JP7405086B2 - ヘアピン型一本鎖rna分子の製造方法 - Google Patents
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Description
[1]標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖RNA分子の製造方法であって、
脱水縮合剤の存在下、緩衝液と親水性有機溶媒とを含む混合溶媒中で、下記式(I)で表される第1の一本鎖オリゴRNA分子と下記式(II)で表される第2の一本鎖オリゴRNA分子とを反応させる工程を含み、
5’-Xc-Lx1 ・・・(I)
Lx2-X-Y-Ly-Yc-3’ ・・・(II)
[式(I)及び式(II)中、X、Xc、Y及びYcは、リボヌクレオチド残基からなり、Xcは、Xと相補的であり、Ycは、Yと相補的であり、Lyは、非ヌクレオチド性リンカーであり、Lx1は、アミノ基を有する非ヌクレオチド性リンカーであり、Lx2は、カルボキシル基を有する非ヌクレオチド性リンカーであり、X-Yは、上記標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含む]
上記脱水縮合剤は、トリアジン型脱水縮合剤、N-ヒドロキシ含窒素芳香環構造を含むウロニウム型脱水縮合剤、カルボジイミド型脱水縮合剤、2-ハロピリジニウム型脱水縮合剤、及びホルムアミジニウム型脱水縮合剤からなる群から選択され、
上記脱水縮合剤がカルボジイミド型脱水縮合剤の場合は、N-ヒドロキシ含窒素芳香族化合物又はシアノ(ヒドロキシイミノ)酢酸エステルと組み合わせて使用し、
上記脱水縮合剤が2-ハロピリジニウム型脱水縮合剤の場合は、N-ヒドロキシ含窒素芳香族化合物と組み合わせて使用し、
上記脱水縮合剤がホルムアミジニウム型脱水縮合剤の場合は、N-ヒドロキシ含窒素芳香族化合物又はN-炭化水素置換イミダゾール誘導体と組み合わせて使用する、
ヘアピン型一本鎖RNA分子の製造方法。
(ii)上記N-ヒドロキシ含窒素芳香族化合物が、ヒドロキシベンゾトリアゾール又はその誘導体である、
(iii)上記シアノ(ヒドロキシイミノ)酢酸エステルが、シアノ(ヒドロキシイミノ)酢酸アルキルエステルである、及び/又は
(iv)上記N-炭化水素置換イミダゾール誘導体が、N-アルキルイミダゾール誘導体である、
[1]~[4]のいずれかに記載の製造方法。
上記N-ヒドロキシ含窒素芳香族化合物が、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾールであり、
上記シアノ(ヒドロキシイミノ)酢酸エステルが、シアノ(ヒドロキシイミノ)酢酸エチルであり、
上記N-炭化水素置換イミダゾール誘導体が、N-メチルイミダゾールである、[1]~[7]のいずれかに記載の製造方法。
(a)1番目のリボヌクレオチド残基がLx2と連結され、26番目と27番目のリボヌクレオチド残基がLyを介して連結されている配列番号3で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子
(b)1番目のリボヌクレオチド残基がLx2と連結され、26番目と27番目のリボヌクレオチド残基がLyを介して連結されている配列番号6で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子
(1)24番目のリボヌクレオチド残基がLx1と連結されている配列番号2で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、1番目のリボヌクレオチド残基がLx2と連結され、26番目と27番目のリボヌクレオチド残基がLyを介して連結されている配列番号3で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子の組み合わせ
(2)22番目のリボヌクレオチド残基がLx1と連結されている配列番号5で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、1番目のリボヌクレオチド残基がLx2と連結され、26番目と27番目のリボヌクレオチド残基がLyを介して連結されている配列番号6で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子の組み合わせ
Lx2-X-Y-Ly-Yc-3’ ・・・(II)
リンカーLx1は、例えば、下記式(III)で表される。
上記リンカーLyは、例えば、下記式(VIII)で表される。
Y1及びY2は、それぞれ独立して、単結合、CH2、NH、O又はSであり、
Zは、環A上のC-3、C-4、C-5又はC-6に結合する水素原子又は置換基であり、
L1は、炭素数rのアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン鎖の炭素原子上の水素原子は、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH又はSRaで置換されても、置換されていなくてもよく、又は、
L1は、上記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ここで、Y1が、NH、O又はSの場合、Y1に結合するL1の原子は炭素であり、Oに結合するL1の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず、
L2は、炭素数sのアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン鎖の炭素原子上の水素原子は、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH又はSRaで置換されても、置換されていなくてもよく、又は、
L2は、上記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ここで、Y2が、NH、O又はSの場合、Y2に結合するL2の原子は炭素であり、Oに結合するL2の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず、
Ra及びRbは、それぞれ独立して、置換基又は保護基であり;
qは、1又は2であり、
rは、0~30の範囲の整数であり、
sは、0~30の範囲の整数であり、
環Aは、環A上のC-2以外の1個の炭素原子が、窒素原子、酸素原子、硫黄原子で置換されてもよく、環A内に、炭素-炭素二重結合又は炭素-窒素二重結合を含んでもよい。
Y1及びY2は、それぞれ独立して、単結合、CH2、NH、O又はSであり、
L1は、炭素数rのアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン鎖の炭素原子上の水素原子は、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH又はSRaで置換されても、置換されていなくてもよく、又は、
L1は、上記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ここで、Y1が、NH、O又はSの場合、Y1に結合するL1の原子は炭素であり、Oに結合するL1の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず、
L2は、炭素数sのアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン鎖の炭素原子上の水素原子は、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH又はSRaで置換されても、置換されていなくてもよく、又は、
L2は、上記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ここで、Y2が、NH、O又はSの場合、Y2に結合するL2の原子は炭素であり、Oに結合するL2の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず、
Ra及びRbは、それぞれ独立して、置換基又は保護基であり;
rは、0~30の範囲の整数であり、
sは、0~30の範囲の整数である。
(XVIII-2)で表される光学活性体であってよい。
(i)N-ヒドロキシ含窒素芳香環構造を含むウロニウム型脱水縮合剤を使用し、それがベンゾトリアゾリルウロニウム型脱水縮合剤である、
(ii)N-ヒドロキシ含窒素芳香族化合物を使用し、それがヒドロキシベンゾトリアゾール又はその誘導体である、
(iii)シアノ(ヒドロキシイミノ)酢酸エステルを使用し、それがシアノ(ヒドロキシイミノ)酢酸アルキルエステルである、
(iv)N-炭化水素置換イミダゾール誘導体を使用し、それがN-アルキルイミダゾール誘導体である。
(a)1番目のリボヌクレオチド残基がLx2と連結され、26番目と27番目のリボヌクレオチド残基がLyを介して連結されている配列番号3で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子、
(b)1番目のリボヌクレオチド残基がLx2と連結され、26番目と27番目のリボヌクレオチド残基がLyを介して連結されている配列番号6で表される塩基配列からなる一本鎖オリゴRNA分子。
(1)24番目のリボヌクレオチド残基がLx1と連結されている配列番号2で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、1番目のリボヌクレオチド残基がLx2と連結され、26番目と27番目のリボヌクレオチド残基がLyを介して連結されている配列番号3で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子の組み合わせ、
(2)22番目のリボヌクレオチド残基がLx1と連結されている配列番号5で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、1番目のリボヌクレオチド残基がLx2と連結され、26番目と27番目のリボヌクレオチド残基がLyを介して連結されている配列番号6で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子の組み合わせ。
プロリンジアミド型アミダイトの合成
プロリンジアミド型アミダイトは、例えば、国際公開WO2012/017919の記載に従って合成することができる。具体的な合成例を以下に示すが、合成方法はそれにより限定されない。
Fmoc-L-プロリン(10.00g、29.64mmol)、4-アミノ-1-ブタノール(3.18g、35.56mmol)及び1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(10.90g、70.72mmol)を混合し、その混合物に対し、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。得られた混合物に、無水アセトニトリル(140mL)を室温で加え、さらに、ジシクロヘキシルカルボジイミド(7.34g、35.56mmol)の無水アセトニトリル溶液(70mL)を添加した後、アルゴン雰囲気下、室温で15時間撹拌した。反応終了後、生成した沈殿をろ別し、回収したろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣にジクロロメタン(200mL)を加え、飽和重曹水(200mL)で洗浄した。そして、有機層を回収し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、ろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去し、その残渣にジエチルエーテル(200mL)を加え、粉末化した。生じた粉末を濾取することにより、無色粉末状物質としてFmoc-ヒドロキシアミド-L-プロリンが得られた。Fmocは、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基である。
Fmoc-ヒドロキシアミド-L-プロリン(7.80g、19.09mmol)を無水ピリジン(5mL)と混合し、室温で2回共沸乾燥した。得られた残留物に、4,4’-ジメトキシトリチルクロリド(8.20g、24.20mmol)、4-ジメチルアミノピリジン(23mg、0.19mmol)及び無水ピリジン(39mL)を加えた。この混合物を、室温で1時間撹拌した後、メタノール(7.8mL)を加え、室温で30分撹拌した。この混合物を、ジクロロメタン(100mL)で希釈し、飽和重曹水(150mL)で洗浄後、有機層を分離した。この有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた未精製の残渣に、無水N,N-ジメチルホルムアミド(39mL)及びピペリジン(18.7mL、189mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。反応終了後、その混合液から、減圧下、室温で、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(商品名Wakogel C-300、展開溶媒 ジクロロメタン:メタノール=9:1、0.05%ピリジン含有)に供することにより、淡黄色油状物質としてDMTr-アミド-L-プロリンが得られた。DMTrは、4,4’-ジメトキシトリチル基である。
得られたDMTr-アミド-L-プロリン(6.01g、12.28mmol)、N-(3’-ジメチルアミノプロピル)-N’-エチルカルボジイミド(2.83g、14.74mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(3.98g、29.47mmol)及びトリエチルアミン(4.47g、44.21mmol)の無水ジクロロメタン溶液(120mL)を混合した。この混合液に、さらに、アルゴン雰囲気下、室温で、6-ヒドロキシヘキサン酸(1.95g、14.47mmol)を加え、その後、アルゴン雰囲気下、室温で、1時間撹拌した。得られた混合液をジクロロメタン(600mL)で希釈し、飽和食塩水(800mL)で3回洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。これにより、淡黄色泡状物質としてDMTr-ヒドロキシジアミド-L-プロリンが得られた。
得られたDMTr-ヒドロキシジアミド-L-プロリン(8.55g、14.18mmol)を無水アセトニトリルと混合し、室温で3回共沸乾燥した。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(2.91g、17.02mmol)を加え、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。その混合物に対し、無水アセトニトリル(10mL)を加え、さらに、2-シアノエトキシ-N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(5.13g、17.02mmol)の無水アセトニトリル溶液(7mL)を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で2時間撹拌した。得られた混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水(200mL)で3回洗浄した後、飽和食塩水(200mL)で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過した。得られたろ液について、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 ヘキサン:酢酸エチル=1:3、0.05%ピリジン含有)に供することにより、無色シロップ状物質としてDMTr-ジアミド-L-プロリンアミダイトが得られた。
1.プロリンエステル型アミダイトの合成(シアノエチル保護)
Boc-L-プロリン(10.00g、46.46mmol)、2-シアノエタノール(3.96g、55.75mmol)を混合し、その混合物に対し、ジクロロメタン(100mL)を室温で加え、氷浴にて冷却した。N-(3’-ジメチルアミノプロピル)-N’-エチルカルボジイミド塩酸塩(9.80g、51.10mmol)、4-ジメチルアミノピリジン(1.12g、9.29mmol)を添加した後、氷浴を外し、アルゴン雰囲気下、室温で3時間撹拌した。得られた混合液を蒸留水(100mL)で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 クロロホルム:メタノール=19:1)に供することにより、油状物質としてBoc-L-プロリン-シアノエチルエステル(12.47g、収率100%)を得た。Bocは、ブトキシカルボニル基である。
Boc-L-プロリン-シアノエチルエステル(12.47g、46.46mmol)をジオキサン(29mL)と混合した。得られた混合物に4M塩化水素ジオキサン溶液(44mL)を加え、この混合物を室温で2時間撹拌した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた未精製の残渣に、ジクロロメタン(90mL)を加えた。この混合物に6-ヒドロキシヘキサン酸(8.09g、61.20mmol)とトリエチルアミン(9.40g、92.91mmol)を加え、氷浴にて冷却した。EDCI塩酸塩(9.80g、51.10mmol)を添加した後、氷浴を外し、室温で4時間撹拌した。得られた混合液を蒸留水(100mL)で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 クロロホルム:メタノール=9:1)に供することにより、油状物質としてN-アミド-L-プロリン-シアノエチルエステル(10.16g、収率77%)を得た。
得られたN-アミド-L-プロリン-シアノエチルエステル(5.00g、17.71mmol)を無水アセトニトリル(40mL)と混合し、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。その混合物に対し、テトラゾール(1.49g、21.25mmol)とジイソプロピルアミン(2.15g、21.25mmol)を加え、さらに2-シアノエトキシ-N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(6.41g、21.25mmol)の無水アセトニトリル溶液(10mL)を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で3時間撹拌した。得られた混合物をジクロロメタン(100mL)で希釈し、5%炭酸水素ナトリウム水溶液(100mL)で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過した。得られたろ液について、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 ヘキサン:酢酸エチル=1:4)に供することにより、油状物質としてシアノエチル-L-プロリンアミダイト(7.03g、収率82%)を得た。
Fmoc-L-プロリン(12.04g、35.67mmol)、2,4-ジメトキシベンジルアルコール(5.00g、29.73mmol)を混合し、その混合物に対し、ジクロロメタン(100mL)を室温で加えた。EDCI塩酸塩(6.84g、35.67mmol)、4-ジメチルアミノピリジン(0.36g、2.97mmol)を添加した後、室温で3時間撹拌した。得られた混合液を蒸留水(100mL)で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 ヘキサン:酢酸エチル=3:2)に供することにより、Fmoc-L-プロリン-(2,4-ジメトキシ)ベンジルエステル(13.24g、収率91%)を得た。Fmocは、フルオレニルメチルオキシカルボニル基である。
Fmoc-L-プロリン-(2,4-ジメトキシ)ベンジルエステル(13.24g、27.16mmol)をジクロロメタン(130mL)と混合した。得られた混合物にジアザビシクロウンデセン(4.96g、32.59mmol)を加え、この混合物を室温で1時間撹拌した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 クロロホルム:メタノール=9:1)に供することにより、油状物質としてL-プロリン-(2,4-ジメトキシ)ベンジルエステル(6.39g、収率89%)を得た。
L-プロリン-(2,4-ジメトキシ)ベンジルエステル(6.39g、24.09mmol)をジクロロメタン(120mL)と混合した。この混合物に6-ヒドロキシヘキサン酸(3.82g、28.90mmol)とトリエチルアミン(4.87g、48.17mmol)を加えた。EDCI塩酸塩(5.54g、28.90mmol)を添加した後、室温で16時間撹拌した。得られた混合液を蒸留水(100mL)で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 酢酸エチル:メタノール=9:1)に供することにより、油状物質としてN-アミド-L-プロリン-(2,4-ジメトキシ)ベンジルエステル(5.22g、収率57%)を得た。
N-アミド-L-プロリン-(2,4-ジメトキシ)ベンジルエステル(2.00g、5.27mmol)を無水アセトニトリル(27mL)と混合し、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。その混合物に対し、テトラゾール(0.44g、6.32mmol)とジイソプロピルアミン(0.64g、6.32mmol)を加え、さらに2-シアノエトキシ-N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(1.91g、6.32mmol)を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で23時間撹拌した。得られた混合物をクロロホルム(60mL)で希釈し、5%炭酸水素ナトリウム水溶液(60mL)で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過した。得られたろ液について、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 ヘキサン:酢酸エチル=1:4)に供することにより、油状物質として(2,4-ジメトキシ)ベンジル-L-プロリンアミダイト(2.27g、収率74%)を得た。
グリシンジアミド型アミダイトの合成
グリシンジアミド型アミダイトは、例えば、国際公開WO2013/103146の記載に従って合成することができる。具体的な合成例を以下に示すが、合成方法はそれにより限定されない。
Fmoc-グリシン(4.00g、13.45mmol)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(3.33g、16.15mmol)及び1-ヒドロキシベンゾトリアゾール1水和物(4.94g、32.29mmol)の無水N,N-ジメチルホルムアミド溶液(100mL)に4-アミノブタノール(1.44g、16.15mmol)の無水N,N-ジメチルホルムアミド溶液(30mL)を加え、アルゴン雰囲気下、室温で終夜撹拌した。生成した沈殿をろ別し、ろ液を減圧下で濃縮した。得られた残渣にジクロロメタン(200mL)を加え、飽和重曹水で3回洗浄した。更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ(展開溶媒:ジクロロメタン-メタノール(95:5)に付し、Fmoc-ヒドロキシアミド-グリシン(4.30g、87%)を得た。
化合物12(4.20g、11.40mmol)に対し無水ピリジンを用いて3回共沸乾燥した。その共沸残渣に4,4’-ジメトキシトリチルクロリド(5.80g、17.10mmol)及び無水ピリジン(80mL)を加え、室温下で終夜撹拌した。得られた反応混合物にメタノール(20mL)を加え室温で30分撹拌した後、減圧下で溶媒を留去した。その後、ジクロロメタン(200mL)を加え、飽和重曹水で3回洗浄し、更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。未精製のFmoc-DMTr-アミド-グリシン(11.40g)を得た。
未精製の化合物13(11.40g、16.99mmol)にN,N-ジメチルホルムアミド(45mL)及びピペリジン(11.7mL)を室温で加え、室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下で溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ(展開溶媒:ジクロロメタン-メタノール(9:1)+0.05%ピリジン)に付し、DMTr-アミド-グリシン(4.90g、96%、 2steps)を得た。
化合物14(4.80g、10.70mmol)を無水ピリジンで3回共沸乾燥後、アルゴン雰囲気下で6-ヒドロキシヘキサン酸(1.70g、12.84mmol)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(2.46g、12.84mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール1水和物(3.93g、25.69mmol)、及び無水ジクロロメタン(60mL)を室温で加え、10分間撹拌した。このようにして得た混合物にトリエチルアミン(3.90g、38.53mmol)を加え、アルゴン雰囲気下、室温で終夜撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン(200mL)を加え飽和重曹水で3回、更に飽和食塩水で1回洗浄した。有機層を分取し硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ(展開溶媒:ジクロロメタン-メタノール(95:5)+0.05%ピリジン)に付し、DMTr-ヒドロキシジアミド-グリシン(4.80g、80%)を得た。
化合物15(4.70g、8.35mmol)を無水ピリジンで3回共沸乾燥した。次に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(1.72g、10.02mmol)を加え、減圧下で脱気してアルゴンガスを充填し、無水アセトニトリル(5mL)を加えた。さらに、2-シアノエトキシ-N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(3.02g、10.02mmol)の無水アセトニトリルジクロロメタン混合溶液(1:1)(4mL)を加え、混合物をアルゴン雰囲気下、室温で4時間撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン(150mL)を加え、飽和重曹水で2回、更に飽和食塩水で1回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。アミノシリカを用いたカラムクロマトグラフ(展開溶媒:n-ヘキサン-アセトン(3:2)+0.1%トリエチルアミン)に残渣を付し、DMTr-ジアミド-グリシンアミダイト(4.50g、71%、HPLC98.2%)を得た。
グリシンエステル型アミダイトの合成(シアノエチル保護)
Boc-グリシン(5.00g、28.54mmol)、2-シアノエタノール(2.40g、33.76mmol)を混合し、その混合物に対し、ジクロロメタン(50mL)を室温で加え、氷浴にて冷却した。N-(3’-ジメチルアミノプロピル)-N’-エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC)(6.00g、31.30mmol)と4-ジメチルアミノピリジン(DMAP)(0.70g、5.73mmol)を添加した後、氷浴を外し、アルゴン雰囲気下、室温で3時間撹拌した。得られた混合液を蒸留水と飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 ヘキサン:酢酸エチル=3:2)に供することにより、Boc-グリシン-シアノエチルエステル(5.70g、収率88%)を得た。
Boc-グリシン-シアノエチルエステル(2.80g、12.27mmol)をジオキサン(7.5mL)と混合した。得られた混合物に4M塩化水素ジオキサン溶液(20mL)を加え、この混合物を室温で3時間撹拌した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた白色の固体を酢酸エチルで洗浄した。真空乾燥し、グリシン-シアノエチルエステル(1.90g)を得た。
共沸乾燥した6-ヒドロキシヘキサン酸(1.2g、9.08mmol)とDMAP(113mg、0.92mmol)のピリジン溶液(30mL)に4,4-ジメトキシトリチルクロリド(3.1g、9.15mmol)を加えて室温にて5時間撹拌した後、メタノール(5mL)を加えて30分撹拌した。混合液を減圧濃縮した後、ジクロロメタンを加えて溶液を希釈した。この溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で3回、飽和食塩水で1回洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。減圧乾燥し、未精製の6-(4,4’-ジメトキシトリチル)ヘキサン酸(6.2g)を得た。
グリシン-シアノエチルエステル(0.85g、6.70mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド(15mL)に溶かした。この混合物に6-(4,4’-ジメトキシトリチル)ヘキサン酸(6.2g)とトリエチルアミン(1.35g、13.34mmol)を加え氷冷下で撹拌した。EDC(2.55g、13.30mmol)を添加した後、氷浴を外し室温で15時間撹拌した。得られた混合液を減圧濃縮し、ジクロロメタンを加えて溶液を希釈した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、そして飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 ヘキサン:酢酸エチル=1:1、0.05%ピリジン含有)に供することにより、白色固体を得た(2.50g、収率69%)。得られた白色固体(2.50g、4.59mmol)を80%酢酸水溶液(30mL)に加え、室温で3時間撹拌した。反応溶液を分液ロートに入れ、水層から脱保護した4,4-ジメトキシトリチル基が除去できるまでヘキサンにより洗浄した。水層にトルエンを加え、共沸を3回行った。真空乾燥することにより、白色固体としてN-アミド-グリシン-シアノエチルエステル(0.80g、収率72%)を得た。
N-アミド-グリシン-シアノエチルエステル(0.80g、3.30mmol)を無水アセトニトリルで2回共沸した。ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(0.68g、3.97mmol)を加え、真空乾燥した。この混合物に無水アセトニトリル(3mL)を加えた。2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(1.20g、3.98mmol)の無水アセトニトリル溶液(1mL)を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で3時間撹拌した。得られた混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過した。得られたろ液について、減圧下に溶媒を留去した。油状物質としてシアノエチル-グリシンアミダイト(1.4g)を得た。
後述の実施例4では、TGF-β1遺伝子発現抑制配列を有するヘアピン型一本鎖RNA分子(以下、ssTbRNAとも称する。)を、その2つの分割フラグメントである、末端にアミノ基を有する第1の一本鎖オリゴRNA分子(以下、ストランドA)と、末端にカルボキシル基を有する第2の一本鎖オリゴRNA分子(ストランドB)をアミド化反応により連結することで作製する(図1参照)。
実施例3で合成したストランドA及びストランドB-1を用い、下記の操作A~Cのいずれかの方法を用いて各種反応条件下でアミド化反応を行い、ストランドA及びストランドB-1を連結し、反応収率をHPLC分析にて決定した。
・操作A:ストランドAの5.3mM水溶液380μLとストランドB-1の5.6mM水溶液360μLを混合し、水を加えて2mLに定容した溶液から、30μLを測り取り、減圧エバポレーター及び真空ポンプにて溶媒を留去し乾燥させた。得られた残渣に室温で緩衝液を添加して溶解させた。その後、有機溶媒と、脱水縮合剤の0.4M水溶液を加え、室温で撹拌した。
・操作B:ストランドAの5.3mM水溶液380μLとストランドB-1の5.6mM水溶液360μLを混合し、水を加えて2mLに定容した溶液から、30μLを測り取り、減圧エバポレーター及び真空ポンプにて溶媒を留去し乾燥させた。得られた残渣に室温で緩衝液を添加して溶解させた。その後、有機溶媒と、脱水縮合剤の0.4M有機溶媒溶液を加え、室温で撹拌した。なおこの脱水縮合剤溶液は、それと混合した有機溶媒(下記表に記載)と同じ種類の有機溶媒を用いて調製した。
・操作C:ストランドAの5.3mM水溶液380μLとストランドB-1の5.6mM水溶液360μLを混合し、水を加えて2mLに定容した溶液から、30μLを測り取り、減圧エバポレーター及び真空ポンプにて溶媒を留去し乾燥させた。得られた残渣に室温で緩衝液を添加して溶解させた。その後、脱水縮合剤を固体として加え、室温で撹拌した。
・操作D:ストランドAの4.8mM水溶液170μLとストランドB-1の4.8mM水溶液170μLを混合し、水を加えて1mLに定容した溶液から、38μLを測り取り、減圧エバポレーター及び真空ポンプにて溶液を留去し乾燥させた。得られた残渣に室温で緩衝液を添加して溶解させた。その後、有機溶媒と、脱水縮合剤の0.4M有機溶媒溶液を加え、室温で撹拌した。なおこの脱水縮合剤溶液は、それと混合した有機溶媒(下記表に記載)と同じ種類の有機溶媒を用いて調製した。
・操作E:ストランドAの4.8mM水溶液170μLとストランドB-1の4.8mM水溶液170μLを混合し、水を加えて1mLに定容した溶液から、38μLを測り取り、減圧エバポレーター及び真空ポンプにて溶液を留去し乾燥させた。得られた残渣に室温で緩衝液を添加して溶解させた。その後、脱水縮合剤を固体として加え、室温で撹拌した。
・操作F:ストランドAの4.8mM水溶液170μLとストランドB-1の4.8mM水溶液170μLを混合し、水を加えて1mLに定容した溶液から、38μLを測り取り、減圧エバポレーター及び真空ポンプにて溶液を留去し乾燥させた。得られた残渣に室温で緩衝液を添加して溶解させた。その後、有機溶媒と、脱水縮合剤の1.6M有機溶媒溶液を加え、室温で撹拌した。なおこの脱水縮合剤溶液は、それと混合した有機溶媒(下記表に記載)と同じ種類の有機溶媒を用いて調製した。
・操作G:ストランドAの4.8mM水溶液170μLとストランドB-1の4.8mM水溶液170μLを混合し、水を加えて1mLに定容した溶液から、38μLを測り取り、減圧エバポレーター及び真空ポンプにて溶液を留去し乾燥させた。得られた残渣に室温で緩衝液を添加して溶解させた。その後、有機溶媒と、脱水縮合剤の0.2M溶液(注射用水とアセトニトリルの体積比にて1:1の混合溶液)を加え、室温で撹拌した。
・カラム:XBridge Oligonucleotide BEH C18(Waters)4.6×50mm、2.5μm
・カラム温度:60℃
・移動相A:200mM TEAA水溶液(pH7.0)/アセトニトリル=95/5
・移動相B:200mM TEAA水溶液(pH7.0)/アセトニトリル=50/50
・展開条件:A/B=100/0(0-3min)、100/0→70/30(3-23min、リニアグラジエント)、70/30(23-33min)、70/30→100/0(33-33.1min、リニアグラジエント)、100/0(33.1-45min)
・流速:1.0mL/min
・検出:PDA検出器(254nm)
・注入量:10μL
反応収率(%)=(ssTbRNAのピーク面積)/(クロマトグラム中の総ピーク面積)×100
脱水縮合剤を検討するために、上記の方法により、試験例1~4、21~32及び比較例1~9、12~22についてアミド化反応を行った。試験例1~4、21~32及び比較例1~9、12~22における、操作、添加した緩衝液の種類及び添加量、添加した有機溶媒の種類及び添加量、並びに添加した脱水縮合剤の種類及び添加量を表1、表2、及び表3に示す。
トリアジン型脱水縮合剤を用いたアミド化反応の反応条件を検討するために、DMT-MMを脱水縮合剤に用いて上記の方法により、試験例1、5~14及び比較例10のアミド化反応を行った。試験例1、5~14及び比較例10における、操作、添加した緩衝液の種類及び添加量、添加した有機溶媒の種類及び添加量並びに脱水縮合剤の種類及び添加量を表7に示す。
ベンゾトリアゾリルウロニウム型脱水縮合剤を用いたアミド化反応の反応条件を検討するために、HATUを脱水縮合剤に用いて、上記の方法により、試験例2、15~20、33~38及び比較例11についてアミド化反応を行った。試験例2、15~20、33~38及び比較例11における、操作、添加した緩衝液の種類及び添加量、添加した有機溶媒の種類及び添加量並びに添加した脱水縮合剤の種類及び添加量を表11に示す。
ssTbRNAの単離精製
1)DMT-MMを用いたアミド化反応
ストランドA水溶液及びストランドB-1水溶液より各1μmolを測り取って混合し、遠心濃縮機にて溶媒を留去し乾燥させた。得られた残渣に1M MOPS緩衝液を80μL添加して溶解させ、溶液を95℃まで加熱後、室温まで放冷した。1M DMT-MM水溶液を80μL、DMSOを100μL添加し撹拌後、室温にて6時間静置した。上記反応溶液に2M塩化ナトリウム水溶液を20μLと、エタノール800μLを加えて撹拌し、-30℃にて静置後遠心分離し、上清を除去し、取得した沈殿物を乾燥させた。沈殿物を注射用水に溶解させ、強陰イオン交換クロマトグラフィー(DNAPac PA100、Thermo Fisher Scientific;移動相A:25mM Tris-HCl緩衝液、10%アセトニトリル;移動相B:25mM Tris-HCl緩衝液、10%アセトニトリル, 700mM NaClO4)にて精製し、目的物を分取した。目的のフラクションをエタノール沈殿にて回収し、白色固体11.7mg(RP-HPLC純度:90%、収率:69%)を得た。質量分析により目的物の分子量と一致することを確認した。
ストランドA水溶液及びストランドB-1水溶液より各1μmolを測り取って混合し、遠心濃縮機にて溶媒を留去し乾燥させた。得られた残渣に1M MOPS緩衝液を100μL添加して溶解させ、溶液を95℃まで加熱後、室温まで放冷した。HATUの0.2M DMSO溶液を100μL添加し撹拌後、室温にて4時間静置した。上記反応溶液に2M塩化ナトリウム水溶液を20μLと、エタノール800μLを加えて撹拌し、-30℃にて静置後遠心分離し、上清を除去し、取得した沈殿物を乾燥させた。沈殿物を注射用水に溶解させ、強陰イオン交換クロマトグラフィー(DNAPac PA100、Thermo Fisher Scientific;移動相A:25mM Tris-HCl緩衝液、10%アセトニトリル;移動相B:25mM Tris-HCl緩衝液、10%アセトニトリル,700mM NaClO4)にて精製し、目的物を分取した。目的のフラクションをエタノール沈殿にて回収し、白色固体14.1mg(AEX-HPLC純度:96%,収率83%)を得た。質量分析により目的物の分子量と一致することを確認した。
分析条件:
・カラム:ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18 130Å(Waters)、2.1×100mm、1.7μm
・カラム温度:80℃
・移動相A:50mM TEAA・1mM EDTA水溶液(pH7.3)
・移動相B:50mM TEAA・1mM EDTA水溶液/メタノール=20/80
・展開条件:A/B=100/0→75/25(0-10min、リニアグラジエント)、75/25→0/100(10-10.5min、リニアグラジエント)、0/100(10.5-15min)、0/100→100/0(15-15.5min、リニアグラジエント)
・流速:0.2mL/min
・検出:PDA検出器(260nm)
・注入量:10μL
解析条件:
・Width:2sec
・Slope:4000μV/min
・Drift:0μV/min
・T.DBL:1000min
・最小面積:500カウント
TGF-β1遺伝子発現抑制配列を有するヘアピン型一本鎖RNA分子の2つの分割フラグメントとして、Ly、Lx1及びLx2が以下に示す構造のストランドA及びストランドB-2の合成を行った。
TGF-β1遺伝子発現抑制配列を有するヘアピン型一本鎖RNA分子の2つの分割フラグメントとして、Ly、Lx1及びLx2が以下に示す構造のストランドA及びストランドB-3の合成を行った。
本実施例では、GAPDH遺伝子発現抑制配列を有するヘアピン型一本鎖RNA分子を、その2つの分割フラグメントである、末端にアミノ基を有する第1の一本鎖オリゴRNA分子(以下、ストランドC)と、末端にカルボキシル基を有する第2の一本鎖オリゴRNA分子(ストランドD)をアミド化反応により連結することで作製した。
GAPDH遺伝子発現抑制配列を有するヘアピン型一本鎖RNA分子の2つの分割フラグメントとして、Ly、Lx1及びLx2が以下に示す構造のストランドC及びストランドD-2の合成を行った。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
Claims (14)
- 標的遺伝子の発現を抑制するヘアピン型一本鎖RNA分子の製造方法であって、
脱水縮合剤の存在下、緩衝液と親水性有機溶媒とを含む混合溶媒中で、下記式(I)で表される第1の一本鎖オリゴRNA分子と下記式(II)で表される第2の一本鎖オリゴRNA分子とを反応させる工程を含み、
5’-Xc-Lx1 ・・・(I)
Lx2-X-Y-Ly-Yc-3’ ・・・(II)
[式(I)及び式(II)中、X、Xc、Y及びYcは、リボヌクレオチド残基からなり、Xcは、Xと相補的であり、Ycは、Yと相補的であり、Lyは、非ヌクレオチド性リンカーであり、Lx1は、アミノ基を有する非ヌクレオチド性リンカーであり、Lx2は、カルボキシル基を有する非ヌクレオチド性リンカーであり、X-Yは、前記標的遺伝子に対する遺伝子発現抑制配列を含み、
Lx 1 は、下記式(VI):
で表され、
Lx 2 は、下記式(VII)又は下記式(VII’):
で表され、
Lyは、下記式(V)又は下記式(XXII):
で表される]
前記脱水縮合剤は、トリアジン型脱水縮合剤、N-ヒドロキシ含窒素芳香環構造を含むウロニウム型脱水縮合剤、カルボジイミド型脱水縮合剤、2-ハロピリジニウム型脱水縮合剤、及びホルムアミジニウム型脱水縮合剤からなる群から選択され、
前記脱水縮合剤がカルボジイミド型脱水縮合剤の場合は、N-ヒドロキシ含窒素芳香族化合物又はシアノ(ヒドロキシイミノ)酢酸エステルと組み合わせて使用し、
前記脱水縮合剤が2-ハロピリジニウム型脱水縮合剤の場合は、N-ヒドロキシ含窒素芳香族化合物と組み合わせて使用し、
前記脱水縮合剤がホルムアミジニウム型脱水縮合剤の場合は、N-ヒドロキシ含窒素芳香族化合物又はN-炭化水素置換イミダゾール誘導体と組み合わせて使用する、
ヘアピン型一本鎖RNA分子の製造方法。 - (i)前記N-ヒドロキシ含窒素芳香環構造を含むウロニウム型脱水縮合剤が、ベンゾトリアゾリルウロニウム型脱水縮合剤である、
(ii)前記N-ヒドロキシ含窒素芳香族化合物が、ヒドロキシベンゾトリアゾール又はその誘導体である、
(iii)前記シアノ(ヒドロキシイミノ)酢酸エステルが、シアノ(ヒドロキシイミノ)酢酸アルキルエステルである、及び/又は
(iv)前記N-炭化水素置換イミダゾール誘導体が、N-アルキルイミダゾール誘導体である、
請求項1に記載の製造方法。 - 前記親水性有機溶媒が、親水性の非プロトン性有機溶媒である、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 前記親水性の非プロトン性有機溶媒が、ジメチルスルホキシド、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N’-ジメチルエチレンウレア、又はアセトニトリルである、請求項3に記載の製造方法。
- 前記脱水縮合剤が、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート、N-(3’-ジメチルアミノプロピル)-N’-エチルカルボジイミド塩酸塩、2-クロロ-1-メチルピリジニウムヨージド、又はクロロ-N,N,N’,N’-テトラメチルホルムアミジニウムヘキサフルオロホスファートであり、
前記N-ヒドロキシ含窒素芳香族化合物が、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾールであり、
前記シアノ(ヒドロキシイミノ)酢酸エステルが、シアノ(ヒドロキシイミノ)酢酸エチルであり、
前記N-炭化水素置換イミダゾール誘導体が、N-メチルイミダゾールである、請求項1~4のいずれか一項記載の製造方法。 - 前記脱水縮合剤と前記親水性の非プロトン性有機溶媒の組み合わせが、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファートとジメチルスルホキシドとの組み合わせ、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファートとN,N-ジメチルホルムアミドとの組み合わせ、N-(3’-ジメチルアミノプロピル)-N’-エチルカルボジイミド塩酸塩と1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾールとジメチルスルホキシドとの組み合わせ、又はクロロ-N,N,N’,N’-テトラメチルホルムアミジニウムヘキサフルオロホスファートと1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾールとジメチルスルホキシドとの組み合わせである、請求項4又5のいずれか一項記載の製造方法。
- 前記緩衝液のpHは、6.5~7.5である、請求項1~6のいずれか一項記載の製造方法。
- 前記標的遺伝子は、TGF-β1遺伝子である、請求項1~9のいずれか一項記載の製造方法。
- 前記ヘアピン型一本鎖RNA分子は、配列番号1で表される塩基配列からなる、請求項1~10のいずれか一項記載の製造方法。
- 以下の(1)又は(2)である、一本鎖オリゴRNA分子の組み合わせ:
(1)24番目のリボヌクレオチド残基がLx1と連結されている配列番号2で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、1番目のリボヌクレオチド残基がLx2と連結され、26番目と27番目のリボヌクレオチド残基がLyを介して連結されている配列番号3で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子の組み合わせ、
(2)22番目のリボヌクレオチド残基がLx1と連結されている配列番号5で表される塩基配列からなる第1の一本鎖オリゴRNA分子と、1番目のリボヌクレオチド残基がLx2と連結され、26番目と27番目のリボヌクレオチド残基がLyを介して連結されている配列番号6で表される塩基配列からなる第2の一本鎖オリゴRNA分子の組み合わせ、
を含む、標的遺伝子の発現を抑制するためのヘアピン型一本鎖RNA分子の製造用のキットであって、
Lx 1 は、下記式(VI):
で表され、
Lx 2 は、下記式(VII)又は下記式(VII’):
で表され、
Lyは、下記式(V)又は下記式(XXII):
で表される、キット。
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