JPWO2019182037A1 - 毒性が低減されたアンチセンスオリゴヌクレオチド - Google Patents

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Abstract

毒性が低減されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
中央領域、５’側領域及び３’側領域を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、糖部分の２’位と３’位が架橋されたヌクレオチド（２’−３’架橋ヌクレオチド）及び／又は３’位に置換基を有する非架橋のヌクレオチド（３’位修飾非架橋ヌクレオチド）を中央領域に有することを特徴とする、アンチセンスオリゴヌクレオチド。

Description

本発明は、毒性が低減されたアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
核酸医薬は、標的となるＤＮＡ又はＲＮＡと相補的塩基対を形成する核酸（オリゴヌクレオチド）からなる医薬品であり、新規な医薬品として期待されている。そして、核酸医薬に用いられる核酸単位として、種々の人工核酸単位（人工ヌクレオシド又はそのリン酸付加体である人工ヌクレオチド）が開発されている。例えば、リボヌクレオチドの糖部２’位の酸素原子をメトキシエチル（ＭＯＥ）化することで、標的核酸への親和性、及びヌクレアーゼへの耐性が向上することが知られている（例えば、特許文献１参照）。また、２’，４’−ＢＮＡ及び２’，４’−ＬＮＡは、核酸単位の糖部分の２’位と４’位が架橋された化合物であり、標的核酸への高い親和性が知られている（例えば、特許文献２〜５参照）。さらには、２’位と３’位が架橋されたヌクレオチド（２’−３’架橋ヌクレオチド）や、糖部３’位炭素原子のβ位にアルキルが導入されたヌクレオチド（３’位修飾非架橋ヌクレオチド）も知られている。これらの人工核酸をＤＮＡ鎖に導入することによる、ＲＮａｓｅＨのＲＮＡ鎖切断活性への影響について検討されている（例えば、非特許文献１及び２参照）。
一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドの両末端に、人工核酸単位を導入したギャップマー型アンチセンス核酸の開発が進んでいる。ギャップマー型アンチセンス核酸は標的ＲＮＡと二重鎖複合体を形成し、細胞内のＲＮａｓｅＨが、デオキシリボヌクレオチド部分と標的ＲＮＡとの二重鎖部分を認識し、ＲＮＡ鎖を切断することが知られている。
ギャップマー型アンチセンス核酸を臨床に応用するためには、高い配列特異性が求められる。しかしながら近年、オフターゲット効果に起因する毒性が報告されている（例えば、非特許文献３及び４参照）。オフターゲット効果は、アンチセンス核酸と標的以外の類似した配列を有するＲＮＡとが二重鎖複合体を形成し、当該標的以外のＲＮＡが切断されることによって生じる。しかしながら、このような毒性を低減する修飾方法に関する報告はない。
また、一塩基多型（ＳＮＰ）を有する遺伝子を標的とした場合では、野生型に対する変異型の選択性が求められており、糖部をフッ素で修飾した人工核酸を用いた検討が報告されている（例えば、非特許文献５参照）。
特開平７−２８８９号公報 国際公開第９８／３９３５２号 国際公開第２００９／００６４７８号 国際公開第２０１１／０５２４３６号 国際公開第２０１５／１２５７８３号
Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2008, 18, pp 2296-2300 The Journal of Biological Chemistry, 2004, 279, pp 36317-36326 Nucleic Acids Research, 2016, 44, pp 2093-2109 Scientific Reports, 2016, 6, 30377 Molecular Therapy - Nucleic Acids, 2017, 7, pp 20-30
ギャップマー型アンチセンス核酸において、「オフターゲット効果」に起因する毒性を低減する新たな技術が求められている。
また、一塩基多型（ＳＮＰ）部位を標的とした場合では、野生型に対する変異型の選択性の向上が求められているが、ギャップマー型アンチセンス核酸の配列は、野生型ＲＮＡの配列と一塩基のミスマッチを含むのみであり、野生型／変異型の選択性を得るのは依然として難しい。よって、これを解決する新たな技術が求められている。
本発明の目的は、毒性が低減されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することにある。
本発明者らは、糖部分の２’位と３’位が架橋されたヌクレオチド（２’−３’架橋ヌクレオチド）及び／又は３’位に置換基を有する非架橋のヌクレオチド（３’位修飾非架橋ヌクレオチド）を、中央領域に有するギャップマー型アンチセンス核酸が、低毒性であり、かつ高い配列選択性を有することを見出し、本発明を完成した。なお、一部の糖部修飾ヌクレオチドの使用が、ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ鎖切断活性に影響を与えることは報告されているが、これらヌクレオチドが、オフターゲット効果に起因する毒性を低減することについては、報告がなく、ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ鎖切断活性の制御とオフターゲット効果に起因する毒性を低減することとの関係についても、報告されていなかった。切断位置の制御により、オフターゲット効果に起因する毒性を低減できることが、本発明により、明らかになった。すなわち、本発明は以下の態様を包含する。
１． 中央領域、５’側領域及び３’側領域を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、
ここで、
− 中央領域は、
デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及び糖部修飾ヌクレオチドからなる群より独立して選択される少なくとも５個のヌクレオチドからなり、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドからなる群から選択される糖部修飾ヌクレオチドを少なくとも一つ含み、その３’末端及び５’末端が、それぞれ独立して、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、２’−３’架橋ヌクレオチド又は３’位修飾非架橋ヌクレオチドであり、そして
デオキシリボヌクレオチド、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドからなる群から独立して選択される、連続する少なくとも４個のヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチド鎖を、少なくとも一つ含み；
− ５’側領域は、
デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及び糖部修飾ヌクレオチドからなる群から独立して選択される少なくとも１個のヌクレオチドからなり、その３’末端が、糖部修飾ヌクレオチドであり、ここで、該３’末端の糖部修飾ヌクレオチドは、中央領域に結合し、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドを除く糖部修飾ヌクレオチドから選択され、そして
デオキシリボヌクレオチド、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドからなる群から独立して選択される、連続する少なくとも４個のヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチド鎖を含まず；
− ３’側領域は、
デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及び糖部修飾ヌクレオチドからなる群から独立して選択される少なくとも１個のヌクレオチドからなり、その５’末端が、糖部修飾ヌクレオチドであり、ここで、該５’末端の糖部修飾ヌクレオチドは、中央領域に結合し、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドを除く糖部修飾ヌクレオチドから選択され、そして
デオキシリボヌクレオチド、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドからなる群から独立して選択される、連続する少なくとも４個のヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチド鎖を含まない、
アンチセンスオリゴヌクレオチド。
２． 前記中央領域が、５〜１５個のヌクレオチドからなり、
前記５’側領域及び前記３’側領域が、それぞれ独立して、１〜７個のヌクレオチドからなる、１．に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３． 前記中央領域が、８〜１２個のヌクレオチドからなり、
前記５’側領域及び前記３’側領域が、それぞれ独立して、２〜５個のヌクレオチドからなる、１．又は２．に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４． 中央領域に含まれる、２’−３’架橋ヌクレオチドが、
下記式（Ｉ）：

（式中、ｍは、１、２、３又は４であり、
Ｂｘは、核酸塩基部分であり、
Ｘは、Ｏ又はＳであり、
−Ｑ−は、それぞれ独立して、−ＣＲ４Ｒ５−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｃ（＝ＮＲ６）−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＲ６−又は−Ｓ−であり、
ｍが、２、３又は４であるとき、２つの隣り合った−Ｑ−は、一緒に
式 −ＣＲ７＝ＣＲ８−
で表される基を形成してもよく、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、１つ以上の置換基で置換されたＣ２−Ｃ６アルケニル、１つ以上の置換基で置換されたＣ２−Ｃ６アルキニル、アシル、１つ以上の置換基で置換されたアシル、１つ以上の置換基で置換されたアミド、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルコキシ、スルファニル、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ又は１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルチオであり；ここで、前記置換基は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、オキソ、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、アジド、ＯＣ（＝Ｙ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｙ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｙ）ＮＪ１Ｊ２及びシアノからなる群から独立して選択され、Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、それぞれ独立して、水素原子又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、かつＹは、Ｏ、Ｓ又はＮＪ４であり、Ｊ４はＣ１−Ｃ１２アルキル又はアミノ保護基であり；
Ｒ６は、Ｃ１−Ｃ１２アルキル又はアミノ保護基であり、
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素原子又はＣ１−Ｃ６アルキルである）
で表される部分構造を含むヌクレオチドである、１．から３．の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５． 中央領域に含まれる、３’位修飾非架橋ヌクレオチドが、
下記式（II）：

（式中、Ｂｘは、核酸塩基部分であり、
Ｘは、Ｏ又はＳであり、
Ｒ１２は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、１つ以上の置換基で置換されたＣ２−Ｃ６アルケニル、１つ以上の置換基で置換されたＣ２−Ｃ６アルキニル、アシル、１つ以上の置換基で置換されたアシル、１つ以上の置換基で置換されたアミド、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルコキシ、スルファニル、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ又は１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルチオであり；ここで、前記置換基は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、オキソ、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、アジド、ＯＣ（＝Ｙ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｙ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｙ）ＮＪ１Ｊ２及びシアノからなる群から独立して選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ１１は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、１つ以上の置換基で置換されたＣ２−Ｃ６アルケニル、１つ以上の置換基で置換されたＣ２−Ｃ６アルキニル、アシル、１つ以上の置換基で置換されたアシル、１つ以上の置換基で置換されたアミド、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルコキシ、スルファニル、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ又は１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルチオであり；ここで、前記置換基は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、オキソ、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、アジド、ＯＣ（＝Ｙ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｙ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｙ）ＮＪ１Ｊ２及びシアノからなる群から独立して選択され；
Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、それぞれ独立して、水素原子又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、かつＹは、Ｏ、Ｓ又はＮＪ４であり、Ｊ４はＣ１−Ｃ１２アルキル又はアミノ保護基である）
で表される部分構造を含むヌクレオチドである、１．から３．の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６． 中央領域に含まれる、２’−３’架橋ヌクレオチドが、
下記式（III）：

（式中、Ｂｘは、核酸塩基部分であり、
Ｘは、Ｏ又はＳであり、
−Ｑ１−及び−Ｑ２−は、それぞれ独立して、−ＣＲ４Ｒ５−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｃ（＝ＮＲ６）−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＲ６−又は−Ｓ−であるか、あるいは、
−Ｑ１−Ｑ２−は、−ＣＲ７＝ＣＲ８−であり；かつ、式中、Ｒ７及びＲ８は独立して水素原子又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、１つ以上の置換基で置換されたＣ２−Ｃ６アルケニル、１つ以上の置換基で置換されたＣ２−Ｃ６アルキニル、アシル、１つ以上の置換基で置換されたアシル、１つ以上の置換基で置換されたアミド、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルコキシ、スルファニル、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ又は１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルチオであり；ここで、前記置換基は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、オキソ、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、アジド、ＯＣ（＝Ｙ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｙ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｙ）ＮＪ１Ｊ２及びシアノからなる群から独立して選択され、Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、それぞれ独立して、水素原子又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、かつＹは、Ｏ、Ｓ又はＮＪ４であり、Ｊ４はＣ１−Ｃ１２アルキル又はアミノ保護基であり；
Ｒ６は、Ｃ１−Ｃ１２アルキル又はアミノ保護基である）
で表されるヌクレオチドである、４．に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
７． −Ｑ１−が、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＲ６−又は−Ｓ−であり、Ｒ６はＣ１−Ｃ１２アルキルであり、−Ｑ２−が−ＣＨ２−である、６．に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
８． −Ｑ１−が、−Ｏ−であり、−Ｑ２−が−ＣＨ２−である、６．又は７．に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
９． Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が、水素原子である、４．から８．の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１０． Ｘが、Ｏである、４．から９．の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１１． 前記中央領域が、ギャップ領域であり、
前記５’側領域が、５’ウィング領域であり、
前記３’側領域が、３’ウィング領域である、１．から１０．の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１２． 前記５’側領域及び前記３’側領域に含まれる糖部修飾ヌクレオチドが、それぞれ独立して、２’位修飾非架橋ヌクレオチド及び２’，４’−ＢＮＡからなる群から選択される、１．から１１．の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１３． 前記２’位修飾非架橋ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）化ヌクレオチド、２’−Ｏ−アミノプロピル（ＡＰ）化ヌクレオチド、２’−フルオロ化ヌクレオチド、２’−Ｏ−（Ｎ−メチルアセトアミド）（ＮＭＡ）化ヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチルカルバモイルエチル（ＭＣＥ）化ヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つである、１２．に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１４． 前記２’，４’−ＢＮＡが、ＬＮＡ、ｃＥｔ−ＢＮＡ、ＥＮＡ、ＢＮＡＮＣ、ＡｍＮＡ及びｓｃｐＢＮＡからなる群から選択される少なくとも１つである、１２．に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１５． アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合を含む、１．から１４．の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１６． 標識機能、精製機能及び標的部位への送達機能からなる群から選択される少なくとも１種の機能を有する機能性分子に由来する基をさらに含む、１．から１５．の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１７． 前記機能性分子が、糖、脂質、ペプチド及びタンパク質並びにそれらの誘導体からなる群から選択される、１６．に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１８． 前記機能性分子が、コレステロール、トコフェロール及びトコトリエノールからなる群から選択される脂質である、１６．又は１７．に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１９． 前記機能性分子が、アシアロ糖タンパク質受容体と相互作用する糖誘導体である、１６．又は１７．に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２０． 前記機能性分子が、受容体のリガンド及び抗体からなる群から選択される、ペプチド又はタンパク質である、１６．又は１７．に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２１． １．から２０．の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドのプロドラッグ。
２２． （ｉ）１．から２０．の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び
（ｉｉ）少なくとも１個のリボヌクレオチドを含み、かつ前記（ｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズする領域を含むオリゴヌクレオチド
を含む、オリゴヌクレオチド複合体。
２３． （ｉ）１．から２０．の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドに由来する基、及び
（ｉｉ）少なくとも１個のリボヌクレオチドを含み、かつ前記（ｉ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズする領域を含むオリゴヌクレオチドに由来する基
を含み、前記（ｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドに由来する基と、前記（ｉｉ）オリゴヌクレオチドに由来する基とが連結された、オリゴヌクレオチド。
２４． （ｉｉｉ）１．から２０．の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドに由来する基に、少なくとも１個のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖が連結されたオリゴヌクレオチド、及び
（ｉｖ）ＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４個の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖を含むオリゴヌクレオチド
を含むオリゴヌクレオチド複合体であって、
前記（ｉｉｉ）の少なくとも１個のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖と、前記（ｉｖ）のＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４個の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖とがハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド複合体。
２５． （ｉｉｉ） １．から２０．の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドに由来する基に、少なくとも１個のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖が連結されたオリゴヌクレオチドに由来する基、及び
（ｉｖ）ＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４個の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖を含むオリゴヌクレオチドに由来する基
を含み、前記（ｉｉｉ）オリゴヌクレオチドに由来する基と、前記（ｉｖ）オリゴヌクレオチドに由来する基とが連結され、
前記（ｉｉｉ）の少なくとも１個のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖と、前記（ｉｖ）のＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４個の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖とがハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド。
２６． １．から２０．の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、２１．に記載のプロドラッグ、２２．若しくは２４．に記載のオリゴヌクレオチド複合体、又は２３．若しくは２５．に記載のオリゴヌクレオチドと、薬理学上許容される担体とを含む、医薬組成物。
２７． １．から２０．の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、２１．に記載のプロドラッグ、２２．若しくは２４．に記載のオリゴヌクレオチド複合体、又は２３．若しくは２５．に記載のオリゴヌクレオチドと、細胞とを接触させる工程を含む、標的ＲＮＡの機能を制御する方法。
２８． ２６．に記載の医薬組成物を、哺乳動物に投与する工程を含む、該哺乳動物における標的ＲＮＡの機能を制御する方法。
２９． １．から２０．の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、２１．に記載のプロドラッグ、２２．若しくは２４．に記載のオリゴヌクレオチド複合体、又は２３．若しくは２５．に記載のオリゴヌクレオチドと、細胞とを接触させる工程を含む、標的遺伝子の発現を制御する方法。
３０． ２６．に記載の医薬組成物を、哺乳動物に投与する工程を含む、該哺乳動物における標的遺伝子の発現を制御する方法。
３１． ２’−３’架橋ヌクレオチド及び、３’位修飾非架橋ヌクレオチドからなる群から選択されるヌクレオチドを使用して、１．から２０．の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は２１．に記載のプロドラッグを製造する方法。
本発明により、毒性が低減されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。
本実施形態に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例１）のマウス脳内皮細胞におけるＳＯＤ−１の発現レベルへの影響を示すグラフである。 本実施形態に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例１）のマウス脳内皮細胞における細胞生存率への影響を示すグラフである。 本実施形態に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例２）のマウス脳内皮細胞における細胞生存率への影響を示すグラフである。 アンチセンスオリゴヌクレオチド（比較例１）のマウス脳内皮細胞における遺伝子の発現量の変動への影響を網羅的に解析した結果を示すグラフである。 本実施形態に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例１）のマウス脳内皮細胞における遺伝子の発現量の変動への影響を網羅的に解析した結果を示すグラフである。
本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。以下に、本明細書中で使用する各用語を説明する。なお、本明細書中、各用語は単独で使用されている場合も、又は他の用語と一緒になって使用されている場合も、特に記載の無い限り、同一の意義を有する。
「ｎ−」はノルマル、「ｉ−」はイソ、「ｓ−」はセカンダリー、「ｔ−」はターシャリー、「ｍ−」はメタ、「ｐ−」はパラを意味する。「Ｐｈ」はフェニル、「Ｍｅ」はメチル、「Ｐｒ」はプロピル、「Ｂｕ」はブチル、「ＤＭＴｒ」はジメトキシトリチルを意味する。
保護基により置換された官能基とは、官能基が有する水素原子が保護基により置換された官能基を意味する。
「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子を意味する。
「Ｃ１−Ｃ１２アルキル」とは、炭素数が１から１２の直鎖又は分枝状の飽和脂肪族炭化水素の１価の基を意味する。Ｃ１−Ｃ１２アルキルとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−へプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル、ｎ−ウンデシル、ｎ−ドデシル等が挙げられる。
「Ｃ１−Ｃ６アルキル」とは、前記「Ｃ１−Ｃ１２アルキル」のうち、炭素数が１から６の直鎖又は分枝状の飽和脂肪族炭化水素の１価の基を意味する。Ｃ１−Ｃ６アルキルとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル等が挙げられる。同様に「Ｃ１−Ｃ３アルキル」とは、炭素数が１から３の直鎖又は分枝状の飽和脂肪族炭化水素の１価の基を意味する。
「ハロＣ１−Ｃ６アルキル」とは、前記「Ｃ１−Ｃ６アルキル」の任意の位置の水素原子の少なくとも１個が、前記「ハロゲン原子」で置換された基を意味する。
「Ｃ２−Ｃ６アルケニル」とは、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含む、炭素数が２から６の直鎖又は分枝状の不飽和脂肪族炭化水素の１価の基を意味する。Ｃ２−Ｃ６アルケニルとしては、例えば、ビニル、アリル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル、ブタジエニル、３−メチル−２−ブテニル、ペンテニル、イソペンテニル、ペンタジエニル、ヘキセニル、イソヘキセニル、ヘキサジエニル等が挙げられる。
「Ｃ２−Ｃ６アルキニル」とは、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を含む、炭素数が２から６の直鎖又は分岐状の不飽和脂肪族炭化水素の１価の基を意味する。Ｃ２−Ｃ６アルキニルとしては、例えば、エチニル、プロパルギル、３−ブチニル又は４−ペンチニル等が挙げられる。
「アシル」とは、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル又はアリールがカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）基に結合した基を意味する。アシルとしては、例えば、ホルミル、アセチル、ピバロイル、ベンゾイル等が挙げられる。
「ハロアシル」とは、前記「アシル」の任意の位置の水素原子の少なくとも１個が、前記「ハロゲン原子」で置換された基を意味する。
「アミド」とは、アミノカルボニル（−ＣＯＮＨ２）基、又はアミノカルボニル基の水素原子の少なくとも１つが、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル及びアリールからなる群から独立して選択される基に置き換えられた基を意味する。アミドとしては、例えば、カルバモイル、メチルアミノカルボニル、イソプロピルアミノカルボニル、フェニルアミノカルボニル等が挙げられる。
「Ｃ１−Ｃ６アルコキシ」とは、前記「Ｃ１−Ｃ６アルキル」がオキシ（−Ｏ−）基に結合した基を意味する。Ｃ１−Ｃ６アルコキシとしては、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓ−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｎ−へキシルオキシ等が挙げられる。
「Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ」とは、前記「Ｃ１−Ｃ６アルキル」がチオ（−Ｓ−）基に結合した基を意味する。Ｃ１−Ｃ６アルキルチオとしては、例えば、メチルチオ、エチルチオ、ｎ−プロピルチオ、イソプロピルチオ、ｎ−ブチルチオ、イソブチルチオ、ｓ−ブチルチオ、ｔ−ブチルチオ、ｎ−ペンチルチオ、イソペンチルチオ、ｎ−ヘキシルチオ等が挙げられる。
「Ｃ２−Ｃ５０アルキレン」とは、炭素数が２から５０の直鎖又は分枝状の飽和脂肪族炭化水素の２価の基を意味する。
「Ｃ２−Ｃ２０アルキレン」とは、炭素数が２から２０の直鎖又は分枝状の飽和脂肪族炭化水素の２価の基を意味する。
「Ｃ８−Ｃ１２アルキレン」とは、前記「Ｃ２−Ｃ２０アルキレン」のうち、炭素数が８から１２の直鎖又は分枝状の飽和脂肪族炭化水素の２価の基を意味する。
「Ｃ２−Ｃ６アルキレン」とは、前記「Ｃ２−Ｃ２０アルキレン」のうち、炭素数が２から６の直鎖又は分岐状の飽和脂肪族炭化水素の２価の基を意味し、例としては、エチレン（エタンジイル）、プロピレン、プロパン−１，３−ジイル（トリメチレン）、プロパン−２，２−ジイル（イソプロピリデン）、２，２−ジメチル−プロパン−１，３−ジイル、ヘキサン−１，６−ジイル（ヘキサメチレン）及び３−メチルブタン−１，２−ジイル等が挙げられる。
「Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン」とは、炭素数が２から２０の、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含む、直鎖又は分枝状の不飽和脂肪族炭化水素の２価の基を意味する。
「モノＣ１−Ｃ６アルキルアミノ」とは、アミノ（ＮＨ２）基の水素原子の１つが、前記「Ｃ１−Ｃ６アルキル」に置き換えられた基を意味し、例えば、メチルアミノ、エチルアミノ、ｎ−プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、ｎ−ブチルアミノ、イソブチルアミノ、ｓ−ブチルアミノ、ｔ−ブチルアミノ、ｎ−ペンチルアミノ、ｎ−ヘキシルアミノ及びイソヘキシルアミノが挙げられる。
「ジＣ１−Ｃ６アルキルアミノ」とは、アミノ（ＮＨ２）基の水素原子の２つが、同一又は異なる２つの前記「Ｃ１−Ｃ６アルキル」に置き換えられた基を意味し、例えば、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジｎ−プロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジｎ−ブチルアミノ、ジｎ−ペンチルアミノ、ジｎ−ヘキシルアミノ、Ｎ−メチル−Ｎ−エチルアミノ、及びＮ−メチル−Ｎ−イソプロピルアミノが挙げられる。
「Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボニル」、「ハロＣ１−Ｃ６アルキルカルボニル」、「Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル」、「モノＣ１−Ｃ６アルキルアミノカルボニル」及び「ジＣ１−Ｃ６アルキルアミノカルボニル」は、それぞれ、前記「Ｃ１−Ｃ６アルキル」、「ハロＣ１−Ｃ６アルキル」、「Ｃ１−Ｃ６アルコキシ」、「モノＣ１−Ｃ６アルキルアミノ」及び「ジＣ１−Ｃ６アルキルアミノ」が、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）基に結合した基を意味する。
「Ｃ１−Ｃ６アルキルスルホニル」、「ハロＣ１−Ｃ６アルキルスルホニル」、「Ｃ１−Ｃ６アルコキシスルホニル」、「モノＣ１−Ｃ６アルキルアミノスルホニル」及び「ジＣ１−Ｃ６アルキルアミノスルホニル」は、それぞれ、前記「Ｃ１−Ｃ６アルキル」、「ハロＣ１−Ｃ６アルキル」、「Ｃ１−Ｃ６アルコキシ」、「モノＣ１−Ｃ６アルキルアミノ」及び「ジＣ１−Ｃ６アルキルアミノ」が、スルホニル基（−Ｓ（Ｏ）２−）に結合した基を意味する。
「リボヌクレオシド基」は、リボースの１’位の炭素原子に塩基が結合し、該リボースの３’位及び５’位のヒドロキシ基を取り除いた基を意味する。本発明におけるリボヌクレオシド基における塩基部分は、天然に存在する塩基あっても、天然に存在する塩基が修飾された塩基であってもよい。前記塩基部分の修飾は１つのリボヌクレオシド基に対して、複数種組み合わせて施されてもよい。前記修飾は、例えばジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリ−（２０１６年、５９巻、２１号、９６４５−９６６７頁）、メディシナル・ケミストリー・コミュニケーションズ（２０１４年、５巻、１４５４−１４７１頁）、フューチャー・メディシナル・ケミストリー（２０１１年、３巻、３号、３３９−３６５頁）に記載されている。
「デオキシリボヌクレオシド基」は、２’−デオキシリボースの１’位の炭素原子に塩基が結合し、該２’−デオキシリボースの３’位及び５’位のヒドロキシ基を取り除いた基を意味する。本発明におけるデオキシリボヌクレオシド基における塩基部分は、天然に存在する塩基あっても、天然に存在する塩基が修飾された塩基であってもよい。前記塩基部分の修飾は１つのデオキシリボヌクレオシド基に対して、複数種組み合わせて施されてもよい。前記修飾は、例えばジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリ−（２０１６年、５９巻、２１、９６４５−９６６７頁）、メディシナル・ケミストリー・コミュニケーションズ（２０１４年、５巻、１４５４−１４７１頁）、フューチャー・メディシナル・ケミストリー（２０１１年、３巻、３号、３３９−３６５頁）等に記載されている。
「オキソ」とは、酸素原子が二重結合を介して置換した基（＝Ｏ）を示す。オキソが炭素原子に置換した場合は当該炭素原子と一緒となってカルボニルを形成する。
「チオキソ」とは、酸素原子が二重結合を介して置換した基（＝Ｓ）を示す。チオキソが炭素原子に置換した場合は当該炭素原子と一緒となってチオカルボニルを形成する。
ヒドロキシ保護基、アミノ保護基は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを合成する際に安定であればよいため、特に限定されず、例えば、当業者に良く知られた、Protective Groups in Organic Synthesis 第４版、T. W. Greene、P. G. M. Wuts著、John Wiley & Sons Inc.（2006年）等に記載されている保護基を挙げることができる。例えば、「アミノ保護基」としては、アシル（例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ピバロイル（Ｐｖ）、チグロイル等が挙げられる）、ハロアシル（例えば、フルオロアセチル、ジフルオロアセチル、トリフルオロアセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル等が挙げられる）、アリールカルボニル（例えば、ベンゾイル、ｐ−ブロモベンゾイル、ｐ−ニトロベンゾイル、２，４−ジニトロベンゾイル等が挙げられる）等のアミド系保護基；Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル（例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｎ−プロポキシカルボニル、ｉ−プロポキシカルボニル、ｎ−ブトキシカルボニル、ｉ−ブトキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｔ−アミルオキシカルボニル等が挙げられ、好ましくはＢｏｃ等が挙げられる）、Ｃ２−Ｃ６アルケニルオキシカルボニル（例えば、ビニルオキシカルボニル（Ｖｏｃ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）等が挙げられる）、トリ（Ｃ１−Ｃ３アルキル）シリルエトキシカルボニル（例えば、２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル（Ｔｅｏｃ）等が挙げられる）、ハロＣ１−Ｃ６アルコキシカルボニル（例えば、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル（Ｔｒｏｃ）等が挙げられる）、アリールオキシカルボニル（例えば、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ又はＣｂｚ）、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル（Ｍｏｚ）等が挙げられる）等のカルバメート系保護基；及びアルキルスルホニル（例えば、メタンスルホニル（Ｍｓ）、エタンスルホニル等が挙げられる）、アリールスルホニル（例えば、ベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｓ）、ｐ−クロロベンゼンスルホニル、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル（ＭＢＳ）、ｍ−ニトロベンゼンスルホニル、ｏ−ニトロベンゼンスルホニル、ｐ−ニトロベンゼンスルホニル、２，４−ニトロベンゼンスルホニル、２，６−ジメトキシ−４−メチルベンゼンスルホニル（ｉＭｄｓ）、２，６−ジメチル−４−メトキシベンゼンスルホニル（Ｍｄｓ）、２，４，６−トリメトキシベンゼンスルホニル（Ｍｔｂ）、２，３，５，６−テトラメチル−４−メトキシベンゼンスルホニル（Ｍｔｅ）、２，３，６−トリメチル−４−メトキシベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）、２，４，６−トリメチルベンゼンスルホニル（Ｍｔｓ）、ペンタメチルベンゼンスルホニル（Ｐｍｅ）等が挙げられる）等のスルホンアミド系保護基等が挙げられる。
本発明における「ヒドロキシ保護基」及び「アミノ保護基」の保護及び脱保護については、Protective Groups in Organic Synthesis 第４版、T. W. Greene、P. G. M. Wuts著、John Wiley & Sons Inc.（2006年）等を参照可能である。
「アンチセンス効果」とは、標的遺伝子に対応して選択される標的ＲＮＡと、例えば、その部分配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドとがハイブリダイズすることによって、標的ＲＮＡの機能が制御されることを意味する。例えば、標的ＲＮＡがｍＲＮＡの場合、ハイブリダイゼーションにより前記標的ＲＮＡの翻訳が阻害されること、エキソンスキッピング等のスプライシング機能変換効果、ハイブリダイズした部分が認識されることにより前記標的ＲＮＡが分解されること等を意味する。
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、前記アンチセンス効果が生じるオリゴヌクレオチドである。例えば、ＤＮＡ及びオリゴデオキシリボヌクレオチド等が挙げられるが、これらに限定されず、ＲＮＡ、オリゴリボヌクレオチド又はアンチセンス効果が通常生じるように設計されたオリゴヌクレオチド等でもよい。アンチセンス核酸も同様である。
「標的ＲＮＡ」は、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体又はｎｃＲＮＡを意味し、標的遺伝子をコードするゲノムＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ、塩基の修飾を受けていないｍＲＮＡ、スプライシングを受けていないｍＲＮＡ前駆体及びｎｃＲＮＡ等を含む。アンチセンス効果によって機能が制御される「標的ＲＮＡ」としては、特に制限はなく、各種疾患において発現が亢進する遺伝子に関連するＲＮＡが挙げられる。「標的ＲＮＡ」は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって合成されるいかなるＲＮＡでもよく、好ましくはｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ前駆体である。より好ましくは、哺乳動物のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ前駆体であり、更に好ましくは、ヒトのｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ前駆体であり、特に好ましくは、ヒトのｍＲＮＡである。
「ハイブリダイズ」とは、相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに由来する基同士で二重鎖を形成させる行為、及び相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに由来する基同士が二重鎖を形成する現象を意味する。
「相補的」とは、２つの核酸塩基が、水素結合を介して、ワトソン−クリック型塩基対（天然型塩基対）又は非ワトソン−クリック型塩基対（フーグスティーン型塩基対等）を形成できることを意味する。２つのオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに由来する基は、それらの配列が相補的である場合に「ハイブリダイズ」し得る。２つのオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに由来する基がハイブリダイズするために、それらが完全に相補的である必要はないが、２つのオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに由来する基がハイブリダイズするための相補性は、好ましくは７０％以上であり、より好ましくは８０％以上であり、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）である。配列の相補性は、オリゴヌクレオチドの部分配列を自動的に同定するコンピュータープログラムを利用することにより決定することができる。例えば、OligoAnalyzerは、そのようなソフトウエアの１つであり、Integrated DNA Technologies社が提供している。このプログラムは、ウェブサイトでも利用することができる。当業者は、２つのオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに由来する基がハイブリダイズできる条件（温度、塩濃度等）を容易に決定することができる。また、当業者は、例えば、標的ＲＮＡのヌクレオチド配列の情報に基づいて、ＢＬＡＳＴプログラム等を利用することにより、標的ＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを容易に設計することができる。ＢＬＡＳＴプログラムについては、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1990, 87, pp 2264-2268、同1993, 90, pp 5873−5877、及びJournal of Molecular Biology, 1990, 215, pp 403-410等を参照できる。
「ヌクレオチド」は、核酸（オリゴヌクレオチド）の構成単位となりうる分子を意味し、通常、構成要素として塩基を有する。ヌクレオチドは、例えば、糖、塩基及びリン酸から構成される。ヌクレオチドは、後述するリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド及び糖部修飾ヌクレオチドを包含する。
「オリゴヌクレオチド」は、１つ以上の前記ヌクレオチドが重合した構造を有する分子を意味する。「オリゴヌクレオチド」が１つのヌクレオチドから構成されるとき、そのオリゴヌクレオチドは、「ヌクレオチド」と言うことができる。
本発明の「アンチセンスオリゴヌクレオチド」分子が含むヌクレオチドは、それぞれ独立して、互いにホスホジエステル結合、後述する修飾されたホスホジエステル結合又は後述する非ヌクレオチド構造を含む連結基で連結されている。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド分子の３’末端のヌクレオチドは、その３’位に、好ましくはヒドロキシ基又はリン酸基を有し、より好ましくはヒドロキシ基を有し、通常はヒドロキシ基を有する。アンチセンスオリゴヌクレオチド分子の５’末端のヌクレオチドは、その５’位に、好ましくはヒドロキシ基又はリン酸基を有し、より好ましくはヒドロキシ基を有し、通常はヒドロキシ基を有する。
「オリゴヌクレオチドに由来する基」は、前記オリゴヌクレオチドの３’末端及び５’末端の少なくとも一方のヒドロキシ基から水素原子、ヒドロキシ基等を取り除いた基を意味し、他の基（例えば、他のオリゴヌクレオチドに由来する基）と、ホスホジエステル結合若しくは修飾されたホスホジエステル結合を形成して間接的に共有結合で連結されている。前記３’末端又は５’末端のヒドロキシ基とは、リン酸基が有するヒドロキシ基を含む。例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端のヒドロキシ基から水素原子を取り除いた基と、他のオリゴヌクレオチドの５’末端のリン酸基からヒドロキシ基を取り除いた基がホスホジエステル結合若しくは修飾されたホスホジエステル結合を形成する。
「ヌクレオチド配列」は、オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドの塩基配列を意味する。
本明細書において、「配列部分」は、オリゴヌクレオチド鎖の部分構造を意味する。例えば、ヌクレオチドを含む配列部分は、オリゴヌクレオチド鎖のうち、該ヌクレオチドを含む領域の部分構造である。
「デオキシリボヌクレオチド」は、糖が２’−デオキシリボースであり、２’−デオキシリボースの１’位の炭素原子に塩基が結合し、３’位又は５’位にリン酸基を有する分子を意味する。本発明におけるデオキシリボヌクレオチドは、天然に存在するデオキシリボヌクレオチドであっても、天然に存在するデオキシリボヌクレオチドの塩基部分若しくはホスホジエステル結合部分が修飾されたデオキシリボヌクレオチドであってもよい。塩基部分の修飾やホスホジエステル結合部位の修飾は１つのデオキシリボヌクレオチドに対して、複数種組み合わせて施されてもよい。前記修飾されたデオキシリボヌクレオチドは、例えば、Journal of Medicinal Chemistry, 2016, 59, pp 9645-9667、Medicinal Chemistry Communication, 2014, 5, pp 1454-1471、Future Medicinal Chemistry, 2011, 3, pp 339-365等に記載されている。
前記「デオキシリボヌクレオチド」が本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド分子を構成する際、通常、デオキシリボヌクレオチドの３’位がホスホジエステル結合又は修飾されたホスホジエステル結合（例えば、ホスホロチオエート結合）で他のヌクレオチド等と連結され、デオキシリボヌクレオチドの５’位がホスホジエステル結合又は修飾されたホスホジエステル結合（例えば、ホスホロチオエート結合）で別のヌクレオチド等と連結されている。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド分子の３’末端のデオキシリボヌクレオチドは、その３’位に、好ましくはヒドロキシ基又はリン酸基を有し、５’位は前述の通りである。アンチセンスオリゴヌクレオチド分子の５’末端のデオキシリボヌクレオチドは、その５’位に、好ましくはヒドロキシ基又はリン酸基を有し、３’位は前述の通りである。
「オリゴデオキシリボヌクレオチド」は、前記デオキシリボヌクレオチドにより構成されるオリゴヌクレオチドを意味する。オリゴデオキシリボヌクレオチドを構成するデオキシリボヌクレオチドは、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。
「ＤＮＡ」は、天然のデオキシリボヌクレオチドにより構成されるオリゴヌクレオチドを意味する。ＤＮＡを構成する天然のデオキシリボヌクレオチドは、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。
「リボヌクレオチド」は、糖がリボースであり、リボースの１’位の炭素原子に塩基が結合し、２’位、３’位又は５’位にリン酸基を有する分子を意味する。本発明におけるリボヌクレオチドは、天然に存在するリボヌクレオチドであっても、天然に存在するリボヌクレオチドの塩基部分若しくはホスホジエステル結合部分が修飾されたリボヌクレオチドであってもよい。塩基部分の修飾やホスホジエステル結合部位の修飾は１つのリボヌクレオチドに対して、複数種組み合わせて施されてもよい。前記修飾されたリボヌクレオチドは、例えば、Journal of Medicinal Chemistry, 2016, 59, pp 9645-9667、Medicinal Chemistry Communication, 2014, 5, pp 1454-1471、Future Medicinal Chemistry, 2011, 3, pp 339-365等に記載されている。
前記「リボヌクレオチド」が本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド分子を構成する際、典型的には、リボヌクレオチドの３’位がホスホジエステル結合又は修飾されたホスホジエステル結合（例えば、ホスホロチオエート結合）で他のヌクレオチドと連結され、リボヌクレオチドの５’位がホスホジエステル結合又は修飾されたホスホジエステル結合（例えば、ホスホロチオエート結合）で別のヌクレオチド等と連結されている。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド分子の３’末端のリボヌクレオチドは、その３’位に、好ましくはヒドロキシ基又はリン酸基を有し、５’位は前述の通りである。アンチセンスオリゴヌクレオチド分子の５’末端のリボヌクレオチドは、その５’位に、好ましくはヒドロキシ基又はリン酸基を有し、３’位は前述の通りである。
「オリゴリボヌクレオチド」は、前記リボヌクレオチドにより構成されるオリゴヌクレオチドを意味する。オリゴリボヌクレオチドを構成するリボヌクレオチドは、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。
「ＲＮＡ」は、天然のリボヌクレオチドにより構成されるオリゴヌクレオチドを意味する。ＲＮＡを構成する天然のリボヌクレオチドは、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。
「糖部修飾ヌクレオチド」は、前記デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの糖部分が、部分的に１つ以上の置換基によって置換されているか、又はその糖骨格全体がリボース及び２’−デオキシリボースとは異なる糖骨格（例えば、ヘキシトール、トレオース等の５から６員の糖骨格）に置き換えられているか、あるいはその糖骨格全体又は糖骨格の環の部分が５から７員の飽和若しくは不飽和環（例えば、シクロヘキサン、シクロヘキセン、モルホリン等）又は５から７員の環を水素結合によって形成し得る部分構造（例えば、ペプチド構造）に置き換えられているか、又は糖部分の環が開環しているか、さらに、該開環した部分が修飾されたヌクレオチドを意味する。「糖部修飾ヌクレオチド」の塩基部分は、天然に存在する塩基であっても修飾された塩基であってもよい。また、「糖部修飾ヌクレオチド」のホスホジエステル結合部分は、ホスホジエステル結合であっても修飾されたホスホジエステル結合であってもよい。塩基部分の修飾やホスホジエステル結合部位の修飾は１つの糖部修飾ヌクレオチドに対して、複数種組み合わせて施されてもよい。前記開環した部分の修飾は、例えば、ハロゲン化、アルキル化（例えば、メチル化、エチル化）、ヒドロキシ化、アミノ化、及びチオ化等の他に、デメチル化等も含む。
「糖部修飾ヌクレオチド」は、架橋化ヌクレオチドであっても、非架橋化ヌクレオチドであってもよい。糖部修飾ヌクレオチドとしては、例えば、特開平１０−３０４８８９号公報、国際公開第２００５／０２１５７０号、特開平１０−１９５０９８号公報、特表２００２−５２１３１０号公報、国際公開第２００７／１４３３１５号、国際公開第２００８／０４３７５３号、国際公開第２００８／０２９６１９号、Journal of Medicinal Chemistry, 2008, 51, p 2766及び国際公開第２００８／０４９０８５号（以下、これら文献を「アンチセンス法に関する文献」と称する）等において、アンチセンス法に好適に用いられるとして開示されているヌクレオチド等が挙げられる。前記文献には、ヘキシトールヌクレオチド（ＨＮＡ）、シクロヘキセンヌクレオチド（ＣｅＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオヌクレオチド（ＴＮＡ）、モルホリノ核酸、トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）化ヌクレオチド、２’−Ｏ−アミノプロピル（ＡＰ）化ヌクレオチド、２’−フルオロ化ヌクレオチド、２’−Ｆ−アラビノヌクレオチド（２’−Ｆ−ＡＮＡ）、架橋化ヌクレオチド（ＢＮＡ（Bridged Nucleic Acid））、２’−Ｏ−（Ｎ−メチルアセトアミド）（ＮＭＡ）化ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルカルバモイルエチル（ＭＣＥ）化ヌクレオチド等のヌクレオチドが開示されている。さらに、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2008, 18, pp 2296-2300（上述の、非特許文献１）、The Journal of Biological Chemistry, 2004, 279, pp 36317-36326（上述の、非特許文献２）には、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチ等のヌクレオチドが開示されている。また、Journal of Medicinal Chemistry, 2016, 59, pp 9645-9667、Medicinal Chemistry Communication, 2014, 5, pp 1454-1471、Future Medicinal Chemistry, 2011, 3, pp 339-365等にも、糖部修飾ヌクレオチドが開示されている。
前記「糖部修飾ヌクレオチド」が本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド分子を構成する際、例えば、該糖部修飾ヌクレオチドの３’位がホスホジエステル結合又は修飾されたホスホジエステル結合（例えば、ホスホロチオエート結合）で他のヌクレオチド等と連結され、該糖部修飾ヌクレオチドの５’位がホスホジエステル結合又は修飾されたホスホジエステル結合（例えば、ホスホロチオエート結合）で別のヌクレオチド等と連結されている。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド分子の３’末端の糖部修飾ヌクレオチドは、例えば、その３’位に、好ましくはヒドロキシ基又はリン酸基を有し、５’位は前述の通りである。アンチセンスオリゴヌクレオチド分子の５’末端の糖部修飾ヌクレオチドは、例えば、その５’位に、好ましくはヒドロキシ基又はリン酸基を有し、３’位は前述の通りである。
デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及び糖部修飾ヌクレオチドにおけるホスホジエステル結合部分の修飾の例としては、ホスホロチオエート化、メチルホスホネート化（キラル−メチルホスホネート化を含む）、メチルチオホスホネート化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化、ホスホロジアミデート化、ホスホロアミドチオエート化及びボラノホスフェート化等が挙げられる。また、Journal of Medicinal Chemistry, 2016, 59, pp 9645-9667、Medicinal Chemistry Communication, 2014, 5, pp 1454-1471、Future Medicinal Chemistry, 2011, 3, pp 339-365等に、ヌクレオチドにおけるホスホジエステル結合部分の修飾の例が開示されており、これらをデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及び糖部修飾ヌクレオチドにおけるホスホジエステル結合部分に用いることができる。
「架橋化ヌクレオチド」とは、糖部分における２箇所の置換によって架橋ユニットが置換された糖部修飾ヌクレオチドであり、例えば、２’−４’架橋ヌクレオチド及び、２’−３’架橋ヌクレオチド、３’−５’架橋ヌクレオチド等が挙げられる。
２’−４’架橋ヌクレオチド（２’，４’−ＢＮＡ）は、２’位の炭素原子と４’位の炭素原子とが、２以上の原子によって架橋されている糖部分を有するヌクレオチドであり、例えば、Ｃ２−Ｃ６アルキレン（該アルキレンは無置換であるか、又はハロゲン原子、オキソ及びチオキソからなる群から選択される１個以上の置換基で置換されており、かつ該アルキレンの１若しくは２つのメチレンは、置き換えられていないか、又は独立して−Ｏ−、−ＮＲ１３−（Ｒ１３は、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル又はハロＣ１−Ｃ６アルキルを示す）及び−Ｓ−からなる群から選択される基で置き換えられている）で架橋された糖部分を有するヌクレオチドが挙げられる。
前記置換と置き換えを組み合わせて、２’，４’−ＢＮＡの２’位と４’位を架橋する基は、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ１３−（Ｒ１３は、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル又はハロＣ１−Ｃ６アルキルを示す）、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ１３−（Ｒ１３は、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル又はハロＣ１−Ｃ６アルキルを示す）、−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＲ１３−（Ｒ１３は、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル又はハロＣ１−Ｃ６アルキルを示す）等で表される基を含んでいてもよい。
このようなＢＮＡとしては、例えば、ＬＮＡとも称されるロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（登録商標））、α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ又はβ−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、ＥＮＡとも称されるエチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、β−Ｄ−チオ（４’−ＣＨ２−Ｓ−２’）ＢＮＡ、アミノオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ２１）−２’）ＢＮＡ（Ｒ２１は、Ｈ又はＣＨ３である）、２’，４’−ＢＮＡＮＣとも称されるオキシアミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ２２）−Ｏ−２’）ＢＮＡ（Ｒ２２は、Ｈ又はＣＨ３である）、２’，４’−ＢＮＡＣＯＣ、３’−アミノ−２’，４’−ＢＮＡ、５’−メチルＢＮＡ、ｃＥｔ−ＢＮＡとも称される（４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、ｃＭＯＥ−ＢＮＡとも称される（４’−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、ＡｍＮＡとも称されるアミド型ＢＮＡ（４’−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ１４）−２’）ＢＮＡ（Ｒ１４は、Ｈ又はＣＨ３である）、ｓｃｐＢＮＡとも称される（４’−Ｃ（スピロ−シクロプロピル）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、当業者に知られた他のＢＮＡ等が挙げられる。
２’−３’架橋ヌクレオチドは、２’位の炭素原子と３’位の炭素原子とが、１以上の原子によって架橋されている糖部分を有するヌクレオチドであり、例えば、下記式（Ｉ）で示される部分構造（糖部分及び塩基部分）を有するヌクレオチドが挙げられる。
式中、ｍは、１、２、３又は４であり、
Ｂｘは、核酸塩基部分であり、
Ｘは、Ｏ又はＳであり、
−Ｑ−は、それぞれ独立して、−ＣＲ４Ｒ５−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｃ（＝ＮＲ６）−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＲ６−又は−Ｓ−であり、
ｍが、２、３又は４であるとき、２つの隣り合った−Ｑ−は、一緒に
式 −ＣＲ７＝ＣＲ８−
で表される基を形成してもよく、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、１つ以上の置換基で置換されたＣ２−Ｃ６アルケニル、１つ以上の置換基で置換されたＣ２−Ｃ６アルキニル、アシル、１つ以上の置換基で置換されたアシル、１つ以上の置換基で置換されたアミド、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルコキシ、スルファニル、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ又は１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルチオであり；ここで、前記置換基は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、オキソ、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、アジド、ＯＣ（＝Ｙ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｙ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｙ）ＮＪ１Ｊ２及びシアノからなる群から独立して選択され、Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、それぞれ独立して、水素原子又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、かつＹは、Ｏ、Ｓ又はＮＪ４であり、Ｊ４はＣ１−Ｃ１２アルキル又はアミノ保護基であり；
Ｒ６は、Ｃ１−Ｃ１２アルキル又はアミノ保護基であり、
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素原子又はＣ１−Ｃ６アルキルである。
３’−５’架橋ヌクレオチドは、３’位の炭素原子と５’位の炭素原子とが、２以上の原子によって架橋されている糖部分を有するヌクレオチドである。例えば、トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）が挙げられる。
３’位修飾非架橋ヌクレオチドは、３’位の炭素原子が修飾された、非架橋のヌクレオチドであり、例えば、下記式（II）で示される部分構造（糖部分及び塩基部分）を有するヌクレオチドが挙げられる。
式中、Ｂｘは、核酸塩基部分であり、
Ｘは、Ｏ又はＳであり、
Ｒ１２は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、１つ以上の置換基で置換されたＣ２−Ｃ６アルケニル、１つ以上の置換基で置換されたＣ２−Ｃ６アルキニル、アシル、１つ以上の置換基で置換されたアシル、１つ以上の置換基で置換されたアミド、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルコキシ、スルファニル、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ又は１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルチオであり；ここで、前記置換基は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、オキソ、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、アジド、ＯＣ（＝Ｙ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｙ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｙ）ＮＪ１Ｊ２及びシアノからなる群から独立して選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ１１は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、１つ以上の置換基で置換されたＣ２−Ｃ６アルケニル、１つ以上の置換基で置換されたＣ２−Ｃ６アルキニル、アシル、１つ以上の置換基で置換されたアシル、１つ以上の置換基で置換されたアミド、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルコキシ、スルファニル、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ又は１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルチオであり；ここで、前記置換基は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、オキソ、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、アジド、ＯＣ（＝Ｙ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｙ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｙ）ＮＪ１Ｊ２及びシアノからなる群から独立して選択され；
Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、それぞれ独立して、水素原子又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、かつＹは、Ｏ、Ｓ又はＮＪ４であり、Ｊ４はＣ１−Ｃ１２アルキル又はアミノ保護基である。
２’位修飾非架橋ヌクレオチドは、２’位の酸素原子又は炭素原子が修飾された、非架橋のヌクレオチドであり、例えば、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）化ヌクレオチド、２’−Ｏ−アミノプロピル（ＡＰ）化ヌクレオチド、２’−フルオロ化ヌクレオチド、２’−Ｏ−（Ｎ−メチルアセトアミド）（ＮＭＡ）化ヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチルカルバモイルエチル（ＭＣＥ）化ヌクレオチド等が挙げられる。
糖部修飾ヌクレオチドは、ここで例示されたものに限定されるわけではない。多数の糖部修飾ヌクレオチドが当該分野では知られており、例えば、Tachasらの米国特許第８２９９０３９号明細書（特に１７から２２欄）、又はJournal of Medicinal Chemistry, 2016, 59, pp 9645-9667、Medicinal Chemistry Communication, 2014, 5, pp 1454-1471、Future Medicinal Chemistry, 2011, 3, pp 339-365等に記載の糖部修飾ヌクレオチドを、本発明の実施態様として利用することもできる。
当業者であれば、このような糖部修飾ヌクレオチドの中から、アンチセンス効果、標的ＲＮＡの部分配列に対する親和性、核酸分解酵素に対する耐性等の観点を考慮し、適宜糖部修飾ヌクレオチドを選択して利用することができる。
「核酸塩基」とは、一般に、核酸を構成する塩基成分であり、天然の核酸塩基として、プリン塩基：アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基：チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（ｕ）を含む。本明細書に使用されるデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及び糖部修飾ヌクレオチドの塩基部分には、天然の核酸塩基及びその修飾された核酸塩基を用いることができる。修飾された核酸塩基は、任意の核酸塩基（好ましくは、修飾前の核酸塩基に相補的な塩基）と塩基対を形成しうる（すなわち、水素結合を形成しうる）。典型的には、修飾された核酸塩基には、５―メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５―ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及びその他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及びその他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、ピリミジン塩基の５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシル及びシトシン及びその他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及びその他の８位が置換されたアデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及びその他の５位が置換されたウラシル、及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ-アデニン、８―アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンを含む。さらなる修飾された核酸塩基には、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、置換されたフェノキサジンシチジンなどのＧ−クランプ（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）などの三環系ピリミジンを含む。また、修飾された核酸塩基には、プリン又はピリミジン塩基がその他の複素環で置換されたもの、例えば７−デアザアデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン及び２−ピリドンを含んでいてもよい。また、Journal of Medicinal Chemistry, 2016, 59, pp 9645-9667、Medicinal Chemistry Communication, 2014, 5, pp 1454-1471、Future Medicinal Chemistry, 2011, 3, pp 339-365、国際公開第２００７／０９００７１号等に、ヌクレオチドにおける塩基部分の修飾の例が開示されており、これらをデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及び糖部修飾ヌクレオチドにおける塩基部分に用いることができる。塩基部分のアミノ及びヒドロキシは、それぞれ独立に、保護されていてもよい。
デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及び糖部修飾ヌクレオチドにおける塩基部分は、好ましくは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）及び５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）からなる群から選ばれる少なくとも１種である。
「ＲＮａｓｅＨ」は、一般的には、ＤＮＡとＲＮＡとがハイブリダイズした二重鎖を認識して、そのＲＮＡを切断し一本鎖ＤＮＡを生じさせるリボヌクレアーゼとして知られている。ＲＮａｓｅＨは、ＤＮＡとＲＮＡがハイブリダイズした二重鎖に限らず、ＤＮＡ及びＲＮＡの少なくとも一方の、塩基部分、ホスホジエステル結合部分及び糖部分の少なくとも１つが修飾された二重鎖をも認識し得る。例えば、オリゴデオキシリボヌクレオチドとオリゴリボヌクレオチドがハイブリダイズした二重鎖をも認識し得る。
よって、ＤＮＡは、ＲＮＡとハイブリダイズした際に、ＲＮａｓｅＨによって認識され得る。ＤＮＡ及びＲＮＡの少なくとも一方において、塩基部分、ホスホジエステル結合部分及び糖部分の少なくとも１つが修飾された場合も、同様である。例えば、代表的なものとして、ＤＮＡのホスホジエステル結合部分が、ホスホロチオエートに修飾されたオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
ＲＮＡは、ＤＮＡとハイブリダイズした際に、ＲＮａｓｅＨによって切断され得る。ＤＮＡ及びＲＮＡの少なくとも一方において、塩基部分、ホスホジエステル結合部分及び糖部分の少なくとも１つが修飾された場合も、同様である。
ＲＮａｓｅＨによって認識され得るＤＮＡ及び／又はＲＮＡの修飾例は、例えば、Nucleic Acids Research, 2014, 42, pp 5378-5389、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2008, 18, pp 2296-2300（上述の、非特許文献１）、Molecular BioSystems, 2009, 5, pp 838-843、Nucleic Acid Therapeutics, 2015, 25, pp 266-274、The Journal of Biological Chemistry, 2004, 279, pp 36317-36326（上述の、非特許文献２）等に記載されている。
本発明に用いられるＲＮａｓｅＨは、好ましくは哺乳動物のＲＮａｓｅＨであり、より好ましくはヒトのＲＮａｓｅＨであり、特に好ましくはヒトＲＮａｓｅＨ１である。
「ギャップ領域」は、「ＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４個の連続するヌクレオチド」を含む領域であり、４個以上の連続するヌクレオチドを含み、ＲＮａｓｅＨによって認識される限り特に限定されないが、該連続するヌクレオチドは、好ましくはデオキシリボヌクレオチド及び糖部修飾ヌクレオチドから独立して選ばれる。
「５’ウィング領域」は、ギャップ領域の５’側に連結し、前記「ＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４個の連続するヌクレオチド」を含まずに「少なくとも１個のヌクレオチド」を含む領域であり、ここで、５’ウィング領域の３’末端のヌクレオチドの糖部分は、ギャップ領域の５’末端のヌクレオチドの糖部分と異なっている。糖部分の違いにより、５’ウィング領域とギャップ領域の境界が確認される。（例えば、ギャップ領域の５’末端のヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドであり、５’ウィング領域の３’末端のヌクレオチドは、糖部修飾ヌクレオチドである。）５’ウィング領域の３’末端のヌクレオチドは、一般的に、糖部修飾ヌクレオチドである。５’ウィング領域は、上記定義を満たす限り特に限定されないが、該少なくとも１個のヌクレオチドは、好ましくはデオキシリボヌクレオチド及び糖部修飾ヌクレオチドから独立して選ばれ、少なくとも１個の糖部修飾ヌクレオチドを含む。
「３’ウィング領域」は、ギャップ領域の３’側に連結し、前記「ＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４個の連続するヌクレオチド」を含まずに「少なくとも１個のヌクレオチド」を含む領域であり、ここで、３’ウィング領域の５’末端のヌクレオチドの糖部分は、ギャップ領域の３’末端のヌクレオチドの糖部分と異なっている。糖部分の違いにより、３’ウィング領域とギャップ領域の境界が確認される。（例えば、ギャップ領域の３’末端のヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドであり、３’ウィング領域の５’末端のヌクレオチドは、糖部修飾ヌクレオチドである。）３’ウィング領域の５’末端のヌクレオチドは、一般的に、糖部修飾ヌクレオチドである。３’ウィング領域は、上記定義を満たす限り特に限定されないが、該少なくとも１個のヌクレオチドは、好ましくはデオキシリボヌクレオチド及び糖部修飾ヌクレオチドから独立して選ばれ、少なくとも１個の糖部修飾ヌクレオチドを含む。
ギャップ領域、５’ウィング領域及び３’ウィング領域を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマー型アンチセンスオリゴヌクレオチドと呼ばれる。
「中央領域」は、オリゴヌクレオチドにおける中央の領域である。
「５’側領域」は、前記「中央領域」の５’側に連結し、少なくとも１個のヌクレオチドを含む領域である。
「３’側領域」は、前記「中央領域」の３’側に連結し、少なくとも１個のヌクレオチドを含む領域である。
３’ 側領域の５’末端のヌクレオチドの糖部分は、中央領域の３’末端のヌクレオチドの糖部分と異なっている。糖部分の違いにより、３’ 側領域と中央領域の境界が確認される。５’ 側領域の３’末端のヌクレオチドの糖部分は、中央領域の５’末端のヌクレオチドの糖部分と異なっている。糖部分の違いにより、５’ 側領域と中央領域の境界が確認される。
「ＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４個の連続するヌクレオチド」は、４個以上の連続するヌクレオチドを含み、ＲＮａｓｅＨによって認識される限り特に限定されないが、例えば、「少なくとも４個の連続するデオキシリボヌクレオチド」及び「デオキシリボヌクレオチド、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドからなる群から独立して選択される、連続する少なくとも４個のヌクレオチド」などが挙げられる。ヌクレオチドの数は、例えば、５〜３０であり、好ましくは５〜１５であり、より好ましくは８〜１２である。
ある少なくとも４個の連続するヌクレオチドが、「ＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４個の連続するヌクレオチド」であるかどうか、当業者は、その連続するヌクレオチドの糖部分の構造により、判断できる。
次に、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドについて説明する。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの全体とハイブリダイズする必要はなく、標的ＲＮＡの少なくとも一部とハイブリダイズすればよいが、通常は、標的ＲＮＡの少なくとも一部とハイブリダイズする。例えば、標的ＲＮＡの部分配列に相補的なアンチセンス配列を有するオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチド又は通常アンチセンス効果が生じるように設計されたオリゴヌクレオチド等）と標的ＲＮＡの少なくとも一部がハイブリダイズすることによって、標的遺伝子の発現が制御される。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドの全体がハイブリダイズする必要はなく、一部がハイブリダイズしなくてもよい。アンチセンス配列部分の全体は、一部がハイブリダイズしなくてもよいが、ハイブリダイズすることが、好ましい。
なお、「アンチセンス配列」とは、標的ＲＮＡとのハイブリダイズを可能にするオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドの塩基配列を意味し、「アンチセンス配列部分」は、オリゴヌクレオチド鎖のうち、前記アンチセンス配列を有する領域の部分構造を意味する。
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドのアンチセンス配列部分と標的ＲＮＡの部分配列との相補性は、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）である。アンチセンスオリゴヌクレオチドのアンチセンス配列部分と標的ＲＮＡの少なくとも一部とがハイブリダイズするために、それらの配列が完全に相補的である必要はないが、完全に相補的であることがさらにより好ましい。
当業者は、「標的ＲＮＡとのハイブリダイズを可能にする」アンチセンス配列に適合する塩基配列を、ＢＬＡＳＴプログラム等を利用することにより容易に決定することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、中央領域、５’側領域及び３’側領域を有する。中央領域は好ましくは、ギャップ領域であり、５’側領域は、好ましくは５’ウィング領域であり、３’側領域は、３’ウィング領域である。
中央領域は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及び糖部修飾ヌクレオチドからなる群より独立して選択される少なくとも５個のヌクレオチドからなり、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドからなる群から選択される糖部修飾ヌクレオチドを少なくとも一つ含み、その３’末端及び５’末端が、それぞれ独立して、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、２’−３’架橋ヌクレオチド又は３’位修飾非架橋ヌクレオチドであり、そしてデオキシリボヌクレオチド、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドからなる群から独立して選択される、連続する少なくとも４個のヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチド鎖を、少なくとも一つ含む。
中央領域に含まれるヌクレオチドの数は、５〜３０であり、好ましくは５〜１５であり、より好ましくは８〜１２であり、特に好ましくは、９又は１０である。中央領域に含まれるヌクレオチドの数は、通常、前記標的ＲＮＡに対するアンチセンス効果の強さ、毒性の低さ、費用、合成収率等の他の要素に応じて選択される。
中央領域は、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドからなる群から選択される糖部修飾ヌクレオチドを少なくとも一つ含む。次に、中央領域に含まれる２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドについて説明する。
中央領域に含まれる、２’−３’架橋ヌクレオチドの部分構造は、好ましくは、下記式（Ｉ）で示される。
式（Ｉ）中、Ｂｘは、核酸塩基部分である。
核酸塩基部分には、前述の「核酸塩基」を用いることができる。
式（Ｉ）において、Ｘは、Ｏ又はＳである。Ｘは、好ましくはＯである。
ｍは、１、２、３又は４である。
−Ｑ−は、それぞれ独立して、−ＣＲ４Ｒ５−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｃ（＝ＮＲ６）−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＲ６−又は−Ｓ−であり、ｍが、２、３又は４であるとき、２つの隣り合った−Ｑ−は、一緒に
式 −ＣＲ７＝ＣＲ８−
で表される基を形成してもよい。
式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、１つ以上の置換基で置換されたＣ２−Ｃ６アルケニル、１つ以上の置換基で置換されたＣ２−Ｃ６アルキニル、アシル、１つ以上の置換基で置換されたアシル、１つ以上の置換基で置換されたアミド、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルコキシ、スルファニル、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ又は１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルチオであり；ここで、前記置換基は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、オキソ、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、アジド、ＯＣ（＝Ｙ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｙ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｙ）ＮＪ１Ｊ２及びシアノからなる群から独立して選択され、Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、それぞれ独立して、水素原子又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、かつＹは、Ｏ、Ｓ又はＮＪ４であり、Ｊ４はＣ１−Ｃ１２アルキル又はアミノ保護基であり；Ｒ６は、Ｃ１−Ｃ１２アルキル又はアミノ保護基であり、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素原子又はＣ１−Ｃ６アルキルである。
式（Ｉ）において、核酸塩基部分は、好ましくは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）及び５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）からなる群から選ばれる少なくとも１種である。Ｒ１は、好ましくは水素原子又はＣ１−Ｃ３アルキルであり、より好ましくは水素原子である。Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、好ましくは水素原子又はＣ１−Ｃ３アルキルであり、より好ましくは水素原子である。
Ｒ６は、好ましくはＣ１−Ｃ３アルキルであり、より好ましくはメチルである。
式（Ｉ）において、ｍは、好ましくは１、２又は３であり、さらに好ましくは２又は３であり、特に好ましくは２である。
ｍが２の場合、中央領域に含まれる、好ましい２’−３’架橋ヌクレオチドの部分構造は、下記式（III）で示される。
式（III）において、Ｂｘは、核酸塩基部分である。
核酸塩基部分には、前述の「核酸塩基」を用いることができる。
Ｘは、Ｏ又はＳである。
−Ｑ１−及び−Ｑ２−は、それぞれ独立して、−ＣＲ４Ｒ５−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｃ（＝ＮＲ６）−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＲ６−又は−Ｓ−であるか、又は、−Ｑ１−Ｑ２−は、−ＣＲ７＝ＣＲ８−であり；かつ、式中、Ｒ７及びＲ８は独立して水素原子又はＣ１−Ｃ６アルキルである。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、１つ以上の置換基で置換されたＣ２−Ｃ６アルケニル、１つ以上の置換基で置換されたＣ２−Ｃ６アルキニル、アシル、１つ以上の置換基で置換されたアシル、１つ以上の置換基で置換されたアミド、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルコキシ、スルファニル、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ又は１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルチオであり；ここで、前記置換基は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、オキソ、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、アジド、ＯＣ（＝Ｙ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｙ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｙ）ＮＪ１Ｊ２及びシアノからなる群から独立して選択され、Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、それぞれ独立して、水素原子又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、かつＹは、Ｏ、Ｓ又はＮＪ４であり、Ｊ４はＣ１−Ｃ１２アルキル又はアミノ保護基であり；Ｒ６は、Ｃ１−Ｃ１２アルキル又はアミノ保護基である。
式（III）におけるＸ、Ｂｘ及びＲ１〜Ｒ８は、式（Ｉ）におけるＸ、Ｂｘ及びＲ１〜Ｒ８と同義であり、好ましい態様も同様である。
−Ｑ１−が−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＲ６−又は−Ｓ−であり、該Ｒ６はＣ１−Ｃ１２アルキルであり、−Ｑ２−が−ＣＨ２−であることが好ましく、−Ｑ１−が−Ｏ−であり、−Ｑ２−が−ＣＨ２−であることがさらに好ましい。
中央領域に含まれる、３’位修飾非架橋ヌクレオチドの部分構造は、好ましくは、下記式（II）で示される。
式（II）において、Ｂｘは、核酸塩基部分である。
Ｘは、Ｏ又はＳである。
Ｒ１２は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、１つ以上の置換基で置換されたＣ２−Ｃ６アルケニル、１つ以上の置換基で置換されたＣ２−Ｃ６アルキニル、アシル、１つ以上の置換基で置換されたアシル、１つ以上の置換基で置換されたアミド、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルコキシ、スルファニル、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ又は１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルチオであり；ここで、前記置換基は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、オキソ、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、アジド、ＯＣ（＝Ｙ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｙ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｙ）ＮＪ１Ｊ２及びシアノからなる群から独立して選択される。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ１１は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、１つ以上の置換基で置換されたＣ２−Ｃ６アルケニル、１つ以上の置換基で置換されたＣ２−Ｃ６アルキニル、アシル、１つ以上の置換基で置換されたアシル、１つ以上の置換基で置換されたアミド、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルコキシ、スルファニル、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ又は１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルチオであり；ここで、前記置換基は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、オキソ、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、アジド、ＯＣ（＝Ｙ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｙ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｙ）ＮＪ１Ｊ２及びシアノからなる群から独立して選択され；Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、それぞれ独立して、水素原子又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、かつＹは、Ｏ、Ｓ又はＮＪ４であり、Ｊ４はＣ１−Ｃ１２アルキル又はアミノ保護基である。
式（II）におけるＸ、Ｂｘ及びＲ１〜Ｒ３は、式（Ｉ）におけるＸ、Ｂｘ及びＲ１〜Ｒ３と同義であり、好ましい態様も同様である。
Ｒ１１は、好ましくは水素原子又はＣ１−Ｃ３アルキルであり、より好ましくは水素原子である。
Ｒ１２は、好ましくはＣ１−Ｃ６アルキル又は１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルであり、より好ましくはＣ１−Ｃ３アルキルであり、特に好ましくはメチルである。
中央領域は、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドをともに含んでいてもよい。中央領域に含まれる２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドの数（総数）は、１〜３０であり、好ましくは１〜５であり、より好ましくは１〜２であり、特に好ましくは１である。中央領域に含まれる２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドの数は、通常、前記標的ＲＮＡに対するアンチセンス効果の強さ、毒性の低さ、費用、合成収率等の他の要素に応じて選択される。
中央領域に含まれる２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドは、中央領域の任意の箇所に含むことができるが、中央領域の３’末端から数えて３つ目のヌクレオチドから、５’末端までの間に含むことが好ましい。２’−３’架橋ヌクレオチド又は３’位修飾非架橋ヌクレオチドを含む箇所は、通常、前記標的ＲＮＡに対するアンチセンス効果の強さ、毒性の低さ等の他の要素に応じて選択される。
ＳＮＰを有する部分を標的とする場合、ある実施態様においては、変異した塩基と塩基対を形成する塩基と近い配列部分（例えば、変異した塩基と塩基対を形成する塩基から数えて、５つ目以内、４つ目以内、３つ目以内、２つ目以内、１つ目以内）に、２’−３’架橋ヌクレオチド又は３’位修飾非架橋ヌクレオチドを含むことが好ましい。変異した塩基と塩基対を形成する塩基が、２’−３’架橋ヌクレオチド又は３’位修飾非架橋ヌクレオチドであることが特に好ましい。
中央領域に含まれるヌクレオチドのうち、少なくとも１個のヌクレオチドがホスホロチオエート化されていることが好ましく、８０％のヌクレオチドがホスホロチオエート化されていることが更に好ましく、９０％のヌクレオチドがホスホロチオエート化されていることが更により好ましく、全てがホスホロチオエート化されていることが特に好ましい。
５’側領域は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及び糖部修飾ヌクレオチドからなる群から独立して選択される少なくとも１個のヌクレオチドからなり、その３’末端が、糖部修飾ヌクレオチドであり、ここで、該３’末端の糖部修飾ヌクレオチドは、中央領域に結合し、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドを除く糖部修飾ヌクレオチドから選択され、そしてデオキシリボヌクレオチド、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドからなる群から独立して選択される、連続する少なくとも４個のヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチド鎖を含まない。
３’側領域は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及び糖部修飾ヌクレオチドからなる群から独立して選択される少なくとも１個のヌクレオチドからなり、その５’末端が、糖部修飾ヌクレオチドであり、ここで、該５’末端の糖部修飾ヌクレオチドは、中央領域に結合し、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドを除く糖部修飾ヌクレオチドから選択され、そしてデオキシリボヌクレオチド、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドからなる群から独立して選択される、連続する少なくとも４個のヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチド鎖を含まない。
５’側領域に含まれるヌクレオチドの数は、１〜１５であり、好ましくは１〜７であり、より好ましくは２〜５であり、特に好ましくは、３である。５’側領域に含まれるヌクレオチドの数は、通常、前記標的ＲＮＡに対するアンチセンス効果の強さ、毒性の低さ、費用、合成収率等の他の要素に応じて選択される。３’側領域は、５’側領域と同様である。
５’側領域に含まれる糖部修飾ヌクレオチドは、置換等により、標的ＲＮＡの部分配列に対する親和性が増大したヌクレオチド又は核酸分解酵素に対する耐性が増大したヌクレオチドが好ましい。より好ましくは、２’位修飾非架橋ヌクレオチド及び２’，４’−ＢＮＡから独立して選択される。
２’位修飾非架橋ヌクレオチドは、好ましくは、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）化ヌクレオチド、２’−Ｏ−アミノプロピル（ＡＰ）化ヌクレオチド、２’−フルオロ化ヌクレオチド、２’−Ｏ−（Ｎ−メチルアセトアミド）（ＮＭＡ）化ヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチルカルバモイルエチル（ＭＣＥ）化ヌクレオチドからなる群から独立して選択され、より好ましくは、２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）化ヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチルカルバモイルエチル（ＭＣＥ）化ヌクレオチドから独立して選択され、特に好ましくは、２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）化ヌクレオチドである。
２’，４’−ＢＮＡは、好ましくは、ＬＮＡ、ｃＥｔ−ＢＮＡ、ＥＮＡ、ＢＮＡＮＣ、ＡｍＮＡ及びｓｃｐＢＮＡであり、より好ましくは下記式（VI）で表わされる部分構造を含むＬＮＡである。３’側領域は、５’側領域と同様である。
式中、Ｂｘは、核酸塩基部分を表し、式（Ｉ）におけるＢｘと同義である。
５’側領域における糖部修飾ヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの種類、数及び位置は、ここで開示するアンチセンスオリゴヌクレオチドが奏するアンチセンス効果等に影響を与えうる。その種類、数及び位置は、標的ＲＮＡの配列等によっても異なるため、一概には言えないが、当業者は、前記アンチセンス法に関する文献の記載を参酌しながら、好ましい態様を決定することができる。また、塩基部分、糖部分又はホスホジエステル結合部分の修飾後のオリゴヌクレオチドが有するアンチセンス効果を測定し、得られた測定値が、修飾前のオリゴヌクレオチドのそれよりも有意に低下していなければ（例えば、修飾後オリゴヌクレオチドの測定値が修飾前のオリゴヌクレオチドの測定値の３０％以上であれば）、当該修飾が好ましい態様であると評価することができる。アンチセンス効果の測定は、例えば、後述の実施例において示されているように、細胞等に被検オリゴヌクレオチドを導入し、該被検オリゴヌクレオチドが奏するアンチセンス効果によって制御された標的ＲＮＡの発現量、標的ＲＮＡに関連しているｃＤＮＡの発現量、標的ＲＮＡに関連しているタンパク質の量等を、ノザンブロッティング、定量的ＰＣＲ、ウェスタンブロッティング等の公知の手法を適宜利用することによって行うことができる。３’側領域は、５’側領域と同様である。
５’側領域における好ましい形態は、２’位修飾非架橋ヌクレオチド、２’，４’−ＢＮＡ、及びデオキシリボヌクレオチドからなる群から独立して選択される２〜５個のヌクレオチドからなり、２’位修飾非架橋ヌクレオチド及び２’，４’−ＢＮＡからなる群から選択されるヌクレオチドを少なくとも２個含むオリゴヌクレオチドである。より好ましくは、２’位修飾非架橋ヌクレオチド及び２’，４’−ＢＮＡからなる群から独立して選択される２〜５個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであり、さらに好ましくは、２’位修飾非架橋ヌクレオチド及び２’，４’−ＢＮＡからなる群から独立して選択される２〜３個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、ＬＮＡ及び２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）化ヌクレオチドから独立して選択される２〜３個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであり、特に好ましくは、２〜３個のＬＮＡからなるオリゴヌクレオチドである。
別の好ましい形態として、５個の２’位修飾非架橋ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドである。
別の好ましい形態として、５’側領域は、２’，４’−ＢＮＡ及びデオキシリボヌクレオチドからなる群から独立して選択される２〜５個のヌクレオチドからなり、少なくとも２個の２’，４’−ＢＮＡを含むオリゴヌクレオチドであり、そのようなオリゴヌクレオチドは国際公開第２０１６／１２７００２号等を参考にできる。３’側領域は、５’側領域と同様である。
５’側領域に含まれるヌクレオチドのうち、少なくとも１個のヌクレオチドがホスホロチオエート化されていることが好ましく、５０％のヌクレオチドがホスホロチオエート化されていることが更に好ましく、８０％のヌクレオチドがホスホロチオエート化されていることが更により好ましく、全てがホスホロチオエート化されていることが特に好ましい。別の形態として、５’側領域に含まれるヌクレオチドの全てがホスホジエステル結合で連結されていることが好ましい。３’側領域は、５’側領域と同様である。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’側領域の３’末端と中央領域の５’末端が、ホスホジエステル結合若しくは修飾されたホスホジエステル結合を形成して連結されており、３’側領域の５’末端と中央領域の３’末端が、ホスホジエステル結合若しくは修飾されたホスホジエステル結合を形成して連結されている。好ましくは、５’側領域の３’末端と中央領域の５’末端が、修飾されたホスホジエステル結合を形成して連結されており、３’側領域の５’末端と中央領域の３’末端が、修飾されたホスホジエステル結合を形成して連結されている。さらに好ましくは、５’側領域の３’末端と中央領域の５’末端が、ホスホロチオエート結合で連結されており、３’側領域の５’末端と中央領域の３’末端が、ホスホロチオエート結合で形成して連結されている。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドには、直接的に又は間接的に機能性分子が結合していてもよい。機能性分子とアンチセンスオリゴヌクレオチドとの結合は、直接的でも、他の物質を介して間接的でもよいが、共有結合、イオン結合又は水素結合でオリゴヌクレオチドと機能性分子とが結合していることが好ましい。その結合の安定性が高いという観点から、共有結合で直接的に結合していること、又は共有結合でリンカー（連結基）を介して結合していることがより好ましい。
前記機能性分子が、共有結合でアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合する場合、前記機能性分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド分子の３’末端又は５’末端に、直接的に又は間接的に結合していることが好ましい。前記リンカー又は機能性分子と、アンチセンスオリゴヌクレオチド分子の末端ヌクレオチドとの結合は、機能性分子に応じて選択される。
前記リンカー又は機能性分子と、アンチセンスオリゴヌクレオチド分子の末端ヌクレオチドとは、ホスホジエステル結合又は修飾されたホスホジエステル結合で連結されていることが好ましく、ホスホジエステル結合で連結されていることがより好ましい。
前記リンカー又は機能性分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド分子の３’末端のヌクレオチドが有する３’位の酸素原子又は５’末端のヌクレオチドが有する５’位の酸素原子に直接連結されていてもよい。
「機能性分子」の構造は、特に制限はなく、それが結合することによりアンチセンスオリゴヌクレオチドに所望の機能が付与される。所望の機能としては、標識機能、精製機能及び標的部位への送達機能が挙げられる。標識機能を付与する分子の例としては、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等の化合物が挙げられる。精製機能を付与する分子の例としては、ビオチン、アビジン、Ｈｉｓタグペプチド、ＧＳＴタグペプチド、ＦＬＡＧタグペプチド等の化合物が挙げられる。
また、アンチセンスオリゴヌクレオチドを特異性高く効率的に標的部位（例えば、標的細胞）に送達し、かつ当該アンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的遺伝子の発現を非常に効果的に制御するという観点から、機能性分子として、アンチセンスオリゴヌクレオチドを標的部位に送達させる機能を有する分子が結合していることが好ましい。該送達機能を有する分子は、例えば、European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2016, 107, pp 321-340、Advanced Drug Delivery Reviews, 2016, 104, pp 78-92、Expert Opinion on Drug Delivery, 2014, 11, pp 791-822等を参照できる。
標的ＲＮＡへの送達機能を付与する分子として、例えば、肝臓等に特異性高く効率的にアンチセンスオリゴヌクレオチドを送達できるという観点から、脂質、糖が挙げられる。このような脂質としては、コレステロール；脂肪酸；ビタミンＥ（トコフェロール類、トコトリエノール類）、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＫ等の脂溶性ビタミン；アシルカルニチン、アシルＣｏＡ等の中間代謝物；糖脂質；グリセリド；それらの誘導体等が挙げられる。これらの中では、より安全性が高いという観点から、コレステロール、ビタミンＥ（トコフェロール類、トコトリエノール類）が好ましい。中でも、トコフェロール類がより好ましく、トコフェロールが更に好ましく、α−トコフェロールが特に好ましい。糖としては、アシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体が挙げられる。
「アシアロ糖タンパク質受容体」は肝臓細胞表面に存在し、アシアロ糖タンパク質のガラクトース残基を認識して、その分子を細胞内に取り込み分解する作用を持つ。「アシアロ糖タンパク質受容体と相互作用する糖誘導体」は、ガラクトース残基と類似した構造を持ち、アシアロ糖タンパク質受容体との相互作用により細胞内に取り込まれる化合物が好ましく、例えば、ＧａｌＮＡｃ（Ｎ−アセチルガラクトサミン）誘導体、ガラクトース誘導体及びラクトース誘導体が挙げられる。また、脳に特異性高く効率的に本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを送達できるという観点では、「機能性分子」として、糖（例えば、グルコース、スクロース等）が挙げられる。また、各臓器の細胞表面にある各種タンパク質に相互作用することにより、当該臓器に特異性高く効率的にアンチセンスオリゴヌクレオチドを送達できるという観点では、「機能性分子」として、受容体のリガンド、抗体、それらの断片のペプチド又はタンパク質が挙げられる。
機能性分子と、アンチセンスオリゴヌクレオチドとの結合を介するリンカーは、アンチセンスオリゴヌクレオチド分子として機能性分子が有する機能を発揮できればよいため、該機能性分子と該オリゴヌクレオチドとを、安定して結合させるリンカーであれば特に限定されない。該リンカーとしては、例えば、ヌクレオチド数が１〜２０のオリゴヌクレオチドに由来する基、アミノ酸数が２〜２０のポリペプチドに由来する基、炭素数が２〜２０のアルキレン及び炭素数が２〜２０のアルケニレン等が挙げられる。前記ヌクレオチド数が２〜２０のオリゴヌクレオチドに由来する基は、ヌクレオチド数が２〜２０のオリゴヌクレオチドから、ヒドロキシ、水素原子等を取り除いた基である。前記ヌクレオチド数が１〜２０のオリゴヌクレオチドに由来する基は、例えば国際公開第２０１７/０５３９９５号が参照できる。国際公開第２０１７/０５３９９５号には、例えば、ＴＣＡモチーフを有する３塩基のリンカー、ＴＣＡモチーフを有さない１〜５塩基のリンカー等が記載されている。前記アミノ酸数が２〜２０のポリペプチドに由来する基は、アミノ酸数が２〜２０のポリペプチドから、ヒドロキシ、水素原子、アミノ等を取り除いた基である。
リンカーは、好ましくは、Ｃ２−Ｃ２０アルキレン又はＣ２−Ｃ２０アルケニレン（該アルキレン及びアルケニレンに含まれるメチレンは、それぞれ独立して、無置換であるか、ハロゲン原子、ヒドロキシ、保護されたヒドロキシ、オキソ及びチオキソからなる群から選択される１又は２の置換基により置換されている。また、該アルキレン及びアルケニレンのメチレンは、それぞれ独立して、置き換えられていないか、又は−Ｏ−、−ＮＲＢ−（ＲＢは、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル又はハロＣ１−Ｃ６アルキルである）、−Ｓ−、−Ｓ（＝Ｏ）−又は−Ｓ（＝Ｏ）２−により置き換えられている）である。ここで、前記置換と置き換えを組み合わせて、リンカーは、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ１３−（Ｒ１３は、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル又はハロＣ１−Ｃ６アルキルを示す）、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ１３−（Ｒ１３は、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル又はハロＣ１−Ｃ６アルキルを示す）、−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＲ１３−（Ｒ１３は、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル又はハロＣ１−Ｃ６アルキルを示す）、−ＮＲ１３−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ１３−（Ｒ１３は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル又はハロＣ１−Ｃ６アルキルを示す）等で表される基を含んでいてもよい。
リンカーは、より好ましくは、Ｃ２−Ｃ２０アルキレン（該アルキレンのメチレンは、それぞれ独立して、置き換えられていないか、又は−Ｏ−により置き換えられている。置き換えられていないメチレンは、それぞれ独立して、無置換であるか、又はヒドロキシ又は保護されたヒドロキシで置換されている）であり、さらに好ましくはＣ８−Ｃ１２アルキレン（該アルキレンのメチレンは、それぞれ独立して、置き換えられていないか、又は−Ｏ−により置き換えられている。置き換えられていないメチレンは、それぞれ独立して、無置換であるか、又はヒドロキシで置換されている）であり、特に好ましくは、１，８−オクチレンである。またその他の態様として、リンカーは特に好ましくは、下記式（VII）で表される基である。
式中、一つの＊は、オリゴヌクレオチドに由来する基との結合位置（ヌクレオチドを構成する原子）を表し、他方の＊は、機能性分子に由来する基との結合位置（機能性分子に由来する基を構成する原子）を表す。
その他の態様として、リンカーは、より好ましくは、Ｃ２−Ｃ２０アルキレン（該アルキレンのメチレンは、それぞれ独立して、置き換えられていないか、又は−Ｏ−若しくは−ＮＲＢ−（ＲＢは、水素原子又はＣ１−Ｃ６アルキルである）により置き換えられている。置き換えられていないメチレンは、それぞれ独立して、無置換であるか、又はオキソにより置換されている）であり、さらに好ましくは、下記式：

（式中ｅは、それぞれ独立して、１から６の整数である）で表される基であり、特に好ましくは、下記式：

で表される基である。
前記「保護されたヒドロキシ」の保護基は、機能性分子とオリゴヌクレオチドとを結合させる際に安定であればよいため、特に限定されない。リンカーとして特に限定されず、例えば、Protective Groups in Organic Synthesis 第４版、T. W. Greene、P. G. M. Wuts著、John Wiley & Sons Inc.（2006年）等に記載されている任意の保護基を挙げることができる。具体的には、Ｃ１−Ｃ６アルキル（例えば、メチル、ｔ−ブチル等が挙げられる）、トリアリールメチル（例えば、トリフェニルメチル（トリチル）、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、トリメトキシトリチル等が挙げられる）等のエーテル系保護基；メトキシメチル、メチルチオメチル、メトキシエチル、ベンジルオキシメチル、２−テトラヒドロピラニル、エトキシエチル等のアセタール系保護基；アシル（例えば、ホルミル、アセチル、ピバロイル、ベンゾイル等が挙げられる）等のアシル系保護基；トリ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）シリル（例えば、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ジメチルイソプロピルシリル等が挙げられる）、（Ｃ１−Ｃ６アルキル）ジアリールシリル（例えば、ｔ−ブチルジフェニルシリル、ジフェニルメチルシリル等が挙げられる）、トリアリールシリル（例えば、トリフェニルシリル等が挙げられる）、トリベンジルシリル、［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル（Ｔｏｍ基）等のシリル系保護基；１−（４−クロロフェニル）−４−エトキシピペリジン−４−イル（Ｃｐｅｐ基）、９−フェニルキサンテン−９−イル（Ｐｉｘｙｌ基）、９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンテン−９−イル（ＭＯＸ基）等を挙げることができる。「保護されたヒドロキシ」の保護基は、好ましくは、ベンゾイル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、トリフェニルメチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、９−フェニルキサンテン−９−イル又は９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンテン−９−イルであり、より好ましくは、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル又はトリメトキシトリチルであり、さらにより好ましくはジメトキシトリチルである。
本発明には、該アンチセンスオリゴヌクレオチドのプロドラッグも含む。
プロドラッグとは、化学的又は代謝的に分解できる基を有する医薬品化合物の誘導体であり、加溶媒分解又は生理的条件下のインビボ（in vivo）での分解により、薬理学的に活性な医薬品化合物へと誘導される化合物である。適当なプロドラッグ誘導体を選択する方法及び製造する方法は、例えばDesign of Prodrugs（Elsevier, Amsterdam, 1985）に記載されている。本発明の場合、ヒドロキシ基を有する場合は、その化合物と適当なアシルハライド、適当な酸無水物又は適当なハロゲン化アルキルオキシカルボニル化合物とを反応させることによって製造されるアシルオキシ誘導体のようなプロドラッグが例示される。プロドラッグとして特に好ましい構造としては、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ２Ｈ５、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）（ｔ−Ｂｕ）、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ１５Ｈ３１、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ） − （ｍ−ＣＯ２Ｎａ−Ｐｈ）、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｎａ−ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ３、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２又は−Ｏ−ＣＨ２ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ３などが挙げられる。本発明を形成するアンチセンスオリゴヌクレオチドがアミノ基を有する場合は、アミノ基を有する化合物と適当な酸ハロゲン化物、適当な混合酸無水物又は適当なハロゲン化アルキルオキシカルボニル化合物とを反応させることにより製造されるプロドラッグが例示される。プロドラッグとして特に好ましい構造としては、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ） − (ＣＨ２)２０ＯＣＨ３、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ(ＮＨ２)ＣＨ３、−ＮＨ−ＣＨ２ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ３等が挙げられる。
本発明に含まれるプロドラッグの別の好ましい構造は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと相補的な、リボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド（例えば、オリゴリボヌクレオチドヌクレオチド、ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むオリゴヌクレオチド、又はデオキシリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド（例えば、オリゴデオキシリボヌクレオチド、ＤＮＡ）を含む二本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、国際公開第２０１３／０８９２８３号、国際公開第２０１７/０６８７９１号、国際公開第２０１７/０６８７９０号又は国際公開第２０１８/００３７３９号に記載されている）、アンチセンスオリゴヌクレオチドと相補的なＲＮＡオリゴヌクレオチドをリンカーにより結合した一本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、国際公開第２０１７／１３１１２４号に記載されている）などが挙げられる。前記リンカーは、国際公開第２０１７／１３１１２４号に記載のものに限られず、例えば、非ヌクレオチド構造を含んでもよい。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドと相補的なＲＮＡオリゴヌクレオチドが直接連結した一本鎖オリゴヌクレオチドも挙げられる。
本発明のプロドラッグのより具体的な例は、以下に挙げられる。
（Ａ）
（ｉ）前記アンチセンスオリゴヌクレオチド、及び
（ｉｉ）少なくとも１個のリボヌクレオチドを含み、かつ前記（ｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズする領域を含むオリゴヌクレオチド
を含む、オリゴヌクレオチド複合体。
（Ｂ）
（ｉ）前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに由来する基、及び
（ｉｉ）少なくとも１個のリボヌクレオチドを含み、かつ上記（ｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズする領域を含むオリゴヌクレオチドに由来する基
を含み、前記（ｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドに由来する基と、前記（ｉｉ）のオリゴヌクレオチドに由来する基とが
連結されたオリゴヌクレオチド。
（Ｂ）において、（ｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドに由来する基と、（ｉｉ）オリゴヌクレオチドに由来する基とは、生理的条件で分解されるオリゴヌクレオチドに由来する基により連結されていてもよく、非ヌクレオチド構造を含む連結基により連結されていてもよく、直接的に連結されていてもよい。
（Ｃ）
（ｉｉｉ）前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに由来する基に、少なくとも１個のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖が連結されたオリゴヌクレオチド、及び
（ｉｖ）ＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４個の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖を含むオリゴヌクレオチド
を含むオリゴヌクレオチド複合体であって、
前記（ｉｉｉ）の少なくとも１個のリボヌクレオチドを含む前記オリゴヌクレオチド鎖と、前記（ｉｖ）のＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４個の連続するヌクレオチドを含む前記オリゴヌクレオチド鎖とがハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド複合体。
（Ｄ）
（ｉｉｉ）前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに由来する基に、少なくとも１個のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖が連結されたオリゴヌクレオチドに由来する基、及び
（ｉｖ）ＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４個の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖を含むオリゴヌクレオチドに由来する基
を含み、前記（ｉｉｉ）オリゴヌクレオチドに由来する基と、前記（ｉｖ）オリゴヌクレオチドに由来する基とが連結され、
前記（ｉｉｉ）の少なくとも１個のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖と、前記（ｉｖ）のＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４個の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖とがハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド。
（Ｄ）において、（ｉｉｉ）オリゴヌクレオチドに由来する基と、（ｉｖ）オリゴヌクレオチドに由来する基とは、生理的条件で分解されるオリゴヌクレオチドに由来する基により連結されていてもよく、非ヌクレオチド構造を含む連結基により連結されていてもよく、直接的に連結されていてもよい。
（Ｃ）及び（Ｄ）において、アンチセンスオリゴヌクレオチドに由来する基と、少なくとも１個のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖とは、生理的条件で分解されるオリゴヌクレオチドに由来する基により連結されていてもよく、非ヌクレオチド構造を含む連結基により連結されていてもよく、直接的に連結されていてもよい。
「生理的条件で分解されるオリゴヌクレオチド」は、生理的条件にて各種ＤＮａｓｅ（デオキシリボヌクレアーゼ）及びＲＮａｓｅ（リボヌクレアーゼ）等の酵素によって分解されるオリゴヌクレオチドであればよく、該オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、その一部あるいは全部において、塩基、糖若しくはリン酸塩結合に化学修飾がされていてもよく、されていなくてもよい。「生理的条件で分解されるオリゴヌクレオチド」は、例えば、ホスホジエステル結合を少なくとも１つ含み、好ましくはホスホジエステル結合で連結されたオリゴヌクレオチドであり、より好ましくはオリゴデオキシリボヌクレオチド又はオリゴリボヌクレオチドであり、さらに好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡであり、さらにより好ましくはＲＮＡである。
生理的条件で分解されるオリゴヌクレオチドは、生理的条件で分解されるオリゴヌクレオチド内において部分的に相補的な配列を含んでいてもよく、含んでいなくてもよいが、好ましくは、部分的に相補的な配列を含まない。そのようなオリゴヌクレオチドの例として、ホスホジエステル結合で連結された（Ｎ）ｋ’（Ｎは、それぞれ独立してアデノシン、ウリジン、シチジン、グアノシン、２’−デオキシアデノシン、チミジン、２’−デオキシシチジン、または２’−デオキシグアノシンであり、ｋは１〜４０の整数（繰り返し数）である）を挙げることができる。中でも、ｋ’は好ましくは３〜２０であり、より好ましくは４〜１０であり、さらに好ましくは４〜７であり、さらにより好ましくは、４又は５であり、特に好ましくは４である。
「非ヌクレオチド構造を含む連結基」は、少なくとも１つの「非ヌクレオチド構造」を構成単位として有する連結基である。非ヌクレオチド構造としては、例えば核酸塩基を有さない構造が挙げられる。「非ヌクレオチド構造を含む連結基」は、ヌクレオチド（デオキシリボヌクレオシド基、リボヌクレオシド基等）を含んでもよく、含まなくてもよい。「非ヌクレオチド構造を含む連結基」は、例えば、下記の構造の基である。

｛式中、Ｖ１１は、
Ｃ２−Ｃ５０アルキレン
（該Ｃ２−Ｃ５０アルキレンは、無置換であるか又は、置換基群Ｖａより独立して選択される１つ以上の置換基で置換されている）、
下記式（ＸＩＩＩ−１）から（ＸＩＩＩ−１１）：
（式中、о１は、０から３０の整数であり、ｐ１は、０から３０の整数であり、ｄ１は、１から１０の整数であり、ｗは、０から３の整数であり、Ｒｂは、ハロゲン原子、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ若しくはカルバモイルで置換されたＣ１−Ｃ６アルコキシ、モノＣアルキルアミノ、ジＣ１−Ｃ６アルキルアミノ又はＣアルキル基あり、Ｒｃは、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ハロＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボニル、ハロＣ１−Ｃ６アルキルカルボニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ若しくはカルバモイルで置換されたＣ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、モノＣ１−Ｃ６アルキルアミノカルボニル、ジＣ１−Ｃ６アルキルアミノカルボニル、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルホニル、ハロＣ１−Ｃ６アルキルスルホニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシスルホニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ若しくはカルバモイルで置換されたＣ１−Ｃ６アルコキシスルホニル、モノＣ１−Ｃ６アルキルアミノスルホニル又はジＣ１−Ｃ６アルキルアミノスルホニルである）
からなる群より選択される基、
リボヌクレオシド基、又は
デオキシリボヌクレオシド基であり、
少なくとも１つのＶ１１は、Ｃ２−Ｃ５０アルキレン（該Ｃ２−Ｃ５０アルキレンは、無置換であるか、又は置換基群Ｖａより独立して選択される１つ以上の置換基で置換されている）、又は前記式（ＸＩＩＩ−１）から（ＸＩＩＩ−１１）より選択される基であり、
置換基群Ｖａは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、カルバモイル、スルファモイル、ホスホノ、スルホ、テトラゾリル及びホルミルにより構成される置換基群を意味し、
Ｐ１１は、それぞれ独立して、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）− 又は −Ｐ（＝Ｏ）（ＳＨ）− であり、
少なくとも１つのＰ１１は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）− であり、
ｑ１１は、１から１０の整数であり、ｑ１２は、１から２０の整数であり、ｑ１１及びｑ１２の少なくとも一方が２以上のとき、Ｖ１１は、同一であるか又は異なっている。｝
ここで、о１は、好ましくは１から３０の整数であり、ｐ１は、好ましくは１から３０の整数である。ｑ１１は、好ましくは１から６の整数であり、より好ましくは１から３の整数である。ｑ１２は、好ましくは１から６の整数であり、より好ましくは１から３の整数である。Ｐ１１は、好ましくは、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）− である。
以下、上記（Ａ）における（ｉｉ）のオリゴヌクレオチド、上記（Ｂ）における（ｉｉ）のオリゴヌクレオチドに由来する基、上記（Ｃ）及び（Ｄ）に示されるオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド複合体における（ｉｉｉ）のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１個のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖（ＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４個の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖とハイブリダイズする部分）について、説明する。
糖部修飾ヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの種類、数及び位置は、ここで開示するアンチセンスオリゴヌクレオチドのプロドラッグが奏するアンチセンス効果等に影響を与えうる。その種類、数及び位置は、標的ＲＮＡの配列等によっても異なるため、一概には言えないが、当業者は、前記アンチセンス法に関する文献の記載を参酌しながら、好ましい態様を決定することができる。また、塩基部分、糖部分又はホスホジエステル結合部分の修飾後のアンチセンスオリゴヌクレオチドのプロドラッグが有するアンチセンス効果を測定し、得られた測定値が、修飾前のアンチセンスオリゴヌクレオチドのプロドラッグのそれよりも有意に低下していなければ（例えば、修飾後アンチセンスオリゴヌクレオチドのプロドラッグの測定値が修飾前のプロドラッグの測定値の３０％以上であれば）、当該修飾が好ましい態様であると評価することができる。アンチセンス効果の測定は、例えば、後述の実施例において示されているように、細胞等に被検オリゴヌクレオチドを導入し、該被検オリゴヌクレオチドが奏するアンチセンス効果によって制御された標的ＲＮＡの発現量、標的ＲＮＡに関連しているｃＤＮＡの発現量、標的ＲＮＡに関連しているタンパク質の量等を、ノザンブロッティング、定量的ＰＣＲ、ウェスタンブロッティング等の公知の手法を適宜利用することによって行うことができる。
前記（Ａ）に示されるオリゴヌクレオチド複合体における（ｉｉ）のオリゴヌクレオチド又は前記（Ｂ）に示されるオリゴヌクレオチドにおける（ｉｉ）のオリゴヌクレオチドに由来する基は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、糖部修飾ヌクレオチドから独立して選択され、好ましくは、リボヌクレオチドから選択される。（ｉｉ）のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに由来する基が、リボヌクレオチドから選択されるとき、当該リボヌクレオチドは、好ましくは互いにホスホジエステル結合で連結されている。
その他の態様として、（ｉｉ）のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに由来する基は、リボヌクレオチド及び糖部修飾ヌクレオチドから選択され、当該糖部修飾ヌクレオチドは、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドを除く糖部修飾ヌクレオチドから選択される。このとき、当該オリゴヌクレオチドの末端が、少なくとも１つの糖部修飾ヌクレオチドであることが好ましい。この糖部修飾ヌクレオチドは、好ましくは、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドであり、ホスホロチオエート結合で隣接するヌクレオチドと結合していることが好ましい。前記（Ｃ）に示されるオリゴヌクレオチド複合体又は（Ｄ）に示されるオリゴヌクレオチドにおいて、（ｉｉｉ）のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１個のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖（ＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４個の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖とハイブリダイズする部分も同様である。
（Ａ）の場合、（ｉｉ）のオリゴヌクレオチドの３’末端及び５’末端のヌクレオチドは、好ましくは糖部修飾ヌクレオチドである。（Ｂ）の場合、（ｉｉ）のオリゴヌクレオチドに由来する基の３’末端及び５’末端のうち、（ｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドに由来する基と結合していない末端のヌクレオチドは、好ましくは、糖部修飾ヌクレオチドである。（Ｃ）及び（Ｄ）の場合、（ｉｉｉ）のオリゴヌクレオチドに由来する基の３’末端及び５’末端のうち、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドに由来する基と結合していない末端のヌクレオチドは、好ましくは、糖部修飾ヌクレオチドである。
（ｉｉ）のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに由来する基の塩基数は、特に制限されず、（ｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチド（又は由来する基）の塩基数と同一であっても異なっていてもよい。（Ａ）においては、（ｉ）及び（ｉｉ）のオリゴヌクレオチドの塩基数は、同一であることが好ましく、（ｉ）及び（ｉｉ）のオリゴヌクレオチドの全体がハイブリダイズすることが好ましい。（Ｂ）において、（ｉ）と（ｉｉ）のオリゴヌクレオチドに由来する基が、生理的条件で分解されるオリゴヌクレオチドに由来する基又は非ヌクレオチド構造を含む連結基により連結されている場合も同様である。
前記（Ｃ）に示されるオリゴヌクレオチド複合体における（ｉｖ）のオリゴヌクレオチド、及び前記（Ｄ）におけるオリゴヌクレオチドにおける（ｉｖ）のオリゴヌクレオチドに由来する基は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、糖部修飾ヌクレオチドから独立して選択され、好ましくは、デオキシリボヌクレオチド及び糖部修飾ヌクレオチドから選択される。（ｉｖ）のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに由来する基に含まれる糖部修飾ヌクレオチドは、好ましくは、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドを除く糖部修飾ヌクレオチドから選択される。このとき、当該オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに由来する基の５’末端及び３’末端は、少なくとも１つの糖部修飾ヌクレオチドであることが好ましい。当該少なくとも１つの糖部修飾ヌクレオチドは、好ましくは、２’位修飾非架橋ヌクレオチド及び２’，４’−ＢＮＡから選択される少なくとも１つであり、より好ましくは、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）化ヌクレオチド、２’−Ｏ−アミノプロピル（ＡＰ）化ヌクレオチド、２’−フルオロ化ヌクレオチド、２’−Ｏ−（Ｎ−メチルアセトアミド）（ＮＭＡ）化ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルカルバモイルエチル（ＭＣＥ）化ヌクレオチド、ＬＮＡ、ｃＥｔ−ＢＮＡ、ＥＮＡ、ＢＮＡＮＣ、ＡｍＮＡ及びｓｃｐＢＮＡからなる群から選択される少なくとも１つである。（ｉｖ）又はオリゴヌクレオチドに由来する基のオリゴヌクレオチドに含まれるヌクレオチドは、好ましくは互いにホスホロチオエート結合で連結されている。
前記（Ａ）においては、
上記（ｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドと、（ｉｉ）少なくとも１個のリボヌクレオチドを含み、かつ上記（ｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズする領域とがハイブリダイズした部分が、ＲＮａｓｅＨによって認識され、（ｉｉ）少なくとも１個のリボヌクレオチドを含み、かつ上記（ｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズする領域が切断されると考えられる。その結果、標的細胞等において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが生成し、（Ａ）のプロドラッグは治療効果等を発揮すると考えられる。前記（Ｂ）についても同様である。
前記（Ｃ）においては、
前記（ｉｉｉ）の少なくとも１個のリボヌクレオチドを含む前記オリゴヌクレオチド鎖と、前記（ｉｖ）のＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４個の連続するヌクレオチドを含む前記オリゴヌクレオチド鎖とが、ハイブリダイズした部分が、ＲＮａｓｅＨによって認識され、（ｉｉｉ）の少なくとも１個のリボヌクレオチドを含む前記オリゴヌクレオチド鎖が切断されると考えられる。その結果、標的細胞等において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが生成し、（Ｃ）のプロドラッグは治療効果等を発揮すると考えられる。前記（Ｄ）についても同様である。
前記（Ａ）に示されるオリゴヌクレオチド複合体が、機能性分子を有するとき、（ｉｉ）のオリゴヌクレオチドが機能性分子を含むことが好ましく、当該機能性分子は、（ｉｉ）のオリゴヌクレオチドの末端に結合することが好ましい。前記（Ｂ）に示されるオリゴヌクレオチドも同様である。前記（Ｃ）に示されるオリゴヌクレオチド複合体が、機能性分子を有するとき、（ｉｖ）のオリゴヌクレオチドが機能性分子を含むことが好ましく、当該機能性分子は、（ｉｖ）のオリゴヌクレオチドの末端に結合することが好ましい。前記（Ｄ）に示されるオリゴヌクレオチドも同様である。機能性分子とその結合の好ましい態様は、前述の通りである。
前記（Ａ）及び（Ｂ）のうち、（ｉｉ）のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに由来する基は、更にアンチセンスオリゴヌクレオチドに由来する基を有してもよい。当該（ｉｉ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドに由来する基は、（ｉ）のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに由来する基と同一でもよく、異なっていてもよい。また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに由来する基であってもなくてもよい。前記（ｉｉ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドに由来する基は、（ｉ）のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに由来する基とは、ハイブリダイズしないことが好ましい。
前記（Ｃ）及び（Ｄ）のうち、（ｉｖ）のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに由来する基は、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに由来する基であってもよい。当該（ｉｖ）のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに由来する基は、（ｉｉｉ）のオリゴヌクレオチドが含むアンチセンスオリゴヌクレオチドに由来する基と同一でもよく、異なっていてもよい。また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに由来する基であってもなくてもよい。前記（ｉｖ）のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに由来する基は、（ｉｉｉ）のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに由来する基とは、ハイブリダイズしないことが好ましい。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドでないアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、以下のアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。
（１）中央領域、５’側領域及び３’側領域を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、ここで、
− 中央領域は、
デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及び糖部修飾ヌクレオチドからなる群より独立して選択される少なくとも５個のヌクレオチドからなり、前記糖部修飾ヌクレオチドは、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドを除く糖部修飾ヌクレオチドから選択され、
その３’末端及び５’末端が、それぞれ独立して、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、そして
デオキシリボヌクレオチドから独立して選択される、連続する少なくとも４個のヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチド鎖を、少なくとも一つ含み；
− ５’側領域は、
デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及び糖部修飾ヌクレオチドからなる群から独立して選択される少なくとも１個のヌクレオチドからなり、その３’末端が、糖部修飾ヌクレオチドであり、ここで、該３’末端の糖部修飾ヌクレオチドは、中央領域に結合し、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドを除く糖部修飾ヌクレオチドから選択され、そして
デオキシリボヌクレオチド、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドからなる群から独立して選択される、連続する少なくとも４個のヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチド鎖を含まず；
− ３’側領域は、
デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及び糖部修飾ヌクレオチドからなる群から独立して選択される少なくとも１個のヌクレオチドからなり、その５’末端が、糖部修飾ヌクレオチドであり、ここで、該５’末端の糖部修飾ヌクレオチドは、中央領域に結合し、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドを除く糖部修飾ヌクレオチドから選択され、そして
デオキシリボヌクレオチド、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドからなる群から独立して選択される、連続する少なくとも４個のヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチド鎖を含まない、
アンチセンスオリゴヌクレオチド。
中でも、以下（２）のアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。
（２）中央領域、５’側領域及び３’側領域を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、ここで、
− 中央領域は、
デオキシリボヌクレオチドから独立して選択される少なくとも５個のヌクレオチドからなり、
− ５’側領域は、
デオキシリボヌクレオチド及び糖部修飾ヌクレオチドからなる群から独立して選択される少なくとも１個のヌクレオチドからなり、その３’末端が、糖部修飾ヌクレオチドであり、ここで、該３’末端の糖部修飾ヌクレオチドは、中央領域に結合し、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドを除く糖部修飾ヌクレオチドから選択され、そして
デオキシリボヌクレオチド、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドからなる群から独立して選択される、連続する少なくとも４個のヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチド鎖を含まず；
− ３’側領域は、
デオキシリボヌクレオチド及び糖部修飾ヌクレオチドからなる群から独立して選択される少なくとも１個のヌクレオチドからなり、その５’末端が、糖部修飾ヌクレオチドであり、ここで、該５’末端の糖部修飾ヌクレオチドは、中央領域に結合し、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドを除く糖部修飾ヌクレオチドから選択され、そして
デオキシリボヌクレオチド、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドからなる群から独立して選択される、連続する少なくとも４個のヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチド鎖を含まない、
アンチセンスオリゴヌクレオチド。
中でも、以下（３）のアンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましい。
（３）中央領域、５’側領域及び３’側領域を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、ここで、
− 中央領域は、
デオキシリボヌクレオチドから独立して選択される少なくとも５個のヌクレオチドからなり、
− ５’側領域は、
糖部修飾ヌクレオチドから独立して選択される少なくとも１個のヌクレオチドからなり、その３’末端の糖部修飾ヌクレオチドは、中央領域に結合し、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドを除く糖部修飾ヌクレオチドから選択され、
− ３’側領域は、
デオキシリボヌクレオチドから独立して選択される少なくとも１個のヌクレオチドからなり、その５’末端の糖部修飾ヌクレオチドは、中央領域に結合し、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドを除く糖部修飾ヌクレオチドから選択される、
アンチセンスオリゴヌクレオチド。
前記（１）、（２）及び（３）において、中央領域は、好ましくはギャップ領域であり、５’側領域は、好ましくは５’ウィング領域であり、３’側領域は、好ましくは３’ウィング領域である。また、５’側領域及び３’側領域の好ましい態様は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおける５’側領域及び３’側領域と同様である。中央領域の好ましい態様は、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドからなる群から選択される糖部修飾ヌクレオチドを含まないこと以外は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおける中央領域と同様である。
その他に、以下（４）のアンチセンスオリゴヌクレオチド（いわゆるミックスマー）が挙げられる。
（４）デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及び糖部修飾ヌクレオチドからなる群より独立して選択される少なくとも５個のヌクレオチドからなり、
デオキシリボヌクレオチド、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドからなる群から独立して選択される、連続する少なくとも４個のヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチド鎖を含まない、
アンチセンスオリゴヌクレオチド。
非ヌクレオチド構造を含む連結基とオリゴヌクレオチドとは、一般的なアミダイト法又はＨ−ホスホネート法により、結合できる。例えば、２つのヒドロキシ基を有する化合物の一方のヒドロキシ基を保護した後、アミダイト化試薬（例えば、クロロ（ジイソプロピルアミノ）亜ホスフィン酸２−シアノエチル、ビス（ジイソプロピルアミノ）亜ホスフィン酸２−シアノエチル等）によりアミダイト体へ、又はＨ−ホスホネート試薬（例えば、亜リン酸ジフェニル、亜リン酸等）によりＨ−ホスホネート体へと誘導し、オリゴヌクレオチドと結合させることができ、前記保護されたヒドロキシ基を脱保護し、市販の核酸自動合成機を用いて、さらにヌクレオチドを伸長することができる。前記２つのヒドロキシ基を有する化合物は、当業者に公知の保護・脱保護反応（例えば、前記 Protective Groups in Organic Synthesis 第４版を参照できる）、酸化反応、還元反応、縮合反応（酸化反応、還元反応、縮合反応は、例えば、Comprehensive Organic Transformations, 第２版、R.C.Larock著、Wiley-VCH（1999年)等を参照できる）等を組み合わせて用い、例えば、アミノ酸、カルボン酸、ジオール化合物等の原料から、合成することができる。非ヌクレオチド構造を含む連結基に、上記２つのヒドロキシ基以外の官能基（例えば、アミノ基、ヒドロキシ基又はチオール基）を有する場合は、当業者に公知の保護基（例えば、Protective Groups in Organic Synthesis 第４版を参照できる）で保護することで、効率よく伸長できる。また、非ヌクレオチド構造を含む連結基を有するオリゴヌクレオチドの合成に、ＷＯ２０１２／０１７９１９、ＷＯ２０１３／１０３１４６、ＷＯ２０１３／１３３２２１、ＷＯ２０１５／０９９１８７、ＷＯ２０１６／１０４７７５等を参照できる。
また、二つのオリゴヌクレオチドを別途合成した後に、非ヌクレオチド構造を含む連結基を結合させることができる。合成法の一例を以下に示す。オリゴヌクレオチドの５’末端に、当業者に公知の方法でアミノ基等の官能基を有する部分構造を結合させ（例えば、６−（トリフルオロアセチルアミノ）ヘキシル−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホロアミダイト等を使用する）、別のオリゴヌクレオチドの３’末端に、当業者に公知の方法でアミノ基等の官能基を有する部分構造を結合させる（例えば、２−（（４，４’−ジメトキシトリチル）オキシメチル）−６−フルオレニルメトキシカルボニルアミノ−ヘキサン−１−スクシノイル−ロングチェーンアルキルアミノ−ＣＰＧ（Glen RESEARCH社、製品番号20-2958）等を使用する）。非ヌクレオチド構造を含む連結基が有する２つの官能基を前記アミノ基等と反応する所望の官能基へと変換し、二つのオリゴヌクレオチドを、連結することができる。例えば、非ヌクレオチド構造を含む連結基が有する２つの官能基を、カルボン酸、エステル、活性エステル（Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド化等）、酸クロリド、活性化炭酸ジエステル（４−ニトロフェニル化炭酸ジエステル等）、イソシアネート等に変換した後、既知のＮ−カルボニル化条件により反応させることで連結できる。前記、Ｎ−カルボニル化条件は、例えば、｛（Comprehensive Organic Transformations Second Edition）１９９９年、（John Wiley & Sons, INC.）｝等を参照することができる。当業者は、必要に応じて前記２つの官能基のうち、一方を保護し、１つのオリゴヌクレオチドを、非ヌクレオチド構造を含む連結基に結合させ、脱保護した後、同様にもう１つのオリゴヌクレオチドを、非ヌクレオチド構造を含む連結基に結合させることができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのプロドラッグは、それらの互変異性、幾何異性を経由して存在することに加えて、その混合物或いはそれぞれの異性体の混合物として存在するものも含む。また不斉中心が存在する場合、或いは異性化の結果、不斉中心が生じる場合は、それぞれの光学異性体及び任意の比率の混合物として存在するものも含む。また、不斉中心を２個以上持つ化合物の場合には、さらにそれぞれの光学異性によるジアステレオマーも存在する。本発明は、これらすべての型を、任意の割合で含んだものも含む。また、光学活性体はこの目的のためによく知られた方法によって得ることができる。
例えば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのプロドラッグが、修飾されたホスホジエステル結合（例えば、ホスホロチオエート結合）を含み、且つリン原子が不斉原子となる場合、リン原子の立体が制御されたオリゴヌクレオチド及びリン原子の立体が制御されていないオリゴヌクレオチドのいずれの形態も、本発明の範囲に含有される。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、そのプロドラッグ又はそれらの医薬的に許容される塩は、製造条件により任意の結晶形として存在することができ、任意の水和物として存在することができるが、これら結晶形や水和物及びそれらの混合物も本発明の範囲に含有される。またアセトン、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールなどの有機溶媒を含む溶媒和物として存在することもあるが、これらの形態はいずれも本発明の範囲に含有される。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのプロドラッグは、必要に応じて医薬的に許容され得る塩に変換することも、又は生成した塩から遊離させることもできる。アンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのプロドラッグの医薬的に許容され得る塩としては、例えば、アルカリ金属（リチウム、ナトリウム、カリウムなど）、アルカリ土類金属（マグネシウム、カルシウムなど）、アンモニウム、有機塩基（トリエチルアミン、トリメチルアミンなど）、アミノ酸（グリシン、リシン、グルタミン酸など）、無機酸（塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸など）又は有機酸（酢酸、クエン酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸など）との塩が挙げられる。
特に、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−で表される部分構造が、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ−）−で表されるアニオン性の部分構造へ変換されて、アルカリ金属（リチウム、ナトリウム、カリウムなど）、アルカリ土類金属（マグネシウム、カルシウムなど）又はアンモニウム等と塩を形成してもよい。また、ホスホロチオエート結合を形成する、−Ｐ（＝Ｏ）（ＳＨ）−で表される部分構造が、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｓ−）−で表されるアニオン性の部分構造へ変換されて、同様に、アルカリ金属、アルカリ土類金属又はアンモニウム等と塩を形成しても
よい。その他の修飾されたホスホジエステル結合についても同様である。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのプロドラッグは、当業者であれば公知の方法を適宜選択することにより調製することができる。例えば、当業者は、標的ＲＮＡのヌクレオチド配列の情報に基づいて、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を設計し、市販の核酸自動合成機（アプライドバイオシステムズ社製、ベックマン社製、ジーンデザイン社等）を用いて合成することができる。また、酵素を用いた反応によって合成することもできる。前記酵素としては、ポリメラ―ゼ、ライゲース及び制限酵素等が挙げられるが、これらに限定されない。すなわち、本実施形態に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのプロドラッグの製造方法は、３’末端又は５’末端でヌクレオチド鎖を伸長する工程を含むことができる。
機能性分子と該オリゴヌクレオチドとを結合させるための多くの方法は、当該分野においてよく知られており、例えば、European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2016, 107, pp 321-340、Advanced Drug Delivery Reviews, 2016, 104, pp 78-92、Expert Opinion on Drug Delivery, 2014, 11, pp 791-822等を参照できる。例えば、機能性分子とリンカーとを公知の方法により結合させた後に、それをアミダイト化試薬によりアミダイト体へ、又はＨ−ホスホネート試薬によりＨ−ホスホネート体へと誘導し、オリゴヌクレオチドと結合させることができる。
得られるオリゴヌクレオチドを逆相カラムクロマトグラフィー等により精製することにより、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのプロドラッグを調製することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのプロドラッグは、標的遺伝子の発現を効果的に制御することができる。従って、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、例えば、標的遺伝子の発現をアンチセンス効果によって制御するための組成物を、本発明は提供することができる。特に、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのプロドラッグは、低濃度の投与により高い薬効を得ることができ、代謝性疾患、腫瘍、感染症といった標的遺伝子の発現亢進に伴う疾患を治療、予防、改善するための医薬組成物も、いくつかの実施形態において提供することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのプロドラッグを含む組成物は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤、注射剤、坐剤等として、経腸管的（経口的等）又は非経腸管的に使用することができる。
これら製剤化においては、薬理学上若しくは飲食品として許容される担体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、ｐＨ調節剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのプロドラッグを含む組成物の投与形態としては特に制限はないが、経腸管的（経口的等）又は非経腸管的投与が挙げられる。より好ましくは、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、気道内投与、直腸投与、筋肉内投与、髄腔内投与、脳室内投与、経鼻投与及び硝子体内投与等及び輸液による投与が挙げられる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのプロドラッグを利用した核酸医薬品が治療、予防、改善できる疾患は、特に制限されず、例えば、代謝性疾患、循環器疾患、腫瘍、感染症、眼疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、遺伝性希少疾患等、遺伝子の発現が原因となる疾患等が挙げられる。より具体的には、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、脊髄性筋委縮症、筋ジストロフィー（デュシェンヌ型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー（福山型先天性筋ジストロフィー、ウールリッヒ型先天性筋ジストロフィー、メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー、インテグリン欠損症、ウォーカーワールブルグ症候群等）、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、三好型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー等）、ハンチントン病、アルツハイマー症、トランスサイレイチン型アミロイドーシス、家族性アミロイド性心筋症、多発性硬化症、クローン病、炎症性大腸疾患、先端巨大症、２型糖尿病、慢性腎症、ＲＳウイルス感染症、エボラ出血熱、マールブルグ熱、ＨＩＶ、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、肝硬変、慢性心不全、心筋線維化、心房細動、前立腺癌、メラノーマ、乳癌、膵臓癌、大腸癌、腎細胞癌、胆管癌、子宮頸癌、肝癌、肺癌、白血病、非ホジキンリンパ腫、アトピー性皮膚炎、緑内障、加齢性黄斑変性症等が挙げられる。前記疾患の種類に応じて、その疾患の原因となる遺伝子を前記標的遺伝子に設定し、さらに、前記標的遺伝子の配列に応じて、前記発現制御配列（例えば、アンチセンス配列）を適宜設定することができる。
ヒトなどの霊長類に加えて、様々な他の哺乳類の疾患を、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのプロドラッグを含む組成物により治療、予防、改善することができる。例えば、それだけに限らないが、ウシ（cow）、ヒツジ（sheep）、ヤギ、ウマ（horse）、イヌ（dog）、ネコ（cat）、テンジクネズミ、又は他のウシ（bovine）、ヒツジ（ovine）、ウマ（equine）、イヌ（canine）、ネコ（feline）、マウスなどの齧歯類の種を含めた哺乳類の種の疾患を治療することができる。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物は、鳥類（例えば、ニワトリ）などの他の種においても適用することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのプロドラッグを含む組成物を、ヒトを含む動物に投与又は摂取する場合、その投与量又は摂取量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態、組成物の種類（医薬品、飲食品など）等に応じて、適宜選択されるが、その投与量又は摂取量は、アンチセンスオリゴヌクレオチド換算で０．０００１ｍｇ／ｋｇ／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日であることが好ましい。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのプロドラッグは、標的遺伝子の発現を効果的に制御しつつ、従来のアンチセンスオリゴヌクレオチドに比較して、毒性を低減することができる。従って、ヒトを含む動物に本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのプロドラッグを投与し、より安全に標的遺伝子の発現をアンチセンス効果によって制御する方法を提供することができる。また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのプロドラッグを含む組成物を、ヒトを含む動物に投与することを含む、標的遺伝子の発現亢進等を伴う各種疾患を治療、予防、改善するための方法をも提供することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する好ましい方法としては以下に示すものが挙げられる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのプロドラッグと、細胞を接触させる工程を含む、標的ＲＮＡの機能を制御する方法。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのプロドラッグを含む医薬組成物を、哺乳動物に投与する工程を含む、該哺乳動物おける標的ＲＮＡの機能を制御する方法。
哺乳動物において、標的ＲＮＡの機能を制御するための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのプロドラッグの使用。
哺乳動物において、標的ＲＮＡの機能を制御するための薬剤を製造するための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのプロドラッグの使用。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのプロドラッグと細胞を接触させる工程を含む、標的遺伝子の発現を制御する方法。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのプロドラッグを含む医薬組成物を、哺乳動物に投与する工程を含む、該哺乳動物おける標的遺伝子の発現を制御する方法。
哺乳動物において、標的遺伝子の発現を制御するための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのプロドラッグの使用。
哺乳動物において、標的遺伝子の発現を制御するための薬剤を製造するための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのプロドラッグの使用。
本発明における標的ＲＮＡの機能の制御は、アンチセンス配列部分がハイブリダイゼーションにより標的ＲＮＡの一部を被覆することによって生じる、翻訳の阻害又はエキソンスキッピング等のスプライシング機能が調節若しくは変換されること、又は、アンチセンス配列部分と標的ＲＮＡの一部とがハイブリダイズした部分が認識されることにより生じ得る前記標的ＲＮＡの分解によって、標的ＲＮＡの機能が抑制されること等を意味する。
前記哺乳動物は、好ましくはヒトである。
投与経路は、好ましくは経腸管的である。その他の態様として、投与経路は、非経腸管的である。
本発明の実施形態に係る２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドは、以下、順に示す方法によって製造することができるが、下記製造方法は一般的な製造方法の一例を示すものであり、本実施形態に係る２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドの製造方法を限定するものではない。原料化合物については、それらの具体的な製法が述べられていない場合には、市販されているものを用いることができるか、又は公知の方法若しくはこれに準ずる方法に従って製造することができる。
まず、代表的な三員環２’−３’架橋ヌクレオチドである下記化合物Ｃの一般的な製造方法を記載する。

式中、Ｐ１及びＰ２は、それぞれ独立してヒドロキシ保護基であり、ＬＧ１は脱離基を表し、−Ｑ−は、−ＣＲ４Ｒ５−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、又は−Ｃ（＝ＮＲ６）−を表し、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びその他の記号は前記定義に同じである。
なお、脱離基としては、アセテート（ＡｃＯ）、ｐ−ニトロベンゾエート（ＰＮＢＯ）、スルホネート（例えば、メタンスルホネート（メシレート：ＭｓＯ）、ｐ−トルエンスルホネート（トシレート：ＴｓＯ）、ｐ−ブロモベンゼンスルホネート（ブロシレート：ＢｓＯ）、ｐ−ニトロベンゼンスルホネート（ノシレート：ＮｓＯ）、フルオロメタンスルホネート、ジフルオロメタンスルホネート、トリフルオロメタンスルホネート（トリフレート：ＴｆＯ）及びエタンスルホネート）及びハロゲン原子等が挙げられる。
出発原料である化合物Ａは、例えば、３’及び５’ヒドロキシが保護されたリボヌクレオシドの２’ヒドロキシを脱離基に変換することで合成できる。脱離基への変換は、例えばアルコールのスルホネート化（例えば、メタンスルホネート化、ｐ−トルエンスルホネート化）を行うことででき、塩化メタンスルホン酸又は塩化ｐ−トルエンスルホン酸を、適当な塩基（例えば、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン）と共に反応させることで実施できる。
多様なＲ１、Ｒ２を有する化合物Ａは、例えば、以下に記載の化合物Ａ−１から、当業者に公知の保護・脱保護反応（例えば、前記 Protective Groups in Organic Synthesis 第４版に記載されている反応）、酸化反応、還元反応（例えば、Comprehensive Organic Transformations, 第２版、R.C.Larock著、Wiley-VCH（1999年)等を参照できる）を組み合わせて用い、合成できる。

式中、Ｐ３は、ヒドロキシ保護基を表し、その他の記号は前記定義に同じである。
例えば、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方がアルキル基である化合物Ａを合成するためには、まず、ヒドロキシの保護・脱保護反応により３’位のヒドロキシが保護され５’位のヒドロキシが脱保護された化合物（化合物Ａ−２）を得る。次に、化合物Ａ−２の５’位のヒドロキシを酸化し、Ｒ１に対応するアルキル金属試薬又はグリニャール試薬などを用いて所望のＲ１を導入できる。また必要であれば、もう一度５’位のヒドロキシを酸化し、Ｒ２に対応するアルキル金属試薬、金属水素化物又はグリニャール試薬などを用いて所望のＲ２を導入できる。得られた化合物の３’位の保護されたヒドロキシを脱保護することで、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方がアルキル基である化合物Ａを合成できる。
（化合物Ｂの合成）：オレフィン化
適当な塩基（例えば、ＤＢＵ又は安息香酸ナトリウム）を用いて、脱離基を脱離させることによりオレフィン化体（化合物Ｂ）を得ることができる。例えば、溶媒中、安息香酸ナトリウムを反応させる方法が挙げられる。
（化合物Ｃの合成）：環化
−Ｑ−が−ＣＲ４Ｒ５−である場合、通常知られているシクロプロパン化反応により環化体（Ｃ）を合成できる。例えば、溶媒中、アルキルで置換されていてもよいジヨードメタンを、ジエチル亜鉛と共に反応させる方法が挙げられる。
−Ｑ−が−Ｃ（＝Ｏ）−である場合、例えば、保護されたヒドロキシジヨードメタンを、ジエチル亜鉛と共に反応させ、その後保護されたヒドロキシを脱保護し、酸化する方法により、環化体（Ｃ）を合成できる。−Ｑ−が−Ｃ（＝Ｓ）−である場合、上記−Ｃ（＝Ｏ）−である化合物に対して、ローソン試薬等でチオカルボニル化することにより、また、−Ｑ−が−Ｃ（＝ＮＲ６）−である場合、−Ｑ−が−Ｃ（＝Ｏ）−である前記化合物に対し、対応するアミノ基を有するアミンを用いたイミノ化により、環化体（化合物Ｃ）を合成できる。
次に、代表的な四員環、五員環または六員環の２’−３’架橋ヌクレオチドの一般的な製造方法を記載する。

式中、Ｐ１及びＰ２はヒドロキシ保護基であり、ＬＧ１及びＬＧ２はそれぞれ独立して脱離基であり、Ｑ１１は、Ｏ、ＮＨ又はＮＲ６であり、Ｈは水素原子であり、ｋは０〜３の整数であり、Ｒ６及びその他の記号は前記定義に同じである。
出発原料である化合物Ｄは、Journal of the American Chemical Society, 1998, 120, p 5458、Journal of the Chemical Society, Perkin Transaction 1, 1999, p 2543に記載の方法等、当業者に公知な方法に準じて合成できる。
多様なＲ１、Ｒ２を有する化合物Ｄは、例えば、以下に記載の化合物Ｄ−１から、当業者に公知の保護・脱保護反応（例えば、前記Protective Groups in Organic Synthesis 第４版に記載されている反応）、酸化反応、還元反応（例えば、Comprehensive Organic Transformations, 第２版、R.C.Larock著、Wiley-VCH（1999年)等を参照できる）を組み合わせて用い、合成することができる。具体的な方法は、多様なＲ１、Ｒ２を有する化合物Ａの合成法と同じである。

式中、Ｐ３はヒドロキシ保護基を表し、その他の記号は前記定義に同じである。
（化合物Ｅの合成）：２’位の立体反転置換及びオレフィンのカルボニル化
２’位の脱離基に対し、溶媒中、例えば水酸化ナトリウム水溶液などの塩基と反応することで、ヒドロキシが２’位のβ位に位置したヒドロキシ体を得ることができる。２’位の脱離基に対し、溶媒中、置換基を有してもよいアミン又はアンモニアを反応させることで、置換基を有してもよいアミノ基が２’位のβ位に位置したアミノ体を得ることができる。又は、アジ化ナトリウムによる還元によってもアミノ体を得ることができる。
さらに、末端オレフィンをジヒドロキシル化し、酸化剤で酸化的開裂を行うことで、カルボニル化合物Ｅを得ることができる。例えば、溶媒中、触媒量の四酸化オスミウムと過ヨウ素酸ナトリウムを反応させる方法が挙げられる。
（化合物Ｇの合成）：カルボニルの還元及び脱離基への変換
適当な還元剤（例えば、水素化ホウ素ナトリウム）を用いて、カルボニルをヒドロキシに変換できる。生成したヒドロキシを、例えばスルホネート化（例えば、メタンスルホネート化、ｐ−トルエンスルホネート化）することで化合物Ｇを合成できる。例えば、塩化メタンスルホン酸又は塩化ｐ−トルエンスルホン酸を、適当な塩基（例えば、トリエチルアミン又はＮ,Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン）と共に反応させることで実施できる。
（化合物Ｋの合成）：環化
例えば、溶媒中、適当な塩基（例えば、水素化ナトリウム）と反応させることで、化合物Ｋを合成できる。また、塩基を加えなくても、環化する場合がある。
（化合物Ｇ’の合成）：アルデヒドのカルボン酸への変換
例えば、溶媒中、適当な酸化剤（例えば、亜塩素酸）、リン酸二水素ナトリウム及び２−メチル−２−ブテンと反応することで、カルボン酸化合物Ｇ’を得ることができる。
（化合物Ｋ’の合成）：環化
化合物Ｇ’のカルボキシと、ヒドロキシ又はアミノとを既知の方法により縮合することで、化合物Ｋ’を合成できる。また、カルボキシをエステル、活性エステル（Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド化等）、酸クロリド等へ変換した後、既知の縮合反応により合成することもできる。
化合物Ｅから化合物Ｇ経由して化合物Ｋを得る過程において、２’位のβ位に位置するヒドロキシや、置換基を有してもよいアミノ基を保護した後に反応を行い、化合物Ｇの２’位のヒドロキシ又は置換基を有してもよいアミノ基保護された化合物（２’位が保護された化合物Ｇ）を得て、該２’位が保護された化合物Ｇの２’位を脱保護し、環化反応を行ってもよい。化合物Ｅから化合物Ｇ’を経由して化合物Ｋ’を得る過程も同様である。
次に、代表的な３’位修飾非架橋ヌクレオチドの一般的な製造方法を記載する。３’位修飾非架橋ヌクレオチドの合成は、Journal of the Chemical Society, Perkin Transaction 1, 1998, p 1409に記載の方法等が参照できる。

式中、Ｐ1はヒドロキシ保護基であり、その他の記号は前記定義に同じである。
出発原料である化合物Ｍは、Journal of the Chemical Society, Perkin Transaction 1, 1998, p 1409に記載の方法等、当業者に公知な方法に準じて合成できる。
多様なＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ１１を有する化合物Ｍは、例えば、以下に記載の化合物Ｍ−１又はＭ−２から、当業者に公知の保護・脱保護反応（例えば、前記Protective Groups in Organic Synthesis 第４版に記載されている反応）、酸化反応、還元反応（例えば、Comprehensive Organic Transformations, 第２版、R.C.Larock著、Wiley-VCH（1999年)等を参照できる）を組み合わせて用い、合成することができる。具体的な方法は、多様なＲ１、Ｒ２を有する化合物Ａの合成法と同じである。

式中の記号は前記定義に同じである。

式中の記号は前記定義に同じである。
例えば、Ｒ３及びＲ１１の少なくとも一方がアルキルである化合物Ｍは、まず、ヒドロキシを酸化した後、アルキル金属試薬又はグリニャール試薬などを用いて還元し、合成できる。
（化合物Ｎの合成）：オレフィンのジヒドロキシ化
３’位のオレフィンに対し、溶媒中、適当なジヒドロキシ化試薬を用いて反応することで、化合物Ｎを合成できる。ジヒドロキシ化は、例えば、触媒量の塩化ルテニウムと化学量論量以上の過ヨウ素酸ナトリウムを用いることで実施できる。
（化合物Ｓの合成）：一級アルコールのアルキル化
一級のアルコール化合物Ｎに対して、溶媒中、適当なアルキル化試薬を用いて反応することで、化合物Ｓを合成できる。アルキル化は、例えば、適当な塩基（例えば、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）存在下で、ハロゲン化アルキルと反応させることで実施できる。
（化合物Ｔ及びＵの合成）：一級アルコールのアルキル化
化合物Ｕは、化合物Ｍのエポキシ化、得られたエポキシ化合物（化合物Ｔ）の還元によって合成できる。合成法は、Journal of the Chemical Society, Perkin Transaction 1, 1998, p 1409に記載の方法等を参照できる。
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、実施形態は以下の実施例に限定されるものではない。
核酸自動合成機は、特に記載がない場合は、ｎＳ−８II（ジーンデザイン社製）を用いた。
実施例中の配列表記（表１、２、４、５、７、８、１０）において、特に記載がない限り、「（Ｌ）」はＬＮＡを意味し、小文字のアルファベットはデオキシリボヌクレオチドを意味し、大文字のアルファベット（前記（Ｌ）付のアルファベットは除く）はリボヌクレオチドを意味し、「＾」はホスホロチオエート結合を意味し、「５」は、そのヌクレオチドの塩基が５−メチルシトシンであることを意味し、「（ｍ）」は２’−Ｏ−ＭＯＥ化ヌクレオチドを意味し、「ＦＡＭ−」は、５’末端が６−カルボキシフルオレセインで標識されていることを意味する。また、Ｚ１は下記式（Ｚ１）で表されるヌクレオチド構造を意味する。
また、Ｚ２は下記式（Ｚ2）で表されるヌクレオチド構造を意味する。
５’末端の６−カルボキシフルオレセインによる標識は、５’末端のヒドロキシ基から水素原子を取り除いた部分に、
式 −Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）６−Ｎ（Ｈ）−で表される基を介して、６−カルボキシフルオレセインの１つのカルボキシ基からヒドロキシ基を取り除いた部分が、結合していることを意味する。なお、式中、窒素原子が６−カルボキシフルオレセインの１つのカルボキシ基からヒドロキシ基を取り除いた部分に結合し、リン原子は、５’末端のヒドロキシ基から水素原子を取り除いた部分に結合する。
［ヌクレオチドの合成例１］
２’−Ｏ−３’−Ｃ−架橋の修飾ヌクレオチドである、（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−１−（２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノキシ）−２−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル)−４−（チミン−１−イル）−３，６-ジオキサビシクロ−［３．２．０］ヘプタンは、Journal of the American Chemical Society, 1998, 120, pp 5458-5463に記載の方法に準じて合成した。
（実施例１、比較例１）
表１に記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、核酸自動合成機を使用して調製した。標的遺伝子は、マウスSuperoxide Dismutase−1（ＳＯＤ−１）である。ギャップ領域に修飾が無い比較例１のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、オフターゲット効果に起因する高い毒性を生じることが報告されている（Nucleic Acids Research, 2016, 44, p 2093）。
合成したオリゴヌクレオチドの分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳにより測定した。結果を表１に示す。
［評価例１］
マウス脳内皮細胞株ｂＥＮＤ．３の細胞を５０００細胞／ウェルとなるように１０％ウシ胎児血清を含んだＤＭＥＭ培地に懸濁し、９６ウェルプレート（コーニング社製、♯３５８５）に播き、５％ＣＯ２下３７℃にて約２４時間培養した。表１の各オリゴヌクレオチドを、その最終濃度が１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ又は１０００ｎＭとなるように１０ｍＭの塩化カルシウムを含んだ１０％ウシ胎児血清を含んだＤＭＥＭ培地に溶解し（試験培地）、約２４時間後に試験培地に交換し培養した（Nucleic Acids Research, 2015, 43, p e128参照）。さらに7日後に細胞を回収し、細胞からRNeasy mini kit（QIAGEN社製）を用いてTotal RNAを抽出した。
Total RNAからPrimeScript RT Master Mix（タカラバイオ（株）製）を用いてｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡ及びTaqMan（登録商標）Gene Expression ID（Applied Biosystems社製）を用いて7500 Real-Time PCR System（Applied Biosystems社製）によりリアルタイムＰＣＲを行い、ＰＴＥＮのｍＲＮＡ量を定量した。リアルタイムＰＣＲでは、ハウスキーピング遺伝子のcyclophilinのｍＲＮＡ量も同時に定量し、cyclophilinのｍＲＮＡ量に対するＰＴＥＮのｍＲＮＡ量をＰＴＥＮ発現レベルとして評価した。オリゴヌクレオチドの添加を行わなかった細胞をコントロールとして用いた。結果を図１に示す。
なお、用いたプライマーは、TaqMan Gene Expression Assay（Applied Biosystems社製）であり、Assay IDは、以下の通りであった：
マウスＳＯＤ−１定量用： Mm01344233_g1
マウスcyclophilin定量用： Mm0234230_g1
図１から明らかなように、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例１）は、ギャップ領域に修飾が無いアンチセンスオリゴヌクレオチド（比較例１）と同程度のアンチセンス効果を示すことが確認された。
［評価例２］
マウス脳内皮細胞株ｂＥＮＤ．３の細胞を５０００細胞／ウェルとなるように１０％ウシ胎児血清を含んだＤＭＥＭ培地に懸濁し、９６ウェルプレート（コーニング社製、#3585）に播き、５％ＣＯ２下３７℃にて約２４時間培養した。表１の各オリゴヌクレオチドを、その最終濃度が１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ又は１０００ｎＭとなるように１０ｍＭの塩化カルシウムを含んだ１０％ウシ胎児血清を含んだＤＭＥＭ培地に溶解し（試験培地）、約２４時間後に試験培地に交換し培養した（Nucleic Acids Research, 2015, 43, p e128参照）。さらに７日後の細胞培養液に対してＡＴＰ試薬１００μL（CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製）を添加し懸濁させ、約１０分間室温で静置下後、FlexStation 3（Molcular Devices社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引き３点の平均値として生細胞の数を測定した。オリゴヌクレオチドの添加を行わなかった細胞をコントロールとして用いた。
図２から明らかなように、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例１）は、ギャップ領域に修飾が無いアンチセンスオリゴヌクレオチド（比較例１）に比較して、細胞毒性が低いことが確認された。比較例１で見られたオフターゲット効果に起因する細胞毒性を、ギャップ領域に２’位と３’位が架橋された核酸を挿入することで、低減することを示唆する結果である。
［評価例３］
表２に記載された、５’末端が６−カルボキシフルオレセインで標識された、実施例１および比較例１のオリゴヌクレオチドに相補なＲＮＡ（ＲＮＡ（ＳＯＤ−１））を合成した。ＲＮＡ（ＳＯＤ−１）の分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳにより測定した。分子量実測値は、５６４５．５８（Ｍ−Ｈ−）であった。
水（１５０μＬ）に、表１の各オリゴヌクレオチド（１５０ｐｍｏｌ）と、表２のＲＮＡ（４５０ｐｍｏｌ）、及びアニーリングバッファー（２００ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ＝７．５）（６０μＬ）を加え、９０℃で２分間加熱した。その後、ゆっくりと３０℃まで降温し、この温度で維持した。溶液Ａ（７５０ｍＭ ＫＣｌ，５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，３０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１００ｍＭ ジチオトレイトール，ｐＨ＝８．０）（３０μＬ）及び、E．coli由来リコンビナントＲＮａｓｅＨ（和光純薬工業（株）製）（１unit）を加え、３０℃で２時間反応させた。９０℃のオイルバスに移し、５分間保持することで酵素を不活性化し、逆相ＨＰＬＣによってＲＮＡの切断活性を測定した。
（ＨＰＬＣ分析条件）
溶離液：０．１Ｍのヘキサフルオロイソプロピルアルコールと８ｍＭのトリエチルアミンとを含む水溶液／メタノール＝９５／５（１分）→（１４分）→７５／２５（３．５分）
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム：WatersXBridgeTM C18 ２．５μｍ，４．６ｍｍ×７５ｍｍ
カラム温度：６０℃
検出：蛍光（Ｅｍ５１８ｎｍ、Ｅｘ４９４ｎｍ）
結果を表３に示す。表３中、「転化率」はＲＮＡ（１６ｍｅｒ）が切断された割合を示し、［１００−（ＲＮＡ（１６ｍｅｒ）÷（各ピークの面積値の総和）×１００）］で表される。また、「太字表記の数字（ｍｅｒ）」は、切断されたＲＮＡ断片を表し、それぞれ５’末端から数えたヌクレオチドの数で表される。「切断ＲＮＡ面積（％）」は、各ＲＮＡ断片ピークの、面積百分率（％）を表す。
表３に関し、１ｍｅｒから７ｍｅｒ、１３ｍｅｒから１５ｍｅｒのピークは殆どないことが確認されている。なお、７ｍｅｒから１１ｍｅｒは、核酸自動合成機を使用して別途調製し、その分子量はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳにより測定した。分子量実測値は、以下の通りであった。
１１ｍｅｒ： ４０９５．６０（Ｍ−Ｈ−）
１０ｍｅｒ： ３７６４．６８（Ｍ−Ｈ−）
９ｍｅｒ： ３４２０．６５（Ｍ−Ｈ−）
８ｍｅｒ： ３０７４．７７（Ｍ−Ｈ−）
７ｍｅｒ： ２７４６．２３（Ｍ−Ｈ−）
上記ＨＰＬＣ分析条件１でのそれらのピークの保持時間を確認した。その他の表３中のＲＮＡ断片は、上記ＨＰＬＣ分析条件１におけるピークの保持時間から推定できる。
表３から明らかなように、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例１）は、ギャップ領域に修飾が無いアンチセンスオリゴヌクレオチド（比較例１）に比較して、修飾位置に近い領域において、切断位置の選択性が向上していることが示された。上記、評価例１から３の結果から、切断位置の選択性を向上する修飾が、細胞毒性を低減することが示唆された。
（実施例２、比較例２）
表４に記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、核酸自動合成機を使用して調製した。標的遺伝子は、マウスcoagulation factor XI（ＦＸＩ）である。ギャップ領域に修飾が無い比較例２のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、オフターゲット効果に起因する高い毒性を生じることが報告されている（Nucleic Acids Research, 2016, 44, pp 2093-2109）。
合成したオリゴヌクレオチドの分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳにより測定した。結果を表４に示す。
［評価例４］
評価例２と同じ評価方法を用いて、表４の各オリゴヌクレオチドの最終濃度が１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ又は１０００ｎＭとなるようにし、生細胞の数を測定した。オリゴヌクレオチドの添加を行わなかった細胞をコントロールとして用いた。
結果を図３に示す。
図３から明らかなように、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例２）は、ギャップ領域に修飾が無いアンチセンスオリゴヌクレオチド（比較例２）に比較して、細胞毒性が低いことが確認された。比較例２で見られたオフターゲット効果に起因する細胞毒性を、ギャップ領域に２’位と３’位が架橋された核酸を挿入することで、低減することを示唆する結果である。
［評価例５］
表５に記載された、５’末端が６−カルボキシフルオレセインで標識された、実施例２および比較例２のオリゴヌクレオチドに相補なＲＮＡ（ＲＮＡ（ＦＸＩ））を合成した。ＲＮＡ（ＦＸＩ）の分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳにより測定した。分子量実測値は、５７７３．５４（Ｍ−Ｈ−）であった。
評価例３と同じ評価方法を用いて、ＲＮＡの切断活性を測定した。ただし、反応時間は１．５時間とした。
結果を表６に示す。表６中の表記は、表３と同じである。
表６に関し、１ｍｅｒから６ｍｅｒ、１４ｍｅｒ及び１５ｍｅｒのピークは殆どないことが確認されている。なお、６ｍｅｒから１０ｍｅｒは、核酸自動合成機を使用して別途調製、分子量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳにより測定した。分子量実測値は、以下の通りであった。
１０ｍｅｒ： ３８２８．０８（Ｍ−Ｈ−）
９ｍｅｒ： ３５２１．６７（Ｍ−Ｈ−）
８ｍｅｒ： ３１７７．４６（Ｍ−Ｈ−）
７ｍｅｒ： ２８７３．４６（Ｍ−Ｈ−）
６ｍｅｒ： ２５４３．９４（Ｍ−Ｈ−）
上記ＨＰＬＣ分析条件１でのそれらのピークの保持時間を確認した。その他の表３中のＲＮＡ断片は、上記ＨＰＬＣ分析条件１におけるピークの保持時間から推定できる。
表６から明らかなように、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例２）は、ギャップ領域に修飾が無いアンチセンスオリゴヌクレオチド（比較例２）に比較して、修飾位置に近い領域において、切断位置の選択性が向上していることが示された（８ｍｅｒ及び１０ｍｅｒの生成抑制）。上記、評価例４および評価例５の結果から、切断位置の選択性を向上する修飾が、細胞毒性を低減することが示唆された。
（実施例３、比較例３）
表７に記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、核酸自動合成機を使用して調製した。標的遺伝子は、ヒト変異型ハンチントン（ｍｕＨＴＴ）であり、野生型のＡからＧに変異したＳＮＰを有した箇所である（Molecular Therapy - Nucleic Acids, 2017, 7, pp 20-30参照）。
表８に記載された、５’末端が６−カルボキシフルオレセインで標識された、変異型ＲＮＡ（ｍｕ−ＨＴＴ、アンチセンスオリゴヌクレオチドと完全相補）と野生型ＲＮＡ（ｗｔ−ＨＴＴ、アンチセンスオリゴヌクレオチドと一塩基ミスマッチを含む）を合成した。
上記ｍｕ−ＨＴＴ及びｗｔ−ＨＴＴの分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳにより測定した。分子量実測値は、以下の通りであった。
ｍｕ−ＨＴＴ： ５３６７．７９（Ｍ−Ｈ−）
ｗｔ−ＨＴＴ： ５３８２．０２（Ｍ−Ｈ−）
［評価例６］
表７の各オリゴヌクレオチドと、表８の各ＲＮＡを用い、評価例３と同じ評価方法を用いて、ＲＮＡの切断活性を測定した。ただし、反応時間は０．５時間とした。
結果を表９に示す。表９中の表記は、表３と同じである。
表９に関し、１ｍｅｒから７ｍｅｒ、１３ｍｅｒから１４ｍｅｒのピークは殆どないことが確認されている。なお、ｍｕ−ＨＴＴの切断されたＲＮＡ断片のうち、７ｍｅｒから１３ｍｅｒは、核酸自動合成機を使用して別途調製、分子量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳにより測定した。分子量実測値は、以下の通りであった。
１３ｍｅｒ： ４７３０．５６（Ｍ−Ｈ−）
１２ｍｅｒ： ４４２５．４１（Ｍ−Ｈ−）
１１ｍｅｒ： ４１１７．９８（Ｍ−Ｈ−）
１０ｍｅｒ： ３７８８．９２（Ｍ−Ｈ−）
９ｍｅｒ： ３４６０．６１（Ｍ−Ｈ−）
８ｍｅｒ： ３１５４．４１（Ｍ−Ｈ−）
７ｍｅｒ： ２８２５．８７（Ｍ−Ｈ−）
上記ＨＰＬＣ分析条件１でのそれらのピークの保持時間を確認した。その他の表９中のＲＮＡ断片は、上記ＨＰＬＣ分析条件１におけるピークの保持時間から推定できる。
表９から明らかなように、ｗｔ−ＨＴＴに対するｍｕ−ＨＴＴのノックダウンの選択性は、ギャップ領域に修飾が無いアンチセンスオリゴヌクレオチド（比較例２）（９１．８÷６９．８＝１．３）に比較して、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例３）（８８．７÷３９．４＝２．３）の方が高いことが示された。
［評価例７］
マウス脳内皮細胞株ｂＥＮＤ．３の細胞を４００００細胞／ウェルとなるように１０％ウシ胎児血清を含んだＤＭＥＭ培地に懸濁し、６ウェルプレート（コーニング社製、#3516）に播き、５％ＣＯ２下３７℃にて約２４時間培養した。表１の各オリゴヌクレオチドを、その最終濃度が３０００ｎＭとなるように１０ｍＭの塩化カルシウムを含んだ１０％ウシ胎児血清を含んだＤＭＥＭ培地に溶解し（試験培地）、約２４時間後に試験培地に交換し培養した（Nucleic Acids Research, 2015, 43, p e128参照）。さらに２４時間後に細胞を回収し、細胞からRNeasy mini kit（QIAGEN社製）を用いてTotal RNAを抽出した。オリゴヌクレオチドの添加を行わなかった細胞をコントロールとして用いた。
常法に従い、Total RNAから Cy3［シアニン−３］で蛍光標識した相補的ＲＮＡを作製した。蛍光標識した相補的ＲＮＡと、SurePrint G3 Mouse Gene Expression 8x60K v2（Agilent Technologies社製）とを、一色法（one-color protocol）にてハイブリダイズさせた。得られたシグナルデータは、GeneSpring ソフトウエア（Agilent Technologies社製）を用いて分析し、コントロールに対する遺伝子の発現量の変動を網羅的に解析した。比較例１の結果を図４に、実施例１の結果を図５に示す。なお、図４及び図５中、横軸（log 2 expression of control experiment）は、コントロール検体における発現量（log2）を表し、縦軸（log 2 fold change）は、コントロールに対しての発現変化の割合（log2）を表す。
図４および図５から発現量が５０％以下になった遺伝子の数をカウントすると、ギャップ領域に修飾が無いアンチセンスオリゴヌクレオチド（比較例１）が７６０であるのに対し、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例１）は５６４であった。このことから、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例１）が、オフターゲット効果を抑制していることが確認された。
［ヌクレオチドの合成例２］
３’−メチル−ヌクレオチドである、（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）−２−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−３−メチル−５−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）テトラヒドロフラン−３−イル（２−シアノエチル）ホスホルアミダイトは、Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1,1998, 120, pp 5458-5463に記載の方法に準じて合成した。
（実施例４、比較例２）
表１０に記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、核酸自動合成機を使用して調製した。標的遺伝子は、実施例２および比較例２と同様に、マウスcoagulation factor XI（ＦＸＩ）である。
合成したオリゴヌクレオチドの分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳにより測定した。結果を表１０に示す。
［評価例８］
評価例５と同じ評価方法を用いて、ＲＮＡの切断活性を測定した。反応時間は１．５時間とした。
結果を表１１に示す。表１１中の表記は、表３と同じである。
表１１に関し、１ｍｅｒから６ｍｅｒ、１４ｍｅｒ及び１５ｍｅｒのピークは殆どないことが確認されている。
表１１から明らかなように、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例４）は、ギャップ領域に修飾が無いアンチセンスオリゴヌクレオチド（比較例２）に比較して、修飾位置に近い領域において、切断位置の選択性が向上していることが示された（８ｍｅｒ及び１０ｍｅｒの生成抑制）。
本発明のオリゴヌクレオチドは、オフターゲット効果を抑制できるため、毒性を低減できると考えられ、代謝性疾患、腫瘍、感染症等の、標的ＲＮＡの機能及び/又は標的遺伝子の発現亢進に伴う疾患を治療、予防するための医薬組成物等として、有用である。
日本国特許出願２０１８−０５２５７８（出願日：２０１８年３月２０日）、日本国特許出願２０１８−１２９２９６（出願日：２０１８年７月６日）の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。

Claims (31)

  1. 中央領域、５’側領域及び３’側領域を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、
    ここで、
    − 中央領域は、
    デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及び糖部修飾ヌクレオチドからなる群より独立して選択される少なくとも５個のヌクレオチドからなり、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドからなる群から選択される糖部修飾ヌクレオチドを少なくとも一つ含み、その３’末端及び５’末端が、それぞれ独立して、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、２’−３’架橋ヌクレオチド又は３’位修飾非架橋ヌクレオチドであり、そして
    デオキシリボヌクレオチド、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドからなる群から独立して選択される、連続する少なくとも４個のヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチド鎖を、少なくとも一つ含み；
    − ５’側領域は、
    デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及び糖部修飾ヌクレオチドからなる群から独立して選択される少なくとも１個のヌクレオチドからなり、その３’末端が、糖部修飾ヌクレオチドであり、ここで、該３’末端の糖部修飾ヌクレオチドは、中央領域に結合し、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドを除く糖部修飾ヌクレオチドから選択され、そして
    デオキシリボヌクレオチド、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドからなる群から独立して選択される、連続する少なくとも４個のヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチド鎖を含まず；
    − ３’側領域は、
    デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及び糖部修飾ヌクレオチドからなる群から独立して選択される少なくとも１個のヌクレオチドからなり、その５’末端が、糖部修飾ヌクレオチドであり、ここで、該５’末端の糖部修飾ヌクレオチドは、中央領域に結合し、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドを除く糖部修飾ヌクレオチドから選択され、そして
    デオキシリボヌクレオチド、２’−３’架橋ヌクレオチド及び３’位修飾非架橋ヌクレオチドからなる群から独立して選択される、連続する少なくとも４個のヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチド鎖を含まない、
    アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  2. 前記中央領域が、５〜１５個のヌクレオチドからなり、
    前記５’側領域及び前記３’側領域が、それぞれ独立して、１〜７個のヌクレオチドからなる、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  3. 前記中央領域が、８〜１２個のヌクレオチドからなり、
    前記５’側領域及び前記３’側領域が、それぞれ独立して、２〜５個のヌクレオチドからなる、請求項１又は２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  4. 中央領域に含まれる、２’−３’架橋ヌクレオチドが、
    下記式（Ｉ）：

    （式中、ｍは、１、２、３又は４であり、
    Ｂｘは、核酸塩基部分であり、
    Ｘは、Ｏ又はＳであり、
    −Ｑ−は、それぞれ独立して、−ＣＲ４Ｒ５−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｃ（＝ＮＲ６）−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＲ６−又は−Ｓ−であり、
    ｍが、２、３又は４であるとき、２つの隣り合った−Ｑ−は、一緒に
    式 −ＣＲ７＝ＣＲ８−
    で表される基を形成してもよく、
    Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、１つ以上の置換基で置換されたＣ２−Ｃ６アルケニル、１つ以上の置換基で置換されたＣ２−Ｃ６アルキニル、アシル、１つ以上の置換基で置換されたアシル、１つ以上の置換基で置換されたアミド、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルコキシ、スルファニル、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ又は１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルチオであり；ここで、前記置換基は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、オキソ、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、アジド、ＯＣ（＝Ｙ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｙ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｙ）ＮＪ１Ｊ２及びシアノからなる群から独立して選択され、Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、それぞれ独立して、水素原子又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、かつＹは、Ｏ、Ｓ又はＮＪ４であり、Ｊ４はＣ１−Ｃ１２アルキル又はアミノ保護基であり；
    Ｒ６は、Ｃ１−Ｃ１２アルキル又はアミノ保護基であり、
    Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素原子又はＣ１−Ｃ６アルキルである）
    で表される部分構造を含むヌクレオチドである、請求項１から３の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  5. 中央領域に含まれる、３’位修飾非架橋ヌクレオチドが、
    下記式（II）：

    （式中、Ｂｘは、核酸塩基部分であり、
    Ｘは、Ｏ又はＳであり、
    Ｒ１２は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、１つ以上の置換基で置換されたＣ２−Ｃ６アルケニル、１つ以上の置換基で置換されたＣ２−Ｃ６アルキニル、アシル、１つ以上の置換基で置換されたアシル、１つ以上の置換基で置換されたアミド、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルコキシ、スルファニル、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ又は１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルチオであり；ここで、前記置換基は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、オキソ、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、アジド、ＯＣ（＝Ｙ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｙ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｙ）ＮＪ１Ｊ２及びシアノからなる群から独立して選択され；
    Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ１１は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、１つ以上の置換基で置換されたＣ２−Ｃ６アルケニル、１つ以上の置換基で置換されたＣ２−Ｃ６アルキニル、アシル、１つ以上の置換基で置換されたアシル、１つ以上の置換基で置換されたアミド、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルコキシ、スルファニル、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ又は１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルチオであり；ここで、前記置換基は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、オキソ、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、アジド、ＯＣ（＝Ｙ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｙ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｙ）ＮＪ１Ｊ２及びシアノからなる群から独立して選択され；
    Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、それぞれ独立して、水素原子又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、かつＹは、Ｏ、Ｓ又はＮＪ４であり、Ｊ４はＣ１−Ｃ１２アルキル又はアミノ保護基である）
    で表される部分構造を含むヌクレオチドである、請求項１から３の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  6. 中央領域に含まれる、２’−３’架橋ヌクレオチドが、
    下記式（III）：

    （式中、Ｂｘは、核酸塩基部分であり、
    Ｘは、Ｏ又はＳであり、
    −Ｑ１−及び−Ｑ２−は、それぞれ独立して、−ＣＲ４Ｒ５−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｃ（＝ＮＲ６）−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＲ６−又は−Ｓ−であるか、あるいは、
    −Ｑ１−Ｑ２−は、−ＣＲ７＝ＣＲ８−であり；かつ、式中、Ｒ７及びＲ８は独立して水素原子又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、
    Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、１つ以上の置換基で置換されたＣ２−Ｃ６アルケニル、１つ以上の置換基で置換されたＣ２−Ｃ６アルキニル、アシル、１つ以上の置換基で置換されたアシル、１つ以上の置換基で置換されたアミド、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルコキシ、スルファニル、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ又は１つ以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルチオであり；ここで、前記置換基は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、オキソ、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、アジド、ＯＣ（＝Ｙ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｙ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｙ）ＮＪ１Ｊ２及びシアノからなる群から独立して選択され、Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、それぞれ独立して、水素原子又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、かつＹは、Ｏ、Ｓ又はＮＪ４であり、Ｊ４はＣ１−Ｃ１２アルキル又はアミノ保護基であり；
    Ｒ６は、Ｃ１−Ｃ１２アルキル又はアミノ保護基である）
    で表されるヌクレオチドである、請求項４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  7. −Ｑ１−が、−Ｏ−、−ＮＨ−、−ＮＲ６−又は−Ｓ−であり、Ｒ６はＣ１−Ｃ１２アルキルであり、−Ｑ２−が−ＣＨ２−である、請求項６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  8. −Ｑ１−が、−Ｏ−であり、−Ｑ２−が−ＣＨ２−である、請求項６又は７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  9. Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が、水素原子である、請求項４から８の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  10. Ｘが、Ｏである、請求項４から９の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  11. 前記中央領域が、ギャップ領域であり、
    前記５’側領域が、５’ウィング領域であり、
    前記３’側領域が、３’ウィング領域である、請求項１から１０の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  12. 前記５’側領域及び前記３’側領域に含まれる糖部修飾ヌクレオチドが、それぞれ独立して、２’位修飾非架橋ヌクレオチド及び２’，４’−ＢＮＡからなる群から選択される、請求項１から１１の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  13. 前記２’位修飾非架橋ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）化ヌクレオチド、２’−Ｏ−アミノプロピル（ＡＰ）化ヌクレオチド、２’−フルオロ化ヌクレオチド、２’−Ｏ−（Ｎ−メチルアセトアミド）（ＮＭＡ）化ヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチルカルバモイルエチル（ＭＣＥ）化ヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  14. 前記２’，４’−ＢＮＡが、ＬＮＡ、ｃＥｔ−ＢＮＡ、ＥＮＡ、ＢＮＡＮＣ、ＡｍＮＡ及びｓｃｐＢＮＡからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  15. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合を含む、請求項１から１４の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  16. 標識機能、精製機能及び標的部位への送達機能からなる群から選択される少なくとも１種の機能を有する機能性分子に由来する基をさらに含む、請求項１から１５の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  17. 前記機能性分子が、糖、脂質、ペプチド及びタンパク質並びにそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  18. 前記機能性分子が、コレステロール、トコフェロール及びトコトリエノールからなる群から選択される脂質である、請求項１６又は１７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  19. 前記機能性分子が、アシアロ糖タンパク質受容体と相互作用する糖誘導体である、請求項１６又は１７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  20. 前記機能性分子が、受容体のリガンド及び抗体からなる群から選択される、ペプチド又はタンパク質である、請求項１６又は１７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  21. 請求項１から２０の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドのプロドラッグ。
  22. （ｉ）請求項１から２０の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び
    （ｉｉ）少なくとも１個のリボヌクレオチドを含み、かつ前記（ｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズする領域を含むオリゴヌクレオチド
    を含む、オリゴヌクレオチド複合体。
  23. （ｉ）請求項１から２０の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドに由来する基、及び
    （ｉｉ）少なくとも１個のリボヌクレオチドを含み、かつ前記（ｉ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズする領域を含むオリゴヌクレオチドに由来する基
    を含み、前記（ｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドに由来する基と、前記（ｉｉ）オリゴヌクレオチドに由来する基が、連結されたオリゴヌクレオチド。
  24. （ｉｉｉ） 請求項１から２０の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドに由来する基に、少なくとも１個のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖が連結されたオリゴヌクレオチド、及び
    （ｉｖ）ＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４個の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖を含むオリゴヌクレオチド
    を含むオリゴヌクレオチド複合体であって、
    前記（ｉｉｉ）の少なくとも１個のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖と、前記（ｉｖ）のＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４個の連続するヌクレオチドを含む前記オリゴヌクレオチド鎖とがハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド複合体。
  25. （ｉｉｉ） 請求項１から２０の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドに由来する基に、少なくとも１個のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖が連結されたオリゴヌクレオチドに由来する基、及び
    （ｉｖ）ＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４個の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖を含むオリゴヌクレオチドに由来する基
    を含み、前記（ｉｉｉ）オリゴヌクレオチドに由来する基と、前記（ｉｖ）オリゴヌクレオチドに由来する基が、連結され、
    前記（ｉｉｉ）の少なくとも１個のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖と、前記（ｉｖ）のＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４個の連続するヌクレオチドを含む前記オリゴヌクレオチド鎖とがハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド。
  26. 請求項１から２５の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項２１に記載のプロドラッグ、請求項２２若しくは２４に記載のオリゴヌクレオチド複合体、又は請求項２３若しくは２５に記載のオリゴヌクレオチドと、薬理学上許容される担体とを含む、医薬組成物。
  27. 請求項１から２０の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項２１に記載のプロドラッグ、請求項２２若しくは２４に記載のオリゴヌクレオチド複合体、又は請求項２３若しくは２５に記載のオリゴヌクレオチドと、細胞とを接触させる工程を含む、標的ＲＮＡの機能を制御する方法。
  28. 請求項２６に記載の医薬組成物を、哺乳動物に投与する工程を含む、該哺乳動物における標的ＲＮＡの機能を制御する方法。
  29. 請求項１から２０の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項２１に記載のプロドラッグ、請求項２２若しくは２４に記載のオリゴヌクレオチド複合体、又は請求項２３若しくは２５に記載のオリゴヌクレオチドと、細胞とを接触させる工程を含む、標的遺伝子の発現を制御する方法。
  30. 請求項２６に記載の医薬組成物を、哺乳動物に投与する工程を含む、該哺乳動物における標的遺伝子の発現を制御する方法。
  31. ２’−３’架橋ヌクレオチド及び、３’位修飾非架橋ヌクレオチドからなる群から選択されるヌクレオチドを使用して、請求項１から２０の何れか一つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は請求項２１に記載のプロドラッグを製造する方法。
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