KR20210069628A - 헤어핀형 단일쇄 rna 분자의 제조 방법 - Google Patents

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카츠히코 이세키
히데아키 이나다
타츠야 후지타
케이이치 오키무라
무네타카 쿠니시마
타다아키 오기
에리코 아오키
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Abstract

본 발명은 표적 유전자의 발현을 억제하는 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자의 제조 방법으로서, 탈수 축합제의 존재 하, 완충액과 친수성 유기 용매를 포함하는 혼합 용매 중에서, 하기 식 (I)로 나타내어지는 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와 하기 식 (II)로 나타내어지는 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자를 반응시키는 공정을 포함하고, 5'-Xc-Lx1 ... (I) Lx2-X-Y-Ly-Yc-3'···(II) 상기 탈수 축합제는 트리아진 형 탈수 축합제, N-히드록시 함질소 방향환 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제, 카르보디이미드형 탈수 축합제, 2-할로피리디늄형 탈수 축합제 및 포름아미디늄형 탈수 축합제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법에 관한 것이다.

Description

헤어핀형 단일쇄 RNA 분자의 제조 방법
본 발명은 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자의 제조 방법에 관한 것이다.
유전자 발현을 억제하는 기술로서, 예를 들면, RNA 간섭(RNAi)이 알려져 있다(비특허문헌 1). RNA 간섭에 의한 유전자 발현 억제에는, siRNA(small interfering RNA)라 불리는 짧은 이중쇄의 RNA 분자를 사용하는 방법이 많이 이용되고 있다. 또한, 분자 내 아닐에 의해, 부분적으로 이중쇄를 형성한 환상 RNA 분자를 사용한 유전자 발현을 억제하는 기술도 보고되어 있다(특허문헌 1).
그러나, siRNA는 생체 내에서의 안정성이 낮고, 단일쇄 RNA로 해리되기 쉽기 때문에, 유전자 발현을 안정적으로 억제하는 것이 곤란하다. 특허문헌 2에는, siRNA의 센스쇄와 안티센스쇄를, 아미노산 유도체를 사용하여 형성되는 1개 또는 2개의 링커를 사용해서 단일쇄에 연결한 헤어핀형 단일쇄 장쇄 RNA 분자가, siRNA를 안정화할 수 있는 것이 보고되어 있다. 이 단일쇄 장쇄 RNA 분자의 제조 방법으로서는, 포스포아미다이트법에 의한 고상 합성법이 특허문헌 2에 기재되어 있다.
장쇄 DNA 분자의 제조 방법으로서는, 비교적 단쇄의 2개의 올리고 DNA 분자의 페어, 즉, 말단에 카르복실기를 갖는 제 1 올리고 DNA 분자와, 말단에 아미노기를 갖는 제 2 올리고 DNA 분자의 2개로 분할해서 합성하고, 그것들을 트리아진형 탈수 축합제를 포함하는 완충액 중, 아미드화에 의해 연결함으로써 제조하는 기술이 비특허문헌 2에 보고되어 있지만, RNA 분자에 관한 기재는 없다.
한편, 수계 용매에서의 아미드화 반응은, 예를 들면 비특허문헌 3에 보고되어 있지만, RNA 분자에 관한 기재는 없다.
고상 합성시에, 5' 말단에 카르복실산을 함유하는 올리고머의 카르복실산과 라벨체(예를 들면, 시아닌, 아미노산, 펩티드와 같은 아미노기 함유 물질)와 아미드 결합을 형성할 때에 사용하는 펩티드 커플링제로서 HATU가 예시되어 있다(비특허문헌 4).
미국 특허출원 공개 제 2004/058886호 국제공개 WO2012/017919
Fire 등, Nature, 1998년, 제 391권, p.806-811 Liu 등, Tetrahedron, 2008년, 제 64권, p.8417-8422. Badland 등, Tetrahedron Letters, 2017년, 제 58권, p.4391-4394. Guidebook for the Synthesis OF Oligonucleotides Product Guide 2015/16, Link Technologies Ltd., 2017년, 제 58권, p.49-51.
본 발명은, 표적 유전자의 발현을 억제하는 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자의 효율적인 제조 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
표적 유전자의 발현을 억제하는 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자의 종래의 제조 방법은, 포스포아미다이트법에 의해 뉴클레오시드를 1유닛씩 신장하는 것으로, 효율이 좋은 방법이라고는 할 수 없다.
그래서 본 발명자들은, 표적 유전자의 발현을 억제하는 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자의 효율적인 제조 방법의 개발을 목적으로, 비특허문헌 2의 합성 기술을 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자의 합성에 적용했지만, RNA 분자 중에는, 아미드화 반응에 있어서 부반응의 원인이 되는 수산기가 다수 존재하기 때문에, 불순물이 많이 생성되고, 목적물을 높은 수율로 얻어지지 않는 것이 나타내어졌다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토를 거듭한 결과, 완충액과 디메틸술폭시드 등의 친수성 유기 용매와 포함하는 혼합 용매 중에서, 소정 타입의 탈수 축합제를 사용하여 2개의 단일쇄 올리고 RNA 분자의 말단을 아미드화 반응시킴으로써, 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자를 높은 수율로 효율적으로 제조할 수 있는 것을 찾아내고, 본 발명을 완성하는 것에 이르렀다.
디메틸술폭시드 등의 유기 용매는, 핵산의 변성제로서 사용되는 것이 문헌(Nucleic Acid Research, 1990년, 제 391권, p.4953., 기초 분자 생물학 제 4판 다무라 등 저, 2016년, 동경 화학 동인 등)에 기재되어 있고, 그와 같은 유기 용매는 핵산의 어닐링을 불안정화시키는 것이 알려져 있다. 이 것을 생각하면, 본 발명자들이 찾아낸 상기 지견은 놀랄만한 것이었다.
즉, 본 발명은 이하를 포함한다.
[1] 표적 유전자의 발현을 억제하는 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자의 제조 방법으로서,
탈수 축합제의 존재 하, 완충액과 친수성 유기 용매를 포함하는 혼합 용매 중에서, 하기 식 (I)로 나타내어지는 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와 하기 식 (II)로 나타내어지는 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자를 반응시키는 공정을 포함하고,
5'-Xc-Lx1···(I)
Lx2-X-Y-Ly-Yc-3'···（II)
[식 (I) 및 식 (II) 중, X, Xc, Y 및 Yc는 리보뉴클레오티드 잔기로 이루어지고, Xc는 X와 상보적이며, Yc는 Y와 상보적이며, Ly는 비뉴클레오티드성 링커이며, Lx1은 아미노기를 갖는 비뉴클레오티드성 링커이며, Lx2는 카르복실기를 갖는 비뉴클레오티드성 링커이며, X-Y는 상기 표적 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열을 포함한다]
상기 탈수 축합제는, 트리아진형 탈수 축합제, N-히드록시 함질소 방향환 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제, 카르보디이미드형 탈수 축합제, 2-할로피리디늄형 탈수 축합제, 및 포름아미디늄형 탈수 축합제로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
상기 탈수 축합제가 카르보디이미드형 탈수 축합제일 경우는, N-히드록시 함질소 방향족 화합물 또는 시아노(히드록시이미노)아세트산 에스테르와 조합시켜서 사용하고,
상기 탈수 축합제가 2-할로피리디늄형 탈수 축합제일 경우는, N-히드록시 함질소 방향족 화합물과 조합시켜서 사용하고,
상기 탈수 축합제가 포름아미디늄형 탈수 축합제일 경우는, N-히드록시 함질소 방향족 화합물 또는 N-탄화수소 치환 이미다졸 유도체와 조합시켜서 사용하는,
헤어핀형 단일쇄 RNA 분자의 제조 방법.
[2] 상기 링커 Ly가 아미노산 골격 또는 아미노알콜 골격을 갖는 비뉴클레오티드성 링커이며, 상기 링커 Lx2가 아미노산 골격을 갖는 비뉴클레오티드성 링커인 [1]에 기재된 제조 방법.
[3] 상기 Ly가, 피롤리딘 골격 및 피페리딘 골격 중 적어도 일방을 포함하는 비뉴클레오티드성 링커, 또는 -NHCH2COO-를 포함하는 비뉴클레오티드성 링커이며, 상기 Lx2가 카르복실기를 갖는 피롤리딘 골격 및 피페리딘 골격 중 적어도 일방을 포함하는 비뉴클레오티드성 링커, 또는 -NHCH2COOH를 포함하는 비뉴클레오티드성 링커인 [1] 또는 [2]에 기재된 제조 방법.
[4] Lx1이 하기 식 (III)으로 나타내어지고, Lx2가 하기 식 (IV) 또는 하기 식 (IV')로 나타내어지는 [1]~[3] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
Figure pct00001
[식 (III) 중, R1은 치환되어 있어도 좋은 알킬렌쇄이며, -OR1은 Xc의 3' 말단에 포스포디에스테르 결합을 통해 결합되어 있다]
Figure pct00002
[식 (IV) 중, R2는 치환되어 있어도 좋은 알킬렌쇄이며, p는 1 또는 2이며, -OR2는 X의 5' 말단에 포스포디에스테르 결합을 통해 결합되어 있고, 식 (IV') 중, R2는 치환되어 있어도 좋은 알킬렌쇄이며, -OR2는 X의 5' 말단에 포스포디에스테르 결합을 통해 결합되어 있다]
[5] (i) 상기 N-히드록시 함질소 방향환 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제가 벤조트리아졸릴우로늄형 탈수 축합제이고,
(ii) 상기 N-히드록시 함질소 방향족 화합물이 히드록시벤조트리아졸 또는 그 유도체이며,
(iii) 상기 시아노(히드록시이미노)아세트산 에스테르가 시아노(히드록시이미노)아세트산 알킬에스테르이고, 및/또는
(iv) 상기 N-탄화수소 치환 이미다졸 유도체가 N-알킬이미다졸 유도체인 [1]~[4] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[6] 상기 친수성 유기 용매가 친수성의 비프로톤성 유기 용매인 [1]~[5]에 기재된 제조 방법.
[7] 상기 친수성의 비프로톤성 유기 용매가, 디메틸술폭시드, N,N-디메틸포름아미드, N,N'-디메틸에틸렌우레아, 또는 아세토니트릴인, [6]에 기재된 제조 방법.
[8] 상기 탈수 축합제가 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드, O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N'N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트, N-(3'-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 염산염, 2-클로로-1-메틸피리디늄요오다이드, 또는 클로로-N,N,N'N'-테트라메틸포름아미디늄헥사플루오로포스페이트이며,
상기 N-히드록시 함질소 방향족 화합물이 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸이며,
상기 시아노(히드록시이미노)아세트산 에스테르가 시아노(히드록시이미노)아세트산 에틸이며,
상기 N-탄화수소 치환 이미다졸 유도체가 N-메틸이미다졸인, [1]~[7] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[9] 상기 탈수 축합제와 상기 친수성의 비프로톤성 유기 용매의 조합이, O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N'N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트와 디메틸술폭시드의 조합, O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N'N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트와 N,N-디메틸포름아미드의 조합, N-(3'-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 염산염과 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸과 디메틸술폭시드의 조합, 또는 클로로-N,N,N'N'-테트라메틸포름아미디늄헥사플루오로포스페이트와 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸과 디메틸술폭시드의 조합인, [7] 또는 [8] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[10] 상기 완충액의 pH는 6.5~7.5인 [1]~[9] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[11] Ly가 피롤리딘 골격 또는 피페리딘 골격을 포함하는 비뉴클레오티드성 링커이며, Lx1이 아미노기를 갖는 비뉴클레오티드성 링커이며, Lx2가 카르복실기를 갖는 피롤리딘 골격 및 피페리딘 골격 중 적어도 일방을 포함하는 비뉴클레오티드성 링커인, [1]~[10] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[12] Ly가 하기 식 (V)로 나타내어지는 [1]~[11] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
Figure pct00003
[13] Lx1이 하기 식 (VI)으로 나타내어지고, Lx2가 하기 식 (VII)로 나타내어지는 [1]~[12] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
Figure pct00004
Figure pct00005
[14] 상기 표적 유전자는 TGF-β1 유전자인 [1]~[13] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[15] 상기 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자는, 서열번호 1로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 [1]~[14] 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
[16] 이하의 (a) 또는 (b)인 단일쇄 올리고 RNA 분자.
(a) 1번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 Lx2와 연결되고, 26번째와 27번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 Ly를 통해 연결되어 있는 서열번호 3으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 단일쇄 올리고 RNA 분자
(b) 1번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 Lx2와 연결되고, 26번째와 27번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 Ly를 통해 연결되어 있는 서열번호 6으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 단일쇄 올리고 RNA 분자
[17] 이하의 (1) 또는 (2)인, 단일쇄 올리고 RNA 분자의 조합을 포함하는, 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자의 제조용의 키트.
(1) 24번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 Lx1과 연결되어 있는 서열번호 2로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와, 1번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 Lx2와 연결되고, 26번째와 27번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 Ly를 통해 연결되어 있는 서열번호 3으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자의 조합
(2) 22번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 Lx1과 연결되어 있는 서열번호 5로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와, 1번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 Lx2와 연결되고, 26번째와 27번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 Ly를 통해 연결되어 있는 서열번호 6으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자의 조합
본 명세서는 본원의 우선권의 기초가 되는 일본국 특허출원 번호 2018-187767호의 개시 내용을 포함한다.
본 발명에 의하면, 표적 유전자에 대한 발현 억제 서열을 포함하는 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자를 효율적으로 제조할 수 있다.
도 1은 본 발명의 제조 방법의 개략도이다. 도면 중의 X, Xc, Y, Yc 서열을 나타내는 선 상의 수직선(실선)은, 서열이 상보적인 것을 모식적으로 나타내고 있지만, 개개의 리보뉴클레오티드 잔기나 그것이 대응하는 잔기와의 상보성을 한정적으로 나타내고 있는 것은 아니다. 도면 중의 서열 X와 서열 Y의 경계를 수직선(점선)으로 모식적으로 나타내고 있다.
도 2는 ssTbRNA 분자(서열번호 1)의 모식도이다. Lx1은 아미노기를 갖는 비뉴클레오티드성 링커를 나타내고, Ly는 비뉴클레오티드성 링커를 나타내고, Lx2는 카르복실기를 갖는 비뉴클레오티드성 링커를 나타낸다. 서열번호 1의 29위치(U)~47위치(C)는 활성 서열(TGF-β1 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열)에 상당한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 유전자의 발현을 억제하는 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의해 제조되는 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자는, 유전자 발현 억제 서열을 포함하는 이중쇄 RNA의 센스쇄의 3' 말단 및 안티센스쇄의 5' 말단이, 비뉴클레오티드성 링커를 포함하는 서열을 통해 연결되고, 그 안티센스쇄의 3' 말단에 보다 나은 비뉴클레오티드성 링커를 포함하는 서열을 통해 리보뉴클레오티드가 더 연결된 단일쇄 구조를 갖는다. 본 발명의 방법에 의해 제조되는 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자의 5' 말단과 3' 말단은 결합되어 있지 않다. 본 명세서에 있어서 「헤어핀형」이란, 단일쇄 RNA 분자가 분자 내 어닐링(자기 어닐링)에 의해 1개 이상의 이중쇄 구조를 형성하는 것을 의미한다. 본 발명의 방법에 의해 제조되는 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자는, 그 5' 말단을 포함하는 5'측 영역과 3' 말단을 포함하는 3'측 영역이 각각 별개로 분자 내 어닐링함으로써, 적어도 2개의 이중쇄 구조를 형성한다. 본 명세서에 있어서 「RNA」, 「RNA 분자」, 「핵산 분자」 및 「핵산」은 뉴클레오티드만으로 구성되어 있어도 좋지만, 뉴클레오티드와 비뉴클레오티드 물질(예를 들면, 프롤린 유도체, 글리신 유도체 등의 아미노산 유도체)로 구성되어 있어도 좋다.
본 발명에서는, 유전자 발현 억제 서열을 포함하는 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자를, (i) 아미노기를 갖는 비뉴클레오티드성 링커(Lx1)를 3'측에 갖는 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와, (ii) 카르복실기를 갖는 비뉴클레오티드성 링커(Lx2)를 5'측에 갖고, 비뉴클레오티드성 링커(Ly)를 3'측에 포함하는 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자와의 2개의 프래그먼트로 분할해서 합성하고, 그것들을 아미드화 반응으로 연결함으로써 제조할 수 있다. 여기에서 카르복실기는 카르복실산기라고도 칭해진다. 본 발명의 방법의 개략도를 도 1에 나타낸다. 도 1 중, Lx1은 아미노기를 갖는 비뉴클레오티드성 링커이며, Lx2는 카르복실기를 갖는 비뉴클레오티드성 링커이며, Ly는 비뉴클레오티드성 링커이다. 본 발명의 방법에서는, 비교적 장쇄의 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자를, 보다 단쇄의 단일쇄 RNA 분자의 페어를 연결함으로써 제조하고, 그것에 의해 높은 생산 효율을 실현할 수 있다.
보다 구체적으로는, 본 발명에 따른 유전자 발현 억제 서열을 포함하는 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자의 제조 방법은, 탈수 축합제의 존재 하, 하기 식 (I)로 나타내어지는 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와 하기 식 (II)로 나타내어지는 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자를 반응시키는 공정을 포함한다.
5'-Xc-Lx1···(I)
Lx2-X-Y-Ly-Yc-3'···（II)
또한 후술하는 바와 같이, 상기 방법에서 탈수 축합제로서 카르보디이미드형 탈수 축합제를 사용할 경우에는, 카르보디이미드형 탈수 축합제는 N-히드록시 함질소 방향족 화합물(예를 들면 히드록시벤조트리아졸 또는 그 유도체) 또는 시아노(히드록시이미노)아세트산 에스테르와 조합시켜서 사용된다. 탈수 축합제로서 2-할로피리디늄형 탈수 축합제를 사용할 경우에는, 2-할로피리디늄형 탈수 축합제는 N-히드록시 함질소 방향족 화합물과 조합시켜서 사용된다. 탈수 축합제로서 포름아미디늄형 탈수 축합제를 사용할 경우에는, 포름아미디늄형 탈수 축합제는 N-히드록시 함질소 방향족 화합물 또는 N-탄화수소 치환 이미다졸 유도체와 조합시켜서 사용된다.
제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자의 반응은 아미드화 반응이다. 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자(구체적으로는, 이 분자의 말단의 Lx1에 있는 아미노기)와, 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자(구체적으로는, 이 분자의 말단의 Lx2에 있는 카르복실기)의 아미드화 반응(탈수 축합 반응)에 의해, 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자 사이에 아미드 결합을 형성시킬 수 있다. 본 발명의 제조 방법에 있어서의 이 아미드화 반응은, 반응 용매 중, 특히, 완충액과 친수성 유기 용매를 포함하는 혼합 용매 중에서 실시할 수 있다.
본 발명에 있어서 「올리고 RNA」 및 「올리고 RNA 분자」란, 49염기 길이 이하(비뉴클레오티드성 링커의 잔기수는 불산입)의 염기서열을 갖는 RNA 분자를 가리킨다. 본 발명에 있어서 용어 「올리고 RNA」와 「올리고 RNA 분자」는 통상, 호환적으로 사용된다. 본 발명에 따른 단일쇄 올리고 RNA 분자는, 단일쇄 올리고 RNA, 올리고 핵산, 단일쇄 핵산 분자, 올리고 RNA, 또는 올리고 RNA 분자라고 칭해질 경우도 있다.
식 (I)은 서열 Xc와 링커 Lx1이 5' 말단측으로부터 Xc-Lx1의 순서로 연결된 구조를 나타내고 있다. 식 (II)는 서열 X, Y 및 Yc 및 링커 Lx2 및 Ly가 5' 말단측으로부터, Lx2-X-Y-Ly-Yc의 순서로 연결된 구조를 나타내고 있다.
식 (I) 및 식 (II) 중, X, Xc, Y 및 Yc는 리보뉴클레오티드 잔기(1개 또는 그 이상의 리보뉴클레오티드 잔기)로 이루어진다. 리보뉴클레오티드 잔기는, 아데닌, 우라실, 구아닌 또는 시토신으로부터 선택되는 어느 하나의 핵산염기를 갖는 것이면 좋다. 리보뉴클레오티드 잔기는 또한 수식 리보뉴클레오티드 잔기라도 좋고, 예를 들면, 수식된 핵산염기(수식 염기)를 갖고 있어도 좋다. 수식으로서는 형광 색소 표지, 메틸화, 할로겐화, 수도유리딘화, 아미노화, 탈아미노화, 티오화, 디히드로화 등을 들 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다. X, Xc, Y 및 Yc는, 각각 독립적으로, 비수식 리보뉴클레오티드 잔기만으로 이루어지는 것이어도 좋고, 비수식 리보뉴클레오티드 잔기에 추가해서 수식 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하는 것이어도 좋고, 수식 리보뉴클레오티드 잔기만으로 이루어지는 것이어도 좋다.
본 발명에 있어서, Xc는 X와 상보적이다. Xc는 바람직하게는 X의 전체 영역 또는 그 부분 영역에 대하여 완전히 상보적인 서열(상보서열)로 이루어진다. Xc가 X의 전체 영역에 대하여 완전히 상보적일 경우, Xc는 X의 5' 말단으로부터 3' 말단의 전체 영역의 상보서열로 이루어지고, Xc와 X의 염기수는 동일하다. 또한, Xc가 X의 부분 영역에 대하여 완전히 상보적일 경우, Xc는 X의 부분 영역의 상보서열로 이루어지고, Xc는 X보다 1염기 이상, 예를 들면 1~4염기 또는 1~2염기 적은 염기수를 갖는다. 이 부분 영역은, X 중의 Lx2측의 말단 염기로부터 연속되는 염기서열로 이루어지는 영역인 것이 바람직하다.
X는, 예를 들면 19~39염기 길이이면 좋고, 바람직하게는 19~30염기 길이, 보다 바람직하게는 19~25염기 길이이다.
Xc는, 예를 들면 19~39염기 길이이면 좋고, 바람직하게는 19~30염기 길이, 보다 바람직하게는 19~25염기 길이이다.
본 발명에 있어서, Yc와 Y는 동일한 염기 길이를 갖는다. 본 발명에 있어서, Yc는 Y와 상보적이다. Yc는 바람직하게는 Y의 전체 영역에 대하여 완전히 상보적인 서열(상보서열)로 이루어진다. Yc가 Y의 전체 영역에 대하여 완전히 상보적일 경우, Yc는 Y의 5' 말단으로부터 3' 말단의 전체 영역의 상보서열로 이루어지고, Yc와 Y의 염기수는 동일하다.
Y는, 예를 들면 1~5염기 길이이면 좋고, 바람직하게는 1~3염기 길이, 보다 바람직하게는 1 또는 2염기 길이이다.
Yc는, 예를 들면 1~5염기 길이이면 좋고, 바람직하게는 1~3염기 길이, 보다 바람직하게는 1 또는 2염기 길이이다.
X와 Y의 염기수(염기 길이)의 합계[(X+Y)]와, Xc와 Yc의 염기수(염기 길이)의 합계[(Xc+Yc)]의 차[(X+Y)-(Xc+Yc)]는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 0~4염기(염기 길이)이며, 바람직하게는 0, 1, 또는 2염기(염기 길이)이다.
식 (II)로 나타내어지는 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자에 있어서, X, Y 및 Yc의 합계 염기수는, 예를 들면 21~49염기이며, 바람직하게는 21~30염기, 보다 바람직하게는 25~30염기이다.
상기 식 (I) 중의 링커 Lx1은, 아미노기, 바람직하게는 1급 아미노기 또는 2급 아미노기를 갖는 비뉴클레오티드성 링커이다. 상기 아미노기는 링커 Lx1의 말단에 존재해도 좋고, 내부에 존재해도 좋지만, 말단에 존재하는 것이 바람직하다.
링커 Lx1은, 예를 들면 하기 식 (III)으로 나타내어진다.
Figure pct00006
식 (III) 중, R1은 탄소수 m의 알킬렌쇄이다. 여기에서, 알킬렌쇄 R1의 탄소 원자 상의 임의의 수소 원자는, 임의의 치환기로 치환되어도 좋고, 치환되어 있지 않아도 좋다. m은 특별히 제한되지 않고, 링커 Lx1의 소망의 길이에 따라 적당히 설정할 수 있지만, 예를 들면, 제조 비용 및 수율 등의 점으로부터는, m은 1~30의 정수가 바람직하고, 보다 바람직하게는 1~20의 정수이며, 더 바람직하게는 1~10의 정수이다. 식 (III) 중의 -OR1은 Xc의 3' 말단에 포스포디에스테르 결합을 통해 결합되어 있다. 즉, 링커 Lx1 중의 -OR1은 Xc의 3' 말단의 당(리보오스)의 3' 위치에 포스포디에스테르 결합을 통해 결합되어 있다.
링커 Lx1은 직쇄 구조를 갖는 것이 바람직하다. 바람직한 실시형태에서는 링커 Lx1은 하기 식 (VI)으로 나타내어지는 것이면 좋다.
Figure pct00007
상기 식 (II) 중의 링커 Lx2는 카르복실기를 갖는 비뉴클레오티드성 링커이다.
상기 링커 Lx2는 카르복실기를 갖고, 아미드화 반응을 저해하지 않는 한 임의의 구조여도 좋다. 상기 카르복실기는 링커 Lx2의 말단에 존재해도 좋고, 내부에 존재해도 좋지만, 말단에 존재하는 것이 바람직하다.
상기 링커 Lx2로서는, 예를 들면 아미노산 골격을 갖는 비뉴클레오티드성 링커를 들 수 있다. 그와 같은 링커 Lx2는 아미노산으로부터 유도되고, 또한 말단에 카르복실기를 갖는 구조를 포함하는 링커이면 좋다.
본 명세서에 있어서 「아미노산 골격」이란, 분자 중에 아미노기 및 카르복실기를 각각 1개 이상 포함하는 임의의 유기 화합물 또는 그 구조를 말한다. 여기에서 아미노기란, 암모니아, 1급 아민, 또는 2급 아민으로부터 1개 이상의 수소 원자를 제거한 관능기를 말한다. 아미노산 골격을 구성하는 아미노기 및/또는 카르복실기는, 아미드 결합, 에스테르 결합 등의 임의의 화학 결합을 형성하고 있어도 좋다. 아미노산 골격이 유래하는 아미노산은, 예를 들면, 천연 아미노산이라도 좋고, 인공 아미노산이라도 좋다. 또한, 천연 아미노산은 천연에 존재하는 구조의 아미노산 또는 그 광학 이성체를 말한다. 또한, 인공 아미노산은 천연에 존재하지 않는 구조의 아미노산을 말한다. 즉, 인공 아미노산은, 아미노산 즉 아미노기를 포함하는 카르복실산 유도체(분자 중에 아미노기 및 카르복실기를 각각 1개 이상 포함하는 유기 화합물)이며, 천연에 존재하지 않는 구조의 카르복실산 유도체를 말한다. 인공 아미노산은, 예를 들면, 헤테로환을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 아미노산은, 예를 들면 글리신, α-알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파라긴산, 시스테인, 시스틴, 글루타민, 글루타민산, 히스티딘, 이소로이신, 로이신, 리신, 히드록시리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 세린, 트레오닌, 티로신, 발린, 프롤린, 4-히드록시프롤린, 트립토판, β-알라닌, 1-아미노-2-카르복시시클로펜탄, 아미노벤조산, 아미노피리딘카르복실산, 니페코트산, 이소니페코트산, 피페코린산, 3-피롤리딘카르복실산, γ-아미노부티르산, 또는 사르코신이라도 좋고, 또한 치환기 또는 보호기를 갖고 있어도 갖고 있지 않아도 좋다. 치환기로서는 이하에 한정되지 않지만, 예를 들면, 할로겐, 히드록시, 알콕시, 아미노, 카르복시, 술포, 니트로, 카르바모일, 술파모일, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로알킬, 아릴, 아릴알킬, 알킬아릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알킬알킬, 시크릴알킬, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 아미노알킬, 실릴, 실릴옥시알킬, 피롤일, 이미다졸릴 등을 들 수 있다. 보호기는, 예를 들면, 반응성이 높은 관능기를 불활성으로 변환하는 관능기이면 좋고, 공지의 보호기 등을 들 수 있다. 보호기에 대해서는, 예를 들면, 문헌(Protective Groups in Organic Synthesis 제 4판, Greene 등 저, 2007년, John Wiley&Sons, Inc.)의 기재를 원용할 수 있다. 보호기는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, tert-부틸디메틸실릴기, 비스(2-아세톡시에틸옥시)메틸기, 트리이소프로필실릴옥시메틸기, 1- (2-시아노에톡시)에틸기, 2-시아노에톡시메틸기, 2-시아노에틸기, 톨릴술포닐에톡시메틸기, 트리틸기 및 디메톡시트리틸기 등을 들 수 있다. 또한, 아미노산은, 광학 이성체, 기하 이성체, 입체 이성체 등의 이성체가 존재할 경우는 어느 이성체라도 좋다. 이것들은 단일의 이성체라도 좋고 혼합물이라도 좋다.
상기 링커 Lx2의 바람직한 예로서는, 카르복실기를 갖는 피롤리딘 골격 및 피페리딘 골격 중 적어도 일방을 포함하는 비뉴클레오티드성 링커, 또는 -NHCH2COOH를 포함하는 비뉴클레오티드성 링커를 들 수 있다. 일실시형태에서는 상기 링커 Lx2는, 예를 들면, 하기 식 (IV) 또는 하기 식 (IV')로 나타내어지고, 보다 바람직하게는 하기 식 (IV)로 나타내어진다.
Figure pct00008
식 (IV) 및 식 (IV') 중, R2는 탄소수 n의 알킬렌쇄이다. 여기에서, 알킬렌쇄 R2의 탄소 원자 상의 임의의 수소 원자는, 임의의 치환기로 치환되어도 좋고, 치환되어 있지 않아도 좋다. n은 특별히 제한되지 않고, 링커 Lx2의 소망의 길이에 따라 적당히 설정할 수 있지만, 예를 들면, 제조 비용 및 수율 등의 점으로부터는, n은 1~30의 정수가 바람직하고, 보다 바람직하게는 1~20의 정수이며, 더 바람직하게는 1~10의 정수이다.
식 (IV) 중, p는 1 또는 2이며, 바람직하게는 1이다.
식 (IV) 및 식 (IV') 중의 -OR2는 X의 5' 말단에 포스포디에스테르 결합을 통해 결합되어 있다. 즉, 링커 Lx2 중의 -OR2는 X의 5' 말단의 당(리보오스)의 5' 위치에 포스포디에스테르 결합을 통해 결합되어 있다.
여기에서, R1의 m과 R2의 n의 합계는, 예를 들면 2~31의 정수이고, 바람직하게는 2~21의 정수이며, 보다 바람직하게는 2~15의 정수이다.
식 (IV)에서는, 링커 Lx2는 피롤리딘 골격 또는 피페리딘 골격과 같은 환상 구조를 갖고 있다.
바람직한 실시형태에서는, 링커 Lx2는 하기 식 (VII)로 나타내어지는 것이면 좋다.
Figure pct00009
식 (VII)로 나타내어지는 링커는 하기 식 (VII-1) 또는 하기 식 (VII-2)로 나타내어지는 광학 활성체이면 좋다.
Figure pct00010
Figure pct00011
별도의 실시형태에서는 링커 Lx2는, 하기 식 (VII')로 나타내어지는 것이면 좋다.
Figure pct00012
식 (II) 중의 링커 Ly는 비뉴클레오티드성 링커이다. 상기 링커 Ly는 아미드화 반응을 저해하지 않는 한 임의의 구조이면 좋다. 링커 Ly로서는, 아미노산 골격 또는 아미노알콜 골격을 갖는 비뉴클레오티드성 링커를 들 수 있다. 그와 같은 링커 Ly는 아미노산으로부터 유도되는 구조를 포함하는 링커이면 좋다. 이 「아미노산 골격」은 상술한 바와 같다. 단 링커 Ly의 아미노산 골격을 구성하는 아미노기 및/또는 카르복실기는, 아미드 결합, 에스테르 결합 등의 임의의 화학 결합을 형성하고 있어도 좋다.
여기에서 「아미노알콜 골격」은, 분자 중에 아미노기 및 히드록실기를 각각 1개 이상 포함하는 임의의 유기 화합물 또는 그 구조를 말한다. 「아미노기」는 상술한 바와 같다. 링커 Ly의 아미노알콜 골격을 구성하는 아미노기 및/또는 히드록실기는, 아미드 결합, 에스테르 결합, 에테르 결합 등의 임의의 화학 결합을 형성하고 있어도 좋다. 아미노알콜은, 예를 들면 상기 아미노산의 카르복실기를 변환해서 얻어지는 아미노알콜을 들 수 있다. 아미노알콜은, 예를 들면 아미노에탄올, 아미노프로판올, 발리놀, 프롤리놀, 또는 피페리딘메탄올이라도 좋고, 또한 치환기 또는 보호기를 갖고 있어도 갖고 있지 않아도 좋다. 치환기로서는 이하에 한정되지 않지만, 예를 들면, 할로겐, 히드록시, 알콕시, 아미노, 카르복시, 술포, 니트로, 카르바모일, 술파모일, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로알킬, 아릴, 아릴알킬, 알킬아릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알킬알킬, 시크릴알킬, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 아미노알킬, 실릴, 실릴옥시알킬, 피롤일, 이미다졸릴 등을 들 수 있다. 보호기는, 예를 들면 반응성이 높은 관능기를 불활성으로 변환하는 관능기이면 좋고, 공지의 보호기 등을 들 수 있다. 보호기에 대해서는, 예를 들면, 문헌(Protective Groups in Organic Synthesis 제 4판, Green 등 저, 2007년, John Wiley&Sons, Inc.)의 기재를 원용할 수 있다. 보호기는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, tert-부틸디메틸실릴기, 비스(2-아세톡시에틸옥시)메틸기, 트리이소프로필실릴옥시메틸기, 1-(2-시아노에톡시)에틸기, 2-시아노에톡시메틸기, 2-시아노에틸 기, 톨릴술포닐에톡시메틸기, 트리틸기 및 디메톡시트리틸기 등을 들 수 있다. 또한, 아미노알콜은 광학 이성체, 기하 이성체, 입체 이성체 등의 이성체가 존재할 경우는 어느 이성체라도 좋다. 이것들은 단일의 이성체라도 좋고, 혼합물이라도 좋다.
링커 Ly는, 바람직하게는 피롤리딘 골격 및 피페리딘 골격 중 적어도 일방을 포함하는 비뉴클레오티드성 링커, 또는 -NHCH2COO-를 포함하는 비뉴클레오티드성 링커이다. 링커 Ly는 2 이상의 위치에서 치환 가능한 환상 구조를 갖는 것이 보다 바람직하다. 링커 Ly는 n원환(예를 들면 n=5 또는 6)을 1개 또는 2개 이상 갖고 있어도 좋고, 2개 이상의 환을 가질 경우, 그것들은 축합환, 스피로환 또는 비시클로 환 등을 형성하고 있어도 좋다. 링커 Ly는 1개 또는 2개 이상의 치환기를 갖고 있어도 좋다. 링커 Ly는 그 어느 2개의 기(예를 들면, n원환을 구성하는 2개의 원자상의 치환기)를 통해, 상기 Y와 Yc를 연결한다. 본 발명의 방법에 의해 제조되는 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자는, 이와 같은 링커로 센스쇄와 안티센스쇄가 연결되어 있음으로써 뉴클레아제 내성이 우수하다.
일실시형태에서는 링커 Ly는 피롤리딘 골격 및 피페리딘 골격 중 적어도 일방을 포함하는 비뉴클레오티드성 링커이며, 바람직하게는, 피롤리딘 골격 또는 피페리딘 골격을 포함하는 비뉴클레오티드성 링커이다. 상기 피롤리딘 골격은, 예를 들면 피롤리딘의 5원환을 구성하는 탄소 원자가 1개 이상 치환된 피롤리딘 유도체의 골격이어도 좋고, 치환될 경우, 예를 들면 2위치의 탄소 원자(C-2) 이외의 탄소 원자가 치환되어 있는 것이 바람직하다. 상기 탄소 원자는, 예를 들면 질소 원자, 산소 원자 또는 황 원자로 치환되어도 좋다. 상기 피롤리딘 골격은, 예를 들면 피롤리딘의 5원환 내에 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-질소 이중 결합을 포함해도 좋다. 상기 피롤리딘 골격에 있어서, 피롤리딘의 5원환을 구성하는 탄소 원자 및 질소 원자에는, 예를 들면 수소 원자가 결합해도 좋고, 후술하는 치환기가 결합해도 좋다. 링커 Ly는, 예를 들면 상기 피롤리딘 골격 중 어느 하나의 기를 통해, Y와 Yc를 연결해도 좋다. 그것들은 상기 5원환을 구성하는 어느 1개의 탄소 원자와 질소 원자, 바람직하게는, 상기 5원환의 2위치의 탄소 원자(C-2)와 질소 원자를 통해 연결될 수 있다. 상기 피롤리딘 골격으로서는, 예를 들면 프롤린 골격, 프롤리놀 골격 등을 들 수 있다.
일실시형태에서는, 본 발명에 있어서, 식 (I) 및 식 (II) 중, Ly는 피롤리딘 골격 또는 피페리딘 골격을 포함하는 비뉴클레오티드성 링커이며, Lx1은 아미노기를 갖는 비뉴클레오티드성 링커이며, Lx2는 카르복실기를 갖는 피롤리딘 골격 및 피페리딘 골격 중 적어도 일방을 포함하는 비뉴클레오티드성 링커이다.
상기 피페리딘 골격은, 예를 들면 피페리딘의 6원환을 구성하는 탄소 원자가, 1개 이상 치환된 피페리딘 유도체의 골격이어도 좋고, 치환될 경우, 예를 들면 2위치의 탄소 원자(C-2) 이외의 탄소 원자가 치환되어 있는 것이 바람직하다. 상기 탄소 원자는, 예를 들면 질소 원자, 산소 원자 또는 황 원자로 치환되어도 좋다. 상기 피페리딘 골격은, 예를 들면 피페리딘의 6원환 내에, 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-질소 이중 결합을 포함해도 좋다. 상기 피페리딘 골격에 있어서, 피페리딘의 6원환을 구성하는 탄소 원자 및 질소 원자는, 예를 들면 수소 원자가 결합해도 좋고, 후술하는 바와 같은 치환기가 결합해도 좋다. 링커 Ly는, 예를 들면 상기 피페리딘 골격 중 어느 하나의 기를 통해 Y와 Yc를 연결해도 좋다. 그것들은, 상기 6원환을 구성하는 어느 1개의 탄소 원자와 질소 원자, 바람직하게는, 상기 6원환의 2위치의 탄소 원자(C-2)와 질소 원자를 통해 연결될 수 있다.
상기 링커 Ly는, 예를 들면, 하기 식 (VIII)로 나타내어진다.
Figure pct00013
식 (VIII) 중, X1 및 X2는 각각 독립적으로 H2, O, S 또는 NH이며,
Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 단결합, CH2, NH, O 또는 S이며, Z는 환 A 상의 C-3, C-4, C-5 또는 C-6에 결합되는 수소 원자 또는 치환기이며,
L1은 탄소수 r의 알킬렌쇄이며, 여기에서, 알킬렌쇄의 탄소 원자 상의 수소 원자는 OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH 또는 SRa로 치환되어도, 치환되어 있지 않아도 좋고, 또는,
L1은, 상기 알킬렌쇄의 하나 이상의 탄소 원자가 산소 원자로 치환된 폴리에테르쇄이며,
여기에서, Y1이 NH, O 또는 S일 경우, Y1에 결합되는 L1의 원자는 탄소이며, O에 결합되는 L1의 원자는 탄소이며, 산소 원자끼리는 인접하지 않고,
L2는 탄소수 s의 알킬렌쇄이며, 여기에서, 알킬렌쇄의 탄소 원자 상의 수소 원자는 OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH 또는 SRa로 치환되어도, 치환되어 있지 않아도 좋고, 또는,
L2는, 상기 알킬렌쇄의 하나 이상의 탄소 원자가 산소 원자로 치환된 폴리에테르쇄이며,
여기에서, Y2가 NH, O 또는 S일 경우, Y2에 결합되는 L2의 원자는 탄소이며, O에 결합되는 L2의 원자는 탄소이며, 산소 원자끼리는 인접하지 않고,
Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 치환기 또는 보호기이며;
q는 1 또는 2이며,
r은 0~30의 범위의 정수이며,
s는 0~30의 범위의 정수이며,
환 A는, 환 A 상의 C-2 이외의 1개의 탄소 원자가, 질소 원자, 산소 원자, 황 원자로 치환되어도 좋고, 환 A 내에 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-질소 이중 결합을 포함해도 좋다.
Y와 Yc는 식 (VIII) 중의 -O1 또는 -OL2를 통해 링커 Ly와 연결한다. 일실시형태에서는 Y가 -OL1을 통해 Yc가 -OL2를 통해 링커 Ly와 연결해도 좋다. 별도의 실시형태에서는 Y가 -OL2를 통해, Yc가 -OL1을 통해 링커 Ly와 연결해도 좋다.
식 (VIII) 중, X1 및 X2는, 예를 들면 각각 독립적으로, H2, O, S 또는 NH이다. 식 (VIII)에 있어서, X1이 H2이다란, X1이 X1이 결합되는 탄소 원자와 함께 CH2를 형성하는 것을 의미한다. X2에 대해서도 마찬가지이다.
식 (VIII) 중, Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 단결합, CH2, NH, O 또는 S이다.
식 (VIII) 중, 환 A에 있어서, q는 1 또는 2이다. q가 1일 경우, 환 A는 5원환이며, 예를 들면 상기 피롤리딘 골격이다. 상기 피롤리딘 골격은, 예를 들면 프롤린 골격, 프롤리놀 골격 등을 들 수 있고, 이들 2가의 구조를 예시할 수 있다. q가 2일 경우, 환 A는 6원환이며, 예를 들면 상기 피페리딘 골격이다. 환 A는 환 A상의 C-2 이외의 1개의 탄소 원자가, 질소 원자, 산소 원자 또는 황 원자로 치환되어도 좋다. 또한, 환 A는 환 A 내에 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-질소 이중 결합을 포함해도 좋다. 환 A는, 예를 들면, L형 및 D형 중 어느 것이라도 좋다.
식 (VIII) 중, Z는 환 A 상의 C-3, C-4, C-5 또는 C-6에 결합되는 수소 원자 또는 치환기이다. Z가 치환기일 경우, 치환기 Z는 1이라도 복수라도 존재하지 않아도 좋고, 복수일 경우 동일해도 달라도 좋다.
치환기 Z는, 예를 들면, 할로겐, OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH, SRa 또는 옥소기(=O) 등이다.
Ra 및 Rb는, 예를 들면, 각각 독립적으로 치환기 또는 보호기이고, 동일해도 달라도 좋다. 상기 치환기는, 예를 들면 할로겐, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알킬알킬, 시크릴알킬, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 아미노알킬, 헤테로시크릴알케닐, 헤테로시크릴알킬, 헤테로아릴알킬, 실릴, 실릴옥시알킬 등을 들 수 있다. 이하, 마찬가지이다. 치환기 Z는 이들 열거하는 치환기라도 좋다.
상기 보호기는, 예를 들면, 반응성이 높은 관능기를 불활성으로 변환하는 관능기이며, 공지의 보호기 등을 들 수 있다. 상기 보호기에 대해서는, 예를 들면, 문헌(Protective Groups in Organic Synthesis 제 4판, Greene 등 저, 2007년, John Wiley&Sons, Inc.)의 기재를 원용할 수 있다. 상기 보호기는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 tert-부틸디메틸실릴기(이하, TBDMS기), 비스(2-아세톡시에틸옥시)메틸기(이하, ACE기), 트리이소프로필실릴옥시메틸기(이하, TOM기), 1-(2-시아노에톡시)에틸기(이하, CEE기), 2-시아노에톡시메틸기(이하, CEM기), 2-시아노에틸 기(이하, CE기), 톨릴술포닐에톡시메틸기(이하, TEM기), 트리틸기(이하, Tr기) 및 디메톡시트리틸기(이하, DMTr기) 등을 들 수 있다. Z가 ORa일 경우, 상기 보호기는, 예를 들면 TBDMS기, ACE기, TOM기, CEE기, CEM기 및 TEM기 등을 들 수 있다. 이 외에도 실릴 함유기도 들 수 있다. 이하, 마찬가지이다.
식 (VIII) 중, L1은 탄소수 r의 알킬렌쇄이다. 상기 알킬렌탄소 원자 상의 수소 원자는, 예를 들면, OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH 또는 SRa로 치환되어도 좋고, 치환되어 있지 않아도 좋다. 또는, L1은 상기 알킬렌쇄의 1개 이상의 탄소 원자가 산소 원자로 치환된 폴리에테르쇄여도 좋다. 상기 폴리에테르쇄는, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜이다. 또한, Y1이 NH, O 또는 S일 경우, Y1에 결합되는 L1의 원자는 탄소이며, O에 결합되는 L1의 원자는 탄소이며, 산소 원자끼리는 인접하지 않는다.
식 (VIII) 중, L2는 탄소수 s의 알킬렌쇄이다. 상기 알킬렌쇄의 탄소 원자 상의 수소 원자는, 예를 들면, OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH 또는 SRa로 치환되어도 좋고, 치환되어 있지 않아도 좋다. 또는, L2는 상기 알킬렌쇄의 1개 이상의 탄소 원자가 산소 원자로 치환된 폴리에테르쇄여도 좋다. 또한, Y2가 NH, O 또는 S일 경우, Y2에 결합되는 L2의 원자는 탄소이며, O에 결합되는 L2의 원자는 탄소이며, 산소 원자끼리는 인접하지 않는다.
L1의 r 및 L2의 s는 특별히 제한되지 않고, 각각, 하한은, 예를 들면 0이며, 상한도 특별히 제한되지 않는다. r 및 s는, 예를 들면, 링커 Ly의 소망의 길이에 따라 적당히 설정할 수 있다. r 및 s는, 예를 들면 제조 비용 및 수율 등의 점으로부터, 각각 독립적으로 0~30의 정수가 바람직하고, 보다 바람직하게는 0~20의 정수이며, 더 바람직하게는 0~15의 정수이다. r 및 s는 동일해도 좋고, 달라도 좋다.
Ra 및 Rb는 상술과 마찬가지이다.
식 (VIII) 중, 수소 원자는, 예를 들면, 각각 독립적으로 Cl, Br, F 및 I 등의 할로겐으로 치환되어도 좋다.
바람직한 실시형태에서는, 상기 링커 Ly는 하기 식 (VIII-1)~(VIII-9) 중 어느 하나로 나타내어지는 것이면 좋다. 하기 식 (VIII-1)~(VIII-9)에 있어서, t는 0~10의 정수이며, r 및 s는 상기 식 (VIII)과 동일하다. 구체예로서는, 식 (VIII-1)에 있어서 r=8, 식 (VIII-2)에 있어서 r=3, 식 (VIII-3)에 있어서 r=4 또는 8, 식 (VIII-4)에 있어서 r=7 또는 8, 식 (VIII-5)에 있어서 r=3 및 s=4, 식 (VIII-6)에 있어서 r=8 및 s=4, 식 (VIII-7)에 있어서 r=8 및 s=4, 식 (VIII-8)에 있어서 r=5 및 s=4, 식 (VIII-9)에 있어서 t=1 및 s=4를 들 수 있다.
Figure pct00014
일실시형태에서는, 상기 링커 Ly는 하기 식 (V) 또는 하기 식 (IX)로 나타내어지는 것이면 좋다.
Figure pct00015
Figure pct00016
식 (V)로 나타내어지는 링커는, 하기 식 (V-1) 또는 하기 식 (V-2)로 나타내어지는 광학 활성체이면 좋다.
Figure pct00017
Figure pct00018
별도의 실시형태에서는, 링커 Ly는 -NHCH2COO-를 포함하는 비뉴클레오티드성 링커이며, 그와 같은 링커는, 예를 들면 하기 식 (XXI)로 나타내어진다. 이 링커 Ly는 기본적으로 상기 식 (VIII)로 나타내어지는 링커 Ly와 대응하고 있고, 상기 식 (VIII)로 나타내어지는 링커에 대한 설명은 하기 식 (XXI)로 나타내어지는 링커에도 원용된다.
Figure pct00019
식 (XXI) 중, X1 및 X2는, 각각 독립적으로, H2, O, S 또는 NH이며,
Y1 및 Y2는, 각각 독립적으로, 단결합, CH2, NH, O 또는 S이며, L1은 탄소수 r의 알킬렌쇄이며, 여기에서, 알킬렌쇄의 탄소 원자 상의 수소 원자는 OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH 또는 SRa로 치환되어도, 치환되어 있지 않아도 좋고, 또는,
L1은, 상기 알킬렌쇄의 1개 이상의 탄소 원자가 산소 원자로 치환된 폴리에테르쇄이며,
여기에서, Y1이 NH, O 또는 S일 경우, Y1에 결합되는 L1의 원자는 탄소이며, O에 결합되는 L1의 원자는 탄소이며, 산소 원자끼리는 인접하지 않고, L2는 탄소수 s의 알킬렌쇄이며, 여기에서, 알킬렌쇄의 탄소 원자 상의 수소 원자는 OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH 또는 SRa로 치환되어도, 치환되어 있지 않아도 좋고, 또는,
L2는, 상기 알킬렌쇄의 하나 이상의 탄소 원자가 산소 원자로 치환된 폴리에테르쇄이며,
여기에서, Y2가 NH, O 또는 S일 경우, Y2에 결합되는 L2의 원자는 탄소이며, O에 결합되는 L2의 원자는 탄소이며, 산소 원자끼리는 인접하지 않고,
Ra 및 Rb는, 각각 독립적으로, 치환기 또는 보호기이며;
r은 0~30의 범위의 정수이며,
s는 0~30의 범위의 정수이다.
Y와 Yc는 식 (XXI) 중의 -OL1 또는 -OL2를 통해 링커 Ly와 연결한다. 일실시형태에서는, Y가 -OL1을 통해서, Yc가 -OL2를 통해서 링커 Ly와 연결해도 좋다. 별도의 실시형태에서는, Y가 -OL2를 통해서, Yc가 -OL1을 통해서 링커 Ly와 연결해도 좋다.
식 (XXI) 중, X1 및 X2는, 예를 들면 각각 독립적으로, H2, O, S 또는 NH이다. 식 (XXI)에 있어서 X1이 H2이다란, X1이 X1이 결합되는 탄소 원자와 함께, CH2를 형성하는 것을 의미한다. X2에 대해서도 마찬가지이다.
식 (XXI) 중, Y1 및 Y2는, 각각 독립적으로, 단결합, CH2, NH, O 또는 S이다.
Ra 및 Rb는, 예를 들면, 각각 독립적으로 치환기 또는 보호기이며, 동일해도 달라도 좋다. 상기 치환기는, 예를 들면 할로겐, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알킬알킬, 시크릴알킬, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 아미노알킬, 헤테로시크릴알케닐, 헤테로시크릴알킬, 헤테로아릴알킬, 실릴, 실릴옥시알킬 등을 들 수 있다. 이하, 마찬가지이다.
상기 보호기는, 예를 들면, 반응성이 높은 관능기를 불활성으로 변환하는 관능기이며, 공지의 보호기 등을 들 수 있다. 상기 보호기에 대해서는, 예를 들면 문헌(Protective Groups in Organic Synthesis 제 4판, Greene 등 저, 2007년, John Wiley&Sons, Inc.)의 기재를 원용할 수 있다. 상기 보호기는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 TBDMS기, ACE기, TOM기, CEE기, CEM기, CE기, TEM기, Tr기 및, DMTr기 등을 들 수 있다. 이하, 마찬가지이다.
식 (XXI) 중, L1은 탄소수 r의 알킬렌쇄이다. 상기 알킬렌탄소 원자 상의 수소 원자는, 예를 들면 OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH 또는 SRa로 치환되어도 좋고, 치환되어 있지 않아도 좋다. 또는, L1은, 상기 알킬렌쇄의 1개 이상의 탄소 원자가 산소 원자로 치환된 폴리에테르쇄여도 좋다. 상기 폴리에테르쇄는, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜이다. 또한, Y1이 NH, O 또는 S일 경우, Y1에 결합되는 L1의 원자는 탄소이며, O에 결합되는 L1의 원자는 탄소이며, 산소 원자끼리는 인접하지 않는다.
식 (XXI) 중, L2는 탄소수 s의 알킬렌쇄이다. 상기 알킬렌쇄의 탄소 원자 상의 수소 원자는, 예를 들면 OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, SH 또는 SRa로 치환되어도 좋고, 치환되어 있지 않아도 좋다. 또는, L2는, 상기 알킬렌쇄의 1개 이상의 탄소 원자가 산소 원자로 치환된 폴리에테르쇄여도 좋다. 또한, Y2가 NH, O 또는 S일 경우, Y2에 결합되는 L2의 원자는 탄소이며, O에 결합되는 L2의 원자는 탄소이며, 산소 원자끼리는 인접하지 않는다.
L1의 r 및 L2의 s는 특별히 제한되지 않고, 각각, 하한은, 예를 들면 0이며, 상한도 특별히 제한되지 않는다. r 및 s는, 예를 들면 링커 Ly의 소망의 길이에 따라 적당히 설정할 수 있다. r 및 s는, 예를 들면 제조 비용 및 수율 등의 점으로부터, 각각 독립적으로, 0~30의 정수가 바람직하고, 보다 바람직하게는 0~20의 정수이며, 더 바람직하게는 0~15의 정수이다. r 및 s는 동일해도 좋고, 달라도 좋다.
Ra 및 Rb는 상술과 마찬가지이다.
식 (XXI) 중, 수소 원자는, 예를 들면, 각각 독립적으로, Cl, Br, F 및 I 등의 할로겐으로 치환되어도 좋다.
바람직한 실시형태에서는, 상기 링커 Ly는 하기 식 (XXII)로 나타내어지는 것이면 좋다.
Figure pct00020
제 1 및 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자는, 당업자가 공지의 RNA 합성법을 이용하여 제작할 수 있다. 당업자에게 공지의 RNA 합성법으로서는, 예를 들면, 포스포아미다이트법이나 H-포스포네이트법 등을 들 수 있다. 포스포아미다이트법에서는, 담체의 소수성기에 결합한 리보뉴클레오시드를 RNA 아미다이트(리보뉴클레오시드포스포아미다이트)와의 축합 반응에 의해 신장하고, 산화와 탈보호를 거쳐, RNA 아미다이트와의 축합 반응을 되풀이 행함으로써 RNA 합성을 행할 수 있다.
식 (I)로 나타내어지는 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자는, 일반적인 RNA 합성법, 예를 들면 포스포아미다이트법에 의해 제작할 수 있다. 일실시형태에서는 미리 링커 Lx1의 구조에 상당하는 아미노알콜이 아미노기를 통해 결합된 고상 담체(예를 들면, 후술하는 3'-PT Amino-Modifier C4 CPG; Link Technologies)를 사용하고, 상법대로 3' 말단측으로부터 Xc를 고상 합성함으로써 제작할 수 있다. 합성에는 임의의 RNA 아미다이트를 사용할 수 있고, 예를 들면 2'위치의 수산기에 TBDMS기, TOM기, ACE기, CEE기, CEM기, TEM기, DMTr기 등의 다양한 보호기를 갖는 범용형 RNA 아미다이트도 사용할 수 있다. 또한 고상 담체로서는, 폴리스티렌계 담체, 아크릴아미드계 담체, 또는 유리 담체 등의 임의의 고상 담체를 사용할 수 있다. 담체는 비드, 플레이트, 칩, 튜브 등의 임의의 형태이면 좋다. 아미노알콜이 결합된 담체의 예로서, 예를 들면, 3'-PT Amino-Modifier C3 CPG, 또는 C7 CPG(Link Technologies) 등을 들 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다.
식 (II)로 나타내어지는 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자도 마찬가지로, 일반적인 RNA 합성법, 예를 들면 포스포아미다이트법에 의해 제작할 수 있다. 일실시형태에서는, 고상 담체 상에, 상법대로 3' 말단측으로부터 Yc를 고상 합성한 후, Yc의 5' 말단에 링커 Ly를 연결한다. 이어서 그 말단으로부터 고상 합성을 더 행하고, X의 5' 말단에 링커 Lx2를 연결함으로써, 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자를 제작할 수 있다. 합성에는 임의의 RNA 아미다이트를 사용할 수 있고, 예를 들면, 2'위치의 수산기에 TBDMS기, TOM기, ACE기, CEE기, CEM기, TEM기, DMTr기 등의 다양한 보호기를 갖는 범용형 RNA 아미다이트도 사용할 수 있다. 또한 고상 담체로서는, 폴리스티렌계 담체, 아크릴아미드계 담체, 또는 유리 담체 등의 임의의 고상 담체를 사용할 수 있다. 담체는 비드, 플레이트, 칩, 튜브 등의 임의의 형태이면 좋다. 담체의 예로서, 예를 들면 NittoPhase(R) HL rG(ibu), 또는 rU(KINOVATE) 등을 들 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다.
X의 5' 말단에의 링커 Lx2의 연결에는 그것에 적합한 임의의 RNA 합성용 모노머를 사용할 수 있고, 예를 들면, 하기 식 (X)으로 나타내어지는 RNA 합성용의 모노머를 사용할 수 있다. 이 모노머는 기본적으로 상기 식 (IV)로 나타내어지는 링커와 대응하고 있고, 상기 식 (IV)로 나타내어지는 링커에 대한 설명은 하기 식 (X)으로 나타내어지는 모노머에도 원용된다. 하기 식 (X)으로 나타내어지는 모노머는, 예를 들면, 자동 핵산 합성용의 아미다이트로서 사용할 수 있고, 예를 들면 일반적인 핵산 자동 합성 장치에 적용 가능하다. 본 발명은 하기 식 (X)으로 나타내어지는 RNA 합성용의 모노머(아미다이트)도 제공한다.
Figure pct00021
식 (X)에 있어서, 상기 식 (IV)와 동일 개소에 대해서는 식 (IV)의 설명을 원용할 수 있다. 구체적으로는, 식 (X) 중, R2는 탄소수 n의 알킬렌쇄이다. 여기에서, 알킬렌쇄 R2의 탄소 원자 상의 임의의 수소 원자는, 임의의 치환기로 치환되어도 좋고, 치환되어 있지 않아도 좋다. n은 특별히 제한되지 않고, 링커 Lx2의 소망의 길이에 따라 적당히 설정할 수 있지만, 예를 들면, 제조 비용 및 수율 등의 점으로부터는, n은 1~30의 정수가 바람직하고, 보다 바람직하게는 1~20의 정수이며, 더 바람직하게는 1~15의 정수이다. 식 (X) 중, p는 1 또는 2이며, 바람직하게는 1이다. 식 (X) 중, R3은 카르복실산 보호기이다. 카르복실산 보호기에 대해서는, 예를 들면, 문헌(Protective Groups in Organic Synthesis 제 4판, Greene 등 저, 2007년, John Wiley&Sons, Inc.)의 기재를 원용할 수 있다. 카르복실산 보호기의 구체예로서, 예를 들면 DMTr기, Tr기, TBDMS기, ACE기, TOM기, CEE기, CEM기, CE기, TEM기 및 2,4-디메톡시벤질기를 들 수 있지만, CE기 또는 2,4-디메톡시벤질기가 바람직하다.
R4는 전자 흡인기로 치환된 알킬기이며, 구체적으로는, 예를 들면 2-시아노에틸기(CE기), 니트로페닐에틸기 등을 들 수 있지만, 2-시아노에틸기(CE기)가 바람직하다.
R5 및 R6은, 각각 독립적으로 알킬기이며, 동일해도 달라도 좋다. -NR5R6은, 구체적으로는, 예를 들면 디이소프로필아미노기, 디에틸아미노기, 에틸메틸아미노기 등을 들 수 있지만, 디이소프로필아미노기가 바람직하다.
바람직한 실시형태에서는, 식 (X)으로 나타내어지는 모노머는 하기 식 (XI)또는 하기 식 (XVIII)로 나타내어지는 것이면 좋다.
Figure pct00022
Figure pct00023
식 (XI)로 나타내어지는 모노머는, 하기 식 (XI-1) 또는 하기 식 (XI-2)로 나타내어지는 광학 활성체이면 좋다.
Figure pct00024
Figure pct00025
식 (XVIII)로 나타내어지는 모노머는, 하기 식 (XVIII-1) 또는 하기 식 (XVIII-2)로 나타내어지는 광학 활성체이면 좋다.
Figure pct00026
Figure pct00027
이하에, 식 (X)으로 나타내어지는 모노머의 합성법의 예를 설명하지만, 합성에 사용하는 출발 물질과 시약은, 시판품을 그대로 이용해도 좋고, 공지의 방법에 의해 합성해도 좋다.
식 (X)으로 나타내어지는 모노머는, 예를 들면, 이하의 스킴 1에 나타내는 바와 같이, 식 (XII)로 나타내어지는 알콜 유도체의, 식 (XIII)으로 나타내어지는 인산화 시약에 의한 인산화 반응으로 합성할 수 있다.
Figure pct00028
[식 중, X는 할로겐 또는 NR5R6이며, R2, R3, R4, R5, R6, p는 상술의 정의와 동일.]
식 (XIII)으로 나타내어지는 인산화 시약의 구체예로서는, 예를 들면 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포아미다이트, 니트로페닐에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포아미다이트, 메틸-N,N-디이소프로필클로로포스포아미다이트 또는 2-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포디아미다이트 등을 들 수 있다.
식 (XIII)으로 나타내어지는 인산화 시약의 당량은, 식 (XII)로 나타내어지는 알콜 유도체에 대하여 1~10당량이 바람직하고, 1.1~1.5당량이 보다 바람직하다.
인산화 반응에 사용하는 활성화제로서는, 테트라졸 또는 디이소프로필아민테트라졸염 등을 들 수 있지만, 디이소프로필아민테트라졸염이 바람직하다.
상기 활성화제의 당량은, 식 (XII)로 나타내어지는 알콜 유도체에 대하여 1~10당량이 바람직하고, 1.1~1.5당량이 보다 바람직하다.
인산화 반응에 사용하는 용매는, 테트라히드로푸란, 디클로로메탄, 클로로포름, 디에틸에테르 또는 아세토니트릴 등을 들 수 있지만, 아세토니트릴이 바람직하다.
인산화 반응의 반응 온도는 20~50℃가 바람직하고, 20~30℃가 보다 바람직하다. 또한, 인산화 반응의 반응 시간은 1~48시간이 바람직하고, 2~5시간이 보다 바람직하다.
식 (XII)로 나타내어지는 알콜 유도체는, 예를 들면, 이하의 스킴 2에 나타내는 바와 같이, 식 (XIV)로 나타내어지는 아민 유도체와 식 (XV)로 나타내어지는 카르복실산 유도체의 축합 반응에 의해 합성할 수 있다.
Figure pct00029
[식 중, R2, R3, p는 상술의 정의와 동일.]
축합 반응에 사용하는, 식 (XV)로 나타내어지는 카르복실산 유도체의 당량은, 식 (XIV)로 나타내어지는 아민 유도체에 대하여 1~3당량이 바람직하고, 1.1~1.5당량이 보다 바람직하다.
축합 반응에 사용하는 축합제로서는, 예를 들면 시클로헥실카르보디이미드, N-(3'-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 염산염, 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스디메틸아미노포스포늄염, O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N'N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트 또는 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N'N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트 등을 들 수 있지만, N-(3'-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 염산염이 바람직하다.
상기 축합제의 당량은, 식 (XV)로 나타내어지는 카르복실산 유도체에 대하여 1~10당량이 바람직하고, 1.1~1.5당량이 보다 바람직하다.
축합 반응에 사용하는 염기로서는, 예를 들면 디이소프로필에틸아민, 트리에틸아민, 피리딘 또는 N-메틸모르폴린 등의 유기 염기 또는 탄산 칼륨, 탄산 나트륨 또는 탄산 수소나트륨 등의 유기산염을 들 수 있지만, 디이소프로필에틸아민 또는 트리에틸아민이 바람직하다.
상기 염기의 당량은 식 (XV)로 나타내어지는 카르복실산 유도체에 대하여 0~10당량이 바람직하고, 1~3당량이 보다 바람직하다.
축합 반응에 사용하는 용매로서는, 예를 들면 N,N-디메틸포름아미드, 테트라히드로푸란, 디클로로메탄, 클로로포름 또는 디에틸에테르 등을 들 수 있지만, 디클로로메탄이 바람직하다.
축합 반응의 반응 온도는 0~50℃가 바람직하고, 0~30℃가 보다 바람직하다. 또한, 축합 반응의 반응 시간은 1~48시간이 바람직하고, 2~5시간이 보다 바람직하다.
식 (XIV)로 나타내어지는 아민 유도체는, 예를 들면 이하의 스킴 3에 나타내는 바와 같이, 식 (XVI)로 나타내어지는 아미노산 유도체의 카르복실산에의 보호기도입 반응과, 얻어진 식 (XVII)로 나타내어지는 아미노산 유도체의 탈Boc화 반응 또는 스킴 4에 나타내는 바와 같이, 식 (XIX)로 나타내어지는 아미노산 유도체의 카르복실산으로의 보호기 도입 반응과, 얻어진 식 (XX)으로 나타내어지는 아미노산 유도체의 탈Fmoc화 반응에 의해 합성할 수 있다.
Figure pct00030
[식 중, R3, p는 상술의 정의와 동일.]
Figure pct00031
[식 중, R3, p는 상술의 정의와 동일.]
상기 카르복실산으로의 보호기 도입 반응은, 예를 들면, 문헌(Protective Groups in Organic Synthesis 제 4판, Greene 등 저, 2007년, John Wiley&Sons, Inc.) 등에 기재된 공지의 방법으로 실시할 수 있다.
탈Boc화 반응이나 탈Fmoc화 반응은, 예를 들면, 문헌(Protective Groups in Organic Synthesis 제 4판, Greene 등 저, 2007년, John Wiley&Sons, Inc.) 등에 기재된 공지의 방법에 의해 행할 수 있다.
식 (XVI)이나 식 (XIX)로 나타내어지는 아미노산 유도체는, 구입할 수 있거나 또는 공지의 방법 또는 그것에 준한 방법으로 제조할 수 있다.
별도의 실시형태에서는, X의 5' 말단에의 링커 Lx2의 연결에 하기 식 (X')로 나타내어지는 RNA 합성용의 모노머도 사용할 수 있다. 이 모노머는 기본적으로 상기 식 (IV')로 나타내어지는 링커와 대응하고 있고, 상기 식 (IV')로 나타내어지는 링커에 대한 설명은 하기 식 (X')로 나타내어지는 모노머에도 원용된다. 본 발명은 하기 식 (X')로 나타내어지는 RNA 합성용의 모노머(아미다이트)도 제공한다.
Figure pct00032
식 (X')에 있어서, 상기 식 (IV')와 동일 개소에 대해서는 식 (IV')의 설명을 원용할 수 있다. 구체적으로는, 식 (X') 중, R2는 탄소수 n의 알킬렌쇄이다. 여기에서, 알킬렌쇄 R2의 탄소 원자 상의 임의의 수소 원자는 임의의 치환기로 치환되어도 좋고, 치환되어 있지 않아도 좋다. n은 특별히 제한되지 않고, 링커 Lx2의 소망의 길이에 따라 적당히 설정할 수 있지만, 예를 들면, 제조 비용 및 수율 등의 점으로부터는, n은 1~30의 정수가 바람직하고, 보다 바람직하게는 1~20의 정수이며, 더 바람직하게는 1~15의 정수이다. 식 (X') 중, R3은 카르복실산 보호기이다. 카르복실산 보호기에 대해서는, 예를 들면, 문헌(Protective Groups in Organic Synthesis 제 4판, Greene 등 저, 2007년, John Wiley&Sons, Inc.)의 기재를 원용할 수 있다. 카르복실산 보호기의 구체예로서, 예를 들면, DMTr기, Tr기, TBDMS기, ACE기, TOM기, CEE기, CEM기, CE기, TEM기 및 2,4-디메톡시벤질기를 들 수 있지만, CE기가 바람직하다.
R4는 전자 흡인기로 치환된 알킬기이며, 구체적으로는, 예를 들면 2-시아노에틸기(CE기), 니트로페닐에틸기 등을 들 수 있지만, 2-시아노에틸기(CE기)가 바람직하다.
R5 및 R6은 각각 독립적으로 알킬기이며, 동일해도 달라도 좋다. -NR5R6은, 구체적으로는, 예를 들면 디이소프로필아미노기, 디에틸아미노기, 에틸메틸아미노기 등을 들 수 있지만, 디이소프로필아미노기가 바람직하다.
바람직한 실시형태에서는, 식 (X')로 나타내어지는 모노머는, 하기 식 (XXIII)으로 나타내어지는 것이면 좋다.
Figure pct00033
식 (X')로 나타내어지는 모노머는, 예를 들면, 식 (XVI)으로 나타내어지는 아미노 유도체 대신에, 식 (XVI')로 나타내어지는 아미노산 유도체를 사용하여, 상기 스킴 1~3과 마찬가지의 방법에 의해 제조할 수 있다.
Figure pct00034
식 (XVI')로 나타내어지는 아미노산 유도체는, 구입할 수 있거나 또는 공지의 방법 또는 그것에 준한 방법으로 제조할 수 있다.
또한 Yc의 5' 말단에의 상기 링커 Ly의 연결에는, 그것에 적합한 임의의 RNA 합성용 모노머, 예를 들면, 문헌(일본국 특허 제 5261677호 명세서 또는 일본국 특허 제 5876890호 명세서)에 기재되어 있는 공지의 RNA 합성용 모노머를 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 제조되는 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자에 있어서, X-Y는, 표적 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열을 포함한다. 유전자 발현 억제 서열은, X만 또는 Y에만 포함되어 있어도 좋다. 유전자 발현 억제 서열은, 바람직하게는, 표적 유전자로부터 전사되는 mRNA의 전체 또는 일부의 센스 서열 또는 안티센스 서열이다.
상기 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자는, 유전자 발현 억제 서열을 1개 포함해도 좋고, 2개 이상 포함해도 좋다. 상기 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자는, 예를 들면, 동일 표적 유전자에 대한 동일 발현 억제 서열을 2개 이상 가져도 좋고, 동일 표적에 대한 다른 발현 억제 서열을 2개 이상 가져도 좋고, 다른 표적 유전자에 대한 다른 발현 억제 서열을 2개 이상 가져도 좋다. 다른 표적 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열을 2개 이상 갖는 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자는, 2종류 이상의 다른 표적 유전자의 발현 억제에 유용하다. 본 발명에 있어서 「유전자」란, mRNA에 전사되는 게놈 영역을 가리키고, 단백질 코드 영역이면 좋지만, RNA 코드 영역이라도 좋다.
본 발명에 따른 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자는, 유전자 발현 억제 서열을 통해 표적 유전자의 발현을 억제하는 능력을 갖는다. 본 발명에 따른 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자에 의한 표적 유전자의 발현 억제는, RNA 간섭에 의한 것이 바람직하지만, 그것에 한정되지 않는다. RNA 간섭은, 일반적으로, 긴 이중쇄 RNA(dsRNA)가 세포 내에 있어서, Dicer에 의해, 3' 말단이 돌출된 19~21염기대 정도의 짧은 이중쇄 RNA(siRNA: small interfering RNA)로 절단되고, 그 한편의 단일쇄 RNA가 표적 mRNA에 결합해서, 표적 mRNA를 분해함으로써 표적 mRNA의 번역을 억제하고, 그것에 의해 표적 mRNA가 유래하는 표적 유전자의 발현을 억제하는 현상이다. 표적 mRNA에 결합되는 siRNA에 포함되는 단일쇄 RNA의 서열은, 예를 들면 표적 유전자의 종류 에 따라 다양한 종류가 보고되어 있다. 본 발명은, 예를 들면, siRNA에 포함되는 단일쇄 RNA의 서열을 유전자 발현 억제 서열로서 사용할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 제조되는 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자는, in vivo에서 절단되어 siRNA를 생성함으로써 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 본 발명에 따른 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자는, 표적 유전자의 발현 또는 발현 증가와 관련되는 질환 또는 장해의 치료 또는 예방을 위해 사용할 수 있다.
유전자 발현 억제 서열은 바람직하게는 19~30염기 길이이며, 보다 바람직하게는 19~27염기 길이이며, 예를 들면 19, 20, 21, 22, 또는 23염기 길이이면 좋다. 유전자 발현 억제 서열은, 표적 유전자의 mRNA의 적어도 일부의 서열과 완전히 동일 또는 완전히 상보적인 RNA 서열로 이루어지는 것이 바람직하다.
표적 유전자로서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, TGF-β1 유전자, GAPDH 유전자, LAMA1 유전자, LMNA 유전자를 들 수 있다. 표적 유전자가 TGF-β1 유전자일 경우, 본 발명의 방법에 의해 제조되는 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자는, in vivo에서 TGF-β1 유전자의 발현을 억제한다. 그와 같은 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자는, TGF-β1 유전자의 유전자 발현 억제를 통해서, TGF-β1 유전자의 발현 또는 발현 증가와 관련되는 질환 또는 장해, 예를 들면 폐선유증이나 급성 폐질환의 치료 또는 예방을 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 제조되는 유전자 발현 억제 서열을 포함하는 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자의 1개의 예는, 서열번호 1로 나타내어지는 염기서열을 갖고, 서열번호 2로 나타내어지는 염기서열을 갖는 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자(스트랜드 A)와 서열번호 3으로 나타내어지는 염기서열을 갖는 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자(스트랜드 B)의 조합에 의해 얻어진다. 서열번호 1로 나타내어지는 염기서열은, 표적 유전자인 TGF-β1 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열을 포함한다. 서열번호 1로 나타내어지는 염기서열의 29위치~47위치의 서열이 유전자 발현 억제 서열(활성 서열)에 상당한다(도 2).
또한, 별도의 예로서는 서열번호 4로 나타내어지는 염기서열을 갖고, 서열번호 5로 나타내어지는 염기서열을 갖는 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자(스트랜드 C)와 서열번호 6으로 나타내어지는 염기서열을 갖는 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자(스트랜드 D)의 조합에 의해 얻어진다. 서열번호 4로 나타내어지는 염기서열은, 표적 유전자인 GAPDH 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열을 포함한다. 서열번호 4로 나타내어지는 염기서열의 27위치~45위치의 서열이 유전자 발현 억제 서열(활성 서열)에 상당한다.
본 발명에서는, 상기 식 (I)로 나타내어지는 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와, 상기 식 (II)로 나타내어지는 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자를, 반응 용매 중에서, 탈수 축합제(축합제라고도 칭해진다.)의 존재 하 반응시켜, 링커 Lx1과 링커 Lx2 사이에 아미드 결합을 형성함으로써, 상기 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자를 제조할 수 있다. 반응 용매는 완충액과 친수성 유기 용매를 포함하는 혼합 용매이다.
상기 완충액으로서는, 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 완충액(이하, MES 완충액), 3-(N-모르폴리노)-2-히드록시프로판술폰산 완충액(이하, MOPSO 완충액), 피페라진-1,4-비스(2-에탄술폰산) 완충액(이하, PIPES 완충액), 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산 완충액(이하, MOPS 완충액), N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산 완충액(이하, BES 완충액), 3-[N,N-비스(2-히드록시에틸)아미노]-2-히드록시프로판술폰산 완충액(이하, DIPSO 완충액), 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산 완충액(이하, HEPES 완충액), 피페라진-1,4-비스(2-히드록시프로판술폰산) 완충액(이하, POPSO 완충액), 4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-(2-히드록시프로판-3-술폰산 완충액(이하, HEPPSO 완충액), 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진프로판 술폰산 완충액(이하, HEPPS 완충액) 등을 들 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다. MES 완충액 또는 MOPS 완충액 등이 바람직하게 사용된다.
완충액의 pH는 적당히 조정할 수 있지만, 6.5~7.5인 것이 바람직하고, 6.9~7.5인 것이 보다 바람직하고, 예를 들면 6.5~7.0, 6.9~7.1, 또는 7.0~7.5이다.
본 발명에서는, 상기 반응 용매의 성분으로서 친수성 유기 용매를 사용할 수 있다. 친수성 유기 용매는, 예를 들면, 친수성의 비프로톤성 유기 용매라도 좋다.
친수성 유기 용매란, 물과 자유로운 비율로 혼화할 수 있는 유기 용매를 의미하고, 술포란 등의 술폰계 용매, 디메틸술폭시드 등의 술폭시드계 용매, N,N-디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈 등의 아미드계 용매, N,N'-디메틸에틸렌우레아 등의 우레아계 용매, 아세토니트릴 등의 니트릴계 용매, 테트라히드로푸란, 1,2-디메톡시에탄 등의 에테르계 용매, 에탄올, tert-부틸알콜 등의 알콜계 용매를 들 수 있다. 또한, 「비프로톤성」유기 용매란, 프로톤 공여성을 가지지 않는 유기 용매를 의미하고, 친수성의 비프로톤성 유기 용매로서는, 술포란 등의 술폰계 용매, 디메틸술폭시드 등의 술폭시드계 용매, N,N-디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈 등의 아미드계 용매, N,N'-디메틸에틸렌우레아 등의 우레아계 용매, 아세토니트릴 등의 니트릴계 용매, 테트라히드로푸란, 1,2-디메톡시에탄 등의 에테르계 용매를 들 수 있지만, 디메틸술폭시드(이하, DMSO), N,N-디메틸포름아미드(이하, DMF), N,N'-디메틸에틸렌우레아(이하, DMEU), 또는 아세토니트릴이 바람직하고, DMSO 또는 DMF가 보다 바람직하다.
또한, 탈수 축합제나 N-히드록시 함질소 방향족 화합물(예를 들면 히드록시벤조트리아졸 또는 그 유도체), 시아노(히드록시이미노)아세트산 에스테르, 또는 N-탄화수소 치환 이미다졸 유도체를 유기 용매에 용해 또는 현탁해서 첨가할 경우, 그 유기 용매는 혼합 용매 중의 「유기 용매」에 포함하는 것으로 한다. 유기 용매는 1종류를 사용해도 좋고, 2종류 이상을 조합시켜서 사용할 수도 있다.
일실시형태에서는 반응 용매인 혼합 용매 중의 유기 용매의 비율은, 용매 전체량(완충액과 유기 용매를 포함하는 혼합 용매의 전량)의, 15~70체적%(v/v%)이면 좋고, 예를 들면 20~70체적%, 20~65체적%, 35~60체적%, 35~55체적%, 또는 50~55체적%이면 좋다. 본 발명에 있어서, 탈수 축합제나 N-히드록시 함질소 방향족 화합물(예를 들면 히드록시벤조트리아졸 또는 그 유도체)이나 시아노(히드록시이미노)아세트산 에스테르나 N-탄화수소 치환 이미다졸 유도체를, 물, 완충액 또는 유기 용매 등의 용액에 용해 또는 현탁해서 첨가할 경우, 용매 전체량은 탈수 축합제나 N-히드록시 함질소 방향족 화합물(예를 들면 히드록시벤조트리아졸 또는 그 유도체)이나 시아노(히드록시이미노)아세트산 에스테르나 N-탄화수소 치환 이미다졸 유도체를 포함하는 용액의 양을 포함한다. 또한 혼합 용매 중의 유기 용매의 비율의 산출에 있어서, 탈수 축합제나 N-히드록시 함질소 방향족 화합물(예를 들면 히드록시벤조트리아졸 또는 그 유도체), 시아노(히드록시이미노)아세트산 에스테르, 또는 N-탄화수소 치환 이미다졸 유도체를 유기 용매에 용해 또는 현탁해서 첨가할 경우, 그 유기 용매의 양은 혼합 용매 중의 유기 용매의 합계량에 포함시키는 것으로 한다.
친수성 유기 용매가 DMSO일 경우, 혼합 용매 중의 DMSO의 비율은 용매 전체량의 20~65체적%인 것이 바람직하고, 35~60체적%인 것이 바람직하고, 50~55 또는 50~60체적%인 것이 보다 바람직하다. 친수성 유기 용매가 DMSO이며, 탈수 축합제가 N-히드록시 함질소 방향환 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제, 예를 들면 HATU 등의 벤조트리아졸릴우로늄형 탈수 축합제일 경우, 혼합 용매 중의 DMSO의 비율은 용매 전체량의 35~65체적%인 것이 바람직하고, 50~65체적%인 것이 보다 바람직하고, 예를 들면 50~60체적%이면 좋다. 친수성 유기 용매가 DMSO이며, 탈수 축합제가 트리아진형 탈수 축합제, 예를 들면 DMT-MM 등의 트리아진형 4급 모르폴리늄 유도체일 경우, 혼합 용매 중의 DMSO의 비율은 용매 전체량의 35~65체적%인 것이 바람직하고, 35~60체적%인 것이 보다 바람직하고, 예를 들면 50~60체적%, 또는 50~55체적%이면 좋다. 이것들의 경우, 반응 용매(혼합 용매)의 pH는 이하에 한정하는 것은 아니지만, 6.5~7.5인 것이 바람직하고, 6.9~7.5인 것이 보다 바람직하고, 예를 들면 6.5~7.0, 6.9~7.1, 또는 7.0~7.5이면 좋다.
친수성 유기 용매가 DMF일 경우, 혼합 용매 중의 DMF의 비율은 용매 전체량의 20~65체적%인 것이 바람직하고, 35~65체적%인 것이 바람직하고, 50~65체적%인 것이 보다 바람직하다. 친수성 유기 용매가 DMF이며, 탈수 축합제가, N-히드록시 함질소 방향환 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제, 예를 들면 HATU 등의 벤조트리아졸릴우로늄형 탈수 축합제일 경우, 혼합 용매 중의 DMF의 비율은 용매 전체량의 35~65체적%인 것이 바람직하고, 50~65체적%인 것이 보다 바람직하고, 예를 들면 50~60체적%이면 좋다. 이것들의 경우, 반응 용매(혼합 용매)의 pH는 이하에 한정하는 것은 아니지만, 6.5~7.5인 것이 바람직하고, 6.9~7.5인 것이 보다 바람직하고, 예를 들면 6.5~7.0, 6.9~7.1, 또는 7.0~7.5이면 좋다.
친수성 유기 용매가 DMEU일 경우, 혼합 용매 중의 DMEU의 비율은 용매 전체량의 20~65체적%인 것이 바람직하고, 35~65체적%인 것이 바람직하고, 50~60체적%인 것이 보다 바람직하다. 친수성 유기 용매가 DMEU이며, 탈수 축합제가, N-히드록시 함질소 방향환 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제, 예를 들면 HATU 등의 벤조트리아졸릴우로늄형 탈수 축합제일 경우, 혼합 용매 중의 DMEU의 비율은 용매 전체량의 35~65체적%인 것이 바람직하고, 50~65체적%인 것이 보다 바람직하고, 예를 들면 50~60체적%이면 좋다. 이것들의 경우, 반응 용매(혼합 용매)의 pH는 이하에 한정하는 것은 아니지만, 6.5~7.5인 것이 바람직하고, 6.9~7.5인 것이 보다 바람직하고, 예를 들면 6.5~7.0, 6.9~7.1, 또는 7.0~7.5이면 좋다.
친수성 유기 용매가 아세토니트릴일 경우, 혼합 용매 중의 아세토니트릴의 비율은 용매 전체량의 20~65체적%인 것이 바람직하고, 35~65체적%인 것이 바람직하고, 50~65체적%인 것이 보다 바람직하다. 친수성 유기 용매가 아세토니트릴이며, 탈수 축합제가, N-히드록시 함질소 방향환 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제, 예를 들면, HATU 등의 벤조트리아졸릴우로늄형 탈수 축합제일 경우, 혼합 용매 중의 아세토니트릴의 비율은 용매 전체량의 35~65체적%인 것이 바람직하고, 50~65체적%인 것이 보다 바람직하고, 예를 들면 50~60체적%이면 좋다. 이것들의 경우, 반응 용매(혼합 용매)의 pH는 이하에 한정되는 것은 아니지만, 6.5~7.5인 것이 바람직하고, 6.9~7.5인 것이 보다 바람직하고, 예를 들면 6.5~7.0, 6.9~7.1, 또는 7.0~7.5이면 좋다.
완충액과 친수성 유기 용매의 첨가 순서에 특별히 제한은 없고, 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자를 완충액에 용해한 후에 친수성 유기 용매를 첨가해도 좋고, 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자에 친수성 유기 용매를 첨가한 후에 완충액을 첨가해도 좋다. 또는, 완충액과 친수성 유기 용매를 사전에 혼합한 용매와, 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자를 혼합할 수도 있다. 통상, 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자를 완충액에 용해한 후에 친수성 유기 용매를 첨가하는 것이 바람직하다.
제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자를 완충액에 용해한 후, 일정 시간(예를 들면 1~15분간)에 걸쳐 정치해도 좋고, 정치하지 않고 즉시 친수성 유기 용매를 첨가해도 좋다. 또한, 완충액 중에서 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자의 열변성(예를 들면, 90℃ 이상의 온도에서의 가열한 후, 실온까지 냉각)을 행해도 좋고, 행하지 않아도 좋다.
본 발명의 제조 방법에서 사용하는 탈수 축합제로서는, (i) 트리아진형 탈수 축합제, (ii) N-히드록시 함질소 방향환 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제(예를 들면 벤조트리아졸릴우로늄형 탈수 축합제), (iii) 카르보디이미드형 탈수 축합제, (iv) 2-할로피리디늄형 탈수 축합제, 또는 (v) 포름아미디늄형 탈수 축합제를 사용할 수 있다. 탈수 축합제로서 (iii) 카르보디이미드형 탈수 축합제를 사용할 경우, 카르보디이미드형 탈수 축합제를 N-히드록시 함질소 방향족 화합물(예를 들면, 히드록시벤조트리아졸 또는 그 유도체) 또는 시아노(히드록시이미노)아세트산 에스테르와 조합시켜서 사용할 수 있고, (iv) 2-할로피리디늄형 탈수 축합제를 사용할 경우, 2-할로피리디늄형 탈수 축합제를 N-히드록시 함질소 방향족 화합물과 조합시켜서 사용할 수 있고, (v) 포름아미디늄형 탈수 축합제를 사용할 경우, 포름아미디늄형 탈수 축합제를 N-히드록시 함질소 방향족 화합물 또는 N-탄화수소 치환 이미다졸 유도체와 조합시켜서 사용할 수 있다. 본 발명의 제조 방법에서는, N-아실옥시 함질소 방향족 화합물형 활성 중간체(예를 들면 벤조트리아졸릴형 활성 중간체), 시아노(아실옥시이미노)아세트산 에스테르형 활성 중간체 또는 N'-아실-N-탄화수소 치환 이미다졸형 활성 중간체를 경유해서 아미드화를 일으키는 반응 조건을 적합하게 이용할 수 있다. 탈수 축합제는 유리체 또는 염의 형태이면 좋고, 바람직하게는 염의 형태이다.
일실시형태에서는, 본 발명의 제조 방법은, 이하의 (i)~(iv) 중 적어도 1개 또는 그것들의 임의의 조합(예를 들면, 모두)의 조건을 충족시켜도 좋다:
(i) N-히드록시 함질소 방향환 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제를 사용하고, 그것이 벤조트리아졸릴우로늄형 탈수 축합제인,
(ii) N-히드록시 함질소 방향족 화합물을 사용하고, 그것이 히드록시벤조트리아졸 또는 그 유도체인,
(iii) 시아노(히드록시이미노)아세트산 에스테르를 사용하고, 그것이 시아노(히드록시이미노)아세트산 알킬에스테르인,
(iv) N-탄화수소 치환 이미다졸 유도체를 사용하고, 그것이 N-알킬이미다졸 유도체이다.
트리아진형 탈수 축합제는, 트리아진의 적어도 1개의 탄소 원자가, 4급 암모늄 또는 할로겐 등의 탈리 가능한 관능기로 치환된 구조를 갖는 화합물(예를 들면 유리체 또는 염)을 의미한다. 트리아진형 탈수 축합제로서는, 예를 들면, 문헌(Kunishima 등, Tetrahedron, 2001년, 제 57권, p.1551-1558; Kunishima 등, Chemistry A European Journal, 2012년, 제 18권, p.15856-15867; 일본국 특허 제4349749호 명세서, 일본 특허공개 2008-214473호 공보, 일본 특허공개 2016-141618호 공보, 일본 특허공개 2016-141619호 공보, 일본 특허공개 2017-149876호 공보등)에 기재된 탈수 축합제를 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 트리아진형 탈수 축합제는 트리아진형 4급 모르폴리늄, 예를 들면, 4-[4,6-비스(2,6-크실릴)-1,3,5-트리아진-2-일]-4-메틸모르폴리늄, 4-[4-메톡시-6-(2,6-크실릴)-1,3,5-트리아진-2-일]-4-메틸모르폴리늄, 4-(4-t-부틸-6-메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)4-메톡시모르폴리늄, 4-(4,6-디-t-부틸-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄, N-[4-메톡시-6-(N'-페닐아세트아미드)-1,3,5-트리아진-2-일]-4-메틸모르폴리늄, N-[4-메톡시-6-(N'-메틸아세트아미드)-1,3,5-트리아진-2-일]-4-메틸모르폴리늄, N-[4-메톡시-6-(N'-페닐벤즈아미드)-1,3,5-트리아진-2-일]-4-메틸모르폴리늄, N-[4-메톡시-6-(N'-메틸벤즈아미드)-1,3,5-트리아진-2-일]-4-메틸모르폴리늄, N-[4-메톡시-6- (2,5-디옥소피롤리딜)-1,3,5-트리아진-2-일]-4-메틸모르폴리늄, N-[4-메톡시-6- (2-피페리돈-1-일)-1,3,5-트리아진-2-일]-4-메틸모르폴리늄, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄, 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄, 및 그 유도체를 들 수 있다. 유도체의 예로서는, 퍼클로레이트, 트리플루오로메탄술포네이트, 염화물, 헥사플루오로포스페이트 등의 염을 들 수 있다. 트리아진형 탈수 축합제는, 예를 들면, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄염이면 좋다.
트리아진형 탈수 축합제인 트리아진형 4급 모르폴리늄 유도체로서는, 예를 들면, 4-[4,6-비스(2,6-크실릴)-1,3,5-트리아진-2-일]-4-메틸모르폴리늄퍼클로레이트, 4-[4-메톡시-6-(2,6-크실릴)-1,3,5-트리아진-2-일]-4-메틸모르폴리늄퍼클로레이트, 4-(4-t-부틸-6-메톡시-1,3,5-트리아진-2-일) 4-메톡시모르폴리늄트리플루오로메탄술포네이트, 4-(4,6-디-t-부틸-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드, N-[4-메톡시-6-(N'-페닐아세트아미드)-1,3,5-트리아진-2-일]-4-메틸모르폴리늄퍼클로레이트, N-[4-메톡시-6-(N'-메틸아세트아미드)-1,3,5-트리아진-2-일]-4-메틸모르폴리늄퍼클로레이트, N-[4-메톡시-6-(N'-페닐벤즈아미드)-1,3,5-트리아진-2-일]-4-메틸모르폴리늄클로라이드, N-[4-메톡시-6-(N'-메틸벤즈아미드)-1,3,5-트리아진-2-일]-4-메틸모르폴리늄클로라이드, N-[4-메톡시-6-(2,5-디옥소피롤리딜)-1,3,5-트리아진-2-일]-4-메틸모르폴리늄클로라이드, N-[4-메톡시-6-(2-피페리돈-1-일)-1,3,5-트리아진-2-일]-4-메틸모르폴리늄클로라이드, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄트리플루오로메탄술포네이트 등이 바람직하고, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드(이하, DMT-MM)가 보다 바람직하다.
트리아진형 탈수 축합제의 당량으로서는, 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자에 대하여 10~100당량이 바람직하고, 20~40당량이 보다 바람직하다.
N-히드록시 함질소 방향환 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제는, N-히드록시 함질소 방향환 구조에 테트라알킬아미디늄 구조가 부가된 화합물을 의미한다. N-히드록시 함질소 방향환 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제로서는, 예를 들면, 벤조트리아졸릴우로늄형 탈수 축합제(1-히드록시벤조트리아졸 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제), N-히드록시-2-피리돈 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제, 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제, N-히드록시이미다졸 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제, 또는 N-히드록시피리딘 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제 등이 바람직하고, 벤조트리아졸릴우로늄형 탈수 축합제, N-히드록시-2-피리돈 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제, 또는 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제가 보다 바람직하고, 벤조트리아졸릴우로늄형 탈수 축합제, 또는 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제가 보다 바람직하다.
벤조트리아졸릴우로늄형 탈수 축합제는, 1-히드록시벤조트리아졸 구조에 테트라알킬아미디늄 구조가 부가된 화합물을 의미한다. 아미디늄 구조의 두개의 질소 원자 상의 4개의 치환기는 아미드화 반응을 저해하지 않는 것이면 특별히 제한은 없고, 질소 원자와 함께 환을 형성하고 있어도 좋다. 상기 1-히드록시벤조트리아졸 구조는 아미드화 반응을 저해하지 않는 것이면 특별히 제한 없고, 벤젠환 상에 치환기를 갖고 있어도 좋고, 벤젠환 중의 일부의 탄소 원자가 질소 원자로 치환되어 있어도 좋다.
벤조트리아졸릴우로늄형 탈수 축합제는, 일반적으로 O-아실형(우로늄형)과 N-아실형(아미늄형)의 2개의 형태를 취하는 것이 문헌(Carpino 등, Angewandte Chemie International Edition, 2002년, 제 41권, p.441-445.)에서 알려져 있지만, 본 발명에 있어서 「벤조트리아졸릴우로늄형 탈수 축합제」는, O-아실형(우로늄형)과 N-아실형(아미늄형)의 양방의 형태를 포함한다.
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벤조트리아졸릴우로늄형 탈수 축합제로서는, 예를 들면, 문헌(Knorr 등, Tetrahedron Letters, 1989년, 제 30권, p.1927-1930; Carpino 등, Organic Letters, 2001년, 제 3권, p.2793-2795; EL-Faham 등, The Journal of Organic Chemistry, 2008년, 제 73권, p.2731-2737; 국제공개 제 1994/007910호, 국제공개 제 2002/094822호 등)에 기재된 탈수 축합제를 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 벤조트리아졸릴우로늄형 탈수 축합제는, 벤조트리아졸릴우로늄, 예를 들면 O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N'N'-테트라메틸우로늄, [(벤조트리아졸-1-일옥시)피페리딘-1-일메틸렌]피페리디늄 등, 및 그 유도체, 또는, 아자벤조트리아졸릴우로늄, 예를 들면, O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N'N'-테트라메틸우로늄, O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N'N'-테트라에틸우로늄, [(7-아자벤조트리아졸-1-일옥시)-4-모르폴리노메틸렌]디메틸암모늄, [(7-아자벤조트리아졸-1-일옥시)피페리딘-1-일메틸렌]피페리디늄, [(7-아자벤조트리아졸-1-일옥시)피롤리딘-1-일메틸렌]피롤리디늄 등, 및 그 유도체를 들 수 있다. 유도체의 예로서는, 퍼클로레이트, 트리플루오로메탄술포네이트, 염화물, 헥사플루오로포스페이트 등의 염을 들 수 있다. 벤조트리아졸릴우로늄형 탈수 축합제는, 예를 들면 O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N'N'-테트라메틸우로늄염이나 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N'N'-테트라메틸우로늄염이라도 좋다.
벤조트리아졸릴우로늄형 탈수 축합제의 바람직한 예로서는, O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트나 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트(이하, HATU)를 들 수 있다.
N-히드록시-2-피리돈 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제는, N-히드록시-2-피리돈 구조에 테트라알킬아미디늄 구조가 부가된 화합물을 의미한다. 아미디늄 구조의 2개의 질소 원자 상의 4개의 치환기는 아미드화 반응을 저해하지 않는 것이면 특별히 제한은 없고, 질소 원자와 함께 환을 형성하고 있어도 좋다. 상기 N-히드록시-2-피리돈 구조는 아미드화 반응을 저해하지 않는 것이면 특별히 제한 없이, 피리돈환 상에 치환기를 갖고 있어도 좋다. N-히드록시-2-피리돈 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제로서는, 예를 들면 O-(1,2-디히드로-2-옥소-1-피리딜)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄, O-(1,2-디히드로-2-옥소-1-피리딜)-N,N,N',N'-비스(테트라메틸렌)우로늄, 및 O-(1,2-디히드로-2-옥소-1-피리딜)-N,N,N',N'-비스(펜타 메틸렌)우로늄 등, 및 그 유도체를 들 수 있다. 유도체의 예로서는 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 퍼클로레이트, 트리플루오로메탄술포네이트, 테트라플루오로보레이트, 헥사플루오로포스페이트 등의 염을 들 수 있다. N-히드록시-2-피리돈 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제는, O-(1,2-디히드로-2-옥소-1-피리딜)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄염이라도 좋다.
N-히드록시-2-피리돈 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제의 바람직한 예로서는, O-(1,2-디히드로-2-옥소-1-피리딜)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄테트라플루오로보레이트(이하, TPTU)를 들 수 있다.
3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제는, 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 구조에 테트라알킬아미디늄 구조가 부가된 화합물을 의미한다. 아미디늄 구조의 2개의 질소 원자 상의 4개의 치환기는 아미드화 반응을 저해하지 않는 것이면 특별히 제한은 없고, 질소 원자와 함께 환을 형성하고 있어도 좋다. 상기 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 구조는 아미드화 반응을 저해하지 않는 것이면 특별히 제한 없고, 4-옥소-1,2,3-벤조트리아진환 상에 치환기를 갖고 있어도 좋다. 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제로서는, 예를 들면 O-(3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진-3-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄, O-(3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진-3-일)-N,N,N',N'-비스(테트라메틸렌)우로늄, O-(3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진-3-일)-N,N,N',N'-비스(펜타메틸렌)우로늄 등, 및 그 유도체를 들 수 있다. 유도체의 예로서는 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 퍼클로레이트, 트리플루오로메탄술포네이트, 테트라플루오로보레이트, 헥사플루오로포스페이트 등의 염을 들 수 있다. 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제는, O-(3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진-3-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄염이라도 좋다.
3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제의 바람직한 예로서는, O-(3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진-3-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄테트라플루오로보레이트(이하, TDBTU)를 들 수 있다.
N-히드록시이미다졸 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제는, N-히드록시이미다졸 구조에 테트라알킬아미디늄 구조가 부가된 화합물을 의미한다. 아미디늄 구조의 2개의 질소 원자 상의 4개의 치환기는 아미드화 반응을 저해하지 않는 것이면 특별히 제한은 없고, 질소 원자와 함께 환을 형성하고 있어도 좋다. 상기 N-히드록시이미다졸 구조는 아미드화 반응을 저해하지 않는 것이면 특별히 제한 없고, N-히드록시이미다졸환 상에 치환기를 갖고 있어도 좋다. N-히드록시이미다졸 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제로서는, 예를 들면 O-(이미다졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄, O-(이미다졸-1-일)-N,N,N',N'-비스(테트라메틸렌)우로늄, O-(이미다졸-1-일)-N,N,N',N'-비스(펜타메틸렌)우로늄 등, 및 그 유도체를 들 수 있다. 유도체의 예로서는 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 퍼클로레이트, 트리플루오로메탄술포네이트, 테트라플루오로보레이트, 헥사플루오로포스페이트 등의 염을 들 수 있다. N-히드록시이미다졸 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제는, O-(이미다졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄염이라도 좋다.
N-히드록시이미다졸 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제의 바람직한 예로서는, O-(이미다졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트를 들 수 있다.
N-히드록시피리딘 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제는, N-히드록시피리딘 구조에 테트라알킬아미디늄 구조가 부가된 화합물을 의미한다. 아미디늄 구조의 2개의 질소 원자 상의 4개의 치환기는 아미드화 반응을 저해하지 않는 것이면 특별히 제한은 없고, 질소 원자와 함께 환을 형성하고 있어도 좋다. 상기 N-히드록시피리딘 구조는 아미드화 반응을 저해하지 않는 것이면 특별히 제한 없고, N-히드록시피리딘환 상에 치환기를 갖고 있어도 좋다. N-히드록시피리딘 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제로서는, 예를 들면, O-피리딜-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄, O-피리딜-N,N,N',N'-비스(테트라메틸렌)우로늄, O-피리딜-N,N,N',N'-비스(펜타메틸렌)우로늄, O-(4-디메틸아미노-피리딜)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄, O-(4-디메틸아미노-피리딜)-N,N,N',N'-비스(테트라메틸렌)우로늄, O-(4-디메틸아미노-피리딜)-N,N,N',N'-비스(펜타메틸렌)우로늄 등, 및 그 유도체를 들 수 있다. 유도체의 예로서는 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 퍼클로레이트, 트리플루오로메탄술포네이트, 테트라플루오로보레이트, 헥사플루오로포스페이트 등의 염을 들 수 있다. N-히드록시피리딘 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제는, O-피리딜-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄염이나 O-4-디메틸아미노-피리딜)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄염이라도 좋다.
N-히드록시피리딘 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제의 바람직한 예로서는, O-(4-디메틸아미노-피리딜)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트를 들 수 있다.
N-히드록시 함질소 방향환 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제(예를 들면, 벤조트리아졸릴우로늄형 탈수 축합제)의 당량으로서는, 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자에 대하여 10~100당량이 바람직하고, 20~40당량이 보다 바람직하다.
카르보디이미드형 탈수 축합제는, N=C=N으로 나타내어지는 카르보디이미드 구조를 갖는 화합물을 의미한다. N 상의 치환기는 아미드화 반응을 저해하지 않는 것이면 특별히 제한은 없다. 카르보디이미드형 탈수 축합제로서는, 예를 들면, N,N'-디메틸카르보디이미드, N,N'-디에틸카르보디이미드, N,N'-디프로필카르보디이미드, N,N'-디이소프로필카르보디이미드, N-tert-부틸-N'-메틸카르보디이미드, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드, N-벤질-N'-메틸카르보디이미드, N-벤질-N'-에틸카르보디이미드, N-벤질-N'-프로필카르보디이미드, N-(3'-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드, N,N'-비스(3'-디메틸아미노프로필)카르보디이미드, 3-(에틸이미노메틸리덴아미노)프로필트리메틸암모늄, 3-(이소프로필이미노메틸리덴아미노)프로필 트리메틸암모늄 등의 카르보디이미드 유도체, 및 그 염(산부가염을 포함한다)을 사용할 수 있다. 염의 예로서는 퍼클로레이트, 트리플루오로메탄술포네이트, 염화물, 헥사플루오로포스페이트, 염산염, 브롬산염, 트리플루오로메탄술폰산염, 과염소산염 등을 들 수 있다. 3급 아민 구조 또는 4급 암모늄 구조를 포함하는 카르보디이미드 유도체가 보다 바람직하고, 예를 들면, N-(3'-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 및 그 산부가염 등의 염, N,N'-비스(3'-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 및 그 산부가염 등의 염, 3-에틸이미노메틸리덴아미노)프로필트리메틸암모늄염, 3-(이소프로필이미노메틸리덴아미노)프로필트리메틸암모늄염을 들 수 있다. 특히 바람직한 카르보디이미드형 탈수 축합제의 예는, N-(3'-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 염산염(이하, EDCI 염산염)이다.
N-히드록시 함질소 방향족 화합물로서는, 예를 들면, 히드록시벤조트리아졸 또는 그 유도체, N-히드록시트리아졸 또는 그 유도체, N-히드록시벤조이미다졸 또는 그 유도체, N-히드록시이미다졸 또는 그 유도체, N-히드록시-2-피리돈 또는 그 유도체, 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 또는 그 유도체, 또는 N-히드록시피리딘 또는 그 유도체가 바람직하고, 히드록시벤조트리아졸 또는 그 유도체, N-히드록시트리아졸 또는 그 유도체, N-히드록시-2-피리돈 또는 그 유도체, 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 또는 그 유도체, 또는 N-히드록시피리딘 또는 그 유도체가 보다 바람직하다.
히드록시벤조트리아졸 또는 그 유도체는, 아미드화 반응을 저해하지 않는 것이면 특별히 제한은 없고, 벤젠환 상에 치환기를 갖고 있어도 좋고, 벤젠환 중의 일부의 탄소 원자가 질소 원자로 치환되어 있어도 좋다. 히드록시벤조트리아졸 또는 그 유도체로서는, 1-히드록시벤조트리아졸, 1-히드록시-6-클로로-벤조트리아졸, 1-히드록시-6-트리플루오로메틸벤조트리아졸, 1-히드록시-4-니트로-6-트리플루오로메틸벤조트리아졸, 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸, 1-히드록시-4-메틸-7-아자벤조트리아졸, 1-히드록시-4-메톡시-7-아자벤조트리아졸, 1-히드록시-4-tert-부틸-7-아자벤조트리아졸, 1-히드록시-4,5,6-트리메틸-7-아자벤조트리아졸, 1-히드록시-6-아자벤조트리아졸, 1-히드록시-5-아자벤조트리아졸 또는 1-히드록시-4-아자벤조트리아졸 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸, 1-히드록시-4-메틸-7-아자벤조트리아졸, 1-히드록시-4-메톡시-7-아자벤조트리아졸, 1-히드록시-4-tert-부틸-7-아자벤조트리아졸, 1-히드록시-4,5,6-트리메틸-7-아자벤조트리아졸, 1-히드록시-6-아자벤조트리아졸, 1-히드록시-5-아자벤조트리아졸 또는 1-히드록시-4-아자벤조트리아졸 등의 히드록시아자벤조트리아졸 또는 그 유도체이며, 보다 바람직하게는 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(이하, HOAt)이다.
N-히드록시트리아졸 또는 그 유도체는, 아미드화 반응을 저해하지 않는 것이면 특별히 제한은 없고, 트리아졸환 상 4 또는 5위치에 치환기를 갖고 있어도 좋다. N-히드록시트리아졸 또는 그 유도체는, 예를 들면, 1-히드록시-1,2,3-트리아졸-4-카르복실산 에틸을 들 수 있다.
N-히드록시벤조이미다졸 또는 그 유도체는, 아미드화 반응을 저해하지 않는 것이면 특별히 제한은 없고, 벤젠환 상에 치환기를 갖고 있어도 좋고, 벤젠환 중의 일부의 탄소 원자가 질소 원자로 치환되어 있어도 좋다. N-히드록시벤조이미다졸 또는 그 유도체는, 예를 들면, N-히드록시벤조이미다졸, N-히드록시-7-아자벤조이미다졸을 들 수 있다.
N-히드록시이미다졸 또는 그 유도체는, 아미드화 반응에 저해하지 않는 것이면 특별히 제한은 없고, 이미다졸환 상에 치환기를 갖고 있어도 좋다. N-히드록시이미다졸 또는 그 유도체는, 예를 들면, N-히드록시이미다졸을 들 수 있다.
N-히드록시-2-피리돈 또는 그 유도체는, 아미드화 반응에 저해하지 않는 것이면 특별히 제한은 없고, 피리돈환 상 3~6위치에 치환기를 갖고 있어도 좋다. N-히드록시-2-피리돈 또는 그 유도체는, 예를 들면, N-히드록시-2-피리돈(이하, HOPO)을 들 수 있다.
3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 또는 그 유도체는, 아미드화 반응에 저해하지 않는 것이면 특별히 제한은 없고, 벤젠환 상에 치환기를 갖고 있어도 좋다. 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 또는 그 유도체는, 예를 들면 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진, 7-클로로-3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진, 3,4-디히드로-3-히드록시-7-니트로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진, 3,4-디히드로-3-히드록시-6,7-디메톡시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진을 들 수 있다.
N-히드록시피리딘 또는 그 유도체는, 아미드화 반응에 저해하지 않는 것이면 특별히 제한은 없고, 피리딘환 상에 치환기를 갖고 있어도 좋다. N-히드록시피리딘 또는 그 유도체는, 예를 들면 N-히드록시피리딘, 4-(디메틸아미노)피리딘-N-옥시드를 들 수 있다.
시아노(히드록시이미노)아세트산 에스테르는 에스테르기로서, 아미드화 반응을 저해하지 않는 치환기를 갖고 있어도 좋다. 시아노(히드록시이미노)아세트산 에스테르로서는, 예를 들면 시아노(히드록시이미노)아세트산 알킬에스테르, 시아노(히드록시이미노)아세트산 아릴에스테르를 들 수 있다.
시아노(히드록시이미노)아세트산 알킬에스테르에 있어서, 알킬에스테르기 부분은 직쇄상, 분기상, 환상 중 어느 것이라도 좋고, 탄소수 1~10의 알킬기인 것이 바람직하다. 시아노(히드록시이미노)아세트산 알킬에스테르로서는, 예를 들면, 시아노(히드록시이미노)아세트산 메틸, 시아노(히드록시이미노)아세트산 에틸, 시아노(히드록시이미노)아세트산 프로필, 시아노(히드록시이미노)아세트산 tert-부틸, 시아노(히드록시이미노)아세트산 벤질, 시아노(히드록시이미노)아세트산 시클로헥실, 시아노(히드록시이미노)아세트산 (2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-일)메틸이며, 보다 바람직하게는 시아노(히드록시이미노)아세트산 에틸이다.
시아노(히드록시이미노)아세트산 아릴에스테르에 있어서, 아릴에스테르기 부분은 벤젠환 상에 치환기를 갖고 있어도 좋고, 벤젠환 중의 일부의 탄소 원자가 질소 원자로 치환되어 있어도 좋다. 시아노(히드록시이미노)아세트산 아릴에스테르로서는, 예를 들면 시아노(히드록시이미노)아세트산 페닐, 시아노(히드록시이미노)아세트산-1-나프틸을 들 수 있다.
카르보디이미드형 탈수 축합제의 당량으로서는, 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자에 대하여 10~100당량이 바람직하고, 20~40당량이 보다 바람직하다. 또한, N-히드록시 함질소 방향족 화합물(예를 들면 히드록시벤조트리아졸 또는 그 유도체) 또는 시아노(히드록시이미노)아세트산 에스테르의 당량으로서는, 각각 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자에 대하여 10~100당량이 바람직하고, 20~40당량이 보다 바람직하다.
2-할로피리디늄형 탈수 축합제는, 피리딘환 상의 질소 원자 상에 탄화수소 치환기를 갖는 피리디늄염으로서, 피리딘환의 2위치에 할로겐을 갖는 화합물을 의미한다. 상기 피리딘환은 피리딘환 상 3~6위치에 치환기를 갖고 있어도 좋다. 상기 질소 원자 상의 탄화수소 치환기, 및 피리딘환 상 3~6위치에 치환기는 아미드화 반응을 저해하지 않는 것이면 특별히 제한은 없다. 2-할로피리디늄형 탈수 축합제로서는, 예를 들면 2-클로로-1-메틸피리디늄, 2-브로모-1-메틸피리디늄, 2-플루오로-1-메틸피리디늄, 2-클로로-1-에틸피리디늄, 2-브로모-1-에틸피리디늄, 2-플루오로-1-에틸피리디늄, 2-플루오로-1,3-디메틸피리디늄, 2-클로로-1-메틸퀴놀리늄, 2-요오드-1-메틸퀴놀리늄, 2-클로로-1-(2-옥소-2-페네틸)피리디늄, 2-브로모-1-(2-옥소-2-페네틸)피리디늄, 2-클로로-1-[2-(3-니트로페닐)-2-옥소에틸]피리디늄, 2-클로로-1-[2-(4-플루오로페닐)-2-옥소에틸]피리디늄, 2-클로로-1-[2-(4-클로로페닐)-2-옥소에틸]피리디늄, 2-브로모-1-[2-(4-비페닐)-2-옥소에틸]피리디늄, 2-브로모-1- [2-(3-니트로페닐)-2-옥소에틸]피리디늄, 2-브로모-1-[2-(4-메톡시페닐)-2-옥소에틸]피리디늄, 2-클로로-1-벤질피리디늄, 2-요오드-1-에틸-6-메톡시퀴놀리늄 등, 및 그 유도체를 들 수 있다. 유도체의 예로서는 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 퍼클로레이트, 트리플루오로메탄술포네이트, 테트라플루오로보레이트, 헥사플루오로포스페이트 등의 염을 들 수 있다. 2-할로피리디늄형 탈수 축합제는 2-클로로-1-메틸피리디늄염이라도 좋다.
2-할로피리디늄형 탈수 축합제의 바람직한 예로서는, 2-클로로-1-메틸피리디늄요오다이드를 들 수 있다.
2-할로피리디늄형 탈수 축합제의 당량으로서는, 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자에 대하여 10~100당량이 바람직하고, 20~40당량이 보다 바람직하다. 또한, N-히드록시 함질소 방향족 화합물(예를 들면 히드록시벤조트리아졸 또는 그 유도체)의 당량으로서는, 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자에 대하여 10~100당량이 바람직하고, 20~40당량이 보다 바람직하다.
포름아미디늄형 탈수 축합제의 2개의 질소 원자 상의 4개의 치환기는 아미드화 반응을 저해하지 않는 것이면 특별히 제한은 없고, 질소 원자와 함께 환을 형성하고 있어도 좋다. 포름아미디늄형 탈수 축합제로서는, 클로로-N,N,N',N'-테트라메틸포름아미디늄, 2-클로로-1,3-디메틸이미다졸리늄, 클로로-N,N,N',N'-비스(테트라메틸렌)포름아미디늄, 클로로-N,N,N',N'-비스(펜타메틸렌)포름아미디늄, 2-클로로-1,3-디메틸-4,5-디히드로피리미디늄, 플루오로-N,N,N',N'-테트라메틸포름아미디늄, 2-플루오로-1,3-디메틸이미다졸리늄, 플루오로-N,N,N',N'-비스(테트라메틸렌)포름아미디늄 등, 및 그 유도체를 들 수 있다. 유도체의 예로서는 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 퍼클로레이트, 트리플루오로메탄술포네이트, 테트라플루오로보레이트, 헥사플루오로포스페이트 등의 염을 들 수 있다. 포름아미디늄형 탈수 축합제는 클로로-N,N,N',N'-테트라메틸포름아미디늄염이라도 좋다.
포름아미디늄형 탈수 축합제의 바람직한 예로서는, 클로로-N,N,N',N'-테트라메틸포름아미디늄헥사플루오로포스페이트(이하, TCFH)를 들 수 있다.
N-탄화수소 치환 이미다졸 유도체는 이미다졸 구조의 질소 원자 상에 탄화수소 치환기를 갖는 화합물을 의미한다. 상기 이미다졸 구조는 이미다졸환 2위치, 4위치 또는 5위치 상에 치환기를 갖고 있어도 좋다. 상기 탄화수소 치환기, 및 이미다졸환 2위치, 4위치 또는 5위치 상의 치환기는 아미드화 반응을 저해하지 않는 것이면 특별히 제한은 없다. N-탄화수소 치환 이미다졸 유도체로서는, 예를 들면 N-알킬이미다졸 유도체, N-아릴이미다졸 유도체를 들 수 있다.
N-알킬이미다졸 유도체는 아미드화 반응을 저해하지 않는 것이면 특별히 제한은 없고, 이미다졸환 상에 치환기를 갖고 있어도 좋다. N-알킬이미다졸 유도체로서는, 예를 들면, N-메틸이미다졸(이하, NMI), 1,2-디메틸이미다졸을 들 수 있다.
N-아릴이미다졸 유도체는 아미드화 반응을 저해하지 않는 것이면 특별히 제한은 없고, 이미다졸환 상에 치환기를 갖고 있어도 좋다. N-아릴이미다졸 유도체로서는, 예를 들면, N-페닐이미다졸, 1-페닐-2-메틸이미다졸을 들 수 있다.
포름아미디늄형 탈수 축합제의 당량으로서는, 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자에 대하여 10~100당량이 바람직하고, 20~40당량이 보다 바람직하다. 또한, N-히드록시 함질소 방향족 화합물(예를 들면 히드록시벤조트리아졸 또는 그 유도체) 또는 N-탄화수소 치환 이미다졸 유도체의 당량으로서는, 각각 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자에 대하여 10~100당량이 바람직하고, 20~40당량이 보다 바람직하다.
상기 탈수 축합제 및 상기 N-히드록시 함질소 방향족 화합물, 상기 시아노(히드록시이미노)아세트산 에스테르 및 상기 N-탄화수소 치환 이미다졸 유도체는, 시판품을 사용해도 좋고 공지의 방법 또는 그것에 준한 방법으로 합성해도 좋다.
일실시형태에서는, 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자 및 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자에 대하여, 탈수 축합제, 구체적으로는 트리아진형 탈수 축합제, N-히드록시 함질소 방향환 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제(예를 들면 벤조트리아졸릴우로늄형 탈수 축합제), 카르보디이미드형 탈수 축합제, 2-할로피리디늄형 탈수 축합제 또는 포름아미디늄형 탈수 축합제를, 고체로 해서 첨가해도 좋고, 물, 완충액, 친수성 유기 용매 또는 그것들의 혼합 용매 등의 용액에 용해 또는 현탁해서 첨가해도 좋다. 카르보디이미드형 탈수 축합제와 N-히드록시 함질소 방향족 화합물(예를 들면 히드록시벤조트리아졸 또는 그 유도체) 또는 시아노(히드록시이미노)아세트산 에스테르를 조합시켜서 사용할 경우, 카르보디이미드형 탈수 축합제와 N-히드록시 함질소 방향족 화합물(예를 들면 히드록시벤조트리아졸 또는 그 유도체) 또는 시아노(히드록시이미노)아세트산 에스테르 중 어느 하나를 먼저 첨가해도 좋고, 양자를 동시에 첨가할 수도 있다. 2-할로피리디늄형 탈수 축합제와 N-히드록시 함질소 방향족 화합물을 조합시켜서 사용할 경우, 2-할로피리디늄형 탈수 축합제와 N-히드록시 함질소 방향족 화합물 중 어느 하나를 먼저 첨가해도 좋고, 양자를 동시에 첨가할 수도 있다. 포름아미디늄형 탈수 축합제와 N-히드록시 함질소 방향족 화합물 또는 N-탄화수소 치환 이미다졸 유도체를 조합시켜서 사용할 경우, 포름아미디늄형 탈수 축합제와 N-히드록시 함질소 방향족 화합물 또는 N-탄화수소 치환 이미다졸 유도체 중 어느 하나를 먼저 첨가해도 좋고, 양자를 동시에 첨가할 수도 있다.
또한, 탈수 축합제, 구체적으로는, 트리아진형 탈수 축합제, N-히드록시 함질소 방향환 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제(예를 들면 벤조트리아졸릴우로늄형 탈수 축합제), 카르보디이미드형 탈수 축합제, 2-할로피리디늄형 탈수 축합제 또는 포름아미디늄형 탈수 축합제에 대하여, 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자 및 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자를 첨가할 수도 있다. 이 때, 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자는 어느 하나를 먼저 첨가해도 좋고, 양자를 동시에 첨가할 수도 있다. 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자 및 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자는 고체로 해서 첨가해도 좋고, 물, 완충액, 친수성 유기 용매 또는 그들 혼합 용매 등에 용해 또는 현탁해서 첨가해도 좋지만, 통상, 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자의 용액에 탈수 축합제를 첨가하는 것이 바람직하다. 카르보디이미드형 탈수 축합제와 N-히드록시 함질소 방향족 화합물 또는 시아노(히드록시이미노)아세트산 에스테르를 조합시켜서 사용할 경우, 카르보디이미드형 탈수 축합제와 N-히드록시 함질소 방향족 화합물 또는 시아노(히드록시이미노)아세트산 에스테르에 대하여, 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자 및 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자를 첨가할 수도 있다. 이 때, 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자는 어느 하나를 먼저 첨가해도 좋고, 양자를 동시에 첨가할 수도 있다. 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자 및 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자는, 고체로 해서 첨가해도 좋고, 물, 완충액, 친수성 유기 용매 또는 그들 혼합 용매 등에 용해 또는 현탁해서 첨가해도 좋지만, 통상, 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자의 용액에 탈수 축합제를 첨가하는 것이 바람직하다. 2-할로피리디늄형 탈수 축합제와 N-히드록시 함질소 방향족 화합물을 조합시켜서 사용할 경우, 2-할로피리디늄형 탈수 축합제와 N-히드록시 함질소 방향족 화합물에 대하여, 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자 및 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자를 첨가할 수도 있다. 이 때, 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자는 어느 하나를 먼저 첨가해도 좋고, 양자를 동시에 첨가할 수도 있다. 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자 및 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자는, 고체로 해서 첨가해도 좋고, 물, 완충액, 친수성 유기 용매 또는 그들 혼합 용매 등에 용해 또는 현탁해서 첨가해도 좋지만, 통상, 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자의 용액에 탈수 축합제를 첨가하는 것이 바람직하다. 포름아미디늄형 탈수 축합제와 N-히드록시 함질소 방향족 화합물 또는 N-탄화수소 치환 이미다졸 유도체를 조합시켜서 사용할 경우, 포름아미디늄형 탈수 축합제와 N-히드록시 함질소 방향족 화합물 또는 N-탄화수소 치환 이미다졸 유도체에 대하여, 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자 및 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자를 첨가할 수도 있다. 이 때, 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자는 어느 하나를 먼저 첨가해도 좋고, 양자를 동시에 첨가할 수도 있다. 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자 및 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자는, 고체로 해서 첨가해도 좋고, 물, 완충액, 친수성 유기 용매 또는 그것들의 혼합 용매 등에 용해 또는 현탁해서 첨가해도 좋지만, 통상, 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자의 용액에 탈수 축합제를 첨가하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 탈수 축합제로서는 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄염, O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄염, N-(3'-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 또는 그 염, 2-클로로-1-메틸피리디늄염 또는 클로로-N,N,N',N'-테트라메틸포름아미디늄염이 바람직하고, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드, O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트, N-(3'-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 염산염, 2-클로로-1-메틸피리디늄요오다이드, 또는 클로로-N,N,N',N'-테트라메틸포름아미디늄헥사플루오로포스페이트가 보다 바람직하다.
탈수 축합제로서의 카르보디이미드형 탈수 축합제나 2-할로피리디늄형 탈수 축합제나 포름아미디늄형 탈수 축합제와 함께 사용하는 N-히드록시 함질소 방향족 화합물로서는, 히드록시벤조트리아졸 또는 그 유도체가 바람직하고, 히드록시아자벤조트리아졸 또는 그 유도체가 보다 바람직하고, 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸이 보다 바람직하다.
탈수 축합제로서의 카르보디이미드형 탈수 축합제와 함께 사용하는 시아노(히드록시이미노)아세트산 에스테르로서는, 시아노(히드록시이미노)아세트산 알킬에스테르가 바람직하고, 시아노(히드록시이미노)아세트산 에틸이 보다 바람직하다.
탈수 축합제로서의 포름아미디늄형 탈수 축합제와 함께 사용하는 N-탄화수소 치환 이미다졸 유도체로서는, N-알킬이미다졸 유도체가 바람직하고, N-메틸이미다졸이 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서, 탈수 축합제는, 적어도 트리아진형 탈수 축합제, N-히드록시 함질소 방향환 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제(예를 들면 벤조트리아졸릴우로늄형 탈수 축합제), 카르보디이미드형 탈수 축합제, 2-할로피리디늄형 탈수 축합제 또는 포름아미디늄형 탈수 축합제를 포함하고 있으면 좋고, 2종류 이상을 혼합해도 좋다. 본 발명에 있어서, 탈수 축합제나 N-히드록시 함질소 방향족 화합물(예를 들면 히드록시벤조트리아졸 또는 그 유도체)이나 시아노(히드록시이미노)아세트산 에스테르나 N-탄화수소 치환 이미다졸 유도체를, 물, 완충액 또는 친수성 유기 용매 등의 용액에 용해 또는 현탁해서 첨가할 경우, 탈수 축합제나 N-히드록시 함질소 방향족 화합물(예를 들면 히드록시벤조트리아졸 또는 그 유도체)이나 시아노(히드록시이미노)아세트산 에스테르나 N-탄화수소 치환 이미다졸 유도체를 포함하는 용액은, 반응 용매(혼합 용매)의 일부를 구성한다.
상기 탈수 축합제의 바람직한 형태, 상기 N-히드록시 함질소 방향족 화합물(예를 들면 히드록시벤조트리아졸 또는 그 유도체), 시아노(히드록시이미노)아세트산 에스테르 또는 N-탄화수소 치환 이미다졸 유도체의 바람직한 형태, 상기 친수성 유기 용매의 바람직한 형태는, 임의로 조합시킬 수 있다. 예를 들면, DMT-MM과 DMSO의 조합, HATU와 DMSO의 조합, HATU와 DMF의 조합, EDCI 염산염과 HOAt와 DMSO의 조합, EDCI 염산염과 시아노(히드록시이미노)아세트산 에틸과 DMSO의 조합, 2-클로로-1-메틸피리디늄요오다이드와 HOAt와 DMSO의 조합, 클로로-N,N,N',N'-테트라메틸포름아미디늄헥사플루오로포스페이트와 HOAt와 DMSO의 조합, 클로로-N,N,N',N'-테트라메틸포름아미디늄헥사플루오로포스페이트와 N-메틸이미다졸과 DMSO의 조합을 들 수 있고, 특히 바람직한 조합의 형태는, HATU와 DMSO의 조합, HATU와 DMF의 조합, EDCI 염산염과 HOAt와 DMSO의 조합, 클로로-N,N,N',N'-테트라메틸포름아미디늄헥사플루오로포스페이트와 HOAt와 DMSO의 조합을 들 수 있다.
반응 용매(혼합 용매)의 pH는 적당히 조정할 수 있지만, 6.5~7.5인 것이 바람직하고, 6.9~7.5인 것이 보다 바람직하고, 예를 들면 6.5~7.0, 6.9~7.1, 또는 7.0~7.5이다.
제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자의 반응(아미드화 반응)에 사용하는 시간은, 적당히 설정할 수 있지만, 전형적으로는 1시간 이상, 예를 들면 1~48시간, 또는 1~24시간이면 좋다.
일실시형태에서는 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자는 등몰량으로 혼합해도 좋다. 본 발명에 있어서 「등몰량으로 혼합한다」란, 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자를 1:1.1~1.1:1의 몰비로 혼합하는 것을 의미한다. 아미드화 반응액(반응 용매) 중에서 형성된 본 발명에 따른 유전자 발현 억제 서열을 포함하는 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자는, 당업자가 공지의 방법에 의해 정제할 수 있다. 정제 기술로서는 역상 크로마토그래피, 역상고속 액체 크로마토그래피(RP-HPLC), 초고속 액체 크로마토그래피(UHPLC), 이온 교환 크로마토그래피 등의 크로마토그래피법, 겔 여과, 컬럼 정제, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 등, 또는 그것들의 임의의 조합을 들 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다.
특허문헌 2에 기재된 방법에서는, 극히 단쇄 중에 신장 반응이 정지한 것에 의한 단쇄 핵산 불순물이나 결손체 등의 핵산 불순물의 생성에 의해, 반응액 중의 목적 산물의 순도의 저하가 일어난다. 한편, 본 발명의 방법은 핵산 불순물을 저감할 수 있는 점에서 유리하다. 바람직한 실시형태에서는, 본 발명의 방법은 핵산 불순물의 생성을 저감하면서, 범용형 RNA 아미다이트를 사용해서 안정성이 높은 유전자 발현 억제성 단일쇄 RNA 분자를 제조할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자는, 상법에 따라, 생체 내 또는 세포 내에 투여함으로써, 표적 유전자의 발현을 억제하기 위해서 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서의 상기 바람직한 형태, 예를 들면, 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자, 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자, 완충액, 유기 용매, 탈수 축합제, pH, 유기 용매의 비율, 반응 시간, 사용량, 그 밖의 반응 조건 등은 임의로 조합시킬 수 있다.
본 발명은, 본 발명의 방법에 따라 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자의 제조를 위해 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자로서 사용할 수 있는, 단일쇄 올리고 RNA 분자를 제공한다.
일실시형태에서는, 표적 유전자인 TGF-β1 유전자 또는 GAPDH 유전자의 발현을 억제하는 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자의 제조에 사용하는 단일쇄 올리고 RNA 분자의 예로서, 하기 (a) 또는 (b)를 들 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다:
(a) 1번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 Lx2와 연결되고, 26번째와 27번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 Ly을 통해 연결되어 있는 서열번호 3으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 단일쇄 올리고 RNA 분자,
(b) 1번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 Lx2와 연결되고, 26번째와 27번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 Ly를 통해 연결되어 있는 서열번호 6으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 단일쇄 올리고 RNA 분자.
또한 본 발명은, 본 발명에 따른 단일쇄 올리고 RNA 분자의 조합(페어)을 포함하는, 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자의 제조용의 키트에도 관한 것이다. 그와 같은 키트는, 본 발명에 따른 표적 유전자의 발현을 억제하는 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자의 제조 방법을 실시하기 위해서 적합하게 사용할 수 있다.
일실시형태에서는, 키트의 예로서, 이하의 (1) 또는 (2)에 기재된 단일쇄 올리고 RNA 분자의 조합을 포함하는, TGF-β1 유전자 또는 GAPDH 유전자의 발현을 억제하기 위한 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자의 제조용의 키트를 들 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다:
(1) 24번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 Lx1과 연결되어 있는 서열번호 2로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와, 1번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 Lx2와 연결되고, 26번째와 27번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 L을 통해 연결되어 있는 서열번호 3으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자의 조합,
(2) 22번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 Lx1과 연결되어 있는 서열번호 5로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와, 1번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 Lx2와 연결되고, 26번째와 27번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 Ly를 통해 연결되어 있는 서열번호 6으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자의 조합.
(실시예)
이하, 실시예를 사용하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명의 기술적 범위는 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
(참고예 1)
프롤린디아미드형 아미다이트의 합성
프롤린디아미드형 아미다이트는, 예를 들면, 국제공개 WO2012/017919의 기재에 따라 합성할 수 있다. 구체적인 합성예를 이하에 나타내지만, 합성 방법은 그것에 의해 한정되지 않는다.
Figure pct00036
(1) Fmoc-히드록시아미드-L-프롤린(화합물 1)
Fmoc-L-프롤린(10.00g, 29.64m㏖), 4-아미노-1-부탄올(3.18g, 35. 56m㏖) 및 1-히드록시벤조트리아졸(10.90g, 70.72m㏖)을 혼합하고, 그 혼합물에 대하여 감압 하에서 탈기하여 아르곤 가스를 충전했다. 얻어진 혼합물에 무수 아세토니트릴(140mL)을 실온에서 첨가하고, 또한, 디시클로헥실카르보디이미드(7.34g, 35. 56m㏖)의 무수 아세토니트릴 용액(70mL)을 첨가한 후, 아르곤 분위기 하, 실온에서 15시간 교반했다. 반응 종료 후, 생성한 침전을 여과 선별하고, 회수한 액에 대하여 감압 하에서 용매를 증류 제거했다. 얻어진 잔사에 디클로로메탄(200mL)을 첨가하고, 포화중조수(200mL)로 세정했다. 그리고, 유기층을 회수하고, 황산 마그네슘으로 건조한 후 여과했다. 얻어진 액에 대하여 감압 하에서 용매를 증류 제거하고, 그 잔사에 디에틸에테르(200mL)를 첨가하여 분말화했다. 발생한 분말을 여과하여 취함으로써, 무색 분말 형상 물질로서 Fmoc-히드록시아미드-L-프롤린이 얻어졌다. Fmoc는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기이다.
(2) DMTr-아미드-L-프롤린(화합물 2)
Fmoc-히드록시아미드-L-프롤린(7.80g, 19.09m㏖)을 무수 피리딘(5mL)과 혼합하고, 실온에서 2회 공비 건조했다. 얻어진 잔류물에 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(8.20g, 24.20m㏖), 4-디메틸아미노피리딘(23mg, 0.19m㏖) 및 무수 피리딘(39mL)을 첨가했다. 이 혼합물을 실온에서 1시간 교반한 후, 메탄올(7.8mL)을 첨가하고, 실온에서 30분 교반했다. 이 혼합물을 디클로로메탄(100mL)으로 희석하고, 포화중조수(150mL)로 세정 후 유기층을 분리했다. 이 유기층을 황산나트륨으로 건조한 후 여과했다. 얻어진 액에 대하여 감압 하에서 용매를 증류 제거했다. 얻어진 미정제의 잔사에 무수 N,N-디메틸포름아미드(39mL) 및 피페리딘(18.7mL, 189m㏖)을 첨가하고, 실온에서 1시간 교반했다. 반응 종료 후, 그 혼합액으로부터 감압 하, 실온에서 용매를 증류 제거했다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(상품명 Wakogel C-300, 전개 용매 디클로로메탄:메탄올=9:1, 0.05% 피리딘 함유)에 제공함으로써, 담황색 유상 물질로서 DMTr-아미드-L-프롤린이 얻어졌다. DMTr은 4,4'-디메톡시트리틸기이다.
(3) DMTr-히드록시디아미드-L-프롤린(화합물 3)
얻어진 DMTr-아미드-L-프롤린(6.01g, 12.28m㏖), N-(3'-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드(2.83g, 14.74m㏖), 1-히드록시벤조트리아졸(3.98g, 29.47m㏖) 및 트리에틸아민(4.47g, 44.21m㏖)의 무수 디클로로메탄 용액(120mL)을 혼합했다. 이 혼합액에 아르곤 분위기 하, 실온에서 6-히드록시헥산산(1.95g, 14.47m㏖)을 더 첨가하고, 그 후, 아르곤 분위기 하, 실온에서 1시간 교반했다. 얻어진 혼합액을 디클로로메탄(600mL)으로 희석하고, 포화식염수(800mL)로 3회 세정했다. 유기층을 회수하고, 황산 나트륨으로 건조한 후 여과했다. 얻어진 액에 대하여 감압 하에서 용매를 증류 제거했다. 이것에 의해, 담황색 기포 형상 물질로서 DMTr-히드록시디아미드-L-프롤린이 얻어졌다.
(4) DMTr-디아미드-L-프롤린아미다이트(화합물 4)
얻어진 DMTr-히드록시디아미드-L-프롤린(8.55g, 14.18m㏖)을 무수 아세토니트릴과 혼합하고, 실온에서 3회 공비 건조했다. 얻어진 잔류물에 디이소프로필암모늄테트라졸리드(2.91g, 17.02m㏖)를 첨가하고, 감압 하에서 탈기하여 아르곤 가스를 충전했다. 그 혼합물에 대하여 무수 아세토니트릴(10mL)을 첨가하고, 또한, 2-시아노에톡시-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포디아미다이트(5. 13g, 17.02m㏖)의 무수 아세토니트릴 용액(7mL)을 첨가했다. 이 혼합물을 아르곤 분위기 하, 실온에서 2시간 교반했다. 얻어진 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고, 포화중조수(200mL)로 3회 세정한 후 포화식염수(200mL)로 세정했다. 유기층을 회수하고, 황산 나트륨으로 건조한 후 여과했다. 얻어진 액에 대해서 감압 하에 용매를 증류 제거했다. 얻어진 잔사를, 충전제로서 아미노 실리카겔을 사용한 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 헥산:아세트산 에틸=1:3, 0.05% 피리딘 함유)에 제공함으로써, 무색 시럽 형상 물질로서 DMTr-디아미드-L-프롤린아미다이트가 얻어졌다.
(실시예 1)
1. 프롤린에스테르형 아미다이트의 합성(시아노에틸 보호)
Figure pct00037
(1) Boc-L-프롤린-시아노에틸에스테르(화합물 5)
Boc-L-프롤린(10.00g, 46.46m㏖), 2-시아노에탄올(3.96g, 55. 75m㏖)을 혼합하고, 그 혼합물에 대하여 디클로로메탄(100mL)을 실온에서 첨가하고, 빙욕에서 냉각했다. N-(3'-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 염산염(9.80g, 51.10m㏖), 4-디메틸아미노피리딘(1.12g, 9.29m㏖)을 첨가한 후, 빙욕을 제거하고, 아르곤 분위기 하, 실온에서 3시간 교반했다. 얻어진 혼합액을 증류수(100mL)로 세정했다. 유기층을 회수하고, 황산 나트륨으로 건조한 후 여과했다. 얻어진 여액에 대하여 감압 하에서 용매를 증류 제거했다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 클로로포름:메탄올=19:1)에 제공함으로써, 유상 물질로서 Boc-L-프롤린-시아노에틸에스테르(12.47g, 수율 100%)를 얻었다. Boc는 부톡시카르보닐기이다.
(2) N-아미드-L-프롤린-시아노에틸에스테르(화합물 6)
Boc-L-프롤린-시아노에틸에스테르(12.47g, 46.46m㏖)를 디옥산(29mL)과 혼합했다. 얻어진 혼합물에 4M 염화수소디옥산 용액(44mL)을 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 2시간 교반한 후, 감압 하에서 용매를 증류 제거했다. 얻어진 미정제의 잔사에 디클로로메탄(90mL)을 첨가했다. 이 혼합물에 6-히드록시헥산산(8.09g, 61.20m㏖)과 트리에틸아민(9.40g, 92.91m㏖)을 첨가하고, 빙욕에서 냉각했다. EDCI 염산염(9.80g, 51.10m㏖)을 첨가한 후, 빙욕을 제거하고, 실온에서 4시간 교반했다. 얻어진 혼합액을 증류수(100mL)로 세정했다. 유기층을 회수하고, 황산 나트륨으로 건조한 후 여과했다. 얻어진 여액에 대하여 감압 하에서 용매를 증류 제거했다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 클로로포름:메탄올=9:1)에 제공함으로써, 유상 물질로서 N-아미드-L-프롤린-시아노에틸에스테르(10.16g, 수율 77%)를 얻었다.
(3) 시아노에틸-L-프롤린아미다이트(화합물 7)
얻어진 N-아미드-L-프롤린-시아노에틸에스테르(5.00g, 17.71m㏖)를 무수 아세토니트릴(40mL)과 혼합하고, 감압 하에서 탈기하여 아르곤 가스를 충전했다. 그 혼합물에 대하여, 테트라졸(1.49g, 21.25m㏖)과 디이소프로필아민(2.15g, 21.25m㏖)을 첨가하고, 2-시아노에톡시-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포디아미다이트 (6.41g, 21.25m㏖)의 무수 아세토니트릴 용액(10mL)을 더 첨가했다. 이 혼합물을 아르곤 분위기 하, 실온에서 3시간 교반했다. 얻어진 혼합물을 디클로로메탄(100mL)으로 희석하고, 5% 탄산 수소나트륨 수용액(100mL)으로 세정했다. 유기층을 회수하고, 황산 나트륨으로 건조한 후 여과했다. 얻어진 여액에 대하여 감압 하에 용매를 증류 제거했다. 얻어진 잔사를 충전제로서 아미노 실리카겔을 사용한 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 헥산:아세트산 에틸=1:4)에 제공함으로써, 유상 물질로서 시아노에틸-L-프롤린아미다이트(7.03g, 수율 82%)를 얻었다.
2. 프롤린에스테르형 아미다이트의 합성(2,4-디메톡시벤질 보호)
Figure pct00038
(1) Fmoc-L-프롤린-(2,4-디메톡시)벤질에스테르(화합물 8)
Fmoc-L-프롤린(12.04g, 35.67m㏖), 2,4-디메톡시벤질알콜(5.00g, 29. 73m㏖)을 혼합하고, 그 혼합물에 대하여, 디클로로메탄(100mL)을 실온에서 첨가했다. EDCI 염산염(6.84g, 35.67m㏖), 4-디메틸아미노피리딘(0.36g, 2.97m㏖)을 첨가한 후, 실온에서 3시간 교반했다. 얻어진 혼합액을 증류수(100mL)로 세정했다. 유기층을 회수하고, 황산 나트륨으로 건조한 후 여과했다. 얻어진 여액에 대하여 감압 하에서 용매를 증류 제거했다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 헥산:아세트산 에틸=3:2)에 제공함으로써, Fmoc-L-프롤린-(2,4-디메톡시)벤질에스테르(13.24g, 수율 91%)를 얻었다. Fmoc는 플루오렌일메틸옥시카르보닐기이다.
(2) L-프롤린-(2,4-디메톡시)벤질에스테르(화합물 9)
Fmoc-L-프롤린-(2,4-디메톡시)벤질에스테르(13.24g, 27.16m㏖)를 디클로로메탄(130mL)과 혼합했다. 얻어진 혼합물에 디아자비시클로운데센(4.96g, 32.59m㏖)을 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 1시간 교반한 후, 감압 하에서 용매를 증류 제거했다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 클로로포름:메탄올=9:1)에 제공함으로써, 유상 물질로서 L-프롤린-(2,4-디메톡시)벤질에스테르 (6.39g, 수율 89%)를 얻었다.
(3) N-아미드-L-프롤린-(2,4-디메톡시)벤질에스테르(화합물 10)
L-프롤린-(2,4-디메톡시)벤질에스테르(6.39g, 24.09m㏖)를 디클로로메탄(120mL)과 혼합했다. 이 혼합물에 6-히드록시헥산산(3.82g, 28.90m㏖)과 트리에틸아민(4.87g, 48.17m㏖)을 첨가했다. EDCI 염산염(5.54g, 28.90m㏖)을 첨가한 후, 실온에서 16시간 교반했다. 얻어진 혼합액을 증류수(100mL)로 세정했다. 유기층을 회수하고, 황산 나트륨으로 건조한 후 여과했다. 얻어진 여액에 대해서, 감압 하에서 용매를 증류 제거했다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 아세트산 에틸:메탄올=9:1)에 제공함으로써, 유상 물질로서 N-아미드-L-프롤린- (2,4-디메톡시)벤질에스테르(5.22g, 수율 57%)를 얻었다.
(4) (2,4-디메톡시)벤질-L-프롤린아미다이트(화합물 11)
N-아미드-L-프롤린-(2,4-디메톡시)벤질에스테르(2.00g, 5.27m㏖)를 무수 아세토니트릴(27mL)과 혼합하고, 감압 하에서 탈기하여 아르곤 가스를 충전했다. 그 혼합물에 대하여, 테트라졸(0.44g, 6.32m㏖)과 디이소프로필아민(0.64g, 6.32m㏖)을 첨가하고, 2-시아노에톡시-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포디아미다이트 (1.91g, 6.32m㏖)를 더 첨가했다. 이 혼합물을 아르곤 분위기 하, 실온에서 23시간 교반했다. 얻어진 혼합물을 클로로포름(60mL)으로 희석하고, 5% 탄산 수소나트륨 수용액(60mL)으로 세정했다. 유기층을 회수하고, 황산 나트륨으로 건조한 후 여과했다. 얻어진 여액에 대해서 감압 하에 용매를 증류 제거했다. 얻어진 잔사를, 충전제로서 아미노 실리카겔을 사용한 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 헥산:아세트산 에틸=1:4)에 제공함으로써, 유상 물질로서 (2,4-디메톡시)벤질-L-프롤린아미다이트(2.27g, 수율 74%)를 얻었다.
(참고예 2)
글리신디아미드형 아미다이트의 합성
글리신디아미드형 아미다이트는, 예를 들면, 국제공개 WO2013/103146의 기재에 따라 합성할 수 있다. 구체적인 합성예를 이하에 나타내지만, 합성 방법은 그것에 의해 한정되지 않는다.
Figure pct00039
(1) Fmoc-히드록시아미드-글리신(화합물 12)
Fmoc-글리신(4.00g, 13.45m㏖), 디시클로헥실카르보디이미드(3.33g, 16.15m㏖) 및 1-히드록시벤조트리아졸 1수화물(4.94g, 32.29m㏖)의 무수 N,N-디메틸포름아미드 용액(100mL)에 4-아미노부탄올(1.44g, 16.15m㏖)의 무수 N,N-디메틸포름아미드 용액(30mL)을 첨가하고, 아르곤 분위기 하, 실온에서 일야 교반했다. 생성한 침전을 여과 선별하고, 여액을 감압 하에서 농축했다. 얻어진 잔사에 디클로로메탄(200mL)을 첨가하고, 포화중조수로 3회 세정했다. 포화식염수로 더 세정했다. 황산 나트륨으로 건조 후, 감압 하에서 용매를 증류 제거했다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개 용매:디클로로메탄-메탄올(95:5)에 첨가하고, Fmoc-히드록시아미드-글리신(4.30g, 87%)을 얻었다.
(2) Fmoc-DMTr-아미드-글리신(화합물 13)
화합물 12(4.20g, 11.40m㏖)에 대하여 무수 피리딘을 사용하여 3회 공비 건조했다. 그 공비 잔사에 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(5.80g, 17.10m㏖) 및 무수 피리딘(80mL)을 첨가하고, 실온 하에서 일야 교반했다. 얻어진 반응 혼합물에 메탄올(20mL)을 첨가해 실온에서 30분 교반한 후, 감압 하에서 용매를 증류 제거했다. 그 후, 디클로로메탄(200mL)을 첨가하고, 포화중조수로 3회 세정하고, 포화식염수로 더 세정했다. 황산 나트륨으로 건조 후, 감압 하에서 용매를 증류 제거했다. 미정제의 Fmoc-DMTr-아미드-글리신(11.40g)을 얻었다.
(3) DMTr-아미드-글리신(화합물 14)
미정제의 화합물 13(11.40g, 16.99m㏖)에 N,N-디메틸포름아미드(45mL) 및 피페리딘(11.7mL)을 실온에서 첨가하고, 실온에서 일야 교반했다. 반응 혼합물을 감압 하에서 용매를 증류 제거하고, 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개 용매:디클로로메탄-메탄올(9:1)+0.05% 피리딘)에 첨가하고, DMTr-아미드-글리신(4.90g, 96%, 2steps)을 얻었다.
(4) DMTr-히드록시디아미드-글리신(화합물 15)
화합물 14(4.80g, 10.70m㏖)를 무수 피리딘으로 3회 공비 건조 후, 아르곤 분위기 하에서 6-히드록시헥산산(1.70g, 12.84m㏖), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(2.46g, 12.84m㏖), 1-히드록시벤조트리아졸 1수화물 (3.93g, 25.69m㏖), 및 무수 디클로로메탄(60mL)을 실온에서 첨가하고, 10분간 교반했다. 이와 같이 해서 얻은 혼합물에 트리에틸아민(3.90g, 38.53m㏖)을 첨가하고, 아르곤 분위기 하, 실온에서 일야 교반했다. 얻어진 반응 혼합물에 디클로로메탄(200mL)을 첨가해 포화중조수로 3회, 포화식염수로 1회 더 세정했다. 유기층을 분취하여 황산 나트륨으로 건조 후, 감압 하에서 용매를 증류 제거했다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개 용매:디클로로메탄-메탄올(95:5)+0.05% 피리딘)에 첨가하고, DMTr-히드록시디아미드-글리신(4.80g, 80%)을 얻었다.
(5) DMTr-디아미드-글리신아미다이트(화합물 16)
화합물 15(4.70g, 8.35m㏖)를 무수 피리딘으로 3회 공비 건조했다. 이어서, 디이소프로필암모늄테트라졸리드(1.72g, 10.02m㏖)를 첨가하고, 감압 하에서 탈기하여 아르곤 가스를 충전하고, 무수 아세토니트릴(5mL)을 첨가했다. 또한, 2-시아노에톡시-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포디아미다이트(3.02g, 10.02m㏖)의 무수 아세토니트릴디클로로메탄 혼합 용액(1:1)(4mL)을 첨가하고, 혼합물을 아르곤 분위기 하, 실온에서 4시간 교반했다. 얻어진 반응 혼합물에 디클로로메탄(150mL)을 더하고, 포화중조수로 2회, 포화식염수로 1회 더 세정했다. 유기층을 분취하고, 황산 나트륨으로 건조 후, 감압 하에서 용매를 증류 제거했다. 아미노실리카를 사용한 컬럼 크로마토그래피(전개 용매:n-헥산-아세톤(3:2)+0.1% 트리에틸아민)에 잔사를 첨가하고, DMTr-디아미드-글리신아미다이트(4.50g, 71%, HPLC 98.2%)를 얻었다.
(실시예 2)
글리신에스테르형 아미다이트의 합성(시아노에틸 보호)
Figure pct00040
(1) Boc-글리신-시아노에틸에스테르(화합물 17)
Boc-글리신(5.00g, 28.54m㏖), 2-시아노에탄올(2.40g, 33. 76m㏖)을 혼합하고, 그 혼합물에 대하여 디클로로메탄(50mL)을 실온에서 첨가하고, 빙욕에서 냉각했다. N-(3'-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 염산염(EDC)(6.00g, 31.30m㏖)과 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)(0.70g, 5.73m㏖)을 첨가한 후, 빙욕을 제거하고, 아르곤 분위기 하, 실온에서 3시간 교반했다. 얻어진 혼합액을 증류수와 포화식염수로 세정했다. 유기층을 회수하고, 황산 나트륨으로 건조한 후 여과했다. 얻어진 여액에 대하여 감압 하에서 용매를 증류 제거했다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 헥산:아세트산 에틸=3:2)에 제공함으로써, Boc-글리신-시아노에틸에스테르(5.70g, 수율 88%)를 얻었다.
(2) 글리신-시아노에틸에스테르(화합물 18)
Boc-글리신-시아노에틸에스테르(2.80g, 12.27m㏖)를 디옥산(7.5mL)과 혼합했다. 얻어진 혼합물에 4M 염화수소디옥산 용액(20mL)을 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 3시간 교반한 후, 감압 하에서 용매를 증류 제거했다. 얻어진 백색의 고체를 아세트산 에틸로 세정했다. 진공 건조하고, 글리신-시아노에틸에스테르(1.90g)를 얻었다.
(3) 6-(4,4'-디메톡시트리틸)헥산산(화합물 21)
공비 건조한 6-히드록시헥산산(1.2g, 9.08m㏖)과 DMAP(113mg, 0.92m㏖)의 피리딘 용액(30mL)에 4,4-디메톡시트리틸클로라이드(3.1g, 9.15m㏖)를 첨가해서 실온에서 5시간 교반한 후, 메탄올(5mL)을 첨가해서 30분 교반했다. 혼합액을 감압 농축한 후, 디클로로메탄을 첨가해서 용액을 희석했다. 이 용액을 포화탄산 수소나트륨 수용액으로 3회, 포화식염수로 1회 세정했다. 유기층을 회수하고, 황산 나트륨으로 건조한 후 여과했다. 얻어진 여액에 대하여 감압 하에서 용매를 증류 제거했다. 감압 건조하여 미정제의 6-(4,4'-디메톡시트리틸)헥산산(6.2g)을 얻었다.
(4) N-아미드-글리신-시아노에틸에스테르(화합물 19)
글리신-시아노에틸에스테르(0.85g, 6.70m㏖)를 N,N-디메틸포름아미드(15mL)에 녹였다. 이 혼합물에 6-(4,4'-디메톡시트리틸)헥산산(6.2g)과 트리에틸아민 (1.35g, 13.34m㏖)을 첨가해 빙냉 하에서 교반했다. EDC(2.55g, 13.30m㏖)를 첨가한 후, 빙욕을 제거하고 실온에서 15시간 교반했다. 얻어진 혼합액을 감압 농축하고, 디클로로메탄을 첨가해서 용액을 희석했다. 포화탄산 수소나트륨 수용액, 그리고 포화식염수로 세정했다. 유기층을 회수하고, 황산 나트륨으로 건조한 후 여과했다. 얻어진 여액에 대하여 감압 하에서 용매를 증류 제거했다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 헥산:아세트산 에틸=1:1, 0.05% 피리딘 함유)에 제공함으로써 백색 고체를 얻었다(2.50g, 수율 69%). 얻어진 백색 고체(2.50g, 4.59m㏖)를 80% 아세트산 수용액(30mL)에 첨가하고, 실온에서 3시간 교반했다. 반응 용액을 분액 로트에 넣고, 수층으로부터 탈보호한 4,4-디메톡시트리틸기를 제거할 수 있을 때까지 헥산에 의해 세정했다. 수층에 톨루엔을 첨가하여 공비를 3회 행했다. 진공 건조함으로써, 백색 고체로서 N-아미드-글리신-시아노에틸에스테르(0.80g, 수율 72%)를 얻었다.
(5) 시아노에틸-글리신아미다이트(화합물 20)
N-아미드-글리신-시아노에틸에스테르(0.80g, 3.30m㏖)를 무수 아세토니트릴로 2회 공비했다. 디이소프로필암모늄테트라졸리드(0.68g, 3.97m㏖)를 첨가하여 진공 건조했다. 이 혼합물에 무수 아세토니트릴(3mL)을 첨가했다. 2-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포디아미다이트(1.20g, 3.98m㏖)의 무수 아세토니트릴 용액(1mL)을 첨가했다. 이 혼합물을 아르곤 분위기 하, 실온에서 3시간 교반했다. 얻어진 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고, 포화탄산 수소나트륨 수용액과 포화식염수로 세정했다. 유기층을 회수하고, 황산 나트륨으로 건조한 후 여과했다. 얻어진 여액에 대해서 감압 하에 용매를 증류 제거했다. 유상 물질로서 시아노에틸-글리신아미다이트(1.4g)를 얻었다.
(실시예 3)
후술의 실시예 4에서는, TGF-β1 유전자 발현 억제 서열을 갖는 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자(이하, ssTbRNA라고도 칭한다.)를, 그 2개의 분할 프래그먼트인, 말단에 아미노기를 갖는 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자(이하, 스트랜드 A)와, 말단에 카르복실기를 갖는 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자(스트랜드 B)를 아미드화 반응에 의해 연결함으로써 제작한다(도 1 참조).
그래서 본 실시예에서는, Ly, Lx1 및 Lx2가 이하에 나타내는 구조의 스트랜드 A 및 스트랜드 B-1의 합성을 행했다.
Figure pct00041
스트랜드 A 및 스트랜드 B-1은, 포스포아미다이트법에 의해, 핵산 자동 합성 장치(AKTA oligopilot plus 10, GE Healthcare Life Sciences)를 사용해서 합성했다. 이 합성에는 RNA 아미다이트로서 TBDMS 아미다이트를 사용했다. 스트랜드 B-1의 3' 말단에는, 보호 구아노신을 결합한 핵산 합성용 폴리머 비드 Nitto Phase(등록상표; 닛토덴코 가부시키가이샤) HL rG(ibu)를 사용하고, Ly의 연결을 위해, 특수 아미다이트로서 DMTr-디아미드-L-프롤린아미다이트(화합물 4)를, Lx2의 연결을 위해, 시아노에틸-L-프롤린아미다이트(화합물 7) 또는 (2,4-디메톡시)벤질-L-프롤린아미다이트(화합물 11)를 사용했다. 또한, 스트랜드 A의 3' 말단에는, 3'-PT Amino-Modifier C4 CPG(화합물명: N-(4-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)-부틸)-(2-카르복시아미드)-프탈이미딜-lcaa-CPG; Link Technologies)를 사용했다. 핵산의 고상 합성 및 합성 후의 탈보호 반응은 상법에 따라 행했다. 여기에서, 시아노에틸기의 탈보호는 고상 담체로부터의 절제시에 행해진다. (2,4-디메톡시)벤질기의 탈보호는 합성 종료 후의 고상 담체를 3% 트리클로로아세트산/톨루엔 용액 중에서 1시간 정치한 후, 용액을 제거함으로써 행했다. 화합물 7 또는 화합물 11 중 어느 하나를 사용했을 경우라도 동일 스트랜드 B-1이 얻어진다.
핵산 합성 후의 반응 용액에 염화나트륨 수용액과 2-프로판올을 첨가해서 원심 분리하고, 상청을 제거했다. 얻어진 침전물을 주사용수에 용해시키고, 역상 크로마토그래피(Inertsil ODS-3, GL Sciences; 이동상 A: 50mM TEAB 완충액, 5% 아세토니트릴; 이동상 B: 50mM TEAB 완충액, 50% 아세토니트릴)로 정제했다. 목적의 프랙션에 염화나트륨 수용액과 에탄올을 첨가해서 원심 분리하여 침전물을 회수했다. 질량 분석에 의해 목적물의 분자량과 일치하는 것을 확인했다. 회수된 목적물은, 3' 말단에 아미노기를 갖는 비뉴클레오티드성 링커 Lx1을 갖는 스트랜드 A와, 5' 말단에 카르복실기를 갖는 비뉴클레오티드성 링커 Lx2를 갖는 스트랜드 B-1이다. 스트랜드 B-1의 Ly 및 Lx2는 피롤리딘 골격을 갖고 있다.
하기 실시예에 있어서, 스트랜드 A의 말단의 아미노기와, 스트랜드 B-1의 말단의 카르복실기를 아미드 결합에 의해 연결하고, 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자(ssTbRNA)를 제작한다.
(실시예 4)
실시예 3에서 합성한 스트랜드 A 및 스트랜드 B-1을 사용하고, 하기 조작 A~C 중 어느 하나의 방법을 이용하여 각종 반응 조건 하에서 아미드화 반응을 행하고, 스트랜드 A 및 스트랜드 B-1을 연결하여, 반응 수율을 HPLC 분석으로 결정했다.
·조작 A: 스트랜드 A의 5.3mM 수용액 380μL와 스트랜드 B-1의 5.6mM 수용액 360μL를 혼합하고, 물을 첨가해서 2mL로 정용한 용액으로부터 30μL를 측정하여, 감압 증발기 및 진공 펌프로 용매를 증류 제거해 건조시켰다. 얻어진 잔사에 실온에서 완충액을 첨가해서 용해시켰다. 그 후, 유기 용매와 탈수 축합제의 0.4M 수용액을 첨가하여 실온에서 교반했다.
·조작 B: 스트랜드 A의 5.3mM 수용액 380μL와 스트랜드 B-1의 5.6mM 수용액 360μL를 혼합하고, 물을 첨가해서 2mL로 정용한 용액으로부터 30μL를 측정하고, 감압 증발기 및 진공 펌프로 용매를 증류 제거해 건조시켰다. 얻어진 잔사에 실온에서 완충액을 첨가해서 용해시켰다. 그 후, 유기 용매와 탈수 축합제의 0.4M 유기 용매 용액을 첨가하여 실온에서 교반했다. 또한 이 탈수 축합제 용액은, 그것과 혼합한 유기 용매(하기 표에 기재)와 동일 종류의 유기 용매를 사용하여 조제했다.
·조작 C: 스트랜드 A의 5.3mM 수용액 380μL와 스트랜드 B-1의 5.6mM 수용액 360μL를 혼합하고, 물을 첨가해서 2mL로 정용한 용액으로부터 30μL를 측정하고, 감압 증발기 및 진공 펌프로 용매를 증류 제거해 건조시켰다. 얻어진 잔사에 실온에서 완충액을 첨가해서 용해시켰다. 그 후, 탈수 축합제를 고체로 해서 첨가하여 실온에서 교반했다.
·조작 D: 스트랜드 A의 4.8mM 수용액 170μL와 스트랜드 B-1의 4.8mM 수용액 170μL를 혼합하고, 물을 첨가해서 1mL로 정용한 용액으로부터 38μL를 측정하고, 감압 증발기 및 진공 펌프로 용액을 증류 제거해 건조시켰다. 얻어진 잔사에 실온에서 완충액을 첨가해서 용해시켰다. 그 후, 유기 용매와 탈수 축합제의 0.4M 유기 용매 용액을 첨가하여 실온에서 교반했다. 또한 이 탈수 축합제 용액은, 그것과 혼합한 유기 용매(하기 표에 기재)와 동일 종류의 유기 용매를 사용하여 조제했다.
·조작 E: 스트랜드 A의 4.8mM 수용액 170μL와 스트랜드 B-1의 4.8mM 수용액 170μL를 혼합하고, 물을 첨가해서 1mL로 정용한 용액으로부터 38μL를 측정하고, 감압 증발기 및 진공 펌프로 용액을 증류 제거해 건조시켰다. 얻어진 잔사에 실온에서 완충액을 첨가해서 용해시켰다. 그 후, 탈수 축합제를 고체로 해서 첨가하여 실온에서 교반했다.
·조작 F: 스트랜드 A의 4.8mM 수용액 170μL와 스트랜드 B-1의 4.8mM 수용액 170μL를 혼합하고, 물을 첨가해서 1mL로 정용한 용액으로부터 38μL를 측정하고, 감압 증발기 및 진공 펌프로 용액을 증류 제거해 건조시켰다. 얻어진 잔사에 실온에서 완충액을 첨가해서 용해시켰다. 그 후, 유기 용매와 탈수 축합제의 1.6M 유기 용매 용액을 첨가하여 실온에서 교반했다. 또한 이 탈수 축합제 용액은, 그것과 혼합한 유기 용매(하기 표에 기재)와 동일 종류의 유기 용매를 사용하여 조제했다.
·조작 G: 스트랜드 A의 4.8mM 수용액 170μL와 스트랜드 B-1의 4.8mM 수용액 170μL를 혼합하고, 물을 첨가해서 1mL로 정용한 용액으로부터 38μL를 측정하고, 감압 증발기 및 진공 펌프로 용액을 증류 제거해 건조시켰다. 얻어진 잔사에 실온에서 완충액을 첨가해서 용해시켰다. 그 후, 유기 용매와 탈수 축합제의 0.2M 용액(주사용수와 아세토니트릴의 체적비로 1:1의 혼합 용액)을 첨가하여 실온에서 교반했다.
탈수 축합제의 첨가로부터 1, 3, 5, 8, 및 23시간 후에 샘플링을 행하고, 반응액의 HPLC 분석을 행하여 반응 수율을 결정했다. HPLC 분석 조건은 이하와 같다.
·컬럼: XBridge Oligonucleotide BEH C18(Waters) 4.6×50㎜, 2.5㎛
·컬럼 온도: 60℃
·이동상 A: 200mM TEAA 수용액(pH7.0)/아세토니트릴=95/5
·이동상 B: 200mM TEAA 수용액(pH7.0)/아세토니트릴=50/50
·전개 조건: A/B=100/0(0-3min), 100/0→70/30(3-23min, 리니어 그라디언트), 70/30(23-33min), 70/30→100/0(33-33.1min, 리니어 그라디언트), 100/0(33.1-45min)
·유속: 1.0mL/min
·검출: PDA 검출기(254nm)
·주입량: 10μL
반응 수율(%)은 HPLC 해석 결과에 근거하여, 이하의 식으로 산출했다.
반응 수율(%)=(ssTbRNA의 피크 면적)/(크로마토그램 중의 총피크 면적)×100
1) 탈수 축합제의 검토
탈수 축합제를 검토하기 위해서, 상기 방법에 의해, 시험예 1~4, 21~32 및 비교예 1~9, 12~22에 대해서 아미드화 반응을 행했다. 시험예 1~4, 21~32 및 비교예 1~9, 12~22에 있어서의, 조작, 첨가한 완충액의 종류 및 첨가량, 첨가한 유기 용매의 종류 및 첨가량, 및 첨가한 탈수 축합제의 종류 및 첨가량을 표 1, 표 2, 및 표 3에 나타낸다.
Figure pct00042
MOPS, DMT-MM, HATU, EDCI, HOAt의 의미에 대해서는 상술하고 있다.
HBTU는 O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트이다. TSTU는 N,N,N',N'-테트라메틸-O-(N-숙신이미딜)우로늄테트라플루오로보레이트이다. TFFH는 플루오로-N,N,N',N'-테트라메틸포름아미디늄헥사플루오로포스페이트이다. COMU(등록상표; Luxembourg Bio Technologies Ltd.)는 1-[(1-(시아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴아미노옥시)디메틸아미노모르폴리노)]우로늄헥사플루오로포스페이트이다. PyBOP는 (벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트이다. DPPA는 디페닐포스포릴아지드이다. CDI는 카르보닐디이미다졸이다.
Figure pct00043
HCTU는 O-(6-클로로벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트이다. TPTU는 O-(1,2-디히드로-2-옥소-1-피리딜)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄테트라플루오로보레이트이다. TDBTU는 O-(3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진-3-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄테트라플루오로보레이트이다. HOBt는 1-히드록시벤조트리아졸이다. HOPO는 2-히드록시피리딘-N-옥시드이다. TCFH는 클로로-N,N,N',N'-테트라메틸포름아미디늄헥사플루오로포스페이트이다. NMI는 N-메틸이미다졸이다. 화합물 22는 1-히드록시-1,2,3-트리아졸-4-카르복실산 에틸이다. 화합물 23은 시아노(히드록시이미노)아세트산 에틸이다. 화합물 24는 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진이다. 화합물 25는 4-(디메틸아미노)피리딘-N-옥시드이다. 화합물 26은 2-클로로-1-메틸피리디늄요오다이드이다.
Figure pct00044
HOTT는 N,N,N',N'-테트라메틸-S-(1-옥시드-2-피리딜)티오우로늄헥사플루오로포스페이트이다. DEPBT는 인산 디에틸3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진-3-일이다. DMAP는 4-디메틸아미노피리딘이다. DIC는 디이소프로필카르보디이미드이다. 화합물 27은 3-니트로-1-토실-1,2,4-트리아졸이다. 화합물 28은 N-tert-부틸-5-메틸이소옥사졸륨퍼클로레이트이다. 화합물 29는 2,4,6-트리프로필-1,3,5,2,4,6-트리옥사트리포스포리난이다.
표 4, 표 5, 및 표 6에 탈수 축합제에 의한 반응성의 차이를 나타낸다.
Figure pct00045
표 4에 나타내어지는 바와 같이, 탈수 축합제로서 DMT-MM, HATU, HBTU, 또는 EDCI 염산염과 HOAt를 조합시켜서 사용했을 경우에 높은 수율이 얻어진(시험예 1~4) 한편, HATU, HBTU와 동일 벤조트리아졸릴 구조를 포함하는 탈수 축합제여도, PyBOP 등의 포스포늄형 탈수 축합제에서는 높은 수율은 얻어지지 않았다(비교예 5). 또한, 우로늄형 탈수 축합제에 있어서도, N-히드록시 함질소 방향환 구조를 포함하지 않는 TSTU, TFFH, COMU(등록상표; Luxembourg Bio Technologies Ltd.)에서는 높은 수율은 얻어지지 않았다(비교예 2~4).
Figure pct00046
또한 표 5에 나타내어져 있는 바와 같이, 탈수 축합제로서 HCTU, TPTU 또는TDBTU 단독의 경우, EDCI 염산염과, HOBt, 화합물 22, HOPO, 화합물 23, 화합물 24또는 화합물 25를 조합시켰을 경우, TCFH와, HOAt 또는 NMI를 조합시켰을 경우, 또는, 화합물 26과 HOAt를 조합시켰을 경우에 높은 수율이 얻어졌다(시험예 21~32).
Figure pct00047
표 6에 나타내어져 있는 바와 같이, 완충액 대신에 주사용수를 사용한 결과, 수율이 낮아지는 결과가 얻어졌다(비교예 21, 22).
이상의 결과로부터, N-히드록시 함질소 방향환 구조(예를 들면 1-히드록시벤조트리아졸 구조)를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제(예를 들면 벤조트리아졸릴우로늄형 탈수 축합제) 또는 EDCI 염산염과 N-히드록시 함질소 방향족 화합물을 조합시켰을 경우에 있어서 높은 수율이 얻어지는 것이 나타내어졌다. 한편, 탈수 축합제로서 DPPA나 CDI를 사용했을 경우에서는, 각각 단독 또는 HOAt와 조합시켜도 높은 수율은 얻어지지 않았다(비교예 6~9).
2) 트리아진형 탈수 축합제를 사용한 아미드화 반응
트리아진형 탈수 축합제를 사용한 아미드화 반응의 반응 조건을 검토하기 위해서, DMT-MM을 탈수 축합제에 사용해서 상기 방법에 의해, 시험예 1, 5~14 및 비교예 10의 아미드화 반응을 행했다. 시험예 1, 5~14 및 비교예 10에 있어서의, 조작, 첨가한 완충액의 종류 및 첨가량, 첨가한 유기 용매의 종류 및 첨가량 및 탈수 축합제의 종류 및 첨가량을 표 7에 나타낸다.
Figure pct00048
표 8~10에 유기 용매의 첨가 효과, 유기 용매 비율의 영향, 완충액 pH의 영향에 대해서 나타낸다. 표 중의 유기 용매 비율은, 아미드화에 사용한 탈수 축합제 용액에 포함되는 유기 용매의 양도, 유기 용매의 합계량에 포함시켜서 산출했다.
Figure pct00049
표 8에 나타내어져 있는 바와 같이, 유기 용매를 첨가하지 않을 경우(비교예 10)와 비교하여, 유기 용매의 첨가에 의해 목적물의 수율이 향상하는 결과가 얻어졌다. 특히 DMSO를 첨가했을 경우에 높은 효과가 얻어졌다(시험예 1).
Figure pct00050
표 9에 나타내어져 있는 바와 같이, DMSO의 비율을 용매 전체의 35~60체적%로 했을 때, 목적물이 높은 수율로 얻어졌다(시험예 1, 9~11).
Figure pct00051
표 10에 나타내어져 있는 바와 같이, pH6.5~7.5의 범위에서 특히 높은 수율이 얻어졌다. pH가 6.0까지 저하되면, 반응 속도의 저하에 의해 수율이 낮아지는 경향이 확인되었다.
3) 벤조트리아졸릴우로늄형 탈수 축합제를 사용한 아미드화 반응
벤조트리아졸릴우로늄형 탈수 축합제를 사용한 아미드화 반응의 반응 조건을 검토하기 위해서, HATU를 탈수 축합제에 사용하고, 상기 방법에 의해, 시험예 2, 15~20, 33~38 및 비교예 11에 대해서 아미드화 반응을 행했다. 시험예 2, 15~20, 33~38 및 비교예 11에 있어서의, 조작, 첨가한 완충액의 종류 및 첨가량, 첨가한 유기 용매의 종류 및 첨가량 및 첨가한 탈수 축합제의 종류 및 첨가량을 표 11에 나타낸다.
Figure pct00052
표 12, 13에 유기 용매의 첨가 효과, 유기 용매 비율의 영향에 대해서 나타낸다.
Figure pct00053
표 12에 나타내어져 있는 바와 같이, 유기 용매를 첨가하지 않을 경우(비교예 11)와 비교하여, 유기 용매의 첨가에 의해 목적물의 수율이 향상되는 결과가 얻어졌다(시험예 2, 16~20, 38). 특히 비프로톤성의 친수성 유기 용매를 첨가했을 경우에 높은 효과가 얻어졌다.
Figure pct00054
표 13에 나타내어져 있는 바와 같이, DMSO의 비율을 용매 전체의 20~65체적%로 했을 때, 목적물이 높은 수율로 얻어졌다(시험예 2, 15, 33, 34). 또한, DMF, DMEU, 아세토니트릴의 비율을 용매 전체의 50~65체적%로 했을 때도, 목적물이 높은 수율로 얻어졌다(시험예 16, 17, 19, 35~37).
(실시예 5)
ssTbRNA의 단리 정제
1) DMT-MM을 사용한 아미드화 반응
스트랜드 A 수용액 및 스트랜드 B-1 수용액으로부터 각 1μ㏖을 측정하여 혼합하고, 원심 농축기로 용매를 증류 제거해 건조시켰다. 얻어진 잔사에 1M MOPS 완충액을 80μL 첨가해서 용해시키고, 용액을 95℃까지 가열 후, 실온까지 방랭했다. 1M DMT-MM 수용액을 80μL, DMSO를 100μL 첨가해 교반 후, 실온에서 6시간 정치했다. 상기 반응 용액에 2M 염화나트륨 수용액을 20μL와, 에탄올 800μL를 첨가해서 교반하고, -30℃에서 정치 후 원심 분리하고, 상청을 제거하여 취득한 침전물을 건조시켰다. 침전물을 주사용수에 용해시키고, 강음이온 교환 크로마토그래피(DNAPac PA100, Thermo Fisher Scientific; 이동상 A: 25mM Tris-HCl 완충액, 10% 아세토니트릴; 이동상 B: 25mM Tris-HCl 완충액, 10% 아세토니트릴, 700mM NaClO4)로 정제하여 목적물을 분취했다. 목적의 프랙션을 에탄올 침전으로 회수하고, 백색 고체 11.7mg(RP-HPLC 순도: 90%, 수율: 69%)을 얻었다. 질량 분석에 의해 목적물의 분자량과 일치하는 것을 확인했다.
2) HATU를 사용한 아미드화 반응
스트랜드 A 수용액 및 스트랜드 B-1 수용액으로부터 각 1μ㏖을 측정하여 혼합하고, 원심 농축기로 용매를 증류 제거해 건조시켰다. 얻어진 잔사에 1M MOPS 완충액을 100μL 첨가해서 용해시키고, 용액을 95℃까지 가열 후, 실온까지 방랭했다. HATU의 0.2M DMSO 용액을 100μL 첨가해 교반 후, 실온에서 4시간 정치했다. 상기 반응 용액에 2M 염화나트륨 수용액을 20μL와, 에탄올 800μL를 첨가해서 교반하고, -30℃에서 정치 후 원심 분리하고, 상청을 제거하여 취득한 침전물을 건조시켰다. 침전물을 주사용수에 용해시키고, 강음이온 교환 크로마토그래피(DNAPac PA100, Thermo Fisher Scientific; 이동상 A: 25mM Tris-HCl 완충액, 10% 아세토니트릴; 이동상 B: 25mM Tris-HCl 완충액, 10% 아세토니트릴 , 700mM NaClO4)로 정제하여 목적물을 분취했다. 목적의 프랙션을 에탄올 침전으로 회수하고, 백색 고체 14.1mg(AEX-HPLC 순도: 96%, 수율 83%)을 얻었다. 질량 분석에 의해 목적물의 분자량과 일치하는 것을 확인했다.
상기 방법으로 얻어진 ssTbRNA의 순도를 RP-UPLC(reversed phase ultra performance liquid chromatography; 역상 초고속 액체 크로마토그래피)에 의해 분석하고, 특허문헌 2에 기재된 포스포아미다이트법을 이용한 고상 합성에 의해 합성한 ssTbRNA와 비교한 결과를 표 14에 나타낸다. 분석 조건 및 해석 조건은 하기와 같다.
분석 조건:
·컬럼: ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18 130Å(Waters), 2.1×100㎜, 1.7㎛
·컬럼 온도: 80℃
·이동상 A: 50mM TEAA·1mM EDTA 수용액(pH7.3)
·이동상 B: 50mM TEAA·1mM EDTA 수용액/메탄올=20/80
·전개 조건: A/B=100/0→75/25(0-10min, 리니어 그라디언트), 75/25→0/100 (10-10.5min, 리니어 그라디언트), 0/100(10.5-15min), 0/100→100/0(15-15.5min, 리니어 그라디언트)
·유속: 0.2mL/min
·검출: PDA 검출기(260nm)
·주입량: 10μL
해석 조건:
·Width: 2sec
·Slope: 4000μV/min
·Drift: 0μV/min
·T.DBL: 1000min
·최소 면적: 500카운트
Figure pct00055
표 14 중, 스트랜드 A, 스트랜드 B-1 및 ssTbRNA 분자의 값은, 크로마토그램에 근거하는 각각의 피크 면적 비율을 나타내고, 상기 해석 조건을 이용하여 산출했다. 또한, ssTbRNA 분자의 피크 부근의 핵산(주로 ssTbRNA 분자와 그 결손체를 포함한다)의 상대량으로서, ssTbRNA 분자의 피크를 포함하는, RRT(relative retention time; 여기에서는 ssTbRNA 분자의 피크의 유지 시간을 1로 했을 경우의 상대 유지 시간)=0.98~1.07의 범위에 대해서 피크 면적%의 합계값을 산출했다. 또한 스트랜드 A와 스트랜드 B-1의 피크 유지 시간은 ssTbRNA 분자의 피크와는 충분히 떨어져 있고, RRT=0.98~1.07의 범위에는 포함되지 않는다.
표 14에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 방법으로 합성한 ssTbRNA 분자에 포함되는 핵산 불순물의 양은 약간이며, ssTbRNA 분자의 피크 부근에 나타내어지는 결손체(ssTbRNA 분자의 서열의 일부가 빠진 것)의 양도 적었다. 한편, 포스포아미다이트법을 이용한 고상 합성에 의해 합성했을 경우(특허문헌 2), ssTbRNA 분자 이외의 단쇄 핵산 불순물(합성이 단쇄 중에 정지한 RNA 분자 등)이 비교적 많이 포함되어 있고, ssTbRNA 분자의 피크 부근에 나타내어지는 결손체도 많았다. 본 발명의 방법에서는, 목적의 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자를 고순도로 제조할 수 있는 것이 나타내어졌다.
(실시예 6)
TGF-β1 유전자 발현 억제 서열을 갖는 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자의 2개의 분할 프래그먼트로서, Ly, Lx1 및 Lx2가 이하에 나타내는 구조의 스트랜드 A 및 스트랜드 B-2의 합성을 행했다.
Figure pct00056
스트랜드 A 및 스트랜드 B-2는, 포스포아미다이트법에 의해, 핵산 자동 합성 장치(ABI3900; Applied Biosystems)를 사용해서 합성했다. 이 합성에는 RNA 아미다이트로서 TBDMS 아미다이트를 사용했다. 스트랜드 B-2의 3' 말단에는 2'-O-TBDMS-구아노신(N-iBu)-3'-lcaa-CPG(ChemGenes)를 사용하고, Ly의 연결을 위해 특수 아미다이트로서 DMTr-디아미드-L-프롤린아미다이트(화합물 4)를, Lx2의 연결을 위해 시아노에틸-글리신아미다이트(화합물 20)를 사용했다. 또한, 스트랜드 A의 3' 말단에는, 3'-PT Amino-Modifier C4 CPG(화합물명: N-(4-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)-부틸)-(2-카르복시아미드)-프탈이미딜-lcaa-CPG; ChemGenes)를 사용했다. 핵산의 고상 합성 및 합성 후의 탈보호 반응은 상법에 따라 행했다.
각 스트랜드의 탈보호 반응 종료 후의 반응 용액에 염화나트륨 수용액과 2-프로판올을 첨가해서 원심 분리하고, 상청을 제거했다. 얻어진 침전물을 주사용수에 용해시켰다. 질량 분석에 의해 목적물의 분자량과 일치하는 것을 확인했다. 회수된 목적물은, 3' 말단에 아미노기를 갖는 비뉴클레오티드성 링커 Lx1을 갖는 스트랜드 A(질량 분석 측정값: 7817.3, 이론값: 7816.8)와, 5' 말단에 카르복실기를 갖는 비뉴클레오티드성 링커 Lx2를 갖는 스트랜드 B-2(질량 분석 측정값: 9195.0, 이론값: 9194.6)이다.
스트랜드 A 수용액 및 스트랜드 B-2 수용액으로부터 각 100n㏖을 측정하여 혼합하고, 원심 농축기로 용매를 증류 제거해 건조시켰다. 얻어진 잔사에 1M MOPS 완충액을 10μL 첨가해서 용해시키고, 용액을 95℃까지 가열 후 실온까지 방랭했다. HATU의 0.2M DMSO 용액을 10μL 첨가해 교반 후, 실온에서 4시간 정치했다. 상기 반응 용액에 2M 염화나트륨 수용액을 2μL와, 에탄올 50μL를 첨가해서 교반하고, -30℃에서 정치 후 원심 분리하고, 상청을 제거하여 취득한 침전물을 건조시켰다. 질량 분석에 의해 목적물의 분자량과 일치하는 것을 확인했다(측정값: 16993.9, 이론값 16993.3).
(실시예 7)
TGF-β1 유전자 발현 억제 서열을 갖는 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자의 2개의 분할 프래그먼트로서, Ly, Lx1 및 Lx2가 이하에 나타내는 구조의 스트랜드 A 및 스트랜드 B-3의 합성을 행했다.
Figure pct00057
스트랜드 A 및 스트랜드 B-3은, 포스포아미다이트법에 의해, 핵산 자동 합성 장치(ABI3900; Applied Biosystems)를 사용해서 합성했다. 이 합성에는 RNA 아미다이트로서 TBDMS 아미다이트를 사용했다. 스트랜드 B-3의 3' 말단에는 2'-O-TBDMS-구아노신(N-iBu)-3'-lcaa-CPG(ChemGenes)를 사용하고, Ly의 연결을 위해 특수 아미다이트로서 DMTr-디아미드-글리신아미다이트(화합물 16)를, Lx2의 연결을 위해 시아노에틸-글리신아미다이트(화합물 20)를 사용했다. 또한, 스트랜드 A의 3' 말단에는, 3'-PT Amino-Modifier C4 CPG(화합물명: N-(4-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)-부틸)-(2-카르복시아미드)-프탈이미딜-lcaa-CPG; ChemGenes)를 사용했다. 핵산의 고상 합성 및 합성 후의 탈보호 반응은 상법에 따라 행했다.
각 스트랜드의 탈보호 반응 종료 후의 반응 용액에 염화나트륨 수용액과 2-프로판올을 첨가해서 원심 분리하고, 상청을 제거했다. 얻어진 침전물을 주사용수에 용해시켰다. 질량 분석에 의해 목적물의 분자량과 일치하는 것을 확인했다. 회수된 목적물은, 3' 말단에 아미노기를 갖는 비뉴클레오티드성 링커 Lx1을 갖는 스트랜드 A(질량 분석 측정값: 7817.3, 이론값: 7816.8)와, 5' 말단에 카르복실기를 갖는 비뉴클레오티드성 링커 Lx2를 갖는 스트랜드 B-3(질량 분석 측정값: 9155.0, 이론값: 9154.5)이다.
스트랜드 A 수용액 및 스트랜드 B-3 수용액으로부터 각 100n㏖을 측정하여 혼합하고, 원심 농축기로 용매를 증류 제거해 건조시켰다. 얻어진 잔사에 1M MOPS 완충액을 10μL 첨가해서 용해시키고, 용액을 95℃까지 가열 후 실온까지 방랭했다. HATU의 0.2M DMSO 용액을 10μL 첨가해 교반 후 실온에서 4시간 정치했다. 상기 반응 용액에 2M 염화나트륨 수용액을 2μL와 에탄올 50μL를 첨가해서 교반하고, -30℃에서 정치 후 원심 분리하고, 상청을 제거하여 취득한 침전물을 건조시켰다. 질량 분석에 의해 목적물의 분자량과 일치하는 것을 확인했다(측정값: 16954.1, 이론값: 16953.3).
(실시예 8)
본 실시예에서는, GAPDH 유전자 발현 억제 서열을 갖는 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자를, 그 2개의 분할 프래그먼트인, 말단에 아미노기를 갖는 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자(이하, 스트랜드 C)와, 말단에 카르복실기를 갖는 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자(스트랜드 D)를 아미드화 반응에 의해 연결함으로써 제작했다.
우선, Ly, Lx1 및 Lx2가 이하에 나타내는 구조의 스트랜드 C 및 스트랜드 D-1의 합성을 행했다.
Figure pct00058
스트랜드 C 및 스트랜드 D-1은, 포스포아미다이트법에 의해, 핵산 자동 합성 장치(ABI3900; Applied Biosystems)를 사용해서 합성했다. 이 합성에는 RNA 아미다이트로서 TBDMS 아미다이트를 사용했다. 스트랜드 D-1의 3' 말단에는 2'-O-TBDMS-아데노신(N-Bz)-3'-lcaa-CPG(ChemGenes)를 사용하고, Ly의 연결을 위해 특수 아미다이트로서 DMTr-디아미드-L-프롤린아미다이트(화합물 4)를, Lx2의 연결을 위해 시아노에틸-L-프롤린아미다이트(화합물 7)를 사용했다. 또한, 스트랜드 C의 3' 말단에는, 3'-PT Amino-Modifier C4 CPG(화합물명: N-(4-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)-부틸)-(2-카르복시아미드)-프탈이미딜-lcaa-CPG; ChemGenes)를 사용했다. 핵산의 고상 합성 및 합성 후의 탈보호 반응은 상법에 따라 행했다.
각 스트랜드의 탈보호 반응 종료 후의 반응 용액에 염화나트륨 수용액과 2-프로판올을 첨가해서 원심 분리하고, 상청을 제거했다. 얻어진 침전물을 주사용수에 용해시켰다. 질량 분석에 의해 목적물의 분자량과 일치하는 것을 확인했다. 회수된 목적물은, 3' 말단에 아미노기를 갖는 비뉴클레오티드성 링커 Lx1을 갖는 스트랜드 C(질량 분석 측정값: 7222.9, 이론값: 7222.4)와, 5' 말단에 카르복실기를 갖는 비뉴클레오티드성 링커 Lx2를 갖는 스트랜드 D-1(질량 분석 측정값: 9853.5, 이론값: 9853.0)이다.
스트랜드 C 수용액 및 스트랜드 D-1 수용액으로부터 각 100n㏖을 측정하여 혼합하고, 원심 농축기로 용매를 증류 제거해 건조시켰다. 얻어진 잔사에 1M MOPS 완충액을 10μL 첨가해서 용해시키고, 용액을 95℃까지 가열 후 실온까지 방랭했다. HATU의 0.2M DMSO 용액을 10μL 첨가해 교반 후, 실온에서 4시간 정치했다. 상기 반응 용액에 2M 염화나트륨 수용액을 2μL와, 에탄올 50μL를 첨가해서 교반하고, -30℃에서 정치 후 원심 분리하고, 상청을 제거하여 취득한 침전물을 건조시켰다. 질량 분석에 의해 목적물의 분자량과 일치하는 것을 확인했다(측정값 17057.9, 이론값: 17057.4).
(실시예 9)
GAPDH 유전자 발현 억제 서열을 갖는 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자의 2개의 분할 프래그먼트로서, Ly, Lx1 및 Lx2가 이하에 나타내는 구조의 스트랜드 C 및 스트랜드 D-2의 합성을 행했다.
Figure pct00059
스트랜드 C 및 스트랜드 D-2는, 포스포아미다이트법에 의해, 핵산 자동 합성 장치(ABI3900; Applied Biosystems)를 사용해서 합성했다. 이 합성에는 RNA 아미다이트로서 TBDMS 아미다이트를 사용했다. 스트랜드 D-2의 3' 말단에는, 2'-O-TBDMS-아데노신(N-Bz)-3'-lcaa-CPG(ChemGenes)을 사용하고, Ly의 연결을 위해 특수 아미다이트로서 DMTr-디아미드-글리신아미다이트(화합물 16)를, Lx2의 연결을 위해 시아노에틸글리신아미다이트(화합물 20)를 사용했다. 또한, 스트랜드 C의 3' 말단에는, 3'-PT Amino-Modifier C4 CPG(화합물명: N-(4-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)-부틸)-(2-카르복시아미드)-프탈이미딜-lcaa-CPG; ChemGenes)를 사용했다. 핵산의 고상 합성 및 합성 후의 탈보호 반응은 상법에 따라 행했다.
각 스트랜드의 탈보호 반응 종료 후의 반응 용액에 염화나트륨 수용액과 2-프로판올을 첨가해서 원심 분리하고, 상청을 제거했다. 얻어진 침전물을 주사용수에 용해시켰다. 질량 분석에 의해 목적물의 분자량과 일치하는 것을 확인했다. 회수된 목적물은, 3' 말단에 아미노기를 갖는 비뉴클레오티드성 링커 Lx1을 갖는 스트랜드 C(질량 분석 측정값: 7222.9, 이론값: 7222.4)와, 5' 말단에 카르복실기를 갖는 비뉴클레오티드성 링커 Lx2를 갖는 스트랜드 D-2(질량 분석 측정값: 9773.3, 이론값: 9772.9)이다.
스트랜드 C 수용액 및 스트랜드 D-2 수용액으로부터 각 100n㏖을 측정하여 혼합하고, 원심 농축기로 용매를 증류 제거해 건조시켰다. 얻어진 잔사에 1M MOPS 완충액을 10μL 첨가해서 용해시켜, 용액을 95℃까지 가열 후 실온까지 방랭했다. HATU의 0.2M DMSO 용액을 10μL 첨가해 교반 후 실온에서 4시간 정치했다. 상기 반응 용액에 2M 염화나트륨 수용액을 2μL와 에탄올 50μL를 첨가해서 교반하고, -30℃에서 정치 후 원심 분리하고, 상청을 제거하여 취득한 침전물을 건조시켰다. 질량 분석에 의해 목적물의 분자량과 일치하는 것을 확인했다 (측정값: 16977.6, 이론값 16977.3).
(산업상의 이용 가능성)
본 발명은, 표적 유전자에 대한 발현 억제 서열을 포함하는 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자의 효율적인 제조를 가능하게 할 수 있다.
(서열목록 자유텍스트)
서열번호 1~6: 합성 RNA
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 그대로 인용에 의해 본 명세서에 도입되는 것으로 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Toray Industries, Inc. Bonac Corporation <120> Method for producing hairpin single-stranded RNA molecules <130> PH-8071-PCT <150> JP 2018-187767 <151> 2018-10-02 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 51 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> modified_base <222> (24)..(25) <223> nucleotides 24 and 25 are connected via a linker <220> <221> modified_base <222> (50)..(51) <223> nucleotides 50 and 51 are connected via a linker <400> 1 agcagaguac acacagcaua uaccgguaua ugcugugugu acucugcuuc g 51 <210> 2 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> modified_base <222> (24) <223> nucleotide 24 is connected to a linker <400> 2 agcagaguac acacagcaua uacc 24 <210> 3 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> modified_base <222> (1) <223> nucleotide 1 is connected to a linker <220> <221> modified_base <222> (26)..(27) <223> nucleotides 26 and 27 are connected via a linker <400> 3 gguauaugcu guguguacuc ugcuucg 27 <210> 4 <211> 51 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> modified_base <222> (22)..(23) <223> nucleotides 22 and 23 are connected via a linker <220> <221> modified_base <222> (48)..(49) <223> nucleotides 48 and 49 are connected via a linker <400> 4 caugagaagu augacaacag ccggcuguug ucauacuucu caugguucga a 51 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> modified_base <222> (22) <223> nucleotide 22 is connected to a linker <400> 5 caugagaagu augacaacag cc 22 <210> 6 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> modified_base <222> (1) <223> nucleotide 1 is connected to a linker <220> <221> modified_base <222> (26)..(27) <223> nucleotides 26 and 27 are connected via a linker <400> 6 ggcuguuguc auacuucuca ugguucgaa 29

Claims (17)

  1. 표적 유전자의 발현을 억제하는 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자의 제조 방법으로서,
    탈수 축합제의 존재 하, 완충액과 친수성 유기 용매를 포함하는 혼합 용매 중에서, 하기 식 (I)로 나타내어지는 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와 하기 식 (II)로 나타내어지는 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자를 반응시키는 공정을 포함하고,
    5'-Xc-Lx1···(I)
    Lx2-X-Y-Ly-Yc-3'···（II)
    [식 (I) 및 식 (II) 중, X, Xc, Y 및 Yc는, 리보뉴클레오티드 잔기로 이루어지고, Xc는 X와 상보적이고, Yc는 Y와 상보적이고, Ly는 비뉴클레오티드성 링커이며, Lx1은 아미노기를 갖는 비뉴클레오티드성 링커이며, Lx2는 카르복실기를 갖는 비뉴클레오티드성 링커이며, X-Y는 상기 표적 유전자에 대한 유전자 발현 억제 서열을 포함한다]
    상기 탈수 축합제는, 트리아진형 탈수 축합제, N-히드록시 함질소 방향환 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제, 카르보디이미드형 탈수 축합제, 2-할로피리디늄형 탈수 축합제, 및 포름아미디늄형 탈수 축합제로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
    상기 탈수 축합제가 카르보디이미드형 탈수 축합제일 경우에는, N-히드록시 함질소 방향족 화합물 또는 시아노(히드록시이미노)아세트산 에스테르와 조합시켜서 사용하고,
    상기 탈수 축합제가 2-할로피리디늄형 탈수 축합제일 경우에는, N-히드록시 함질소 방향족 화합물과 조합시켜서 사용하고,
    상기 탈수 축합제가 포름아미디늄형 탈수 축합제일 경우에는, N-히드록시 함질소 방향족 화합물 또는 N-탄화수소 치환 이미다졸 유도체와 조합시켜서 사용하는, 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 링커 Ly가 아미노산 골격 또는 아미노알콜 골격을 갖는 비뉴클레오티드성 링커이며, 상기 링커 Lx2가 아미노산 골격을 갖는 비뉴클레오티드성 링커인 제조 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 Ly가 피롤리딘 골격 및 피페리딘 골격 중 적어도 일방을 포함하는 비뉴클레오티드성 링커, 또는 -NHCH2COO-를 포함하는 비뉴클레오티드성 링커이며, 상기Lx2가 카르복실기를 갖는 피롤리딘 골격 및 피페리딘 골격 중 적어도 일방을 포함하는 비뉴클레오티드성 링커, 또는 -NHCH2COOH를 포함하는 비뉴클레오티드성 링커인 제조 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Lx1이 하기 식 (III)으로 나타내어지고, Lx2가 하기 식 (IV) 또는 하기 식 (IV')로 나타내어지는 제조 방법.
    Figure pct00060

    [식 (III) 중, R1은 치환되어 있어도 좋은 알킬렌쇄이며, -OR1은 Xc의 3' 말단에 포스포디에스테르 결합을 통해 결합되어 있다]
    Figure pct00061

    [식 (IV) 중, R2는 치환되어 있어도 좋은 알킬렌쇄이고, p는 1 또는 2이며, -OR2는 X의 5' 말단에 포스포디에스테르 결합을 통해 결합되어 있고, 식 (IV') 중, R2는 치환되어 있어도 좋은 알킬렌쇄이며, -OR2는 X의 5' 말단에 포스포디에스테르 결합을 통해 결합되어 있다]
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 상기 N-히드록시 함질소 방향환 구조를 포함하는 우로늄형 탈수 축합제가 벤조트리아졸릴우로늄형 탈수 축합제이고,
    (ii) 상기 N-히드록시 함질소 방향족 화합물이 히드록시벤조트리아졸 또는 그 유도체이며,
    (iii) 상기 시아노(히드록시이미노)아세트산 에스테르가 시아노(히드록시이미노)아세트산 알킬에스테르이고, 및/또는
    (iv) 상기 N-탄화수소 치환 이미다졸 유도체가 N-알킬이미다졸 유도체인 제조 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 친수성 유기 용매가 친수성의 비프로톤성 유기 용매인 제조 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 친수성의 비프로톤성 유기 용매가, 디메틸술폭시드, N,N-디메틸포름아미드, N,N'-디메틸에틸렌우레아, 또는 아세토니트릴인 제조 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 탈수 축합제가, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드, O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트, N-(3'-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 염산염, 2-클로로-1-메틸피리디늄요오다이드, 또는 클로로-N,N,N',N'-테트라메틸포름아미디늄헥사플루오로포스페이트이며,
    상기 N-히드록시 함질소 방향족 화합물이 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸이며,
    상기 시아노(히드록시이미노)아세트산 에스테르가 시아노(히드록시이미노)아세트산 에틸이며,
    상기 N-탄화수소 치환 이미다졸 유도체가 N-메틸이미다졸인 제조 방법.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 탈수 축합제와 상기 친수성의 비프로톤성 유기 용매의 조합이, O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트와 디메틸술폭시드의 조합, O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트와 N,N-디메틸포름아미드의 조합, N-(3'-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 염산염과 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸과 디메틸술폭시드의 조합, 또는 클로로-N,N,N',N'-테트라메틸포름아미디늄헥사플루오로포스페이트와 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸과 디메틸술폭시드의 조합인 제조 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 완충액의 pH는 6.5~7.5인 제조 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Ly가 피롤리딘 골격 또는 피페리딘 골격을 포함하는 비뉴클레오티드성 링커이며, Lx1이 아미노기를 갖는 비뉴클레오티드성 링커이며, Lx2가 카르복실기를 갖는 피롤리딘 골격 및 피페리딘 골격 중 적어도 일방을 포함하는 비뉴클레오티드성 링커인 제조 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Ly가 하기 식 (V)로 나타내어지는 제조 방법.
    Figure pct00062
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Lx1이 하기 식 (VI)으로 나타내어지고, Lx2가 하기 식 (VII)로 나타내어지는 제조 방법.
    Figure pct00063

    Figure pct00064
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적 유전자는 TGF-β1 유전자인 제조 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자는, 서열번호 1로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제조 방법.
  16. 이하의 (a) 또는 (b)인 단일쇄 올리고 RNA 분자.
    (a) 1번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 Lx2와 연결되고, 26번째와 27번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 Ly를 통해 연결되어 있는 서열번호 3으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 단일쇄 올리고 RNA 분자
    (b) 1번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 Lx2와 연결되고, 26번째와 27번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 Ly를 통해 연결되어 있는 서열번호 6으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 단일쇄 올리고 RNA 분자

  17. 이하의 (1) 또는 (2)인, 단일쇄 올리고 RNA 분자의 조합을 포함하는, 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 헤어핀형 단일쇄 RNA 분자의 제조용의 키트.
    (1) 24번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 Lx1과 연결되어 있는 서열번호 2로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와, 1번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 Lx2와 연결되고, 26번째와 27번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 Ly를 통해 연결되어 있는 서열번호 3으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자의 조합
    (2) 22번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 Lx1과 연결되어 있는 서열번호 5로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 1 단일쇄 올리고 RNA 분자와, 1번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 Lx2와 연결되고, 26번째와 27번째의 리보뉴클레오티드 잔기가 Ly를 통해 연결되어 있는 서열번호 6으로 나타내어지는 염기서열로 이루어지는 제 2 단일쇄 올리고 RNA 분자의 조합
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