WO2019189722A1 - ヘアピン型一本鎖ｒｎａ分子の製造方法 - Google Patents

ヘアピン型一本鎖ｒｎａ分子の製造方法 Download PDF

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英朗 稲田
克彦 伊関
慶一 沖村
真人 佐野坂
あゆみ ▲高▼科
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    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a hairpin type single-stranded RNA molecule.
  • RNA interference is known as a technique for suppressing gene expression (Non-patent Document 1).
  • RNA interference a method using a short double-stranded RNA molecule called siRNA (small interfering RNA) is often used.
  • siRNA small interfering RNA
  • Patent Document 1 a gene expression suppression technique using a circular RNA molecule partially forming a double strand by intramolecular annealing has been reported (Patent Document 1).
  • Patent Document 2 discloses a hairpin single-stranded long RNA molecule in which a sense strand and an antisense strand of siRNA are linked to a single strand using one or two linkers formed using a cyclic amine derivative. It has been reported that siRNA can be stabilized. However, since this single-stranded long RNA molecule cannot be efficiently synthesized by the phosphoramidite method using a general-purpose amidite such as TBDMS amidite, a special RNA amidite is used for the synthesis (for example, Patent Documents 2 and 3). Must be used.
  • Patent Document 4 discloses a method of ligating a first nucleic acid strand and a second nucleic acid strand using an auxiliary nucleic acid as a third nucleic acid strand and T4 RNA ligase 2, but the auxiliary nucleic acid is long. This indicates that the reaction is so slow that the auxiliary nucleic acids that provide good ligation efficiency in the method are limited.
  • An object of the present invention is to provide an efficient method for producing a hairpin single-stranded RNA molecule that suppresses the expression of the title gene.
  • the present inventors have obtained a hairpin type single-stranded RNA molecule containing an expression suppressing sequence for a target gene having a linker such as a non-nucleotide linker or a nucleotide linker.
  • a linker such as a non-nucleotide linker or a nucleotide linker.
  • the present invention includes the following.
  • a method for producing a hairpin single-stranded RNA molecule that suppresses expression of a target gene An annealing step for annealing the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule;
  • the first single-stranded oligo RNA molecule comprises a first RNA portion and a second RNA portion linked via a first linker, wherein one of the first RNA portion and the second RNA portion is Can be complementarily bound to the other
  • the second single-stranded oligo RNA molecule comprises a third RNA portion and a fourth RNA portion linked via a second linker, wherein one of the third RNA portion and the fourth
  • a method for producing a hairpin single-stranded RNA molecule is represented by the following formula (I), and the second single-stranded oligo RNA molecule is represented by the following formula (II): 5′-Xs-Lx 1 -Xa-3 ′ Formula (I) 5'-Ya 1 -Ya 2 -Ya 3 -Lx 2 -Ys-3 'Formula (II)
  • Xs, Xa, Ya 1 , Ya 2 , Ya 3 and Ys represent one or more ribonucleotide residues
  • Lx 1 and Lx 2 represent a first linker and a second linker, respectively, Ya 3 is complementary to Ys
  • Xa-Ya 1 generated in the ligation process is complementary to Xs
  • Xa-Ya 1 -Ya 2 -Ya 3 generated in the ligation step includes a gene expression suppress
  • the first single-stranded oligo RNA molecule has uracil (U) or adenine (A) at the 3 ′ end
  • the second single-stranded oligo RNA molecule has uracil (U) at the 5 ′ end.
  • the first linker and the second linker are each independently (i) a non-nucleotide linker containing at least one of a pyrrolidine skeleton and a piperidine skeleton, or (ii) a nucleotide linker. ] To [3].
  • the hairpin single-stranded RNA molecule has a base sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein the 24th and 25th ribonucleotide residues are linked via a first linker, and the 50th and 51st
  • the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule are any of the following (1) to (6), The manufacturing method in any one.
  • 24th and 25th A first single-stranded oligo RNA molecule consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 19, wherein the ribonucleotide residues are linked via a first linker, and the 16th and 17th ribonucleotide residues are Combination with the second single-stranded oligo RNA molecule consisting of the base sequence
  • the first single-stranded oligo RNA molecule having the base sequence represented by SEQ ID NO: 29 and the 21st and 22nd ribonucleotide residues are linked via a second linker (5)
  • the first single-stranded oligo RNA molecule having the base sequence represented by No. 31 and the 22nd and 23rd ribonucleotide residues are represented by SEQ ID NO: 30 linked via a second linker.
  • a first single-stranded oligo RNA molecule comprising: a second first consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 32 in which the 23rd and 24th ribonucleotide residues are linked via a second linker Combination with a single-stranded oligo RNA molecule [12]
  • a single-stranded oligo RNA molecule which is any one of the following (a) to (l): (A) Single-stranded oligo RNA molecule comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 in which the 24th and 25th ribonucleotide residues are linked via a linker (b) The 10th and 11th ribonucleotides Single-stranded oligo RNA molecule (c
  • Single-stranded oligo RNA molecule consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 28 (i) represented by SEQ ID NO: 31 in which the 24th and 25th ribonucleotide residues are linked via a linker
  • Single-stranded oligo RNA molecule consisting of a base sequence (j) represented by SEQ ID NO: 30 in which the 22nd and 23rd ribonucleotide residues are linked via a linker
  • Single-stranded oligo RNA molecule consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 33 in which 24th and 25th ribonucleotide residues are linked via a linker
  • a single-stranded oligo RNA molecule [13] comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 32 in which the 23rd and 24th ribonucleotide residues are linked via a linker (1) to (6)
  • the first single-stranded oligo RNA molecule having the base sequence represented by SEQ ID NO: 29 and the 21st and 22nd ribonucleotide residues are linked via a second linker (5)
  • the first single-stranded oligo RNA molecule having the base sequence represented by No. 31 and the 22nd and 23rd ribonucleotide residues are represented by SEQ ID NO: 30 linked via a second linker.
  • Combination with a second single-stranded oligo RNA molecule comprising a base sequence (6)
  • a first single-stranded oligo RNA molecule comprising: a second first consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 32 in which the 23rd and 24th ribonucleotide residues are linked via a second linker
  • RNA molecule that suppresses the expression of a target gene can be efficiently produced.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a ligation method according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of an ssTbRNA molecule (SEQ ID NO: 1).
  • P represents a proline derivative.
  • the 29th (U) to 47th (C) of SEQ ID NO: 1 corresponds to an active sequence (gene expression suppressing sequence for TGF- ⁇ 1 gene; antisense sequence).
  • FIG. 3 shows the ligation efficiency after annealing and ligation reaction using T4 RNA ligase 2 of a set (pair) of single-stranded oligo RNA molecules (strands 1 and 2) of 004 to 019 shown in Table 1.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a ligation method according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of an ssTbRNA molecule (SEQ ID NO: 1).
  • P represents a proline derivative.
  • FIG. 4 shows the structure of single-stranded oligo RNA molecules (Strands 1 and 2) 011, 016, and 018. The right side of each pair is Strand 1 and the left side is Strand 2.
  • FIG. 5 shows the change in ligation efficiency over time when 016 oligonucleic acids were ligated at different oligo RNA concentrations and different reaction temperatures.
  • FIG. 6 shows the change in ligation efficiency over time when 011, 016, and 018 oligo RNAs (100 ⁇ M) were used and ligated at different reaction temperatures.
  • A shows the result of ligation at 25 ° C. and B shows 37 ° C.
  • FIG. 7 shows the results of denaturing PAGE analysis when 011 oligo RNA was ligated under different ATP concentrations.
  • FIG. 8 shows ligation efficiency when 011 oligo RNA was ligated under different ATP concentrations.
  • FIG. 9 shows changes over time in ligation efficiency when 016 oligo RNAs were ligated under different oligo RNA concentrations and different pH conditions.
  • FIG. 10 shows the ligation efficiency when 016 oligo RNAs were ligated under different pH conditions.
  • FIG. 11 shows the ligation efficiency when 016 oligo RNAs were ligated under different oligo RNA concentrations and different MgCl 2 concentrations.
  • A shows the result of ligation in the presence of 10 ⁇ M or 100 ⁇ M oligo RNA, and B shows the presence of 10 ⁇ M or 200 ⁇ M oligo RNA.
  • FIG. 9 shows changes over time in ligation efficiency when 016 oligo RNAs were ligated under different oligo RNA concentrations and different pH conditions.
  • FIG. 10 shows the ligation efficiency when 016 oligo RNAs were lig
  • FIG. 12 shows the ligation efficiency when 016 oligo RNAs were ligated under different MgCl 2 concentrations and different pH conditions.
  • A shows the results of ligation at pH 7.5
  • B shows pH 8.0.
  • FIG. 13 shows the ligation efficiency when ligation was performed by adding PEG using different enzyme amounts.
  • FIG. 14 shows the time course of the ligation reaction using different oligo RNA concentrations.
  • FIG. 15 shows the production amount of the target product ssTbRNA molecule in the ligation reaction performed with the initial oligo RNA concentration of 100 ⁇ M and sequentially adding oligo RNA.
  • Production amount of ssTbRNA molecule (nmol) (addition amount of single-stranded oligo RNA molecule) ⁇ (FLP (Full Length Product, full-length product) (%)) / 100.
  • H on the horizontal axis of the graph represents the time after the start of ligation.
  • the oligo RNA concentration of 100 ⁇ M (10 nmol) at the start of ligation and the enzyme concentration of 4 units / nmol oligo RNA became the oligo RNA concentration of 300 ⁇ M (40 nmol) and the enzyme concentration of 1 unit / nmol oligo RNA after the final addition.
  • FIG. 17 shows a hairpin type single-stranded RNA molecule containing a gene expression suppressing sequence for the GAPDH gene, the LAMA1 gene, or the LMNA gene, and the dividing position thereof. (1) to (7) indicate division positions. Gene expression suppression sequences (active sequences / antisense sequences) for each gene are shown in a frame.
  • FIG. 17 shows a hairpin type single-stranded RNA molecule containing a gene expression suppressing sequence for the GAPDH gene, the LAMA1 gene, or the LMNA gene, and the dividing position thereof.
  • (1) to (7) indicate division positions. Gene expression suppression sequences (active sequences / antisense sequences) for each gene are shown in a frame.
  • FIG. 18 shows annealing using a pair of single-stranded oligo RNA molecules (strands 1 and 2) that are split fragments of a hairpin single-stranded RNA molecule containing a gene expression suppressing sequence for the GAPDH gene, the LAMA1 gene, or the LMNA gene. And the ligation efficiency after the ligation reaction.
  • FIG. 19 shows the ligation efficiency after annealing and ligation reaction using T4 RNA ligase of the set (pair) of strand 1 and strand 2 shown in Table 1.
  • the present invention relates to a method for producing a hairpin single-stranded RNA molecule that suppresses the expression of a target gene.
  • the hairpin type single-stranded RNA molecule produced by the method of the present invention is such that the 3 ′ end of the sense strand of the double-stranded RNA containing the gene expression suppressing sequence and the 5 ′ end of the antisense strand are non-nucleotide linkers or nucleotides
  • One or more ribonucleotide residues are further linked via a sequence containing a linker, such as a non-nucleotide linker or a nucleotide linker, to the 3 ′ end of the antisense strand.
  • hairpin type means that a single-stranded RNA molecule forms one or more double-stranded structures by intramolecular annealing (self-annealing).
  • the hairpin single-stranded RNA molecule produced by the method of the present invention typically has a 5 ′ end region including the 5 ′ end and a 3 ′ end region including the 3 ′ end separately annealed separately. This forms two double-stranded structures.
  • RNA Ribonucleic acid molecule
  • nucleic acid may be composed only of nucleotides, but nucleotides and non-nucleotide substances (for example, cyclic amine derivatives such as proline derivatives) You may be comprised from.
  • a hairpin single-stranded RNA molecule that suppresses the expression of a target gene is 2 in a sequence sandwiched between two linkers (for example, a non-nucleotide linker, a nucleotide linker, or a linker that combines them). They can be produced by synthesizing them into fragments, annealing them, and ligating them. Ligation means that two nucleic acids (typically RNA in the present invention) are linked by bonding (phosphodiester bond) a 5′-phosphate group and a 3′-hydroxyl group at their ends.
  • a relatively long hairpin single-stranded RNA molecule is produced by ligation of a pair of shorter single-stranded RNA molecules, thereby producing a high yield of the hairpin single-stranded RNA molecule. Manufacturing can be realized.
  • the present invention is a method for producing a hairpin single-stranded RNA molecule that suppresses the expression of a target gene, An annealing step for annealing the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule; A ligation step of ligating the 3 ′ end of the first single-stranded oligo RNA molecule and the 5 ′ end of the second single-stranded oligo RNA molecule with an Rnl2 family ligase; A method for producing a hairpin single-stranded RNA molecule, wherein the sequence generated by ligation of the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule includes a gene expression suppressing sequence for the target gene. About.
  • the first single-stranded oligo RNA molecule comprises a first RNA portion and a second RNA portion linked via a first linker, the first RNA portion and the second RNA portion.
  • One of the RNA moieties can bind complementarily to the other. Due to its complementary binding, the first linker can form a loop and the first RNA portion and the second RNA portion can form a stem adjacent to the loop.
  • the first RNA portion is located on the 5 'end side
  • the second RNA portion is located on the 3' end side.
  • the second single-stranded oligo RNA molecule includes a third RNA portion and a fourth RNA portion linked via a second linker, and one of the third RNA portion and the fourth RNA portion. Can be complementarily bound to the other. Due to its complementary binding, the second linker can form a loop, and the third and fourth RNA portions can form a stem adjacent to the loop. In the second single-stranded oligo RNA molecule, the third RNA portion is located on the 5 'end side and the fourth RNA portion is located on the 3' end side. Each of the first to fourth RNA portions contains one or more ribonucleotide residues.
  • the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule contain self-complementary sequences, and can each form a hairpin structure by intramolecular annealing (self-annealing).
  • One of the first RNA portion and the second RNA portion preferably has a longer base length than the other.
  • the third RNA portion preferably has a longer base length than the fourth RNA portion.
  • the fourth RNA portion preferably has a longer base length than the first RNA portion.
  • the RNA portion having the longer base length is the ribonucleotide residue or sequence thereof complementary to the RNA portion having the shorter base length.
  • it is adjacent to one linker.
  • the RNA portion having the longer base length is the ribonucleotide residue or sequence thereof complementary to the RNA portion having the shorter base length.
  • it is adjacent to the two linkers.
  • one of two RNA parts (first and second RNA parts or third and fourth RNA parts) contained in a single-stranded oligo RNA molecule can be complementarily bound to the other.
  • “Is the length of one of the two RNA parts (usually the RNA part having the shorter base length) is the other RNA part (usually the RNA having the longer base length). Part), in which case the full length of the former RNA part is complementary to the corresponding ribonucleotide residue or sequence thereof in the latter RNA part. It is.
  • One of the two RNA portions contained in a single-stranded oligo RNA molecule is completely complementary to the corresponding ribonucleotide residue or sequence thereof in the other RNA portion (ie, all ribonucleotides in one RNA portion). More preferably, the nucleotide residue has no mismatch to the corresponding ribonucleotide residue in the other RNA portion.
  • one of the two RNA parts contained in the single-stranded oligo RNA molecule is one or more, for example one or two ribonucleotides, as long as stable base pairing can be formed with the other RNA part. Residue mismatches may also be included, in which case they are also “complementarily capable of binding”. However, it is preferable that the mismatch does not exist in the ribonucleotide residue at the molecular end to be ligated in the method of the present invention.
  • one of the first RNA portion and the fourth RNA portion is shorter than the other, preferably 1 to 7 bases long, eg 1 to 6 bases long, 1 to 4 bases long, 1 to The length is 3 bases, 1 base or 2 bases.
  • the longer one (the other) of the first RNA portion and the fourth RNA portion may be 19 to 28 bases long, for example, 19 to 27 bases long, 19 to 25 bases long, 19 to 23 bases
  • the base length may be 20 to 28 bases, 21 to 27 bases, 20 to 25 bases, 22 to 27 bases, 23 to 26 bases, 24 to 28 bases, or 26 to 28 bases.
  • the second RNA portion is not limited to the following, but may be 1 to 20 bases long, for example 2 to 20 bases long, 2 It may be -15 bases long, 3-10 bases long, 3-6 bases long, 5-12 bases long, or 9-12 bases long. If the first RNA portion is shorter than the fourth RNA portion, the second RNA portion may be, but is not limited to, 8 to 38 bases long, such as 8 to 36 bases long, 12 The length may be ⁇ 36 bases, 14 to 34 bases, 14 to 33 bases, 14 to 36 bases, or 20 to 34 bases.
  • the base sequence of the first RNA portion may contain CC (cytosine-cytosine) adjacent to the linker.
  • the base sequence of the second RNA portion is such that it is complementary to the sequence. It is preferable that GG (guanine-guanine) is contained adjacent to the ⁇ .
  • the base sequence of the first RNA portion may comprise ACC (adenine-cytosine-cytosine), GCC (guanine-cytosine-cytosine), or UCC (uracil-cytosine-cytosine) adjacent to the linker.
  • the base sequence of the second RNA portion is GGU (guanine-guanine-uracil), GGC (guanine-guanine-cytosine), adjacent to the linker, respectively, so as to be complementary to the sequence, or GGA (guanine-guanine-adenine) is preferably included.
  • the base sequence of the third RNA portion may include C (cytosine) adjacent to the linker.
  • the base sequence of the fourth RNA portion is It is preferable that G (guanine) is contained adjacently.
  • the base length of the first or second single-stranded oligo RNA molecule is not limited to the following, but is preferably 13 to 48 bases.
  • the base length of the first single-stranded oligo RNA molecule ie, the total base length of the first RNA portion and the second RNA portion (including the linker portion) Is preferably 21-48 bases long, for example, 21-45 bases long, 25-45 bases long, 26-35 bases long, 26-30 bases long, 26-28 bases long, or 33-36. Base length.
  • the base length of the first single-stranded oligo RNA molecule ie, the total base length of the first RNA portion and the second RNA portion (including the linker portion) Is preferably 13 to 45 bases, for example, 13 to 43 bases, 15 to 41 bases, 15 to 30 bases, 17 to 25 bases, or 20 to 25 bases.
  • the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule are complementary to each other in the sequence of the 5 'end or the 3' end.
  • the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule are molecules between complementary sequences at 5 ′ end or 3 ′ end (preferably, between completely complementary sequences). Interplexes can be formed. More specifically, in one embodiment, the sequence at the 5 ′ end of the first single-stranded oligo RNA molecule forming the hairpin structure (into the stem loop of the hairpin structure at the 5 ′ end of the first RNA portion).
  • Sequence not included and 5 ′ end sequence of the second single-stranded oligo RNA molecule forming the hairpin structure (sequence not included in the stem loop of the 5 ′ end of the third RNA portion of the hairpin structure) ) are complementary to each other and can form intermolecular duplexes.
  • the sequence at the 3 ′ end of the first single-stranded oligo RNA molecule that has formed the hairpin structure (the sequence that is not included in the stem loop of the hairpin structure at the 3 ′ end of the second RNA portion)
  • the sequence at the 3 ′ end of the second single-stranded oligo RNA molecule forming the hairpin structure (the sequence at the 3 ′ end of the fourth RNA portion and not included in the stem loop of the hairpin structure) is complementary to each other. And can form intermolecular duplexes.
  • the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule form an intermolecular duplex between complementary sequences at the 5 ′ end or the 3 ′ end.
  • a double-stranded oligo RNA is generated.
  • the length of the complementary sequence (not including the gap portion described below) between the first and second single-stranded oligo RNA molecules is not limited to the following, but is usually 6 bases or longer, For example, 7 or more bases, 10 or more bases, 12 or more bases, 14 or more bases, or 18 or more bases, for example, 6 to 27 bases, 7 to 25 bases, 10 to 25 bases, 12 to 23 bases It may be long, 12-22 bases long, 12-15 bases long, or 18-23 bases long.
  • the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule form a duplex
  • the 3 ′ end of the first single-stranded oligo RNA molecule Ribonucleotide residues and the 5 ′ end ribonucleotide residue of the second single-stranded oligo RNA molecule generate a nick.
  • the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule are molecules having a complementary sequence between the first and second single-stranded oligo RNA molecules.
  • nick refers to a state in which a phosphodiester bond between two nucleotide residues is broken and a 3 ′ hydroxyl group and a 5 ′ phosphate group are released in one nucleotide strand of a nucleic acid duplex.
  • Nicks can be linked by a ligation reaction.
  • the annealing step of the method of the present invention when the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule form a duplex, the 5 ′ end of the first single-stranded oligo RNA molecule There is a gap of one or more ribonucleotide residues between this ribonucleotide residue and the 3 ′ terminal ribonucleotide residue of the second single-stranded oligo RNA molecule.
  • the gap of one or more ribonucleotide residues may be a gap of 1 to 4 residues (1, 2, 3, or 4 residues). No base pairing is formed at this gap.
  • the gap between the 5 ′ terminal ribonucleotide residue of the first single stranded oligo RNA molecule and the 3 ′ terminal ribonucleotide residue of the second single stranded oligo RNA molecule is the first single stranded oligo RNA molecule.
  • the RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule are annealed, they may be closer to the first linker or closer to the second linker.
  • the sequence generated by ligation of the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule includes a gene expression suppressing sequence for the target gene.
  • the first RNA portion or the fourth RNA portion may include a gene expression suppressing sequence (sense sequence or antisense sequence; for example, sense sequence) for the target gene.
  • the sequence in which the second RNA portion and the third RNA portion are linked by ligation can contain a gene expression suppression sequence (antisense sequence or sense sequence; for example, an antisense sequence) for the target gene.
  • the second RNA portion or the third RNA portion may contain a gene expression suppressing sequence (antisense sequence or sense sequence; for example, an antisense sequence) for the target gene.
  • the linker for example, the first linker and the second linker may be a non-nucleotide linker, a nucleotide linker, or a combination thereof.
  • the first single stranded oligo RNA molecule has uracil (U) or adenine (A) at the 3 ′ end and the second single stranded oligo RNA molecule has uracil (5 ′ end).
  • a single-stranded oligo RNA molecule having uracil (U) or adenine (A) at the 3 ′ end or 5 ′ end means that the ribonucleotide residue at the 3 ′ end or 5 ′ end of the single-stranded oligo RNA molecule Means containing uracil (U) or adenine (A) as a base.
  • a preferred combination of the base of the 3 ′ end ribonucleotide residue of the first single-stranded oligo RNA molecule and the base of the 5 ′ end ribonucleotide residue of the second single-stranded oligo RNA molecule is , UA, UU, AU, or AA.
  • Lx 1 and Lx 2 are linkers (for example, non-nucleotide linkers, nucleotide linkers, or combinations thereof).
  • linkers for example, non-nucleotide linkers, nucleotide linkers, or combinations thereof.
  • relatively long hairpin single-stranded RNA molecules can be produced by ligating pairs of shorter single-stranded RNA molecules, thereby achieving high yields.
  • a method for producing a hairpin single-stranded RNA molecule that suppresses expression of a target gene comprises A first single-stranded oligo RNA molecule represented by the following formula (I) (in FIG. 1, strand 1): 5′-Xs-Lx 1 -Xa-3 ′ Formula (I) And a second single-stranded oligo RNA molecule represented by the following formula (II) (strand 2 in FIG.
  • the method for producing a hairpin single-stranded RNA molecule that suppresses the expression of a target gene comprises: The first single-stranded oligo RNA molecule represented by the following formula (A): 5′-XXs-Lx 1 -XXa 3 -XXa 2 -XXa 1 -3 'Formula (A) And a second single-stranded oligo RNA molecule represented by the following formula (B): 5′-YYa-Lx 2 -YYs-3 ′ Formula (B) And an ligation step of ligating the 3 ′ end of the first single-stranded oligo RNA molecule and the 5 ′ end of the second single-stranded oligo RNA molecule. This ligation can be performed by Rnl2 family ligase.
  • oligo RNA and “oligo RNA molecule” refer to an RNA molecule having a base sequence of 49 bases or less in length (the number of residues of linker moieties such as non-nucleotide linkers and nucleotide linkers is not counted). .
  • the terms “oligo RNA” and “oligo RNA molecule” are usually used interchangeably.
  • the single-stranded oligo RNA molecule according to the present invention may be referred to as single-stranded oligo RNA, oligonucleic acid, single-stranded nucleic acid molecule, oligo RNA, or oligo RNA molecule.
  • Xs, Xa, Ya 1 , Ya 2 , Ya 3 , and Ys represent one or more ribonucleotide residues.
  • Lx 1 and Lx 2 each independently represent a linker, for example, non-nucleotide linker, nucleotide linker, or combinations thereof.
  • Formula (I) represents a structure in which the regions Xs and Xa are connected via Lx 1 .
  • Formula (II) has a structure in which a ribonucleotide sequence (Ya 1 -Ya 2 -Ya 3 ) in which regions Ya 1 , Ya 2 , and Ya 3 are linked in this order and a region Ys are linked through Lx 2 Represents.
  • XXs, XXa 3 , XXa 2 , XXa 1 , YYa, and YYs represent one or more ribonucleotide residues.
  • Lx 1 and Lx 2 each independently represent a linker, for example, non-nucleotide linker, nucleotide linker, or combinations thereof.
  • Formula (A), region XXa 3, XXa 2, and XXa 1 is linked ribonucleotide sequence in this order (XXa 3 -XXa 2 -XXa 1) a region XXs is linked via a Lx 1 structure Represents.
  • Formula (B), the area YYa and YYs have represents a linking structure via Lx 2.
  • Xs, Xa, Ya 1 , Ya 2 , Ya 3 , Ys, XXs, XXa 3 , XXa 2 , XXa 1 , YYa, and YYs consist of ribonucleotide residues.
  • the ribonucleotide residue may have any nucleobase selected from adenine, uracil, guanine, or cytosine.
  • the ribonucleotide residue may also be a modified ribonucleotide residue, for example, having a modified nucleobase (modified base).
  • Modifications include, but are not limited to, fluorescent dye labels, methylation, halogenation, pseudouridine, amination, deamination, thiolation, dihydrolation, and the like.
  • Xs, Xa, Ya 1 , Ya 2 , Ya 3 , and Ys may each independently consist of only unmodified ribonucleotide residues, or modified ribonucleotides in addition to unmodified ribonucleotide residues A residue may be included, and it may consist only of a modified ribonucleotide residue.
  • Xs may contain a modified ribonucleotide residue at the 5 ′ end.
  • Ys may contain a modified ribonucleotide residue at the 3 ′ end.
  • XXs, XXa 3 , XXa 2 , XXa 1 , YYa, and YYs may each independently consist only of unmodified ribonucleotide residues, or in addition to unmodified ribonucleotide residues
  • the modified ribonucleotide residue may be included, or the modified ribonucleotide residue alone may be included.
  • XXs may contain a modified ribonucleotide residue at the 5 ′ end.
  • YYs may contain a modified ribonucleotide residue at the 3 ′ end.
  • Xa-Ya 1 (nucleotide sequence in which Xa and Ya 1 are linked by ligation) generated in the ligation step is complementary to Xs.
  • Xs may be 19 to 28 bases long, for example 19 to 27 bases long, 19 to 25 bases long, 19 to 23 bases long, 20 to 28 bases long, 21 bases to 27 bases, 21 It may be 25 to 25 bases, 22 to 27 bases, 23 to 26 bases, 24 to 28 bases, or 26 to 28 bases long.
  • XXa 1 -YYa (nucleotide sequence in which XXa 1 and YYa are linked by ligation) generated in the ligation step is complementary to YYs.
  • YYs may be 19 to 28 bases long, such as 19 to 27 bases long, 19 to 25 bases long, 19 to 23 bases long, 20 to 28 bases long, 21 bases to 27 bases, 21 The base may be 25 to 25 bases, 22 to 27 bases long, 23 to 26 bases long, 24 to 28 bases long, or 26 to 28 bases long.
  • Xa is complementary to the corresponding residue or sequence in Xs.
  • the base sequence of Xs may contain C (cytosine) adjacent to the linker.
  • the base sequence of Xa includes G (guanine) adjacent to the linker so as to be complementary to Xs.
  • the base sequence of Xs may contain CC (cytosine-cytosine) adjacent to the linker.
  • the base sequence of Xa includes GG (guanine-guanine) adjacent to the linker so as to be complementary to Xs.
  • the base sequence of Xs may contain ACC (adenine-cytosine-cytosine) adjacent to the linker.
  • the base sequence of Xa includes GGU (guanine-guanine-uracil) adjacent to the linker so as to be complementary to Xs.
  • Xa may comprise the base uracil (U) or adenine (A) at the 3 'end.
  • Xa may be 1 to 20 bases long, for example, 2 to 20 bases long, 2 to 15 bases long, 3 to 10 bases long, 3 to 6 bases long, 5 to 12 bases long, or 9 to 12 bases long It may be.
  • XXa 3 is complementary to XXs.
  • the base sequence of XXs may include C (cytosine) adjacent to the linker.
  • the base sequence of XXa 3 is such that the complement of the XXs, including G (guanine) adjacent to the linker.
  • the base sequence of XXs may contain CC (cytosine-cytosine) adjacent to the linker.
  • the base sequence of XXa 3 is such that the complement of the XXs, GG adjacent to the linker - containing (guanine guanine).
  • the base sequence of XXs may include ACC (adenine-cytosine-cytosine; in the 5 ′ to 3 ′ direction) adjacent to the linker.
  • the base sequence of XXa 3 is to be complementary to the XXs, GGU adjacent to the linker; including (guanine - uracil - guanine in the direction of 5 'to 3').
  • the base sequence of XXa 1 may contain the base uracil (U) or adenine (A) at the 3 ′ end.
  • XXa 3 and XXs are preferably 1 to 7 bases long, for example, 1 to 4 bases long, 1 base long or 2 bases long. In one embodiment, if YYs of 26-28 bases in length, XXa 3 and XXs may be one bases in length.
  • Ya 3 is complementary to Ys.
  • the base sequence of Ya 3 may include C (cytosine) adjacent to the linker.
  • the base sequence of the Ys is as will become complementary to Ya 3, including G (guanine) adjacent to the linker.
  • Ya 3 and Ys are preferably 1 to 7 bases long, for example, 1 to 4 bases long, 1 base long or 2 bases long. In one embodiment, when Xs is 26 to 28 bases in length, Ya 3 and Ys may be 1 base in length.
  • YYa is complementary to the corresponding residue or sequence in YYs.
  • the base sequence of YYa may include C (cytosine) adjacent to the linker.
  • the base sequence of YYs includes G (guanine) adjacent to the linker so as to be complementary to YYa.
  • YYa may be 2 to 20 bases long, for example, 2 to 15 bases long, 3 to 10 bases long, 3 to 6 bases long, 5 to 12 bases long, or 9 to 12 bases long.
  • complementary means that two nucleic acids or nucleotides can form a stable base pairing between them.
  • Two complementary nucleic acids have the same base length.
  • Two complementary nucleic acids typically consist of each other's complementary sequences (complementary strands), ie, are completely complementary.
  • the two complementary nucleic acids may each contain a modified base and a nucleobase capable of forming a base pair with it at the corresponding position during annealing.
  • Ya 2 does not form base pairing with any of Xs and Ys when the hairpin single-stranded RNA molecule according to the present invention after ligation undergoes intramolecular annealing (self-annealing).
  • Ya 2 is preferably 1 to 4 bases in length, for example, 1, 2, or 3 bases in length.
  • XXa 2 when the hairpin single-stranded RNA molecules according to the present invention after ligation occurs intramolecular annealing (self-annealing), do not form with any base pairing XXs and YYs.
  • XXa 2 is preferably 1 to 4 bases in length, for example, 1, 2, or 3 bases in length.
  • the total base length of Xs and Xa in formula (I) (not including a linker moiety such as a non-nucleotide linker, a nucleotide linker, or a combination thereof) Is preferably 21 to 48 bases long, for example, 21 to 45 bases long, 25 to 45 bases long, 26 to 35 bases long, 26 to 30 bases long, 26 to 28 bases long, or 33 to 36 bases long is there.
  • Ya 1 in the formula (II) is preferably 6 to 27 bases long, for example, 7 to 25 bases long, 10 to 25 bases long, 12 to It is 23 bases long, 12-22 bases long, 12-15 bases long, or 18-23 bases long.
  • the total base length of Ya 1 , Ya 2 , Ya 3 , and Ys in formula (II) Is preferably 13 to 45 bases long, such as 13 to 43 bases, 15 to 41 bases, 15 to 30 bases, 17 to 25 bases, or 20 to 25 bases. It is long.
  • the total base length of XXs, XXa 3 , XXa 2 , and XXa 1 in formula (A) is preferably 13 to 45 bases long, such as 13 to 43 bases, 15 to 41 bases, 15 to 30 bases, 17 to 25 bases, or 20 to 25 bases. It is long.
  • XXa 1 is preferably 6 to 27 bases long, for example 7 to 25 bases long, 10 to 25 bases long, 12 to 23 bases long, 12 to 22 bases long, 12 to 15 bases long, or 18 to 23 bases It is long.
  • the total base length of YYa and YYs in formula (B) (not including a linker moiety such as a non-nucleotide linker, a nucleotide linker, or a combination thereof) ) Is preferably 21 to 48 bases long, for example, 21 to 45 bases long, 25 to 45 bases long, 26 to 35 bases long, 26 to 30 bases long, 26 to 28 bases long, or 33 to 36 bases long It is.
  • the linker for example, the first linker and the second linker are not particularly limited, but each may independently be, for example, a non-nucleotide linker, a nucleotide linker, or a combination thereof.
  • a nucleotide linker consists of one or more nucleotide residues (ribonucleotide residues or deoxyribonucleotide residues, preferably ribonucleotide residues).
  • Non-nucleotide linkers do not contain nucleotide residues.
  • the structural unit of the linker used in the present invention is not particularly limited, and may be a nucleotide residue and / or a non-nucleotide residue.
  • a linker that is a combination of a non-nucleotide linker and a nucleotide linker includes both nucleotide and non-nucleotide residues.
  • the linker of the present invention can be composed of any of the following residues (1) to (7), for example.
  • both the first linker and the second linker may consist of nucleotide residues (nucleotide linkers), or consist of non-nucleotide residues (non-nucleotide linkers). It may be. Alternatively, one of the first linker and the second linker may be a nucleotide residue, and the other may be a non-nucleotide residue. (In the above formula, the linker Lx 1 and Lx 2) first linker and second linker may be the same structure or may have different structures.
  • the linker used in the present invention for example, the first linker and the second linker (Lx 1 and Lx 2 in the above formula) contain non-nucleotide residues
  • the number of non-nucleotide residues is not particularly limited. For example, it may be 1 to 8, 1 to 6, 1 to 4, 1, 2 or 3.
  • a “non-nucleotide residue” refers to a building block of a non-nucleotide linker.
  • the non-nucleotide residue is not limited to the following, and may be, for example, a cyclic amine derivative having a pyrrolidine skeleton or a piperidine skeleton.
  • the non-nucleotide residue may be, for example, a unit (one) having a structure represented by the following formula (III).
  • the linker for example, the first linker and the second linker (wherein Lx 1 and Lx 2 ) are non-nucleotides containing at least one of a pyrrolidine skeleton and a piperidine skeleton. It may be a linker.
  • the first linker and the second linker (Lx 1 and Lx 2 in the above formula) may have the same structure or different structures.
  • the first linker and the second linker in the above formula, Lx 1 and Lx 2 ) may each independently have a non-nucleotide structure containing a pyrrolidine skeleton, or a non-nucleotide structure containing a piperidine skeleton.
  • the hairpin single-stranded RNA molecule produced by the method of the present invention is excellent in nuclease resistance because the sense strand and the antisense strand are connected by such a linker.
  • the pyrrolidine skeleton may be, for example, a pyrrolidine derivative skeleton in which one or more carbon atoms constituting the 5-membered ring of pyrrolidine are substituted.
  • a carbon atom other than the 2-position carbon atom (C-2) is preferred.
  • the carbon atom may be substituted with, for example, a nitrogen atom, an oxygen atom, or a sulfur atom.
  • the pyrrolidine skeleton may contain, for example, a carbon-carbon double bond or a carbon-nitrogen double bond in the 5-membered ring of pyrrolidine.
  • the carbon atom and nitrogen atom constituting the 5-membered ring of pyrrolidine may be bonded to, for example, a hydrogen atom or a substituent as described later.
  • the linker Lx 1 may link, for example, Xs and Xa in the formula (I) and XXs and XXa 3 in the formula (A) via any group of the pyrrolidine skeleton.
  • the linker Lx 2 may link, for example, Ya 3 and Ys in the formula (II) and YYa and YYs in the formula (B) via any group of the pyrrolidine skeleton.
  • pyrrolidine skeleton examples include a proline skeleton and a prolinol skeleton.
  • the piperidine skeleton may be, for example, a skeleton of a piperidine derivative in which one or more carbons constituting the six-membered ring of piperidine are substituted. It is preferable.
  • the carbon atom may be substituted with, for example, a nitrogen atom, an oxygen atom, or a sulfur atom.
  • the piperidine skeleton may contain, for example, a carbon-carbon double bond or a carbon-nitrogen double bond in the 6-membered ring of piperidine.
  • the carbon atom and nitrogen atom constituting the piperidine 6-membered ring may be bonded to, for example, a hydrogen atom or a substituent as described later.
  • the linker Lx 1 may link, for example, Xs and Xa in the formula (I) and XXs and XXa 3 in the formula (A) via any group of the piperidine skeleton.
  • the linker Lx 2 may link, for example, Ya 3 and Ys in the formula (II) and YYa and YYs in the formula (B) via any group of the piperidine skeleton. They can be linked via any one carbon atom of the 6-membered ring and a nitrogen atom, preferably via the nitrogen atom (C-2) at the 2-position of the 6-membered ring.
  • the linker may contain, for example, only non-nucleotide residues having the non-nucleotide structure described above.
  • the linker region may be represented by, for example, the following formula (III) or may include one or more non-nucleotide residues represented by the following formula (III).
  • X 1 and X 2 are each independently H 2 , O, S or NH
  • Y 1 and Y 2 are each independently a single bond, CH 2 , NH, O or S
  • R 3 is a hydrogen atom or substituent bonded to C-3, C-4, C-5 or C-6 on ring A
  • L 1 is an alkylene chain consisting of n atoms, wherein the hydrogen atom on the alkylene carbon atom is replaced with OH, OR a , NH 2 , NHR a , NR a R b , SH, or SR a May or may not be substituted
  • L 1 is a polyether chain in which one or more carbon atoms of the alkylene chain are substituted with an oxygen atom
  • Y 1 is NH, O, or S
  • L 2 is an alkylene chain consisting of m atoms, wherein the hydrogen atom on the alkylene carbon atom is substituted with OH, OR c , NH 2 , NHR c , NR c R d , SH or SR c May not be substituted, or L 2 is a polyether chain in which one or more carbon atoms of the alkylene chain are substituted with an oxygen atom,
  • Y 2 is NH, O or S
  • the atom of L 2 bonded to Y 2 is carbon
  • the atom of L 2 bonded to OR 2 is carbon, and oxygen atoms are not adjacent to each other.
  • R a , R b , R c and R d are each independently a substituent or a protecting group; l is 1 or 2; m is an integer ranging from 0 to 30; n is an integer ranging from 0 to 30; In ring A, one carbon atom other than C-2 on ring A may be substituted with a nitrogen atom, an oxygen atom, or a sulfur atom. Ring A may contain a carbon-carbon double bond or a carbon-nitrogen double bond, Here, R 1 and R 2 may or may not be present. When present, R 1 and R 2 are each independently represented by the formula (III) in which R 1 and R 2 are not present. The represented non-nucleotide residue.
  • Xs and Xa in the formula (I) and XXs and XXa 3 in the formula (A) can be linked to the linker Lx 1 via —OR 1 — or —OR 2 — in formula (III).
  • Xs may be linked to linker Lx 1 through —OR 1 — and Xa through —OR 2 —.
  • Xs may be linked to linker Lx 1 through —OR 2 — and Xa through —OR 1 —.
  • XXs may be linked to linker Lx 1 via —OR 1 — and XXa 3 via —OR 2 —.
  • XXs may be linked to linker Lx 1 via —OR 2 — and XXa 3 via —OR 1 —.
  • Ya 3 and Ys in the formula (II) and YYa and YYs in the formula (B) can be linked to the linker Lx 2 via —OR 1 — or —OR 2 — in formula (III).
  • Ya 3 may be linked to linker Lx 2 through —OR 1 — and Ys through —OR 2 —.
  • Ya 3 may be linked to linker Lx 2 via —OR 2 — and Ys via —OR 1 —.
  • YYa may be linked to linker Lx 2 through —OR 1 — and YYs through —OR 2 —.
  • YYa may be linked to linker Lx 2 via —OR 2 — and YYs via —OR 1 —.
  • Xs is linked via —OR 2 —
  • Xa is linked via —OR 1 — to Linker Lx 1 and Ya 3 is linked via —OR 2 — and Ys is —OR 1 It may be linked to the linker Lx 2 via —.
  • XXs is linked to linker Lx 1 through —OR 2 —, XXa 3 through —OR 1 —, and YYa through —OR 2 —, and YYs is —OR.
  • the linker Lx 2 may be linked via 1- .
  • X 1 and X 2 are each independently, for example, H 2 , O, S or NH.
  • X 1 being H 2 means that X 1 together with the carbon atom to which X 1 is bonded forms CH 2 (methylene group). The same is true for X 2.
  • Y 1 and Y 2 are each independently a single bond, CH 2 , NH, O or S.
  • l 1 or 2.
  • ring A is a 5-membered ring, for example, the pyrrolidine skeleton.
  • the pyrrolidine skeleton include a proline skeleton and a prolinol skeleton, and examples thereof include a divalent structure.
  • ring A is a 6-membered ring, for example, the piperidine skeleton.
  • one carbon atom other than C-2 on ring A may be substituted with a nitrogen atom, an oxygen atom or a sulfur atom.
  • Ring A may contain a carbon-carbon double bond or a carbon-nitrogen double bond in ring A.
  • Ring A may be, for example, either L-type or D-type.
  • R 3 is a hydrogen atom or a substituent bonded to C-3, C-4, C-5 or C-6 on the ring A.
  • R 3 is the above-described substituent, the substituent R 3 may be one, plural, or absent, and when plural, it may be the same or different.
  • the substituent R 3 is, for example, halogen, OH, OR 4 , NH 2 , NHR 4 , NR 4 R 5 , SH, SR 4 or an oxo group ( ⁇ O).
  • R 4 and R 5 are, for example, each independently a substituent or a protecting group, and may be the same or different.
  • substituents include halogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, haloalkyl, aryl, heteroaryl, arylalkyl, cycloalkyl, cycloalkenyl, cycloalkylalkyl, cyclylalkyl, hydroxyalkyl, alkoxyalkyl, aminoalkyl, heterocyclylalkenyl. , Heterocyclylalkyl, heteroarylalkyl, silyl, silyloxyalkyl and the like. The same applies hereinafter.
  • the substituent R 3 may be any of these listed substituents.
  • the protecting group is, for example, a functional group that converts a highly reactive functional group to be inert, and examples thereof include known protecting groups.
  • the description of the literature J. F. W. McOmie, “Protecting Groups in Organic Chemistry”, Plenum Press, London and New York, 1973) can be used for the protecting group.
  • the protecting group is not particularly limited, and examples thereof include tert-butyldimethylsilyl group (TBDMS), bis (2-acetoxyethyloxy) methyl group (ACE), triisopropylsilyloxymethyl group (TOM), 1- (2 -Cyanoethoxy) ethyl group (CEE), 2-cyanoethoxymethyl group (CEM), tolylsulfonylethoxymethyl group (TEM), dimethoxytrityl group (DMTr) and the like.
  • TBDMS tert-butyldimethylsilyl group
  • ACE (2-acetoxyethyloxy) methyl group
  • TOM triisopropylsilyloxymethyl group
  • CEE 2-Cyanoethoxymethyl group
  • CEM 2-cyanoethoxymethyl group
  • TEM dimethoxytrityl group
  • DMTr dimethoxytrityl group
  • R 3 is OR 4
  • the protecting group is not particularly
  • L 1 is an alkylene chain consisting of n atoms.
  • the hydrogen atom on the alkylene carbon atom may be substituted with, for example, OH, OR a , NH 2 , NHR a , NR a R b , SH, or SR a , or may not be substituted.
  • L 1 may be a polyether chain in which one or more carbon atoms of the alkylene chain are replaced with an oxygen atom.
  • the polyether chain is, for example, polyethylene glycol.
  • Y 1 is NH, O, or S
  • the L 1 atom bonded to Y 1 is carbon
  • the L 1 atom bonded to OR 1 is carbon
  • oxygen atoms are not adjacent to each other. That is, for example, when Y 1 is O, the oxygen atom and the oxygen atom of L 1 are not adjacent, and the oxygen atom of OR 1 and the oxygen atom of L 1 are not adjacent.
  • L 2 is an alkylene chain composed of m atoms.
  • the hydrogen atom on the alkylene carbon atom may be substituted with, for example, OH, OR c , NH 2 , NHR c , NR c R d , SH or SR c , or may not be substituted.
  • L 2 may be a polyether chain in which one or more carbon atoms of the alkylene chain are substituted with an oxygen atom.
  • Y 2 is NH, O, or S
  • the L 2 atom bonded to Y 2 is carbon
  • the L 2 atom bonded to OR 2 is carbon
  • oxygen atoms are not adjacent to each other. That is, for example, when Y 2 is O, the oxygen atom and the oxygen atom of L 2 are not adjacent, and the oxygen atom of OR 2 and the oxygen atom of L 2 are not adjacent.
  • N in L 1 and m in L 2 are not particularly limited, and the lower limit is, for example, 0, and the upper limit is not particularly limited.
  • n and m can be appropriately set depending on, for example, the desired lengths of the linkers Lx 1 and Lx 2 .
  • n and m are each preferably from 0 to 30, more preferably from 0 to 20, and even more preferably from 0 to 15 from the viewpoints of production cost and yield, for example.
  • n + m is, for example, 0 to 30, preferably 0 to 20, and more preferably 0 to 15.
  • R a , R b , R c and R d are each independently a substituent or a protecting group, for example.
  • the substituent and the protecting group are the same as described above, for example.
  • hydrogen atoms may be independently substituted with halogens such as Cl, Br, F and I, for example.
  • the linker is represented by any of the following formulas (IV-1) to (IV-9) or represented by the following formulas (IV-1) to (IV-9): It may contain one or more non-nucleotide residues.
  • q is an integer of 0 to 10.
  • the linker is represented by the following formula (V) or (VI), or one or two non-nucleotide residues represented by the following formula (V) or (VI): It may contain more than one.
  • the first RNA moiety (Xs, XXs) is on the 2-position carbon atom side in formula (VI) and the second RNA moiety (Xa, XXa 3 ) is the 1-position nitrogen in formula (VI). in atomic side, coupled with a linker Lx 1, third RNA portion (Ya 3, YYA) in 2-position carbon atom side, a fourth RNA portion (Ys, YYs) is 1-position nitrogen of formula (VI) in atomic side, it may be linked with a linker Lx 2.
  • the linker represented by the formula (VI) may be an optically active substance represented by the following formula (VI-1) or (VI-2).
  • Xa is complementary to the 3 ′ region of Xs
  • Ya 3 is complementary to Ys.
  • Xa turns back toward Xs
  • Xa forms a double strand by self-annealing with Xs.
  • Ys is folded toward the Ya 3, Ys by Ya 3 and self-annealing to form duplexes.
  • YYA is complementary to 5 'side region of the YYs
  • XXa 3 is complementary to XXs. Therefore, in the first single-stranded oligo RNA molecule, XXa 3 folds toward XXs, and XXa 3 forms a duplex by self-annealing with XXs. Similarly, in the second single-stranded oligo RNA molecule, YYa folds toward YYs, and YYa forms a double strand by self-annealing with YYs.
  • the linker as described above tends to form a ⁇ -turn structure. Therefore, the first single-stranded oligo RNA molecule of the formula (I) has a folded structure on the ⁇ -turn side by the linker Lx 1 so that when Xa self-anneals with Xs, the 3 ′ end of Xa is It is considered that the structure of the second single-stranded oligo RNA molecule (II) is easily accessible to the 5 ′ end (5 ′ end of Ya 1 ). The same applies to the first and second single-stranded oligo RNA molecules of the formulas (A) and (B).
  • the linker eg, the first linker and the second linker (wherein Lx 1 and Lx 2 ) may be nucleotide linkers consisting of one or more nucleotide residues.
  • the linker is a nucleotide linker
  • the length is not particularly limited, but the sequence before and after the linker, for example, the first RNA portion and the second RNA portion, or the third RNA portion and the fourth RNA. It is preferable that the length does not hinder the formation of a double chain by the portion.
  • the length (number of bases) and the base sequence of the first linker and the second linker (in the above formula, Lx 1 and Lx 2 ) which are nucleotide linkers may be the same or different.
  • the length of the nucleotide linker may be, for example, 1 base or more, 2 bases or more, or 3 bases or more, and may be 100 bases or less, 80 bases or less, or 50 bases or less, for example.
  • the length of such a nucleotide linker may be, for example, 1 to 50 bases, 1 to 30 bases, 3 to 20 bases, 3 to 10 bases, or 3 to 7 bases. There may be 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 bases.
  • the nucleotide linker is preferably not self-complementary and has a structure that does not cause self-annealing within the sequence.
  • the linker used in the present invention for example, the first linker and the second linker (in the above formula, Lx 1 and Lx 2 ) are used to convert an unmodified nucleotide residue and a modified nucleotide residue (for example, a modified ribonucleotide residue).
  • a modified nucleotide residue for example, a modified ribonucleotide residue.
  • the number of modified nucleotide residues is not particularly limited, and may be, for example, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, for example 1 or 2.
  • nucleotide linkers used in the present invention include 5′-CACACACC-3 ′, 5′-CACACACA-3 ′, or An example of the linker is a 5′-UUCG-3 ′ RNA sequence.
  • the first linker and the second linker (wherein Lx 1 and Lx 2 ) are each independently 5′-CACACACC-3 ′, Selected from 5'-CCACACACC-3 'and 5'-UUCCG-3'.
  • the first linker consists of the 5′-CACACACC-3 ′ RNA sequence
  • the second linker is 5′-UUCCG-3. It consists of 'RNA sequence.
  • the first and second single-stranded oligo RNA molecules can be prepared using RNA synthesis methods known to those skilled in the art.
  • RNA synthesis methods known to those skilled in the art include the phosphoramidite method and the H-phosphonate method.
  • a ribonucleoside bound to a hydrophobic group of a carrier is elongated by a condensation reaction with an RNA amidite (ribonucleoside phosphoramidite), undergoes a condensation reaction with an RNA amidite through oxidation and deprotection.
  • RNA synthesis can be performed.
  • the first and second single-stranded oligo RNA molecules of the formulas (I) and (II) will be described as an example.
  • the first and second single-stranded oligo RNA molecules according to the present invention can be synthesized by an RNA synthesis method, for example, After synthesizing the sequence (Xa, Ys) from the 3 ′ end to the front of the linker by the phosphoramidite method, a non-nucleotide residue such as a cyclic amine derivative having a pyrrolidine skeleton or a piperidine skeleton is bound. It can be produced by forming a linker and sequentially synthesizing a sequence (Xs; or Ya 3 , Ya 2 , and Ya 1 ) from the linker to the 5 ′ end.
  • the first and second single-stranded oligo RNA molecules according to the present invention can be synthesized by the RNA synthesis method, for example, phosphoramidite method, of the sequence (Xa, Ys) from the 3 ′ end side to the nucleotide linker. Synthesis, followed by synthesis of a nucleotide linker sequence, and further by sequentially synthesizing a sequence (Xs; or Ya 3 , Ya 2 , and Ya 1 ) from the back of the nucleotide linker to the 5 ′ end can do.
  • the RNA synthesis method for example, phosphoramidite method
  • RNA amidite can be used.
  • TDMS t-butyldimethylsilyl
  • TOM triisopropylsilyloxymethyl
  • ACE bis (2-acetoxyethoxy) methyl
  • RNA amidites can also be used.
  • any solid phase carrier such as polystyrene carrier, acrylamide carrier, or glass carrier can be used for RNA synthesis.
  • the carrier may be in any form such as a bead, plate, chip, tube or the like.
  • carriers, polystyrene beads, for example NittoPhase (R) HL rG (ibu ), or rU (KINOVATE) include, but are not limited to.
  • a cyclic amine derivative for forming a non-nucleotide linker is a monomer for RNA synthesis and has, for example, a structure of the following formula (VII).
  • This cyclic amine derivative basically corresponds to each of the above linker structures, and the description of the linker structure is also incorporated in this cyclic amine derivative.
  • the cyclic amine derivative that forms a linker can be used, for example, as an amidite for automatic nucleic acid synthesis, and can be applied to, for example, a general nucleic acid automatic synthesizer.
  • X 1 and X 2 are each independently H 2 , O, S or NH; Y 1 and Y 2 are each independently a single bond, CH 2 , NH, O or S; R 1 and R 2 are each independently H, a protecting group or a phosphate protecting group; R 3 is a hydrogen atom or substituent bonded to C-3, C-4, C-5 or C-6 on ring A; L 1 is an alkylene chain consisting of n atoms, wherein the hydrogen atom on the alkylene carbon atom is replaced with OH, OR a , NH 2 , NHR a , NR a R b , SH, or SR a May or may not be substituted, or L 1 is a polyether chain in which one or more carbon atoms of the alkylene chain are substituted with an oxygen atom,
  • Y 1 is NH, O, or S
  • the atom of L 1 bonded to Y 1 is carbon
  • the atom of L 1 is atom of L 1
  • L 2 is an alkylene chain consisting of m atoms, wherein the hydrogen atom on the alkylene carbon atom is substituted with OH, OR c , NH 2 , NHR c , NR c R d , SH or SR c May not be substituted, or L 2 is a polyether chain in which one or more carbon atoms of the alkylene chain are substituted with an oxygen atom,
  • Y 2 is NH, O or S
  • the atom of L 2 bonded to Y 2 is carbon
  • the atom of L 2 bonded to OR 2 is carbon, and oxygen atoms are not adjacent to each other.
  • R a , R b , R c and R d are each independently a substituent or a protecting group; l is 1 or 2; m is an integer ranging from 0 to 30; n is an integer ranging from 0 to 30; In ring A, one carbon atom other than C-2 on ring A may be substituted with a nitrogen atom, an oxygen atom or a sulfur atom, Ring A may contain a carbon-carbon double bond or a carbon-nitrogen double bond.
  • R 1 and R 2 are each independently H, a protecting group, or a phosphate protecting group, as described above.
  • the protecting group is the same as described in the above formula (III), and can be selected from, for example, group I as a specific example.
  • group I include a dimethoxytrityl (DMTr) group, a TBDMS group, an ACE group, a TOM group, a CEE group, a CEM group, a TEM group, and a silyl-containing group represented by the following formula. It is preferably any of the above silyl-containing groups.
  • the phosphate protecting group can be represented by the following formula, for example. -P (OR 6 ) (NR 7 R 8 )
  • R 6 is a hydrogen atom or an arbitrary substituent.
  • R 6 is preferably a hydrocarbon group, for example, and the hydrocarbon group may be substituted with an electron withdrawing group or may not be substituted.
  • R 6 is, for example, halogen, haloalkyl, heteroaryl, hydroxyalkyl, alkoxyalkyl, aminoalkyl, silyl, silyloxyalkyl, heterocyclylalkenyl, heterocyclylalkyl, heteroarylalkyl, and alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, arylalkyl , Hydrocarbons such as cycloalkyl, cycloalkenyl, cycloalkylalkyl, cyclylalkyl and the like, and may be substituted with an electron-withdrawing group or may not be substituted.
  • Specific examples of R 6 include a ⁇ -cyanoethyl group, a nitrophenylethyl group, and
  • R 7 and R 8 are each a hydrogen atom or an arbitrary substituent, and may be the same or different.
  • R 7 and R 8 are preferably, for example, a hydrocarbon group, and the hydrocarbon group may be further substituted with an arbitrary substituent or may not be substituted.
  • the hydrocarbon group is, for example, the same as the enumeration for R 6 described above, and is preferably a methyl group, an ethyl group, or an isopropyl group.
  • specific examples of —NR 7 R 8 include a diisopropylamino group, a diethylamino group, and an ethylmethylamino group.
  • the substituents R 7 and R 8 are combined together with the nitrogen atom to which they are bonded (that is, —NR 7 R 8 is combined), and a nitrogen-containing ring (eg, piperidyl group, morpholino group, etc.) May be formed.
  • a nitrogen-containing ring eg, piperidyl group, morpholino group, etc.
  • phosphate protecting group can be selected from the following group II, for example.
  • Group II includes, for example, —P (OCH 2 CH 2 CN) (N (i-Pr) 2 ), —P (OCH 3 ) (N (i-Pr) 2 ), and the like.
  • i-Pr represents isopropyl.
  • R 1 and R 2 are H or a protecting group, and the other is H or a phosphate protecting group.
  • R 1 is the protecting group
  • R 2 is preferably H or the phosphate protecting group, specifically, when R 1 is selected from group I above, R 2 is , H or above group II.
  • R 1 is the above phosphate protecting group
  • R 2 is preferably H or the above protecting group, specifically, when R 1 is selected from the above group II, 2 is preferably selected from H or Group I above.
  • the cyclic amine derivative may be represented by any of the following formulas (VII-1) to (VII-9).
  • n and m are the same as in the above formula (VII).
  • the cyclic amine derivative may be a prolinol derivative represented by the following formula (VIII) or a proline derivative represented by the following formula (IX).
  • the cyclic amine derivative may contain a labeling substance, for example, a stable isotope.
  • the above cyclic amine derivative can be synthesized, for example, according to the method for producing a monomer for nucleic acid molecule synthesis described in International Publication WO2013 / 027843 or International Publication WO2016 / 159374.
  • the first single-stranded oligo RNA molecule for example, strand 1 in FIG. 1
  • the second single-stranded oligo RNA molecule for example, strand 2 in FIG. 1
  • a hairpin single-stranded RNA molecule that suppresses the expression of the target gene according to the present invention can be produced.
  • Xa-Ya 1 -Ya 2 -Ya 3 generated in the ligation step contains a gene expression suppressing sequence for the target gene.
  • the gene expression suppressing sequence may be contained in Xa, Xa-Ya 1 , Xa-Ya 1 -Ya 2 , or Xa-Ya 1 -Ya 2 -Ya 3 .
  • XXa 3 -XXa 2 -XXa 1 -YYa generated in the ligation step contains a gene expression suppressing sequence for the target gene.
  • the gene expression suppressing sequence may be contained in YYa, XXa 1 -YYa, XXa 2 -XXa 1 -YYa, or XXa 3 -XXa 2 -XXa 1 -YYa.
  • the gene expression suppressing sequence is preferably a sense sequence or an antisense sequence of the whole or a part of mRNA transcribed from the target gene. Since Xa-Ya 1 generated in the ligation step is complementary to Xs, Xs may also contain a gene expression suppressing sequence for the target gene. Similarly, since XXa 1 -YYa is complementary to YYs, YYs may also contain a gene expression suppressing sequence for the target gene.
  • the hairpin single-stranded RNA molecule may include one gene expression suppressing sequence or two or more.
  • the hairpin single-stranded RNA molecule may have, for example, two or more same gene expression suppression sequences for the same target gene, or may have two or more different gene expression suppression sequences for the same target. Two or more different gene expression suppression sequences for different target genes may be included.
  • a hairpin single-stranded RNA molecule having two or more gene expression suppressing sequences for different target genes is useful for suppressing the expression of two or more different target genes.
  • the “gene” refers to a genomic region that is transcribed into mRNA, and may be a protein coding region or an RNA coding region.
  • the hairpin single-stranded RNA molecule according to the present invention has an ability to suppress the expression of a target gene via a gene expression suppressing sequence.
  • the suppression of target gene expression by the hairpin single-stranded RNA molecule according to the present invention is preferably by RNA interference, but is not limited thereto.
  • RNA interference generally, a long double-stranded RNA (dsRNA) is cleaved into a short double-stranded RNA (siRNA: small interfering RNA) of about 19 to 21 base pairs protruding at the 3 ′ end by Dicer in the cell.
  • Various types of sequences of single-stranded RNA contained in siRNA that binds to the target mRNA have been reported, for example, depending on the type of target gene.
  • a single-stranded RNA sequence (preferably an antisense sequence) contained in siRNA can be used as a gene expression suppressing sequence.
  • the hairpin single-stranded RNA molecule produced by the method of the present invention can be cleaved in vivo to generate siRNA, thereby suppressing the expression of the target gene.
  • the hairpin single-stranded RNA molecule according to the present invention can be used for treatment or prevention of a disease or disorder associated with expression or increased expression of a target gene.
  • the gene expression suppression sequence is preferably 19 to 30 bases long, more preferably 19 to 27 bases long, and may be 19, 20, 21, 22, or 23 bases long, for example.
  • the gene expression suppressing sequence is preferably composed of an RNA sequence that is completely identical or completely complementary to at least a partial sequence of mRNA of the target gene.
  • the gene expression suppressing sequence can be designed by a conventional method with respect to the base sequence of the target gene.
  • the target gene may be any gene, for example, any disease-related gene.
  • the target gene is preferably derived from the same species as the target that causes gene expression suppression in a living body, cell, tissue or organ by a hairpin single-stranded RNA molecule, for example, human, chimpanzee, gorilla, etc. Mammals, fish, insects, etc. including primates, horses, cattle, pigs, sheep, goats, camels, donkeys, etc., pets such as dogs, cats, rabbits, rodents such as mice, rats, guinea pigs, etc. May be derived from other animals, plants, fungi and the like.
  • the target gene is not particularly limited, and examples thereof include TGF- ⁇ 1 gene, GAPDH gene, LAMA1 gene, and LMNA gene.
  • the mRNA sequence of the human TGF- ⁇ 1 (transforming growth factor- ⁇ 1) gene can be obtained, for example, based on GenBank (NCBI) accession number NM_000660 (NCBI Gene ID: 7040).
  • the mRNA sequence of the human GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) gene can be obtained, for example, based on GenBank (NCBI) accession number NM_002046 (NCBI Gene ID: 2597).
  • the mRNA sequence of the human LAMA1 gene can be obtained, for example, based on GenBank accession number NM_005559 (NCBI Gene ID: 284217).
  • the mRNA sequence of the human LMNA gene can be obtained, for example, based on GenBank accession number NM_170707 (NCBI Gene ID: 4000).
  • the target gene is a TGF- ⁇ 1 gene
  • the hairpin single-stranded RNA molecule produced by the method of the present invention suppresses the expression of the TGF- ⁇ 1 gene in vivo.
  • Such a hairpin single-stranded RNA molecule is capable of treating or preventing a disease or disorder associated with TGF- ⁇ 1 gene expression or increased expression, for example, pulmonary fibrosis or acute lung disease, through gene expression suppression of the TGF- ⁇ 1 gene. Can be used for.
  • the hairpin single-stranded RNA molecule according to the present invention that suppresses the expression of other target genes such as GAPDH gene, LAMA1 gene, and LMNA gene can also be expressed through the suppression of the expression of the target gene. It can be used for the treatment or prevention of diseases or disorders associated with increased expression.
  • Such a hairpin single-stranded RNA molecule consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 has an RNA sequence consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the direction from the 5 'end to the 3'end; Linker (non-nucleotide linker, nucleotide linker, or a combination thereof; Lx 1 in FIG. 1 ), an RNA sequence comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, and the above linker (non-nucleotide linker, nucleotide Sex linker, or a combination thereof; Lx 2 in FIG. 1) and a base G (guanine).
  • the hairpin single-stranded RNA molecule comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 contains a gene expression suppression sequence for the target gene TGF- ⁇ 1 gene.
  • the 29th to 47th sequences of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 correspond to the gene expression suppression sequence (active sequence; SEQ ID NO: 50).
  • the present invention provides a method for producing a hairpin single-stranded RNA molecule comprising this gene expression suppressing sequence.
  • first single-stranded oligo RNA molecule (Strand 1) and the second single-stranded oligo RNA molecule (Strand 2) for producing such RNA molecules are listed in Table 1 below. Yes.
  • the linker containing P (proline derivative) is as described above. It may be substituted with any linker such as other non-nucleotide linkers or nucleotide linkers.
  • the first single stranded oligo RNA molecule has uracil (U) or adenine (A) at the 3 ′ end and the second single stranded oligo RNA molecule is at the 5 ′ end. It is preferable to have uracil (U) or adenine (A).
  • first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule for producing a hairpin type single-stranded RNA molecule consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, (1) a first single-stranded oligo RNA molecule having a base sequence represented by SEQ ID NO: 7 in which the 24th and 25th ribonucleotide residues are linked via a first linker (Lx 1 ); Combination with the second single-stranded oligo RNA molecule consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 in which the 10th and 11th ribonucleotide residues are linked via the second linker (Lx 2 ) , (2) a first single-stranded oligo RNA molecule having a base sequence represented by SEQ ID NO: 19 in which the 24th and 25th ribonucleotide residues are linked via a first linker (Lx 1 );
  • These first single-stranded oligo RNA molecules contain U or A at the 3 ′ end (the 3 ′ end of Xa). These second single-stranded oligo RNA molecules contain U or A at the 5 ′ end (the 5 ′ end of Ya 1 ).
  • the 24th and 25th ribonucleotide residues are linked via the first linker (Lx 1 )”
  • the 24th ribonucleotide residue (base: C) and the 25th ribonucleotide residue (base: G) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 19 are the first linker. through Lx 1 it means that it is bound.
  • the linkers Lx 1 and Lx 2 are preferably represented by the formula (VI), for example, the formula (VI- 1) or represented by formula (VI-2).
  • the present invention provides a single-stranded oligo that can be used as a first single-stranded oligo RNA molecule or a second single-stranded oligo RNA molecule for the production of hairpin single-stranded RNA molecules according to the method of the present invention.
  • RNA molecules are provided.
  • examples of single-stranded oligo RNA molecules used for the production of a hairpin single-stranded RNA molecule that suppresses the expression of the target gene TGF- ⁇ 1 gene include the following (a) to (l): But not limited to: (A) a single-stranded oligo RNA molecule consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 in which the 24th and 25th ribonucleotide residues are linked via a linker; (B) a single-stranded oligo RNA molecule consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 in which the 10th and 11th ribonucleotide residues are linked via a linker; (C) a single-stranded oligo RNA molecule consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 19 in which the 24th and 25th ribonucleotide residues are linked via a linker; (D) a single-stranded oligo RNA molecule
  • single-stranded oligo RNA molecules (a) and (b); (c) and (d); (e) and (f); (g) and (h); (i) and (j) Or (k) and (l) can be used in combination in the method for producing a hairpin single-stranded RNA molecule according to the present invention.
  • FIG. 1 An example of a hairpin-type single-stranded RNA molecule for the GAPDH gene consists of the base sequence represented by SEQ ID NO: 51, and the 22nd and 23rd nucleotides (ribonucleotide residues) serve as the first linker (Lx 1 ). RNA molecules in which the 48th and 49th nucleotides (ribonucleotide residues) are linked via a second linker (Lx 2 ).
  • RNA molecule for the LAMA1 gene consists of the base sequence represented by SEQ ID NO: 52, and the 24th and 25th nucleotides (ribonucleotide residues) serve as the first linker (Lx 1 ).
  • RNA molecule for the LAMA1 gene consists of a base sequence represented by SEQ ID NO: 53, and the first and second nucleotides (ribonucleotide residues) are nucleotide-like first linkers This is an RNA molecule linked via (Lx 1 ) and having the 56th and 61st nucleotides (ribonucleotide residues) linked via a nucleotide-like second linker (Lx 2 ).
  • RNA molecule for the LMNA gene consists of the base sequence represented by SEQ ID NO: 54, and the 24th and 25th nucleotides (ribonucleotide residues) serve as the first linker (Lx 1 ).
  • Examples of gene expression suppression sequences (antisense sequences; SEQ ID NOs: 55, 56 and 57, respectively) for the GAPDH gene, LAMA1 gene, or LMNA gene as target genes are also shown in FIG.
  • the present invention also provides a method for producing a hairpin single-stranded RNA molecule comprising any of these gene expression suppressing sequences.
  • Examples of single-stranded oligo RNA molecules used for the production of hairpin single-stranded RNA molecules that suppress the expression of the target gene GAPDH gene include (m) and (n) below, but are not limited to these: (M) a single-stranded oligo RNA molecule having the base sequence represented by SEQ ID NO: 37 in which the 22nd and 23rd ribonucleotide residues are linked via a linker, and (n) the 20th and 21st nucleotides A single-stranded oligo RNA molecule having a base sequence represented by SEQ ID NO: 36 in which ribonucleotide residues are linked via a linker
  • the single-stranded oligo RNA molecules (m) and (n) can be combined and used in the method for producing a hairpin single-stranded RNA molecule according to the present invention.
  • Examples of single-stranded oligo RNA molecules used for the production of hairpin-type single-stranded RNA molecules that suppress the expression of the target gene LAMA1 gene include, but are not limited to, the following (o) to (v): (O) a single-stranded oligo RNA molecule consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 39 in which the 24th and 25th ribonucleotide residues are linked via a linker; (P) a single-stranded oligo RNA molecule consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 38 in which the 16th and 17th ribonucleotide residues are linked via a linker; (Q) a single-stranded oligo RNA molecule consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 41 in which the 24th and 25th ribonucleotide residues are linked via a linker; (R) a single-stranded oligo RNA molecule consisting of the base sequence
  • single-stranded oligo RNA molecules (o) and (p); (q) and (r); (s) and (t); or (u) and (v) are combined in the present invention. It can be used in a method for producing such a hairpin single-stranded RNA molecule.
  • Examples of single-stranded oligo RNA molecules used for the production of hairpin single-stranded RNA molecules that suppress the expression of the target gene LMNA gene include, but are not limited to, (w) to (z) below: (W) a single-stranded oligo RNA molecule consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 47 in which the 24th and 25th ribonucleotide residues are linked via a linker; (X) a single-stranded oligo RNA molecule consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 46 in which the 21st and 22nd ribonucleotide residues are linked via a linker; (Y) a single-stranded oligo RNA molecule consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 49 in which the 24th and 25th ribonucleotide residues are linked via a linker; A single-stranded oligo RNA molecule consisting of a base sequence represented by SEQ ID
  • the single-stranded oligo RNA molecules (w) and (x); or (y) and (z) may be used in combination in the method for producing a hairpin single-stranded RNA molecule according to the present invention. it can.
  • the “linker” in the single-stranded oligo RNA molecules (a) to (z) corresponds to the first linker or the second linker, and the above-mentioned linker can be used.
  • the nucleotide linkers in the single-stranded oligo RNA molecules (s) to (v) may be substituted with the above-mentioned linkers (for example, other nucleotide linkers).
  • a hairpin single-stranded RNA molecule can be produced by ligating the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule.
  • the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule are annealed prior to ligation.
  • the annealing reaction can be triggered by mixing the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule in an aqueous medium.
  • the annealing step comprises mixing the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule in an aqueous medium (usually water or a buffer), for a certain time (for example, The reaction may be performed by standing for 1 to 15 minutes) or may be used for the ligation reaction without standing.
  • the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule may be heat-denatured (for example, heated at a temperature of 90 ° C. or higher), but may not be performed. .
  • the reaction solution containing the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule is heated at, for example, a heat denaturing temperature (eg, 90 ° C. or higher), and then an annealing temperature.
  • a heat denaturing temperature eg, 90 ° C. or higher
  • an annealing temperature e.g, the Tm value based on the Ya 1 sequence of the single-stranded oligo RNA molecule is a temperature in the range of ⁇ 5 ° C., for example, 55 to 60 ° C.). Up to °C).
  • the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule are mixed at room temperature (15 to 35 ° C.) for a certain time (for example, 1 minute to 1
  • the annealing step may be performed by standing for a period of time or 5 to 15 minutes.
  • the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule may be mixed in equimolar amounts in the reaction solution.
  • “mixing in equimolar amounts” means that the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule are mixed at a molar ratio of 1: 1.1 to 1.1: 1. It means mixing.
  • an annealing reaction solution containing a double-stranded oligo RNA obtained by annealing the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule is subjected to ligation.
  • a part of the annealing reaction solution may be added to the ligation reaction solution, or the ligation reaction solution may be prepared using the total amount of the annealing reaction solution.
  • the ligation may be an enzymatic ligation. Enzymatic ligation may be ligation with RNA ligases, in particular Rnl2 family ligases.
  • Rnl2 family ligase (Rnl2 family member) is responsible for RNA nick sealing activity, ie, RNA nick (nick in RNA duplex or RNA-DNA duplex) with its 3 ′ hydroxyl group (3′-OH) and 5
  • An enzyme with ligase activity that fills (seals) by linking 'phosphate groups (5'-PO 4 ) (eg, Nandakumar J. et al., Cell 127, p. 71-84 (2006)).
  • Rnl2 family ligases include T4 RNA ligase 2, trypanosoma brucei (eg Trypanosoma brucei) and leishmania genus (eg leishmania tarenotolae) RNA editing ligase (REL), vibriophage KVP40RnmEP2 Examples include, but are not limited to, ligase, baculovirus XcGV ligase, and mutants or modifications thereof. These ligases are well known to those skilled in the art and are commercially available or can be obtained according to the teachings of articles and the like. For example, T4 RNA ligase 2 is commercially available from New England Biolabs.
  • T4 RNA ligase 2 protein is encoded by the gene gp24.1 of bacteriophage T4. Isolation of T4 RNA ligase 2 is described, for example, in Nandakumar J. and Shuman S., (2005) J. Biol. Chem., 280: 23484-23489; Nandakumar J., et al., (2004) J. Biol. Chem., 279: 31337-31347; Nandakumar J. and Shuman S., (2004) Mol. Cell, 16: 211-221.
  • the “Rnl2 family ligase” is not limited to an isolated natural ligase, but may be a recombinant protein, mutant, deletion (such as truncated form), peptide (as long as it has RNA nick sealing activity)
  • tags such as His, HA, c-Myc, V5, DDDDK, etc.
  • fusion with other proteins modified proteins such as glycosylation or lipid addition proteins, and the like are included.
  • the ligation reaction solution can be prepared using components usually used for ligation or a buffer containing the same.
  • the ligation reaction solution contains components that can be used for RNA ligation, such as Tris (Tris) -HCl, Divalent metal ions, dithiothreitol (DTT), adenosine triphosphate (ATP) and the like may also be included.
  • the divalent metal ion include, but are not limited to, Mg 2+ and Mn 2+ .
  • the ligation reaction solution usually contains a divalent metal ion in the form of a salt, for example, a metal chloride (MgCl 2 , MnCl 2, etc.).
  • Ligation of the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule can be achieved by RNA ligase or other enzymes having activity to link the ends of RNAs or dsRNA nicks, particularly Rnl2 family ligases. Can be used.
  • RNA ligase dsRNA ligase can be used.
  • dsRNA ligase is an enzyme mainly having an activity of linking double-stranded RNA (dsRNA) nicks. Examples of the dsRNA ligase include, but are not limited to, T4 RNA ligase 2.
  • T4 RNA ligase 2 catalyzes the formation of 3 ' ⁇ 5' phosphodiester bonds.
  • Rnl2 family ligase was added to the ligation reaction solution, and the annealed first single-stranded oligo RNA molecule and second single-stranded oligo RNA molecule were ligated together with the Rnl2 family ligase.
  • the 3 ′ end of the first single-stranded oligo RNA molecule constituting the double-stranded oligo RNA molecule and the 5 ′ end of the second single-stranded oligo RNA molecule (antisense strand) Can be ligated to a single strand.
  • the ligation of the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule is a ligation reaction comprising equimolar amounts of the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule. You may carry out in a liquid.
  • “including in an equimolar amount” includes the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule in a molar ratio of 1: 1.1 to 1.1: 1. Means that.
  • the ligation is carried out by using a first single-stranded oligo RNA molecule and a second single-stranded oligo RNA molecule of 10 ⁇ M or more, 40 ⁇ M or more, 100 ⁇ M or more, 150 ⁇ M or more, 200 ⁇ M or more, 300 ⁇ M or more, Alternatively, the reaction may be performed in a ligation reaction solution containing 500 ⁇ M or more.
  • the ligation reaction solution may contain a first single-stranded oligo RNA molecule and a second single-stranded oligo RNA molecule at 10,000 ⁇ M or less, for example, 1,000 ⁇ M or less, 500 ⁇ M or less.
  • the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule are used in a ligation reaction, for example, at a concentration of 50-500 ⁇ M, 100-300 ⁇ M, or 100-250 ⁇ M. May be.
  • the ligation reaction solution comprising equimolar amounts of the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule comprises the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule.
  • Strand oligo RNA molecules are included at such concentrations.
  • the first and second single-stranded oligo RNA molecules are used at a higher concentration (or amount) relative to the concentration (or amount) of the Rnl2 family ligase in the reaction solution.
  • the production efficiency of the single-stranded RNA molecule can be increased.
  • the ligation reaction may comprise 0.01 U / ⁇ L or more of Rnl2 family ligase, such as 0.01 U / ⁇ L or more, 0.08 U / ⁇ L or more, 0.2 U / ⁇ L or more, or 0 It may be contained at a concentration of 35 U / ⁇ L or more.
  • the ligation reaction solution may contain Rnl2 family ligase at a concentration of, for example, 10 U / ⁇ L or less, 1 U / ⁇ L or less, or 0.5 U / ⁇ L or less.
  • a ligation reaction comprising equimolar amounts of the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule comprises Rnl2 family ligase at such a concentration.
  • the ligation reaction may have a pH of 6.5 or higher, such as pH 7.0 to 9.0, pH 7.4 or higher, pH 7.4 to 8.6, pH 7.5 to 8.5, or The pH may be 7.5 to 8.0.
  • the ligation reaction solution containing equimolar amounts of the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule may have such a pH.
  • the ligation reaction comprises 1 mM or more, such as 1-20 mM, 2-10 mM, 3-6 mM, or 5 mM divalent metal ions. In one embodiment, the ligation reaction comprises 1 mM or more, such as 1-20 mM, 2-10 mM, 3-6 mM, or 5 mM Mg 2+ or Mn 2+ , for example, may include that concentration of MgCl 2 . In one embodiment, a ligation reaction solution containing equimolar amounts of the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule contains a divalent metal ion at such a concentration.
  • the ligation reaction solution may contain other additive substances such as polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • the ligation reaction solution may contain polyethylene glycol in an amount of, for example, 3 to 30 w / v%, 5 to 20 w / v%, 5 to 15 w / v%, or 10 to 30 w / v%.
  • the ligation reaction solution containing equimolar amounts of the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule comprises polyethylene glycol at such a concentration.
  • the addition of such polyethylene glycol is 0.4 U / ⁇ L or less, such as 0.01 to 0.4 U / ⁇ L, 0.08 to 0.4 U / ⁇ L, or 0.1 U / ⁇ L to 0. It may be used in a ligation reaction containing less than 3 U / ⁇ L RNA ligase.
  • the ligation reaction solution usually contains ATP.
  • the ligation reaction solution contains ATP at a concentration of, for example, 5 mM or less, 2 mM or less, 1 mM or less, and / or 0.1 mM or more, or 0.1 to 1.5 mM.
  • the ligation reaction solution may contain Tris-HCl, for example, 10 to 70 mM Tris-HCl, but is not limited to this concentration.
  • the ligation reaction solution may contain dithiothreitol (DTT), for example, 0.1 to 5 mM DTT, but is not limited to this concentration.
  • DTT dithiothreitol
  • the ligation reaction time may be a time suitable for the ligation reaction of the double-stranded oligo RNA of the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule according to the present invention.
  • the ligation reaction may be performed over a reaction time of, for example, 20 minutes or more, 30 minutes or more, 1 hour or more, 2 hours or more, or 3 hours or more.
  • the reaction time of ligation in the present invention may be 4 hours or more, 6 hours or more, 8 hours or more, 10 hours or more, 12 hours or more, 24 hours or more, or 48 hours or more.
  • the ligation reaction when using a ligation reaction solution containing the first and second single-stranded oligo RNA molecules at a particularly high concentration (for example, 100 ⁇ M or 200 ⁇ M or more), the ligation reaction may be performed for a longer time.
  • a longer time for example, 4 hours or longer
  • 12 hours or more, or 24 hours or more may be used.
  • Such a longer reaction time may be used, particularly when high concentrations of single-stranded oligo RNA molecules are used.
  • the ligation step may be performed while adding the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule stepwise.
  • “Add stepwise” for the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule means that in the ligation step, the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule This means that the oligo RNA molecule is added to the reaction solution multiple times at intervals of time.
  • the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule are added stepwise to the reaction system by adding the single-stranded oligo RNA molecule and performing an additional reaction step for further ligation reaction once or repeatedly. Ligation can be performed.
  • the additional reaction step may be repeated two times, three times, four times or more.
  • the initial incubation time (initial reaction time) for ligation of the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule may be in accordance with the above ligation reaction time. It may be 4 hours or more, 8 hours or more, 12 hours or more, or 24 hours or more.
  • the incubation time (addition reaction time) after adding the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule is, for example, 4 hours or more, 8 hours or more, 12 hours or more, or 24 hours or more. It may be.
  • the additional reaction time for each cycle may be the same as or different from each other.
  • the initial reaction time for ligation and the additional reaction time for each cycle may be the same or different.
  • the concentration of the single-stranded RNA molecule initially added to the ligation reaction solution is the same as above.
  • the concentration may be 40 ⁇ M or more, 100 ⁇ M or more, 150 ⁇ M or more, or 200 ⁇ M or more.
  • the amount of single-stranded RNA molecules added to the ligation reaction solution in each additional reaction step may be the same or different from the amount (number of moles) of single-stranded RNA molecules contained in the initial reaction solution. For example, it may be 4 nmol or more, 10 nmol or more, 15 nmol or more, or 20 nmol or more.
  • reaction inhibition decreased ligation efficiency due to high-concentration single-stranded RNA molecules is reduced.
  • the content of the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule in the reaction solution can be increased, thereby increasing the yield of the hairpin single-stranded RNA molecule.
  • the above reaction conditions can be used in any combination.
  • the temperature of the annealing step, the time of the annealing step, the mixing ratio of the first single-stranded oligo RNA molecule to be annealed and the second single-stranded oligo RNA molecule, the first and second single strands in the ligation reaction solution Amount (concentration) of strand oligo RNA molecule, type and amount of enzyme (eg, Rnl2 family ligase), type and concentration of divalent metal ion, pH, ATP concentration, additive components and concentrations such as PEG, in reaction solution
  • Arbitrarily combining a plurality of conditions selected from the above conditions such as other buffer components, ligation reaction time, stepwise addition (additional addition) of the first and second single-stranded oligo RNA molecules during the ligation reaction Can do.
  • a relatively high concentration (for example, 100 ⁇ M to 300 ⁇ M) of the first and second single-stranded oligo RNA molecules in the ligation reaction solution may be combined with other conditions.
  • the amount of enzyme (eg, Rnl2 family ligase) used eg, 0.01 U / ⁇ L to 1 U / ⁇ L
  • Rnl2 family ligase eg, 0.01 U / ⁇ L to 1 U / ⁇ L
  • RNA ligase in the method of the present invention, by adjusting the ligation reaction conditions as described above, a smaller amount of RNA ligase than the amount of the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule used.
  • the ligase of the Rnl2 family can be used to increase the yield of the ligation product relatively or absolutely.
  • the amount of RNA ligase used, particularly the Rnl2 family ligase is 0.001 unit per amount (nmol) of the first single-stranded oligo RNA molecule and / or the second single-stranded oligo RNA molecule. (U) or more, 0.01 unit or more, 0.1 unit or more, 0.2 unit or more, or 1 unit or more.
  • an RNA ligase having an amount of“ X ”units or less per mole (nmol) of the first single-stranded oligo RNA molecule and / or the second single-stranded oligo RNA molecule refers to the first single-stranded oligo RNA molecule.
  • the amount of RNA ligase, particularly the Rnl2 family ligase, is “X” as compared to either the number of moles of strand oligo RNA molecule or the number of moles of second single-stranded oligo RNA molecule (nmol) or both. Means less than unit.
  • the amount of RNA ligase used may be determined based on the smaller number of moles (nmol) of the first single-stranded oligo RNA molecule and the second single-stranded oligo RNA molecule.
  • the number of moles (nmol) of the first single-stranded oligo RNA molecule may be calculated as the total amount of the first single-stranded oligo RNA molecule added to the ligation reaction system.
  • the number of moles of the first single-stranded oligo RNA molecule in the initial ligation reaction solution and the number of moles of the first single-stranded oligo RNA molecule added to the reaction system in the additional reaction step Calculated as the total number of moles.
  • the temperature of the ligation reaction may vary depending on the enzyme used (Rnl2 family ligase), for example, 10 to 50 ° C., 15 to 45 ° C., 20 to 40 ° C., 20 to 30 ° C., or 23 to 28 ° C. Good.
  • T4 RNA ligase 2 when used, it may be 10-50 ° C, 15-45 ° C, 20-40 ° C, 20-30 ° C, or 23-28 ° C.
  • the ligation reaction solution contains a high proportion of hairpin single-stranded RNA molecules containing the gene expression suppressing sequence according to the present invention.
  • the hairpin single-stranded RNA molecule containing the gene expression suppressing sequence according to the present invention in the ligation reaction solution can be purified by methods known to those skilled in the art. Purification techniques include reverse phase chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC), ultra high performance liquid chromatography (UHPLC), ion exchange chromatography, and other chromatographic methods, gel filtration, column purification, polyacrylamide gel Examples include, but are not limited to, electrophoresis (PAGE) or any combination thereof.
  • a preferred embodiment of the method of the present invention is advantageous in that nucleic acid impurities in the ligation reaction solution after the production of the hairpin single-stranded RNA molecule according to the present invention can be reduced.
  • a highly stable gene expression-inhibiting single-stranded RNA molecule can be produced using a general-purpose RNA amidite while reducing the generation of nucleic acid impurities.
  • the hairpin single-stranded RNA molecule produced by the method of the present invention can be used for suppressing the expression of a target gene by administering it into a living body or a cell by a conventional method.
  • the present invention also relates to a kit for producing a hairpin single-stranded RNA molecule for suppressing the expression of a target gene, comprising a combination (pair) of single-stranded oligo RNA molecules according to the present invention.
  • a kit for producing a hairpin single-stranded RNA molecule for suppressing the expression of a target gene comprising a combination (pair) of single-stranded oligo RNA molecules according to the present invention.
  • a kit can be suitably used for carrying out the method for producing a hairpin single-stranded RNA molecule that suppresses the expression of a target gene according to the present invention.
  • Kits for the production of RNA molecules include, but are not limited to: (I) a first single-stranded oligo RNA molecule having a base sequence represented by SEQ ID NO: 7 in which the 24th and 25th ribonucleotide residues are linked via a first linker; A combination with a second single-stranded oligo RNA molecule consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 in which the 11th ribonucleotide residue is linked via a second linker; (Ii) a first single-stranded oligo RNA molecule consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 19 in which the 24th and 25th ribonucleotide residues are linked via a first linker; A combination with
  • kits for producing a hairpin single-stranded RNA molecule for suppressing the expression of the GAPDH gene comprising the combination of the following single-stranded oligo RNA molecules (vii): Including but not limited to: (Vii) a single-stranded oligo RNA molecule consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 37 in which the 22nd and 23rd ribonucleotide residues are linked via a first linker, and the 20th and 21st A combination with a single-stranded oligo RNA molecule consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 36, in which ribonucleotide residues are linked via a second linker.
  • a hairpin single-stranded RNA for suppressing the expression of the LAMA1 gene comprising a combination of single-stranded oligo RNA molecules of any of the following (viii) to (xi):
  • kits for the production of molecules include, but are not limited to, kits for the production of molecules: (Viii) a single-stranded oligo RNA molecule consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 39 in which the 24th and 25th ribonucleotide residues are linked via a first linker, and the 16th and 17th A combination with a single-stranded oligo RNA molecule consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 38 in which ribonucleotide residues are linked via a second linker; (Ix) a single-stranded oligo RNA molecule consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 41 in which the 24th and 25th ribonucleotide residues are
  • kits for the production of molecules include, but are not limited to, kits for the production of molecules: (Xii) a single-stranded oligo RNA molecule consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 47 in which the 24th and 25th ribonucleotide residues are linked via a first linker, and the 21st and 22nd A combination with a single-stranded oligo RNA molecule consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 46 in which ribonucleotide residues are linked via a second linker; (Xiii) a single-stranded oligo RNA molecule consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 49 in which the 24th and 25th ribonucle
  • Proline diamide amidite used to generate the hairpin single-stranded RNA molecule of the present invention containing a proline derivative linker can be synthesized, for example, as described in International Publication WO2013 / 027843. it can. Specific synthesis examples are shown below, but the synthesis method is not limited thereby.
  • Fmoc-hydroxyamide-L-proline Fmoc-L-proline is used as a starting material.
  • Fmoc is a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group.
  • Fmoc-L-proline (10.00 g, 29.64 mmol), 4-amino-1-butanol (3.18 g, 35.56 mmol) and 1-hydroxybenzotriazole (10.90 g, 70.72 mmol) were mixed, The mixture is degassed under reduced pressure and filled with argon gas.
  • the mixture is diluted with dichloromethane (100 mL), washed with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate (150 mL), and the organic layer is separated. The organic layer is dried over sodium sulfate and then filtered. About the obtained filtrate, the solvent is distilled off under reduced pressure.
  • anhydrous dimethylformamide (39 mL) and piperidine (18.7 mL, 189 mmol) are added and stirred at room temperature for 1 hour. After completion of the reaction, the solvent is distilled off from the mixture at room temperature under reduced pressure.
  • DMTr-diamide-L-proline amidite The obtained DMTr-hydroxydiamide-L-proline (8.55 g, 14.18 mmol) is mixed with anhydrous acetonitrile and dried azeotropically three times at room temperature. To the resulting residue is added diisopropylammonium tetrazolide (2.91 g, 17.02 mmol), degassed under reduced pressure and filled with argon gas.
  • L-proline amidite is obtained.
  • Example 1 Synthesis of single-stranded oligo RNA molecule
  • ssTbRNA molecule hairpin type single-stranded RNA molecule having a linker using a proline derivative and a human TGF- ⁇ 1 gene expression suppressing sequence. 2
  • RNA ligase T4 RNA ligase 2
  • a pair of single-stranded oligo RNA molecules (Strand 1 and Strand 2; Table 1) in which the dividing position in the ssTbRNA molecule was shifted by one base were prepared as follows.
  • each single-stranded oligo RNA molecule (strand 1 and strand 2) is converted into a nucleic acid synthesizer (trade name AKTA oligopilot-100; GE Healthcare Life Sciences or trade name nS-8) based on the phosphoramidite method.
  • nS-8II manufactured by Gene Design Co., Ltd.
  • RNA synthesis based on the phosphoramidite method, as RNA amidite, 5′-O-DMT-2′-O-TBDMSi-RNA phosphoramidite (ThermoFisher Scientific) or 5′-O-DMT-2′-O— TBDMS-RNA phosphoramidite (Sigma-Aldrich) was used.
  • the carrier polystyrene beads NitoPhase (R) HL rG ( ibu), or rU; KINOVATE); using (Chemgenes Universal UnyLinker Support 1000 ⁇ ) or porous glass (CPG) beads.
  • RNA sequences (Xs; or Ya 3 , Ya 2 , and Ya 1 in FIG. 1) immediately after the linker to the 5 ′ end on the “side”, single-stranded oligo RNA molecules of strand 1 and strand 2 was made.
  • These single-stranded oligo RNA molecules have linkers represented by the formula (VI-1) as Lx 1 and Lx 2 , and Xa is the 1st nitrogen atom side in the formula (VI-1), and Xs Is linked to the linker Lx 1 on the 2nd carbon atom side, Ys is linked to the 1st nitrogen atom side in the formula (VI-1), and Ya 3 is linked to the linker Lx 2 on the 2nd carbon atom side.
  • strand 2 antisense side
  • synthesis was completed in the DMTr-OFF state, and single-stranded oligo RNA molecules were excised and deprotected at the base and 2 'positions by conventional methods.
  • strand 1 sense side
  • synthesis was completed in the DMTr-ON state.
  • Example 2 Examination of ligation method (division position) In order to examine the split position of the ssTbRNA molecule into two split fragments, the paired strands 1 and 2 (Table 1) were ligated using RNA ligase (T4 RNA ligase 2), and the ligation efficiency was determined.
  • T4 RNA ligase 2 RNA ligase 2
  • each pair of strand 1 and strand 2 was dissolved in water for injection (DW), and equimolar amounts were mixed. This equimolar mixture was heat-denatured by heating at 93 ° C. for 1 minute, then allowed to stand at 55 ° C. for 15 minutes for annealing, and the temperature was lowered to 4 ° C. After the temperature was lowered, the reaction solution was analyzed by reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) (20 ° C.) and native polyacrylamide gel electrophoresis (Native PAGE), and the annealing state of strand 1 and strand 2 was examined.
  • RP-HPLC reverse phase high performance liquid chromatography
  • Native PAGE native polyacrylamide gel electrophoresis
  • Native PAGE Native PAGE
  • double-stranded oligo RNA in which strand 1 and strand 2 were annealed was obtained. There were pairs that were shown to anneal almost all of strand 1 and strand 2 and pairs annealed at a lower rate.
  • the resulting double-stranded oligo RNA (final concentration of each of strand 1 and strand 2 of 10 ⁇ M) was added to buffer (50 mM Tris-HCl, 2 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol (DTT), 400 ⁇ M adenosine triphosphate (ATP). ) was prepared, and 2 ⁇ L of 10 U / ⁇ L T4 RNA ligase 2 (New England Biolabs; the same applies hereinafter) (40 U / nmol oligo RNA) was added to a reaction volume of 50 ⁇ L. The reaction was incubated at 37 ° C. for 30 minutes.
  • the conditions of the denatured PAGE are as follows. Denaturing PAGE: 19% acrylamide, 7.5M urea, 200V, 90 minutes after electrophoresis, stained with ethidium bromide (EtBr)
  • Ligation efficiency (FLP (%) was calculated by the following formula using the area percentage method based on the UHPLC analysis result.
  • pairs 011, 016, and 018 suitable for the ligation method were selected.
  • the reaction solution after annealing the strands 1 and 2 of the pairs 011, 016, and 018 as described above and ligating them by ligation was analyzed by RP-HPLC under the above conditions.
  • the target ssTbRNA molecule and The amount of nucleic acid impurities in the reaction solution other than the free strand 1 and the strand 2 was very small, and the amount of defects (those lacking a part of the ssTbRNA molecule sequence) that appeared near the peak of the ssTbRNA molecule was also small (Table). 2).
  • the values of the strand 1, the strand 2, and the ssTbRNA molecule represent respective peak area ratios based on the chromatogram.
  • the RRT relative retention time including the peak of the ssTbRNA molecule; here, the retention time of the peak of the ssTbRNA molecule is 1 Relative holding time
  • the total value of peak area% was calculated.
  • strand 1 and strand 2 were dissolved in water for injection, and equimolar amounts were mixed at 40 ⁇ M each.
  • the mixture was heat-denatured by heating at 93 ° C. for 1 minute, then allowed to stand at 55 ° C. for 15 minutes for annealing, and the temperature was lowered to 4 ° C. After the temperature was lowered, the reaction solution was analyzed by reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) (20 ° C.) and native polyacrylamide gel electrophoresis (Native PAGE), and the annealing state of strand 1 and strand 2 was examined.
  • RP-HPLC reverse phase high performance liquid chromatography
  • Native PAGE native polyacrylamide gel electrophoresis
  • the RP-HPLC did not confirm the peak of the single strand, and a double-stranded peak produced by annealing was observed. Further, even in non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis, annealing of almost all molecules of the strand 1 and the strand 2 was confirmed under both the heat denaturing condition and the room temperature condition.
  • the annealing state of single-stranded oligo RNA molecules of strand 1 and strand 2 was confirmed by RP-HPLC and native polyacrylamide gel electrophoresis (Native PAGE), and the two were confirmed by RP-HPLC. It was used for the ligation reaction after confirming that the purity (FLP) of the strand RNA was 95% or more.
  • Native PAGE Native PAGE
  • Example 4 Examination of ligation method (reaction temperature and reaction time) Using three types of pairs 011, 016, and 018 (Table 1; hereinafter, each pair is also simply referred to as 011, 016, and 018), the temperature and time of the ligation reaction were examined. The structures of the strands 1 and 2 of 011, 016, and 018 are shown in FIG.
  • each pair of strand 1 and strand 2 was dissolved in water for injection and mixed in equimolar amounts. This equimolar mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes, and double-stranded oligo RNA was prepared by annealing.
  • the resulting double-stranded oligo RNA (an equimolar mixture of strand 1 and strand 2; final concentration of each strand 10 ⁇ M, 40 ⁇ M, or 100 ⁇ M) was added to T4 RNA ligase 2 (New England Biolabs) buffer (50 mM Tris- 100 ⁇ L of a reaction solution containing 0.4 U / ⁇ L T4 RNA ligase 2 in HCl, 2 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, 400 ⁇ M ATP, pH 7.5 (25 ° C.)) is incubated at 25 ° C. or 37 ° C. and ligated. did.
  • T4 RNA ligase 2 New England Biolabs
  • the amount of enzyme (T4 RNA ligase 2) used for this ligation reaction is 40 U / nmol oligo RNA, 10 U / nmol oligo RNA, or 4 U / nmol oligo RNA.
  • samples of 20-25 ⁇ L were taken after 0.5, 2, 4, or 24 hours, and heated at 85 ° C. for 20 minutes to inactivate the enzyme.
  • the reaction solution after heat inactivation was analyzed by denaturing PAGE and UHPLC, and the ligation efficiency (FLP (%)) was calculated.
  • the conditions for denaturing PAGE and UHPLC and the method for calculating FLP (%) are the same as in Example 2.
  • the ligation efficiency did not change greatly depending on the reaction temperature and reaction time, and both were very high.
  • the ligation efficiency decreased as compared to 10 ⁇ M or 40 ⁇ M, but the ligation efficiency increased as the reaction time increased.
  • the ligation efficiency after 4 hours was higher when incubated at 25 ° C. than at 37 ° C.
  • the results for 016 are shown in FIG.
  • the results of the ligation reaction at an oligo RNA concentration of 100 ⁇ M are shown in FIG. 6 (A: 25 ° C., B: 37 ° C.).
  • the ligation efficiency at 011 and 016 was particularly high.
  • Example 5 Examination of ligation method (ATP concentration) Using the 011 double-stranded oligo RNA (equal molar mixture) prepared in the same manner as in Example 4, the ATP concentration in the ligation reaction solution was examined. ATP was added to T4 RNA ligase 2 (New England Biolabs) attached buffer (50 mM Tris-HCl, 2 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, 400 ⁇ M ATP, pH 7.5 (25 ° C.)) to give an ATP concentration of 0.4 mM (added) None) 1 mM, 2 mM, 5 mM, or 10 mM.
  • T4 RNA ligase 2 New England Biolabs
  • FIG. 7 shows the result of denaturation PAGE
  • FIG. 8 shows FLP (%) shown at an oligo RNA concentration of 40 ⁇ M. Increasing the ATP concentration inhibited the ligation reaction.
  • Example 6 Examination of ligation method (pH) Using 016 double-stranded oligo RNA (equimolar mixture) prepared in the same manner as in Example 4, the pH conditions of the ligation reaction solution were examined. The following three types of buffers were used.
  • the results are shown in FIG.
  • the pH 7.5 reaction solution showed a ligation efficiency of 95% or more when reacted for 24 hours even when it contained a high concentration of oligo RNA.
  • Example 7 Examination of ligation method (pH 8.0 or more) Using 016 double-stranded oligo RNA (equimolar mixture) prepared in the same manner as in Example 4, the pH conditions of the ligation reaction solution were further examined. The following four types of buffers were used.
  • Example 8 Examination of ligation method (divalent ion concentration) Using 016 double-stranded oligo RNA (equal molar mixture) prepared in the same manner as in Example 4, the MgCl 2 concentration in the ligation reaction solution was examined. The following five types of buffers were used.
  • FIG. 11 The results are shown in FIG. 11 (A: 10 ⁇ M or 100 ⁇ M oligo RNA, B: 10 ⁇ M or 200 ⁇ M oligo RNA).
  • a ligation efficiency of 95% or more was shown by a reaction of 4 hours or more at a MgCl 2 concentration of 2 mM or more.
  • a ligation efficiency of 95% or more is shown by a reaction for 24 hours or more at a MgCl 2 concentration of 2 mM or more, and a ligation efficiency of 5 mM MgCl 2 is particularly rapid after 4 hours. An increase was observed. From this result, it was shown that when a higher concentration of oligo RNA is used, the progress of the ligation reaction can be accelerated by appropriately increasing the MgCl 2 concentration.
  • Example 9 Examination of enzyme ligation method (divalent ion concentration and pH) Using 016 double-stranded oligo RNA (equal molar mixture) prepared in the same manner as in Example 4, the concentration of divalent ions in the ligation reaction solution was examined. The following six types of buffers were used. (1) 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM DTT, 400 ⁇ M ATP, 2 mM, 5 mM, or 10 mM MgCl 2 (2) 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM DTT, 400 ⁇ M ATP, 2 mM, 5 mM, or 10 mM MgCl 2
  • Example 10 Examination of enzyme ligation method (PEG addition) Using 018 double-stranded oligo RNA (equal molar mixture) prepared in the same manner as in Example 4, the influence on the ligation efficiency due to the addition of PEG to the ligation reaction solution was examined.
  • Double stranded oligo RNA (final of each strand) in buffer (5, 10, or 15% (w / v) PEG 8000, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 2 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, 400 ⁇ M ATP) And a reaction solution containing 0.4 U / ⁇ L or 0.2 U / ⁇ L of T4 RNA ligase 2 was incubated at 25 ° C. for 30 minutes, 4 hours, or 24 hours and ligated.
  • the amount of the enzyme (T4 RNA ligase 2) used in this ligation reaction is 2 U / nmol oligo RNA or 1 U / nmol oligo RNA, and compared with the enzyme amount in Example 4, 1/20 and 1 respectively. / 40.
  • the enzyme was inactivated by heating at 85 ° C. for 20 minutes.
  • the reaction solution after heat inactivation was analyzed by denaturing PAGE and UHPLC, and the ligation efficiency (FLP (%)) was calculated.
  • the conditions for denaturing PAGE and UHPLC and the method for calculating FLP (%) are the same as in Example 2.
  • Example 11 Analysis of reaction time course in enzyme ligation method Using 016 double-stranded oligo RNA (an equimolar mixture) prepared in the same manner as in Example 4, the time course of the ligation reaction was examined.
  • Double-stranded oligo RNA (final concentration of each strand 100 ⁇ M or 200 ⁇ M), 0.4 U / ⁇ L T4 RNA ligase 2 in buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, 400 ⁇ M ATP) 80 ⁇ L of the reaction solution contained therein was incubated at 25 ° C. and ligated. During the ligation reaction, samples were taken 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12, 15, 18, and 24 hours after the start, and the enzyme was inactivated by heating at 85 ° C. for 20 minutes, followed by UHPLC analysis. The FLP% was calculated. The UHPLC conditions and the FLP (%) calculation method are the same as in Example 2.
  • Example 12 Additional addition of oligo RNA in enzyme ligation method Using 016 double-stranded oligo RNA (equal molar mixture) prepared in the same manner as in Example 4, one of strand 1 and strand 2 was used in the ligation reaction phase. A method for increasing the yield of ssTbRNA molecules by sequentially adding single-stranded oligo RNA molecules was examined.
  • Double-stranded oligo RNA (final concentration 100 ⁇ M; total amount of oligo RNA in 100 ⁇ L reaction solution is 10 nmol for each of strand 1 and strand 2)
  • T4 RNA ligase 2 (0.4 U / ⁇ L; 4 U / nmol oligo RNA) in a buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, 400 ⁇ M ATP) is dispensed into 4 tubes and incubated at 25 ° C.
  • the ligation reaction was started.
  • 016 strands in 016 double-stranded oligo RNA were placed in three tubes. (Equimolar mixture of 1 and strand 2) was added in an amount (11.1 ⁇ L) to give 10 nmol of each strand, followed by incubation.
  • the oligo RNA concentration in the reaction solution after addition of oligo RNA is 180 ⁇ M (concentration of each strand), and the amount of enzyme (T4 RNA ligase 2) is 0.36 U / ⁇ L (2 U / nmol oligo RNA).
  • oligo RNA twelve hours after addition of oligo RNA, 016 double-stranded oligo RNA (equal equimolar mixture as above) was added to 2 tubes out of 3 tubes added with oligo RNA (11.1 ⁇ L) to each strand of 10 nmol. ) And further incubated.
  • concentration of oligo RNA in the reaction solution after the second addition of oligo RNA is 245 ⁇ M (concentration of each strand), and the amount of enzyme (T4 RNA ligase 2) is 0.33 U / ⁇ L (1.33 U / nmol oligo RNA).
  • oligo RNA (equal equimolar mixture as described above) was added to one tube out of two tubes added with oligo RNA twice. ) And incubated for a further 12 hours.
  • the oligo RNA concentration in the reaction solution after the third oligo RNA addition is 300 ⁇ M (concentration of each strand), and the amount of enzyme (T4 RNA ligase 2) is 0.3 U / ⁇ L (1 U / nmol oligo RNA).
  • the reaction solution was sampled from these tubes every 12 hours and heated at 85 ° C. for 20 minutes to inactivate the enzyme.
  • the obtained samples after the reaction are as follows.
  • the reaction time refers to the time from the start of the ligation reaction.
  • Tube 1 100 ⁇ M oligo RNA (total 10 nmol for each strand; no addition), enzyme amount 0.4 U / ⁇ L, reaction temperature 25 ° C., reaction time 12, 24, 36, or 48 hours
  • Tube 2 180 ⁇ M oligo RNA (each strand 20 nmol; added once), enzyme amount 0.36 U / ⁇ L, reaction temperature 25 ° C., reaction time 24, 36, or 48 hours tube 3) 245 ⁇ M oligo RNA (total 30 nmol for each strand; added twice), enzyme Amount 0.33 U / ⁇ L, reaction temperature 25 ° C., reaction time 36 or 48 hours
  • Tube 4 300 ⁇ M oligo RNA (total 40 nmol for each strand; added 3 times), enzyme amount 0.3 U / ⁇ L, reaction temperature 25 ° C. 48 hours reaction time
  • the production amount (nmol) of the target product (ssTbRNA molecule) was calculated from the addition amount of FLP% and single-stranded oligo RNA molecules. The result is shown in FIG.
  • Double-stranded oligo RNA (final concentration 200 ⁇ M; total amount of oligo RNA in 100 ⁇ L reaction solution is 20 nmol for each of strand 1 and strand 2), and T4 RNA ligase 2 (0.4 U / ⁇ L; 4 U / nmol oligo) RNA) in a buffer (50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, 400 ⁇ M ATP (pH 8.0)) is dispensed into 4 tubes and incubated at 25 ° C. The ligation reaction was started.
  • a buffer 50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, 400 ⁇ M ATP (pH 8.0)
  • 016 strands 1 and 2 in 016 double-stranded oligo RNA were placed in three tubes.
  • the oligo RNA was added up to the third time every 12 hours, and the ligation reaction was continued.
  • the reaction solution was sampled from these tubes every 12 hours and heated at 85 ° C. for 20 minutes to inactivate the enzyme.
  • the obtained samples after the reaction are as follows.
  • the reaction time refers to the time from the start of the ligation reaction.
  • Tube 1 200 ⁇ M oligo RNA (total 20 nmol for each strand; no addition), enzyme amount 0.4 U / ⁇ L, reaction temperature 25 ° C., reaction time 12, 24, 36, or 48 hours tube 2) 327 ⁇ M oligo RNA (each strand 40 nmol; added once), enzyme amount 0.36 U / ⁇ L, reaction temperature 25 ° C., reaction time 24, 36, or 48 hours tube 3) 415 ⁇ M oligo RNA (total 60 nmol for each strand; added twice), enzyme Amount 0.33 U / ⁇ L, reaction temperature 25 ° C., reaction time 36, or 48 hours Tube 4) 480 ⁇ M oligo RNA (total 80 nmol for each strand; added 3 times), enzyme amount 0.3 U / ⁇ L, reaction temperature 25 ° C. 48 hours reaction time
  • the production amount (nmol) of the target product (ssTbRNA molecule) was calculated from the addition amount of FLP% and single-stranded oligo RNA molecules. The result is shown in FIG.
  • the amount of hairpin single-stranded RNA molecules (here, ssTbRNA molecules) can be increased by sequentially adding oligo RNA to the ligation reaction phase. It was.
  • RNA ligase use amount (the enzyme amount is 0.4 U / ⁇ L with respect to the starting oligo RNA amount of 10 ⁇ M)
  • a ligation efficiency of more than 90% of FLP can be obtained under the same ligation reaction conditions as described above, but per 100 ⁇ L reaction solution.
  • the amount of ssTbRNA molecules produced is less than 1 nmol.
  • the amount of enzyme used per oligo RNA amount is reduced from 1/30 to 1/40 under an efficient reaction condition showing 90% or more of FLP. It was shown that it can be reduced.
  • RNA molecules Production of hairpin single-stranded RNA molecules for other target genes
  • Strand RNA molecules were prepared by the method of ligating two split fragments, strand 1 and strand 2, as in Examples 1 and 2.
  • the linker the same proline derivative as in Examples 1 and 2 or a nucleotide linker was used.
  • FIG. 17 shows the hairpin type single-stranded RNA molecule and the dividing position in the molecule.
  • gene expression suppression sequences antisense sequences for each gene contained in the hairpin single-stranded RNA molecule are shown in a frame.
  • Table 5 shows a pair of strand 1 and strand 2, which are two fragment fragments of each hairpin type single-stranded RNA molecule.
  • the pair of strand 1 and strand 2 in Table 5 has UU, AA, AU, or UA as a terminal base combination to be ligated.
  • each pair of strand 1 and strand 2 was annealed to obtain double-stranded oligo RNA.
  • the resulting double-stranded oligo RNA (final concentration of each of strand 1 and strand 2 of 10 ⁇ M) was added to buffer (50 mM Tris-HCl, 2 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol (DTT), 400 ⁇ M adenosine triphosphate (ATP).
  • buffer 50 mM Tris-HCl, 2 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol (DTT), 400 ⁇ M adenosine triphosphate (ATP).
  • reaction solution pH 7.5 [25 ° C.]
  • 2 ⁇ L of 10 U / ⁇ L T4 RNA ligase 2 (New England Biolabs) (40 U / nmol oligo RNA) was added to a reaction solution volume of 50 ⁇ L. .
  • the reaction was incubated at 37 ° C. for 30 minutes.
  • Each ligation product was subjected to LC-MS analysis and confirmed to have the expected molecular weight.
  • the LC apparatus and MS apparatus used for the LC-MS analysis are the same as those used in Example 2.
  • each pair of strand 1 and strand 2 was annealed to obtain double-stranded oligo RNA.
  • the resulting double-stranded oligo RNA (final concentration of each of strand 1 and strand 2 of 10 ⁇ M) was added to buffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2 , 5 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM adenosine triphosphate (ATP). ) was prepared, and 0.5 ⁇ L of 10 U / ⁇ L T4 RNA ligase (Promega) (10 U / nmol oligo RNA) was added to a reaction volume of 50 ⁇ L. The reaction was incubated at 37 ° C. for 30 minutes.
  • the present invention uses a general-purpose amidite, and enables efficient production of a hairpin single-stranded RNA molecule containing an expression suppression sequence for a target gene while reducing the amount of enzyme used.

Abstract

本発明は、標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法であって、（ｉ）第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とをアニーリングするアニーリング工程と、（ｉｉ）前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３'末端と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５'末端とをＲｎｌ２ファミリーのリガーゼによりライゲーションするライゲーション工程とを含み、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とのライゲーションにより生成される配列は、前記標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む、ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法を提供する。

Description

ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法
　本発明は、ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法に関する。
　遺伝子発現を抑制する技術として、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が知られている（非特許文献１）。ＲＮＡ干渉による遺伝子発現抑制には、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ）と呼ばれる短い二本鎖のＲＮＡ分子を用いる方法が多く利用されている。また、分子内アニールにより、部分的に二重鎖を形成した環状ＲＮＡ分子を用いた遺伝子発現抑制技術も報告されている（特許文献１）。
　しかし、ｓｉＲＮＡはｉｎ　ｖｉｖｏでの安定性が低く、一本鎖ＲＮＡに解離しやすいため、遺伝子発現を安定的に抑制するのが困難である。特許文献２は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖を、環状アミン誘導体を用いて形成される１つ又は２つのリンカーを用いて一本鎖に連結したヘアピン型一本鎖長鎖ＲＮＡ分子が、ｓｉＲＮＡを安定化できることを報告している。しかしこの一本鎖長鎖ＲＮＡ分子は、ＴＢＤＭＳアミダイトなどの汎用型アミダイトを使用したホスホロアミダイト法では効率的に合成できないため、その合成には特別なＲＮＡアミダイト（例えば、特許文献２及び３）を用いる必要がある。
　特許文献４は、第三の核酸鎖としての補助核酸とＴ４　ＲＮＡリガーゼ２とを用いて、第一の核酸鎖と第二の核酸鎖をライゲーションする方法を開示しているが、補助核酸が長いほど反応が遅いことを示しており、その方法において良好なライゲーション効率をもたらす補助核酸は限定されている。
米国特許出願公開第２００４／０５８８８６号 国際公開ＷＯ２０１３／０２７８４３ 国際公開ＷＯ２０１６／１５９３７４ 国際公開ＷＯ２０１１／０５２０１３
Fire et al., Nature, (1998) Feb 19; 391(6669):806-811
　本発明は、標記遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の効率的な製造方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、標的遺伝子に対する発現抑制配列を含むヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を、非ヌクレオチド性リンカーやヌクレオチド性リンカーなどのリンカーを有する２つの一本鎖オリゴＲＮＡ分子に分割して合成し、それらをアニーリングし、ライゲーションすることによって、特別なＲＮＡアミダイトや補助核酸を必要とせず、当該ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を効率的に製造できること、また、ライゲーション条件を調節することにより、酵素使用量に対するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の生産効率をさらに増加させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下を包含する。
［１］標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法であって、
　第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とをアニーリングするアニーリング工程と、
　前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端とをＲｎｌ２ファミリーのリガーゼによりライゲーションするライゲーション工程とを含み、
　前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、第１のリンカーを介して連結された第１のＲＮＡ部分と第２のＲＮＡ部分を含み、第１のＲＮＡ部分と第２のＲＮＡ部分の一方は他方に対して相補的に結合可能であり、
　前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、第２のリンカーを介して連結された第３のＲＮＡ部分と第４のＲＮＡ部分を含み、第３のＲＮＡ部分と第４のＲＮＡ部分の一方は他方に対して相補的に結合可能であり、
　前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とは５’末端又は３’末端の相補的な配列間で分子間二重鎖を形成可能であり、
　アニーリング工程において前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子が二重鎖を形成するとき、前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端のリボヌクレオチド残基と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端のリボヌクレオチド残基はニックを生成し、また前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端のリボヌクレオチド残基と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端のリボヌクレオチド残基の間には１個以上のリボヌクレオチド残基のギャップが存在し、
　前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とのライゲーションにより生成される配列は、前記標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む、
ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法。
［２］前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、下記式（Ｉ）で表され、前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、下記式（ＩＩ）で表され、
　　５’－Ｘｓ－Ｌｘ１－Ｘａ－３’　　　　　　　　　　　・・・式（Ｉ）
　　５’－Ｙａ１－Ｙａ２－Ｙａ３－Ｌｘ２－Ｙｓ－３’　　　・・・式（ＩＩ）
　式（Ｉ）及び式（ＩＩ）中、Ｘｓ、Ｘａ、Ｙａ１、Ｙａ２、Ｙａ３及びＹｓは、１個又はそれ以上のリボヌクレオチド残基を表し、
　Ｌｘ１及びＬｘ２は、それぞれ、第１のリンカー及び第２のリンカーを表し、
　Ｙａ３は、Ｙｓと相補的であり、
　ライゲーション工程で生じるＸａ－Ｙａ１は、Ｘｓと相補的であり、
　ライゲーション工程で生じるＸａ－Ｙａ１－Ｙａ２－Ｙａ３は、前記標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む、
上記［１］に記載の製造方法。
［３］前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子が３’末端にウラシル（Ｕ）又はアデニン（Ａ）を有し、前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子が５’末端にウラシル（Ｕ）又はアデニン（Ａ）を有する、上記［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］第１のリンカー及び第２のリンカーは、それぞれ独立して、（ｉ）ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド性リンカー、又は（ｉｉ）ヌクレオチド性リンカーである、上記［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼが、Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ２である、上記［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］ｐＨ７．４～８．６の反応液中で前記ライゲーションが行われる、上記［１］～［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］２～１０ｍＭの二価金属イオンを含む反応液中で前記ライゲーションが行われる、上記［１］～［６］のいずれかに記載の製造方法。
［８］第１のリンカー及び第２のリンカーは、それぞれ独立して、下記式（ＶＩ）で表される非ヌクレオチド性リンカーである、上記［１］～［７］のいずれかに記載の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 ［９］前記標的遺伝子は、ＴＧＦ－β１遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子、ＬＡＭＡ１遺伝子又はＬＭＮＡ遺伝子である、上記［１］～［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１０］前記ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、配列番号１で表される塩基配列からなり、２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結され、５０番目と５１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている、上記［１］～［９］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、以下の（１）～（６）のいずれかである、上記［１］～［１０］のいずれかに記載の製造方法。
（１）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号７で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１０番目と１１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（２）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号１９で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１６番目と１７番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号１８で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（３）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号２７で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２０番目と２１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号２６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（４）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号２９で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２１番目と２２番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号２８で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（５）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号３１で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２２番目と２３番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号３０で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（６）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号３３で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２３番目と２４番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号３２で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
［１２］以下の（ａ）～（ｌ）のいずれかである、一本鎖オリゴＲＮＡ分子。
（ａ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号７で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｂ）１０番目と１１番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号６で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｃ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号１９で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｄ）１６番目と１７番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号１８で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｅ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号２７で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｆ）２０番目と２１番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号２６で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｇ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号２９で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｈ）２１番目と２２番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号２８で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｉ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３１で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｊ）２２番目と２３番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３０で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｋ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３３で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｌ）２３番目と２４番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３２で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
［１３］以下の（１）～（６）のいずれかの一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせを含む、ＴＧＦ－β１遺伝子の発現を抑制するためのヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造用のキット。
（１）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号７で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１０番目と１１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（２）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号１９で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１６番目と１７番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号１８で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（３）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号２７で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２０番目と２１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号２６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（４）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号２９で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２１番目と２２番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号２８で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（５）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号３１で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２２番目と２３番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号３０で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（６）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号３３で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２３番目と２４番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号３２で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１８－０７０４２３号の開示内容を包含する。
　本発明によれば、標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を、効率的に製造することができる。
図１は、本発明の一実施形態のライゲーション法の概略図である。 図２は、ｓｓＴｂＲＮＡ分子（配列番号１）の模式図である。Ｐはプロリン誘導体を表す。配列番号１の２９番目（Ｕ）～４７番目（Ｃ）は活性配列（ＴＧＦ－β１遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列；アンチセンス配列）に相当する。 図３は、表１に示す００４～０１９の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランド１及び２）のセット（ペア）のＴ４　ＲＮＡリガーゼ２を用いたアニーリング及びライゲーション反応後のライゲーション効率を示す。 図４は、０１１、０１６、及び０１８の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランド１及び２）の構造を示す。それぞれのペアの右側がストランド１、左側がストランド２である。 図５は、０１６のオリゴ核酸を、異なるオリゴＲＮＡ濃度及び異なる反応温度でライゲーションしたときのライゲーション効率の経時的変化を示す。 図６は、０１１、０１６、及び０１８のオリゴＲＮＡ（１００μＭ）を用い、異なる反応温度でライゲーションしたときのライゲーション効率の経時的変化を示す。Ａは２５℃、Ｂは３７℃でのライゲーションの結果を示す。 図７は、０１１のオリゴＲＮＡを異なるＡＴＰ濃度下でライゲーションしたときの変性ＰＡＧＥ解析の結果を示す。 図８は、０１１のオリゴＲＮＡを異なるＡＴＰ濃度下でライゲーションしたときのライゲーション効率を示す。 図９は、０１６のオリゴＲＮＡを、異なるオリゴＲＮＡ濃度、異なるｐＨ条件下でライゲーションしたときのライゲーション効率の経時的変化を示す。 図１０は、０１６のオリゴＲＮＡを異なるｐＨ条件下でライゲーションしたときのライゲーション効率を示す。 図１１は、０１６のオリゴＲＮＡを、異なるオリゴＲＮＡ濃度、異なるＭｇＣｌ２濃度下でライゲーションしたときのライゲーション効率を示す。Ａは１０μＭ又は１００μＭ　オリゴＲＮＡ、Ｂは１０μＭ又は２００μＭ　オリゴＲＮＡの存在下でのライゲーションの結果を示す。 図１２は、０１６のオリゴＲＮＡを、異なるＭｇＣｌ２濃度、異なるｐＨ条件下でライゲーションしたときのライゲーション効率を示す。ＡはｐＨ７．５、ＢはｐＨ８．０でのライゲーションの結果を示す。 図１３は、異なる酵素量を用い、ＰＥＧを添加してライゲーションしたときのライゲーション効率を示す。 図１４は、異なるオリゴＲＮＡ濃度を使用したライゲーション反応のタイムコースを示す。 図１５は、初期オリゴＲＮＡ濃度を１００μＭとし、オリゴＲＮＡを順次追加しながら行ったライゲーション反応における、目的産物ｓｓＴｂＲＮＡ分子の生成量を示す。ｓｓＴｂＲＮＡ分子の生成量（ｎｍｏｌ）＝（一本鎖オリゴＲＮＡ分子の添加量）×（ＦＬＰ（Ｆｕｌｌ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔ，完全長の生成物）（％））／１００。グラフの横軸のｈはライゲーション開始後の時間を表す。ライゲーション開始時のオリゴＲＮＡ濃度１００μＭ（１０ｎｍｏｌ）、酵素濃度４ユニット／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡは、最終添加後にはオリゴＲＮＡ濃度３００μＭ（４０ｎｍｏｌ）、酵素濃度１ユニット／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡとなった。 図１６は、初期オリゴＲＮＡ濃度を２００μＭとし、オリゴＲＮＡを順次追加しながら行ったライゲーション反応における、目的産物ｓｓＴｂＲＮＡ分子の生成量を示す。ｓｓＴｂＲＮＡ分子の生成量（ｎｍｏｌ）＝（一本鎖オリゴＲＮＡ分子の添加量）×（ＦＬＰ（％））／１００。グラフの横軸のｈはライゲーション開始後の時間を表す。ライゲーション開始時のオリゴＲＮＡ濃度２００μＭ（２０ｎｍｏｌ）、酵素濃度４ユニット／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡは、最終添加後にはオリゴＲＮＡ濃度４８０μＭ（８０ｎｍｏｌ）、酵素濃度０．５ユニット／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡとなった。 図１７は、ＧＡＰＤＨ遺伝子、ＬＡＭＡ１遺伝子、又はＬＭＮＡ遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含むヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子と、その分割位置を示す。（１）～（７）は分割位置を示す。各遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列（活性配列／アンチセンス配列）を枠で示した。 図１８は、ＧＡＰＤＨ遺伝子、ＬＡＭＡ１遺伝子、又はＬＭＮＡ遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含むヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の分割フラグメントである一本鎖オリゴＲＮＡ分子のペア（ストランド１及び２）を用いたアニーリング及びライゲーション反応後のライゲーション効率を示す。 図１９は、表１に示すストランド１及びストランド２のセット（ペア）のＴ４　ＲＮＡリガーゼを用いたアニーリング及びライゲーション反応後のライゲーション効率を示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法に関する。本発明の方法により製造されるヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、遺伝子発現抑制配列を含む二本鎖ＲＮＡのセンス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の５’末端が、非ヌクレオチド性リンカー又はヌクレオチド性リンカーなどのリンカーを含む配列を介して連結され、そのアンチセンス鎖の３’末端に非ヌクレオチド性リンカー又はヌクレオチド性リンカーなどのリンカーを含む配列を介して１個以上のリボヌクレオチド残基がさらに連結された一本鎖構造を有する。本発明の方法により製造されるヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の５’末端と３’末端は、結合されていない。本明細書において「ヘアピン型」とは、一本鎖ＲＮＡ分子が分子内アニーリング（自己アニーリング）により１つ以上の二重鎖構造を形成することを意味する。本発明の方法により製造されるヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、典型的には、その５’末端を含む５’側領域と３’末端を含む３’側領域がそれぞれ別個に分子内アニーリングすることにより、２つの二重鎖構造を形成する。本明細書において「ＲＮＡ」、「ＲＮＡ分子」、「核酸分子」及び「核酸」は、ヌクレオチドのみから構成されていてもよいが、ヌクレオチドと非ヌクレオチド物質（例えば、プロリン誘導体などの環状アミン誘導体）から構成されていてもよい。
　本発明では、標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を、２つのリンカー（例えば、非ヌクレオチド性リンカー、ヌクレオチド性リンカー、又はそれらを組み合わせたリンカー）に挟まれた配列中で２つに分割したフラグメントとして合成し、それらをアニーリングし、ライゲーションすることにより、製造することができる。ライゲーションとは、２つの核酸（本発明においては、典型的にはＲＮＡ）を、その末端の５’リン酸基と３’水酸基を結合（ホスホジエステル結合）させることにより連結することを意味する。本発明の方法では、比較的長鎖のヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を、より短鎖の一本鎖ＲＮＡ分子のペアのライゲーションによって製造し、それにより当該ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の高収量な製造を実現することができる。
　より具体的には、本発明は、標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法であって、
　第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とをアニーリングするアニーリング工程と、
　前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端とをＲｎｌ２ファミリーのリガーゼによりライゲーションするライゲーション工程とを含み、
　第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とのライゲーションにより生成される配列は、前記標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む、ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法に関する。
　本発明の方法において、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、第１のリンカーを介して連結された第１のＲＮＡ部分と第２のＲＮＡ部分を含み、第１のＲＮＡ部分と第２のＲＮＡ部分の一方は他方に対して相補的に結合可能である。その相補的な結合により、第１のリンカーはループを形成し、第１のＲＮＡ部分と第２のＲＮＡ部分は当該ループに隣接してステムを形成し得る。第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子において、第１のＲＮＡ部分は５’末端側に、第２のＲＮＡ部分は３’末端側に配置される。また、第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、第２のリンカーを介して連結された第３のＲＮＡ部分と第４のＲＮＡ部分を含み、第３のＲＮＡ部分と第４のＲＮＡ部分の一方は他方に対して相補的に結合可能である。その相補的な結合により、第２のリンカーはループを形成し、第３のＲＮＡ部分と第４のＲＮＡ部分は当該ループに隣接してステムを形成し得る。第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子において、第３のＲＮＡ部分は５’末端側に、第４のＲＮＡ部分は３’末端側に配置される。第１～第４のＲＮＡ部分は、それぞれ、１個又は２個以上のリボヌクレオチド残基を含む。このように第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、自己相補配列を含み、それぞれ、分子内アニーリング（自己アニーリング）により、ヘアピン構造を形成することができる。第１のＲＮＡ部分と第２のＲＮＡ部分は一方が他方よりも長い塩基長を有することが好ましい。また第３のＲＮＡ部分と第４のＲＮＡ部分は一方が他方よりも長い塩基長を有することが好ましい。第１のＲＮＡ部分が第２のＲＮＡ部分よりも長い塩基長を有する場合、第３のＲＮＡ部分は第４のＲＮＡ部分よりも長い塩基長を有することが好ましい。第２のＲＮＡ部分が第１のＲＮＡ部分よりも長い塩基長を有する場合、第４のＲＮＡ部分は第１のＲＮＡ部分よりも長い塩基長を有することが好ましい。第１のＲＮＡ部分と第２のＲＮＡ部分のうち、より長い塩基長を有する方のＲＮＡ部分は、より短い塩基長を有する方のＲＮＡ部分に相補的なリボヌクレオチド残基又はその配列を、第１のリンカーに隣接して含むことが好ましい。第３のＲＮＡ部分と第４のＲＮＡ部分のうち、より長い塩基長を有する方のＲＮＡ部分は、より短い塩基長を有する方のＲＮＡ部分に相補的なリボヌクレオチド残基又はその配列を、第２のリンカーに隣接して含むことが好ましい。
　本発明において、一本鎖オリゴＲＮＡ分子に含まれる２つのＲＮＡ部分（第１及び第２のＲＮＡ部分、又は第３及び第４のＲＮＡ部分）の一方が他方に対して「相補的に結合可能である」とは、２つのＲＮＡ部分のうちいずれか一方（通常は、より短い塩基長を有する方のＲＮＡ部分）の全長が他方のＲＮＡ部分（通常は、より長い塩基長を有する方のＲＮＡ部分）に対し、安定な塩基対合を形成して結合できることを意味し、この場合、前者のＲＮＡ部分の全長は後者のＲＮＡ部分内の対応するリボヌクレオチド残基又はその配列に対して相補的である。一本鎖オリゴＲＮＡ分子に含まれる２つのＲＮＡ部分の一方は、他方のＲＮＡ部分中の対応するリボヌクレオチド残基又はその配列に対して完全に相補的（すなわち、一方のＲＮＡ部分の全てのリボヌクレオチド残基が、他方のＲＮＡ部分中の対応するリボヌクレオチド残基に対してミスマッチを有さない）であることがより好ましい。あるいは、一本鎖オリゴＲＮＡ分子に含まれる２つのＲＮＡ部分の一方は、他方のＲＮＡ部分に対して、安定な塩基対合を形成できる限り、１個以上、例えば１個又は２個のリボヌクレオチド残基のミスマッチを含んでもよく、その場合も「相補的に結合可能」である。但しそのミスマッチは、本発明の方法においてライゲーションされる分子末端のリボヌクレオチド残基には存在しないことが好ましい。
　一実施形態では、第１のＲＮＡ部分及び第４のＲＮＡ部分の一方は、他方より短く、好ましくは１～７塩基長であり、例えば、１～６塩基長、１～４塩基長、１～３塩基長、１塩基長又は２塩基長である。その場合、第１のＲＮＡ部分及び第４のＲＮＡ部分のうち長い方（他方）は、１９～２８塩基長であってよく、例えば、１９～２７塩基長、１９～２５塩基長、１９～２３塩基長、２０～２８塩基長、２１～２７塩基長、２０～２５塩基長、２２～２７塩基長、２３～２６塩基長、２４～２８塩基長、２６～２８塩基長であってよい。
　第１のＲＮＡ部分が第４のＲＮＡ部分よりも長い場合、第２のＲＮＡ部分は、以下に限定するものではないが、１～２０塩基長であってよく、例えば２～２０塩基長、２～１５塩基長、３～１０塩基長、３～６塩基長、５～１２塩基長、又は９～１２塩基長であってよい。第１のＲＮＡ部分が第４のＲＮＡ部分よりも短い場合、第２のＲＮＡ部分は、以下に限定するものではないが、８～３８塩基長であってよく、例えば８～３６塩基長、１２～３６塩基長、１４～３４塩基長、１４～３３塩基長、１４～３６塩基長、又は２０～３４塩基長であってよい。
　第１のＲＮＡ部分の塩基配列は、リンカーと隣接してＣＣ（シトシン－シトシン）を含んでもよく、この場合、第２のＲＮＡ部分の塩基配列は、その配列と相補的になるように、リンカーと隣接してＧＧ（グアニン－グアニン）を含むことが好ましい。一実施形態では、第１のＲＮＡ部分の塩基配列は、リンカーと隣接してＡＣＣ（アデニン－シトシン－シトシン）、ＧＣＣ（グアニン－シトシン－シトシン）、又はＵＣＣ（ウラシル－シトシン－シトシン）を含んでもよく、この場合、第２のＲＮＡ部分の塩基配列は、その配列と相補的になるように、リンカーと隣接してそれぞれＧＧＵ（グアニン－グアニン－ウラシル）、ＧＧＣ（グアニン－グアニン－シトシン）、又はＧＧＡ（グアニン－グアニン－アデニン）を含むことが好ましい。第３のＲＮＡ部分の塩基配列は、リンカーと隣接してＣ（シトシン）を含んでもよく、この場合、第４のＲＮＡ部分の塩基配列は、その残基と相補的になるように、リンカーと隣接してＧ（グアニン）を含むことが好ましい。
　第１又は第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の塩基長、すなわち２つのＲＮＡ部分の合計塩基長（リンカー部分は含まない）は、以下に限定されないが、好ましくは１３～４８塩基長である。第１のＲＮＡ部分が第４のＲＮＡ部分よりも長い場合、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の塩基長、すなわち第１のＲＮＡ部分及び第２のＲＮＡ部分の合計塩基長（リンカー部分は含まない）は、好ましくは２１～４８塩基長であり、例えば、２１～４５塩基長、２５～４５塩基長、２６～３５塩基長、２６～３０塩基長、２６～２８塩基長、又は３３～３６塩基長である。第１のＲＮＡ部分が第４のＲＮＡ部分よりも短い場合、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の塩基長、すなわち第１のＲＮＡ部分及び第２のＲＮＡ部分の合計塩基長（リンカー部分は含まない）は、好ましくは１３～４５塩基長であり、例えば、１３～４３塩基長、１５～４１塩基長、１５～３０塩基長、１７～２５塩基長、又は２０～２５塩基長である。
　本発明の方法において、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、５’末端又は３’末端の配列において互いに相補的である。第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とは、５’末端又は３’末端の相補的な配列間（好ましくは、完全に相補的な配列間）で分子間二重鎖を形成可能である。より具体的には、一実施形態では、ヘアピン構造を形成した第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端の配列（第１のＲＮＡ部分の５’末端の、ヘアピン構造のステム・ループに含まれない配列）と、ヘアピン構造を形成した第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端の配列（第３のＲＮＡ部分の５’末端の、ヘアピン構造のステム・ループに含まれない配列）が、互いに相補的であり、分子間二重鎖を形成可能である。別の実施形態では、ヘアピン構造を形成した第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端の配列（第２のＲＮＡ部分の３’末端の、ヘアピン構造のステム・ループに含まれない配列）と、ヘアピン構造を形成した第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端の配列（第４のＲＮＡ部分の３’末端の、ヘアピン構造のステム・ループに含まれない配列）が、互いに相補的であり、分子間二重鎖を形成可能である。本発明の方法のアニーリング工程では、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とが５’末端又は３’末端の相補的な配列間で分子間二重鎖を形成することにより、二本鎖オリゴＲＮＡが生成される。
　一実施形態では、第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子間で相補的な配列の長さ（後述のギャップ部分を含まない）は、以下に限定されないが、通常は６塩基長以上、例えば７塩基以上、１０塩基長以上、１２塩基長以上、１４塩基長以上、又は１８塩基以上であり、例えば６～２７塩基長、７～２５塩基長、１０～２５塩基長、１２～２３塩基長、１２～２２塩基長、１２～１５塩基長、又は１８～２３塩基長であってよい。
　本発明の方法のアニーリング工程において、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子が二重鎖を形成するとき、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端のリボヌクレオチド残基と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端のリボヌクレオチド残基はニックを生成する。より具体的には、アニーリング工程において第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子間で相補的な配列の分子間アニーリングにより二重鎖（分子間二重鎖）を形成することに加えて、第１のＲＮＡ部分と第２のＲＮＡ部分、及び第３のＲＮＡ部分と第４のＲＮＡ部分において、それぞれ、分子内アニーリングによる二重鎖（分子内二重鎖、すなわちヘアピン構造）を形成し、第２のＲＮＡ部分と第３のＲＮＡ部分の間にはニックが生じる。本発明において「ニック」とは、核酸二重鎖の一方のヌクレオチド鎖において２つのヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合が切れて３’水酸基と５’リン酸基が遊離している状態を指す。ニックは、ライゲーション反応により連結可能である。
　本発明の方法のアニーリング工程において、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子が二重鎖を形成するとき、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端のリボヌクレオチド残基と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端のリボヌクレオチド残基の間には１個以上のリボヌクレオチド残基のギャップが存在する。このギャップはライゲーション反応により連結されないため、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、ライゲーション反応後、一本鎖ＲＮＡ分子を形成する。１個以上のリボヌクレオチド残基のギャップは、１～４残基（１、２、３、又は４残基）のギャップであってもよい。このギャップ部分では塩基対合は形成されない。
　第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端のリボヌクレオチド残基と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端のリボヌクレオチド残基の間のギャップは、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子がアニーリングした二重鎖中、第１のリンカーにより近い位置にあってもよいし、あるいは第２のリンカーにより近い位置にあってもよい。
　第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とのライゲーションにより生成される配列は、標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む。第１のＲＮＡ部分又は第４のＲＮＡ部分は、標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列（センス配列又はアンチセンス配列；例えばセンス配列）を含み得る。ライゲーションにより第２のＲＮＡ部分と第３のＲＮＡ部分が連結された配列は、標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列（アンチセンス配列又はセンス配列；例えばアンチセンス配列）を含み得る。一実施形態では、第２のＲＮＡ部分又は第３のＲＮＡ部分が標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列（アンチセンス配列又はセンス配列；例えばアンチセンス配列）を含んでもよい。
　本発明の方法において、リンカー、例えば、第１のリンカー及び第２のリンカーは、非ヌクレオチド性リンカー、ヌクレオチド性リンカー、又はそれらの組み合わせであってよい。
　一実施形態では、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は３’末端にウラシル（Ｕ）又はアデニン（Ａ）を有し、かつ、第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は５’末端にウラシル（Ｕ）又はアデニン（Ａ）を有する。ここで一本鎖オリゴＲＮＡ分子が３’末端又は５’末端にウラシル（Ｕ）又はアデニン（Ａ）を有するとは、一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端又は５’末端のリボヌクレオチド残基が塩基としてウラシル（Ｕ）又はアデニン（Ａ）を含むことを意味する。具体的には、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端のリボヌクレオチド残基の塩基と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端のリボヌクレオチド残基の塩基の好ましい組み合わせは、Ｕ－Ａ、Ｕ－Ｕ、Ａ－Ｕ、又はＡ－Ａであり得る。
　本発明の方法の一実施形態の概略図を図１に示す。図１中、Ｌｘ１及びＬｘ２はリンカー（例えば、非ヌクレオチド性リンカー、ヌクレオチド性リンカー、又はそれらの組み合わせ）である。本発明の方法では、比較的長鎖のヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を、より短鎖の一本鎖ＲＮＡ分子のペアをライゲーションすることによって製造し、それにより高収量を実現することができる。
　一実施形態において、本発明に係る、標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法は、
下記式（Ｉ）で表される第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（図１中、ストランド１）：
　　５’－Ｘｓ－Ｌｘ１－Ｘａ－３’　　　　・・・式（Ｉ）
と、下記式（ＩＩ）で表される第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（図１中、ストランド２）：
　　５’－Ｙａ１－Ｙａ２－Ｙａ３－Ｌｘ２－Ｙｓ－３’　　　　・・・式（ＩＩ）
をアニーリングするアニーリング工程と、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端とをライゲーションするライゲ-ション工程とを含む。このライゲーションはＲｎｌ２ファミリーのリガーゼにより行うことができる。
　別の実施形態において、本発明に係る、標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法は、
下記式（Ａ）で表される第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子：
　　５’－ＸＸｓ－Ｌｘ１－ＸＸａ３－ＸＸａ２－ＸＸａ１－３’　・・・式（Ａ）
と、下記式（Ｂ）で表される第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子：
　　５’－ＹＹａ－Ｌｘ２－ＹＹｓ－３’　　　　・・・式（Ｂ）
をアニーリングするアニーリング工程と、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端とをライゲーションするライゲ-ション工程とを含む。このライゲーションはＲｎｌ２ファミリーのリガーゼにより行うことができる。
　本発明において「オリゴＲＮＡ」及び「オリゴＲＮＡ分子」とは、４９塩基長以下（非ヌクレオチド性リンカー及びヌクレオチド性リンカーなどのリンカー部分の残基数は不算入）の塩基配列を有するＲＮＡ分子を指す。本発明において用語「オリゴＲＮＡ」と「オリゴＲＮＡ分子」は通常、互換的に使用される。本発明に係る一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、一本鎖オリゴＲＮＡ、オリゴ核酸、一本鎖核酸分子、オリゴＲＮＡ、又はオリゴＲＮＡ分子と称されることもある。
　式（Ｉ）及び式（ＩＩ）中、Ｘｓ、Ｘａ、Ｙａ１、Ｙａ２、Ｙａ３、及びＹｓは、１個又はそれ以上のリボヌクレオチド残基を表す。式（Ｉ）及び式（ＩＩ）中、Ｌｘ１及びＬｘ２は、それぞれ独立して、リンカー、例えば、非ヌクレオチド性リンカー、ヌクレオチド性リンカー、又はそれらの組み合わせを表す。
　式（Ｉ）は、領域ＸｓとＸａが、Ｌｘ１を介して連結された構造を表している。式（ＩＩ）は、領域Ｙａ１、Ｙａ２、及びＹａ３がこの順番で連結されたリボヌクレオチド配列（Ｙａ１－Ｙａ２－Ｙａ３）と領域Ｙｓが、Ｌｘ２を介して連結された構造を表している。
　式（Ａ）及び式（Ｂ）中、ＸＸｓ、ＸＸａ３、ＸＸａ２、ＸＸａ１、ＹＹａ、及びＹＹｓは、１個又はそれ以上のリボヌクレオチド残基を表す。式（Ａ）及び式（Ｂ）中、Ｌｘ１及びＬｘ２は、それぞれ独立して、リンカー、例えば、非ヌクレオチド性リンカー、ヌクレオチド性リンカー、又はそれらの組み合わせを表す。
　式（Ａ）は、領域ＸＸａ３、ＸＸａ２、及びＸＸａ１がこの順番で連結されたリボヌクレオチド配列（ＸＸａ３－ＸＸａ２－ＸＸａ１）と領域ＸＸｓが、Ｌｘ１を介して連結された構造を表している。式（Ｂ）は、領域ＹＹａとＹＹｓが、Ｌｘ２を介して連結された構造を表している。
　Ｘｓ、Ｘａ、Ｙａ１、Ｙａ２、Ｙａ３、Ｙｓ、ＸＸｓ、ＸＸａ３、ＸＸａ２、ＸＸａ１、ＹＹａ、及びＹＹｓはリボヌクレオチド残基からなる。リボヌクレオチド残基は、アデニン、ウラシル、グアニン、又はシトシンから選択されるいずれかの核酸塩基を有するものであってよい。リボヌクレオチド残基はまた、修飾リボヌクレオチド残基であってもよく、例えば、修飾された核酸塩基（修飾塩基）を有していてもよい。修飾としては、蛍光色素標識、メチル化、ハロゲン化、シュードウリジン化、アミノ化、脱アミノ化、チオ化、ジヒドロ化などが挙げられるが、これらに限定されない。Ｘｓ、Ｘａ、Ｙａ１、Ｙａ２、Ｙａ３、及びＹｓは、それぞれ独立に、非修飾リボヌクレオチド残基のみからなるものであってもよいし、非修飾リボヌクレオチド残基に加えて修飾リボヌクレオチド残基を含むものであってもよいし、修飾リボヌクレオチド残基のみからなるものであってもよい。Ｘｓが５’末端に修飾リボヌクレオチド残基を含んでいてもよい。Ｙｓが３’末端に修飾リボヌクレオチド残基を含んでいてもよい。同様に、ＸＸｓ、ＸＸａ３、ＸＸａ２、ＸＸａ１、ＹＹａ、及びＹＹｓは、それぞれ独立に、非修飾リボヌクレオチド残基のみからなるものであってもよいし、非修飾リボヌクレオチド残基に加えて修飾リボヌクレオチド残基を含むものであってもよいし、修飾リボヌクレオチド残基のみからなるものであってもよい。ＸＸｓが５’末端に修飾リボヌクレオチド残基を含んでいてもよい。ＹＹｓが３’末端に修飾リボヌクレオチド残基を含んでいてもよい。
　本発明において、ライゲーション工程で生じるＸａ－Ｙａ１（ライゲーションによりＸａとＹａ１が連結されたヌクレオチド配列）は、Ｘｓと相補的である。一実施形態では、Ｘｓは、１９～２８塩基長であってよく、例えば１９～２７塩基長、１９～２５塩基長、１９～２３塩基長、２０～２８塩基長、２１塩基～２７塩基、２１塩基～２５塩基、２２～２７塩基長、２３～２６塩基長、２４～２８塩基長、又は２６～２８塩基長であってよい。
　本発明において、ライゲーション工程で生じるＸＸａ１－ＹＹａ（ライゲーションによりＸＸａ１とＹＹａが連結されたヌクレオチド配列）は、ＹＹｓと相補的である。一実施形態では、ＹＹｓは、１９～２８塩基長であってよく、例えば１９～２７塩基長、１９～２５塩基長、１９～２３塩基長、２０～２８塩基長、２１塩基～２７塩基、２１塩基～２５塩基、２２～２７塩基長、２３～２６塩基長、２４～２８塩基長、又は２６～２８塩基長であってよい。
　本発明において、Ｘａは、Ｘｓ内の対応する残基又は配列と相補的である。一実施形態では、式（Ｉ）中、Ｘｓの塩基配列が、リンカーと隣接してＣ（シトシン）を含んでもよい。この場合、Ｘａの塩基配列は、Ｘｓと相補的になるように、リンカーと隣接してＧ（グアニン）を含む。一実施形態では、式（Ｉ）中、Ｘｓの塩基配列が、リンカーと隣接してＣＣ（シトシン－シトシン）を含んでもよい。この場合、Ｘａの塩基配列は、Ｘｓと相補的になるように、リンカーと隣接してＧＧ（グアニン－グアニン）を含む。一実施形態では、式（Ｉ）中、Ｘｓの塩基配列は、リンカーと隣接してＡＣＣ（アデニン－シトシン－シトシン）を含んでもよい。この場合、Ｘａの塩基配列は、Ｘｓと相補的になるように、リンカーと隣接してＧＧＵ（グアニン－グアニン－ウラシル）を含む。一実施形態では、Ｘａは、３’末端に塩基ウラシル（Ｕ）又はアデニン（Ａ）を含んでもよい。Ｘａは、１～２０塩基長であってよく、例えば２～２０塩基長、２～１５塩基長、３～１０塩基長、３～６塩基長、５～１２塩基長又は９～１２塩基長であってよい。
　本発明において、ＸＸａ３はＸＸｓと相補的である。一実施形態では、式（Ａ）中、ＸＸｓの塩基配列が、リンカーと隣接してＣ（シトシン）を含んでもよい。この場合、ＸＸａ３の塩基配列は、ＸＸｓと相補的になるように、リンカーと隣接してＧ（グアニン）を含む。一実施形態では、式（Ａ）中、ＸＸｓの塩基配列が、リンカーと隣接してＣＣ（シトシン－シトシン）を含んでもよい。この場合、ＸＸａ３の塩基配列は、ＸＸｓと相補的になるように、リンカーと隣接してＧＧ（グアニン－グアニン）を含む。一実施形態では、式（Ａ）中、ＸＸｓの塩基配列は、リンカーと隣接してＡＣＣ（アデニン－シトシン－シトシン；５’から３’の方向で）を含んでもよい。この場合、ＸＸａ３の塩基配列は、ＸＸｓと相補的になるように、リンカーと隣接してＧＧＵ（グアニン－グアニン－ウラシル；５’から３’の方向で）を含む。一実施形態では、ＸＸａ１の塩基配列は、３’末端に塩基ウラシル（Ｕ）又はアデニン（Ａ）を含んでもよい。ＸＸａ３及びＸＸｓは、好ましくは１～７塩基長であり、例えば、１～４塩基長、１塩基長又は２塩基長である。一実施形態では、ＹＹｓが２６～２８塩基長の場合、ＸＸａ３及びＸＸｓは１塩基長であってよい。
　本発明において、Ｙａ３はＹｓと相補的である。一実施形態では、Ｙａ３の塩基配列は、リンカーと隣接してＣ（シトシン）を含んでもよい。この場合、Ｙｓの塩基配列は、Ｙａ３と相補的になるように、リンカーと隣接してＧ（グアニン）を含む。Ｙａ３及びＹｓは、好ましくは１～７塩基長であり、例えば、１～４塩基長、１塩基長又は２塩基長である。一実施形態では、Ｘｓが２６～２８塩基長の場合、Ｙａ３及びＹｓは１塩基長であってよい。
　本発明において、ＹＹａは、ＹＹｓ内の対応する残基又は配列と相補的である。一実施形態では、ＹＹａの塩基配列は、リンカーと隣接してＣ（シトシン）を含んでもよい。この場合、ＹＹｓの塩基配列は、ＹＹａと相補的になるように、リンカーと隣接してＧ（グアニン）を含む。ＹＹａは、２～２０塩基長であってよく、例えば２～１５塩基長、３～１０塩基長、３～６塩基長、５～１２塩基長又は９～１２塩基長であってよい。
　本発明において、「相補的」とは、２つの核酸又はヌクレオチドがその間で安定な塩基対合を形成できることを意味する。相補的な２つの核酸は、同じ塩基長を有する。相補的な２つの核酸は、典型的には、互いの相補配列（相補鎖）からなり、すなわち、完全に相補的である。あるいは、相補的な２つの核酸は、修飾塩基と、それと塩基対を形成できる核酸塩基を、アニーリング時に対応する位置にそれぞれ含有してもよい。
　Ｙａ２は、ライゲーション後の本発明に係るヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子が分子内アニーリング（自己アニーリング）を生じる際に、Ｘｓ及びＹｓのいずれとも塩基対合を形成しない。Ｙａ２は、好ましくは１～４塩基長であり、例えば１、２、又は３塩基長である。同様に、ＸＸａ２は、ライゲーション後の本発明に係るヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子が分子内アニーリング（自己アニーリング）を生じる際に、ＸＸｓ及びＹＹｓのいずれとも塩基対合を形成しない。ＸＸａ２は、好ましくは１～４塩基長であり、例えば１、２、又は３塩基長である。
　第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランド１）において、式（Ｉ）中のＸｓとＸａの合計塩基長（非ヌクレオチド性リンカー、ヌクレオチド性リンカー、又はそれらの組み合わせなどのリンカー部分は含まない）は好ましくは２１～４８塩基長であり、例えば、２１～４５塩基長、２５～４５塩基長、２６～３５塩基長、２６～３０塩基長、２６～２８塩基長、又は３３～３６塩基長である。
　第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランド２）において、式（ＩＩ）中のＹａ１は、好ましくは６～２７塩基長であり、例えば７～２５塩基長、１０～２５塩基長、１２～２３塩基長、１２～２２塩基長、１２～１５塩基長、又は１８～２３塩基長である。
　第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランド２）において、式（ＩＩ）中のＹａ１、Ｙａ２、Ｙａ３、及びＹｓの合計塩基長（非ヌクレオチド性リンカー、ヌクレオチド性リンカー、又はそれらの組み合わせなどのリンカー部分は含まない）は好ましくは１３～４５塩基長であり、例えば、１３～４３塩基長、１５～４１塩基長、１５～３０塩基長、１７～２５塩基長、又は２０～２５塩基長である。
　第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランド１）において、式（Ａ）中のＸＸｓ、ＸＸａ３、ＸＸａ２、及びＸＸａ１の合計塩基長（非ヌクレオチド性リンカー、ヌクレオチド性リンカー、又はそれらの組み合わせなどのリンカー部分は含まない）は好ましくは１３～４５塩基長であり、例えば、１３～４３塩基長、１５～４１塩基長、１５～３０塩基長、１７～２５塩基長、又は２０～２５塩基長である。
　ＸＸａ１は、好ましくは６～２７塩基長であり、例えば７～２５塩基長、１０～２５塩基長、１２～２３塩基長、１２～２２塩基長、１２～１５塩基長、又は１８～２３塩基長である。
　第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランド２）において、式（Ｂ）中のＹＹａとＹＹｓとの合計塩基長（非ヌクレオチド性リンカー、ヌクレオチド性リンカー、又はそれらの組み合わせなどのリンカー部分は含まない）は好ましくは２１～４８塩基長であり、例えば、２１～４５塩基長、２５～４５塩基長、２６～３５塩基長、２６～３０塩基長、２６～２８塩基長、又は３３～３６塩基長である。
　本発明において、リンカー、例えば、第１のリンカー及び第２のリンカーは、特に限定されないが、それぞれ独立に、例えば、非ヌクレオチド性リンカー、ヌクレオチド性リンカー、又はそれらの組み合わせであってよい。ヌクレオチド性リンカーは、１個以上のヌクレオチド残基（リボヌクレオチド残基又はデオキシリボヌクレオチド残基、好ましくはリボヌクレオチド残基）からなる。非ヌクレオチド性リンカーはヌクレオチド残基を含まない。本発明において用いるリンカーの構成単位は、特に限定されず、ヌクレオチド残基及び／又は非ヌクレオチド残基であってよい。非ヌクレオチド性リンカーとヌクレオチド性リンカーの組み合わせであるリンカーは、ヌクレオチド残基と非ヌクレオチド残基の両方を含む。本発明のリンカーは、例えば、以下の（１）～（７）のいずれかの残基で構成され得る。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基と修飾ヌクレオチド残基の組み合わせ
（４）非ヌクレオチド残基
（５）非ヌクレオチド残基と非修飾ヌクレオチド残基の組み合わせ
（６）非ヌクレオチド残基と修飾ヌクレオチド残基の組み合わせ
（７）非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基及び修飾ヌクレオチド残基の組み合わせ
　一実施形態では、第１のリンカー及び第２のリンカーの両方が、ヌクレオチド残基からなるもの（ヌクレオチド性リンカー）であってもよいし、又は非ヌクレオチド残基からなるもの（非ヌクレオチド性リンカー）であってもよい。あるいは、第１のリンカー及び第２のリンカーの一方がヌクレオチド残基からなり、他方が非ヌクレオチド残基からからなるものであってもよい。第１のリンカー及び第２のリンカー（上記式中、Ｌｘ１及びＬｘ２のリンカー）は、同じ構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。
　本発明において用いるリンカー、例えば、第１のリンカー及び第２のリンカー（上記式中、Ｌｘ１及びＬｘ２）が、非ヌクレオチド残基を含む場合、非ヌクレオチド残基の個数は、特に限定されず、例えば、１～８個、１～６個、１～４個、１、２又は３個であってよい。「非ヌクレオチド残基」は、非ヌクレオチド性リンカーの構成単位を指す。非ヌクレオチド残基は、以下に限定するものではないが、例えば、ピロリジン骨格又はピペリジン骨格を有する環状アミン誘導体等であってよい。非ヌクレオチド残基は、例えば、後述の式（ＩＩＩ）で表される構造を単位（１個）とするものであってよい。
　本発明の一実施形態において、リンカー、例えば、第１のリンカー及び第２のリンカー（上記式中、Ｌｘ１及びＬｘ２）は、ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を１個以上含む非ヌクレオチド性リンカーであってよい。第１のリンカー及び第２のリンカー（上記式中、Ｌｘ１及びＬｘ２）は、同じ構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。第１のリンカー及び第２のリンカー（上記式中、Ｌｘ１及びＬｘ２）は、それぞれ独立して、ピロリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造を有してもよいし、ピペリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造を有してもよいし、上記ピロリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造と、上記ピペリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造との両方を有してもよい。本発明の方法により製造されるヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、このようなリンカーでセンス鎖とアンチセンス鎖が連結されていることにより、ヌクレアーゼ耐性に優れる。
　本発明のヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子において、ピロリジン骨格は、例えば、ピロリジンの５員環を構成する炭素原子が、１個以上、置換されたピロリジン誘導体の骨格でもよく、置換される場合、例えば、２位の炭素原子（Ｃ－２）以外の炭素原子であることが好ましい。上記炭素原子は、例えば、窒素原子、酸素原子又は硫黄原子で置換されてもよい。ピロリジン骨格は、例えば、ピロリジンの５員環内に、例えば、炭素－炭素二重結合又は炭素－窒素二重結合を含んでもよい。上記ピロリジン骨格において、ピロリジンの５員環を構成する炭素原子及び窒素原子は、例えば、水素原子が結合してもよいし、後述するような置換基が結合してもよい。リンカーＬｘ１は、例えば、上記ピロリジン骨格のいずれかの基を介して、式（Ｉ）におけるＸｓとＸａ、及び式（Ａ）におけるＸＸｓとＸＸａ３を連結してもよい。リンカーＬｘ２は、例えば、上記ピロリジン骨格のいずれかの基を介して、式（ＩＩ）におけるＹａ３とＹｓ、及び式（Ｂ）におけるＹＹａとＹＹｓを連結してもよい。それらは、上記５員環のいずれか１個の炭素原子と窒素原子、好ましくは、上記５員環の２位の炭素原子（Ｃ－２）と窒素原子を介して連結されうる。上記ピロリジン骨格としては、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等が挙げられる。
　上記ピペリジン骨格は、例えば、ピペリジンの６員環を構成する炭素が、１個以上置換されたピペリジン誘導体の骨格でもよく、置換される場合、例えば、Ｃ－２の炭素原子以外の炭素原子であることが好ましい。上記炭素原子は、例えば、窒素原子、酸素原子又は硫黄原子で置換されてもよい。上記ピペリジン骨格は、例えば、ピペリジンの６員環内に、例えば、炭素－炭素二重結合又は炭素－窒素二重結合を含んでもよい。上記ピペリジン骨格において、ピペリジンの６員環を構成する炭素原子及び窒素原子は、例えば、水素原子が結合してもよいし、後述するような置換基が結合してもよい。リンカーＬｘ１は、例えば、上記ピペリジン骨格のいずれかの基を介して、式（Ｉ）におけるＸｓとＸａ、及び式（Ａ）におけるＸＸｓとＸＸａ３を連結してもよい。リンカーＬｘ２は、例えば、上記ピペリジン骨格のいずれかの基を介して、式（ＩＩ）におけるＹａ３とＹｓ、及び式（Ｂ）におけるＹＹａとＹＹｓを連結してもよい。それらは、上記６員環のいずれか１個の炭素原子と窒素原子、好ましくは、上記６員環の２位の炭素原子（Ｃ－２）と窒素原子を介して連結されうる。
　上記リンカーは、例えば、上記の非ヌクレオチド構造からなる非ヌクレオチド残基のみを含むものでありうる。
　上記リンカー領域は、例えば、下記式（ＩＩＩ）で表されるか、又は下記式（ＩＩＩ）で表される非ヌクレオチド残基を１個又は２個以上含むものであってよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 　上記式（ＩＩＩ）中、
Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり；
Ｙ１及びＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、Ｏ又はＳであり；
Ｒ３は、環Ａ上のＣ－３、Ｃ－４、Ｃ－５又はＣ－６に結合する水素原子又は置換基であり、
Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、又は、
Ｌ１は、上記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ここで、Ｙ１が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、又は、
Ｌ２は、上記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ここで、Ｙ２が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、置換基又は保護基であり；
ｌは、１又は２であり；
ｍは、０～３０の範囲の整数であり；
ｎは、０～３０の範囲の整数であり；
環Ａは、環Ａ上のＣ－２以外の１個の炭素原子が、窒素原子、酸素原子、硫黄原子で置換されてもよく、
環Ａ内に、炭素－炭素二重結合又は炭素－窒素二重結合を含んでもよく、
ここで、Ｒ１及びＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｒ１及びＲ２が存在しない式（ＩＩＩ）で表される非ヌクレオチド残基である。
　式（Ｉ）におけるＸｓとＸａ、式（Ａ）におけるＸＸｓとＸＸａ３は、式（ＩＩＩ）中の－ＯＲ１－又は－ＯＲ２－を介して、リンカーＬｘ１と連結し得る。一実施形態では、Ｘｓが－ＯＲ１－を介して、Ｘａが－ＯＲ２－を介して、リンカーＬｘ１と連結してもよい。別の実施形態では、Ｘｓが－ＯＲ２－を介して、Ｘａが－ＯＲ１－を介して、リンカーＬｘ１と連結してもよい。別の実施形態では、ＸＸｓが－ＯＲ１－を介して、ＸＸａ３が－ＯＲ２－を介して、リンカーＬｘ１と連結してもよい。別の実施形態では、ＸＸｓが－ＯＲ２－を介して、ＸＸａ３が－ＯＲ１－を介して、リンカーＬｘ１と連結してもよい。
　式（ＩＩ）におけるＹａ３とＹｓ、式（Ｂ）におけるＹＹａとＹＹｓは、式（ＩＩＩ）中の－ＯＲ１－又は－ＯＲ２－を介して、リンカーＬｘ２と連結し得る。一実施形態では、Ｙａ３が－ＯＲ１－を介して、Ｙｓが－ＯＲ２－を介して、リンカーＬｘ２と連結してもよい。別の実施形態では、Ｙａ３が－ＯＲ２－を介して、Ｙｓが－ＯＲ１－を介して、リンカーＬｘ２と連結してもよい。別の実施形態では、ＹＹａが－ＯＲ１－を介して、ＹＹｓが－ＯＲ２－を介して、リンカーＬｘ２と連結してもよい。別の実施形態では、ＹＹａが－ＯＲ２－を介して、ＹＹｓが－ＯＲ１－を介して、リンカーＬｘ２と連結してもよい。
　好ましい一実施形態では、Ｘｓが－ＯＲ２－を介して、Ｘａが－ＯＲ１－を介して、リンカーＬｘ１と連結し、さらにＹａ３が－ＯＲ２－を介して、Ｙｓが－ＯＲ１－を介して、リンカーＬｘ２と連結してもよい。好ましい別の実施形態では、ＸＸｓが－ＯＲ２－を介して、ＸＸａ３が－ＯＲ１－を介して、リンカーＬｘ１と連結し、さらにＹＹａが－ＯＲ２－を介して、ＹＹｓが－ＯＲ１－を介して、リンカーＬｘ２と連結してもよい。
　上記式（ＩＩＩ）中、Ｘ１及びＸ２は、例えば、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、Ｓ又はＮＨである。上記式（ＩＩＩ）中において、Ｘ１がＨ２であるとは、Ｘ１が、Ｘ１の結合する炭素原子とともに、ＣＨ２（メチレン基）を形成することを意味する。Ｘ２についても同様である。
　上記式（ＩＩＩ）中、Ｙ１及びＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、Ｏ又はＳである。
　上記式（ＩＩＩ）中、環Ａにおいて、ｌは、１又は２である。ｌ＝１の場合、環Ａは、５員環であり、例えば、上記ピロリジン骨格である。上記ピロリジン骨格は、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等があげられ、これらの二価の構造が例示できる。ｌ＝２の場合、環Ａは、６員環であり、例えば、上記ピペリジン骨格である。環Ａは、環Ａ上のＣ－２以外の１個の炭素原子が、窒素原子、酸素原子又は硫黄原子で置換されてもよい。また、環Ａは、環Ａ内に、炭素－炭素二重結合又は炭素－窒素二重結合を含んでもよい。環Ａは、例えば、Ｌ型及びＤ型のいずれでもよい。
　上記式（ＩＩＩ）中、Ｒ３は、環Ａ上のＣ－３、Ｃ－４、Ｃ－５又はＣ－６に結合する水素原子又は置換基である。Ｒ３が上記置換基の場合、置換基Ｒ３は、１でも複数でも、存在しなくてもよく、複数の場合、同一でも異なってもよい。
　置換基Ｒ３は、例えば、ハロゲン、ＯＨ、ＯＲ４、ＮＨ２、ＮＨＲ４、ＮＲ４Ｒ５、ＳＨ、ＳＲ４又はオキソ基（＝Ｏ）等である。
　Ｒ４及びＲ５は、例えば、それぞれ独立して、置換基又は保護基であり、同一でも異なってもよい。上記置換基は、例えば、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等が挙げられる。以下、同様である。置換基Ｒ３は、これらの列挙する置換基であってもよい。
　上記保護基は、例えば、反応性の高い官能基を不活性に変換する官能基であり、公知の保護基等が挙げられる。上記保護基は、例えば、文献（J. F. W. McOmie, 「Protecting　Groups in Organic Chemistry」 Plenum Press, London and New York, 1973）の記載を援用できる。上記保護基は、特に制限されず、例えば、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）、ビス（２－アセトキシエチルオキシ）メチル基（ＡＣＥ）、トリイソプロピルシリルオキシメチル基（ＴＯＭ）、１－（２－シアノエトキシ）エチル基（ＣＥＥ）、２－シアノエトキシメチル基（ＣＥＭ）及びトリルスルフォニルエトキシメチル基（ＴＥＭ）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）等が挙げられる。Ｒ３がＯＲ４の場合、上記保護基は、特に制限されず、例えば、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基及びＴＥＭ基等が挙げられる。この他にも、シリル含有基も挙げられる。以下、同様である。
　上記式（ＩＩＩ）中、Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖である。上記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。又は、Ｌ１は、上記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。上記ポリエーテル鎖は、例えば、ポリエチレングリコールである。なお、Ｙ１が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ１がＯの場合、その酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接せず、ＯＲ１の酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接しない。
　上記式（ＩＩＩ）中、Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖である。上記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。又は、Ｌ２は、上記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。なお、Ｙ２が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ２がＯの場合、その酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接せず、ＯＲ２の酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接しない。
　Ｌ１のｎ及びＬ２のｍは、特に制限されず、それぞれ、下限は、例えば、０であり、上限も、特に制限されない。ｎ及びｍは、例えば、リンカーＬｘ１及びＬｘ２の所望の長さに応じて、適宜設定できる。ｎ及びｍは、例えば、製造コスト及び収率等の点から、それぞれ、０～３０が好ましく、より好ましくは０～２０であり、さらに好ましくは０～１５である。ｎとｍは、同じでもよいし（ｎ＝ｍ）、異なってもよい。ｎ＋ｍは、例えば、０～３０であり、好ましくは０～２０であり、より好ましくは０～１５である。
　Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、例えば、それぞれ独立して、置換基又は保護基である。上記置換基及び上記保護基は、例えば、前述と同様である。
　上記式（ＩＩＩ）において、水素原子は、例えば、それぞれ独立して、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ及びＩ等のハロゲンに置換されてもよい。
　好ましい実施形態では、上記リンカーは、下記式（ＩＶ－１）～（ＩＶ－９）のいずれかで表されるものであるか、又は下記式（ＩＶ－１）～（ＩＶ－９）で表される非ヌクレオチド残基を１個又は２個以上含むものであってよい。下記式において、ｑは、０～１０の整数である。下記式において、ｎ及びｍは、上記式（ＩＩＩ）と同じである。具体例としては、式（ＩＶ－１）においてｎ＝８、式（ＩＶ－２）においてｎ＝３、式（ＩＶ－３）においてｎ＝４又は８、式（ＩＶ－４）においてｎ＝７又は８、式（ＩＶ－５）においてｎ＝３及びｍ＝４、式（ＩＶ－６）においてｎ＝８及びｍ＝４、式（ＩＶ－７）においてｎ＝８及びｍ＝４、式（ＩＶ－８）においてｎ＝５及びｍ＝４、式（ＩＶ－９）においてｑ＝１及びｍ＝４が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　一実施形態では、上記リンカーは、下記式（Ｖ）又は（ＶＩ）で表されるものであるか、又は下記式（Ｖ）又は（ＶＩ）で表される非ヌクレオチド残基を１個又は２個以上含むものであってよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　一実施形態では、第１のＲＮＡ部分（Ｘｓ、ＸＸｓ）は式（ＶＩ）中の２位炭素原子側で、第２のＲＮＡ部分（Ｘａ、ＸＸａ３）は式（ＶＩ）中の１位窒素原子側で、リンカーＬｘ１と連結し、第３のＲＮＡ部分（Ｙａ３、ＹＹａ）は２位炭素原子側で、第４のＲＮＡ部分（Ｙｓ、ＹＹｓ）は式（ＶＩ）中の１位窒素原子側で、リンカーＬｘ２と連結していてもよい。
　式（ＶＩ）で表されるリンカーは、下記式（ＶＩ－１）又は（ＶＩ－２）で表される光学活性体であってよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子において、ＸａはＸｓの３’側領域と相補的であり、Ｙａ３はＹｓと相補的である。このため、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子において、ＸａはＸｓに向かって折り返し、ＸａはＸｓと自己アニーリングによって、二重鎖を形成する。同様に第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子において、ＹｓはＹａ３に向かって折り返し、ＹｓはＹａ３と自己アニーリングによって、二重鎖を形成する。
　第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子において、ＹＹａはＹＹｓの５’側領域と相補的であり、ＸＸａ３はＸＸｓと相補的である。このため、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子において、ＸＸａ３はＸＸｓに向かって折り返し、ＸＸａ３はＸＸｓと自己アニーリングによって、二重鎖を形成する。同様に第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子において、ＹＹａはＹＹｓに向かって折り返し、ＹＹａはＹＹｓと自己アニーリングによって、二重鎖を形成する。
　上記のようなリンカーはβターン構造を形成しやすい。そのため、式（Ｉ）の第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、リンカーＬｘ１によりβターン側で折り返し構造を取り、それによって、ＸａがＸｓと自己アニーリングする際にＸａの３’末端が式（ＩＩ）の第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端（Ｙａ１の５’末端）に接近しやすい構造を取ると考えられる。式（Ａ）及び（Ｂ）の第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子についても同様である。
　別の実施形態において、リンカー、例えば、第１のリンカー及び第２のリンカー（上記式中、Ｌｘ１及びＬｘ２）は、１つ以上のヌクレオチド残基からなるヌクレオチド性リンカーであってよい。リンカーがヌクレオチド性リンカーである場合、その長さは、特に限定されないが、リンカーの前後の配列、例えば、第１のＲＮＡ部分と第２のＲＮＡ部分、又は第３のＲＮＡ部分と第４のＲＮＡ部分による二重鎖形成を妨げない長さであることが好ましい。ヌクレオチド性リンカーである第１のリンカー及び第２のリンカー（上記式中、Ｌｘ１及びＬｘ２）の長さ（塩基数）及び塩基配列は、同じであっても異なっていてもよい。そのヌクレオチド性リンカーの長さは、例えば１塩基以上、２塩基以上、又は３塩基以上であってよく、かつ、例えば１００塩基以下、８０塩基以下、又は５０塩基以下であってよい。そのようなヌクレオチド性リンカーの長さは、例えば、１～５０塩基、１～３０塩基、３～２０塩基、３～１０塩基、又は３～７塩基であってよく、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０塩基であってよい。ヌクレオチド性リンカーは、自己相補的ではなく、配列内部において自己アニーリングを生じない構造であることが好ましい。
　本発明において用いるリンカー、例えば、第１のリンカー及び第２のリンカー（上記式中、Ｌｘ１及びＬｘ２）が、非修飾ヌクレオチド残基と修飾ヌクレオチド残基（例えば、修飾リボヌクレオチド残基）を含む場合、修飾ヌクレオチド残基の個数は、特に限定されないが、例えば、１～５個、１～４個、１～３個、例えば１個又は２個であってよい。
　本発明において用いるヌクレオチド性リンカーの例として、５’－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ｃ－３’、５’－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ｃ－３’、又は５’－Ｕ－Ｕ－Ｃ－Ｇ－３’のＲＮＡ配列からなるリンカーが挙げられる。一実施形態では、第１のリンカー及び第２のリンカー（上記式中、Ｌｘ１及びＬｘ２）は、それぞれ独立して、５’－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ｃ－３’、５’－Ｃ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ｃ－３’、及び５’－Ｕ－Ｕ－Ｃ－Ｇ－３’から選択される。一実施形態では、第１のリンカーは５’－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ａ－Ｃ－Ｃ－３’のＲＮＡ配列からなり、第２のリンカーは５’－Ｕ－Ｕ－Ｃ－Ｇ－３’のＲＮＡ配列からなる。
　第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、当業者に公知のＲＮＡ合成法を用いて作製することができる。当業者に公知のＲＮＡ合成法としては、例えば、ホスホロアミダイト法やＨ－ホスホネート法等が挙げられる。ホスホロアミダイト法では、担体の疎水性基に結合したリボヌクレオシドをＲＮＡアミダイト（リボヌクレオシドホスホロアミダイト）との縮合反応により伸長し、酸化と脱保護を経て、ＲＮＡアミダイトとの縮合反応を繰り返し行うことにより、ＲＮＡ合成を行うことができる。式（Ｉ）及び（ＩＩ）の第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を例にとって説明すると、本発明に係る第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、ＲＮＡ合成法、例えばホスホロアミダイト法により、３’末端側からリンカーの手前までの配列（Ｘａ、Ｙｓ）の合成を行った後、ピロリジン骨格又はピペリジン骨格を有する環状アミン誘導体のような非ヌクレオチド残基を結合してリンカーを形成し、その末端にさらにリンカーから５’末端までの配列（Ｘｓ；又はＹａ３、Ｙａ２、及びＹａ１）の合成を順次行うことにより、作製することができる。あるいは、本発明に係る第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、ＲＮＡ合成法、例えばホスホロアミダイト法により、３’末端側からヌクレオチド性リンカーの手前までの配列（Ｘａ、Ｙｓ）の合成を行い、引き続きヌクレオチド性リンカーの配列を合成し、さらにヌクレオチド性リンカーの後ろから５’末端までの配列（Ｘｓ；又はＹａ３、Ｙａ２、及びＹａ１）の合成を順次行うことにより、作製することができる。非ヌクレオチド性リンカーとヌクレオチド性リンカーの組み合わせを用いる場合、及び式（Ａ）及び（Ｂ）の第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を用いる場合も、上記の方法に準じて作製することができる。本発明では、任意のＲＮＡアミダイトを使用することができ、例えば、２位の水酸基にｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、トリイソプロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）、ビス（２－アセトキシエトキシ）メチル（ＡＣＥ）１－（２－シアノエトキシ）エチル基（ＣＥＥ）、２－シアノエトキシメチル基（ＣＥＭ）、トリルスルフォニルエトキシメチル基（ＴＥＭ）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）等の様々な保護基を有する汎用型ＲＮＡアミダイトも使用することができる。また本発明では、ＲＮＡ合成において、ポリスチレン系担体、アクリルアミド系担体、又はガラス担体などの任意の固相担体を使用することができる。担体は、ビーズ、プレート、チップ、チューブ等の任意の形態であってよい。担体の例として、ポリスチレンビーズ、例えばＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（Ｒ）　ＨＬ　ｒＧ（ｉｂｕ）、又はｒＵ（ＫＩＮＯＶＡＴＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。
　上記リンカーのうち、非ヌクレオチド性リンカーを形成するための環状アミン誘導体は、ＲＮＡ合成用のモノマーであって、例えば、下記式（ＶＩＩ）の構造を有する。この環状アミン誘導体は、基本的に上記の各リンカー構造と対応しており、リンカー構造についての説明はこの環状アミン誘導体にも援用される。リンカーを形成する環状アミン誘導体は、例えば、自動核酸合成用のアミダイトとして使用でき、例えば、一般的な核酸自動合成装置に適用可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 　上記式（ＶＩＩ）中、
Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり；
Ｙ１及びＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、Ｏ又はＳであり；
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、保護基又はリン酸保護基であり；
Ｒ３は、環Ａ上のＣ－３、Ｃ－４、Ｃ－５又はＣ－６に結合する水素原子又は置換基であり；
Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、又は、
Ｌ１は、上記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ここで、Ｙ１が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、又は、
Ｌ２は、上記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ここで、Ｙ２が、ＮＨ、Ｏ又はＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、置換基又は保護基であり；
ｌは、１又は２であり；
ｍは、０～３０の範囲の整数であり；
ｎは、０～３０の範囲の整数であり；
環Ａは、環Ａ上のＣ－２以外の１個の炭素原子が、窒素原子、酸素原子又は硫黄原子で置換されてもよく、
環Ａ内に、炭素－炭素二重結合又は炭素－窒素二重結合を含んでもよい。
　上記式（ＶＩＩ）において、上記式（ＩＩＩ）と同一箇所については、上記式（ＩＩＩ）の説明を援用できる。具体的に、上記式（ＶＩＩ）において、例えば、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、Ｙ２、Ｒ３、Ｌ１、Ｌ２、ｌ、ｍ、ｎ及び環Ａは、上記式（ＩＩＩ）の説明を全て援用できる。
　上記式（ＶＩＩ）において、Ｒ１及びＲ２は、前述のように、それぞれ独立して、Ｈ、保護基又はリン酸保護基である。
　上記保護基は、例えば、上記式（ＩＩＩ）における説明と同様であり、具体例として、例えば、群Ｉから選択できる。上記群Ｉは、例えば、ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基、ＴＥＭ基、及び、下記式に示すシリル含有基があげられ、中でも、ＤＭＴｒ基及び上記シリル含有基のいずれかであることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　上記リン酸保護基は、例えば、下記式で表すことができる。
　　－Ｐ（ＯＲ６）（ＮＲ７Ｒ８）
　上記式において、Ｒ６は、水素原子又は任意の置換基である。Ｒ６は、例えば、炭化水素基が好ましく、上記炭化水素基は、電子吸引基で置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。Ｒ６は、例えば、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアリール、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、及び、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル等の炭化水素等があげられ、さらに、電子吸引基で置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。Ｒ６は、具体的には、例えば、β－シアノエチル基、ニトロフェニルエチル基、メチル基等が挙げられる。
　Ｒ７及びＲ８は、それぞれ、水素原子又は任意の置換基であり、同一でも異なっていてもよい。Ｒ７及びＲ８は、例えば、炭化水素基が好ましく、上記炭化水素基は、さらに任意の置換基で置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。上記炭化水素基は、例えば、前述した上記Ｒ６での列挙と同様であり、好ましくは、メチル基、エチル基、イソプロピル基である。この場合、－ＮＲ７Ｒ８は、具体的には、例えば、ジイソプロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、エチルメチルアミノ基等が挙げられる。又は、置換基Ｒ７及びＲ８が一体となって、それらが結合する窒素原子とともに（すなわち、－ＮＲ７Ｒ８が一体となって）、窒素含有環（例えば、ピペリジル基、モルホリノ基等）を形成してもよい。
　上記リン酸保護基の具体例としては、例えば、下記群ＩＩから選択できる。群ＩＩは、例えば、－Ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）（Ｎ（ｉ－Ｐｒ）２）、－Ｐ（ＯＣＨ３）（Ｎ（ｉ－Ｐｒ）２）等が挙げられる。上記式において、ｉ－Ｐｒは、イソプロピルを示す。
　上記式（ＶＩＩ）において、例えば、Ｒ１及びＲ２は、いずれか一方が、Ｈ又は保護基であり、他方が、Ｈ又はリン酸保護基である。好ましくは、例えば、Ｒ１が、上記保護基の場合、Ｒ２は、Ｈ又は上記リン酸保護基が好ましく、具体的には、Ｒ１が、上記群Ｉから選択される場合、Ｒ２は、Ｈ又は上記群ＩＩから選択されることが好ましい。また、好ましくは、例えば、Ｒ１が、上記リン酸保護基の場合、Ｒ２は、Ｈ又は上記保護基が好ましく、具体的には、Ｒ１が、上記群ＩＩから選択される場合、Ｒ２は、Ｈ又は上記群Ｉから選択されることが好ましい。
　上記環状アミン誘導体は、下記式（ＶＩＩ－１）～（ＶＩＩ－９）のいずれかで表されるものであってよい。下記式において、ｎ及びｍは、上記式（ＶＩＩ）と同じである。下記式において、ｑは、０～１０の整数である。具体例としては、式（ＶＩＩ－１）においてｎ＝８、式（ＶＩＩ－２）においてｎ＝３、式（ＶＩＩ－３）においてｎ＝４又は８、式（ＶＩＩ－４）においてｎ＝７又は８、式（ＶＩＩ－５）においてｎ＝３及びｍ＝４、式（ＶＩＩ－６）においてｎ＝８及びｍ＝４、式（ＶＩＩ－７）においてｎ＝８及びｍ＝４、式（ＶＩＩ－８）においてｎ＝５及びｍ＝４、式（ＶＩＩ－９）においてｑ＝１及びｍ＝４が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　一実施形態では、上記環状アミン誘導体は、下記式（ＶＩＩＩ）で表されるプロリノール誘導体又は下記式（ＩＸ）で表されるプロリン誘導体で表されるものであってよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　上記環状アミン誘導体は、例えば、標識物質、例えば安定同位体を含んでもよい。
　上記環状アミン誘導体は、例えば、国際公開ＷＯ２０１３／０２７８４３又は国際公開ＷＯ２０１６／１５９３７４に記載された、核酸分子合成用モノマーの製造方法に従って合成することができる。
　本発明の方法では、上記の第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（例えば、図１中、ストランド１）と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（例えば、図１中、ストランド２）をアニーリングし、ライゲーションすることにより、本発明に係る標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を製造することができる。
　本発明の方法により製造されるヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子において、ライゲーション工程で生じるＸａ－Ｙａ１－Ｙａ２－Ｙａ３は、標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む。遺伝子発現抑制配列は、Ｘａ、Ｘａ－Ｙａ１、Ｘａ－Ｙａ１－Ｙａ２、又はＸａ－Ｙａ１－Ｙａ２－Ｙａ３に含まれていてもよい。同様に、ライゲーション工程で生じるＸＸａ３－ＸＸａ２－ＸＸａ１－ＹＹａは、標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む。遺伝子発現抑制配列は、ＹＹａ、ＸＸａ１－ＹＹａ、ＸＸａ２－ＸＸａ１－ＹＹａ、又はＸＸａ３－ＸＸａ２－ＸＸａ１－ＹＹａに含まれていてもよい。遺伝子発現抑制配列は、好ましくは、標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡの全体又は一部のセンス配列又はアンチセンス配列である。なお、ライゲーション工程で生じるＸａ－Ｙａ１は、Ｘｓと相補的であることから、Ｘｓも標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含んでいてもよい。同様に、ＸＸａ１－ＹＹａは、ＹＹｓと相補的であることから、ＹＹｓも標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含んでいてよい。
　上記ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、遺伝子発現抑制配列を１つ含んでもよいし、２つ以上含んでもよい。上記ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、例えば、同じ標的遺伝子に対する同じ遺伝子発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、同じ標的に対する異なる遺伝子発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、異なる標的遺伝子に対する異なる遺伝子発現抑制配列を２つ以上有してもよい。異なる標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を２つ以上有するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、２種類以上の異なる標的遺伝子の発現抑制に有用である。本発明において「遺伝子」とは、ｍＲＮＡに転写されるゲノム領域を指し、タンパク質コード領域であってよいが、ＲＮＡコード領域であってもよい。
　本発明に係るヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、遺伝子発現抑制配列を介して標的遺伝子の発現を抑制する能力を有する。本発明に係るヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子による標的遺伝子の発現抑制は、ＲＮＡ干渉によるものであることが好ましいが、それに限定されない。ＲＮＡ干渉は、一般に、長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、細胞内において、Ｄｉｃｅｒにより、３’末端が突出した１９～２１塩基対程度の短い二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ）に切断され、その一方の一本鎖ＲＮＡが標的ｍＲＮＡに結合して、標的ｍＲＮＡを分解することにより、標的ｍＲＮＡの翻訳を抑制し、それにより標的ｍＲＮＡが由来する標的遺伝子の発現を抑制する現象である。標的ｍＲＮＡに結合するｓｉＲＮＡに含まれる一本鎖ＲＮＡの配列は、例えば、標的遺伝子の種類に応じて様々な種類が報告されている。本発明は、例えば、ｓｉＲＮＡに含まれる一本鎖ＲＮＡの配列（好ましくは、アンチセンス配列）を、遺伝子発現抑制配列として使用できる。本発明の方法により製造されるヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、ｉｎ　ｖｉｖｏで切断されてｓｉＲＮＡを生成することにより標的遺伝子の発現を抑制することができる。本発明に係るヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、標的遺伝子の発現又は発現増加と関連する疾患又は障害の治療又は予防のために用いることができる。
　遺伝子発現抑制配列は、好ましくは１９～３０塩基長であり、より好ましくは１９～２７塩基長であり、例えば、１９、２０、２１、２２、又は２３塩基長であってよい。遺伝子発現抑制配列は、標的遺伝子のｍＲＮＡの少なくとも一部の配列と完全に同一又は完全に相補的なＲＮＡ配列からなることが好ましい。遺伝子発現抑制配列は、標的遺伝子の塩基配列に対し、常法により設計することができる。
　標的遺伝子は、任意の遺伝子であってよく、例えば任意の疾患関連遺伝子であってよい。標的遺伝子は、ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子により生体、細胞、組織又は器官等において遺伝子発現抑制をもたらす対象と同じ生物種に由来するものであることが好ましく、例えば、ヒト、チンパンジー、ゴリラなどの霊長類、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ロバ等の家畜、イヌ、ネコ、ウサギ等の愛玩動物、マウス、ラット、モルモット等のげっ歯類などを含む哺乳動物、魚類、昆虫等の動物、植物、真菌等に由来するものであってよい。標的遺伝子としては、特に限定されないが、例えばＴＧＦ－β１遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子、ＬＡＭＡ１遺伝子、ＬＭＮＡ遺伝子が挙げられる。ヒトＴＧＦ－β１（トランスフォーミング増殖因子－β１）遺伝子のｍＲＮＡ配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）アクセッション番号ＮＭ＿０００６６０に基づいて入手することができる（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：　７０４０）。ヒトＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子のｍＲＮＡ配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）アクセッション番号ＮＭ＿００２０４６に基づいて入手することができる（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：　２５９７）。ヒトＬＡＭＡ１遺伝子のｍＲＮＡ配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５５５９に基づいて入手することができる（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：　２８４２１７）。ヒトＬＭＮＡ遺伝子のｍＲＮＡ配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１７０７０７に基づいて入手することができる（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：　４０００）。標的遺伝子がＴＧＦ－β１遺伝子である場合、本発明の方法により製造されるヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、ｉｎ　ｖｉｖｏでＴＧＦ－β１遺伝子の発現を抑制する。そのようなヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、ＴＧＦ－β１遺伝子の遺伝子発現抑制を通じて、ＴＧＦ－β１遺伝子の発現又は発現増加と関連する疾患又は障害、例えば肺線維症や急性肺疾患の治療又は予防のために用いることができる。同様に、ＧＡＰＤＨ遺伝子、ＬＡＭＡ１遺伝子、ＬＭＮＡ遺伝子等の他の標的遺伝子の発現を抑制する本発明に係るへアピン型一本鎖ＲＮＡ分子も、当該標的遺伝子の発現抑制を通じて、当該標的遺伝子の発現又は発現増加と関連する疾患又は障害の治療又は予防のために用いることができる。
　本発明の方法により製造される、標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の１つの例は、配列番号１で表される塩基配列からなり、かつ２４番目と２５番目のヌクレオチド（リボヌクレオチド残基）がリンカー（Ｌｘ１）を介して連結され、５０番目と５１番目のヌクレオチド（リボヌクレオチド残基）がリンカー（Ｌｘ２）を介して連結されているＲＮＡ分子である（例えば、図２）。配列番号１で表される塩基配列からなるそのようなヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、５’末端から３’末端の方向に、配列番号２で表される塩基配列からなるＲＮＡ配列と、上記のリンカー（非ヌクレオチド性リンカー、ヌクレオチド性リンカー、又はそれらの組み合わせ；図１のＬｘ１）と、配列番号３で表される塩基配列からなるＲＮＡ配列と、上記のリンカー（非ヌクレオチド性リンカー、ヌクレオチド性リンカー、又はそれらの組み合わせ；図１のＬｘ２）と、塩基Ｇ（グアニン）を含む。配列番号１で表される塩基配列からなる上記ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、標的遺伝子であるＴＧＦ－β１遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む。配列番号１で表される塩基配列の２９番目～４７番目の配列が遺伝子発現抑制配列（活性配列；配列番号５０）に相当する。本発明は、この遺伝子発現抑制配列を含むヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法を提供する。
　そのようなＲＮＡ分子を製造するための、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランド１）と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランド２）の例は、後述の表１に挙げられている。表１に挙げられている第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランド１）と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランド２）の配列において、Ｐ（プロリン誘導体）を含むリンカーは、上記の他の非ヌクレオチド性リンカー又はヌクレオチド性リンカーなどの任意のリンカーに置換されたものであってもよい。一実施形態では、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、３’末端にウラシル（Ｕ）又はアデニン（Ａ）を有することが好ましく、かつ第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は５’末端にウラシル（Ｕ）又はアデニン（Ａ）を有することが好ましい。
　配列番号１で表される塩基配列からなるヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を製造するための特に好ましい第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子のペアとしては、以下：
（１）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカー（Ｌｘ１）を介して連結されている配列番号７で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１０番目と１１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカー（Ｌｘ２）を介して連結されている配列番号６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ、
（２）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカー（Ｌｘ１）を介して連結されている配列番号１９で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１６番目と１７番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカー（Ｌｘ２）を介して連結されている配列番号１８で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせ、
（３）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカー（Ｌｘ１）を介して連結されている配列番号２７で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２０番目と２１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカー（Ｌｘ２）を介して連結されている配列番号２６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（４）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカー（Ｌｘ１）を介して連結されている配列番号２９で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２１番目と２２番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカー（Ｌｘ２）を介して連結されている配列番号２８で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせ
（５）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカー（Ｌｘ１）を介して連結されている配列番号３１で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２２番目と２３番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカー（Ｌｘ２）を介して連結されている配列番号３０で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ、及び
（６）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカー（Ｌｘ１）を介して連結されている配列番号３３で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２３番目と２４番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカー（Ｌｘ２）を介して連結されている配列番号３２で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせ、
が挙げられる。これらの第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、３’末端（Ｘａの３’末端）にＵ又はＡを含む。これらの第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、５’末端（Ｙａ１の５’末端）にＵ又はＡを含む。
　ここで、例えば（１）の第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子について、「２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカー（Ｌｘ１）を介して連結されている」とは、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子において配列番号１９で表される塩基配列の２４番目のリボヌクレオチド残基（塩基：Ｃ）と２５番目のリボヌクレオチド残基（塩基：Ｇ）が第１のリンカーＬｘ１を介して結合していることを意味する。なお、本発明における一本鎖オリゴＲＮＡ分子及びヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子に関する「Ｘ番目とＹ番目のリボヌクレオチド残基がＺを介して連結されている」という表現も、これに準じて解釈される。
　（１）～（６）の第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子において、リンカーＬｘ１及びＬｘ２は、好ましくは、式（ＶＩ）、例えば式（ＶＩ－１）又は式（ＶＩ－２）で表されるものである。
　好ましい実施形態では、（１）～（６）の第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、Ｌｘ１及びＬｘ２として式（ＶＩ）で示されるリンカーを有しており、式（Ｉ）のＸａは式（ＶＩ）中の１位窒素原子側で、Ｘｓは２位炭素原子側でリンカーＬｘ１と連結し、Ｙｓは式（ＶＩ）中の１位窒素原子側で、Ｙａ３は２位炭素原子側でリンカーＬｘ２と連結していてもよい。
　本発明は、本発明の方法に従ってヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造のために第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子又は第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子として用いることができる、一本鎖オリゴＲＮＡ分子を提供する。
　一実施形態では、標的遺伝子であるＴＧＦ－β１遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造に用いる一本鎖オリゴＲＮＡ分子の例として、下記（ａ）～（ｌ）が挙げられるが、これらに限定されない：
（ａ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号７で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｂ）１０番目と１１番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号６で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｃ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号１９で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｄ）１６番目と１７番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号１８で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｅ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号２７で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｆ）２０番目と２１番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号２６で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｇ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号２９で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｈ）２１番目と２２番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号２８で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｉ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３１で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｊ）２２番目と２３番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３０で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｋ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３３で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、及び
（ｌ）２３番目と２４番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３２で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子。
　好ましい実施形態では、一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ａ）及び（ｂ）；（ｃ）及び（ｄ）；（ｅ）及び（ｆ）；（ｇ）及び（ｈ）；（ｉ）及び（ｊ）；又は（ｋ）及び（ｌ）を組み合わせて、本発明に係るヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法に使用することができる。
　別の実施形態として、本発明の方法により製造される、ＧＡＰＤＨ遺伝子、ＬＡＭＡ１遺伝子、又はＬＭＮＡ遺伝子である標的遺伝子に対するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の例が、図１７に示されている。ＧＡＰＤＨ遺伝子に対するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の例は、配列番号５１で表される塩基配列からなり、かつ２２番目と２３番目のヌクレオチド（リボヌクレオチド残基）が第１のリンカー（Ｌｘ１）を介して連結され、４８番目と４９番目のヌクレオチド（リボヌクレオチド残基）が第２のリンカー（Ｌｘ２）を介して連結されているＲＮＡ分子である。ＬＡＭＡ１遺伝子に対するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の例は、配列番号５２で表される塩基配列からなり、かつ２４番目と２５番目のヌクレオチド（リボヌクレオチド残基）が第１のリンカー（Ｌｘ１）を介して連結され、５０番目と５１番目のヌクレオチド（リボヌクレオチド残基）が第２のリンカー（Ｌｘ２）を介して連結されているＲＮＡ分子である。ＬＡＭＡ１遺伝子に対するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の別の例は、配列番号５３で表される塩基配列からなり、かつ２４番目と３１番目のヌクレオチド（リボヌクレオチド残基）がヌクレオチド性の第１のリンカー（Ｌｘ１）を介して連結され、５６番目と６１番目のヌクレオチド（リボヌクレオチド残基）がヌクレオチド性の第２のリンカー（Ｌｘ２）を介して連結されているＲＮＡ分子である。ＬＭＮＡ遺伝子に対するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の例は、配列番号５４で表される塩基配列からなり、かつ２４番目と２５番目のヌクレオチド（リボヌクレオチド残基）が第１のリンカー（Ｌｘ１）を介して連結され、５０番目と５１番目のヌクレオチド（リボヌクレオチド残基）が第２のリンカー（Ｌｘ２）を介して連結されているＲＮＡ分子である。標的遺伝子としてのＧＡＰＤＨ遺伝子、ＬＡＭＡ１遺伝子、又はＬＭＮＡ遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列（アンチセンス配列；それぞれ、配列番号５５、５６、５７）の例も、図１７に示されている。本発明は、これらの遺伝子発現抑制配列のいずれかを含むヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法も提供する。
　標的遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造に用いる一本鎖オリゴＲＮＡ分子の例として、下記（ｍ）及び（ｎ）が挙げられるが、これに限定されない：
（ｍ）２２番目と２３番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３７で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、及び
（ｎ）２０番目と２１番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３６で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
　好ましい実施形態では、（ｍ）及び（ｎ）の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を組み合わせて、本発明に係るヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法に使用することができる。
　標的遺伝子であるＬＡＭＡ１遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造に用いる一本鎖オリゴＲＮＡ分子の例として、下記（ｏ）～（ｖ）が挙げられるが、これに限定されない：
（ｏ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３９で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｐ）１６番目と１７番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３８で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｑ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号４１で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｒ）２２番目と２３番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号４０で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｓ）２４番目と３１番目のリボヌクレオチド残基がヌクレオチド性リンカーを介して連結されている配列番号４３で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｔ）２１番目と２６番目のリボヌクレオチド残基がヌクレオチド性リンカーを介して連結されている配列番号４２で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｕ）２４番目と３１番目のリボヌクレオチド残基がヌクレオチド性リンカーを介して連結されている配列番号４５で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、及び
（ｖ）２２番目と２７番目のリボヌクレオチド残基がヌクレオチド性リンカーを介して連結されている配列番号４４で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子。
　好ましい実施形態では、一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ｏ）及び（ｐ）；（ｑ）及び（ｒ）；（ｓ）及び（ｔ）；又は（ｕ）及び（ｖ）を組み合わせて、本発明に係るヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法に使用することができる。
　標的遺伝子であるＬＭＮＡ遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造に用いる一本鎖オリゴＲＮＡ分子の例として、下記（ｗ）～（ｚ）が挙げられるが、これに限定されない：
（ｗ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号４７で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｘ）２１番目と２２番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号４６で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、
（ｙ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号４９で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子、及び
（ｚ）２３番目と２４番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号４８で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子。
　好ましい実施形態では、一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ｗ）及び（ｘ）；又は（ｙ）及び（ｚ）を組み合わせて、本発明に係るヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法に使用することができる。
　一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ａ）～（ｚ）における「リンカー」は、上記第１のリンカー又は第２のリンカーに相当し、また上述のリンカーを用いることができる。一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ｓ）～（ｖ）中のヌクレオチド性リンカーは、上述のリンカー（例えば、他のヌクレオチド性リンカー）に置換されてもよい。
　本発明では、上記の第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子をライゲーションで連結することにより、ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を製造することができる。上記の第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、ライゲーションの前にアニーリングされる。アニーリング反応は、水性媒体中で第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を混合することにより、引き起こすことができる。本発明の方法において、アニーリング工程は、水性媒体（通常は、水又はバッファー）中で第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を混合し、一定時間（例えば、１～１５分間）にわたり静置することにより行ってもよいし、静置することなくライゲーション反応に用いてもよい。アニーリング工程では、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の熱変性（例えば、９０℃以上の温度での加熱）を行ってもよいが、行わなくてもよい。熱変性を行う場合、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を含む反応液を、例えば、熱変性温度（例えば、９０℃以上）で加熱し、次いでアニーリング温度（典型的には、一本鎖オリゴＲＮＡ分子のＹａ１配列に基づくＴｍ値±５℃の範囲の温度、例えば、５５～６０℃）で一定時間反応させてアニーリングさせた後、降温（例えば４℃まで）させればよい。熱変性を行わずにアニーリングする場合、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を室温（１５～３５℃）で混合し、一定時間（例えば、１分間～１時間、又は５～１５分間）にわたり静置することによりアニーリング工程を実施してもよい。
　一実施形態では、本発明のアニーリング工程において、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、反応液中、等モル量で混合してもよい。本発明において「等モル量で混合する」とは、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を、１：１．１～１．１：１のモル比で混合することを意味する。
　アニーリング工程後、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子がアニーリングした二本鎖オリゴＲＮＡを含むアニーリング反応液を、ライゲーションに供する。アニーリング反応液の一部を、ライゲーション反応液に添加してもよいし、アニーリング反応液全量を用いてライゲーション反応液を調製してもよい。ライゲーションは、酵素的なライゲーションであってよい。酵素的なライゲーションは、ＲＮＡリガーゼ、特に、Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼによるライゲーションであってよい。
　Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼ（Ｒｎｌ２ファミリーメンバー）は、ＲＮＡニックシーリング活性、すなわち、ＲＮＡのニック（ＲＮＡ二重鎖又はＲＮＡ－ＤＮＡ二重鎖中のニック）をその３’水酸基（３’－ＯＨ）及び５’リン酸基（５’－ＰＯ４）を連結することによって埋める（シーリングする）リガーゼ活性を有する酵素である（例えば、Nandakumar J. et al., Cell 127, p.71-84 (2006)を参照のこと）。Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼとしては、Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ２、トリパノソーマ属（例えば、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｂｒｕｃｅｉ）及びリーシュマニア属（例えば、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ　ｔａｒｅｎｏｔｏｌａｅ）のＲＮＡ編集リガーゼ（ＲＥＬ）、ビブリオファージＫＶＰ４０Ｒｎｌ２、ポックスウイルスＡｍＥＰＶリガーゼ、バキュロウイルスＡｃＮＰＶリガーゼ、及びバキュロウイルスＸｃＧＶリガーゼ、並びにそれらの変異体又は修飾体等が挙げられるが、これらに限定されない。これらのリガーゼは当業者にはよく知られており、市販されているか又は論文等の教示に従って入手できる。例えば、Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ２は、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓから市販されている。Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ２タンパク質は、バクテリオファージＴ４の遺伝子ｇｐ２４．１によってコードされている。Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ２の単離は、例えば、Nandakumar J. and Shuman S., (2005) J. Biol. Chem., 280: 23484-23489; Nandakumar J., et al., (2004) J. Biol. Chem., 279: 31337-31347; Nandakumar J. and Shuman S., (2004) Mol. Cell, 16: 211-221等の記載に従って行うことができる。本発明において、「Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼ」は、単離された天然リガーゼに限定されず、ＲＮＡニックシーリング活性を有する限り、組換えタンパク質、突然変異体、欠損体（末端切断形態など）、ペプチド（例えば、Ｈｉｓ、ＨＡ、ｃ－Ｍｙｃ、Ｖ５，ＤＤＤＤＫなどのタグ）又は他のタンパク質との融合体、糖鎖付加（グリコシル化）又は脂質付加タンパク質などの修飾タンパク質等を包含する。
　ライゲーション反応液は、ライゲーションに通常用いる成分又はそれを含むバッファーを用いて調製することができる。ライゲーション反応液は、上記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び上記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子に加えて、ＲＮＡのライゲーション反応に用いることができる成分、例えば、Ｔｒｉｓ（トリス）－ＨＣｌ、二価金属イオン、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、及びアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）等を含んでもよい。二価金属イオンとしては、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋等が挙げられるが、これらに限定されない。ライゲーション反応液は、二価金属イオンを、通常、塩の形態で含み、例えば、金属塩化物（ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２など）を含む。
　第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子のライゲーションは、ＲＮＡリガーゼ、又はＲＮＡ同士の末端又はｄｓＲＮＡのニックを連結する活性を有する他の酵素、特にＲｎｌ２ファミリーのリガーゼを用いて行うことができる。ＲＮＡリガーゼとしては、ｄｓＲＮＡリガーゼを用いることができる。ｄｓＲＮＡリガーゼは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）のニックを連結する活性を主として有する酵素である。ｄｓＲＮＡリガーゼとしては、Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ２が挙げられるが、これに限定されない。Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ２は、３’→５’ホスホジエステル結合の形成を触媒する。
　ライゲーション反応液にＲｎｌ２ファミリーのリガーゼを添加し、アニーリングした第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の二本鎖オリゴＲＮＡ分子を、Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼと共に、ライゲーションが可能な条件下でインキュベートすることにより、二本鎖オリゴＲＮＡ分子を構成する第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端（アンチセンス鎖内）を一本鎖にライゲーションすることができる。
　第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子のライゲーションは、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を等モル量で含むライゲーション反応液中で行ってもよい。本発明において「等モル量で含む」とは、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を、１：１．１～１．１：１のモル比で含むことを意味する。
　本発明の方法では、ライゲーションを、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を、それぞれ、１０μＭ以上、４０μＭ以上、１００μＭ以上、１５０μＭ以上、２００μＭ以上、３００μＭ以上、又は５００μＭ以上の濃度で含むライゲーション反応液中で行ってもよい。一実施形態では、ライゲーション反応液は、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を、それぞれ、１０，０００μＭ以下で含んでもよく、例えば１，０００μＭ以下、５００μＭ以下、又は３００μＭ以下の濃度で含んでもよい。一実施形態では、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、ライゲーション反応液中で、例えば、５０～５００μＭ、１００～３００μＭ、又は１００～２５０μＭの濃度で使用してもよい。一実施形態では、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を等モル量で含むライゲーション反応液が、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子をこのような濃度で含む。本発明の方法では、反応液中のＲｎｌ２ファミリーのリガーゼの濃度（又は量）に対して第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子をより多い濃度（又は量）で用いて、ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造効率を増加させることができる。
　一実施形態では、ライゲーション反応液は、Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼを０．０１Ｕ／μＬ以上含んでもよく、例えば、０．０１Ｕ／μＬ以上、０．０８Ｕ／μＬ以上、０．２Ｕ／μＬ以上、又は０．３５Ｕ／μＬ以上の濃度で含んでもよい。ライゲーション反応液は、Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼを、例えば、１０Ｕ／μＬ以下、１Ｕ／μＬ以下、又は０．５Ｕ／μＬ以下の濃度で含んでもよい。一実施形態では、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を等モル量で含むライゲーション反応液が、Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼをこのような濃度で含む。
　一実施形態では、ライゲーション反応液は、ｐＨ６．５以上であってよく、例えばｐＨ７．０～９．０、ｐＨ７．４以上、ｐＨ７．４～８．６、ｐＨ７．５～８．５、又はｐＨ７．５～８．０であってよい。第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を等モル量で含むライゲーション反応液が、このようなｐＨを有していてもよい。
　一実施形態では、ライゲーション反応液は、１ｍＭ以上、例えば１～２０ｍＭ、２～１０ｍＭ、３～６ｍＭ、又は５ｍＭの二価金属イオンを含む。一実施形態では、ライゲーション反応液は、１ｍＭ以上、例えば１～２０ｍＭ、２～１０ｍＭ、３～６ｍＭ、又は５ｍＭのＭｇ２＋又はＭｎ２＋を含み、例えば、当該濃度のＭｇＣｌ２を含んでもよい。一実施形態では、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を等モル量で含むライゲーション反応液が、二価金属イオンをこのような濃度で含む。
　ライゲーション反応液は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの他の添加物質を含んでもよい。ポリエチレングリコールとしては、例えば、ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ２００００などの、ＰＥＧ６０００～２００００を使用することができる。ライゲーション反応液は、ポリエチレングリコールを、例えば３～３０ｗ／ｖ％、５～２０ｗ／ｖ％、５～１５ｗ／ｖ％又は１０～３０ｗ／ｖ％の量で含んでもよい。一実施形態では、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を等モル量で含むライゲーション反応液が、ポリエチレングリコールをこのような濃度で含む。一実施形態では、そのようなポリエチレングリコールの添加を、０．４Ｕ／μＬ以下、例えば０．０１～０．４Ｕ／μＬ、０．０８～０．４Ｕ／μＬ、又は０．１Ｕ／μＬ以上０．３Ｕ／μＬ未満のＲＮＡリガーゼを含むライゲーション反応液において用いてもよい。
　ライゲーション反応液は、通常はＡＴＰを含む。本発明において、ライゲーション反応液は、ＡＴＰを、例えば５ｍＭ以下、２ｍＭ以下、１ｍＭ以下、及び／若しくは０．１ｍＭ以上、又は０．１～１．５ｍＭの濃度で含む。
　一実施形態では、ライゲーション反応液は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを含んでもよく、例えば、１０～７０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを含んでもよいが、この濃度に限定されない。ライゲーション反応液は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含んでもよく、例えば、０．１～５ｍＭ　ＤＴＴを含んでもよいが、この濃度に限定されない。
　本発明において、ライゲーションの反応時間は、本発明に係る第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の二本鎖オリゴＲＮＡのライゲーション反応に適した時間であればよい。ライゲーション反応は、例えば２０分以上又は３０分以上、１時間以上、２時間以上、又は３時間以上の反応時間にわたって行ってもよい。本発明におけるライゲーションの反応時間は、４時間以上、６時間以上、８時間以上、１０時間以上、１２時間以上、２４時間以上、又は４８時間以上であってもよい。本発明において、とりわけ高濃度（例えば、１００μＭ又は２００μＭ以上）の第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を含むライゲーション反応液を用いる場合、より長時間にわたってライゲーション反応を行ってもよい。例えば、ライゲーション反応液が、ｐＨ７．４以上、ｐＨ７．４～８．６、ｐＨ７．５～８．５、又はｐＨ７．５～ｐＨ８．０を示す場合に、より長時間（例えば、４時間以上、１２時間以上、又は２４時間以上）の反応時間を用いてもよい。特に高濃度の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を用いる場合に、そのようなより長時間の反応時間を用いてもよい。
　本発明の方法では、ライゲーション工程を、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を段階的に添加しながら行ってもよい。第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子について「段階的に添加する」とは、ライゲーション工程において、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を、複数回にわたり、時間的間隔を空けて反応液に添加することを意味する。例えば、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子をライゲーション反応に適した時間にわたってＲＮＡリガーゼと共にインキュベートした後、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を追加的に添加してさらにライゲーション反応を行う追加反応工程を１回行うか又はそれ以上反復して行うことにより、当該一本鎖ＲＮＡ分子を反応系に段階的に添加しながらライゲーションを行うことができる。追加反応工程は、２回、３回、４回、又はそれ以上繰り返して行ってもよい。この場合、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子のライゲーションのための最初のインキュベーション時間（初期反応時間）は、上記のライゲーション反応時間に従えばよく、例えば、４時間以上、８時間以上、１２時間以上、又は２４時間以上であってよい。第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を追加後のインキュベーション時間（追加反応時間）は、例えば、４時間以上、８時間以上、１２時間以上、又は２４時間以上であってよい。ライゲーションの追加反応工程において、サイクル毎の追加反応時間は、互いに同一であっても異なっていてもよい。ライゲーションの初期反応時間とサイクル毎の追加反応時間は、同一であっても異なっていてもよい。第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を段階的に添加する場合、ライゲーション反応液に最初に添加する一本鎖ＲＮＡ分子の濃度は、上記と同様であってよく、例えば、４０μＭ以上、１００μＭ以上、１５０μＭ以上、又は２００μＭ以上の濃度であってよい。それぞれの追加反応工程においてライゲーション反応液に添加する一本鎖ＲＮＡ分子の量は、最初の反応液中に含まれる一本鎖ＲＮＡ分子の量（モル数）と同じであっても異なっていてもよく、例えば、４ｎｍｏｌ以上、１０ｎｍｏｌ以上、１５ｎｍｏｌ以上、又は２０ｎｍｏｌ以上であってよい。
　第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を段階的に添加しながらライゲーションを行うことにより、高濃度の一本鎖ＲＮＡ分子による反応阻害（ライゲーション効率低下）を軽減しながら、反応液中の第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の含量を増加させ、それにより上記ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の収量を増大させることができる。
　以上のような反応条件は、任意に組み合わせて用いることができる。例えば、アニーリング工程の温度、アニーリング工程の時間、アニーリングさせる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の混合比、ライゲーション反応液中の第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の量（濃度）、酵素（例えば、Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼ）の種類及び使用量、二価金属イオンの種類及び濃度、ｐＨ、ＡＴＰ濃度、ＰＥＧ等の添加成分及び濃度、反応液中の他のバッファー成分、ライゲーション反応時間、ライゲーション反応中の第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の段階的添加（追加添加）などの上記条件から選択される複数の条件を任意に組み合わせることができる。例えば、上記のライゲーション反応液中の第１及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の比較的高い濃度（例えば、１００μＭ～３００μＭ）を、他のそれぞれの条件と組み合わせてもよい。あるいは、酵素（例えば、Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼ）の使用量（例えば、０．０１Ｕ／μＬ～１Ｕ／μＬ）を、他のそれぞれの条件と組み合わせてもよい。
　本発明の方法では、上記のようにライゲーション反応条件を調節することにより、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の使用量に対してより少ない量のＲＮＡリガーゼ、特にＲｎｌ２ファミリーのリガーゼを使用して、ライゲーション産物の収量を相対的に又は絶対的に増加させることができる。本発明の方法では、ライゲーションに使用する、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び／又は第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子のモル数（ｎｍｏｌ）当たり、１０ユニット（Ｕ）以下、５ユニット以下、４ユニット以下、２ユニット以下、１ユニット以下、０．７ユニット以下、０．５ユニット以下、又は０．３ユニット以下、又は０．１ユニット以下の量のＲＮＡリガーゼ、特にＲｎｌ２ファミリーのリガーゼを使用してもよい。一実施形態では、ＲＮＡリガーゼ、特にＲｎｌ２ファミリーのリガーゼの使用量は、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び／又は第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の量（ｎｍｏｌ）当たり、０．００１ユニット（Ｕ）以上、０．０１ユニット以上、０．１ユニット以上、０．２ユニット以上、又は１ユニット以上であってもよい。なお、「第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び／又は第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子のモル数（ｎｍｏｌ）当たり”Ｘ”ユニット以下の量のＲＮＡリガーゼ」とは、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子のモル数又は第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子のモル数（ｎｍｏｌ）のいずれか、又はその両方と比較して、ＲＮＡリガーゼ、特にＲｎｌ２ファミリーのリガーゼの活性量が”Ｘ”ユニット以下であることを意味する。一実施形態では、第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の少ない方のモル数（ｎｍｏｌ）を基準としてＲＮＡリガーゼの使用量を定めてもよい。第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子のモル数（ｎｍｏｌ）は、ライゲーション反応系に添加した第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の合計量として算出すればよく、例えば、一本鎖オリゴＲＮＡ分子を段階的に添加する場合には、ライゲーションの初期反応液中の第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子のモル数と、追加反応工程で反応系に添加した第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子のモル数の合計モル数として算出する。
　ライゲーション反応の温度は、用いる酵素（Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼ）によって変動し得るが、例えば、１０～５０℃、１５～４５℃、２０～４０℃、２０～３０℃、又は２３～２８℃であってよい。例えばＴ４　ＲＮＡリガーゼ２を用いる場合、１０～５０℃、１５～４５℃、２０～４０℃、２０～３０℃、又は２３～２８℃であってよい。
　ライゲーション工程の完了後、ライゲーション反応液中には、本発明に係る遺伝子発現抑制配列を含むヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子が高い割合で含まれる。
　ライゲーション反応液中の本発明に係る遺伝子発現抑制配列を含むヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、当業者に公知の方法により、精製することができる。精製技術としては、逆相クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法、ゲル濾過、カラム精製、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）など、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
　国際公開ＷＯ２０１３／０２７８４３記載の方法では、ごく短鎖のうちに伸長反応が停止したことによる短鎖核酸不純物や欠損体などの核酸不純物の生成により、反応液中の目的産物の純度の低下が起こる。一方、本発明の方法の好ましい実施形態では、本発明に係るヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造後のライゲーション反応液中の核酸不純物を低減できる点で、有利である。本発明の方法の好ましい実施形態では、核酸不純物の生成を低減しつつ、汎用型ＲＮＡアミダイトを使用して安定性の高い遺伝子発現抑制性一本鎖ＲＮＡ分子を製造することができる。
　本発明の方法により製造されたヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、常法により、生体内又は細胞内に投与することにより、標的遺伝子の発現を抑制するために用いることができる。
　さらに本発明は、本発明に係る一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせ（ペア）を含む、標的遺伝子の発現を抑制するためのヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造用のキットにも関する。そのようなキットは、本発明に係る標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法を実施するために、好適に用いることができる。
　一実施形態では、キットの例として、以下の（ｉ）～（ｖｉ）のいずれかの一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせを含む、ＴＧＦ－β１遺伝子の発現を抑制するためのヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造用のキットが挙げられるが、これらに限定されない：
（ｉ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号７で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１０番目と１１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ、
（ｉｉ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号１９で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１６番目と１７番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号１８で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ、
（ｉｉｉ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号２７で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２０番目と２１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号２６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ、
（ｉｖ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号２９で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２１番目と２２番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号２８で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ、
（ｖ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号３１で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２２番目と２３番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号３０で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ、及び
（ｖｉ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号３３で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２３番目と２４番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号３２で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ。
　別の実施形態では、キットの例として、以下の（ｖｉｉ）の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせを含む、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を抑制するためのヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造用のキットが挙げられるが、これに限定されない：
（ｖｉｉ）２２番目と２３番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号３７で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２０番目と２１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号３６で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ。
　別の実施形態では、キットの例として、以下の（ｖｉｉｉ）～（ｘｉ）のいずれかの一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせを含む、ＬＡＭＡ１遺伝子の発現を抑制するためのヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造用のキットが挙げられるが、これに限定されない：
（ｖｉｉｉ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号３９で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１６番目と１７番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号３８で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ、
（ｉｘ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号４１で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２２番目と２３番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号４０で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ、
（ｘ）配列番号４３で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子（２４番目と３１番目のリボヌクレオチド残基がヌクレオチド性リンカーを介して連結されている）と、配列番号４２で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子（２１番目と２６番目のリボヌクレオチド残基がヌクレオチド性リンカーを介して連結されている）との組み合わせ、
（ｘｉ）配列番号４５で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子（２４番目と３１番目のリボヌクレオチド残基がヌクレオチド性リンカーを介して連結されている）と、配列番号４４で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子（２２番目と２７番目のリボヌクレオチド残基がヌクレオチド性リンカーを介して連結されている）との組み合わせ。
　別の実施形態では、キットの例として、以下の（ｘｉｉ）～（ｘｉｉｉ）のいずれかの一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせを含む、ＬＭＮＡ遺伝子の発現を抑制するためのヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造用のキットが挙げられるが、これに限定されない：
（ｘｉｉ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号４７で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２１番目と２２番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号４６で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ、
（ｘｉｉｉ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号４９で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２３番目と２４番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号４８で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ。
　以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
［参考例１］プロリンジアミドアミダイトの合成
　プロリン誘導体リンカーを含む本発明のヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を生成するために用いるプロリンジアミドアミダイトは、例えば、国際公開ＷＯ２０１３／０２７８４３の記載に従って合成することができる。具体的な合成例を以下に示すが、合成方法はそれにより限定されない。
（１）Ｆｍｏｃ－ヒドロキシアミド－Ｌ－プロリン
　Ｆｍｏｃ－Ｌ－プロリンを開始原料とする。Ｆｍｏｃは、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基である。Ｆｍｏｃ－Ｌ－プロリン（１０．００ｇ、２９．６４ｍｍｏｌ）、４－アミノ－１－ブタノール（３．１８ｇ、３５.５６ｍｍｏｌ）及び１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（１０．９０ｇ、７０．７２ｍｍｏｌ）を混合し、その混合物に対し、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填する。得られた混合物に、無水アセトニトリル（１４０ｍＬ）を室温で加え、さらに、ジシクロヘキシルカルボジイミド（７．３４ｇ、３５.５６ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（７０ｍＬ）を添加した後、アルゴン雰囲気下、室温で１５時間撹拌する。反応終了後、生成した沈殿をろ別し、回収したろ液について、減圧下で溶媒を留去する。得られた残渣にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水（２００ｍＬ）で洗浄する。そして、有機層を回収し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、ろ過する。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去し、その残渣にジエチルエーテル（２００ｍＬ）を加え、粉末化する。生じた粉末を濾取することにより、無色粉末状物質としてＦｍｏｃ－ヒドロキシアミド－Ｌ－プロリンが得られる。
（２）ＤＭＴｒ－アミド－Ｌ－プロリン
　Ｆｍｏｃ－ヒドロキシアミド－Ｌ－プロリン（７．８０ｇ、１９．０９ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（５ｍＬ）と混合し、室温で２回共沸乾燥する。得られた残留物に、４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（８．２０ｇ、２４．２０ｍｍｏｌ）、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（２３ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）及び無水ピリジン（３９ｍＬ）を加える。この混合物を、室温で１時間撹拌した後、メタノール（７．８ｍＬ）を加え、室温で３０分撹拌する。この混合物を、ジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈し、飽和重曹水（１５０ｍＬ）で洗浄後、有機層を分離する。この有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過する。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去する。得られた未精製の残渣に、無水ジメチルホルムアミド（３９ｍＬ）及びピペリジン（１８．７ｍＬ、１８９ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌する。反応終了後、その混合液から、減圧下、室温で、溶媒を留去する。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（商品名Ｗａｋｏｇｅｌ　Ｃ－３００、展開溶媒ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９：１、０．０５％ピリジン含有）に供することにより、淡黄色油状物質としてＤＭＴｒ－アミド－Ｌ－プロリンが得られる。ＤＭＴｒは、ジメトキシトリチル基である。
（３）ＤＭＴｒ－ヒドロキシジアミド－Ｌ－プロリン
　得られたＤＭＴｒ－アミド－Ｌ－プロリン（６．０１ｇ、１２．２８ｍｍｏｌ）、Ｎ－（３’－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）（２．８３ｇ、１４．７４ｍｍｏｌ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（３．９８ｇ、２９．４７ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（４．４７ｇ、４４．２１ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（１２０ｍＬ）を混合する。この混合液に、さらに、アルゴン雰囲気下、室温で、６－ヒドロキシヘキサン酸（１．９５ｇ、１４．４７ｍｍｏｌ）を加え、その後、アルゴン雰囲気下、室温で、１時間撹拌する。得られた混合液をジクロロメタン（６００ｍＬ）で希釈し、飽和食塩水（８００ｍＬ）で３回洗浄する。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過する。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去する。これにより、淡黄色泡状物質としてＤＭＴｒ－ヒドロキシジアミド－Ｌ－プロリンが得られる。
（４）ＤＭＴｒ－ジアミド－Ｌ－プロリンアミダイト
　得られたＤＭＴｒ－ヒドロキシジアミド－Ｌ－プロリン（８．５５ｇ、１４．１８ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルと混合し、室温で３回共沸乾燥する。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（２．９１ｇ、１７．０２ｍｍｏｌ）を加え、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填する。その混合物に対し、無水アセトニトリル（１０ｍＬ）を加え、さらに、２－シアノエトキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（５.１３ｇ、１７．０２ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（７ｍＬ）を加える。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で２時間撹拌する。得られた混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水（２００ｍＬ）で３回洗浄した後、飽和食塩水（２００ｍＬ）で洗浄する。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過する。得られたろ液について、減圧下に溶媒を留去する。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ヘキサン：酢酸エチル＝１：３、０．０５％ピリジン含有）に供することにより、無色シロップ状物質としてＤＭＴｒ－ジアミド－Ｌ－プロリンアミダイトが得られる。
［実施例１］一本鎖オリゴＲＮＡ分子の合成
　以下の実施例では、プロリン誘導体を用いたリンカーとヒトＴＧＦ－β１遺伝子発現抑制配列とを有するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子（以下、「ｓｓＴｂＲＮＡ分子」とも称する。；図２）を、その２つの分割フラグメントである一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランド１及びストランド２）をＲＮＡリガーゼ（Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ２）を用いてライゲーションすることにより、作製する（ライゲーション法；図１）。
　分割位置の検討のため、ｓｓＴｂＲＮＡ分子中の分割位置を１塩基ずつシフトさせたペアの一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランド１及びストランド２；表１）を下記のようにして作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　具体的には、それぞれの一本鎖オリゴＲＮＡ分子（ストランド１及びストランド２）を、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ－１００；ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ又は商品名ｎＳ－８及びｎＳ－８ＩＩ；ジーンデザイン社製）を使用して、３’側から５’側に向かって合成した。ホスホロアミダイト法に基づくＲＮＡ合成には、ＲＮＡアミダイトとして、５’－Ｏ－ＤＭＴ－２’－Ｏ－ＴＢＤＭＳｉ－ＲＮＡホスホロアミダイト（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）又は５’－Ｏ－ＤＭＴ－２’－Ｏ－ＴＢＤＭＳ－ＲＮＡホスホロアミダイト（シグマ―アルドリッチ）を用いた。担体としてはポリスチレンビーズ（ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（Ｒ）　ＨＬ　ｒＧ（ｉｂｕ）、又はｒＵ；ＫＩＮＯＶＡＴＥ）又は多孔質ガラス（ＣＰＧ）ビーズ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＵｎｙＬｉｎｋｅｒ　Ｓｕｐｐｏｒｔ　１０００Å；Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ）を用いた。５’－リン酸化試薬としては３－（４，４'－ジメトキシトリチルオキシ）－２，２－（Ｎ－メチルアミド）］プロピル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト（Ｓｏｌｉｄ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ；ＬＩＮＫ）を用いた。
　３’末端からリンカー直前までのＲＮＡ配列（図１中、Ｘａ、Ｙｓ）が合成された後、その５’末端に、リンカー形成用のＤＭＴｒ－ジアミド－Ｌ－プロリンアミダイトを連結し、さらにその５’側に、リンカー直後から５’末端までのＲＮＡ配列（図１中、Ｘｓ；又はＹａ３、Ｙａ２、及びＹａ１）を合成することにより、ストランド１及びストランド２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を作製した。これらの一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、Ｌｘ１及びＬｘ２として式（ＶＩ－１）で示されるリンカーを有しており、Ｘａは式（ＶＩ－１）中の１位窒素原子側で、Ｘｓは２位炭素原子側でリンカーＬｘ１と連結し、Ｙｓは式（ＶＩ－１）中の１位窒素原子側で、Ｙａ３は２位炭素原子側でリンカーＬｘ２と連結している。
　ストランド２（アンチセンス側）については、ＤＭＴｒ－ＯＦＦの状態で合成を終了し、常法により一本鎖オリゴＲＮＡ分子の切り出しと塩基部及び２’位の脱保護を行った。ストランド１（センス側）については、ＤＭＴｒ－ＯＮの状態で合成を終了した。
［実施例２］ライゲーション法の検討（分割位置）
　ｓｓＴｂＲＮＡ分子の２つの分割フラグメントへの分割位置を検討するため、ペアのストランド１及びストランド２（表１）をＲＮＡリガーゼ（Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ２）を用いてライゲーションし、そのライゲーション効率を決定した。
　具体的には、まず、各ペアのストランド１及びストランド２を注射用水（ＤＷ）に溶解し、等モル量を混合した。この等モル混合液を、９３℃で１分間加熱して熱変性し、次いでアニーリングのため５５℃で１５分静置し、４℃まで降温させた。降温後、反応液を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）（２０℃）と未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｎａｔｉｖｅ　ＰＡＧＥ）で分析し、ストランド１及びストランド２のアニーリング状態を調べた。
　アニーリング状態の確認のために用いたＲＰ－ＨＰＬＣの条件は以下のとおりである。
・カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ＢＥＨ　Ｃ１８　Ｃｏｌｕｍｎ，　１３０Ａ，　１．７μｍ，　２．１ｍｍ　ｘ　１００ｍｍ
・移動相：Ａ）　０．１Ｍ　酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）、Ｂ）　アセトニトリル（ＭｅＣＮ）
・分析条件：Ｂ５－３０％、１０分、２０℃、０．４ｍｌ／ｍｉｎ
　用いたＮａｔｉｖｅ　ＰＡＧＥ（未変性ＰＡＧＥ）の条件は以下のとおりである。
　未変性ＰＡＧＥ；１９％アクリルアミド、１５０Ｖ、９０分間の泳動
　このようにして、ストランド１及びストランド２がアニーリングした二本鎖オリゴＲＮＡを得た。ストランド１及びストランド２のほぼ全てがアニーリングすることが示されたペアと、より低い割合でアニーリングしたペアが存在した。
　得られた二本鎖オリゴＲＮＡ（ストランド１、ストランド２のそれぞれの最終濃度１０μＭ）を、バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、４００μＭ　アデノシン三リン酸（ＡＴＰ））中に含む反応液（ｐＨ７．５）を調製し、２μＬの１０Ｕ／μＬ　Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ；以下同じ）（４０Ｕ／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡ）を添加して反応液量５０μＬとした。この反応液を３７℃で３０分インキュベートした。
　酵素反応後、反応液中のライゲーション効率を、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）及び変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｄｅｎａｔｕｒｅｄ　ＰＡＧＥ）により確認した。
　ライゲーション後ＵＨＰＬＣの条件は以下のとおりである。
・カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ＢＥＨ　Ｃ１８　Ｃｏｌｕｍｎ，　１３０Ａ，　１．７μｍ，　２．１ｍｍ　ｘ　１００ｍｍ
・移動相：Ａ）　１００ｍＭ　ヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）－８ｍＭ　トリエチルアミン（ＴＥＡ）、Ｂ）　メタノール（ＭｅＯＨ）
・分析条件：Ｂ５－４０％、１０分、８０℃、０．４ｍｌ／ｍｉｎ
　Ｄｅｎａｔｕｒｅｄ　ＰＡＧＥ（変性ＰＡＧＥ）の条件は以下のとおりである。
　変性ＰＡＧＥ；１９％アクリルアミド、７．５Ｍ尿素、２００Ｖ、９０分間の泳動後、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）にて染色
　ライゲーション効率（ＦＬＰ（％））は、ＵＨＰＬＣ解析結果に基づき、面積百分率法により、以下の式で算出した。
　ＦＬＰ（Ｆｕｌｌ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔ）（％）
　＝（目的のライゲーション生成物のピーク面積）／（クロマトグラム中の総ピーク面積）×１００
　結果を図３に示す。分割位置により、ライゲーション効率に大きな差が生じた。ストランド１の３’末端がＵになる分割位置ではライゲーション効率が高くなる傾向が示された。またストランド１の３’末端又はストランド２の５’末端がＡになる分割位置を採用した場合にもライゲーション効率が高くなる傾向が示された。またストランド１の３’末端の塩基とストランド２の５’末端の塩基がそれぞれＵ又はＡになる分割位置を採用した場合、特に優れたライゲーション効率が示された。
　なお、それぞれのライゲーション生成物について、ＬＣ－ＭＳ分析を行い、予測される分子量を有することを確認した。ＬＣ－ＭＳ分析には、以下の機器を用いた。
・ＬＣ装置：ＵＨＰＬＣ　ＵｌｔｉＭａｔｅ３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）
・ＭＳ装置：Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）
　この結果に基づき、ライゲーション法に適したペア０１１、０１６、及び０１８を選抜した。
　上記のようにしてペア０１１、０１６、及び０１８のストランド１及びストランド２をアニーリングさせ、ライゲーションにより連結した後の反応液を、上記条件でＲＰ－ＨＰＬＣにより解析したところ、目的物であるｓｓＴｂＲＮＡ分子と遊離ストランド１及びストランド２以外の反応液中の核酸不純物の量はわずかであり、ｓｓＴｂＲＮＡ分子のピーク付近に現れる欠損体（ｓｓＴｂＲＮＡ分子の配列の一部が欠けたもの）の量も少なかった（表２）。一方、ｓｓＴｂＲＮＡ分子の全長をホスホロアミダイト法により固相合成する方法（特許文献２）では、合成後の反応液にｓｓＴｂＲＮＡ分子以外の短鎖核酸不純物（合成が短鎖のうちに停止したＲＮＡ分子など）が比較的多く含まれており、ｓｓＴｂＲＮＡ分子のピーク付近に現れる欠損体も多かった（表２）。本発明の方法では、目的のヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を高純度で製造できることが示された。
　表２中、ストランド１、ストランド２、及びｓｓＴｂＲＮＡ分子の値は、クロマトグラムに基づくそれぞれのピーク面積比率を表す。また、ｓｓＴｂＲＮＡ分子のピーク付近の核酸（主としてｓｓＴｂＲＮＡ分子とその欠損体を含む）の相対量として、ｓｓＴｂＲＮＡ分子のピークを含む、ＲＲＴ（ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ；ここではｓｓＴｂＲＮＡ分子のピークの保持時間を１とした場合の相対保持時間）＝０．９８～１．０７の範囲についてピーク面積％の合計値を算出した。なおストランド１とストランド２のピーク保持時間はｓｓＴｂＲＮＡ分子のピークとは十分に離れており、ＲＲＴ＝０．９８～１．０７の範囲には含まれない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
［実施例３］ライゲーション法の検討（アニーリング温度）
　ペア０１１、０１６、及び０１８のストランド１及びストランド２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を用い、２つの条件でアニーリングテストを行った。
　まず、熱変性条件では、ストランド１及びストランド２を注射用水に溶解し、それぞれ４０μＭで等モル量を混合した。混合液を９３℃で１分間加熱して熱変性し、次いでアニーリングのため５５℃で１５分静置し、４℃まで降温させた。降温後、反応液を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）（２０℃）と未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｎａｔｉｖｅ　ＰＡＧＥ）で分析し、ストランド１及びストランド２のアニーリング状態を調べた。
　一方、室温条件では、ストランド１及びストランド２を注射用水に溶解し、それぞれ２００～４００μＭで等モル量を混合した。混合液を、室温で１０分間静置した。静置後の反応液を、ＲＰ－ＨＰＬＣ（２０℃）と未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、ストランド１及びストランド２のアニーリング状態を調べた。
　その結果、熱変性条件と室温条件のいずれにおいても、ＲＰ－ＨＰＬＣではストランド単独のピークは確認されず、アニーリングにより生じた二本鎖のピークが観察された。また未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動でも、熱変性条件と室温条件の両方で、ストランド１及びストランド２のほぼ全ての分子のアニーリングが確認された。
　熱変性条件と室温条件で同等の結果が得られたことから、以後、ライゲーション法におけるアニーリングは室温条件で実施した。
　なお、以下の実施例では、ストランド１及びストランド２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子のアニーリング状態を、ＲＰ－ＨＰＬＣと未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｎａｔｉｖｅ　ＰＡＧＥ）で確認し、ＲＰ－ＨＰＬＣにより二本鎖ＲＮＡの純度（ＦＬＰ）が９５％以上であることを確認した上で、ライゲーション反応に使用した。
　アニーリング状態の確認のために用いたＲＰ－ＨＰＬＣの条件は以下のとおりである。
・カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ＢＥＨ　Ｃ１８　Ｃｏｌｕｍｎ，　１３０Å，　１．７μｍ，　２．１ｍｍ　ｘ　１００ｍｍ
・移動相：Ａ）　０．１Ｍ　酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）、Ｂ）　アセトニトリル（ＭｅＣＮ）
・分析条件：Ｂ５－３０％、１０分、２０℃、０．４ｍｌ／ｍｉｎ
　用いたＮａｔｉｖｅ　ＰＡＧＥ（未変性ＰＡＧＥ）の条件は以下のとおりである。
　未変性ＰＡＧＥ；１９％アクリルアミド、１５０Ｖ、９０分間の泳動
［実施例４］ライゲーション法の検討（反応温度及び反応時間）
　３種類のペア０１１、０１６、及び０１８（表１；以下、各ペアを単に０１１、０１６、及び０１８とも称する）をそれぞれ用いて、ライゲーション反応の温度と時間について検討を行った。なお０１１、０１６、及び０１８のストランド１及びストランド２の構造を図４に示す。
　実施例２と同様に、各ペアのストランド１及びストランド２を注射用水に溶解し、それぞれ等モル量で混合した。この等モル混合液を、室温で１０分間静置し、アニーリングにより二本鎖オリゴＲＮＡを調製した。
　得られた二本鎖オリゴＲＮＡ（ストランド１とストランド２の等モル混合液；各ストランドの最終濃度１０μＭ、４０μＭ、又は１００μＭ）を、Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）の添付バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＤＴＴ、４００μＭ　ＡＴＰ、ｐＨ７．５（２５℃））中、０．４Ｕ／μＬのＴ４　ＲＮＡリガーゼ２と共に含む反応液１００μＬを、２５℃又は３７℃にてインキュベートし、ライゲーションした。このライゲーション反応に使用した酵素（Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ２）の量は、４０Ｕ／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡ、１０Ｕ／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡ、又は４Ｕ／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡである。ライゲーション反応中、０．５時間、２時間、４時間、又は２４時間経過後に２０～２５μＬのサンプルを採取し、８５℃で２０分加熱して酵素を失活させた。熱失活後の反応液を、変性ＰＡＧＥ、及びＵＨＰＬＣにより解析し、ライゲーション効率（ＦＬＰ（％））を算出した。変性ＰＡＧＥ及びＵＨＰＬＣの条件、並びにＦＬＰ（％）の算出方法は、実施例２と同じである。
　その結果、１０μＭ又は４０μＭのオリゴＲＮＡ濃度を用いた場合、ライゲーション効率は反応温度や反応時間で大きく変わることはなく、いずれも非常に高かった。１００μＭのオリゴＲＮＡ濃度を用いた場合、１０μＭ又は４０μＭの場合と比較してライゲーション効率は低下したが、反応時間が長くなるにつれてライゲーション効率は上昇した。また１００μＭのオリゴＲＮＡ濃度では、３７℃よりも２５℃でインキュベートした場合の方が４時間以降のライゲーション効率は高かった。
　０１６についての結果を図５に示す。また、１００μＭのオリゴＲＮＡ濃度でのライゲーション反応の結果を図６に示す（Ａ：２５℃、Ｂ：３７℃）。０１１、０１６におけるライゲーション効率が特に高かった。
［実施例５］ライゲーション法の検討（ＡＴＰ濃度）
　実施例４と同様に調製した０１１の二本鎖オリゴＲＮＡ（等モル混合液）を用いて、ライゲーション反応液中のＡＴＰ濃度の検討を行った。Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）の添付バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＤＴＴ、４００μＭ　ＡＴＰ、ｐＨ７．５（２５℃））に、ＡＴＰを添加してＡＴＰ濃度０．４ｍＭ（添加なし）、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、又は１０ｍＭとした。このように調製したバッファー中、二本鎖オリゴＲＮＡ（各ストランドの最終濃度１０μＭ、２０μＭ、又は４０μＭ）とＴ４　ＲＮＡリガーゼ２を含む反応液２５μＬを、３７℃で３０分インキュベートし、ライゲーションした。ライゲーション反応後、８５℃で２０分加熱して酵素を失活させ、その反応液を、変性ＰＡＧＥ、及びＵＨＰＬＣにより解析し、ライゲーション効率（ＦＬＰ（％））を算出した。変性ＰＡＧＥ及びＵＨＰＬＣの条件、並びにＦＬＰ（％）の算出方法は、実施例２と同じである。
　変性ＰＡＧＥの結果を図７に、オリゴＲＮＡ濃度４０μＭで示されたＦＬＰ（％）を図８に示す。ＡＴＰ濃度を増加させると、ライゲーション反応は阻害された。
［実施例６］ライゲーション法の検討（ｐＨ）
　実施例４と同様に調製した０１６の二本鎖オリゴＲＮＡ（等モル混合液）を用いて、ライゲーション反応液のｐＨ条件の検討を行った。以下の３種類のバッファーを用いた。
（１）　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　７．０）、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、４００μＭ　ＡＴＰ
（２）　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　７．５）、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＤＴＴ、４００μＭ　ＡＴＰ
（３）　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ酢酸（ｐＨ　６．５）、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＤＴＴ、４００μＭ　ＡＴＰ
　０１６の二本鎖オリゴＲＮＡ（各ストランドの最終濃度１０μＭ、１００μＭ、又は２００μＭ）、及びＴ４　ＲＮＡリガーゼ２（最終濃度０．４Ｕ／μＬ）を上記のいずれかのバッファー中に含む反応液３０μＬを、２５℃で３０分、４時間、又は２４時間にわたりインキュベートし、ライゲーションした。ライゲーション反応後、８５℃で２０分加熱して酵素を失活させ、その反応液を、変性ＰＡＧＥ、及びＵＨＰＬＣにより解析し、ライゲーション効率（ＦＬＰ（％））を算出した。変性ＰＡＧＥ及びＵＨＰＬＣの条件、並びにＦＬＰ（％）の算出方法は、実施例２と同じである。
　結果を図９に示す。ｐＨ７．５の反応液では、高濃度のオリゴＲＮＡを含む場合でも、２４時間反応させたときに９５％以上のライゲーション効率を示した。
［実施例７］ライゲーション法の検討（ｐＨ８．０以上）
　実施例４と同様に調製した０１６の二本鎖オリゴＲＮＡ（等モル混合液）を用いて、ライゲーション反応液のｐＨ条件をさらに検討した。以下の４種類のバッファーを用いた。
（１）　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　７．０）、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＤＴＴ、４００μＭ　ＡＴＰ
（２）　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　７．５）、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＤＴＴ、４００μＭ　ＡＴＰ
（３）　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　８．０）、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＤＴＴ、４００μＭ　ＡＴＰ、
（４）　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　８．５）、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＤＴＴ、４００μＭ　ＡＴＰ
　０１６の二本鎖オリゴＲＮＡ（各ストランドの最終濃度１０μＭ又は２００μＭ）、及びＴ４　ＲＮＡリガーゼ２（最終濃度０．４Ｕ／μＬ）を、上記のいずれかのバッファー中に含む反応液３０μＬを、２５℃で３０分、４時間、又は２４時間にわたりインキュベートし、ライゲーションした。ライゲーション反応後、８５℃で２０分加熱して酵素を失活させ、その反応液を、変性ＰＡＧＥ、及びＵＨＰＬＣにより解析し、ライゲーション効率（ＦＬＰ（％））を算出した。変性ＰＡＧＥ及びＵＨＰＬＣの条件、並びにＦＬＰ（％）の算出方法は、実施例２と同じである。結果を図１０に示す。ｐＨ７．５以上の反応液は高いライゲーション効率を示した。
［実施例８］ライゲーション法の検討（２価イオン濃度）
　実施例４と同様に調製した０１６の二本鎖オリゴＲＮＡ（等モル混合液）を用いて、ライゲーション反応液中のＭｇＣｌ２濃度の検討を行った。以下の５種類のバッファーを用いた。
（１）　０．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　７．５）、１ｍＭ　ＤＴＴ、４００μＭ　ＡＴＰ
（２）　１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　７．５）、１ｍＭ　ＤＴＴ、４００μＭ　ＡＴＰ
（３）　２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　７．５）、１ｍＭ　ＤＴＴ、４００μＭ　ＡＴＰ
（４）　５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　７．５）、１ｍＭ　ＤＴＴ、４００μＭ　ＡＴＰ
（５）　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　７．５）、１ｍＭ　ＤＴＴ、４００μＭ　ＡＴＰ
　０１６の二本鎖オリゴＲＮＡ（各ストランドの最終濃度１０μＭ、１００μＭ、又は２００μＭ）、及びＴ４　ＲＮＡリガーゼ２（最終濃度０．４Ｕ／μＬ）を、上記のいずれかのバッファー中に含む反応液３０μＬを、２５℃で３０分、４時間、又は２４時間にわたりインキュベートし、ライゲーションした。ライゲーション反応後、８５℃で２０分加熱して酵素を失活させ、その反応液を、変性ＰＡＧＥ、及びＵＨＰＬＣにより解析し、ライゲーション効率（ＦＬＰ（％））を算出した。変性ＰＡＧＥ及びＵＨＰＬＣの条件、並びにＦＬＰ（％）の算出方法は、実施例２と同じである。
　結果を図１１に示す（Ａ：１０μＭ又は１００μＭ　オリゴＲＮＡ、Ｂ：１０μＭ又は２００μＭ　オリゴＲＮＡ）。二本鎖オリゴＲＮＡ濃度が１００μＭの場合は２ｍＭ以上のＭｇＣｌ２濃度で、４時間以上の反応により９５％以上のライゲーション効率が示された。オリゴＲＮＡ濃度が２００μＭの場合も、２ｍＭ以上のＭｇＣｌ２濃度で、２４時間以上の反応により９５％以上のライゲーション効率が示され、さらに、５ｍＭのＭｇＣｌ２濃度では４時間後にライゲーション効率の特に急激な上昇が認められた。この結果から、より高濃度のオリゴＲＮＡを用いる場合には、ＭｇＣｌ２濃度を適度に増加させることにより、ライゲーション反応の進行を早めることができることが示された。
［実施例９］酵素ライゲーション法の検討（２価イオン濃度及びｐＨ）
　実施例４と同様に調製した０１６の二本鎖オリゴＲＮＡ（等モル混合液）を用いて、ライゲーション反応液中の２価イオン濃度の検討を行った。以下の６種類のバッファーを用いた。
（１）　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　７．５）、１ｍＭ　ＤＴＴ、４００μＭ　ＡＴＰ、２ｍＭ、５ｍＭ、又は１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
（２）　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　８．０）、１ｍＭ　ＤＴＴ、４００μＭ　ＡＴＰ、２ｍＭ、５ｍＭ、又は１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
　０１６の二本鎖オリゴＲＮＡ（各ストランドの最終濃度１０μＭ又は２００μＭ）、及びＴ４　ＲＮＡリガーゼ２（最終濃度０．４Ｕ／μＬ）を、上記のいずれかのバッファー中に含む反応液３０μＬを、２５℃で３０分、４時間、又は２４時間にわたりインキュベートし、ライゲーションした。ライゲーション反応後、８５℃で２０分加熱して酵素を失活させ、その反応液を、変性ＰＡＧＥ、及びＵＨＰＬＣにより解析し、ライゲーション効率（ＦＬＰ（％））を算出した。変性ＰＡＧＥ及びＵＨＰＬＣの条件、並びにＦＬＰ（％）の算出方法は、実施例２と同じである。
　結果を図１２に示す（Ａ：ｐＨ７．５、Ｂ：ｐＨ８．０）。ｐＨ７．５とｐＨ８．０のいずれにおいても、４時間後の時点で、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２の場合にライゲーション効率の最も急激な上昇が認められた。
［実施例１０］酵素ライゲーション法の検討（ＰＥＧ添加）
　実施例４と同様に調製した０１８の二本鎖オリゴＲＮＡ（等モル混合液）を用いて、ライゲーション反応溶液へのＰＥＧの添加によるライゲーション効率への影響を調べた。
　バッファー（５、１０、又は１５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ８０００、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＤＴＴ、４００μＭ　ＡＴＰ）中に、二本鎖オリゴＲＮＡ（各ストランドの最終濃度２００μＭ）と、０．４Ｕ／μＬ、又は０．２Ｕ／μＬのＴ４　ＲＮＡリガーゼ２を含む反応液３０μＬを、２５℃で３０分、４時間、又は２４時間にわたりインキュベートし、ライゲーションした。このライゲーション反応に使用した酵素（Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ２）の量は、２Ｕ／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡ、又は１Ｕ／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡであり、実施例４での酵素量と比較すると、それぞれ１／２０、及び１／４０である。ライゲーション反応後、８５℃で２０分加熱して酵素を失活させた。熱失活後の反応液を、変性ＰＡＧＥ、及びＵＨＰＬＣにより解析し、ライゲーション効率（ＦＬＰ（％））を算出した。変性ＰＡＧＥ及びＵＨＰＬＣの条件、並びにＦＬＰ（％）の算出方法は、実施例２と同じである。
　結果を図１３に示す。ＰＥＧの添加によりライゲーション効率が増加したことが示された。
［実施例１１］酵素ライゲーション法における反応タイムコースの解析
　実施例４と同様に調製した０１６の二本鎖オリゴＲＮＡ（等モル混合液）を用いて、ライゲーション反応のタイムコースの検討を行った。
　二本鎖オリゴＲＮＡ（各ストランドの最終濃度１００μＭ又は２００μＭ）、０．４Ｕ／μＬのＴ４　ＲＮＡリガーゼ２を、バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＤＴＴ、４００μＭ　ＡＴＰ）中に含む反応液８０μＬを、２５℃でインキュベートし、ライゲーションした。ライゲーション反応中、開始から１、２、３、４、６、９、１２、１５、１８、及び２４時間後にサンプリングし、８５℃で２０分加熱して酵素を失活させた後、ＵＨＰＬＣ解析を行い、ＦＬＰ％を算出した。ＵＨＰＬＣの条件、並びにＦＬＰ（％）の算出方法は、実施例２と同じである。
　結果を図１４に示す。オリゴＲＮＡ濃度が１００μＭの場合は反応開始後６時間、２００μＭの場合は反応開始後９時間でライゲーション反応がほぼプラトーに達した。
［実施例１２］酵素ライゲーション法におけるオリゴＲＮＡの追加添加
　実施例４と同様に調製した０１６の二本鎖オリゴＲＮＡ（等モル混合液）を用いて、ライゲーション反応相にストランド１及びストランド２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子を順次添加することによりｓｓＴｂＲＮＡ分子の収量を増加させる方法を検討した。
　まず、二本鎖オリゴＲＮＡを各ストランドの最終濃度１００μＭで含むライゲーション反応液を用いて検討を行った。二本鎖オリゴＲＮＡ（最終濃度１００μＭ；　１００μＬの反応液中のトータルのオリゴＲＮＡ量は、ストランド１及びストランド２のそれぞれについて１０ｎｍｏｌ）、及びＴ４　ＲＮＡリガーゼ２（０．４Ｕ／μＬ；　４Ｕ／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡ）を、バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＤＴＴ、４００μＭ　ＡＴＰ）中に含む反応液１００μＬを、４本のチューブに分注し、２５℃でインキュベートすることによりライゲーション反応を開始した。
　ライゲーション反応開始から１２時間後、３本のチューブに、０１６の二本鎖オリゴＲＮＡ（反応バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＤＴＴ、４００μＭ　ＡＴＰ（ｐＨ８．０））中、０１６のストランド１とストランド２の等モル混合液）を各ストランド１０ｎｍｏｌとなる量（１１．１μＬ）で添加し、引き続きインキュベートした。オリゴＲＮＡ追加後の反応液中のオリゴＲＮＡ濃度は１８０μＭ（各ストランドの濃度）、酵素（Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ２）の量は０．３６Ｕ／μＬ（２Ｕ／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡ）である。
　オリゴＲＮＡ追加の１２時間後、オリゴＲＮＡを追加した３本のうち２本のチューブに、０１６の二本鎖オリゴＲＮＡ（上記と同じ等モル混合液）を各ストランド１０ｎｍｏｌとなる量（１１．１μＬ）でさらに添加し、引き続きインキュベートした。２回目のオリゴＲＮＡ追加後の反応液中のオリゴＲＮＡ濃度は２４５μＭ（各ストランドの濃度）、酵素（Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ２）の量は０．３３Ｕ／μＬ（１．３３Ｕ／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡ）である。
　その１２時間後、オリゴＲＮＡを２回追加した２本のうち１本のチューブに、０１６の二本鎖オリゴＲＮＡ（上記と同じ等モル混合液）を各ストランド１０　ｎｍｏｌとなる量（１１．１μＬ）で添加し、さらに１２時間インキュベートした。３回目のオリゴＲＮＡ追加後の反応液中のオリゴＲＮＡ濃度は３００μＭ（各ストランドの濃度）、酵素（Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ２）の量は０．３Ｕ／μＬ（１Ｕ／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡ）である。
　それらのチューブから、１２時間毎に反応液をサンプリングし、８５℃で２０分加熱して酵素を失活させた。得られた反応後のサンプルは以下のとおりである。反応時間はライゲーション反応開始時からの時間を指す。
チューブ１）１００μＭ　オリゴＲＮＡ（各ストランドについてトータル１０ｎｍｏｌ；追加なし）、酵素量０．４Ｕ／μＬ、反応温度２５℃、反応時間１２、２４、３６、又は４８時間
チューブ２）１８０μＭ　オリゴＲＮＡ（各ストランドについてトータル２０ｎｍｏｌ；１回追加）、酵素量０．３６Ｕ／μＬ、反応温度２５℃、反応時間２４、３６、又は４８時間
チューブ３）２４５μＭ　オリゴＲＮＡ（各ストランドについてトータル３０ｎｍｏｌ；２回追加）、酵素量０．３３Ｕ／μＬ、反応温度２５℃、反応時間３６、又は４８時間
チューブ４）３００μＭ　オリゴＲＮＡ（各ストランドについてトータル４０ｎｍｏｌ；３回追加）、酵素量０．３Ｕ／μＬ、反応温度２５℃、反応時間４８時間
　各サンプルについてＵＨＰＬＣ解析を行い、ＦＬＰ％を算出した。ＵＨＰＬＣの条件、並びにＦＬＰ（％）の算出方法は、実施例２と同じである。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　さらに、各サンプルについて、ＦＬＰ％と一本鎖オリゴＲＮＡ分子の添加量から目的産物（ｓｓＴｂＲＮＡ分子）の生成量（ｎｍｏｌ）を算出した。その結果を図１５に示す。
　同様の方法で、二本鎖オリゴＲＮＡを各ストランドの最終濃度２００μＭで含むライゲーション反応液を用いて検討を行った。
　二本鎖オリゴＲＮＡ（最終濃度２００μＭ；　１００μＬの反応液中のトータルのオリゴＲＮＡ量は、ストランド１及びストランド２のそれぞれについて２０ｎｍｏｌ）、及びＴ４　ＲＮＡリガーゼ２（０．４Ｕ／μＬ；　４Ｕ／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡ）を、バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＤＴＴ、４００μＭ　ＡＴＰ（ｐＨ８．０））中に含む反応液１００μＬを、４本のチューブに分注し、２５℃でインキュベートすることによりライゲーション反応を開始した。１２時間後、３本のチューブに、０１６の二本鎖オリゴＲＮＡ（反応バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＤＴＴ、４００μＭ　ＡＴＰ（ｐＨ８．０））中、０１６のストランド１とストランド２の等モル混合液）を各ストランド２０　ｎｍｏｌとなる量（２２．２μＬ）で添加し、引き続きインキュベートした。その後、オリゴＲＮＡを最終濃度１００μＭで用いた場合と同様に、１２時間毎に３回目までオリゴＲＮＡを追加し、ライゲーション反応を継続した。
　それらのチューブから、１２時間毎に反応液をサンプリングし、８５℃で２０分加熱して酵素を失活させた。得られた反応後のサンプルは以下のとおりである。反応時間はライゲーション反応開始時からの時間を指す。
チューブ１）２００μＭ　オリゴＲＮＡ（各ストランドについてトータル２０ｎｍｏｌ；追加なし）、酵素量０．４Ｕ／μＬ、反応温度２５℃、反応時間１２、２４、３６、又は４８時間
チューブ２）３２７μＭ　オリゴＲＮＡ（各ストランドについてトータル４０ｎｍｏｌ；１回追加）、酵素量０．３６Ｕ／μＬ、反応温度２５℃、反応時間２４、３６、又は４８時間
チューブ３）４１５μＭ　オリゴＲＮＡ（各ストランドについてトータル６０ｎｍｏｌ；２回追加）、酵素量０．３３Ｕ／μＬ、反応温度２５℃、反応時間３６、又は４８時間
チューブ４）４８０μＭ　オリゴＲＮＡ（各ストランドについてトータル８０ｎｍｏｌ；３回追加）、酵素量０．３Ｕ／μＬ、反応温度２５℃、反応時間４８時間
　各サンプルについてＵＨＰＬＣ解析を行い、ＦＬＰ％を算出した。ＵＨＰＬＣの条件、並びにＦＬＰ（％）の算出方法は、実施例２と同じである。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　さらに、各サンプルについて、ＦＬＰ％と一本鎖オリゴＲＮＡ分子の添加量から目的産物（ｓｓＴｂＲＮＡ分子）の生成量（ｎｍｏｌ）を算出した。その結果を図１６に示す。
　以上の結果から、本発明の方法では、ライゲーション反応相にオリゴＲＮＡを順次追加することにより、ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子（ここでは、ｓｓＴｂＲＮＡ分子）の生成量を増加させることができることが示された。
　一般的なＲＮＡリガーゼ使用量（出発オリゴＲＮＡ量１０μＭに対し、酵素量０．４Ｕ／μＬ）では、上記と同様のライゲーション反応条件でＦＬＰ　９０％超のライゲーション効率が得られるものの、１００μＬ反応液当たりのｓｓＴｂＲＮＡ分子の生成量は１ｎｍｏｌ未満である。そのような一般的な場合と比較して、本発明の方法では、９０％以上のＦＬＰを示した効率的な反応条件下で、オリゴＲＮＡ量当たりの酵素使用量を１／３０～１／４０に削減できることが示された。
［実施例１３］他の標的遺伝子に対するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造
　ヒトＴＧＦ－β１遺伝子の代わりにヒトＧＡＰＤＨ遺伝子、ヒトＬＡＭＡ１遺伝子、又はヒトＬＭＮＡ遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含むヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子を、実施例１及び２と同様に２つの分割フラグメントであるストランド１及びストランド２をライゲーションする方法により作製した。リンカーとしては、実施例１及び２と同様のプロリン誘導体、又はヌクレオチド性リンカーを用いた。
　ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子、及びその分子中の分割位置を図１７に示す。図１７中、ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子に含まれる各遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列（アンチセンス配列）を枠で示した。また、それぞれのヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の２つの分割フラグメントであるストランド１及びストランド２のペアを表５に示す。表５のストランド１及びストランド２のペアは、ライゲーションする末端の塩基の組み合わせとして、Ｕ－Ｕ、Ａ－Ａ、Ａ－Ｕ、又はＵ－Ａを有するものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　プロリン誘導体を含むストランド１及びストランド２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の合成は、実施例１と同様の方法により行った。プロリン誘導体の代わりにヌクレオチド性リンカーを含むストランド１及びストランド２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の合成は、ホスホロアミダイト法を用いた固相合成法により行った。
　実施例２に記載のようにして、各ペアのストランド１及びストランド２（表５）をアニーリングし、二本鎖オリゴＲＮＡを得た。得られた二本鎖オリゴＲＮＡ（ストランド１、ストランド２のそれぞれの最終濃度１０μＭ）を、バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、４００μＭ　アデノシン三リン酸（ＡＴＰ））中に含む反応液（ｐＨ７．５［２５℃］）を調製し、２μＬの１０Ｕ／μＬ　Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）（４０Ｕ／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡ）を添加して反応液量５０μＬとした。この反応液を３７℃で３０分インキュベートした。
　酵素反応後、反応液中のライゲーション効率を、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）及び変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｄｅｎａｔｕｒｅｄ　ＰＡＧＥ）により確認した。ライゲーション後ＵＨＰＬＣの条件、及びライゲーション効率（ＦＬＰ（％））の算出方法は、実施例２と同じである。
　なお、それぞれのライゲーション生成物について、ＬＣ－ＭＳ分析を行い、予測される分子量を有することを確認した。ＬＣ－ＭＳ分析に用いたＬＣ装置及びＭＳ装置は実施例２で用いたものと同じである。
　結果を図１８に示す。表５のストランド１及び２のペアは、いずれも高いライゲーション効率を示した。
［比較例］
　実施例２の実験と並行して、Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ２の代わりにＴ４　ＲＮＡリガーゼを用いて、表１に示したストランド１及びストランド２がアニーリングした二本鎖オリゴＲＮＡをライゲーションし、そのライゲーション効率を決定した。
　実施例２に記載のようにして、それぞれのペアのストランド１及びストランド２（表１）をアニーリングし、二本鎖オリゴＲＮＡを得た。得られた二本鎖オリゴＲＮＡ（ストランド１、ストランド２のそれぞれの最終濃度１０μＭ）を、バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５ｍＭ　ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭ　アデノシン三リン酸（ＡＴＰ））中に含む反応液（ｐＨ７．８）を調製し、０．５μＬの１０Ｕ／μＬ　Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（１０Ｕ／ｎｍｏｌオリゴＲＮＡ）を添加して反応液量５０μＬとした。この反応液を３７℃で３０分インキュベートした。
　酵素反応後、反応液中のライゲーション効率を、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）及び変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｄｅｎａｔｕｒｅｄ　ＰＡＧＥ）により確認した。ライゲーション後ＵＨＰＬＣの条件、及びライゲーション効率（ＦＬＰ（％））の算出方法は、実施例２と同じである。
　結果を図１９に示す。Ｔ４　ＲＮＡリガーゼを用いた場合のライゲーション効率は、Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ２（図３）と比較して顕著に低かった。
　本発明は、汎用型アミダイトを使用し、酵素使用量を低減しながら、標的遺伝子に対する発現抑制配列を含むヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の効率的な製造を可能にすることができる。
　配列番号１～５７：合成ＲＮＡ
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (13)

  1. 　標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法であって、
    　第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とをアニーリングするアニーリング工程と、
    　前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端とをＲｎｌ２ファミリーのリガーゼによりライゲーションするライゲーション工程とを含み、
    　前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、第１のリンカーを介して連結された第１のＲＮＡ部分と第２のＲＮＡ部分を含み、第１のＲＮＡ部分と第２のＲＮＡ部分の一方は他方に対して相補的に結合可能であり、
    　前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、第２のリンカーを介して連結された第３のＲＮＡ部分と第４のＲＮＡ部分を含み、第３のＲＮＡ部分と第４のＲＮＡ部分の一方は他方に対して相補的に結合可能であり、
    　前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とは５’末端又は３’末端の相補的な配列間で分子間二重鎖を形成可能であり、
    　アニーリング工程において前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子が二重鎖を形成するとき、前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端のリボヌクレオチド残基と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端のリボヌクレオチド残基はニックを生成し、また前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端のリボヌクレオチド残基と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端のリボヌクレオチド残基の間には１個以上のリボヌクレオチド残基のギャップが存在し、
    　前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とのライゲーションにより生成される配列は、前記標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む、
    ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法。
  2. 　前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、下記式（Ｉ）で表され、前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、下記式（ＩＩ）で表され、
    　　５’－Ｘｓ－Ｌｘ１－Ｘａ－３’　　　　　　　　　　　・・・式（Ｉ）
    　　５’－Ｙａ１－Ｙａ２－Ｙａ３－Ｌｘ２－Ｙｓ－３’　　　・・・式（ＩＩ）
    　式（Ｉ）及び式（ＩＩ）中、Ｘｓ、Ｘａ、Ｙａ１、Ｙａ２、Ｙａ３及びＹｓは、１個又はそれ以上のリボヌクレオチド残基を表し、
    　Ｌｘ１及びＬｘ２は、それぞれ、第１のリンカー及び第２のリンカーを表し、
    　Ｙａ３は、Ｙｓと相補的であり、
    　ライゲーション工程で生じるＸａ－Ｙａ１は、Ｘｓと相補的であり、
    　ライゲーション工程で生じるＸａ－Ｙａ１－Ｙａ２－Ｙａ３は、前記標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む、
    請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子が３’末端にウラシル（Ｕ）又はアデニン（Ａ）を有し、前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子が５’末端にウラシル（Ｕ）又はアデニン（Ａ）を有する、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　第１のリンカー及び第２のリンカーは、それぞれ独立して、（ｉ）ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド性リンカー、又は（ｉｉ）ヌクレオチド性リンカーである、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
  5. 　Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼが、Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ２である、請求項１～４のいずれか一項に記載の製造方法。
  6. 　ｐＨ７．４～８．６の反応液中で前記ライゲーションが行われる、請求項１～５のいずれか一項に記載の製造方法。
  7. 　２～１０ｍＭの二価金属イオンを含む反応液中で前記ライゲーションが行われる、請求項１～６のいずれか一項に記載の製造方法。
  8. 　第１のリンカー及び第２のリンカーは、それぞれ独立して、下記式（ＶＩ）で表される非ヌクレオチド性リンカーである、請求項１～７のいずれか一項に記載の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  9. 　前記標的遺伝子は、ＴＧＦ－β１遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子、ＬＡＭＡ１遺伝子又はＬＭＮＡ遺伝子である、請求項１～８のいずれか一項に記載の製造方法。
  10. 　前記ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、配列番号１で表される塩基配列からなり、２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結され、５０番目と５１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている、請求項１～９のいずれか一項に記載の製造方法。
  11. 　前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、以下の（１）～（６）のいずれかである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の製造方法。
    （１）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号７で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１０番目と１１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
    （２）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号１９で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１６番目と１７番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号１８で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
    （３）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号２７で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２０番目と２１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号２６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
    （４）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号２９で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２１番目と２２番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号２８で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
    （５）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号３１で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２２番目と２３番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号３０で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
    （６）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号３３で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２３番目と２４番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号３２で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
  12. 　以下の（ａ）～（ｌ）のいずれかである、一本鎖オリゴＲＮＡ分子。
    （ａ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号７で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
    （ｂ）１０番目と１１番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号６で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
    （ｃ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号１９で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
    （ｄ）１６番目と１７番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号１８で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
    （ｅ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号２７で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
    （ｆ）２０番目と２１番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号２６で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
    （ｇ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号２９で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
    （ｈ）２１番目と２２番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号２８で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
    （ｉ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３１で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
    （ｊ）２２番目と２３番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３０で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
    （ｋ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３３で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
    （ｌ）２３番目と２４番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号３２で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
  13. 　以下の（１）～（６）のいずれかの一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせを含む、ＴＧＦ－β１遺伝子の発現を抑制するためのヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造用のキット。
    （１）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号７で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１０番目と１１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
    （２）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号１９で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１６番目と１７番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号１８で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
    （３）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号２７で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２０番目と２１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号２６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
    （４）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号２９で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２１番目と２２番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号２８で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
    （５）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号３１で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２２番目と２３番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号３０で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
    （６）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号３３で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２３番目と２４番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号３２で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
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