JPWO2009102081A1 - 環状1本鎖核酸複合体およびその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
しかしながら、2本鎖RNAは、生体に投与すると細胞内のヌクレアーゼで容易に分解されてしまい、生体内で不安定であるという問題があった。
2本鎖RNAの生体内での安定性を高めるため、非天然ヌクレオシドを導入したRNA鎖が開発された。しかし、安定性は高くなるが生物活性は下がってしまうことが問題となっていた。さらに、非天然ヌクレオシドが生体に与える毒性も未知であり、医薬品への応用は難しかった。
2本鎖RNAの生体内での安定性を向上させる別のアプローチから、環状1本鎖RNA(ダンベル型RNA)が開発された。ダンベル型RNAは2本鎖RNAの両端がループ状に閉じているために、RNA末端がなくなり、細胞内においてダイサーなどの特異的酵素以外は、分解酵素エキソヌクレアーゼなどの基質となりにくく、分解されにくいという特徴を持つ。そのようなダンベル型RNAとして、例えば非特許文献1に記載されているダンベル型RNAが挙げられる。該ダンベル型RNAは2本鎖RNAと比較してヒト血清を加えたバッファー中で安定であることが非特許文献1に記載されている。
また、特許文献1には、抗インフルエンザウイルス剤としてのダンベル型RNA−DNAキメラ核酸が記載されている。該ダンベル型核酸は、インフルエンザウイルス遺伝子を直接攻撃するアンチセンス法に用いられるものである。該ダンベル型核酸のステム部分はDNAとそれに相補的なRNAが対合してなり、ループ部分はオリゴヌクレオチドまたはエチレングリコール化合物残基からなる。該ダンベル型核酸が細胞内に入ると、リボヌクレアーゼHにより分解または切断されて、アンチセンスDNA部分が遊離すると考えられる。
本発明者らは、環状1本鎖核酸複合体のステム部分を連結する2つのループ部分を、ポリアルキレングリコール、DNA、DNAとRNAのキメラ、これらの誘導体、またはこれらの組合せにすることにより、生体内安定性が向上し、かつ細胞内でRNA干渉作用を示し、ならびに環状1本鎖核酸複合体を簡易に効率よく製造できること等を見出し、本発明を完成した。
本発明の特徴は要約すると以下の通りである。
[1]センス鎖RNA配列と、センス鎖RNA配列に相補的なアンチセンス鎖RNA配列と、センス鎖とアンチセンス鎖の間に両鎖を結合する同じかまたは異なる2つのループ部分を含む環状1本鎖核酸複合体であって、センス鎖とアンチセンス鎖が対合してステムを形成し、ループ部分がポリアルキレングリコール、DNA、DNAとRNAのキメラ、これらの誘導体、およびこれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする、環状1本鎖核酸複合体。
[2]細胞内でRNA干渉作用を有する2本鎖RNAに変換される、[1]に記載の環状1本鎖核酸複合体。
[3]ステムを形成するRNA配列が、標的RNA配列と80〜100%の同一性を有する、[1]または[2]に記載の環状1本鎖核酸複合体。
[4]ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、[1]〜[3]のいずれかに記載の環状1本鎖核酸複合体。
[5]ステムの長さが19〜31塩基である、[1]〜[4]のいずれかに記載の環状1本鎖核酸複合体。
[6][1]〜[5]のいずれかに記載の環状1本鎖核酸複合体の製造方法であって、以下の工程:
(1)センス鎖の一部とループ部分とアンチセンス鎖の一部を含む線状1本鎖核酸複合体、およびセンス鎖の残部とループ部分とアンチセンス鎖の残部を含む線状1本鎖核酸複合体を作製する工程、および
(2)センス鎖の一部とセンス鎖の残部、およびアンチセンス鎖の一部とアンチセンス鎖の残部を連結する工程
を含む製造方法。
[7][1]〜[5]のいずれかに記載の環状1本鎖核酸複合体の製造方法であって、以下の工程:
(1)センス鎖とアンチセンス鎖を作製する工程、および
(2)センス鎖とアンチセンス鎖で形成された2本鎖RNAの両端に、ループ部分を連結する工程
を含む製造方法。
[8][1]〜[5]のいずれかに記載の環状1本鎖核酸複合体を真核細胞に導入し、標的RNAを不能にしてタンパク質への翻訳を阻害することを含む、該タンパク質をコードする遺伝子の発現をin vitroで抑制する方法。
[9][1]〜[5]のいずれかに記載の環状1本鎖核酸複合体を非ヒト動物、植物、またはそれらの細胞に導入し、標的RNAを不能にしてタンパク質への翻訳を阻害することを含む、該タンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する方法。
[10][1]〜[5]のいずれかに記載の環状1本鎖核酸複合体を有効成分として含む、医薬組成物。
本明細書において「環状1本鎖核酸複合体」は、「ダンベル型核酸複合体」ともいう。「ダンベル型核酸複合体」とは、センス鎖とアンチセンス鎖が相補的に対合してステムを形成し、ステムの両端のそれぞれに、センス鎖とアンチセンス鎖を連結するループが形成され、環状1本鎖核酸複合体の全体の形状としてダンベル状になっているものをいう。また、「核酸複合体」とは、DNAとRNAの複合体、ポリアルキレングリコールとRNAの複合体、またはDNAとポリアルキレングリコールとRNAの複合体をいう。
本明細書において「DNAとRNAのキメラ」とは、DNA配列とRNA配列の任意の組合せからなるハイブリッドをいい、その組合せはどのような形でもよく、例えば、DNAが連続しているブロックとRNAが連続しているブロックが連結されていてもよく、双方の複数のブロックがランダムに混ざって連結されていてもよく、DNAとRNAが1つずつ交互に連結されてもよい。
本明細書において「標的RNA」とは、RNA干渉法において発現を抑制したい遺伝子のmRNAまたはその前駆体RNAをいう。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2008−035310号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
図2は、本発明のダンベル型核酸複合体の製造方法の概略を示す。
図3は、本発明のダンベル型核酸複合体の製造方法の概略を示す。
図4は、本発明のダンベル型核酸複合体等の電気泳動像を示す。
図5は、本発明のダンベル型核酸複合体および2本鎖RNAの構造を示す。
図6は、血清を用いた生物学的安定性試験における本発明のダンベル型核酸複合体、ダンベル型RNAおよび2本鎖RNAの電気泳動像を示す。
図7は、血清を用いた生物学的安定性試験における本発明のダンベル型核酸複合体、ダンベル型RNAおよび2本鎖RNAの電気泳動像のバンドによる定量結果の経時的変化(残存率)を示す。
図8は、細胞抽出液を用いた生物学的安定性試験における本発明のダンベル型核酸複合体、ダンベル型RNAおよび2本鎖RNAの電気泳動像を示す。
図9は、細胞抽出液を用いた生物学的安定性試験における本発明のダンベル型核酸複合体、ダンベル型RNAおよび2本鎖RNAの電気泳動像のバンドによる定量結果の経時的変化(残存率)を示す。
図10は、哺乳動物培養細胞における本発明のダンベル型核酸複合体および2本鎖RNAのRNA干渉効果を示す。
本発明の環状1本鎖核酸複合体(以下「ダンベル型核酸複合体」ともいう)は、RNA干渉作用を提供し得るものである。RNA干渉作用は、細胞内または生体内で、標的RNAと相補的な配列を持つ小RNA分子が標的RNAに結合し、それを分解するか、または翻訳を抑制する作用である。
本発明のダンベル型核酸複合体は、センス鎖RNA配列と、センス鎖RNA配列に実質的に相補的なアンチセンス鎖RNA配列と、センス鎖とアンチセンス鎖の間に両鎖を結合する同じかまたは異なる2つのループ部分を含む環状1本鎖核酸複合体である。
アンチセンス鎖RNA配列は、センス鎖RNA配列に実質的に相補的であって、RNA干渉において標的RNAと特異的に結合する配列である。センス鎖とアンチセンス鎖は対合してステムを形成する。センス鎖RNA配列とアンチセンス鎖RNA配列は、具体的には、標的RNA配列およびそれに相補的な配列、あるいは標的RNA配列と80〜100%の同一性を有するRNA配列およびそれに相補的な配列を有する。ここで「同一性」は、2つの塩基配列にギャップを導入するかまたはギャップを導入しないで整列したときに、総塩基数に対する同一塩基数の割合(%)を表す。ステムの長さは、RNA干渉作用を付与する限り、特に限定されないが、例えば19〜31塩基対、好ましくは20〜25塩基対、より好ましくは20〜24塩基対、さらに好ましくは20〜23塩基対からなる。
センス鎖および/またはアンチセンス鎖のRNAは、修飾ヌクレオシドを含む誘導体でもよい。修飾ヌクレシドは、塩基および糖部分の修飾体であり、アルキル化体、アルコキシル化体、イノシン、リボースの2’−O−アルキルまたは2’−ハロゲン化体、2’,4’−BNA化体などが挙げられる。また、ヌクレオチドのリン酸基部が修飾されてもよく、リン酸基部の修飾体として、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド、メチルホスホネートなどが挙げられる。また、センス鎖および/またはアンチセンス鎖の塩基配列は、RNA干渉作用を有する限り、RNAのみならず、RNAとDNAのキメラであってもよい。さらに、センス鎖に、1〜6個の塩基のミスマッチ、好ましくは1〜3個の塩基のミスマッチ、さらに好ましくは1〜2個の塩基のミスマッチが含まれていてもよい。塩基のミスマッチが含まれると、2本鎖RNAがヘリケースにより1本鎖RNAに解離しやすくなると考えられる(Schwarz,D.S.,et al.Asymmetry in the Assembly of the RNAi Enzyme Complex.Cell 115,199−208(2003))。ループ部分は、ステムの両端に位置し、センス鎖の5’末端のRNAとアンチセンス鎖の3’末端のRNAを連結し、またセンス鎖の3’末端のRNAとアンチセンス鎖のRNAの5’末端を連結する。ループ部分は、ポリアルキレングリコール、DNA、DNAとRNAのキメラ、これらの誘導体、またはこれらの組合せで構成される。これにより、例えば2本鎖RNA(siRNA)、ループ部分がRNAのみからなる環状1本鎖RNA、またはヘアピン構造を有する2本鎖RNA(shRNA)と比較して、より細胞内または生体内安定性が向上し、RNA干渉においてより持続的および徐放的な効果を発揮することができる。ループの長さは特に限定されず、ステムの両端を連結できる長さであればよい。たとえループが長くてもダイサーによるRNAの切断は阻害されない。
ループ部分のポリアルキレングリコールは特に限定されないが、生体安全性が高いことが好ましい。これらは、そのアルキレン部分が、ハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アシル、アルキルチオなどの非限定的置換基で置換されていてもよい誘導体を含む。またモノマーの単位の炭素数が1〜4のものが好ましいが、炭素数5以上のもの、例えば5〜8のものでもよい。ポリアルキレングリコールとしては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、ポリオキシエチレンオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンオキシブチレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシブチレングリコールなどが挙げられる。本発明においてはポリエチレングリコールが特に好ましい。
ポリエチレングリコールは、式:−O−[(CH2)2−O−]n−(式中、nは特に限定されないが、好ましくはn=1〜1000、より好ましくはn=2〜50、さらに好ましくは3〜20、特に好ましくは3〜10である。)で表される。ポリアルキレングリコールの一方または両方の水酸基はリン酸エステル化されていてもよい。
ループ部分のDNA、またはDNAとRNAのキメラは、ループの長さとして1塩基以上であればよく、好ましくは2〜20塩基、より好ましくは6〜12塩基、さらに好ましくは7〜11である。ループ部分の核酸配列は、実質的に相補鎖を形成しない配列を含んでいれば特に限定されない。相補鎖を形成しないDNA配列の例としては、GATTAGTCACT(配列番号14)、AGAGAACTT(配列番号15)、TTCAAGAGA(配列番号16)、TGTGCTGTC(配列番号17)などが挙げられる。該DNA配列の一部は、各DNAに対応するRNAに置換されていてもよい。DNAまたはRNAは修飾ヌクレオシドを含む誘導体でもよい。修飾ヌクレオシドは、塩基および糖部分の修飾体であり、アルキル化体、アルコキシル化体、イノシン、リボースの2’−O−アルキルまたは2’−ハロゲン化体、2’,4’−BNA化体などが挙げられる。また、ヌクレオチドのリン酸基部が修飾されてもよく、リン酸基部の修飾体として、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド、メチルホスホネートなどが挙げられる。さらに、ループ部分の核酸配列中の任意の位置にポリアルキレングリコールが含まれていてもよい。さらにまた、ループ部分にペプチドが含まれてもよい。
2.環状1本鎖核酸複合体の製造方法
本発明の環状1本鎖核酸複合体(ダンベル型核酸複合体)は、以下の工程:
(1)センス鎖の一部とループ部分とアンチセンス鎖の一部を含む線状1本鎖核酸複合体、およびセンス鎖の残部とループ部分とアンチセンス鎖の残部を含む線状1本鎖核酸複合体を作製する工程、および
(2)センス鎖の一部とセンス鎖の残部、およびアンチセンス鎖の一部とアンチセンス鎖の残部を連結する工程、
を含む製造方法で作製することができる。
あるいは、以下の工程:
(1)センス鎖とアンチセンス鎖を作製する工程、および
(2)センス鎖とアンチセンス鎖で形成された2本鎖RNAの両端に、ループ部分を連結する工程、
を含む製造方法で作製することができる。
ダンベル型核酸複合体のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、標的となる遺伝子の発現を抑制できるように、標的遺伝子の塩基配列から設計する。標的遺伝子は、一般に真核生物由来の遺伝子であり、好ましくは動物や植物由来の遺伝子である。設計は、複数のセンス鎖およびアンチセンス鎖を作製してそれぞれ抑制効率を確認してもよいが、例えばsiRNA設計用アルゴリズムなどによる設計を利用してもよい(参照文献:J.A.Jaeger et al.,Methods in Enzymology(1989)183:281−306;D.H.Mathews et al.,J.Mol.Biol.(1999)288:911−940)。設計時には、標的遺伝子と類似した配列を持つ標的遺伝子以外の遺伝子の発現を抑制すること(Off target効果)がないようにすることが望ましい。また、ダンベル型核酸複合体が細胞内または生体内でダイサーにより切断されたときに、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む生じた2本鎖RNAの3’末端が、1〜3個のU(ウラシル)の突出末端となるように配列を設計してもよい。センス鎖およびアンチセンス鎖の長さは特に限定されないが、例えば19〜31塩基、好ましくは20〜25塩基、より好ましくは20〜24塩基、さらに好ましくは20〜23塩基の長さで設計する。具体的な標的遺伝子は特に限定されないが、例えば過剰発現される疾患関連遺伝子、ウイルス性遺伝子など、具体的には、白血病のabl/bcr遺伝子、加齢性黄斑変性症のVEGF遺伝子、肝炎のHCV遺伝子などが挙げられる。
ループ部分は、ポリアルキレングリコール、DNA、DNAとRNAのキメラ、これらの誘導体、あるいはこれらの組合せとし、ループ部分の塩基配列は、上記に示したように、実質的に相補鎖を形成しない配列を含む。
センス鎖の一部とループ部分とアンチセンス鎖の一部を含む線状1本鎖核酸複合体、およびセンス鎖の残部とループ部分とアンチセンス鎖の残部を含む線状1本鎖核酸複合体の作製は、市販の核酸合成機および試薬を用いて行うことができる。合成した線状1本鎖核酸複合体の5’末端をリン酸化する。これらの線状1本鎖核酸複合体を混合すると、センス鎖とアンチセンス鎖が部分的に対合し、かつセンス鎖の一部とセンス鎖の残部の間およびアンチセンス鎖の一部とアンチセンス鎖の残部の間に切れ目があるステムが形成される。この切れ目を酵素的または化学的に連結し、ダンベル型核酸複合体を製造する。酵素的に連結するには、リガーゼを用いればよく、リガーゼはT4 RNAリガーゼが好ましい。化学的に連結するには、縮合剤を用いればよく、縮合剤はジシクロヘキシルイミドなどが好ましく、リン酸エステルとして連結することができる。
あるいは、センス鎖とアンチセンス鎖をそれぞれ合成し、センス鎖とアンチセンス鎖を混合して2本鎖RNAを形成させ、この2本鎖RNAの両端にループ部分を連結して、ダンベル型核酸複合体を製造してもよい。ループ部分がポリアルキレングリコールを含む場合は、核酸の5’末端をリン酸化し、核酸にポリアルキレングリコールをリン酸化エステルにより連結するか、ポリアルキレングリコールの両端をリン酸エステル化し、核酸の3’末端および5’末端と連結することができる。あるいは、ループ部分がDNA、DNAとRNAのキメラの場合は、合成したセンス鎖、アンチセンス鎖およびループ部分の5’末端をリン酸化し、ループ部分と2本鎖RNAの各末端を上記酵素的または化学的に連結することができる。
以下、図2を参照しながら、ダンベル型核酸複合体(Db−23PEG;23塩基対からなるステムとポリエチレングリコールを含むループ部分からなるダンベル型核酸複合体)の製造方法の例を具体的に説明する。図中、ステムにおいて上段のRNA鎖はセンス鎖であり、下段のRNA鎖はアンチセンス鎖である。
(1)センス鎖RNA配列の任意の切れ目部位から5’末端まで、例えばホスホロアミダイト法に基づく核酸合成機でRNA鎖を合成し、5’末端をリン酸化する。図2でいえば、3’が付されているセンス鎖の端(3’AAC・・・)からセンス鎖の5’末端(・・・UGA)まで合成する。
次に、ポリエチレングリコールを含むループ部分を合成する。ポリエチレングリコールは特に限定されないが、例えば分子量約60〜60000、より好ましくは約120〜3000、さらに好ましくは約180〜1200、特に好ましくは約180〜600のポリエチレングリコールを用いることが好ましい。また、核酸合成機で用いられるスペーサー用の試薬を用いることが好ましい。図2でいえば、センス鎖の5’末端に、A(アデニン)、ポリエチレングリコールのリンカー、U(ウラシル)を含むループ部分を結合する。
さらに、アンチセンス鎖の3’末端から任意の切れ目部位までRNA鎖を合成する。図2でいえば、アンチセンス鎖の3’末端(UCA)から5’が付されているアンチセンス鎖の端まで合成し、リン酸化試薬で5’末端をリン酸化する。この工程により、線状1本鎖核酸複合体が作製できる。
なお、この工程で作製されるセンス鎖とアンチセンス鎖の塩基の数は、少なくとも1つの塩基の対合が生じるように、同じでないことが好ましい。塩基の数の違いは、1〜25塩基であることがより好ましく、5〜15塩基であることが更に好ましい。
(2)上記(1)で合成したアンチセンス鎖配列の残部のRNA鎖を合成する。図2でいえば、3’が付されているアンチセンス鎖の端(3’GCG・・・)からアンチセンス鎖の5’末端(・・・GGA)まで合成する。
次に、ポリエチレングリコールを含むループ部分を合成する。図2でいえば、アンチセンス鎖の5’末端に、A(アデニン)、ポリエチレングリコールのリンカー、U(ウラシル)を含むループ部分を結合する。
さらに、センス鎖の残部のRNA鎖を合成する。図2でいえば、アンチセンス鎖RNAの3’末端(UCC)から5’が付されているアンチセンス鎖の端まで合成し、リン酸化試薬で5’末端をリン酸化する。この工程により、線状1本鎖核酸複合体が作製できる。
(3)上記(1)で作製した線状1本鎖核酸複合体と、(2)で作製した線状1本鎖核酸複合体を混合する。(1)で作製した線状1本鎖核酸複合体に含まれるセンス鎖と、(2)で作製した線状1本鎖核酸複合体に含まれるアンチセンス鎖が対合して、ステムを形成し、図2に示すように、ステムに2つの切れ目があるダンベル型核酸複合体が形成される。
縮合剤またはRNAリガーゼ、例えばT4 RNAリガーゼを添加して、この2つの切れ目を連結する。即ち、(1)で作製した線状1本鎖核酸複合体のセンス鎖の一部と(2)で作製した線状1本鎖核酸複合体のセンス鎖の残部、および、(1)で作製した線状1本鎖核酸複合体のアンチセンス鎖の一部と(2)で作製した線状1本鎖核酸複合体のアンチセンス鎖の残部を連結する。図2でいえば、センス鎖の3’が付されているAと5’が付されているCを連結し、アンチセンス鎖の5’が付されているCと3’が付されているGを連結する。
リガーゼの反応条件は、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、BSAなどを含む緩衝液中で低温〜室温下で約20時間のインキュベーションが好ましい。ポリエチレングリコールを加えることによりダンベル型核酸複合体の収率が向上し、BSAを加えることによりリガーゼの失活を防ぐことができる。ダンベル型核酸複合体の抽出は、特に限定されないが、クロロホルムを用いてダンベル型核酸複合体を抽出し、反応液に含まれる余分なポリエチレングリコールを除去することが好ましい。
DNAまたはDNA−RNAキメラのループ部分を有するダンベル型核酸複合体も、上記(1)〜(3)と同様にして作製し、回収、精製することができる。そのようなダンベル型核酸複合体(Db−23D7;23塩基対からなるステムとDNAを含むループ部分からなるダンベル型核酸複合体)の作製の例を図3に示す。
作製したダンベル型核酸複合体は、高速液体クロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、エキソヌクレアーゼによる分解を調べる試験等で、ダンベル型核酸複合体が作製されたかどうかを確認し、回収、精製することが好ましい。上記方法で作製したダンベル型核酸複合体を変性ポリアクリルアミドゲルで分析した例を図4に示す。図4の短い矢印は、T4 RNAリガーゼで1ヶ所のみ連結した生成物のバンドを示し、長い矢印は、2ヶ所とも連結した目的生成物(ダンベル型核酸複合体)のバンドを示す。破線の矢印は、ダンベル型核酸複合体の原料として用いた、上記(1)および(2)で合成した線状1本鎖核酸複合体のバンドを示す。
3.遺伝子の発現を抑制する方法
本発明のダンベル型核酸複合体を真核細胞または真核生物に導入し、標的RNAを不能にしてタンパク質への翻訳を阻害することができる。該細胞は、ヒト細胞を含む動物細胞、植物細胞などを含む。本発明のダンベル型核酸複合体は、生体内安定性(例えば血中安定性)が高く、持続的、徐放的に効果を発揮することができる。また、生体に対する安全性も高いと考えられる。
in vitroでRNA干渉法を行う場合、ダンベル型核酸複合体を、例えばエレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法などで細胞に導入することができる。
in vivoでRNA干渉法を行う場合、ダンベル型核酸複合体を、例えば局所投与、静脈内投与、遺伝子銃を用いる方法などで、動物または植物に導入することができる。
細胞内に導入されたダンベル型核酸複合体は、細胞内のダイサーにより切断を受け、RNA干渉作用のある2本鎖RNA(siRNA)が細胞内で生じる(図1)。siRNAが1本鎖となり、RNA誘導サイレンシング複合体(RNA induced silencing complex(RISC))を形成し、1本鎖RNAと相補的な配列の標的mRNAを認識して、mRNAを分解し、結果として標的遺伝子の発現が抑制される。
4.環状1本鎖核酸複合体を含む医薬組成物
本発明の医薬組成物は、環状1本鎖核酸複合体(ダンベル型核酸複合体)を有効成分として含む。ダンベル型核酸複合体の医薬組成物への配合量は、組成物の全量に対して、例えば0.1重量%、0.5重量%、1重量%、3重量%、5重量%、10重量%、20重量%、30重量%、40重量%、50重量%、60重量%、70重量%、80重量%、90重量%、100重量%であるが、これらに限定されない。
本発明の医薬組成物の剤形としては、例えば液体製剤(溶液剤、懸濁剤、乳濁剤など)、固体製剤(用時調製の凍結乾燥剤など)、リポソーム(カチオン性リポソームが好ましい)封入製剤などが挙げられる。投与は全身投与、局所投与を問わない。全身投与に関しては、最近、マウスとハムスターに合成siRNAを全身投与したところ、標的遺伝子の効果的なサイレンシングが起き、しかも内在性マイクロRNA(miRNA)の量や活性に影響が認められなかったことが確認されている(John,M.et al.Effective RNAi−mediated gene silencing without interruption of the endogenous microRNA pathway.Nature 449,745−747(2007))。投与経路としては、非経口投与が好ましく、例えば皮内または皮下投与、直腸内投与、経粘膜投与、静脈内投与などが挙げられる。
本発明の医薬組成物は、製剤化、剤形等に応じて、製薬上許容される賦形剤または希釈剤(生理食塩水、滅菌水、リンゲル液など)、添加剤、例えば医薬上許容される緩衝剤、等張化剤、安定化剤などを含めてもよい。
また、本発明の医薬組成物の投与量は、患者の性別、体重、年齢、重篤度、症状などに応じて変更し得る。
本発明の医薬組成物の適用は特に限定されないが、癌、遺伝子疾患、ウイルス等による感染症などの治療が挙げられる。例えば癌の治療では、本発明の医薬組成物を用いて癌細胞で特異的に発現する遺伝子やタンパク質の機能を抑制することができる。
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
23塩基対のステムを有する本発明のダンベル型核酸複合体(配列番号7〜13)、および本発明のダンベル型核酸複合体の対照として2本鎖RNA(siRNA、配列番号5および6)を設計した(図5)。図中、対照のsiRNAは、siRNA−1と記載する。また、設計された各ダンベル型の名前において、「Db」はダンベル型を意味し、「23」はダンベル型核酸複合体が23塩基対のステムを有することを意味し、「PEG」はループ部分にポリエチレングリコールを含むことを意味する。「PEGuu」はループ部分にポリエチレングリコールを含み、かつダイサーで切断されたときに生じる2本鎖RNAにUU(連続した2つのウラシル)の突出末端を形成するRNAを含むことを意味し、「D3」、「D5」および「D7」は、ループ部分にDNAをそれぞれ3つ、5つ、7つ含むことを意味する。対照のsiRNA−1と各ダンベル型核酸複合体のステムにおいて、上段の配列はセンス鎖配列、下段の配列はアンチセンス鎖を示す。太字で示された配列は、標的RNAに対する相補配列を示す。四角で囲まれた部分は、対照のsiRNA−1と各ダンベル型核酸複合体の全てに共通な2本鎖RNA部分を示す。ダンベル型核酸複合体のループ部分のA(アデニン)、C(シトシン)、G(グアニン)およびT(チミン)は、2’−デオキシヌクレオチドであることを示す。ダンベル型核酸複合体のループ部分に示された太線は、ポリエチレングリコール(PEG)のリンカーを示す。ここでポリエチレングリコールの式:−[(CH2)2−O]n−のnは4である。また、比較として、Db−23D3のループ部分のDNAが対応するRNAに置換されている以外は同じ配列を持つ、RNAのみからなるダンベル型RNA(Db−23)を設計した。
なお、本実施例では、ホタルルシフェラーゼ発現ベクターpGL3−Controlの配列を標的として、上記ダンベル型核酸複合体、2本鎖RNAおよびダンベル型RNAを設計した。
(B)ダンベル型核酸複合体等の作製
(a)線状1本鎖核酸複合体等の合成
ダンベル型核酸複合体の原料となる線状1本鎖核酸複合体は、全てホスホロアミダイト法に基づき核酸合成機(GeneWorld H8−SE)により合成した。例えば、図5に示すDb−23PEGおよびDb−23D7は、図2(配列番号1および2)および図3(配列番号3および4)にそれぞれ示すように、センス鎖の切れ目の3’末端のRNAからループ部分、アンチセンス鎖の切れ目の5’末端のRNAまで、核酸合成機で線状1本鎖核酸複合体を合成し、5’末端をリン酸化した。また、アンチセンス鎖の切れ目の3’末端のRNAからループ部分、センス鎖の切れ目の5’末端のRNAまで、核酸合成機で線状1本鎖核酸複合体を合成し、5’末端をリン酸化した。図5に示す他のダンベル型複合体の原料の線状1本鎖核酸複合体も同様にして合成した。
アミダイト試薬としては、RNAは2’−O−TBDMS保護体(Proligo)または2’−O−TOM保護体(Glen Research)のどちらかを使用し、5’末端リン酸化にはChemical Phosphorylation Reagent(Glen Research)を用いた。また、ループ部分のPEGにはSpacer Phosphoramidite 18(Glen Research)を使用した。RNAの脱保護は定法に従い、変性ポリアクリルアミドゲルにより完全鎖長の生成物を精製した。
対照のsiRNA−1の原料となる線状1本鎖RNAについては、上記核酸合成機を用いて合成し、精製した。比較のDb−23の原料となる線状1本鎖RNAについては、センス鎖の両末端にそれぞれ、ループ部分の一部が4または5塩基連結された線状1本鎖RNA、およびアンチセンス鎖の両末端にそれぞれ、ループ部分の残部が5または4塩基連結された線状1本鎖RNAを、上記核酸合成機を用いて合成し、精製した。
(b)T4 RNAリガーゼを用いたライゲーション反応によるダンベル型核酸複合体の作製
T4 RNAリガーゼを用いた反応液は、最終的に以下の組成となるようにした。
2μM 線状1本鎖核酸複合体
0.2〜0.4ユニット/μL T4 RNAリガーゼ
0.006% BSA
25% PEG6000
50mM Tris−HCl(pH7.5)
10mM MgCl2
10mM DTT
1mM ATP
(反応スケール2.5mL)
具体的には、上記(a)で合成、精製した2つの5’リン酸化線状1本鎖核酸複合体を、2つで4μMとなるよう、100mM Tris−HCl(pH7.5)、20mM MgCl2、20mM DTT、2mM ATP緩衝液(2x緩衝液、最終的な反応液量の半分量)に溶解し、90℃で3分間加熱後、その後室温まで徐冷した。その後、BSA水溶液、PEG6000水溶液、T4 RNAリガーゼを上記反応液の組成になるように加え、室温で約20時間インキュベートした。反応液(2.5mL)を、クロロホルム(2.5mL)で2回抽出し(PEG6000の除去)、アルコール沈殿してRNAを回収し、変性PAGEを用いて環化体を単離した(10%PAGE、7M尿素、25%ホルムアミド、1xTBE、1mm厚)。図4に電気泳動像を示す。図4において、長い矢印が示すバンドが環化体(ダンベル型核酸複合体)である。ここでのダンベル型核酸複合体の収率は、ダンベル型核酸複合体の原料として用いた2つの線状1本鎖核酸複合体の量を100%とすると、Db−23PEGおよびDb−23D7のいずれも約50%であった。UV shadowing法で目的物を含むバンドを可視化して切り出し、細かく粉砕した後、溶出バッファー(0.2M NaCl、10mM EDTA(pH8.0))4mLで3回抽出した。Sep−Pakカートリッジを用いて脱塩(50%アセトニトリル水6mLで溶出)し、遠心エバポレーターを用いて濃縮し、さらに酢酸ナトリウム塩存在下でアルコール沈殿した。得られた核酸複合体は超純水に溶解し、適宜希釈後UV吸収スペクトルを測定し、溶液濃度を定量した。収率は、ダンベル型核酸複合体の原料として用いた2つの線状1本鎖核酸複合体の量を100%とすると、Db−23PEGおよびDb−23D7で約10〜25%であった。他のダンベル型核酸複合体の収率も同程度であった。
(c)siRNAおよびDb−23の作製
対照のsiRNA−1は、上記(a)で作製したセンス鎖およびアンチセンス鎖を混合してアニーリングさせて作製し、エタノール沈殿によりsiRNA−1を回収し、PAGEで精製した。
比較のDb−23は、上記(a)で作製したセンス鎖を含む線状1本鎖RNAおよびアンチセンス鎖を含む線状1本鎖RNAを混合してアニーリングさせ、ループ部分をT4 RNAリガーゼで連結して作製した。T4 RNAリガーゼの反応条件は、上記反応スケール2.5mLから25μLにし、上記T4 RNAリガーゼの濃度0.2〜0.4ユニット/μlから2.0ユニット/μLにし、上記90℃で3分間加熱から65℃で5分間加熱にし、上記室温で約20時間インキュベートから11℃で20時間インキュベートにした以外は、上記と同様とした。エタノール沈殿によりDb−23を回収し、PAGEで精製した。
(C)血清中のダンベル型核酸複合体の生物学的安定性試験
5μMの各ダンベル型核酸複合体、または対照のsiRNA−1、比較のDb−23を、1xアニーリングバッファー(100mM酢酸カリウム、30mM HEPES−KOH(pH7.4)、2mM酢酸マグネシウム)中で90℃、3分間加熱後、徐冷した。この核酸溶液4μLとウシ血清(Gibco)16μLを混合し、37℃でインキュベートした。2、4、6、8時間後に反応液の一部をサンプリングし、15%未変性PAGEで分析した。SYBR Green Iを用いてゲルを染色し、バンドを可視化、定量した。
バンドによる定量結果の経時的変化をみると、対照のsiRNA−1、比較のDb−23は、2時間後、それぞれ約30%、約40%になるのに対して、本発明のダンベル型核酸複合体は、いずれも安定であった(図6および図7)。特に、Db−23PEGとDb−23D7は、8時間以降も70%以上が残存しており、高い血中安定性を示すことが明らかとなった。
(D)細胞抽出液中のダンベル型核酸複合体の生物学的安定性試験
HL60細胞(RIKEN CELL BANK)を培養し、細胞抽出液を調製した。終濃度がタンパク質10mg/mL、各ダンベル型核酸複合体または対照のsiRNA−1、比較のDb−23が2.5μMとなるよう混合し、37℃でインキュベートし、0.5、1、2、4時間後に反応液の一部をサンプリングした。これを15%未変性PAGEで分析し、SYBR Green Iを用いてゲルを染色し、バンドを可視化、定量した。
バンドによる定量結果の経時的変化をみると、対照のsiRNA−1は、1時間ですでに40%以下に分解されるのに対して、本発明のダンベル型核酸複合体は極めて安定であり、特にDb−23D7は最も安定であった(図8および図9)。Db−23D7は、4時間後もほとんど分解されずに残っていた。
(E)哺乳動物培養細胞系を用いたダンベル型核酸複合体のRNA干渉効果の測定
デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム(promega)を用い、ダンベル型核酸複合体の哺乳動物培養細胞におけるRNA干渉効果を測定した。
NIH 3T3細胞(RIKEN CELL BANK)を10%ウシ胎児血清(FCS、Invitro/Gibco)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、GIBCO)培地中で37℃、5%CO2下で培養した。96穴プレートに、100μLずつ、1.6x104cell/ウェルとなるよう分注した。さらに37℃、5%CO2下で24時間培養し、約70%コンフルエントの状態で2種のプラスミドベクター(pGL3−ControlおよびpRL−TK(内部標準)、いずれもpromega)と各ダンベル型核酸複合体および対照のsiRNA−1を、トランスフェクション試薬GeneSilencer(Genlantis)を用い、トランスフェクション試薬添付のプロトコールに従い、コトランスフェクションした。トランスフェクション時の濃度条件は、0.2μg pGL3−Control/0.02μg pRL−TK/25nM各ダンベル型核酸複合体または対照のsiRNA−1(最終量100μL)とした。
具体的には、上記細胞に血清を含まないDMEM培地55.6μLを加えた状態とし、下記の組成のトランスフェクション用混合溶液を添加することで行った。
GeneSilencer 1μL
DMEM培地 25μL
siRNA希釈液 2.5μL
DMEM培地 15μL
RNA(5pmol/μl) 0.5μL
pGL3−Control(1μg/μl) 0.2μL
pRL−TK(0.1μg/μl) 0.2μL
44.4μL
トランスフェクション後、37℃、5%CO2下で4時間インキュベートし、20%血清入りDMEM培地100μLをそれぞれのウェルに加えた。37℃でさらに20時間インキュベート後、Dual−luciferase Reporter Assay System(promega)を用い、添付のプロトコールに従いルシフェラーゼ発現量を定量した(条件:試薬量30μL、delay time2秒、read time10秒。機器 Wallac ARVOSX 1420 Multilabel Counter)。比較として、バッファーのみ(対照)の条件も同様に評価した。ホタルルシフェラーゼの発光強度は、内部標準であるレニラルシフェラーゼの発光強度により補正した。
結果を図10に示す。siRNA−1とDb−23D3は、ほぼ同等の活性を有していることが明らかとなった。さらに、Db−23D7やDb−23PEGなど、siRNAほどではないが十分な阻害活性が観察された。
以上の実施例から、ダンベル型核酸複合体は、血清中、細胞抽出液中で十分な安定性を有し、また哺乳動物細胞において十分なRNA干渉効果を発揮することが明らかとなった。
さらにまた、本発明の製造方法により、生体内安定性の高い環状1本鎖核酸複合体を簡易に効率よく製造することができる。
本発明のダンベル型核酸複合体は、医学、農学分野などでの広範な応用が期待される。例えば、医薬品開発、農薬開発、植物又は動物あるいはそれらの細胞での特定の遺伝子やタンパク質の機能の解明、例えばノックアウト法による機能の解明など、種々の目的のために本発明のダンベル型核酸複合体を使用することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
[配列表]
【発明の名称】環状1本鎖核酸複合体およびその製造方法
【技術分野】
【0001】
本発明は、環状1本鎖核酸複合体、その製造方法、および環状1本鎖核酸複合体を用いた医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
RNA干渉法は、化学合成された2本鎖RNAを用いる方法と、プラスミドベクターを用いる方法に大別される。このRNA干渉法を用いた医薬品開発が現在進められているが、後者のプラスミドベクターを用いた場合、人体への安全性が問題となることから、前者の化学合成された2本鎖RNAを用いる医薬品の開発が期待されている。
【0003】
しかしながら、2本鎖RNAは、生体に投与すると細胞内のヌクレアーゼで容易に分解されてしまい、生体内で不安定であるという問題があった。
【0004】
2本鎖RNAの生体内での安定性を高めるため、非天然ヌクレオシドを導入したRNA鎖が開発された。しかし、安定性は高くなるが生物活性は下がってしまうことが問題となっていた。さらに、非天然ヌクレオシドが生体に与える毒性も未知であり、医薬品への応用は難しかった。
【0005】
2本鎖RNAの生体内での安定性を向上させる別のアプローチから、環状1本鎖RNA(ダンベル型RNA)が開発された。ダンベル型RNAは2本鎖RNAの両端がループ状に閉じているために、RNA末端がなくなり、細胞内においてダイサーなどの特異的酵素以外は、分解酵素エキソヌクレアーゼなどの基質となりにくく、分解されにくいという特徴を持つ。そのようなダンベル型RNAとして、例えば非特許文献1に記載されているダンベル型RNAが挙げられる。該ダンベル型RNAは2本鎖RNAと比較してヒト血清を加えたバッファー中で安定であることが非特許文献1に記載されている。
【0006】
また、特許文献1には、抗インフルエンザウイルス剤としてのダンベル型RNA−DNAキメラ核酸が記載されている。該ダンベル型核酸は、インフルエンザウイルス遺伝子を直接攻撃するアンチセンス法に用いられるものである。該ダンベル型核酸のステム部分はDNAとそれに相補的なRNAが対合してなり、ループ部分はオリゴヌクレオチドまたはエチレングリコール化合物残基からなる。該ダンベル型核酸が細胞内に入ると、リボヌクレアーゼHにより分解または切断されて、アンチセンスDNA部分が遊離すると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】 特開平11−137260号
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】 Abe, N., Abe, H., & Ito, Y. Dumbbell-Shaped Nanocircular RNAs for RNA Interference. Journal of the American Chemical Society 129, 15108-15109 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、RNA干渉法に用いられる環状1本鎖核酸複合体、その製造方法、および該環状1本鎖核酸複合体を用いた医薬組成物を提供することを課題とする。
【0010】
本発明者らは、環状1本鎖核酸複合体のステム部分を連結する2つのループ部分を、ポリアルキレングリコール、DNA、DNAとRNAのキメラ、これらの誘導体、またはこれらの組合せにすることにより、生体内安定性が向上し、かつ細胞内でRNA干渉作用を示し、ならびに環状1本鎖核酸複合体を簡易に効率よく製造できること等を見出し、本発明を完成した。
【0011】
本発明の特徴は要約すると以下の通りである。
[1]センス鎖RNA配列と、センス鎖RNA配列に相補的なアンチセンス鎖RNA配列と、センス鎖とアンチセンス鎖の間に両鎖を結合する同じかまたは異なる2つのループ部分を含む環状1本鎖核酸複合体であって、センス鎖とアンチセンス鎖が対合してステムを形成し、ループ部分がポリアルキレングリコール、DNA、DNAとRNAのキメラ、これらの誘導体、およびこれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする、環状1本鎖核酸複合体。
[2]細胞内でRNA干渉作用を有する2本鎖RNAに変換される、[1]に記載の環状1本鎖核酸複合体。
[3]ステムを形成するRNA配列が、標的RNA配列と80〜100%の同一性を有する、[1]または[2]に記載の環状1本鎖核酸複合体。
[4]ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、[1]〜[3]のいずれかに記載の環状1本鎖核酸複合体。
[5]ステムの長さが19〜31塩基である、[1]〜[4]のいずれかに記載の環状1本鎖核酸複合体。
【0012】
[6][1]〜[5]のいずれかに記載の環状1本鎖核酸複合体の製造方法であって、以下の工程:
(1)センス鎖の一部とループ部分とアンチセンス鎖の一部を含む線状1本鎖核酸複合体、およびセンス鎖の残部とループ部分とアンチセンス鎖の残部を含む線状1本鎖核酸複合体を作製する工程、および
(2)センス鎖の一部とセンス鎖の残部、およびアンチセンス鎖の一部とアンチセンス鎖の残部を連結する工程
を含む製造方法。
【0013】
[7][1]〜[5]のいずれかに記載の環状1本鎖核酸複合体の製造方法であって、以下の工程:
(1)センス鎖とアンチセンス鎖を作製する工程、および
(2)センス鎖とアンチセンス鎖で形成された2本鎖RNAの両端に、ループ部分を連結する工程
を含む製造方法。
【0014】
[8][1]〜[5]のいずれかに記載の環状1本鎖核酸複合体を真核細胞に導入し、標的RNAを不能にしてタンパク質への翻訳を阻害することを含む、該タンパク質をコードする遺伝子の発現をin vitroで抑制する方法。
[9][1]〜[5]のいずれかに記載の環状1本鎖核酸複合体を非ヒト動物、植物、またはそれらの細胞に導入し、標的RNAを不能にしてタンパク質への翻訳を阻害することを含む、該タンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する方法。
[10][1]〜[5]のいずれかに記載の環状1本鎖核酸複合体を有効成分として含む、医薬組成物。
【発明の効果】
【0015】
本明細書において「環状1本鎖核酸複合体」は、「ダンベル型核酸複合体」ともいう。「ダンベル型核酸複合体」とは、センス鎖とアンチセンス鎖が相補的に対合してステムを形成し、ステムの両端のそれぞれに、センス鎖とアンチセンス鎖を連結するループが形成され、環状1本鎖核酸複合体の全体の形状としてダンベル状になっているものをいう。また、「核酸複合体」とは、DNAとRNAの複合体、ポリアルキレングリコールとRNAの複合体、またはDNAとポリアルキレングリコールとRNAの複合体をいう。
【0016】
本明細書において「DNAとRNAのキメラ」とは、DNA配列とRNA配列の任意の組合せからなるハイブリッドをいい、その組合せはどのような形でもよく、例えば、DNAが連続しているブロックとRNAが連続しているブロックが連結されていてもよく、双方の複数のブロックがランダムに混ざって連結されていてもよく、DNAとRNAが1つずつ交互に連結されてもよい。
【0017】
本明細書において「標的RNA」とは、RNA干渉法において発現を抑制したい遺伝子のmRNAまたはその前駆体RNAをいう。
【0018】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2008-035310号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】本発明のダンベル型核酸複合体を模式的に示す。
【図2】本発明のダンベル型核酸複合体の製造方法の概略を示す。
【図3】本発明のダンベル型核酸複合体の製造方法の概略を示す。
【図4】本発明のダンベル型核酸複合体等の電気泳動像を示す。
【図5】本発明のダンベル型核酸複合体および2本鎖RNAの構造を示す。
【図6】血清を用いた生物学的安定性試験における本発明のダンベル型核酸複合体、ダンベル型RNAおよび2本鎖RNAの電気泳動像を示す。
【図7】血清を用いた生物学的安定性試験における本発明のダンベル型核酸複合体、ダンベル型RNAおよび2本鎖RNAの電気泳動像のバンドによる定量結果の経時的変化(残存率)を示す。
【図8】細胞抽出液を用いた生物学的安定性試験における本発明のダンベル型核酸複合体、ダンベル型RNAおよび2本鎖RNAの電気泳動像を示す。
【図9】細胞抽出液を用いた生物学的安定性試験における本発明のダンベル型核酸複合体、ダンベル型RNAおよび2本鎖RNAの電気泳動像のバンドによる定量結果の経時的変化(残存率)を示す。
【図10】哺乳動物培養細胞における本発明のダンベル型核酸複合体および2本鎖RNAのRNA干渉効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0020】
1.環状1本鎖核酸複合体
本発明の環状1本鎖核酸複合体(以下「ダンベル型核酸複合体」ともいう)は、RNA干渉作用を提供し得るものである。RNA干渉作用は、細胞内または生体内で、標的RNAと相補的な配列を持つ小RNA分子が標的RNAに結合し、それを分解するか、または翻訳を抑制する作用である。
【0021】
本発明のダンベル型核酸複合体は、センス鎖RNA配列と、センス鎖RNA配列に実質的に相補的なアンチセンス鎖RNA配列と、センス鎖とアンチセンス鎖の間に両鎖を結合する同じかまたは異なる2つのループ部分を含む環状1本鎖核酸複合体である。
【0022】
アンチセンス鎖RNA配列は、センス鎖RNA配列に実質的に相補的であって、RNA干渉において標的RNAと特異的に結合する配列である。センス鎖とアンチセンス鎖は対合してステムを形成する。センス鎖RNA配列とアンチセンス鎖RNA配列は、具体的には、標的RNA配列およびそれに相補的な配列、あるいは標的RNA配列と80〜100%の同一性を有するRNA配列およびそれに相補的な配列を有する。ここで「同一性」は、2つの塩基配列にギャップを導入するかまたはギャップを導入しないで整列したときに、総塩基数に対する同一塩基数の割合(%)を表す。ステムの長さは、RNA干渉作用を付与する限り、特に限定されないが、例えば19〜31塩基対、好ましくは20〜25塩基対、より好ましくは20〜24塩基対、さらに好ましくは20〜23塩基対からなる。
【0023】
センス鎖および/またはアンチセンス鎖のRNAは、修飾ヌクレオシドを含む誘導体でもよい。修飾ヌクレオシドは、塩基および糖部分の修飾体であり、アルキル化体、アルコキシル化体、イノシン、リボースの2’−O−アルキルまたは2’−ハロゲン化体、2’,4’−BNA化体などが挙げられる。また、ヌクレオチドのリン酸基部が修飾されてもよく、リン酸基部の修飾体として、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド、メチルホスホネートなどが挙げられる。また、センス鎖および/またはアンチセンス鎖の塩基配列は、RNA干渉作用を有する限り、RNAのみならず、RNAとDNAのキメラであってもよい。さらに、センス鎖に、1〜6個の塩基のミスマッチ、好ましくは1〜3個の塩基のミスマッチ、さらに好ましくは1〜2個の塩基のミスマッチが含まれていてもよい。塩基のミスマッチが含まれると、2本鎖RNAがヘリケースにより1本鎖RNAに解離しやすくなると考えられる(Schwarz, D.S., et al. Asymmetry in the Assembly of the RNAi Enzyme Complex. Cell 115, 199-208 (2003))。ループ部分は、ステムの両端に位置し、センス鎖の5’末端のRNAとアンチセンス鎖の3’末端のRNAを連結し、またセンス鎖の3’末端のRNAとアンチセンス鎖のRNAの5’末端を連結する。ループ部分は、ポリアルキレングリコール、DNA、DNAとRNAのキメラ、これらの誘導体、またはこれらの組合せで構成される。これにより、例えば2本鎖RNA(siRNA)、ループ部分がRNAのみからなる環状1本鎖RNA、またはヘアピン構造を有する2本鎖RNA(shRNA)と比較して、より細胞内または生体内安定性が向上し、RNA干渉においてより持続的および徐放的な効果を発揮することができる。ループの長さは特に限定されず、ステムの両端を連結できる長さであればよい。たとえループが長くてもダイサーによるRNAの切断は阻害されない。
【0024】
ループ部分のポリアルキレングリコールは特に限定されないが、生体安全性が高いことが好ましい。これらは、そのアルキレン部分が、ハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アシル、アルキルチオなどの非限定的置換基で置換されていてもよい誘導体を含む。またモノマーの単位の炭素数が1〜4のものが好ましいが、炭素数5以上のもの、例えば5〜8のものでもよい。ポリアルキレングリコールとしては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、ポリオキシエチレンオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンオキシブチレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシブチレングリコールなどが挙げられる。本発明においてはポリエチレングリコールが特に好ましい。
【0025】
ポリエチレングリコールは、式:−O−[(CH2)2−O−]n−(式中、nは特に限定されないが、好ましくはn=1〜1000、より好ましくはn=2〜50、さらに好ましくは3〜20、特に好ましくは3〜10である。)で表される。ポリアルキレングリコールの一方または両方の水酸基はリン酸エステル化されていてもよい。
【0026】
ループ部分のDNA、またはDNAとRNAのキメラは、ループの長さとして1塩基以上であればよく、好ましくは2〜20塩基、より好ましくは6〜12塩基、さらに好ましくは7〜11である。ループ部分の核酸配列は、実質的に相補鎖を形成しない配列を含んでいれば特に限定されない。相補鎖を形成しないDNA配列の例としては、GATTAGTCACT(配列番号14)、AGAGAACTT(配列番号15)、TTCAAGAGA(配列番号16)、TGTGCTGTC(配列番号17)などが挙げられる。該DNA配列の一部は、各DNAに対応するRNAに置換されていてもよい。DNAまたはRNAは修飾ヌクレオシドを含む誘導体でもよい。修飾ヌクレオシドは、塩基および糖部分の修飾体であり、アルキル化体、アルコキシル化体、イノシン、リボースの2’−O−アルキルまたは2’−ハロゲン化体、2’,4’−BNA化体などが挙げられる。また、ヌクレオチドのリン酸基部が修飾されてもよく、リン酸基部の修飾体として、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド、メチルホスホネートなどが挙げられる。さらに、ループ部分の核酸配列中の任意の位置にポリアルキレングリコールが含まれていてもよい。さらにまた、ループ部分にペプチドが含まれてもよい。
【0027】
2.環状1本鎖核酸複合体の製造方法
本発明の環状1本鎖核酸複合体(ダンベル型核酸複合体)は、以下の工程:
(1)センス鎖の一部とループ部分とアンチセンス鎖の一部を含む線状1本鎖核酸複合体、およびセンス鎖の残部とループ部分とアンチセンス鎖の残部を含む線状1本鎖核酸複合体を作製する工程、および
(2)センス鎖の一部とセンス鎖の残部、およびアンチセンス鎖の一部とアンチセンス鎖の残部を連結する工程、
を含む製造方法で作製することができる。
【0028】
あるいは、以下の工程:
(1)センス鎖とアンチセンス鎖を作製する工程、および
(2)センス鎖とアンチセンス鎖で形成された2本鎖RNAの両端に、ループ部分を連結する工程、
を含む製造方法で作製することができる。
【0029】
ダンベル型核酸複合体のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、標的となる遺伝子の発現を抑制できるように、標的遺伝子の塩基配列から設計する。標的遺伝子は、一般に真核生物由来の遺伝子であり、好ましくは動物や植物由来の遺伝子である。設計は、複数のセンス鎖およびアンチセンス鎖を作製してそれぞれ抑制効率を確認してもよいが、例えばsiRNA設計用アルゴリズムなどによる設計を利用してもよい(参照文献:J.A.Jaeger et al., Methods in Enzymology(1989) 183:281-306;D.H.Mathews et al., J. Mol. Biol.(1999) 288:911-940)。設計時には、標的遺伝子と類似した配列を持つ標的遺伝子以外の遺伝子の発現を抑制すること(Off target効果)がないようにすることが望ましい。また、ダンベル型核酸複合体が細胞内または生体内でダイサーにより切断されたときに、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む生じた2本鎖RNAの3’末端が、1〜3個のU(ウラシル)の突出末端となるように配列を設計してもよい。センス鎖およびアンチセンス鎖の長さは特に限定されないが、例えば19〜31塩基、好ましくは20〜25塩基、より好ましくは20〜24塩基、さらに好ましくは20〜23塩基の長さで設計する。具体的な標的遺伝子は特に限定されないが、例えば過剰発現される疾患関連遺伝子、ウイルス性遺伝子など、具体的には、白血病のabl/bcr遺伝子、加齢性黄斑変性症のVEGF遺伝子、肝炎のHCV遺伝子などが挙げられる。
【0030】
ループ部分は、ポリアルキレングリコール、DNA、DNAとRNAのキメラ、これらの誘導体、あるいはこれらの組合せとし、ループ部分の塩基配列は、上記に示したように、実質的に相補鎖を形成しない配列を含む。
【0031】
センス鎖の一部とループ部分とアンチセンス鎖の一部を含む線状1本鎖核酸複合体、およびセンス鎖の残部とループ部分とアンチセンス鎖の残部を含む線状1本鎖核酸複合体の作製は、市販の核酸合成機および試薬を用いて行うことができる。合成した線状1本鎖核酸複合体の5’末端をリン酸化する。これらの線状1本鎖核酸複合体を混合すると、センス鎖とアンチセンス鎖が部分的に対合し、かつセンス鎖の一部とセンス鎖の残部の間およびアンチセンス鎖の一部とアンチセンス鎖の残部の間に切れ目があるステムが形成される。この切れ目を酵素的または化学的に連結し、ダンベル型核酸複合体を製造する。酵素的に連結するには、リガーゼを用いればよく、リガーゼはT4 RNAリガーゼが好ましい。化学的に連結するには、縮合剤を用いればよく、縮合剤はジシクロヘキシルカルボジイミドなどが好ましく、リン酸エステルとして連結することができる。
【0032】
あるいは、センス鎖とアンチセンス鎖をそれぞれ合成し、センス鎖とアンチセンス鎖を混合して2本鎖RNAを形成させ、この2本鎖RNAの両端にループ部分を連結して、ダンベル型核酸複合体を製造してもよい。ループ部分がポリアルキレングリコールを含む場合は、核酸の5’末端をリン酸化し、核酸にポリアルキレングリコールをリン酸化エステルにより連結するか、ポリアルキレングリコールの両端をリン酸エステル化し、核酸の3’末端および5’末端と連結することができる。あるいは、ループ部分がDNA、DNAとRNAのキメラの場合は、合成したセンス鎖、アンチセンス鎖およびループ部分の5’末端をリン酸化し、ループ部分と2本鎖RNAの各末端を上記酵素的または化学的に連結することができる。
【0033】
以下、図2を参照しながら、ダンベル型核酸複合体(Db−23PEG;23塩基対からなるステムとポリエチレングリコールを含むループ部分からなるダンベル型核酸複合体)の製造方法の例を具体的に説明する。図中、ステムにおいて上段のRNA鎖はセンス鎖であり、下段のRNA鎖はアンチセンス鎖である。
【0034】
(1)センス鎖RNA配列の任意の切れ目部位から5’末端まで、例えばホスホロアミダイト法に基づく核酸合成機でRNA鎖を合成し、5’末端をリン酸化する。図2でいえば、3’が付されているセンス鎖の端(3’AAC・・・)からセンス鎖の5’末端(・・・UGA)まで合成する。
【0035】
次に、ポリエチレングリコールを含むループ部分を合成する。ポリエチレングリコールは特に限定されないが、例えば分子量約60〜60000、より好ましくは約120〜3000、さらに好ましくは約180〜1200、特に好ましくは約180〜600のポリエチレングリコールを用いることが好ましい。また、核酸合成機で用いられるスペーサー用の試薬を用いることが好ましい。図2でいえば、センス鎖の5’末端に、A(アデニン)、ポリエチレングリコールのリンカー、U(ウラシル)を含むループ部分を結合する。
【0036】
さらに、アンチセンス鎖の3’末端から任意の切れ目部位までRNA鎖を合成する。図2でいえば、アンチセンス鎖の3’末端(UCA)から5’が付されているアンチセンス鎖の端まで合成し、リン酸化試薬で5’末端をリン酸化する。この工程により、線状1本鎖核酸複合体が作製できる。
【0037】
なお、この工程で作製されるセンス鎖とアンチセンス鎖の塩基の数は、少なくとも1つの塩基の対合が生じるように、同じでないことが好ましい。塩基の数の違いは、1〜25塩基であることがより好ましく、5〜15塩基であることが更に好ましい。
【0038】
(2)上記(1)で合成したアンチセンス鎖配列の残部のRNA鎖を合成する。図2でいえば、3’が付されているアンチセンス鎖の端(3’GCG・・・)からアンチセンス鎖の5’末端(・・・GGA)まで合成する。
【0038】
次に、ポリエチレングリコールを含むループ部分を合成する。図2でいえば、アンチセンス鎖の5’末端に、A(アデニン)、ポリエチレングリコールのリンカー、U(ウラシル)を含むループ部分を結合する。
【0039】
さらに、センス鎖の残部のRNA鎖を合成する。図2でいえば、アンチセンス鎖RNAの3’末端(UCC)から5’が付されているアンチセンス鎖の端まで合成し、リン酸化試薬で5’末端をリン酸化する。この工程により、線状1本鎖核酸複合体が作製できる。
【0040】
(3)上記(1)で作製した線状1本鎖核酸複合体と、(2)で作製した線状1本鎖核酸複合体を混合する。(1)で作製した線状1本鎖核酸複合体に含まれるセンス鎖と、(2)で作製した線状1本鎖核酸複合体に含まれるアンチセンス鎖が対合して、ステムを形成し、図2に示すように、ステムに2つの切れ目があるダンベル型核酸複合体が形成される。
【0041】
縮合剤またはRNAリガーゼ、例えばT4 RNAリガーゼを添加して、この2つの切れ目を連結する。即ち、(1)で作製した線状1本鎖核酸複合体のセンス鎖の一部と(2)で作製した線状1本鎖核酸複合体のセンス鎖の残部、および、(1)で作製した線状1本鎖核酸複合体のアンチセンス鎖の一部と(2)で作製した線状1本鎖核酸複合体のアンチセンス鎖の残部を連結する。図2でいえば、センス鎖の3’が付されているAと5’が付されているCを連結し、アンチセンス鎖の5’が付されているCと3’が付されているGを連結する。
【0042】
リガーゼの反応条件は、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、BSAなどを含む緩衝液中で低温〜室温下で約20時間のインキュベーションが好ましい。ポリエチレングリコールを加えることによりダンベル型核酸複合体の収率が向上し、BSAを加えることによりリガーゼの失活を防ぐことができる。ダンベル型核酸複合体の抽出は、特に限定されないが、クロロホルムを用いてダンベル型核酸複合体を抽出し、反応液に含まれる余分なポリエチレングリコールを除去することが好ましい。
【0043】
DNAまたはDNA−RNAキメラのループ部分を有するダンベル型核酸複合体も、上記(1)〜(3)と同様にして作製し、回収、精製することができる。そのようなダンベル型核酸複合体(Db−23D7;23塩基対からなるステムとDNAを含むループ部分からなるダンベル型核酸複合体)の作製の例を図3に示す。
【0044】
作製したダンベル型核酸複合体は、高速液体クロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、エキソヌクレアーゼによる分解を調べる試験等で、ダンベル型核酸複合体が作製されたかどうかを確認し、回収、精製することが好ましい。上記方法で作製したダンベル型核酸複合体を変性ポリアクリルアミドゲルで分析した例を図4に示す。図4の短い矢印は、T4 RNAリガーゼで1ヶ所のみ連結した生成物のバンドを示し、長い矢印は、2ヶ所とも連結した目的生成物(ダンベル型核酸複合体)のバンドを示す。破線の矢印は、ダンベル型核酸複合体の原料として用いた、上記(1)および(2)で合成した線状1本鎖核酸複合体のバンドを示す。
【0045】
3.遺伝子の発現を抑制する方法
本発明のダンベル型核酸複合体を真核細胞または真核生物に導入し、標的RNAを不能にしてタンパク質への翻訳を阻害することができる。該細胞は、ヒト細胞を含む動物細胞、植物細胞などを含む。本発明のダンベル型核酸複合体は、生体内安定性(例えば血中安定性)が高く、持続的、徐放的に効果を発揮することができる。また、生体に対する安全性も高いと考えられる。
【0046】
in vitroでRNA干渉法を行う場合、ダンベル型核酸複合体を、例えばエレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法などで細胞に導入することができる。
【0047】
in vivoでRNA干渉法を行う場合、ダンベル型核酸複合体を、例えば局所投与、静脈内投与、遺伝子銃を用いる方法などで、動物または植物に導入することができる。
細胞内に導入されたダンベル型核酸複合体は、細胞内のダイサーにより切断を受け、RNA干渉作用のある2本鎖RNA(siRNA)が細胞内で生じる(図1)。siRNAが1本鎖となり、RNA誘導サイレンシング複合体(RNA induced silencing complex(RISC))を形成し、1本鎖RNAと相補的な配列の標的mRNAを認識して、mRNAを分解し、結果として標的遺伝子の発現が抑制される。
【0048】
4.環状1本鎖核酸複合体を含む医薬組成物
本発明の医薬組成物は、環状1本鎖核酸複合体(ダンベル型核酸複合体)を有効成分として含む。ダンベル型核酸複合体の医薬組成物への配合量は、組成物の全量に対して、例えば0.1重量%、0.5重量%、1重量%、3重量%、5重量%、10重量%、20重量%、30重量%、40重量%、50重量%、60重量%、70重量%、80重量%、90重量%、100重量%であるが、これらに限定されない。
【0049】
本発明の医薬組成物の剤形としては、例えば液体製剤(溶液剤、懸濁剤、乳濁剤など)、固体製剤(用時調製の凍結乾燥剤など)、リポソーム(カチオン性リポソームが好ましい)封入製剤などが挙げられる。投与は全身投与、局所投与を問わない。全身投与に関しては、最近、マウスとハムスターに合成siRNAを全身投与したところ、標的遺伝子の効果的なサイレンシングが起き、しかも内在性マイクロRNA(miRNA)の量や活性に影響が認められなかったことが確認されている(John, M. et al. Effective RNAi-mediated gene silencing without interruption of the endogenous microRNApathway. Nature 449, 745-747 (2007))。投与経路としては、非経口投与が好ましく、例えば皮内または皮下投与、直腸内投与、経粘膜投与、静脈内投与などが挙げられる。
【0050】
本発明の医薬組成物は、製剤化、剤形等に応じて、製薬上許容される賦形剤または希釈剤(生理食塩水、滅菌水、リンゲル液など)、添加剤、例えば医薬上許容される緩衝剤、等張化剤、安定化剤などを含めてもよい。
【0051】
また、本発明の医薬組成物の投与量は、患者の性別、体重、年齢、重篤度、症状などに応じて変更し得る。
【0052】
本発明の医薬組成物の適用は特に限定されないが、癌、遺伝子疾患、ウイルス等による感染症などの治療が挙げられる。例えば癌の治療では、本発明の医薬組成物を用いて癌細胞で特異的に発現する遺伝子やタンパク質の機能を抑制することができる。
【0053】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例】
【0054】
[実施例1]
(A)ダンベル型核酸複合体等の設計
23塩基対のステムを有する本発明のダンベル型核酸複合体(配列番号7〜13)、および本発明のダンベル型核酸複合体の対照として2本鎖RNA(siRNA、配列番号5および6)を設計した(図5)。図中、対照のsiRNAは、siRNA−1と記載する。また、設計された各ダンベル型の名前において、「Db」はダンベル型を意味し、「23」はダンベル型核酸複合体が23塩基対のステムを有することを意味し、「PEG」はループ部分にポリエチレングリコールを含むことを意味する。「PEGuu」はループ部分にポリエチレングリコールを含み、かつダイサーで切断されたときに生じる2本鎖RNAにUU(連続した2つのウラシル)の突出末端を形成するRNAを含むことを意味し、「D3」、「D5」および「D7」は、ループ部分にDNAをそれぞれ3つ、5つ、7つ含むことを意味する。対照のsiRNA−1と各ダンベル型核酸複合体のステムにおいて、上段の配列はセンス鎖配列、下段の配列はアンチセンス鎖を示す。太字で示された配列は、標的RNAに対する相補配列を示す。四角で囲まれた部分は、対照のsiRNA−1と各ダンベル型核酸複合体の全てに共通な2本鎖RNA部分を示す。ダンベル型核酸複合体のループ部分のA(アデニン)、C(シトシン)、G(グアニン)およびT(チミン)は、2’−デオキシヌクレオチドであることを示す。ダンベル型核酸複合体のループ部分に示された太線は、ポリエチレングリコール(PEG)のリンカーを示す。ここでポリエチレングリコールの式:−[(CH2)2−O]n−のnは4である。また、比較として、Db−23D3のループ部分のDNAが対応するRNAに置換されている以外は同じ配列を持つ、RNAのみからなるダンベル型RNA(Db−23)を設計した。
【0055】
なお、本実施例では、ホタルルシフェラーゼ発現ベクターpGL3−Controlの配列を標的として、上記ダンベル型核酸複合体、2本鎖RNAおよびダンベル型RNAを設計した。
【0056】
(B)ダンベル型核酸複合体等の作製
(a)線状1本鎖核酸複合体等の合成
ダンベル型核酸複合体の原料となる線状1本鎖核酸複合体は、全てホスホロアミダイト法に基づき核酸合成機(GeneWorld H8-SE)により合成した。例えば、図5に示すDb−23PEGおよびDb−23D7は、図2(配列番号1および2)および図3(配列番号3および4)にそれぞれ示すように、センス鎖の切れ目の3’末端のRNAからループ部分、アンチセンス鎖の切れ目の5’末端のRNAまで、核酸合成機で線状1本鎖核酸複合体を合成し、5’末端をリン酸化した。また、アンチセンス鎖の切れ目の3’末端のRNAからループ部分、センス鎖の切れ目の5’末端のRNAまで、核酸合成機で線状1本鎖核酸複合体を合成し、5’末端をリン酸化した。図5に示す他のダンベル型複合体の原料の線状1本鎖核酸複合体も同様にして合成した。
【0057】
アミダイト試薬としては、RNAは2’−O−TBDMS保護体(Proligo)または2’−O−TOM保護体(Glen Research)のどちらかを使用し、5’末端リン酸化にはChemical Phosphorylation Reagent (Glen Research)を用いた。また、ループ部分のPEGにはSpacer Phosphoramidite 18 (Glen Research)を使用した。RNAの脱保護は定法に従い、変性ポリアクリルアミドゲルにより完全鎖長の生成物を精製した。
【0058】
対照のsiRNA−1の原料となる線状1本鎖RNAについては、上記核酸合成機を用いて合成し、精製した。比較のDb−23の原料となる線状1本鎖RNAについては、センス鎖の両末端にそれぞれ、ループ部分の一部が4または5塩基連結された線状1本鎖RNA、およびアンチセンス鎖の両末端にそれぞれ、ループ部分の残部が5または4塩基連結された線状1本鎖RNAを、上記核酸合成機を用いて合成し、精製した。
【0059】
(b)T4 RNAリガーゼを用いたライゲーション反応によるダンベル型核酸複合体の作製
T4 RNAリガーゼを用いた反応液は、最終的に以下の組成となるようにした。
2μM 線状1本鎖核酸複合体
0.2〜0.4ユニット/μL T4 RNAリガーゼ
0.006% BSA
25% PEG6000
50mM Tris−HCl(pH7.5)
10mM MgCl2
10mM DTT
1mM ATP
(反応スケール2.5mL)
【0060】
具体的には、上記(a)で合成、精製した2つの5’リン酸化線状1本鎖核酸複合体を、2つで4μMとなるよう、100mM Tris−HCl(pH7.5)、20mM MgCl2、20mM DTT、2mM ATP緩衝液(2x緩衝液、最終的な反応液量の半分量)に溶解し、90℃で3分間加熱後、その後室温まで徐冷した。その後、BSA水溶液、PEG6000水溶液、T4 RNAリガーゼを上記反応液の組成になるように加え、室温で約20時間インキュベートした。反応液(2.5mL)を、クロロホルム(2.5mL)で2回抽出し(PEG6000の除去)、アルコール沈殿してRNAを回収し、変性PAGEを用いて環化体を単離した(10%PAGE、7M尿素、25%ホルムアミド、1xTBE、1mm厚)。図4に電気泳動像を示す。図4において、長い矢印が示すバンドが環化体(ダンベル型核酸複合体)である。ここでのダンベル型核酸複合体の収率は、ダンベル型核酸複合体の原料として用いた2つの線状1本鎖核酸複合体の量を100%とすると、Db−23PEGおよびDb−23D7のいずれも約50%であった。UV shadowing法で目的物を含むバンドを可視化して切り出し、細かく粉砕した後、溶出バッファー(0.2M NaCl、10mM EDTA(pH8.0))4mLで3回抽出した。Sep-Pakカートリッジを用いて脱塩(50%アセトニトリル水6mLで溶出)し、遠心エバポレーターを用いて濃縮し、さらに酢酸ナトリウム塩存在下でアルコール沈殿した。得られた核酸複合体は超純水に溶解し、適宜希釈後UV吸収スペクトルを測定し、溶液濃度を定量した。収率は、ダンベル型核酸複合体の原料として用いた2つの線状1本鎖核酸複合体の量を100%とすると、Db−23PEGおよびDb−23D7で約10〜25%であった。他のダンベル型核酸複合体の収率も同程度であった。
【0061】
(c)siRNAおよびDb−23の作製
対照のsiRNA−1は、上記(a)で作製したセンス鎖およびアンチセンス鎖を混合してアニーリングさせて作製し、エタノール沈殿によりsiRNA−1を回収し、PAGEで精製した。
【0062】
比較のDb−23は、上記(a)で作製したセンス鎖を含む線状1本鎖RNAおよびアンチセンス鎖を含む線状1本鎖RNAを混合してアニーリングさせ、ループ部分をT4 RNAリガーゼで連結して作製した。T4 RNAリガーゼの反応条件は、上記反応スケール2.5mLから25μLにし、上記T4 RNAリガーゼの濃度0.2〜0.4ユニット/μLから2.0ユニット/μLにし、上記90℃で3分間加熱から65℃で5分間加熱にし、上記室温で約20時間インキュベートから11℃で20時間インキュベートにした以外は、上記と同様とした。エタノール沈殿によりDb−23を回収し、PAGEで精製した。
【0063】
(C)血清中のダンベル型核酸複合体の生物学的安定性試験
5μMの各ダンベル型核酸複合体、または対照のsiRNA−1、比較のDb−23を、1xアニーリングバッファー(100mM酢酸カリウム、30mM HEPES−KOH(pH7.4)、2mM酢酸マグネシウム)中で90℃、3分間加熱後、徐冷した。この核酸溶液4μLとウシ血清(Gibco)16μLを混合し、37℃でインキュベートした。2、4、6、8時間後に反応液の一部をサンプリングし、15%未変性PAGEで分析した。SYBR Green Iを用いてゲルを染色し、バンドを可視化、定量した。
【0064】
バンドによる定量結果の経時的変化をみると、対照のsiRNA−1、比較のDb−23は、2時間後、それぞれ約30%、約40%になるのに対して、本発明のダンベル型核酸複合体は、いずれも安定であった(図6および図7)。特に、Db−23PEGとDb−23D7は、8時間以降も70%以上が残存しており、高い血中安定性を示すことが明らかとなった。
【0065】
(D)細胞抽出液中のダンベル型核酸複合体の生物学的安定性試験
HL60細胞(RIKEN CELL BANK)を培養し、細胞抽出液を調製した。終濃度がタンパク質10mg/mL、各ダンベル型核酸複合体または対照のsiRNA−1、比較のDb−23が2.5μMとなるよう混合し、37℃でインキュベートし、0.5、1、2、4時間後に反応液の一部をサンプリングした。これを15%未変性PAGEで分析し、SYBR Green Iを用いてゲルを染色し、バンドを可視化、定量した。
【0066】
バンドによる定量結果の経時的変化をみると、対照のsiRNA−1は、1時間ですでに40%以下に分解されるのに対して、本発明のダンベル型核酸複合体は極めて安定であり、特にDb−23D7は最も安定であった(図8および図9)。Db−23D7は、4時間後もほとんど分解されずに残っていた。
【0067】
(E)哺乳動物培養細胞系を用いたダンベル型核酸複合体のRNA干渉効果の測定
デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム(promega)を用い、ダンベル型核酸複合体の哺乳動物培養細胞におけるRNA干渉効果を測定した。
【0068】
NIH 3T3細胞(RIKEN CELL BANK)を10%ウシ胎児血清(FCS、Invitrogen/Gibco)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、GIBCO)培地中で37℃、5%CO2下で培養した。96穴プレートに、100μLずつ、1.6x104cell/ウェルとなるよう分注した。さらに37℃、5%CO2下で24時間培養し、約70%コンフルエントの状態で2種のプラスミドベクター(pGL3−ControlおよびpRL−TK(内部標準)、いずれもpromega)と各ダンベル型核酸複合体および対照のsiRNA−1を、トランスフェクション試薬GeneSilencer (Genlantis)を用い、トランスフェクション試薬添付のプロトコールに従い、コトランスフェクションした。トランスフェクション時の濃度条件は、0.2μg pGL3−Control/0.02μg pRL−TK/25nM各ダンベル型核酸複合体または対照のsiRNA−1(最終量100μL)とした。
【0069】
具体的には、上記細胞に血清を含まないDMEM培地55.6μLを加えた状態とし、下記の組成のトランスフェクション用混合溶液を添加することで行った。
GeneSilencer 1μL
DMEM培地 25μL
siRNA希釈液 2.5μL
DMEM培地 15μL
RNA(5pmol/μL) 0.5μL
pGL3−Control(1μg/μL) 0.2μL
pRL−TK(0.1μg/μL) 0.2μL
44.4μL
【0070】
トランスフェクション後、37℃、5%CO2下で4時間インキュベートし、20%血清入りDMEM培地100μLをそれぞれのウェルに加えた。37℃でさらに20時間インキュベート後、Dual-luciferase Reporter Assay System (promega)を用い、添付のプロトコールに従いルシフェラーゼ発現量を定量した(条件:試薬量30μL、delay time2秒、read time10秒。機器 Wallac ARVO SX 1420 MultilabelCounter)。比較として、バッファーのみ(対照)の条件も同様に評価した。ホタルルシフェラーゼの発光強度は、内部標準であるレニラルシフェラーゼの発光強度により補正した。
【0071】
結果を図10に示す。siRNA−1とDb−23D3は、ほぼ同等の活性を有していることが明らかとなった。さらに、Db−23D7やDb−23PEGなど、siRNAほどではないが十分な阻害活性が観察された。
【0072】
以上の実施例から、ダンベル型核酸複合体は、血清中、細胞抽出液中で十分な安定性を有し、また哺乳動物細胞において十分なRNA干渉効果を発揮することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【0073】
本発明の環状1本鎖核酸複合体は、細胞または生体内に投与されるとダイサーに特異的に認識され、両側のループ部分が切断されて2本鎖RNAになり(図1)、この2本鎖RNAがRNA干渉作用を持ち得る。本発明の環状1本鎖核酸複合体は、従来の2本鎖RNAよりも優れた生体内安定性(例えば血中安定性)を有し、かつRNA干渉において持続的、徐放的な効果を発揮し得るという格別優れた作用効果を奏する。従って、持続性および徐放性を有し、かつRNA干渉作用を付与し得る環状1本鎖核酸複合体含有医薬品を提供することが可能となる。この医薬品は、全身投与することも患部に直接投与することもでき、かつその投与量を減らすことが可能となる。
【0074】
さらにまた、本発明の製造方法により、生体内安定性の高い環状1本鎖核酸複合体を簡易に効率よく製造することができる。
【0073】
本発明のダンベル型核酸複合体は、医学、農学分野などでの広範な応用が期待される。例えば、医薬品開発、農薬開発、植物又は動物あるいはそれらの細胞での特定の遺伝子やタンパク質の機能の解明、例えばノックアウト法による機能の解明など、種々の目的のために本発明のダンベル型核酸複合体を使用することができる。
【0075】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
Claims (10)
- センス鎖RNA配列と、センス鎖RNA配列に相補的なアンチセンス鎖RNA配列と、センス鎖とアンチセンス鎖の間に両鎖を結合する同じかまたは異なる2つのループ部分を含む環状1本鎖核酸複合体であって、センス鎖とアンチセンス鎖が対合してステムを形成し、ループ部分がポリアルキレングリコール、DNA、DNAとRNAのキメラ、これらの誘導体、およびこれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする、環状1本鎖核酸複合体。
- 細胞内でRNA干渉作用を有する2本鎖RNAに変換される、請求項1に記載の環状1本鎖核酸複合体。
- ステムを形成するRNA配列が、標的RNA配列と80〜100%の同一性を有する、請求項1または2に記載の環状1本鎖核酸複合体。
- ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の環状1本鎖核酸複合体。
- ステムの長さが19〜31塩基である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の環状1本鎖核酸複合体。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の環状1本鎖核酸複合体の製造方法であって、以下の工程:
(1)センス鎖の一部とループ部分とアンチセンス鎖の一部を含む線状1本鎖核酸複合体、およびセンス鎖の残部とループ部分とアンチセンス鎖の残部を含む線状1本鎖核酸複合体を作製する工程、および
(2)センス鎖の一部とセンス鎖の残部、およびアンチセンス鎖の一部とアンチセンス鎖の残部を連結する工程
を含む製造方法。 - 請求項1〜5のいずれかに記載の環状1本鎖核酸複合体の製造方法であって、以下の工程:
(1)センス鎖とアンチセンス鎖を作製する工程、および
(2)センス鎖とアンチセンス鎖で形成された2本鎖RNAの両端に、ループ部分を連結する工程
を含む製造方法。 - 請求項1〜5のいずれかに記載の環状1本鎖核酸複合体を真核細胞に導入し、標的RNAを不能にしてタンパク質への翻訳を阻害することを含む、該タンパク質をコードする遺伝子の発現をin vitroで抑制する方法。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の環状1本鎖核酸複合体を非ヒト動物、植物、またはそれらの細胞に導入し、標的RNAを不能にしてタンパク質への翻訳を阻害することを含む、該タンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する方法。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の環状1本鎖核酸複合体を有効成分として含む、医薬組成物。
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