JP2019213567A5 - - Google Patents
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Claims (13)
- 標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法であって、
第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とをアニーリングするアニーリング工程と、
前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端とをＲｎｌ２ファミリーのリガーゼによりライゲーションするライゲーション工程とを含み、
前記ライゲーション工程における前記Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼの使用量は、前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子及び／又は前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子のモル数（ｎｍｏｌ）当たり、１０ユニット以下であり、
前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、第１のリンカーを介して連結された第１のＲＮＡ部分と第２のＲＮＡ部分を含み、第１のＲＮＡ部分と第２のＲＮＡ部分の一方は他方に対して相補的に結合可能であり、
前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、第２のリンカーを介して連結された第３のＲＮＡ部分と第４のＲＮＡ部分を含み、第３のＲＮＡ部分と第４のＲＮＡ部分の一方は他方に対して相補的に結合可能であり、
前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とは５’末端又は３’末端の相補的な配列間で分子間二重鎖を形成可能であり、
アニーリング工程において前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子が二重鎖を形成するとき、前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端のリボヌクレオチド残基と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端のリボヌクレオチド残基はニックを生成し、また前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の５’末端のリボヌクレオチド残基と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子の３’末端のリボヌクレオチド残基の間には１個以上のリボヌクレオチド残基のギャップが存在し、
前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子とのライゲーションにより生成される配列は、前記標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む、
ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造方法。 - 前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、下記式（Ｉ）で表され、前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、下記式（ＩＩ）で表され、
５’－Ｘｓ－Ｌｘ１－Ｘａ－３’ ・・・式（Ｉ）
５’－Ｙａ１－Ｙａ２－Ｙａ３－Ｌｘ２－Ｙｓ－３’ ・・・式（ＩＩ）
式（Ｉ）及び式（ＩＩ）中、Ｘｓ、Ｘａ、Ｙａ１、Ｙａ２、Ｙａ３及びＹｓは、１個又はそれ以上のリボヌクレオチド残基を表し、
Ｌｘ１及びＬｘ２は、それぞれ、第１のリンカー及び第２のリンカーを表し、
Ｘａは、２～２０個のリボヌクレオチド残基であり、
Ｙａ３は、Ｙｓと相補的であり、
ライゲーション工程で生じるＸａ－Ｙａ１は、Ｘｓと相補的であり、
ライゲーション工程で生じるＸａ－Ｙａ１－Ｙａ２－Ｙａ３は、前記標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む、
請求項１に記載の製造方法。 - 前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子が３’末端にウラシル（Ｕ）又はアデニン（Ａ）を有し、前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子が５’末端にウラシル（Ｕ）又はアデニン（Ａ）を有する、請求項１又は２に記載の製造方法。
- 第１のリンカー及び第２のリンカーは、それぞれ独立して、（ｉ）ピロリジン骨格及びピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド性リンカー、又は（ｉｉ）ヌクレオチド性リンカーである、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
- Ｒｎｌ２ファミリーのリガーゼが、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２である、請求項１～４のいずれか一項に記載の製造方法。
- ｐＨ７．４～８．６の反応液中で前記ライゲーションが行われる、請求項１～５のいずれか一項に記載の製造方法。
- ２～１０ｍＭの二価金属イオンを含む反応液中で前記ライゲーションが行われる、請求項１～６のいずれか一項に記載の製造方法。
- 第１のリンカー及び第２のリンカーは、それぞれ独立して、下記式（ＶＩ）で表される非ヌクレオチド性リンカーである、請求項１～７のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記標的遺伝子は、ＴＧＦ－β１遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子、ＬＡＭＡ１遺伝子又はＬＭＮＡ遺伝子である、請求項１～８のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記ヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子は、配列番号１で表される塩基配列からなり、２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結され、５０番目と５１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている、請求項１～９のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と前記第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子は、以下の（１）～（１３）のいずれかである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の製造方法。
（１）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号７で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１０番目と１１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（２）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号１９で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１６番目と１７番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号１８で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（３）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号２７で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２０番目と２１番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号２６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（４）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号２９で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２１番目と２２番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号２８で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（５）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号３１で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２２番目と２３番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号３０で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（６）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号３３で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、２３番目と２４番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号３２で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（７）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号５で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、９番目と１０番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号４で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（８）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号９で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１１番目と１２番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号８で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（９）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号１１で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１２番目と１３番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号１０で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（１０）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号１３で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１３番目と１４番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号１２で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（１１）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号１７で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１５番目と１６番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号１６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（１２）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号２１で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１７番目と１８番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号２０で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（１３）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号２５で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１９番目と２０番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号２４で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ - 以下の（ａ）～（ｎ）のいずれかである、一本鎖オリゴＲＮＡ分子。
（ａ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号５で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｂ）９番目と１０番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号４で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｃ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号９で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｄ）１１番目と１２番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号８で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｅ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号１１で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｆ）１２番目と１３番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号１０で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｇ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号１３で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｈ）１３番目と１４番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号１２で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｉ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号１７で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｊ）１５番目と１６番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号１６で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｋ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号２１で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｌ）１７番目と１８番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号２０で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｍ）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号２５で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子
（ｎ）１９番目と２０番目のリボヌクレオチド残基がリンカーを介して連結されている配列番号２４で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴＲＮＡ分子 - 以下の（１）～（７）のいずれかの一本鎖オリゴＲＮＡ分子の組み合わせを含む、ＴＧＦ－β１遺伝子の発現を抑制するためのヘアピン型一本鎖ＲＮＡ分子の製造用のキット。
（１）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号５で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、９番目と１０番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号４で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（２）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号９で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１１番目と１２番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号８で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（３）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号１１で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１２番目と１３番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号１０で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（４）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号１３で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１３番目と１４番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号１２で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（５）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号１７で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１５番目と１６番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号１６で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（６）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号２１で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１７番目と１８番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号２０で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
（７）２４番目と２５番目のリボヌクレオチド残基が第１のリンカーを介して連結されている配列番号２５で表される塩基配列からなる第１の一本鎖オリゴＲＮＡ分子と、１９番目と２０番目のリボヌクレオチド残基が第２のリンカーを介して連結されている配列番号２４で表される塩基配列からなる第２の一本鎖オリゴＲＮＡ分子との組み合わせ
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