JPWO2019189722A1 - ヘアピン型一本鎖rna分子の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖RNA分子の製造方法であって、
第1の一本鎖オリゴRNA分子と第2の一本鎖オリゴRNA分子とをアニーリングするアニーリング工程と、
前記第1の一本鎖オリゴRNA分子の3’末端と前記第2の一本鎖オリゴRNA分子の5’末端とをRnl2ファミリーのリガーゼによりライゲーションするライゲーション工程とを含み、
前記第1の一本鎖オリゴRNA分子は、第1のリンカーを介して連結された第1のRNA部分と第2のRNA部分を含み、第1のRNA部分と第2のRNA部分の一方は他方に対して相補的に結合可能であり、
前記第2の一本鎖オリゴRNA分子は、第2のリンカーを介して連結された第3のRNA部分と第4のRNA部分を含み、第3のRNA部分と第4のRNA部分の一方は他方に対して相補的に結合可能であり、
前記第1の一本鎖オリゴRNA分子と前記第2の一本鎖オリゴRNA分子とは5’末端又は3’末端の相補的な配列間で分子間二重鎖を形成可能であり、
アニーリング工程において前記第1の一本鎖オリゴRNA分子と前記第2の一本鎖オリゴRNA分子が二重鎖を形成するとき、前記第1の一本鎖オリゴRNA分子の3’末端のリボヌクレオチド残基と前記第2の一本鎖オリゴRNA分子の5’末端のリボヌクレオチド残基はニックを生成し、また前記第1の一本鎖オリゴRNA分子の5’末端のリボヌクレオチド残基と前記第2の一本鎖オリゴRNA分子の3’末端のリボヌクレオチド残基の間には1個以上のリボヌクレオチド残基のギャップが存在し、
前記第1の一本鎖オリゴRNA分子と前記第2の一本鎖オリゴRNA分子とのライゲーションにより生成される配列は、前記標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む、
ヘアピン型一本鎖RNA分子の製造方法。
[2]前記第1の一本鎖オリゴRNA分子は、下記式(I)で表され、前記第2の一本鎖オリゴRNA分子は、下記式(II)で表され、
5’−Xs−Lx1−Xa−3’ ・・・式(I)
5’−Ya1−Ya2−Ya3−Lx2−Ys−3’ ・・・式(II)
式(I)及び式(II)中、Xs、Xa、Ya1、Ya2、Ya3及びYsは、1個又はそれ以上のリボヌクレオチド残基を表し、
Lx1及びLx2は、それぞれ、第1のリンカー及び第2のリンカーを表し、
Ya3は、Ysと相補的であり、
ライゲーション工程で生じるXa−Ya1は、Xsと相補的であり、
ライゲーション工程で生じるXa−Ya1−Ya2−Ya3は、前記標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む、
上記[1]に記載の製造方法。
[3]前記第1の一本鎖オリゴRNA分子が3’末端にウラシル(U)又はアデニン(A)を有し、前記第2の一本鎖オリゴRNA分子が5’末端にウラシル(U)又はアデニン(A)を有する、上記[1]又は[2]に記載の製造方法。
[4]第1のリンカー及び第2のリンカーは、それぞれ独立して、(i)ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド性リンカー、又は(ii)ヌクレオチド性リンカーである、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の製造方法。
[5]Rnl2ファミリーのリガーゼが、T4 RNAリガーゼ2である、上記[1]〜[4]のいずれかに記載の製造方法。
[6]pH7.4〜8.6の反応液中で前記ライゲーションが行われる、上記[1]〜[5]のいずれかに記載の製造方法。
[7]2〜10mMの二価金属イオンを含む反応液中で前記ライゲーションが行われる、上記[1]〜[6]のいずれかに記載の製造方法。
[8]第1のリンカー及び第2のリンカーは、それぞれ独立して、下記式(VI)で表される非ヌクレオチド性リンカーである、上記[1]〜[7]のいずれかに記載の製造方法。
[10]前記ヘアピン型一本鎖RNA分子は、配列番号1で表される塩基配列からなり、24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結され、50番目と51番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている、上記[1]〜[9]のいずれかに記載の製造方法。
[11]前記第1の一本鎖オリゴRNA分子と前記第2の一本鎖オリゴRNA分子は、以下の(1)〜(6)のいずれかである、上記[1]〜[10]のいずれかに記載の製造方法。
(1)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号7で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、10番目と11番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号6で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ
(2)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号19で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、16番目と17番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号18で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ
(3)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号27で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、20番目と21番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号26で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ
(4)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号29で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、21番目と22番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号28で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ
(5)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号31で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、22番目と23番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号30で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ
(6)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号33で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、23番目と24番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号32で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ
[12]以下の(a)〜(l)のいずれかである、一本鎖オリゴRNA分子。
(a)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号7で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子
(b)10番目と11番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号6で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子
(c)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号19で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子
(d)16番目と17番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号18で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子
(e)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号27で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子
(f)20番目と21番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号26で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子
(g)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号29で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子
(h)21番目と22番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号28で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子
(i)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号31で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子
(j)22番目と23番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号30で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子
(k)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号33で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子
(l)23番目と24番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号32で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子
[13]以下の(1)〜(6)のいずれかの一本鎖オリゴRNA分子の組み合わせを含む、TGF−β1遺伝子の発現を抑制するためのヘアピン型一本鎖RNA分子の製造用のキット。
(1)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号7で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、10番目と11番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号6で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ
(2)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号19で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、16番目と17番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号18で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ
(3)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号27で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、20番目と21番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号26で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ
(4)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号29で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、21番目と22番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号28で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ
(5)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号31で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、22番目と23番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号30で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ
(6)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号33で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、23番目と24番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号32で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ
本発明は、標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖RNA分子の製造方法に関する。本発明の方法により製造されるヘアピン型一本鎖RNA分子は、遺伝子発現抑制配列を含む二本鎖RNAのセンス鎖の3’末端及びアンチセンス鎖の5’末端が、非ヌクレオチド性リンカー又はヌクレオチド性リンカーなどのリンカーを含む配列を介して連結され、そのアンチセンス鎖の3’末端に非ヌクレオチド性リンカー又はヌクレオチド性リンカーなどのリンカーを含む配列を介して1個以上のリボヌクレオチド残基がさらに連結された一本鎖構造を有する。本発明の方法により製造されるヘアピン型一本鎖RNA分子の5’末端と3’末端は、結合されていない。本明細書において「ヘアピン型」とは、一本鎖RNA分子が分子内アニーリング(自己アニーリング)により1つ以上の二重鎖構造を形成することを意味する。本発明の方法により製造されるヘアピン型一本鎖RNA分子は、典型的には、その5’末端を含む5’側領域と3’末端を含む3’側領域がそれぞれ別個に分子内アニーリングすることにより、2つの二重鎖構造を形成する。本明細書において「RNA」、「RNA分子」、「核酸分子」及び「核酸」は、ヌクレオチドのみから構成されていてもよいが、ヌクレオチドと非ヌクレオチド物質(例えば、プロリン誘導体などの環状アミン誘導体)から構成されていてもよい。
第1の一本鎖オリゴRNA分子と第2の一本鎖オリゴRNA分子とをアニーリングするアニーリング工程と、
前記第1の一本鎖オリゴRNA分子の3’末端と前記第2の一本鎖オリゴRNA分子の5’末端とをRnl2ファミリーのリガーゼによりライゲーションするライゲーション工程とを含み、
第1の一本鎖オリゴRNA分子と第2の一本鎖オリゴRNA分子とのライゲーションにより生成される配列は、前記標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む、ヘアピン型一本鎖RNA分子の製造方法に関する。
下記式(I)で表される第1の一本鎖オリゴRNA分子(図1中、ストランド1):
5’−Xs−Lx1−Xa−3’ ・・・式(I)
と、下記式(II)で表される第2の一本鎖オリゴRNA分子(図1中、ストランド2):
5’−Ya1−Ya2−Ya3−Lx2−Ys−3’ ・・・式(II)
をアニーリングするアニーリング工程と、第1の一本鎖オリゴRNA分子の3’末端と第2の一本鎖オリゴRNA分子の5’末端とをライゲーションするライゲ-ション工程とを含む。このライゲーションはRnl2ファミリーのリガーゼにより行うことができる。
下記式(A)で表される第1の一本鎖オリゴRNA分子:
5’−XXs−Lx1−XXa3−XXa2−XXa1−3’ ・・・式(A)
と、下記式(B)で表される第2の一本鎖オリゴRNA分子:
5’−YYa−Lx2−YYs−3’ ・・・式(B)
をアニーリングするアニーリング工程と、第1の一本鎖オリゴRNA分子の3’末端と第2の一本鎖オリゴRNA分子の5’末端とをライゲーションするライゲ-ション工程とを含む。このライゲーションはRnl2ファミリーのリガーゼにより行うことができる。
(1)非修飾ヌクレオチド残基
(2)修飾ヌクレオチド残基
(3)非修飾ヌクレオチド残基と修飾ヌクレオチド残基の組み合わせ
(4)非ヌクレオチド残基
(5)非ヌクレオチド残基と非修飾ヌクレオチド残基の組み合わせ
(6)非ヌクレオチド残基と修飾ヌクレオチド残基の組み合わせ
(7)非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基の組み合わせ
X1及びX2は、それぞれ独立して、H2、O、S又はNHであり;
Y1及びY2は、それぞれ独立して、単結合、CH2、NH、O又はSであり;
R3は、環A上のC−3、C−4、C−5又はC−6に結合する水素原子又は置換基であり、
L1は、n個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、もしくはSRaで置換されても置換されていなくてもよく、又は、
L1は、上記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ここで、Y1が、NH、O又はSの場合、Y1に結合するL1の原子は炭素であり、OR1に結合するL1の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
L2は、m個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SHもしくはSRcで置換されても置換されていなくてもよく、又は、
L2は、上記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ここで、Y2が、NH、O又はSの場合、Y2に結合するL2の原子は炭素であり、OR2に結合するL2の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
Ra、Rb、Rc及びRdは、それぞれ独立して、置換基又は保護基であり;
lは、1又は2であり;
mは、0〜30の範囲の整数であり;
nは、0〜30の範囲の整数であり;
環Aは、環A上のC−2以外の1個の炭素原子が、窒素原子、酸素原子、硫黄原子で置換されてもよく、
環A内に、炭素−炭素二重結合又は炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
ここで、R1及びR2は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、R1及びR2は、それぞれ独立して、R1及びR2が存在しない式(III)で表される非ヌクレオチド残基である。
X1及びX2は、それぞれ独立して、H2、O、S又はNHであり;
Y1及びY2は、それぞれ独立して、単結合、CH2、NH、O又はSであり;
R1及びR2は、それぞれ独立して、H、保護基又はリン酸保護基であり;
R3は、環A上のC−3、C−4、C−5又はC−6に結合する水素原子又は置換基であり;
L1は、n個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、もしくはSRaで置換されても置換されていなくてもよく、又は、
L1は、上記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ここで、Y1が、NH、O又はSの場合、Y1に結合するL1の原子は炭素であり、OR1に結合するL1の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
L2は、m個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SHもしくはSRcで置換されても置換されていなくてもよく、又は、
L2は、上記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ここで、Y2が、NH、O又はSの場合、Y2に結合するL2の原子は炭素であり、OR2に結合するL2の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
Ra、Rb、Rc及びRdは、それぞれ独立して、置換基又は保護基であり;
lは、1又は2であり;
mは、0〜30の範囲の整数であり;
nは、0〜30の範囲の整数であり;
環Aは、環A上のC−2以外の1個の炭素原子が、窒素原子、酸素原子又は硫黄原子で置換されてもよく、
環A内に、炭素−炭素二重結合又は炭素−窒素二重結合を含んでもよい。
−P(OR6)(NR7R8)
(1)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカー(Lx1)を介して連結されている配列番号7で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、10番目と11番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカー(Lx2)を介して連結されている配列番号6で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ、
(2)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカー(Lx1)を介して連結されている配列番号19で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、16番目と17番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカー(Lx2)を介して連結されている配列番号18で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子の組み合わせ、
(3)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカー(Lx1)を介して連結されている配列番号27で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、20番目と21番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカー(Lx2)を介して連結されている配列番号26で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ
(4)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカー(Lx1)を介して連結されている配列番号29で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、21番目と22番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカー(Lx2)を介して連結されている配列番号28で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子の組み合わせ
(5)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカー(Lx1)を介して連結されている配列番号31で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、22番目と23番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカー(Lx2)を介して連結されている配列番号30で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ、及び
(6)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカー(Lx1)を介して連結されている配列番号33で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、23番目と24番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカー(Lx2)を介して連結されている配列番号32で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子の組み合わせ、
が挙げられる。これらの第1の一本鎖オリゴRNA分子は、3’末端(Xaの3’末端)にU又はAを含む。これらの第2の一本鎖オリゴRNA分子は、5’末端(Ya1の5’末端)にU又はAを含む。
(a)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号7で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子、
(b)10番目と11番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号6で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子、
(c)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号19で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子、
(d)16番目と17番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号18で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子、
(e)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号27で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子、
(f)20番目と21番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号26で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子、
(g)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号29で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子、
(h)21番目と22番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号28で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子、
(i)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号31で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子、
(j)22番目と23番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号30で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子、
(k)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号33で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子、及び
(l)23番目と24番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号32で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子。
(m)22番目と23番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号37で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子、及び
(n)20番目と21番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号36で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子
(o)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号39で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子、
(p)16番目と17番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号38で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子、
(q)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号41で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子、
(r)22番目と23番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号40で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子、
(s)24番目と31番目のリボヌクレオチド残基がヌクレオチド性リンカーを介して連結されている配列番号43で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子、
(t)21番目と26番目のリボヌクレオチド残基がヌクレオチド性リンカーを介して連結されている配列番号42で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子、
(u)24番目と31番目のリボヌクレオチド残基がヌクレオチド性リンカーを介して連結されている配列番号45で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子、及び
(v)22番目と27番目のリボヌクレオチド残基がヌクレオチド性リンカーを介して連結されている配列番号44で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子。
(w)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号47で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子、
(x)21番目と22番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号46で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子、
(y)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号49で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子、及び
(z)23番目と24番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号48で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子。
(i)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号7で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、10番目と11番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号6で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ、
(ii)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号19で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、16番目と17番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号18で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ、
(iii)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号27で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、20番目と21番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号26で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ、
(iv)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号29で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、21番目と22番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号28で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ、
(v)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号31で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、22番目と23番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号30で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ、及び
(vi)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号33で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、23番目と24番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号32で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ。
(vii)22番目と23番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号37で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子と、20番目と21番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号36で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ。
(viii)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号39で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子と、16番目と17番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号38で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ、
(ix)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号41で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子と、22番目と23番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号40で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ、
(x)配列番号43で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子(24番目と31番目のリボヌクレオチド残基がヌクレオチド性リンカーを介して連結されている)と、配列番号42で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子(21番目と26番目のリボヌクレオチド残基がヌクレオチド性リンカーを介して連結されている)との組み合わせ、
(xi)配列番号45で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子(24番目と31番目のリボヌクレオチド残基がヌクレオチド性リンカーを介して連結されている)と、配列番号44で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子(22番目と27番目のリボヌクレオチド残基がヌクレオチド性リンカーを介して連結されている)との組み合わせ。
(xii)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号47で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子と、21番目と22番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号46で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ、
(xiii)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号49で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子と、23番目と24番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号48で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ。
プロリン誘導体リンカーを含む本発明のヘアピン型一本鎖RNA分子を生成するために用いるプロリンジアミドアミダイトは、例えば、国際公開WO2013/027843の記載に従って合成することができる。具体的な合成例を以下に示すが、合成方法はそれにより限定されない。
Fmoc−L−プロリンを開始原料とする。Fmocは、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基である。Fmoc−L−プロリン(10.00g、29.64mmol)、4−アミノ−1−ブタノール(3.18g、35.56mmol)及び1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(10.90g、70.72mmol)を混合し、その混合物に対し、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填する。得られた混合物に、無水アセトニトリル(140mL)を室温で加え、さらに、ジシクロヘキシルカルボジイミド(7.34g、35.56mmol)の無水アセトニトリル溶液(70mL)を添加した後、アルゴン雰囲気下、室温で15時間撹拌する。反応終了後、生成した沈殿をろ別し、回収したろ液について、減圧下で溶媒を留去する。得られた残渣にジクロロメタン(200mL)を加え、飽和重曹水(200mL)で洗浄する。そして、有機層を回収し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、ろ過する。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去し、その残渣にジエチルエーテル(200mL)を加え、粉末化する。生じた粉末を濾取することにより、無色粉末状物質としてFmoc−ヒドロキシアミド−L−プロリンが得られる。
Fmoc−ヒドロキシアミド−L−プロリン(7.80g、19.09mmol)を無水ピリジン(5mL)と混合し、室温で2回共沸乾燥する。得られた残留物に、4,4’−ジメトキシトリチルクロリド(8.20g、24.20mmol)、4−ジメチルアミノピリジン(DMAP)(23mg、0.19mmol)及び無水ピリジン(39mL)を加える。この混合物を、室温で1時間撹拌した後、メタノール(7.8mL)を加え、室温で30分撹拌する。この混合物を、ジクロロメタン(100mL)で希釈し、飽和重曹水(150mL)で洗浄後、有機層を分離する。この有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過する。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去する。得られた未精製の残渣に、無水ジメチルホルムアミド(39mL)及びピペリジン(18.7mL、189mmol)を加え、室温で1時間撹拌する。反応終了後、その混合液から、減圧下、室温で、溶媒を留去する。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(商品名Wakogel C−300、展開溶媒CH2Cl2:CH3OH=9:1、0.05%ピリジン含有)に供することにより、淡黄色油状物質としてDMTr−アミド−L−プロリンが得られる。DMTrは、ジメトキシトリチル基である。
得られたDMTr−アミド−L−プロリン(6.01g、12.28mmol)、N−(3’−ジメチルアミノプロピル)−N’−エチルカルボジイミド(EDC)(2.83g、14.74mmol)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(3.98g、29.47mmol)及びトリエチルアミン(4.47g、44.21mmol)の無水ジクロロメタン溶液(120mL)を混合する。この混合液に、さらに、アルゴン雰囲気下、室温で、6−ヒドロキシヘキサン酸(1.95g、14.47mmol)を加え、その後、アルゴン雰囲気下、室温で、1時間撹拌する。得られた混合液をジクロロメタン(600mL)で希釈し、飽和食塩水(800mL)で3回洗浄する。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過する。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去する。これにより、淡黄色泡状物質としてDMTr−ヒドロキシジアミド−L−プロリンが得られる。
得られたDMTr−ヒドロキシジアミド−L−プロリン(8.55g、14.18mmol)を無水アセトニトリルと混合し、室温で3回共沸乾燥する。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(2.91g、17.02mmol)を加え、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填する。その混合物に対し、無水アセトニトリル(10mL)を加え、さらに、2−シアノエトキシ−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト(5.13g、17.02mmol)の無水アセトニトリル溶液(7mL)を加える。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で2時間撹拌する。得られた混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水(200mL)で3回洗浄した後、飽和食塩水(200mL)で洗浄する。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過する。得られたろ液について、減圧下に溶媒を留去する。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー(展開溶媒ヘキサン:酢酸エチル=1:3、0.05%ピリジン含有)に供することにより、無色シロップ状物質としてDMTr−ジアミド−L−プロリンアミダイトが得られる。
以下の実施例では、プロリン誘導体を用いたリンカーとヒトTGF−β1遺伝子発現抑制配列とを有するヘアピン型一本鎖RNA分子(以下、「ssTbRNA分子」とも称する。;図2)を、その2つの分割フラグメントである一本鎖オリゴRNA分子(ストランド1及びストランド2)をRNAリガーゼ(T4 RNAリガーゼ2)を用いてライゲーションすることにより、作製する(ライゲーション法;図1)。
ssTbRNA分子の2つの分割フラグメントへの分割位置を検討するため、ペアのストランド1及びストランド2(表1)をRNAリガーゼ(T4 RNAリガーゼ2)を用いてライゲーションし、そのライゲーション効率を決定した。
・カラム:ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18 Column, 130A, 1.7μm, 2.1mm x 100mm
・移動相:A) 0.1M 酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA)、B) アセトニトリル(MeCN)
・分析条件:B5−30%、10分、20℃、0.4ml/min
未変性PAGE;19%アクリルアミド、150V、90分間の泳動
・カラム:ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18 Column, 130A, 1.7μm, 2.1mm x 100mm
・移動相:A) 100mM ヘキサフルオロ−2−プロパノール(HFIP)−8mM トリエチルアミン(TEA)、B) メタノール(MeOH)
・分析条件:B5−40%、10分、80℃、0.4ml/min
変性PAGE;19%アクリルアミド、7.5M尿素、200V、90分間の泳動後、エチジウムブロマイド(EtBr)にて染色
=(目的のライゲーション生成物のピーク面積)/(クロマトグラム中の総ピーク面積)×100
・LC装置:UHPLC UltiMate3000(ThermoFisher Scientific社製)
・MS装置:Q−Exactive(ThermoFisher Scientific社製)
ペア011、016、及び018のストランド1及びストランド2の一本鎖オリゴRNA分子を用い、2つの条件でアニーリングテストを行った。
・カラム:ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18 Column, 130Å, 1.7μm, 2.1mm x 100mm
・移動相:A) 0.1M 酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA)、B) アセトニトリル(MeCN)
・分析条件:B5−30%、10分、20℃、0.4ml/min
未変性PAGE;19%アクリルアミド、150V、90分間の泳動
3種類のペア011、016、及び018(表1;以下、各ペアを単に011、016、及び018とも称する)をそれぞれ用いて、ライゲーション反応の温度と時間について検討を行った。なお011、016、及び018のストランド1及びストランド2の構造を図4に示す。
実施例4と同様に調製した011の二本鎖オリゴRNA(等モル混合液)を用いて、ライゲーション反応液中のATP濃度の検討を行った。T4 RNAリガーゼ2(New England Biolabs)の添付バッファー(50mM Tris−HCl、2mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP、pH7.5(25℃))に、ATPを添加してATP濃度0.4mM(添加なし)、1mM、2mM、5mM、又は10mMとした。このように調製したバッファー中、二本鎖オリゴRNA(各ストランドの最終濃度10μM、20μM、又は40μM)とT4 RNAリガーゼ2を含む反応液25μLを、37℃で30分インキュベートし、ライゲーションした。ライゲーション反応後、85℃で20分加熱して酵素を失活させ、その反応液を、変性PAGE、及びUHPLCにより解析し、ライゲーション効率(FLP(%))を算出した。変性PAGE及びUHPLCの条件、並びにFLP(%)の算出方法は、実施例2と同じである。
実施例4と同様に調製した016の二本鎖オリゴRNA(等モル混合液)を用いて、ライゲーション反応液のpH条件の検討を行った。以下の3種類のバッファーを用いた。
(1) 50mM Tris−HCl(pH 7.0)、2mM MgCl2、1mM ジチオトレイトール(DTT)、400μM ATP
(2) 50mM Tris−HCl(pH 7.5)、2mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP
(3) 50mM Tris酢酸(pH 6.5)、2mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP
実施例4と同様に調製した016の二本鎖オリゴRNA(等モル混合液)を用いて、ライゲーション反応液のpH条件をさらに検討した。以下の4種類のバッファーを用いた。
(1) 50mM Tris−HCl(pH 7.0)、2mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP
(2) 50mM Tris−HCl(pH 7.5)、2mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP
(3) 50mM Tris−HCl(pH 8.0)、2mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP、
(4) 50mM Tris−HCl(pH 8.5)、2mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP
実施例4と同様に調製した016の二本鎖オリゴRNA(等モル混合液)を用いて、ライゲーション反応液中のMgCl2濃度の検討を行った。以下の5種類のバッファーを用いた。
(1) 0.5mM MgCl2、50mM Tris−HCl(pH 7.5)、1mM DTT、400μM ATP
(2) 1mM MgCl2、50mM Tris−HCl(pH 7.5)、1mM DTT、400μM ATP
(3) 2mM MgCl2、50mM Tris−HCl(pH 7.5)、1mM DTT、400μM ATP
(4) 5mM MgCl2、50mM Tris−HCl(pH 7.5)、1mM DTT、400μM ATP
(5) 10mM MgCl2、50mM Tris−HCl(pH 7.5)、1mM DTT、400μM ATP
実施例4と同様に調製した016の二本鎖オリゴRNA(等モル混合液)を用いて、ライゲーション反応液中の2価イオン濃度の検討を行った。以下の6種類のバッファーを用いた。
(1) 50mM Tris−HCl(pH 7.5)、1mM DTT、400μM ATP、2mM、5mM、又は10mM MgCl2
(2) 50mM Tris−HCl(pH 8.0)、1mM DTT、400μM ATP、2mM、5mM、又は10mM MgCl2
実施例4と同様に調製した018の二本鎖オリゴRNA(等モル混合液)を用いて、ライゲーション反応溶液へのPEGの添加によるライゲーション効率への影響を調べた。
実施例4と同様に調製した016の二本鎖オリゴRNA(等モル混合液)を用いて、ライゲーション反応のタイムコースの検討を行った。
実施例4と同様に調製した016の二本鎖オリゴRNA(等モル混合液)を用いて、ライゲーション反応相にストランド1及びストランド2の一本鎖オリゴRNA分子を順次添加することによりssTbRNA分子の収量を増加させる方法を検討した。
チューブ2)180μM オリゴRNA(各ストランドについてトータル20nmol;1回追加)、酵素量0.36U/μL、反応温度25℃、反応時間24、36、又は48時間
チューブ3)245μM オリゴRNA(各ストランドについてトータル30nmol;2回追加)、酵素量0.33U/μL、反応温度25℃、反応時間36、又は48時間
チューブ4)300μM オリゴRNA(各ストランドについてトータル40nmol;3回追加)、酵素量0.3U/μL、反応温度25℃、反応時間48時間
チューブ2)327μM オリゴRNA(各ストランドについてトータル40nmol;1回追加)、酵素量0.36U/μL、反応温度25℃、反応時間24、36、又は48時間
チューブ3)415μM オリゴRNA(各ストランドについてトータル60nmol;2回追加)、酵素量0.33U/μL、反応温度25℃、反応時間36、又は48時間
チューブ4)480μM オリゴRNA(各ストランドについてトータル80nmol;3回追加)、酵素量0.3U/μL、反応温度25℃、反応時間48時間
ヒトTGF−β1遺伝子の代わりにヒトGAPDH遺伝子、ヒトLAMA1遺伝子、又はヒトLMNA遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含むヘアピン型一本鎖RNA分子を、実施例1及び2と同様に2つの分割フラグメントであるストランド1及びストランド2をライゲーションする方法により作製した。リンカーとしては、実施例1及び2と同様のプロリン誘導体、又はヌクレオチド性リンカーを用いた。
実施例2の実験と並行して、T4 RNAリガーゼ2の代わりにT4 RNAリガーゼを用いて、表1に示したストランド1及びストランド2がアニーリングした二本鎖オリゴRNAをライゲーションし、そのライゲーション効率を決定した。
Claims (13)
- 標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖RNA分子の製造方法であって、
第1の一本鎖オリゴRNA分子と第2の一本鎖オリゴRNA分子とをアニーリングするアニーリング工程と、
前記第1の一本鎖オリゴRNA分子の3’末端と前記第2の一本鎖オリゴRNA分子の5’末端とをRnl2ファミリーのリガーゼによりライゲーションするライゲーション工程とを含み、
前記第1の一本鎖オリゴRNA分子は、第1のリンカーを介して連結された第1のRNA部分と第2のRNA部分を含み、第1のRNA部分と第2のRNA部分の一方は他方に対して相補的に結合可能であり、
前記第2の一本鎖オリゴRNA分子は、第2のリンカーを介して連結された第3のRNA部分と第4のRNA部分を含み、第3のRNA部分と第4のRNA部分の一方は他方に対して相補的に結合可能であり、
前記第1の一本鎖オリゴRNA分子と前記第2の一本鎖オリゴRNA分子とは5’末端又は3’末端の相補的な配列間で分子間二重鎖を形成可能であり、
アニーリング工程において前記第1の一本鎖オリゴRNA分子と前記第2の一本鎖オリゴRNA分子が二重鎖を形成するとき、前記第1の一本鎖オリゴRNA分子の3’末端のリボヌクレオチド残基と前記第2の一本鎖オリゴRNA分子の5’末端のリボヌクレオチド残基はニックを生成し、また前記第1の一本鎖オリゴRNA分子の5’末端のリボヌクレオチド残基と前記第2の一本鎖オリゴRNA分子の3’末端のリボヌクレオチド残基の間には1個以上のリボヌクレオチド残基のギャップが存在し、
前記第1の一本鎖オリゴRNA分子と前記第2の一本鎖オリゴRNA分子とのライゲーションにより生成される配列は、前記標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む、
ヘアピン型一本鎖RNA分子の製造方法。 - 前記第1の一本鎖オリゴRNA分子は、下記式(I)で表され、前記第2の一本鎖オリゴRNA分子は、下記式(II)で表され、
5’−Xs−Lx1−Xa−3’ ・・・式(I)
5’−Ya1−Ya2−Ya3−Lx2−Ys−3’ ・・・式(II)
式(I)及び式(II)中、Xs、Xa、Ya1、Ya2、Ya3及びYsは、1個又はそれ以上のリボヌクレオチド残基を表し、
Lx1及びLx2は、それぞれ、第1のリンカー及び第2のリンカーを表し、
Ya3は、Ysと相補的であり、
ライゲーション工程で生じるXa−Ya1は、Xsと相補的であり、
ライゲーション工程で生じるXa−Ya1−Ya2−Ya3は、前記標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む、
請求項1に記載の製造方法。 - 前記第1の一本鎖オリゴRNA分子が3’末端にウラシル(U)又はアデニン(A)を有し、前記第2の一本鎖オリゴRNA分子が5’末端にウラシル(U)又はアデニン(A)を有する、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 第1のリンカー及び第2のリンカーは、それぞれ独立して、(i)ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド性リンカー、又は(ii)ヌクレオチド性リンカーである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の製造方法。
- Rnl2ファミリーのリガーゼが、T4 RNAリガーゼ2である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の製造方法。
- pH7.4〜8.6の反応液中で前記ライゲーションが行われる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の製造方法。
- 2〜10mMの二価金属イオンを含む反応液中で前記ライゲーションが行われる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記標的遺伝子は、TGF−β1遺伝子、GAPDH遺伝子、LAMA1遺伝子又はLMNA遺伝子である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記ヘアピン型一本鎖RNA分子は、配列番号1で表される塩基配列からなり、24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結され、50番目と51番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている、請求項1〜9のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記第1の一本鎖オリゴRNA分子と前記第2の一本鎖オリゴRNA分子は、以下の(1)〜(6)のいずれかである、請求項1〜10のいずれか一項に記載の製造方法。
(1)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号7で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、10番目と11番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号6で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ
(2)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号19で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、16番目と17番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号18で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ
(3)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号27で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、20番目と21番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号26で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ
(4)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号29で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、21番目と22番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号28で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ
(5)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号31で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、22番目と23番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号30で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ
(6)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号33で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、23番目と24番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号32で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ - 以下の(a)〜(l)のいずれかである、一本鎖オリゴRNA分子。
(a)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号7で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子
(b)10番目と11番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号6で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子
(c)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号19で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子
(d)16番目と17番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号18で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子
(e)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号27で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子
(f)20番目と21番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号26で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子
(g)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号29で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子
(h)21番目と22番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号28で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子
(i)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号31で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子
(j)22番目と23番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号30で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子
(k)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号33で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子
(l)23番目と24番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号32で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子 - 以下の(1)〜(6)のいずれかの一本鎖オリゴRNA分子の組み合わせを含む、TGF−β1遺伝子の発現を抑制するためのヘアピン型一本鎖RNA分子の製造用のキット。
(1)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号7で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、10番目と11番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号6で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ
(2)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号19で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、16番目と17番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号18で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ
(3)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号27で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、20番目と21番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号26で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ
(4)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号29で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、21番目と22番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号28で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ
(5)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号31で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、22番目と23番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号30で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ
(6)24番目と25番目のリボヌクレオチド残基が第1のリンカーを介して連結されている配列番号33で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、23番目と24番目のリボヌクレオチド残基が第2のリンカーを介して連結されている配列番号32で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子との組み合わせ
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