TW202003842A - 髮夾型單股rna分子之製造方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種髮夾型單股RNA分子之製造方法,其係抑制標的基因表現的髮夾型單股RNA分子之製造方法,其包含(i)將第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子降溫貼合的降溫貼合(annealing)步驟、及(ii)藉由Rnl2家族之連接酶(ligase)而將前述第一單股寡RNA分子之3’末端與前述第二單股寡RNA分子之5’末端連接的連接(ligation)步驟,且藉由第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子之連接所生成的序列,包含對前述標的基因的基因表現抑制序列。
Description
本發明係關於髮夾型單股RNA分子之製造方法。
就抑制基因表現的技術而言,已知有例如RNA干擾(RNAi)(非專利文獻1)。於利用RNA干擾的基因表現抑制中,大多利用使用稱為siRNA(短小干擾RNA(small interfering RNA))的短雙股RNA分子的方法。又,亦已報告使用藉由分子內降溫貼合(annealing)而部分地形成雙鏈的環狀RNA分子之基因表現抑制技術(專利文獻1)。
然而,由於siRNA於活體內的安定性低,容易解離成單股RNA,因而難以安定地抑制基因表現。專利文獻2已報告使用利用環狀胺衍生物而形成的1個或2個連接子(linker),將siRNA之正義股與反義股連結成單股之髮夾型單股長鏈RNA分子,可將siRNA安定化。然而,此單股長鏈RNA分子由於以使用TBDMS亞磷醯胺(TBDMS amidite)等之泛用型亞磷醯胺(amidite)的亞磷醯胺法(phosphoramidite method)無法有效率地合成,而於該合成需要使用特別的RNA亞磷醯胺(例如,專利 文獻2及3)。
專利文獻4揭示使用作為第三核酸鏈之輔助核酸與T4 RNA連接酶2,將第一核酸鏈與第二核酸鏈連接(ligation)的方法,但顯示輔助核酸越長則反應越慢,於該方法中提供良好的連接效率的輔助核酸受到限定。
[專利文獻1]美國專利申請公開第2004/058886號
[專利文獻2]國際公開WO2013/027843
[專利文獻3]國際公開WO2016/159374
[專利文獻4]國際公開WO2011/052013
[非專利文獻1]Fire et al., Nature, (1998) Feb 19; 391(6669):806-811
本發明係以提供抑制標記基因之表現的髮夾型單股RNA分子之有效率的製造方法為課題。
本案發明人等為了解決上述課題而深入檢討的結果,發現將包含對標的基因的表現抑制序列的髮夾型單股RNA分子,分割而合成2個具有非核苷酸性連接子或核苷酸性連接子等之連接子的單股寡RNA分子,藉 由將彼等降溫貼合,進行連接,可不需要特別的RNA亞磷醯胺或輔助核酸而有效率地製造該髮夾型單股RNA分子;又,藉由調節連接條件,可使髮夾型單股RNA分子相對於酵素使用量的生產效率進一步增加,遂而完成本發明。
即,本發明包含以下。
[1]一種髮夾型單股RNA分子之製造方法,其係抑制標的基因表現的髮夾型單股RNA分子之製造方法,其包含:將第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子降溫貼合的降溫貼合步驟、及藉由Rnl2家族之連接酶(ligase)而將前述第一單股寡RNA分子之3’末端與前述第二單股寡RNA分子之5’末端連接的連接步驟,前述第一單股寡RNA分子包含經由第一連接子而連結的第一RNA部分與第二RNA部分,第一RNA部分與第二RNA部分之一者相對於另一者可互補性地結合,前述第二單股寡RNA分子包含經由第二連接子而連結的第三RNA部分與第四RNA部分,第三RNA部分與第四RNA部分之一者相對於另一者可互補性地結合,前述第一單股寡RNA分子與前述第二單股寡RNA分子可於5’末端或3’末端之互補的序列間形成分子間雙鏈,於降溫貼合步驟,前述第一單股寡RNA分子與前述第二單股寡RNA分子形成雙鏈時,前述第一單股寡RNA 分子之3’末端之核糖核苷酸殘基與前述第二單股寡RNA分子之5’末端之核糖核苷酸殘基生成鏈裂(nick),又於前述第一單股寡RNA分子之5’末端之核糖核苷酸殘基與前述第二單股寡RNA分子之3’末端之核糖核苷酸殘基之間存在有1個以上之核糖核苷酸殘基的間隙(gap),藉由前述第一單股寡RNA分子與前述第二單股寡RNA分子之連接所生成的序列,包含對前述標的基因的基因表現抑制序列。
[2]如上述[1]記載之製造方法,其中前述第一單股寡RNA分子係以下述式(I)表示,前述第二單股寡RNA分子係以下述式(II)表示,5’-Xs-Lx1-Xa-3’‧‧‧式(I)
5’-Ya1-Ya2-Ya3-Lx2-Ys-3’‧‧‧式(II)
式(I)及式(II)中,Xs、Xa、Ya1、Ya2、Ya3及Ys表示1個或其以上之核糖核苷酸殘基,Lx1及Lx2各自表示第一連接子及第二連接子,Ya3係與Ys互補,於連接步驟所生成的Xa-Ya1係與Xs互補,於連接步驟所生成的Xa-Ya1-Ya2-Ya3包含對前述標的基因的基因表現抑制序列。
[3]如上述[1]或[2]記載之製造方法,其中前述第一單股寡RNA分子於3’末端具有尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A),前述第二單股寡RNA分子於5’末端具有尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A)。
[4]如上述[1]~[3]中任一項記載之製造方法,其中 第一連接子及第二連接子各自獨立為(i)包含吡咯啶骨架及哌啶骨架之至少一者的非核苷酸性連接子、或(ii)核苷酸性連接子。
[5]如上述[1]~[4]中任一項記載之製造方法,其中Rnl2家族之連接酶為T4 RNA連接酶2。
[6]如上述[1]~[5]中任一項記載之製造方法,其係於pH7.4~8.6之反應液中進行前述連接。
[7]如上述[1]~[6]中任一項記載之製造方法,其係於包含2~10mM之二價金屬離子的反應液中進行前述連接。
[9]如上述[1]~[8]中任一項記載之製造方法,其中前述標的基因為TGF-β1基因、GAPDH基因、LAMA1基因或LMNA基因。
[10]如上述[1]~[9]中任一項記載之製造方法,其中前述髮夾型單股RNA分子包含序列識別號1所表示的鹼基序列,第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由第一連接子而連結,第50號及第51號之核糖核苷酸殘基 係經由第二連接子而連結。
[11]如上述[1]~[10]中任一項記載之製造方法,其中前述第一單股寡RNA分子與前述第二單股寡RNA分子為以下之(1)~(6)之任一者:(1)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由第一連接子而連結的序列識別號7所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第10號及第11號之核糖核苷酸殘基係經由第二連接子而連結的序列識別號6所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合;(2)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由第一連接子而連結的序列識別號19所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第16號及第17號之核糖核苷酸殘基係經由第二連接子而連結的序列識別號18所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合;(3)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由第一連接子而連結的序列識別號27所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第20號及第21號之核糖核苷酸殘基係經由第二連接子而連結的序列識別號26所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合;(4)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由第一連接子而連結的序列識別號29所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第21號及第22號之核糖核苷酸殘基係經由第二連接子而連結的序列識別號28所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合;(5)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由 第一連接子而連結的序列識別號31所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第22號及第23號之核糖核苷酸殘基係經由第二連接子而連結的序列識別號30所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合;(6)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由第一連接子而連結的序列識別號33所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第23號及第24號之核糖核苷酸殘基係經由第二連接子而連結的序列識別號32所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合。
[12]一種單股寡RNA分子,其為以下之(a)~(1)之任一者:(a)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由連接子而連結的序列識別號7所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子;(b)包含第10號及第11號之核糖核苷酸殘基係經由連接子而連結的序列識別號6所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子;(c)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由連接子而連結的序列識別號19所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子;(d)包含第16號及第17號之核糖核苷酸殘基係經由連接子而連結的序列識別號18所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子;(e)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由連接子而連結的序列識別號27所表示的鹼基序列的單 股寡RNA分子;(f)包含第20號及第21號之核糖核苷酸殘基係經由連接子而連結的序列識別號26所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子;(g)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由連接子而連結的序列識別號29所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子;(h)包含第21號及第22號之核糖核苷酸殘基係經由連接子而連結的序列識別號28所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子;(i)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由連接子而連結的序列識別號31所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子;(j)包含第22號及第23號之核糖核苷酸殘基係經由連接子而連結的序列識別號30所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子;(k)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由連接子而連結的序列識別號33所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子;(l)包含第23號及第24號之核糖核苷酸殘基係經由連接子而連結的序列識別號32所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子。
[13]一種用以抑制TGF-β1基因表現的髮夾型單股RNA分子之製造用之套組,其包含以下之(1)~(6)之任一單股寡RNA分子之組合: (1)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由第一連接子而連結的序列識別號7所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第10號及第11號之核糖核苷酸殘基係經由第二連接子而連結的序列識別號6所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合;(2)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由第一連接子而連結的序列識別號19所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第16號及第17號之核糖核苷酸殘基係經由第二連接子而連結的序列識別號18所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合;(3)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由第一連接子而連結的序列識別號27所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第20號及第21號之核糖核苷酸殘基係經由第二連接子而連結的序列識別號26所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合;(4)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由第一連接子而連結的序列識別號29所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第21號及第22號之核糖核苷酸殘基係經由第二連接子而連結的序列識別號28所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合;(5)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由第一連接子而連結的序列識別號31所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第22號及第23號之核糖核苷酸殘基係經由第二連接子而連結的序列識別號30所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合; (6)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由第一連接子而連結的序列識別號33所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第23號及第24號之核糖核苷酸殘基係經由第二連接子而連結的序列識別號32所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合。
本說明書包含成為本案優先權基礎的日本國專利申請案第2018-070423號之揭示內容。
若依據本發明,可有效率地製造抑制標的基因表現的髮夾型單股RNA分子。
[圖1]圖1為本發明之一實施形態的連接法的示意圖。
[圖2]圖2為ssTbRNA分子(序列識別號1)之模式圖。P表示脯胺酸衍生物。序列識別號1之第29號(U)~第47號(C)相當於活性序列(對TGF-β1基因的基因表現抑制序列;反義序列)。
[圖3]圖3顯示表1所示的004~019之單股寡RNA分子(股1及2)之組(對)之使用T4 RNA連接酶2的降溫貼合及連接反應後之連接效率。
[圖4]圖4顯示011、016、及018之單股寡RNA分子(股1及2)之結構。各自之成對的右側為股1,左側為股2。
[圖5]圖5顯示將016之寡核酸於不同寡RNA濃度 及不同反應溫度下連接時的連接效率之經時的變化。
[圖6]圖6顯示使用011、016、及018之寡RNA(100μM)且於不同反應溫度下連接時之連接效率之經時的變化。A顯示於25℃之連接的結果;B顯示於37℃之連接的結果。
[圖7]圖7顯示將011之寡RNA於不同ATP濃度下連接時之變性PAGE解析之結果。
[圖8]圖8顯示將011之寡RNA於不同ATP濃度下連接時之連接效率。
[圖9]圖9顯示將016之寡RNA於不同寡RNA濃度、不同pH條件下連接時之連接效率之經時的變化。
[圖10]圖10顯示將016之寡RNA於不同pH條件下連接時之連接效率。
[圖11]圖11顯示將016之寡RNA於不同寡RNA濃度、不同MgCl2濃度下連接時之連接效率。A顯示於10μM或100μM寡RNA之存在下的連接的結果;B顯示於10μM或200μM寡RNA之存在下的連接的結果。
[圖12]圖12顯示將016之寡RNA於不同MgCl2濃度、不同pH條件下連接時之連接效率。A顯示於pH7.5之連接的結果;B顯示於pH8.0之連接的結果。
[圖13]圖13顯示使用不同酵素量且添加PEG而連接時之連接效率。
[圖14]圖14顯示使用不同寡RNA濃度的連接反應之時間歷程(time course)。
[圖15]圖15顯示將初期寡RNA濃度設為100μM, 一邊依序追加寡RNA一邊進行的連接反應中的目的產物ssTbRNA分子之生成量。ssTbRNA分子之生成量(nmol)=(單股寡RNA分子之添加量)×(FLP(Full Length Product,完全長度之生成物)(%))/100。圖表之橫軸之h表示連接開始後之時間。連接開始時之寡RNA濃度100μM(10nmol)、酵素濃度4單位/nmol寡RNA,於最終添加後,成為寡RNA濃度300μM(40nmol)、酵素濃度1單位/nmol寡RNA。
[圖16]圖16顯示將初期寡RNA濃度設為200μM,一邊依序追加寡RNA一邊進行的連接反應中的目的產物ssTbRNA分子之生成量。ssTbRNA分子之生成量(nmol)=(單股寡RNA分子之添加量)×(FLP(%))/100。圖表之橫軸之h表示連接開始後之時間。連接開始時之寡RNA濃度200μM(20nmol)、酵素濃度4單位/nmol寡RNA,於最終添加後,成為寡RNA濃度480μM(80nmol)、酵素濃度0.5單位/nmol寡RNA。
[圖17]圖17顯示包含對GAPDH基因、LAMA1基因、或LMNA基因的基因表現抑制序列的髮夾型單股RNA分子、及其分割位置。(1)~(7)表示分割位置。將對各基因的基因表現抑制序列(活性序列/反義序列)以框來表示。
[圖18]圖18顯示使用為包含對GAPDH基因、LAMA1基因、或LMNA基因的基因表現抑制序列的髮夾型單股RNA分子之分割片段的單股寡RNA分子之對(股1及2)的降溫貼合及連接反應後之連接效率。
[圖19]圖19顯示表1所示的股1及股2之組(對)之使用T4 RNA連接酶的降溫貼合及連接反應後之連接效率。
以下,詳細說明本發明。
本發明係關於抑制標的基因表現的髮夾型單股RNA分子之製造方法。依據本發明之方法所製造的髮夾型單股RNA分子,其包含基因表現抑制序列的雙股RNA之正義股的3’末端及反義股的5’末端係經由包含非核苷酸性連接子或核苷酸性連接子等之連接子的序列而連結,且於其反義股之3’末端具有經由包含非核苷酸性連接子或核苷酸性連接子等之連接子的序列而1個以上之核糖核苷酸殘基進一步被連結的單股結構。依據本發明之方法所製造的髮夾型單股RNA分子之5’末端與3’末端並未鍵結。於本說明書,「髮夾型」意指單股RNA分子藉由分子內降溫貼合(自降溫貼合(self-annealing))而形成1個以上之雙鏈結構。依據本發明之方法所製造的髮夾型單股RNA分子,典型地,藉由包含其5’末端的5’側區域與包含3’末端的3’側區域各自各別地進行分子內降溫貼合,而形成2個雙鏈結構。於本說明書,「RNA」、「RNA分子」、「核酸分子」及「核酸」雖可僅由核苷酸所構成,但亦可由核苷酸與非核苷酸物質(例如,脯胺酸衍生物等之環狀胺衍生物)所構成。
於本發明,將抑制標的基因表現的髮夾型單 股RNA分子,作為在包夾於2個連接子(例如,非核苷酸性連接子、核苷酸性連接子、或組合彼等的連接子)的序列中分割成2個之片段而合成,將彼等降溫貼合、連接,藉此而可製造。連接意指將2個核酸(於本發明,典型而言為RNA),藉由使其末端之5’磷酸基與3’羥基鍵結(磷酸二酯鍵)而連結。於本發明之方法,係藉由較短鏈的單股RNA分子之對的連接而製造相較更長鏈之髮夾型單股RNA分子,藉此可實現該髮夾型單股RNA分子之高產量的製造。
更具體而言,本發明係關於一種髮夾型單股RNA分子之製造方法,其係抑制標的基因表現的髮夾型單股RNA分子之製造方法,其包含:將第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子降溫貼合的降溫貼合步驟、及藉由Rnl2家族之連接酶而將前述第一單股寡RNA分子之3’末端與前述第二單股寡RNA分子之5’末端連接的連接步驟,藉由第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子之連接所生成的序列,包含對前述標的基因的基因表現抑制序列。
於本發明之方法,第一單股寡RNA分子包含經由第一連接子而連結的第一RNA部分與第二RNA部分,第一RNA部分與第二RNA部分之一者相對於另一者可互補地結合。藉由該互補的結合,而第一連接子形成環圈(loop),第一RNA部分與第二RNA部分係與該環 圈鄰接而可形成主幹(stem)。於第一單股寡RNA分子中,第一RNA部分配置於5’末端側,第二RNA部分配置於3’末端側。又,第二單股寡RNA分子包含經由第二連接子而連結的第三RNA部分與第四RNA部分,第三RNA部分與第四RNA部分之一者相對於另一者可互補地結合。藉由該互補的結合,而第二連接子形成環圈,第三RNA部分與第四RNA部分係與該環圈鄰接而可形成主幹。於第二單股寡RNA分子中,第三RNA部分配置於5’末端側,第四RNA部分配置於3’末端側。第一~第四RNA部分各自包含1個或2個以上之核糖核苷酸殘基。如此,第一單股寡RNA分子及第二單股寡RNA分子包含自互補序列(self-complementary sequence),且各自藉由分子內降溫貼合(自降溫貼合),而可形成髮夾結構。第一RNA部分與第二RNA部分較佳為一者較另一者具有更長的鹼基長度。又,第三RNA部分與第四RNA部分較佳為一者較另一者具有更長的鹼基長度。於第一RNA部分具有較第二RNA部分更長的鹼基長度的情形,第三RNA部分較佳為具有較第四RNA部分更長的鹼基長度。於第二RNA部分具有較第一RNA部分更長的鹼基長度的情形,第四RNA部分較佳為具有較第一RNA部分更長的鹼基長度。第一RNA部分與第二RNA部分之中具有較長的鹼基長度者的RNA部分,較佳為以與第一連接子鄰接的方式來包含與具有較短鹼基長度者的RNA部分互補的核糖核苷酸殘基或其序列。第三RNA部分與第四RNA部分之中具有較長的 鹼基長度者之RNA部分,較佳為以與第二連接子鄰接的方式來包含與具有較短的鹼基長者之RNA部分互補的核糖核苷酸殘基或其序列。
於本發明,單股寡RNA分子所包含的2個RNA部分(第一及第二RNA部分、或第三及第四RNA部分)之一者相對於另一者「可互補地結合」意指2個RNA部分中之任一者(通常為具有較短的鹼基長度者之RNA部分)之全長相對於另一者之RNA部分(通常為具有較長鹼基長度者之RNA部分),可形成安定的鹼基配對而結合,於此情形,前者之RNA部分之全長相對於後者之RNA部分內的對應的核糖核苷酸殘基或其序列係互補。單股寡RNA分子所包含的2個RNA部分之一者,更佳為相對於另一者之RNA部分中之對應的核糖核苷酸殘基或其序列為完全地互補的(即,一者之RNA部分的全部的核糖核苷酸殘基相對於另一者之RNA部分中之對應的核糖核苷酸殘基不具有誤配(mismatch))。或者,單股寡RNA分子所包含的2個RNA部分之一者,只要相對於另一者之RNA部分可形成安定的鹼基配對,則可包含1個以上,例如1個或2個之核糖核苷酸殘基之誤配,此情形亦為「可互補地結合」。惟,較佳為於本發明之方法所連接的分子末端之核糖核苷酸殘基中不存在該誤配。
於一實施形態,第一RNA部分及第四RNA部分之一者,較另一者更短,較佳為1~7個鹼基長,例如為1~6個鹼基長、1~4個鹼基長、1~3個鹼基長、1 個鹼基長或2個鹼基長。於該情形,第一RNA部分及第四RNA部分中較長者(另一者)可為19~28個鹼基長,例如可為19~27個鹼基長、19~25個鹼基長、19~23個鹼基長、20~28個鹼基長、21~27個鹼基長、20~25個鹼基長、22~27個鹼基長、23~26個鹼基長、24~28個鹼基長、26~28個鹼基長。
第一RNA部分較第四RNA部分更長的情形,第二RNA部分雖未限定於以下者,但可為1~20個鹼基長,例如可為2~20個鹼基長、2~15個鹼基長、3~10個鹼基長、3~6個鹼基長、5~12個鹼基長、或9~12個鹼基長。第一RNA部分較第四RNA部分更短的情形,第二RNA部分雖未限定於以下者,但可為8~38個鹼基長,例如可為8~36個鹼基長、12~36個鹼基長、14~34個鹼基長、14~33個鹼基長、14~36個鹼基長、或20~34個鹼基長。
第一RNA部分之鹼基序列可以與連接子鄰接的方式來包含CC(胞嘧啶-胞嘧啶),於此情形,第二RNA部分之鹼基序列較佳為以與連接子鄰接的方式來包含GG(鳥糞嘌呤-鳥糞嘌呤),以與該序列成為互補。於一實施形態,第一RNA部分之鹼基序列可以與連接子鄰接的方式來包含ACC(腺嘌呤-胞嘧啶-胞嘧啶)、GCC(鳥糞嘌呤-胞嘧啶-胞嘧啶)、或UCC(尿嘧啶-胞嘧啶-胞嘧啶),於此情形,第二RNA部分之鹼基序列較佳為以與連接子鄰接的方式來各自包含GGU(鳥糞嘌呤-鳥糞嘌呤-尿嘧啶)、GGC(鳥糞嘌呤-鳥糞嘌呤-胞嘧啶)、或GGA(鳥 糞嘌呤-鳥糞嘌呤-腺嘌呤),以與該序列成為互補。第三RNA部分之鹼基序列可以與連接子鄰接的方式來包含C(胞嘧啶),於此情形,第四RNA部分之鹼基序列較佳為以與連接子鄰接的方式來包含G(鳥糞嘌呤),以與該殘基成為互補。
第一或第二單股寡RNA分子之鹼基長度,即2個RNA部分之合計鹼基長度(不包含連接子部分)雖未限定為以下,但較佳為13~48個鹼基長。第一RNA部分較第四RNA部分更長的情形,第一單股寡RNA分子之鹼基長度,即第一RNA部分及第二RNA部分之合計鹼基長度(不包含連接子部分)較佳為21~48個鹼基長,例如為21~45個鹼基長、25~45個鹼基長、26~35個鹼基長、26~30個鹼基長、26~28個鹼基長、或33~36個鹼基長。第一RNA部分較第四RNA部分更短的情形,第一單股寡RNA分子之鹼基長度,即第一RNA部分及第二RNA部分之合計鹼基長度(不包含連接子部分)較佳為13~45個鹼基長,例如為13~43個鹼基長、15~41個鹼基長、15~30個鹼基長、17~25個鹼基長、或20~25個鹼基長。
於本發明之方法,第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子,於5’末端或3’末端之序列係相互地互補。第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子,可於5’末端或3’末端之互補的序列間(較佳為完全互補的序列間)形成分子間雙鏈。更具體而言,於一實施形態,形成髮夾結構的第一單股寡RNA分子之5’末端的序列 (第一RNA部分之5’末端的不包含於髮夾結構之主幹‧環圈的序列)與形成髮夾結構的第二單股寡RNA分子之5’末端的序列(第三RNA部分之5’末端的不包含於髮夾結構之主幹‧環圈的序列)係彼此互補,可形成分子間雙鏈。於其它實施形態,形成髮夾結構的第一單股寡RNA分子之3’末端的序列(第二RNA部分之3’末端的不包含於髮夾結構之主幹‧環圈的序列)與形成髮夾結構的第二單股寡RNA分子之3’末端的序列(第四RNA部分之3’末端的不包含於髮夾結構之主幹‧環圈的序列)係彼此互補,可形成分子間雙鏈。於本發明之方法之降溫貼合步驟,藉由第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子於5’末端或3’末端之互補的序列間形成分子間雙鏈,而生成雙股寡RNA。
於一實施形態,於第一及第二單股寡RNA分子間互補的序列長度(不包含後述之間隙部分)雖未限定於以下,但通常為6個鹼基長以上,例如7個鹼基以上、10個鹼基長以上、12個鹼基長以上、14個鹼基長以上、或18個鹼基以上,例如可為6~27個鹼基長、7~25個鹼基長、10~25個鹼基長、12~23個鹼基長、12~22個鹼基長、12~15個鹼基長、或18~23個鹼基長。
於本發明之方法之降溫貼合步驟,第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子形成雙鏈時,第一單股寡RNA分子之3’末端之核糖核苷酸殘基與前述第二單股寡RNA分子之5’末端之核糖核苷酸殘基生成鏈裂。更具體而言,於降溫貼合步驟,第一單股寡RNA分 子與第二單股寡RNA分子係除了藉由於第一及第二單股寡RNA分子間互補的序列之分子間降溫貼合而形成雙鏈(分子間雙鏈)之外,於第一RNA部分與第二RNA部分、及於第三RNA部分與第四RNA部分各自形成因分子內降溫貼合所致的雙鏈(分子內雙鏈,即髮夾結構),於第二RNA部分與第三RNA部分之間生成鏈裂。於本發明,「鏈裂」係指於核酸雙鏈之一者的核苷酸鏈中,2個核苷酸殘基間的磷酸二酯鍵斷開而3’羥基及5’磷酸基游離的狀態。鏈裂可藉由連接反應而連結。
於本發明之方法之降溫貼合步驟,第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子形成雙鏈時,於第一單股寡RNA分子之5’末端的核糖核苷酸殘基與第二單股寡RNA分子之3’末端的核糖核苷酸殘基之間,存在有1個以上之核糖核苷酸殘基的間隙。此間隙因不會藉由連接反應而連結,故第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子於連接反應後形成單股RNA分子。1個以上之核糖核苷酸殘基的間隙可為1~4個殘基(1、2、3、或4個殘基)之間隙。於此間隙部分未形成鹼基配對。
第一單股寡RNA分子之5’末端之核糖核苷酸殘基與第二單股寡RNA分子之3’末端之核糖核苷酸殘基之間的間隙可位於第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子降溫貼合的雙鏈中較靠近第一連接子的位置,或者可位於較靠近第二連接子的位置。
藉由第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子之連接所生成的序列,包含對標的基因的基因 表現抑制序列。第一RNA部分或第四RNA部分可包含對標的基因的基因表現抑制序列(正義序列或反義序列;例如正義序列)。藉由連接而連結有第二RNA部分與第三RNA部分的序列,可包含對標的基因的基因表現抑制序列(反義序列或正義序列;例如反義序列)。於一實施形態,第二RNA部分或第三RNA部分可包含對標的基因的基因表現抑制序列(反義序列或正義序列;例如反義序列)。
於本發明之方法,連接子,例如第一連接子及第二連接子,可為非核苷酸性連接子、核苷酸性連接子、或彼等之組合。
於一實施形態,第一單股寡RNA分子於3’末端具有尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A),且第二單股寡RNA分子於5’末端具有尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A)。其中,單股寡RNA分子於3’末端或5’末端具有尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A)意指單股寡RNA分子之3’末端或5’末端之核糖核苷酸殘基包含作為鹼基之尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A)。具體而言,第一單股寡RNA分子之3’末端之核糖核苷酸殘基的鹼基與第二單股寡RNA分子之5’末端之核糖核苷酸殘基的鹼基之較佳組合可為U-A、U-U、A-U、或A-A。
圖1顯示本發明之方法之一實施形態的示意圖。圖1中,Lx1及Lx2為連接子(例如,非核苷酸性連接子、核苷酸性連接子、或彼等之組合)。於本發明之方法,係藉由將較短鏈之單股RNA分子之對進行連接而製造相較更長鏈之髮夾型單股RNA分子,藉此可實現高產 量。
於一實施形態,與本發明有關的抑制標的基因表現的髮夾型單股RNA分子之製造方法包含將下述式(I)所表示的第一單股寡RNA分子(圖1中,股1):5’-Xs-Lx1-Xa-3’‧‧‧式(I)
與下述式(II)所表示的第二單股寡RNA分子(圖1中,股2):5’-Ya1-Ya2-Ya3-Lx2-Ys-3’‧‧‧式(II)
進行降溫貼合的降溫貼合步驟;及將第一單股寡RNA分子之3’末端與第二單股寡RNA分子之5’末端進行連接的連接步驟。此連接可藉由Rnl2家族之連接酶而進行。
於另外的實施形態,與本發明有關的抑制標的基因表現的髮夾型單股RNA分子之製造方法包含將下述式(A)所表示的第一單股寡RNA分子:5’-XXs-Lx1-XXa3-XXa2-XXa1-3’‧‧‧式(A)
與下述式(B)所表示的第二單股寡RNA分子:5’-YYa-Lx2-YYs-3’‧‧‧式(B)
進行降溫貼合的降溫貼合步驟;及將第一單股寡RNA分子之3’末端與第二單股寡RNA分子之5’末端進行連接的連接步驟。此連接可藉由Rnl2家族之連接酶而進行。
於本發明,「寡RNA」及「寡RNA分子」係指具有49個鹼基長以下(不算入非核苷酸性連接子及核苷酸性連接子等之連接子部分的殘基數)之鹼基序列 的RNA分子。於本發明,用語「寡RNA」與「寡RNA分子」通常係交互使用。與本發明有關的單股寡RNA分子亦有稱為單股寡RNA、寡核酸、單股核酸分子、寡RNA、或寡RNA分子的情形。
式(I)及式(II)中,Xs、Xa、Ya1、Ya2、Ya3、及Ys表示1個或其以上之核糖核苷酸殘基。式(I)及式(II)中,Lx1及Lx2各自獨立地表示連接子,例如非核苷酸性連接子、核苷酸性連接子、或彼等之組合。
式(I)表示區域Xs與Xa經由Lx1而連結的結構。式(II)表示區域Ya1、Ya2、及Ya3以此順序所連結的核糖核苷酸序列(Ya1-Ya2-Ya3)與區域Ys經由Lx2而連結的結構。
式(A)及式(B)中,XXs、XXa3、XXa2、XXa1、YYa、及YYs表示1個或其以上之核糖核苷酸殘基。式(A)及式(B)中,Lx1及Lx2各自獨立表示連接子,例如非核苷酸性連接子、核苷酸性連接子、或彼等之組合。
式(A)表示區域XXa3、XXa2、及XXa1以此順序所連結的核糖核苷酸序列(XXa3-XXa2-XXa1)與區域XXs經由Lx1而連結的結構。式(B)表示區域YYa與YYs經由Lx2而連結的結構。
Xs、Xa、Ya1、Ya2、Ya3、Ys、XXs、XXa3、XXa2、XXa1、YYa、及YYs由核糖核苷酸殘基所構成。核糖核苷酸殘基可為具有選自腺嘌呤、尿嘧啶、鳥糞嘌呤、或胞嘧啶的任一核酸鹼基者。核糖核苷酸殘基又可為修飾核糖核苷酸殘基,例如可具有經修飾的核酸鹼基 (修飾鹼基)。就修飾而言,可列舉螢光色素標識、甲基化、鹵化、假尿苷(pseudouridine)化、胺基化、去胺基化、硫化、二氫化等,但未限定於此等。Xs、Xa、Ya1、Ya2、Ya3、及Ys各自獨立可為僅由非修飾核糖核苷酸殘基所構成者,可為除了非修飾核糖核苷酸殘基之外亦包含修飾核糖核苷酸殘基者,亦可為僅由修飾核糖核苷酸殘基所構成者。Xs可於5’末端包含修飾核糖核苷酸殘基。Ys可於3’末端包含修飾核糖核苷酸殘基。同樣地,XXs、XXa3、XXa2、XXa1、YYa、及YYs各自獨立可為僅由非修飾核糖核苷酸殘基所構成者,可為除了非修飾核糖核苷酸殘基之外亦包含修飾核糖核苷酸殘基者,亦可為僅由修飾核糖核苷酸殘基所構成者。XXs可於5’末端包含修飾核糖核苷酸殘基。YYs可於3’末端包含修飾核糖核苷酸殘基。
於本發明,於連接步驟所生成的Xa-Ya1(藉由連接而連結有Xa與Ya1的核苷酸序列)係與Xs互補。於一實施形態,Xs可為19~28個鹼基長,例如可為19~27個鹼基長、19~25個鹼基長、19~23個鹼基長、20~28個鹼基長、21鹼基~27鹼基、21鹼基~25鹼基、22~27個鹼基長、23~26個鹼基長、24~28個鹼基長、或26~28個鹼基長。
於本發明,於連接步驟所生成的XXa1-YYa(藉由連接而連結有XXa1與YYa的核苷酸序列)係與YYs互補。於一實施形態,YYs可為19~28個鹼基長,例如可為19~27個鹼基長、19~25個鹼基長、 19~23個鹼基長、20~28個鹼基長、21鹼基~27鹼基、21鹼基~25鹼基、22~27個鹼基長、23~26個鹼基長、24~28個鹼基長、或26~28個鹼基長。
於本發明,Xa係與Xs內之對應的殘基或序列互補。於一實施形態,式(I)中,Xs之鹼基序列可以與連接子鄰接的方式來包含C(胞嘧啶)。於此情形,Xa之鹼基序列係以與連接子鄰接的方式來包含G(鳥糞嘌呤),以與Xs成為互補。於一實施形態,式(I)中,Xs之鹼基序列可以與連接子鄰接的方式來包含CC(胞嘧啶-胞嘧啶)。於此情形,Xa之鹼基序列係以與連接子鄰接的方式來包含GG(鳥糞嘌呤-鳥糞嘌呤),以與Xs成為互補。於一實施形態,式(I)中,Xs之鹼基序列可以與連接子鄰接的方式來包含ACC(腺嘌呤-胞嘧啶-胞嘧啶)。於此情形,Xa之鹼基序列係以與連接子鄰接的方式來包含GGU(鳥糞嘌呤-鳥糞嘌呤-尿嘧啶),以與Xs成為互補。於一實施形態,Xa可於3’末端包含鹼基尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A)。Xa可為1~20個鹼基長,例如可為2~20個鹼基長、2~15個鹼基長、3~10個鹼基長、3~6個鹼基長、5~12個鹼基長或9~12個鹼基長。
於本發明,XXa3係與XXs互補。於一實施形態,式(A)中,XXs之鹼基序列可以與連接子鄰接的方式來包含C(胞嘧啶)。於此情形,XXa3之鹼基序列係以與連接子鄰接的方式來包含G(鳥糞嘌呤),以與XXs成為互補。於一實施形態,式(A)中,XXs之鹼基序列可以與連接子鄰接的方式來包含CC(胞嘧啶-胞嘧啶)。於此情 形,XXa3之鹼基序列係以與連接子鄰接的方式來包含GG(鳥糞嘌呤-鳥糞嘌呤),以與XXs成為互補。於一實施形態,式(A)中,XXs之鹼基序列可以與連接子鄰接的方式來包含ACC(腺嘌呤-胞嘧啶-胞嘧啶;以5’至3’之方向)。於此情形,XXa3之鹼基序列係以與連接子鄰接的方式來包含GGU(鳥糞嘌呤-鳥糞嘌呤-尿嘧啶;以5’至3’之方向),以與成為XXs互補。於一實施形態,XXa1之鹼基序列可於3’末端包含鹼基尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A)。XXa3及XXs較佳為1~7個鹼基長,例如1~4個鹼基長、1個鹼基長或2個鹼基長。於一實施形態,YYs為26~28個鹼基長的情形,XXa3及XXs可為1個鹼基長。
於本發明,Ya3係與Ys互補。於一實施形態,Ya3之鹼基序列可以與連接子鄰接的方式來包含C(胞嘧啶)。於此情形,Ys之鹼基序列係以與連接子鄰接的方式來包含G(鳥糞嘌呤),以與Ya3成為互補。Ya3及Ys較佳為1~7個鹼基長,例如1~4個鹼基長、1個鹼基長或2個鹼基長。於一實施形態,Xs為26~28個鹼基長的情形,Ya3及Ys可為1個鹼基長。
於本發明,YYa係與YYs內之對應的殘基或序列互補。於一實施形態,YYa之鹼基序列可以與連接子鄰接的方式來包含C(胞嘧啶)。於此情形,YYs之鹼基序列係以與連接子鄰接的方式來包含G(鳥糞嘌呤),以與YYa成為互補。YYa可為2~20個鹼基長,例如可為2~15個鹼基長、3~10個鹼基長、3~6個鹼基長、5~12個鹼基長或9~12個鹼基長。
於本發明,「互補」意指2個核酸或核苷酸於其之間可形成安定的鹼基配對。互補的2個核酸具有相同鹼基長度。互補的2個核酸,典型而言係由彼此之互補序列(互補鏈)所構成,即,為完全互補。或者,互補的2個核酸可於降溫貼合時對應的位置各自含有修飾鹼基及可與其形成鹼基對的核酸鹼基。
於連接後之與本發明有關的髮夾型單股RNA分子發生分子內降溫貼合(自降溫貼合)之際,Ya2係與Xs及Ys之任一者皆不形成鹼基配對。Ya2較佳為1~4個鹼基長,例如為1、2、或3個鹼基長。同樣地,於連接後之與本發明有關的髮夾型單股RNA分子發生分子內降溫貼合(自降溫貼合)之際,XXa2係與XXs及YYs之任一者皆不形成鹼基配對。XXa2較佳為1~4個鹼基長,例如為1、2、或3個鹼基長。
於第一單股寡RNA分子(股1),式(I)中之Xs與Xa之合計鹼基長度(不包含非核苷酸性連接子、核苷酸性連接子、或彼等之組合等之連接子部分)較佳為21~48個鹼基長,例如為21~45個鹼基長、25~45個鹼基長、26~35個鹼基長、26~30個鹼基長、26~28個鹼基長、或33~36個鹼基長。
於第二單股寡RNA分子(股2),式(II)中之Ya1較佳為6~27個鹼基長,例如為7~25個鹼基長、10~25個鹼基長、12~23個鹼基長、12~22個鹼基長、12~15個鹼基長、或18~23個鹼基長。
於第二單股寡RNA分子(股2),式(II)中之 Ya1、Ya2、Ya3、及Ys之合計鹼基長度(不包含非核苷酸性連接子、核苷酸性連接子、或彼等之組合等之連接子部分)較佳為13~45個鹼基長,例如為13~43個鹼基長、15~41個鹼基長、15~30個鹼基長、17~25個鹼基長、或20~25個鹼基長。
於第一單股寡RNA分子(股1),式(A)中之XXs、XXa3、XXa2、及XXa1之合計鹼基長度(不包含非核苷酸性連接子、核苷酸性連接子、或彼等之組合等之連接子部分)較佳為13~45個鹼基長,例如為13~43個鹼基長、15~41個鹼基長、15~30個鹼基長、17~25個鹼基長、或20~25個鹼基長。
XXa1較佳為6~27個鹼基長,例如為7~25個鹼基長、10~25個鹼基長、12~23個鹼基長、12~22個鹼基長、12~15個鹼基長、或18~23個鹼基長。
於第二單股寡RNA分子(股2),式(B)中之YYa與YYs之合計鹼基長度(不包含非核苷酸性連接子、核苷酸性連接子、或彼等之組合等之連接子部分)較佳為21~48個鹼基長,例如為21~45個鹼基長、25~45個鹼基長、26~35個鹼基長、26~30個鹼基長、26~28個鹼基長、或33~36個鹼基長。
於本發明,連接子,例如第一連接子及第二連接子,並未特別限定,可彼此獨立為例如非核苷酸性連接子、核苷酸性連接子、或彼等之組合。核苷酸性連接子係由1個以上之核苷酸殘基(核糖核苷酸殘基或去氧核糖核苷酸殘基,較佳為核糖核苷酸殘基)所構成。非核 苷酸性連接子不包含核苷酸殘基。於本發明所使用的連接子之構成單元並未特別限定,可為核苷酸殘基及/或非核苷酸殘基。為非核苷酸性連接子與核苷酸性連接子之組合的連接子,包含核苷酸殘基與非核苷酸殘基兩者。本發明之連接子,例如可以以下(1)~(7)之任一殘基構成。
(1)非修飾核苷酸殘基
(2)修飾核苷酸殘基
(3)非修飾核苷酸殘基與修飾核苷酸殘基之組合
(4)非核苷酸殘基
(5)非核苷酸殘基與非修飾核苷酸殘基之組合
(6)非核苷酸殘基與修飾核苷酸殘基之組合
(7)非核苷酸殘基、非修飾核苷酸殘基及修飾核苷酸殘基之組合
於一實施形態,第一連接子及第二連接子兩者可為由核苷酸殘基所構成者(核苷酸性連接子),或可為由非核苷酸殘基所構成者(非核苷酸性連接子)。或者,亦可第一連接子及第二連接子之一者係由核苷酸殘基所構成,另一者係由非核苷酸殘基所構成者。第一連接子及第二連接子(上述式中,Lx1及Lx2之連接子)可為相同結構,亦可為不同結構。
於本發明所使用的連接子,例如第一連接子及第二連接子(上述式中,Lx1及Lx2),於包含非核苷酸殘基的情形,非核苷酸殘基之個數並未特別限定,例如可為1~8個、1~6個、1~4個、1、2或3個。「非核 苷酸殘基」係指非核苷酸性連接子之構成單元。非核苷酸殘基並未限定於以下,但例如可為具有吡咯啶骨架或哌啶骨架的環狀胺衍生物等。非核苷酸殘基,例如,可將後述之式(III)所表示的結構作為單元(1個)。
於本發明之一實施形態,連接子,例如第一連接子及第二連接子(上述式中,Lx1及Lx2),可為包含1個以上之吡咯啶骨架及哌啶骨架之至少一者的非核苷酸性連接子。第一連接子及第二連接子(上述式中,Lx1及Lx2)可為相同結構,亦可為不同結構。第一連接子及第二連接子(上述式中,Lx1及Lx2)各自獨立為可具有包含吡咯啶骨架的非核苷酸結構,可具有包含哌啶骨架的非核苷酸結構,亦可具有包含上述吡咯啶骨架的非核苷酸結構及包含上述哌啶骨架的非核苷酸結構兩者。依據本發明之方法所製造的髮夾型單股RNA分子,藉由以此種連接子來連結正義股與反義股,而核酸酶耐性優異。
於本發明之髮夾型單股RNA分子,吡咯啶骨架可為例如構成吡咯啶之5員環的碳原子1個以上經取代的吡咯啶衍生物之骨架,於被取代的情形,較佳為例如2位之碳原子(C-2)以外的碳原子。上述碳原子可被例如氮原子、氧原子或硫原子取代。吡咯啶骨架,例如,於吡咯啶之5員環內可包含例如碳-碳雙鍵或碳-氮雙鍵。於上述吡咯啶骨架,構成吡咯啶之5員環的碳原子及氮原子,例如,可有氫原子鍵結,亦可有如後述的取代基鍵結。連接子Lx1,例如,可經由上述吡咯啶骨架之任一者之基,而將式(I)中的Xs與Xa、及式(A)中的 XXs與XXa3連結。連接子Lx2,例如,可經由上述吡咯啶骨架之任一者之基,而將式(II)中的Ya3與Ys、及式(B)中的YYa與YYs連結。彼等可經由上述5員環之任1個碳原子與氮原子而連結,較佳為經由上述5員環之2位的碳原子(C-2)與氮原子而連結。就上述吡咯啶骨架而言,可列舉例如脯胺酸骨架、脯胺醇(prolinol)骨架等。
上述哌啶骨架可為例如構成哌啶之6員環的碳1個以上經取代的哌啶衍生物之骨架,於被取代的情形,例如較佳為C-2碳原子以外的碳原子。上述碳原子可被例如氮原子、氧原子或硫原子取代。上述哌啶骨架,例如,於哌啶之6員環內可包含例如碳-碳雙鍵或碳-氮雙鍵。於上述哌啶骨架,構成哌啶之6員環的碳原子及氮原子,例如,可有氫原子鍵結,亦可有如後述的取代基鍵結。連接子Lx1,例如,可經由上述哌啶骨架之任一者之基,而將式(I)中的Xs與Xa、及式(A)中的XXs與XXa3連結。連接子Lx2,例如,可經由上述哌啶骨架之任一者之基,而將式(II)中的Ya3與Ys、及式(B)中的YYa與YYs連結。彼等可經由上述6員環之任1個碳原子與氮原子而連結,較佳為經由上述6員環之2位的碳原子(C-2)與氮原子而連結。
上述連接子,例如,可僅包含由上述之非核苷酸結構所構成的非核苷酸殘基。
上述連接子區域,例如,可包含1個或2個以上之以下述式(III)所表示或以下述式(III)所表示的非核苷酸殘基。
上述式(III)中,X1及X2各自獨立為H2、O、S或NH;Y1及Y2各自獨立為單鍵、CH2、NH、O或S;R3為與環A上之C-3、C-4、C-5或C-6鍵結的氫原子或取代基,L1為由n個原子所構成的伸烷基鏈,其中,伸烷基碳原子上之氫原子可被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、或SRa取代,亦可未被取代,或者L1為上述伸烷基鏈之一個以上的碳原子經氧原子取代的聚醚鏈,其中,Y1為NH、O或S的情形,與Y1結合的L1之原子為碳,與OR1結合的L1之原子為碳,氧原子彼此不鄰接;L2為由m個原子所構成的伸烷基鏈,其中,伸烷基碳原子上之氫原子可被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代,亦可未被取代,或者L2為上述伸烷基鏈之一個以上的碳原子經氧原子取代的聚醚鏈,其中,Y2為NH、O或S的情形,與Y2結合的L2之原子為碳,與OR2結合的L2之原子為碳,氧原子彼此 不鄰接;Ra、Rb、Rc及Rd各自獨立為取代基或保護基;l為1或2;m為0~30之範圍的整數;n為0~30之範圍的整數;環A係環A上之C-2以外的1個碳原子可被氮原子、氧原子、硫原子取代,於環A內,可包含碳-碳雙鍵或碳-氮雙鍵,其中,R1及R2可存在,亦可不存在,於存在的情形,R1及R2各自獨立為R1及R2不存在之式(III)所表示的非核苷酸殘基。
式(I)中的Xs與Xa、式(A)中的XXs與XXa3,可經由式(III)中之-OR1-或-OR2-而與連接子Lx1連結。於一實施形態,可Xs經由-OR1-、Xa經由-OR2-而與連接子Lx1連結。於另一實施形態,可Xs經由-OR2-、Xa經由-OR1-而與連接子Lx1連結。於另一實施形態,可XXs經由-OR1-、XXa3經由-OR2-而連接子Lx1連結。於另一實施形態,可XXs經由-OR2-、XXa3經由-OR1-而與連接子Lx1連結。
式(II)中的Ya3與Ys、式(B)中的YYa與YYs,可經由式(III)中之-OR1-或-OR2-而與連接子Lx2連結。於一實施形態,可Ya3經由-OR1-、Ys經由-OR2-而與連接子Lx2連結。於另一實施形態,可Ya3經由-OR2-、Ys經由-OR1-而與連接子Lx2連結。於另一實施形態,可YYa經由-OR1-、YYs經由-OR2-而與連接子Lx2連結。 於另一實施形態,可YYa經由-OR2-、YYs經由-OR1-而與連接子Lx2連結。
於一較佳實施形態,可Xs經由-OR2-、Xa經由-OR1-而與連接子Lx1連結,進一步Ya3經由-OR2-、Ys經由-OR1-而與連接子Lx2連結。於較佳另一實施形態,可XXs經由-OR2-、XXa3經由-OR1-而與連接子Lx1連結,進一步YYa經由-OR2-、YYs經由-OR1-而與連接子Lx2連結。
上述式(III)中,X1及X2,例如各自獨立為H2、O、S或NH。於上述式(III)中,X1為H2意指X1及與X1結合的碳原子一起形成CH2(亞甲基)。關於X2亦相同。
上述式(III)中,Y1及Y2各自獨立為單鍵、CH2、NH、O或S。
上述式(III)中,於環A,l為1或2。l=1的情形,環A為5員環,例如為上述吡咯啶骨架。上述吡咯啶骨架,可列舉例如脯胺酸骨架、脯胺醇骨架等,可例示此等之二價的結構。l=2的情形,環A為6員環,例如為上述哌啶骨架。環A係環A上之C-2以外的1個碳原子可被氮原子、氧原子或硫原子取代。又,環A係可於環A內包含碳-碳雙鍵或碳-氮雙鍵。環A,例如,可為L型及D型之任一者。
上述式(III)中,R3為與環A上之C-3、C-4、C-5或C-6結合的氫原子或取代基。R3為上述取代基的情形,取代基R3可為1個亦可為複數個,亦可不存在, 於複數個的情形,可相同,亦可不同。
取代基R3,例如為鹵素、OH、OR4、NH2、NHR4、NR4R5、SH、SR4或側氧基(=O)等。
R4及R5例如各自獨立為取代基或保護基,可相同,亦可不同。上述取代基可列舉例如:鹵素、烷基、烯基、炔基、鹵烷基、芳基、雜芳基、芳基烷基、環烷基、環烯基、環烷基烷基、環狀基烷基(cyclylalkyl)、羥基烷基、烷氧基烷基、胺基烷基、雜環狀基烯基(heterocyclylalkenyl)、雜環狀基烷基(heterocyclylalkyl)、雜芳基烷基、矽基、矽氧基烷基等。以下相同。取代基R3可為此等列舉的取代基。
上述保護基例如為將反應性高的官能基變換為惰性的官能基,可列舉周知之保護基等。上述保護基例如可援用文獻(J.F.W.McOmie,「Protecting Groups in Organic Chemistry」Plenum Press,London and New York,1973)之記載。上述保護基並未特別限制,可列舉例如:三級丁基二甲基矽基(TBDMS)、雙(2-乙醯氧基乙氧基)甲基(ACE)、三異丙基矽氧基甲基(TOM)、1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)、2-氰基乙氧基甲基(CEM)及甲苯基磺醯基乙氧基甲基(TEM)、二甲氧基三苯甲基(DMTr)等。R3為OR4的情形,上述保護基並未特別限制,可列舉例如:TBDMS基、ACE基、TOM基、CEE基、CEM基及TEM基等。除此之外,亦可列舉含有矽基的基。以下相同。
上述式(III)中,L1為由n個之原子所構成的 伸烷基鏈。上述伸烷基碳原子上之氫原子,例如可被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、或SRa取代,亦可未被取代。或者,L1可為上述伸烷基鏈之1個以上的碳原子經氧原子取代的聚醚鏈。上述聚醚鏈例如為聚乙二醇。此外,Y1為NH、O或S的情形,與Y1結合的L1之原子為碳,與OR1結合的L1之原子為碳,氧原子彼此不鄰接。即,例如Y1為O的情形,其氧原子與L1之氧原子並不鄰接,OR1之氧原子與L1之氧原子並不鄰接。
上述式(III)中,L2為由m個之原子所構成的伸烷基鏈。上述伸烷基碳原子上之氫原子,例如可被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代,亦可未被取代。或者,L2亦可為上述伸烷基鏈之1個以上之碳原子經氧原子取代的聚醚鏈。此外,Y2為NH、O或S的情形,與Y2結合的L2之原子為碳,與OR2結合的L2之原子為碳,氧原子彼此不鄰接。即,例如Y2為O的情形,其氧原子與L2之氧原子不鄰接,OR2之氧原子與L2之氧原子不鄰接。
L1之n及L2之m未特別限制,各自的下限為例如0,上限亦未特別限制。n及m可因應例如連接子Lx1及Lx2之期望的長度而適當設定。n及m,例如由製造成本及產率等之觀點來看,各自較佳為0~30,更較佳為0~20,進一步較佳為0~15。n與m可相同(n=m),亦可不同。n+m例如為0~30,較佳為0~20,更佳為0~15。
Ra、Rb、Rc及Rd例如各自獨立為取代基或保 護基。上述取代基及上述保護基例如與前述相同。
於上述式(III),氫原子,例如,各自獨立而可被取代為Cl、Br、F及I等之鹵素。
於較佳實施形態,上述連接子為下述式(IV-1)~(IV-9)之任一者所表示者、或可為包含1個或2個以上之下述式(IV-1)~(IV-9)所表示的非核苷酸殘基者。於下述式,q為0~10之整數。於下述式,n及m與上述式(III)相同。就具體例而言,於式(IV-1)可列舉n=8,於式(IV-2)可列舉n=3,於式(IV-3)可列舉n=4或8,於式(IV-4)可列舉n=7或8,於式(IV-5)可列舉n=3及m=4,於式(IV-6)可列舉n=8及m=4,於式(IV-7)可列舉n=8及m=4,於式(IV-8)可列舉n=5及m=4,於式(IV-9)可列舉q=1及m=4。
於一實施形態,上述連接子為下述式(V)或(VI)所表示者、或可為包含1個或2個以上之下述式(V)或(VI)所表示的非核苷酸殘基者。
於一實施形態,可第一RNA部分(Xs、XXs)係於式(VI)中之2位碳原子側、第二RNA部分(Xa、XXa3)係於式(VI)中之1位氮原子側而與連接子Lx1連結,第三RNA部分(Ya3、YYa)係於2位碳原子側、第四RNA部分(Ys、YYs)係於式(VI)中之1位氮原子側而與連接子Lx2連結。
式(VI)所表示的連接子可為下述式(VI-1)或(VI-2)所表示的光學活性體。
於第一及第二單股寡RNA分子,Xa係與Xs之3’側區域為互補,Ya3係與Ys為互補。因此,於第一單股寡RNA分子,Xa向Xs折疊,Xa藉由與Xs自降溫貼合而形成雙鏈。同樣地,於第二單股寡RNA分子,Ys向Ya3折疊,Ys藉由與Ya3自降溫貼合而形成雙鏈。
於第一及第二單股寡RNA分子,YYa係與YYs之5’側區域互補,XXa3係與XXs互補。因此,於第一單股寡RNA分子,XXa3向XXs折疊,XXa3藉由與XXs自降溫貼合而形成雙鏈。同樣地,於第二單股寡RNA分子,YYa向YYs折疊,YYa藉由與YYs自降溫貼合而形成雙鏈。
如上述的連接子容易形成β轉折(β turn)結構。因此,式(I)之第一單股寡RNA分子,藉由連接子Lx1於β轉折側採折疊結構,可認為藉此而Xa與Xs自降溫貼合之際採取Xa之3’末端容易接近式(II)之第二單股寡RNA分子的5’末端(Ya1之5’末端)的結構。於式(A)及(B)之第一及第二單股寡RNA分子亦相同。
於另外的實施形態,連接子,例如第一連接子及第二連接子(上述式中,Lx1及Lx2),可為由1個以 上之核苷酸殘基所構成的核苷酸性連接子。連接子為核苷酸性連接子的情形,其長度並未特別限定,較佳為不妨礙連接子之前後序列之長度,例如,不妨礙利用第一RNA部分與第二RNA部分、或第三RNA部分與第四RNA部分的雙鏈形成之長度。為核苷酸性連接子的第一連接子及第二連接子(上述式中,Lx1及Lx2)之長度(鹼基數)及鹼基序列可相同,亦可不同。其核苷酸性連接子之長度,例如可為1個鹼基以上、2個鹼基以上、或3個鹼基以上,且例如可為100個鹼基以下、80個鹼基以下、或50個鹼基以下。該種核苷酸性連接子之長度,例如可為1~50個鹼基、1~30個鹼基、3~20個鹼基、3~10個鹼基、或3~7個鹼基,例如可為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個鹼基。核苷酸性連接子較佳為不自互補、於序列內部不發生自降溫貼合的結構者。
於本發明所使用的連接子,例如第一連接子及第二連接子(上述式中,Lx1及Lx2),包含非修飾核苷酸殘基與修飾核苷酸殘基(例如,修飾核糖核苷酸殘基)的情形,修飾核苷酸殘基之個數並未特別限定,例如1~5個、1~4個、1~3個,例如可為1個或2個。
作為於本發明所使用的核苷酸性連接子之例,可列舉由5’-C-A-C-A-C-C-3’、5’-C-C-A-C-A-C-C-3’、或5’-U-U-C-G-3’之RNA序列所構成的連接子。於一實施形態,第一連接子及第二連接子(上述式中,Lx1及Lx2)係各自獨立選自5’-C-A-C-A-C-C-3’、5’-C-C-A-C-A-C-C-3’、及5’-U-U-C-G-3’。於一實施形 態,第一連接子由5’-C-A-C-A-C-C-3’之RNA序列所構成,第二連接子由5’-U-U-C-G-3’之RNA序列所構成。
第一及第二單股寡RNA分子,可使用所屬技術領域中具有通常知識者周知之RNA合成法而製作。就所屬技術領域中具有通常知識者周知之RNA合成法而言,可列舉例如亞磷醯胺法、H-膦酸酯(H-phosphonate)法等。於亞磷醯胺法,係將結合於撐體(support)之疏水性基的核糖核苷藉由與RNA亞磷醯胺(核糖核苷亞磷醯胺)之縮合反應而伸長,經氧化及去保護,重複進行與RNA亞磷醯胺之縮合反應,藉此可進行RNA合成。若以式(I)及(II)之第一及第二單股寡RNA分子為例加以說明,則與本發明有關的第一及第二單股寡RNA分子,可藉由依序進行下列而製作:藉由RNA合成法,例如亞磷醯胺法,進行自3’末端側至緊鄰連接子之前為止的序列(Xa、Ys)之合成後,鍵結如具有吡咯啶骨架或哌啶骨架的環狀胺衍生物的非核苷酸殘基而形成連接子,於其末端進一步進行自連接子至5’末端為止的序列(Xs;或Ya3、Ya2、及Ya1)之合成。或者,與本發明有關的第一及第二單股寡RNA分子,可藉由依序進行下列而製作:藉由RNA合成法,例如亞磷醯胺法,進行自3’末端側至緊鄰核苷酸性連接子之前的序列(Xa、Ys)之合成,接著合成核苷酸性連接子之序列,再依序進行自核苷酸性連接子之後至5’末端為止的序列(Xs;或Ya3、Ya2、及Ya1)之合成。使用非核苷酸性連接子與核苷酸性連接子之組合的情形,及使用式(A)及(B)之第一及第二單股寡RNA 分子的情形,亦可按照上述之方法而製作。於本發明,可使用任意之RNA亞磷醯胺,例如亦可使用於2位之羥基具有三級丁基二甲基矽基(TBDMS)、三異丙基矽氧基甲基(TOM)、雙(2-乙醯氧基乙氧基)甲基(ACE)1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)、2-氰基乙氧基甲基(CEM)、甲苯基磺醯基乙氧基甲基(TEM)、二甲氧基三苯甲基(DMTr)等之各式各樣的保護基的泛用型RNA亞磷醯胺。又,於本發明,於RNA合成可使用聚苯乙烯系撐體、丙烯醯胺系撐體、或玻璃撐體等之任意之固相撐體。撐體可為珠、板、薄片、管等之任意形態。作為撐體之例,可列舉聚苯乙烯珠,例如NittoPhase(R)HL rG(ibu)、或rU(KINOVATE),但未限定於此等。
上述連接子之中,用以形成非核苷酸性連接子之環狀胺衍生物為RNA合成用之單體,例如具有下述式(VII)之結構。此環狀胺衍生物,基本上與上述之各連接子結構對應,關於連接子結構之說明亦援用於此環狀胺衍生物。形成連接子的環狀胺衍生物,例如可作為自動核酸合成用之亞磷醯胺使用,例如可適用於一般的核酸自動合成裝置。
上述式(VII)中,X1及X2各自獨立為H2、O、S或NH;Y1及Y2各自獨立為單鍵、CH2、NH、O或S;R1及R2各自獨立為H、保護基或磷酸保護基;R3係與環A上之C-3、C-4、C-5或C-6結合的氫原子或取代基;L1係由n個原子所構成的伸烷基鏈,其中,伸烷基碳原子上之氫原子可被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、或SRa取代,亦可未被取代,或者L1係上述伸烷基鏈之一個以上之碳原子經氧原子取代的聚醚鏈,其中,Y1為NH、O或S的情形,與Y1結合的L1之原子為碳,與OR1結合的L1之原子為碳,氧原子彼此不鄰接;L2係由m個原子所構成的伸烷基鏈,其中,伸烷基碳原子上之氫原子可被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代,亦可未被取代,或者L2係上述伸烷基鏈之一個以上的碳原子經氧原子取代的聚醚鏈, 其中,Y2為NH、O或S的情形,與Y2結合的L2之原子為碳,與OR2結合的L2之原子為碳,氧原子彼此不鄰接;Ra、Rb、Rc及Rd各自獨立為取代基或保護基;l為1或2;m為0~30之範圍的整數;n為0~30之範圍的整數;環A係環A上之C-2以外的1個碳原子可被氮原子、氧原子或硫原子取代,於環A內可包含碳-碳雙鍵或碳-氮雙鍵。
於上述式(VII),關於與上述式(III)相同處,可援用上述式(III)之說明。具體而言,於上述式(VII),例如X1、X2、Y1、Y2、R3、L1、L2、l、m、n及環A可援用上述式(III)之全部說明。
於上述式(VII),R1及R2係如前述,各自獨立為H、保護基或磷酸保護基。
上述保護基,例如與上述式(III)中的說明相同,作為具體例,例如可選自群I。上述群I,可列舉例如二甲氧基三苯甲基(DMTr)基、TBDMS基、ACE基、TOM基、CEE基、CEM基、TEM基、及下述式所示的含有矽基的基,其中尤以DMTr基及上述含有矽基的基之任一者為較佳。
上述磷酸保護基,例如可以下述式表示。
-P(OR6)(NR7R8)
於上述式,R6為氫原子或任意之取代基。R6例如較佳為烴基,上述烴基可被電子吸引基取代,亦可未被取代。R6可列舉例如鹵素、鹵烷基、雜芳基、羥基烷基、烷氧基烷基、胺基烷基、矽基、矽氧基烷基、雜環狀基烯基、雜環狀基烷基、雜芳基烷基、及烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、環烷基、環烯基、環烷基烷基、環狀基烷基等之烴等,再者,可被電子吸引基取代,亦可未被取代。R6,具體而言,可列舉例如β-氰基乙基、硝基苯基乙基、甲基等。
R7及R8各自獨立為氫原子或任意之取代基,可相同亦可不同。R7及R8例如較佳為烴基,上述烴基可進一步被任意之取代基取代,亦可未被取代。上述烴基,例如與前述的上述R6中列舉者相同,較佳為甲基、乙基、異丙基。於此情形,-NR7R8,具體而言,可列舉例如二異丙基胺基、二乙基胺基、乙基甲基胺基等。或者,取代基R7及R8可成為一體,與彼等所鍵結的氮原子一起(即,-NR7R8成為一體)形成含有氮的環(例如, 哌啶基、啉基等)。
作為上述磷酸保護基之具體例,例如可選自下述群II。群II可列舉例如-P(OCH2CH2CN)(N(i-Pr)2)、-P(OCH3)(N(i-Pr)2)等。於上述式,i-Pr表示異丙基。
於上述式(VII),例如R1及R2係任一者為H或保護基,另一者為H或磷酸保護基。較佳為例如R1為上述保護基的情形,R2較佳為H或上述磷酸保護基,具體而言,R1為選自上述群I的情形,R2較佳為H或選自上述群II者。又,較佳為例如R1為上述磷酸保護基的情形,R2較佳為H或上述保護基,具體而言,R1選自上述群II的情形,R2較佳為H或選自上述群I者。
上述環狀胺衍生物可為下述式(VII-1)~(VII-9)之任一者所表示者。於下述式,n及m係與上述式(VII)相同。於下述式,q為0~10之整數。作為具體例,於式(VII-1)可列舉n=8,於式(VII-2)可列舉n=3,於式(VII-3)可列舉n=4或8,於式(VII-4)可列舉n=7或8,於式(VII-5)可列舉n=3及m=4,於式(VII-6)可列舉n=8及m=4,於式(VII-7)可列舉n=8及m=4,於式(VII-8)可列舉n=5及m=4,於式(VII-9)可列舉q=1及m=4。
於一實施形態,上述環狀胺衍生物可為下述式(VIII)所表示的脯胺醇衍生物或下述式(IX)所表示的脯胺酸衍生物所表示者。
上述環狀胺衍生物,例如可包含標識物質,例如安定同位素。
上述環狀胺衍生物,例如可按照國際公開WO2013/027843或國際公開WO2016/159374記載之核酸分子合成用單體之製造方法而合成。
於本發明之方法,藉由將上述之第一單股寡RNA分子(例如,圖1中,股1)與第二單股寡RNA分子(例如,圖1中,股2)降溫貼合、連接,可製造與本發明有關的抑制標的基因表現的髮夾型單股RNA分子。
於依據本發明之方法所製造的髮夾型單股RNA分子,於連接步驟所生成的Xa-Ya1-Ya2-Ya3包含對標的基因的基因表現抑制序列。基因表現抑制序列可包含於Xa、Xa-Ya1、Xa-Ya1-Ya2、或Xa-Ya1-Ya2-Ya3中。同樣地,於連接步驟所生成的XXa3-XXa2-XXa1-YYa包含對標的基因的基因表現抑制序列。基因表現抑制序列可包含於YYa、XXa1-YYa、XXa2-XXa1-YYa、或XXa3-XXa2-XXa1-YYa中。基因表現抑制序列,較佳為自 標的基因轉錄的mRNA之整體或一部分的正義序列或反義序列。此外,於連接步驟所生成的Xa-Ya1係與Xs互補,因此Xs亦可包含對標的基因的基因表現抑制序列。同樣地,XXa1-YYa係與YYs互補,因此YYs亦可包含對標的基因的基因表現抑制序列。
上述髮夾型單股RNA分子可包含1個基因表現抑制序列,亦可包含2個以上。上述髮夾型單股RNA分子,例如可具有2個以上對相同標的基因的相同基因表現抑制序列,亦可具有2個以上對相同標的的不同基因表現抑制序列,亦可具有2個以上對不同標的基因的不同基因表現抑制序列。具有2個以上對不同標的基因的基因表現抑制序列的髮夾型單股RNA分子,對於2種類以上之不同標的基因的表現抑制為有用的。於本發明,「基因」係指被轉錄為mRNA的基因體區域,雖可為蛋白質編碼區域,但亦可為RNA編碼區域。
與本發明有關的髮夾型單股RNA分子具有經由基因表現抑制序列而抑制標的基因表現的能力。因與本發明有關的髮夾型單股RNA分子所致的標的基因表現抑制,較佳為利用RNA干擾者,但未限定於此。RNA干擾一般而言係指下述現象:長雙股RNA(dsRNA)於細胞內被切丁酶(Dicer)切斷成3’末端突出的19~21鹼基對左右的短雙股RNA(siRNA:small interfering RNA),其一者之單股RNA與標的mRNA結合,藉由將標的mRNA分解,而抑制標的mRNA的轉譯,藉此抑制來自標的mRNA的標的基因的表現。與標的mRNA結合的 siRNA所包含的單股RNA之序列,例如因應標的基因的種類而已報告有各式各樣的種類。本發明例如可將siRNA所包含的單股RNA之序列(較佳為反義序列)作為基因表現抑制序列使用。依據本發明之方法所製造的髮夾型單股RNA分子,於活體內被切斷而生成siRNA,藉此可抑制標的基因的表現。與本發明有關的髮夾型單股RNA分子,可使用於用以治療或預防與標的基因之表現或表現增加有關連的疾病或障礙。
基因表現抑制序列,較佳為19~30個鹼基長,更佳為19~27個鹼基長,例如可為19、20、21、22、或23個鹼基長。基因表現抑制序列較佳為由與標的基因之mRNA的至少一部分序列完全相同或完全互補的RNA序列所構成。基因表現抑制序列,可針對標的基因之鹼基序列,藉由通常方法而設計。
標的基因可為任意之基因,例如可為任意之疾病關連基因。標的基因較佳為來自與藉由髮夾型單股RNA分子而於活體、細胞、組織或器官等中引起基因表現抑制的對象相同的生物種類者,例如可為來自包含人類、黑猩猩、大猩猩等之靈長類;馬、牛、豬、綿羊、山羊、駱駝、驢等之家畜;狗、貓、兔子等之寵物;小鼠、大鼠、天竺鼠等之齧齒類等的哺乳動物;魚類、昆蟲等之動物;植物、真菌等者。作為標的基因,並未特別限定,可列舉例如TGF-β1基因、GAPDH基因、LAMA1基因、LMNA基因。人類TGF-β1(轉形生長因子-β1(transforming growth factor-β1))基因之mRNA序列, 例如可基於GenBank(NCBI)登錄號NM_000660而取得(NCBI Gene ID:7040)。人類GAPDH(甘油醛-3-磷酸去氫酶)基因之mRNA序列,例如可基於GenBank(NCBI)登錄號NM_002046而取得(NCBI Gene ID:2597)。人類LAMA1基因之mRNA序列,例如可基於GenBank登錄號NM_005559而取得(NCBI Gene ID:284217)。人類LMNA基因之mRNA序列,例如可基於GenBank登錄號NM_170707而取得(NCBI Gene ID:4000)。標的基因為TGF-β1基因的情形,依據本發明之方法所製造的髮夾型單股RNA分子,於活體內抑制TGF-β1基因的表現。該種髮夾型單股RNA分子,透過TGF-β1基因之基因表現抑制,可使用於用以治療或預防與TGF-β1基因之表現或表現增加有關連的疾病或障礙,例如肺纖維化或急性肺疾病。同樣地,抑制GAPDH基因、LAMA1基因、LMNA基因等之其它標的基因表現的與本發明有關的髮夾型單股RNA分子,亦透過該標的基因的表現抑制,可使用於用以治療或預防與該標的基因之表現或表現增加有關的疾病或障礙。
依據本發明之方法所製造的抑制標的基因表現的髮夾型單股RNA分子之一例,為包含序列識別號1所表示的鹼基序列,且第24號及第25號之核苷酸(核糖核苷酸殘基)經由連接子(Lx1)而連結,第50號及第51號之核苷酸(核糖核苷酸殘基)經由連接子(Lx2)而連結的RNA分子(例如,圖2)。包含序列識別號1所表示的鹼基序列的該種髮夾型單股RNA分子,於5’末端至3’末 端之方向,包含:包含序列識別號2所表示的鹼基序列的RNA序列、上述之連接子(非核苷酸性連接子、核苷酸性連接子、或彼等之組合;圖1之Lx1)、包含序列識別號3所表示的鹼基序列的RNA序列、上述之連接子(非核苷酸性連接子、核苷酸性連接子、或彼等之組合;圖1之Lx2)、及鹼基G(鳥糞嘌呤)。包含序列識別號1所表示的鹼基序列的上述髮夾型單股RNA分子包含對為標的基因的TGF-β1基因的基因表現抑制序列。序列識別號1所表示的鹼基序列之第29號~第47號之序列相當於基因表現抑制序列(活性序列;序列識別號50)。本發明提供包含此基因表現抑制序列的髮夾型單股RNA分子之製造方法。
用以製造該種RNA分子之第一單股寡RNA分子(股1)與第二單股寡RNA分子(股2)之例,可為後述之表1所列舉者。於表1所列舉的第一單股寡RNA分子(股1)與第二單股寡RNA分子(股2)之序列,包含P(脯胺酸衍生物)的連接子,可被取代為上述之外的非核苷酸性連接子或核苷酸性連接子等之任意之連接子。於一實施形態,第一單股寡RNA分子較佳為於3’末端具有尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A),且第二單股寡RNA分子較佳為於5’末端具有尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A)。
作為用以製造包含序列識別號1所表示的鹼基序列的髮夾型單股RNA分子之特佳的第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子之對,可列舉以下:(1)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基經由第 一連接子(Lx1)而連結的序列識別號7所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第10號及第11號之核糖核苷酸殘基經由第二連接子(Lx2)而連結的序列識別號6所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合;(2)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基經由第一連接子(Lx1)而連結的序列識別號19所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第16號及第17號之核糖核苷酸殘基經由第二連接子(Lx2)而連結的序列識別號18所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合;(3)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基經由第一連接子(Lx1)而連結的序列識別號27所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第20號及第21號之核糖核苷酸殘基經由第二連接子(Lx2)而連結的序列識別號26所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合;(4)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基經由第一連接子(Lx1)而連結的序列識別號29所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第21號及第22號之核糖核苷酸殘基經由第二連接子(Lx2)而連結的序列識別號28所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合;(5)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基經由第一連接子(Lx1)而連結的序列識別號31所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第22號及第23號之 核糖核苷酸殘基經由第二連接子(Lx2)而連結的序列識別號30所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合;及(6)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基經由第一連接子(Lx1)而連結的序列識別號33所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第23號及第24號之核糖核苷酸殘基經由第二連接子(Lx2)而連結的序列識別號32所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合。
此等之第一單股寡RNA分子於3’末端(Xa之3’末端)包含U或A。此等之第二單股寡RNA分子於5’末端(Ya1之5’末端)包含U或A。
其中,例如關於(1)之第一單股寡RNA分子,「第24號及第25號之核糖核苷酸殘基經由第一連接子(Lx1)而連結」意指於第一單股寡RNA分子,序列識別號19所表示的鹼基序列之第24號之核糖核苷酸殘基(鹼基:C)及第25號之核糖核苷酸殘基(鹼基:G)係經由第一連接子Lx1而結合。此外,與本發明中的單股寡RNA分子及髮夾型單股RNA分子有關的所謂「第X號及第Y號之核糖核苷酸殘基經由Z而連結」的表現,亦根據此而解釋。
於(1)~(6)之第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子,連接子Lx1及Lx2較佳為式(VI)所表示者,例如式(VI-1)或式(VI-2)所表示者。
於較佳實施形態,(1)~(6)之第一單股寡 RNA分子與第二單股寡RNA分子具有式(VI)所表示的連接子作為Lx1及Lx2,可式(I)之Xa於式(VI)中之1位氮原子側、Xs於2位碳原子側而與連接子Lx1連結,Ys於式(VI)中之1位氮原子側、Ya3於2位碳原子側而與連接子Lx2連結。
本發明提供一種單股寡RNA分子,其可使用作為按照本發明之方法而用以製造髮夾型單股RNA分子之第一單股寡RNA分子或第二單股寡RNA分子。
於一實施形態,作為抑制為標的基因的TGF-β1基因之表現的髮夾型單股RNA分子之製造所使用的單股寡RNA分子之例,可列舉下述(a)~(1),但未限定於此等:(a)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基經由連接子而連結的序列識別號7所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子、(b)包含第10號及第11號之核糖核苷酸殘基經由連接子而連結的序列識別號6所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子、(c)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基經由連接子而連結的序列識別號19所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子、(d)包含第16號及第17號之核糖核苷酸殘基經由連接子而連結的序列識別號18所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子、(e)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基經由連 接子而連結的序列識別號27所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子、(f)包含第20號及第21號之核糖核苷酸殘基經由連接子而連結的序列識別號26所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子、(g)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基經由連接子而連結的序列識別號29所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子、(h)包含第21號及第22號之核糖核苷酸殘基經由連接子而連結的序列識別號28所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子、(i)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基經由連接子而連結的序列識別號31所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子、(j)包含第22號及第23號之核糖核苷酸殘基經由連接子而連結的序列識別號30所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子、(k)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基經由連接子而連結的序列識別號33所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子、及(l)包含第23號及第24號之核糖核苷酸殘基經由連接子而連結的序列識別號32所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子。
於較佳實施形態,可組合單股寡RNA分子(a)及(b);(c)及(d);(e)及(f);(g)及(h);(i)及(j);或(k)及 (l),而使用於與本發明有關的髮夾型單股RNA分子之製造方法。
作為另一實施形態,藉由本發明之方法所製造的對為GAPDH基因、LAMA1基因、或LMNA基因的標的基因的髮夾型單股RNA分子之例,示於圖17。對GAPDH基因的髮夾型單股RNA分子之例,為包含序列識別號51所表示的鹼基序列,且第22號及第23號之核苷酸(核糖核苷酸殘基)經由第一連接子(Lx1)而連結,第48號與第49號之核苷酸(核糖核苷酸殘基)經由第二連接子(Lx2)而連結的RNA分子。對LAMA1基因的髮夾型單股RNA分子之例,為包含序列識別號52所表示的鹼基序列,且第24號及第25號之核苷酸(核糖核苷酸殘基)經由第一連接子(Lx1)而連結,第50號及第51號之核苷酸(核糖核苷酸殘基)經由第二連接子(Lx2)而連結的RNA分子。對LAMA1基因的髮夾型單股RNA分子之另一例,為包含序列識別號53所表示的鹼基序列,且第24號與第31號之核苷酸(核糖核苷酸殘基)經由核苷酸性之第一連接子(Lx1)而連結,第56號與第61號之核苷酸(核糖核苷酸殘基)經由核苷酸性之第二連接子(Lx2)而連結的RNA分子。對LMNA基因的髮夾型單股RNA分子之例,為包含序列識別號54所表示的鹼基序列,且第24號及第25號之核苷酸(核糖核苷酸殘基)經由第一連接子(Lx1)而連結,第50號及第51號之核苷酸(核糖核苷酸殘基)經由第二連接子(Lx2)而連結的RNA分子。作為對標的基因之GAPDH基因、LAMA1基因、或LMNA基因的基因 表現抑制序列(反義序列;各自為序列識別號55、56、57)之例,亦示於圖17。本發明亦提供包含此等基因表現抑制序列之任一者的髮夾型單股RNA分子之製造方法。
作為抑制為標的基因的GAPDH基因之表現的髮夾型單股RNA分子之製造所使用的單股寡RNA分子之例,可列舉下述(m)及(n),但未限定於此等:(m)包含第22號及第23號之核糖核苷酸殘基經由連接子而連結的序列識別號37所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子、及(n)包含第20號及第21號之核糖核苷酸殘基經由連接子而連結的序列識別號36所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子。
於較佳實施形態,可組合(m)及(n)之單股寡RNA分子,而使用於與本發明有關的髮夾型單股RNA分子之製造方法。
作為抑制為標的基因的LAMA1基因之表現的髮夾型單股RNA分子之製造所使用的單股寡RNA分子之例,可列舉下述(o)~(v),但未限定於此等:(o)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基經由連接子而連結的序列識別號39所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子、(p)包含第16號及第17號之核糖核苷酸殘基經由連接子而連結的序列識別號38所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子、(q)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基經由連 接子而連結的序列識別號41所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子、(r)包含第22號及第23號之核糖核苷酸殘基經由連接子而連結的序列識別號40所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子、(s)包含第24號與第31號之核糖核苷酸殘基經由核苷酸性連接子而連結的序列識別號43所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子、(t)包含第21號與第26號之核糖核苷酸殘基經由核苷酸性連接子而連結的序列識別號42所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子、(u)包含第24號與第31號之核糖核苷酸殘基經由核苷酸性連接子而連結的序列識別號45所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子、及(v)包含第22號與第27號之核糖核苷酸殘基經由核苷酸性連接子而連結的序列識別號44所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子。
於較佳實施形態,可組合單股寡RNA分子(o)及(p);(q)及(r);(s)及(t);或(u)及(v),而使用於與本發明有關的髮夾型單股RNA分子之製造方法。
作為抑制為標的基因的LMNA基因之表現的髮夾型單股RNA分子之製造所使用的單股寡RNA分子之例,可列舉下述(w)~(z),但未限定於此等:(w)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基經由連接子而連結的序列識別號47所表示的鹼基序列的單股 寡RNA分子、(x)包含第21號及第22號之核糖核苷酸殘基經由連接子而連結的序列識別號46所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子、(y)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基經由連接子而連結的序列識別號49所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子、及(z)包含第23號及第24號之核糖核苷酸殘基經由連接子而連結的序列識別號48所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子。
於較佳實施形態,可組合單股寡RNA分子(w)及(x);或(y)及(z),而使用於與本發明有關的髮夾型單股RNA分子之製造方法。
單股寡RNA分子(a)~(z)中的「連接子」相當於上述第一連接子或第二連接子,又可使用上述之連接子。單股寡RNA分子(s)~(v)中之核苷酸性連接子可被取代為上述之連接子(例如,其它核苷酸性連接子)。
於本發明,藉由連接而將上述之第一單股寡RNA分子及第二單股寡RNA分子連結,可製造髮夾型單股RNA分子。上述之第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子,於連接之前進行降溫貼合。降溫貼合反應,可藉由於水性媒體中混合第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子而引起。於本發明之方法,降溫貼合步驟可藉由於水性媒體(通常為水或緩衝液)中將第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子混合,歷經一定 時間(例如,1~15分鐘)靜置而進行,亦可不靜置而使用於連接反應。於降溫貼合步驟,雖可進行第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子之熱變性(例如,於90℃以上之溫度的加熱),亦可不進行。進行熱變性的情形,只要將包含第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子的反應液,於例如熱變性溫度(例如,90℃以上)加熱,接著於降溫貼合溫度(典型而言為基於單股寡RNA分子之Ya1序列之Tm值±5℃之範圍的溫度,例如55~60℃)使其反應一定時間而進行降溫貼合後,使其降溫(例如至4℃)即可。未進行熱變性而降溫貼合的情形,亦可藉由於室溫(15~35℃)混合第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子,歷經一定時間(例如,1分鐘~1小時、或5~15分鐘)靜置,而實施降溫貼合步驟。
於一實施形態,於本發明之降溫貼合步驟,第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子可於反應液中以等莫耳量混合。於本發明,「以等莫耳量混合」意指將第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子以1:1.1~1.1:1之莫耳比混合。
降溫貼合步驟後,將包含第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子降溫貼合的雙股寡RNA的降溫貼合反應液,供給於連接。可將降溫貼合反應液之一部分添加於連接反應液,亦可使用降溫貼合反應液全量而調製連接反應液。連接可為酵素性的連接。酵素性的連接可為利用RNA連接酶的連接,特別是利用Rnl2家族之連接酶的連接。
Rnl2家族之連接酶(Rnl2家族成員)為具有RNA鏈裂封合(nick sealing)活性,即為具有將RNA之鏈裂(RNA雙鏈或RNA-DNA雙鏈中之鏈裂)藉由連結其3’羥基(3’-OH)及5’磷酸基(5’-PO4)而填補(封合)的連接酶活性的酵素(例如,參照Nandakumar J.et al.,Cell 127,p.71-84(2006))。作為Rnl2家族之連接酶,可列舉T4 RNA連接酶2、錐蟲屬(例如,布氏錐蟲(Trypanosoma brucei))及利什曼原蟲屬(例如,陶氏利什曼原蟲(Leishmania tarenotolae))之RNA編集連接酶(REL)、弧菌噬菌體(Vibrio phage)KVP40Rnl2、痘病毒(poxvirus)AmEPV連接酶、桿狀病毒(baculovirus)AcNPV連接酶、及桿狀病毒XcGV連接酶、以及彼等之變異體或修飾體等,但未限定於此等。此等之連接酶為所屬技術領域中具有通常知識者所熟知,可為市售或按照論文等之教示而取得。例如,T4 RNA連接酶2係販售自New England Biolabs。T4 RNA連接酶2蛋白質係藉由噬菌體T4之基因gp24.1而編碼。T4 RNA連接酶2之單離可按照例如Nandakumar J.and Shuman S.,(2005)J.Biol.Chem.,280:23484-23489;Nandakumar J.,et al.,(2004)J.Biol.Chem.,279:31337-31347;Nandakumar J.and Shuman S.,(2004)Mol.Cell,16:211-221等之記載進行。於本發明,「Rnl2家族之連接酶」並未限定於經單離的天然連接酶,只要具有RNA鏈裂封合活性,則包含重組蛋白質、突變體、缺失體(末端切斷形態等)、肽(例如,His、HA、c-Myc、V5、DDDDK等之標籤)或與其它 蛋白質的融合體、糖鏈附加(糖苷化(glycosylation))或脂質附加蛋白質等之修飾蛋白質等。
連接反應液可使用連接所通常使用的成分或包含其之緩衝液而調製。連接反應液除了上述第一單股寡RNA分子及上述第二單股寡RNA分子之外,亦可包含可用於RNA的連接反應的成分,例如:Tris-HCl、二價金屬離子、二硫蘇糖醇(DTT)、及腺苷三磷酸(ATP)等。就二價金屬離子而言,可列舉Mg2+、Mn2+等,但未限定於此等。連接反應液通常以鹽的形態包含二價金屬離子,例如包含金屬氯化物(MgCl2、MnCl2等)。
第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子之連接,可使用RNA連接酶、或具有連結RNA彼此之末端或dsRNA之鏈裂的活性的其它酵素來進行,特別是可使用Rnl2家族之連接酶來進行。作為RNA連接酶,可使用dsRNA連接酶。dsRNA連接酶為主要具有連結雙股RNA(dsRNA)之鏈裂的活性的酵素。就dsRNA連接酶而言,可列舉T4 RNA連接酶2,但未限定於此。T4 RNA連接酶2催化3’→5’磷酸二酯鍵的形成。
於連接反應液中添加Rnl2家族之連接酶,將降溫貼合的第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子之雙股寡RNA分子,與Rnl2家族之連接酶一起,於可連接的條件下培育(incubate),藉此可將構成雙股寡RNA分子的第一單股寡RNA分子之3’末端與第二單股寡RNA分子之5’末端(反義股內)連接成單股。
第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分 子之連接,可於以等莫耳量包含第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子的連接反應液中進行。於本發明,「以等莫耳量包含」意指以1:1.1~1.1:1之莫耳比包含第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子。
於本發明之方法,可於各自以10μM以上、40μM以上、100μM以上、150μM以上、200μM以上、300μM以上、或500μM以上之濃度來包含第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子的連接反應液中進行連接。於一實施形態,連接反應液可各自以10,000μM以下來包含第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子,例如可以1,000μM以下、500μM以下、或300μM以下之濃度包含。於一實施形態,第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子,於連接反應液中,例如可以50~500μM、100~300μM、或100~250μM之濃度來使用。於一實施形態,以等莫耳量包含第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子的連接反應液,係以此種濃度包含第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子。於本發明之方法,相對於反應液中Rnl2家族之連接酶的濃度(或量),以較多的濃度(或量)來使用第一及第二單股寡RNA分子,可使髮夾型單股RNA分子之製造效率增加。
於一實施形態,連接反應液可包含0.01U/μL以上之Rnl2家族之連接酶,例如可以0.01U/μL以上、0.08U/μL以上、0.2U/μL以上、或0.35U/μL以上之濃度來包含。連接反應液可以例如10U/μL以下、1U/μL以下、或0.5U/μL以下之濃度來包含Rnl2家族之連接酶。於一 實施形態,以等莫耳量包含第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子的連接反應液,係以此種濃度包含Rnl2家族之連接酶。
於一實施形態,連接反應液可為pH6.5以上,例如可為pH7.0~9.0、pH7.4以上、pH7.4~8.6、pH7.5~8.5、或pH7.5~8.0。以等莫耳量包含第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子的連接反應液,可具有此種pH。
於一實施形態,連接反應液包含1mM以上之二價金屬離子,例如1~20mM、2~10mM、3~6mM、或5mM。於一實施形態,連接反應液包含1mM以上之Mg2+或Mn2+,例如1~20mM、2~10mM、3~6mM、或5mM,例如可包含該濃度之MgCl2。於一實施形態,以等莫耳量包含第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子的連接反應液,係以此種濃度包含二價金屬離子。
連接反應液可包含聚乙二醇(PEG)等之其它添加物質。就聚乙二醇而言,例如可使用PEG6000、PEG8000、PEG20000等之PEG6000~20000。連接反應液可以例如3~30w/v%、5~20w/v%、5~15w/v%或10~30w/v%之量包含聚乙二醇。於一實施形態,以等莫耳量包含第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子的連接反應液,係以此種濃度包含聚乙二醇。於一實施形態,此種聚乙二醇之添加,可使用於包含0.4U/μL以下,例如0.01~0.4U/μL、0.08~0.4U/μL、或0.1U/μL以上且低於0.3U/μL的RNA連接酶的連接反應液。
連接反應液通常包含ATP。於本發明,連接反應液以例如5mM以下、2mM以下、1mM以下、及/或0.1mM以上、或0.1~1.5mM之濃度包含ATP。
於一實施形態,連接反應液可包含Tris-HCl,例如可包含10~70mM Tris-HCl,但未限定於此濃度。連接反應液可包含二硫蘇糖醇(DTT),例如可包含0.1~5mM DTT,但未限定於此濃度。
於本發明,連接之反應時間只要為適合與本發明有關的第一單股寡RNA分子及第二單股寡RNA分子之雙股寡RNA的連接反應的時間即可。連接反應可歷經例如20分鐘以上或30分鐘以上、1小時以上、2小時以上、或3小時以上之反應時間而進行。本發明中的連接之反應時間可為4小時以上、6小時以上、8小時以上、10小時以上、12小時以上、24小時以上、或48小時以上。於本發明,特別是使用包含高濃度(例如,100μM或200μM以上)之第一及第二單股寡RNA分子的連接反應液的情形,可歷經較長時間進行連接反應。例如,連接反應液於顯示pH7.4以上、pH7.4~8.6、pH7.5~8.5、或pH7.5~pH8.0的情形,可使用較長時間(例如,4小時以上、12小時以上、或24小時以上)之反應時間。特別於使用高濃度之單股寡RNA分子的情形,可使用該種較長時間的反應時間。
於本發明之方法,可一邊階段性地添加第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子,一邊進行連接步驟。關於第一單股寡RNA分子及第二單股寡RNA 分子,「階段性地添加」意指於連接步驟,將第一單股寡RNA分子及第二單股寡RNA分子歷經複數次,隔著時間的間隔而添加於反應液。例如,將第一單股寡RNA分子及第二單股寡RNA分子歷經適合連接反應的時間而與RNA連接酶一起培育後,藉由進行一次或重複進行一次以上之追加地添加第一單股寡RNA分子及第二單股寡RNA分子而進一步進行連接反應的追加反應步驟,可一邊於反應系統中階段性地添加該單股RNA分子一邊進行連接。追加反應步驟可重複2次、3次、4次、或其以上來進行。於此情形,用於第一單股寡RNA分子及第二單股寡RNA分子之連接的最初之培育時間(初期反應時間),只要按照上述之連接反應時間即可,例如可為4小時以上、8小時以上、12小時以上、或24小時以上。追加第一單股寡RNA分子及第二單股寡RNA分子後之培育時間(追加反應時間),例如可為4小時以上、8小時以上、12小時以上、或24小時以上。於連接之追加反應步驟,每次循環的追加反應時間可彼此相同亦可不同。連接之初期反應時間與每次循環的追加反應時間可相同亦可不同。階段性地添加第一單股寡RNA分子及第二單股寡RNA分子的情形,於連接反應液最初地添加的單股RNA分子之濃度,可與上述相同,例如,可為40μM以上、100μM以上、150μM以上、或200μM以上之濃度。於各自之追加反應步驟,添加於連接反應液的單股RNA分子之量,可與最初之反應液中所含的單股RNA分子之量(莫耳數)相同,亦可不同,例如,可為4nmol以上、 10nmol以上、15nmol以上、或20nmol以上。
藉由一邊階段性地添加第一單股寡RNA分子及第二單股寡RNA分子,一邊進行連接,可減輕因高濃度之單股RNA分子所致的反應阻礙(連接效率降低)的同時,使反應液中之第一單股寡RNA分子及第二單股寡RNA分子之含量增加,藉此可使上述髮夾型單股RNA分子的產量增大。
如以上的反應條件,可任意地組合而使用。例如,可將從降溫貼合步驟之溫度、降溫貼合步驟之時間、降溫貼合的第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子之混合比、連接反應液中之第一及第二單股寡RNA分子的量(濃度)、酵素(例如,Rnl2家族之連接酶)之種類及使用量、二價金屬離子之種類及濃度、pH、ATP濃度、PEG等之添加成分及濃度、反應液中之其它緩衝液成分、連接反應時間、連接反應中之第一及第二單股寡RNA分子之階段的添加(追加添加)等之上述條件所選擇的複數條件加以任意地組合。例如,可將上述之連接反應液中之第一及第二單股寡RNA分子之比較高的濃度(例如,100μM~300μM),與其它之各自的條件組合。或者,可將酵素(例如,Rnl2家族之連接酶)之使用量(例如,0.01U/μL~1U/μL),與其它之各自的條件組合。
於本發明之方法,藉由如上述地調節連接反應條件,可相對於第一單股寡RNA分子及第二單股寡RNA分子之使用量,使用較少量的RNA連接酶,特別是Rnl2家族之連接酶,可使連接產物的產量相對地或絕對 地增加。於本發明之方法,使用於連接的每第一單股寡RNA分子及/或第二單股寡RNA分子之莫耳數(nmol),可使用10單位(U)以下、5單位以下、4單位以下、2單位以下、1單位以下、0.7單位以下、0.5單位以下、或0.3單位以下、或0.1單位以下之量之RNA連接酶,特別是Rnl2家族之連接酶。於一實施形態,RNA連接酶,特別是Rnl2家族之連接酶之使用量,每第一單股寡RNA分子及/或第二單股寡RNA分子之量(nmol),可為0.001單位(U)以上、0.01單位以上、0.1單位以上、0.2單位以上、或1單位以上。此外,「每第一單股寡RNA分子及/或第二單股寡RNA分子之莫耳數(nmol)為「X」單位以下之量之RNA連接酶」意指與第一單股寡RNA分子之莫耳數或第二單股寡RNA分子之莫耳數(nmol)之任一者或其兩者比較,RNA連接酶、特別是Rnl2家族之連接酶之活性量為「X」單位以下。於一實施形態,可將第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子之至少一者的莫耳數(nmol)作為基準來決定RNA連接酶之使用量。第一單股寡RNA分子之莫耳數(nmol)只要作為添加於連接反應系的第一單股寡RNA分子之合計量而算出即可,例如,於將單股寡RNA分子階段性地添加的情形,係作為連接之初期反應液中之第一單股寡RNA分子的莫耳數、與於追加反應步驟中添加於反應系統的第一單股寡RNA分子之莫耳數的合計莫耳數而算出。
連接反應之溫度,可依據使用的酵素(Rnl2家族之連接酶)而變動,例如可為10~50℃、15~45℃、 20~40℃、20~30℃、或23~28℃。例如使用T4 RNA連接酶2的情形,可為10~50℃、15~45℃、20~40℃、20~30℃、或23~28℃。
連接步驟結束後,連接反應液中可以高比率含有包含與本發明有關的基因表現抑制序列的髮夾型單股RNA分子。
連接反應液中之包含與本發明有關的基因表現抑制序列的髮夾型單股RNA分子,可藉由所屬技術領域中具有通常知識者周知之方法而純化。就純化技術而言,可列舉逆相層析、逆相高效液體層析(RP-HPLC)、超高效液體層析(UHPLC)、離子交換層析等之層析法、凝膠過濾、管柱純化、聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)等、或彼等之任意之組合,但未限定於此等。
於國際公開WO2013/027843記載之方法,由於因在極短鏈時伸長反應停止所致的短鏈核酸雜質或缺失體等之核酸雜質的生成,而引起反應液中之目的產物的純度降低。另一方面,於本發明之方法之較佳實施形態,於可使與本發明有關的髮夾型單股RNA分子之製造後之連接反應液中的核酸雜質降低的點係有利的。於本發明之方法之較佳實施形態,減少核酸雜質的生成的同時,可使用泛用型RNA亞磷醯胺而製造安定性高的基因表現抑制性單股RNA分子。
依據本發明之方法所製造的髮夾型單股RNA分子,可藉由通常方法投予至活體內或細胞內,藉此使用於用以抑制標的基因之表現。
再者,本發明亦關於一種用以抑制標的基因之表現的髮夾型單股RNA分子之製造用之套組,其包含與本發明有關的單股寡RNA分子之組合(對)。該種套組可適合使用於用以實施與本發明有關的抑制標的基因之表現的髮夾型單股RNA分子之製造方法。
於一實施形態,作為套組之例,可列舉包含以下之(i)~(vi)之任一單股寡RNA分子之組合之用以抑制TGF-β1基因之表現的髮夾型單股RNA分子之製造用之套組,但未限定於此等:(i)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基經由第一連接子而連結的序列識別號7所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第10號及第11號之核糖核苷酸殘基經由第二連接子而連結的序列識別號6所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合;(ii)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基經由第一連接子而連結的序列識別號19所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第16號及第17號之核糖核苷酸殘基經由第二連接子而連結的序列識別號18所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合;(iii)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基經由第一連接子而連結的序列識別號27所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第20號及第21號之核糖核苷酸殘基經由第二連接子而連結的序列識別號26所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合;(iv)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基經由第 一連接子而連結的序列識別號29所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第21號及第22號之核糖核苷酸殘基經由第二連接子而連結的序列識別號28所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合;(v)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基經由第一連接子而連結的序列識別號31所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第22號及第23號之核糖核苷酸殘基經由第二連接子而連結的序列識別號30所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合;及(vi)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基經由第一連接子而連結的序列識別號33所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第23號及第24號之核糖核苷酸殘基經由第二連接子而連結的序列識別號32所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合。
於另一實施形態,作為套組之例,可列舉用以抑制GAPDH基因之表現的髮夾型單股RNA分子之製造用之套組,其包含以下之(vii)之單股寡RNA分子之組合,但未限定於此:(vii)包含第22號及第23號之核糖核苷酸殘基經由第一連接子而連結的序列識別號37所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子、與包含第20號及第21號之核糖核苷酸殘基經由第二連接子而連結的序列識別號36所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子之組合。
於另一實施形態,作為套組之例,可列舉用以抑制LAMA1基因之表現的髮夾型單股RNA分子之製 造用之套組,其包含以下之(viii)~(xi)之任一單股寡RNA分子之組合,但未限定於此等:(viii)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基經由第一連接子而連結的序列識別號39所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子、與包含第16號及第17號之核糖核苷酸殘基經由第二連接子而連結的序列識別號38所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子之組合;(ix)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基經由第一連接子而連結的序列識別號41所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子、與包含第22號及第23號之核糖核苷酸殘基經由第二連接子而連結的序列識別號40所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子之組合;(x)包含序列識別號43所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子(第24號及第31號之核糖核苷酸殘基經由核苷酸性連接子而連結)、與包含序列識別號42所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子(第21號及第26號之核糖核苷酸殘基經由核苷酸性連接子而連結)之組合;(xi)包含序列識別號45所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子(第24號及第31號之核糖核苷酸殘基經由核苷酸性連接子而連結)、與包含序列識別號44所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子(第22號及第27號之核糖核苷酸殘基經由核苷酸性連接子而連結)之組合。
於另一實施形態,作為套組之例,可列舉用以抑制LMNA基因之表現的髮夾型單股RNA分子之製造用套組,其包含以下之(xii)~(xiii)之任一單股寡RNA 分子之組合,但未限定於此等:(xii)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基經由第一連接子而連結的序列識別號47所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子、與包含第21號及第22號之核糖核苷酸殘基經由第二連接子而連結的序列識別號46所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子之組合;(xiii)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基經由第一連接子而連結的序列識別號49所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子、與包含第23號及第24號之核糖核苷酸殘基經由第二連接子而連結的序列識別號48所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子之組合。
以下,使用實施例進一步具體地說明本發明。惟,本發明之技術範圍並未限定於此等實施例。
用以生成包含脯胺酸衍生物連接子的本發明之髮夾型單股RNA分子所使用的脯胺酸二醯胺亞磷醯胺,例如,可按照國際公開WO2013/027843之記載而合成。以下顯示具體的合成例,但合成方法並未因其而被限定。
將Fmoc-L-脯胺酸作為起始原料。Fmoc為9-茀基甲氧羰基。混合Fmoc-L-脯胺酸(10.00g,29.64mmol)、4- 胺基-1-丁醇(3.18g,35.56mmol)及1-羥基苯并三唑(10.90g,70.72mmol),對該混合物於減壓下脫氣,並填充氬氣。對獲得的混合物,於室溫添加無水乙腈(140mL),進一步添加二環己基碳二亞胺(dicyclohexylcarbodiimide)(7.34g,35.56mmol)之無水乙腈溶液(70mL)後,於氬氣環境下,於室溫攪拌15小時。反應結束後,過濾生成的沉澱,對於回收的濾液於減壓下餾除溶媒。於獲得的殘渣中添加二氯甲烷(200mL),並以飽和碳酸氫鈉水(200mL)洗淨。然後,回收有機層,以硫酸鎂乾燥後,進行過濾。對於獲得的濾液,於減壓下餾除溶媒,於該殘渣中添加二乙基醚(200mL),進行粉末化。藉由濾取生成的粉末,獲得呈無色粉末狀物質之Fmoc-羥基醯胺-L-脯胺酸。
將Fmoc-羥基醯胺-L-脯胺酸(7.80g,19.09mmol)與無水吡啶(5mL)混合,於室溫進行2次共沸乾燥。於獲得的殘留物中,添加4,4’-二甲氧基三苯甲基氯(4,4’-Dimethoxytrityl Chloride)(8.20g,24.20mmol)、4-二甲基胺基吡啶(DMAP)(23mg,0.19mmol)及無水吡啶(39mL)。將此混合物於室溫攪拌1小時後,添加甲醇(7.8mL),於室溫攪拌30分鐘。將此混合物以二氯甲烷(100mL)稀釋,以飽和碳酸氫鈉水(150mL)洗淨後,將有機層分離。將此有機層以硫酸鈉乾燥後,進行過濾。對於獲得的濾液,於減壓下餾除溶媒。於獲得的未純化之 殘渣中,添加無水二甲基甲醯胺(39mL)及哌啶(18.7mL,189mmol),於室溫攪拌1小時。反應結束後,自該混合液於減壓下,於室溫餾除溶媒。藉由將獲得的殘渣供給於矽膠管柱層析(商品名Wakogel C-300,展開溶媒CH2Cl2:CH3OH=9:1,含有0.05%吡啶),獲得呈淡黃色油狀物質之DMTr-醯胺-L-脯胺酸。DMTr為二甲氧基三苯甲基。
將獲得的DMTr-醯胺-L-脯胺酸(6.01g,12.28mmol)、N-(3’-二甲基胺基丙基)-N’-乙基碳二亞胺(EDC)(2.83g,14.74mmol)、1-羥基苯并三唑(3.98g,29.47mmol)及三乙基胺(4.47g,44.21mmol)之無水二氯甲烷溶液(120mL)混合。於此混合液中,進一步於氬氣環境下,於室溫添加6-羥基己酸(1.95g,14.47mmol),之後,於氬氣環境下,於室溫攪拌1小時。將獲得的混合液以二氯甲烷(600mL)稀釋,以飽和食鹽水(800mL)洗淨3次。回收有機層,以硫酸鈉乾燥後,進行過濾。對於獲得的濾液,於減壓下餾除溶媒。藉此,獲得呈淡黃色泡狀物質之DMTr-羥基二醯胺-L-脯胺酸。
將獲得的DMTr-羥基二醯胺-L-脯胺酸(8.55g,14.18mmol)與無水乙腈混合,於室溫共沸乾燥3次。於獲得的殘留物中,添加四唑二異丙基銨(diisopropylammonium tetrazolide)(2.91g,17.02mmol),於減壓下脫氣,填充氬氣。對該混合物,添加無水乙腈(10mL),再添加2-氰基乙氧基-N,N,N’,N’-四異丙基亞磷醯二胺(2-cyanoethoxy-N,N,N’,N’-tetraisopropylphosphorodiamidite)(5.13g,17.02mmol)之無水乙腈溶液(7mL)。將此混合物於氬氣環境下,於室溫攪拌2小時。將獲得的混合物以二氯甲烷稀釋,以飽和碳酸氫鈉水(200mL)洗淨3次後,以飽和食鹽水(200mL)洗淨。回收有機層,以硫酸鈉乾燥後,進行過濾。對獲得的濾液,於減壓下餾除溶媒。將獲得的殘渣供給於使用胺基矽膠作為填充劑的管柱層析(展開溶媒己烷:乙酸乙酯=1:3,含有0.05%吡啶),藉此獲得呈無色糖漿狀物質之DMTr-二醯胺-L-脯胺酸亞磷醯胺。
於以下之實施例,藉由下述而製作具有使用脯胺酸衍生物的連接子與人類TGF-β1基因表現抑制序列的髮夾型單股RNA分子(以下,亦稱為「ssTbRNA分子」;圖2):將為其之2個分割片段的單股寡RNA分子(股1及股2)使用RNA連接酶(T4 RNA連接酶2)而連接(連接法;圖1)。
為了檢討分割位置,如下述製作使ssTbRNA分子中的分割位置每位移1個鹼基的成對的單股寡RNA分子(股1及股2;表1)。
具體而言,將各自之單股寡RNA分子(股1及股2),基於亞磷醯胺法,使用核酸合成機(商品名AKTA oligopilot-100;GE Healthcare Life Sciences或商品名nS-8及nS-8II;GeneDesign公司製),自3’側向5’側合 成。於基於亞磷醯胺法的RNA合成,作為RNA亞磷醯胺,使用5’-O-DMT-2’-O-TBDMSi-RNA phosphoramidite(ThermoFisher Scientific)或5’-O-DMT-2’-O-TBDMS-RNA phosphoramidite(Sigma-Aldrich)。作為撐體,使用聚苯乙烯珠(NittoPhase(R)HL rG(ibu)或rU;KINOVATE)或多孔質玻璃(CPG)珠(Universal UnyLinker Support 1000Å;Chemgenes)。作為5’-磷酸化試藥,使用3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)-2,2-(N-甲基醯胺)]丙基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺(Solid Chemical Phosphorylation Reagent;LINK)。
合成自3’末端直至連接子之前為止之RNA序列(圖1中,Xa、Ys)後,於其5’末端連結連接子形成用之DMTr-二醯胺-L-脯胺酸亞磷醯胺,再於其5’側合成自連接子之後直至5’末端為止之RNA序列(圖1中,Xs;或Ya3、Ya2、及Ya1),藉此製作股1及股2之單股寡RNA分子。此等單股寡RNA分子具有作為Lx1及Lx2之式(VI-1)所示的連接子,Xa係於式(VI-1)中之1位氮原子側、Xs係於2位碳原子側而與連接子Lx1連結,Ys係於式(VI-1)中之1位氮原子側、Ya3係於2位碳原子側而與連接子Lx2連結。
關於股2(反義側)係於DMTr-OFF之狀態下結束合成,且藉由通常方法進行單股寡RNA分子之切出、與鹼基部及2’位之去保護。關於股1(正義側)係於DMTr-ON之狀態下結束合成。
為了檢討ssTbRNA分子之對2個分割片段的分割位置,使用RNA連接酶(T4 RNA連接酶2)將成對的股1及股2(表1)連接,並確定其連接效率。
具體而言,首先,將各對的股1及股2溶解於注射用水(DW),混合等莫耳量。將此等莫耳混合液於93℃加熱1分鐘而熱變性,接著為了降溫貼合,於55℃靜置15分鐘,使其降溫至4℃為止。降溫後,將反應液以逆相高效液體層析(RP-HPLC)(20℃)及未變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(Native PAGE)分析,調查股1及股2之降溫貼合狀態。
為了確認降溫貼合狀態所使用的RP-HPLC之條件係如以下。
‧管柱:ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18 Column,130A,1.7μm,2.1mm×100mm
‧移動相:A)0.1M乙酸三乙基銨(TEAA)、B)乙腈(MeCN)
‧分析條件:B5-30%,10分,20℃,0.4ml/min
使用的原態PAGE(Native PAGE)(未變性PAGE)之條件係如以下。
未變性PAGE;19%丙烯醯胺、150V、90分鐘之泳動
如此,獲得股1及股2降溫貼合的雙股寡RNA。存在有顯示股1及股2幾乎全部降溫貼合的對(pair)、及以較低比率降溫貼合的對(pair)。
調製於緩衝液(50mM Tris-HCl、2mM MgCl2、1mM二硫蘇糖醇(DTT)、400μM腺苷三磷酸(ATP))中包含獲得的雙股寡RNA(股1、股2之各自之最終濃度10μM)之反應液(pH7.5),添加2μL之10U/μL T4 RNA連接酶2(New England Biolabs;以下相同)(40U/nmol寡RNA),而作成反應液量50μL。將此反應液於37℃培育30分鐘。
酵素反應後,藉由超高效液體層析(UHPLC)及變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(Denatured PAGE)而確認反應液中之連接效率。
連接後UHPLC之條件係如以下。
‧管柱:ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18 Column,130A,1.7μm,2.1mm×100mm
‧移動相:A)100mM六氟-2-丙醇(HFIP)-8mM三乙基胺(TEA)、B)甲醇(MeOH)
‧分析條件:B5-40%,10分鐘,80℃,0.4ml/min
Denatured PAGE(變性PAGE)之條件係如以下。
變性PAGE;19%丙烯醯胺、7.5M尿素、200V、90分鐘之泳動後,以溴化乙錠(ethidium bromide(EtBr))染色。
連接效率(FLP(%))係基於UHPLC解析結果,藉由面積百分率法,以下列之式算出。
FLP(全長產物(Ful1 Length Product))(%)=(目的之連接生成物之波峰面積)/(層析圖中的總波峰面積)×100
將結果示於圖3。由於分割位置而於連接效率產生很大差異。於股1之3’末端成為U的分割位置,顯示連接效率有變高的傾向。又,採用股1之3’末端或股2之5’末端成為A的分割位置的情形,亦顯示連接效率變高的傾向。又,採用股1之3’末端之鹼基與股2之5’末端之鹼基各自成為U或A的分割位置的情形,顯示特別優異的連接效率。
此外,對於各自之連接生成物進行LC-MS分析,確認具有所預測的分子量。於LC-MS分析,使用以下之機器。
‧LC裝置:UHPLC UltiMate3000(ThermoFisher Scientific公司製)
‧MS裝置:Q-Exactive(ThermoFisher Scientific公司製)
基於此結果,選出適於連接法的對011、016、及018。
如上述,將使對011、016、及018之股1及股2降溫貼合並利用連接而連結後之反應液,以上述條件藉由RP-HPLC而解析的結果,為目的物的ssTbRNA分子與游離股1及股2以外之反應液中的核酸雜質的量為些微,於ssTbRNA分子之波峰附近出現的缺失體(ssTbRNA分子之序列之一部分欠缺者)之量亦少(表2)。另一方面,於藉由亞磷醯胺法而固相合成ssTbRNA分子之全長的方法(專利文獻2),於合成後之反應液中包含較多的ssTbRNA分子以外之短鏈核酸雜質(合成在短鏈時 停止的RNA分子等),於ssTbRNA分子之波峰附近出現的缺失體亦多(表2)。顯示於本發明之方法,可高純度地製造目的之髮夾型單股RNA分子。
表2中,股1、股2、及ssTbRNA分子之值,表示基於層析之各自的波峰面積比率。又,作為ssTbRNA分子之波峰附近的核酸(主要包含ssTbRNA分子與其缺失體)之相對量,對於包含ssTbRNA分子之波峰的RRT(相對滯留時間(relative retention time);其中將ssTbRNA分子之波峰之滯留時間設為1的情形之相對滯留時間)=0.98~1.07之範圍,算出波峰面積%之合計值。此外,股1與股2之波峰滯留時間係與ssTbRNA分子之波峰充分遠離,不包含在RRT=0.98~1.07之範圍。
使用011、016、及018對之股1及股2之單股寡RNA分子,於2個條件下進行降溫貼合試驗。
首先,於熱變性條件下,將股1及股2溶解於注射用水,各自以40μM而混合等莫耳量。將混合液於93℃加熱1分鐘而熱變性,接著為了降溫貼合,於55℃靜置15分鐘,使其降溫至4℃。降溫後,將反應液以逆 相高效液體層析(RP-HPLC)(20℃)及未變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(Native PAGE)分析,調查股1及股2之降溫貼合狀態。
另一方面,於室溫條件下,將股1及股2溶解於注射用水,各自以200~400μM而混合等莫耳量。將混合液於室溫靜置10分鐘。將靜置後之反應液以RP-HPLC(20℃)與未變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分析,調查股1及股2之降溫貼合狀態。
其結果,於熱變性條件及室溫條件之任一者,於RP-HPLC皆未確認到股單獨之波峰,且觀察到藉由降溫貼合所生成的雙股之波峰。又,於未變性聚丙烯醯胺凝膠電泳,亦於熱變性條件及室溫條件之兩者確認到股1及股2之幾乎全部的分子之降溫貼合。
因為以熱變性條件及室溫條件獲得同等之結果,之後,連接法中的降溫貼合係於室溫條件下實施。
此外,於以下之實施例,以RP-HPLC及未變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(Native PAGE)而確認股1及股2之單股寡RNA分子的降溫貼合狀態,藉由RP-HPLC而確認雙股RNA之純度(FLP)為95%以上後,使用於連接反應。
為了確認降溫貼合狀態所使用的RP-HPLC之條件係如以下。
‧管柱:ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18 Column,130Å,1.7μm,2.1mm×100mm
‧移動相:A)0.1M乙酸三乙基銨(TEAA)、B)乙腈 (MeCN)
‧分析條件:B5-30%,10分鐘,20℃,0.4ml/min
使用的Native PAGE(未變性PAGE)之條件係如以下。
未變性PAGE;19%丙烯醯胺、150V、90分鐘的泳動
各自使用3種類之011、016、及018對(表1;以下,亦將各對僅稱為011、016、及018),針對連接反應之溫度及時間進行檢討。此外,將011、016、及018之股1及股2之結構顯示於圖4。
與實施例2同樣地,將各對的股1及股2溶解於注射用水,各自以等莫耳量混合。將此等莫耳混合液於室溫靜置10分鐘,藉由降溫貼合而調製雙股寡RNA。
將於T4 RNA連接酶2(New England Biolabs)之添附的緩衝液(50mM Tris-HCl、2mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP、pH7.5(25℃))中包含0.4U/μL之T4 RNA連接酶2連同獲得的雙股寡RNA(股1與股2之等莫耳混合液;各股之最終濃度10μM、40μM、或100μM)的反應液100μL,於25℃或37℃培育,進行連接。使用於此連接反應的酵素(T4 RNA連接酶2)之量為40U/nmol寡RNA、10U/nmol寡RNA、或4U/nmol寡RNA。連接反應中,於經過0.5小時、2小時、4小時、或24小時 後,採取20~25μL之樣品,於85℃加熱20分鐘,使酵素失活。將熱失活後之反應液藉由變性PAGE及UHPLC進行解析,算出連接效率(FLP(%))。變性PAGE及UHPLC之條件、以及FLP(%)之算出方法,與實施例2相同。
其結果,於使用10μM或40μM之寡RNA濃度的情形,連接效率不因反應溫度或反應時間而大幅變動,任一者皆非常地高。使用100μM之寡RNA濃度的情形,與10μM或40μM的情形比較,連接效率降低,但隨著反應時間變長,連接效率提升。又,於100μM之寡RNA濃度,比起37℃,於25℃下培育時之4小時後的連接效率更高。
將關於016之結果示於圖5。又,將於100μM之寡RNA濃度的連接反應的結果示於圖6(A:25℃,B:37℃)。011、016中的連接效率為特高。
使用與實施例4同樣調製的011之雙股寡RNA(等莫耳混合液),進行連接反應液中之ATP濃度的檢討。於T4 RNA連接酶2(New England Biolabs)之添附緩衝液(50mM Tris-HCl、2mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP、pH7.5(25℃))中,添加ATP而作成ATP濃度0.4mM(無添加)、1mM、2mM、5mM、或10mM。如此調製的緩衝液中,將包含雙股寡RNA(各股之最終濃度10μM、20μM、或40μM)與T4 RNA連接酶2的反應液25μL,於37℃培育30分鐘,進行連接。連接反應後,於85℃加熱20分 鐘而使酵素失活,將該反應液藉由變性PAGE及UHPLC進行解析,算出連接效率(FLP(%))。變性PAGE及UHPLC之條件、以及FLP(%)之算出方法,與實施例2相同。
將變性PAGE之結果示於圖7,將於寡RNA濃度40μM所示的FLP(%)示於圖8。若使ATP濃度增加,則連接反應被阻礙。
使用與實施例4同樣地調製的016之雙股寡RNA(等莫耳混合液),進行連接反應液之pH條件的檢討。使用以下之3種類之緩衝液。
(1)50mM Tris-HCl(pH 7.0)、2mM MgCl2、1mM二硫蘇糖醇(DTT)、400μM ATP
(2)50mM Tris-HCl(pH 7.5)、2mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP
(3)50mM Tris乙酸(pH 6.5)、2mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP
將於上述之任一緩衝液中包含016之雙股寡RNA(各股之最終濃度10μM、100μM、或200μM)及T4 RNA連接酶2(最終濃度0.4U/μL)的反應液30μL,於25℃歷經30分鐘、4小時、或24小時而培育,進行連接。連接反應後,於85℃加熱20分鐘而使酵素失活,將該反應液藉由變性PAGE及UHPLC進行解析,算出連接效率(FLP(%))。變性PAGE及UHPLC之條件、以及FLP(%)之算出方法,係與實施例2相同。
將結果示於圖9。於pH7.5之反應液,即使包含高濃度之寡RNA的情形,使其反應24小時時亦顯示95%以上之連接效率。
使用與實施例4同樣地調製的016之雙股寡RNA(等莫耳混合液),進一步檢討連接反應液之pH條件。使用以下之4種類之緩衝液。
(1)50mM Tris-HCl(pH 7.0)、2mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP
(2)50mM Tris-HCl(pH 7.5)、2mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP
(3)50mM Tris-HCl(pH 8.0)、2mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP、
(4)50mM Tris-HCl(pH 8.5)、2mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP
將於上述之任一緩衝液中包含016之雙股寡RNA(各股之最終濃度10μM或200μM)及T4 RNA連接酶2(最終濃度0.4U/μL)的反應液30μL,於25℃歷經30分鐘、4小時、或24小時而培育,進行連接。連接反應後,於85℃加熱20分鐘使酵素失活,將該反應液藉由變性PAGE及UHPLC進行解析,算出連接效率(FLP(%))。變性PAGE及UHPLC之條件、以及FLP(%)之算出方法,與實施例2相同。將結果示於圖10。pH7.5以上之反應液顯示高連接效率。
使用與實施例4同樣地調製的016之雙股寡RNA(等莫耳混合液),進行連接反應液中之MgCl2濃度的檢討。使用以下之5種類之緩衝液。
(1)0.5mM MgCl2、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM DTT、400μM ATP
(2)1mM MgCl2、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM DTT、400μM ATP
(3)2mM MgCl2、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM DTT、400μM ATP
(4)5mM MgCl2、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM DTT、400μM ATP
(5)10mM MgCl2、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM DTT、400μM ATP
將於上述之任一緩衝液中包含016之雙股寡RNA(各股之最終濃度10μM、100μM、或200μM)及T4 RNA連接酶2(最終濃度0.4U/μL)的反應液30μL,於25℃歷經30分鐘、4小時、或24小時而培育,進行連接。連接反應後,於85℃加熱20分鐘而使酵素失活,並將該反應液藉由變性PAGE及UHPLC解析,算出連接效率(FLP(%))。變性PAGE及UHPLC之條件、以及FLP(%)之算出方法,與實施例2相同。
將結果示於圖11(A:10μM或100μM寡RNA,B:10μM或200μM寡RNA)。雙股寡RNA濃度為 100μM的情形,於2mM以上之MgCl2濃度,藉由4小時以上之反應而顯示95%以上之連接效率。寡RNA濃度為200μM的情形,亦於2mM以上之MgCl2濃度,藉由24小時以上之反應而顯示95%以上之連接效率,再者,於5mM之MgCl2濃度,4小時後觀察到連接效率之特別急遽的上升。由此結果顯示,於使用更高濃度的寡RNA的情形,藉由使MgCl2濃度適度地增加,可加快連接反應的進行。
使用與實施例4同樣地調製的016之雙股寡RNA(等莫耳混合液),進行連接反應液中之2價離子濃度的檢討。使用以下之6種類之緩衝液。
(1)50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM DTT、400μM ATP、2mM、5mM、或10mM MgCl2
(2)50mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM DTT、400μM ATP、2mM、5mM、或10mM MgCl2
將於上述之任一緩衝液中包含016之雙股寡RNA(各股之最終濃度10μM或200μM)及T4 RNA連接酶2(最終濃度0.4U/μL)的反應液30μL,於25℃歷經30分鐘、4小時、或24小時而培育,進行連接。連接反應後,於85℃加熱20分鐘而使酵素失活,將該反應液藉由變性PAGE及UHPLC進行解析,算出連接效率(FLP(%))。變性PAGE及UHPLC之條件、以及FLP(%)之算出方法,與實施例2相同。
將結果示於圖12(A:pH7.5,B:pH8.0)。於pH7.5及pH8.0之任一者,於4小時後之時間點,於5mM MgCl2的情形皆觀察到連接效率之最急遽的上升。
使用與實施例4同樣地調製的018之雙股寡RNA(等莫耳混合液),調查因PEG對連接反應溶液的添加所致的對連接效率的影響。
將於緩衝液(5、10、或15%(w/v)之PEG8000、50mM Tris-HCl(pH8.0)、2mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP)中包含雙股寡RNA(各股之最終濃度200μM)及0.4U/μL或0.2U/μL之T4 RNA連接酶2的反應液30μL,於25℃歷經30分鐘、4小時、或24小時而培育,進行連接。於此連接反應所使用的酵素(T4 RNA連接酶2)之量為2U/nmol寡RNA或1U/nmol寡RNA,若與實施例4之酵素量比較,則各自為1/20及1/40。連接反應後,於85℃加熱20分鐘而使酵素失活。將熱失活後之反應液藉由變性PAGE及UHPLC進行解析,算出連接效率(FLP(%))。變性PAGE及UHPLC之條件、以及FLP(%)之算出方法係與實施例2相同。
將結果示於圖13。顯示藉由PEG之添加而連接效率增加。
使用與實施例4同樣地調製的016之雙股寡RNA(等 莫耳混合液),進行連接反應之時間歷程的檢討。
將於緩衝液(50mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP)中包含雙股寡RNA(各股之最終濃度100μM或200μM)、0.4U/μL之T4 RNA連接酶2的反應液80μL,於25℃培育,進行連接。連接反應中,於自開始起1、2、3、4、6、9、12、15、18、及24小時後採樣,於85℃加熱20分鐘而使酵素失活後,進行UHPLC解析,算出FLP%。UHPLC之條件、以及FLP(%)之算出方法,與實施例2相同。
將結果示於圖14。寡RNA濃度為100μM的情形係於反應開始後6小時,200μM的情形係於反應開始後9小時,連接反應幾乎到達平穩期(plateau)。
使用與實施例4同樣地調製的016之雙股寡RNA(等莫耳混合液),藉由於連接反應相依序添加股1及股2之單股寡RNA分子,而檢討使ssTbRNA分子之產量增加的方法。
首先,使用以各股之最終濃度100μM包含雙股寡RNA的連接反應液而進行檢討。將於緩衝液(50mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP)中包含雙股寡RNA(最終濃度100μM;100μL之反應液中之總寡RNA量,於股1及股2之各自為10nmol)及T4 RNA連接酶2(0.4U/μL;4U/nmol寡RNA)的反應液100μL,分注於4根試管,藉由於25℃培育而開始連接反應。
自連接反應開始12小時後,於3根試管中,以各股成為10nmol的量(11.1μL)添加016之雙股寡RNA(於反應緩衝液(50mM Tris-HCl、5mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP(pH8.0))中,016之股1與股2之等莫耳混合液),接著培育。寡RNA追加後之反應液中之寡RNA濃度為180μM(各股的濃度),酵素(T4 RNA連接酶2)之量為0.36U/μL(2U/nmol寡RNA)。
寡RNA追加之12小時後,於經追加寡RNA的3根中之2根試管中,以各股成為10nmol的量(11.1μL)進一步添加016之雙股寡RNA(與上述相同的等莫耳混合液),接著培育。第2次的寡RNA追加後之反應液中之寡RNA濃度為245μM(各股之濃度),酵素(T4 RNA連接酶2)之量為0.33U/μL(1.33U/nmol寡RNA)。
其12小時後,於經2次追加寡RNA的2根中之1根試管中,以各股成為10nmol的量(11.1μL)添加016之雙股寡RNA(與上述相同的等莫耳混合液),再培育12小時。第3次之寡RNA追加後之反應液中的寡RNA濃度為300μM(各股之濃度),酵素(T4 RNA連接酶2)之量為0.3U/μL(1U/nmol寡RNA)。
自彼等試管,每12小時採樣反應液,於85℃加熱20分鐘而使酵素失活。獲得的反應後之樣品係如以下。反應時間係指自連接反應開始時起的時間。
試管1)100μM寡RNA(於各股,總計10nmol;無追加),酵素量0.4U/μL,反應溫度25℃,反應時間12、24、36、或48小時
試管2)180μM寡RNA(於各股,總計20nmol;1次追加),酵素量0.36U/μL,反應溫度25℃,反應時間24、36、或48小時
試管3)245μM寡RNA(於各股,總計30nmol;2次追加),酵素量0.33U/μL,反應溫度25℃,反應時間36或48小時
試管4)300μM寡RNA(於各股,總計40nmol;3次追加),酵素量0.3U/μL,反應溫度25℃,反應時間48小時
對各樣品進行UHPLC解析,算出FLP%。UHPLC之條件、以及FLP(%)之算出方法,與實施例2相同。將結果示於表3。
再者,對各樣品,自FLP%與單股寡RNA分子之添加量算出目的產物(ssTbRNA分子)之生成量(nmol)。將其結果示於圖15。
以同樣之方法,使用以各股之最終濃度200μM包含雙股寡RNA的連接反應液而進行檢討。
將於緩衝液(50mM Tris-HCl、5mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP(pH8.0))中包含雙股寡RNA(最終濃度200μM;100μL之反應液中的總寡RNA量,於股1 及股2之各自為20nmol)及T4 RNA連接酶2(0.4U/μL;4U/nmol寡RNA)的反應液100μL,分注於4根試管,藉由於25℃培育而開始連接反應。12小時後,於3根試管中,以各股成為20nmol的量(22.2μL)添加016之雙股寡RNA(反應緩衝液(50mM Tris-HCl、5mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP(pH8.0))中,016之股1與股2的等莫耳混合液),接著培育。之後,與以最終濃度100μM使用寡RNA的情形同樣地,每12小時追加寡RNA至第3次為止,繼續連接反應。
自彼等試管,每12小時採樣反應液,於85℃加熱20分鐘而使酵素失活。獲得的反應後之樣品如下。反應時間係指自連接反應開始時起的時間。
試管1)200μM寡RNA(於各股,總計20nmol;無追加),酵素量0.4U/μL,反應溫度25℃,反應時間12、24、36、或48小時
試管2)327μM寡RNA(於各股,總計40nmol;1次追加),酵素量0.36U/μL,反應溫度25℃,反應時間24、36、或48小時
試管3)415μM寡RNA(於各股,總計60nmol;2次追加),酵素量0.33U/μL,反應溫度25℃,反應時間36、或48小時
試管4)480μM寡RNA(於各股,總計80nmol;3次追加),酵素量0.3U/μL,反應溫度25℃,反應時間48小時
對各樣品進行UHPLC解析,算出FLP%。UHPLC之條件、以及FLP(%)之算出方法係與實施例2相同。將結果示於表4。
再者,針對各樣品,自FLP%與單股寡RNA分子之添加量算出目的產物(ssTbRNA分子)之生成量(nmol)。將其結果示於圖16。
由以上之結果顯示,於本發明之方法,藉由於連接反應相依序追加寡RNA,可使髮夾型單股RNA分子(此處,ssTbRNA分子)之生成量增加。
於一般的RNA連接酶使用量(相對於起始寡RNA量10μM,酵素量為0.4U/μL),以與上述同樣的連接反應條件雖獲得FLP超過90%的連接效率,但每100μL反應液的ssTbRNA分子之生成量低於1nmol。與該種一般的情形比較,於本發明之方法,於顯示90%以上之FLP的效率的反應條件下,顯示可將每單位寡RNA量的酵素使用量削減為1/30~1/40。
藉由與實施例1及2同樣地連接2個分割片段的股1及股2的方法,而製作包含對人類GAPDH基因、人類 LAMA1基因、或人類LMNA基因的基因表現抑制序列來代替對人類TGF-β1基因的基因表現抑制序列的髮夾型單股RNA分子。就連接子而言,使用與實施例1及2同樣的脯胺酸衍生物、或核苷酸性連接子。
將髮夾型單股RNA分子、及其分子中之分割位置示於圖17。圖17中,將髮夾型單股RNA分子所包含的對各基因的基因表現抑制序列(反義序列)於框中表示。又,將各自之髮夾型單股RNA分子之為2個分割片段的股1及股2之對示於表5。表5之股1及股2之對,作為連接的末端之鹼基之組合,為具有U-U、A-A、A-U、或U-A者。
包含脯胺酸衍生物的股1及股2之單股寡RNA分子之合成,係藉由與實施例1同樣的方法進行。包含核苷酸性連接子代替脯胺酸衍生物的股1及股2之單股寡RNA分子之合成,係藉由使用亞磷醯胺法的固相合成法進行。
如實施例2記載的方式,將各對的股1及股2(表5)降溫貼合,獲得雙股寡RNA。調製於緩衝液(50mM Tris-HCl、2mM MgCl2、1mM二硫蘇糖醇(DTT)、400μM 腺苷三磷酸(ATP))中包含獲得的雙股寡RNA(股1、股2之各自的最終濃度10μM)的反應液(pH7.5[25℃]),添加2μL之10U/μL T4 RNA連接酶2(New England Biolabs)(40U/nmol寡RNA)而作成反應液量50μL。將此反應液於37℃培育30分鐘。
酵素反應後,藉由超高效液體層析(UHPLC)及變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(Denatured PAGE)確認反應液中之連接效率。連接後UHPLC之條件、及連接效率(FLP(%))之算出方法,與實施例2相同。
此外,對各自之連接生成物,進行LC-MS分析,確認具有所預測的分子量。用於LC-MS分析的LC裝置及MS裝置與實施例2所使用者相同。
將結果示於圖18。表5之股1及2之對,任一者皆顯示高連接效率。
與實施例2之實驗並行,使用T4 RNA連接酶代替T4 RNA連接酶2,連結表1所示的股1及股2降溫貼合的雙股寡RNA,並確定其連接效率。
如實施例2所記載,將各自之對之股1及股2(表1)降溫貼合,獲得雙股寡RNA。調製於緩衝液(50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、5mM二硫蘇糖醇(DTT)、1mM腺苷三磷酸(ATP))中包含獲得的雙股寡RNA(股1、股2之各自的最終濃度10μM)的反應液(pH7.8),添加0.5μL 之10U/μL T4 RNA連接酶(Promega)(10U/nmol寡RNA)而作成反應液量50μL。將此反應液於37℃培育30分鐘。
酵素反應後,藉由超高效液體層析(UHPLC)及變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(Denatured PAGE)確認反應液中之連接效率。連接後UHPLC之條件、及連接效率(FLP(%))之算出方法,與實施例2相同。
將結果示於圖19。使用T4 RNA連接酶的情形之連接效率,與T4 RNA連接酶2(圖3)比較顯著更低。
本發明使用泛用型亞磷醯胺且減少酵素使用量的同時,可使包含對標的基因的表現抑制序列的髮夾型單股RNA分子之有效率的製造成為可能。
序列識別號1~57:合成RNA
本說明書所引用的全部刊物、專利及專利申請案係藉由引用而直接併入本說明書。
<110> 東麗股份有限公司
<120> 髮夾型單股RNA分子之製造方法
<130> PH-7783-PCT
<150> JP 2018-070423
<151> 2018-03-30
<160> 57
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (24)..(25)
<223> 核苷酸24及25經由連接子連接
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (50)..(51)
<223> 核苷酸50及51經由連接子連接
<210> 2
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<210> 3
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<210> 4
<211> 10
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (9)..(10)
<223> 核苷酸9及10經由連接子連接
<210> 5
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (24)..(25)
<223> 核苷酸24及25經由連接子連接
<210> 6
<211> 11
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (10)..(11)
<223> 核苷酸10及11經由連接子連接
<210> 7
<211> 40
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (24)..(25)
<223> 核苷酸24及25經由連接子連接
<210> 8
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (11)..(12)
<223> 核苷酸11及12經由連接子連接
<210> 9
<211> 39
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (24)..(25)
<223> 核苷酸24及25經由連接子連接
<210> 10
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (12)..(13)
<223> 核苷酸12及13經由連接子連接
<210> 11
<211> 38
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (24)..(25)
<223> 核苷酸24及25經由連接子連接
<210> 12
<211> 14
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (13)..(14)
<223> 核苷酸13及14經由連接子連接
<210> 13
<211> 37
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (24)..(25)
<223> 核苷酸24及25經由連接子連接
<210> 14
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (14)..(15)
<223> 核苷酸14及15經由連接子連接
<210> 15
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (24)..(25)
<223> 核苷酸24及25經由連接子連接
<210> 16
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (15)..(16)
<223> 核苷酸15及16經由連接子連接
<210> 17
<211> 35
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (24)..(25)
<223> 核苷酸24及25經由連接子連接
<210> 18
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (16)..(17)
<223> 核苷酸16及17經由連接子連接
<210> 19
<211> 34
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (24)..(25)
<223> 核苷酸24及25經由連接子連接
<210> 20
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (17)..(18)
<223> 核苷酸17及18經由連接子連接
<210> 21
<211> 33
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (24)..(25)
<223> 核苷酸24及25經由連接子連接
<210> 22
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (18)..(19)
<223> 核苷酸18及19經由連接子連接
<210> 23
<211> 32
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (24)..(25)
<223> 核苷酸24及25經由連接子連接
<210> 24
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (19)..(20)
<223> 核苷酸19及20經由連接子連接
<210> 25
<211> 31
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (24)..(25)
<223> 核苷酸24及25經由連接子連接
<210> 26
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 核苷酸20及21經由連接子連接
<210> 27
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (24)..(25)
<223> 核苷酸24及25經由連接子連接
<210> 28
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (21)..(22)
<223> 核苷酸21及22經由連接子連接
<210> 29
<211> 29
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (24)..(25)
<223> 核苷酸24及25經由連接子連接
<210> 30
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (22)..(23)
<223> 核苷酸22及23經由連接子連接
<210> 31
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (24)..(25)
<223> 核苷酸24及25經由連接子連接
<210> 32
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (23)..(24)
<223> 核苷酸23及24經由連接子連接
<210> 33
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (24)..(25)
<223> 核苷酸24及25經由連接子連接
<210> 34
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (24)..(25)
<223> 核苷酸24及25經由連接子連接
<210> 35
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (24)..(25)
<223> 核苷酸24及25經由連接子連接
<210> 36
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 核苷酸20及21經由連接子連接
<210> 37
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (22)..(23)
<223> 核苷酸22及23經由連接子連接
<210> 38
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (16)..(17)
<223> 核苷酸16及17經由連接子連接
<210> 39
<211> 34
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (24)..(25)
<223> 核苷酸24及25經由連接子連接
<210> 40
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (22)..(23)
<223> 核苷酸22及23經由連接子連接
<210> 41
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (24)..(25)
<223> 核苷酸24及25經由連接子連接
<210> 42
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<210> 43
<211> 35
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<210> 44
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<210> 45
<211> 34
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<210> 46
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (21)..(22)
<223> 核苷酸21及22經由連接子連接
<210> 47
<211> 29
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (24)..(25)
<223> 核苷酸24及25經由連接子連接
<210> 48
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (23)..(24)
<223> 核苷酸23及24經由連接子連接
<210> 49
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (24)..(25)
<223> 核苷酸24及25經由連接子連接
<210> 50
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<210> 51
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (22)..(23)
<223> 核苷酸22及23經由連接子連接
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (48)..(49)
<223> 核苷酸48及49經由連接子連接
<210> 52
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (24)..(25)
<223> 核苷酸24及25經由連接子連接
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (50)..(51)
<223> 核苷酸50及51經由連接子連接
<210> 53
<211> 61
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<210> 54
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (24)..(25)
<223> 核苷酸24及25經由連接子連接
<220>
<221> 修飾的鹼基
<222> (50)..(51)
<223> 核苷酸50及51經由連接子連接
<210> 55
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<210> 56
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<210> 57
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
Claims (13)
- 一種髮夾型單股RNA分子之製造方法,其係抑制標的基因表現的髮夾型單股RNA分子之製造方法,其包含:將第一單股寡RNA分子與第二單股寡RNA分子降溫貼合的降溫貼合(annealing)步驟、及藉由Rnl2家族之連接酶(ligase)而將該第一單股寡RNA分子之3’末端與該第二單股寡RNA分子之5’末端連接的連接(ligation)步驟,該第一單股寡RNA分子包含經由第一連接子(linker)而連結的第一RNA部分與第二RNA部分,第一RNA部分與第二RNA部分之一者相對於另一者可互補性地結合,該第二單股寡RNA分子包含經由第二連接子而連結的第三RNA部分與第四RNA部分,第三RNA部分與第四RNA部分之一者相對於另一者可互補性地結合,該第一單股寡RNA分子與該第二單股寡RNA分子可於5’末端或3’末端之互補的序列間形成分子間雙鏈,於降溫貼合步驟,該第一單股寡RNA分子與該第二單股寡RNA分子形成雙鏈時,該第一單股寡RNA分子之3’末端之核糖核苷酸殘基與該第二單股寡RNA分子之5’末端之核糖核苷酸殘基生成鏈裂(nick),又於該第一單股寡RNA分子之5’末端之核糖核苷酸殘基與該第二單股寡RNA分子之3’末端之核糖核苷酸 殘基之間存在有1個以上之核糖核苷酸殘基的間隙(gap),藉由該第一單股寡RNA分子與該第二單股寡RNA分子之連接所生成的序列,包含對該標的基因的基因表現抑制序列。
- 如請求項1之製造方法,其中該第一單股寡RNA分子係以下述式(I)表示,該第二單股寡RNA分子係以下述式(II)表示,5’-Xs-Lx 1-Xa-3’‧‧‧式(I) 5’-Ya 1-Ya 2-Ya 3-Lx 2-Ys-3’‧‧‧式(II)式(I)及式(II)中,Xs、Xa、Ya 1、Ya 2、Ya 3及Ys表示1個或其以上之核糖核苷酸殘基,Lx 1及Lx 2各自表示第一連接子及第二連接子,Ya 3係與Ys互補,於連接步驟所生成的Xa-Ya 1係與Xs互補,於連接步驟所生成的Xa-Ya 1-Ya 2-Ya 3包含對該標的基因的基因表現抑制序列。
- 如請求項1或2之製造方法,其中該第一單股寡RNA分子於3’末端具有尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A),該第二單股寡RNA分子於5’末端具有尿嘧啶(U)或腺嘌呤(A)。
- 如請求項1至3中任一項之製造方法,其中第一連接子及第二連接子各自獨立為(i)包含吡咯啶骨架及哌啶骨架之至少一者的非核苷酸性連接子、或(ii)核苷酸性連接子。
- 如請求項1至4中任一項之製造方法,其中Rnl2家族 之連接酶為T4 RNA連接酶2。
- 如請求項1至5中任一項之製造方法,其係於pH7.4~8.6之反應液中進行該連接。
- 如請求項1至6中任一項之製造方法,其係於包含2~10mM之二價金屬離子的反應液中進行該連接。
- 如請求項1至8中任一項之製造方法,其中該標的基因為TGF-β1基因、GAPDH基因、LAMA1基因或LMNA基因。
- 如請求項1至9中任一項之製造方法,其中該髮夾型單股RNA分子包含序列識別號1所表示的鹼基序列,且第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由第一連接子而連結,第50號及第51號之核糖核苷酸殘基係經由第二連接子而連結。
- 如請求項1至10中任一項之製造方法,其中該第一單股寡RNA分子與該第二單股寡RNA分子為以下之(1)~(6)之任一者:(1)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由第 一連接子而連結的序列識別號7所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第10號及第11號之核糖核苷酸殘基係經由第二連接子而連結的序列識別號6所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合;(2)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由第一連接子而連結的序列識別號19所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第16號及第17號之核糖核苷酸殘基係經由第二連接子而連結的序列識別號18所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合;(3)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由第一連接子而連結的序列識別號27所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第20號及第21號之核糖核苷酸殘基係經由第二連接子而連結的序列識別號26所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合;(4)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由第一連接子而連結的序列識別號29所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第21號及第22號之核糖核苷酸殘基係經由第二連接子而連結的序列識別號28所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合;(5)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由第一連接子而連結的序列識別號31所表示的鹼基序 列的第一單股寡RNA分子、與包含第22號及第23號之核糖核苷酸殘基係經由第二連接子而連結的序列識別號30所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合;(6)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由第一連接子而連結的序列識別號33所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第23號及第24號之核糖核苷酸殘基係經由第二連接子而連結的序列識別號32所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合。
- 一種單股寡RNA分子,其為以下之(a)~(1)之任一者:(a)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由連接子而連結的序列識別號7所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子;(b)包含第10號及第11號之核糖核苷酸殘基係經由連接子而連結的序列識別號6所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子;(c)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由連接子而連結的序列識別號19所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子;(d)包含第16號及第17號之核糖核苷酸殘基係經由連接子而連結的序列識別號18所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子;(e)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由連接子而連結的序列識別號27所表示的鹼基序列的 單股寡RNA分子;(f)包含第20號及第21號之核糖核苷酸殘基係經由連接子而連結的序列識別號26所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子;(g)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由連接子而連結的序列識別號29所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子;(h)包含第21號及第22號之核糖核苷酸殘基係經由連接子而連結的序列識別號28所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子;(i)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由連接子而連結的序列識別號31所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子;(j)包含第22號及第23號之核糖核苷酸殘基係經由連接子而連結的序列識別號30所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子;(k)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由連接子而連結的序列識別號33所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子;(l)包含第23號及第24號之核糖核苷酸殘基係經由連接子而連結的序列識別號32所表示的鹼基序列的單股寡RNA分子。
- 一種用以抑制TGF-β1基因表現的髮夾型單股RNA分子之製造用之套組,其包含以下之(1)~(6)之任一單股寡RNA分子之組合: (1)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由第一連接子而連結的序列識別號7所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第10號及第11號之核糖核苷酸殘基係經由第二連接子而連結的序列識別號6所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合;(2)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由第一連接子而連結的序列識別號19所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第16號及第17號之核糖核苷酸殘基係經由第二連接子而連結的序列識別號18所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合;(3)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由第一連接子而連結的序列識別號27所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第20號及第21號之核糖核苷酸殘基係經由第二連接子而連結的序列識別號26所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合;(4)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由第一連接子而連結的序列識別號29所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第21號及第22號之核糖核苷酸殘基係經由第二連接子而連結的序列識別號28所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合;(5)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由第 一連接子而連結的序列識別號31所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第22號及第23號之核糖核苷酸殘基係經由第二連接子而連結的序列識別號30所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合;(6)包含第24號及第25號之核糖核苷酸殘基係經由第一連接子而連結的序列識別號33所表示的鹼基序列的第一單股寡RNA分子、與包含第23號及第24號之核糖核苷酸殘基係經由第二連接子而連結的序列識別號32所表示的鹼基序列的第二單股寡RNA分子之組合。
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