ｒ１5、Ｒ１6、Ｒ１7、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ１5’、Ｒ１6‘、Ｒ１7’、Ｒ１８‘、Ｒ２６、Ｒ２７、Ｒ２８、及びＲ２９におけるアルキル基は、置換基（例えば、アルキル基、水酸基）を有していてもよいフェニル基等の置換基を有していてもよい。
　ヒンダードアミン系光安定剤（ＨＡＬＳ）としては、具体的には、セバシン酸ビス(2,2,6,6-テトラメチル-4-ピペリジル)、メタクリル酸2,2,6,6-テトラメチル-4-ピペリジル、又は2,2,6,6-テトラメチルピペリジン1-オキシル－フリーラジカル（ＴＥＭＰＯフリーラジカル）、N,N'-Bis(2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl)hexane-1,6-diamine、2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl、Bis(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidyl-1-oxyl) Sebacate、Bis(1,2,2,6,6-pentamethyl-4-piperidyl) Sebacate、Bis(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidyl) Sebacate、1,2,2,6,6-Pentamethyl-4-piperidyl Methacrylate、N1,N3-Bis(2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl)isophthalamide、Bis(1,2,2,6,6-pentamethyl-4-piperidyl) Butyl(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxybenzyl)malonate、2,2,6,6-Tetramethyl-4-piperidyl Methacrylate、Tetrakis(1,2,2,6,6-pentamethyl-4-piperidyl) butane-1,2,3,4-tetracarboxylate、Tetrakis(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidyl) butane-1,2,3,4-tetracarboxylate、1,2,3,4-Butanetetracarboxylic acid, tetramethyl ester, reaction products with 1,2,2,6,6-pentamethyl-4-piperidinol and β,β,β',β'-tetramethyl-2,4,8,10-tetraoxaspiro[5.5]undecane-3,9-diethanol、1,2,3,4-Butanetetracarboxylic acid, tetramethyl ester, reaction products with 2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinol and β,β,β',β'-tetramethyl-2,4,8,10-tetraoxaspiro[5.5]undecane-3,9-diethanol、Bis(1,2,2,6,6-pentamethyl-4-piperidyl) sebacate、Bis(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidyl) sebacate、Bis(1-undecanoxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl)carbonate、1,2,2,6,6-Pentamethyl-4-piperidyl methacrylate、2,2,6,6-Tetramethyl-4-piperidyl methacrylate、reaction mass of:2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl hexadecanoate2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl octadecanoate、又は2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl hexadecanoate2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl octadecanoate等が挙げられる。
　過酸化物分解剤としては、リン系酸化防止剤、又は硫黄系酸化防止剤が挙げられる。リン系酸化防止剤としては、ホスフィン化合物、又はホスファイト化合物等が挙げられ、具体的には、トリフェニルホスフィン、亜リン酸トリフェニル、3,9-Bis(octadecyloxy)-2,4,8,10-tetraoxa-3,9-diphosphaspiro[5.5]undecane、3,9-Bis(2,6-di-tert-butyl-4-methylphenoxy)-2,4,8,10-tetraoxa-3,9-diphosphaspiro[5.5]undecane、2,2'-Methylenebis(4,6-di-tert-butylphenyl) 2-ethylhexyl phosphite、Tris(2,4-ditert-butylphenyl) phosphite、Tris(nonylphenyl) phosphite、Tetra-C12-15-alkyl (propane-2,2-diylbis(4,1-phenylene)) bis(phosphite)、2-Ethylhexyl diphenyl phosphite、Isodecyl diphenyl phosphite、又はTriisodecyl phosphite等が挙げられる。　硫黄系酸化防止剤としては、スルフィド系化合物等が挙げられ、具体的には、ジオクタデシルスルフィド、2,2-Bis{[3-(dodecylthio)-1-oxopropoxy]methyl}propane-1,3-diyl bis[3-(dodecylthio)propionate]、又はDi(tridecyl) 3,3'-thiodipropionate等が挙げられる。
　ラジカル反応阻害剤の使用量は、通常、式（３）で示される核酸オリゴマーのモル数に対して、式（３）におけるＲが式（１）で示される基である数を乗じたモル数１モルに対して、１０モル以下、９モル以下、８モル以下、６モル以下、５モル以下、４モル以下、３モル以下、２モル以下、１．５モル以下、１．３モル以下、又は１．１モル以下であり、０．００１モル以上、０．０１モル以上、０．０５モル以上、０．１モル以上、又は０．５モル以上であり、好ましくは、０．０１～１０モル、０．０１～８モル、０．０５～８モル、０．０５～５モル、０．１～５モル、０．１～４モル、０．１～３モル、０．１～２モル、０．１～１．５モル、０．１～１．３モル、０．１～１．１モル、０．５～５モル、０．５～４モル、０．５～３モル、０．５～２モル、０．５～１．５モル、０．５～１．３モル、０．５～１．２モル、又は０．５～１．１モルである。
　ラジカル反応阻害剤がヒンダードアミン系光安定剤である場合、その使用量は、式（３）で示される核酸オリゴマーのモル数に対して、式（３）におけるＲが式（１）で示される基である数を乗じたモル数１モルに対して、好ましくは、５モル以下、４モル以下、３モル以下、２モル以下、１．５モル以下、１．３モル以下、又は１．１モル以下であり、０．００１モル以上、０．０１モル以上、０．０５モル以上、０．１モル以上、又は０．５モル以上であり、好ましくは、０．０１～５モル、０．１～５モル、０．１～４モル、０．１～３モル、０．１～２モル、０．１～１．５モル、０．１～１．３モル、０．１～１．１モル、０．５～５モル、０．５～４モル、０．５～３モル、０．５～２モル、０．５～１．５モル、０．５～１．３モル、０．５～１．２モル、又は０．５～１．１モルである。
　この工程では、通常、反応に不活性な有機溶媒が使用され、具体的には、例えば、スルホキシド溶媒、ニトリル溶媒、エーテル溶媒、アミド溶媒、ケトン溶媒、脂肪族炭化水素溶媒、エステル溶媒、芳香族溶媒、又はこれらの２種類以上の混合溶媒が挙げられ、これらの溶媒のうちスルホキシド溶媒が好ましい。スルホキシド溶媒としては、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。ニトリル溶媒としては、アセトニトリル、又はプロピオニトリル等が挙げられる。エーテル溶媒としては、テトラヒドロフラン等が挙げられる。アミド溶媒としては、Ｎ－メチル－２－ピロリドン等が挙げられる。ケトン溶媒としては、アセトン、又はメチルエチルケトン等が挙げられる。脂肪族炭化水素溶媒としては、ヘキサン、又はヘプタン等が挙げられる。エステル溶媒としては、酢酸メチル、又は酢酸エチル等が挙げられる。芳香族溶媒としては、トルエン、又はピリジン等が挙げられる。中でも、ジメチルスルホキシド、又はジメチルスルホキシドとアセトニトリルとの混合溶媒が好ましい。
　式（１）で示される保護基を脱保護する工程で使用される試薬であるフッ化物イオン源は、溶媒に溶解後、通常、脱水して使用する。脱水剤としてモレキュラーシーブ、又は硫酸塩などが挙げられ、好ましくはモレキュラーシーブ４Ａを使用する。
　使用する溶媒の量は、通常、脱保護工程に供される核酸オリゴマー１モル当たり、５～８，０００Ｌ、好ましくは５０～２，０００Ｌ、より好ましくは１００～１，６００Ｌである。
　必要であれば、本工程における副生成物である下記式（２）に示す化合物と反応して当該化合物を捕捉する化合物を添加することができる。該捕捉する化合物としては、例えば、ニトロアルカン、アルキルアミン、アミジン、チオール、チオール誘導体又はこれらの２種類以上の混合物を挙げることができる。「ニトロアルカン」としては、例えばニトロメタンを挙げることができる。「アルキルアミン」としては、例えば、直鎖状の炭素数１～６のアルキルアミン、および炭素数１～８の環状アミンを挙げることができる。具体的には、例えば、メチルアミン、エチルアミン、ｎ－プロピルアミン、ｎ－ブチルアミン、ｎ－ペンチルアミン、ｎ－ヘキシルアミン、モルホリン、又はピペリジン等を挙げることができる。「アミジン」としては、例えば、ベンズアミジン、又はホルムアミジン等を挙げることができる。「チオール」としては、例えば、直鎖状の炭素数１～６のチオールを挙げることができる。具体的には、例えば、メタンチオール、エタンチオール、１－プロパンチオール、１－ブタンチオール、１－ペンタンチオール、又は１－ヘキサンチオール等を挙げることができる。「チオール誘導体」としては、例えば、同一又は異なる直鎖状の炭素数１～６のアルキルチオール基を有するアルコール又はエーテル等を挙げることができる。具体的には、例えば、２－メルカプトエタノール、４－メルカプト－１－ブタノール、６－メルカプト－１－ヘキサノール、メルカプトメチルエーテル、２－メルカプトエチルエーテル、３－メルカプトプロピルエーテル、４－メルカプトブチルエーテル、５－メルカプトペンチルエーテル、又は６－メルカプトヘキシルエーテル等を挙げることができる。より好ましくはニトロメタンを使用する。
　式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　副生成物である式（２）に示す化合物を捕捉する化合物の使用量は、式（１）で示される水酸基の保護基を脱保護するフッ化物イオン源に対して０．１～１００．０モル％で用いることができ、好ましくは１．０～５０．０モル％、より好ましくは２．０～４０．０モル％である。
　式（３）で示される核酸オリゴマーとフッ化物イオンとの反応は、フッ化物イオンを式（３）で示される核酸オリゴマーに添加してもよいし、逆に、フッ化物イオンに式（３）で示される核酸オリゴマーを添加してもよいし、両者を同時に加えてもよい。フッ化物イオンを式（３）で示される核酸オリゴマーに添加する方法が好ましい。
　式（３）で示される核酸オリゴマーにフッ化物イオンの全量を添加するために要する時間は、５分以上が好ましく、１０分以上がより好ましく、１５分以上がより好ましく、３０分以上がより好ましく、更に好ましくは１時間以上かけて滴下することである。
　かかる添加は、式（３）で示される核酸オリゴマーを含む溶液の液表面または液中に５分以上かけて滴下することが好ましく、１０分以上かけて滴下することがより好ましく、１５分以上かけて滴下することがより好ましく、３０分以上かけて滴下することがより好ましく、更に好ましくは１時間以上かけて滴下することである。
　ラジカル反応阻害剤は、フッ化物イオンを添加する前に、反応系に存在することが好ましい。
　式（３）で示される核酸オリゴマーにフッ化物イオンを添加する際の両方または片方の溶液の温度は、８０℃以下でもよく、好ましくは両方とも４０℃以下であり、好ましくは両方とも３５℃以下であり、より好ましくは両方とも３０℃以下であり、より好ましくは両方とも２５℃以下であり、より好ましくは両方とも２０℃以下であり、より好ましくは両方とも１５℃以下であり、より好ましくは両方とも１０℃以下であり、更により好ましくは両方とも５℃以下である。
　式（３）で示される核酸オリゴマーにフッ化物イオンを添加終了後、１分以上保温してもよく、好ましくは５分以上保温であり、より好ましくは１０分以上保温であり、より好ましくは１５分以上保温であり、より好ましくは３０分以上保温であり、更により好ましくは１時間以上保温である。
　更に、保温後、昇温してもよく、５℃以上８０℃以下に昇温してもよく、好ましくは１０℃以上４０℃以下への昇温であり、好ましくは１０℃以上３５℃以下への昇温であり、好ましくは１５℃以上３５℃以下への昇温であり、より好ましくは２０℃以上３５℃以下への昇温であり、更に好ましくは２５℃以上３５℃以下への昇温である。
　更に昇温後、脱保護反応の時間は、使用する脱保護剤の種類、反応温度によって異なるが、通常、１時間～１００時間、好ましくは、１～２４時間、より好ましくは２～１２時間、更に好ましくは３～６時間である。
　尚、フッ化物イオンは、任意のタイミングで追加してもよい。
　保護基の脱保護反応時に反応系の攪拌は必須ではないが、通常、攪拌動力Ｐｖが０．０～０．５ｋＷ／ｍ３の範囲で攪拌を行い、Ｐｖが０．１～０．３ｋＷ／ｍ３の攪拌が好ましい。
　反応により生成した核酸オリゴマーの反応混合物からの分離精製手段は、通常の方法が採用され、例えば、抽出、濃縮、中和、濾過、遠心分離、再結晶、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親水性相互作用液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、沈殿（例えば、エタノール、イソプロパノール、メタノール若しくはポリエチレングリコールを用いた核酸オリゴマーの沈殿）、透析、又は限外ろ過などの手段を用いることにより、精製された核酸オリゴマーを単離することができる。単離された核酸オリゴマーは、通常、その５’末端の水酸基が保護された核酸オリゴマーとして得られる。
　式（３）で示される核酸オリゴマーから式（１）で示される保護基を脱保護することにより下記式（４）で示される核酸オリゴマーを得る反応は、以下のとおりである。（スキーム１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
 　ここで、式中のＧ４は、水素原子または水酸基の保護基を表し、
　Ｇ９は、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、アルカリ金属イオン、水素イオンまたはヒドロキシアルキルアンモニウムイオンを表し、
　Ｂｃは、それぞれ独立して同一又は相異なる核酸塩基を表し、
　Ｒは、それぞれ独立して同一又は相異なって、水素原子、フッ素原子またはＯＱ基を表し、
　Ｑは、それぞれ独立して同一又は相異なって、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、メチル基、２－メトキシエチル基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基、または下記式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
 （式中、
　＊印のついた結合は、ＯＱ基の酸素原子との結合であることを表し、
　ｎは０以上の何れかの整数を表す。）
の保護基を表し、
　Ｙは、それぞれ独立して同一又は相異なって、酸素原子または硫黄原子を表し、
　ｍは、２以上２００までの何れかの整数を表し、
　ＷおよびＸは、下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかで定義され、
（ａ）Ｗが水酸基であるときは、Ｘは前記Ｒ基と同じ定義である。
（ｂ）Ｘが水酸基であるときは、ＷはＯＶ基を表し、
　Ｖは、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、または前記式（１）の基を表す。
　ただし、前記Ｒ、ＷおよびＸのうち少なくとも一つの基は、前記式（１）の保護基で保護された水酸基を表す。そして
　ｍが３以上の整数のとき、式（３）で示される核酸オリゴマーは、それぞれの５’末端と３’末端のヌクレオチドの間のｐ個（ただし、ｐは、式：ｍ－１＞ｐを満たす正の整数である。）のヌクレオチドの代わりに、非ヌクレオチドリンカーが組み込まれていてもよい核酸オリゴマーである。）
　式（３）または式（４）において、Ｒが、ＯＱ基を表し、Ｒ’が、ＯＱ’基を表す際、リボースの構造は、下記式（ＬＮＡ－１）、（ＬＮＡ－２）または（ＬＮＡ－３）で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
 （式中、Ｂａｓｅは、核酸塩基を示す）
　本実施形態で使用される核酸オリゴマー内に含まれるヌクレオシド（リボース、およびデオキシリボース）としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、２’－Ｏ－ＭＯＥ（２’－Ｏ－メトキシエチル）、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｆ　ＲＮＡ、又は前記のＬＮＡが例示されるが、前記ヌクレオシドは、これらに限定されない。
　式（３）で表される核酸オリゴマーは、例えば、下記スキーム２に示すように、式（５）で示される固相合成により製造される核酸オリゴマーを固相担体から切り出して得られる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
　固相担体上で合成される式（５）の核酸オリゴマーについて説明する。
　置換基Ｂａは、それぞれ独立して同一又は相異なる保護されていてもよい核酸塩基を表す。
　Ｇ４およびＹは、前記の式（３）において定義されたとおりであり、
　Ｇ２は、それぞれ独立して同一又は相異なるリン酸の保護基を表し、
　Ｘ１がＯＺを表すとき、Ｗ１はＯＶ基を表し、
　Ｖは、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、または前記式（１）の基を表す。
　Ｘ１がＲ基を表すとき、Ｗ１はＯＺで表される基を表し、
　Ｚは、固相担体、および固相担体と核酸オリゴマーの３’末端のリボースの２’位もしくは３’位の水酸基の酸素原子とをつなぐ連結部からなる基を表す。
　より具体的には、Ｚは、下記式（６）で模式的に示される構造を表す。
　－［Ｓｐ］－［Ｌｉｎｋｅｒ］－［Ｓｏｌｉｄ　Ｓｕｐｐｏｒｔ］　・・・　（６）　ここで、式（６）において、Ｓｐは、スペーサーを表す。
　スペーサー（Ｓｐ）は、例えば、下記式（７）に示す構造式を有するものが例示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
　Ｌｉｎｋｅｒは、リンカー（接合構造）となる構造を表す。Ｌｉｎｋｅｒの構造は、例えば、下記式（８－１）（８－２）（８－３）（８－４）（８－５）（８－６）（８－７）又は（８－８）に示す構造でもよい。
　Ｓｏｌｉｄ　ｓｕｐｐｏｒｔは、固体の担体となる構造を示す。Ｓｏｌｉｄ　ｓｕｐｐｏｒｔとしては、無機多孔質担体や有機系樹脂担体などが挙げられる。無機多孔質担体には、例えば、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）およびゼオライトが挙げられる。有機系樹脂担体には、例えば、ポリスチレンからなる担体が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
 （式中、Ａは、それぞれ独立して水酸基、アルコキシ基、またはアルキル基であってもよい。アルコキシ基としては例えばメトキシ基およびエトキシ基が挙げられる。アルキル基としては例えばメチル基、エチル基、イソプロピル基、ｎ－プロピル基が挙げられる。Ｓｉは、担体表面の水酸基の酸素と結合していることを示す。）
　Ｇ４は、水素原子または水酸基の保護基を表し、保護基を表す場合はＧ１と同じ保護基を表す。Ｇ４は脱保護された場合には水素原子であるが、その場合のヌクレオチド化合物もまた、一連の核酸伸張反応の工程に供される。
　Ｇ９は、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、アルカリ金属イオン、水素イオン又はヒドロキシアルキルアンモニウムイオン等を表す。アルキルアンモニウムイオンとして、具体的なアルキル部分の例としては、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロビル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ジブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、又はヘキシル等が挙げられるが、より具体的には、例えば、ジエチルアンモニウムイオン、トリエチルアンモニウムイオン、テトラブチルアンモニウムイオン、ヘキシルアンモニウムイオン、又はジブチルアンモニウムイオンなどが挙げられる。また、アルカリ金属イオンとしては、例えば、ナトリウムイオン、又はリチウムイオン等が挙げられる。また、ヒドロキシアルキルアンモニウムイオンとして、具体的なヒドロキシアルキル部分の例としては、例えば、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシ－ｎ－プロピル、ヒドロキシイソプロピル、ヒドロキシ－ｎ－ブチル、又はトリスヒドロキシメチル等が挙げられるが、より具体的なヒドロキシアルキルアンモニウムイオンの例としては、トリスヒドロキシメチルアンモニウムイオン等などが挙げられる。
　前記式（５）の化合物は、例えば、下記式（Ａ１３）のアミダイト化合物を用いてアミダイト法により製造される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
 （式中、
　Ｒは、水素原子、フッ素原子、またはＯＱ基を表し、
　Ｑは、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、メチル基、２－メトキシエチル基、４’の炭素原子と結合したメチレン基、４’の炭素原子と結合したエチレン基、４’の炭素原子と結合したエチリデン基、または前記式（１）で示される保護基を表し、
　Ｂａは、保護されていてもよい核酸塩基を表し、
　Ｇ１は、水酸基の保護基を表し、
　Ｇ２は、リン酸の保護基を表し、
　Ｇ３は、アルキル基、または互いにその末端で結合して環状構造を表す。）
　Ｂａは、Ｂｃで表される核酸塩基または当該核酸塩基が保護基で保護された核酸塩基を表す。
　Ｂａにおける核酸塩基は、特に限定されない。当該核酸塩基としては、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、チミン、５－メチルシトシン、シュードウラシル、１－メチルシュードウラシルなどが挙げられる。また、核酸塩基は、置換基により置換されていてもよい。そのような置換基としては、例えば、フルオロ基、クロロ基ブロモ基、若しくはヨード基などのハロゲン原子、アセチル基などのアシル基、メチル基、若しくはエチル基などのアルキル基、ベンジル基などのアリールアルキル基、メトキシ基などのアルコキシ基、メトキシエチル基などのアルコキシアルキル基、シアノエチル基などのシアノアルキル基、ヒドロキシ基、ヒドロキシアルキル基、アシルオキシメチル基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルボキシ基、シアノ基、又はニトロ基など、並びにそれらの２種類以上の置換基の組み合わせが挙げられる。
　核酸塩基が環外にアミノ基を有する場合、当該アミノ基の保護基としては、特に限定されず、公知の核酸化学で用いられる保護基を使用することができ、そのような保護基としては、例えば、ベンゾイル基、４－メトキシベンゾイル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、フェニルアセチル基、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、又は（ジメチルアミノ）メチレン基など、並びにそれらの２種類以上の保護基の組み合わせが挙げられる。
　Ｂａは、より具体的には、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
（上記式中、
　Ｒ４は、水素原子、メチル基、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はベンゾイル基を表し、
　Ｒ５は、水素原子、アセチル基、イソブチリル基又はベンゾイル基を表し、
　Ｒ６は、水素原子、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はイソブチリル基を表し、
　Ｒ７は、２－シアノエチル基を表し、
　Ｒ８は、水素原子、メチル基、ベンゾイル基、４－メトキシベンゾイル基又は４－メチルベンゾイル基を表し、
　Ｒ９は、ジメチルアミノメチレン基を表す。）
のいずれかで表される基を表す。
　Ｇ１としては、保護基として機能し得るものであれば特に制限なく使用することができ、アミダイト化合物で使用される公知の保護基を広く使用することができる。
　Ｇ１としては、好ましくは、以下の基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
 （式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は同一又は相異なって水素又はアルコキシ基を表す。）
　Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、１つが水素であり、残りの２つが同一または相異なる（同一が好ましい）アルコキシ基であることが好ましく、アルコキシ基としてはメトキシ基が特に好ましい。
　Ｇ２としては、保護基として機能し得るものであれば特に制限なく使用することができ、アミダイト化合物で使用される公知の保護基を広く使用することができる。Ｇ２としては、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、ハロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、シクロアルケニル基、シクロアルキルアルキル基、シクリルアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、アルコキシアルキル基、ヘテロシクリルアルケニル基、ヘテロシクリルアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、シリル基、シリルオキシアルキル基、モノ、ジアルキルシリル基若しくはトリアルキルシリル基、又は、モノアルキルシリルオキシアルキル基、ジアルキルシリルオキシアルキル基若しくはトリアルキルシリルオキシアルキル基などが挙げられ、これらは１つ以上の電子求引基で置換されていてもよい。
　Ｇ２は、好ましくは、電子求引基で置換されたアルキル基である。当該電子求引基としては、例えば、シアノ基、ニトロ基、アルキルスルホニル基、ハロゲン原子、アリールスルホニル基、トリハロメチル基、又はトリアルキルアミノ基などが挙げられ、好ましくはシアノ基である。
　Ｇ２としては、特に好ましいのは、以下の基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
　Ｇ３は、２つのＧ３が互いに結合して環状構造を形成していてもよい。Ｇ３としては、両方がイソプロピル基であることが好ましい。
　前記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＧ２の定義におけるアルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状のいずれでもよく、好ましくは炭素数１～１２のアルキル基、より好ましくは炭素数１～６のアルキル基である。具体的なアルキル基の例としては、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロビル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、又はヘキシル等が挙げられる。前記置定義におけるアルコキシ基を構成するアルキル基部分は、ここでのアルキル基の定義と同じ定義を有する。
　本明細書においては、核酸塩基とは、天然型あるいは非天然型の核酸塩基骨格を有する基を意味する。前記核酸塩基は、天然型あるいは非天然型の核酸塩基骨格が修飾された修飾体も包含する。ＢＣで表される核酸塩基としては、より具体的には、以下の構造が例示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000071
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000074
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000075
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000076
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000077
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000078
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000079
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000080
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000081
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000082
（上記式中、
　Ｒ４’は、水素原子、またはメチル基を表し、
　Ｒ５’は、水素原子、またはアセチル基を表し、
　Ｒ６’は、水素原子を表し、
　Ｒ８’は、水素原子、メチル基を表す。）
　式（３）および式（４）の核酸オリゴマーの５’末端と３’末端のヌクレオチドの間のｐ個（ただし、ｐは、式：ｍ－１＞ｐを満たす正の整数である。）のヌクレオチドの代わりに、導入されうる非ヌクレオチドリンカーについて説明する。
　非ヌクレオチドリンカーとしては、アミノ酸骨格からなるリンカー（例えば、特許第５１５７１６８号公報または特許第５５５４８８１号公報に記載されたアミノ酸骨格からなるリンカー）が例示される。具体的には、非限定的な例として、例えば、下記式（Ａ１４－１）、（Ａ１４－２）または（１４－３）（例えば、特許第５５５５３４６号公報または特許第５８７６８９０号公報に記載）で表されるリンカーが例示される。これらのリンカー以外に国際公開第２０１２／００５３６８号公報、国際公開第２０１８／１８２００８号公報または国際公開第２０１９／０７４１１０号公報に記載のリンカーが例示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000083
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000084
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000085
　式（３）におけるＲ基および式（４）におけるＲ’基が、水酸基以外の置換基であるヌクレオチドおよびアミダイトは、特許第３７４５２２６号公報などに記載された公知の方法、国際公開第２００１／０５３５２８号公報あるいは特開２０１４－２２１８１７号公報およびそこに引用される公知の方法で合成されるヌクレオシドから製造することもでき、さらには、市販品として入手可能なものを用いて、後述する実施例に記載の方法に則して又はこれらの方法に適宜変更を加えた方法により製造することができる。
核酸オリゴマー（以下、オリゴヌクレオチドとも記す）の固相担体からの切り出し
　切り出し工程は、所望の鎖長の核酸オリゴマーを、切り出し剤として濃アンモニア水を用いて実施した。
　ホスホロアミダイト法では、一般的に公知の方法（例えば、前記の特許第５１５７１６８号公報または特許第５５５４８８１号公報に記載の方法）に従って、脱保護工程、縮合工程、及び酸化工程の各工程を繰り返し行うことにより、核酸伸長反応を行う。
（核酸伸長反応）
　本明細書において、「核酸伸長反応」とは、ホスホジエステル結合を介して、ヌクレオチドを順次結合させることにより、オリゴヌクレオチドを伸長させる反応を意味する。核酸伸長反応は、一般的なホスホロアミダイト法の手順に従い行うことができる。核酸伸長反応は、ホスホロアミダイト法を採用する核酸自動合成装置等を用いて行ってもよい。
　核酸オリゴマーの鎖長は、例えば、２～２００ｍｅｒや１０～１５０ｍｅｒ、１５～１１０ｍｅｒであってもよい。
　５’脱保護工程は、固相担体上に担持されるＲＮＡ鎖末端の５’ヒドロキシル基の保護基を脱保護する工程である。一般的な保護基としては、４，４’－ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ基）や４－モノメトキシトリチル基、４，４’，４”－トリメトキシトリチル基が用いられる。脱保護は、酸を用いて行うことができる。脱保護用の酸としては、例えば、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、塩酸、酢酸、又はｐ－トルエンスルホン酸等が挙げられる。
　縮合工程は、前記脱保護工程により脱保護したオリゴヌクレオチド鎖末端の５’ヒドロキシル基に対して、式（Ａ１３）で示されるヌクレオシドホスホロアミダイトを結合させる反応である。なお、核酸伸長に用いるホスホロアミダイトとしては、式（Ａ１３）または（Ａ１２）で示されるアミダイト化合物を用いる。また、他に使用可能なホスホロアミダイトとして、２’－ＯＭｅ、２’－Ｆ、２’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基，２’－Ｏ－メトキシエチル基，２’－Ｈ，２'－フルオロ－２’－デオキシ－β－Ｄ－アラビノフラノシル等が挙げられる。前記ヌクレオシドホスホロアミダイトとしては、５’ヒドロキシル基が保護基（例、ＤＭＴｒ基）で保護されたものを用いる。縮合工程は、前記ヌクレオシドホスホロアミダイトを活性化する活性化剤を用いて行うことができる。活性化剤としては、例えば、５－（ベンジルチオ）－１Ｈ－テトラゾール（ＢＴＴ）、１Ｈ－テトラゾール、４，５－ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）、５－（エチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）、Ｎ－メチルベンズイミダゾリウムトリフラート（Ｎ－ＭｅＢＩＴ）、ベンズイミダゾリウムトリフラート（ＢＩＴ）、Ｎ－フェニルイミダゾリウムトリフラート（Ｎ－ＰｈＩＭＴ）、イミダゾリウムトリフラート（ＩＭＴ）、５－ニトロベンズイミダゾリウムトリフラート（ＮＢＴ）、又は１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）又は５－（ビス－３，５－トリフルオロメチルフェニル）－１Ｈ－テトラゾール等が挙げられる。
　縮合工程の後は、適宜、未反応の５’ヒドロキシル基をキャッピングしてもよい。キャッピングは、無水酢酸－テトラヒドロフラン溶液、フェノキシ酢酸無水物／Ｎ－メチルイミダゾール溶液等の公知のキャッピング溶液を用いて行うことができる。
　酸化工程は、前記縮合工程により形成された亜リン酸基をリン酸基又はチオリン酸基に変換する工程である。本工程は、３価のリンから５価のリンに酸化剤を使用して変換する反応であり、固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に酸化剤を作用させることにより実施することができる。
　亜リン酸基をリン酸基に変換する場合には、「酸化剤」として、例えば、ヨウ素、あるいはｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシドや過酸化水素などの過酸、あるいは（１Ｓ）－（＋）－（１０－ｃａｍｐｈｏｒｓｕｌｆｏｎｙｌ）－ｏｘａｚｉｒｉｄｉｎｅ（ＣＳＯ）、またはこれらの２つ以上の混合物を使用することができる。該酸化剤は、０．００５～２Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することができる。反応に使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ピリジン、ＴＨＦ、水、アセトニトリル又はこれらの２つ以上の任意の混合溶媒を挙げることができる。例えば、ヨウ素／水／ピリジン／アセトニトリル、あるいはヨウ素／水／ピリジン、あるいはヨウ素／水／ピリジン／アセトニトリル／ＮＭＩ、あるいはヨウ素／水／ピリジン／ＴＨＦ、あるいはヨウ素／水／ピリジン／ＴＨＦ／ＮＭＩ、あるいはＣＳＯ／アセトニトリル、あるいはヨウ素／ピリジン－酢酸や過酸（ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド／メチレンクロリド）を用いることができる。
　亜リン酸トリエステル基をチオリン酸基に変換する場合には、「酸化剤」として、例えば、硫黄、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン－１，１－ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）、３－アミノ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオン（ＡＤＴＴ）、５－フェニル－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－オン（ＰＯＳ）、［（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾリン－３－チオン（ＤＤＴＴ）、又はフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）等を使用することができる。該酸化剤は、０．０１～２Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することができる。反応に使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、ピリジン又はこれらの任意の混合溶媒が挙げられる。酸化工程は、前記キャッピング操作の後で行ってもよいし、逆に、酸化工程の後でキャッピング操作を行ってもよいし、この順序は限定されない。
　リン酸保護基を脱保護する工程は、所望の配列を有する核酸の合成が完了した後は、リン酸部分の保護基を脱保護するためにアミン類を作用させる。アミン類としては、例えば、特許第４７０５７１６号公報に記載されるジエチルアミン等が挙げられる。
　伸長の最後に導入したヌクレオシドの５’ヒドロキシル基の保護基は、後述の固相担体からの切り出し及び保護基の脱保護の後、５’保護基をタグとするカラム精製のために使用してもよく、カラム精製後、５’ヒドロキシル基の保護基を脱保護してもよい。
　更にアンモニア水又はアミン類等を用いて、例えば、前記スキーム２で示されるように固相担体からオリゴヌクレオチド鎖を切断して回収する。アミン類としては、例えば、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、エチレンジアミン、又はジエチルアミン等が挙げられる。
　本実施形態の製造方法を用いて製造可能な核酸オリゴマーとしては、核酸オリゴマー内に含まれるヌクレオシドが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、並びに２’－Ｏ－ＭＯＥ、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｆを有するＲＮＡ、又はＬＮＡである核酸オリゴマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　例えば、Xiulong, Shenら著、Nucleic Acids Research, 2018, Vol. 46, No.46, 1584-1600、又はDaniel O'Reillyら著、Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No.2, 546-558に記載された、様々なヌクレオシドの例が挙げられる。
　本実施形態の製造方法において使用可能な核酸オリゴマーの典型的な例を、実施例に記載の例に加えて下記の例を示すが、これらに限定されるものではない。
　以下、配列の説明中、Ｕはウリジンを、Ｃはシチジンを、Ａはアデノシンを、Ｇはグアノシンを示す。
　国際公開第２０１９／０６０４４２号に記載されている、下記の配列（Ｂ）および（Ｃ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｂ）：５’－AUGGAAUmACUCUUGGUUmACdTdT－３’（Antisense）（配列番号３）　２１ｍｅｒ
配列（Ｃ）：５’－GUmAACmCmAAGAGUmAUmUmCmCmAUmdTdT－３’（Sense）（配列番号４）　２１ｍｅｒ
　配列（Ｂ）および（Ｃ）中、Umは2'-O-メチルウリジンを、Cmは2'-O-メチルシチジンを、またdTはチミジンを示す。
　Daniel O'Reillyら著、Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No.2, 546-558に記載されている核酸オリゴマー（553頁参照）が挙げられる。典型例として、下記の配列（Ｄ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｄ）：５’－AGAGCCAGCCUUCUUAUUGUUUUAGAGCUAUGCUGU－３’（配列番号５）　３６ｍｅｒ
　特許第４９６５７４５号公報に記載されている核酸オリゴマーが挙げられる。典型例として、下記の配列（Ｅ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｅ）：５’－CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-P-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU－３’　４９ｍｅｒ。この配列はCCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC（配列番号６）、GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU（配列番号７）よりなる。
　配列（Ｅ）中、”Ｐ”は、以下の式（Ａ５）において波線で区切られる部分構造で示される。
　Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No. 2: 547に記載されている、下記の配列（Ｆ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｆ）：５’－ACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU－３’（配列番号８）　６７ｍｅｒ
　ＪＰ　２０１５－５２３８５６, １７３頁に記載されている、下記の配列（Ｇ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｇ）：５’－GUUUUCCCUUUUCAAAGAAAUCUCCUGGGCACCUAUCUUCUUAGGUGCCCUCCCUUGUUUAAACCUGACCAGUUAACCGGCUGGUUAGGUUUUU－３’（配列番号９）　９４ｍｅｒ
　ＪＰ　２０１７－５３７６２６に記載されている核酸オリゴマーが挙げられる。典型例として、下記の配列（Ｈ）、（Ｊ）、（Ｋ）、（Ｌ）を有する核酸オリゴマーを挙げられる。
配列（Ｈ）：５’－AGUCCUCAUCUCCCUCAAGCGUUUUAGAGCUAGUAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU－３’（配列番号１０）　１００ｍｅｒ配列（Ｊ）：５’－GCAGAUGUAGUGUUUCCACAGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU－３’（配列番号１１）　１１３ｍｅｒ
配列（Ｋ）：５’－dAdGdTdCdCdTdCdAdTdCdTdCdCdCdTdCdAdAdGdCGUUUAAGAGCUAUGCUGGUAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU －３’（配列番号１２）　１１３ｍｅｒ
　配列（Ｋ）中、dTはチミジンを、dCは2'-デオキシシチジンを、dAは2'-デオキシアデノシンを、またdGは2'-デオキシグアノシンを示す。
配列（Ｌ）：５’－AmsGmsUmsCCUCAUCUCCCUCAAGCGUUUAAGAGCUAUGCUGGUAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUmsUmsUmsU－３’（配列番号１３）　１１３ｍｅｒ
　配列（Ｌ）中、Umは2'-O-メチルウリジンを、Amは2'-O-メチルアデノシンを、Gmは2'-O-メチルグアノシンを、またはホスホロチオエート修飾を示す。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
（測定方法）
　以下の試験で用いた各測定方法を以下に示す。
（測定方法１：オリゴヌクレオチドの純度の測定方法）
　固相合成後のオリゴヌクレオチド粗生成物の純度の測定は、ＨＰＬＣにより行った。粗生成物をＨＰＬＣ（波長：２６０ｎｍ、カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ＢＥＨ　Ｃ１８，　２．１ｍｍ×１００ｍｍ，　１．７μｍ（Ｗａｔｅｒｓ製））によって各成分に分離し、得られたクロマトグラムの総面積値における主生成物の面積値からオリゴヌクレオチドの純度を算出した。
　ＨＰＬＣ測定条件を下記表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000086
（測定方法２：オリゴヌクレオチド収量の測定）
　前記粗生成物のＯＤ２６０を測定した。ＯＤ２６０とは１ｍＬ溶液（ｐＨ＝７．５）における１０ｍｍ光路長あたりのＵＶ２６０ｎｍの吸光度を表す。一般的にＲＮＡでは１ＯＤ＝４０μｇであることが知られていることから、前記ＯＤ２６０の測定値に基づき、収量を算出した。さらに、固相担体の単位体積当たりの収量を算出した。実施例１～２１については比較例１の収量に対する相対収量を求めた。実施例２２～３３については比較例２の収量に対する相対収量を求めた。
（オリゴヌクレオチドの固相合成）
　配列（Ｉ）：５’－AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G－３’　５３ｍｅｒ
　前記配列（Ｉ）において、”Ａ”は、以下の式（Ａ１）において波線で区切られる部分構造で示される。”Ｃ”は、以下の式（Ａ２）において波線で区切られる部分構造で示される。”Ｇ”は、以下の式（Ａ３）において波線で区切られる部分構造で示される。Ｕは、以下の式（Ａ４）において波線で区切られる部分構造で示される。”Ｐ”は、以下の式（Ａ５）において波線で区切られる部分構造で示される。なお、５‘末端の”Ａ”は、以下の式（Ａ６）において波線で区切られる部分構造で示される。また、３‘末端の”Ｇ”は、以下の式（Ａ７）において波線で区切られる部分構造で示される。但し、構造式中のリン酸基は塩であってもよい。
　換言すると、配列（Ｉ）は前記“Ｐ”で結合されたAGCAGAGUAC ACACAGCAUA UACC（配列番号１）、およびGGUAUAUGCU GUGUGUACUC UGCUUC（配列番号２）からなる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000087
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000088
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000089
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000090
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000091
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000092
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000093
　固相担体として、コントロールド・ポア・ガラス（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ））を使用し、核酸合成機としてＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、ホスホロアミダイト固相合成法により、上記配列（Ｉ）からなるオリゴヌクレオチドを３’側から５’側に向かって合成した。合成は７７．８９μｍｏｌスケールにて実施した。また、合成には、国際公開第２０１３／０２７８４３号公報の実施例２に記載のウリジンＥＭＭアミダイト（Ａ１１）、実施例３に記載のシチジンＥＭＭアミダイト（Ａ９）、実施例４に記載のアデノシンＥＭＭアミダイト（Ａ８）、実施例５に記載のグアノシンＥＭＭアミダイト（Ａ１０）、および国際公開第２０１７／１８８０４２号公報に記載の化合物（Ａ１２）、および特許第５１５７１６８号公報の実施例９に記載のＮ６－アセチル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）アデノシン　３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト（Ａ１５）、実施例８に記載のＮ２－アセチル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）グアノシン　３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）（Ａ１７）、実施例５に記載のＮ４－アセチル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）シチジン　３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）（Ａ１６）、実施例２に記載の　５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－（２－シアノエトキシメチル）ウリジン　３’－Ｏ－（２－シアノエチル　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）（Ａ１８）を使用し、デブロッキング溶液としてジクロロ酢酸トルエン溶液を使用し、縮合剤として５－（ベンジルチオ）－１Ｈ－テトラゾールを使用し、酸化剤としてヨウ素溶液を使用し、そしてキャッピング溶液としてフェノキシ酢酸無水物溶液とＮ－メチルイミダゾール溶液を使用した。核酸伸長終了後、担体上の核酸にジエチルアミン溶液を作用させることでリン酸部分のシアノエチル保護基を選択的に脱保護した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000094
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000095
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000096
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000097
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000098
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000099
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000100
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000101
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000102
　次に、本実施形態の製造方法により製造されるオリゴヌクレオチド（核酸オリゴマー）の具体的な製造例を示す。反応は、空気下（酸素濃度２１％）で実施した。ここで、下記の実施例において本実施形態の製造方法により製造されるオリゴヌクレオチドは、前記配列番号１および２で示される配列（Ｉ）を有するオリゴヌクレオチドである。
　また、以下の実施例および比較例中に記載するグアノシン誘導体とは、下記の構造式で示される化合物を意味する。下記構造式において図示されたサークルは、ＣＰＧを模式的に示すものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000103
（実施例１）
　９３．７９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ１５）、式（Ａ１６）、式（Ａ１７）、式（Ａ１８）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０３μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１５ｇとエタノール３．０７ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．４６ｇとアセトニトリル２．９９ｇを添加した溶液から、０．５０４μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール（ＢＨＴ）０．７３ｍｇを添加（ＢＨＴの量は保護基１モル当たり０．１モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７５ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２７．１モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－シアノエトキシメトキシ（ＣＥＭ）保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．４ｍｇ、純度は５２％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例２）
　９３．７９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ１５）、式（Ａ１６）、式（Ａ１７）、式（Ａ１８）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０３μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１５ｇとエタノール３．０７ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．４６ｇとアセトニトリル２．９９ｇを添加した溶液から、０．５０４μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール（ＢＨＴ）２．８５ｍｇを添加（ＢＨＴの量は保護基１モル当たり０．５モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７５ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２７．１モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－シアノエトキシメトキシ（ＣＥＭ）保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．２ｍｇ、純度は５３％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例３）
　９３．７９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ１５）、式（Ａ１６）、式（Ａ１７）、式（Ａ１８）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０３μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１５ｇとエタノール３．０７ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．４６ｇとアセトニトリル２．９９ｇを添加した溶液から、０．５０３μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール（ＢＨＴ）５．８３ｍｇを添加（ＢＨＴの量は保護基１モル当たり１．０モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７５ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２７．２モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－シアノエトキシメトキシ（ＣＥＭ）保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．２ｍｇ、純度は５３％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例４）
　９３．７９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ１５）、式（Ａ１６）、式（Ａ１７）、式（Ａ１８）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０３μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１５ｇとエタノール３．０７ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．４６ｇとアセトニトリル２．９９ｇを添加した溶液から、０．４８９μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール（ＢＨＴ）１１．５６ｍｇを添加（ＢＨＴの量は保護基１モル当たり２．１モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７５ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２８．０モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－シアノエトキシメトキシ（ＣＥＭ）保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．０ｍｇ、純度は５３％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例５）
　９３．７９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ１５）、式（Ａ１６）、式（Ａ１７）、式（Ａ１８）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０３μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１５ｇとエタノール３．０７ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．４６ｇとアセトニトリル２．９９ｇを添加した溶液から、０．５１２μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール（ＢＨＴ）１７．８１ｍｇを添加（ＢＨＴの量は保護基１モル当たり３．０モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７９ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２８．１モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－シアノエトキシメトキシ（ＣＥＭ）保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．２ｍｇ、純度は５２％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例６）
　９３．７９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ１５）、式（Ａ１６）、式（Ａ１７）、式（Ａ１８）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０３μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１５ｇとエタノール３．０７ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．４６ｇとアセトニトリル２．９９ｇを添加した溶液から、０．５１０μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール（ＢＨＴ）２３．１１ｍｇを添加（ＢＨＴの量は保護基１モル当たり４．０モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７６ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２７．２モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－シアノエトキシメトキシ（ＣＥＭ）保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．２ｍｇ、純度は５２％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例７）
　９３．７９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ１５）、式（Ａ１６）、式（Ａ１７）、式（Ａ１８）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０３μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１５ｇとエタノール３．０７ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．４６ｇとアセトニトリル２．９９ｇを添加した溶液から、０．５０３μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、4-sec-ブチル-2,6-ジ-tert-ブチルフェノール７．２０ｍｇを添加（4-sec-ブチル-2,6-ジ-tert-ブチルフェノールの量は保護基１モル当たり１．０モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７５ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２７．２モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－シアノエトキシメトキシ（ＣＥＭ）保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．２ｍｇ、純度は５４％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例８）
　９３．７９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ１５）、式（Ａ１６）、式（Ａ１７）、式（Ａ１８）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０３μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１５ｇとエタノール３．０７ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．４６ｇとアセトニトリル２．９９ｇを添加した溶液から、０．４８５μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、6-tert-ブチル-2,4-キシレノール４．２０ｍｇを添加（6-tert-ブチル-2,4-キシレノールの量は保護基１モル当たり０．９モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７６ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２８．６モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－シアノエトキシメトキシ（ＣＥＭ）保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．１ｍｇ、純度は５６％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例９）
　９３．７９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ１５）、式（Ａ１６）、式（Ａ１７）、式（Ａ１８）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０３μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１５ｇとエタノール３．０７ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．４６ｇとアセトニトリル２．９９ｇを添加した溶液から、０．４９２μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、4,6-ジ-tert-ブチル-m-クレゾール５．３０ｍｇを添加（4,6-ジ-tert-ブチル-m-クレゾールの量は保護基１モル当たり０．９モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７７ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２８．５モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－シアノエトキシメトキシ（ＣＥＭ）保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．４ｍｇ、純度は５２％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例１０）
　９３．７９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ１５）、式（Ａ１６）、式（Ａ１７）、式（Ａ１８）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０３μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１５ｇとエタノール３．０７ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．４６ｇとアセトニトリル２．９９ｇを添加した溶液から、０．５０６μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、1,4-ジヒドロキシベンゼン３．００ｍｇを添加（1,4-ジヒドロキシベンゼンの量は保護基１モル当たり１．０モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７５ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２７．０モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－シアノエトキシメトキシ（ＣＥＭ）保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．３ｍｇ、純度は５３％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例１１）
　９３．７９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ１５）、式（Ａ１６）、式（Ａ１７）、式（Ａ１８）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０３μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１５ｇとエタノール３．０７ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．４６ｇとアセトニトリル２．９９ｇを添加した溶液から、０．４９３μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、セバシン酸ビス(2,2,6,6-テトラメチル-4-ピペリジル)１．３０ｍｇを添加（セバシン酸ビス(2,2,6,6-テトラメチル-4-ピペリジル)の量は保護基１モル当たり０．１モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７９ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２９．２モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－シアノエトキシメトキシ（ＣＥＭ）保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．３ｍｇ、純度は５２％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例１２）
　９３．７９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ１５）、式（Ａ１６）、式（Ａ１７）、式（Ａ１８）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０３μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１５ｇとエタノール３．０７ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．４６ｇとアセトニトリル２．９９ｇを添加した溶液から、０．４９２μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、セバシン酸ビス(2,2,6,6-テトラメチル-4-ピペリジル)６．４０ｍｇを添加（セバシン酸ビス(2,2,6,6-テトラメチル-4-ピペリジル)の量は保護基１モル当たり０．５モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７６ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２８．２モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－シアノエトキシメトキシ（ＣＥＭ）保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．３ｍｇ、純度は５４％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例１３）
　９３．７９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ１５）、式（Ａ１６）、式（Ａ１７）、式（Ａ１８）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０３μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１５ｇとエタノール３．０７ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．４６ｇとアセトニトリル２．９９ｇを添加した溶液から、０．５１１μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、メタクリル酸2,2,6,6-テトラメチル-4-ピペリジル０．６６ｍｇを添加（メタクリル酸2,2,6,6-テトラメチル-4-ピペリジルの量は保護基１モル当たり０．１モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７５ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２６．８モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－シアノエトキシメトキシ（ＣＥＭ）保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．２ｍｇ、純度は５２％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例１４）
　９３．７９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ１５）、式（Ａ１６）、式（Ａ１７）、式（Ａ１８）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０３μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１５ｇとエタノール３．０７ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．４６ｇとアセトニトリル２．９９ｇを添加した溶液から、０．４９９μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、メタクリル酸2,2,6,6-テトラメチル-4-ピペリジル２．８０ｍｇを添加（メタクリル酸2,2,6,6-テトラメチル-4-ピペリジルの量は保護基１モル当たり０．５モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７９ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２８．９モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－シアノエトキシメトキシ（ＣＥＭ）保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．０ｍｇ、純度は５２％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例１５）
　９３．７９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ１５）、式（Ａ１６）、式（Ａ１７）、式（Ａ１８）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０３μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１５ｇとエタノール３．０７ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．４６ｇとアセトニトリル２．９９ｇを添加した溶液から、０．４９５μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、メタクリル酸2,2,6,6-テトラメチル-4-ピペリジル６．５０ｍｇを添加（メタクリル酸2,2,6,6-テトラメチル-4-ピペリジルの量は保護基１モル当たり１．１モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７５ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２７．６モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－シアノエトキシメトキシ（ＣＥＭ）保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．０ｍｇ、純度は５２％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例１６）
　９３．７９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ１５）、式（Ａ１６）、式（Ａ１７）、式（Ａ１８）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０３μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１５ｇとエタノール３．０７ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．４６ｇとアセトニトリル２．９９ｇを添加した溶液から、０．５０８μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、2,2,6,6-テトラメチルピペリジン1-オキシル フリーラジカル４．９ｍｇを添加（2,2,6,6-テトラメチルピペリジン1-オキシル フリーラジカルの量は保護基１モル当たり１．２モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．８３ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２９．８モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－シアノエトキシメトキシ（ＣＥＭ）保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．２ｍｇ、純度は５５％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例１７）
　９３．７９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ１５）、式（Ａ１６）、式（Ａ１７）、式（Ａ１８）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０３μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１５ｇとエタノール３．０７ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．４６ｇとアセトニトリル２．９９ｇを添加した溶液から、０．４８５μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、ジオクタデシルスルフィド１４．３０ｍｇを添加（ジオクタデシルスルフィドの量は保護基１モル当たり１．１モル）、更にジメチルスルホキシドを０．２８ｇ追加、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７８ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２９．３モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－シアノエトキシメトキシ（ＣＥＭ）保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．０ｍｇ、純度は５５％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例１８）
　９３．７９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ１５）、式（Ａ１６）、式（Ａ１７）、式（Ａ１８）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０３μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１５ｇとエタノール３．０７ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．４６ｇとアセトニトリル２．９９ｇを添加した溶液から、０．４８９μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、ベンゾフェノン５．００ｍｇを添加（ベンゾフェノンの量は保護基１モル当たり１．１モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７９ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２９．５モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－シアノエトキシメトキシ（ＣＥＭ）保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．２ｍｇ、純度は５５％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例１９）
　９３．７９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ１５）、式（Ａ１６）、式（Ａ１７）、式（Ａ１８）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０３μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１５ｇとエタノール３．０７ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．４６ｇとアセトニトリル２．９９ｇを添加した溶液から、０．５０５μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、n-オクタノヒドラジド４．１０ｍｇを添加（n-オクタノヒドラジドの量は保護基１モル当たり１．０モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７９ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２８．５モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－シアノエトキシメトキシ（ＣＥＭ）保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．３ｍｇ、純度は５４％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例２０）
　９３．７９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ１５）、式（Ａ１６）、式（Ａ１７）、式（Ａ１８）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０３μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１５ｇとエタノール３．０７ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．４６ｇとアセトニトリル２．９９ｇを添加した溶液から、０．５００μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、こはく酸ジヒドラジド３．９０ｍｇを添加（こはく酸ジヒドラジドの量は保護基１モル当たり１．０モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．８１ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２９．６モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－シアノエトキシメトキシ（ＣＥＭ）保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．１ｍｇ、純度は５２％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例２１）
　９３．７９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ１５）、式（Ａ１６）、式（Ａ１７）、式（Ａ１８）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０３μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１５ｇとエタノール３．０７ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．４６ｇとアセトニトリル２．９９ｇを添加した溶液から、０．４９４μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、トリフェニルホスフィン６．００ｍｇを添加（トリフェニルホスフィンの量は保護基１モル当たり０．９モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７９ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２９．２モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－シアノエトキシメトキシ（ＣＥＭ）保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．３ｍｇ、純度は５４％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（比較例１）
　９３．７９μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ１５）、式（Ａ１６）、式（Ａ１７）、式（Ａ１８）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０３μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１５ｇとエタノール３．０７ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、ニトロメタン０．４６ｇとアセトニトリル２．９９ｇを添加した溶液から、０．４９８μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７８ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２８．６モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－シアノエトキシメトキシ（ＣＥＭ）保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．１ｍｇ、純度は４８％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例２２）
　９３．８６μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０２μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１８ｇとエタノール３．０３ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、アセトニトリル３．００ｇを添加した溶液から、０．５０４μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、ニトロメタン２．８９ｍｇと2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール（ＢＨＴ）１．１５ｍｇを添加（ＢＨＴの量は保護基１モル当たり０．２モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７８ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２８．２モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．２ｍｇ、純度は５３％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例２３）
　９３．８６μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０２μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１８ｇとエタノール３．０３ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、アセトニトリル３．００ｇを添加した溶液から、０．５１３μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、ニトロメタン２．８９ｍｇと2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール（ＢＨＴ）５．８７ｍｇを添加（ＢＨＴの量は保護基１モル当たり１．０モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７８ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２７．７モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．０ｍｇ、純度は５３％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例２４）
　９３．８６μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０２μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１８ｇとエタノール３．０３ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、アセトニトリル３．００ｇを添加した溶液から、０．５１１μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、ニトロメタン２．８９ｍｇと2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール（ＢＨＴ）２３．２０ｍｇを添加（ＢＨＴの量は保護基１モル当たり４．０モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７８ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２７．８モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．３ｍｇ、純度は５５％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例２５）
　９３．８６μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０２μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１８ｇとエタノール３．０３ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、アセトニトリル３．００ｇを添加した溶液から、０．５１４μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、ニトロメタン２．８９ｍｇと2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール（ＢＨＴ）３４．１０ｍｇを添加（ＢＨＴの量は保護基１モル当たり５．８モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．８２ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２９．１モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．４ｍｇ、純度は５５％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例２６）
　９３．８６μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０２μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１８ｇとエタノール３．０３ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、アセトニトリル３．００ｇを添加した溶液から、０．５０８μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、ニトロメタン２．８９ｍｇと2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール（ＢＨＴ）４７．１０ｍｇを添加（ＢＨＴの量は保護基１モル当たり８．１モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７６ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２７．３モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．３ｍｇ、純度は５４％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例２７）
　９３．８６μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０２μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１８ｇとエタノール３．０３ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、アセトニトリル３．００ｇを添加した溶液から、０．５１３μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、ニトロメタン２．８９ｍｇと6-tert-ブチル-2,4-キシレノール６．００ｍｇを添加（6-tert-ブチル-2,4-キシレノールの量は保護基１モル当たり１．３モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７８ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２７．８モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．５ｍｇ、純度は５４％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例２８）
　９３．８６μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０２μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１８ｇとエタノール３．０３ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、アセトニトリル３．００ｇを添加した溶液から、０．５２０μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、ニトロメタン２．８９ｍｇと4,6-ジ-tert-ブチル-m-クレゾール５．１０ｍｇを添加（4,6-ジ-tert-ブチル-m-クレゾールの量は保護基１モル当たり０．９モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７８ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２７．３モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．３ｍｇ、純度は５３％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例２９）
　９３．８６μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０２μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１８ｇとエタノール３．０３ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、アセトニトリル３．００ｇを添加した溶液から、０．５０４μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、ニトロメタン２．８９ｍｇとメタクリル酸2,2,6,6-テトラメチル-4-ピペリジル０．７０ｍｇを添加（メタクリル酸2,2,6,6-テトラメチル-4-ピペリジルの量は保護基１モル当たり０．１モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７８ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２８．２モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．２ｍｇ、純度は５０％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例３０）
　９３．８６μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０２μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１８ｇとエタノール３．０３ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、アセトニトリル３．００ｇを添加した溶液から、０．５１１μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、ニトロメタン２．８９ｍｇと2,2,6,6-テトラメチルピペリジン1-オキシル フリーラジカル４．５０ｍｇを添加（2,2,6,6-テトラメチルピペリジン1-オキシル フリーラジカルの量は保護基１モル当たり１．１モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７８ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２７．８モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．０ｍｇ、純度は５２％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例３１）
　９３．８６μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０２μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１８ｇとエタノール３．０３ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、アセトニトリル３．００ｇを添加した溶液から、０．５０３μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、ニトロメタン２．８９ｍｇとジオクタデシルスルフィド１４．００ｍｇを添加（ジオクタデシルスルフィドの量は保護基１モル当たり１．０モル）、ジメチルスルホキシド０．２８ｇを添加、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．８１ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２９．４モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．０ｍｇ、純度は５４％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例３２）
　９３．８６μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０２μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１８ｇとエタノール３．０３ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、アセトニトリル３．００ｇを添加した溶液から、０．５２１μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、ニトロメタン２．８９ｍｇとベンゾフェノン４．８０ｍｇを添加（ベンゾフェノンの量は保護基１モル当たり１．０モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．８３ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２９．０モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．０ｍｇ、純度は５３％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（実施例３３）
　９３．８６μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０２μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１８ｇとエタノール３．０３ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、アセトニトリル３．００ｇを添加した溶液から、０．４９１μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、ニトロメタン２．８９ｍｇとトリフェニルホスフィン６．４０ｍｇを添加（トリフェニルホスフィンの量は保護基１モル当たり１．０モル）、溶解し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．７９ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり２９．４モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．０ｍｇ、純度は５３％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（比較例２）
　９３．８６μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０２μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１８ｇとエタノール３．０３ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、アセトニトリル３．００ｇを添加した溶液から、０．５１０μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、ニトロメタン２．８９ｍｇを添加し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液１．５６ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり５５．８モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．１ｍｇ、純度は４９％であった。得られた粗生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定し、また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定した。
（参考例１）
　９３．８６μｍｏｌのグアノシン誘導体を担持したＣＰＧと、式（Ａ８）、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトとを用いて、配列（Ｉ）の固相合成をＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ１００により実施した。その後、３０．０２μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体を採取し、アンモニア水１０．１８ｇとエタノール３．０３ｇを用いてオリゴヌクレオチドを固相担体から遊離させた後、担体を濾別し、遊離オリゴヌクレオチドを含む濾液を濃縮乾固した。次いで遊離オリゴヌクレオチドを１３．２４ｇのジメチルスルホキシドに溶解後に、アセトニトリル３．００ｇを添加した溶液から、０．４９７μｍｏｌ分の溶液を容量１５ｍＬのファルコンチューブに採取した。そこへ、ニトロメタン２．８９ｍｇを添加し、更にモレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液０．８２ｇ（ＴＢＡＦの量は保護基１モル当たり３０．１モル）を流入し、ボルテックスミキサーにより均一に攪拌し、その後混合物を３０℃で４時間保温することにより２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。保護基の脱保護を行った。粗生成物は沈殿操作により得た。収量は４．２ｍｇ、純度は４９％であった。
　更に、得られた粗生成物の全量を含む水溶液4.7mLをアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。具体的には、Cytiva社製AKTA pure 150を用いて、市販のアフィニティーカラム（SkillPak Toyopearl AF-Chelate-650M、1mL、Tosoh Corporation）に核酸水溶液全量をアプライし、移動相を水とし、流速０．６ｍＬ／ｍｉｎで２０ｍＬ送液した。溶出液のＵＶ（２６０ｎｍ）はモニターにより確認でき、核酸の溶出が認められた部分の全量を回収し、膜濾過により濃縮することで核酸精製物を得た。
　測定結果を下記表２～表４に示す。
　下表において、ラジカル反応阻害剤の使用量は、固相担体に担持されている化合物１ｍｏｌに対して、式（3）におけるのＲが式（１）で示される基である数を乗じた数値に対する使用量を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000104
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000105
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000106
　上記表２～表４に示す通り、明細書中に記載のオリゴヌクレオチドに含まれるリボースの水酸基の保護基の脱保護反応を、ラジカル反応阻害剤の存在下で実施することにより、ラジカル反応阻害剤が存在しない条件で実施した場合と比較して、該脱保護反応が効率よく進行し、結果、高い純度で脱保護されたオリゴヌクレオチドを得ることができた。
　本発明により、効率的に核酸オリゴマーを製造できる。
　配列表の配列番号１～１３は、本発明の製造方法に従って製造されるオリゴヌクレオチドの塩基配列を表す。

Claims (26)

  1. 　ラジカル反応阻害剤の存在下で、下記式（３）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、
    　Ｇ４は、水素原子または水酸基の保護基を表し、
    　Ｇ９は、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、アルカリ金属イオン、水素イオンまたはヒドロキシアルキルアンモニウムイオンを表し、
    　Ｂｃは、それぞれ独立して同一又は相異なる核酸塩基を表し、
    　Ｒは、それぞれ独立して同一又は相異なって、水素原子、フッ素原子またはＯＱ基を表し、
    　Ｑは、それぞれ独立して同一又は相異なって、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、メチル基、２－メトキシエチル基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基、または下記式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、
    　＊印のついた結合は、ＯＱ基の酸素原子との結合であることを表し、
    　ｎは０以上の何れかの整数を表す。）
    の保護基を表し、
    　Ｙは、それぞれ独立して同一又は相異なって、酸素原子または硫黄原子を表し、
    　ｍは、２以上３００までの何れかの整数を表し、
    　ＷおよびＸは、下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかで定義され、
    （ａ）Ｗが水酸基であるときは、Ｘは前記Ｒ基と同じ定義である。
    （ｂ）Ｘが水酸基であるときは、ＷはＯＶ基を表し、
    　Ｖは、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、または前記式（１）の基を表す。
    　ただし、前記Ｒ、ＷおよびＸのうち少なくとも一つの基は、前記式（１）の保護基で保護された水酸基を表す。そして
    　ｍが３以上の整数のとき、式（３）で示される核酸オリゴマーは、それぞれの５’末端と３’末端のヌクレオチドの間のｐ個（ただし、ｐは、式：ｍ－１＞ｐを満たす正の整数である。）のヌクレオチドの代わりに、非ヌクレオチドリンカーが組み込まれていてもよい核酸オリゴマーである。）
    で示される核酸オリゴマーを、フッ化物イオンと接触させることを特徴とする、下記式（４）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式中、Ｒ’は、それぞれ独立して同一又は相異なって、水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、
    　Ｑ’は、それぞれ独立して同一又は相異なって、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、または４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表し、
    　式（４）の置換基Ｇ４、Ｇ９、Ｙ、Ｂｃおよびｍの定義は、前記式（３）における定義と同じであり、
    　Ｗ０は、水酸基であり、
    　Ｘ０は、前記Ｒ’基と同じ定義である。
    　そして、ｍが３以上の整数のとき、式（４）で示される核酸オリゴマーは、それぞれの５’末端と３’末端のヌクレオチドの間のｐ個（ただし、ｐは、式：ｍ－１＞ｐを満たす正の整数である。）のヌクレオチドの代わりに、非ヌクレオチドリンカーが組み込まれていてもよい核酸オリゴマーである。）
    で示される核酸オリゴマーの製造方法。
  2. 　式（１）中のｎが０または１である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　式（１）中のｎが０である、請求項１に記載の製造方法。
  4. 　式（１）中のｎが１である、請求項１に記載の製造方法。
  5. 　非ヌクレオチドリンカーが、アミノ酸骨格からなるリンカーである、請求項１～４の何れか１項に記載の製造方法。
  6. 　アミノ酸骨格からなるリンカーが、下記式（Ａ１４－１）、（Ａ１４－２）または（Ａ１４－３）の構造を有するリンカーである、請求項５に記載の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     （式中、５’および３’は、核酸オリゴマーの５’末端側および３’末端側をそれぞれ示す。）
  7. 　Ｗが水酸基であり、ＸがＲ基であり、Ｗ０が水酸基であり、そしてＸ０がＲ’基である、請求項１～６の何れか１項に記載の製造方法。
  8. 　フッ化物イオン源が、フッ化テトラアルキルアンモニウムである、請求項１～７の何れか１項に記載の製造方法。
  9. 　フッ化物イオン源が、フッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウムである、請求項１～８の何れか１項に記載の製造方法。
  10. 　ラジカル反応阻害剤が、ラジカル連鎖開始阻止剤、ラジカル捕捉剤、又は過酸化物分解剤である、請求項１～９の何れか１項に記載の製造方法。
  11. 　ラジカル反応阻害剤が、ラジカル捕捉剤である、請求項１～９の何れか１項に記載の製造方法。
  12. 　ラジカル捕捉剤が、フェノール系酸化防止剤又はヒンダードアミン系光安定剤である、請求項１１に記載の製造方法。
  13. 　ラジカル捕捉剤が、フェノール系酸化防止剤である、請求項１１に記載の製造方法。
  14. 　フェノール系酸化防止剤が、下記式（８）で示される化合物である、請求項１２又は１３に記載の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     （式中、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ１３は、同一又は相異なって、鎖式炭化水素基、カルボシクリル基、ヘテロシクリル基、アルコキシ基、アルキルスルファニル基｛該鎖式炭化水素基、該カルボシクリル基、該ヘテロシクリル基、該アルコキシ基、該アルキルスルファニル基は、１以上の置換基を有していてもよい｝、ＳｉＲ５１Ｒ５２Ｒ５３、アミド基、Ｃ（Ｏ）Ｒ６１、ＯＣ（Ｏ）Ｒ６１、水酸基、又は水素原子を示し、Ｒ５１、Ｒ５２及びＲ５３は、同一又は相異なって、アルキル基、アルコキシ基、又は水素原子を示し、Ｒ６１は、鎖式炭化水素基を示す。）
  15. 　ラジカル捕捉剤が、ヒンダードアミン系光安定剤である、請求項１２に記載の製造方法。
  16. 　ヒンダードアミン系光安定剤が、下記式（１２）で示される化合物である、請求項１２、１４、又は１５に記載の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     （式中、Ｒ１４は、ＯＣ（Ｏ）Ｒ２０、ＮＨＲ２０、又は水素原子を示し、Ｒ１９は、アルキル基、アルコキシ基、酸素フリーラジカル、水酸基、又は水素原子を示し、Ｒ１5、Ｒ１6、Ｒ１7、及びＲ１８は、同一又は相異なって、アルキル基又は水素原子を示し、Ｒ２０は、鎖式炭化水素基、カルボシクリル基、ヘテロシクリル基、アルコキシ基、アルキルスルファニル基｛該鎖式炭化水素基、該カルボシクリル基、該ヘテロシクリル基、該アルコキシ基、該アルキルスルファニル基は、１以上の置換基を有していてもよい｝、ＳｉＲ５４Ｒ５５Ｒ５６、アミド基、水酸基、又は水素原子を示し、Ｒ５４、Ｒ５５及びＲ５６は、同一又は相異なって、アルキル基、アルコキシ基、又は水素原子を示す。）
  17. 　ラジカル反応阻害剤が、過酸化物分解剤である、請求項１～９の何れか１項に記載の製造方法。
  18. 　過酸化物分解剤が、リン系酸化防止剤又は硫黄系酸化防止剤である、請求項１７に記載の製造方法。
  19. 　過酸化物分解剤が、リン系酸化防止剤である、請求項１７に記載の製造方法。
  20. 　過酸化物分解剤が、硫黄系酸化防止剤である、請求項１７に記載の製造方法。
  21. 　ラジカル反応阻害剤が、ラジカル連鎖開始阻止剤である、請求項１～９の何れか１項に記載の製造方法。
  22. 　ラジカル連鎖開始阻害剤が、金属不活性化剤又は紫外線吸収剤である、請求項２１に記載の製造方法。
  23. 　ラジカル連鎖開始阻害剤が、金属不活性化剤である、請求項２１に記載の製造方法。
  24. 　ラジカル連鎖開始阻害剤が、紫外線吸収剤である、請求項２１に記載の製造方法。
  25. 　ラジカル反応阻害剤の使用量が、式（３）で示される核酸オリゴマーのモル数に対して、式（３）におけるＲが式（１）で示される基である数を乗じたモル数１モルに対して、９モル以下である、請求項１～２４の何れか１項に記載の製造方法。
  26. 　式（３）で示される核酸オリゴマーのＲ、ＷおよびＸのうち、前記式（１）の保護基の割合が１０％以上であり、かつ、核酸鎖長が１０鎖長以上である、請求項１～２５の何れか１項に記載の製造方法。
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