WO2013133221A1 - microRNA阻害剤 - Google Patents

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WO2013133221A1
WO2013133221A1 PCT/JP2013/055868 JP2013055868W WO2013133221A1 WO 2013133221 A1 WO2013133221 A1 WO 2013133221A1 JP 2013055868 W JP2013055868 W JP 2013055868W WO 2013133221 A1 WO2013133221 A1 WO 2013133221A1
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glygly
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microrna
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忠明 大木
久男 白水
鈴木　寛
智洋 濱崎
隆之 水谷
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株式会社ボナック
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    • C12N2310/51—Physical structure in polymeric form, e.g. multimers, concatemers

Definitions

  • the present invention relates to microRNA inhibitors.
  • microRNA is a small 18-25 mer RNA transcribed from the genome, which regulates the expression of the target gene. Abnormal expression of microRNA has been found to be deeply involved in many diseases such as cancer, and recently researches targeting microRNA as a diagnostic and therapeutic target have been activated.
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • microRNA Sponge Non-patent Document 1
  • microRNA Sponge is versatile, but has the problem that RNA molecules used by degrading enzymes are easily degraded.
  • this invention aims at provision of the microRNA inhibitor which has versatility and is hard to be decomposed
  • the microRNA inhibitor of the present invention has two or more complementary sequences to the sequence of microRNA to be inhibited, and the two or more complementary sequences are linked via a linker residue. It is characterized by being connected.
  • microRNA inhibitor of the present invention is excellent in versatility because it is not necessary to use a special modified nucleic acid, and is difficult to be degraded because the complementary sequences are linked via a linker residue.
  • FIG. 1 shows an example of the sequence of the microRNA inhibitor of the present invention. It is a figure which shows typically the example of a mismatched sequence.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of qPCR confirmation of the expression level of microRNA in Example 1. It is a schematic diagram which shows expression of the sea pansy luciferase gene by the plasmid used in the Example. It is a schematic diagram which shows expression of a firefly luciferase gene by another plasmid used in the Example. It is a graph which shows miR-16 activity inhibitory effect of the microRNA inhibitor of Example 2-1.
  • Example 4 it is a graph which compared miR-16 activity inhibitory effect of Gly type sponge oligo (microRNA inhibitor) and GlyGly type sponge oligo (microRNA inhibitor) using HCT116 cell.
  • Example 4 it is a graph which compared miR-16 activity inhibitory effect of GlyGly type sponge oligo (microRNA inhibitor) and TPA type sponge oligo (microRNA inhibitor) using HCT116 cell.
  • Example 4 it is another graph which compared miR-16 activity inhibitory effect of GlyGly type sponge oligo (microRNA inhibitor) and TPA type sponge oligo (microRNA inhibitor) using HCT116 cell. In Example 4, it is another graph which compared the miR-16 activity inhibitory effect of GlyGly type sponge oligo (microRNA inhibitor) and TPA type sponge oligo (microRNA inhibitor) using HCT116 cell. In Example 4, it is a graph which compared miR-16 activity inhibitory effect of Gly type sponge oligo (microRNA inhibitor) and GlyGly type sponge oligo (microRNA inhibitor) using HEK293T cell.
  • Example 4 it is another graph which compared miR-16 activity inhibitory effect of Gly type sponge oligo (microRNA inhibitor) and GlyGly type sponge oligo (microRNA inhibitor) using HEK293T cell.
  • Example 4 it is another graph which compared miR-16 activity inhibitory effect of Gly type sponge oligo (microRNA inhibitor) and GlyGly type sponge oligo (microRNA inhibitor) using HEK293T cell.
  • Example 5 it is a graph which compared miR-16 activity inhibitory effect of sponge oligo (microRNA inhibitor) in case miR-16 binding sequence is Perfect type, Bubble type, or Bulge type using HCT116 cell.
  • Example 5 it is a graph which compared miR-16 activity inhibitory effect of sponge oligo (microRNA inhibitor) in case miR-16 binding sequence is Perfect type, Bubble type, or Bulge type using HEK293T cell.
  • a linker residue is bound to the end of the complementary sequence located at both ends. According to this aspect, decomposition can be further suppressed.
  • the linker residue comprises at least one selected from the group consisting of an amino acid residue, a polyamine residue, and a polycarboxylic acid residue.
  • the linker residue may or may not include residues other than amino acid residues, polyamine residues and polycarboxylic acid residues.
  • the linker residue may be either a polycarboxylic acid residue, a terephthalic acid residue or an amino acid residue.
  • polyamine refers to any compound containing a plurality (two or more) of amino groups.
  • the “amino group” is not limited to —NH 2 group, and includes imino group (—NH—).
  • the polyamine is not particularly limited, and examples thereof include 1,4-diaminobenzene, 1,3-diaminobenzene, 1,2-diaminobenzene and the like.
  • polycarboxylic acid refers to any compound containing a plurality (two or more) of carboxy groups. In the present invention, the polycarboxylic acid is not particularly limited.
  • amino acid refers to any organic compound having one or more amino group and one or more carboxy group in the molecule, as described later.
  • amino group is not limited to —NH 2 group, and includes imino group (—NH—).
  • the amino acid residue located between the two or more complementary sequences may be a combination of a plurality of amino acid residues.
  • an amino acid residue in which a plurality of amino acid residues are linked means, for example, a residue containing a peptide structure. More specifically, for example, in the amino acid residue of the chemical formula (I) described later, the amino acid residue to which the plurality of amino acid residues are linked is a peptide (eg, glycine dimer or It refers to an amino acid residue that is glycine trimer etc.).
  • the amino acid residue may be a glycine residue, a terephthalamide residue or a proline residue.
  • the amino acid residue bound to the end of the complementary sequence may be one in which a plurality of amino acid residues are linked.
  • at least one of an amino acid residue located between the two or more complementary sequences and an amino acid residue bound to an end of the complementary sequence is glycine It may be a dimer or trimer residue.
  • the complementary sequence may be RNA or DNA.
  • the amino acid residue linking two or more of the complementary sequences is not particularly limited, but, for example, as described above, glycine residue, terephthalamide residue or proline residue may be used. it can.
  • the amino acid residue may also be a modified amino acid residue or a derivative of an amino acid.
  • the amino acid residue linking (binding) two or more of the complementary sequences may be a single amino acid residue or a linked two or more amino acid residue.
  • the linker residue is preferably linked to each end of the complementary sequence located at both ends of the microRNA inhibitor.
  • the linker residue may be, for example, an amino acid residue.
  • the amino acid residue is not particularly limited, and is, for example, a glycine residue, a terephthalamide residue or a proline residue.
  • the amino acid residue linking two or more of the complementary sequences may be a single amino acid residue or a linked two or more amino acid residue.
  • the complementary sequence is complementary to all or part of the microRNA to be inhibited.
  • the complementary sequence may include a sequence complementary to all or part of the loop portion of microRNA.
  • the number of complementary sequences is two or more, for example, 2 to 10, preferably 3 to 8, and more preferably 4 to 6.
  • the number of bases of the complementary sequence is not particularly limited, and may be, for example, about 20 to 25 bases.
  • the complementary sequence may be either RNA or DNA, as described above, or may be in the form of DNA and RNA mixed.
  • nucleic acid constituting the complementary sequence is preferably a natural nucleic acid
  • the present invention is not limited thereto, and may be, for example, a modified nucleic acid.
  • nucleic acid constituting the complementary sequence may be, for example, an artificial nucleic acid such as LNA (BNA) or PNA.
  • BNA LNA
  • PNA PNA
  • natural nucleic acids are preferable as described above.
  • FIG. 2 shows an example of the sequence of the microRNA inhibitor of the present invention when hsa-miR-15a is targeted for inhibition as a microRNA.
  • the complementary sequence (SEQ ID NO: 1) is complementary to the entire sequence of hsa-miR-15a. 5'-CACAAACCATGCCTGCTGCTA-3 '(SEQ ID NO: 1)
  • the complementary sequence may be, for example, a perfect complement (full match) to all or part of the microRNA, but a mismatch may exist.
  • a mismatch exists in the microRNA inhibitor of the present invention, cleavage by an enzyme (Dicer etc.) that cleaves double-stranded nucleic acid is suppressed, which makes it more difficult to be degraded, which is preferable.
  • the mismatch is not particularly limited.
  • the central portion of the complementary sequence may have a mismatch of one to several bases, or the central portion of the complementary sequence may be Bulge (a complementary sequence to a target sequence). In addition, it may have an extra sequence of about 1 base to several bases (eg, about 4 bases) in the central portion.
  • FIG. 3 is a schematic view of a full match example
  • FIG. 3 (b) is a schematic view of the bulge example
  • FIG. 3 (c) is a single base at the central portion of the complementary sequence.
  • FIG. 6 is a schematic view of an example in which a mismatch of several bases is included.
  • the lower white strand represents the target sequence (all or part of the microRNA)
  • the upper black strand represents the complementary sequence. .
  • FIG. 3 (b) or (c) may be referred to as a bubble type or the like.
  • the example of the full match in FIG. 3A may be called Perfect type
  • the example in FIG. 3B may be called Bulge type
  • the example in FIG. 3C may be called Bubble.
  • microRNA inhibitor of the present invention can be produced, for example, by chemical synthesis as follows.
  • the chemical synthesis method is not particularly limited, and examples thereof include a phosphoramidite method and an H-phosphonate method.
  • a commercially available automatic nucleic acid synthesizer can be used.
  • the said chemical synthesis method can use amidite, for example.
  • the amidite is not particularly limited, and commercially available amidites such as RNA Phosphoramidites (2'-O-TBDMSi, trade name, Sansen Pharmaceutical), ACE amidite, TOM amidite, CEE amidite, CEM amidite, etc. Can be mentioned.
  • As the microRNA inhibitor of the present invention for example, it is preferable to use the monomer of the present invention described later in the synthesis of the amino acid residue.
  • the linker residue is represented, for example, by the following chemical formula (I-0).
  • Y 1 and Y 2 are each independently a single bond, CH 2 , NH, O or S
  • L 1 is an alkylene chain having n carbon atoms, and a hydrogen atom on the alkylene carbon atom is substituted by OH, OR a , NH 2 , NHR a , NR a R
  • each of Q 11 and Q 12 may be, for example, a carbonyl group.
  • Q 1 and Q 2 are each preferably an imino group.
  • the structure of the following chemical formula (I ⁇ ) is represented by the following chemical formula (I ⁇ 2).
  • R 100 is an optional substituent, which may or may not be present, and when present, may be one or more, and in the case of more than one, they may be the same or different.
  • R 100 examples include the following substituents exemplified in the above-mentioned R a , R b , R c and R d , and more specifically, for example, halogen, hydroxy, alkoxy, Amino, carboxy, sulfo, nitro, carbamoyl, sulfamoyl, alkyl, alkenyl, alkynyl, haloalkyl, aryl, arylalkyl, alkylaryl, cycloalkyl, cycloalkenyl, cycloalkylalkyl, cyclylalkyl, hydroxyalkyl, alkoxyalkyl, aminoalkyl , Silyl, silyloxyalkyl, pyrrolyl, imidazolyl and the like. More preferably, the structure of the chemical formula (I ⁇ 2) is represented by the following chemical formula (I ⁇ 3).
  • the linker residue of the chemical formula (I-0) can also be said to be a carboxylic acid amide residue It can also be said that is a carboxylic acid residue.
  • the “TPA” structure in the following examples can be said to be a terephthalic acid amide residue, but it can also be said to be a residue of terephthalic acid represented by the chemical formula (I ⁇ 3).
  • each of Q 11 and Q 12 may be an imino group.
  • Q 1 and Q 2 are preferably each a carbonyl group.
  • the structure of the following chemical formula (I ⁇ ) is represented by the following chemical formula (I ⁇ 2).
  • R 100 is an optional substituent, which may or may not be present, and when present, may be one or more, and in the case of more than one, they may be the same or different. Specifically, for example, it is the same as R 100 in the chemical formula (I ⁇ 2). More preferably, the structure of the chemical formula (I ⁇ 2) is represented by the following chemical formula (I ⁇ 3).
  • the linker residue is an amino acid residue
  • the amino acid residue is represented, for example, by the following chemical formula (I).
  • the structure of the following chemical formula (I) is an example of the structure represented by the above chemical formula (I-0).
  • X 1 and X 2 are each independently H 2 , O, S or NH; Y 1 and Y 2 are each independently a single bond, CH 2 , NH, O or S; L 1 is an alkylene chain having n carbon atoms, and a hydrogen atom on the alkylene carbon atom is substituted by OH, OR a , NH 2 , NHR a , NR a R b , SH, or SR a May not be substituted, or L 1 is a polyether chain in which at least one carbon atom of the alkylene chain is substituted with an oxygen atom,
  • L 2 is an alkylene chain having m carbon atoms, and a hydrogen atom on the alkylene carbon atom may be substituted
  • X 1 and X 2 are each independently, for example, H 2 , O, S or NH.
  • that X 1 is H 2 means that X 1 forms a CH 2 (methylene group) together with the carbon atom to which X 1 is bonded. The same is true for X 2.
  • Y 1 and Y 2 are each independently a single bond, CH 2 , NH, O or S.
  • L 1 is an alkylene chain having n carbon atoms. Hydrogen atoms on the alkylene carbon atoms is, for example, OH, OR a, NH 2 , NHR a, NR a R b, SH, or may be substituted by SR a, it may not be substituted. Alternatively, L 1 may be a polyether chain in which one or more carbon atoms of the alkylene chain is replaced by an oxygen atom. The polyether chain is, for example, polyethylene glycol.
  • Y 1 is NH, O or S
  • the atom of L 1 bonded to Y 1 is carbon
  • the atom of L 1 bonded to OR 1 is carbon
  • the oxygen atoms are not adjacent to each other. That is, for example, if Y 1 is O, the oxygen atom of an oxygen atom and L 1 is not adjacent the oxygen atom of an oxygen atom and L 1 of OR 1 are not adjacent.
  • L 2 is an alkylene chain having m carbon atoms.
  • the hydrogen atom on the alkylene carbon atom may be substituted or unsubstituted, for example, with OH, OR c , NH 2 , NHR c , NR c R d , SH or SR c .
  • L 2 may be a polyether chain in which one or more carbon atoms of the alkylene chain is replaced with an oxygen atom.
  • Y 2 is NH, O or S
  • the atom of L 2 bonded to Y 2 is carbon
  • the atom of L 2 bonded to OR 2 is carbon
  • the oxygen atoms are not adjacent to each other. That is, for example, when Y 2 is O, the oxygen atom of an oxygen atom and L 2 are not adjacent the oxygen atom of an oxygen atom and L 2 of OR 2 are not adjacent.
  • n of L 1 and the m of L 2 are not particularly limited, and the lower limit is, for example, 0, and the upper limit is also not particularly limited.
  • n and m can be set as appropriate according to, for example, the desired length of the amino acid residue.
  • Each of n and m is preferably 0 to 30, more preferably 0 to 20, and still more preferably 0 to 15, from the viewpoint of, for example, production cost and yield.
  • n + m is, for example, 0-30, preferably 0-20, more preferably 0-15.
  • R a , R b , R c and R d are, for example, each independently a substituent or a protecting group, and may be the same or different.
  • substituent include hydroxy, carboxy, sulfo, halogen, halogenated alkyl (haloalkyl such as CF 3 , CH 2 CF 3 , and CH 2 CCl 3 ), nitro, nitroso, cyano, alkyl (such as methyl and ethyl) , Isopropyl, tert-butyl), alkenyl (eg: vinyl), alkynyl (eg: ethynyl), cycloalkyl (eg: cyclopropyl, adamantyl), cycloalkylalkyl (eg: cyclohexylmethyl, adamantyl methyl), cycloalkenyl (eg : Cyclopropenyl), cyclylalkyl, hydroxy
  • substituents may be substituted by one or more further substituents or further protecting groups.
  • the additional protecting group is not particularly limited, but may be, for example, a protecting group according to the following exemplification. The same applies to the following.
  • the protective group is, for example, a functional group that converts a highly reactive functional group into an inactive group, and examples thereof include known protective groups.
  • the protective group the description in the literature (J. F. W. McOmie, "Protecting Groups in Organic Chemistry", Prenum Press, London and New York, 1973) can be incorporated.
  • the protective group is not particularly limited.
  • tert-butyldimethylsilyl TDMS
  • bis (2-acetoxyethyloxy) methyl ACE
  • triisopropylsilyloxymethyl TOM
  • 1- (2) And -cyanoethoxy) ethyl group CEE
  • 2-cyanoethoxymethyl group CEM
  • tolylsulfonylethoxymethyl group TEM
  • dimethoxytrityl group DMTr
  • each hydrogen atom may be independently substituted with a halogen such as F, Cl, Br, and I.
  • the complementary sequence is linked to the linker residue (eg, amino acid residue) via, for example, -OR 1 -or -OR 2- , respectively.
  • R 1 and R 2 may or may not be present.
  • R 1 and R 2 may each independently be a nucleotide residue or a structure of the above chemical formula (I-0) or (I).
  • the linker residue eg, amino acid residue
  • the linker residue is, for example, the above-mentioned chemical formula (I-0) excluding nucleotide residue R 1 and / or R 2 It is formed from the non-nucleotide residue having the structure of (I) and the nucleotide residue.
  • the linker residue eg, amino acid residue
  • the non-nucleotide residue consisting of the structure of is a structure in which two or more are linked.
  • the structure of the chemical formula (I-0) or (I) may include, for example, one, two, three or four.
  • the structure of the chemical formula (I-0) or (I) may be, for example, directly linked or may be linked via the nucleotide residue.
  • the linker residue eg, amino acid residue
  • the linker residue is formed only from the non-nucleotide residue consisting of, for example, the structure of the chemical formula (I-0) or (I) Be done.
  • the atomic group A in the chemical formula (I) is not particularly limited and is optional, provided that the following chemical formula (Ia) is an amino acid or peptide as described above.
  • the atomic group A in the chemical formula (I), (IA) or (Ia) is, for example, a chain atomic group, an alicyclic atomic group, an aromatic atomic group, a heteroaromatic atomic group, and a heteroalicyclic ring It may or may not contain at least one selected from the group consisting of formula groups.
  • the chain atomic group is not particularly limited, and examples thereof include alkyl, alkenyl, alkynyl, haloalkyl, hydroxyalkyl, alkoxyalkyl, aminoalkyl, silyl, silyloxyalkyl and the like.
  • the alicyclic group is not particularly limited, and examples thereof include cycloalkyl, cycloalkenyl, cycloalkylalkyl, cyclylalkyl and the like.
  • the aromatic atom group is not particularly limited, and examples thereof include aryl, arylalkyl, alkylaryl, condensed aryl, condensed arylalkyl, condensed alkylaryl and the like.
  • the heteroaromatic group is not particularly limited, and examples thereof include heteroaryl, heteroarylalkyl, alkylheteroaryl, condensed heteroaryl, condensed arylaryl, condensed arylheteroaryl and the like. .
  • each of the atomic groups may or may not have a substituent or a protective group.
  • the substituents or protecting groups may be the same or different in a plurality of cases.
  • substituents examples include the substituents exemplified for the aforementioned Ra , Rb , Rc and Rd , and more specifically, for example, halogen, hydroxy, alkoxy, amino, carboxy, sulfo, nitro , Carbamoyl, sulfamoyl, alkyl, alkenyl, alkynyl, haloalkyl, aryl, arylalkyl, alkylaryl, cycloalkyl, cycloalkenyl, cycloalkylalkyl, cyclylalkyl, hydroxyalkyl, alkoxyalkyl, aminoalkyl, silyl, silyloxyalkyl, And pyrrolyl, imidazolyl and the like.
  • the protective groups are, for example, the same as the protective groups exemplified for the R a , R b , R c and R d .
  • amino acid refers to any organic compound having one or more amino group and one or more carboxy group in the molecule.
  • the “amino group” is not limited to —NH 2 group, and includes imino group (—NH—).
  • imino group —NH—
  • proline, hydroxyproline and the like do not contain an —NH 2 group in the molecule and an imino group (—NH—) but are included in the definition of “amino acid” in the present invention.
  • the “amino acid” may be a natural amino acid or an artificial amino acid as described later.
  • a compound represented by the chemical formula (Ia2) or (Ia3) described later is also included in the definition of "amino acid” in the present invention because it contains an amino group and a carboxy group in the molecule. Therefore, for example, in the chemical formula (I), a structure in which the atomic group A is represented by the chemical formula (A2) or the chemical formula (A2a) described later is included in the definition of “amino acid residue” in the present invention. Also, for example, the “TPA” structure in the examples described later is also included in the definition of “amino acid residue” in the present invention. Also, in the present invention, “peptide” refers to an organic compound having a structure in which two or more molecules of amino acids are linked by peptide bond.
  • the peptide bond may be an acid amide structure or an acid imide structure.
  • the amino group specified in the chemical formula (Ia) may be any amino group.
  • the carboxy group specified in the chemical formula (Ia) may be any carboxy group.
  • the amino acid may be a natural amino acid or an artificial amino acid.
  • natural amino acid refers to an amino acid having a naturally occurring structure or an optical isomer thereof.
  • the method for producing the above-mentioned natural amino acid is not particularly limited, and for example, it may be extracted from nature or may be synthesized.
  • artificial amino acid refers to an amino acid having a non-naturally occurring structure.
  • the artificial amino acid is a carboxylic acid derivative having an amino acid, that is, a carboxylic acid derivative containing an amino group (an organic compound having one or more amino groups and one or more carboxy groups in the molecule) and having a nonnaturally occurring structure.
  • the artificial amino acid preferably does not include, for example, a heterocycle.
  • the amino acid may be, for example, an amino acid that constitutes a protein.
  • amino acids examples include glycine, ⁇ -alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, cystine, glutamine, glutamic acid, histidine, isoleucine, leucine, leucine, lysine, hydroxylysine, methionine, phenylalanine, serine, threonine, tyrosine, valine, At least one selected from the group consisting of proline, 4-hydroxyproline, tryptophan, ⁇ -alanine, 1-amino-2-carboxycyclopentane, aminobenzoic acid, aminopyridine carboxylic acid and amino acids represented by the following chemical formula (Ia2) It may be of one type, and may or may not have a substituent or a protecting group.
  • substituents examples include the substituents exemplified for the aforementioned Ra , Rb , Rc and Rd , and more specifically, for example, halogen, hydroxy, alkoxy, amino, carboxy, sulfo, nitro , Carbamoyl, sulfamoyl, alkyl, alkenyl, alkynyl, haloalkyl, aryl, arylalkyl, alkylaryl, cycloalkyl, cycloalkenyl, cycloalkylalkyl, cyclylalkyl, hydroxyalkyl, alkoxyalkyl, aminoalkyl, silyl, silyloxyalkyl, And pyrrolyl, imidazolyl and the like.
  • the protective groups are, for example, the same as the protective groups exemplified for the R a , R b , R c and R d . Further, when an amino acid which is not the peptide of the chemical formula (Ia) has an isomer such as an optical isomer, a geometric isomer, a stereoisomer, etc., any isomer may be used.
  • R 100 is an optional substituent, which may or may not be present, and when present, may be one or more, and in the case of more than one, they may be the same or different.
  • optional substituents for R 100 include the substituents exemplified for the aforementioned R a , R b , R c and R d , and more specifically, for example, halogen, hydroxy, alkoxy, amino, Carboxy, sulfo, nitro, carbamoyl, sulfamoyl, alkyl, alkenyl, alkynyl, haloalkyl, aryl, arylalkyl, alkylaryl, cycloalkyl, cycloalkenyl, cycloalkylalkyl, cyclylalkyl, hydroxyalkyl, alkoxyalkyl, aminoalkyl, silyl , Silyloxyalkyl, pyr
  • the structure of atomic group A in the chemical formula (I) is represented by the following chemical formula (A2).
  • R 100 in the following chemical formula (A2) is the same as R 100 in the chemical formula (Ia2).
  • the structure of the chemical formula (Ia) is the chemical formula (Ia3)
  • the structure of atomic group A in the chemical formula (I) is represented by the following chemical formula (A2a).
  • Examples of the structure of the chemical formula (I) include the following chemical formulas (I-1) to (I-6), and in the following chemical formulas (I-1) to (I-6), n and m are the above-mentioned chemical formulas Same as (I).
  • the structures are shown in the following chemical formulas (I-1a), (I-4a) and (I-6a).
  • alkyl includes, for example, a linear or branched alkyl group.
  • the carbon number of the alkyl is not particularly limited, and is, for example, 1 to 30, preferably 1 to 6, and more preferably 1 to 4.
  • the alkyl group is, for example, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl, n-hexyl, isohexyl, n-heptyl, n-octyl, n-nonyl, n-decyl and the like can be mentioned.
  • Preferred examples include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl, n-hexyl, isohexyl and the like.
  • alkenyl includes, for example, linear or branched alkenyl.
  • alkenyl include those in the alkyl having one or more double bonds.
  • the carbon number of the alkenyl is not particularly limited, and is, for example, the same as the alkyl, preferably 2 to 8.
  • alkenyl include vinyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, 3-butenyl, 1,3-butadienyl, 3-methyl-2-butenyl and the like.
  • alkynyl includes, for example, linear or branched alkynyl.
  • alkynyl include those in the alkyl having one or more triple bonds.
  • the carbon number of the alkynyl is not particularly limited, and is, for example, the same as the alkyl, preferably 2 to 8.
  • alkynyl include ethynyl, propynyl, butynyl and the like.
  • the alkynyl may further have, for example, one or more double bonds.
  • aryl includes, for example, a monocyclic aromatic hydrocarbon group and a polycyclic aromatic hydrocarbon group.
  • the monocyclic aromatic hydrocarbon group include phenyl and the like.
  • the polycyclic aromatic hydrocarbon group is, for example, 1-naphthyl, 2-naphthyl, 1-anthryl, 2-anthryl, 9-anthryl, 1-phenanthryl, 2-phenanthryl, 3-phenanthryl, 4-phenanthryl, 9- Phenantril etc. are mentioned.
  • Preferred examples include phenyl, naphthyl such as 1-naphthyl and 2-naphthyl and the like.
  • heteroaryl includes, for example, a single ring aromatic heterocyclic group and a fused aromatic heterocyclic group.
  • the heteroaryl include furyl (eg, 2-furyl, 3-furyl), thienyl (eg, 2-thienyl, 3-thienyl), pyrrolyl (eg, 1-pyrrolyl, 2-pyrrolyl, 3-pyrrolyl), Imidazolyl (eg: 1-imidazolyl, 2-imidazolyl, 4-imidazolyl), pyrazolyl (eg: 1-pyrazolyl, 3-pyrazolyl, 4-pyrazolyl), triazolyl (eg: 1,2,4-triazol-1-yl, 1,2,4-triazol-3-yl, 1,2,4-triazol-4-yl), tetrazolyl (eg, 1-tetrazolyl, 2-tetrazolyl, 5-tetrazolyl), oxazolyl (eg,
  • phenazinyl eg: 1-phenazinyl, 2-phenazinyl
  • phenothiazinyl eg: 1-phenothiazinyl, 2-phenothiazinyl, 3-phenothiazinyl, 4-phenothiazinyl Etc
  • cycloalkyl is, for example, a cyclic saturated hydrocarbon group, and the carbon number is, for example, 3 to 15.
  • examples of the cycloalkyl include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, a bridged cyclic hydrocarbon group, a spiro hydrocarbon group and the like, with preference given to cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl And bridged cyclic hydrocarbon groups.
  • the “bridged cyclic hydrocarbon group” is, for example, bicyclo [2.1.0] pentyl, bicyclo [2.2.1] heptyl, bicyclo [2.2.2] octyl and bicyclo [3. .2.1] Octyl, tricyclo [2.2.1.0] heptyl, bicyclo [3.3.1] nonane, 1-adamantyl, 2-adamantyl and the like.
  • examples of the "spiro hydrocarbon group” include spiro [3.4] octyl and the like.
  • cycloalkenyl covers, for example, a cyclic unsaturated aliphatic hydrocarbon group and has, for example, 3 to 7 carbon atoms.
  • examples of the cycloalkenyl include cyclopropenyl, cyclobutenyl, cyclopentenyl, cyclohexenyl, cycloheptenyl and the like, with preference given to cyclopropenyl, cyclobutenyl, cyclopentenyl, cyclohexenyl and the like.
  • the above cycloalkenyl also includes, for example, a bridged cyclic hydrocarbon group having a unsaturated bond in the ring and a spirohydrocarbon group.
  • arylalkyl includes, for example, benzyl, 2-phenethyl, naphthalenylmethyl and the like
  • cycloalkylalkyl or “cyclylalkyl” includes, for example, cyclohexylmethyl, adamantyl methyl and the like.
  • hydroxyalkyl include hydroxymethyl and 2-hydroxyethyl and the like.
  • alkoxy includes, for example, the aforementioned alkyl-O- group, and examples thereof include methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, n-butoxy and the like
  • alkoxyalkyl is, for example, Examples thereof include methoxymethyl and the like
  • aminoalkyl includes, for example, 2-aminoethyl and the like.
  • heterocyclyl is, for example, 1-pyrrolinyl, 2-pyrrolinyl, 3-pyrrolinyl, 1-pyrrolidinyl, 2-pyrrolidinyl, 3-pyrrolidinyl, pyrrolidinone, 1-imidazolinyl, 2-imidazolinyl, 4-imidazolinyl, 1 -Imidazolidinyl, 2-imidazolidinyl, 4-imidazolidinyl, imidazolidinone, 1-pyrazolinyl, 3-pyrazolinyl, 4-pyrazolinyl, 4-pyrazolinyl, 1-pyrazolidinyl, 3-pyrazolidinyl, 4-pyrazolidinyl, piperidinone, piperidino, 2-piperidinyl, 3-piperidinyl 4- piperidinyl, 1-piperazinyl, 2-piperazinyl, piperazinone, 2-morpholinyl, 3-morpholinyl, morpholino,
  • heterocyclylalkyl includes, for example, piperidinylmethyl, piperazinylmethyl and the like
  • heterocyclylalkenyl includes, for example, 2-piperidinylethenyl and the like
  • heteroarylalkyl includes pyridylmethyl and quinolin-3-ylmethyl and the like.
  • sil includes a group represented by the chemical formula R 3 Si—, and R can be independently selected from the above alkyl, aryl and cycloalkyl, for example, trimethylsilyl, tert-butyldimethylsilyl
  • R can be independently selected from the above alkyl, aryl and cycloalkyl, for example, trimethylsilyl, tert-butyldimethylsilyl
  • the "silyloxy” include a trimethylsilyloxy group and the like
  • examples of the “silyloxy alkyl” include a trimethylsilyloxymethyl and the like.
  • alkylene includes, for example, methylene, ethylene, propylene and the like.
  • the various groups described above may be substituted.
  • substituents include hydroxy, carboxy, sulfo, halogen, halogenated alkyl (haloalkyl such as CF 3 , CH 2 CF 3 , and CH 2 CCl 3 ), nitro, nitroso, cyano, alkyl (such as methyl and ethyl) , Isopropyl, tert-butyl), alkenyl (eg: vinyl), alkynyl (eg: ethynyl), cycloalkyl (eg: cyclopropyl, adamantyl), cycloalkylalkyl (eg: cyclohexylmethyl, adamantyl methyl), cycloalkenyl (eg : Cyclopropenyl), cyclylalkyl, hydroxyalkyl (eg, hydroxymethyl, hydroxyethyl), alkoxyalkyl (eg
  • the molecule for introducing the linker residue may have, for example, the structure of the following chemical formula (II-0).
  • the monomer of the present invention having the structure of the following chemical formula (II-0) can be incorporated into the description of the linker residue represented by the above chemical formula (I-0) unless otherwise indicated.
  • Y 1 and Y 2 are each independently a single bond, CH 2 , NH, O or S
  • R 11 and R 21 are each independently H, a protecting group or a phosphate protecting group
  • L 1 is an alkylene chain having n carbon atoms, and a hydrogen atom on the alkylene carbon atom is substituted by OH, OR a , NH 2 , NHR a , NR a R b , SH, or
  • the monomer of the present invention may have, for example, the structure of the following chemical formula (II).
  • the description of the linker residue (amino acid residue) represented by said Chemical formula (I) can be used for the monomer of this invention which has a structure of following Chemical formula (II).
  • X 1 and X 2 are each independently H 2 , O, S or NH; Y 1 and Y 2 are each independently a single bond, CH 2 , NH, O or S; R 11 and R 21 are each independently H, a protecting group or a phosphate protecting group; L 1 is an alkylene chain having n carbon atoms, and a hydrogen atom on the alkylene carbon atom is substituted by OH, OR a , NH 2 , NHR a , NR a R b , SH, or SR a May not be substituted, or L 1 is a polyether chain in which at least one carbon atom of the alkylene chain is substituted with an oxygen atom, However, when Y 1 is NH, O or S, the atom of L 1 bonded to Y 1 is carbon, the atom of L 1 bonded to OR 11 is carbon, and the oxygen atoms are not adjacent to each other; L 2 is an alkylene chain having m carbon
  • the monomer of the present invention represented by the chemical formula (II-0) or (II) for example, the amino acid residue represented by the chemical formula (I-0) or (I) in the synthesis of the microRNA inhibitor of the present invention Groups can be easily synthesized.
  • the monomer of the present invention can be used, for example, as an amidite for automatic nucleic acid synthesis in the synthesis of the microRNA inhibitor of the present invention, and is applicable to, for example, a general automatic nucleic acid synthesizer. Examples of the synthesis method include phosphoroamidite method and H-phosphonate method.
  • R 11 and R 21 are each independently H, a protecting group or a phosphate protecting group as described above.
  • the protective group is, for example, the same as the description in the chemical formula (I-0) or (I), and as a specific example, it can be selected from the following group I.
  • the group I comprises a DMTr group, a TBDMS group, an ACE group, a TOM group, a CEE group, a CEM group, a TEM group, and a silyl-containing group represented by the following chemical formula (P1) or (P2).
  • the protective group is preferably any one of a DMtr group and the silyl-containing group.
  • the phosphoric acid protecting group can be represented, for example, by the following chemical formula. -P (OR 6 ) (NR 7 R 8 ) (P 3)
  • R 6 is a hydrogen atom or any substituent.
  • the substituent R 6 is preferably, for example, a hydrocarbon group, and the hydrocarbon group may or may not be substituted with an electron-withdrawing group.
  • the substituent R 6 is, for example, halogen, haloalkyl, heteroaryl, hydroxyalkyl, alkoxyalkyl, aminoalkyl, silyl, silyloxyalkyl, heterocyclylalkenyl, heterocyclylalkyl, heteroarylalkyl, alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, arylalkyl And hydrocarbons such as cycloalkyl, cycloalkenyl, cycloalkylalkyl, cyclylalkyl and the like, and may be substituted or not with an electron-withdrawing group.
  • Specific examples of the substituent R 6 include ⁇ -cyanoethyl group, nitrophenylethyl group, methyl group and the like.
  • R 7 and R 8 are each a hydrogen atom or any substituent, and may be the same or different.
  • the substituents R 7 and R 8 are preferably, for example, a hydrocarbon group, and the hydrocarbon group may be further substituted or unsubstituted with any substituent.
  • the hydrocarbon group is, for example, the same as the above-mentioned list for R 6 and is preferably a methyl group, an ethyl group or an isopropyl group.
  • specific examples of —NR 7 R 8 include a diisopropylamino group, a diethylamino group, an ethylmethylamino group and the like.
  • a nitrogen-containing ring eg, piperidyl group, morpholino group etc.
  • the phosphoric acid protecting group represented by said Chemical formula (P3) it can select from the following group II, for example. Group II, -P (OCH 2 CH 2 CN ) (N (i-Pr) 2), and -P (OCH 3) consisting of (N (i-Pr) 2 ). In the above chemical formula, i-Pr represents isopropyl.
  • R 1 and R 2 may be H or a protecting group, and the other may be H or a phosphoric acid protecting group.
  • R 1 is the above protecting group
  • R 2 is preferably H or the above phosphoric acid protecting group.
  • R 1 is selected from the group I above
  • R 2 is preferably selected from H or a phosphate protecting group represented by the chemical formula (P3), and is preferably selected from H or the group II above Is more preferred.
  • R 1 is the above-mentioned phosphoric acid protecting group
  • R 2 is preferably H or the above-mentioned protecting group.
  • R 1 is selected from the phosphoric acid protecting group represented by the chemical formula (P3) or the group II
  • R 2 is preferably selected from H or the group I.
  • Examples of the structure of the chemical formula (II-0) or (II) include the following chemical formulas (II-1) to (II-6), and n in the following chemical formulas (II-1) to (II-6) And m are the same as the aforementioned chemical formula (II-0) or (II).
  • n and m are not particularly limited, and are as described above.
  • the structures are shown in the following chemical formulas (II-1a), (II-4a) and (II-6a).
  • Method for producing a monomer of the present invention is not particularly limited, for example, as the following scheme 1, a compound wherein amino group of the amino acid (Ia) has been protected by a protecting group R 31 from (Ib), the following compound by a condensation reaction (Ic) may be produced, and further (Ia) may be produced from (Ic), and (IIa) may be converted to (II).
  • the following scheme 1 is an example, and the present invention is not limited thereto.
  • the protecting group R 31 is, for example, Fmoc (9--fluorenylmethyloxycarbonyl group), such as Z (benzyloxycarbonyl) or BOC (t-butoxycarbonyl) is It can be mentioned.
  • Y 1 , Y 2 , L 1 , L 2 , R 11 and R 21 are the same as the aforementioned chemical formula (II).
  • the following compound (IIa) is a compound in which X 1 is O and X 2 is O in the chemical formula (II).
  • the carbonyl oxygen in the following chemical formula (IIa) may be appropriately converted to X 1 and X 2 in the above chemical formula (II), and if it is not necessary to convert, the following compound (IIa) is directly used as the compound (II) It may be used as Further, the method for producing the monomer of the present invention represented by the chemical formula (II-0) is also not particularly limited, but may be, for example, the production method of the following scheme 1 or the production method according to the following scheme 1.
  • the present invention represented by the above-mentioned chemical formula (II-0) by the same production method as the following scheme 1 except that a polyamine or a polycarboxylic acid is used instead of the amino acid of the following chemical formula (Ib) It is also possible to produce monomers of
  • the monomer of the present invention preferably contains, for example, a labeling substance, and in particular, preferably contains a stable isotope.
  • the isotope can be conveniently introduced into the microRNA inhibitor molecule of the present invention.
  • the monomer having an isotope can be synthesized, for example, from the source of the amino acid (Ia) into which the isotope has been introduced.
  • the method for obtaining the amino acid (Ia) into which the isotope has been introduced is not particularly limited. For example, it may be produced by an appropriate method, or a commercially available product may be used if it is available.
  • the amino acid into which the stable isotope has been introduced for example, the amino acid into which deuterium (D) has been introduced is, for example, treating the amino acid (Ia) with LiAlD 4 as shown in the following scheme 3, and further It can be manufactured by oxidizing
  • an amino acid into which another stable isotope has been introduced for example, an amino acid into which heavy oxygen ( 18 O) has been introduced is, for example, a methyl ester of amino acid (Ia) under basic conditions as shown in Scheme 4 below. Can be produced by reacting with H 2 18 O.
  • a peptide into which a stable isotope has been introduced for example, a peptide into which deuterium (D) has been introduced can be produced, for example, by treating a peptide bond with LiAlD 4 as shown in the following scheme 3a.
  • a peptide into which a stable isotope has been introduced for example, a peptide into which heavy oxygen ( 18 O) has been introduced, for example, as shown in the following scheme 4a, under basic conditions, the methyl ester of carboxylic acid is H 2 18 It can be produced by reacting with O and then condensing the carboxylic acid in the following chemical formula with an amino group or an imino group to form a peptide bond.
  • a monomer into which a stable isotope has been introduced can be synthesized, and by using the monomer as an amidite for synthesis, the microRNA inhibition of the present invention, wherein a stable isotope is introduced into the amino acid residue
  • the agent can be synthesized.
  • the structure of the terminal part of the microRNA inhibitor of the present invention may be a nucleic acid, it is preferably a linker residue, and more preferably an amino acid residue (amino acid or peptide).
  • the use of the monomer of the present invention is not particularly limited, but it is preferably for automatic nucleic acid synthesis.
  • the monomer of the present invention is preferably used for the production of a nucleic acid molecule, and the nucleic acid molecule is more preferably the microRNA inhibitor of the present invention.
  • dodecanoic acid amidoglycine-4,4'-dimethoxytrityloxide decanamide phosphoroamidite (6) was synthesized.
  • the compound (6) is a molecule for introducing a glycine residue (Gly), and is an example of the monomer of the present invention.
  • Gly in the following scheme 5 represents a structure represented by the following chemical formula, that is, an atomic group of a structure in which one hydrogen atom of an amino group and OH of a carboxy group are removed from glycine.
  • “Gly” represents a structure of the following chemical formula, unless otherwise specified.
  • 12-Trifluoroacetamidododecanol (compound 1) A solution of 12-aminododecanol (4.81 g, 23.9 mmol) and ethyl trifluoroacetate (6.79 g, 47.8 mmol) in ethanol (100 mL) was stirred overnight at room temperature. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to give 12-trifluoroacetamidododecanol (1) (6.98 g, q.) As a colorless syrup.
  • Fmoc-glycine-4,4'-dimethoxytrityl oxydecanamide (compound 3) Fmoc-glycine (Fmoc-Gly-OH, purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (2.00 g, 6.73 mmol), dicyclohexyl carbodiimide (1.66 g, 8.07 mmol) and 1-hydroxybenzotriazole monohydrate
  • Compound 2 (4.07 g, 8.07 mmol) in anhydrous N, N-dimethylformamide (30 mL) was added to (2.31 g, 16.14 mmol) in anhydrous N, N-dimethylformamide (70 mL) under an argon atmosphere.
  • Triethylamine (2.05 g, 20.22 mmol) was added to the mixture thus obtained, and stirred at room temperature overnight under an argon atmosphere.
  • Dichloromethane 200 mL was added to the obtained reaction mixture, and the mixture was washed three times with saturated aqueous sodium bicarbonate solution and once with saturated brine. The organic layer was separated and dried over sodium sulfate, and the solvent was evaporated under reduced pressure.
  • anhydrous acetonitrile dichloromethane solution (3 mL) of 2-cyanoethoxy-N, N, N ', N'-tetraisopropyl phosphorodiamidite (1.36 g, 4.51 mmol) is added, and the mixture is brought to room temperature under argon atmosphere at room temperature. Stir for 4 hours.
  • Dichloromethane 150 mL was added to the resulting reaction mixture, and the mixture was washed twice with saturated aqueous sodium bicarbonate solution and once with saturated brine. The organic layer was separated, dried over sodium sulfate, and the solvent was evaporated under reduced pressure.
  • the residue is subjected to column chromatography using amino silica (developing solvent: n-hexane-acetone (7: 3) + 0.05% pyridine), and the dodecanoic acid amidoglycine-4,4'-dimethoxytrityloxide decanamide phospho Loamidite (6) (2.72 g, 77%, HPLC 98.5%) was obtained.
  • the instrumental analysis values of dodecanoic acid amidoglycine-4,4′-dimethoxytrityloxide decanamide phosphoroamidite (6) are shown below.
  • Gly is actually represented by following Chemical formula (G1). That is, in the structural formulas (sequences) of the oligonucleotides of the following examples and reference examples, for simplification, parts other than Gly in the following chemical formula (G1) are omitted.
  • the N atom described in the following chemical formula (G1) is bonded to the carbonyl carbon (CO) side of Gly, and the carbonyl carbon described in the following chemical formula (G1) is bonded to the NH side of Gly.
  • hexanoic acid amidoglycylglycine-4,4'-dimethoxytrityloxybutyramido phosphoramidite (16) was synthesized.
  • the compound (16) is a molecule for introducing glycine dimer residue (GlyGly), and is an example of the monomer of the present invention.
  • Gly in the following scheme 6 represents a structure represented by the following chemical formula, that is, an atomic group having a structure in which one hydrogen atom of an amino group and OH of a carboxy group are removed from glycine.
  • GlyGly represents a structure (described below) in which two Glys are linked to form a peptide bond, unless otherwise specified.
  • the NH side of GlyGly is attached to the Fmoc or carbonyl carbon, and the carbonyl carbon (CO) side of Gly is attached to the OH or N atom.
  • Fmoc-glycylglycine-4,4'-dimethoxyxitlyloxybutylamide (compound 13) Fmoc-Glycylglycine (Fmoc-GlyGly-OH, purchased from China Langchem) (2.50 g, 7.05 mmol), dicyclohexylcarbodiimide (1.75 g, 8.46 mmol) and 1-hydroxybenzotriazole monohydrate ( A solution of compound 12 (3.31 g, 8.46 mmol) in anhydrous N, N-dimethylformamide (50 mL) in an anhydrous N, N-dimethylformamide solution (70 mL) in an atmosphere of argon under an argon atmosphere Add cold.
  • Triethylamine (778 mg, 5.08 mmol) was added to the mixture thus obtained, and stirred at room temperature overnight under an argon atmosphere.
  • Dichloromethane 150 mL was added to the obtained reaction mixture, and the mixture was washed three times with saturated aqueous sodium bicarbonate solution and once with saturated brine. The organic layer was separated and dried over sodium sulfate, and the solvent was evaporated under reduced pressure.
  • the residue is subjected to column chromatography using amino silica (developing solvent: dichloromethane-acetone (7: 3) + 0.05% pyridine), and the hexamic acid amidoglycylglycine-4,4'-dimethoxytrityloxy butylamide
  • the phosphoroamidite (16) (938 mg, 86%, HPLC 98.2%) was obtained.
  • the instrumental analysis values of the hexamic acid amidoglycylglycine-4,4'-dimethoxytrityloxy butyramido phosphoramidite (16) are shown below.
  • GlyGly is actually represented by the following chemical formula (G2) in the oligonucleotides of each example and each reference example. That is, in the structural formulas (sequences) of the oligonucleotides of the following examples and reference examples, for simplification, parts other than GlyGly in the following chemical formula (G2) are omitted.
  • GlyGly in chemical formula (G2) below is a structure in which two Glys are linked to form a peptide bond as described above.
  • the N atom described in the following chemical formula (G2) is bonded to the carbonyl carbon (CO) side of GlyGly, and the carbonyl carbon described in the following chemical formula (G2) is bonded to the NH side of GlyGly.
  • a hydrogen atom at the 5' end (H) is bound.
  • terephthalic acid amidite (monomer of the present invention), which is a molecule for introducing terephthalic acid amide residue (TPA)
  • TPA terephthalic acid amide residue
  • target compound 21 (3.94 g, 90%) was obtained.
  • the instrumental analysis values of the compound 21 are shown below.
  • TPA is a structure represented by the following chemical formula in the oligonucleotide of each after-mentioned Example and each reference example.
  • a hydrogen atom H is bound to the 5' end.
  • Example 1 Using the microRNAs to be inhibited as two hsa-miR-16-5p and hsa-miR-122, microRNA inhibitors were produced as described below according to the aforementioned chemical synthesis method.
  • the complementary sequence was complementary to the entire sequence or a part of the two microRNAs.
  • the number of the complementary sequences was three, these were linked by glycine residues (Gly), and glycine residues (Gly) were also linked to each end of the complementary sequences located at both ends.
  • the two types of microRNA inhibitors were introduced into Huh-7 cells, and the expression level of the microRNA collected 24 hours after the introduction was confirmed by qPCR. The results are shown in FIG. As shown in the figure, it can be seen that the two microRNA inhibitors (Sponge Oligo) of this example inhibited microRNAs more dominantly than when they were not introduced (Normal).
  • the microRNA inhibitor is a nucleic acid synthesizer (trade name: ABI Expedite (registered trademark) 8909 Nucleic Acid Synthesis System, Applied, based on the phosphoroamidite method. Biosystems) synthesized from 3 'to 5'.
  • RNA Phosphoramidites (2'-O-TBDMSi, trade name, Sansenri Pharmaceutical) was used as RNA amidite.
  • DNA Phosphoramidites Sansen Pharmaceutical Co., Ltd.
  • a molecule for introducing glycine residue (Gly) and a molecule for introducing glycine dimer residue (GlyGly) used in the above-mentioned phosphoroamidite method were synthesized by the method described later.
  • the molecule for introducing glycine residue (Gly) and the molecule for introducing glycine dimer residue (GlyGly) are both amidites and correspond to the monomers of the present invention.
  • Deprotection of the amidite was performed according to a standard method, and the synthesized microRNA inhibitor was purified by HPLC.
  • Example 2 Comparison of inhibitory effect of sponge oligonucleotide (Example) and monomeric decoy oligonucleotide (Reference Example) on hsa-miR-16-5p (miR-16) activity in HCT116 cells]
  • Material 1-a Oligonucleotide
  • a complementary sequence to the sequence of hsa-miR-16-5p which is a microRNA is Gly (the above G1) or GlyGly (the above G2)
  • the microRNA inhibitory effect was measured using the microRNA inhibitor linked by (1).
  • hsa-miR-16-5p is simply referred to as "miR-16".
  • the microRNA is miR-16 unless otherwise specified.
  • a microRNA inhibitor having two or more complementary sequences to the microRNA sequence is referred to as a "sponge oligonucleotide” or “sponge oligo".
  • a microRNA inhibitor (Reference Example) having only one complementary sequence to the microRNA sequence is referred to as "monomer decoy oligonucleotide” or “monomer decoy”.
  • the “Perfect type” refers to the microRNA inhibitor of the full match structure of FIG. 3 (a)
  • the “Bulge type” is FIG. 3 (b)
  • the “Bubble type” refers to the mismatched structure microRNA inhibitor of FIG.
  • microRNA inhibitors of Reference Examples 2-7 and 2-8 below a positive control (LNA-miR16) of the inhibitory effect of miR-16 activity and the following LNA as its negative control (LNA-Neg.Con) A molecule (manufactured by EXIQON) was used.
  • aqueous solution of the above oligonucleotide was prepared in distilled water for injection to a concentration of 10 ⁇ M.
  • HCT116 As a cell line, HCT116 (ATCC), which is a human colon cancer cell line, was used. The medium was cultured at 37 ° C. in the presence of 10% CO 2 using DMEM medium (Nacalai) containing 10% FBS.
  • reporter Plasmid As a reporter plasmid, a plasmid having the following reporter gene was used.
  • the pGL4.74 [hRluc / TK] vector of Promega is a plasmid that expresses the sea pansy luciferase (Renilla Luciferase) gene under the control of the HSV-TK promoter, as shown in FIG.
  • pGL4-miR16 incorporates the target sequence of miR-16 downstream of the luciferase gene of this vector, and the structure of miR-16 has a structure in which the expression level of luciferase is suppressed.
  • pGL4-NTC pGL4-NTC is a downstream of the luciferase gene of the pGL4.74 [hRluc / TK] vector, into which a non-specific sequence that does not react with miR-16 was incorporated, and was used as a control for pGL4-miR16.
  • (3) pMIR-REPORT Luciferase Ambion's pMIR-REPORT Luciferase is a plasmid that expresses a firefly luciferase (Firefly Luciferase) gene under the control of a CMV promoter as shown in FIG. Transfection efficiency was monitored by co-transfection with the pGL4-miR16 or the GL4-NTC.
  • Both solutions were well stirred and allowed to stand at room temperature for 5 minutes, then Solution A and Solution B were mixed, and further kept at room temperature for 20 minutes. During this time, the medium of the seeded cells was replaced with fresh medium. After 20 minutes, the mixed solution of solution A and solution B was added to the culture solution containing the cells, and culture was continued at 37 ° C. in the presence of 10% CO 2 for 8 hours. Thereafter, the medium of the cells was replaced with fresh medium.
  • RNAiMAX Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) was added to 50 ⁇ L of OptiMEM to prepare a solution D.
  • Solution C and solution D were each allowed to stand at room temperature for 5 minutes, then solution C and solution D were mixed, and further allowed to stand at room temperature for 20 minutes. During this time, the medium of the seeded cells was replaced with fresh medium.
  • a mixture of solution C and solution D was added to the culture medium containing HCT116 cells transfected with the reporter gene, and culture was continued at 37 ° C. in the presence of 10% CO 2 for 24 hours. Thereafter, the medium of the cells was replaced with fresh medium.
  • the final concentration of sponge oligo or LNA is 25 nM, and the final concentration of monomeric decoy is 75 nM.
  • firefly luciferase derived from pMIR-REPORT reflects transfection efficiency
  • Renilla luciferase derived from pGL4-NTC and pGL4-miR16 reflects miR-16 activity. Therefore, dividing the activity of sea pansy luciferase (A pGL4-NTC or A pGL4-miR16 ) by the activity of firefly luciferase (A pMIR-REPORT (NTC) or A pMIR-REPORT (miR-16) ) gives Obtain the sea pansy luciferase activity value.
  • the sea pansy luciferase activity value derived from pGL4-NTC When the standardized sea pansy luciferase activity value derived from pGL4-NTC is set to 1, the sea pansy luciferase activity value derived from pGL4-miR16 becomes a value suppressed by miR-16. Therefore, for each sponge oligo, monomer decoy or LNA, the value of miR-16 activity suppression effect was obtained by the following calculation formula.
  • FIGS. 7 to 9 represent the miR-16 activity inhibitory effect (also referred to as an activity inhibitory effect or activity inhibitory ability).
  • FIGS. 10 to 21 The same applies to FIGS. 10 to 21 described later.
  • Fig. 7 shows Gly-containing Bubble-type sponge oligo (Example 2-1)
  • Fig. 8 shows GlyGly-containing Perfect-type sponge oligo (Example 2-2)
  • Fig. 9 shows GlyGly-containing Bubble-type sponge oligo (Example 2-3) Is the result of using As shown, in all cases, sponge oligos were shown to have miR-16 activity suppression ability comparable to LNA.
  • the sponge oligo of this example has the advantage of being extremely simple and highly versatile compared to LNA in terms of its structure.
  • the monomer decoy having a concentration three times that of sponge oligo is used, but sponge oligo is the monomer decoy. It was shown to have higher ability to suppress miR-16 activity. This indicates that the binding of miRNA occurs in a coordinated manner on sponge oligos.
  • Example 3 Inhibitory effect of DNA type sponge oligo and RNA type sponge oligo on miR-16 activity in HCT116 cells
  • Material 1-a Oligonucleotide As shown in the following sequence and Table 2 described later, the microRNA inhibitory effect (microRNA inhibitory activity) is measured using a microRNA inhibitor in which a complementary sequence to miR-16 is linked with GlyGly (the above G2) did.
  • Example 3-1 spo-D-16 (GlyGly-Containing Bubble-type DNA sponge oligo) 5'-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAAATTCGATGCTGCTA-GlyGly-T-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • Example 3-2 spo-R-16 (GlyGly-Containing Bubble-type RNA sponge oligo) 5'-GlyGly-CGCCAAUAUGUUGUGUCGUA-GlyGly-CGCCAAUAUUGGAUGCUGCUA-GlyGly-CGCCAAUAUGUGAUGCUGCUA-GlyGly-U-3 '(SEQ ID NO: 13) Also the following negative control oligos for each were used.
  • a positive control (LNA-miR16) of the inhibitory effect of miR-16 activity and the following LNA as its negative control (LNA-Neg.Con) A molecule (manufactured by EXIQON) was used.
  • Reference Example 3-3 is the same as Reference Example 2-7
  • Reference Example 3-4 is the same as Reference Example 2-8.
  • Reference Example 3-4 LNA-Neg. Con AGAGGTCCCCTTCAATCC AAA (SEQ ID NO: 12)
  • An aqueous solution of the above oligonucleotide was prepared to have a concentration of 10 ⁇ M using distilled water for injection.
  • Cell line The cell line and medium used the same cell line and medium as in Example 2.
  • Reporter Plasmid As a reporter plasmid, a plasmid having the same reporter gene as in Example 2 was used.
  • Method 2-a Transfection of Reporter Gene into HCT116 Cells Using HCT116 cells, the reporter gene plasmids pGL4-NTC (2 ⁇ g) and pMIR-REPORT (2 ⁇ g) were prepared Alternatively, pGL4-miR16 (2 ⁇ g) and pMIR-REPORT (2 ⁇ g) were respectively transfected into HCT116 cells.
  • each of the DNA-type sponge oligo and the RNA-type sponge oligo of Examples had extremely high miR-16 activity suppressing ability as compared with the negative control. Furthermore, both the DNA-type sponge oligo and the RNA-type sponge oligo according to this example have the advantages of being extremely simple and highly versatile compared to LNA in terms of their structures. Furthermore, in addition to that, it was shown that the DNA-type sponge oligo of the present example is higher in the ability to suppress miR-16 activity than the RNA-type sponge oligo and has high ability to suppress miR-16 activity comparable to LNA.
  • the DNA-type sponge oligo had a higher microRNA activity suppression effect than the RNA-type sponge oligo.
  • the RNA type sponge oligo may have higher microRNA activity suppression ability than the DNA type sponge oligo. is there.
  • Material 1-a Oligonucleotide As shown in the following base sequence and Table 3 described later, microRNA inhibition in which a complementary sequence to the sequence of miR-16 is linked by Gly (the above G1), Gly Gly (the above G2) or TPA The agent was used to measure the microRNA inhibitory effect (microRNA inhibitory activity).
  • Example 4-1 spo-D-3 (Gly-containing Bubble type sponge oligo) 5'-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-CGCCAATATCGATGCTGCTA-Gly-CGCCAATATCGATGCTGCTA-Gly-CGCCAATATCGATGCTGCTA-Gly-T-3 '(SEQ ID NO: 2) (Example 4-2) spo-D-16 (GlyGly-Containing Bubble-type sponge oligo) 5'-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAAATTCGATGCTGCTA-GlyGly-T-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • Example 4-3 spo-D-13 (GlyGly-containing Perfect type sponge oligo) 5'-GlyGly-CGCCAAATTTTACGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAAATTTTACGTGCTGCTA-
  • microRNA inhibitors in which the following base sequences are linked by Gly (the above G1) or Gly Gly (the above G2) (the following Reference Examples 4-1 to 4-4)
  • the microRNA suppression effect was measured using.
  • microRNA inhibitor of the following reference examples 4-5 and 4-6 the positive control (LNA-miR16) of the inhibitory effect of miR-16 activity and the following LNA which is its negative control (LNA-Neg.Con) A molecule (manufactured by EXIQON) was used.
  • Reference Example 4-5 is the same as Reference Example 2-7
  • Reference Example 4-6 is the same as Reference Example 2-8.
  • LNA-miR16 GCCAAATTTTACGTGCTGCT SEQ ID NO: 11
  • Reference Example 4-6 LNA-Neg. Con AGAGGTCCCCTTCAATCC AAA (SEQ ID NO: 12)
  • RNA solution The above oligonucleotide was dissolved in distilled water for injection to a concentration of 10 ⁇ M to prepare an RNA solution.
  • HCT116 which is a human colon cancer cell line
  • HEK293T ATCC
  • FBS FBS
  • Reporter Plasmid As a reporter plasmid, a plasmid having the same reporter gene as in Example 2 was used.
  • FIG. 11 is a comparison of Gly type sponge oligo and GlyGly type sponge oligo using HCT116 cells.
  • FIGS. 12-17 compare GlyGly type sponge oligo with TPA type sponge oligo. 12 to 14 show the results using HCT116 cells, and FIGS. 15 to 17 show the results using HEK293T cells.
  • the Perfect type sponge oligo was used, the activity of TPA was higher in HCT116 cells (FIG. 12), and the activities of both HEK293T cells were almost the same (FIG. 15).
  • microRNA inhibitor of Reference Example 5-1 was used as the negative control oligo of Examples 5-1 to 5-3, and the microRNA inhibitory effect (microRNA inhibitory activity) was measured.
  • Reference Example 5-1 spo-D-19 (Perfect type sponge oligo negative control containing TPA) 5'-TPA-CGCCAAATTTTACGTAAATTACA-TPA-CGCCAAATTTTACGTAAATTACA-TPA-CGCCAAATTTTACGTAAATTACA-TPA-CGCCAAATTTTACGTAAATTACA-TPA-T-3 '(SEQ ID NO: 19)
  • Reference Example 5-2 is the same as Reference Example 2-7
  • Reference Example 5-3 is the same as Reference Example 2-8.
  • Reference Example 5-2 LNA-miR16 GCCAAATTTTACGTGCTGCT (SEQ ID NO: 11)
  • Reference Example 5-3 LNA-Neg. Con AGAGGTCCCCTTCAATCC AAA (SEQ ID NO: 12)
  • An aqueous solution of the above oligonucleotide was prepared to have a concentration of 10 ⁇ M using distilled water for injection.
  • Cell line The same cell line as in Example 4 was used for activity measurement.
  • Reporter Plasmid As a reporter plasmid, a plasmid having the same reporter gene as in Example 2 was used.
  • FIG. 18 is a comparison of sponge oligo activities when the miR-16 binding sequence is Perfect, Bubble, or Bulge type using HCT116 cells. As a result, although there was almost no difference among these three, Perfect type and Bulge type showed relatively strong inhibitory effect on miR-16 activity in vitro.
  • FIG. 19 is a comparison of sponge oligo activities when the miR-16 binding sequence is Perfect, Bubble or Bulge type using HEK293T cells. As a result, among these three, Bulge type showed the strongest suppressive effect on miR-16 activity in vitro.
  • the microRNA inhibitor of the present invention is excellent in versatility since it is not necessary to use a special modified nucleic acid, and is difficult to be degraded since the complementary sequence is linked (linked) via a linker residue. For this reason, the microRNA inhibitor of the present invention can be widely used in various fields.

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Abstract

　汎用性があり、かつ、分解され難いmicroRNA阻害剤を提供する。　microRNA阻害剤であって、阻害の対象となるmicroRNAの配列に対する相補的配列２を二つ以上有し、前記二つ以上の相補的配列２が、リンカー残基３を介して連結していることを特徴とするmicroRNA阻害剤１。

Description

microRNA阻害剤
　本発明は、microRNA阻害剤に関する。
　microRNAは、ゲノムから転写される１８～２５merの小さなRNAであり、標的とする遺伝子の発現を制御している。microRNAの発現異常は、ガン等の多くの疾患に深く関わっていることが分かっており、最近は、microRNAを診断および治療の標的とした研究が活発にされている。microRNAを阻害する方法としては、例えば、LNA（Locked　Nucleic　Acid）を用いた方法があり、欧米では臨床段階まで進んでいる。その他のmicroRNAの阻害方法としては、microRNA　Spongeという技術がある（非特許文献１）。
NATURE　METHODS,4:72
　しかしながら、LNAを用いた方法は、特殊な修飾核酸を用いた方法であるため、汎用性に欠ける。また、microRNA　Spongeは、汎用性はあるが、分解酵素によって用いるRNA分子が分解されやすいという問題がある。
　そこで、本発明は、汎用性があり、かつ、分解され難いmicroRNA阻害剤の提供を目的とする。
　前記目的を達成するために、本発明のmicroRNA阻害剤は、阻害の対象となるmicroRNAの配列に対する相補的配列を二つ以上有し、前記二つ以上の相補的配列が、リンカー残基を介して連結していることを特徴とする。
　本発明のmicroRNA阻害剤は、特殊な修飾核酸を用いる必要がないことから汎用性に優れ、かつ、前記相補的配列がリンカー残基を介して連結されているため分解され難い。
本発明のmicroRNA阻害剤の構成の例を示す図である。 本発明のmicroRNA阻害剤の配列の例を示す図である。 ミスマッチ配列の例を模式的に示す図である。 実施例１におけるmicroRNAの発現量の、qPCRによる確認結果を示す図である。 実施例で用いたプラスミドによる、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の発現を示す模式図である。 実施例で用いた別のプラスミドによる、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現を示す模式図である。 実施例２－１のmicroRNA阻害剤のmiR-16活性抑制効果を示すグラフである。 実施例２－２のmicroRNA阻害剤のmiR-16活性抑制効果を示すグラフである。 実施例２－３のmicroRNA阻害剤のmiR-16活性抑制効果を示すグラフである。 実施例３のmicroRNA阻害剤のmiR-16活性抑制効果を示すグラフである。 実施例４において、HCT116細胞を用いてGly型スポンジオリゴ（microRNA阻害剤）とGlyGly型スポンジオリゴ（microRNA阻害剤）のmiR-16活性抑制効果を比較したグラフである。 実施例４において、HCT116細胞を用いてGlyGly型スポンジオリゴ（microRNA阻害剤）とTPA型スポンジオリゴ（microRNA阻害剤）のmiR-16活性抑制効果を比較したグラフである。 実施例４において、HCT116細胞を用いてGlyGly型スポンジオリゴ（microRNA阻害剤）とTPA型スポンジオリゴ（microRNA阻害剤）のmiR-16活性抑制効果を比較した別のグラフである。 実施例４において、HCT116細胞を用いてGlyGly型スポンジオリゴ（microRNA阻害剤）とTPA型スポンジオリゴ（microRNA阻害剤）のmiR-16活性抑制効果を比較したさらに別のグラフである。 実施例４において、HEK293T細胞を用いてGly型スポンジオリゴ（microRNA阻害剤）とGlyGly型スポンジオリゴ（microRNA阻害剤）のmiR-16活性抑制効果を比較したグラフである。 実施例４において、HEK293T細胞を用いてGly型スポンジオリゴ（microRNA阻害剤）とGlyGly型スポンジオリゴ（microRNA阻害剤）のmiR-16活性抑制効果を比較した別のグラフである。 実施例４において、HEK293T細胞を用いてGly型スポンジオリゴ（microRNA阻害剤）とGlyGly型スポンジオリゴ（microRNA阻害剤）のmiR-16活性抑制効果を比較したさらに別のグラフである。 実施例５において、HCT116細胞を用いてmiR-16結合配列がPerfect型、Bubble型、またはBulge型の場合のスポンジオリゴ（microRNA阻害剤）のmiR-16活性抑制効果を比較したグラフである。 実施例５において、HEK293T細胞を用いてmiR-16結合配列がPerfect型、Bubble型、またはBulge型の場合のスポンジオリゴ（microRNA阻害剤）のmiR-16活性抑制効果を比較したグラフである。
　以下、本発明について、例を挙げて詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の説明により限定されない。
　本発明のmicroRNA阻害剤において、両末端に位置する前記相補的配列の端部にリンカー残基が結合していることが好ましい。この形態によれば、さらに分解を抑制することができる。
　本発明のmicroRNA阻害剤において、前記リンカー残基が、アミノ酸残基、ポリアミン残基、およびポリカルボン酸残基からなる群から選択される少なくとも一つを含むことが好ましい。前記リンカー残基は、アミノ酸残基、ポリアミン残基、およびポリカルボン酸残基以外の残基を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。例えば、前記リンカー残基は、ポリカルボン酸残基、テレフタル酸残基またはアミノ酸残基のいずれかであってもよい。
　本発明において、「ポリアミン」は、アミノ基を複数（２つ、または３つ以上）含む任意の化合物をいう。前記「アミノ基」は、－ＮＨ２基に限定されず、イミノ基（－ＮＨ－）も含む。本発明において、前記ポリアミンは、特に限定されないが、例えば、１，４－ジアミノベンゼン、１，３－ジアミノベンゼン、１，２－ジアミノベンゼン等が挙げられる。また、本発明において、「ポリカルボン酸」は、カルボキシ基を複数（２つ、または３つ以上）含む任意の化合物をいう。本発明において、前記ポリカルボン酸は、特に限定されないが、例えば、１，４－ジカルボキシベンゼン（テレフタル酸）、１，３－ジカルボキシベンゼン（イソフタル酸）、１，２－ジカルボキシベンゼン（フタル酸）等が挙げられる。また、本発明において、「アミノ酸」は、後述するように、分子中にアミノ基およびカルボキシ基をそれぞれ１つ以上含む任意の有機化合物をいう。前記「アミノ基」は、－ＮＨ２基に限定されず、イミノ基（－ＮＨ－）も含む。
　本発明のmicroRNA阻害剤において、前記二つ以上の相補的配列の間に位置しているアミノ酸残基が、複数のアミノ酸残基が連結したものであってもよい。なお、本発明において、複数のアミノ酸残基が連結したアミノ酸残基とは、例えば、ペプチド構造を含む残基をいう。より具体的には、前記複数のアミノ酸残基が連結したアミノ酸残基は、例えば、後述する化学式（Ｉ）のアミノ酸残基において、後述する化学式（Ｉａ）がペプチド（例えば、グリシン二量体またはグリシン三量体等）であるアミノ酸残基をいう。
　本発明のmicroRNA阻害剤において、前記アミノ酸残基が、グリシン残基、テレフタル酸アミド残基またはプロリン残基であってもよい。
　本発明のmicroRNA阻害剤において、前記相補的配列の端部に結合したアミノ酸残基が、複数のアミノ酸残基が連結したものであってもよい。また、本発明のmicroRNA阻害剤において、前記二つ以上の相補的配列の間に位置しているアミノ酸残基、および、前記相補的配列の端部に結合したアミノ酸残基の少なくとも一方が、グリシン二量体または三量体の残基であってもよい。
　本発明において、前記相補的配列は、RNAまたはDNAであってもよい。
　本発明において、二つ以上の前記相補的配列を連結するアミノ酸残基は、特に制限されないが、例えば、前述のように、グリシン残基、テレフタル酸アミド残基またはプロリン残基を使用することができる。また、前記アミノ酸残基は、修飾アミノ酸残基またはアミノ酸の誘導体であってもよい。二つ以上の前記相補的配列を連結（結合）するアミノ酸残基は、一つのアミノ酸残基でもよいし、二つ以上のアミノ酸残基が連結したものであってもよい。
　本発明において、前述のように、microRNA阻害剤の両末端に位置する前記相補的配列の各端部には、前記リンカー残基が連結していることが好ましい。前記リンカー残基は、例えば、アミノ酸残基であってもよい。前記アミノ酸残基は、特に制限されないが、例えば、グリシン残基、テレフタル酸アミド残基またはプロリン残基である。二つ以上の前記相補的配列を連結するアミノ酸残基は、一つのアミノ酸残基でもよいし、二つ以上のアミノ酸残基が連結したものであってもよい。
　本発明において、前記相補的配列は、阻害の対象となるmicroRNAの全体または一部に対し相補的である。一部に対し相補的である場合は、microRNAのループより３´側または５´側の配列と相補的であることが好ましい。また、前記相補的配列は、microRNAのループ部分の全体または一部と相補的な配列を含んでいてもよい。前記相補的配列の数は、二つ以上であり、例えば、２～１０、好ましくは、３～８、より好ましくは、４～６である。また、前記相補的配列の塩基数は、特に限定されないが、例えば、約２０～２５塩基であっても良い。前記相補的配列は、前述のように、RNAまたはDNAのいずれであってもよく、DNAおよびRNAが混在した形態であってもよい。また、前記相補的配列を構成する核酸は、天然核酸が好ましいが、本発明はこれに制限されず、例えば、修飾核酸であってもよい。また、前記相補的配列を構成する核酸は、例えば、LNA（BNA）またはPNA等の人工核酸であっても良い。ただし、汎用性および簡便性の観点からは、前記のとおり天然核酸が好ましい。
　本発明のmicroRNA阻害剤の構成の例を図１に示す。同図に示すように、本例のmicroRNA阻害剤１は、３つの相補的配列２が、二つのリンカー残基（例えば、アミノ酸残基）３で連結されており、また、両端の相補的配列２の各端部にもリンカー残基３が連結している。また、microRNAとしてhsa-miR-15aを阻害対象とした場合の本発明のmicroRNA阻害剤の配列の例を図２に示す。本例では、前記相補的配列（配列番号１）はhsa-miR-15aの全配列と相補的である。
 
　　5’-CACAAACCATGCCTGCTGCTA-3’（配列番号１）
　なお、本発明のmicroRNA阻害剤において、前記相補的配列は、例えば、microRNAの全体または一部に対し完全に相補的（フルマッチ）であっても良いが、ミスマッチが存在しても良い。本発明のmicroRNA阻害剤にミスマッチが存在すると、二本鎖の核酸を切断する酵素（Dicer等）による切断が抑制されるため、さらに分解され難くなり好ましい。前記ミスマッチは、特に限定されないが、例えば、前記相補的配列の中心部分に１塩基～数塩基のミスマッチが入っていても良いし、前記相補的配列の中心部分がBulge(ターゲット配列に対する相補配列に加え、中心部分に１塩基～数塩基［例えば、約4塩基］ほどのエクストラ配列が入った状態)であっても良い。なお、前記相補的配列の前記「中心部分」は、前記相補的配列の末端の塩基以外であれば、特に限定されない。図３に、ミスマッチの例を、フルマッチの例と併せて模式的に示す。図３（ａ）は、フルマッチの例の模式図であり、図３（ｂ）は、前記Bulgeの例の模式図であり、図３（ｃ）は、前記相補的配列の中心部分に１塩基～数塩基のミスマッチが入った例の模式図である。図３（ａ）～（ｃ）の各図において、それぞれ、下側の白色の鎖が、ターゲット配列（microRNAの全体または一部）を表し、上側の黒色の鎖が、前記相補的配列を表す。なお、図３（ｂ）または（ｃ）のミスマッチの例（特に、図３（ｃ））を、Bubble型などということがある。または、図３（ａ）のフルマッチの例をPerfect型、図３（ｂ）の例をBulge型、図３（ｃ）の例をBubble型ということがある。
　本発明のmicroRNA阻害剤は、例えば、化学合成によって、次のようにして製造できる。
　前記化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法およびＨ－ホスホネート法等があげられる。前記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。また、前記化学合成法は、例えば、アミダイトを使用可能である。前記アミダイトは、特に制限されず、市販のアミダイトとして、例えば、ＲＮＡ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（２’－Ｏ－ＴＢＤＭＳｉ、商品名、三千里製薬）、ＡＣＥアミダイト、ＴＯＭアミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト等があげられる。本発明のmicroRNA阻害剤については、例えば、前記アミノ酸残基の合成の際、後述する本発明のモノマーを使用することが好ましい。
　本発明のmicroRNA阻害剤において、前記リンカー残基は、例えば、下記化学式（Ｉ－０）で表わされる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 前記化学式（Ｉ－０）中、
Ｑ１１およびＱ１２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２（メチレン基）、ＮＨ（イミノ基）、Ｃ＝Ｏ（カルボニル基）、Ｃ＝Ｓ（チオカルボニル基）、Ｃ＝ＮＨ（イミノメチレン基）、Ｏ、またはＳであり、
Ｑ１およびＱ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２（メチレン基）、ＮＨ（イミノ基）、Ｃ＝Ｏ（カルボニル基）、Ｃ＝Ｓ（チオカルボニル基）、Ｃ＝ＮＨ（イミノメチレン基）、Ｏ、またはＳであり、
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｍは、０～３０の範囲の整数であり；
ｎは、０～３０の範囲の整数であり；
前記microRNAの配列に対する相補的配列は、それぞれ、－ＯＲ１－または－ＯＲ２－を介して、前記リンカー残基に結合し、
前記リンカー残基が、前記microRNAの相補的配列の間に位置している場合は、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ－０）であり、
前記リンカー残基が、末端に位置する前記microRNAの相補的配列の端部に位置している場合は、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、保護基またはリン酸保護基であり；
Ａは、任意の原子団である。
　前記化学式（Ｉ－０）において、例えば、Ｑ１１がＣ＝Ｏ（カルボニル基）であり、Ｑ１がＮＨ（イミノ基）であってもよい。また、例えば、Ｑ１１がＮＨ（イミノ基）であり、Ｑ１がＣ＝Ｏ（カルボニル基）であってもよい。また例えば、Ｑ１２がＣ＝Ｏ（カルボニル基）であり、Ｑ２がＮＨ（イミノ基）であってもよい。また、例えば、Ｑ１２がＮＨ（イミノ基）であり、Ｑ２がＣ＝Ｏ（カルボニル基）であってもよい。
　前記化学式（Ｉ－０）中、Ｑ１１およびＱ１２は、例えば、それぞれカルボニル基であってもよい。この場合において、Ｑ１およびＱ２が、それぞれイミノ基であることが好ましい。また、この場合において、下記化学式（Ｉα）の構造が、下記化学式（Ｉα２）で表されることがより好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 前記化学式（Ｉα２）中、
Ｒ１００は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、１個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。Ｒ１００における前記任意の置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄにおいて例示する後述の置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル、等があげられる。また、前記化学式（Ｉα２）の構造が、下記化学式（Ｉα３）で表されることがさらに好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　なお、Ｑ１１およびＱ１２がカルボニル基であり、かつＱ１およびＱ２がイミノ基である場合、前記化学式（Ｉ－０）のリンカー残基は、カルボン酸アミド残基であるということもできるが、カルボン酸残基であるということもできる。例えば、後述の実施例における「TPA」構造は、テレフタル酸アミド残基であるということもできるが、前記化学式（Ｉα３）で表されるテレフタル酸の残基であるということもできる。
　前記化学式（Ｉ－０）中、Ｑ１１およびＱ１２が、それぞれイミノ基であってもよい。この場合において、Ｑ１およびＱ２が、それぞれカルボニル基であることが好ましい。また、この場合において、下記化学式（Ｉβ）の構造が、下記化学式（Ｉβ２）で表されることがより好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
 前記化学式（Ｉβ２）中、
Ｒ１００は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、１個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。具体的には、例えば、前記化学式（Ｉα２）中のＲ１００と同様である。また、前記化学式（Ｉβ２）の構造が、下記化学式（Ｉβ３）で表されることがさらに好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　本発明のmicroRNA阻害剤において、前記リンカー残基が、アミノ酸残基である場合、前記アミノ酸残基は、例えば、下記化学式（Ｉ）で表わされる。なお、下記化学式（Ｉ）の構造は、前記化学式（Ｉ－０）で表される構造の一例である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
　前記化学式（Ｉ）中、例えば、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｍは、０～３０の範囲の整数であり；
ｎは、０～３０の範囲の整数であり；
前記microRNAの配列に対する相補的配列は、それぞれ、－ＯＲ１－または－ＯＲ２－を介して、前記アミノ酸残基に結合し、
前記アミノ酸残基が、前記microRNAの相補的配列の間に位置している場合は、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ）であり、
前記アミノ酸残基が、末端に位置する前記microRNAの相補的配列の端部に位置している場合は、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、保護基またはリン酸保護基であり；
Ａは、任意の原子団であり、ただし、下記化学式（Ｉａ）は、アミノ酸またはペプチドである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
　前記化学式（Ｉ）中、Ｘ１およびＸ２は、例えば、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨである。前記化学式（Ｉ）中において、Ｘ１がＨ２であるとは、Ｘ１が、Ｘ１の結合する炭素原子とともに、ＣＨ２（メチレン基）を形成することを意味する。Ｘ２についても同様である。
　前記化学式（Ｉ）中、Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳである。
　前記化学式（Ｉ－０）および（Ｉ）中、Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ１は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。前記ポリエーテル鎖は、例えば、ポリエチレングリコールである。なお、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ１がＯの場合、その酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接せず、ＯＲ１の酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接しない。
　前記化学式（Ｉ－０）および（Ｉ）中、Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ２は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。なお、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ２がＯの場合、その酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接せず、ＯＲ２の酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接しない。
　Ｌ１のｎおよびＬ２のｍは、特に制限されず、それぞれ、下限は、例えば、０であり、上限も、特に制限されない。ｎおよびｍは、例えば、前記アミノ酸残基の所望の長さに応じて、適宜設定できる。ｎおよびｍは、例えば、製造コストおよび収率等の点から、それぞれ、０～３０が好ましく、より好ましくは０～２０であり、さらに好ましくは０～１５である。ｎとｍは、同じでもよいし（ｎ＝ｍ）、異なってもよい。ｎ＋ｍは、例えば、０～３０であり、好ましくは０～２０であり、より好ましくは０～１５である。
　Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基であり、同一でも異なってもよい。前記置換基は、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル（ハロアルキル、例：ＣＦ３、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＨ２ＣＣｌ３）、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アルキル（例：メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ－ブチル）、アルケニル（例：ビニル）、アルキニル（例：エチニル）、シクロアルキル（例：シクロプロピル、アダマンチル）、シクロアルキルアルキル（例：シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル）、シクロアルケニル（例：シクロプロペニル）、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル（例：ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル）、アルコキシアルキル（例：メトキシメチル、エトキシメチル、エトキシエチル）、アリール（例：フェニル、ナフチル）、アリールアルキル（例：ベンジル、フェネチル）、アルキルアリール（例、ｐ－メチルフェニル）、ヘテロアリール（例：ピリジル、フリル）、ヘテロアリールアルキル（例：ピリジルメチル）、ヘテロシクリル（例：ピペリジル）、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル（例：モルホリルメチル）、アルコキシ（例：メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ）、ハロゲン化アルコキシ（例：ＯＣＦ３）、アルケニルオキシ（例：ビニルオキシ、アリルオキシ）、アリールオキシ（例：フェニルオキシ）、アルキルオキシカルボニル（例：メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）、アリールアルキルオキシ（例：ベンジルオキシ）、アミノ［アルキルアミノ（例：メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ）、アシルアミノ（例：アセチルアミノ、ベンゾイルアミノ）、アリールアルキルアミノ（例：ベンジルアミノ、トリチルアミノ）、ヒドロキシアミノ］、アミノアルキル（例：アミノメチル）、アルキルアミノアルキル（例：ジエチルアミノメチル）、カルバモイル、スルファモイル、オキソ、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。これらの置換基は、１または複数のさらなる置換基またはさらなる保護基で置換されていても良い。前記さらなる置換基は、特に限定されないが、例えば、上記例示に係る置換基でも良い。前記さらなる保護基は、特に限定されないが、例えば、下記例示に係る保護基でも良い。以下において同様である。
　前記保護基（または、前記さらなる保護基）は、例えば、反応性の高い官能基を不活性に変換する官能基であり、公知の保護基等があげられる。前記保護基は、例えば、文献（J.　F.　W.　McOmie,　「Protecting　Groups　in　Organic　Chemistry」　Prenum　Press,　London　and　New　York,　1973）の記載を援用できる。前記保護基は、特に制限されず、例えば、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）、ビス（２－アセトキシエチルオキシ）メチル基（ＡＣＥ）、トリイソプロピルシリルオキシメチル基（ＴＯＭ）、１－（２－シアノエトキシ）エチル基（ＣＥＥ）、２－シアノエトキシメチル基（ＣＥＭ）およびトリルスルフォニルエトキシメチル基（ＴＥＭ）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）等があげられる。この他にも、後述する化学式（Ｐ１）および（Ｐ２）のシリル含有基もあげられる。以下において同様である。
　前記化学式（Ｉ－０）および（Ｉ）において、水素原子は、例えば、それぞれ独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩ等のハロゲンに置換されてもよい。
　本発明のmicroRNA阻害剤において、前記相補的配列は、例えば、それぞれ、－ＯＲ１－または－ＯＲ２－を介して、前記リンカー残基（例えば、アミノ酸残基）に結合する。ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよい。Ｒ１およびＲ２が存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記化学式（Ｉ－０）もしくは（Ｉ）の構造であってもよい。Ｒ１および／またはＲ２が前記ヌクレオチド残基の場合、前記リンカー残基（例えば、アミノ酸残基）は、例えば、ヌクレオチド残基Ｒ１および／またはＲ２を除く前記化学式（Ｉ－０）または（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基と、前記ヌクレオチド残基とから形成される。Ｒ１および／またはＲ２が前記化学式（Ｉ－０）または（Ｉ）の構造の場合、前記リンカー残基（例えば、アミノ酸残基）は、例えば、前記化学式（Ｉ－０）または（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基が、２つ以上連結された構造となる。前記化学式（Ｉ－０）または（Ｉ）の構造は、例えば、１個、２個、３個または４個含んでもよい。このように、前記構造を複数含む場合、前記化学式（Ｉ－０）または（Ｉ）の構造は、例えば、直接連結されてもよいし、前記ヌクレオチド残基を介して結合してもよい。他方、Ｒ１およびＲ２が存在しない場合、前記リンカー残基（例えば、アミノ酸残基）は、例えば、前記化学式（Ｉ－０）または（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基のみから形成される。
　本発明において、前記化学式（Ｉ）中の原子団Ａは、特に限定されず、任意であり、ただし、前述のとおり、下記化学式（Ｉａ）が、アミノ酸またはペプチドである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
　前記化学式（Ｉ）、（ＩＡ）または（Ｉａ）中の原子団Ａは、例えば、鎖式原子団、脂環式原子団、芳香族性原子団、ヘテロ芳香族性原子団、およびヘテロ脂環式原子団からなる群から選択される少なくとも一つを含んでいても含んでいなくても良い。前記鎖式原子団は、特に限定されないが、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等が挙げられる。前記脂環式原子団は、特に限定されないが、例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル等が挙げられる。前記芳香族性原子団は、特に限定されないが、例えば、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、縮環系アリール、縮環系アリールアルキル、縮環系アルキルアリール等が挙げられる。前記ヘテロ芳香族性原子団は、特に限定されないが、例えば、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリール、縮環系ヘテロアリール、縮環系ヘテロアリールアルキル、縮環系アルキルヘテロアリール等が挙げられる。また、前記化学式（Ｉ）、（ＩＡ）または（Ｉａ）中の原子団Ａにおいて、前記各原子団は、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い。前記置換基または保護基は、複数の場合は同一でも異なってもよい。前記置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル、等があげられる。前記保護基は、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した保護基と同様である。
　本発明において、「アミノ酸」は、前述のとおり、分子中にアミノ基およびカルボキシ基をそれぞれ１つ以上含む任意の有機化合物をいう。前記「アミノ基」は、－ＮＨ２基に限定されず、イミノ基（－ＮＨ－）も含む。例えば、プロリン、ヒドロキシプロリン等は、分子中に－ＮＨ２基を含まず、イミノ基（－ＮＨ－）を含むが、本発明における「アミノ酸」の定義に含まれる。本発明において、前記「アミノ酸」は、後述するとおり、天然アミノ酸でもよいし、人工アミノ酸でもよい。例えば、後述する化学式（Ｉａ２）または（Ｉａ３）で表される化合物も、分子中にアミノ基およびカルボキシ基を含むため、本発明における「アミノ酸」の定義に含まれる。したがって、例えば、前記化学式（Ｉ）において、原子団Ａが、後述の化学式（Ａ２）または化学式（Ａ２ａ）で表される構造は、本発明における「アミノ酸残基」の定義に含まれる。また、例えば、後述の実施例における「TPA」構造も、本発明における「アミノ酸残基」の定義に含まれる。また、本発明において、「ペプチド」は、２分子以上のアミノ酸がペプチド結合により結合した構造の有機化合物をいう。前記ペプチド結合は、酸アミド構造でも良いし、酸イミド構造でも良い。また、前記化学式（Ｉａ）で表すアミノ酸またはペプチド分子中にアミノ基が複数存在する場合は、前記化学式（Ｉａ）中に明示しているアミノ基は、いずれのアミノ基であっても良い。また、前記化学式（Ｉａ）で表すアミノ酸またはペプチド分子中にカルボキシ基が複数存在する場合は、前記化学式（Ｉａ）中に明示しているカルボキシ基は、いずれのカルボキシ基であっても良い。
　本発明のmicroRNA阻害剤の前記アミノ酸残基において、前記アミノ酸は、例えば、前述のとおり、天然アミノ酸でも良いし、人工アミノ酸であっても良い。なお、本発明において、「天然アミノ酸」は、天然に存在する構造のアミノ酸またはその光学異性体をいう。前記天然アミノ酸の製造方法は特に限定されず、例えば、天然から抽出しても良いし、合成しても良い。また、本発明において、「人工アミノ酸」は、天然に存在しない構造のアミノ酸をいう。すなわち、前記人工アミノ酸は、アミノ酸すなわちアミノ基を含むカルボン酸誘導体（分子中にアミノ基およびカルボキシ基をそれぞれ１つ以上含む有機化合物）であって、天然に存在しない構造のカルボン酸誘導体をいう。前記人工アミノ酸は、例えば、ヘテロ環を含まないことが好ましい。前記アミノ酸は、例えば、タンパク質を構成するアミノ酸であっても良い。前記アミノ酸は、例えば、グリシン、α－アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、ヒドロキシリシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、チロシン、バリン、プロリン、４－ヒドロキシプロリン、トリプトファン、β－アラニン、１－アミノ－２－カルボキシシクロペンタン、アミノ安息香酸、アミノピリジンカルボン酸および下記化学式（Ｉａ２）で表されるアミノ酸からなる群から選択される少なくとも１種類であっても良く、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い。前記置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル、等があげられる。前記保護基は、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した保護基と同様である。また、前記化学式（Ｉａ）のペプチドでないアミノ酸に、光学異性体、幾何異性体、立体異性体等の異性体が存在する場合は、いずれの異性体でも良い。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
 　前記化学式（Ｉａ２）中、
Ｒ１００は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、１個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。Ｒ１００における前記任意の置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル、等があげられる。また、前記化学式（Ｉａ２）の構造は、例えば、下記化学式（Ｉａ３）であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
　なお、前記化学式（Ｉａ）の構造が、前記化学式（Ｉａ２）である場合、前記化学式（Ｉ）中の原子団Ａの構造は、下記化学式（Ａ２）で表される。下記化学式（Ａ２）中のＲ１００は、前記化学式（Ｉａ２）中のＲ１００と同じである。また、前記化学式（Ｉａ）の構造が、前記化学式（Ｉａ３）である場合、前記化学式（Ｉ）中の原子団Ａの構造は、下記化学式（Ａ２ａ）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
　前記化学式（Ｉ）の構造は、例えば、下記化学式（Ｉ－１）～（Ｉ－６）が例示でき、下記化学式（Ｉ－１）～（Ｉ－６）において、ｎおよびｍは、前記化学式（Ｉ）と同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
　前記化学式（Ｉ－１）～（Ｉ－６）において、ｎおよびｍは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記化学式（Ｉ－１）においてｎ＝１１およびｍ＝１２と、前記化学式（Ｉ－４）においてｎ＝５およびｍ＝４と、前記化学式（Ｉ－６）において、ｎ＝４およびｍ＝４とがあげられる。その構造を、下記化学式（Ｉ－１ａ）、（Ｉ－４ａ）および（Ｉ－６ａ）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
　本発明において、「アルキル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルキル基を含む。前記アルキルの炭素数は、特に制限されず、例えば、１～３０であり、好ましくは、１～６であり、より好ましくは、１～４である。前記アルキル基は、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、イソヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル、ｎ－デシル等があげられる。好ましくは、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ-ヘキシル、イソヘキシル等があげられる。
　本発明において、「アルケニル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルケニルを含む。前記アルケニルは、前記アルキルにおいて、１個または複数の二重結合を有するもの等があげられる。前記アルケニルの炭素数は、特に制限されず、例えば、前記アルキルと同様であり、好ましくは２～８である。前記アルケニルは、例えば、ビニル、１－プロペニル、２－プロペニル、１－ブテニル、２－ブテニル、３－ブテニル、１，３－ブタジエニル、３－メチル－２－ブテニル等があげられる。
　本発明において、「アルキニル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルキニルを含む。前記アルキニルは、前記アルキルにおいて、１個または複数の三重結合を有するもの等があげられる。前記アルキニルの炭素数は、特に制限されず、例えば、前記アルキルと同様であり、好ましくは２～８である。前記アルキニルは、例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル等があげられる。前記アルキニルは、例えば、さらに、１個または複数の二重結合を有してもよい。
　本発明において、「アリール」は、例えば、単環芳香族炭化水素基および多環芳香族炭化水素基を含む。前記単環芳香族炭化水素基は、例えば、フェニル等があげられる。前記多環芳香族炭化水素基は、例えば、１－ナフチル、２－ナフチル、１－アントリル、２－アントリル、９－アントリル、１－フェナントリル、２－フェナントリル、３－フェナントリル、４－フェナントリル、９－フェナントリル等があげられる。好ましくは、例えば、フェニル、１－ナフチルおよび２－ナフチル等のナフチル等があげられる。
　本発明において、「ヘテロアリール」は、例えば、単環芳香族複素環式基および縮合芳香族複素環式基を含む。前記ヘテロアリールは、例えば、フリル（例：２－フリル、３－フリル）、チエニル（例：２－チエニル、３－チエニル）、ピロリル（例：１－ピロリル、２－ピロリル、３－ピロリル）、イミダゾリル（例：１－イミダゾリル、２－イミダゾリル、４－イミダゾリル）、ピラゾリル（例：１－ピラゾリル、３－ピラゾリル、４－ピラゾリル）、トリアゾリル（例：１，２，４－トリアゾール－１－イル、１，２，４－トリアゾール－３－イル、１，２，４－トリアゾール－４－イル）、テトラゾリル（例：１－テトラゾリル、２－テトラゾリル、５－テトラゾリル）、オキサゾリル（例：２－オキサゾリル、４－オキサゾリル、５－オキサゾリル）、イソキサゾリル（例：３－イソキサゾリル、４－イソキサゾリル、５－イソキサゾリル）、チアゾリル（例：２－チアゾリル、４－チアゾリル、５－チアゾリル）、チアジアゾリル、イソチアゾリル（例：３－イソチアゾリル、４－イソチアゾリル、５－イソチアゾリル）、ピリジル（例：２－ピリジル、３－ピリジル、４－ピリジル）、ピリダジニル（例：３－ピリダジニル、４－ピリダジニル）、ピリミジニル（例：２－ピリミジニル、４－ピリミジニル、５－ピリミジニル）、フラザニル（例：３－フラザニル）、ピラジニル（例：２－ピラジニル）、オキサジアゾリル（例：１，３，４－オキサジアゾール－２－イル）、ベンゾフリル（例：２－ベンゾ［ｂ］フリル、３－ベンゾ［ｂ］フリル、４－ベンゾ［ｂ］フリル、５－ベンゾ［ｂ］フリル、６－ベンゾ［ｂ］フリル、７－ベンゾ［ｂ］フリル）、ベンゾチエニル（例：２－ベンゾ［ｂ］チエニル、３－ベンゾ［ｂ］チエニル、４－ベンゾ［ｂ］チエニル、５－ベンゾ［ｂ］チエニル、６－ベンゾ［ｂ］チエニル、７－ベンゾ［ｂ］チエニル）、ベンズイミダゾリル（例：１－ベンゾイミダゾリル、２－ベンゾイミダゾリル、４－ベンゾイミダゾリル、５－ベンゾイミダゾリル）、ジベンゾフリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、キノキサリル（例：２－キノキサリニル、５－キノキサリニル、６－キノキサリニル）、シンノリニル（例：３－シンノリニル、４－シンノリニル、５－シンノリニル、６－シンノリニル、７－シンノリニル、８－シンノリニル）、キナゾリル（例：２－キナゾリニル、４－キナゾリニル、５－キナゾリニル、６－キナゾリニル、７－キナゾリニル、８－キナゾリニル）、キノリル（例：２－キノリル、３－キノリル、４－キノリル、５－キノリル、６－キノリル、７－キノリル、８－キノリル）、フタラジニル（例：１－フタラジニル、５－フタラジニル、６－フタラジニル）、イソキノリル（例：１－イソキノリル、３－イソキノリル、４－イソキノリル、５－イソキノリル、６－イソキノリル、７－イソキノリル、８－イソキノリル）、プリル、プテリジニル（例：２－プテリジニル、４－プテリジニル、６－プテリジニル、７－プテリジニル）、カルバゾリル、フェナントリジニル、アクリジニル（例：１－アクリジニル、２－アクリジニル、３－アクリジニル、４－アクリジニル、９－アクリジニル）、インドリル（例：１－インドリル、２－インドリル、３－インドリル、４－インドリル、５－インドリル、６－インドリル、７－インドリル）、イソインドリル、フェナジニル（例：１－フェナジニル、２－フェナジニル）またはフェノチアジニル（例：１－フェノチアジニル、２－フェノチアジニル、３－フェノチアジニル、４－フェノチアジニル）等があげられる。
　本発明において、「シクロアルキル」は、例えば、環状飽和炭化水素基であり、炭素数は、例えば、３～１５である。前記シクロアルキルは、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、橋かけ環式炭化水素基、スピロ炭化水素基等があげられ、好ましくは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、橋かけ環式炭化水素基等があげられる。
　本発明において、「橋かけ環式炭化水素基」は、例えば、ビシクロ［２．１．０］ペンチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［２．２．２］オクチルおよびビシクロ［３．２．１］オクチル、トリシクロ［２．２．１．０］ヘプチル、ビシクロ［３．３．１］ノナン、１－アダマンチル、２－アダマンチル等があげられる。
　本発明において、「スピロ炭化水素基」は、例えば、スピロ［３．４］オクチル等があげられる。
　本発明において、「シクロアルケニル」は、例えば、環状の不飽和脂肪族炭化水素基を包み、炭素数は、例えば、３～７個である。前記シクロアルケニルは、例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル等があげられ、好ましくは、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等である。前記シクロアルケニルは、例えば、環中に不飽和結合を有する橋かけ環式炭化水素基およびスピロ炭化水素基も含む。
　本発明において、「アリールアルキル」は、例えば、ベンジル、２－フェネチル、およびナフタレニルメチル等があげられ、「シクロアルキルアルキル」または「シクリルアルキル」は、例えば、シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル等があげられ、「ヒドロキシアルキル」は、例えば、ヒドロキシメチルおよび２－ヒドロキシエチル等があげられる。
　本発明において、「アルコキシ」は、例えば、前記アルキル－Ｏ－基を含み、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、およびｎ－ブトキシ等があげられ、「アルコキシアルキル」は、例えば、メトキシメチル等があげられ、「アミノアルキル」は、例えば、２－アミノエチル等があげられる。
　本発明において、「ヘテロシクリル」は、例えば、１－ピロリニル、２－ピロリニル、３－ピロリニル、１－ピロリジニル、２－ピロリジニル、３－ピロリジニル、ピロリジノン、１－イミダゾリニル、２－イミダゾリニル、４－イミダゾリニル、１－イミダゾリジニル、２－イミダゾリジニル、４－イミダゾリジニル、イミダゾリジノン、１－ピラゾリニル、３－ピラゾリニル、４－ピラゾリニル、１－ピラゾリジニル、３－ピラゾリジニル、４－ピラゾリジニル、ピペリジノン、ピペリジノ、２－ピペリジニル、３－ピペリジニル、４－ピペリジニル、１－ピペラジニル、２－ピペラジニル、ピペラジノン、２－モルホリニル、３－モルホリニル、モルホリノ、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル等があげられる。
　本発明において、「ヘテロシクリルアルキル」は、例えば、ピペリジニルメチル、ピペラジニルメチル等があげられ、「ヘテロシクリルアルケニル」は、例えば、２－ピペリジニルエテニル等があげられ、「ヘテロアリールアルキル」は、例えば、ピリジルメチルおよびキノリン－３－イルメチル等があげられる。
　本発明において、「シリル」は、化学式Ｒ３Ｓｉ－で表される基を含み、Ｒは、独立して、前記アルキル、アリールおよびシクロアルキルから選択でき、例えば、トリメチルシリル基、tert-ブチルジメチルシリル基等があげられ、「シリルオキシ」は、例えば、トリメチルシリルオキシ基等があげられ、「シリルオキシアルキル」は、例えば、トリメチルシリルオキシメチル等があげられる。
　本発明において、「アルキレン」は、例えば、メチレン、エチレン、およびプロピレン等があげられる。
　本発明において、前述した各種基は、置換されてもよい。前記置換基は、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル（ハロアルキル、例：ＣＦ３、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＨ２ＣＣｌ３）、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アルキル（例：メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ－ブチル）、アルケニル（例：ビニル）、アルキニル（例：エチニル）、シクロアルキル（例：シクロプロピル、アダマンチル）、シクロアルキルアルキル（例：シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル）、シクロアルケニル（例：シクロプロペニル）、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル（例：ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル）、アルコキシアルキル（例：メトキシメチル、エトキシメチル、エトキシエチル）、アリール（例：フェニル、ナフチル）、アリールアルキル（例：ベンジル、フェネチル）、アルキルアリール（例、ｐ－メチルフェニル）、ヘテロアリール（例：ピリジル、フリル）、ヘテロアリールアルキル（例：ピリジルメチル）、ヘテロシクリル（例：ピペリジル）、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル（例：モルホリルメチル）、アルコキシ（例：メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ）、ハロゲン化アルコキシ（例：ＯＣＦ３）、アルケニルオキシ（例：ビニルオキシ、アリルオキシ）、アリールオキシ（例：フェニルオキシ）、アルキルオキシカルボニル（例：メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）、アリールアルキルオキシ（例：ベンジルオキシ）、アミノ［アルキルアミノ（例：メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ）、アシルアミノ（例：アセチルアミノ、ベンゾイルアミノ）、アリールアルキルアミノ（例：ベンジルアミノ、トリチルアミノ）、ヒドロキシアミノ］、アミノアルキル（例：アミノメチル）、アルキルアミノアルキル（例：ジエチルアミノメチル）、カルバモイル、スルファモイル、オキソ、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。
　本発明において、前記リンカー残基導入用の分子（以下「本発明のモノマー」または単に「モノマー」という。）は、例えば、下記化学式（ＩＩ－０）の構造を有していてもよい。下記化学式（ＩＩ－０）の構造を有する本発明のモノマーは、特に示さない限り、前記化学式（Ｉ－０）で表されるリンカー残基の説明を援用できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
 前記化学式（ＩＩ－０）中、
Ｑ１１およびＱ１２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２（メチレン基）、ＮＨ（イミノ基）、Ｃ＝Ｏ（カルボニル基）、Ｃ＝Ｓ（チオカルボニル基）、Ｃ＝ＮＨ（イミノメチレン基）、Ｏ、またはＳであり、
Ｑ１およびＱ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２（メチレン基）、ＮＨ（イミノ基）、Ｃ＝Ｏ（カルボニル基）、Ｃ＝Ｓ（チオカルボニル基）、Ｃ＝ＮＨ（イミノメチレン基）、Ｏ、またはＳであり、
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｒ１１およびＲ２１は、それぞれ独立して、Ｈ、保護基またはリン酸保護基であり；
Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１1に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２1に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｍは、０～３０の範囲の整数であり；
ｎは、０～３０の範囲の整数であり；
Ａは、任意の原子団である。
　また、本発明のモノマー（前記リンカー残基導入用の分子）は、例えば、下記化学式（ＩＩ）の構造を有していてもよい。下記化学式（ＩＩ）の構造を有する本発明のモノマーは、特に示さない限り、前記化学式（Ｉ）で表されるリンカー残基（アミノ酸残基）の説明を援用できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
　前記化学式（ＩＩ）中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｒ１１およびＲ２１は、それぞれ独立して、Ｈ、保護基またはリン酸保護基であり；
Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１1に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２1に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｍは、０～３０の範囲の整数であり；
ｎは、０～３０の範囲の整数であり；
Ａは、任意の原子団であり、ただし、下記化学式（Ｉａ）は、アミノ酸またはペプチドである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
　前記化学式（ＩＩ－０）または（ＩＩ）で表わされる本発明のモノマーを用いれば、例えば、本発明のmicroRNA阻害剤の合成において、前記化学式（Ｉ－０）または（Ｉ）で表わされるアミノ酸残基を容易に合成できる。本発明のモノマーは、例えば、本発明のmicroRNA阻害剤の合成において、自動核酸合成用のアミダイトとして使用でき、例えば、一般的な自動核酸合成装置に適用可能である。前記合成方法は、例えば、ホスホロアミダイト法、および、Ｈ－ホスホネート法等があげられる。
　前記化学式（ＩＩ－０）または（ＩＩ）において、前記化学式（Ｉ－０）または（Ｉ）と同一箇所は、前記化学式（Ｉ－０）または（Ｉ）の説明を援用できる。具体的に、前記化学式（ＩＩ－０）または（ＩＩ）において、例えば、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、Ｙ２、Ｌ１、Ｌ２、ｍ、ｎおよびＡは、前記化学式（Ｉ－０）または（Ｉ）の説明を全て援用できる。
　前記化学式（ＩＩ－０）または（ＩＩ）において、Ｒ１１およびＲ２１は、前述のように、それぞれ独立して、Ｈ、保護基またはリン酸保護基である。
　前記保護基は、例えば、前記化学式（Ｉ－０）または（Ｉ）における説明と同様であり、具体例として、例えば、下記群Ｉから選択できる。前記群Ｉは、ＤＭＴｒ基、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基、ＴＥＭ基、および、下記化学式（Ｐ１）または（Ｐ２）に示すシリル含有基からなる。前記保護基は、中でも、ＤＭｔｒ基および前記シリル含有基のいずれかであることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
　前記リン酸保護基は、例えば、下記化学式で表わすことができる。
 
　　－Ｐ（ＯＲ６）（ＮＲ７Ｒ８）　　　（Ｐ３）
 
前記化学式（Ｐ３）において、Ｒ６は、水素原子または任意の置換基である。置換基Ｒ６は、例えば、炭化水素基が好ましく、前記炭化水素基は、電子吸引基で置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。置換基Ｒ６は、例えば、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアリール、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル等の炭化水素等があげられ、さらに、電子吸引基で置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。置換基Ｒ６は、具体的には、例えば、β－シアノエチル基、ニトロフェニルエチル基、メチル基等があげられる。
　Ｒ７およびＲ８は、それぞれ、水素原子または任意の置換基であり、同一でも異なっていてもよい。置換基Ｒ７およびＲ８は、例えば、炭化水素基が好ましく、前記炭化水素基は、さらに任意の置換基で置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。前記炭化水素基は、例えば、前述した前記Ｒ６での列挙と同様であり、好ましくは、メチル基、エチル基、イソプロピル基である。この場合、－ＮＲ７Ｒ８は、具体的には、例えば、ジイソプロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、エチルメチルアミノ基等があげられる。または、置換基Ｒ７およびＲ８が一体となって、それらが結合する窒素原子とともに（すなわち、－ＮＲ７Ｒ８が一体となって）、窒素含有環（例えば、ピペリジル基、モルホリノ基等）を形成してもよい。
　前記化学式（Ｐ３）で表されるリン酸保護基の具体例としては、例えば、下記群ＩＩから選択できる。群ＩＩは、－P(OCH2CH2CN)(N(i-Pr)2)、および－P(OCH3)(N(i-Pr)2)からなる。前記化学式において、i-Prは、イソプロピルを示す。
　前記化学式（ＩＩ－０）または（ＩＩ）において、例えば、Ｒ１およびＲ２は、いずれか一方が、Ｈまたは保護基であり、他方が、Ｈまたはリン酸保護基であってもよい。Ｒ１が、前記保護基の場合、Ｒ２は、Ｈまたは前記リン酸保護基が好ましい。Ｒ１が、前記群Ｉから選択される場合、Ｒ２は、Ｈまたは前記化学式（Ｐ３）で表されるリン酸保護基から選択されることが好ましく、Ｈまたは前記群ＩＩから選択されることがより好ましい。また、Ｒ１が、前記リン酸保護基の場合、Ｒ２は、Ｈまたは前記保護基が好ましい。Ｒ１が、前記化学式（Ｐ３）で表されるリン酸保護基または前記群ＩＩから選択される場合、Ｒ２は、Ｈまたは前記群Ｉから選択されることが好ましい。
　前記化学式（ＩＩ－０）または（ＩＩ）の構造は、例えば、下記化学式（ＩＩ－１）～（ＩＩ－６）が例示でき、下記化学式（ＩＩ－１）～（ＩＩ－６）において、ｎおよびｍは、前記化学式（ＩＩ－０）または（ＩＩ）と同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
　前記化学式（ＩＩ－１）～（ＩＩ－６）において、ｎおよびｍは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記化学式（ＩＩ－１）においてｎ＝１１およびｍ＝１２と、前記化学式（ＩＩ－１）において、ｎ＝５およびｍ＝４と、前記化学式（ＩＩ－６）において、ｎ＝４およびｍ＝４とがあげられる。その構造を、下記化学式（ＩＩ－１ａ）、（ＩＩ－４ａ）および（ＩＩ－６ａ）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
　本発明のモノマーの製造方法は特に限定されないが、例えば、下記スキーム１のように、前記アミノ酸（Ｉａ）のアミノ基が保護基Ｒ３１で保護された化合物（Ｉｂ）から、縮合反応により下記化合物（Ｉｃ）を製造し、さらに（Ｉｃ）から（ＩＩａ）を製造し、（ＩＩａ）を（ＩＩ）に変換しても良い。ただし、下記スキーム１は例示であって、本発明は、これに制限されない。なお、下記化学式（Ｉｂ）および（Ｉｃ）において、保護基Ｒ３１は、例えば、Ｆｍｏｃ（９-フルオレニルメチルオキシカルボニル基）、Ｚ(ベンジルオキシカルボニル)またはＢＯＣ(t-ブトキシカルボニル)等が挙げられる。下記化学式（Ｉｂ）、（Ｉｃ）および（ＩＩａ）において、Ｙ１、Ｙ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｒ１１およびＲ２１は、前記化学式（ＩＩ）と同様である。なお、下記化合物（ＩＩａ）は、前記化学式（ＩＩ）において、Ｘ１がＯ、Ｘ２がＯの化合物である。下記化学式（ＩＩａ）におけるカルボニル酸素は、適宜、前記化学式（ＩＩ）におけるＸ１およびＸ２に変換しても良いし、変換する必要がなければ、下記化合物（ＩＩａ）を、そのまま化合物（ＩＩ）として用いても良い。また、前記化学式（ＩＩ－０）で表される本発明のモノマーの製造方法も、特に限定されないが、例えば、下記スキーム１の製造方法または下記スキーム１に準じた製造方法でもよい。具体的には、例えば、下記化学式（Ｉｂ）のアミノ酸に代えてポリアミンまたはポリカルボン酸等を用いる以外は下記スキーム１と同様の製造方法で、前記化学式（ＩＩ－０）で表される本発明のモノマーを製造することも可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
　本発明のモノマーおよびその製造方法を、下記スキーム２および２ａにさらに具体的に例示する。ただし、下記スキーム２および２ａは例示であり、本発明は、これに限定されない。なお、下記スキーム２および２ａ中、「Ｆｍｏｃ」は、９-フルオレニルメチルオキシカルボニル基を表し、「ｉＰｒ」は、イソプロピル基を表し、「Ｔｒ」は、トリチル基すなわちトリフェニルメチル基を表し、「ＯＤＭＴｒ」は、４，４’－ジメトキシトリチルオキシ基を表す。以下において同様である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
　本発明のモノマーは、例えば、標識物質を含むことが好ましく、中でも、安定同位体を含むことが好ましい。
　本発明のモノマーが、前記安定同位体等の同位体を含む場合、例えば、簡便に、本発明のmicroRNA阻害剤分子に前記同位体を導入できる。同位体を有する前記モノマーは、例えば、前記同位体を導入したアミノ酸（Ｉａ）の原料から、合成可能である。本発明において、同位体を導入したアミノ酸（Ｉａ）の入手方法は特に限定されず、例えば、適宜な方法で製造しても良いし、市販品を入手可能であればそれを用いても良い。
　前記安定同位体が導入されたアミノ酸として、例えば、重水素（Ｄ）が導入されたアミノ酸は、例えば、下記スキーム３に示すように、アミノ酸（Ｉａ）をＬｉＡｌＤ４で処理し、さらに、ＯＨ基を酸化することで製造できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
　他の安定同位体が導入されたアミノ酸として、例えば、重酸素（１８Ｏ）が導入されたアミノ酸は、例えば、下記スキーム４に示すように、塩基性条件下で、アミノ酸（Ｉａ）のメチルエステルをＨ２ １８Ｏと反応させることにより製造できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
　安定同位体が導入されたペプチドとして、例えば、重水素（Ｄ）が導入されたペプチドは、例えば、下記スキーム３ａに示すように、ペプチド結合をＬｉＡｌＤ４で処理することで製造できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
　安定同位体が導入されたペプチドとして、例えば、重酸素（１８Ｏ）が導入されたペプチドは、例えば、下記スキーム４ａに示すように、塩基性条件下で、カルボン酸のメチルエステルをＨ２ １８Ｏと反応させ、その後、下記化学式中のカルボン酸を、アミノ基またはイミノ基と縮合させてペプチド結合とすることにより製造できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
　その他、重窒素（１５Ｎ）または重炭素（１３Ｃ）等が導入されたアミノ酸またはペプチドの製造方法も、特に限定されず、適宜な方法で製造することができる。
　このようにして、安定同位体が導入されたモノマーが合成可能であり、また、前記モノマーを合成用アミダイトとして使用することによって、安定同位体が前記アミノ酸残基に導入された本発明のmicroRNA阻害剤を合成可能である。なお、本発明のmicroRNA阻害剤の末端部分の構造は、核酸であっても良いが、リンカー残基であることが好ましく、アミノ酸残基（アミノ酸またはペプチド）であることがより好ましい。
　また、本発明のモノマーの用途は特に限定されないが、自動核酸合成用であることが好ましい。または、本発明のモノマーは、核酸分子の製造に用いることが好ましく、前記核酸分子が、前記本発明のmicroRNA阻害剤であることがより好ましい。
　以下に実施例等により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［グリシン残基［Gly］導入用分子の合成］
　後述の各実施例および参考例のオリゴヌクレオチド（microRNA阻害剤）において、グリシン残基（Gly）導入用分子（本発明のモノマー）は、以下のようにして合成した。
　すなわち、下記スキーム５に従い、ドデカン酸アミドグリシン－４，４’－ジメトキシトリチルオキシドデカンアミドホスホロアミダイト（６）を合成した。なお、化合物（６）は、グリシン残基（Gly）導入用分子であり、前記本発明のモノマーの一例である。また、下記スキーム５中の「Ｇｌｙ」は、下記化学式で表される構造を表し、すなわち、グリシンから、アミノ基の水素１原子およびカルボキシ基のＯＨを除いた構造の原子団である。以下、「Ｇｌｙ」は、特に断らない限り、下記化学式の構造を表す。また、下記スキーム５において、ＧｌｙのＮＨ側は、Ｆｍｏｃまたはカルボニル炭素に結合し、Ｇｌｙのカルボニル炭素（ＣＯ）側は、ＯＨまたはＮ原子に結合している。
 
（Ｇｌｙ）
―ＨＮ－ＣＨ２－ＣＯ－
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000071
（１）１２－トリフルオロアセトアミドドデカノール（化合物１）
　１２－アミノドデカノール（４．８１ｇ，　２３．９ｍｍｏｌ）及びトリフルオロ酢酸エチル（６．７９ｇ，　４７．８ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（１００ｍＬ）を室温下に終夜撹拌した。その反応混合物を減圧下に濃縮することにより、無色シロップ状の１２－トリフルオロアセトアミドドデカノール（１）（６．９８ｇ，　ｑ．）を得た。
（２）１２－（４，４’－ジメトキシトリチルオキシ）ドデカンアミン（化合物２）
　化合物１（３．００ｇ，　１０．０８ｍｍｏｌ）に対し無水ピリジンを用いて３回共沸乾燥した。その共沸残渣に４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（４．３２ｇ，　１２．１ｍｍｏｌ）及び無水ピリジン（５０ｍＬ）を加え、室温下に終夜撹拌した。得られた反応混合物にメタノール（１０ｍＬ）を加え室温で３０分撹拌した後、減圧下に室温で溶媒を約３０ｍＬになるまで留去した。その後、ジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で３回洗浄し、更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。このようにして得られた未精製の残渣のメタノール溶液（１００ｍＬ）に、水酸化ナトリウム（２．０２ｇ，　５０．４０ｍｍｏｌ）を加え室温で終夜撹拌した。その反応混合物を、減圧下に約３０ｍＬまで濃縮し、水（１００ｍＬ）及びジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、有機層を分取した。分取した有機層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。その後、乾燥剤（硫酸ナトリウム）をろ別し溶媒を減圧下に留去した。生成した残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン－メタノール（９５：５）＋０．０５％ピリジン）に付し、１２－（４，４’－ジメトキシトリチルオキシ）ドデカンアミン（２）（５．１９ｇ，　ｑ．）を得た。以下に、１２－（４，４’－ジメトキシトリチルオキシ）ドデカンアミン（２）の機器分析値を示す。
１２－（４，４’－ジメトキシトリチルオキシ）ドデカンアミン（２）；
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝７．４５－７．４３（２Ｈ，ｍ），７．３４－７．２５（６Ｈ，ｍ），７．２１－７．２０（１Ｈ，ｍ），６．８３－６．７９（４Ｈ，ｍ），３．７８（６Ｈ，ｓ），　３．０４－３．０１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），２．７０－２．６７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．６１－１．５４（６Ｈ，ｍ），１．３３－１．２４（１４Ｈ，ｍ）．
（３）Ｆｍｏｃ－グリシン－４，４’－ジメトキシトリチルオキシドデカンアミド（化合物３）
　Ｆｍｏｃ－グリシン（Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、和光純薬工業株式会社から購入）（２．００ｇ，　６．７３ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．６６ｇ，　８．０７ｍｍｏｌ）及び１－ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（２．３１ｇ，　１６．１４ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液（７０ｍＬ）に化合物２（４．０７ｇ，　８．０７ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液（３０ｍＬ）をアルゴン雰囲気下に室温で加え、アルゴン雰囲気下に室温で終夜撹拌した。生成した沈殿をろ別し、ろ液を減圧下に３５℃で濃縮した。得られた残渣にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で３回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン－メタノール（９５：５）＋０．０５％ピリジン）に付し、無色シロップ状のＦｍｏｃ－グリシルグリシン－４，４’－ジメトキキシトリチルオキシブチルドデカンアミド（３）（５．８８ｇ，　ｑ．）を得た。
（４）グリシン－４，４’－ジメトキシトリチルオキシドデカンアミド（化合物４）
　化合物３（５．８８ｇ，　６．７３ｍｍｏｌ）にＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）及びピペリジン（４．８ｍＬ）を室温で加え、室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下に溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン－メタノール（９：１）＋０．０５％ピリジン）に付し、グリシン－４，４’－ジメトキシトリチルオキシドデカンアミド（４）（３．４４ｇ，　９１％）を得た。以下に、グリシン－４，４’－ジメトキシトリチルオキシドデカンアミド（４）の機器分析値を示す。
グリシン－４，４’－ジメトキシトリチルオキシドデカンアミド（４）；
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝７．４７－７．４４（２Ｈ，ｍ），７．３３－７．２６（６Ｈ，ｍ），７．２１－７．２０（１Ｈ，ｍ），６．８３－６．８０（４Ｈ，ｍ），３．７９（６Ｈ，ｓ），　３．３４（２Ｈ，ｓ），３．３０－３．２５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），３．０６－３．０２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．６４－１．５０（６Ｈ，ｍ），１．３８－１．２５（１４Ｈ，ｍ）．
（５）ヒドロキシドデカン酸アミドグリシン－４，４’－ジメトキシトリチルオキシドデカンアミド（化合物５）
　化合物４（３．１５ｇ，　５．６２ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回共沸乾燥後、アルゴン雰囲気下に１２－ヒドロキシドデカン酸（３．４１ｇ，　６．７４ｍｍｏｌ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１．２９ｇ，　６．７４ｍｍｏｌ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（２．０６ｇ，　１３．４８ｍｍｏｌ）、及び無水ジクロロメタン（５０ｍＬ）を室温で加え、１０分間撹拌した。このようにして得た混合物にトリエチルアミン（２．０５ｇ，　２０．２２ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下に室温で終夜撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え飽和重曹水で３回、更に飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を分取し硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン－メタノール（９５：５）＋０．０５％ピリジン）に付し、無色シロップ状のヒドロキシドデカンアミドグリシン－４，４’－ジメトキキシトリチルオキシドデカンアミド（５）（２．９７ｇ，　７０％）を得た。以下に、ヒドロキシドデカンアミドグリシン－４，４’－ジメトキキシトリチルオキシドデカンアミド（５）の機器分析値を示す。
ヒドロキシドデカンアミドグリシン－４，４’－ジメトキキシトリチルオキシドデカンアミド（５）；
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝７．４２－７．４０（２Ｈ，ｍ），７．３３－７．２６（６Ｈ，ｍ），７．２２－７．２１（１Ｈ，ｍ），６．８３－６．８０（４Ｈ，ｍ），３．８４（２Ｈ，ｓ），３．７９（６Ｈ，ｓ），３．６４－３．６１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．２６－３．２４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），３．０８－３．０６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），２．２８－２．２４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．６９－１．５２（１２Ｈ，ｍ），１．４４－１．３９（２６Ｈ，ｍ）．
（６）ドデカン酸アミドグリシン－４，４’－ジメトキシトリチルオキシドデカンアミドホスホロアミダイト（化合物６）
　化合物５（２．７８ｇ，　３．７６ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回共沸乾燥した。つぎに、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（７７２ｍｇ，　４．５１ｍｍｏｌ）を加え、減圧下に脱気してアルゴンガスを充填し、無水アセトニトリル（３ｍＬ）を加えた。さらに、２－シアノエトキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（１．３６ｇ，　４．５１ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリルジクロロメタン溶液（３ｍＬ）を加え、混合物をアルゴン雰囲気下、室温で４時間撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン（１５０ｍＬ）を加え、飽和重曹水で２回、更に飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。残渣をアミノシリカを用いたカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ｎ－ヘキサン－アセトン（７：３）＋０．０５％ピリジン）に付し、ドデカン酸アミドグリシン－４，４’－ジメトキシトリチルオキシドデカンアミドホスホロアミダイト（６）（２．７２ｇ，　７７％，　ＨＰＬＣ９８．５％）を得た。以下に、ドデカン酸アミドグリシン－４，４’－ジメトキシトリチルオキシドデカンアミドホスホロアミダイト（６）の機器分析値を示す。
ドデカン酸アミドグリシン－４，４’－ジメトキシトリチルオキシドデカンアミドホスホロアミダイト（６）；
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：　δ＝７．４１－７．４９（ｍ，　２Ｈ），　７．２６－７．３０（ｍ，　６Ｈ），　７．１７－７．１９（ｍ，　１Ｈ），　６．８０－６，８３（ｍ，　４Ｈ），　６．４６－６．６２（ｍ，　２Ｈ），　４．０７－４．２９（ｍ，　２Ｈ），　３．８９（ｄ，　Ｊ＝５．４Ｈｚ，　２Ｈ），　３．７５－３．８７（ｍ，　４Ｈ），　３．６７　（ｓ，　６Ｈ），　３．４７－３．７０（ｍ，　４Ｈ），　３．２０－３．２６（ｍ，　２Ｈ），　３．０２（ｔ，　Ｊ＝６．４Ｈｚ，　２Ｈ，　ＣＨ２），　２．６３（ｔ，　６．４Ｈｚ，　２Ｈ，　ＣＨ３），　１．５６－１．６３（ｍ，　６Ｈ），　１．４７－１．５１（ｍ，　２Ｈ），　１．２４－１．３３（ｍ，　２６Ｈ），　１．１３－１．２０（ｍ，　１２Ｈ）：　
Ｐ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：　δ＝１４６．６２．
　なお、後述の各実施例および各参考例のオリゴヌクレオチド中、「Gly」は、実際には、下記化学式（Ｇ１）で表される。すなわち、以下の各実施例および各参考例のオリゴヌクレオチドの構造式（配列）中では、簡略化のために、下記化学式（Ｇ１）中のＧｌｙ以外の部分を省略して示している。下記化学式（Ｇ１）中に記載のＮ原子は、Ｇｌｙのカルボニル炭素（ＣＯ）側に結合しており、下記化学式（Ｇ１）中に記載のカルボニル炭素は、ＧｌｙのＮＨ側に結合している。また、後述の各実施例および各参考例のオリゴヌクレオチドにおいて、Gly（すなわち下記（Ｇ１））の５’末端に結合する塩基がない（記載されていない）場合は、５’末端には水素原子（Ｈ）が結合している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
［グリシン二量体残基［GlyGly］導入用分子の合成］
　後述の各実施例および参考例のオリゴヌクレオチド（microRNA阻害剤）において、グリシン二量体残基（GlyGly）導入用分子（本発明のモノマー）は、以下のようにして合成した。
　すなわち、下記スキーム６に従い、へキサン酸アミドグリシルグリシン－４，４’－ジメトキシトリチルオキシブチルアミドホスホロアミダイト（１６）を合成した。なお、化合物（１６）は、グリシン二量体残基（GlyGly）導入用分子であり、前記本発明のモノマーの一例である。下記スキーム６中の「Ｇｌｙ」は、前述のとおり、下記化学式で表される構造を表し、すなわち、グリシンから、アミノ基の水素１原子およびカルボキシ基のＯＨを除いた構造の原子団である。また、下記スキーム６において、「GlyGly」は、特に断らない限り、Ｇｌｙが二つ連結してペプチド結合を形成した構造（下記）を表す。下記スキーム６において、ＧｌｙＧｌｙのＮＨ側は、Ｆｍｏｃまたはカルボニル炭素に結合し、Ｇｌｙのカルボニル炭素（ＣＯ）側は、ＯＨまたはＮ原子に結合している。
 
（Ｇｌｙ）
―ＨＮ－ＣＨ２－ＣＯ－
 
（ＧｌｙＧｌｙ）
―ＨＮ－ＣＨ２－ＣＯ－ＨＮ－ＣＨ２－ＣＯ－
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
（１）４－トリフルオロアセトアミドブタノール（化合物１１）
　４－アミノブタノール（２．５０ｇ，　２８．０５ｍｍｏｌ）及びトリフルオロ酢酸エチル（１９．９２ｇ，　１４０．２６ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（１００ｍＬ）を室温下に終夜撹拌した。反応混合物を減圧下に濃縮することにより、無色シロップ状の４－トリフルオロアセトアミドブタノール（１１）（５．４４ｇ，　ｑ．）を得た。
（２）４－（４，４’－ジメトキシトリチルオキシ）ブチルアミン（化合物１２）
　化合物１（４．１５ｇ，　２２．４０ｍｍｏｌ）に対し無水ピリジンを用いて３回共沸乾燥した。その共沸残渣に４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（９．６０ｇ，　２８．３ｍｍｏｌ）及び無水ピリジン（１００ｍＬ）を加え、室温下に終夜撹拌した。得られた反応混合物にメタノール（１０ｍＬ）を加え室温で３０分撹拌した後、減圧下に室温で溶媒を約２０ｍＬになるまで留去した。その後、ジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で３回洗浄し、更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。このようにして得られた未精製の残渣（９．００ｇ）のテトラヒドロフラン溶液（５０ｍＬ）に対し、水酸化ナトリウム（３．７１ｇ，　９２．７ｍｍｏｌ）の水溶液（７０ｍＬ）を加えた。この混合物を室温下で激しく撹拌しながら、テトラブチルアンモニウムフロリド３水和物（１８０ｍｇ）を加え、更に激しく室温で終夜撹拌した。得られた反応混合物に対し酢酸エチル（２００ｍＬ）及び水（１００ｍＬ）を加え有機層を分取した。水層は更に酢酸エチルで抽出し、抽出液は先に分取した有機層と併せて硫酸ナトリウムで乾燥した。その後、乾燥剤（硫酸ナトリウム）をろ別し溶媒を減圧下に留去した。生成した残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン－メタノール（９：１）＋０．０５％ピリジン）に付し、４－（４，４’－ジメトキシトリチルオキシ）ブチルアミン（１２）（６．３６ｇ，　８７％）を得た。以下に、４－（４，４’－ジメトキシトリチルオキシ）ブチルアミン（１２）の機器分析値を示す。
４－（４，４’－ジメトキシトリチルオキシ）ブチルアミン（２）；
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：　δ＝７．４２－７．４５（ｍ，　２Ｈ），　７．２６－７．３４（ｍ，　１２Ｈ），　７．１７－７．２０（ｍ，１Ｈ），　６．８０－６．８４（ｍ，　４Ｈ），　３．７９（ｓ，　６Ｈ），　３．４８（ｓ，　２Ｈ，　ＮＨ２），　３．０６（ｔ，　６．８　Ｈｚ，　２Ｈ，　ＣＨ２），　２．６７（ｔ，　７．４　Ｈｚ，　２Ｈ，　ＣＨ２），　１．６０－１．６５（ｍ，　２Ｈ，　ＣＨ２），　１．４９－１．５５（ｍ，　２Ｈ，　ＣＨ２）
（１３）Ｆｍｏｃ－グリシルグリシン－４，４’－ジメトキキシトリチルオキシブチルアミド（化合物１３）
　Ｆｍｏｃ－グリシルグリシン（Ｆｍｏｃ－ＧｌｙＧｌｙ－ＯＨ、Ｃｈｉｎａ　Ｌａｎｇｃｈｅｍ社より購入）（２．５０ｇ，　７．０５ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．７５ｇ，　８．４６ｍｍｏｌ）及び１－ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（２．５９ｇ，　１６．９２ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液（７０ｍＬ）に化合物１２（３．３１ｇ，　８．４６ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液（５０ｍＬ）をアルゴン雰囲気下に氷冷下で加えた。氷浴を除去した後、前記混合液をアルゴン雰囲気下に室温で終夜撹拌した。生成した沈殿をろ別し、ろ液を減圧下に３５℃で濃縮した。得られた残渣にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和食塩水で２回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン－メタノール（９５：５）＋０．０５％ピリジン、次いで、ジクロロメタン－メタノール（９：１）＋０．０５％ピリジン）に付し、無色シロップ状のＦｍｏｃ－グリシルグリシン－４，４’－ジメトキキシトリチルオキシブチルアミド（１３）（３．４９ｇ，　６８％）を得た。
（１４）グリシルグリシン－４，４’－ジメトキシトリチルオキシブチルアミド（化合物１４）
　化合物１３（３．００ｇ，　４．１２ｍｍｏｌ）にアセトニトリル（５ｍＬ）及びピペリジン（２．４ｍＬ）を室温で加え、室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下に溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン－メタノール（９：１）＋０．０５％ピリジン）に付し、グリシルグリシン－４，４’－ジメトキキシトリチルオキシブチルアミド（１４）（１．１３ｇ，　５４％）を得た。以下に、グリシルグリシン－４，４’－ジメトキキシトリチルオキシブチルアミド（１４）の機器分析値を示す。
グリシルグリシン－４，４’－ジメトキキシトリチルオキシブチルアミド（１４）；
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：　δ＝７．４０－７．４２（ｍ，　２Ｈ），　７．２５－７．３１（ｍ，　１２Ｈ），　７．１９－７．２１（ｍ，１Ｈ），　６．８０－６．８４（ｍ，　４Ｈ），　３．８９（ｄ，　Ｊ＝５．９Ｈｚ，　２Ｈ），　３．７９（ｓ，　６Ｈ），　３．３７（ｓ，　２Ｈ），　３．２５（ｔ，　Ｊ＝５．８Ｈｚ，　２Ｈ，　ＣＨ２），　２．６７（ｔ，　Ｊ＝５．８Ｈｚ，　２Ｈ，　ＣＨ２），　１．５７－１．６５（ｍ，　４Ｈ，　ＣＨ２）．
（１５）ヒドロキシへキサン酸アミドグリシルグリシン－４，４’－ジメトキキシトリチルオキシブチルアミド（化合物１５）
　化合物１４（１．０７ｇ，　２．１１ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルで３回共沸乾燥後、アルゴン雰囲気下に６－ヒドロキシヘキサン酸（３３６ｍｇ，　２．５４ｍｍｏｌ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（４８７ｍｇ，　２．５４ｍｍｏｌ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（７７８ｍｇ，　５．０８ｍｍｏｌ）、及び無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）を室温で加え、１０分間撹拌した。このようにして得た混合物にトリエチルアミン（７７８ｍｇ，　５．０８ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下に室温で終夜撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン（１５０ｍＬ）を加え飽和重曹水で３回、更に飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を分取し硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン－メタノール（９５：５）＋０．０５％ピリジン）に付し、無色シロップ状のヒドロキシへキサン酸アミドグリシルグリシン－４，４’－ジメトキキシトリチルオキシブチルアミド（１５）（８９０ｍｇ，６８％）を得た。以下に、ヒドロキシへキサン酸アミドグリシルグリシン－４，４’－ジメトキキシトリチルオキシブチルアミド（１５）の機器分析値を示す。
ヒドロキシへキサン酸アミドグリシルグリシン－４，４’－ジメトキキシトリチルオキシブチルアミド（１５）；
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：　δ＝７．４１－７．４２（ｍ，　２Ｈ），　７．２７－７．３４（ｍ，　１２Ｈ），　７．１８－７．２１（ｍ，１Ｈ），　６．８１－６．８３（ｍ，　４Ｈ），　３．９２（ｄ，　Ｊ＝５．４３Ｈｚ，　２Ｈ，　ＣＨ２），　３．８４（ｄ，　Ｊ＝５．９Ｈｚ，　２Ｈ），　３．７９（ｓ，　６Ｈ），　３．６０（ｍ，　２Ｈ，　ＣＨ２），　３．２３－３．２８（ｍ，　２Ｈ，　ＣＨ２），　３．０５－３．１０（ｍ，　２Ｈ，　ＣＨ２），　２．５６（ｔ，　Ｊ＝７．３Ｈｚ，　２Ｈ，　ＣＨ２），　１．５０－１．７２（ｍ，　８Ｈ），　１．３０－１．４５（ｍ，　２Ｈ，　ＣＨ２）．
（１６）へキサン酸アミドグリシルグリシン－４，４’－ジメトキシトリチルオキシブチルアミドホスホロアミダイト（化合物１６）
　化合物１５（８２４ｍｇ，　１．３３ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回共沸乾燥した。つぎに、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（２７４ｍｇ，　１．６０ｍｍｏｌ）を加え、減圧下に脱気してアルゴンガスを充填し、無水アセトニトリル（１ｍＬ）を加えた。さらに、２－シアノエトキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（４８２ｍｇ，　１．６０ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（１ｍＬ）を加え、混合物をアルゴン雰囲気下、室温で４時間撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン（１００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で２回、更に飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。残渣をアミノシリカを用いたカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン－アセトン（７：３）＋０．０５％ピリジン）に付し、へキサン酸アミドグリシルグリシン－４，４’－ジメトキシトリチルオキシブチルアミドホスホロアミダイト（１６）（９３８ｍｇ，　８６％，　ＨＰＬＣ　９８．２％）を得た。以下に、へキサン酸アミドグリシルグリシン－４，４’－ジメトキシトリチルオキシブチルアミドホスホロアミダイト（１６）の機器分析値を示す。
へキサン酸アミドグリシルグリシン－４，４’－ジメトキシトリチルオキシブチルアミドホスホロアミダイト（１６）；
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：　δ＝７．３６－７．４７（ｍ，　３Ｈ），　７．２４－７．３０（ｍ，　５Ｈ），　７．１８－７．１９（ｍ，１Ｈ），　６．８０－６．８２（ｍ，　４Ｈ），　３．９２（ｄ，　Ｊ＝４．９　Ｈｚ，　２Ｈ，　ＣＨ２），　３．８４（ｄ，　Ｊ＝５．４　Ｈｚ，　２Ｈ），　３．７６（ｓ，　６Ｈ），　３．７３－３．８５　（ｍ，　４Ｈ），　３．５４－３．６４（ｍ，　４Ｈ），　３．１８－３．２５　（ｍ，　２Ｈ，　ＣＨ２），　３．０５－３．１０（ｍ，　２Ｈ，　ＣＨ２），　２．６０（ｔ，　Ｊ＝６．３　Ｈｚ，　２Ｈ，　ＣＨ２），　２．２３（ｔ，　７．４　Ｈｚ，　２Ｈ，　ＣＨ２），　１．５５－１．６８（ｍ，　８Ｈ），　１．３０－１．４５（ｍ，　２Ｈ，　ＣＨ２）．　１．１５－１．１８（ｍ，　１２Ｈ）：　
Ｐ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：　δ＝１４６．５７．
ＨＰＬＣ：Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　６．２５ｍｉｎ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ　ＳＰＤ－１０ＡＶ（ＸＢｒｉｄｇｅ　ＯＳＴ　Ｃ１８，　４．６ｍｍ×５０ｍｍ））
　なお、以下の各実施例において、各実施例および各参考例のオリゴヌクレオチド中、「GlyGly」は、実際には、下記化学式（Ｇ２）で表される。すなわち、以下の各実施例および各参考例のオリゴヌクレオチドの構造式（配列）中では、簡略化のために、下記化学式（Ｇ２）中のＧｌｙＧｌｙ以外の部分を省略して示している。下記化学式（Ｇ２）中のＧｌｙＧｌｙは、前述の、Ｇｌｙが二つ連結してペプチド結合を形成した構造である。下記化学式（Ｇ２）中に記載のＮ原子は、ＧｌｙＧｌｙのカルボニル炭素（ＣＯ）側に結合しており、下記化学式（Ｇ２）中に記載のカルボニル炭素は、ＧｌｙＧｌｙのＮＨ側に結合している。また、後述の各実施例および各参考例のオリゴヌクレオチドにおいて、GlyGly（すなわち下記（Ｇ２））の５’末端に結合する塩基がない（記載されていない）場合は、５’末端には水素原子（Ｈ）が結合している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000074
［テレフタル酸アミド残基［TPA］導入用分子の合成］
　後述の各実施例および参考例のオリゴヌクレオチド（microRNA阻害剤）において、テレフタル酸アミド残基（TPA）導入用分子であるテレフタル酸アミダイト（本発明のモノマー）は、下記スキーム７にしたがって合成した。なお、TPAは、「テレフタル酸アミド残基」と記したが、テレフタル酸残基であるということもできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000075
（１）　化合物１７
　４－アミノブタノール（２．５０ｇ，　２８．０５ｍｍｏｌ）及びトリフルオロ酢酸エチル（１９．９２ｇ，　１４０．２２ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（１００ｍＬ）を室温下で終夜撹拌した。その反応混合物を減圧下で濃縮することにより、化合物１７（５．２０ｇ，　ｑ．）を得た。
（２）　化合物１８
　化合物１７（５．２０ｇ，　２８．０５ｍｍｏｌ）及び４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（１１．４０ｇ，３３．６６ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（２０ｍＬ）を室温下で終夜撹拌した。ジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で３回洗浄し、更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。このようにして得られた未精製の残渣のメタノール溶液（１００ｍＬ）に、水酸化ナトリウム（５．６１ｇ，　１４０．２３ｍｍｏｌ）を加え室温下で終夜撹拌した。その反応混合物を減圧下で濃縮し、水（２００ｍＬ）を加えた。ジクロロメタン（２００ｍＬ）で２回抽出した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。生成した残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン－メタノール（９：１）＋０．０５％ピリジン）に付し、化合物１８（８．２０ｇ，　７５％）を得た。以下に、化合物１８の機器分析値を示す。
化合物１８；
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝７．４４－７．４２(２Ｈ,　ｍ),　７．３４－７．２５(６Ｈ,　ｍ),　７．２０(１Ｈ,　ｄ,　Ｊ＝７．３Ｈｚ),　６．８２(４Ｈ,　ｍ),　３．７８(６Ｈ,　ｓ),　３．０６(２Ｈ,　ｔ,　Ｊ＝６．３Ｈｚ),　２．６８(２Ｈ,　ｔ,　Ｊ＝７．１　Ｈｚ),　１．５９(４Ｈ,　ｍ).
（３）　化合物１９
　テレフタル酸モノメチル（３．００ｇ，　１６．６５ｍｍｏｌ）、４－アミノブタノール（０．８９ｇ，　９．９８ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（２．０６ｇ，　９．９８ｍｍｏｌ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（３．０６ｇ，　１９．９６ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（５．０５ｇ，　４９．９ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン溶液（７０ｍＬ）を還流しながら５時間撹拌した。室温まで冷却後、生成した沈殿をろ別し、ろ液を減圧下で濃縮した。残渣に酢酸エチル（５０ｍＬ）を加え、沈殿をろ別し、目的物である化合物１９を１．５２ｇ得た。ろ液は減圧下で濃縮し、トルエンで洗浄した。沈殿をろ別し、目的物である化合物１９を０．８３ｇ得た。ろ液にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で２回洗浄し、更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。そして目的物である化合物１９を０．３７ｇ得た。得られた目的物（化合物１９）を合計すると、収量２．７２ｇ，収率６５％であった。以下に、化合物１９の機器分析値を示す。
化合物１９；
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝８．１０－８．０７(２Ｈ,　ｍ),　７．８３(２Ｈ,　ｍ),　３．９４(３Ｈ,　ｓ),　３．７４(２Ｈ,　ｔ,　Ｊ＝５．９Ｈｚ),　３．５０(２Ｈ,　ｍ),　１．９２(２Ｈ,　ｄｄ,　Ｊ＝１２．７，　３．４Ｈｚ),　１．８０－１．６５(２Ｈ,　ｍ)．
（４）化合物２０
　化合物１９（２．３３ｇ，　９．２７ｍｍｏｌ）及び水酸化ナトリウム（１．８５ｇ，４６．３６ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（７０ｍＬ）を室温下で終夜撹拌した。その反応混合物を減圧下で濃縮し、水を加えた。さらに、２規定（２ｍｏｌ／Ｌ）塩酸により、ｐＨを２に調製した。生成した沈殿をろ別し、沈殿物を減圧下で乾燥させ、目的物である化合物２０（１．９５ｇ,　８９％）を得た。以下に、化合物２０の機器分析値を示す。
化合物２０；
１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ＝８．００(２Ｈ,　ｄ,　Ｊ＝８．３Ｈｚ),　７．９２(２Ｈ,　ｄ,　Ｊ＝８．３Ｈｚ)，１．７２(２Ｈ,　ｄ,　Ｊ＝１２．７Ｈｚ),　１．６３－１．４５(４Ｈ,　ｍ),　１．１５(２Ｈ,　ｍ).
（５）　化合物２１
　化合物１８（３．０９ｇ，　７．８８ｍｍｏｌ）、化合物２０（１．７０ｇ，　７．１６ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．６３ｇ，　７．８８ｍｍｏｌ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（２．４１ｇ，　１５．７６ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（３．６２ｇ，　３５．８０ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液（１７０ｍＬ）を、アルゴン雰囲気下、室温で終夜撹拌した。得られた反応混合物を減圧下で濃縮し、ジクロロメタン（３００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で３回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。残渣をトルエンでトリチレーションして、生じた沈殿をろ別し、沈殿物を減圧下で乾燥させた。このようにして、目的物である化合物２１（３．９４ｇ,　９０％）を得た。以下に、化合物２１の機器分析値を示す。
化合物２１；
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝７．７６－７．６７(４Ｈ,　ｍ),　７．４０(２Ｈ,　ｄ,　Ｊ＝７．３Ｈｚ),　７．２７(６Ｈ,　ｍ),　７．１９(１Ｈ,　ｍ),　６．８０(４Ｈ,　ｄ,　Ｊ＝８．８Ｈｚ),　３．７８(６Ｈ,　ｓ),　３．７３(２Ｈ,　t,　Ｊ＝５．９Ｈｚ),　３．４８(４Ｈ,　ｍ),　３．１２(２Ｈ,　ｔ,　Ｊ＝５．６Ｈｚ),　１．７２(８Ｈ,　ｍ)．
（６）　化合物２２
　化合物２１（１．５０ｇ，　２．４６ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回共沸乾燥した。つぎに、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（６３０ｍｇ，　３．６８ｍｍｏｌ）を加え、減圧下で脱気してアルゴンガスを充填し、無水ジクロロメタン（１ｍＬ）を加えた。さらに、２－シアノエトキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（１．１１ｇ，　３．６８ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（１ｍＬ）を加え、混合物をアルゴン雰囲気下、室温で４時間撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で３回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、アミノシリカを用いたカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ｎ－ヘキサン－アセトン（７：３）＋０．０５％ピリジン）に付し、化合物２２（１．８６ｇ，９３％）を得た。以下に、化合物２２の機器分析値を示す。
化合物２２；
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝７．７４(４Ｈ,　ｍ),　７．４１(２Ｈ,　ｍ),　７．３１－７．２４(６Ｈ,　ｍ),　７．２０(１Ｈ,　ｍ),　６．８０(４Ｈ,　ｍ),　３．８５－３．５６(１０Ｈ,　ｍ),　３．４５(４Ｈ,　ｍ),　３．１２(２Ｈ,　ｔ,　Ｊ＝５．９Ｈｚ),　２．６０(２Ｈ,　ｄｄ,　Ｊ＝１１．０,　４．６Ｈｚ),　２．１６(２Ｈ,　t,　Ｊ＝３．４Ｈｚ),　１．７２(８Ｈ,　ｔ,　Ｊ＝５．９Ｈｚ)，　１．１７(１２Ｈ,　ｍ)．
３１Ｐ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：　δ＝１４７．１０．
　なお、後述の各実施例および各参考例のオリゴヌクレオチド中、「TPA」は、下記化学式で表される構造である。また、後述の各実施例および各参考例のオリゴヌクレオチドにおいて、TPAの５’末端に結合する塩基がない（記載されていない）場合は、５’末端には水素原子（Ｈ）が結合している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000076
［実施例１］
　阻害対象のmicroRNAをhsa-miR-16-5pおよびhsa-miR-122の二つとして、前述の化学合成方法により、下記のようにして、microRNA阻害剤を製造した。まず、前記相補的配列は、前記二つのmicroRNAの全配列または一部と相補的にした。また、前記相補的配列の数を３つにし、これらをグリシン残基（Gly）で連結し、両端に位置する前記相補的配列の各端部にもグリシン残基（Gly）を連結した。そして、Huh-7細胞に前記二種類のmicroRNA阻害剤を導入し、導入後24時間後に回収したmicroRNAの発現量をqPCRで確認した。その結果を図４に示す。同図に示すように、本例の二つのmicroRNA阻害剤（Sponge　Oligo）は、導入しなかった場合（Normal）に比べ、優位にmicroRNAを阻害したことが分かる。
　なお、実施例１および後述の各実施例（参考例を含む）において、microRNA阻害剤は、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＡＢＩ　Ｅｘｐｅｄｉｔｅ（登録商標）　８９０９　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムズ）により、３’側から５’側に向かって合成した。前記合成において、ＲＮＡアミダイトとしては、ＲＮＡ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（２’－Ｏ－ＴＢＤＭＳｉ、商品名、三千里製薬）を用いた。ＤＮＡアミダイトとしては、ＤＮＡ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（三千里製薬）を用いた。また、前記ホスホロアミダイト法に用いるグリシン残基（Gly）導入用分子およびグリシン二量体残基（GlyGly）導入用分子は、後述の方法により合成した。これらグリシン残基（Gly）導入用分子およびグリシン二量体残基（GlyGly）導入用分子は、いずれも、アミダイトであり、前記本発明のモノマーに該当する。前記アミダイトの脱保護は、定法に従い、合成したmicroRNA阻害剤は、ＨＰＬＣにより精製した。
［実施例２：HCT116細胞におけるhsa-miR-16-5p(miR-16)活性に対するスポンジオリゴヌクレオチド（実施例）およびモノマーデコイオリゴヌクレオチド（参考例）の抑制効果の比較］
（１）材料
１－ａ：オリゴヌクレオチド
　下記塩基配列および後述の表１に示すとおり、microRNAであるhsa-miR-16-5pの配列に対する相補的配列をGly（前記Ｇ１）またはGlyGly（前記Ｇ２）で連結したmicroRNA阻害剤を使用し、microRNA抑制効果（microRNA阻害活性）を測定した。なお、以下において、hsa-miR-16-5pを、単に「miR-16」という。また、本実施例および後述の各実施例（参考例も含む）において、microRNAは、特に断らない限り、miR-16である。
　本実施例（実施例２）および以下の各実施例において、microRNAの配列に対する相補的配列を二つ以上有するmicroRNA阻害剤を「スポンジオリゴヌクレオチド」または「スポンジオリゴ」という。また、microRNAの配列に対する相補的配列を一つのみ有するmicroRNA阻害剤（参考例）を「モノマーデコイオリゴヌクレオチド」または「モノマーデコイ」という。また、本実施例（実施例２）および後述の各実施例において、「Perfect型」は、図３（ａ）のフルマッチ構造のmicroRNA阻害剤をいい、「Bulge型」は、図３（ｂ）のミスマッチ構造のmicroRNA阻害剤をいい、「Bubble型」は、図３（ｃ）のミスマッチ構造のmicroRNA阻害剤をいう。
 
（実施例２－１）
spo-D-3（Gly含有Bubble型スポンジオリゴ）
5'-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-T-3'　　　（配列番号２）
（参考例２－１）
spo-D-7（Gly含有Bubble型モノマーデコイ）
5'-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-T-3'　　　（配列番号３）
（実施例２－２）
spo-D-13（GlyGly含有Perfect型スポンジオリゴ）
5'-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-T-3'　　　（配列番号４）
（参考例２－２）
spo-D-14（GlyGly含有Perfect型モノマーデコイ）
5'-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-T-3'　　　（配列番号５）
（実施例２－３）
spo-D-16（GlyGly含有Bubble型スポンジオリゴ）
5'-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-T-3'　　　（配列番号６）
（参考例２－３）
spo-D-17（GlyGly含有Bubble型モノマーデコイ）
5'-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-T-3'　　　（配列番号７）
　上記実施例２－１～２－３のそれぞれに対するネガティブコントロールとしては、下記参考例２－４～２－６を使用した。
 
（参考例２－４）
spo-D-9（Gly含有Bubble型スポンジオリゴネガティブコントロール）
5'-Gly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-Gly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-Gly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-Gly-T-3'　　　（配列番号８）
（参考例２－５）
spo-D-18（GlyGly含有Perfect型スポンジオリゴネガティブコントロール）
5'-GlyGly-CGCCAATATTTACGTAATTACA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTAATTACA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTAATTACA-GlyGly-T-3'　　　（配列番号９）
（参考例２－６）
spo-D-20（GlyGly含有Bubble型スポンジオリゴネガティブコントロール）
5'-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-T-3'　　　（配列番号１０）
　さらに、下記参考例２－７および２－８のmicroRNA阻害剤として、miR-16活性の抑制効果のポジティブコントロール(LNA-miR16)と、そのネガティブコントロール(LNA-Neg.Con)である以下のＬＮＡ分子（EXIQON社製）を使用した。
 
（参考例２－７）
hsa-miR-16　miRCURY　LNA　microRNA　Power　Inhibitor　(426845-00)　(LNA-miR16)
　　　GCCAATATTTACGTGCTGCT　　　（配列番号１１）
（参考例２－８）
miRCURY　LNATM　microRNA　Power　Antisense　Control　B　(199021-00)　(LNA-Neg.Con)
　　　AGAGCTCCCTTCAATCCAAA　　　（配列番号１２）
　以上のオリゴヌクレオチドの水溶液を、濃度が１０μＭとなるように、注射用蒸留水にて調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000077
１－ｂ:細胞株及び培地
　細胞株は、ヒト大腸がん細胞株であるHCT116(ATCC社)を用いた。培地は、１０％ＦＢＳを含むDMEM培地（Nacalai社）を用いて、３７℃、１０％ＣＯ２存在下で培養した。
１－ｃ：レポータープラスミド
　レポータープラスミドは、以下のレポーター遺伝子を持つプラスミドを使用した。
(1)pGL4-miR16
Promega社のpGL4.74[hRluc/TK]　vectorは、図５に示すように、HSV-TKプロモーターの支配下にウミシイタケルシフェラーゼ（Renilla　Luciferase）遺伝子を発現するプラスミドである。pGL4-miR16は、このvectorのルシフェラーゼ遺伝子の下流にmiR-16の標的配列を組み込んだものであり、miR-16の活性によって、ルシフェラーゼの発現量が抑制される構造になっている。
(2)pGL4-NTC
　pGL4-NTCは、前記pGL4.74[hRluc/TK]　vectorのルシフェラーゼ遺伝子の下流に、miR-16と反応しない非特異的配列を組み込んだものであり、pGL4-miR16に対するコントロールとして使用した。
(3)pMIR-REPORT　Luciferase
Ambion社のpMIR-REPORT　Luciferaseは、図６に示すようにCMVプロモーターの支配下にホタルルシフェラーゼ（FireflyLuciferase）遺伝子を発現するプラスミドである。前記pGL4-miR16または前記GL4-NTCとコトランスフェクションすることによって、トランスフェクション効率をモニターするために使用した。
（２）方法
２－ａ：レポーター遺伝子のHCT116細胞へのトランスフェクション
　前記HCT116細胞を、１×１０５／ｃｍ２の密度で６ｃｍディッシュに播種し、抗生物質を含まないDMEM培地（１０％ＦＢＳ）を用いて培養した。また、OptiMEM　(Gibco社)　500μｌにpGL4-NTC(２μｇ)及びpMIR-REPORT(２μｇ)を加えたもの、またはpGL4-miR16(２μｇ)及びpMIR-REPORT(２μｇ)を加えたものを調製した（溶液Ａ）。また、別のチューブにOptiMEM　500μＬにLipofectamine　2000　(Invitrogen)を20μＬ加えたものを調製した（溶液Ｂ）。両液をよく撹拌し、室温で５分間静置した後、溶液Ａ及び溶液Ｂを混ぜ、さらに室温で２０分間静置した。この間に、前記播種した細胞の培地を新しい培地に交換した。２０分後、前記溶液Ａ及び溶液Ｂの混合液を、前記細胞を含む培養液に加え、引き続き３７℃、１０％ＣＯ２存在下で８時間培養を続けた。その後、前記細胞の培地を新しい培地に交換した。
２－ｂ：スポンジオリゴ、モノマーデコイまたはＬＮＡのHCT116細胞へのトランスフェクション
　前記レポーター遺伝子をトランスフェクションしたHCT116細胞を回収し、５×１０４ウエルになるように、２４ウェルデイッシュに播種した。次に、前記pGL4-NTC及びpMIR-REPORTをトランスフェクションした細胞または前記pGL4-miR16及びpMIR-REPORTをトランスフェクションした細胞それぞれに対して、スポンジオリゴ、モノマーデコイ、またはＬＮＡのトランスフェクションを行った。まず、OptiMEM　５０μＬに１０μＭの前記スポンジオリゴ溶液、前記ＬＮＡ溶液を１．２５μＬ、または１０μＭの前記モノマーデコイ溶液を３．７５μＬ加え、溶液Ｃを作成した。また、OptiMEM　５０μＬにLipofectamine　RNAiMAX　(Invitrogen社)を２μＬ加え、溶液Ｄを調製した。溶液Ｃ及び溶液Ｄをそれぞれ、室温で５分間静置した後、溶液Ｃ及び溶液Ｄを混ぜ、さらに室温で２０分間静置した。この間に、前記播種した細胞の培地を新しい培地に交換した。２０分後、溶液Ｃ、溶液Ｄの混合液を、前記レポーター遺伝子をトランスフェクションしたHCT116細胞を含む培養液に加え、引き続き３７℃、１０％ＣＯ２存在下で２４時間培養を続けた。その後、前記細胞の培地を新しい培地に交換した。このトランスフェクションにより、スポンジオリゴまたはＬＮＡの終濃度は、２５ｎＭ、モノマーデコイの終濃度は、７５ｎＭとなっている。
２－ｃ：活性測定
　前記スポンジオリゴ、モノマーデコイ、またはＬＮＡを、トランスフェクションしてから４８時間後、それぞれの細胞内のルシフェラーゼ活性をDual-Luciferase（登録商標）　Reporter　Assay　System(Promega社)を使用して、添付のプロトコールに従って測定した。測定機器は、Berthold　Centro　960(Berthold社)を用いた。
２－ｄ：活性の解析
　上述のように、pMIR-REPORT由来のホタルルシフェラーゼはトランスフェクション効率を反映し、pGL4-NTCおよびpGL4-miR16由来のウミシイタケルシフェラーゼはmiR-16の活性を反映する。従って、ウミシイタケルシフェラーゼの活性値（ＡpGL4-NTCまたはＡpGL4-miR16）をホタルルシフェラーゼの活性値（ＡpMIR-REPORT（NTC）またはＡpMIR-REPORT（miR-16））で割ると、標準化されたウミシイタケルシフェラーゼ活性値を得る。pGL4-NTC由来の標準化されたウミシイタケルシフェラーゼ活性値を１とした時のpGL4-miR16由来のウミシイタケルシフェラーゼ活性値がmiR-16によって抑制された値となる。従って、それぞれのスポンジオリゴ、モノマーデコイ、またはＬＮＡに対して、以下の計算式でmiR-16活性抑制効果の値を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000078
（３）結果
　得られた結果を図７～９に示す。なお、図７～９における縦軸は、miR-16活性抑制効果（活性阻害効果または活性抑制能ともいう）を表す。後述の図１０～２１においても同じである。図７はGly含有Bubble型スポンジオリゴ（実施例２－１）、図８はGlyGly含有Perfect型スポンジオリゴ（実施例２－２）、図９はGlyGly含有Bubble型スポンジオリゴ（実施例２－３）を用いた結果である。図示のとおり、いずれの場合も、スポンジオリゴはＬＮＡに匹敵するmiR-16活性抑制能を持つことが示された。さらに、本実施例のスポンジオリゴは、その構造上、ＬＮＡと比較して、きわめて簡便性に優れ、かつ汎用性が高いという利点を有する。また、本実施例では、スポンジオリゴとモノマーデコイのmiR-16結合配列の配列数を同数とするために、スポンジオリゴの３倍の濃度のモノマーデコイを用いたが、スポンジオリゴの方がモノマーデコイよりも高いmiR-16活性抑制能を持つことが示された。このことは、スポンジオリゴ上で、miRNAの結合が協調的に起こっていることを示している。
［実施例３：HCT116細胞におけるmiR-16活性に対するＤＮＡ型スポンジオリゴとRNA型スポンジオリゴの抑制効果］
（１）材料
1-a:オリゴヌクレオチド
　下記配列および後述の表２に示すとおり、miR-16対する相補的配列をGlyGly（前記Ｇ２）で連結したmicroRNA阻害剤を使用し、microRNA抑制効果（microRNA阻害活性）を測定した。
 
（実施例３－１）
spo-D-16（GlyGly含有Bubble型DNAスポンジオリゴ）
5'-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-T-3'　　　（配列番号６）
（実施例３－２）
spo-R-16（GlyGly含有Bubble型RNAスポンジオリゴ）
5'-GlyGly-CGCCAAUAUUCGAUGCUGCUA-GlyGly-CGCCAAUAUUCGAUGCUGCUA-GlyGly-CGCCAAUAUUCGAUGCUGCUA-GlyGly-U-3'　　　（配列番号１３）
　またそれぞれに対する以下のネガティブコントロールオリゴを使用した。
（参考例３－１）
spo-D-20（GlyGly含有Bubble型DNAスポンジオリゴネガティブコントロール）
5'-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-T-3'　　　（配列番号１０）
（参考例３－２）
spo-R-20（GlyGly含有Bubble型RNAスポンジオリゴネガティブコントロール）
5'-GlyGly-CGCCAAUAUUCCAUUAUAAGA-GlyGly-CGCCAAUAUUCCAUUAUAAGA-GlyGly-CGCCAAUAUUCCAUUAUAAGA-GlyGly-U-3'　　　（配列番号１４）
　さらに、下記参考例３－３および３－４のmicroRNA阻害剤として、miR-16活性の抑制効果のポジティブコントロール(LNA-miR16)と、そのネガティブコントロール(LNA-Neg.Con)である以下のＬＮＡ分子（EXIQON社製）を使用した。なお、参考例３－３は、前記参考例２－７と同じであり、参考例３－４は、前記参考例２－８と同じである。
 
（参考例３－３）
LNA-miR16　　　GCCAATATTTACGTGCTGCT　　　（配列番号１１）
（参考例３－４）
LNA-Neg.Con　　AGAGCTCCCTTCAATCCAAA　　　（配列番号１２）
　以上のオリゴヌクレオチドの水溶液を、１０μＭとなるように、注射用蒸留水を用いて調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000079
１－ｂ：細胞株
　細胞株および培地は、実施例２と同じ細胞株及び培地を利用した。
１－ｃ:レポータープラスミド
　レポータープラスミドは、実施例２と同じレポーター遺伝子を持つプラスミドを使用した。
（２）方法
２－ａ：レポーター遺伝子のHCT116細胞へのトランスフェクション
　HCT116細胞を用いて、実施例２と同様の方法で、レポーター遺伝子プラスミドpGL4-NTC(２μｇ)およびpMIR-REPORT(２μｇ)を、またはpGL4-miR16(２μｇ)およびpMIR-REPORT(２μｇ)を、それぞれHCT116細胞へトランスフェクションした。
２－ｂ：スポンジオリゴ、ＬＮＡの細胞へのトランスフェクション
　前記レポーター遺伝子をトランスフェクションした細胞に対して、（実施例Ａ２）と同様の方法で、スポンジオリゴまたはＬＮＡのトランスフェクションを行った。このトランスフェクションにより、スポンジオリゴ及びLNAは終濃度が２５ｎＭになっている。
２－ｃ：活性測定
　前記スポンジオリゴまたはＬＮＡをトランスフェクションしてから４８時間後、それぞれの細胞内のルシフェラーゼ活性をDual-Luciferase（登録商標）　Reporter　Assay　System　(Promega社)を使用して、添付のプロトコールに従って測定した。測定機器は、Berthold　Centro　960　(Berthold社)を用いた。
２－ｄ：活性の解析
　実施例２と同様の方法によりmiR-16活性抑制効果の値を得た。
（３）結果
　得られた結果を図１０に示す。図示のとおり、実施例のＤＮＡ型スポンジオリゴおよびＲＮＡ型スポンジオリゴのいずれも、ネガティブコントロールと比較してきわめて高いmiR-16活性抑制能を有していた。さらに、本実施例のＤＮＡ型スポンジオリゴおよびＲＮＡ型スポンジオリゴのいずれも、その構造上、ＬＮＡと比較して、きわめて簡便性に優れ、かつ汎用性が高いという利点を有する。さらに、それに加え、本実施例のＤＮＡ型スポンジオリゴは、miR-16活性抑制能がＲＮＡ型スポンジオリゴよりも高く、ＬＮＡに匹敵する高いmiR-16活性抑制能を持つことが示された。
　なお、本実施例では、前述のとおり、ＤＮＡ型スポンジオリゴの方が、ＲＮＡ型スポンジオリゴよりもmicroRNA活性抑制効果が高かった。ただし、本発明では、標的miRNAの種類によっては、または、細胞株が本実施例と異なる場合等は、ＲＮＡ型スポンジオリゴの方がＤＮＡ型スポンジオリゴよりも高いmicroRNA活性抑制能を持つ可能性もある。
［実施例４：異なるリンカー分子を有するスポンジオリゴの，HCT116細胞とHEK293T細胞におけるmiR-16活性抑制効果比較］
（１）材料
１－ａ：オリゴヌクレオチド
　下記塩基配列および後述の表３に示すとおり、miR-16の配列に対する相補的配列をGly（前記Ｇ１）、GlyGly（前記Ｇ２）またはTPAで連結したmicroRNA阻害剤を使用し、microRNA抑制効果（microRNA阻害活性）を測定した。
 
（実施例４－１）
spo-D-3（Gly含有Bubble型スポンジオリゴ）
5'-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-T-3'　　　（配列番号２）
（実施例４－２）
spo-D-16（GlyGly含有Bubble型スポンジオリゴ）
5'-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-T-3'　　　（配列番号６）
（実施例４－３）
spo-D-13（GlyGly含有Perfect型スポンジオリゴ）
5'-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-T-3'　　　（配列番号４）
（実施例４－４）
spo-D-15（TPA含有Perfect型スポンジオリゴ）
5'-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-T-3'　　　（配列番号１５）
（実施例４－５）
spo-D-21（TPA含有Bubble型スポンジオリゴ）
5'-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-T-3'　　　（配列番号１６）
（実施例４－６）
spo-D-22（TPA含有Bulge型スポンジオリゴ）
5'-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-T-3'　　　（配列番号１７）
（実施例４－７）
spo-D-23（GlyGly含有Bulge型スポンジオリゴ）
5'-GlyGly-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-GlyGly-T-3'　　　（配列番号１８）
　また、前記実施例４－１～４－７のネガティブコントロールオリゴとして、下記塩基配列をGly（前記Ｇ１）またはGlyGly（前記Ｇ２）で連結したmicroRNA阻害剤（下記参考例４－１～４－４）を使用し、microRNA抑制効果（microRNA阻害活性）を測定した。
 
（参考例４－１）
spo-D-9（Gly含有Bubble型スポンジオリゴネガティブコントロール）
5'-Gly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-Gly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-Gly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-Gly-T-3'　　　（配列番号８）
（参考例４－２）
spo-D-20（GlyGly含有Bubble型スポンジオリゴネガティブコントロール）
5'-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-T-3'　　　（配列番号１０）
（参考例４－３）
spo-D-18（GlyGly含有Perfect型スポンジオリゴネガティブコントロール）
5'-GlyGly-CGCCAATATTTACGTAATTACA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTAATTACA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTAATTACA-GlyGly-T-3'　　　（配列番号９）
（参考例４－４）
spo-D-19（TPA含有Perfect型スポンジオリゴネガティブコントロール）
5'-TPA-CGCCAATATTTACGTAATTACA-TPA-CGCCAATATTTACGTAATTACA-TPA-CGCCAATATTTACGTAATTACA-TPA-T-3'　　　（配列番号１９）
　さらに、下記参考例４－５および４－６のmicroRNA阻害剤として、miR-16活性の抑制効果のポジティブコントロール(LNA-miR16)と、そのネガティブコントロール(LNA-Neg.Con)である以下のＬＮＡ分子（EXIQON社製）を使用した。なお、参考例４－５は、前記参考例２－７と同じであり、参考例４－６は、前記参考例２－８と同じである。
 
（参考例４－５）
LNA-miR16　　　GCCAATATTTACGTGCTGCT　　　（配列番号１１）
（参考例４－６）
LNA-Neg.Con　　AGAGCTCCCTTCAATCCAAA　　　（配列番号１２）
　以上のオリゴヌクレオチドを、１０μＭとなるように、注射用蒸留水に溶解し、ＲＮＡ溶液を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000080
１－ｂ：細胞株および培地
　細胞株は、ヒト大腸がん細胞株であるHCT116(ATCC社)またはヒト胎児腎臓細胞株であるHEK293T(ATCC社)を用いた。培地は、１０％ＦＢＳを含むDMEM培地（Nacalai社）を用いて、３７℃、１０％ＣＯ２存在下で培養した。
１－ｃ：レポータープラスミド
　レポータープラスミドは、実施例２と同じレポーター遺伝子を持つプラスミドを使用した。
（２）方法
２－ａ：レポーター遺伝子のHCT116細胞またはHEK293T細胞へのトランスフェクション
　HCT116細胞または293T細胞を用いて、実施例２と同様の方法で、レポーター遺伝子プラスミドpGL4-NTC(２μｇ)及びpMIR-REPORT(２μｇ)またはpGL4-miR16(２μｇ)及びpMIR-REPORT(２μｇ)をそれぞれトランスフェクションした。
２－ｂ：スポンジオリゴまたはLNAのHCT116細胞またはHEK293T細胞へのトランスフェクション
　前記レポーター遺伝子をトランスフェクションした細胞に対して、（実施例Ａ２）と同様の方法で、スポンジオリゴまたはＬＮＡのトランスフェクションを行った。このトランスフェクションにより、スポンジオリゴまたはＬＮＡの終濃度は、２５ｎＭになっている。
２－ｃ：活性測定
　前記スポンジオリゴまたはＬＮＡを前記HCT116細胞またはHEK293T細胞にトランスフェクションしてから４８時間後、それぞれの細胞内のルシフェラーゼ活性をDual-Luciferase（登録商標）　Reporter　Assay　System　(Promega社)を使用して、添付のプロトコールに従って測定した。測定機器は、Berthold　Centro　960　(Berthold社)を用いた。
２－ｄ：活性の解析
　実施例２と同様の方法でmiR-16活性抑制効果の値を得た。
（３）結果
　得られた結果を図１１から図１７に示す。図１１は、HCT116細胞を用いてGly型スポンジオリゴとGlyGly型スポンジオリゴを比較したものである。その結果、GlyGly型スポンジオリゴはGly型よりも少し強い抑制効果を持つことがわかった。図１２から図１７は、GlyGly型スポンジオリゴとTPA型スポンジオリゴを比較したものである。図１２から図１４はHCT116細胞を用いたもので、図１５から図１７はHEK293T細胞を用いた結果である。Perfect型のスポンジオリゴを用いると、HCT116細胞ではTPA型の方が、活性が高く（図１２）、HEK293T細胞では両者の活性はほぼ同じであった（図１５）。Bubble型スポンジオリゴを用いた場合は、HCT116細胞でもHEK293T細胞でもGlyGly型の方が活性が高かった（図１３および１６）。Bulge型スポンジオリゴを用いた場合は、HCT116細胞ではTPA型の方が、活性が高く（図１４）、HEK293T細胞ではGlyGly型の方が活性が高かった（図１７）。以上の結果から、本実施例のスポンジオリゴにおいて、TPA型およびGlyGly型は、Gly型よりも、in　vitroにおけるmiR-16活性に対する少し強い抑制効果を有することが確認された。また、TPA型およびGlyGly型のmiR-16活性抑制効果には、ほとんど差はなかった。
［実施例５：異なるmiR-16結合配列を有するスポンジオリゴの，HCT116細胞またはHEK293T細胞におけるmiR-16活性抑制効果比較］
（１）材料
１－ａ：オリゴヌクレオチド
　下記塩基配列および後述の表４に示すとおり、miR-16の配列に対する相補的配列をTPAで連結したmicroRNA阻害剤を使用し、microRNA抑制効果（microRNA阻害活性）を測定した。
 
（実施例５－１）
spo-D-15（TPA含有Perfect型スポンジオリゴ）
5'-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-T-3'　　　（配列番号１５）
（実施例５－２）
spo-D-21（TPA含有Bubble型スポンジオリゴ）
5'-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-T-3'　　　（配列番号１６）
（実施例５－３）
spo-D-22（TPA含有Bulge型スポンジオリゴ）
5'-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-T-3'　　　（配列番号１７）
　また、前記実施例５－１～５－３のネガティブコントロールオリゴとして、下記参考例５－１のmicroRNA阻害剤を使用し、microRNA抑制効果（microRNA阻害活性）を測定した。
 
（参考例５－１）
spo-D-19（TPA含有Perfect型スポンジオリゴネガティブコントロール）
5'-TPA-CGCCAATATTTACGTAATTACA-TPA-CGCCAATATTTACGTAATTACA-TPA-CGCCAATATTTACGTAATTACA-TPA-T-3'　　　（配列番号１９）
　さらに、下記参考例５－２および５－３のmicroRNA阻害剤として、miR-16活性の抑制効果のポジティブコントロール(LNA-miR16)と、そのネガティブコントロール(LNA-Neg.Con)である以下のＬＮＡ分子（EXIQON社製）を使用した。なお、参考例５－２は、前記参考例２－７と同じであり、参考例５－３は、前記参考例２－８と同じである。
 
（参考例５－２）
LNA-miR16　　　GCCAATATTTACGTGCTGCT　　　（配列番号１１）
（参考例５－３）
LNA-Neg.Con　　AGAGCTCCCTTCAATCCAAA　　　（配列番号１２）
　以上のオリゴヌクレオチドの水溶液を、１０μＭとなるように、注射用蒸留水を用いて調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000081
１－ｂ：細胞株
　活性測定には、実施例４と同じ細胞株を利用した。
１－ｃ：レポータープラスミド
　レポータープラスミドは、実施例２と同じレポーター遺伝子を持つプラスミドを使用した。
（２）方法
２－ａ：レポーター遺伝子のHCT116細胞またはHEK293T細胞へのトランスフェクション
　HCT116細胞または293T細胞を用いて、（実施例Ａ２）と同様の方法で、レポーター遺伝子プラスミドpGL4-NTC(２μｇ)およびpMIR-REPORT(２μｇ)またはpGL4-miR16(２μｇ)およびpMIR-REPORT(２μｇ)をそれぞれHCT116細胞またはHEK293T細胞へトランスフェクションした。
２－ｂ：スポンジオリゴまたはLNAのHCT116細胞またはHEK293T細胞へのトランスフェクション
　前記レポーター遺伝子をトランスフェクションした細胞に対して、（実施例Ａ２）と同様の方法で、スポンジオリゴまたはＬＮＡのトランスフェクションを行った。このトランスフェクションにより、スポンジオリゴまたはＬＮＡの終濃度は、２５ｎＭになっている。
２－ｃ：活性測定
　スポンジオリゴまたはＬＮＡをトランスフェクションしてから４８時間後、それぞれの細胞内のルシフェラーゼ活性をDual-Luciferase（登録商標）　Reporter　Assay　System(Promega社)を使用して、添付のプロトコールに従って測定した。測定機器は、Berthold　Centro　960(Berthold社)を用いた。
２－ｄ：活性の解析
　実施例２と同様の方法でmiR-16活性抑制効果の値を得た。
（３）結果
　得られた結果を図１８および１９に示す。図１８は、HCT116細胞を用いてmiR-16結合配列がPerfect型、Bubble型、またはBulge型の場合のスポンジオリゴ活性を比較したものである。その結果、これら３者にほとんど差はないが、その中でもPerfect型およびBulge型が、in　vitroにおけるmiR-16活性に対する比較的強い抑制効果を示した。図１９は、HEK293T細胞を用いてmiR-16結合配列がPerfect型、Bubble型またはBulge型の場合のスポンジオリゴ活性を比較したものである。その結果、これら３者の中では、Bulge型がin　vitroにおけるmiR-16活性に対する最も強い抑制効果を示した。
　以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
　この出願は、２０１２年３月４日に出願された日本出願特願２０１２－０４７４６６を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
　本発明のmicroRNA阻害剤は、特殊な修飾核酸を用いる必要がないことから汎用性に優れ、かつ、前記相補的配列がリンカー残基を介して連結（結合）されているため分解され難い。このため、本発明のmicroRNA阻害剤は、種々の分野に広く利用可能である。
　１　microRNA阻害剤
　２　相補的配列
　３　リンカー残基

Claims (42)

  1. microRNA阻害剤であって、阻害の対象となるmicroRNAの配列に対する相補的配列を二つ以上有し、前記二つ以上の相補的配列が、リンカー残基を介して連結していることを特徴とするmicroRNA阻害剤。
  2. 両末端に位置する前記相補的配列の端部にリンカー残基が結合していることを特徴とする請求項１記載のmicroRNA阻害剤。
  3. 前記リンカー残基が、アミノ酸残基、ポリアミン残基、およびポリカルボン酸残基からなる群から選択される少なくとも一つを含む請求項１または２記載のmicroRNA阻害剤。
  4. 前記リンカー残基が、ポリカルボン酸残基である請求項１から３のいずれか一項に記載のmicroRNA阻害剤。
  5. 前記ポリカルボン酸残基が、テレフタル酸残基である請求項３または４記載のmicroRNA阻害剤。
  6. 前記リンカー残基が、アミノ酸残基である請求項１から３のいずれか一項に記載のmicroRNA阻害剤。
  7. 前記アミノ酸残基が、グリシン残基、テレフタル酸アミド残基またはプロリン残基である請求項３または６記載のmicroRNA阻害剤。
  8. 前記二つ以上の相補的配列の間に位置しているアミノ酸残基が、複数のアミノ酸残基が連結したものであることを特徴とする請求項３、６および７のいずれか一項に記載のmicroRNA阻害剤。
  9. 前記相補的配列の端部に結合したアミノ酸残基が、複数のアミノ酸残基が連結したものであることを特徴とする請求項３および６から８のいずれか一項に記載のmicroRNA阻害剤。
  10. 前記二つ以上の相補的配列の間に位置しているアミノ酸残基、および、前記相補的配列の端部に結合したアミノ酸残基の少なくとも一方が、グリシン二量体または三量体の残基である請求項８または９記載のmicroRNA阻害剤。
  11. 前記リンカー残基が、下記化学式（Ｉ－０）で表される請求項１から１０のいずれか一項に記載のmicroRNA阻害剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     前記化学式（Ｉ－０）中、
    Ｑ１１およびＱ１２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２（メチレン基）、ＮＨ（イミノ基）、Ｃ＝Ｏ（カルボニル基）、Ｃ＝Ｓ（チオカルボニル基）、Ｃ＝ＮＨ（イミノメチレン基）、Ｏ、またはＳであり、
    Ｑ１およびＱ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２（メチレン基）、ＮＨ（イミノ基）、Ｃ＝Ｏ（カルボニル基）、Ｃ＝Ｓ（チオカルボニル基）、Ｃ＝ＮＨ（イミノメチレン基）、Ｏ、またはＳであり、
    Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
    Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
    Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
    ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
    Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
    Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
    ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
    Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
    ｍは、０～３０の範囲の整数であり；
    ｎは、０～３０の範囲の整数であり；
    前記microRNAの配列に対する相補的配列は、それぞれ、－ＯＲ１－または－ＯＲ２－を介して、前記リンカー残基に結合し、
    前記リンカー残基が、前記microRNAの相補的配列の間に位置している場合は、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ－０）であり、
    前記リンカー残基が、末端に位置する前記microRNAの相補的配列の端部に位置している場合は、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、保護基またはリン酸保護基であり；
    Ａは、任意の原子団である。
  12. 前記化学式（Ｉ－０）中、Ｑ１１およびＱ１２が、それぞれカルボニル基である請求項１１記載のmicroRNA阻害剤。
  13. 前記化学式（Ｉ－０）中、Ｑ１およびＱ２が、それぞれイミノ基である請求項１２記載のmicroRNA阻害剤。
  14. 下記化学式（Ｉα）の構造が、下記化学式（Ｉα２）で表される請求項１２または１３記載のmicroRNA阻害剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     前記化学式（Ｉα２）中、
    Ｒ１００は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、１個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。
  15. 前記化学式（Ｉα２）の構造が、下記化学式（Ｉα３）で表される請求項１４記載のmicroRNA阻害剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
  16. 前記化学式（Ｉ－０）中、Ｑ１１およびＱ１２が、それぞれイミノ基である請求項１１記載のmicroRNA阻害剤。
  17. 前記化学式（Ｉ－０）中、Ｑ１およびＱ２が、それぞれカルボニル基である請求項１６記載のmicroRNA阻害剤。
  18. 下記化学式（Ｉβ）の構造が、下記化学式（Ｉβ２）で表される請求項１６または１７記載のmicroRNA阻害剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     前記化学式（Ｉβ２）中、
    Ｒ１００は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、１個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。
  19. 前記化学式（Ｉβ２）の構造が、下記化学式（Ｉβ３）で表される請求項１８記載のmicroRNA阻害剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
  20. 前記リンカー残基が、アミノ酸残基を含み、前記アミノ酸残基が、下記化学式（Ｉ）で表される請求項１から３および６から１０のいずれか一項に記載のmicroRNA阻害剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     前記化学式（Ｉ）中、
    Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
    Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
    Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
    Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
    ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
    Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
    Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
    ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
    Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
    ｍは、０～３０の範囲の整数であり；
    ｎは、０～３０の範囲の整数であり；
    前記microRNAの配列に対する相補的配列は、それぞれ、－ＯＲ１－または－ＯＲ２－を介して、前記アミノ酸残基に結合し、
    前記アミノ酸残基が、前記microRNAの相補的配列の間に位置している場合は、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ）であり、
    前記アミノ酸残基が、末端に位置する前記microRNAの相補的配列の端部に位置している場合は、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、保護基またはリン酸保護基であり；
    Ａは、任意の原子団であり、ただし、下記化学式（Ｉａ）は、アミノ酸またはペプチドである。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
  21. 前記アミノ酸残基における前記アミノ酸が、天然アミノ酸および人工アミノ酸の少なくとも一方である請求項１から３、６から１０および２０のいずれか一項に記載のmicroRNA阻害剤。
  22. 前記天然アミノ酸が、タンパク質を構成するアミノ酸である請求項２１記載のmicroRNA阻害剤。
  23. 前記アミノ酸残基における前記アミノ酸が、グリシン、α－アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、ヒドロキシリシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、チロシン、バリン、プロリン、４－ヒドロキシプロリン、トリプトファン、β－アラニン、１－アミノ－２－カルボキシシクロペンタン、アミノ安息香酸、アミノピリジンカルボン酸および下記化学式（Ｉａ２）で表されるアミノ酸からなる群から選択される少なくとも１種類であり、前記アミノ酸は、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い、請求項１から３、６から１０、２０および２１のいずれか一項に記載のmicroRNA阻害剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     前記化学式（Ｉａ２）中、
    Ｒ１００は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、１個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。
  24. 前記化学式（Ｉａ２）の構造が、下記化学式（Ｉａ３）で表される請求項２３記載のmicroRNA阻害剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
  25. 前記化学式（Ｉ－０）または（Ｉ）の構造が、下記化学式（Ｉ－１）～（Ｉ－６）であり、下記化学式（Ｉ－１）～（Ｉ－６）において、ｎは、０～３０の整数、ｍは、０～３０の整数である、請求項１１または２０記載のmicroRNA阻害剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
  26. 前記化学式（Ｉ－１）において、ｎ＝１１およびｍ＝１２である、請求項２５記載のmicroRNA阻害剤。
  27. 前記化学式（Ｉ－４）において、ｎ＝５およびｍ＝４である、請求項２５記載のmicroRNA阻害剤。
  28. 前記化学式（Ｉ－６）において、ｎ＝４およびｍ＝４である、請求項２５記載のmicroRNA阻害剤。
  29. 前記相補的配列が、RNAまたはDNAである請求項１から２８のいずれか一項に記載のmicroRNA阻害剤。
  30. 下記配列番号２、４、６、１３および１５～１８のいずれかで表される請求項１から２９のいずれか一項に記載のmicroRNA阻害剤。
     
    5'-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-T-3'　　　（配列番号２）
     
    5'-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-T-3'　　　（配列番号４）
     
    5'-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-T-3'　　　（配列番号６）
     
    5'-GlyGly-CGCCAAUAUUCGAUGCUGCUA-GlyGly-CGCCAAUAUUCGAUGCUGCUA-GlyGly-CGCCAAUAUUCGAUGCUGCUA-GlyGly-U-3'　　　（配列番号１３）
     
    5'-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-T-3'　　　（配列番号１５）
     
    5'-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-T-3'　　　（配列番号１６）
     
    5'-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-T-3'　　　（配列番号１７）
     
    5'-GlyGly-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-GlyGly-T-3'　　　（配列番号１８）
     
    前記配列番号２で表される配列中のGlyは、下記化学式（Ｇ１）で表される原子団であり、ただし、５’末端に結合する塩基がない場合は、５’末端には水素原子（Ｈ）が結合しており、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
     前記化学式（Ｇ１）中のＧｌｙは、下記化学式（Ｇｌｙ）で表される原子団であり、ただし、下記化学式（Ｇｌｙ）中の末端のカルボニル炭素は、上記化学式（Ｇ１）中のＮ原子に結合しており、下記化学式（Ｇｌｙ）中の末端の窒素原子は、上記化学式（Ｇ１）のカルボニル炭素に結合しており、
     
    （Ｇｌｙ）
    ―ＨＮ－ＣＨ２－ＣＯ－
     
    前記配列番号４、６、１３または１８で表される配列中のGlyGlyは、下記化学式（Ｇ２）で表される原子団であり、ただし、５’末端に結合する塩基がない場合は、５’末端には水素原子（Ｈ）が結合しており、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
     前記化学式（Ｇ２）中のＧｌｙＧｌｙは、下記化学式（ＧｌｙＧｌｙ）で表される原子団であり、ただし、下記化学式（ＧｌｙＧｌｙ）中の末端のカルボニル炭素は、上記化学式（Ｇ２）中のＮ原子に結合しており、下記化学式（ＧｌｙＧｌｙ）中の末端の窒素原子は、上記化学式（Ｇ２）のカルボニル炭素に結合しており、
     
    （ＧｌｙＧｌｙ）
    ―ＨＮ－ＣＨ２－ＣＯ－ＨＮ－ＣＨ２－ＣＯ－
     
    前記配列番号１５、１６または１７で表される配列中のTPAは、下記化学式（TPA）で表される原子団であり、ただし、５’末端に結合する塩基がない場合は、５’末端には水素原子（Ｈ）が結合している。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
  31. 核酸分子合成用のモノマーであって、
    下記化学式（ＩＩ）の構造を有することを特徴とするモノマー。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
     前記化学式（ＩＩ）中、
    Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
    Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
    Ｒ１１およびＲ２１は、それぞれ独立して、Ｈ、保護基またはリン酸保護基であり；
    Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
    Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
    ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１1に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
    Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
    Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
    ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２1に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
    Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
    ｍは、０～３０の範囲の整数であり；
    ｎは、０～３０の範囲の整数であり；
    Ａは、下記化学式（Ａ１）または（Ａ２）で表される原子団であり；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
     前記化学式（Ａ２）中、
    Ｒ１００は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、１個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。
  32. 前記化学式（Ａ２）の構造が、下記化学式（Ａ２ａ）である請求項３１記載のモノマー。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
  33. 前記化学式（ＩＩ）の構造が、下記化学式（ＩＩ－４）、（ＩＩ－５）または（ＩＩ－６）であり、下記化学式（ＩＩ－４）、（ＩＩ－５）または（ＩＩ－６）において、ｎは、０～３０の整数、ｍは、０～３０の整数である、請求項３１記載のモノマー。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
  34. 前記化学式（ＩＩ－４）において、ｎ＝５およびｍ＝４である、請求項３３記載のモノマー。
  35. 前記化学式（ＩＩ－６）において、ｎ＝４およびｍ＝４である、請求項３３記載のモノマー。
  36. 前記化学式（ＩＩ）において、Ｌ１は、前記ポリエーテル鎖であり、前記ポリエーテル鎖が、ポリエチレングリコールである、請求項３１から３５のいずれか一項に記載のモノマー。
  37. 前記化学式（ＩＩ）において、Ｌ１の原子個数（ｎ）とＬ２の原子個数（ｍ）との合計（ｍ＋ｎ）が、０～３０の範囲である、請求項３１から３６のいずれか一項に記載のモノマー。
  38. 標識物質を含む、請求項３１から３７のいずれか一項に記載のモノマー。
  39. 安定同位体を含む、請求項３１から３８のいずれか一項に記載のモノマー。
  40. 自動核酸合成用である、請求項３１から３９のいずれか一項に記載のモノマー。
  41. 核酸分子の製造方法であって、
    請求項３１から４０のいずれか一項に記載のモノマーを使用することを特徴とする製造方法。
  42. 前記核酸分子が、請求項１から３０のいずれか一項に記載の記載のmicroRNA阻害剤である請求項４１記載の製造方法。
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