JP5956108B2 - 1,3,5−トリメチルヘキサヒドロ−1,3,5−トリアジンを含有しないn−メチルイミダゾールのキャッピング剤を用いたオリゴヌクレオチドまたはホスホロチオ酸オリゴヌクレオチドの合成 - Google Patents
1,3,5−トリメチルヘキサヒドロ−1,3,5−トリアジンを含有しないn−メチルイミダゾールのキャッピング剤を用いたオリゴヌクレオチドまたはホスホロチオ酸オリゴヌクレオチドの合成 Download PDFInfo
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Description
本出願は、2007年10月15日に出願された米国特許仮出願第60/980,063号の優先権を主張するものであり、この出願は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、1,3,5−トリメチルヘキサヒドロ−1,3,5−トリアジンを実質的に含有しないN−メチルイミダゾールのキャッピング剤を使用しながら、オリゴヌクレオチドまたはホスホロチオ酸オリゴヌクレオチドを合成する方法に関する。
ホスホロチオ酸オリゴヌクレオチドは、本発明の方法に従って、1,3,5−トリメチルヘキサヒドロ−1,3,5−トリアジンを実質的に含有しないN−メチルイミダゾールのキャッピング剤を使用しながら、合成することができる。
手順に従って、表2および3に記載の材料を用いて、DNAを合成する。
[本発明の態様]
1.オリゴヌクレオチドまたはホスホロチオ酸オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、次の工程:
(a)所定量のブロッキングされたヌクレオチドを準備すること;
(b)前記ブロッキングされたヌクレオチドをデブロッキングして、デブロッキングされたヌクレオチドを生成すること;
(c)前記デブロッキングされたヌクレオチドを活性化すること;
(d)前記デブロッキングされたヌクレオチドとホスホロアミダイトをカップリングして、ホスファイトオリゴマーを生成すること;
(e)所定量の無水酢酸、および1,3,5−トリメチルヘキサヒドロ−1,3,5−トリアジンを実質的に含有しない所定量のN−メチルイミダゾールと反応させることにより、前記デブロッキングされたヌクレオチドのうちカップリングしなかったものをキャッピングすること;
(f)前記ホスファイトオリゴマーを酸化してオリゴヌクレオチドを生成し、または前記ホスファイトオリゴマーを硫化してホスホロチオ酸オリゴヌクレオチドを生成すること;及び
(g)任意的に(b)から(f)の工程を反復すること;
を含む、前記方法。
2.前記のブロッキングされたヌクレオチドがブロッキング基を含み、前記デブロッキングが、トルエンまたはジクロロメタン中、所定量のジクロロ酢酸と接触させることによって実施される、1に記載の方法。
3.前記のデブロッキングされたヌクレオチドの活性化が、所定量のアクチベーターとの接触によって実施される、1に記載の方法。
4.前記N−メチルイミダゾールが、N−メチルイミダゾールの重量を基準にして約10ppm以下の含有量の1,3,5−トリメチルヘキサヒドロ−1,3,5−トリアジンを有する、1に記載の方法。
5.前記ホスファイトオリゴマーを酸化し、かかる酸化が、水およびピリジン中、所定量のヨウ素と接触させることによって実施される、1に記載の方法。
6.(b)から(f)の工程を、所望のオリゴヌクレオチド長またはホスホロチオ酸オリゴヌクレオチド長に達するまで反復する、1に記載の方法。
7.前記のブロッキングされたヌクレオチドがヘテロ環式核酸塩基のなかから選択される、1に記載の方法。
8.最初に使用する前記のブロッキングされたヌクレオチドが、支持体に共有結合している、1に記載の方法。
9.ヒドロキシル部位を有するヌクレオチドを、所定量の無水酢酸、および1,3,5−トリメチルヘキサヒドロ−1,3,5−トリアジンを実質的に含有しない所定量のN−メチルイミダゾールと反応させることによりキャッピングすることを含む方法。
Claims (7)
- ホスホロアミダイト法によりオリゴヌクレオチドまたはホスホロチオ酸オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、次の工程:
(a)所定量のブロッキングされたヌクレオチドを準備すること;
(b)前記ブロッキングされたヌクレオチドをデブロッキングして、デブロッキングされたヌクレオチドを生成すること;
(c)前記デブロッキングされたヌクレオチドを活性化すること;
(d)前記デブロッキングされたヌクレオチドをホスホロアミダイトと反応させて、ホスファイトオリゴマーを生成すること;
(e)無水酢酸およびN−メチルイミダゾールと反応させることにより、未反応の前記デブロッキングされたヌクレオチドをキャッピングすること;
(f)前記ホスファイトオリゴマーを酸化してオリゴヌクレオチドを生成し、または前記ホスファイトオリゴマーを硫化してホスホロチオ酸オリゴヌクレオチドを生成すること;及び
(g)任意的に(b)から(f)の工程を反復すること;
を含む方法であって、前記N−メチルイミダゾールが、N−メチルイミダゾールの重量を基準にして10ppm以下の含有量の1,3,5−トリメチルヘキサヒドロ−1,3,5−トリアジンを有する方法。 - 請求項1に記載の方法であって、前記デブロッキングが、トルエンまたはジクロロメタン中でのジクロロ酢酸との反応を含む方法。
- 請求項1または2に記載の方法であって、前記ホスファイトオリゴマーの酸化が、水およびピリジン中でヨウ素と接触させることによって実施される方法。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法であって、前記ブロッキングされたヌクレオチドがヘテロ環式核酸塩基のなかから選択される方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法であって、前記ブロッキングされたヌクレオチドが支持体に共有結合している方法。
- 請求項1に記載の方法であって、(b)から(f)の工程を、所望のオリゴヌクレオチド長またはホスホロチオ酸オリゴヌクレオチド長に達するまで反復する方法。
- ホスホロアミダイト法によりオリゴヌクレオチドまたはホスホロチオ酸オリゴヌクレオチドを製造する方法において、無水酢酸およびN−メチルイミダゾールと反応させることにより、未反応のデブロッキングされたヌクレオチドをキャッピングする方法であって、前記N−メチルイミダゾールが、N−メチルイミダゾールの重量を基準にして10ppm以下の含有量の1,3,5−トリメチルヘキサヒドロ−1,3,5−トリアジンを有する方法。
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