JP5536963B2 - ｍｉｃｒｏＲＮＡ阻害剤 - Google Patents
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Description
本発明は、microRNA阻害剤に関する。
microRNAは、ゲノムから転写される１８〜２５merの小さなRNAであり、標的とする遺伝子の発現を制御している。microRNAの発現異常は、ガン等の多くの疾患に深く関わっていることが分かっており、最近は、microRNAを診断および治療の標的とした研究が活発にされている。microRNAを阻害する方法としては、例えば、LNA（Locked Nucleic Acid）を用いた方法があり、欧米では臨床段階まで進んでいる。その他のmicroRNAの阻害方法としては、microRNA Spongeという技術がある（非特許文献１）。
NATURE METHODS,4:72
しかしながら、LNAを用いた方法は、特殊な修飾核酸を用いた方法であるため、汎用性に欠ける。また、microRNA Spongeは、汎用性はあるが、分解酵素によって用いるRNA分子が分解されやすいという問題がある。
そこで、本発明は、汎用性があり、かつ、分解され難いmicroRNA阻害剤の提供を目的とする。
前記目的を達成するために、本発明のmicroRNA阻害剤は、阻害の対象となるmicroRNAの配列に対する相補的配列を二つ以上有し、前記二つ以上の相補的配列が、リンカー残基を介して連結していることを特徴とする。
本発明のmicroRNA阻害剤は、特殊な修飾核酸を用いる必要がないことから汎用性に優れ、かつ、前記相補的配列がリンカー残基を介して連結されているため分解され難い。
以下、本発明について、例を挙げて詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の説明により限定されない。
本発明のmicroRNA阻害剤において、両末端に位置する前記相補的配列の端部にリンカー残基が結合していることが好ましい。この形態によれば、さらに分解を抑制することができる。
本発明のmicroRNA阻害剤において、前記リンカー残基が、アミノ酸残基、ポリアミン残基、およびポリカルボン酸残基からなる群から選択される少なくとも一つを含むことが好ましい。前記リンカー残基は、アミノ酸残基、ポリアミン残基、およびポリカルボン酸残基以外の残基を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。例えば、前記リンカー残基は、ポリカルボン酸残基、テレフタル酸残基またはアミノ酸残基のいずれかであってもよい。
本発明において、「ポリアミン」は、アミノ基を複数（２つ、または３つ以上）含む任意の化合物をいう。前記「アミノ基」は、−ＮＨ２基に限定されず、イミノ基（−ＮＨ−）も含む。本発明において、前記ポリアミンは、特に限定されないが、例えば、１，４−ジアミノベンゼン、１，３−ジアミノベンゼン、１，２−ジアミノベンゼン等が挙げられる。また、本発明において、「ポリカルボン酸」は、カルボキシ基を複数（２つ、または３つ以上）含む任意の化合物をいう。本発明において、前記ポリカルボン酸は、特に限定されないが、例えば、１，４−ジカルボキシベンゼン（テレフタル酸）、１，３−ジカルボキシベンゼン（イソフタル酸）、１，２−ジカルボキシベンゼン（フタル酸）等が挙げられる。また、本発明において、「アミノ酸」は、後述するように、分子中にアミノ基およびカルボキシ基をそれぞれ１つ以上含む任意の有機化合物をいう。前記「アミノ基」は、−ＮＨ２基に限定されず、イミノ基（−ＮＨ−）も含む。
本発明のmicroRNA阻害剤において、前記二つ以上の相補的配列の間に位置しているアミノ酸残基が、複数のアミノ酸残基が連結したものであってもよい。なお、本発明において、複数のアミノ酸残基が連結したアミノ酸残基とは、例えば、ペプチド構造を含む残基をいう。より具体的には、前記複数のアミノ酸残基が連結したアミノ酸残基は、例えば、後述する化学式（Ｉ）のアミノ酸残基において、後述する化学式（Ｉａ）がペプチド（例えば、グリシン二量体またはグリシン三量体等）であるアミノ酸残基をいう。
本発明のmicroRNA阻害剤において、前記アミノ酸残基が、グリシン残基、テレフタル酸アミド残基またはプロリン残基であってもよい。
本発明のmicroRNA阻害剤において、前記相補的配列の端部に結合したアミノ酸残基が、複数のアミノ酸残基が連結したものであってもよい。また、本発明のmicroRNA阻害剤において、前記二つ以上の相補的配列の間に位置しているアミノ酸残基、および、前記相補的配列の端部に結合したアミノ酸残基の少なくとも一方が、グリシン二量体または三量体の残基であってもよい。
本発明において、前記相補的配列は、RNAまたはDNAであってもよい。
本発明において、二つ以上の前記相補的配列を連結するアミノ酸残基は、特に制限されないが、例えば、前述のように、グリシン残基、テレフタル酸アミド残基またはプロリン残基を使用することができる。また、前記アミノ酸残基は、修飾アミノ酸残基またはアミノ酸の誘導体であってもよい。二つ以上の前記相補的配列を連結（結合）するアミノ酸残基は、一つのアミノ酸残基でもよいし、二つ以上のアミノ酸残基が連結したものであってもよい。
本発明において、前述のように、microRNA阻害剤の両末端に位置する前記相補的配列の各端部には、前記リンカー残基が連結していることが好ましい。前記リンカー残基は、例えば、アミノ酸残基であってもよい。前記アミノ酸残基は、特に制限されないが、例えば、グリシン残基、テレフタル酸アミド残基またはプロリン残基である。二つ以上の前記相補的配列を連結するアミノ酸残基は、一つのアミノ酸残基でもよいし、二つ以上のアミノ酸残基が連結したものであってもよい。
本発明において、前記相補的配列は、阻害の対象となるmicroRNAの全体または一部に対し相補的である。一部に対し相補的である場合は、microRNAのループより３´側または５´側の配列と相補的であることが好ましい。また、前記相補的配列は、microRNAのループ部分の全体または一部と相補的な配列を含んでいてもよい。前記相補的配列の数は、二つ以上であり、例えば、２〜１０、好ましくは、３〜８、より好ましくは、４〜６である。また、前記相補的配列の塩基数は、特に限定されないが、例えば、約２０〜２５塩基であっても良い。前記相補的配列は、前述のように、RNAまたはDNAのいずれであってもよく、DNAおよびRNAが混在した形態であってもよい。また、前記相補的配列を構成する核酸は、天然核酸が好ましいが、本発明はこれに制限されず、例えば、修飾核酸であってもよい。また、前記相補的配列を構成する核酸は、例えば、LNA（BNA）またはPNA等の人工核酸であっても良い。ただし、汎用性および簡便性の観点からは、前記のとおり天然核酸が好ましい。
本発明のmicroRNA阻害剤の構成の例を図１に示す。同図に示すように、本例のmicroRNA阻害剤１は、３つの相補的配列２が、二つのリンカー残基（例えば、アミノ酸残基）３で連結されており、また、両端の相補的配列２の各端部にもリンカー残基３が連結している。また、microRNAとしてhsa-miR-15aを阻害対象とした場合の本発明のmicroRNA阻害剤の配列の例を図２に示す。本例では、前記相補的配列（配列番号１）はhsa-miR-15aの全配列と相補的である。
5’-CACAAACCATGCCTGCTGCTA-3’（配列番号１）
5’-CACAAACCATGCCTGCTGCTA-3’（配列番号１）
なお、本発明のmicroRNA阻害剤において、前記相補的配列は、例えば、microRNAの全体または一部に対し完全に相補的（フルマッチ）であっても良いが、ミスマッチが存在しても良い。本発明のmicroRNA阻害剤にミスマッチが存在すると、二本鎖の核酸を切断する酵素（Dicer等）による切断が抑制されるため、さらに分解され難くなり好ましい。前記ミスマッチは、特に限定されないが、例えば、前記相補的配列の中心部分に１塩基〜数塩基のミスマッチが入っていても良いし、前記相補的配列の中心部分がBulge(ターゲット配列に対する相補配列に加え、中心部分に１塩基〜数塩基［例えば、約4塩基］ほどのエクストラ配列が入った状態)であっても良い。なお、前記相補的配列の前記「中心部分」は、前記相補的配列の末端の塩基以外であれば、特に限定されない。図３に、ミスマッチの例を、フルマッチの例と併せて模式的に示す。図３（ａ）は、フルマッチの例の模式図であり、図３（ｂ）は、前記Bulgeの例の模式図であり、図３（ｃ）は、前記相補的配列の中心部分に１塩基〜数塩基のミスマッチが入った例の模式図である。図３（ａ）〜（ｃ）の各図において、それぞれ、下側の白色の鎖が、ターゲット配列（microRNAの全体または一部）を表し、上側の黒色の鎖が、前記相補的配列を表す。なお、図３（ｂ）または（ｃ）のミスマッチの例（特に、図３（ｃ））を、Bubble型などということがある。または、図３（ａ）のフルマッチの例をPerfect型、図３（ｂ）の例をBulge型、図３（ｃ）の例をBubble型ということがある。
本発明のmicroRNA阻害剤は、例えば、化学合成によって、次のようにして製造できる。
前記化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法およびＨ−ホスホネート法等があげられる。前記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。また、前記化学合成法は、例えば、アミダイトを使用可能である。前記アミダイトは、特に制限されず、市販のアミダイトとして、例えば、ＲＮＡ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ、商品名、三千里製薬）、ＡＣＥアミダイト、ＴＯＭアミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト等があげられる。本発明のmicroRNA阻害剤については、例えば、前記アミノ酸残基の合成の際、後述する本発明のモノマーを使用することが好ましい。
本発明のmicroRNA阻害剤において、前記リンカー残基は、例えば、下記化学式（Ｉ−０）で表わされる。
前記化学式（Ｉ−０）中、
Ｑ１１およびＱ１２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２（メチレン基）、ＮＨ（イミノ基）、Ｃ＝Ｏ（カルボニル基）、Ｃ＝Ｓ（チオカルボニル基）、Ｃ＝ＮＨ（イミノメチレン基）、Ｏ、またはＳであり、
Ｑ１およびＱ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２（メチレン基）、ＮＨ（イミノ基）、Ｃ＝Ｏ（カルボニル基）、Ｃ＝Ｓ（チオカルボニル基）、Ｃ＝ＮＨ（イミノメチレン基）、Ｏ、またはＳであり、
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
前記microRNAの配列に対する相補的配列は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー残基に結合し、
前記リンカー残基が、前記microRNAの相補的配列の間に位置している場合は、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ−０）であり、
前記リンカー残基が、末端に位置する前記microRNAの相補的配列の端部に位置している場合は、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、保護基またはリン酸保護基であり；
Ａは、任意の原子団である。
Ｑ１１およびＱ１２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２（メチレン基）、ＮＨ（イミノ基）、Ｃ＝Ｏ（カルボニル基）、Ｃ＝Ｓ（チオカルボニル基）、Ｃ＝ＮＨ（イミノメチレン基）、Ｏ、またはＳであり、
Ｑ１およびＱ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２（メチレン基）、ＮＨ（イミノ基）、Ｃ＝Ｏ（カルボニル基）、Ｃ＝Ｓ（チオカルボニル基）、Ｃ＝ＮＨ（イミノメチレン基）、Ｏ、またはＳであり、
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
前記microRNAの配列に対する相補的配列は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー残基に結合し、
前記リンカー残基が、前記microRNAの相補的配列の間に位置している場合は、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ−０）であり、
前記リンカー残基が、末端に位置する前記microRNAの相補的配列の端部に位置している場合は、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、保護基またはリン酸保護基であり；
Ａは、任意の原子団である。
前記化学式（Ｉ−０）において、例えば、Ｑ１１がＣ＝Ｏ（カルボニル基）であり、Ｑ１がＮＨ（イミノ基）であってもよい。また、例えば、Ｑ１１がＮＨ（イミノ基）であり、Ｑ１がＣ＝Ｏ（カルボニル基）であってもよい。また例えば、Ｑ１２がＣ＝Ｏ（カルボニル基）であり、Ｑ２がＮＨ（イミノ基）であってもよい。また、例えば、Ｑ１２がＮＨ（イミノ基）であり、Ｑ２がＣ＝Ｏ（カルボニル基）であってもよい。
前記化学式（Ｉ−０）中、Ｑ１１およびＱ１２は、例えば、それぞれカルボニル基であってもよい。この場合において、Ｑ１およびＱ２が、それぞれイミノ基であることが好ましい。また、この場合において、下記化学式（Ｉα）の構造が、下記化学式（Ｉα２）で表されることがより好ましい。
前記化学式（Ｉα２）中、
Ｒ１００は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、１個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。Ｒ１００における前記任意の置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄにおいて例示する後述の置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル、等があげられる。また、前記化学式（Ｉα２）の構造が、下記化学式（Ｉα３）で表されることがさらに好ましい。
Ｒ１００は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、１個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。Ｒ１００における前記任意の置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄにおいて例示する後述の置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル、等があげられる。また、前記化学式（Ｉα２）の構造が、下記化学式（Ｉα３）で表されることがさらに好ましい。
なお、Ｑ１１およびＱ１２がカルボニル基であり、かつＱ１およびＱ２がイミノ基である場合、前記化学式（Ｉ−０）のリンカー残基は、カルボン酸アミド残基であるということもできるが、カルボン酸残基であるということもできる。例えば、後述の実施例における「TPA」構造は、テレフタル酸アミド残基であるということもできるが、前記化学式（Ｉα３）で表されるテレフタル酸の残基であるということもできる。
前記化学式（Ｉ−０）中、Ｑ１１およびＱ１２が、それぞれイミノ基であってもよい。この場合において、Ｑ１およびＱ２が、それぞれカルボニル基であることが好ましい。また、この場合において、下記化学式（Ｉβ）の構造が、下記化学式（Ｉβ２）で表されることがより好ましい。
前記化学式（Ｉβ２）中、
Ｒ１００は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、１個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。具体的には、例えば、前記化学式（Ｉα２）中のＲ１００と同様である。また、前記化学式（Ｉβ２）の構造が、下記化学式（Ｉβ３）で表されることがさらに好ましい。
Ｒ１００は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、１個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。具体的には、例えば、前記化学式（Ｉα２）中のＲ１００と同様である。また、前記化学式（Ｉβ２）の構造が、下記化学式（Ｉβ３）で表されることがさらに好ましい。
本発明のmicroRNA阻害剤において、前記リンカー残基が、アミノ酸残基である場合、前記アミノ酸残基は、例えば、下記化学式（Ｉ）で表わされる。なお、下記化学式（Ｉ）の構造は、前記化学式（Ｉ−０）で表される構造の一例である。
前記化学式（Ｉ）中、例えば、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
前記microRNAの配列に対する相補的配列は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記アミノ酸残基に結合し、
前記アミノ酸残基が、前記microRNAの相補的配列の間に位置している場合は、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ）であり、
前記アミノ酸残基が、末端に位置する前記microRNAの相補的配列の端部に位置している場合は、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、保護基またはリン酸保護基であり；
Ａは、任意の原子団であり、ただし、下記化学式（Ｉａ）は、アミノ酸またはペプチドである。
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
前記microRNAの配列に対する相補的配列は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記アミノ酸残基に結合し、
前記アミノ酸残基が、前記microRNAの相補的配列の間に位置している場合は、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ）であり、
前記アミノ酸残基が、末端に位置する前記microRNAの相補的配列の端部に位置している場合は、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、保護基またはリン酸保護基であり；
Ａは、任意の原子団であり、ただし、下記化学式（Ｉａ）は、アミノ酸またはペプチドである。
前記化学式（Ｉ）中、Ｘ１およびＸ２は、例えば、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨである。前記化学式（Ｉ）中において、Ｘ１がＨ２であるとは、Ｘ１が、Ｘ１の結合する炭素原子とともに、ＣＨ２（メチレン基）を形成することを意味する。Ｘ２についても同様である。
前記化学式（Ｉ）中、Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳである。
前記化学式（Ｉ−０）および（Ｉ）中、Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ１は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。前記ポリエーテル鎖は、例えば、ポリエチレングリコールである。なお、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ１がＯの場合、その酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接せず、ＯＲ１の酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接しない。
前記化学式（Ｉ−０）および（Ｉ）中、Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ２は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。なお、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ２がＯの場合、その酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接せず、ＯＲ２の酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接しない。
Ｌ１のｎおよびＬ２のｍは、特に制限されず、それぞれ、下限は、例えば、０であり、上限も、特に制限されない。ｎおよびｍは、例えば、前記アミノ酸残基の所望の長さに応じて、適宜設定できる。ｎおよびｍは、例えば、製造コストおよび収率等の点から、それぞれ、０〜３０が好ましく、より好ましくは０〜２０であり、さらに好ましくは０〜１５である。ｎとｍは、同じでもよいし（ｎ＝ｍ）、異なってもよい。ｎ＋ｍは、例えば、０〜３０であり、好ましくは０〜２０であり、より好ましくは０〜１５である。
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基であり、同一でも異なってもよい。前記置換基は、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル（ハロアルキル、例：ＣＦ３、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＨ２ＣＣｌ３）、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アルキル（例：メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル）、アルケニル（例：ビニル）、アルキニル（例：エチニル）、シクロアルキル（例：シクロプロピル、アダマンチル）、シクロアルキルアルキル（例：シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル）、シクロアルケニル（例：シクロプロペニル）、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル（例：ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル）、アルコキシアルキル（例：メトキシメチル、エトキシメチル、エトキシエチル）、アリール（例：フェニル、ナフチル）、アリールアルキル（例：ベンジル、フェネチル）、アルキルアリール（例、ｐ−メチルフェニル）、ヘテロアリール（例：ピリジル、フリル）、ヘテロアリールアルキル（例：ピリジルメチル）、ヘテロシクリル（例：ピペリジル）、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル（例：モルホリルメチル）、アルコキシ（例：メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ）、ハロゲン化アルコキシ（例：ＯＣＦ３）、アルケニルオキシ（例：ビニルオキシ、アリルオキシ）、アリールオキシ（例：フェニルオキシ）、アルキルオキシカルボニル（例：メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）、アリールアルキルオキシ（例：ベンジルオキシ）、アミノ［アルキルアミノ（例：メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ）、アシルアミノ（例：アセチルアミノ、ベンゾイルアミノ）、アリールアルキルアミノ（例：ベンジルアミノ、トリチルアミノ）、ヒドロキシアミノ］、アミノアルキル（例：アミノメチル）、アルキルアミノアルキル（例：ジエチルアミノメチル）、カルバモイル、スルファモイル、オキソ、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。これらの置換基は、１または複数のさらなる置換基またはさらなる保護基で置換されていても良い。前記さらなる置換基は、特に限定されないが、例えば、上記例示に係る置換基でも良い。前記さらなる保護基は、特に限定されないが、例えば、下記例示に係る保護基でも良い。以下において同様である。
前記保護基（または、前記さらなる保護基）は、例えば、反応性の高い官能基を不活性に変換する官能基であり、公知の保護基等があげられる。前記保護基は、例えば、文献（J. F. W. McOmie, 「Protecting Groups in Organic Chemistry」 Prenum Press, London and New York, 1973）の記載を援用できる。前記保護基は、特に制限されず、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）、ビス（２−アセトキシエチルオキシ）メチル基（ＡＣＥ）、トリイソプロピルシリルオキシメチル基（ＴＯＭ）、１−（２−シアノエトキシ）エチル基（ＣＥＥ）、２−シアノエトキシメチル基（ＣＥＭ）およびトリルスルフォニルエトキシメチル基（ＴＥＭ）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）等があげられる。この他にも、後述する化学式（Ｐ１）および（Ｐ２）のシリル含有基もあげられる。以下において同様である。
前記化学式（Ｉ−０）および（Ｉ）において、水素原子は、例えば、それぞれ独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩ等のハロゲンに置換されてもよい。
本発明のmicroRNA阻害剤において、前記相補的配列は、例えば、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー残基（例えば、アミノ酸残基）に結合する。ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよい。Ｒ１およびＲ２が存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記化学式（Ｉ−０）もしくは（Ｉ）の構造であってもよい。Ｒ１および／またはＲ２が前記ヌクレオチド残基の場合、前記リンカー残基（例えば、アミノ酸残基）は、例えば、ヌクレオチド残基Ｒ１および／またはＲ２を除く前記化学式（Ｉ−０）または（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基と、前記ヌクレオチド残基とから形成される。Ｒ１および／またはＲ２が前記化学式（Ｉ−０）または（Ｉ）の構造の場合、前記リンカー残基（例えば、アミノ酸残基）は、例えば、前記化学式（Ｉ−０）または（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基が、２つ以上連結された構造となる。前記化学式（Ｉ−０）または（Ｉ）の構造は、例えば、１個、２個、３個または４個含んでもよい。このように、前記構造を複数含む場合、前記化学式（Ｉ−０）または（Ｉ）の構造は、例えば、直接連結されてもよいし、前記ヌクレオチド残基を介して結合してもよい。他方、Ｒ１およびＲ２が存在しない場合、前記リンカー残基（例えば、アミノ酸残基）は、例えば、前記化学式（Ｉ−０）または（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基のみから形成される。
本発明において、前記化学式（Ｉ）中の原子団Ａは、特に限定されず、任意であり、ただし、前述のとおり、下記化学式（Ｉａ）が、アミノ酸またはペプチドである。
前記化学式（Ｉ）、（ＩＡ）または（Ｉａ）中の原子団Ａは、例えば、鎖式原子団、脂環式原子団、芳香族性原子団、ヘテロ芳香族性原子団、およびヘテロ脂環式原子団からなる群から選択される少なくとも一つを含んでいても含んでいなくても良い。前記鎖式原子団は、特に限定されないが、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等が挙げられる。前記脂環式原子団は、特に限定されないが、例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル等が挙げられる。前記芳香族性原子団は、特に限定されないが、例えば、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、縮環系アリール、縮環系アリールアルキル、縮環系アルキルアリール等が挙げられる。前記ヘテロ芳香族性原子団は、特に限定されないが、例えば、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリール、縮環系ヘテロアリール、縮環系ヘテロアリールアルキル、縮環系アルキルヘテロアリール等が挙げられる。また、前記化学式（Ｉ）、（ＩＡ）または（Ｉａ）中の原子団Ａにおいて、前記各原子団は、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い。前記置換基または保護基は、複数の場合は同一でも異なってもよい。前記置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル、等があげられる。前記保護基は、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した保護基と同様である。
本発明において、「アミノ酸」は、前述のとおり、分子中にアミノ基およびカルボキシ基をそれぞれ１つ以上含む任意の有機化合物をいう。前記「アミノ基」は、−ＮＨ２基に限定されず、イミノ基（−ＮＨ−）も含む。例えば、プロリン、ヒドロキシプロリン等は、分子中に−ＮＨ２基を含まず、イミノ基（−ＮＨ−）を含むが、本発明における「アミノ酸」の定義に含まれる。本発明において、前記「アミノ酸」は、後述するとおり、天然アミノ酸でもよいし、人工アミノ酸でもよい。例えば、後述する化学式（Ｉａ２）または（Ｉａ３）で表される化合物も、分子中にアミノ基およびカルボキシ基を含むため、本発明における「アミノ酸」の定義に含まれる。したがって、例えば、前記化学式（Ｉ）において、原子団Ａが、後述の化学式（Ａ２）または化学式（Ａ２ａ）で表される構造は、本発明における「アミノ酸残基」の定義に含まれる。また、例えば、後述の実施例における「TPA」構造も、本発明における「アミノ酸残基」の定義に含まれる。また、本発明において、「ペプチド」は、２分子以上のアミノ酸がペプチド結合により結合した構造の有機化合物をいう。前記ペプチド結合は、酸アミド構造でも良いし、酸イミド構造でも良い。また、前記化学式（Ｉａ）で表すアミノ酸またはペプチド分子中にアミノ基が複数存在する場合は、前記化学式（Ｉａ）中に明示しているアミノ基は、いずれのアミノ基であっても良い。また、前記化学式（Ｉａ）で表すアミノ酸またはペプチド分子中にカルボキシ基が複数存在する場合は、前記化学式（Ｉａ）中に明示しているカルボキシ基は、いずれのカルボキシ基であっても良い。
本発明のmicroRNA阻害剤の前記アミノ酸残基において、前記アミノ酸は、例えば、前述のとおり、天然アミノ酸でも良いし、人工アミノ酸であっても良い。なお、本発明において、「天然アミノ酸」は、天然に存在する構造のアミノ酸またはその光学異性体をいう。前記天然アミノ酸の製造方法は特に限定されず、例えば、天然から抽出しても良いし、合成しても良い。また、本発明において、「人工アミノ酸」は、天然に存在しない構造のアミノ酸をいう。すなわち、前記人工アミノ酸は、アミノ酸すなわちアミノ基を含むカルボン酸誘導体（分子中にアミノ基およびカルボキシ基をそれぞれ１つ以上含む有機化合物）であって、天然に存在しない構造のカルボン酸誘導体をいう。前記人工アミノ酸は、例えば、ヘテロ環を含まないことが好ましい。前記アミノ酸は、例えば、タンパク質を構成するアミノ酸であっても良い。前記アミノ酸は、例えば、グリシン、α−アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、ヒドロキシリシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、チロシン、バリン、プロリン、４−ヒドロキシプロリン、トリプトファン、β−アラニン、１−アミノ−２−カルボキシシクロペンタン、アミノ安息香酸、アミノピリジンカルボン酸および下記化学式（Ｉａ２）で表されるアミノ酸からなる群から選択される少なくとも１種類であっても良く、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い。前記置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル、等があげられる。前記保護基は、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した保護基と同様である。また、前記化学式（Ｉａ）のペプチドでないアミノ酸に、光学異性体、幾何異性体、立体異性体等の異性体が存在する場合は、いずれの異性体でも良い。
Ｒ１００は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、１個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。Ｒ１００における前記任意の置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル、等があげられる。また、前記化学式（Ｉａ２）の構造は、例えば、下記化学式（Ｉａ３）であってもよい。
なお、前記化学式（Ｉａ）の構造が、前記化学式（Ｉａ２）である場合、前記化学式（Ｉ）中の原子団Ａの構造は、下記化学式（Ａ２）で表される。下記化学式（Ａ２）中のＲ１００は、前記化学式（Ｉａ２）中のＲ１００と同じである。また、前記化学式（Ｉａ）の構造が、前記化学式（Ｉａ３）である場合、前記化学式（Ｉ）中の原子団Ａの構造は、下記化学式（Ａ２ａ）で表される。
前記化学式（Ｉ）の構造は、例えば、下記化学式（Ｉ−１）〜（Ｉ−６）が例示でき、下記化学式（Ｉ−１）〜（Ｉ−６）において、ｎおよびｍは、前記化学式（Ｉ）と同じである。
前記化学式（Ｉ−１）〜（Ｉ−６）において、ｎおよびｍは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記化学式（Ｉ−１）においてｎ＝１１およびｍ＝１２と、前記化学式（Ｉ−４）においてｎ＝５およびｍ＝４と、前記化学式（Ｉ−６）において、ｎ＝４およびｍ＝４とがあげられる。その構造を、下記化学式（Ｉ−１ａ）、（Ｉ−４ａ）および（Ｉ−６ａ）に示す。
本発明において、「アルキル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルキル基を含む。前記アルキルの炭素数は、特に制限されず、例えば、１〜３０であり、好ましくは、１〜６であり、より好ましくは、１〜４である。前記アルキル基は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル等があげられる。好ましくは、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ-ヘキシル、イソヘキシル等があげられる。
本発明において、「アルケニル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルケニルを含む。前記アルケニルは、前記アルキルにおいて、１個または複数の二重結合を有するもの等があげられる。前記アルケニルの炭素数は、特に制限されず、例えば、前記アルキルと同様であり、好ましくは２〜８である。前記アルケニルは、例えば、ビニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１，３−ブタジエニル、３−メチル−２−ブテニル等があげられる。
本発明において、「アルキニル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルキニルを含む。前記アルキニルは、前記アルキルにおいて、１個または複数の三重結合を有するもの等があげられる。前記アルキニルの炭素数は、特に制限されず、例えば、前記アルキルと同様であり、好ましくは２〜８である。前記アルキニルは、例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル等があげられる。前記アルキニルは、例えば、さらに、１個または複数の二重結合を有してもよい。
本発明において、「アリール」は、例えば、単環芳香族炭化水素基および多環芳香族炭化水素基を含む。前記単環芳香族炭化水素基は、例えば、フェニル等があげられる。前記多環芳香族炭化水素基は、例えば、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントリル、２−アントリル、９−アントリル、１−フェナントリル、２−フェナントリル、３−フェナントリル、４−フェナントリル、９−フェナントリル等があげられる。好ましくは、例えば、フェニル、１−ナフチルおよび２−ナフチル等のナフチル等があげられる。
本発明において、「ヘテロアリール」は、例えば、単環芳香族複素環式基および縮合芳香族複素環式基を含む。前記ヘテロアリールは、例えば、フリル（例：２−フリル、３−フリル）、チエニル（例：２−チエニル、３−チエニル）、ピロリル（例：１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル）、イミダゾリル（例：１−イミダゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル）、ピラゾリル（例：１−ピラゾリル、３−ピラゾリル、４−ピラゾリル）、トリアゾリル（例：１，２，４−トリアゾール−１−イル、１，２，４−トリアゾール−３−イル、１，２，４−トリアゾール−４−イル）、テトラゾリル（例：１−テトラゾリル、２−テトラゾリル、５−テトラゾリル）、オキサゾリル（例：２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、５−オキサゾリル）、イソキサゾリル（例：３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル）、チアゾリル（例：２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル）、チアジアゾリル、イソチアゾリル（例：３−イソチアゾリル、４−イソチアゾリル、５−イソチアゾリル）、ピリジル（例：２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル）、ピリダジニル（例：３−ピリダジニル、４−ピリダジニル）、ピリミジニル（例：２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、５−ピリミジニル）、フラザニル（例：３−フラザニル）、ピラジニル（例：２−ピラジニル）、オキサジアゾリル（例：１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）、ベンゾフリル（例：２−ベンゾ［ｂ］フリル、３−ベンゾ［ｂ］フリル、４−ベンゾ［ｂ］フリル、５−ベンゾ［ｂ］フリル、６−ベンゾ［ｂ］フリル、７−ベンゾ［ｂ］フリル）、ベンゾチエニル（例：２−ベンゾ［ｂ］チエニル、３−ベンゾ［ｂ］チエニル、４−ベンゾ［ｂ］チエニル、５−ベンゾ［ｂ］チエニル、６−ベンゾ［ｂ］チエニル、７−ベンゾ［ｂ］チエニル）、ベンズイミダゾリル（例：１−ベンゾイミダゾリル、２−ベンゾイミダゾリル、４−ベンゾイミダゾリル、５−ベンゾイミダゾリル）、ジベンゾフリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、キノキサリル（例：２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、６−キノキサリニル）、シンノリニル（例：３−シンノリニル、４−シンノリニル、５−シンノリニル、６−シンノリニル、７−シンノリニル、８−シンノリニル）、キナゾリル（例：２−キナゾリニル、４−キナゾリニル、５−キナゾリニル、６−キナゾリニル、７−キナゾリニル、８−キナゾリニル）、キノリル（例：２−キノリル、３−キノリル、４−キノリル、５−キノリル、６−キノリル、７−キノリル、８−キノリル）、フタラジニル（例：１−フタラジニル、５−フタラジニル、６−フタラジニル）、イソキノリル（例：１−イソキノリル、３−イソキノリル、４−イソキノリル、５−イソキノリル、６−イソキノリル、７−イソキノリル、８−イソキノリル）、プリル、プテリジニル（例：２−プテリジニル、４−プテリジニル、６−プテリジニル、７−プテリジニル）、カルバゾリル、フェナントリジニル、アクリジニル（例：１−アクリジニル、２−アクリジニル、３−アクリジニル、４−アクリジニル、９−アクリジニル）、インドリル（例：１−インドリル、２−インドリル、３−インドリル、４−インドリル、５−インドリル、６−インドリル、７−インドリル）、イソインドリル、フェナジニル（例：１−フェナジニル、２−フェナジニル）またはフェノチアジニル（例：１−フェノチアジニル、２−フェノチアジニル、３−フェノチアジニル、４−フェノチアジニル）等があげられる。
本発明において、「シクロアルキル」は、例えば、環状飽和炭化水素基であり、炭素数は、例えば、３〜１５である。前記シクロアルキルは、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、橋かけ環式炭化水素基、スピロ炭化水素基等があげられ、好ましくは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、橋かけ環式炭化水素基等があげられる。
本発明において、「橋かけ環式炭化水素基」は、例えば、ビシクロ［２．１．０］ペンチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［２．２．２］オクチルおよびビシクロ［３．２．１］オクチル、トリシクロ［２．２．１．０］ヘプチル、ビシクロ［３．３．１］ノナン、１−アダマンチル、２−アダマンチル等があげられる。
本発明において、「スピロ炭化水素基」は、例えば、スピロ［３．４］オクチル等があげられる。
本発明において、「シクロアルケニル」は、例えば、環状の不飽和脂肪族炭化水素基を包み、炭素数は、例えば、３〜７個である。前記シクロアルケニルは、例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル等があげられ、好ましくは、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等である。前記シクロアルケニルは、例えば、環中に不飽和結合を有する橋かけ環式炭化水素基およびスピロ炭化水素基も含む。
本発明において、「アリールアルキル」は、例えば、ベンジル、２−フェネチル、およびナフタレニルメチル等があげられ、「シクロアルキルアルキル」または「シクリルアルキル」は、例えば、シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル等があげられ、「ヒドロキシアルキル」は、例えば、ヒドロキシメチルおよび２−ヒドロキシエチル等があげられる。
本発明において、「アルコキシ」は、例えば、前記アルキル−Ｏ−基を含み、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、およびｎ−ブトキシ等があげられ、「アルコキシアルキル」は、例えば、メトキシメチル等があげられ、「アミノアルキル」は、例えば、２−アミノエチル等があげられる。
本発明において、「ヘテロシクリル」は、例えば、１−ピロリニル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、１−ピロリジニル、２−ピロリジニル、３−ピロリジニル、ピロリジノン、１−イミダゾリニル、２−イミダゾリニル、４−イミダゾリニル、１−イミダゾリジニル、２−イミダゾリジニル、４−イミダゾリジニル、イミダゾリジノン、１−ピラゾリニル、３−ピラゾリニル、４−ピラゾリニル、１−ピラゾリジニル、３−ピラゾリジニル、４−ピラゾリジニル、ピペリジノン、ピペリジノ、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−ピペリジニル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル、ピペラジノン、２−モルホリニル、３−モルホリニル、モルホリノ、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル等があげられる。
本発明において、「ヘテロシクリルアルキル」は、例えば、ピペリジニルメチル、ピペラジニルメチル等があげられ、「ヘテロシクリルアルケニル」は、例えば、２−ピペリジニルエテニル等があげられ、「ヘテロアリールアルキル」は、例えば、ピリジルメチルおよびキノリン−３−イルメチル等があげられる。
本発明において、「シリル」は、化学式Ｒ３Ｓｉ−で表される基を含み、Ｒは、独立して、前記アルキル、アリールおよびシクロアルキルから選択でき、例えば、トリメチルシリル基、tert-ブチルジメチルシリル基等があげられ、「シリルオキシ」は、例えば、トリメチルシリルオキシ基等があげられ、「シリルオキシアルキル」は、例えば、トリメチルシリルオキシメチル等があげられる。
本発明において、「アルキレン」は、例えば、メチレン、エチレン、およびプロピレン等があげられる。
本発明において、前述した各種基は、置換されてもよい。前記置換基は、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル（ハロアルキル、例：ＣＦ３、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＨ２ＣＣｌ３）、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アルキル（例：メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル）、アルケニル（例：ビニル）、アルキニル（例：エチニル）、シクロアルキル（例：シクロプロピル、アダマンチル）、シクロアルキルアルキル（例：シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル）、シクロアルケニル（例：シクロプロペニル）、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル（例：ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル）、アルコキシアルキル（例：メトキシメチル、エトキシメチル、エトキシエチル）、アリール（例：フェニル、ナフチル）、アリールアルキル（例：ベンジル、フェネチル）、アルキルアリール（例、ｐ−メチルフェニル）、ヘテロアリール（例：ピリジル、フリル）、ヘテロアリールアルキル（例：ピリジルメチル）、ヘテロシクリル（例：ピペリジル）、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル（例：モルホリルメチル）、アルコキシ（例：メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ）、ハロゲン化アルコキシ（例：ＯＣＦ３）、アルケニルオキシ（例：ビニルオキシ、アリルオキシ）、アリールオキシ（例：フェニルオキシ）、アルキルオキシカルボニル（例：メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）、アリールアルキルオキシ（例：ベンジルオキシ）、アミノ［アルキルアミノ（例：メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ）、アシルアミノ（例：アセチルアミノ、ベンゾイルアミノ）、アリールアルキルアミノ（例：ベンジルアミノ、トリチルアミノ）、ヒドロキシアミノ］、アミノアルキル（例：アミノメチル）、アルキルアミノアルキル（例：ジエチルアミノメチル）、カルバモイル、スルファモイル、オキソ、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。
本発明において、前記リンカー残基導入用の分子（以下「本発明のモノマー」または単に「モノマー」という。）は、例えば、下記化学式（ＩＩ−０）の構造を有していてもよい。下記化学式（ＩＩ−０）の構造を有する本発明のモノマーは、特に示さない限り、前記化学式（Ｉ−０）で表されるリンカー残基の説明を援用できる。
前記化学式（ＩＩ−０）中、
Ｑ１１およびＱ１２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２（メチレン基）、ＮＨ（イミノ基）、Ｃ＝Ｏ（カルボニル基）、Ｃ＝Ｓ（チオカルボニル基）、Ｃ＝ＮＨ（イミノメチレン基）、Ｏ、またはＳであり、
Ｑ１およびＱ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２（メチレン基）、ＮＨ（イミノ基）、Ｃ＝Ｏ（カルボニル基）、Ｃ＝Ｓ（チオカルボニル基）、Ｃ＝ＮＨ（イミノメチレン基）、Ｏ、またはＳであり、
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｒ１１およびＲ２１は、それぞれ独立して、Ｈ、保護基またはリン酸保護基であり；
Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１1に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２1に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
Ａは、任意の原子団である。
Ｑ１１およびＱ１２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２（メチレン基）、ＮＨ（イミノ基）、Ｃ＝Ｏ（カルボニル基）、Ｃ＝Ｓ（チオカルボニル基）、Ｃ＝ＮＨ（イミノメチレン基）、Ｏ、またはＳであり、
Ｑ１およびＱ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２（メチレン基）、ＮＨ（イミノ基）、Ｃ＝Ｏ（カルボニル基）、Ｃ＝Ｓ（チオカルボニル基）、Ｃ＝ＮＨ（イミノメチレン基）、Ｏ、またはＳであり、
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｒ１１およびＲ２１は、それぞれ独立して、Ｈ、保護基またはリン酸保護基であり；
Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１1に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２1に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
Ａは、任意の原子団である。
また、本発明のモノマー（前記リンカー残基導入用の分子）は、例えば、下記化学式（ＩＩ）の構造を有していてもよい。下記化学式（ＩＩ）の構造を有する本発明のモノマーは、特に示さない限り、前記化学式（Ｉ）で表されるリンカー残基（アミノ酸残基）の説明を援用できる。
前記化学式（ＩＩ）中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｒ１１およびＲ２１は、それぞれ独立して、Ｈ、保護基またはリン酸保護基であり；
Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１1に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２1に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
Ａは、任意の原子団であり、ただし、下記化学式（Ｉａ）は、アミノ酸またはペプチドである。
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｒ１１およびＲ２１は、それぞれ独立して、Ｈ、保護基またはリン酸保護基であり；
Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１1に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２1に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
Ａは、任意の原子団であり、ただし、下記化学式（Ｉａ）は、アミノ酸またはペプチドである。
前記化学式（ＩＩ−０）または（ＩＩ）で表わされる本発明のモノマーを用いれば、例えば、本発明のmicroRNA阻害剤の合成において、前記化学式（Ｉ−０）または（Ｉ）で表わされるアミノ酸残基を容易に合成できる。本発明のモノマーは、例えば、本発明のmicroRNA阻害剤の合成において、自動核酸合成用のアミダイトとして使用でき、例えば、一般的な自動核酸合成装置に適用可能である。前記合成方法は、例えば、ホスホロアミダイト法、および、Ｈ−ホスホネート法等があげられる。
前記化学式（ＩＩ−０）または（ＩＩ）において、前記化学式（Ｉ−０）または（Ｉ）と同一箇所は、前記化学式（Ｉ−０）または（Ｉ）の説明を援用できる。具体的に、前記化学式（ＩＩ−０）または（ＩＩ）において、例えば、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、Ｙ２、Ｌ１、Ｌ２、ｍ、ｎおよびＡは、前記化学式（Ｉ−０）または（Ｉ）の説明を全て援用できる。
前記化学式（ＩＩ−０）または（ＩＩ）において、Ｒ１１およびＲ２１は、前述のように、それぞれ独立して、Ｈ、保護基またはリン酸保護基である。
前記保護基は、例えば、前記化学式（Ｉ−０）または（Ｉ）における説明と同様であり、具体例として、例えば、下記群Ｉから選択できる。前記群Ｉは、ＤＭＴｒ基、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基、ＴＥＭ基、および、下記化学式（Ｐ１）または（Ｐ２）に示すシリル含有基からなる。前記保護基は、中でも、ＤＭｔｒ基および前記シリル含有基のいずれかであることが好ましい。
前記リン酸保護基は、例えば、下記化学式で表わすことができる。
−Ｐ（ＯＲ６）（ＮＲ７Ｒ８） （Ｐ３）
前記化学式（Ｐ３）において、Ｒ６は、水素原子または任意の置換基である。置換基Ｒ６は、例えば、炭化水素基が好ましく、前記炭化水素基は、電子吸引基で置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。置換基Ｒ６は、例えば、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアリール、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル等の炭化水素等があげられ、さらに、電子吸引基で置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。置換基Ｒ６は、具体的には、例えば、β−シアノエチル基、ニトロフェニルエチル基、メチル基等があげられる。
−Ｐ（ＯＲ６）（ＮＲ７Ｒ８） （Ｐ３）
前記化学式（Ｐ３）において、Ｒ６は、水素原子または任意の置換基である。置換基Ｒ６は、例えば、炭化水素基が好ましく、前記炭化水素基は、電子吸引基で置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。置換基Ｒ６は、例えば、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアリール、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル等の炭化水素等があげられ、さらに、電子吸引基で置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。置換基Ｒ６は、具体的には、例えば、β−シアノエチル基、ニトロフェニルエチル基、メチル基等があげられる。
Ｒ７およびＲ８は、それぞれ、水素原子または任意の置換基であり、同一でも異なっていてもよい。置換基Ｒ７およびＲ８は、例えば、炭化水素基が好ましく、前記炭化水素基は、さらに任意の置換基で置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。前記炭化水素基は、例えば、前述した前記Ｒ６での列挙と同様であり、好ましくは、メチル基、エチル基、イソプロピル基である。この場合、−ＮＲ７Ｒ８は、具体的には、例えば、ジイソプロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、エチルメチルアミノ基等があげられる。または、置換基Ｒ７およびＲ８が一体となって、それらが結合する窒素原子とともに（すなわち、−ＮＲ７Ｒ８が一体となって）、窒素含有環（例えば、ピペリジル基、モルホリノ基等）を形成してもよい。
前記化学式（Ｐ３）で表されるリン酸保護基の具体例としては、例えば、下記群ＩＩから選択できる。群ＩＩは、−P(OCH2CH2CN)(N(i-Pr)2)、および−P(OCH3)(N(i-Pr)2)からなる。前記化学式において、i-Prは、イソプロピルを示す。
前記化学式（ＩＩ−０）または（ＩＩ）において、例えば、Ｒ１およびＲ２は、いずれか一方が、Ｈまたは保護基であり、他方が、Ｈまたはリン酸保護基であってもよい。Ｒ１が、前記保護基の場合、Ｒ２は、Ｈまたは前記リン酸保護基が好ましい。Ｒ１が、前記群Ｉから選択される場合、Ｒ２は、Ｈまたは前記化学式（Ｐ３）で表されるリン酸保護基から選択されることが好ましく、Ｈまたは前記群ＩＩから選択されることがより好ましい。また、Ｒ１が、前記リン酸保護基の場合、Ｒ２は、Ｈまたは前記保護基が好ましい。Ｒ１が、前記化学式（Ｐ３）で表されるリン酸保護基または前記群ＩＩから選択される場合、Ｒ２は、Ｈまたは前記群Ｉから選択されることが好ましい。
前記化学式（ＩＩ−０）または（ＩＩ）の構造は、例えば、下記化学式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−６）が例示でき、下記化学式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−６）において、ｎおよびｍは、前記化学式（ＩＩ−０）または（ＩＩ）と同じである。
前記化学式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−６）において、ｎおよびｍは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記化学式（ＩＩ−１）においてｎ＝１１およびｍ＝１２と、前記化学式（ＩＩ−１）において、ｎ＝５およびｍ＝４と、前記化学式（ＩＩ−６）において、ｎ＝４およびｍ＝４とがあげられる。その構造を、下記化学式（ＩＩ−１ａ）、（ＩＩ−４ａ）および（ＩＩ−６ａ）に示す。
本発明のモノマーの製造方法は特に限定されないが、例えば、下記スキーム１のように、前記アミノ酸（Ｉａ）のアミノ基が保護基Ｒ３１で保護された化合物（Ｉｂ）から、縮合反応により下記化合物（Ｉｃ）を製造し、さらに（Ｉｃ）から（ＩＩａ）を製造し、（ＩＩａ）を（ＩＩ）に変換しても良い。ただし、下記スキーム１は例示であって、本発明は、これに制限されない。なお、下記化学式（Ｉｂ）および（Ｉｃ）において、保護基Ｒ３１は、例えば、Ｆｍｏｃ（９-フルオレニルメチルオキシカルボニル基）、Ｚ(ベンジルオキシカルボニル)またはＢＯＣ(t-ブトキシカルボニル)等が挙げられる。下記化学式（Ｉｂ）、（Ｉｃ）および（ＩＩａ）において、Ｙ１、Ｙ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｒ１１およびＲ２１は、前記化学式（ＩＩ）と同様である。なお、下記化合物（ＩＩａ）は、前記化学式（ＩＩ）において、Ｘ１がＯ、Ｘ２がＯの化合物である。下記化学式（ＩＩａ）におけるカルボニル酸素は、適宜、前記化学式（ＩＩ）におけるＸ１およびＸ２に変換しても良いし、変換する必要がなければ、下記化合物（ＩＩａ）を、そのまま化合物（ＩＩ）として用いても良い。また、前記化学式（ＩＩ−０）で表される本発明のモノマーの製造方法も、特に限定されないが、例えば、下記スキーム１の製造方法または下記スキーム１に準じた製造方法でもよい。具体的には、例えば、下記化学式（Ｉｂ）のアミノ酸に代えてポリアミンまたはポリカルボン酸等を用いる以外は下記スキーム１と同様の製造方法で、前記化学式（ＩＩ−０）で表される本発明のモノマーを製造することも可能である。
本発明のモノマーおよびその製造方法を、下記スキーム２および２ａにさらに具体的に例示する。ただし、下記スキーム２および２ａは例示であり、本発明は、これに限定されない。なお、下記スキーム２および２ａ中、「Ｆｍｏｃ」は、９-フルオレニルメチルオキシカルボニル基を表し、「ｉＰｒ」は、イソプロピル基を表し、「Ｔｒ」は、トリチル基すなわちトリフェニルメチル基を表し、「ＯＤＭＴｒ」は、４，４’−ジメトキシトリチルオキシ基を表す。以下において同様である。
本発明のモノマーは、例えば、標識物質を含むことが好ましく、中でも、安定同位体を含むことが好ましい。
本発明のモノマーが、前記安定同位体等の同位体を含む場合、例えば、簡便に、本発明のmicroRNA阻害剤分子に前記同位体を導入できる。同位体を有する前記モノマーは、例えば、前記同位体を導入したアミノ酸（Ｉａ）の原料から、合成可能である。本発明において、同位体を導入したアミノ酸（Ｉａ）の入手方法は特に限定されず、例えば、適宜な方法で製造しても良いし、市販品を入手可能であればそれを用いても良い。
前記安定同位体が導入されたアミノ酸として、例えば、重水素（Ｄ）が導入されたアミノ酸は、例えば、下記スキーム３に示すように、アミノ酸（Ｉａ）をＬｉＡｌＤ４で処理し、さらに、ＯＨ基を酸化することで製造できる。
他の安定同位体が導入されたアミノ酸として、例えば、重酸素（１８Ｏ）が導入されたアミノ酸は、例えば、下記スキーム４に示すように、塩基性条件下で、アミノ酸（Ｉａ）のメチルエステルをＨ２ １８Ｏと反応させることにより製造できる。
安定同位体が導入されたペプチドとして、例えば、重水素（Ｄ）が導入されたペプチドは、例えば、下記スキーム３ａに示すように、ペプチド結合をＬｉＡｌＤ４で処理することで製造できる。
安定同位体が導入されたペプチドとして、例えば、重酸素（１８Ｏ）が導入されたペプチドは、例えば、下記スキーム４ａに示すように、塩基性条件下で、カルボン酸のメチルエステルをＨ２ １８Ｏと反応させ、その後、下記化学式中のカルボン酸を、アミノ基またはイミノ基と縮合させてペプチド結合とすることにより製造できる。
その他、重窒素（１５Ｎ）または重炭素（１３Ｃ）等が導入されたアミノ酸またはペプチドの製造方法も、特に限定されず、適宜な方法で製造することができる。
このようにして、安定同位体が導入されたモノマーが合成可能であり、また、前記モノマーを合成用アミダイトとして使用することによって、安定同位体が前記アミノ酸残基に導入された本発明のmicroRNA阻害剤を合成可能である。なお、本発明のmicroRNA阻害剤の末端部分の構造は、核酸であっても良いが、リンカー残基であることが好ましく、アミノ酸残基（アミノ酸またはペプチド）であることがより好ましい。
また、本発明のモノマーの用途は特に限定されないが、自動核酸合成用であることが好ましい。または、本発明のモノマーは、核酸分子の製造に用いることが好ましく、前記核酸分子が、前記本発明のmicroRNA阻害剤であることがより好ましい。
以下に実施例等により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［グリシン残基［Gly］導入用分子の合成］
後述の各実施例および参考例のオリゴヌクレオチド（microRNA阻害剤）において、グリシン残基（Gly）導入用分子（本発明のモノマー）は、以下のようにして合成した。
後述の各実施例および参考例のオリゴヌクレオチド（microRNA阻害剤）において、グリシン残基（Gly）導入用分子（本発明のモノマー）は、以下のようにして合成した。
すなわち、下記スキーム５に従い、ドデカン酸アミドグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシドデカンアミドホスホロアミダイト（６）を合成した。なお、化合物（６）は、グリシン残基（Gly）導入用分子であり、前記本発明のモノマーの一例である。また、下記スキーム５中の「Ｇｌｙ」は、下記化学式で表される構造を表し、すなわち、グリシンから、アミノ基の水素１原子およびカルボキシ基のＯＨを除いた構造の原子団である。以下、「Ｇｌｙ」は、特に断らない限り、下記化学式の構造を表す。また、下記スキーム５において、ＧｌｙのＮＨ側は、Ｆｍｏｃまたはカルボニル炭素に結合し、Ｇｌｙのカルボニル炭素（ＣＯ）側は、ＯＨまたはＮ原子に結合している。
（Ｇｌｙ）
―ＨＮ−ＣＨ２−ＣＯ−
（Ｇｌｙ）
―ＨＮ−ＣＨ２−ＣＯ−
（１）１２−トリフルオロアセトアミドドデカノール（化合物１）
１２−アミノドデカノール（４．８１ｇ， ２３．９ｍｍｏｌ）及びトリフルオロ酢酸エチル（６．７９ｇ， ４７．８ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（１００ｍＬ）を室温下に終夜撹拌した。その反応混合物を減圧下に濃縮することにより、無色シロップ状の１２−トリフルオロアセトアミドドデカノール（１）（６．９８ｇ， ｑ．）を得た。
１２−アミノドデカノール（４．８１ｇ， ２３．９ｍｍｏｌ）及びトリフルオロ酢酸エチル（６．７９ｇ， ４７．８ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（１００ｍＬ）を室温下に終夜撹拌した。その反応混合物を減圧下に濃縮することにより、無色シロップ状の１２−トリフルオロアセトアミドドデカノール（１）（６．９８ｇ， ｑ．）を得た。
（２）１２−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ドデカンアミン（化合物２）
化合物１（３．００ｇ， １０．０８ｍｍｏｌ）に対し無水ピリジンを用いて３回共沸乾燥した。その共沸残渣に４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（４．３２ｇ， １２．１ｍｍｏｌ）及び無水ピリジン（５０ｍＬ）を加え、室温下に終夜撹拌した。得られた反応混合物にメタノール（１０ｍＬ）を加え室温で３０分撹拌した後、減圧下に室温で溶媒を約３０ｍＬになるまで留去した。その後、ジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で３回洗浄し、更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。このようにして得られた未精製の残渣のメタノール溶液（１００ｍＬ）に、水酸化ナトリウム（２．０２ｇ， ５０．４０ｍｍｏｌ）を加え室温で終夜撹拌した。その反応混合物を、減圧下に約３０ｍＬまで濃縮し、水（１００ｍＬ）及びジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、有機層を分取した。分取した有機層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。その後、乾燥剤（硫酸ナトリウム）をろ別し溶媒を減圧下に留去した。生成した残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９５：５）＋０．０５％ピリジン）に付し、１２−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ドデカンアミン（２）（５．１９ｇ， ｑ．）を得た。以下に、１２−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ドデカンアミン（２）の機器分析値を示す。
化合物１（３．００ｇ， １０．０８ｍｍｏｌ）に対し無水ピリジンを用いて３回共沸乾燥した。その共沸残渣に４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（４．３２ｇ， １２．１ｍｍｏｌ）及び無水ピリジン（５０ｍＬ）を加え、室温下に終夜撹拌した。得られた反応混合物にメタノール（１０ｍＬ）を加え室温で３０分撹拌した後、減圧下に室温で溶媒を約３０ｍＬになるまで留去した。その後、ジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で３回洗浄し、更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。このようにして得られた未精製の残渣のメタノール溶液（１００ｍＬ）に、水酸化ナトリウム（２．０２ｇ， ５０．４０ｍｍｏｌ）を加え室温で終夜撹拌した。その反応混合物を、減圧下に約３０ｍＬまで濃縮し、水（１００ｍＬ）及びジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、有機層を分取した。分取した有機層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。その後、乾燥剤（硫酸ナトリウム）をろ別し溶媒を減圧下に留去した。生成した残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９５：５）＋０．０５％ピリジン）に付し、１２−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ドデカンアミン（２）（５．１９ｇ， ｑ．）を得た。以下に、１２−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ドデカンアミン（２）の機器分析値を示す。
１２−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ドデカンアミン（２）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝７．４５−７．４３（２Ｈ，ｍ），７．３４−７．２５（６Ｈ，ｍ），７．２１−７．２０（１Ｈ，ｍ），６．８３−６．７９（４Ｈ，ｍ），３．７８（６Ｈ，ｓ）， ３．０４−３．０１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），２．７０−２．６７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．６１−１．５４（６Ｈ，ｍ），１．３３−１．２４（１４Ｈ，ｍ）．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝７．４５−７．４３（２Ｈ，ｍ），７．３４−７．２５（６Ｈ，ｍ），７．２１−７．２０（１Ｈ，ｍ），６．８３−６．７９（４Ｈ，ｍ），３．７８（６Ｈ，ｓ）， ３．０４−３．０１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），２．７０−２．６７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．６１−１．５４（６Ｈ，ｍ），１．３３−１．２４（１４Ｈ，ｍ）．
（３）Ｆｍｏｃ−グリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシドデカンアミド（化合物３）
Ｆｍｏｃ−グリシン（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、和光純薬工業株式会社から購入）（２．００ｇ， ６．７３ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．６６ｇ， ８．０７ｍｍｏｌ）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（２．３１ｇ， １６．１４ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（７０ｍＬ）に化合物２（４．０７ｇ， ８．０７ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（３０ｍＬ）をアルゴン雰囲気下に室温で加え、アルゴン雰囲気下に室温で終夜撹拌した。生成した沈殿をろ別し、ろ液を減圧下に３５℃で濃縮した。得られた残渣にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で３回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９５：５）＋０．０５％ピリジン）に付し、無色シロップ状のＦｍｏｃ−グリシルグリシン−４，４’−ジメトキキシトリチルオキシブチルドデカンアミド（３）（５．８８ｇ， ｑ．）を得た。
Ｆｍｏｃ−グリシン（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、和光純薬工業株式会社から購入）（２．００ｇ， ６．７３ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．６６ｇ， ８．０７ｍｍｏｌ）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（２．３１ｇ， １６．１４ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（７０ｍＬ）に化合物２（４．０７ｇ， ８．０７ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（３０ｍＬ）をアルゴン雰囲気下に室温で加え、アルゴン雰囲気下に室温で終夜撹拌した。生成した沈殿をろ別し、ろ液を減圧下に３５℃で濃縮した。得られた残渣にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で３回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９５：５）＋０．０５％ピリジン）に付し、無色シロップ状のＦｍｏｃ−グリシルグリシン−４，４’−ジメトキキシトリチルオキシブチルドデカンアミド（３）（５．８８ｇ， ｑ．）を得た。
（４）グリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシドデカンアミド（化合物４）
化合物３（５．８８ｇ， ６．７３ｍｍｏｌ）にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）及びピペリジン（４．８ｍＬ）を室温で加え、室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下に溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９：１）＋０．０５％ピリジン）に付し、グリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシドデカンアミド（４）（３．４４ｇ， ９１％）を得た。以下に、グリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシドデカンアミド（４）の機器分析値を示す。
化合物３（５．８８ｇ， ６．７３ｍｍｏｌ）にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）及びピペリジン（４．８ｍＬ）を室温で加え、室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下に溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９：１）＋０．０５％ピリジン）に付し、グリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシドデカンアミド（４）（３．４４ｇ， ９１％）を得た。以下に、グリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシドデカンアミド（４）の機器分析値を示す。
グリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシドデカンアミド（４）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝７．４７−７．４４（２Ｈ，ｍ），７．３３−７．２６（６Ｈ，ｍ），７．２１−７．２０（１Ｈ，ｍ），６．８３−６．８０（４Ｈ，ｍ），３．７９（６Ｈ，ｓ）， ３．３４（２Ｈ，ｓ），３．３０−３．２５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），３．０６−３．０２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．６４−１．５０（６Ｈ，ｍ），１．３８−１．２５（１４Ｈ，ｍ）．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝７．４７−７．４４（２Ｈ，ｍ），７．３３−７．２６（６Ｈ，ｍ），７．２１−７．２０（１Ｈ，ｍ），６．８３−６．８０（４Ｈ，ｍ），３．７９（６Ｈ，ｓ）， ３．３４（２Ｈ，ｓ），３．３０−３．２５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），３．０６−３．０２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．６４−１．５０（６Ｈ，ｍ），１．３８−１．２５（１４Ｈ，ｍ）．
（５）ヒドロキシドデカン酸アミドグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシドデカンアミド（化合物５）
化合物４（３．１５ｇ， ５．６２ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回共沸乾燥後、アルゴン雰囲気下に１２−ヒドロキシドデカン酸（３．４１ｇ， ６．７４ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１．２９ｇ， ６．７４ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（２．０６ｇ， １３．４８ｍｍｏｌ）、及び無水ジクロロメタン（５０ｍＬ）を室温で加え、１０分間撹拌した。このようにして得た混合物にトリエチルアミン（２．０５ｇ， ２０．２２ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下に室温で終夜撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え飽和重曹水で３回、更に飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を分取し硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９５：５）＋０．０５％ピリジン）に付し、無色シロップ状のヒドロキシドデカンアミドグリシン−４，４’−ジメトキキシトリチルオキシドデカンアミド（５）（２．９７ｇ， ７０％）を得た。以下に、ヒドロキシドデカンアミドグリシン−４，４’−ジメトキキシトリチルオキシドデカンアミド（５）の機器分析値を示す。
化合物４（３．１５ｇ， ５．６２ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回共沸乾燥後、アルゴン雰囲気下に１２−ヒドロキシドデカン酸（３．４１ｇ， ６．７４ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１．２９ｇ， ６．７４ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（２．０６ｇ， １３．４８ｍｍｏｌ）、及び無水ジクロロメタン（５０ｍＬ）を室温で加え、１０分間撹拌した。このようにして得た混合物にトリエチルアミン（２．０５ｇ， ２０．２２ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下に室温で終夜撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え飽和重曹水で３回、更に飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を分取し硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９５：５）＋０．０５％ピリジン）に付し、無色シロップ状のヒドロキシドデカンアミドグリシン−４，４’−ジメトキキシトリチルオキシドデカンアミド（５）（２．９７ｇ， ７０％）を得た。以下に、ヒドロキシドデカンアミドグリシン−４，４’−ジメトキキシトリチルオキシドデカンアミド（５）の機器分析値を示す。
ヒドロキシドデカンアミドグリシン−４，４’−ジメトキキシトリチルオキシドデカンアミド（５）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝７．４２−７．４０（２Ｈ，ｍ），７．３３−７．２６（６Ｈ，ｍ），７．２２−７．２１（１Ｈ，ｍ），６．８３−６．８０（４Ｈ，ｍ），３．８４（２Ｈ，ｓ），３．７９（６Ｈ，ｓ），３．６４−３．６１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．２６−３．２４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），３．０８−３．０６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），２．２８−２．２４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．６９−１．５２（１２Ｈ，ｍ），１．４４−１．３９（２６Ｈ，ｍ）．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝７．４２−７．４０（２Ｈ，ｍ），７．３３−７．２６（６Ｈ，ｍ），７．２２−７．２１（１Ｈ，ｍ），６．８３−６．８０（４Ｈ，ｍ），３．８４（２Ｈ，ｓ），３．７９（６Ｈ，ｓ），３．６４−３．６１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．２６−３．２４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），３．０８−３．０６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），２．２８−２．２４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．６９−１．５２（１２Ｈ，ｍ），１．４４−１．３９（２６Ｈ，ｍ）．
（６）ドデカン酸アミドグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシドデカンアミドホスホロアミダイト（化合物６）
化合物５（２．７８ｇ， ３．７６ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回共沸乾燥した。つぎに、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（７７２ｍｇ， ４．５１ｍｍｏｌ）を加え、減圧下に脱気してアルゴンガスを充填し、無水アセトニトリル（３ｍＬ）を加えた。さらに、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（１．３６ｇ， ４．５１ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリルジクロロメタン溶液（３ｍＬ）を加え、混合物をアルゴン雰囲気下、室温で４時間撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン（１５０ｍＬ）を加え、飽和重曹水で２回、更に飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。残渣をアミノシリカを用いたカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ｎ−ヘキサン−アセトン（７：３）＋０．０５％ピリジン）に付し、ドデカン酸アミドグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシドデカンアミドホスホロアミダイト（６）（２．７２ｇ， ７７％， ＨＰＬＣ９８．５％）を得た。以下に、ドデカン酸アミドグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシドデカンアミドホスホロアミダイト（６）の機器分析値を示す。
化合物５（２．７８ｇ， ３．７６ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回共沸乾燥した。つぎに、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（７７２ｍｇ， ４．５１ｍｍｏｌ）を加え、減圧下に脱気してアルゴンガスを充填し、無水アセトニトリル（３ｍＬ）を加えた。さらに、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（１．３６ｇ， ４．５１ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリルジクロロメタン溶液（３ｍＬ）を加え、混合物をアルゴン雰囲気下、室温で４時間撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン（１５０ｍＬ）を加え、飽和重曹水で２回、更に飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。残渣をアミノシリカを用いたカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ｎ−ヘキサン−アセトン（７：３）＋０．０５％ピリジン）に付し、ドデカン酸アミドグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシドデカンアミドホスホロアミダイト（６）（２．７２ｇ， ７７％， ＨＰＬＣ９８．５％）を得た。以下に、ドデカン酸アミドグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシドデカンアミドホスホロアミダイト（６）の機器分析値を示す。
ドデカン酸アミドグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシドデカンアミドホスホロアミダイト（６）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ＝７．４１−７．４９（ｍ， ２Ｈ）， ７．２６−７．３０（ｍ， ６Ｈ）， ７．１７−７．１９（ｍ， １Ｈ）， ６．８０−６，８３（ｍ， ４Ｈ）， ６．４６−６．６２（ｍ， ２Ｈ）， ４．０７−４．２９（ｍ， ２Ｈ）， ３．８９（ｄ， Ｊ＝５．４Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．７５−３．８７（ｍ， ４Ｈ）， ３．６７ （ｓ， ６Ｈ）， ３．４７−３．７０（ｍ， ４Ｈ）， ３．２０−３．２６（ｍ， ２Ｈ）， ３．０２（ｔ， Ｊ＝６．４Ｈｚ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．６３（ｔ， ６．４Ｈｚ， ２Ｈ， ＣＨ３）， １．５６−１．６３（ｍ， ６Ｈ）， １．４７−１．５１（ｍ， ２Ｈ）， １．２４−１．３３（ｍ， ２６Ｈ）， １．１３−１．２０（ｍ， １２Ｈ）：
Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ＝１４６．６２．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ＝７．４１−７．４９（ｍ， ２Ｈ）， ７．２６−７．３０（ｍ， ６Ｈ）， ７．１７−７．１９（ｍ， １Ｈ）， ６．８０−６，８３（ｍ， ４Ｈ）， ６．４６−６．６２（ｍ， ２Ｈ）， ４．０７−４．２９（ｍ， ２Ｈ）， ３．８９（ｄ， Ｊ＝５．４Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．７５−３．８７（ｍ， ４Ｈ）， ３．６７ （ｓ， ６Ｈ）， ３．４７−３．７０（ｍ， ４Ｈ）， ３．２０−３．２６（ｍ， ２Ｈ）， ３．０２（ｔ， Ｊ＝６．４Ｈｚ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．６３（ｔ， ６．４Ｈｚ， ２Ｈ， ＣＨ３）， １．５６−１．６３（ｍ， ６Ｈ）， １．４７−１．５１（ｍ， ２Ｈ）， １．２４−１．３３（ｍ， ２６Ｈ）， １．１３−１．２０（ｍ， １２Ｈ）：
Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ＝１４６．６２．
なお、後述の各実施例および各参考例のオリゴヌクレオチド中、「Gly」は、実際には、下記化学式（Ｇ１）で表される。すなわち、以下の各実施例および各参考例のオリゴヌクレオチドの構造式（配列）中では、簡略化のために、下記化学式（Ｇ１）中のＧｌｙ以外の部分を省略して示している。下記化学式（Ｇ１）中に記載のＮ原子は、Ｇｌｙのカルボニル炭素（ＣＯ）側に結合しており、下記化学式（Ｇ１）中に記載のカルボニル炭素は、ＧｌｙのＮＨ側に結合している。また、後述の各実施例および各参考例のオリゴヌクレオチドにおいて、Gly（すなわち下記（Ｇ１））の５’末端に結合する塩基がない（記載されていない）場合は、５’末端には水素原子（Ｈ）が結合している。
［グリシン二量体残基［GlyGly］導入用分子の合成］
後述の各実施例および参考例のオリゴヌクレオチド（microRNA阻害剤）において、グリシン二量体残基（GlyGly）導入用分子（本発明のモノマー）は、以下のようにして合成した。
後述の各実施例および参考例のオリゴヌクレオチド（microRNA阻害剤）において、グリシン二量体残基（GlyGly）導入用分子（本発明のモノマー）は、以下のようにして合成した。
すなわち、下記スキーム６に従い、へキサン酸アミドグリシルグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシブチルアミドホスホロアミダイト（１６）を合成した。なお、化合物（１６）は、グリシン二量体残基（GlyGly）導入用分子であり、前記本発明のモノマーの一例である。下記スキーム６中の「Ｇｌｙ」は、前述のとおり、下記化学式で表される構造を表し、すなわち、グリシンから、アミノ基の水素１原子およびカルボキシ基のＯＨを除いた構造の原子団である。また、下記スキーム６において、「GlyGly」は、特に断らない限り、Ｇｌｙが二つ連結してペプチド結合を形成した構造（下記）を表す。下記スキーム６において、ＧｌｙＧｌｙのＮＨ側は、Ｆｍｏｃまたはカルボニル炭素に結合し、Ｇｌｙのカルボニル炭素（ＣＯ）側は、ＯＨまたはＮ原子に結合している。
（Ｇｌｙ）
―ＨＮ−ＣＨ２−ＣＯ−
（ＧｌｙＧｌｙ）
―ＨＮ−ＣＨ２−ＣＯ−ＨＮ−ＣＨ２−ＣＯ−
（Ｇｌｙ）
―ＨＮ−ＣＨ２−ＣＯ−
（ＧｌｙＧｌｙ）
―ＨＮ−ＣＨ２−ＣＯ−ＨＮ−ＣＨ２−ＣＯ−
（１）４−トリフルオロアセトアミドブタノール（化合物１１）
４−アミノブタノール（２．５０ｇ， ２８．０５ｍｍｏｌ）及びトリフルオロ酢酸エチル（１９．９２ｇ， １４０．２６ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（１００ｍＬ）を室温下に終夜撹拌した。反応混合物を減圧下に濃縮することにより、無色シロップ状の４−トリフルオロアセトアミドブタノール（１１）（５．４４ｇ， ｑ．）を得た。
４−アミノブタノール（２．５０ｇ， ２８．０５ｍｍｏｌ）及びトリフルオロ酢酸エチル（１９．９２ｇ， １４０．２６ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（１００ｍＬ）を室温下に終夜撹拌した。反応混合物を減圧下に濃縮することにより、無色シロップ状の４−トリフルオロアセトアミドブタノール（１１）（５．４４ｇ， ｑ．）を得た。
（２）４−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ブチルアミン（化合物１２）
化合物１（４．１５ｇ， ２２．４０ｍｍｏｌ）に対し無水ピリジンを用いて３回共沸乾燥した。その共沸残渣に４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（９．６０ｇ， ２８．３ｍｍｏｌ）及び無水ピリジン（１００ｍＬ）を加え、室温下に終夜撹拌した。得られた反応混合物にメタノール（１０ｍＬ）を加え室温で３０分撹拌した後、減圧下に室温で溶媒を約２０ｍＬになるまで留去した。その後、ジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で３回洗浄し、更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。このようにして得られた未精製の残渣（９．００ｇ）のテトラヒドロフラン溶液（５０ｍＬ）に対し、水酸化ナトリウム（３．７１ｇ， ９２．７ｍｍｏｌ）の水溶液（７０ｍＬ）を加えた。この混合物を室温下で激しく撹拌しながら、テトラブチルアンモニウムフロリド３水和物（１８０ｍｇ）を加え、更に激しく室温で終夜撹拌した。得られた反応混合物に対し酢酸エチル（２００ｍＬ）及び水（１００ｍＬ）を加え有機層を分取した。水層は更に酢酸エチルで抽出し、抽出液は先に分取した有機層と併せて硫酸ナトリウムで乾燥した。その後、乾燥剤（硫酸ナトリウム）をろ別し溶媒を減圧下に留去した。生成した残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９：１）＋０．０５％ピリジン）に付し、４−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ブチルアミン（１２）（６．３６ｇ， ８７％）を得た。以下に、４−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ブチルアミン（１２）の機器分析値を示す。
化合物１（４．１５ｇ， ２２．４０ｍｍｏｌ）に対し無水ピリジンを用いて３回共沸乾燥した。その共沸残渣に４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（９．６０ｇ， ２８．３ｍｍｏｌ）及び無水ピリジン（１００ｍＬ）を加え、室温下に終夜撹拌した。得られた反応混合物にメタノール（１０ｍＬ）を加え室温で３０分撹拌した後、減圧下に室温で溶媒を約２０ｍＬになるまで留去した。その後、ジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で３回洗浄し、更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。このようにして得られた未精製の残渣（９．００ｇ）のテトラヒドロフラン溶液（５０ｍＬ）に対し、水酸化ナトリウム（３．７１ｇ， ９２．７ｍｍｏｌ）の水溶液（７０ｍＬ）を加えた。この混合物を室温下で激しく撹拌しながら、テトラブチルアンモニウムフロリド３水和物（１８０ｍｇ）を加え、更に激しく室温で終夜撹拌した。得られた反応混合物に対し酢酸エチル（２００ｍＬ）及び水（１００ｍＬ）を加え有機層を分取した。水層は更に酢酸エチルで抽出し、抽出液は先に分取した有機層と併せて硫酸ナトリウムで乾燥した。その後、乾燥剤（硫酸ナトリウム）をろ別し溶媒を減圧下に留去した。生成した残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９：１）＋０．０５％ピリジン）に付し、４−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ブチルアミン（１２）（６．３６ｇ， ８７％）を得た。以下に、４−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ブチルアミン（１２）の機器分析値を示す。
４−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ブチルアミン（２）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ＝７．４２−７．４５（ｍ， ２Ｈ）， ７．２６−７．３４（ｍ， １２Ｈ）， ７．１７−７．２０（ｍ，１Ｈ）， ６．８０−６．８４（ｍ， ４Ｈ）， ３．７９（ｓ， ６Ｈ）， ３．４８（ｓ， ２Ｈ， ＮＨ２）， ３．０６（ｔ， ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．６７（ｔ， ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ， ＣＨ２）， １．６０−１．６５（ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， １．４９−１．５５（ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ＝７．４２−７．４５（ｍ， ２Ｈ）， ７．２６−７．３４（ｍ， １２Ｈ）， ７．１７−７．２０（ｍ，１Ｈ）， ６．８０−６．８４（ｍ， ４Ｈ）， ３．７９（ｓ， ６Ｈ）， ３．４８（ｓ， ２Ｈ， ＮＨ２）， ３．０６（ｔ， ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．６７（ｔ， ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ， ＣＨ２）， １．６０−１．６５（ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， １．４９−１．５５（ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）
（１３）Ｆｍｏｃ−グリシルグリシン−４，４’−ジメトキキシトリチルオキシブチルアミド（化合物１３）
Ｆｍｏｃ−グリシルグリシン（Ｆｍｏｃ−ＧｌｙＧｌｙ−ＯＨ、Ｃｈｉｎａ Ｌａｎｇｃｈｅｍ社より購入）（２．５０ｇ， ７．０５ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．７５ｇ， ８．４６ｍｍｏｌ）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（２．５９ｇ， １６．９２ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（７０ｍＬ）に化合物１２（３．３１ｇ， ８．４６ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（５０ｍＬ）をアルゴン雰囲気下に氷冷下で加えた。氷浴を除去した後、前記混合液をアルゴン雰囲気下に室温で終夜撹拌した。生成した沈殿をろ別し、ろ液を減圧下に３５℃で濃縮した。得られた残渣にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和食塩水で２回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９５：５）＋０．０５％ピリジン、次いで、ジクロロメタン−メタノール（９：１）＋０．０５％ピリジン）に付し、無色シロップ状のＦｍｏｃ−グリシルグリシン−４，４’−ジメトキキシトリチルオキシブチルアミド（１３）（３．４９ｇ， ６８％）を得た。
Ｆｍｏｃ−グリシルグリシン（Ｆｍｏｃ−ＧｌｙＧｌｙ−ＯＨ、Ｃｈｉｎａ Ｌａｎｇｃｈｅｍ社より購入）（２．５０ｇ， ７．０５ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．７５ｇ， ８．４６ｍｍｏｌ）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（２．５９ｇ， １６．９２ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（７０ｍＬ）に化合物１２（３．３１ｇ， ８．４６ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（５０ｍＬ）をアルゴン雰囲気下に氷冷下で加えた。氷浴を除去した後、前記混合液をアルゴン雰囲気下に室温で終夜撹拌した。生成した沈殿をろ別し、ろ液を減圧下に３５℃で濃縮した。得られた残渣にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和食塩水で２回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９５：５）＋０．０５％ピリジン、次いで、ジクロロメタン−メタノール（９：１）＋０．０５％ピリジン）に付し、無色シロップ状のＦｍｏｃ−グリシルグリシン−４，４’−ジメトキキシトリチルオキシブチルアミド（１３）（３．４９ｇ， ６８％）を得た。
（１４）グリシルグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシブチルアミド（化合物１４）
化合物１３（３．００ｇ， ４．１２ｍｍｏｌ）にアセトニトリル（５ｍＬ）及びピペリジン（２．４ｍＬ）を室温で加え、室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下に溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９：１）＋０．０５％ピリジン）に付し、グリシルグリシン−４，４’−ジメトキキシトリチルオキシブチルアミド（１４）（１．１３ｇ， ５４％）を得た。以下に、グリシルグリシン−４，４’−ジメトキキシトリチルオキシブチルアミド（１４）の機器分析値を示す。
化合物１３（３．００ｇ， ４．１２ｍｍｏｌ）にアセトニトリル（５ｍＬ）及びピペリジン（２．４ｍＬ）を室温で加え、室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下に溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９：１）＋０．０５％ピリジン）に付し、グリシルグリシン−４，４’−ジメトキキシトリチルオキシブチルアミド（１４）（１．１３ｇ， ５４％）を得た。以下に、グリシルグリシン−４，４’−ジメトキキシトリチルオキシブチルアミド（１４）の機器分析値を示す。
グリシルグリシン−４，４’−ジメトキキシトリチルオキシブチルアミド（１４）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ＝７．４０−７．４２（ｍ， ２Ｈ）， ７．２５−７．３１（ｍ， １２Ｈ）， ７．１９−７．２１（ｍ，１Ｈ）， ６．８０−６．８４（ｍ， ４Ｈ）， ３．８９（ｄ， Ｊ＝５．９Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．７９（ｓ， ６Ｈ）， ３．３７（ｓ， ２Ｈ）， ３．２５（ｔ， Ｊ＝５．８Ｈｚ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．６７（ｔ， Ｊ＝５．８Ｈｚ， ２Ｈ， ＣＨ２）， １．５７−１．６５（ｍ， ４Ｈ， ＣＨ２）．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ＝７．４０−７．４２（ｍ， ２Ｈ）， ７．２５−７．３１（ｍ， １２Ｈ）， ７．１９−７．２１（ｍ，１Ｈ）， ６．８０−６．８４（ｍ， ４Ｈ）， ３．８９（ｄ， Ｊ＝５．９Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．７９（ｓ， ６Ｈ）， ３．３７（ｓ， ２Ｈ）， ３．２５（ｔ， Ｊ＝５．８Ｈｚ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．６７（ｔ， Ｊ＝５．８Ｈｚ， ２Ｈ， ＣＨ２）， １．５７−１．６５（ｍ， ４Ｈ， ＣＨ２）．
（１５）ヒドロキシへキサン酸アミドグリシルグリシン−４，４’−ジメトキキシトリチルオキシブチルアミド（化合物１５）
化合物１４（１．０７ｇ， ２．１１ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルで３回共沸乾燥後、アルゴン雰囲気下に６−ヒドロキシヘキサン酸（３３６ｍｇ， ２．５４ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（４８７ｍｇ， ２．５４ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（７７８ｍｇ， ５．０８ｍｍｏｌ）、及び無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）を室温で加え、１０分間撹拌した。このようにして得た混合物にトリエチルアミン（７７８ｍｇ， ５．０８ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下に室温で終夜撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン（１５０ｍＬ）を加え飽和重曹水で３回、更に飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を分取し硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９５：５）＋０．０５％ピリジン）に付し、無色シロップ状のヒドロキシへキサン酸アミドグリシルグリシン−４，４’−ジメトキキシトリチルオキシブチルアミド（１５）（８９０ｍｇ，６８％）を得た。以下に、ヒドロキシへキサン酸アミドグリシルグリシン−４，４’−ジメトキキシトリチルオキシブチルアミド（１５）の機器分析値を示す。
化合物１４（１．０７ｇ， ２．１１ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルで３回共沸乾燥後、アルゴン雰囲気下に６−ヒドロキシヘキサン酸（３３６ｍｇ， ２．５４ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（４８７ｍｇ， ２．５４ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（７７８ｍｇ， ５．０８ｍｍｏｌ）、及び無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）を室温で加え、１０分間撹拌した。このようにして得た混合物にトリエチルアミン（７７８ｍｇ， ５．０８ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下に室温で終夜撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン（１５０ｍＬ）を加え飽和重曹水で３回、更に飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を分取し硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９５：５）＋０．０５％ピリジン）に付し、無色シロップ状のヒドロキシへキサン酸アミドグリシルグリシン−４，４’−ジメトキキシトリチルオキシブチルアミド（１５）（８９０ｍｇ，６８％）を得た。以下に、ヒドロキシへキサン酸アミドグリシルグリシン−４，４’−ジメトキキシトリチルオキシブチルアミド（１５）の機器分析値を示す。
ヒドロキシへキサン酸アミドグリシルグリシン−４，４’−ジメトキキシトリチルオキシブチルアミド（１５）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ＝７．４１−７．４２（ｍ， ２Ｈ）， ７．２７−７．３４（ｍ， １２Ｈ）， ７．１８−７．２１（ｍ，１Ｈ）， ６．８１−６．８３（ｍ， ４Ｈ）， ３．９２（ｄ， Ｊ＝５．４３Ｈｚ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ３．８４（ｄ， Ｊ＝５．９Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．７９（ｓ， ６Ｈ）， ３．６０（ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ３．２３−３．２８（ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ３．０５−３．１０（ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．５６（ｔ， Ｊ＝７．３Ｈｚ， ２Ｈ， ＣＨ２）， １．５０−１．７２（ｍ， ８Ｈ）， １．３０−１．４５（ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ＝７．４１−７．４２（ｍ， ２Ｈ）， ７．２７−７．３４（ｍ， １２Ｈ）， ７．１８−７．２１（ｍ，１Ｈ）， ６．８１−６．８３（ｍ， ４Ｈ）， ３．９２（ｄ， Ｊ＝５．４３Ｈｚ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ３．８４（ｄ， Ｊ＝５．９Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．７９（ｓ， ６Ｈ）， ３．６０（ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ３．２３−３．２８（ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ３．０５−３．１０（ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．５６（ｔ， Ｊ＝７．３Ｈｚ， ２Ｈ， ＣＨ２）， １．５０−１．７２（ｍ， ８Ｈ）， １．３０−１．４５（ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）．
（１６）へキサン酸アミドグリシルグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシブチルアミドホスホロアミダイト（化合物１６）
化合物１５（８２４ｍｇ， １．３３ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回共沸乾燥した。つぎに、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（２７４ｍｇ， １．６０ｍｍｏｌ）を加え、減圧下に脱気してアルゴンガスを充填し、無水アセトニトリル（１ｍＬ）を加えた。さらに、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（４８２ｍｇ， １．６０ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（１ｍＬ）を加え、混合物をアルゴン雰囲気下、室温で４時間撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン（１００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で２回、更に飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。残渣をアミノシリカを用いたカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−アセトン（７：３）＋０．０５％ピリジン）に付し、へキサン酸アミドグリシルグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシブチルアミドホスホロアミダイト（１６）（９３８ｍｇ， ８６％， ＨＰＬＣ ９８．２％）を得た。以下に、へキサン酸アミドグリシルグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシブチルアミドホスホロアミダイト（１６）の機器分析値を示す。
化合物１５（８２４ｍｇ， １．３３ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回共沸乾燥した。つぎに、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（２７４ｍｇ， １．６０ｍｍｏｌ）を加え、減圧下に脱気してアルゴンガスを充填し、無水アセトニトリル（１ｍＬ）を加えた。さらに、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（４８２ｍｇ， １．６０ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（１ｍＬ）を加え、混合物をアルゴン雰囲気下、室温で４時間撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン（１００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で２回、更に飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。残渣をアミノシリカを用いたカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−アセトン（７：３）＋０．０５％ピリジン）に付し、へキサン酸アミドグリシルグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシブチルアミドホスホロアミダイト（１６）（９３８ｍｇ， ８６％， ＨＰＬＣ ９８．２％）を得た。以下に、へキサン酸アミドグリシルグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシブチルアミドホスホロアミダイト（１６）の機器分析値を示す。
へキサン酸アミドグリシルグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシブチルアミドホスホロアミダイト（１６）；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ＝７．３６−７．４７（ｍ， ３Ｈ）， ７．２４−７．３０（ｍ， ５Ｈ）， ７．１８−７．１９（ｍ，１Ｈ）， ６．８０−６．８２（ｍ， ４Ｈ）， ３．９２（ｄ， Ｊ＝４．９ Ｈｚ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ３．８４（ｄ， Ｊ＝５．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．７６（ｓ， ６Ｈ）， ３．７３−３．８５ （ｍ， ４Ｈ）， ３．５４−３．６４（ｍ， ４Ｈ）， ３．１８−３．２５ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ３．０５−３．１０（ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．６０（ｔ， Ｊ＝６．３ Ｈｚ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．２３（ｔ， ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ， ＣＨ２）， １．５５−１．６８（ｍ， ８Ｈ）， １．３０−１．４５（ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）． １．１５−１．１８（ｍ， １２Ｈ）：
Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ＝１４６．５７．
ＨＰＬＣ：Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ６．２５ｍｉｎ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＰＤ−１０ＡＶ（ＸＢｒｉｄｇｅ ＯＳＴ Ｃ１８， ４．６ｍｍ×５０ｍｍ））
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ＝７．３６−７．４７（ｍ， ３Ｈ）， ７．２４−７．３０（ｍ， ５Ｈ）， ７．１８−７．１９（ｍ，１Ｈ）， ６．８０−６．８２（ｍ， ４Ｈ）， ３．９２（ｄ， Ｊ＝４．９ Ｈｚ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ３．８４（ｄ， Ｊ＝５．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．７６（ｓ， ６Ｈ）， ３．７３−３．８５ （ｍ， ４Ｈ）， ３．５４−３．６４（ｍ， ４Ｈ）， ３．１８−３．２５ （ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ３．０５−３．１０（ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．６０（ｔ， Ｊ＝６．３ Ｈｚ， ２Ｈ， ＣＨ２）， ２．２３（ｔ， ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ， ＣＨ２）， １．５５−１．６８（ｍ， ８Ｈ）， １．３０−１．４５（ｍ， ２Ｈ， ＣＨ２）． １．１５−１．１８（ｍ， １２Ｈ）：
Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ＝１４６．５７．
ＨＰＬＣ：Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ６．２５ｍｉｎ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＰＤ−１０ＡＶ（ＸＢｒｉｄｇｅ ＯＳＴ Ｃ１８， ４．６ｍｍ×５０ｍｍ））
なお、以下の各実施例において、各実施例および各参考例のオリゴヌクレオチド中、「GlyGly」は、実際には、下記化学式（Ｇ２）で表される。すなわち、以下の各実施例および各参考例のオリゴヌクレオチドの構造式（配列）中では、簡略化のために、下記化学式（Ｇ２）中のＧｌｙＧｌｙ以外の部分を省略して示している。下記化学式（Ｇ２）中のＧｌｙＧｌｙは、前述の、Ｇｌｙが二つ連結してペプチド結合を形成した構造である。下記化学式（Ｇ２）中に記載のＮ原子は、ＧｌｙＧｌｙのカルボニル炭素（ＣＯ）側に結合しており、下記化学式（Ｇ２）中に記載のカルボニル炭素は、ＧｌｙＧｌｙのＮＨ側に結合している。また、後述の各実施例および各参考例のオリゴヌクレオチドにおいて、GlyGly（すなわち下記（Ｇ２））の５’末端に結合する塩基がない（記載されていない）場合は、５’末端には水素原子（Ｈ）が結合している。
［テレフタル酸アミド残基［TPA］導入用分子の合成］
後述の各実施例および参考例のオリゴヌクレオチド（microRNA阻害剤）において、テレフタル酸アミド残基（TPA）導入用分子であるテレフタル酸アミダイト（本発明のモノマー）は、下記スキーム７にしたがって合成した。なお、TPAは、「テレフタル酸アミド残基」と記したが、テレフタル酸残基であるということもできる。
後述の各実施例および参考例のオリゴヌクレオチド（microRNA阻害剤）において、テレフタル酸アミド残基（TPA）導入用分子であるテレフタル酸アミダイト（本発明のモノマー）は、下記スキーム７にしたがって合成した。なお、TPAは、「テレフタル酸アミド残基」と記したが、テレフタル酸残基であるということもできる。
（１） 化合物１７
４−アミノブタノール（２．５０ｇ， ２８．０５ｍｍｏｌ）及びトリフルオロ酢酸エチル（１９．９２ｇ， １４０．２２ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（１００ｍＬ）を室温下で終夜撹拌した。その反応混合物を減圧下で濃縮することにより、化合物１７（５．２０ｇ， ｑ．）を得た。
４−アミノブタノール（２．５０ｇ， ２８．０５ｍｍｏｌ）及びトリフルオロ酢酸エチル（１９．９２ｇ， １４０．２２ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（１００ｍＬ）を室温下で終夜撹拌した。その反応混合物を減圧下で濃縮することにより、化合物１７（５．２０ｇ， ｑ．）を得た。
（２） 化合物１８
化合物１７（５．２０ｇ， ２８．０５ｍｍｏｌ）及び４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（１１．４０ｇ，３３．６６ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（２０ｍＬ）を室温下で終夜撹拌した。ジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で３回洗浄し、更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。このようにして得られた未精製の残渣のメタノール溶液（１００ｍＬ）に、水酸化ナトリウム（５．６１ｇ， １４０．２３ｍｍｏｌ）を加え室温下で終夜撹拌した。その反応混合物を減圧下で濃縮し、水（２００ｍＬ）を加えた。ジクロロメタン（２００ｍＬ）で２回抽出した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。生成した残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９：１）＋０．０５％ピリジン）に付し、化合物１８（８．２０ｇ， ７５％）を得た。以下に、化合物１８の機器分析値を示す。
化合物１７（５．２０ｇ， ２８．０５ｍｍｏｌ）及び４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（１１．４０ｇ，３３．６６ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（２０ｍＬ）を室温下で終夜撹拌した。ジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で３回洗浄し、更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。このようにして得られた未精製の残渣のメタノール溶液（１００ｍＬ）に、水酸化ナトリウム（５．６１ｇ， １４０．２３ｍｍｏｌ）を加え室温下で終夜撹拌した。その反応混合物を減圧下で濃縮し、水（２００ｍＬ）を加えた。ジクロロメタン（２００ｍＬ）で２回抽出した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。生成した残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９：１）＋０．０５％ピリジン）に付し、化合物１８（８．２０ｇ， ７５％）を得た。以下に、化合物１８の機器分析値を示す。
化合物１８；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝７．４４−７．４２(２Ｈ, ｍ), ７．３４−７．２５(６Ｈ, ｍ), ７．２０(１Ｈ, ｄ, Ｊ＝７．３Ｈｚ), ６．８２(４Ｈ, ｍ), ３．７８(６Ｈ, ｓ), ３．０６(２Ｈ, ｔ, Ｊ＝６．３Ｈｚ), ２．６８(２Ｈ, ｔ, Ｊ＝７．１ Ｈｚ), １．５９(４Ｈ, ｍ).
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝７．４４−７．４２(２Ｈ, ｍ), ７．３４−７．２５(６Ｈ, ｍ), ７．２０(１Ｈ, ｄ, Ｊ＝７．３Ｈｚ), ６．８２(４Ｈ, ｍ), ３．７８(６Ｈ, ｓ), ３．０６(２Ｈ, ｔ, Ｊ＝６．３Ｈｚ), ２．６８(２Ｈ, ｔ, Ｊ＝７．１ Ｈｚ), １．５９(４Ｈ, ｍ).
（３） 化合物１９
テレフタル酸モノメチル（３．００ｇ， １６．６５ｍｍｏｌ）、４−アミノブタノール（０．８９ｇ， ９．９８ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（２．０６ｇ， ９．９８ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（３．０６ｇ， １９．９６ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（５．０５ｇ， ４９．９ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン溶液（７０ｍＬ）を還流しながら５時間撹拌した。室温まで冷却後、生成した沈殿をろ別し、ろ液を減圧下で濃縮した。残渣に酢酸エチル（５０ｍＬ）を加え、沈殿をろ別し、目的物である化合物１９を１．５２ｇ得た。ろ液は減圧下で濃縮し、トルエンで洗浄した。沈殿をろ別し、目的物である化合物１９を０．８３ｇ得た。ろ液にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で２回洗浄し、更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。そして目的物である化合物１９を０．３７ｇ得た。得られた目的物（化合物１９）を合計すると、収量２．７２ｇ，収率６５％であった。以下に、化合物１９の機器分析値を示す。
テレフタル酸モノメチル（３．００ｇ， １６．６５ｍｍｏｌ）、４−アミノブタノール（０．８９ｇ， ９．９８ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（２．０６ｇ， ９．９８ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（３．０６ｇ， １９．９６ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（５．０５ｇ， ４９．９ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン溶液（７０ｍＬ）を還流しながら５時間撹拌した。室温まで冷却後、生成した沈殿をろ別し、ろ液を減圧下で濃縮した。残渣に酢酸エチル（５０ｍＬ）を加え、沈殿をろ別し、目的物である化合物１９を１．５２ｇ得た。ろ液は減圧下で濃縮し、トルエンで洗浄した。沈殿をろ別し、目的物である化合物１９を０．８３ｇ得た。ろ液にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で２回洗浄し、更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。そして目的物である化合物１９を０．３７ｇ得た。得られた目的物（化合物１９）を合計すると、収量２．７２ｇ，収率６５％であった。以下に、化合物１９の機器分析値を示す。
化合物１９；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝８．１０−８．０７(２Ｈ, ｍ), ７．８３(２Ｈ, ｍ), ３．９４(３Ｈ, ｓ), ３．７４(２Ｈ, ｔ, Ｊ＝５．９Ｈｚ), ３．５０(２Ｈ, ｍ), １．９２(２Ｈ, ｄｄ, Ｊ＝１２．７， ３．４Ｈｚ), １．８０−１．６５(２Ｈ, ｍ)．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝８．１０−８．０７(２Ｈ, ｍ), ７．８３(２Ｈ, ｍ), ３．９４(３Ｈ, ｓ), ３．７４(２Ｈ, ｔ, Ｊ＝５．９Ｈｚ), ３．５０(２Ｈ, ｍ), １．９２(２Ｈ, ｄｄ, Ｊ＝１２．７， ３．４Ｈｚ), １．８０−１．６５(２Ｈ, ｍ)．
（４）化合物２０
化合物１９（２．３３ｇ， ９．２７ｍｍｏｌ）及び水酸化ナトリウム（１．８５ｇ，４６．３６ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（７０ｍＬ）を室温下で終夜撹拌した。その反応混合物を減圧下で濃縮し、水を加えた。さらに、２規定（２ｍｏｌ／Ｌ）塩酸により、ｐＨを２に調製した。生成した沈殿をろ別し、沈殿物を減圧下で乾燥させ、目的物である化合物２０（１．９５ｇ, ８９％）を得た。以下に、化合物２０の機器分析値を示す。
化合物１９（２．３３ｇ， ９．２７ｍｍｏｌ）及び水酸化ナトリウム（１．８５ｇ，４６．３６ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（７０ｍＬ）を室温下で終夜撹拌した。その反応混合物を減圧下で濃縮し、水を加えた。さらに、２規定（２ｍｏｌ／Ｌ）塩酸により、ｐＨを２に調製した。生成した沈殿をろ別し、沈殿物を減圧下で乾燥させ、目的物である化合物２０（１．９５ｇ, ８９％）を得た。以下に、化合物２０の機器分析値を示す。
化合物２０；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．００(２Ｈ, ｄ, Ｊ＝８．３Ｈｚ), ７．９２(２Ｈ, ｄ, Ｊ＝８．３Ｈｚ)，１．７２(２Ｈ, ｄ, Ｊ＝１２．７Ｈｚ), １．６３−１．４５(４Ｈ, ｍ), １．１５(２Ｈ, ｍ).
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝８．００(２Ｈ, ｄ, Ｊ＝８．３Ｈｚ), ７．９２(２Ｈ, ｄ, Ｊ＝８．３Ｈｚ)，１．７２(２Ｈ, ｄ, Ｊ＝１２．７Ｈｚ), １．６３−１．４５(４Ｈ, ｍ), １．１５(２Ｈ, ｍ).
（５） 化合物２１
化合物１８（３．０９ｇ， ７．８８ｍｍｏｌ）、化合物２０（１．７０ｇ， ７．１６ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．６３ｇ， ７．８８ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（２．４１ｇ， １５．７６ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（３．６２ｇ， ３５．８０ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（１７０ｍＬ）を、アルゴン雰囲気下、室温で終夜撹拌した。得られた反応混合物を減圧下で濃縮し、ジクロロメタン（３００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で３回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。残渣をトルエンでトリチレーションして、生じた沈殿をろ別し、沈殿物を減圧下で乾燥させた。このようにして、目的物である化合物２１（３．９４ｇ, ９０％）を得た。以下に、化合物２１の機器分析値を示す。
化合物１８（３．０９ｇ， ７．８８ｍｍｏｌ）、化合物２０（１．７０ｇ， ７．１６ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．６３ｇ， ７．８８ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（２．４１ｇ， １５．７６ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（３．６２ｇ， ３５．８０ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（１７０ｍＬ）を、アルゴン雰囲気下、室温で終夜撹拌した。得られた反応混合物を減圧下で濃縮し、ジクロロメタン（３００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で３回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。残渣をトルエンでトリチレーションして、生じた沈殿をろ別し、沈殿物を減圧下で乾燥させた。このようにして、目的物である化合物２１（３．９４ｇ, ９０％）を得た。以下に、化合物２１の機器分析値を示す。
化合物２１；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝７．７６−７．６７(４Ｈ, ｍ), ７．４０(２Ｈ, ｄ, Ｊ＝７．３Ｈｚ), ７．２７(６Ｈ, ｍ), ７．１９(１Ｈ, ｍ), ６．８０(４Ｈ, ｄ, Ｊ＝８．８Ｈｚ), ３．７８(６Ｈ, ｓ), ３．７３(２Ｈ, t, Ｊ＝５．９Ｈｚ), ３．４８(４Ｈ, ｍ), ３．１２(２Ｈ, ｔ, Ｊ＝５．６Ｈｚ), １．７２(８Ｈ, ｍ)．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝７．７６−７．６７(４Ｈ, ｍ), ７．４０(２Ｈ, ｄ, Ｊ＝７．３Ｈｚ), ７．２７(６Ｈ, ｍ), ７．１９(１Ｈ, ｍ), ６．８０(４Ｈ, ｄ, Ｊ＝８．８Ｈｚ), ３．７８(６Ｈ, ｓ), ３．７３(２Ｈ, t, Ｊ＝５．９Ｈｚ), ３．４８(４Ｈ, ｍ), ３．１２(２Ｈ, ｔ, Ｊ＝５．６Ｈｚ), １．７２(８Ｈ, ｍ)．
（６） 化合物２２
化合物２１（１．５０ｇ， ２．４６ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回共沸乾燥した。つぎに、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（６３０ｍｇ， ３．６８ｍｍｏｌ）を加え、減圧下で脱気してアルゴンガスを充填し、無水ジクロロメタン（１ｍＬ）を加えた。さらに、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（１．１１ｇ， ３．６８ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（１ｍＬ）を加え、混合物をアルゴン雰囲気下、室温で４時間撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で３回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、アミノシリカを用いたカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ｎ−ヘキサン−アセトン（７：３）＋０．０５％ピリジン）に付し、化合物２２（１．８６ｇ，９３％）を得た。以下に、化合物２２の機器分析値を示す。
化合物２１（１．５０ｇ， ２．４６ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回共沸乾燥した。つぎに、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（６３０ｍｇ， ３．６８ｍｍｏｌ）を加え、減圧下で脱気してアルゴンガスを充填し、無水ジクロロメタン（１ｍＬ）を加えた。さらに、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（１．１１ｇ， ３．６８ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（１ｍＬ）を加え、混合物をアルゴン雰囲気下、室温で４時間撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で３回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、アミノシリカを用いたカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ｎ−ヘキサン−アセトン（７：３）＋０．０５％ピリジン）に付し、化合物２２（１．８６ｇ，９３％）を得た。以下に、化合物２２の機器分析値を示す。
化合物２２；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝７．７４(４Ｈ, ｍ), ７．４１(２Ｈ, ｍ), ７．３１−７．２４(６Ｈ, ｍ), ７．２０(１Ｈ, ｍ), ６．８０(４Ｈ, ｍ), ３．８５−３．５６(１０Ｈ, ｍ), ３．４５(４Ｈ, ｍ), ３．１２(２Ｈ, ｔ, Ｊ＝５．９Ｈｚ), ２．６０(２Ｈ, ｄｄ, Ｊ＝１１．０, ４．６Ｈｚ), ２．１６(２Ｈ, t, Ｊ＝３．４Ｈｚ), １．７２(８Ｈ, ｔ, Ｊ＝５．９Ｈｚ)， １．１７(１２Ｈ, ｍ)．
３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ＝１４７．１０．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝７．７４(４Ｈ, ｍ), ７．４１(２Ｈ, ｍ), ７．３１−７．２４(６Ｈ, ｍ), ７．２０(１Ｈ, ｍ), ６．８０(４Ｈ, ｍ), ３．８５−３．５６(１０Ｈ, ｍ), ３．４５(４Ｈ, ｍ), ３．１２(２Ｈ, ｔ, Ｊ＝５．９Ｈｚ), ２．６０(２Ｈ, ｄｄ, Ｊ＝１１．０, ４．６Ｈｚ), ２．１６(２Ｈ, t, Ｊ＝３．４Ｈｚ), １．７２(８Ｈ, ｔ, Ｊ＝５．９Ｈｚ)， １．１７(１２Ｈ, ｍ)．
３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ＝１４７．１０．
なお、後述の各実施例および各参考例のオリゴヌクレオチド中、「TPA」は、下記化学式で表される構造である。また、後述の各実施例および各参考例のオリゴヌクレオチドにおいて、TPAの５’末端に結合する塩基がない（記載されていない）場合は、５’末端には水素原子（Ｈ）が結合している。
［実施例１］
阻害対象のmicroRNAをhsa-miR-16-5pおよびhsa-miR-122の二つとして、前述の化学合成方法により、下記のようにして、microRNA阻害剤を製造した。まず、前記相補的配列は、前記二つのmicroRNAの全配列または一部と相補的にした。また、前記相補的配列の数を３つにし、これらをグリシン残基（Gly）で連結し、両端に位置する前記相補的配列の各端部にもグリシン残基（Gly）を連結した。そして、Huh-7細胞に前記二種類のmicroRNA阻害剤を導入し、導入後24時間後に回収したmicroRNAの発現量をqPCRで確認した。その結果を図４に示す。同図に示すように、本例の二つのmicroRNA阻害剤（Sponge Oligo）は、導入しなかった場合（Normal）に比べ、優位にmicroRNAを阻害したことが分かる。
阻害対象のmicroRNAをhsa-miR-16-5pおよびhsa-miR-122の二つとして、前述の化学合成方法により、下記のようにして、microRNA阻害剤を製造した。まず、前記相補的配列は、前記二つのmicroRNAの全配列または一部と相補的にした。また、前記相補的配列の数を３つにし、これらをグリシン残基（Gly）で連結し、両端に位置する前記相補的配列の各端部にもグリシン残基（Gly）を連結した。そして、Huh-7細胞に前記二種類のmicroRNA阻害剤を導入し、導入後24時間後に回収したmicroRNAの発現量をqPCRで確認した。その結果を図４に示す。同図に示すように、本例の二つのmicroRNA阻害剤（Sponge Oligo）は、導入しなかった場合（Normal）に比べ、優位にmicroRNAを阻害したことが分かる。
なお、実施例１および後述の各実施例（参考例を含む）において、microRNA阻害剤は、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＡＢＩ Ｅｘｐｅｄｉｔｅ（登録商標） ８９０９ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムズ）により、３’側から５’側に向かって合成した。前記合成において、ＲＮＡアミダイトとしては、ＲＮＡ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ、商品名、三千里製薬）を用いた。ＤＮＡアミダイトとしては、ＤＮＡ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（三千里製薬）を用いた。また、前記ホスホロアミダイト法に用いるグリシン残基（Gly）導入用分子およびグリシン二量体残基（GlyGly）導入用分子は、後述の方法により合成した。これらグリシン残基（Gly）導入用分子およびグリシン二量体残基（GlyGly）導入用分子は、いずれも、アミダイトであり、前記本発明のモノマーに該当する。前記アミダイトの脱保護は、定法に従い、合成したmicroRNA阻害剤は、ＨＰＬＣにより精製した。
［実施例２：HCT116細胞におけるhsa-miR-16-5p(miR-16)活性に対するスポンジオリゴヌクレオチド（実施例）およびモノマーデコイオリゴヌクレオチド（参考例）の抑制効果の比較］
（１）材料
１−ａ：オリゴヌクレオチド
下記塩基配列および後述の表１に示すとおり、microRNAであるhsa-miR-16-5pの配列に対する相補的配列をGly（前記Ｇ１）またはGlyGly（前記Ｇ２）で連結したmicroRNA阻害剤を使用し、microRNA抑制効果（microRNA阻害活性）を測定した。なお、以下において、hsa-miR-16-5pを、単に「miR-16」という。また、本実施例および後述の各実施例（参考例も含む）において、microRNAは、特に断らない限り、miR-16である。
１−ａ：オリゴヌクレオチド
下記塩基配列および後述の表１に示すとおり、microRNAであるhsa-miR-16-5pの配列に対する相補的配列をGly（前記Ｇ１）またはGlyGly（前記Ｇ２）で連結したmicroRNA阻害剤を使用し、microRNA抑制効果（microRNA阻害活性）を測定した。なお、以下において、hsa-miR-16-5pを、単に「miR-16」という。また、本実施例および後述の各実施例（参考例も含む）において、microRNAは、特に断らない限り、miR-16である。
本実施例（実施例２）および以下の各実施例において、microRNAの配列に対する相補的配列を二つ以上有するmicroRNA阻害剤を「スポンジオリゴヌクレオチド」または「スポンジオリゴ」という。また、microRNAの配列に対する相補的配列を一つのみ有するmicroRNA阻害剤（参考例）を「モノマーデコイオリゴヌクレオチド」または「モノマーデコイ」という。また、本実施例（実施例２）および後述の各実施例において、「Perfect型」は、図３（ａ）のフルマッチ構造のmicroRNA阻害剤をいい、「Bulge型」は、図３（ｂ）のミスマッチ構造のmicroRNA阻害剤をいい、「Bubble型」は、図３（ｃ）のミスマッチ構造のmicroRNA阻害剤をいう。
（実施例２−１）
spo-D-3（Gly含有Bubble型スポンジオリゴ）
5'-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-T-3' （配列番号２）
（参考例２−１）
spo-D-7（Gly含有Bubble型モノマーデコイ）
5'-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-T-3' （配列番号３）
（実施例２−２）
spo-D-13（GlyGly含有Perfect型スポンジオリゴ）
5'-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-T-3' （配列番号４）
（参考例２−２）
spo-D-14（GlyGly含有Perfect型モノマーデコイ）
5'-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-T-3' （配列番号５）
（実施例２−３）
spo-D-16（GlyGly含有Bubble型スポンジオリゴ）
5'-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-T-3' （配列番号６）
（参考例２−３）
spo-D-17（GlyGly含有Bubble型モノマーデコイ）
5'-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-T-3' （配列番号７）
（実施例２−１）
spo-D-3（Gly含有Bubble型スポンジオリゴ）
5'-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-T-3' （配列番号２）
（参考例２−１）
spo-D-7（Gly含有Bubble型モノマーデコイ）
5'-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-T-3' （配列番号３）
（実施例２−２）
spo-D-13（GlyGly含有Perfect型スポンジオリゴ）
5'-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-T-3' （配列番号４）
（参考例２−２）
spo-D-14（GlyGly含有Perfect型モノマーデコイ）
5'-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-T-3' （配列番号５）
（実施例２−３）
spo-D-16（GlyGly含有Bubble型スポンジオリゴ）
5'-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-T-3' （配列番号６）
（参考例２−３）
spo-D-17（GlyGly含有Bubble型モノマーデコイ）
5'-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-T-3' （配列番号７）
上記実施例２−１〜２−３のそれぞれに対するネガティブコントロールとしては、下記参考例２−４〜２−６を使用した。
（参考例２−４）
spo-D-9（Gly含有Bubble型スポンジオリゴネガティブコントロール）
5'-Gly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-Gly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-Gly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-Gly-T-3' （配列番号８）
（参考例２−５）
spo-D-18（GlyGly含有Perfect型スポンジオリゴネガティブコントロール）
5'-GlyGly-CGCCAATATTTACGTAATTACA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTAATTACA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTAATTACA-GlyGly-T-3' （配列番号９）
（参考例２−６）
spo-D-20（GlyGly含有Bubble型スポンジオリゴネガティブコントロール）
5'-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-T-3' （配列番号１０）
（参考例２−４）
spo-D-9（Gly含有Bubble型スポンジオリゴネガティブコントロール）
5'-Gly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-Gly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-Gly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-Gly-T-3' （配列番号８）
（参考例２−５）
spo-D-18（GlyGly含有Perfect型スポンジオリゴネガティブコントロール）
5'-GlyGly-CGCCAATATTTACGTAATTACA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTAATTACA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTAATTACA-GlyGly-T-3' （配列番号９）
（参考例２−６）
spo-D-20（GlyGly含有Bubble型スポンジオリゴネガティブコントロール）
5'-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-T-3' （配列番号１０）
さらに、下記参考例２−７および２−８のmicroRNA阻害剤として、miR-16活性の抑制効果のポジティブコントロール(LNA-miR16)と、そのネガティブコントロール(LNA-Neg.Con)である以下のＬＮＡ分子（EXIQON社製）を使用した。
（参考例２−７）
hsa-miR-16 miRCURY LNA microRNA Power Inhibitor (426845-00) (LNA-miR16)
GCCAATATTTACGTGCTGCT （配列番号１１）
（参考例２−８）
miRCURY LNATM microRNA Power Antisense Control B (199021-00) (LNA-Neg.Con)
AGAGCTCCCTTCAATCCAAA （配列番号１２）
（参考例２−７）
hsa-miR-16 miRCURY LNA microRNA Power Inhibitor (426845-00) (LNA-miR16)
GCCAATATTTACGTGCTGCT （配列番号１１）
（参考例２−８）
miRCURY LNATM microRNA Power Antisense Control B (199021-00) (LNA-Neg.Con)
AGAGCTCCCTTCAATCCAAA （配列番号１２）
以上のオリゴヌクレオチドの水溶液を、濃度が１０μＭとなるように、注射用蒸留水にて調製した。
１−ｂ:細胞株及び培地
細胞株は、ヒト大腸がん細胞株であるHCT116(ATCC社)を用いた。培地は、１０％ＦＢＳを含むDMEM培地（Nacalai社）を用いて、３７℃、１０％ＣＯ２存在下で培養した。
細胞株は、ヒト大腸がん細胞株であるHCT116(ATCC社)を用いた。培地は、１０％ＦＢＳを含むDMEM培地（Nacalai社）を用いて、３７℃、１０％ＣＯ２存在下で培養した。
１−ｃ：レポータープラスミド
レポータープラスミドは、以下のレポーター遺伝子を持つプラスミドを使用した。
(1)pGL4-miR16
Promega社のpGL4.74[hRluc/TK] vectorは、図５に示すように、HSV-TKプロモーターの支配下にウミシイタケルシフェラーゼ（Renilla Luciferase）遺伝子を発現するプラスミドである。pGL4-miR16は、このvectorのルシフェラーゼ遺伝子の下流にmiR-16の標的配列を組み込んだものであり、miR-16の活性によって、ルシフェラーゼの発現量が抑制される構造になっている。
(2)pGL4-NTC
pGL4-NTCは、前記pGL4.74[hRluc/TK] vectorのルシフェラーゼ遺伝子の下流に、miR-16と反応しない非特異的配列を組み込んだものであり、pGL4-miR16に対するコントロールとして使用した。
(3)pMIR-REPORT Luciferase
Ambion社のpMIR-REPORT Luciferaseは、図６に示すようにCMVプロモーターの支配下にホタルルシフェラーゼ（FireflyLuciferase）遺伝子を発現するプラスミドである。前記pGL4-miR16または前記GL4-NTCとコトランスフェクションすることによって、トランスフェクション効率をモニターするために使用した。
レポータープラスミドは、以下のレポーター遺伝子を持つプラスミドを使用した。
(1)pGL4-miR16
Promega社のpGL4.74[hRluc/TK] vectorは、図５に示すように、HSV-TKプロモーターの支配下にウミシイタケルシフェラーゼ（Renilla Luciferase）遺伝子を発現するプラスミドである。pGL4-miR16は、このvectorのルシフェラーゼ遺伝子の下流にmiR-16の標的配列を組み込んだものであり、miR-16の活性によって、ルシフェラーゼの発現量が抑制される構造になっている。
(2)pGL4-NTC
pGL4-NTCは、前記pGL4.74[hRluc/TK] vectorのルシフェラーゼ遺伝子の下流に、miR-16と反応しない非特異的配列を組み込んだものであり、pGL4-miR16に対するコントロールとして使用した。
(3)pMIR-REPORT Luciferase
Ambion社のpMIR-REPORT Luciferaseは、図６に示すようにCMVプロモーターの支配下にホタルルシフェラーゼ（FireflyLuciferase）遺伝子を発現するプラスミドである。前記pGL4-miR16または前記GL4-NTCとコトランスフェクションすることによって、トランスフェクション効率をモニターするために使用した。
（２）方法
２−ａ：レポーター遺伝子のHCT116細胞へのトランスフェクション
前記HCT116細胞を、１×１０５／ｃｍ２の密度で６ｃｍディッシュに播種し、抗生物質を含まないDMEM培地（１０％ＦＢＳ）を用いて培養した。また、OptiMEM (Gibco社) 500μｌにpGL4-NTC(２μｇ)及びpMIR-REPORT(２μｇ)を加えたもの、またはpGL4-miR16(２μｇ)及びpMIR-REPORT(２μｇ)を加えたものを調製した（溶液Ａ）。また、別のチューブにOptiMEM 500μＬにLipofectamine 2000 (Invitrogen)を20μＬ加えたものを調製した（溶液Ｂ）。両液をよく撹拌し、室温で５分間静置した後、溶液Ａ及び溶液Ｂを混ぜ、さらに室温で２０分間静置した。この間に、前記播種した細胞の培地を新しい培地に交換した。２０分後、前記溶液Ａ及び溶液Ｂの混合液を、前記細胞を含む培養液に加え、引き続き３７℃、１０％ＣＯ２存在下で８時間培養を続けた。その後、前記細胞の培地を新しい培地に交換した。
２−ａ：レポーター遺伝子のHCT116細胞へのトランスフェクション
前記HCT116細胞を、１×１０５／ｃｍ２の密度で６ｃｍディッシュに播種し、抗生物質を含まないDMEM培地（１０％ＦＢＳ）を用いて培養した。また、OptiMEM (Gibco社) 500μｌにpGL4-NTC(２μｇ)及びpMIR-REPORT(２μｇ)を加えたもの、またはpGL4-miR16(２μｇ)及びpMIR-REPORT(２μｇ)を加えたものを調製した（溶液Ａ）。また、別のチューブにOptiMEM 500μＬにLipofectamine 2000 (Invitrogen)を20μＬ加えたものを調製した（溶液Ｂ）。両液をよく撹拌し、室温で５分間静置した後、溶液Ａ及び溶液Ｂを混ぜ、さらに室温で２０分間静置した。この間に、前記播種した細胞の培地を新しい培地に交換した。２０分後、前記溶液Ａ及び溶液Ｂの混合液を、前記細胞を含む培養液に加え、引き続き３７℃、１０％ＣＯ２存在下で８時間培養を続けた。その後、前記細胞の培地を新しい培地に交換した。
２−ｂ：スポンジオリゴ、モノマーデコイまたはＬＮＡのHCT116細胞へのトランスフェクション
前記レポーター遺伝子をトランスフェクションしたHCT116細胞を回収し、５×１０４ウエルになるように、２４ウェルデイッシュに播種した。次に、前記pGL4-NTC及びpMIR-REPORTをトランスフェクションした細胞または前記pGL4-miR16及びpMIR-REPORTをトランスフェクションした細胞それぞれに対して、スポンジオリゴ、モノマーデコイ、またはＬＮＡのトランスフェクションを行った。まず、OptiMEM ５０μＬに１０μＭの前記スポンジオリゴ溶液、前記ＬＮＡ溶液を１．２５μＬ、または１０μＭの前記モノマーデコイ溶液を３．７５μＬ加え、溶液Ｃを作成した。また、OptiMEM ５０μＬにLipofectamine RNAiMAX (Invitrogen社)を２μＬ加え、溶液Ｄを調製した。溶液Ｃ及び溶液Ｄをそれぞれ、室温で５分間静置した後、溶液Ｃ及び溶液Ｄを混ぜ、さらに室温で２０分間静置した。この間に、前記播種した細胞の培地を新しい培地に交換した。２０分後、溶液Ｃ、溶液Ｄの混合液を、前記レポーター遺伝子をトランスフェクションしたHCT116細胞を含む培養液に加え、引き続き３７℃、１０％ＣＯ２存在下で２４時間培養を続けた。その後、前記細胞の培地を新しい培地に交換した。このトランスフェクションにより、スポンジオリゴまたはＬＮＡの終濃度は、２５ｎＭ、モノマーデコイの終濃度は、７５ｎＭとなっている。
前記レポーター遺伝子をトランスフェクションしたHCT116細胞を回収し、５×１０４ウエルになるように、２４ウェルデイッシュに播種した。次に、前記pGL4-NTC及びpMIR-REPORTをトランスフェクションした細胞または前記pGL4-miR16及びpMIR-REPORTをトランスフェクションした細胞それぞれに対して、スポンジオリゴ、モノマーデコイ、またはＬＮＡのトランスフェクションを行った。まず、OptiMEM ５０μＬに１０μＭの前記スポンジオリゴ溶液、前記ＬＮＡ溶液を１．２５μＬ、または１０μＭの前記モノマーデコイ溶液を３．７５μＬ加え、溶液Ｃを作成した。また、OptiMEM ５０μＬにLipofectamine RNAiMAX (Invitrogen社)を２μＬ加え、溶液Ｄを調製した。溶液Ｃ及び溶液Ｄをそれぞれ、室温で５分間静置した後、溶液Ｃ及び溶液Ｄを混ぜ、さらに室温で２０分間静置した。この間に、前記播種した細胞の培地を新しい培地に交換した。２０分後、溶液Ｃ、溶液Ｄの混合液を、前記レポーター遺伝子をトランスフェクションしたHCT116細胞を含む培養液に加え、引き続き３７℃、１０％ＣＯ２存在下で２４時間培養を続けた。その後、前記細胞の培地を新しい培地に交換した。このトランスフェクションにより、スポンジオリゴまたはＬＮＡの終濃度は、２５ｎＭ、モノマーデコイの終濃度は、７５ｎＭとなっている。
２−ｃ：活性測定
前記スポンジオリゴ、モノマーデコイ、またはＬＮＡを、トランスフェクションしてから４８時間後、それぞれの細胞内のルシフェラーゼ活性をDual-Luciferase（登録商標） Reporter Assay System(Promega社)を使用して、添付のプロトコールに従って測定した。測定機器は、Berthold Centro 960(Berthold社)を用いた。
前記スポンジオリゴ、モノマーデコイ、またはＬＮＡを、トランスフェクションしてから４８時間後、それぞれの細胞内のルシフェラーゼ活性をDual-Luciferase（登録商標） Reporter Assay System(Promega社)を使用して、添付のプロトコールに従って測定した。測定機器は、Berthold Centro 960(Berthold社)を用いた。
２−ｄ：活性の解析
上述のように、pMIR-REPORT由来のホタルルシフェラーゼはトランスフェクション効率を反映し、pGL4-NTCおよびpGL4-miR16由来のウミシイタケルシフェラーゼはmiR-16の活性を反映する。従って、ウミシイタケルシフェラーゼの活性値（ＡpGL4-NTCまたはＡpGL4-miR16）をホタルルシフェラーゼの活性値（ＡpMIR-REPORT（NTC）またはＡpMIR-REPORT（miR-16））で割ると、標準化されたウミシイタケルシフェラーゼ活性値を得る。pGL4-NTC由来の標準化されたウミシイタケルシフェラーゼ活性値を１とした時のpGL4-miR16由来のウミシイタケルシフェラーゼ活性値がmiR-16によって抑制された値となる。従って、それぞれのスポンジオリゴ、モノマーデコイ、またはＬＮＡに対して、以下の計算式でmiR-16活性抑制効果の値を得た。
上述のように、pMIR-REPORT由来のホタルルシフェラーゼはトランスフェクション効率を反映し、pGL4-NTCおよびpGL4-miR16由来のウミシイタケルシフェラーゼはmiR-16の活性を反映する。従って、ウミシイタケルシフェラーゼの活性値（ＡpGL4-NTCまたはＡpGL4-miR16）をホタルルシフェラーゼの活性値（ＡpMIR-REPORT（NTC）またはＡpMIR-REPORT（miR-16））で割ると、標準化されたウミシイタケルシフェラーゼ活性値を得る。pGL4-NTC由来の標準化されたウミシイタケルシフェラーゼ活性値を１とした時のpGL4-miR16由来のウミシイタケルシフェラーゼ活性値がmiR-16によって抑制された値となる。従って、それぞれのスポンジオリゴ、モノマーデコイ、またはＬＮＡに対して、以下の計算式でmiR-16活性抑制効果の値を得た。
（３）結果
得られた結果を図７〜９に示す。なお、図７〜９における縦軸は、miR-16活性抑制効果（活性阻害効果または活性抑制能ともいう）を表す。後述の図１０〜２１においても同じである。図７はGly含有Bubble型スポンジオリゴ（実施例２−１）、図８はGlyGly含有Perfect型スポンジオリゴ（実施例２−２）、図９はGlyGly含有Bubble型スポンジオリゴ（実施例２−３）を用いた結果である。図示のとおり、いずれの場合も、スポンジオリゴはＬＮＡに匹敵するmiR-16活性抑制能を持つことが示された。さらに、本実施例のスポンジオリゴは、その構造上、ＬＮＡと比較して、きわめて簡便性に優れ、かつ汎用性が高いという利点を有する。また、本実施例では、スポンジオリゴとモノマーデコイのmiR-16結合配列の配列数を同数とするために、スポンジオリゴの３倍の濃度のモノマーデコイを用いたが、スポンジオリゴの方がモノマーデコイよりも高いmiR-16活性抑制能を持つことが示された。このことは、スポンジオリゴ上で、miRNAの結合が協調的に起こっていることを示している。
得られた結果を図７〜９に示す。なお、図７〜９における縦軸は、miR-16活性抑制効果（活性阻害効果または活性抑制能ともいう）を表す。後述の図１０〜２１においても同じである。図７はGly含有Bubble型スポンジオリゴ（実施例２−１）、図８はGlyGly含有Perfect型スポンジオリゴ（実施例２−２）、図９はGlyGly含有Bubble型スポンジオリゴ（実施例２−３）を用いた結果である。図示のとおり、いずれの場合も、スポンジオリゴはＬＮＡに匹敵するmiR-16活性抑制能を持つことが示された。さらに、本実施例のスポンジオリゴは、その構造上、ＬＮＡと比較して、きわめて簡便性に優れ、かつ汎用性が高いという利点を有する。また、本実施例では、スポンジオリゴとモノマーデコイのmiR-16結合配列の配列数を同数とするために、スポンジオリゴの３倍の濃度のモノマーデコイを用いたが、スポンジオリゴの方がモノマーデコイよりも高いmiR-16活性抑制能を持つことが示された。このことは、スポンジオリゴ上で、miRNAの結合が協調的に起こっていることを示している。
［実施例３：HCT116細胞におけるmiR-16活性に対するＤＮＡ型スポンジオリゴとRNA型スポンジオリゴの抑制効果］
（１）材料
1-a:オリゴヌクレオチド
下記配列および後述の表２に示すとおり、miR-16対する相補的配列をGlyGly（前記Ｇ２）で連結したmicroRNA阻害剤を使用し、microRNA抑制効果（microRNA阻害活性）を測定した。
（実施例３−１）
spo-D-16（GlyGly含有Bubble型DNAスポンジオリゴ）
5'-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-T-3' （配列番号６）
（実施例３−２）
spo-R-16（GlyGly含有Bubble型RNAスポンジオリゴ）
5'-GlyGly-CGCCAAUAUUCGAUGCUGCUA-GlyGly-CGCCAAUAUUCGAUGCUGCUA-GlyGly-CGCCAAUAUUCGAUGCUGCUA-GlyGly-U-3' （配列番号１３）
またそれぞれに対する以下のネガティブコントロールオリゴを使用した。
（参考例３−１）
spo-D-20（GlyGly含有Bubble型DNAスポンジオリゴネガティブコントロール）
5'-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-T-3' （配列番号１０）
（参考例３−２）
spo-R-20（GlyGly含有Bubble型RNAスポンジオリゴネガティブコントロール）
5'-GlyGly-CGCCAAUAUUCCAUUAUAAGA-GlyGly-CGCCAAUAUUCCAUUAUAAGA-GlyGly-CGCCAAUAUUCCAUUAUAAGA-GlyGly-U-3' （配列番号１４）
1-a:オリゴヌクレオチド
下記配列および後述の表２に示すとおり、miR-16対する相補的配列をGlyGly（前記Ｇ２）で連結したmicroRNA阻害剤を使用し、microRNA抑制効果（microRNA阻害活性）を測定した。
（実施例３−１）
spo-D-16（GlyGly含有Bubble型DNAスポンジオリゴ）
5'-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-T-3' （配列番号６）
（実施例３−２）
spo-R-16（GlyGly含有Bubble型RNAスポンジオリゴ）
5'-GlyGly-CGCCAAUAUUCGAUGCUGCUA-GlyGly-CGCCAAUAUUCGAUGCUGCUA-GlyGly-CGCCAAUAUUCGAUGCUGCUA-GlyGly-U-3' （配列番号１３）
またそれぞれに対する以下のネガティブコントロールオリゴを使用した。
（参考例３−１）
spo-D-20（GlyGly含有Bubble型DNAスポンジオリゴネガティブコントロール）
5'-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-T-3' （配列番号１０）
（参考例３−２）
spo-R-20（GlyGly含有Bubble型RNAスポンジオリゴネガティブコントロール）
5'-GlyGly-CGCCAAUAUUCCAUUAUAAGA-GlyGly-CGCCAAUAUUCCAUUAUAAGA-GlyGly-CGCCAAUAUUCCAUUAUAAGA-GlyGly-U-3' （配列番号１４）
さらに、下記参考例３−３および３−４のmicroRNA阻害剤として、miR-16活性の抑制効果のポジティブコントロール(LNA-miR16)と、そのネガティブコントロール(LNA-Neg.Con)である以下のＬＮＡ分子（EXIQON社製）を使用した。なお、参考例３−３は、前記参考例２−７と同じであり、参考例３−４は、前記参考例２−８と同じである。
（参考例３−３）
LNA-miR16 GCCAATATTTACGTGCTGCT （配列番号１１）
（参考例３−４）
LNA-Neg.Con AGAGCTCCCTTCAATCCAAA （配列番号１２）
（参考例３−３）
LNA-miR16 GCCAATATTTACGTGCTGCT （配列番号１１）
（参考例３−４）
LNA-Neg.Con AGAGCTCCCTTCAATCCAAA （配列番号１２）
以上のオリゴヌクレオチドの水溶液を、１０μＭとなるように、注射用蒸留水を用いて調製した。
１−ｂ：細胞株
細胞株および培地は、実施例２と同じ細胞株及び培地を利用した。
細胞株および培地は、実施例２と同じ細胞株及び培地を利用した。
１−ｃ:レポータープラスミド
レポータープラスミドは、実施例２と同じレポーター遺伝子を持つプラスミドを使用した。
レポータープラスミドは、実施例２と同じレポーター遺伝子を持つプラスミドを使用した。
（２）方法
２−ａ：レポーター遺伝子のHCT116細胞へのトランスフェクション
HCT116細胞を用いて、実施例２と同様の方法で、レポーター遺伝子プラスミドpGL4-NTC(２μｇ)およびpMIR-REPORT(２μｇ)を、またはpGL4-miR16(２μｇ)およびpMIR-REPORT(２μｇ)を、それぞれHCT116細胞へトランスフェクションした。
２−ａ：レポーター遺伝子のHCT116細胞へのトランスフェクション
HCT116細胞を用いて、実施例２と同様の方法で、レポーター遺伝子プラスミドpGL4-NTC(２μｇ)およびpMIR-REPORT(２μｇ)を、またはpGL4-miR16(２μｇ)およびpMIR-REPORT(２μｇ)を、それぞれHCT116細胞へトランスフェクションした。
２−ｂ：スポンジオリゴ、ＬＮＡの細胞へのトランスフェクション
前記レポーター遺伝子をトランスフェクションした細胞に対して、（実施例Ａ２）と同様の方法で、スポンジオリゴまたはＬＮＡのトランスフェクションを行った。このトランスフェクションにより、スポンジオリゴ及びLNAは終濃度が２５ｎＭになっている。
前記レポーター遺伝子をトランスフェクションした細胞に対して、（実施例Ａ２）と同様の方法で、スポンジオリゴまたはＬＮＡのトランスフェクションを行った。このトランスフェクションにより、スポンジオリゴ及びLNAは終濃度が２５ｎＭになっている。
２−ｃ：活性測定
前記スポンジオリゴまたはＬＮＡをトランスフェクションしてから４８時間後、それぞれの細胞内のルシフェラーゼ活性をDual-Luciferase（登録商標） Reporter Assay System (Promega社)を使用して、添付のプロトコールに従って測定した。測定機器は、Berthold Centro 960 (Berthold社)を用いた。
前記スポンジオリゴまたはＬＮＡをトランスフェクションしてから４８時間後、それぞれの細胞内のルシフェラーゼ活性をDual-Luciferase（登録商標） Reporter Assay System (Promega社)を使用して、添付のプロトコールに従って測定した。測定機器は、Berthold Centro 960 (Berthold社)を用いた。
２−ｄ：活性の解析
実施例２と同様の方法によりmiR-16活性抑制効果の値を得た。
実施例２と同様の方法によりmiR-16活性抑制効果の値を得た。
（３）結果
得られた結果を図１０に示す。図示のとおり、実施例のＤＮＡ型スポンジオリゴおよびＲＮＡ型スポンジオリゴのいずれも、ネガティブコントロールと比較してきわめて高いmiR-16活性抑制能を有していた。さらに、本実施例のＤＮＡ型スポンジオリゴおよびＲＮＡ型スポンジオリゴのいずれも、その構造上、ＬＮＡと比較して、きわめて簡便性に優れ、かつ汎用性が高いという利点を有する。さらに、それに加え、本実施例のＤＮＡ型スポンジオリゴは、miR-16活性抑制能がＲＮＡ型スポンジオリゴよりも高く、ＬＮＡに匹敵する高いmiR-16活性抑制能を持つことが示された。
得られた結果を図１０に示す。図示のとおり、実施例のＤＮＡ型スポンジオリゴおよびＲＮＡ型スポンジオリゴのいずれも、ネガティブコントロールと比較してきわめて高いmiR-16活性抑制能を有していた。さらに、本実施例のＤＮＡ型スポンジオリゴおよびＲＮＡ型スポンジオリゴのいずれも、その構造上、ＬＮＡと比較して、きわめて簡便性に優れ、かつ汎用性が高いという利点を有する。さらに、それに加え、本実施例のＤＮＡ型スポンジオリゴは、miR-16活性抑制能がＲＮＡ型スポンジオリゴよりも高く、ＬＮＡに匹敵する高いmiR-16活性抑制能を持つことが示された。
なお、本実施例では、前述のとおり、ＤＮＡ型スポンジオリゴの方が、ＲＮＡ型スポンジオリゴよりもmicroRNA活性抑制効果が高かった。ただし、本発明では、標的miRNAの種類によっては、または、細胞株が本実施例と異なる場合等は、ＲＮＡ型スポンジオリゴの方がＤＮＡ型スポンジオリゴよりも高いmicroRNA活性抑制能を持つ可能性もある。
［実施例４：異なるリンカー分子を有するスポンジオリゴの，HCT116細胞とHEK293T細胞におけるmiR-16活性抑制効果比較］
（１）材料
１−ａ：オリゴヌクレオチド
下記塩基配列および後述の表３に示すとおり、miR-16の配列に対する相補的配列をGly（前記Ｇ１）、GlyGly（前記Ｇ２）またはTPAで連結したmicroRNA阻害剤を使用し、microRNA抑制効果（microRNA阻害活性）を測定した。
（実施例４−１）
spo-D-3（Gly含有Bubble型スポンジオリゴ）
5'-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-T-3' （配列番号２）
（実施例４−２）
spo-D-16（GlyGly含有Bubble型スポンジオリゴ）
5'-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-T-3' （配列番号６）
（実施例４−３）
spo-D-13（GlyGly含有Perfect型スポンジオリゴ）
5'-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-T-3' （配列番号４）
（実施例４−４）
spo-D-15（TPA含有Perfect型スポンジオリゴ）
5'-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-T-3' （配列番号１５）
（実施例４−５）
spo-D-21（TPA含有Bubble型スポンジオリゴ）
5'-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-T-3' （配列番号１６）
（実施例４−６）
spo-D-22（TPA含有Bulge型スポンジオリゴ）
5'-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-T-3' （配列番号１７）
（実施例４−７）
spo-D-23（GlyGly含有Bulge型スポンジオリゴ）
5'-GlyGly-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-GlyGly-T-3' （配列番号１８）
１−ａ：オリゴヌクレオチド
下記塩基配列および後述の表３に示すとおり、miR-16の配列に対する相補的配列をGly（前記Ｇ１）、GlyGly（前記Ｇ２）またはTPAで連結したmicroRNA阻害剤を使用し、microRNA抑制効果（microRNA阻害活性）を測定した。
（実施例４−１）
spo-D-3（Gly含有Bubble型スポンジオリゴ）
5'-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-T-3' （配列番号２）
（実施例４−２）
spo-D-16（GlyGly含有Bubble型スポンジオリゴ）
5'-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-T-3' （配列番号６）
（実施例４−３）
spo-D-13（GlyGly含有Perfect型スポンジオリゴ）
5'-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-T-3' （配列番号４）
（実施例４−４）
spo-D-15（TPA含有Perfect型スポンジオリゴ）
5'-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-T-3' （配列番号１５）
（実施例４−５）
spo-D-21（TPA含有Bubble型スポンジオリゴ）
5'-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-T-3' （配列番号１６）
（実施例４−６）
spo-D-22（TPA含有Bulge型スポンジオリゴ）
5'-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-T-3' （配列番号１７）
（実施例４−７）
spo-D-23（GlyGly含有Bulge型スポンジオリゴ）
5'-GlyGly-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-GlyGly-T-3' （配列番号１８）
また、前記実施例４−１〜４−７のネガティブコントロールオリゴとして、下記塩基配列をGly（前記Ｇ１）またはGlyGly（前記Ｇ２）で連結したmicroRNA阻害剤（下記参考例４−１〜４−４）を使用し、microRNA抑制効果（microRNA阻害活性）を測定した。
（参考例４−１）
spo-D-9（Gly含有Bubble型スポンジオリゴネガティブコントロール）
5'-Gly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-Gly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-Gly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-Gly-T-3' （配列番号８）
（参考例４−２）
spo-D-20（GlyGly含有Bubble型スポンジオリゴネガティブコントロール）
5'-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-T-3' （配列番号１０）
（参考例４−３）
spo-D-18（GlyGly含有Perfect型スポンジオリゴネガティブコントロール）
5'-GlyGly-CGCCAATATTTACGTAATTACA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTAATTACA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTAATTACA-GlyGly-T-3' （配列番号９）
（参考例４−４）
spo-D-19（TPA含有Perfect型スポンジオリゴネガティブコントロール）
5'-TPA-CGCCAATATTTACGTAATTACA-TPA-CGCCAATATTTACGTAATTACA-TPA-CGCCAATATTTACGTAATTACA-TPA-T-3' （配列番号１９）
（参考例４−１）
spo-D-9（Gly含有Bubble型スポンジオリゴネガティブコントロール）
5'-Gly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-Gly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-Gly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-Gly-T-3' （配列番号８）
（参考例４−２）
spo-D-20（GlyGly含有Bubble型スポンジオリゴネガティブコントロール）
5'-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-CGCCAATATTCCATTATAAGA-GlyGly-T-3' （配列番号１０）
（参考例４−３）
spo-D-18（GlyGly含有Perfect型スポンジオリゴネガティブコントロール）
5'-GlyGly-CGCCAATATTTACGTAATTACA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTAATTACA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTAATTACA-GlyGly-T-3' （配列番号９）
（参考例４−４）
spo-D-19（TPA含有Perfect型スポンジオリゴネガティブコントロール）
5'-TPA-CGCCAATATTTACGTAATTACA-TPA-CGCCAATATTTACGTAATTACA-TPA-CGCCAATATTTACGTAATTACA-TPA-T-3' （配列番号１９）
さらに、下記参考例４−５および４−６のmicroRNA阻害剤として、miR-16活性の抑制効果のポジティブコントロール(LNA-miR16)と、そのネガティブコントロール(LNA-Neg.Con)である以下のＬＮＡ分子（EXIQON社製）を使用した。なお、参考例４−５は、前記参考例２−７と同じであり、参考例４−６は、前記参考例２−８と同じである。
（参考例４−５）
LNA-miR16 GCCAATATTTACGTGCTGCT （配列番号１１）
（参考例４−６）
LNA-Neg.Con AGAGCTCCCTTCAATCCAAA （配列番号１２）
（参考例４−５）
LNA-miR16 GCCAATATTTACGTGCTGCT （配列番号１１）
（参考例４−６）
LNA-Neg.Con AGAGCTCCCTTCAATCCAAA （配列番号１２）
以上のオリゴヌクレオチドを、１０μＭとなるように、注射用蒸留水に溶解し、ＲＮＡ溶液を調製した。
１−ｂ：細胞株および培地
細胞株は、ヒト大腸がん細胞株であるHCT116(ATCC社)またはヒト胎児腎臓細胞株であるHEK293T(ATCC社)を用いた。培地は、１０％ＦＢＳを含むDMEM培地（Nacalai社）を用いて、３７℃、１０％ＣＯ２存在下で培養した。
細胞株は、ヒト大腸がん細胞株であるHCT116(ATCC社)またはヒト胎児腎臓細胞株であるHEK293T(ATCC社)を用いた。培地は、１０％ＦＢＳを含むDMEM培地（Nacalai社）を用いて、３７℃、１０％ＣＯ２存在下で培養した。
１−ｃ：レポータープラスミド
レポータープラスミドは、実施例２と同じレポーター遺伝子を持つプラスミドを使用した。
レポータープラスミドは、実施例２と同じレポーター遺伝子を持つプラスミドを使用した。
（２）方法
２−ａ：レポーター遺伝子のHCT116細胞またはHEK293T細胞へのトランスフェクション
HCT116細胞または293T細胞を用いて、実施例２と同様の方法で、レポーター遺伝子プラスミドpGL4-NTC(２μｇ)及びpMIR-REPORT(２μｇ)またはpGL4-miR16(２μｇ)及びpMIR-REPORT(２μｇ)をそれぞれトランスフェクションした。
２−ａ：レポーター遺伝子のHCT116細胞またはHEK293T細胞へのトランスフェクション
HCT116細胞または293T細胞を用いて、実施例２と同様の方法で、レポーター遺伝子プラスミドpGL4-NTC(２μｇ)及びpMIR-REPORT(２μｇ)またはpGL4-miR16(２μｇ)及びpMIR-REPORT(２μｇ)をそれぞれトランスフェクションした。
２−ｂ：スポンジオリゴまたはLNAのHCT116細胞またはHEK293T細胞へのトランスフェクション
前記レポーター遺伝子をトランスフェクションした細胞に対して、（実施例Ａ２）と同様の方法で、スポンジオリゴまたはＬＮＡのトランスフェクションを行った。このトランスフェクションにより、スポンジオリゴまたはＬＮＡの終濃度は、２５ｎＭになっている。
前記レポーター遺伝子をトランスフェクションした細胞に対して、（実施例Ａ２）と同様の方法で、スポンジオリゴまたはＬＮＡのトランスフェクションを行った。このトランスフェクションにより、スポンジオリゴまたはＬＮＡの終濃度は、２５ｎＭになっている。
２−ｃ：活性測定
前記スポンジオリゴまたはＬＮＡを前記HCT116細胞またはHEK293T細胞にトランスフェクションしてから４８時間後、それぞれの細胞内のルシフェラーゼ活性をDual-Luciferase（登録商標） Reporter Assay System (Promega社)を使用して、添付のプロトコールに従って測定した。測定機器は、Berthold Centro 960 (Berthold社)を用いた。
前記スポンジオリゴまたはＬＮＡを前記HCT116細胞またはHEK293T細胞にトランスフェクションしてから４８時間後、それぞれの細胞内のルシフェラーゼ活性をDual-Luciferase（登録商標） Reporter Assay System (Promega社)を使用して、添付のプロトコールに従って測定した。測定機器は、Berthold Centro 960 (Berthold社)を用いた。
２−ｄ：活性の解析
実施例２と同様の方法でmiR-16活性抑制効果の値を得た。
実施例２と同様の方法でmiR-16活性抑制効果の値を得た。
（３）結果
得られた結果を図１１から図１７に示す。図１１は、HCT116細胞を用いてGly型スポンジオリゴとGlyGly型スポンジオリゴを比較したものである。その結果、GlyGly型スポンジオリゴはGly型よりも少し強い抑制効果を持つことがわかった。図１２から図１７は、GlyGly型スポンジオリゴとTPA型スポンジオリゴを比較したものである。図１２から図１４はHCT116細胞を用いたもので、図１５から図１７はHEK293T細胞を用いた結果である。Perfect型のスポンジオリゴを用いると、HCT116細胞ではTPA型の方が、活性が高く（図１２）、HEK293T細胞では両者の活性はほぼ同じであった（図１５）。Bubble型スポンジオリゴを用いた場合は、HCT116細胞でもHEK293T細胞でもGlyGly型の方が活性が高かった（図１３および１６）。Bulge型スポンジオリゴを用いた場合は、HCT116細胞ではTPA型の方が、活性が高く（図１４）、HEK293T細胞ではGlyGly型の方が活性が高かった（図１７）。以上の結果から、本実施例のスポンジオリゴにおいて、TPA型およびGlyGly型は、Gly型よりも、in vitroにおけるmiR-16活性に対する少し強い抑制効果を有することが確認された。また、TPA型およびGlyGly型のmiR-16活性抑制効果には、ほとんど差はなかった。
得られた結果を図１１から図１７に示す。図１１は、HCT116細胞を用いてGly型スポンジオリゴとGlyGly型スポンジオリゴを比較したものである。その結果、GlyGly型スポンジオリゴはGly型よりも少し強い抑制効果を持つことがわかった。図１２から図１７は、GlyGly型スポンジオリゴとTPA型スポンジオリゴを比較したものである。図１２から図１４はHCT116細胞を用いたもので、図１５から図１７はHEK293T細胞を用いた結果である。Perfect型のスポンジオリゴを用いると、HCT116細胞ではTPA型の方が、活性が高く（図１２）、HEK293T細胞では両者の活性はほぼ同じであった（図１５）。Bubble型スポンジオリゴを用いた場合は、HCT116細胞でもHEK293T細胞でもGlyGly型の方が活性が高かった（図１３および１６）。Bulge型スポンジオリゴを用いた場合は、HCT116細胞ではTPA型の方が、活性が高く（図１４）、HEK293T細胞ではGlyGly型の方が活性が高かった（図１７）。以上の結果から、本実施例のスポンジオリゴにおいて、TPA型およびGlyGly型は、Gly型よりも、in vitroにおけるmiR-16活性に対する少し強い抑制効果を有することが確認された。また、TPA型およびGlyGly型のmiR-16活性抑制効果には、ほとんど差はなかった。
［実施例５：異なるmiR-16結合配列を有するスポンジオリゴの，HCT116細胞またはHEK293T細胞におけるmiR-16活性抑制効果比較］
（１）材料
１−ａ：オリゴヌクレオチド
下記塩基配列および後述の表４に示すとおり、miR-16の配列に対する相補的配列をTPAで連結したmicroRNA阻害剤を使用し、microRNA抑制効果（microRNA阻害活性）を測定した。
（実施例５−１）
spo-D-15（TPA含有Perfect型スポンジオリゴ）
5'-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-T-3' （配列番号１５）
（実施例５−２）
spo-D-21（TPA含有Bubble型スポンジオリゴ）
5'-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-T-3' （配列番号１６）
（実施例５−３）
spo-D-22（TPA含有Bulge型スポンジオリゴ）
5'-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-T-3' （配列番号１７）
１−ａ：オリゴヌクレオチド
下記塩基配列および後述の表４に示すとおり、miR-16の配列に対する相補的配列をTPAで連結したmicroRNA阻害剤を使用し、microRNA抑制効果（microRNA阻害活性）を測定した。
（実施例５−１）
spo-D-15（TPA含有Perfect型スポンジオリゴ）
5'-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-T-3' （配列番号１５）
（実施例５−２）
spo-D-21（TPA含有Bubble型スポンジオリゴ）
5'-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-T-3' （配列番号１６）
（実施例５−３）
spo-D-22（TPA含有Bulge型スポンジオリゴ）
5'-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-T-3' （配列番号１７）
また、前記実施例５−１〜５−３のネガティブコントロールオリゴとして、下記参考例５−１のmicroRNA阻害剤を使用し、microRNA抑制効果（microRNA阻害活性）を測定した。
（参考例５−１）
spo-D-19（TPA含有Perfect型スポンジオリゴネガティブコントロール）
5'-TPA-CGCCAATATTTACGTAATTACA-TPA-CGCCAATATTTACGTAATTACA-TPA-CGCCAATATTTACGTAATTACA-TPA-T-3' （配列番号１９）
（参考例５−１）
spo-D-19（TPA含有Perfect型スポンジオリゴネガティブコントロール）
5'-TPA-CGCCAATATTTACGTAATTACA-TPA-CGCCAATATTTACGTAATTACA-TPA-CGCCAATATTTACGTAATTACA-TPA-T-3' （配列番号１９）
さらに、下記参考例５−２および５−３のmicroRNA阻害剤として、miR-16活性の抑制効果のポジティブコントロール(LNA-miR16)と、そのネガティブコントロール(LNA-Neg.Con)である以下のＬＮＡ分子（EXIQON社製）を使用した。なお、参考例５−２は、前記参考例２−７と同じであり、参考例５−３は、前記参考例２−８と同じである。
（参考例５−２）
LNA-miR16 GCCAATATTTACGTGCTGCT （配列番号１１）
（参考例５−３）
LNA-Neg.Con AGAGCTCCCTTCAATCCAAA （配列番号１２）
（参考例５−２）
LNA-miR16 GCCAATATTTACGTGCTGCT （配列番号１１）
（参考例５−３）
LNA-Neg.Con AGAGCTCCCTTCAATCCAAA （配列番号１２）
以上のオリゴヌクレオチドの水溶液を、１０μＭとなるように、注射用蒸留水を用いて調製した。
１−ｂ：細胞株
活性測定には、実施例４と同じ細胞株を利用した。
活性測定には、実施例４と同じ細胞株を利用した。
１−ｃ：レポータープラスミド
レポータープラスミドは、実施例２と同じレポーター遺伝子を持つプラスミドを使用した。
レポータープラスミドは、実施例２と同じレポーター遺伝子を持つプラスミドを使用した。
（２）方法
２−ａ：レポーター遺伝子のHCT116細胞またはHEK293T細胞へのトランスフェクション
HCT116細胞または293T細胞を用いて、（実施例Ａ２）と同様の方法で、レポーター遺伝子プラスミドpGL4-NTC(２μｇ)およびpMIR-REPORT(２μｇ)またはpGL4-miR16(２μｇ)およびpMIR-REPORT(２μｇ)をそれぞれHCT116細胞またはHEK293T細胞へトランスフェクションした。
２−ａ：レポーター遺伝子のHCT116細胞またはHEK293T細胞へのトランスフェクション
HCT116細胞または293T細胞を用いて、（実施例Ａ２）と同様の方法で、レポーター遺伝子プラスミドpGL4-NTC(２μｇ)およびpMIR-REPORT(２μｇ)またはpGL4-miR16(２μｇ)およびpMIR-REPORT(２μｇ)をそれぞれHCT116細胞またはHEK293T細胞へトランスフェクションした。
２−ｂ：スポンジオリゴまたはLNAのHCT116細胞またはHEK293T細胞へのトランスフェクション
前記レポーター遺伝子をトランスフェクションした細胞に対して、（実施例Ａ２）と同様の方法で、スポンジオリゴまたはＬＮＡのトランスフェクションを行った。このトランスフェクションにより、スポンジオリゴまたはＬＮＡの終濃度は、２５ｎＭになっている。
前記レポーター遺伝子をトランスフェクションした細胞に対して、（実施例Ａ２）と同様の方法で、スポンジオリゴまたはＬＮＡのトランスフェクションを行った。このトランスフェクションにより、スポンジオリゴまたはＬＮＡの終濃度は、２５ｎＭになっている。
２−ｃ：活性測定
スポンジオリゴまたはＬＮＡをトランスフェクションしてから４８時間後、それぞれの細胞内のルシフェラーゼ活性をDual-Luciferase（登録商標） Reporter Assay System(Promega社)を使用して、添付のプロトコールに従って測定した。測定機器は、Berthold Centro 960(Berthold社)を用いた。
スポンジオリゴまたはＬＮＡをトランスフェクションしてから４８時間後、それぞれの細胞内のルシフェラーゼ活性をDual-Luciferase（登録商標） Reporter Assay System(Promega社)を使用して、添付のプロトコールに従って測定した。測定機器は、Berthold Centro 960(Berthold社)を用いた。
２−ｄ：活性の解析
実施例２と同様の方法でmiR-16活性抑制効果の値を得た。
実施例２と同様の方法でmiR-16活性抑制効果の値を得た。
（３）結果
得られた結果を図１８および１９に示す。図１８は、HCT116細胞を用いてmiR-16結合配列がPerfect型、Bubble型、またはBulge型の場合のスポンジオリゴ活性を比較したものである。その結果、これら３者にほとんど差はないが、その中でもPerfect型およびBulge型が、in vitroにおけるmiR-16活性に対する比較的強い抑制効果を示した。図１９は、HEK293T細胞を用いてmiR-16結合配列がPerfect型、Bubble型またはBulge型の場合のスポンジオリゴ活性を比較したものである。その結果、これら３者の中では、Bulge型がin vitroにおけるmiR-16活性に対する最も強い抑制効果を示した。
得られた結果を図１８および１９に示す。図１８は、HCT116細胞を用いてmiR-16結合配列がPerfect型、Bubble型、またはBulge型の場合のスポンジオリゴ活性を比較したものである。その結果、これら３者にほとんど差はないが、その中でもPerfect型およびBulge型が、in vitroにおけるmiR-16活性に対する比較的強い抑制効果を示した。図１９は、HEK293T細胞を用いてmiR-16結合配列がPerfect型、Bubble型またはBulge型の場合のスポンジオリゴ活性を比較したものである。その結果、これら３者の中では、Bulge型がin vitroにおけるmiR-16活性に対する最も強い抑制効果を示した。
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
この出願は、２０１２年３月４日に出願された日本出願特願２０１２−０４７４６６を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
本発明のmicroRNA阻害剤は、特殊な修飾核酸を用いる必要がないことから汎用性に優れ、かつ、前記相補的配列がリンカー残基を介して連結（結合）されているため分解され難い。このため、本発明のmicroRNA阻害剤は、種々の分野に広く利用可能である。
１ microRNA阻害剤
２ 相補的配列
３ リンカー残基
２ 相補的配列
３ リンカー残基
Claims (14)
- microRNA阻害剤であって、阻害の対象となるmicroRNAの配列に対する相補的配列を二つ以上有し、前記二つ以上の相補的配列が、下記化学式（Ｇ１）：
（前記化学式（Ｇ１）中のＧｌｙは、下記化学式（Ｇｌｙ）：
で表される原子団であり、ただし、上記化学式（Ｇｌｙ）中の末端のカルボニル炭素は、上記化学式（Ｇ１）中のＮ原子に結合しており、上記化学式（Ｇｌｙ）中の末端の窒素原子は、上記化学式（Ｇ１）のカルボニル炭素に結合している。）で表される原子団、下記化学式（Ｇ２）：
（上記化学式（Ｇ２）中のＧｌｙＧｌｙは、下記化学式（ＧｌｙＧｌｙ）：
で表される原子団であり、ただし、上記化学式（ＧｌｙＧｌｙ）中の末端のカルボニル炭素は、上記化学式（Ｇ２）中のＮ原子に結合しており、上記化学式（ＧｌｙＧｌｙ）中の末端の窒素原子は、上記化学式（Ｇ２）のカルボニル炭素に結合している。）で表される原子団または下記化学式（ＴＰＡ）：
で表される原子団であるリンカー残基を介して連結しており、両末端に位置する前記相補的配列の端部に上記リンカー残基が結合していることを特徴とするmicroRNA阻害剤。
（上記式中、リンカー残基が、末端に位置する前記microRNAの相補的配列の端部に位置している場合は、各残基の末端は、それぞれ独立して、Ｈ、保護基またはリン酸保護基である。） - 前記リンカー残基が、化学式（ＴＰＡ）で表される原子団である請求項１に記載のmicroRNA阻害剤。
- 前記リンカー残基が、化学式（Ｇ１）で表される原子団または化学式（Ｇ２）で表される原子団である請求項１に記載のmicroRNA阻害剤。
- 前記リンカー残基が、化学式（Ｇ２）で表される原子団または化学式（ＴＰＡ）で表される原子団である請求項１に記載のmicroRNA阻害剤。
- 前記二つ以上の相補的配列の間に位置しているリンカー残基が、化学式（Ｇ２）で表される原子団であることを特徴とする請求項１に記載のmicroRNA阻害剤。
- 前記相補的配列の端部に結合したリンカー残基が、化学式（Ｇ２）で表される原子団であることを特徴とする請求項１、３から５のいずれか一項に記載のmicroRNA阻害剤。
- 前記二つ以上の相補的配列の間に位置しているリンカー残基、および、前記相補的配列の端部に結合したリンカー残基の少なくとも一方が、化学式（Ｇ２）で表される原子団である請求項５または６に記載のmicroRNA阻害剤。
- 前記相補的配列が、RNAまたはDNAである請求項１から７のいずれか一項に記載のmicroRNA阻害剤。
- 下記配列番号２、４、６、１３および１５〜１８のいずれかで表されるmicroRNA阻害剤。
5'-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-Gly-T-3' （配列番号２）
5'-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-GlyGly-T-3' （配列番号４）
5'-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-GlyGly-T-3' （配列番号６）
5'-GlyGly-CGCCAAUAUUCGAUGCUGCUA-GlyGly-CGCCAAUAUUCGAUGCUGCUA-GlyGly-CGCCAAUAUUCGAUGCUGCUA-GlyGly-U-3' （配列番号１３）
5'-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-TPA-T-3' （配列番号１５）
5'-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTCGATGCTGCTA-TPA-T-3' （配列番号１６）
5'-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-TPA-T-3' （配列番号１７）
5'-GlyGly-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-GlyGly-CGCCAATATTTAGTTCCGTGCTGCTA-GlyGly-T-3' （配列番号１８）
前記配列番号２で表される配列中のGlyは、下記化学式（Ｇ１）で表される原子団であり、ただし、５’末端に結合する塩基がない場合は、５’末端には水素原子（Ｈ）が結合しており、
前記配列番号４、６、１３または１８で表される配列中のGlyGlyは、下記化学式（Ｇ２）で表される原子団であり、ただし、５’末端に結合する塩基がない場合は、５’末端には水素原子（Ｈ）が結合しており、
前記配列番号１５、１６または１７で表される配列中のTPAは、下記化学式（TPA）で表される原子団であり、ただし、５’末端に結合する塩基がない場合は、５’末端には水素原子（Ｈ）が結合している。
- 請求項１から９のいずれか一項に記載のmicroRNA阻害剤合成用のモノマーであって、
下記化学式（ＩＩ−１ａ）、（ＩＩ−４ａ）または（ＩＩ−６ａ）の構造を有することを特徴とするモノマー。
Ｒ １１およびＲ２１は、それぞれ独立して、Ｈ、保護基またはリン酸保護基である。 - 標識物質を含む、請求項１０に記載のモノマー。
- 安定同位体を含む、請求項１０または１１に記載のモノマー。
- 自動核酸合成用である、請求項１０から１２のいずれか一項に記載のモノマー。
- 請求項１から９のいずれか一項に記載のmicroRNA阻害剤の製造方法であって、
請求項１０から１３のいずれか一項に記載のモノマーを使用することを特徴とする製造方法。
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