JP2019213567A - ヘアピン型一本鎖ｒｎａ分子の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】標記遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の効率的な製造方法の提供。【解決手段】本発明は、標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法であって、（ｉ）第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とをアニーリングするアニーリング工程と、（ｉｉ）前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端とをＲｎｌ２ファミリーのリガーゼによりライゲーションするライゲーション工程とを含み、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とのライゲーションにより生成される配列は、前記標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む、ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法に関する。

遺伝子発現を抑制する技術として、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が知られている（非特許文献１）。ＲＮＡ干渉による遺伝子発現抑制には、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）と呼ばれる短い二本鎖のＲＮＡ分子を用いる方法が多く利用されている。また、分子内アニールにより、部分的に二重鎖を形成した環状ＲＮＡ分子を用いた遺伝子発現抑制技術も報告されている（特許文献１）。

しかし、ｓｉＲＮＡはｉｎ ｖｉｖｏでの安定性が低く、一本鎖ＲＮＡに解離しやすいため、遺伝子発現を安定的に抑制するのが困難である。特許文献２は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖を、環状アミン誘導体を用いて形成される１つ又は２つのリンカーを用いて一本鎖に連結したヘアピン型一本鎖長鎖ＲＮＡ分子が、ｓｉＲＮＡを安定化できることを報告している。しかしこの一本鎖長鎖ＲＮＡ分子は、ＴＢＤＭＳアミダイトなどの汎用型アミダイトを使用したホスホロアミダイト法では効率的に合成できないため、その合成には特別なＲＮＡアミダイト（例えば、特許文献２及び３）を用いる必要がある。

特許文献４は、第三の核酸鎖としての補助核酸とＴ４ ＲＮＡリガーゼ２とを用いて、第一の核酸鎖と第二の核酸鎖をライゲーションする方法を開示しているが、補助核酸が長いほど反応が遅いことを示しており、その方法において良好なライゲーション効率をもたらす補助核酸は限定されている。

米国特許出願公開第２００４／０５８８８６号 国際公開ＷＯ２０１３／０２７８４３ 国際公開ＷＯ２０１６／１５９３７４ 国際公開ＷＯ２０１１／０５２０１３

Fire et al., Nature, (1998) Feb 19; 391(6669):806-811

本発明は、標記遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の効率的な製造方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、標的遺伝子に対する発現抑制配列を含むヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を、非ヌクレオチド性リンカーやヌクレオチド性リンカーなどのリンカーを有する２つの一本鎖オリゴＲＮＡ分子に分割して合成し、それらをアニーリングし、ライゲーションすることによって、特別なＲＮＡアミダイトや補助核酸を必要とせず、当該ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を効率的に製造できること、また、ライゲーション条件を調節することにより、酵素使用量に対するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の生産効率をさらに増加させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下を包含する。
［１］標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法であって、
第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とをアニーリングするアニーリング工程と、
前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端とをＲｎｌ２ファミリーのリガーゼによりライゲーションするライゲーション工程とを含み、
前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、第１のリンカーを介して連結された第１のＲＮＡ部分と第２のＲＮＡ部分を含み、第１のＲＮＡ部分と第２のＲＮＡ部分の一方は他方に対して相補的に結合可能であり、
前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、第２のリンカーを介して連結された第３のＲＮＡ部分と第４のＲＮＡ部分を含み、第３のＲＮＡ部分と第４のＲＮＡ部分の一方は他方に対して相補的に結合可能であり、
前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とは５’末端又は３’末端の相補的な配列間で分子間二重鎖を形成可能であり、
アニーリング工程において前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子が二重鎖を形成するとき、前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端のリボヌクレオチド残基と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端のリボヌクレオチド残基はニックを生成し、また前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端のリボヌクレオチド残基と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端のリボヌクレオチド残基の間には１個以上のリボヌクレオチド残基のギャップが存在し、
前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とのライゲーションにより生成される配列は、前記標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む、
ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法。
［２］前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、下記式（Ｉ）で表され、前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、下記式（ＩＩ）で表され、
５’−Ｘｓ−Ｌｘ_１−Ｘａ−３’ ・・・式（Ｉ）
５’−Ｙａ_１−Ｙａ_２−Ｙａ_３−Ｌｘ_２−Ｙｓ−３’ ・・・式（ＩＩ）
式（Ｉ）及び式（ＩＩ）中、Ｘｓ、Ｘａ、Ｙａ_１、Ｙａ_２、Ｙａ_３及びＹｓは、１個又はそれ以上のリボヌクレオチド残基を表し、
Ｌｘ_１及びＬｘ_２は、それぞれ、第１のリンカー及び第２のリンカーを表し、
Ｙａ_３は、Ｙｓと相補的であり、
ライゲーション工程で生じるＸａ−Ｙａ_１は、Ｘｓと相補的であり、
ライゲーション工程で生じるＸａ−Ｙａ_１−Ｙａ_２−Ｙａ_３は、前記標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む、
上記［１］に記載の製造方法。
［３］前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子が３’末端にウラシル（Ｕ）又はアデニン（Ａ）を有し、前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子が５’末端にウラシル（Ｕ）又はアデニン（Ａ）を有する、上記［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］第１のリンカー及び第２のリンカーは、それぞれ独立して、（ｉ）ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド性リンカー、又は（ｉｉ）ヌクレオチド性リンカーである、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼが、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２である、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］ｐＨ７．４〜８．６の反応液中で前記ライゲーションが行われる、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］２〜１０ｍＭの二価金属イオンを含む反応液中で前記ライゲーションが行われる、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の製造方法。
［８］第１のリンカー及び第２のリンカーは、それぞれ独立して、下記式（ＶＩ）で表される非ヌクレオチド性リンカーである、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の製造方法。
［９］前記標的遺伝子は、ＴＧＦ−β１遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子、ＬＡＭＡ１遺伝子又はＬＭＮＡ遺伝子である、上記［１］〜［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１０］前記ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、配列番号１で表される塩基配列からなり、２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結され、５０番目と５１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている、上記［１］〜［９］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、以下の（１）〜（６）のいずれかである、上記［１］〜［１０］のいずれかに記載の製造方法。
（１）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号７で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１０番目と１１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（２）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号１９で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１６番目と１７番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号１８で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（３）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号２７で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２０番目と２１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号２６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（４）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号２９で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２１番目と２２番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号２８で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（５）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号３１で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２２番目と２３番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号３０で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（６）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号３３で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２３番目と２４番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号３２で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
［１２］以下の（ａ）〜（ｌ）のいずれかである、一本鎖オリゴＲＮＡ分子。
（ａ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号７で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｂ）１０番目と１１番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号６で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｃ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号１９で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｄ）１６番目と１７番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号１８で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｅ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号２７で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｆ）２０番目と２１番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号２６で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｇ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号２９で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｈ）２１番目と２２番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号２８で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｉ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３１で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｊ）２２番目と２３番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３０で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｋ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３３で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｌ）２３番目と２４番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３２で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
［１３］以下の（１）〜（６）のいずれかの一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせを含む、ＴＧＦ−β１遺伝子の発現を抑制するためのヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造用のキット。
（１）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号７で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１０番目と１１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（２）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号１９で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１６番目と１７番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号１８で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（３）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号２７で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２０番目と２１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号２６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（４）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号２９で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２１番目と２２番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号２８で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（５）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号３１で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２２番目と２３番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号３０で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（６）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号３３で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２３番目と２４番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号３２で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ

本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１８−０７０４２３号の開示内容を包含する。

本発明によれば、標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を、効率的に製造することができる。

図１は、本発明の一実施形態のライゲーション法の概略図である。 図２は、ｓｓＴｂＲＮＡ分子（配列番号１）の模式図である。Ｐはプロリン誘導体を表す。配列番号１の２９番目（Ｕ）〜４７番目（Ｃ）は活性配列（ＴＧＦ−β１遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列；アンチセンス配列）に相当する。 図３は、表１に示す００４〜０１９の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランド１及び２）のセット（ペア）のＴ４ ＲＮＡリガーゼ２を用いたアニーリング及びライゲーション反応後のライゲーション効率を示す。 図４は、０１１、０１６、及び０１８の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランド１及び２）の構造を示す。それぞれのペアの右側がストランド１、左側がストランド２である。 図５は、０１６のオリゴ核酸を、異なるオリゴＲＮＡ濃度及び異なる反応温度でライゲーションしたときのライゲーション効率の経時的変化を示す。 図６は、０１１、０１６、及び０１８のオリゴＲＮＡ（１００μＭ）を用い、異なる反応温度でライゲーションしたときのライゲーション効率の経時的変化を示す。Ａは２５℃、Ｂは３７℃でのライゲーションの結果を示す。 図７は、０１１のオリゴＲＮＡを異なるＡＴＰ濃度下でライゲーションしたときの変性ＰＡＧＥ解析の結果を示す。 図８は、０１１のオリゴＲＮＡを異なるＡＴＰ濃度下でライゲーションしたときのライゲーション効率を示す。 図９は、０１６のオリゴＲＮＡを、異なるオリゴＲＮＡ濃度、異なるｐＨ条件下でライゲーションしたときのライゲーション効率の経時的変化を示す。 図１０は、０１６のオリゴＲＮＡを異なるｐＨ条件下でライゲーションしたときのライゲーション効率を示す。 図１１は、０１６のオリゴＲＮＡを、異なるオリゴＲＮＡ濃度、異なるＭｇＣｌ_２濃度下でライゲーションしたときのライゲーション効率を示す。Ａは１０μＭ又は１００μＭ オリゴＲＮＡ、Ｂは１０μＭ又は２００μＭ オリゴＲＮＡの存在下でのライゲーションの結果を示す。 図１２は、０１６のオリゴＲＮＡを、異なるＭｇＣｌ_２濃度、異なるｐＨ条件下でライゲーションしたときのライゲーション効率を示す。ＡはｐＨ７．５、ＢはｐＨ８．０でのライゲーションの結果を示す。 図１３は、異なる酵素量を用い、ＰＥＧを添加してライゲーションしたときのライゲーション効率を示す。 図１４は、異なるオリゴＲＮＡ濃度を使用したライゲーション反応のタイムコースを示す。 図１５は、初期オリゴＲＮＡ濃度を１００μＭとし、オリゴＲＮＡを順次追加しながら行ったライゲーション反応における、目的産物ｓｓＴｂＲＮＡ分子の生成量を示す。ｓｓＴｂＲＮＡ分子の生成量（ｎｍｏｌ）＝（一本鎖オリゴＲＮＡ分子の添加量）×（ＦＬＰ（Ｆｕｌｌ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｒｏｄｕｃｔ，完全長の生成物）（％））／１００。グラフの横軸のｈはライゲーション開始後の時間を表す。ライゲーション開始時のオリゴＲＮＡ濃度１００μＭ（１０ｎｍｏｌ）、酵素濃度４ユニット／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡは、最終添加後にはオリゴＲＮＡ濃度３００μＭ（４０ｎｍｏｌ）、酵素濃度１ユニット／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡとなった。 図１６は、初期オリゴＲＮＡ濃度を２００μＭとし、オリゴＲＮＡを順次追加しながら行ったライゲーション反応における、目的産物ｓｓＴｂＲＮＡ分子の生成量を示す。ｓｓＴｂＲＮＡ分子の生成量（ｎｍｏｌ）＝（一本鎖オリゴＲＮＡ分子の添加量）×（ＦＬＰ（％））／１００。グラフの横軸のｈはライゲーション開始後の時間を表す。ライゲーション開始時のオリゴＲＮＡ濃度２００μＭ（２０ｎｍｏｌ）、酵素濃度４ユニット／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡは、最終添加後にはオリゴＲＮＡ濃度４８０μＭ（８０ｎｍｏｌ）、酵素濃度０．５ユニット／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡとなった。 図１７は、ＧＡＰＤＨ遺伝子、ＬＡＭＡ１遺伝子、又はＬＭＮＡ遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含むヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子と、その分割位置を示す。（１）〜（７）は分割位置を示す。各遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列（活性配列／アンチセンス配列）を枠で示した。 図１８は、ＧＡＰＤＨ遺伝子、ＬＡＭＡ１遺伝子、又はＬＭＮＡ遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含むヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の分割フラグメントである一本鎖オリゴＲＮＡ分子のペア（ストランド１及び２）を用いたアニーリング及びライゲーション反応後のライゲーション効率を示す。 図１９は、表１に示すストランド１及びストランド２のセット（ペア）のＴ４ ＲＮＡリガーゼを用いたアニーリング及びライゲーション反応後のライゲーション効率を示す。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法に関する。本発明の方法により製造されるヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、遺伝子発現抑制配列を含む二本鎖ＲＮＡのセンス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の５’末端が、非ヌクレオチド性リンカー又はヌクレオチド性リンカーなどのリンカーを含む配列を介して連結され、そのアンチセンス鎖の３’末端に非ヌクレオチド性リンカー又はヌクレオチド性リンカーなどのリンカーを含む配列を介して１個以上のリボヌクレオチド残基がさらに連結された一本鎖構造を有する。本発明の方法により製造されるヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の５’末端と３’末端は、結合されていない。本明細書において「ヘアピン型」とは、一本鎖ＲＮＡ分子が分子内アニーリング（自己アニーリング）により１つ以上の二重鎖構造を形成することを意味する。本発明の方法により製造されるヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、典型的には、その５’末端を含む５’側領域と３’末端を含む３’側領域がそれぞれ別個に分子内アニーリングすることにより、２つの二重鎖構造を形成する。本明細書において「ＲＮＡ」、「ＲＮＡ分子」、「核酸分子」及び「核酸」は、ヌクレオチドのみから構成されていてもよいが、ヌクレオチドと非ヌクレオチド物質（例えば、プロリン誘導体などの環状アミン誘導体）から構成されていてもよい。

本発明では、標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を、２つのリンカー（例えば、非ヌクレオチド性リンカー、ヌクレオチド性リンカー、又はそれらを組み合わせたリンカー）に挟まれた配列中で２つに分割したフラグメントとして合成し、それらをアニーリングし、ライゲーションすることにより、製造することができる。ライゲーションとは、２つの核酸（本発明においては、典型的にはＲＮＡ）を、その末端の５’リン酸基と３’水酸基を結合（ホスホジエステル結合）させることにより連結することを意味する。本発明の方法では、比較的長鎖のヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を、より短鎖の一本鎖ＲＮＡ分子のペアのライゲーションによって製造し、それにより当該ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の高収量な製造を実現することができる。

より具体的には、本発明は、標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法であって、
第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とをアニーリングするアニーリング工程と、
前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端とをＲｎｌ２ファミリーのリガーゼによりライゲーションするライゲーション工程とを含み、
第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とのライゲーションにより生成される配列は、前記標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む、ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法に関する。

本発明の方法において、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、第１のリンカーを介して連結された第１のＲＮＡ部分と第２のＲＮＡ部分を含み、第１のＲＮＡ部分と第２のＲＮＡ部分の一方は他方に対して相補的に結合可能である。その相補的な結合により、第１のリンカーはループを形成し、第１のＲＮＡ部分と第２のＲＮＡ部分は当該ループに隣接してステムを形成し得る。第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子において、第１のＲＮＡ部分は５’末端側に、第２のＲＮＡ部分は３’末端側に配置される。また、第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、第２のリンカーを介して連結された第３のＲＮＡ部分と第４のＲＮＡ部分を含み、第３のＲＮＡ部分と第４のＲＮＡ部分の一方は他方に対して相補的に結合可能である。その相補的な結合により、第２のリンカーはループを形成し、第３のＲＮＡ部分と第４のＲＮＡ部分は当該ループに隣接してステムを形成し得る。第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子において、第３のＲＮＡ部分は５’末端側に、第４のＲＮＡ部分は３’末端側に配置される。第１〜第４のＲＮＡ部分は、それぞれ、１個又は２個以上のリボヌクレオチド残基を含む。このように第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、自己相補配列を含み、それぞれ、分子内アニーリング（自己アニーリング）により、ヘアピン構造を形成することができる。第１のＲＮＡ部分と第２のＲＮＡ部分は一方が他方よりも長い塩基長を有することが好ましい。また第３のＲＮＡ部分と第４のＲＮＡ部分は一方が他方よりも長い塩基長を有することが好ましい。第１のＲＮＡ部分が第２のＲＮＡ部分よりも長い塩基長を有する場合、第３のＲＮＡ部分は第４のＲＮＡ部分よりも長い塩基長を有することが好ましい。第２のＲＮＡ部分が第１のＲＮＡ部分よりも長い塩基長を有する場合、第４のＲＮＡ部分は第１のＲＮＡ部分よりも長い塩基長を有することが好ましい。第１のＲＮＡ部分と第２のＲＮＡ部分のうち、より長い塩基長を有する方のＲＮＡ部分は、より短い塩基長を有する方のＲＮＡ部分に相補的なリボヌクレオチド残基又はその配列を、第１のリンカーに隣接して含むことが好ましい。第３のＲＮＡ部分と第４のＲＮＡ部分のうち、より長い塩基長を有する方のＲＮＡ部分は、より短い塩基長を有する方のＲＮＡ部分に相補的なリボヌクレオチド残基又はその配列を、第２のリンカーに隣接して含むことが好ましい。

本発明において、一本鎖オリゴＲＮＡ分子に含まれる２つのＲＮＡ部分（第１及び第２のＲＮＡ部分、又は第３及び第４のＲＮＡ部分）の一方が他方に対して「相補的に結合可能である」とは、２つのＲＮＡ部分のうちいずれか一方（通常は、より短い塩基長を有する方のＲＮＡ部分）の全長が他方のＲＮＡ部分（通常は、より長い塩基長を有する方のＲＮＡ部分）に対し、安定な塩基対合を形成して結合できることを意味し、この場合、前者のＲＮＡ部分の全長は後者のＲＮＡ部分内の対応するリボヌクレオチド残基又はその配列に対して相補的である。一本鎖オリゴＲＮＡ分子に含まれる２つのＲＮＡ部分の一方は、他方のＲＮＡ部分中の対応するリボヌクレオチド残基又はその配列に対して完全に相補的（すなわち、一方のＲＮＡ部分の全てのリボヌクレオチド残基が、他方のＲＮＡ部分中の対応するリボヌクレオチド残基に対してミスマッチを有さない）であることがより好ましい。あるいは、一本鎖オリゴＲＮＡ分子に含まれる２つのＲＮＡ部分の一方は、他方のＲＮＡ部分に対して、安定な塩基対合を形成できる限り、１個以上、例えば１個又は２個のリボヌクレオチド残基のミスマッチを含んでもよく、その場合も「相補的に結合可能」である。但しそのミスマッチは、本発明の方法においてライゲーションされる分子末端のリボヌクレオチド残基には存在しないことが好ましい。

一実施形態では、第１のＲＮＡ部分及び第４のＲＮＡ部分の一方は、他方より短く、好ましくは１〜７塩基長であり、例えば、１〜６塩基長、１〜４塩基長、１〜３塩基長、１塩基長又は２塩基長である。その場合、第１のＲＮＡ部分及び第４のＲＮＡ部分のうち長い方（他方）は、１９〜２８塩基長であってよく、例えば、１９〜２７塩基長、１９〜２５塩基長、１９〜２３塩基長、２０〜２８塩基長、２１〜２７塩基長、２０〜２５塩基長、２２〜２７塩基長、２３〜２６塩基長、２４〜２８塩基長、２６〜２８塩基長であってよい。

第１のＲＮＡ部分が第４のＲＮＡ部分よりも長い場合、第２のＲＮＡ部分は、以下に限定するものではないが、１〜２０塩基長であってよく、例えば２〜２０塩基長、２〜１５塩基長、３〜１０塩基長、３〜６塩基長、５〜１２塩基長、又は９〜１２塩基長であってよい。第１のＲＮＡ部分が第４のＲＮＡ部分よりも短い場合、第２のＲＮＡ部分は、以下に限定するものではないが、８〜３８塩基長であってよく、例えば８〜３６塩基長、１２〜３６塩基長、１４〜３４塩基長、１４〜３３塩基長、１４〜３６塩基長、又は２０〜３４塩基長であってよい。

第１のＲＮＡ部分の塩基配列は、リンカーと隣接してＣＣ（シトシン−シトシン）を含んでもよく、この場合、第２のＲＮＡ部分の塩基配列は、その配列と相補的になるように、リンカーと隣接してＧＧ（グアニン−グアニン）を含むことが好ましい。一実施形態では、第１のＲＮＡ部分の塩基配列は、リンカーと隣接してＡＣＣ（アデニン−シトシン−シトシン）、ＧＣＣ（グアニン−シトシン−シトシン）、又はＵＣＣ（ウラシル−シトシン−シトシン）を含んでもよく、この場合、第２のＲＮＡ部分の塩基配列は、その配列と相補的になるように、リンカーと隣接してそれぞれＧＧＵ（グアニン−グアニン−ウラシル）、ＧＧＣ（グアニン−グアニン−シトシン）、又はＧＧＡ（グアニン−グアニン−アデニン）を含むことが好ましい。第３のＲＮＡ部分の塩基配列は、リンカーと隣接してＣ（シトシン）を含んでもよく、この場合、第４のＲＮＡ部分の塩基配列は、その残基と相補的になるように、リンカーと隣接してＧ（グアニン）を含むことが好ましい。

第１又は第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の塩基長、すなわち２つのＲＮＡ部分の合計塩基長（リンカー部分は含まない）は、以下に限定されないが、好ましくは１３〜４８塩基長である。第１のＲＮＡ部分が第４のＲＮＡ部分よりも長い場合、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の塩基長、すなわち第１のＲＮＡ部分及び第２のＲＮＡ部分の合計塩基長（リンカー部分は含まない）は、好ましくは２１〜４８塩基長であり、例えば、２１〜４５塩基長、２５〜４５塩基長、２６〜３５塩基長、２６〜３０塩基長、２６〜２８塩基長、又は３３〜３６塩基長である。第１のＲＮＡ部分が第４のＲＮＡ部分よりも短い場合、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の塩基長、すなわち第１のＲＮＡ部分及び第２のＲＮＡ部分の合計塩基長（リンカー部分は含まない）は、好ましくは１３〜４５塩基長であり、例えば、１３〜４３塩基長、１５〜４１塩基長、１５〜３０塩基長、１７〜２５塩基長、又は２０〜２５塩基長である。

本発明の方法において、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、５’末端又は３’末端の配列において互いに相補的である。第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とは、５’末端又は３’末端の相補的な配列間（好ましくは、完全に相補的な配列間）で分子間二重鎖を形成可能である。より具体的には、一実施形態では、ヘアピン構造を形成した第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端の配列（第１のＲＮＡ部分の５’末端の、ヘアピン構造のステム・ループに含まれない配列）と、ヘアピン構造を形成した第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端の配列（第３のＲＮＡ部分の５’末端の、ヘアピン構造のステム・ループに含まれない配列）が、互いに相補的であり、分子間二重鎖を形成可能である。別の実施形態では、ヘアピン構造を形成した第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端の配列（第２のＲＮＡ部分の３’末端の、ヘアピン構造のステム・ループに含まれない配列）と、ヘアピン構造を形成した第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端の配列（第４のＲＮＡ部分の３’末端の、ヘアピン構造のステム・ループに含まれない配列）が、互いに相補的であり、分子間二重鎖を形成可能である。本発明の方法のアニーリング工程では、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とが５’末端又は３’末端の相補的な配列間で分子間二重鎖を形成することにより、二本鎖オリゴＲＮＡが生成される。

一実施形態では、第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子間で相補的な配列の長さ（後述のギャップ部分を含まない）は、以下に限定されないが、通常は６塩基長以上、例えば７塩基以上、１０塩基長以上、１２塩基長以上、１４塩基長以上、又は１８塩基以上であり、例えば６〜２７塩基長、７〜２５塩基長、１０〜２５塩基長、１２〜２３塩基長、１２〜２２塩基長、１２〜１５塩基長、又は１８〜２３塩基長であってよい。

本発明の方法のアニーリング工程において、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子が二重鎖を形成するとき、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端のリボヌクレオチド残基と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端のリボヌクレオチド残基はニックを生成する。より具体的には、アニーリング工程において第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子間で相補的な配列の分子間アニーリングにより二重鎖（分子間二重鎖）を形成することに加えて、第１のＲＮＡ部分と第２のＲＮＡ部分、及び第３のＲＮＡ部分と第４のＲＮＡ部分において、それぞれ、分子内アニーリングによる二重鎖（分子内二重鎖、すなわちヘアピン構造）を形成し、第２のＲＮＡ部分と第３のＲＮＡ部分の間にはニックが生じる。本発明において「ニック」とは、核酸二重鎖の一方のヌクレオチド鎖において２つのヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合が切れて３’水酸基と５’リン酸基が遊離している状態を指す。ニックは、ライゲーション反応により連結可能である。

本発明の方法のアニーリング工程において、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子が二重鎖を形成するとき、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端のリボヌクレオチド残基と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端のリボヌクレオチド残基の間には１個以上のリボヌクレオチド残基のギャップが存在する。このギャップはライゲーション反応により連結されないため、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、ライゲーション反応後、一本鎖ＲＮＡ分子を形成する。１個以上のリボヌクレオチド残基のギャップは、１〜４残基（１、２、３、又は４残基）のギャップであってもよい。このギャップ部分では塩基対合は形成されない。

第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端のリボヌクレオチド残基と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端のリボヌクレオチド残基の間のギャップは、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子がアニーリングした二重鎖中、第１のリンカーにより近い位置にあってもよいし、あるいは第２のリンカーにより近い位置にあってもよい。

第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とのライゲーションにより生成される配列は、標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む。第１のＲＮＡ部分又は第４のＲＮＡ部分は、標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列（センス配列又はアンチセンス配列；例えばセンス配列）を含み得る。ライゲーションにより第２のＲＮＡ部分と第３のＲＮＡ部分が連結された配列は、標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列（アンチセンス配列又はセンス配列；例えばアンチセンス配列）を含み得る。一実施形態では、第２のＲＮＡ部分又は第３のＲＮＡ部分が標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列（アンチセンス配列又はセンス配列；例えばアンチセンス配列）を含んでもよい。

本発明の方法において、リンカー、例えば、第１のリンカー及び第２のリンカーは、非ヌクレオチド性リンカー、ヌクレオチド性リンカー、又はそれらの組み合わせであってよい。

一実施形態では、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は３’末端にウラシル（Ｕ）又はアデニン（Ａ）を有し、かつ、第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は５’末端にウラシル（Ｕ）又はアデニン（Ａ）を有する。ここで一本鎖オリゴＲＮＡ分子が３’末端又は５’末端にウラシル（Ｕ）又はアデニン（Ａ）を有するとは、一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端又は５’末端のリボヌクレオチド残基が塩基としてウラシル（Ｕ）又はアデニン（Ａ）を含むことを意味する。具体的には、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端のリボヌクレオチド残基の塩基と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端のリボヌクレオチド残基の塩基の好ましい組み合わせは、Ｕ−Ａ、Ｕ−Ｕ、Ａ−Ｕ、又はＡ−Ａであり得る。

本発明の方法の一実施形態の概略図を図１に示す。図１中、Ｌｘ_１及びＬｘ_２はリンカー（例えば、非ヌクレオチド性リンカー、ヌクレオチド性リンカー、又はそれらの組み合わせ）である。本発明の方法では、比較的長鎖のヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を、より短鎖の一本鎖ＲＮＡ分子のペアをライゲーションすることによって製造し、それにより高収量を実現することができる。

一実施形態において、本発明に係る、標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法は、
下記式（Ｉ）で表される第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（図１中、ストランド１）：
５’−Ｘｓ−Ｌｘ_１−Ｘａ−３’ ・・・式（Ｉ）
と、下記式（ＩＩ）で表される第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（図１中、ストランド２）：
５’−Ｙａ_１−Ｙａ_２−Ｙａ_３−Ｌｘ_２−Ｙｓ−３’ ・・・式（ＩＩ）
をアニーリングするアニーリング工程と、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端とをライゲーションするライゲ-ション工程とを含む。このライゲーションはＲｎｌ２ファミリーのリガーゼにより行うことができる。

別の実施形態において、本発明に係る、標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法は、
下記式（Ａ）で表される第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子：
５’−ＸＸｓ−Ｌｘ_１−ＸＸａ_３−ＸＸａ_２−ＸＸａ_１−３’ ・・・式（Ａ）
と、下記式（Ｂ）で表される第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子：
５’−ＹＹａ−Ｌｘ_２−ＹＹｓ−３’ ・・・式（Ｂ）
をアニーリングするアニーリング工程と、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端とをライゲーションするライゲ-ション工程とを含む。このライゲーションはＲｎｌ２ファミリーのリガーゼにより行うことができる。

本発明において「オリゴＲＮＡ」及び「オリゴＲＮＡ分子」とは、４９塩基長以下（非ヌクレオチド性リンカー及びヌクレオチド性リンカーなどのリンカー部分の残基数は不算入）の塩基配列を有するＲＮＡ分子を指す。本発明において用語「オリゴＲＮＡ」と「オリゴＲＮＡ分子」は通常、互換的に使用される。本発明に係る一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、一本鎖オリゴＲＮＡ、オリゴ核酸、一本鎖核酸分子、オリゴＲＮＡ、又はオリゴＲＮＡ分子と称されることもある。

式（Ｉ）及び式（ＩＩ）中、Ｘｓ、Ｘａ、Ｙａ_１、Ｙａ_２、Ｙａ_３、及びＹｓは、１個又はそれ以上のリボヌクレオチド残基を表す。式（Ｉ）及び式（ＩＩ）中、Ｌｘ_１及びＬｘ_２は、それぞれ独立して、リンカー、例えば、非ヌクレオチド性リンカー、ヌクレオチド性リンカー、又はそれらの組み合わせを表す。

式（Ｉ）は、領域ＸｓとＸａが、Ｌｘ_１を介して連結された構造を表している。式（ＩＩ）は、領域Ｙａ_１、Ｙａ_２、及びＹａ_３がこの順番で連結されたリボヌクレオチド配列（Ｙａ_１−Ｙａ_２−Ｙａ_３）と領域Ｙｓが、Ｌｘ_２を介して連結された構造を表している。

式（Ａ）及び式（Ｂ）中、ＸＸｓ、ＸＸａ_３、ＸＸａ_２、ＸＸａ_１、ＹＹａ、及びＹＹｓは、１個又はそれ以上のリボヌクレオチド残基を表す。式（Ａ）及び式（Ｂ）中、Ｌｘ_１及びＬｘ_２は、それぞれ独立して、リンカー、例えば、非ヌクレオチド性リンカー、ヌクレオチド性リンカー、又はそれらの組み合わせを表す。

式（Ａ）は、領域ＸＸａ_３、ＸＸａ_２、及びＸＸａ_１がこの順番で連結されたリボヌクレオチド配列（ＸＸａ_３−ＸＸａ_２−ＸＸａ_１）と領域ＸＸｓが、Ｌｘ_１を介して連結された構造を表している。式（Ｂ）は、領域ＹＹａとＹＹｓが、Ｌｘ_２を介して連結された構造を表している。

Ｘｓ、Ｘａ、Ｙａ_１、Ｙａ_２、Ｙａ_３、Ｙｓ、ＸＸｓ、ＸＸａ_３、ＸＸａ_２、ＸＸａ_１、ＹＹａ、及びＹＹｓはリボヌクレオチド残基からなる。リボヌクレオチド残基は、アデニン、ウラシル、グアニン、又はシトシンから選択されるいずれかの核酸塩基を有するものであってよい。リボヌクレオチド残基はまた、修飾リボヌクレオチド残基であってもよく、例えば、修飾された核酸塩基（修飾塩基）を有していてもよい。修飾としては、蛍光色素標識、メチル化、ハロゲン化、シュードウリジン化、アミノ化、脱アミノ化、チオ化、ジヒドロ化などが挙げられるが、これらに限定されない。Ｘｓ、Ｘａ、Ｙａ_１、Ｙａ_２、Ｙａ_３、及びＹｓは、それぞれ独立に、非修飾リボヌクレオチド残基のみからなるものであってもよいし、非修飾リボヌクレオチド残基に加えて修飾リボヌクレオチド残基を含むものであってもよいし、修飾リボヌクレオチド残基のみからなるものであってもよい。Ｘｓが５’末端に修飾リボヌクレオチド残基を含んでいてもよい。Ｙｓが３’末端に修飾リボヌクレオチド残基を含んでいてもよい。同様に、ＸＸｓ、ＸＸａ_３、ＸＸａ_２、ＸＸａ_１、ＹＹａ、及びＹＹｓは、それぞれ独立に、非修飾リボヌクレオチド残基のみからなるものであってもよいし、非修飾リボヌクレオチド残基に加えて修飾リボヌクレオチド残基を含むものであってもよいし、修飾リボヌクレオチド残基のみからなるものであってもよい。ＸＸｓが５’末端に修飾リボヌクレオチド残基を含んでいてもよい。ＹＹｓが３’末端に修飾リボヌクレオチド残基を含んでいてもよい。

本発明において、ライゲーション工程で生じるＸａ−Ｙａ_１（ライゲーションによりＸａとＹａ_１が連結されたヌクレオチド配列）は、Ｘｓと相補的である。一実施形態では、Ｘｓは、１９〜２８塩基長であってよく、例えば１９〜２７塩基長、１９〜２５塩基長、１９〜２３塩基長、２０〜２８塩基長、２１塩基〜２７塩基、２１塩基〜２５塩基、２２〜２７塩基長、２３〜２６塩基長、２４〜２８塩基長、又は２６〜２８塩基長であってよい。

本発明において、ライゲーション工程で生じるＸＸａ_１−ＹＹａ（ライゲーションによりＸＸａ_１とＹＹａが連結されたヌクレオチド配列）は、ＹＹｓと相補的である。一実施形態では、ＹＹｓは、１９〜２８塩基長であってよく、例えば１９〜２７塩基長、１９〜２５塩基長、１９〜２３塩基長、２０〜２８塩基長、２１塩基〜２７塩基、２１塩基〜２５塩基、２２〜２７塩基長、２３〜２６塩基長、２４〜２８塩基長、又は２６〜２８塩基長であってよい。

本発明において、Ｘａは、Ｘｓ内の対応する残基又は配列と相補的である。一実施形態では、式（Ｉ）中、Ｘｓの塩基配列が、リンカーと隣接してＣ（シトシン）を含んでもよい。この場合、Ｘａの塩基配列は、Ｘｓと相補的になるように、リンカーと隣接してＧ（グアニン）を含む。一実施形態では、式（Ｉ）中、Ｘｓの塩基配列が、リンカーと隣接してＣＣ（シトシン−シトシン）を含んでもよい。この場合、Ｘａの塩基配列は、Ｘｓと相補的になるように、リンカーと隣接してＧＧ（グアニン−グアニン）を含む。一実施形態では、式（Ｉ）中、Ｘｓの塩基配列は、リンカーと隣接してＡＣＣ（アデニン−シトシン−シトシン）を含んでもよい。この場合、Ｘａの塩基配列は、Ｘｓと相補的になるように、リンカーと隣接してＧＧＵ（グアニン−グアニン−ウラシル）を含む。一実施形態では、Ｘａは、３’末端に塩基ウラシル（Ｕ）又はアデニン（Ａ）を含んでもよい。Ｘａは、１〜２０塩基長であってよく、例えば２〜２０塩基長、２〜１５塩基長、３〜１０塩基長、３〜６塩基長、５〜１２塩基長又は９〜１２塩基長であってよい。

本発明において、ＸＸａ_３はＸＸｓと相補的である。一実施形態では、式（Ａ）中、ＸＸｓの塩基配列が、リンカーと隣接してＣ（シトシン）を含んでもよい。この場合、ＸＸａ_３の塩基配列は、ＸＸｓと相補的になるように、リンカーと隣接してＧ（グアニン）を含む。一実施形態では、式（Ａ）中、ＸＸｓの塩基配列が、リンカーと隣接してＣＣ（シトシン−シトシン）を含んでもよい。この場合、ＸＸａ_３の塩基配列は、ＸＸｓと相補的になるように、リンカーと隣接してＧＧ（グアニン−グアニン）を含む。一実施形態では、式（Ａ）中、ＸＸｓの塩基配列は、リンカーと隣接してＡＣＣ（アデニン−シトシン−シトシン；５’から３’の方向で）を含んでもよい。この場合、ＸＸａ_３の塩基配列は、ＸＸｓと相補的になるように、リンカーと隣接してＧＧＵ（グアニン−グアニン−ウラシル；５’から３’の方向で）を含む。一実施形態では、ＸＸａ_１の塩基配列は、３’末端に塩基ウラシル（Ｕ）又はアデニン（Ａ）を含んでもよい。ＸＸａ_３及びＸＸｓは、好ましくは１〜７塩基長であり、例えば、１〜４塩基長、１塩基長又は２塩基長である。一実施形態では、ＹＹｓが２６〜２８塩基長の場合、ＸＸａ_３及びＸＸｓは１塩基長であってよい。

本発明において、Ｙａ_３はＹｓと相補的である。一実施形態では、Ｙａ_３の塩基配列は、リンカーと隣接してＣ（シトシン）を含んでもよい。この場合、Ｙｓの塩基配列は、Ｙａ_３と相補的になるように、リンカーと隣接してＧ（グアニン）を含む。Ｙａ_３及びＹｓは、好ましくは１〜７塩基長であり、例えば、１〜４塩基長、１塩基長又は２塩基長である。一実施形態では、Ｘｓが２６〜２８塩基長の場合、Ｙａ_３及びＹｓは１塩基長であってよい。

本発明において、ＹＹａは、ＹＹｓ内の対応する残基又は配列と相補的である。一実施形態では、ＹＹａの塩基配列は、リンカーと隣接してＣ（シトシン）を含んでもよい。この場合、ＹＹｓの塩基配列は、ＹＹａと相補的になるように、リンカーと隣接してＧ（グアニン）を含む。ＹＹａは、２〜２０塩基長であってよく、例えば２〜１５塩基長、３〜１０塩基長、３〜６塩基長、５〜１２塩基長又は９〜１２塩基長であってよい。

本発明において、「相補的」とは、２つの核酸又はヌクレオチドがその間で安定な塩基対合を形成できることを意味する。相補的な２つの核酸は、同じ塩基長を有する。相補的な２つの核酸は、典型的には、互いの相補配列（相補鎖）からなり、すなわち、完全に相補的である。あるいは、相補的な２つの核酸は、修飾塩基と、それと塩基対を形成できる核酸塩基を、アニーリング時に対応する位置にそれぞれ含有してもよい。

Ｙａ_２は、ライゲーション後の本発明に係るヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子が分子内アニーリング（自己アニーリング）を生じる際に、Ｘｓ及びＹｓのいずれとも塩基対合を形成しない。Ｙａ_２は、好ましくは１〜４塩基長であり、例えば１、２、又は３塩基長である。同様に、ＸＸａ_２は、ライゲーション後の本発明に係るヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子が分子内アニーリング（自己アニーリング）を生じる際に、ＸＸｓ及びＹＹｓのいずれとも塩基対合を形成しない。ＸＸａ_２は、好ましくは１〜４塩基長であり、例えば１、２、又は３塩基長である。

第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランド１）において、式（Ｉ）中のＸｓとＸａの合計塩基長（非ヌクレオチド性リンカー、ヌクレオチド性リンカー、又はそれらの組み合わせなどのリンカー部分は含まない）は好ましくは２１〜４８塩基長であり、例えば、２１〜４５塩基長、２５〜４５塩基長、２６〜３５塩基長、２６〜３０塩基長、２６〜２８塩基長、又は３３〜３６塩基長である。

第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランド２）において、式（ＩＩ）中のＹａ_１は、好ましくは６〜２７塩基長であり、例えば７〜２５塩基長、１０〜２５塩基長、１２〜２３塩基長、１２〜２２塩基長、１２〜１５塩基長、又は１８〜２３塩基長である。

第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランド２）において、式（ＩＩ）中のＹａ_１、Ｙａ_２、Ｙａ_３、及びＹｓの合計塩基長（非ヌクレオチド性リンカー、ヌクレオチド性リンカー、又はそれらの組み合わせなどのリンカー部分は含まない）は好ましくは１３〜４５塩基長であり、例えば、１３〜４３塩基長、１５〜４１塩基長、１５〜３０塩基長、１７〜２５塩基長、又は２０〜２５塩基長である。

第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランド１）において、式（Ａ）中のＸＸｓ、ＸＸａ_３、ＸＸａ_２、及びＸＸａ_１の合計塩基長（非ヌクレオチド性リンカー、ヌクレオチド性リンカー、又はそれらの組み合わせなどのリンカー部分は含まない）は好ましくは１３〜４５塩基長であり、例えば、１３〜４３塩基長、１５〜４１塩基長、１５〜３０塩基長、１７〜２５塩基長、又は２０〜２５塩基長である。

ＸＸａ_１は、好ましくは６〜２７塩基長であり、例えば７〜２５塩基長、１０〜２５塩基長、１２〜２３塩基長、１２〜２２塩基長、１２〜１５塩基長、又は１８〜２３塩基長である。

第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランド２）において、式（Ｂ）中のＹＹａとＹＹｓとの合計塩基長（非ヌクレオチド性リンカー、ヌクレオチド性リンカー、又はそれらの組み合わせなどのリンカー部分は含まない）は好ましくは２１〜４８塩基長であり、例えば、２１〜４５塩基長、２５〜４５塩基長、２６〜３５塩基長、２６〜３０塩基長、２６〜２８塩基長、又は３３〜３６塩基長である。

本発明において、リンカー、例えば、第１のリンカー及び第２のリンカーは、特に限定されないが、それぞれ独立に、例えば、非ヌクレオチド性リンカー、ヌクレオチド性リンカー、又はそれらの組み合わせであってよい。ヌクレオチド性リンカーは、１個以上のヌクレオチド残基（リボヌクレオチド残基又はデオキシリボヌクレオチド残基、好ましくはリボヌクレオチド残基）からなる。非ヌクレオチド性リンカーはヌクレオチド残基を含まない。本発明において用いるリンカーの構成単位は、特に限定されず、ヌクレオチド残基及び／又は非ヌクレオチド残基であってよい。非ヌクレオチド性リンカーとヌクレオチド性リンカーの組み合わせであるリンカーは、ヌクレオチド残基と非ヌクレオチド残基の両方を含む。本発明のリンカーは、例えば、以下の（１）〜（７）のいずれかの残基で構成され得る。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基と修飾ヌクレオチド残基の組み合わせ
（４）非ヌクレオチド残基
（５）非ヌクレオチド残基と非修飾ヌクレオチド残基の組み合わせ
（６）非ヌクレオチド残基と修飾ヌクレオチド残基の組み合わせ
（７）非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基の組み合わせ

一実施形態では、第１のリンカー及び第２のリンカーの両方が、ヌクレオチド残基からなるもの（ヌクレオチド性リンカー）であってもよいし、又は非ヌクレオチド残基からなるもの（非ヌクレオチド性リンカー）であってもよい。あるいは、第１のリンカー及び第２のリンカーの一方がヌクレオチド残基からなり、他方が非ヌクレオチド残基からからなるものであってもよい。第１のリンカー及び第２のリンカー（上記式中、Ｌｘ_１及びＬｘ_２のリンカー）は、同じ構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。

本発明において用いるリンカー、例えば、第１のリンカー及び第２のリンカー（上記式中、Ｌｘ_１及びＬｘ_２）が、非ヌクレオチド残基を含む場合、非ヌクレオチド残基の個数は、特に限定されず、例えば、１〜８個、１〜６個、１〜４個、１、２又は３個であってよい。「非ヌクレオチド残基」は、非ヌクレオチド性リンカーの構成単位を指す。非ヌクレオチド残基は、以下に限定するものではないが、例えば、ピロリジン骨格又はピペリジン骨格を有する環状アミン誘導体等であってよい。非ヌクレオチド残基は、例えば、後述の式（ＩＩＩ）で表される構造を単位（１個）とするものであってよい。

本発明の一実施形態において、リンカー、例えば、第１のリンカー及び第２のリンカー（上記式中、Ｌｘ_１及びＬｘ_２）は、ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を１個以上含む非ヌクレオチド性リンカーであってよい。第１のリンカー及び第２のリンカー（上記式中、Ｌｘ_１及びＬｘ_２）は、同じ構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。第１のリンカー及び第２のリンカー（上記式中、Ｌｘ_１及びＬｘ_２）は、それぞれ独立して、ピロリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造を有してもよいし、ピペリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造を有してもよいし、上記ピロリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造と、上記ピペリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造との両方を有してもよい。本発明の方法により製造されるヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、このようなリンカーでセンス鎖とアンチセンス鎖が連結されていることにより、ヌクレアーゼ耐性に優れる。

本発明のヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子において、ピロリジン骨格は、例えば、ピロリジンの５員環を構成する炭素原子が、１個以上、置換されたピロリジン誘導体の骨格でもよく、置換される場合、例えば、２位の炭素原子（Ｃ−２）以外の炭素原子であることが好ましい。上記炭素原子は、例えば、窒素原子、酸素原子又は硫黄原子で置換されてもよい。ピロリジン骨格は、例えば、ピロリジンの５員環内に、例えば、炭素−炭素二重結合又は炭素−窒素二重結合を含んでもよい。上記ピロリジン骨格において、ピロリジンの５員環を構成する炭素原子及び窒素原子は、例えば、水素原子が結合してもよいし、後述するような置換基が結合してもよい。リンカーＬｘ_１は、例えば、上記ピロリジン骨格のいずれかの基を介して、式（Ｉ）におけるＸｓとＸａ、及び式（Ａ）におけるＸＸｓとＸＸａ_３を連結してもよい。リンカーＬｘ_２は、例えば、上記ピロリジン骨格のいずれかの基を介して、式（ＩＩ）におけるＹａ_３とＹｓ、及び式（Ｂ）におけるＹＹａとＹＹｓを連結してもよい。それらは、上記５員環のいずれか１個の炭素原子と窒素原子、好ましくは、上記５員環の２位の炭素原子（Ｃ−２）と窒素原子を介して連結されうる。上記ピロリジン骨格としては、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等が挙げられる。

上記ピペリジン骨格は、例えば、ピペリジンの６員環を構成する炭素が、１個以上置換されたピペリジン誘導体の骨格でもよく、置換される場合、例えば、Ｃ−２の炭素原子以外の炭素原子であることが好ましい。上記炭素原子は、例えば、窒素原子、酸素原子又は硫黄原子で置換されてもよい。上記ピペリジン骨格は、例えば、ピペリジンの６員環内に、例えば、炭素−炭素二重結合又は炭素−窒素二重結合を含んでもよい。上記ピペリジン骨格において、ピペリジンの６員環を構成する炭素原子及び窒素原子は、例えば、水素原子が結合してもよいし、後述するような置換基が結合してもよい。リンカーＬｘ_１は、例えば、上記ピペリジン骨格のいずれかの基を介して、式（Ｉ）におけるＸｓとＸａ、及び式（Ａ）におけるＸＸｓとＸＸａ_３を連結してもよい。リンカーＬｘ_２は、例えば、上記ピペリジン骨格のいずれかの基を介して、式（ＩＩ）におけるＹａ_３とＹｓ、及び式（Ｂ）におけるＹＹａとＹＹｓを連結してもよい。それらは、上記６員環のいずれか１個の炭素原子と窒素原子、好ましくは、上記６員環の２位の炭素原子（Ｃ−２）と窒素原子を介して連結されうる。

上記リンカーは、例えば、上記の非ヌクレオチド構造からなる非ヌクレオチド残基のみを含むものでありうる。

上記リンカー領域は、例えば、下記式（ＩＩＩ）で表されるか、又は下記式（ＩＩＩ）で表される非ヌクレオチド残基を１個又は２個以上含むものであってよい。
上記式（ＩＩＩ）中、
Ｘ^１及びＸ^２は、それぞれ独立して、Ｈ_２、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり；
Ｙ^１及びＹ^２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ_２、ＮＨ、Ｏ又はＳであり；
Ｒ^３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５又はＣ−６に結合する水素原子又は置換基であり、
Ｌ^１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲ^ａ、ＮＨ_２、ＮＨＲ^ａ、ＮＲ^ａＲ^ｂ、ＳＨ、もしくはＳＲ^ａで置換されても置換されていなくてもよく、又は、
Ｌ^１は、上記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ここで、Ｙ^１が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ^１に結合するＬ^１の原子は炭素であり、ＯＲ^１に結合するＬ^１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ^２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲ^ｃ、ＮＨ_２、ＮＨＲ^ｃ、ＮＲ^ｃＲ^ｄ、ＳＨもしくはＳＲ^ｃで置換されても置換されていなくてもよく、又は、
Ｌ^２は、上記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ここで、Ｙ^２が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ^２に結合するＬ^２の原子は炭素であり、ＯＲ^２に結合するＬ^２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ及びＲ^ｄは、それぞれ独立して、置換基又は保護基であり；
ｌは、１又は２であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
環Ａは、環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素原子、酸素原子、硫黄原子で置換されてもよく、
環Ａ内に、炭素−炭素二重結合又は炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
ここで、Ｒ^１及びＲ^２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立して、Ｒ^１及びＲ^２が存在しない式（ＩＩＩ）で表される非ヌクレオチド残基である。

式（Ｉ）におけるＸｓとＸａ、式（Ａ）におけるＸＸｓとＸＸａ_３は、式（ＩＩＩ）中の−ＯＲ^１−又は−ＯＲ^２−を介して、リンカーＬｘ_１と連結し得る。一実施形態では、Ｘｓが−ＯＲ^１−を介して、Ｘａが−ＯＲ^２−を介して、リンカーＬｘ_１と連結してもよい。別の実施形態では、Ｘｓが−ＯＲ^２−を介して、Ｘａが−ＯＲ^１−を介して、リンカーＬｘ_１と連結してもよい。別の実施形態では、ＸＸｓが−ＯＲ^１−を介して、ＸＸａ_３が−ＯＲ^２−を介して、リンカーＬｘ_１と連結してもよい。別の実施形態では、ＸＸｓが−ＯＲ^２−を介して、ＸＸａ_３が−ＯＲ^１−を介して、リンカーＬｘ_１と連結してもよい。

式（ＩＩ）におけるＹａ_３とＹｓ、式（Ｂ）におけるＹＹａとＹＹｓは、式（ＩＩＩ）中の−ＯＲ^１−又は−ＯＲ^２−を介して、リンカーＬｘ_２と連結し得る。一実施形態では、Ｙａ_３が−ＯＲ^１−を介して、Ｙｓが−ＯＲ^２−を介して、リンカーＬｘ_２と連結してもよい。別の実施形態では、Ｙａ_３が−ＯＲ^２−を介して、Ｙｓが−ＯＲ^１−を介して、リンカーＬｘ_２と連結してもよい。別の実施形態では、ＹＹａが−ＯＲ^１−を介して、ＹＹｓが−ＯＲ^２−を介して、リンカーＬｘ_２と連結してもよい。別の実施形態では、ＹＹａが−ＯＲ^２−を介して、ＹＹｓが−ＯＲ^１−を介して、リンカーＬｘ_２と連結してもよい。

好ましい一実施形態では、Ｘｓが−ＯＲ^２−を介して、Ｘａが−ＯＲ^１−を介して、リンカーＬｘ_１と連結し、さらにＹａ_３が−ＯＲ^２−を介して、Ｙｓが−ＯＲ^１−を介して、リンカーＬｘ_２と連結してもよい。好ましい別の実施形態では、ＸＸｓが−ＯＲ^２−を介して、ＸＸａ_３が−ＯＲ^１−を介して、リンカーＬｘ_１と連結し、さらにＹＹａが−ＯＲ^２−を介して、ＹＹｓが−ＯＲ^１−を介して、リンカーＬｘ_２と連結してもよい。

上記式（ＩＩＩ）中、Ｘ^１及びＸ^２は、例えば、それぞれ独立して、Ｈ_２、Ｏ、Ｓ又はＮＨである。上記式（ＩＩＩ）中において、Ｘ^１がＨ_２であるとは、Ｘ^１が、Ｘ^１の結合する炭素原子とともに、ＣＨ_２（メチレン基）を形成することを意味する。Ｘ^２についても同様である。

上記式（ＩＩＩ）中、Ｙ^１及びＹ^２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ_２、ＮＨ、Ｏ又はＳである。

上記式（ＩＩＩ）中、環Ａにおいて、ｌは、１又は２である。ｌ＝１の場合、環Ａは、５員環であり、例えば、上記ピロリジン骨格である。上記ピロリジン骨格は、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等があげられ、これらの二価の構造が例示できる。ｌ＝２の場合、環Ａは、６員環であり、例えば、上記ピペリジン骨格である。環Ａは、環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素原子、酸素原子又は硫黄原子で置換されてもよい。また、環Ａは、環Ａ内に、炭素−炭素二重結合又は炭素−窒素二重結合を含んでもよい。環Ａは、例えば、Ｌ型及びＤ型のいずれでもよい。

上記式（ＩＩＩ）中、Ｒ^３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５又はＣ−６に結合する水素原子又は置換基である。Ｒ^３が上記置換基の場合、置換基Ｒ^３は、１でも複数でも、存在しなくてもよく、複数の場合、同一でも異なってもよい。

置換基Ｒ^３は、例えば、ハロゲン、ＯＨ、ＯＲ^４、ＮＨ_２、ＮＨＲ^４、ＮＲ^４Ｒ^５、ＳＨ、ＳＲ^４又はオキソ基（＝Ｏ）等である。

Ｒ^４及びＲ^５は、例えば、それぞれ独立して、置換基又は保護基であり、同一でも異なってもよい。上記置換基は、例えば、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等が挙げられる。以下、同様である。置換基Ｒ^３は、これらの列挙する置換基であってもよい。

上記保護基は、例えば、反応性の高い官能基を不活性に変換する官能基であり、公知の保護基等が挙げられる。上記保護基は、例えば、文献（J. F. W. McOmie, 「Protecting Groups in Organic Chemistry」 Plenum Press, London and New York, 1973）の記載を援用できる。上記保護基は、特に制限されず、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）、ビス（２−アセトキシエチルオキシ）メチル基（ＡＣＥ）、トリイソプロピルシリルオキシメチル基（ＴＯＭ）、１−（２−シアノエトキシ）エチル基（ＣＥＥ）、２−シアノエトキシメチル基（ＣＥＭ）及びトリルスルフォニルエトキシメチル基（ＴＥＭ）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）等が挙げられる。Ｒ^３がＯＲ^４の場合、上記保護基は、特に制限されず、例えば、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基及びＴＥＭ基等が挙げられる。この他にも、シリル含有基も挙げられる。以下、同様である。

上記式（ＩＩＩ）中、Ｌ^１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖である。上記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲ^ａ、ＮＨ_２、ＮＨＲ^ａ、ＮＲ^ａＲ^ｂ、ＳＨ、もしくはＳＲ^ａで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。又は、Ｌ^１は、上記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。上記ポリエーテル鎖は、例えば、ポリエチレングリコールである。なお、Ｙ^１が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ^１に結合するＬ^１の原子は炭素であり、ＯＲ^１に結合するＬ^１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ^１がＯの場合、その酸素原子とＬ^１の酸素原子は隣接せず、ＯＲ^１の酸素原子とＬ^１の酸素原子は隣接しない。

上記式（ＩＩＩ）中、Ｌ^２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖である。上記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲ^ｃ、ＮＨ_２、ＮＨＲ^ｃ、ＮＲ^ｃＲ^ｄ、ＳＨもしくはＳＲ^ｃで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。又は、Ｌ^２は、上記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。なお、Ｙ^２が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ^２に結合するＬ^２の原子は炭素であり、ＯＲ^２に結合するＬ^２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ^２がＯの場合、その酸素原子とＬ^２の酸素原子は隣接せず、ＯＲ^２の酸素原子とＬ^２の酸素原子は隣接しない。

Ｌ^１のｎ及びＬ^２のｍは、特に制限されず、それぞれ、下限は、例えば、０であり、上限も、特に制限されない。ｎ及びｍは、例えば、リンカーＬｘ_１及びＬｘ_２の所望の長さに応じて、適宜設定できる。ｎ及びｍは、例えば、製造コスト及び収率等の点から、それぞれ、０〜３０が好ましく、より好ましくは０〜２０であり、さらに好ましくは０〜１５である。ｎとｍは、同じでもよいし（ｎ＝ｍ）、異なってもよい。ｎ＋ｍは、例えば、０〜３０であり、好ましくは０〜２０であり、より好ましくは０〜１５である。

Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ及びＲ^ｄは、例えば、それぞれ独立して、置換基又は保護基である。上記置換基及び上記保護基は、例えば、前述と同様である。

上記式（ＩＩＩ）において、水素原子は、例えば、それぞれ独立して、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ及びＩ等のハロゲンに置換されてもよい。

好ましい実施形態では、上記リンカーは、下記式（ＩＶ−１）〜（ＩＶ−９）のいずれかで表されるものであるか、又は下記式（ＩＶ−１）〜（ＩＶ−９）で表される非ヌクレオチド残基を１個又は２個以上含むものであってよい。下記式において、ｑは、０〜１０の整数である。下記式において、ｎ及びｍは、上記式（ＩＩＩ）と同じである。具体例としては、式（ＩＶ−１）においてｎ＝８、式（ＩＶ−２）においてｎ＝３、式（ＩＶ−３）においてｎ＝４又は８、式（ＩＶ−４）においてｎ＝７又は８、式（ＩＶ−５）においてｎ＝３及びｍ＝４、式（ＩＶ−６）においてｎ＝８及びｍ＝４、式（ＩＶ−７）においてｎ＝８及びｍ＝４、式（ＩＶ−８）においてｎ＝５及びｍ＝４、式（ＩＶ−９）においてｑ＝１及びｍ＝４が挙げられる。

一実施形態では、上記リンカーは、下記式（Ｖ）又は（ＶＩ）で表されるものであるか、又は下記式（Ｖ）又は（ＶＩ）で表される非ヌクレオチド残基を１個又は２個以上含むものであってよい。

一実施形態では、第１のＲＮＡ部分（Ｘｓ、ＸＸｓ）は式（ＶＩ）中の２位炭素原子側で、第２のＲＮＡ部分（Ｘａ、ＸＸａ_３）は式（ＶＩ）中の１位窒素原子側で、リンカーＬｘ_１と連結し、第３のＲＮＡ部分（Ｙａ_３、ＹＹａ）は２位炭素原子側で、第４のＲＮＡ部分（Ｙｓ、ＹＹｓ）は式（ＶＩ）中の１位窒素原子側で、リンカーＬｘ_２と連結していてもよい。

式（ＶＩ）で表されるリンカーは、下記式（ＶＩ−１）又は（ＶＩ−２）で表される光学活性体であってよい。

第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子において、ＸａはＸｓの３’側領域と相補的であり、Ｙａ_３はＹｓと相補的である。このため、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子において、ＸａはＸｓに向かって折り返し、ＸａはＸｓと自己アニーリングによって、二重鎖を形成する。同様に第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子において、ＹｓはＹａ_３に向かって折り返し、ＹｓはＹａ_３と自己アニーリングによって、二重鎖を形成する。

第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子において、ＹＹａはＹＹｓの５’側領域と相補的であり、ＸＸａ_３はＸＸｓと相補的である。このため、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子において、ＸＸａ_３はＸＸｓに向かって折り返し、ＸＸａ_３はＸＸｓと自己アニーリングによって、二重鎖を形成する。同様に第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子において、ＹＹａはＹＹｓに向かって折り返し、ＹＹａはＹＹｓと自己アニーリングによって、二重鎖を形成する。

上記のようなリンカーはβターン構造を形成しやすい。そのため、式（Ｉ）の第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、リンカーＬｘ_１によりβターン側で折り返し構造を取り、それによって、ＸａがＸｓと自己アニーリングする際にＸａの３’末端が式（ＩＩ）の第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端（Ｙａ_１の５’末端）に接近しやすい構造を取ると考えられる。式（Ａ）及び（Ｂ）の第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子についても同様である。

別の実施形態において、リンカー、例えば、第１のリンカー及び第２のリンカー（上記式中、Ｌｘ_１及びＬｘ_２）は、１つ以上のヌクレオチド残基からなるヌクレオチド性リンカーであってよい。リンカーがヌクレオチド性リンカーである場合、その長さは、特に限定されないが、リンカーの前後の配列、例えば、第１のＲＮＡ部分と第２のＲＮＡ部分、又は第３のＲＮＡ部分と第４のＲＮＡ部分による二重鎖形成を妨げない長さであることが好ましい。ヌクレオチド性リンカーである第１のリンカー及び第２のリンカー（上記式中、Ｌｘ_１及びＬｘ_２）の長さ（塩基数）及び塩基配列は、同じであっても異なっていてもよい。そのヌクレオチド性リンカーの長さは、例えば１塩基以上、２塩基以上、又は３塩基以上であってよく、かつ、例えば１００塩基以下、８０塩基以下、又は５０塩基以下であってよい。そのようなヌクレオチド性リンカーの長さは、例えば、１〜５０塩基、１〜３０塩基、３〜２０塩基、３〜１０塩基、又は３〜７塩基であってよく、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０塩基であってよい。ヌクレオチド性リンカーは、自己相補的ではなく、配列内部において自己アニーリングを生じない構造であることが好ましい。

本発明において用いるリンカー、例えば、第１のリンカー及び第２のリンカー（上記式中、Ｌｘ_１及びＬｘ_２）が、非修飾ヌクレオチド残基と修飾ヌクレオチド残基（例えば、修飾リボヌクレオチド残基）を含む場合、修飾ヌクレオチド残基の個数は、特に限定されないが、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、例えば１個又は２個であってよい。

本発明において用いるヌクレオチド性リンカーの例として、５’−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−３’、５’−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−３’、又は５’−Ｕ−Ｕ−Ｃ−Ｇ−３’のＲＮＡ配列からなるリンカーが挙げられる。一実施形態では、第１のリンカー及び第２のリンカー（上記式中、Ｌｘ_１及びＬｘ_２）は、それぞれ独立して、５’−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−３’、５’−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−３’、及び５’−Ｕ−Ｕ−Ｃ−Ｇ−３’から選択される。一実施形態では、第１のリンカーは５’−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−３’のＲＮＡ配列からなり、第２のリンカーは５’−Ｕ−Ｕ−Ｃ−Ｇ−３’のＲＮＡ配列からなる。

第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、当業者に公知のＲＮＡ合成法を用いて作製することができる。当業者に公知のＲＮＡ合成法としては、例えば、ホスホロアミダイト法やＨ−ホスホネート法等が挙げられる。ホスホロアミダイト法では、担体の疎水性基に結合したリボヌクレオシドをＲＮＡアミダイト（リボヌクレオシドホスホロアミダイト）との縮合反応により伸長し、酸化と脱保護を経て、ＲＮＡアミダイトとの縮合反応を繰り返し行うことにより、ＲＮＡ合成を行うことができる。式（Ｉ）及び（ＩＩ）の第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を例にとって説明すると、本発明に係る第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、ＲＮＡ合成法、例えばホスホロアミダイト法により、３’末端側からリンカーの手前までの配列（Ｘａ、Ｙｓ）の合成を行った後、ピロリジン骨格又はピペリジン骨格を有する環状アミン誘導体のような非ヌクレオチド残基を結合してリンカーを形成し、その末端にさらにリンカーから５’末端までの配列（Ｘｓ；又はＹａ_３、Ｙａ_２、及びＹａ_１）の合成を順次行うことにより、作製することができる。あるいは、本発明に係る第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、ＲＮＡ合成法、例えばホスホロアミダイト法により、３’末端側からヌクレオチド性リンカーの手前までの配列（Ｘａ、Ｙｓ）の合成を行い、引き続きヌクレオチド性リンカーの配列を合成し、さらにヌクレオチド性リンカーの後ろから５’末端までの配列（Ｘｓ；又はＹａ_３、Ｙａ_２、及びＹａ_１）の合成を順次行うことにより、作製することができる。非ヌクレオチド性リンカーとヌクレオチド性リンカーの組み合わせを用いる場合、及び式（Ａ）及び（Ｂ）の第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を用いる場合も、上記の方法に準じて作製することができる。本発明では、任意のＲＮＡアミダイトを使用することができ、例えば、２位の水酸基にｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、トリイソプロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）、ビス（２−アセトキシエトキシ）メチル（ＡＣＥ）１−（２−シアノエトキシ）エチル基（ＣＥＥ）、２−シアノエトキシメチル基（ＣＥＭ）、トリルスルフォニルエトキシメチル基（ＴＥＭ）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）等の様々な保護基を有する汎用型ＲＮＡアミダイトも使用することができる。また本発明では、ＲＮＡ合成において、ポリスチレン系担体、アクリルアミド系担体、又はガラス担体などの任意の固相担体を使用することができる。担体は、ビーズ、プレート、チップ、チューブ等の任意の形態であってよい。担体の例として、ポリスチレンビーズ、例えばＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ^（Ｒ） ＨＬ ｒＧ（ｉｂｕ）、又はｒＵ（ＫＩＮＯＶＡＴＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。

上記リンカーのうち、非ヌクレオチド性リンカーを形成するための環状アミン誘導体は、ＲＮＡ合成用のモノマーであって、例えば、下記式（ＶＩＩ）の構造を有する。この環状アミン誘導体は、基本的に上記の各リンカー構造と対応しており、リンカー構造についての説明はこの環状アミン誘導体にも援用される。リンカーを形成する環状アミン誘導体は、例えば、自動核酸合成用のアミダイトとして使用でき、例えば、一般的な核酸自動合成装置に適用可能である。

上記式（ＶＩＩ）中、
Ｘ^１及びＸ^２は、それぞれ独立して、Ｈ_２、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり；
Ｙ^１及びＹ^２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ_２、ＮＨ、Ｏ又はＳであり；
Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立して、Ｈ、保護基又はリン酸保護基であり；
Ｒ^３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５又はＣ−６に結合する水素原子又は置換基であり；
Ｌ^１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲ^ａ、ＮＨ_２、ＮＨＲ^ａ、ＮＲ^ａＲ^ｂ、ＳＨ、もしくはＳＲ^ａで置換されても置換されていなくてもよく、又は、
Ｌ^１は、上記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ここで、Ｙ^１が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ^１に結合するＬ^１の原子は炭素であり、ＯＲ^１に結合するＬ^１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ^２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲ^ｃ、ＮＨ_２、ＮＨＲ^ｃ、ＮＲ^ｃＲ^ｄ、ＳＨもしくはＳＲ^ｃで置換されても置換されていなくてもよく、又は、
Ｌ^２は、上記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ここで、Ｙ^２が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ^２に結合するＬ^２の原子は炭素であり、ＯＲ^２に結合するＬ^２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ及びＲ^ｄは、それぞれ独立して、置換基又は保護基であり；
ｌは、１又は２であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
環Ａは、環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素原子、酸素原子又は硫黄原子で置換されてもよく、
環Ａ内に、炭素−炭素二重結合又は炭素−窒素二重結合を含んでもよい。

上記式（ＶＩＩ）において、上記式（ＩＩＩ）と同一箇所については、上記式（ＩＩＩ）の説明を援用できる。具体的に、上記式（ＶＩＩ）において、例えば、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｙ^１、Ｙ^２、Ｒ^３、Ｌ^１、Ｌ^２、ｌ、ｍ、ｎ及び環Ａは、上記式（ＩＩＩ）の説明を全て援用できる。

上記式（ＶＩＩ）において、Ｒ^１及びＲ^２は、前述のように、それぞれ独立して、Ｈ、保護基又はリン酸保護基である。

上記保護基は、例えば、上記式（ＩＩＩ）における説明と同様であり、具体例として、例えば、群Ｉから選択できる。上記群Ｉは、例えば、ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基、ＴＥＭ基、及び、下記式に示すシリル含有基があげられ、中でも、ＤＭＴｒ基及び上記シリル含有基のいずれかであることが好ましい。

上記リン酸保護基は、例えば、下記式で表すことができる。
−Ｐ（ＯＲ^６）（ＮＲ^７Ｒ^８）

上記式において、Ｒ^６は、水素原子又は任意の置換基である。Ｒ^６は、例えば、炭化水素基が好ましく、上記炭化水素基は、電子吸引基で置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。Ｒ^６は、例えば、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアリール、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、及び、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル等の炭化水素等があげられ、さらに、電子吸引基で置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。Ｒ^６は、具体的には、例えば、β−シアノエチル基、ニトロフェニルエチル基、メチル基等が挙げられる。

Ｒ^７及びＲ^８は、それぞれ、水素原子又は任意の置換基であり、同一でも異なっていてもよい。Ｒ^７及びＲ^８は、例えば、炭化水素基が好ましく、上記炭化水素基は、さらに任意の置換基で置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。上記炭化水素基は、例えば、前述した上記Ｒ^６での列挙と同様であり、好ましくは、メチル基、エチル基、イソプロピル基である。この場合、−ＮＲ^７Ｒ^８は、具体的には、例えば、ジイソプロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、エチルメチルアミノ基等が挙げられる。又は、置換基Ｒ^７及びＲ^８が一体となって、それらが結合する窒素原子とともに（すなわち、−ＮＲ^７Ｒ^８が一体となって）、窒素含有環（例えば、ピペリジル基、モルホリノ基等）を形成してもよい。

上記リン酸保護基の具体例としては、例えば、下記群ＩＩから選択できる。群ＩＩは、例えば、−Ｐ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ）（Ｎ（ｉ−Ｐｒ）_２）、−Ｐ（ＯＣＨ_３）（Ｎ（ｉ−Ｐｒ）_２）等が挙げられる。上記式において、ｉ−Ｐｒは、イソプロピルを示す。

上記式（ＶＩＩ）において、例えば、Ｒ^１及びＲ^２は、いずれか一方が、Ｈ又は保護基であり、他方が、Ｈ又はリン酸保護基である。好ましくは、例えば、Ｒ^１が、上記保護基の場合、Ｒ^２は、Ｈ又は上記リン酸保護基が好ましく、具体的には、Ｒ^１が、上記群Ｉから選択される場合、Ｒ^２は、Ｈ又は上記群ＩＩから選択されることが好ましい。また、好ましくは、例えば、Ｒ^１が、上記リン酸保護基の場合、Ｒ^２は、Ｈ又は上記保護基が好ましく、具体的には、Ｒ^１が、上記群ＩＩから選択される場合、Ｒ^２は、Ｈ又は上記群Ｉから選択されることが好ましい。

上記環状アミン誘導体は、下記式（ＶＩＩ−１）〜（ＶＩＩ−９）のいずれかで表されるものであってよい。下記式において、ｎ及びｍは、上記式（ＶＩＩ）と同じである。下記式において、ｑは、０〜１０の整数である。具体例としては、式（ＶＩＩ−１）においてｎ＝８、式（ＶＩＩ−２）においてｎ＝３、式（ＶＩＩ−３）においてｎ＝４又は８、式（ＶＩＩ−４）においてｎ＝７又は８、式（ＶＩＩ−５）においてｎ＝３及びｍ＝４、式（ＶＩＩ−６）においてｎ＝８及びｍ＝４、式（ＶＩＩ−７）においてｎ＝８及びｍ＝４、式（ＶＩＩ−８）においてｎ＝５及びｍ＝４、式（ＶＩＩ−９）においてｑ＝１及びｍ＝４が挙げられる。

一実施形態では、上記環状アミン誘導体は、下記式（ＶＩＩＩ）で表されるプロリノール誘導体又は下記式（ＩＸ）で表されるプロリン誘導体で表されるものであってよい。

上記環状アミン誘導体は、例えば、標識物質、例えば安定同位体を含んでもよい。

上記環状アミン誘導体は、例えば、国際公開ＷＯ２０１３／０２７８４３又は国際公開ＷＯ２０１６／１５９３７４に記載された、核酸分子合成用モノマーの製造方法に従って合成することができる。

本発明の方法では、上記の第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（例えば、図１中、ストランド１）と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（例えば、図１中、ストランド２）をアニーリングし、ライゲーションすることにより、本発明に係る標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を製造することができる。

本発明の方法により製造されるヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子において、ライゲーション工程で生じるＸａ−Ｙａ_１−Ｙａ_２−Ｙａ_３は、標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む。遺伝子発現抑制配列は、Ｘａ、Ｘａ−Ｙａ_１、Ｘａ−Ｙａ_１−Ｙａ_２、又はＸａ−Ｙａ_１−Ｙａ_２−Ｙａ_３に含まれていてもよい。同様に、ライゲーション工程で生じるＸＸａ_３−ＸＸａ_２−ＸＸａ_１−ＹＹａは、標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む。遺伝子発現抑制配列は、ＹＹａ、ＸＸａ_１−ＹＹａ、ＸＸａ_２−ＸＸａ_１−ＹＹａ、又はＸＸａ_３−ＸＸａ_２−ＸＸａ_１−ＹＹａに含まれていてもよい。遺伝子発現抑制配列は、好ましくは、標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡの全体又は一部のセンス配列又はアンチセンス配列である。なお、ライゲーション工程で生じるＸａ−Ｙａ_１は、Ｘｓと相補的であることから、Ｘｓも標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含んでいてもよい。同様に、ＸＸａ_１−ＹＹａは、ＹＹｓと相補的であることから、ＹＹｓも標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含んでいてよい。

上記ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、遺伝子発現抑制配列を１つ含んでもよいし、２つ以上含んでもよい。上記ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、例えば、同じ標的遺伝子に対する同じ遺伝子発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、同じ標的に対する異なる遺伝子発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、異なる標的遺伝子に対する異なる遺伝子発現抑制配列を２つ以上有してもよい。異なる標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を２つ以上有するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、２種類以上の異なる標的遺伝子の発現抑制に有用である。本発明において「遺伝子」とは、ｍＲＮＡに転写されるゲノム領域を指し、タンパク質コード領域であってよいが、ＲＮＡコード領域であってもよい。

本発明に係るヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、遺伝子発現抑制配列を介して標的遺伝子の発現を抑制する能力を有する。本発明に係るヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子による標的遺伝子の発現抑制は、ＲＮＡ干渉によるものであることが好ましいが、それに限定されない。ＲＮＡ干渉は、一般に、長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、細胞内において、Ｄｉｃｅｒにより、３’末端が突出した１９〜２１塩基対程度の短い二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）に切断され、その一方の一本鎖ＲＮＡが標的ｍＲＮＡに結合して、標的ｍＲＮＡを分解することにより、標的ｍＲＮＡの翻訳を抑制し、それにより標的ｍＲＮＡが由来する標的遺伝子の発現を抑制する現象である。標的ｍＲＮＡに結合するｓｉＲＮＡに含まれる一本鎖ＲＮＡの配列は、例えば、標的遺伝子の種類に応じて様々な種類が報告されている。本発明は、例えば、ｓｉＲＮＡに含まれる一本鎖ＲＮＡの配列（好ましくは、アンチセンス配列）を、遺伝子発現抑制配列として使用できる。本発明の方法により製造されるヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｖｏで切断されてｓｉＲＮＡを生成することにより標的遺伝子の発現を抑制することができる。本発明に係るヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、標的遺伝子の発現又は発現増加と関連する疾患又は障害の治療又は予防のために用いることができる。

遺伝子発現抑制配列は、好ましくは１９〜３０塩基長であり、より好ましくは１９〜２７塩基長であり、例えば、１９、２０、２１、２２、又は２３塩基長であってよい。遺伝子発現抑制配列は、標的遺伝子のｍＲＮＡの少なくとも一部の配列と完全に同一又は完全に相補的なＲＮＡ配列からなることが好ましい。遺伝子発現抑制配列は、標的遺伝子の塩基配列に対し、常法により設計することができる。

標的遺伝子は、任意の遺伝子であってよく、例えば任意の疾患関連遺伝子であってよい。標的遺伝子は、ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子により生体、細胞、組織又は器官等において遺伝子発現抑制をもたらす対象と同じ生物種に由来するものであることが好ましく、例えば、ヒト、チンパンジー、ゴリラなどの霊長類、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ロバ等の家畜、イヌ、ネコ、ウサギ等の愛玩動物、マウス、ラット、モルモット等のげっ歯類などを含む哺乳動物、魚類、昆虫等の動物、植物、真菌等に由来するものであってよい。標的遺伝子としては、特に限定されないが、例えばＴＧＦ−β１遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子、ＬＡＭＡ１遺伝子、ＬＭＮＡ遺伝子が挙げられる。ヒトＴＧＦ−β１（トランスフォーミング増殖因子−β１）遺伝子のｍＲＮＡ配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）アクセッション番号ＮＭ＿０００６６０に基づいて入手することができる（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ： ７０４０）。ヒトＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子のｍＲＮＡ配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）アクセッション番号ＮＭ＿００２０４６に基づいて入手することができる（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ： ２５９７）。ヒトＬＡＭＡ１遺伝子のｍＲＮＡ配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５５５９に基づいて入手することができる（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ： ２８４２１７）。ヒトＬＭＮＡ遺伝子のｍＲＮＡ配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１７０７０７に基づいて入手することができる（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ： ４０００）。標的遺伝子がＴＧＦ−β１遺伝子である場合、本発明の方法により製造されるヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｖｏでＴＧＦ−β１遺伝子の発現を抑制する。そのようなヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、ＴＧＦ−β１遺伝子の遺伝子発現抑制を通じて、ＴＧＦ−β１遺伝子の発現又は発現増加と関連する疾患又は障害、例えば肺線維症や急性肺疾患の治療又は予防のために用いることができる。同様に、ＧＡＰＤＨ遺伝子、ＬＡＭＡ１遺伝子、ＬＭＮＡ遺伝子等の他の標的遺伝子の発現を抑制する本発明に係るへアピン型一本鎖ＲＮＡ分子も、当該標的遺伝子の発現抑制を通じて、当該標的遺伝子の発現又は発現増加と関連する疾患又は障害の治療又は予防のために用いることができる。

本発明の方法により製造される、標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の１つの例は、配列番号１で表される塩基配列からなり、かつ２４番目と２５番目のヌクレオチド（リボヌクレオチド残基）がリンカー（Ｌｘ_１）を介して連結され、５０番目と５１番目のヌクレオチド（リボヌクレオチド残基）がリンカー（Ｌｘ_２）を介して連結されているＲＮＡ分子である（例えば、図２）。配列番号１で表される塩基配列からなるそのようなヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、５’末端から３’末端の方向に、配列番号２で表される塩基配列からなるＲＮＡ配列と、上記のリンカー（非ヌクレオチド性リンカー、ヌクレオチド性リンカー、又はそれらの組み合わせ；図１のＬｘ_１）と、配列番号３で表される塩基配列からなるＲＮＡ配列と、上記のリンカー（非ヌクレオチド性リンカー、ヌクレオチド性リンカー、又はそれらの組み合わせ；図１のＬｘ_２）と、塩基Ｇ（グアニン）を含む。配列番号１で表される塩基配列からなる上記ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、標的遺伝子であるＴＧＦ−β１遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む。配列番号１で表される塩基配列の２９番目〜４７番目の配列が遺伝子発現抑制配列（活性配列；配列番号５０）に相当する。本発明は、この遺伝子発現抑制配列を含むヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法を提供する。

そのようなＲＮＡ分子を製造するための、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランド１）と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランド２）の例は、後述の表１に挙げられている。表１に挙げられている第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランド１）と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランド２）の配列において、Ｐ（プロリン誘導体）を含むリンカーは、上記の他の非ヌクレオチド性リンカー又はヌクレオチド性リンカーなどの任意のリンカーに置換されたものであってもよい。一実施形態では、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、３’末端にウラシル（Ｕ）又はアデニン（Ａ）を有することが好ましく、かつ第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は５’末端にウラシル（Ｕ）又はアデニン（Ａ）を有することが好ましい。

配列番号１で表される塩基配列からなるヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を製造するための特に好ましい第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子のペアとしては、以下：
（１）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカー（Ｌｘ_１）を介して連結されている配列番号７で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１０番目と１１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカー（Ｌｘ_２）を介して連結されている配列番号６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ、
（２）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカー（Ｌｘ_１）を介して連結されている配列番号１９で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１６番目と１７番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカー（Ｌｘ_２）を介して連結されている配列番号１８で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせ、
（３）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカー（Ｌｘ_１）を介して連結されている配列番号２７で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２０番目と２１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカー（Ｌｘ_２）を介して連結されている配列番号２６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（４）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカー（Ｌｘ_１）を介して連結されている配列番号２９で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２１番目と２２番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカー（Ｌｘ_２）を介して連結されている配列番号２８で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせ
（５）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカー（Ｌｘ_１）を介して連結されている配列番号３１で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２２番目と２３番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカー（Ｌｘ_２）を介して連結されている配列番号３０で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ、及び
（６）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカー（Ｌｘ_１）を介して連結されている配列番号３３で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２３番目と２４番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカー（Ｌｘ_２）を介して連結されている配列番号３２で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせ、
が挙げられる。これらの第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、３’末端（Ｘａの３’末端）にＵ又はＡを含む。これらの第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、５’末端（Ｙａ_１の５’末端）にＵ又はＡを含む。

ここで、例えば（１）の第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子について、「２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカー（Ｌｘ_１）を介して連結されている」とは、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子において配列番号１９で表される塩基配列の２４番目のリボヌクレオチド残基（塩基：Ｃ）と２５番目のリボヌクレオチド残基（塩基：Ｇ）が第１のリンカーＬｘ_１を介して結合していることを意味する。なお、本発明における一本鎖オリゴＲＮＡ分子及びヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子に関する「Ｘ番目とＹ番目のリボヌクレオチド残基がＺを介して連結されている」という表現も、これに準じて解釈される。

（１）〜（６）の第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子において、リンカーＬｘ_１及びＬｘ_２は、好ましくは、式（ＶＩ）、例えば式（ＶＩ−１）又は式（ＶＩ−２）で表されるものである。

好ましい実施形態では、（１）〜（６）の第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、Ｌｘ_１及びＬｘ_２として式（ＶＩ）で示されるリンカーを有しており、式（Ｉ）のＸａは式（ＶＩ）中の１位窒素原子側で、Ｘｓは２位炭素原子側でリンカーＬｘ_１と連結し、Ｙｓは式（ＶＩ）中の１位窒素原子側で、Ｙａ_３は２位炭素原子側でリンカーＬｘ_２と連結していてもよい。

本発明は、本発明の方法に従ってヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造のために第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子又は第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子として用いることができる、一本鎖オリゴＲＮＡ分子を提供する。

一実施形態では、標的遺伝子であるＴＧＦ−β１遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造に用いる一本鎖オリゴＲＮＡ分子の例として、下記（ａ）〜（ｌ）が挙げられるが、これらに限定されない：
（ａ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号７で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｂ）１０番目と１１番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号６で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｃ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号１９で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｄ）１６番目と１７番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号１８で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｅ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号２７で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｆ）２０番目と２１番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号２６で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｇ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号２９で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｈ）２１番目と２２番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号２８で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｉ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３１で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｊ）２２番目と２３番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３０で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｋ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３３で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、及び
（ｌ）２３番目と２４番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３２で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子。

好ましい実施形態では、一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ａ）及び（ｂ）；（ｃ）及び（ｄ）；（ｅ）及び（ｆ）；（ｇ）及び（ｈ）；（ｉ）及び（ｊ）；又は（ｋ）及び（ｌ）を組み合わせて、本発明に係るヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法に使用することができる。

別の実施形態として、本発明の方法により製造される、ＧＡＰＤＨ遺伝子、ＬＡＭＡ１遺伝子、又はＬＭＮＡ遺伝子である標的遺伝子に対するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の例が、図１７に示されている。ＧＡＰＤＨ遺伝子に対するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の例は、配列番号５１で表される塩基配列からなり、かつ２２番目と２３番目のヌクレオチド（リボヌクレオチド残基）が第１のリンカー（Ｌｘ_１）を介して連結され、４８番目と４９番目のヌクレオチド（リボヌクレオチド残基）が第２のリンカー（Ｌｘ_２）を介して連結されているＲＮＡ分子である。ＬＡＭＡ１遺伝子に対するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の例は、配列番号５２で表される塩基配列からなり、かつ２４番目と２５番目のヌクレオチド（リボヌクレオチド残基）が第１のリンカー（Ｌｘ_１）を介して連結され、５０番目と５１番目のヌクレオチド（リボヌクレオチド残基）が第２のリンカー（Ｌｘ_２）を介して連結されているＲＮＡ分子である。ＬＡＭＡ１遺伝子に対するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の別の例は、配列番号５３で表される塩基配列からなり、かつ２４番目と３１番目のヌクレオチド（リボヌクレオチド残基）がヌクレオチド性の第１のリンカー（Ｌｘ_１）を介して連結され、５６番目と６１番目のヌクレオチド（リボヌクレオチド残基）がヌクレオチド性の第２のリンカー（Ｌｘ_２）を介して連結されているＲＮＡ分子である。ＬＭＮＡ遺伝子に対するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の例は、配列番号５４で表される塩基配列からなり、かつ２４番目と２５番目のヌクレオチド（リボヌクレオチド残基）が第１のリンカー（Ｌｘ_１）を介して連結され、５０番目と５１番目のヌクレオチド（リボヌクレオチド残基）が第２のリンカー（Ｌｘ_２）を介して連結されているＲＮＡ分子である。標的遺伝子としてのＧＡＰＤＨ遺伝子、ＬＡＭＡ１遺伝子、又はＬＭＮＡ遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列（アンチセンス配列；それぞれ、配列番号５５、５６、５７）の例も、図１７に示されている。本発明は、これらの遺伝子発現抑制配列のいずれかを含むヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法も提供する。

標的遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造に用いる一本鎖オリゴＲＮＡ分子の例として、下記（ｍ）及び（ｎ）が挙げられるが、これに限定されない：
（ｍ）２２番目と２３番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３７で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、及び
（ｎ）２０番目と２１番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３６で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子

好ましい実施形態では、（ｍ）及び（ｎ）の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を組み合わせて、本発明に係るヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法に使用することができる。

標的遺伝子であるＬＡＭＡ１遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造に用いる一本鎖オリゴＲＮＡ分子の例として、下記（ｏ）〜（ｖ）が挙げられるが、これに限定されない：
（ｏ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３９で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｐ）１６番目と１７番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３８で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｑ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号４１で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｒ）２２番目と２３番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号４０で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｓ）２４番目と３１番目のリボヌクレオチド残基がヌクレオチド性リンカーを介して連結されている配列番号４３で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｔ）２１番目と２６番目のリボヌクレオチド残基がヌクレオチド性リンカーを介して連結されている配列番号４２で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｕ）２４番目と３１番目のリボヌクレオチド残基がヌクレオチド性リンカーを介して連結されている配列番号４５で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、及び
（ｖ）２２番目と２７番目のリボヌクレオチド残基がヌクレオチド性リンカーを介して連結されている配列番号４４で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子。

好ましい実施形態では、一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ｏ）及び（ｐ）；（ｑ）及び（ｒ）；（ｓ）及び（ｔ）；又は（ｕ）及び（ｖ）を組み合わせて、本発明に係るヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法に使用することができる。

標的遺伝子であるＬＭＮＡ遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造に用いる一本鎖オリゴＲＮＡ分子の例として、下記（ｗ）〜（ｚ）が挙げられるが、これに限定されない：
（ｗ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号４７で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｘ）２１番目と２２番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号４６で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｙ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号４９で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、及び
（ｚ）２３番目と２４番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号４８で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子。

好ましい実施形態では、一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ｗ）及び（ｘ）；又は（ｙ）及び（ｚ）を組み合わせて、本発明に係るヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法に使用することができる。

一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ａ）〜（ｚ）における「リンカー」は、上記第１のリンカー又は第２のリンカーに相当し、また上述のリンカーを用いることができる。一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ｓ）〜（ｖ）中のヌクレオチド性リンカーは、上述のリンカー（例えば、他のヌクレオチド性リンカー）に置換されてもよい。

本発明では、上記の第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子をライゲーションで連結することにより、ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を製造することができる。上記の第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、ライゲーションの前にアニーリングされる。アニーリング反応は、水性媒体中で第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を混合することにより、引き起こすことができる。本発明の方法において、アニーリング工程は、水性媒体（通常は、水又はバッファー）中で第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を混合し、一定時間（例えば、１〜１５分間）にわたり静置することにより行ってもよいし、静置することなくライゲーション反応に用いてもよい。アニーリング工程では、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の熱変性（例えば、９０℃以上の温度での加熱）を行ってもよいが、行わなくてもよい。熱変性を行う場合、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を含む反応液を、例えば、熱変性温度（例えば、９０℃以上）で加熱し、次いでアニーリング温度（典型的には、一本鎖オリゴＲＮＡ分子のＹａ_１配列に基づくＴｍ値±５℃の範囲の温度、例えば、５５〜６０℃）で一定時間反応させてアニーリングさせた後、降温（例えば４℃まで）させればよい。熱変性を行わずにアニーリングする場合、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を室温（１５〜３５℃）で混合し、一定時間（例えば、１分間〜１時間、又は５〜１５分間）にわたり静置することによりアニーリング工程を実施してもよい。

一実施形態では、本発明のアニーリング工程において、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、反応液中、等モル量で混合してもよい。本発明において「等モル量で混合する」とは、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を、１：１．１〜１．１：１のモル比で混合することを意味する。

アニーリング工程後、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子がアニーリングした二本鎖オリゴＲＮＡを含むアニーリング反応液を、ライゲーションに供する。アニーリング反応液の一部を、ライゲーション反応液に添加してもよいし、アニーリング反応液全量を用いてライゲーション反応液を調製してもよい。ライゲーションは、酵素的なライゲーションであってよい。酵素的なライゲーションは、ＲＮＡリガーゼ、特に、Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼによるライゲーションであってよい。

Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼ（Ｒｎｌ２ファミリーメンバー）は、ＲＮＡニックシーリング活性、すなわち、ＲＮＡのニック（ＲＮＡ二重鎖又はＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖中のニック）をその３’水酸基（３’−ＯＨ）及び５’リン酸基（５’−ＰＯ_４）を連結することによって埋める（シーリングする）リガーゼ活性を有する酵素である（例えば、Nandakumar J. et al., Cell 127, p.71-84 (2006)を参照のこと）。Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼとしては、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２、トリパノソーマ属（例えば、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）及びリーシュマニア属（例えば、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｏｔｏｌａｅ）のＲＮＡ編集リガーゼ（ＲＥＬ）、ビブリオファージＫＶＰ４０Ｒｎｌ２、ポックスウイルスＡｍＥＰＶリガーゼ、バキュロウイルスＡｃＮＰＶリガーゼ、及びバキュロウイルスＸｃＧＶリガーゼ、並びにそれらの変異体又は修飾体等が挙げられるが、これらに限定されない。これらのリガーゼは当業者にはよく知られており、市販されているか又は論文等の教示に従って入手できる。例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから市販されている。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２タンパク質は、バクテリオファージＴ４の遺伝子ｇｐ２４．１によってコードされている。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２の単離は、例えば、Nandakumar J. and Shuman S., (2005) J. Biol. Chem., 280: 23484-23489; Nandakumar J., et al., (2004) J. Biol. Chem., 279: 31337-31347; Nandakumar J. and Shuman S., (2004) Mol. Cell, 16: 211-221等の記載に従って行うことができる。本発明において、「Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼ」は、単離された天然リガーゼに限定されず、ＲＮＡニックシーリング活性を有する限り、組換えタンパク質、突然変異体、欠損体（末端切断形態など）、ペプチド（例えば、Ｈｉｓ、ＨＡ、ｃ−Ｍｙｃ、Ｖ５，ＤＤＤＤＫなどのタグ）又は他のタンパク質との融合体、糖鎖付加（グリコシル化）又は脂質付加タンパク質などの修飾タンパク質等を包含する。

ライゲーション反応液は、ライゲーションに通常用いる成分又はそれを含むバッファーを用いて調製することができる。ライゲーション反応液は、上記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び上記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子に加えて、ＲＮＡのライゲーション反応に用いることができる成分、例えば、Ｔｒｉｓ（トリス）−ＨＣｌ、二価金属イオン、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、及びアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）等を含んでもよい。二価金属イオンとしては、Ｍｇ^２＋、Ｍｎ^２＋等が挙げられるが、これらに限定されない。ライゲーション反応液は、二価金属イオンを、通常、塩の形態で含み、例えば、金属塩化物（ＭｇＣｌ_２、ＭｎＣｌ_２など）を含む。

第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子のライゲーションは、ＲＮＡリガーゼ、又はＲＮＡ同士の末端又はｄｓＲＮＡのニックを連結する活性を有する他の酵素、特にＲｎｌ２ファミリーのリガーゼを用いて行うことができる。ＲＮＡリガーゼとしては、ｄｓＲＮＡリガーゼを用いることができる。ｄｓＲＮＡリガーゼは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）のニックを連結する活性を主として有する酵素である。ｄｓＲＮＡリガーゼとしては、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２が挙げられるが、これに限定されない。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２は、３’→５’ホスホジエステル結合の形成を触媒する。

ライゲーション反応液にＲｎｌ２ファミリーのリガーゼを添加し、アニーリングした第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の二本鎖オリゴＲＮＡ分子を、Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼと共に、ライゲーションが可能な条件下でインキュベートすることにより、二本鎖オリゴＲＮＡ分子を構成する第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端（アンチセンス鎖内）を一本鎖にライゲーションすることができる。

第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子のライゲーションは、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を等モル量で含むライゲーション反応液中で行ってもよい。本発明において「等モル量で含む」とは、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を、１：１．１〜１．１：１のモル比で含むことを意味する。

本発明の方法では、ライゲーションを、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を、それぞれ、１０μＭ以上、４０μＭ以上、１００μＭ以上、１５０μＭ以上、２００μＭ以上、３００μＭ以上、又は５００μＭ以上の濃度で含むライゲーション反応液中で行ってもよい。一実施形態では、ライゲーション反応液は、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を、それぞれ、１０，０００μＭ以下で含んでもよく、例えば１，０００μＭ以下、５００μＭ以下、又は３００μＭ以下の濃度で含んでもよい。一実施形態では、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、ライゲーション反応液中で、例えば、５０〜５００μＭ、１００〜３００μＭ、又は１００〜２５０μＭの濃度で使用してもよい。一実施形態では、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を等モル量で含むライゲーション反応液が、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子をこのような濃度で含む。本発明の方法では、反応液中のＲｎｌ２ファミリーのリガーゼの濃度（又は量）に対して第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子をより多い濃度（又は量）で用いて、ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造効率を増加させることができる。

一実施形態では、ライゲーション反応液は、Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼを０．０１Ｕ／μＬ以上含んでもよく、例えば、０．０１Ｕ／μＬ以上、０．０８Ｕ／μＬ以上、０．２Ｕ／μＬ以上、又は０．３５Ｕ／μＬ以上の濃度で含んでもよい。ライゲーション反応液は、Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼを、例えば、１０Ｕ／μＬ以下、１Ｕ／μＬ以下、又は０．５Ｕ／μＬ以下の濃度で含んでもよい。一実施形態では、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を等モル量で含むライゲーション反応液が、Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼをこのような濃度で含む。

一実施形態では、ライゲーション反応液は、ｐＨ６．５以上であってよく、例えばｐＨ７．０〜９．０、ｐＨ７．４以上、ｐＨ７．４〜８．６、ｐＨ７．５〜８．５、又はｐＨ７．５〜８．０であってよい。第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を等モル量で含むライゲーション反応液が、このようなｐＨを有していてもよい。

一実施形態では、ライゲーション反応液は、１ｍＭ以上、例えば１〜２０ｍＭ、２〜１０ｍＭ、３〜６ｍＭ、又は５ｍＭの二価金属イオンを含む。一実施形態では、ライゲーション反応液は、１ｍＭ以上、例えば１〜２０ｍＭ、２〜１０ｍＭ、３〜６ｍＭ、又は５ｍＭのＭｇ^２＋又はＭｎ^２＋を含み、例えば、当該濃度のＭｇＣｌ_２を含んでもよい。一実施形態では、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を等モル量で含むライゲーション反応液が、二価金属イオンをこのような濃度で含む。

ライゲーション反応液は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの他の添加物質を含んでもよい。ポリエチレングリコールとしては、例えば、ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ２００００などの、ＰＥＧ６０００〜２００００を使用することができる。ライゲーション反応液は、ポリエチレングリコールを、例えば３〜３０ｗ／ｖ％、５〜２０ｗ／ｖ％、５〜１５ｗ／ｖ％又は１０〜３０ｗ／ｖ％の量で含んでもよい。一実施形態では、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を等モル量で含むライゲーション反応液が、ポリエチレングリコールをこのような濃度で含む。一実施形態では、そのようなポリエチレングリコールの添加を、０．４Ｕ／μＬ以下、例えば０．０１〜０．４Ｕ／μＬ、０．０８〜０．４Ｕ／μＬ、又は０．１Ｕ／μＬ以上０．３Ｕ／μＬ未満のＲＮＡリガーゼを含むライゲーション反応液において用いてもよい。

ライゲーション反応液は、通常はＡＴＰを含む。本発明において、ライゲーション反応液は、ＡＴＰを、例えば５ｍＭ以下、２ｍＭ以下、１ｍＭ以下、及び／若しくは０．１ｍＭ以上、又は０．１〜１．５ｍＭの濃度で含む。

一実施形態では、ライゲーション反応液は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを含んでもよく、例えば、１０〜７０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを含んでもよいが、この濃度に限定されない。ライゲーション反応液は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含んでもよく、例えば、０．１〜５ｍＭ ＤＴＴを含んでもよいが、この濃度に限定されない。

本発明において、ライゲーションの反応時間は、本発明に係る第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の二本鎖オリゴＲＮＡのライゲーション反応に適した時間であればよい。ライゲーション反応は、例えば２０分以上又は３０分以上、１時間以上、２時間以上、又は３時間以上の反応時間にわたって行ってもよい。本発明におけるライゲーションの反応時間は、４時間以上、６時間以上、８時間以上、１０時間以上、１２時間以上、２４時間以上、又は４８時間以上であってもよい。本発明において、とりわけ高濃度（例えば、１００μＭ又は２００μＭ以上）の第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を含むライゲーション反応液を用いる場合、より長時間にわたってライゲーション反応を行ってもよい。例えば、ライゲーション反応液が、ｐＨ７．４以上、ｐＨ７．４〜８．６、ｐＨ７．５〜８．５、又はｐＨ７．５〜ｐＨ８．０を示す場合に、より長時間（例えば、４時間以上、１２時間以上、又は２４時間以上）の反応時間を用いてもよい。特に高濃度の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を用いる場合に、そのようなより長時間の反応時間を用いてもよい。

本発明の方法では、ライゲーション工程を、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を段階的に添加しながら行ってもよい。第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子について「段階的に添加する」とは、ライゲーション工程において、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を、複数回にわたり、時間的間隔を空けて反応液に添加することを意味する。例えば、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子をライゲーション反応に適した時間にわたってＲＮＡリガーゼと共にインキュベートした後、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を追加的に添加してさらにライゲーション反応を行う追加反応工程を１回行うか又はそれ以上反復して行うことにより、当該一本鎖ＲＮＡ分子を反応系に段階的に添加しながらライゲーションを行うことができる。追加反応工程は、２回、３回、４回、又はそれ以上繰り返して行ってもよい。この場合、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子のライゲーションのための最初のインキュベーション時間（初期反応時間）は、上記のライゲーション反応時間に従えばよく、例えば、４時間以上、８時間以上、１２時間以上、又は２４時間以上であってよい。第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を追加後のインキュベーション時間（追加反応時間）は、例えば、４時間以上、８時間以上、１２時間以上、又は２４時間以上であってよい。ライゲーションの追加反応工程において、サイクル毎の追加反応時間は、互いに同一であっても異なっていてもよい。ライゲーションの初期反応時間とサイクル毎の追加反応時間は、同一であっても異なっていてもよい。第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を段階的に添加する場合、ライゲーション反応液に最初に添加する一本鎖ＲＮＡ分子の濃度は、上記と同様であってよく、例えば、４０μＭ以上、１００μＭ以上、１５０μＭ以上、又は２００μＭ以上の濃度であってよい。それぞれの追加反応工程においてライゲーション反応液に添加する一本鎖ＲＮＡ分子の量は、最初の反応液中に含まれる一本鎖ＲＮＡ分子の量（モル数）と同じであっても異なっていてもよく、例えば、４ｎｍｏｌ以上、１０ｎｍｏｌ以上、１５ｎｍｏｌ以上、又は２０ｎｍｏｌ以上であってよい。

第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を段階的に添加しながらライゲーションを行うことにより、高濃度の一本鎖ＲＮＡ分子による反応阻害（ライゲーション効率低下）を軽減しながら、反応液中の第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の含量を増加させ、それにより上記ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の収量を増大させることができる。

以上のような反応条件は、任意に組み合わせて用いることができる。例えば、アニーリング工程の温度、アニーリング工程の時間、アニーリングさせる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の混合比、ライゲーション反応液中の第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の量（濃度）、酵素（例えば、Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼ）の種類及び使用量、二価金属イオンの種類及び濃度、ｐＨ、ＡＴＰ濃度、ＰＥＧ等の添加成分及び濃度、反応液中の他のバッファー成分、ライゲーション反応時間、ライゲーション反応中の第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の段階的添加（追加添加）などの上記条件から選択される複数の条件を任意に組み合わせることができる。例えば、上記のライゲーション反応液中の第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の比較的高い濃度（例えば、１００μＭ〜３００μＭ）を、他のそれぞれの条件と組み合わせてもよい。あるいは、酵素（例えば、Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼ）の使用量（例えば、０．０１Ｕ／μＬ〜１Ｕ／μＬ）を、他のそれぞれの条件と組み合わせてもよい。

本発明の方法では、上記のようにライゲーション反応条件を調節することにより、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の使用量に対してより少ない量のＲＮＡリガーゼ、特にＲｎｌ２ファミリーのリガーゼを使用して、ライゲーション産物の収量を相対的に又は絶対的に増加させることができる。本発明の方法では、ライゲーションに使用する、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び／又は第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子のモル数（ｎｍｏｌ）当たり、１０ユニット（Ｕ）以下、５ユニット以下、４ユニット以下、２ユニット以下、１ユニット以下、０．７ユニット以下、０．５ユニット以下、又は０．３ユニット以下、又は０．１ユニット以下の量のＲＮＡリガーゼ、特にＲｎｌ２ファミリーのリガーゼを使用してもよい。一実施形態では、ＲＮＡリガーゼ、特にＲｎｌ２ファミリーのリガーゼの使用量は、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び／又は第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の量（ｎｍｏｌ）当たり、０．００１ユニット（Ｕ）以上、０．０１ユニット以上、０．１ユニット以上、０．２ユニット以上、又は１ユニット以上であってもよい。なお、「第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び／又は第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子のモル数（ｎｍｏｌ）当たり”Ｘ”ユニット以下の量のＲＮＡリガーゼ」とは、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子のモル数又は第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子のモル数（ｎｍｏｌ）のいずれか、又はその両方と比較して、ＲＮＡリガーゼ、特にＲｎｌ２ファミリーのリガーゼの活性量が”Ｘ”ユニット以下であることを意味する。一実施形態では、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の少ない方のモル数（ｎｍｏｌ）を基準としてＲＮＡリガーゼの使用量を定めてもよい。第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子のモル数（ｎｍｏｌ）は、ライゲーション反応系に添加した第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の合計量として算出すればよく、例えば、一本鎖オリゴＲＮＡ分子を段階的に添加する場合には、ライゲーションの初期反応液中の第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子のモル数と、追加反応工程で反応系に添加した第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子のモル数の合計モル数として算出する。

ライゲーション反応の温度は、用いる酵素（Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼ）によって変動し得るが、例えば、１０〜５０℃、１５〜４５℃、２０〜４０℃、２０〜３０℃、又は２３〜２８℃であってよい。例えばＴ４ ＲＮＡリガーゼ２を用いる場合、１０〜５０℃、１５〜４５℃、２０〜４０℃、２０〜３０℃、又は２３〜２８℃であってよい。

ライゲーション工程の完了後、ライゲーション反応液中には、本発明に係る遺伝子発現抑制配列を含むヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子が高い割合で含まれる。

ライゲーション反応液中の本発明に係る遺伝子発現抑制配列を含むヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、当業者に公知の方法により、精製することができる。精製技術としては、逆相クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法、ゲル濾過、カラム精製、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）など、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

国際公開ＷＯ２０１３／０２７８４３記載の方法では、ごく短鎖のうちに伸長反応が停止したことによる短鎖核酸不純物や欠損体などの核酸不純物の生成により、反応液中の目的産物の純度の低下が起こる。一方、本発明の方法の好ましい実施形態では、本発明に係るヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造後のライゲーション反応液中の核酸不純物を低減できる点で、有利である。本発明の方法の好ましい実施形態では、核酸不純物の生成を低減しつつ、汎用型ＲＮＡアミダイトを使用して安定性の高い遺伝子発現抑制性一本鎖ＲＮＡ分子を製造することができる。

本発明の方法により製造されたヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、常法により、生体内又は細胞内に投与することにより、標的遺伝子の発現を抑制するために用いることができる。

さらに本発明は、本発明に係る一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせ（ペア）を含む、標的遺伝子の発現を抑制するためのヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造用のキットにも関する。そのようなキットは、本発明に係る標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法を実施するために、好適に用いることができる。

一実施形態では、キットの例として、以下の（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれかの一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせを含む、ＴＧＦ−β１遺伝子の発現を抑制するためのヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造用のキットが挙げられるが、これらに限定されない：
（ｉ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号７で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１０番目と１１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ、
（ｉｉ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号１９で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１６番目と１７番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号１８で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ、
（ｉｉｉ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号２７で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２０番目と２１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号２６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ、
（ｉｖ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号２９で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２１番目と２２番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号２８で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ、
（ｖ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号３１で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２２番目と２３番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号３０で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ、及び
（ｖｉ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号３３で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２３番目と２４番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号３２で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ。

別の実施形態では、キットの例として、以下の（ｖｉｉ）の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせを含む、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を抑制するためのヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造用のキットが挙げられるが、これに限定されない：
（ｖｉｉ）２２番目と２３番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号３７で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２０番目と２１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号３６で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ。

別の実施形態では、キットの例として、以下の（ｖｉｉｉ）〜（ｘｉ）のいずれかの一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせを含む、ＬＡＭＡ１遺伝子の発現を抑制するためのヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造用のキットが挙げられるが、これに限定されない：
（ｖｉｉｉ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号３９で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１６番目と１７番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号３８で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ、
（ｉｘ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号４１で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２２番目と２３番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号４０で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ、
（ｘ）配列番号４３で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子（２４番目と３１番目のリボヌクレオチド残基がヌクレオチド性リンカーを介して連結されている）と、配列番号４２で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子（２１番目と２６番目のリボヌクレオチド残基がヌクレオチド性リンカーを介して連結されている）との組み合わせ、
（ｘｉ）配列番号４５で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子（２４番目と３１番目のリボヌクレオチド残基がヌクレオチド性リンカーを介して連結されている）と、配列番号４４で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子（２２番目と２７番目のリボヌクレオチド残基がヌクレオチド性リンカーを介して連結されている）との組み合わせ。

別の実施形態では、キットの例として、以下の（ｘｉｉ）〜（ｘｉｉｉ）のいずれかの一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせを含む、ＬＭＮＡ遺伝子の発現を抑制するためのヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造用のキットが挙げられるが、これに限定されない：
（ｘｉｉ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号４７で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２１番目と２２番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号４６で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ、
（ｘｉｉｉ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号４９で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２３番目と２４番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号４８で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ。

以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

［参考例１］プロリンジアミドアミダイトの合成
プロリン誘導体リンカーを含む本発明のヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を生成するために用いるプロリンジアミドアミダイトは、例えば、国際公開ＷＯ２０１３／０２７８４３の記載に従って合成することができる。具体的な合成例を以下に示すが、合成方法はそれにより限定されない。

（１）Ｆｍｏｃ−ヒドロキシアミド−Ｌ−プロリン
Ｆｍｏｃ−Ｌ−プロリンを開始原料とする。Ｆｍｏｃは、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基である。Ｆｍｏｃ−Ｌ−プロリン（１０．００ｇ、２９．６４ｍｍｏｌ）、４−アミノ−１−ブタノール（３．１８ｇ、３５.５６ｍｍｏｌ）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１０．９０ｇ、７０．７２ｍｍｏｌ）を混合し、その混合物に対し、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填する。得られた混合物に、無水アセトニトリル（１４０ｍＬ）を室温で加え、さらに、ジシクロヘキシルカルボジイミド（７．３４ｇ、３５.５６ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（７０ｍＬ）を添加した後、アルゴン雰囲気下、室温で１５時間撹拌する。反応終了後、生成した沈殿をろ別し、回収したろ液について、減圧下で溶媒を留去する。得られた残渣にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水（２００ｍＬ）で洗浄する。そして、有機層を回収し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、ろ過する。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去し、その残渣にジエチルエーテル（２００ｍＬ）を加え、粉末化する。生じた粉末を濾取することにより、無色粉末状物質としてＦｍｏｃ−ヒドロキシアミド−Ｌ−プロリンが得られる。

（２）ＤＭＴｒ−アミド−Ｌ−プロリン
Ｆｍｏｃ−ヒドロキシアミド−Ｌ−プロリン（７．８０ｇ、１９．０９ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（５ｍＬ）と混合し、室温で２回共沸乾燥する。得られた残留物に、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（８．２０ｇ、２４．２０ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（２３ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）及び無水ピリジン（３９ｍＬ）を加える。この混合物を、室温で１時間撹拌した後、メタノール（７．８ｍＬ）を加え、室温で３０分撹拌する。この混合物を、ジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈し、飽和重曹水（１５０ｍＬ）で洗浄後、有機層を分離する。この有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過する。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去する。得られた未精製の残渣に、無水ジメチルホルムアミド（３９ｍＬ）及びピペリジン（１８．７ｍＬ、１８９ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌する。反応終了後、その混合液から、減圧下、室温で、溶媒を留去する。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（商品名Ｗａｋｏｇｅｌ Ｃ−３００、展開溶媒ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＣＨ_３ＯＨ＝９：１、０．０５％ピリジン含有）に供することにより、淡黄色油状物質としてＤＭＴｒ−アミド−Ｌ−プロリンが得られる。ＤＭＴｒは、ジメトキシトリチル基である。

（３）ＤＭＴｒ−ヒドロキシジアミド−Ｌ−プロリン
得られたＤＭＴｒ−アミド−Ｌ−プロリン（６．０１ｇ、１２．２８ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３’−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）（２．８３ｇ、１４．７４ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３．９８ｇ、２９．４７ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（４．４７ｇ、４４．２１ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（１２０ｍＬ）を混合する。この混合液に、さらに、アルゴン雰囲気下、室温で、６−ヒドロキシヘキサン酸（１．９５ｇ、１４．４７ｍｍｏｌ）を加え、その後、アルゴン雰囲気下、室温で、１時間撹拌する。得られた混合液をジクロロメタン（６００ｍＬ）で希釈し、飽和食塩水（８００ｍＬ）で３回洗浄する。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過する。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去する。これにより、淡黄色泡状物質としてＤＭＴｒ−ヒドロキシジアミド−Ｌ−プロリンが得られる。

（４）ＤＭＴｒ−ジアミド−Ｌ−プロリンアミダイト
得られたＤＭＴｒ−ヒドロキシジアミド−Ｌ−プロリン（８．５５ｇ、１４．１８ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルと混合し、室温で３回共沸乾燥する。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（２．９１ｇ、１７．０２ｍｍｏｌ）を加え、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填する。その混合物に対し、無水アセトニトリル（１０ｍＬ）を加え、さらに、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（５.１３ｇ、１７．０２ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（７ｍＬ）を加える。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で２時間撹拌する。得られた混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水（２００ｍＬ）で３回洗浄した後、飽和食塩水（２００ｍＬ）で洗浄する。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過する。得られたろ液について、減圧下に溶媒を留去する。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ヘキサン：酢酸エチル＝１：３、０．０５％ピリジン含有）に供することにより、無色シロップ状物質としてＤＭＴｒ−ジアミド−Ｌ−プロリンアミダイトが得られる。

［実施例１］一本鎖オリゴＲＮＡ分子の合成
以下の実施例では、プロリン誘導体を用いたリンカーとヒトＴＧＦ−β１遺伝子発現抑制配列とを有するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子（以下、「ｓｓＴｂＲＮＡ分子」とも称する。；図２）を、その２つの分割フラグメントである一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランド１及びストランド２）をＲＮＡリガーゼ（Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２）を用いてライゲーションすることにより、作製する（ライゲーション法；図１）。

分割位置の検討のため、ｓｓＴｂＲＮＡ分子中の分割位置を１塩基ずつシフトさせたペアの一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランド１及びストランド２；表１）を下記のようにして作製した。

具体的には、それぞれの一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランド１及びストランド２）を、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＡＫＴＡ ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ−１００；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ又は商品名ｎＳ−８及びｎＳ−８ＩＩ；ジーンデザイン社製）を使用して、３’側から５’側に向かって合成した。ホスホロアミダイト法に基づくＲＮＡ合成には、ＲＮＡアミダイトとして、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ−ＲＮＡホスホロアミダイト（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）又は５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−ＲＮＡホスホロアミダイト（シグマ―アルドリッチ）を用いた。担体としてはポリスチレンビーズ（ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ^（Ｒ） ＨＬ ｒＧ（ｉｂｕ）、又はｒＵ；ＫＩＮＯＶＡＴＥ）又は多孔質ガラス（ＣＰＧ）ビーズ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＵｎｙＬｉｎｋｅｒ Ｓｕｐｐｏｒｔ １０００Å；Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ）を用いた。５’−リン酸化試薬としては３−（４，４'−ジメトキシトリチルオキシ）−２，２−（Ｎ−メチルアミド）］プロピル−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイト（Ｓｏｌｉｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ；ＬＩＮＫ）を用いた。

３’末端からリンカー直前までのＲＮＡ配列（図１中、Ｘａ、Ｙｓ）が合成された後、その５’末端に、リンカー形成用のＤＭＴｒ−ジアミド−Ｌ−プロリンアミダイトを連結し、さらにその５’側に、リンカー直後から５’末端までのＲＮＡ配列（図１中、Ｘｓ；又はＹａ_３、Ｙａ_２、及びＹａ_１）を合成することにより、ストランド１及びストランド２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を作製した。これらの一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、Ｌｘ_１及びＬｘ_２として式（ＶＩ−１）で示されるリンカーを有しており、Ｘａは式（ＶＩ−１）中の１位窒素原子側で、Ｘｓは２位炭素原子側でリンカーＬｘ_１と連結し、Ｙｓは式（ＶＩ−１）中の１位窒素原子側で、Ｙａ_３は２位炭素原子側でリンカーＬｘ_２と連結している。

ストランド２（アンチセンス側）については、ＤＭＴｒ−ＯＦＦの状態で合成を終了し、常法により一本鎖オリゴＲＮＡ分子の切り出しと塩基部及び２’位の脱保護を行った。ストランド１（センス側）については、ＤＭＴｒ−ＯＮの状態で合成を終了した。

［実施例２］ライゲーション法の検討（分割位置）
ｓｓＴｂＲＮＡ分子の２つの分割フラグメントへの分割位置を検討するため、ペアのストランド１及びストランド２（表１）をＲＮＡリガーゼ（Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２）を用いてライゲーションし、そのライゲーション効率を決定した。

具体的には、まず、各ペアのストランド１及びストランド２を注射用水（ＤＷ）に溶解し、等モル量を混合した。この等モル混合液を、９３℃で１分間加熱して熱変性し、次いでアニーリングのため５５℃で１５分静置し、４℃まで降温させた。降温後、反応液を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）（２０℃）と未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ）で分析し、ストランド１及びストランド２のアニーリング状態を調べた。

アニーリング状態の確認のために用いたＲＰ−ＨＰＬＣの条件は以下のとおりである。
・カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８ Ｃｏｌｕｍｎ， １３０Ａ， １．７μｍ， ２．１ｍｍ ｘ １００ｍｍ
・移動相：Ａ） ０．１Ｍ 酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）、Ｂ） アセトニトリル（ＭｅＣＮ）
・分析条件：Ｂ５−３０％、１０分、２０℃、０．４ｍｌ／ｍｉｎ

用いたＮａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ（未変性ＰＡＧＥ）の条件は以下のとおりである。
未変性ＰＡＧＥ；１９％アクリルアミド、１５０Ｖ、９０分間の泳動

このようにして、ストランド１及びストランド２がアニーリングした二本鎖オリゴＲＮＡを得た。ストランド１及びストランド２のほぼ全てがアニーリングすることが示されたペアと、より低い割合でアニーリングしたペアが存在した。

得られた二本鎖オリゴＲＮＡ（ストランド１、ストランド２のそれぞれの最終濃度１０μＭ）を、バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、４００μＭ アデノシン三リン酸（ＡＴＰ））中に含む反応液（ｐＨ７．５）を調製し、２μＬの１０Ｕ／μＬ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；以下同じ）（４０Ｕ／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡ）を添加して反応液量５０μＬとした。この反応液を３７℃で３０分インキュベートした。

酵素反応後、反応液中のライゲーション効率を、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）及び変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｄｅｎａｔｕｒｅｄ ＰＡＧＥ）により確認した。

ライゲーション後ＵＨＰＬＣの条件は以下のとおりである。
・カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８ Ｃｏｌｕｍｎ， １３０Ａ， １．７μｍ， ２．１ｍｍ ｘ １００ｍｍ
・移動相：Ａ） １００ｍＭ ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）−８ｍＭ トリエチルアミン（ＴＥＡ）、Ｂ） メタノール（ＭｅＯＨ）
・分析条件：Ｂ５−４０％、１０分、８０℃、０．４ｍｌ／ｍｉｎ

Ｄｅｎａｔｕｒｅｄ ＰＡＧＥ（変性ＰＡＧＥ）の条件は以下のとおりである。
変性ＰＡＧＥ；１９％アクリルアミド、７．５Ｍ尿素、２００Ｖ、９０分間の泳動後、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）にて染色

ライゲーション効率（ＦＬＰ（％））は、ＵＨＰＬＣ解析結果に基づき、面積百分率法により、以下の式で算出した。

ＦＬＰ（Ｆｕｌｌ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｒｏｄｕｃｔ）（％）
＝（目的のライゲーション生成物のピーク面積）／（クロマトグラム中の総ピーク面積）×１００

結果を図３に示す。分割位置により、ライゲーション効率に大きな差が生じた。ストランド１の３’末端がＵになる分割位置ではライゲーション効率が高くなる傾向が示された。またストランド１の３’末端又はストランド２の５’末端がＡになる分割位置を採用した場合にもライゲーション効率が高くなる傾向が示された。またストランド１の３’末端の塩基とストランド２の５’末端の塩基がそれぞれＵ又はＡになる分割位置を採用した場合、特に優れたライゲーション効率が示された。

なお、それぞれのライゲーション生成物について、ＬＣ−ＭＳ分析を行い、予測される分子量を有することを確認した。ＬＣ−ＭＳ分析には、以下の機器を用いた。
・ＬＣ装置：ＵＨＰＬＣ ＵｌｔｉＭａｔｅ３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）
・ＭＳ装置：Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）

この結果に基づき、ライゲーション法に適したペア０１１、０１６、及び０１８を選抜した。

上記のようにしてペア０１１、０１６、及び０１８のストランド１及びストランド２をアニーリングさせ、ライゲーションにより連結した後の反応液を、上記条件でＲＰ−ＨＰＬＣにより解析したところ、目的物であるｓｓＴｂＲＮＡ分子と遊離ストランド１及びストランド２以外の反応液中の核酸不純物の量はわずかであり、ｓｓＴｂＲＮＡ分子のピーク付近に現れる欠損体（ｓｓＴｂＲＮＡ分子の配列の一部が欠けたもの）の量も少なかった（表２）。一方、ｓｓＴｂＲＮＡ分子の全長をホスホロアミダイト法により固相合成する方法（特許文献２）では、合成後の反応液にｓｓＴｂＲＮＡ分子以外の短鎖核酸不純物（合成が短鎖のうちに停止したＲＮＡ分子など）が比較的多く含まれており、ｓｓＴｂＲＮＡ分子のピーク付近に現れる欠損体も多かった（表２）。本発明の方法では、目的のヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を高純度で製造できることが示された。

表２中、ストランド１、ストランド２、及びｓｓＴｂＲＮＡ分子の値は、クロマトグラムに基づくそれぞれのピーク面積比率を表す。また、ｓｓＴｂＲＮＡ分子のピーク付近の核酸（主としてｓｓＴｂＲＮＡ分子とその欠損体を含む）の相対量として、ｓｓＴｂＲＮＡ分子のピークを含む、ＲＲＴ（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ；ここではｓｓＴｂＲＮＡ分子のピークの保持時間を１とした場合の相対保持時間）＝０．９８〜１．０７の範囲についてピーク面積％の合計値を算出した。なおストランド１とストランド２のピーク保持時間はｓｓＴｂＲＮＡ分子のピークとは十分に離れており、ＲＲＴ＝０．９８〜１．０７の範囲には含まれない。

［実施例３］ライゲーション法の検討（アニーリング温度）
ペア０１１、０１６、及び０１８のストランド１及びストランド２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を用い、２つの条件でアニーリングテストを行った。

まず、熱変性条件では、ストランド１及びストランド２を注射用水に溶解し、それぞれ４０μＭで等モル量を混合した。混合液を９３℃で１分間加熱して熱変性し、次いでアニーリングのため５５℃で１５分静置し、４℃まで降温させた。降温後、反応液を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）（２０℃）と未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ）で分析し、ストランド１及びストランド２のアニーリング状態を調べた。

一方、室温条件では、ストランド１及びストランド２を注射用水に溶解し、それぞれ２００〜４００μＭで等モル量を混合した。混合液を、室温で１０分間静置した。静置後の反応液を、ＲＰ−ＨＰＬＣ（２０℃）と未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、ストランド１及びストランド２のアニーリング状態を調べた。

その結果、熱変性条件と室温条件のいずれにおいても、ＲＰ−ＨＰＬＣではストランド単独のピークは確認されず、アニーリングにより生じた二本鎖のピークが観察された。また未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動でも、熱変性条件と室温条件の両方で、ストランド１及びストランド２のほぼ全ての分子のアニーリングが確認された。

熱変性条件と室温条件で同等の結果が得られたことから、以後、ライゲーション法におけるアニーリングは室温条件で実施した。

なお、以下の実施例では、ストランド１及びストランド２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子のアニーリング状態を、ＲＰ−ＨＰＬＣと未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ）で確認し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより二本鎖ＲＮＡの純度（ＦＬＰ）が９５％以上であることを確認した上で、ライゲーション反応に使用した。

アニーリング状態の確認のために用いたＲＰ−ＨＰＬＣの条件は以下のとおりである。
・カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８ Ｃｏｌｕｍｎ， １３０Å， １．７μｍ， ２．１ｍｍ ｘ １００ｍｍ
・移動相：Ａ） ０．１Ｍ 酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）、Ｂ） アセトニトリル（ＭｅＣＮ）
・分析条件：Ｂ５−３０％、１０分、２０℃、０．４ｍｌ／ｍｉｎ

用いたＮａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ（未変性ＰＡＧＥ）の条件は以下のとおりである。
未変性ＰＡＧＥ；１９％アクリルアミド、１５０Ｖ、９０分間の泳動

［実施例４］ライゲーション法の検討（反応温度及び反応時間）
３種類のペア０１１、０１６、及び０１８（表１；以下、各ペアを単に０１１、０１６、及び０１８とも称する）をそれぞれ用いて、ライゲーション反応の温度と時間について検討を行った。なお０１１、０１６、及び０１８のストランド１及びストランド２の構造を図４に示す。

実施例２と同様に、各ペアのストランド１及びストランド２を注射用水に溶解し、それぞれ等モル量で混合した。この等モル混合液を、室温で１０分間静置し、アニーリングにより二本鎖オリゴＲＮＡを調製した。

得られた二本鎖オリゴＲＮＡ（ストランド１とストランド２の等モル混合液；各ストランドの最終濃度１０μＭ、４０μＭ、又は１００μＭ）を、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の添付バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、４００μＭ ＡＴＰ、ｐＨ７．５（２５℃））中、０．４Ｕ／μＬのＴ４ ＲＮＡリガーゼ２と共に含む反応液１００μＬを、２５℃又は３７℃にてインキュベートし、ライゲーションした。このライゲーション反応に使用した酵素（Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２）の量は、４０Ｕ／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡ、１０Ｕ／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡ、又は４Ｕ／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡである。ライゲーション反応中、０．５時間、２時間、４時間、又は２４時間経過後に２０〜２５μＬのサンプルを採取し、８５℃で２０分加熱して酵素を失活させた。熱失活後の反応液を、変性ＰＡＧＥ、及びＵＨＰＬＣにより解析し、ライゲーション効率（ＦＬＰ（％））を算出した。変性ＰＡＧＥ及びＵＨＰＬＣの条件、並びにＦＬＰ（％）の算出方法は、実施例２と同じである。

その結果、１０μＭ又は４０μＭのオリゴＲＮＡ濃度を用いた場合、ライゲーション効率は反応温度や反応時間で大きく変わることはなく、いずれも非常に高かった。１００μＭのオリゴＲＮＡ濃度を用いた場合、１０μＭ又は４０μＭの場合と比較してライゲーション効率は低下したが、反応時間が長くなるにつれてライゲーション効率は上昇した。また１００μＭのオリゴＲＮＡ濃度では、３７℃よりも２５℃でインキュベートした場合の方が４時間以降のライゲーション効率は高かった。

０１６についての結果を図５に示す。また、１００μＭのオリゴＲＮＡ濃度でのライゲーション反応の結果を図６に示す（Ａ：２５℃、Ｂ：３７℃）。０１１、０１６におけるライゲーション効率が特に高かった。

［実施例５］ライゲーション法の検討（ＡＴＰ濃度）
実施例４と同様に調製した０１１の二本鎖オリゴＲＮＡ（等モル混合液）を用いて、ライゲーション反応液中のＡＴＰ濃度の検討を行った。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の添付バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、４００μＭ ＡＴＰ、ｐＨ７．５（２５℃））に、ＡＴＰを添加してＡＴＰ濃度０．４ｍＭ（添加なし）、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、又は１０ｍＭとした。このように調製したバッファー中、二本鎖オリゴＲＮＡ（各ストランドの最終濃度１０μＭ、２０μＭ、又は４０μＭ）とＴ４ ＲＮＡリガーゼ２を含む反応液２５μＬを、３７℃で３０分インキュベートし、ライゲーションした。ライゲーション反応後、８５℃で２０分加熱して酵素を失活させ、その反応液を、変性ＰＡＧＥ、及びＵＨＰＬＣにより解析し、ライゲーション効率（ＦＬＰ（％））を算出した。変性ＰＡＧＥ及びＵＨＰＬＣの条件、並びにＦＬＰ（％）の算出方法は、実施例２と同じである。

変性ＰＡＧＥの結果を図７に、オリゴＲＮＡ濃度４０μＭで示されたＦＬＰ（％）を図８に示す。ＡＴＰ濃度を増加させると、ライゲーション反応は阻害された。

［実施例６］ライゲーション法の検討（ｐＨ）
実施例４と同様に調製した０１６の二本鎖オリゴＲＮＡ（等モル混合液）を用いて、ライゲーション反応液のｐＨ条件の検討を行った。以下の３種類のバッファーを用いた。
（１） ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．０）、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、４００μＭ ＡＴＰ
（２） ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、４００μＭ ＡＴＰ
（３） ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸（ｐＨ ６．５）、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、４００μＭ ＡＴＰ

０１６の二本鎖オリゴＲＮＡ（各ストランドの最終濃度１０μＭ、１００μＭ、又は２００μＭ）、及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（最終濃度０．４Ｕ／μＬ）を上記のいずれかのバッファー中に含む反応液３０μＬを、２５℃で３０分、４時間、又は２４時間にわたりインキュベートし、ライゲーションした。ライゲーション反応後、８５℃で２０分加熱して酵素を失活させ、その反応液を、変性ＰＡＧＥ、及びＵＨＰＬＣにより解析し、ライゲーション効率（ＦＬＰ（％））を算出した。変性ＰＡＧＥ及びＵＨＰＬＣの条件、並びにＦＬＰ（％）の算出方法は、実施例２と同じである。

結果を図９に示す。ｐＨ７．５の反応液では、高濃度のオリゴＲＮＡを含む場合でも、２４時間反応させたときに９５％以上のライゲーション効率を示した。

［実施例７］ライゲーション法の検討（ｐＨ８．０以上）
実施例４と同様に調製した０１６の二本鎖オリゴＲＮＡ（等モル混合液）を用いて、ライゲーション反応液のｐＨ条件をさらに検討した。以下の４種類のバッファーを用いた。
（１） ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．０）、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、４００μＭ ＡＴＰ
（２） ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、４００μＭ ＡＴＰ
（３） ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、４００μＭ ＡＴＰ、
（４） ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．５）、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、４００μＭ ＡＴＰ

０１６の二本鎖オリゴＲＮＡ（各ストランドの最終濃度１０μＭ又は２００μＭ）、及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（最終濃度０．４Ｕ／μＬ）を、上記のいずれかのバッファー中に含む反応液３０μＬを、２５℃で３０分、４時間、又は２４時間にわたりインキュベートし、ライゲーションした。ライゲーション反応後、８５℃で２０分加熱して酵素を失活させ、その反応液を、変性ＰＡＧＥ、及びＵＨＰＬＣにより解析し、ライゲーション効率（ＦＬＰ（％））を算出した。変性ＰＡＧＥ及びＵＨＰＬＣの条件、並びにＦＬＰ（％）の算出方法は、実施例２と同じである。結果を図１０に示す。ｐＨ７．５以上の反応液は高いライゲーション効率を示した。

［実施例８］ライゲーション法の検討（２価イオン濃度）
実施例４と同様に調製した０１６の二本鎖オリゴＲＮＡ（等モル混合液）を用いて、ライゲーション反応液中のＭｇＣｌ_２濃度の検討を行った。以下の５種類のバッファーを用いた。
（１） ０．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１ｍＭ ＤＴＴ、４００μＭ ＡＴＰ
（２） １ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１ｍＭ ＤＴＴ、４００μＭ ＡＴＰ
（３） ２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１ｍＭ ＤＴＴ、４００μＭ ＡＴＰ
（４） ５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１ｍＭ ＤＴＴ、４００μＭ ＡＴＰ
（５） １０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１ｍＭ ＤＴＴ、４００μＭ ＡＴＰ

０１６の二本鎖オリゴＲＮＡ（各ストランドの最終濃度１０μＭ、１００μＭ、又は２００μＭ）、及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（最終濃度０．４Ｕ／μＬ）を、上記のいずれかのバッファー中に含む反応液３０μＬを、２５℃で３０分、４時間、又は２４時間にわたりインキュベートし、ライゲーションした。ライゲーション反応後、８５℃で２０分加熱して酵素を失活させ、その反応液を、変性ＰＡＧＥ、及びＵＨＰＬＣにより解析し、ライゲーション効率（ＦＬＰ（％））を算出した。変性ＰＡＧＥ及びＵＨＰＬＣの条件、並びにＦＬＰ（％）の算出方法は、実施例２と同じである。

結果を図１１に示す（Ａ：１０μＭ又は１００μＭ オリゴＲＮＡ、Ｂ：１０μＭ又は２００μＭ オリゴＲＮＡ）。二本鎖オリゴＲＮＡ濃度が１００μＭの場合は２ｍＭ以上のＭｇＣｌ_２濃度で、４時間以上の反応により９５％以上のライゲーション効率が示された。オリゴＲＮＡ濃度が２００μＭの場合も、２ｍＭ以上のＭｇＣｌ_２濃度で、２４時間以上の反応により９５％以上のライゲーション効率が示され、さらに、５ｍＭのＭｇＣｌ_２濃度では４時間後にライゲーション効率の特に急激な上昇が認められた。この結果から、より高濃度のオリゴＲＮＡを用いる場合には、ＭｇＣｌ_２濃度を適度に増加させることにより、ライゲーション反応の進行を早めることができることが示された。

［実施例９］酵素ライゲーション法の検討（２価イオン濃度及びｐＨ）
実施例４と同様に調製した０１６の二本鎖オリゴＲＮＡ（等モル混合液）を用いて、ライゲーション反応液中の２価イオン濃度の検討を行った。以下の６種類のバッファーを用いた。
（１） ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１ｍＭ ＤＴＴ、４００μＭ ＡＴＰ、２ｍＭ、５ｍＭ、又は１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２
（２） ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、１ｍＭ ＤＴＴ、４００μＭ ＡＴＰ、２ｍＭ、５ｍＭ、又は１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２

０１６の二本鎖オリゴＲＮＡ（各ストランドの最終濃度１０μＭ又は２００μＭ）、及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（最終濃度０．４Ｕ／μＬ）を、上記のいずれかのバッファー中に含む反応液３０μＬを、２５℃で３０分、４時間、又は２４時間にわたりインキュベートし、ライゲーションした。ライゲーション反応後、８５℃で２０分加熱して酵素を失活させ、その反応液を、変性ＰＡＧＥ、及びＵＨＰＬＣにより解析し、ライゲーション効率（ＦＬＰ（％））を算出した。変性ＰＡＧＥ及びＵＨＰＬＣの条件、並びにＦＬＰ（％）の算出方法は、実施例２と同じである。

結果を図１２に示す（Ａ：ｐＨ７．５、Ｂ：ｐＨ８．０）。ｐＨ７．５とｐＨ８．０のいずれにおいても、４時間後の時点で、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２の場合にライゲーション効率の最も急激な上昇が認められた。

［実施例１０］酵素ライゲーション法の検討（ＰＥＧ添加）
実施例４と同様に調製した０１８の二本鎖オリゴＲＮＡ（等モル混合液）を用いて、ライゲーション反応溶液へのＰＥＧの添加によるライゲーション効率への影響を調べた。

バッファー（５、１０、又は１５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ８０００、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、４００μＭ ＡＴＰ）中に、二本鎖オリゴＲＮＡ（各ストランドの最終濃度２００μＭ）と、０．４Ｕ／μＬ、又は０．２Ｕ／μＬのＴ４ ＲＮＡリガーゼ２を含む反応液３０μＬを、２５℃で３０分、４時間、又は２４時間にわたりインキュベートし、ライゲーションした。このライゲーション反応に使用した酵素（Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２）の量は、２Ｕ／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡ、又は１Ｕ／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡであり、実施例４での酵素量と比較すると、それぞれ１／２０、及び１／４０である。ライゲーション反応後、８５℃で２０分加熱して酵素を失活させた。熱失活後の反応液を、変性ＰＡＧＥ、及びＵＨＰＬＣにより解析し、ライゲーション効率（ＦＬＰ（％））を算出した。変性ＰＡＧＥ及びＵＨＰＬＣの条件、並びにＦＬＰ（％）の算出方法は、実施例２と同じである。

結果を図１３に示す。ＰＥＧの添加によりライゲーション効率が増加したことが示された。

［実施例１１］酵素ライゲーション法における反応タイムコースの解析
実施例４と同様に調製した０１６の二本鎖オリゴＲＮＡ（等モル混合液）を用いて、ライゲーション反応のタイムコースの検討を行った。

二本鎖オリゴＲＮＡ（各ストランドの最終濃度１００μＭ又は２００μＭ）、０．４Ｕ／μＬのＴ４ ＲＮＡリガーゼ２を、バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、４００μＭ ＡＴＰ）中に含む反応液８０μＬを、２５℃でインキュベートし、ライゲーションした。ライゲーション反応中、開始から１、２、３、４、６、９、１２、１５、１８、及び２４時間後にサンプリングし、８５℃で２０分加熱して酵素を失活させた後、ＵＨＰＬＣ解析を行い、ＦＬＰ％を算出した。ＵＨＰＬＣの条件、並びにＦＬＰ（％）の算出方法は、実施例２と同じである。

結果を図１４に示す。オリゴＲＮＡ濃度が１００μＭの場合は反応開始後６時間、２００μＭの場合は反応開始後９時間でライゲーション反応がほぼプラトーに達した。

［実施例１２］酵素ライゲーション法におけるオリゴＲＮＡの追加添加
実施例４と同様に調製した０１６の二本鎖オリゴＲＮＡ（等モル混合液）を用いて、ライゲーション反応相にストランド１及びストランド２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を順次添加することによりｓｓＴｂＲＮＡ分子の収量を増加させる方法を検討した。

まず、二本鎖オリゴＲＮＡを各ストランドの最終濃度１００μＭで含むライゲーション反応液を用いて検討を行った。二本鎖オリゴＲＮＡ（最終濃度１００μＭ； １００μＬの反応液中のトータルのオリゴＲＮＡ量は、ストランド１及びストランド２のそれぞれについて１０ｎｍｏｌ）、及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（０．４Ｕ／μＬ； ４Ｕ／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡ）を、バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、４００μＭ ＡＴＰ）中に含む反応液１００μＬを、４本のチューブに分注し、２５℃でインキュベートすることによりライゲーション反応を開始した。

ライゲーション反応開始から１２時間後、３本のチューブに、０１６の二本鎖オリゴＲＮＡ（反応バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、４００μＭ ＡＴＰ（ｐＨ８．０））中、０１６のストランド１とストランド２の等モル混合液）を各ストランド１０ｎｍｏｌとなる量（１１．１μＬ）で添加し、引き続きインキュベートした。オリゴＲＮＡ追加後の反応液中のオリゴＲＮＡ濃度は１８０μＭ（各ストランドの濃度）、酵素（Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２）の量は０．３６Ｕ／μＬ（２Ｕ／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡ）である。

オリゴＲＮＡ追加の１２時間後、オリゴＲＮＡを追加した３本のうち２本のチューブに、０１６の二本鎖オリゴＲＮＡ（上記と同じ等モル混合液）を各ストランド１０ｎｍｏｌとなる量（１１．１μＬ）でさらに添加し、引き続きインキュベートした。２回目のオリゴＲＮＡ追加後の反応液中のオリゴＲＮＡ濃度は２４５μＭ（各ストランドの濃度）、酵素（Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２）の量は０．３３Ｕ／μＬ（１．３３Ｕ／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡ）である。

その１２時間後、オリゴＲＮＡを２回追加した２本のうち１本のチューブに、０１６の二本鎖オリゴＲＮＡ（上記と同じ等モル混合液）を各ストランド１０ ｎｍｏｌとなる量（１１．１μＬ）で添加し、さらに１２時間インキュベートした。３回目のオリゴＲＮＡ追加後の反応液中のオリゴＲＮＡ濃度は３００μＭ（各ストランドの濃度）、酵素（Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２）の量は０．３Ｕ／μＬ（１Ｕ／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡ）である。

それらのチューブから、１２時間毎に反応液をサンプリングし、８５℃で２０分加熱して酵素を失活させた。得られた反応後のサンプルは以下のとおりである。反応時間はライゲーション反応開始時からの時間を指す。

チューブ１）１００μＭ オリゴＲＮＡ（各ストランドについてトータル１０ｎｍｏｌ；追加なし）、酵素量０．４Ｕ／μＬ、反応温度２５℃、反応時間１２、２４、３６、又は４８時間
チューブ２）１８０μＭ オリゴＲＮＡ（各ストランドについてトータル２０ｎｍｏｌ；１回追加）、酵素量０．３６Ｕ／μＬ、反応温度２５℃、反応時間２４、３６、又は４８時間
チューブ３）２４５μＭ オリゴＲＮＡ（各ストランドについてトータル３０ｎｍｏｌ；２回追加）、酵素量０．３３Ｕ／μＬ、反応温度２５℃、反応時間３６、又は４８時間
チューブ４）３００μＭ オリゴＲＮＡ（各ストランドについてトータル４０ｎｍｏｌ；３回追加）、酵素量０．３Ｕ／μＬ、反応温度２５℃、反応時間４８時間

各サンプルについてＵＨＰＬＣ解析を行い、ＦＬＰ％を算出した。ＵＨＰＬＣの条件、並びにＦＬＰ（％）の算出方法は、実施例２と同じである。結果を表３に示す。

さらに、各サンプルについて、ＦＬＰ％と一本鎖オリゴＲＮＡ分子の添加量から目的産物（ｓｓＴｂＲＮＡ分子）の生成量（ｎｍｏｌ）を算出した。その結果を図１５に示す。

同様の方法で、二本鎖オリゴＲＮＡを各ストランドの最終濃度２００μＭで含むライゲーション反応液を用いて検討を行った。

二本鎖オリゴＲＮＡ（最終濃度２００μＭ； １００μＬの反応液中のトータルのオリゴＲＮＡ量は、ストランド１及びストランド２のそれぞれについて２０ｎｍｏｌ）、及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（０．４Ｕ／μＬ； ４Ｕ／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡ）を、バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、４００μＭ ＡＴＰ（ｐＨ８．０））中に含む反応液１００μＬを、４本のチューブに分注し、２５℃でインキュベートすることによりライゲーション反応を開始した。１２時間後、３本のチューブに、０１６の二本鎖オリゴＲＮＡ（反応バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、４００μＭ ＡＴＰ（ｐＨ８．０））中、０１６のストランド１とストランド２の等モル混合液）を各ストランド２０ ｎｍｏｌとなる量（２２．２μＬ）で添加し、引き続きインキュベートした。その後、オリゴＲＮＡを最終濃度１００μＭで用いた場合と同様に、１２時間毎に３回目までオリゴＲＮＡを追加し、ライゲーション反応を継続した。

それらのチューブから、１２時間毎に反応液をサンプリングし、８５℃で２０分加熱して酵素を失活させた。得られた反応後のサンプルは以下のとおりである。反応時間はライゲーション反応開始時からの時間を指す。

チューブ１）２００μＭ オリゴＲＮＡ（各ストランドについてトータル２０ｎｍｏｌ；追加なし）、酵素量０．４Ｕ／μＬ、反応温度２５℃、反応時間１２、２４、３６、又は４８時間
チューブ２）３２７μＭ オリゴＲＮＡ（各ストランドについてトータル４０ｎｍｏｌ；１回追加）、酵素量０．３６Ｕ／μＬ、反応温度２５℃、反応時間２４、３６、又は４８時間
チューブ３）４１５μＭ オリゴＲＮＡ（各ストランドについてトータル６０ｎｍｏｌ；２回追加）、酵素量０．３３Ｕ／μＬ、反応温度２５℃、反応時間３６、又は４８時間
チューブ４）４８０μＭ オリゴＲＮＡ（各ストランドについてトータル８０ｎｍｏｌ；３回追加）、酵素量０．３Ｕ／μＬ、反応温度２５℃、反応時間４８時間

各サンプルについてＵＨＰＬＣ解析を行い、ＦＬＰ％を算出した。ＵＨＰＬＣの条件、並びにＦＬＰ（％）の算出方法は、実施例２と同じである。結果を表４に示す。

さらに、各サンプルについて、ＦＬＰ％と一本鎖オリゴＲＮＡ分子の添加量から目的産物（ｓｓＴｂＲＮＡ分子）の生成量（ｎｍｏｌ）を算出した。その結果を図１６に示す。

以上の結果から、本発明の方法では、ライゲーション反応相にオリゴＲＮＡを順次追加することにより、ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子（ここでは、ｓｓＴｂＲＮＡ分子）の生成量を増加させることができることが示された。

一般的なＲＮＡリガーゼ使用量（出発オリゴＲＮＡ量１０μＭに対し、酵素量０．４Ｕ／μＬ）では、上記と同様のライゲーション反応条件でＦＬＰ ９０％超のライゲーション効率が得られるものの、１００μＬ反応液当たりのｓｓＴｂＲＮＡ分子の生成量は１ｎｍｏｌ未満である。そのような一般的な場合と比較して、本発明の方法では、９０％以上のＦＬＰを示した効率的な反応条件下で、オリゴＲＮＡ量当たりの酵素使用量を１／３０〜１／４０に削減できることが示された。

［実施例１３］他の標的遺伝子に対するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造
ヒトＴＧＦ−β１遺伝子の代わりにヒトＧＡＰＤＨ遺伝子、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子、又はヒトＬＭＮＡ遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含むヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を、実施例１及び２と同様に２つの分割フラグメントであるストランド１及びストランド２をライゲーションする方法により作製した。リンカーとしては、実施例１及び２と同様のプロリン誘導体、又はヌクレオチド性リンカーを用いた。

ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子、及びその分子中の分割位置を図１７に示す。図１７中、ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子に含まれる各遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列（アンチセンス配列）を枠で示した。また、それぞれのヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の２つの分割フラグメントであるストランド１及びストランド２のペアを表５に示す。表５のストランド１及びストランド２のペアは、ライゲーションする末端の塩基の組み合わせとして、Ｕ−Ｕ、Ａ−Ａ、Ａ−Ｕ、又はＵ−Ａを有するものである。

プロリン誘導体を含むストランド１及びストランド２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の合成は、実施例１と同様の方法により行った。プロリン誘導体の代わりにヌクレオチド性リンカーを含むストランド１及びストランド２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の合成は、ホスホロアミダイト法を用いた固相合成法により行った。

実施例２に記載のようにして、各ペアのストランド１及びストランド２（表５）をアニーリングし、二本鎖オリゴＲＮＡを得た。得られた二本鎖オリゴＲＮＡ（ストランド１、ストランド２のそれぞれの最終濃度１０μＭ）を、バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、４００μＭ アデノシン三リン酸（ＡＴＰ））中に含む反応液（ｐＨ７．５［２５℃］）を調製し、２μＬの１０Ｕ／μＬ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）（４０Ｕ／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡ）を添加して反応液量５０μＬとした。この反応液を３７℃で３０分インキュベートした。

酵素反応後、反応液中のライゲーション効率を、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）及び変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｄｅｎａｔｕｒｅｄ ＰＡＧＥ）により確認した。ライゲーション後ＵＨＰＬＣの条件、及びライゲーション効率（ＦＬＰ（％））の算出方法は、実施例２と同じである。

なお、それぞれのライゲーション生成物について、ＬＣ−ＭＳ分析を行い、予測される分子量を有することを確認した。ＬＣ−ＭＳ分析に用いたＬＣ装置及びＭＳ装置は実施例２で用いたものと同じである。

結果を図１８に示す。表５のストランド１及び２のペアは、いずれも高いライゲーション効率を示した。

［比較例］
実施例２の実験と並行して、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２の代わりにＴ４ ＲＮＡリガーゼを用いて、表１に示したストランド１及びストランド２がアニーリングした二本鎖オリゴＲＮＡをライゲーションし、そのライゲーション効率を決定した。

実施例２に記載のようにして、それぞれのペアのストランド１及びストランド２（表１）をアニーリングし、二本鎖オリゴＲＮＡを得た。得られた二本鎖オリゴＲＮＡ（ストランド１、ストランド２のそれぞれの最終濃度１０μＭ）を、バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５ｍＭ ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭ アデノシン三リン酸（ＡＴＰ））中に含む反応液（ｐＨ７．８）を調製し、０．５μＬの１０Ｕ／μＬ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（１０Ｕ／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡ）を添加して反応液量５０μＬとした。この反応液を３７℃で３０分インキュベートした。

酵素反応後、反応液中のライゲーション効率を、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）及び変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｄｅｎａｔｕｒｅｄ ＰＡＧＥ）により確認した。ライゲーション後ＵＨＰＬＣの条件、及びライゲーション効率（ＦＬＰ（％））の算出方法は、実施例２と同じである。

結果を図１９に示す。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを用いた場合のライゲーション効率は、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２（図３）と比較して顕著に低かった。

本発明は、汎用型アミダイトを使用し、酵素使用量を低減しながら、標的遺伝子に対する発現抑制配列を含むヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の効率的な製造を可能にすることができる。

配列番号１〜５７：合成ＲＮＡ

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (13)

1. 標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法であって、
   第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とをアニーリングするアニーリング工程と、
   前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端とをＲｎｌ２ファミリーのリガーゼによりライゲーションするライゲーション工程とを含み、
   前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、第１のリンカーを介して連結された第１のＲＮＡ部分と第２のＲＮＡ部分を含み、第１のＲＮＡ部分と第２のＲＮＡ部分の一方は他方に対して相補的に結合可能であり、
   前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、第２のリンカーを介して連結された第３のＲＮＡ部分と第４のＲＮＡ部分を含み、第３のＲＮＡ部分と第４のＲＮＡ部分の一方は他方に対して相補的に結合可能であり、
   前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とは５’末端又は３’末端の相補的な配列間で分子間二重鎖を形成可能であり、
   アニーリング工程において前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子が二重鎖を形成するとき、前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端のリボヌクレオチド残基と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端のリボヌクレオチド残基はニックを生成し、また前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端のリボヌクレオチド残基と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端のリボヌクレオチド残基の間には１個以上のリボヌクレオチド残基のギャップが存在し、
   前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とのライゲーションにより生成される配列は、前記標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む、
   ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法。
2. 前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、下記式（Ｉ）で表され、前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、下記式（ＩＩ）で表され、
   ５’−Ｘｓ−Ｌｘ_１−Ｘａ−３’ ・・・式（Ｉ）
   ５’−Ｙａ_１−Ｙａ_２−Ｙａ_３−Ｌｘ_２−Ｙｓ−３’ ・・・式（ＩＩ）
   式（Ｉ）及び式（ＩＩ）中、Ｘｓ、Ｘａ、Ｙａ_１、Ｙａ_２、Ｙａ_３及びＹｓは、１個又はそれ以上のリボヌクレオチド残基を表し、
   Ｌｘ_１及びＬｘ_２は、それぞれ、第１のリンカー及び第２のリンカーを表し、
   Ｙａ_３は、Ｙｓと相補的であり、
   ライゲーション工程で生じるＸａ−Ｙａ_１は、Ｘｓと相補的であり、
   ライゲーション工程で生じるＸａ−Ｙａ_１−Ｙａ_２−Ｙａ_３は、前記標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む、
   請求項１に記載の製造方法。
3. 前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子が３’末端にウラシル（Ｕ）又はアデニン（Ａ）を有し、前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子が５’末端にウラシル（Ｕ）又はアデニン（Ａ）を有する、請求項１又は２に記載の製造方法。
4. 第１のリンカー及び第２のリンカーは、それぞれ独立して、（ｉ）ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド性リンカー、又は（ｉｉ）ヌクレオチド性リンカーである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
5. Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼが、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
6. ｐＨ７．４〜８．６の反応液中で前記ライゲーションが行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
7. ２〜１０ｍＭの二価金属イオンを含む反応液中で前記ライゲーションが行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
8. 第１のリンカー及び第２のリンカーは、それぞれ独立して、下記式（ＶＩ）で表される非ヌクレオチド性リンカーである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法。
   
9. 前記標的遺伝子は、ＴＧＦ−β１遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子、ＬＡＭＡ１遺伝子又はＬＭＮＡ遺伝子である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製造方法。
10. 前記ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、配列番号１で表される塩基配列からなり、２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結され、５０番目と５１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の製造方法。
11. 前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、以下の（１）〜（６）のいずれかである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の製造方法。
    （１）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号７で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１０番目と１１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
    （２）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号１９で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１６番目と１７番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号１８で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
    （３）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号２７で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２０番目と２１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号２６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
    （４）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号２９で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２１番目と２２番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号２８で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
    （５）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号３１で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２２番目と２３番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号３０で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
    （６）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号３３で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２３番目と２４番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号３２で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
12. 以下の（ａ）〜（ｌ）のいずれかである、一本鎖オリゴＲＮＡ分子。
    （ａ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号７で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
    （ｂ）１０番目と１１番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号６で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
    （ｃ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号１９で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
    （ｄ）１６番目と１７番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号１８で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
    （ｅ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号２７で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
    （ｆ）２０番目と２１番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号２６で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
    （ｇ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号２９で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
    （ｈ）２１番目と２２番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号２８で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
    （ｉ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３１で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
    （ｊ）２２番目と２３番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３０で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
    （ｋ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３３で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
    （ｌ）２３番目と２４番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３２で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
13. 以下の（１）〜（６）のいずれかの一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせを含む、ＴＧＦ−β１遺伝子の発現を抑制するためのヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造用のキット。
    （１）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号７で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１０番目と１１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
    （２）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号１９で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１６番目と１７番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号１８で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
    （３）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号２７で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２０番目と２１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号２６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
    （４）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号２９で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２１番目と２２番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号２８で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
    （５）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号３１で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２２番目と２３番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号３０で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
    （６）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号３３で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２３番目と２４番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号３２で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ