JP6828219B1 - 核酸分子の製造方法 - Google Patents
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-
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Abstract
Description
本発明の一態様にかかる一本鎖RNAの製造方法は、
(I)5’末端にリン酸基を有する第1の一本鎖RNAと3’末端に水酸基を有する第2の一本鎖RNAに、国際生化学連合が酵素番号として定めるEC6.5.1.3に分類され、二本鎖ニック修復活性を有するRNAリガーゼを作用させ、前記第1の一本鎖RNAと前記第2の一本鎖RNAとを連結する工程、および
(II)(I)の連結工程で生成した一本鎖RNAを含む反応生成物をモノアルキルアンモニウム塩およびジアルキルアンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも1つのアンモニウム塩を含む移動相を用いた逆相カラムクロマトグラフィーによって精製する工程を含む一本鎖RNAの製造方法であって、
a)前記第1の一本鎖RNAが、5’末端側から順に、X1領域およびZ領域からなる一本鎖RNAであり;
b)前記第2の一本鎖RNAが、5’末端側から順に、X2領域、Y2領域、Lyリンカー領域およびY1領域からなる一本鎖RNAであり;
c)前記X1領域と前記X2領域とが、互いに相補的な、5以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり;
d)前記Y1領域と前記Y2領域とが、互いに相補的な、2以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり;
e)前記Z領域が、任意のヌクレオチド数のヌクレオチド配列を含む領域であり;
f)前記Lyリンカー領域が、4〜30量体のヌクレオチド配列またはアミノ酸から誘導される原子団を有するリンカー領域であり;
g)前記第1の一本鎖RNAと前記第2の一本鎖RNAとの連結により生成する一本鎖RNAが、5’末端側から順に、前記X2領域、前記Y2領域、前記Lyリンカー領域、前記Y1領域、前記X1領域および前記Z領域からなる連結一本鎖RNAである、一本鎖RNAの製造方法。
また、本発明の一態様にかかる一本鎖RNAの製造方法は、前記製造方法において、前記Z領域が、5’末端側から順に、Z1領域、Lzリンカー領域及びZ2領域からなる領域であり、前記Lzリンカー領域がアミノ酸から誘導される原子団を有するリンカー領域であり、前記Z1領域と前記Z2領域とが、互いに相補的なヌクレオチド配列を含み、前記第1の一本鎖RNAと前記第2の一本鎖RNAとの連結により生成する一本鎖RNAが、5’末端側から順に、前記X2領域、前記Y2領域、前記Lyリンカー領域、前記Y1領域、前記X1領域、前記Z1領域、前記Lzリンカー領域および前記Z2領域からなる連結一本鎖RNAである、製造方法である。
W2n=X2n+Y2n ・・・(1)
W1n≧X1n+Y1n ・・・(2)
X1n=Y1n ・・・(3)
X1n<Y1n ・・・(4)
X1n>Y1n ・・・(5)
Y1領域のヌクレオチド数(Y1n)、およびY2領域のヌクレオチド数(Y2n)は、2以上であり、好ましくは3以上であり、より好ましくは4以上である。
X1n≧X2n ・・・(6)
Y1n=Y2n ・・・(7)
Z1n≧Z2n ・・・(8)
前記Y12及びY22、並びに、Y’12及びY’22におけるアミノ基で置換されていてもよいアルキル基は、炭素数1〜10が好ましく、炭素数1〜5がより好ましい。アルキル基は、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよい、
(Lya、Lyc)または(Lyc、Lya)=(AA、AA)、(AA、AC)、(AA、AG)、(AA、CA)、(AA、CC)、(AA、CG)、(AA、GA)、(AA、GC)、(AA、GG)、(AC、AA)、(AC、AC)、(AC、AG)、(AC、CA)、(AC、CC)、(AC、CG)、(AC、UA)、(AC、UC)、(AC、UG)、(AG、AA)、(AG、AC)、(AG、AG)(AG、GA)、(AG、GG)、(AG、UA)、(AG、UC)、(AG、UU)、(AU、CA)、(AU、CC)、(AU、CG)、(AU、GA)、(AU、GC)、(AU、GG)、(AU、UA)、(AU、UC)、(AU、UG)、(AU、UU)、(CA、AA)、(CA、AC)、(CA、AU)、(CC、AA)、(CC、AC)、(CC、AU)、(CC、CC)、(CC、CU)、(CC、UA)、(CC、UC)、(CC、UU)、(CG、AA)、(CG、AC)、(CG、AU)、(CG、GA)、(CG、GC)、(CG、GU)、(GA、AA)、(GA、AG)、(GA、GG)、(GA、GU)、(GC、AA)、(GC、AG)、(GC、AU)、(GC、CA)、(GC、CG)、(GC、CU)、(GC、GA)、(GC、GG)、(GC、GU)、(GC、UA)、(GC、UG)、(GC、UU)、(GG、AA)、(GG、AG)、(GG、AU)、(GG、GA)、(GG、GG)、(GG、GU)、(GG、UU)、(GU、CA)、(GU、CG)、(GU、GU)、(GU、UA)、(GU、UG)、(GU、UU)、(UA、AC)、(UA、AG)、(UA、AU)、(UC、AC)、(UC、AG)、(UC、AU)、(UC、CC)、(UC、CG)、(UC、CU)、(UC、UC)、(UC、UG)、(UC、UU)、(UG、AA)、(UG、AC)、(UG、AG)、(UG、AU)、(UG、GC)、(UG、GG)、(UG、GU)、(UG、UC)、(UG、UG)、(UG、UU)、(UU、CC)、(UU、CG)、(UU、CU)、(UU、GC)、(UU、GG)、(UU、GU)、(UU、UC)、(UU、UG)、(UU、UU)
このようにして、KVP40由来のRNAリガーゼ2を得ることができる。KVP40由来のRNAリガーゼ2としては、配列番号10のアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、二本鎖ニック修復活性を有するRNAリガーゼが使用可能である。
あるいは、本実施形態の製造方法は、非特許文献(Bacteriophage T4 RNA ligase 2 (gp24-1) exemplifies a family of RNA ligases found in all, Proc. Natl. Acad. Sci, 2002, Vol.99, No.20, PP.12709-12714.)に記載の条件に準じて行うこともできる。
逆相カラムクロマトグラフィーにおいて、移動相(溶離液)となるのは、非疎水性の移動相であり、具体的には、前記のようなアンモニウム塩を含むものが例示される。かかる移動相としては、C1−C3アルコール(例えば、メタノール、エタノール、2−プロパノールもしくはn−プロパノール)、ニトリル(例えば、アセトニトリル)および場合によっては、水を含む溶媒が、例示される。前記アンモニウム塩を形成する酸としては、例えば、炭酸、酢酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸およびプロピオン酸が例示される。かかる移動相としては、典型的には、モノアルキルアミンまたはジアルキルアミン/酢酸/水/アセトニトリルからなる溶離液が例示される。
逆相カラムクロマトグラフィーの温度は、例えば、20−100℃、25−80℃、あるいは30−60℃である。
逆相カラムクロマトグラフィーにより得られる画分は、一般的に核酸の分離分析に用いるクロマトグラフィーの条件下で、波長260nmのUV吸収で、組成を分析して、選択された画分が集められ、精製された目的物が得られ、たとえば、非特許文献(Handbook of Analysis of Oligonucleotides and Related Products, CRC Press)に記載の方法を用いることができる。
標的遺伝子の発現抑制は、例えば、標的遺伝子からの転写産物の生成量の減少、転写産物の活性の減少、標的遺伝子からの翻訳産物の生成量の減少、または翻訳産物の活性の減少等によって確認できる。翻訳産物としてのタンパク質は、例えば、成熟タンパク質、または、プロセシングもしくは翻訳後修飾を受ける前の前駆体タンパク質等が挙げられる。
1.第1の一本鎖RNAの合成
以下に示す一本鎖RNA(図11の鎖I)を合成した。当該鎖は26塩基長からなり、第1の一本鎖RNAに対応する。
配列表中の配列番号1の記載は、5’末端から「P」の前までの塩基配列を示す。当該一本鎖RNAは、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機(商品名NTS M−4MX−E、日本テクノサービス株式会社)を用いて3’側から5’側に向かって合成した。
以下に示す一本鎖RNA(図11の鎖II)を合成した。当該鎖は27塩基長からなり、第2の一本鎖RNAに対応する。
当該一本鎖RNAは、上記と同様の方法により合成した。
鎖III:
AGCAGAGUACACACAGCAUAUACCPGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG (5'-3') (配列番号1,2)
上記配列中、5’末端の塩基から27番目の塩基までの塩基配列は前記配列番号2の配列に相当し、また、28番目の塩基から3’末端の塩基までの塩基配列は前記配列番号1の配列に相当する。
上記第1および第2のRNAをライゲーションすることで得られる連結一本鎖RNAの標品を、前記第1および第2のRNAと同様に、固相合成法で合成した。
次に、50mLコニカルチューブの中に蒸留水(大塚製薬社製)を22.3mL、500mM Tris−Acetate(pH7.0)2.8mL、0.87mMの鎖IのRNAを78.1μL、0.74mMの鎖IIのRNAを101.3μL加え、65℃に加温した水浴中に10分間静置し、その後室温にて冷却した。そして、1625units T4 RNAリガーゼ2(New England Biolabs社)、20mM MgCl2、10mM DTT、および4mM ATP混合液2.8mLの組成で、反応スケール28.2mLで行った。その後、37℃で1時間インキュベートし、0.2M エチレンジアミン四酢酸水溶液1mLを反応液に加えて65℃の水浴中に10分間静置し、反応を停止させた。
下記表2に記載の条件で、カラムクロマトグラフィーにより精製を行った。ただし、精製前にカラム内に移動相A/移動相B=65/35の比率で流速1.0mL/minで10分間通液したのちにサンプルを添加した。得られた画分をそれぞれHPLCにて分析した。なお、HPLCにおいて波長260nmのUVスペクトルによって検出し、得られたクロマトグラムの総面積値に対する目的物の面積値を純度として算出した。
その結果、得られた画分の中で目的物が最も高純度になった画分は、純度96.4%となった。得られた試料を質量分析測定によって測定した結果、表3に示すとおり、計算値と合致していることから、目的物が得られていることが確認できた。また、原料である鎖Iおよび鎖IIは検出されなかった。
実施例1におけるライゲーションで得られた反応液から14mLを取り出し、マイレクス−GP(メルク社製)を用いてろ過し、100mM トリエチルアンモニウムアセテート(pH.7.0) 1mLで洗いこんだ。
その結果、目的物が最も高純度になった画分は、純度77%であった。得られた試料を質量分析測定した結果を表3に示す。
5.ライゲーション
次に、250mLポリプロピレン反応器の中に蒸留水(大塚製薬社製)を68mM、500mM Tris−Acetate(pH7.0)8.6mL、0.87mMの鎖IのRNAを203μL、0.74mMの鎖IIのRNAを230μL加え、65℃に加温した水浴中に10分間静置し、その後室温にて冷却した。そして、2500units T4 RNAリガーゼ2(New England Biolabs社)、20mM MgCl2、10mM DTT、および4mM ATP混合液2.8mLの組成で、反応スケール28.2mLで行った。その後、35℃で24時間インキュベートし、0.2M エチレンジアミン四酢酸水溶液1mLを反応液に加えて65℃の水浴中に10分間静置し、反応を停止させた。
下記表5に記載の条件で、カラムクロマトグラフィーにより精製を行った。ただし、精製前にカラム内に移動相A/移動相B=65/35の比率で流速1.0mL/minで10分間通液したのちにサンプルを添加した。得られた画分をそれぞれHPLCにて分析し、実施例1と同様の方法で純度および残存割合を算出した。
その結果、得られた画分のうち、目的物が最も高い純度を示した画分の純度は79%、鎖Iおよび鎖IIの残存割合についてはそれぞれ5.0%、7.1%となった。
1.第1の一本鎖RNAの合成
第1の一本鎖RNAとして、以下に示す一本鎖RNA(図11の鎖IV)を使用した。当該鎖は23基長からなり、第1の一本鎖RNAに対応する。
当該一本鎖RNAは、シグマアルドリッチジャパン社から購入したものを使用した。
第2の一本鎖RNAとして、以下に示す一本鎖RNA(図11の鎖V)を使用した。当該鎖は36塩基長からなり、第2の一本鎖RNAに対応する。
当該一本鎖RNAは、シグマアルドリッチジャパン社から購入したものを使用した。
鎖VI:
ACUCCAUUUGUUUUGAUGAUGGAUUCUUAUGCUCCAUCAUCAUCGUCUCAAAUGAGUCU (5'-3') (配列番号5)
上記配列中、5’末端の塩基から36番目の塩基までの塩基配列は前記配列番号4の配列に相当し、また、37番目の塩基から3’末端の塩基までの塩基配列は前記配列番号3の配列に相当する。
次に、50mLコニカルチューブの中に蒸留水(大塚製薬社製)を1.74mL、500mM Tris−Acetate(pH7.0)234μL、0.10mMの鎖IVのRNAを64.1μL、0.10mMの鎖VのRNAを70.5μL加え、65℃に加温した水浴中に10分間静置し、その後室温にて冷却した。そして、1750units T4 RNAリガーゼ2(New England Biolabs社)、20mM MgCl2、10mM DTT、および4mM ATP混合液234μLの組成で、反応スケール2.4mLで行った。その後、37℃で1時間インキュベートし、0.2M エチレンジアミン四酢酸水溶液0.1mLを反応液に加えて65℃の水浴中に10分間静置し、反応を停止させた。
表2に記載の条件で、カラムクロマトグラフィーにより精製を行った。ただし、精製前にカラム内に移動相A/移動相B=65/35の比率で流速1.0mL/minで10分間通液したのちにサンプルを添加した。得られた画分をそれぞれHPLCにて分析し、実施例1と同様の方法で純度を算出した。その結果、得られた画分の中で目的物が最も高純度になった画分の目的物の純度は80.5%となった。得られた試料を質量分析測定によって測定した結果を表7に示す。計算値と合致していることから、目的物が得られていることが確認できた。また、質量分析では原料である鎖IVおよび鎖Vは検出されなかった。
実施例2において、ライゲーションを停止して得られた反応液から1.2mLを取り出し、マイレクス−GP(メルク社製)を用いてろ過し、100mM トリエチルアンモニウムアセテート(pH.7.0) 1mLで洗いこんだ。
1.第1の一本鎖RNAの合成
以下に示す一本鎖RNA(図11の鎖VII)を合成した。当該鎖は23塩基長からなり、第1の一本鎖RNAに対応する。
当該一本鎖RNAは、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機(商品名NTS M−4MX−E、日本テクノサービス株式会社)を用いて3’側から5’側に向かって、実施例1における一本鎖RNA(鎖I)の合成と同様のやりかたで合成し、さらに、同様の方法で固相合成後の固相担体からの切出しと脱保護を行った。
以下に示す一本鎖RNA(図11の鎖VIII)を前記第一の一本鎖RNAと同様の方法で合成した。当該鎖は29塩基長からなり、第2の一本鎖RNAに対応する。
鎖IX:
GCAGAGUACACACAGCAUAUACCCACCGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUU (5'-3') (配列番号8)
上記配列中、5’末端の塩基から29番目の塩基までの塩基配列は前記配列番号7の配列に相当し、また、30番目の塩基から3’末端の塩基までの塩基配列は前記配列番号6の配列に相当する。
次に、50mLコニカルチューブの中に蒸留水(大塚製薬社製)を19.6mL、500mM Tris−Acetate(pH7.0)2.5mL、0.62mMの鎖VIIのRNAを111.2μL、0.49mMの鎖VIIIのRNAを154.9μL加え、65℃に加温した水浴中に10分間静置し、その後室温にて冷却した。そして、1750units T4 RNAリガーゼ2(New England Biolabs社)、20mM MgCl2、10mM DTT、および4mM ATP混合液2.5mLの組成で、反応スケール25mLで行った。その後、37℃で1時間インキュベートし、0.2M エチレンジアミン四酢酸水溶液1mLを反応液に加えて65℃の水浴中に10分間静置し、反応を停止させた。
表2に記載の条件で、カラムクロマトグラフィーにより精製を行った。ただし、精製前にカラム内に移動相A/移動相B=65/35の比率で流速1.0mL/minで10分間通液したのちにサンプルを添加した。得られた画分をそれぞれHPLCにて分析し、実施例1と同様の方法で純度および残存割合を算出した。その結果、目的物が最も高純度となった画分の純度は94.2%、鎖VIIおよび鎖VIIIの残存割合についてはそれぞれ0.4%、0.5%となった。得られた試料を質量分析測定によって測定した結果を表9に示す。計算値と合致していることから、目的物が得られていることが確認できた。
実施例3のライゲーション反応で得られた一本鎖RNAを含む反応液から12.5mLを取り出し、マイレクス−GP(メルク社製)を用いてろ過し、100mM トリエチルアンモニウムアセテート(pH.7.0) 1mLで洗いこんだ。
配列番号9〜11は、アミノ酸配列を示す。
Claims (14)
- (I)5’末端にリン酸基を有する第1の一本鎖RNAと3’末端に水酸基を有する第2の一本鎖RNAに、国際生化学連合が酵素番号として定めるEC6.5.1.3に分類され、二本鎖ニック修復活性を有するRNAリガーゼを作用させ、前記第1の一本鎖RNAと前記第2の一本鎖RNAとを連結する工程、および
(II)(I)の連結工程で生成した一本鎖RNAを含む反応生成物をモノアルキルアンモニウム塩およびジアルキルアンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも1つのアンモニウム塩を含む移動相を用いた逆相カラムクロマトグラフィーによって精製する工程を含む一本鎖RNAの製造方法であって、
a)前記第1の一本鎖RNAが、5’末端側から順に、X1領域およびZ領域からなる一本鎖RNAであり;
b)前記第2の一本鎖RNAが、5’末端側から順に、X2領域、Y2領域、Lyリンカー領域およびY1領域からなる一本鎖RNAであり;
c)前記X1領域と前記X2領域とが、互いに完全に相補的な、5以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり;
d)前記Y1領域と前記Y2領域とが、互いに完全に相補的な、2以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり;
e)前記Z領域が、ヌクレオチド数が0〜3のヌクレオチド配列を含む領域であり;
f)前記Lyリンカー領域が、4〜30量体のヌクレオチド配列またはアミノ酸から誘導される原子団を有するリンカー領域であり;
g)前記第1の一本鎖RNAと前記第2の一本鎖RNAとの連結により生成する一本鎖RNAが、5’末端側から順に、前記X2領域、前記Y2領域、前記Lyリンカー領域、前記Y1領域、前記X1領域および前記Z領域からなる連結一本鎖RNAである、
一本鎖RNAの製造方法。 - 前記Z領域が、5’末端側から順に、Z1領域、Lzリンカー領域及びZ2領域からなる領域であり、
前記Lzリンカー領域が、アミノ酸から誘導される原子団を有するリンカー領域であり、
前記Z1領域と前記Z2領域とが、互いに相補的なヌクレオチド配列を含み、
前記第1の一本鎖RNAと前記第2の一本鎖RNAとの連結により生成する一本鎖RNAが、5’末端側から順に、前記X2領域、前記Y2領域、前記Lyリンカー領域、前記Y1領域、前記X1領域、前記Z1領域、前記Lzリンカー領域および前記Z2領域からなる一本鎖RNAである、請求項1に記載の製造方法。 - 前記Lyリンカー領域が、下記式(I)で表される二価の基である、請求項1または2に記載の製造方法。
Y11に結合している末端の酸素原子は、前記Y1領域および前記Y2領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
Y21に結合している末端の酸素原子は、前記Y1領域および前記Y2領域のY11とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。) - 前記Lyリンカー領域が、下記式(I)で表される二価の基であり、前記Lzリンカー領域が、下記式(I’)で表される二価の基である、請求項2または3に記載の製造方法。
Y11に結合している末端の酸素原子は、前記Y1領域および前記Y2領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
Y21に結合している末端の酸素原子は、前記Y2領域および前記Y1領域のY11とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。)
Y’11に結合している末端の酸素原子は、前記Z1領域および前記Z2領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
Y’21に結合している末端の酸素原子は、前記Z2領域および前記Z1領域のY’11とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。) - Lyリンカー領域が、X2領域、Y2領域、Y1領域およびX1領域のヌクレオチド数の総和より少ない数のヌクレオチド配列からなるリンカー領域である、請求項1または2に記載の製造方法。
- Lyリンカー領域が、5’末端からLya領域、Lyb領域およびLyc領域からなり、Lya領域およびLyc領域は、互いにワトソンクリック塩基対を形成しない2塩基のヌクレオチド配列からなるリンカー領域である、請求項1、2または6に記載の製造方法。
- Lyリンカー領域が、5’末端からLya領域、Lyb領域およびLyc領域からなり、Lyb領域は0から20量体のヌクレオチド配列からなり、Lya領域およびLyc領域は、それぞれ2塩基のヌクレオチド配列のリンカー領域であり、その組合せである(Lya、Lyc)または(Lyc、Lya)は、以下の組み合わせから選ばれる、請求項1、2、6または7に記載の製造方法。
(Lya、Lyc)または(Lyc、Lya)=(AA、AA)、(AA、AC)、(AA、AG)、(AA、CA)、(AA、CC)、(AA、CG)、(AA、GA)、(AA、GC)、(AA、GG)、(AC、AA)、(AC、AC)、(AC、AG)、(AC、CA)、(AC、CC)、(AC、CG)、(AC、UA)、(AC、UC)、(AC、UG)、(AG、AA)、(AG、AC)、(AG、AG)(AG、GA)、(AG、GG)、(AG、UA)、(AG、UC)、(AG、UU)、(AU、CA)、(AU、CC)、(AU、CG)、(AU、GA)、(AU、GC)、(AU、GG)、(AU、UA)、(AU、UC)、(AU、UG)、(AU、UU)、(CA、AA)、(CA、AC)、(CA、AU)、(CC、AA)、(CC、AC)、(CC、AU)、(CC、CC)、(CC、CU)、(CC、UA)、(CC、UC)、(CC、UU)、(CG、AA)、(CG、AC)、(CG、AU)、(CG、GA)、(CG、GC)、(CG、GU)、(GA、AA)、(GA、AG)、(GA、GG)、(GA、GU)、(GC、AA)、(GC、AG)、(GC、AU)、(GC、CA)、(GC、CG)、(GC、CU)、(GC、GA)、(GC、GG)、(GC、GU)、(GC、UA)、(GC、UG)、(GC、UU)、(GG、AA)、(GG、AG)、(GG、AU)、(GG、GA)、(GG、GG)、(GG、GU)、(GG、UU)、(GU、CA)、(GU、CG)、(GU、GU)、(GU、UA)、(GU、UG)、(GU、UU)、(UA、AC)、(UA、AG)、(UA、AU)、(UC、AC)、(UC、AG)、(UC、AU)、(UC、CC)、(UC、CG)、(UC、CU)、(UC、UC)、(UC、UG)、(UC、UU)、(UG、AA)、(UG、AC)、(UG、AG)、(UG、AU)、(UG、GC)、(UG、GG)、(UG、GU)、(UG、UC)、(UG、UG)、(UG、UU)、(UU、CC)、(UU、CG)、(UU、CU)、(UU、GC)、(UU、GG)、(UU、GU)、(UU、UC)、(UU、UG)、(UU、UU) - 前記X1領域、前記Y1領域および前記Z領域からなるW1領域、および前記X2領域および前記Y2領域からなるW2領域の少なくとも一方に、RNA干渉法の標的となる遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド配列を含む、請求項1から8の何れか一項に記載の製造方法。
- 前記RNAリガーゼが、T4バクテリオファージ由来のT4 RNAリガーゼ2、KVP40由来のリガーゼ2、Trypanosoma brucei RNAリガーゼ、Deinococcus radiodurans RNAリガーゼ、またはLeishmania tarentolae RNAリガーゼである、請求項1から9の何れか一項に記載の製造方法。
- 前記RNAリガーゼが、配列番号9、10、または11に記載のアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるRNAリガーゼである、請求項1から10の何れか一項に記載の製造方法。
- 前記RNAリガーゼが、T4バクテリオファージ由来のT4 RNAリガーゼ2またはKVP40由来のRNAリガーゼ2である、請求項1から11の何れか一項に記載の製造方法。
- 前記アンモニウム塩が、ヘキシルアンモニウム塩、ジプロピルアンモニウム塩、ジブチルアンモニウム塩、およびジアミルアンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも1つのアンモニウム塩である請求項1から12の何れか一項に記載の製造方法。
- 前記逆相カラムクロマトグラフィーの充填剤が、フェニル基、炭素数1〜20のアルキル基、またはシアノプロピル基のいずれか1つ以上が固定されたシリカまたはポリマーである請求項1から13のいずれか一項に記載の製造方法。
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