JPWO2019156020A1 - 核酸分子の製造方法 - Google Patents

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Abstract

５’末端にリン酸基を有する第１の一本鎖ＲＮＡと３’末端に水酸基を有する第２の一本鎖ＲＮＡに、ＲＮＡリガーゼを作用させ、前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとを連結する工程を含む一本鎖ＲＮＡの製造方法。第１の一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、Ｘ１領域およびＺ領域からなる一本鎖ＲＮＡであり；第２の一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、Ｘ２領域、Ｙ２領域、Ｌｙリンカー領域およびＹ１領域からなる一本鎖であり；Ｘ１領域とＸ２領域とが、互いに相補的な、少なくとも２ヌクレオチド長である同じヌクレオチド数のヌクレオチド配列であり；Ｙ１領域とＹ２領域とが、互いに相補的な、少なくとも２ヌクレオチド長の同じヌクレオチド数のヌクレオチド配列である。

Description

本発明は、核酸分子の製造方法に関する。
本願は、２０１８年２月９日に、日本に出願された特願２０１８−２１７９９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
特許文献１及び２には、ＲＮＡ干渉法に用いられる一本鎖ＲＮＡが開示されており、かかる化合物の製造方法としては、核酸合成装置を用いて多段階の化学反応により製造する方法が知られている。
国際公開第２０１２／０１７９１９号 国際公開第２０１３／１０３１４６号
本発明は、一本鎖ＲＮＡの簡便な製造方法を提供することを課題とする。
本発明は、以下の態様を包含する。
本発明の一態様にかかる一本鎖ＲＮＡの製造方法は、５’末端にリン酸基を有する第１の一本鎖ＲＮＡと３’末端に水酸基を有する第２の一本鎖ＲＮＡに、国際生化学連合が酵素番号として定めるＥＣ６．５．１．３に分類され、二本鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを作用させ、前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとを連結する工程を含む一本鎖ＲＮＡの製造方法であって、以下のａ）〜ｇ）の特徴を有する製造方法である：
ａ）前記第１の一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、Ｘ１領域およびＺ領域からなる一本鎖ＲＮＡであり；
ｂ）前記第２の一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、Ｘ２領域、Ｙ２領域、Ｌｙリンカー領域およびＹ１領域からなる一本鎖であり；
ｃ）前記Ｘ１領域と前記Ｘ２領域とが、互いに相補的な、２以上の同数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；
ｄ）前記Ｙ１領域と前記Ｙ２領域とが、互いに相補的な、２以上の同数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；
ｅ）前記Ｚ領域が、任意のヌクレオチド数のヌクレオチド配列を含む領域であり；
ｆ）前記Ｌｙリンカー領域がアミノ酸から誘導される原子団を有するリンカー領域であり；
ｇ）前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとの連結により生成する一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から、前記Ｘ２領域、前記Ｙ２領域、前記Ｌｙリンカー領域、前記Ｙ１領域、前記Ｘ１領域および前記Ｚ領域からなる連結一本鎖ＲＮＡである。
また、本発明の一態様にかかる一本鎖ＲＮＡの製造方法は、前記製造方法において、前記Ｚ領域が、５’末端側から順に、Ｚ１領域、Ｌｚリンカー領域及びＺ２領域からなる領域であり、前記Ｌｚリンカー領域がアミノ酸から誘導される原子団を有するリンカー領域であり、前記Ｚ１領域と前記Ｚ２領域とが、互いに相補的なヌクレオチド配列を含み、前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとの連結により生成する一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、前記Ｘ２領域、前記Ｙ２領域、前記Ｌｙリンカー領域、前記Ｙ１領域、前記Ｘ１領域および前記Ｚ１領域、前記Ｌｚリンカー領域およびＺ２領域からなる連結一本鎖ＲＮＡである、製造方法である。
また、本発明の一態様にかかる一本鎖ＲＮＡの製造方法は、前記製造方法において、前記Ｌｙリンカー領域が、下記式（Ｉ）で表される二価の基である、製造方法である。
Figure 2019156020
 （式中、Ｙ１１及びＹ２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ１２及びＹ２２は、それぞれ独立して、水素原子もしくはアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ１２とＹ２２とがその末端で互いに結合して炭素数３〜４のアルキレン基を表し、Ｙ１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ１領域および前記Ｙ２領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、Ｙ２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ１領域および前記Ｙ２領域のＹ１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
また、本発明の一態様にかかる一本鎖ＲＮＡの製造方法は、前記製造方法において、前記Ｌｙリンカー領域が、下記式（Ｉ）で表される二価の基であり、前記Ｌｚリンカー領域が、下記式（Ｉ’）で表される二価の基である、製造方法である。
Figure 2019156020
 （式中、Ｙ１１及びＹ２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ１２及びＹ２２は、それぞれ独立して、水素原子もしくはアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ１２とＹ２２とがその末端で互いに結合して炭素数３〜４のアルキレン基を表し、Ｙ１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ１領域および前記Ｙ２領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、Ｙ２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ２領域および前記Ｙ１領域のＹ１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
Figure 2019156020
 （式中、Ｙ’１１及びＹ’２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ’１２及びＹ’２２は、それぞれ独立して、水素原子もしくはアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ’１２とＹ’２２とがその末端で互いに結合し炭素数３〜４のアルキレン基を表し、Ｙ’１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｚ１領域および前記Ｚ２領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、Ｙ’２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｚ２領域および前記Ｚ１領域のＹ’１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
また、本発明の一態様にかかる一本鎖ＲＮＡの製造方法は、前記製造方法において、前記Ｌｙリンカー領域および前記Ｌｚリンカー領域は、それぞれ独立して、下記式（ＩＩ−Ａ）または（ＩＩ−Ｂ）で表される構造の二価の基である、製造方法である。
Figure 2019156020
 （式中、ｎおよびｍは、それぞれ独立して、１から２０の何れかの整数を表す。）
また、本発明の一態様にかかる一本鎖ＲＮＡの製造方法は、前記製造方法において、前記Ｘ１領域、前記Ｙ１領域および前記Ｚ領域からなるＷ１領域、および前記Ｘ２領域および前記Ｙ２領域からなるＷ２領域の少なくとも一方に、ＲＮＡ干渉法の標的となる遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド配列を含む、製造方法である。
また、本発明の一態様にかかる一本鎖ＲＮＡの製造方法は、前記製造方法において、前記ＲＮＡリガーゼが、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４ ＲＮＡリガーゼ２、ＫＶＰ４０由来のリガーゼ２、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ ＲＮＡリガーゼ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ ＲＮＡリガーゼ、またはＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ ＲＮＡリガーゼである、製造方法である。
また、本発明の一態様にかかる一本鎖ＲＮＡの製造方法は、前記製造方法において、前記ＲＮＡリガーゼが、配列番号２１、２２、または２３に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるＲＮＡリガーゼである、製造方法である。
また、本発明の一態様にかかる一本鎖ＲＮＡの製造方法は、前記製造方法において、前記ＲＮＡリガーゼが、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４ ＲＮＡリガーゼ２またはＫＶＰ４０由来のＲＮＡリガーゼ２である、製造方法である。
本発明の製造方法によれば、一本鎖ＲＮＡを簡便に製造できる。
第１および第２の一本鎖ＲＮＡの各領域の結合順序の一例を示す模式図である。 連結一本鎖ＲＮＡの製造のステップの一例を示す模式図である。 第１および第２の一本鎖ＲＮＡの各領域の結合順序の一例を示す模式図である。 連結一本鎖ＲＮＡの製造のステップの一例を示す模式図である。 実施例１で用いた、第１および第２の一本鎖ＲＮＡと生成する連結一本鎖ＲＮＡとを示す。 実施例２で用いた、第１および第２の一本鎖ＲＮＡと生成する連結一本鎖ＲＮＡとを示す。
本発明の一実施形態にかかる製造方法は、５’末端にリン酸基を有する第１の一本鎖ＲＮＡと３’末端に水酸基を有する第２の一本鎖ＲＮＡに、国際生化学連合が酵素番号として定めるＥＣ６．５．１．３に分類され、二本鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを作用させ、前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとを連結する工程を含む一本鎖ＲＮＡの製造方法である。本実施形態の製造方法により得られる連結一本鎖ＲＮＡは、５’末端側から、Ｘ２領域、Ｙ２領域、Ｌｙリンカー領域、Ｙ１領域、Ｘ１領域およびＺ領域からなる一本鎖ＲＮＡである。前記Ｚ領域は、５’末端側から、Ｚ１領域、リンカー領域Ｌｚおよび領域Ｚ２からなっていてもよく、前記連結一本鎖ＲＮＡは、Ｘ２領域、Ｙ２領域、Ｌｙリンカー領域、Ｙ１領域、Ｘ１領域、Ｚ１領域、Ｌｚリンカー領域および領域Ｚ２からなる一本鎖ＲＮＡであってもよい。前記連結一本鎖ＲＮＡは、Ｙ１領域とＸ１領域とＺ領域（又はＺ１領域）とからなるＷ１領域、および、Ｘ２領域とＹ２領域とからなるＷ２領域の少なくとも一方に、ＲＮＡ干渉法の標的となる遺伝子の発現を抑制する配列を含んでいてもよい。
Ｗ１領域およびＷ２領域のいずれか一方または両者は、同じ標的遺伝子に対する同一の発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、同じ標的に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、異なる標的遺伝子に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有してもよい。Ｗ１領域が、２つ以上の発現抑制配列を有する場合、各発現抑制配列の配置箇所は、特に制限されず、Ｘ１領域およびＹ１領域のいずれか一領域または両者でもよいし、両者に架かる領域であってもよい。Ｗ２領域が、２つ以上の発現抑制配列を有する場合、各発現抑制配列の配置箇所は、Ｘ２領域およびＹ２領域のいずれか一領域または両者でもよいし、両者に架かる領域であってもよい。発現抑制配列は、標的遺伝子の所定領域に対して、９０％以上の相補性を有していることが好ましく、より好ましくは９５％であり、さらに好ましくは９８％であり、特に好ましくは１００％である。
かかる連結一本鎖ＲＮＡは、５’末端にリン酸基を有する第１の一本鎖ＲＮＡと３’末端に水酸基を有する第２の一本鎖ＲＮＡとにリガーゼを作用させ、前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖とを連結する工程で製造される（図１乃至４参照）。
連結一本鎖ＲＮＡは、分子内において相補性のある配列部分が並び、分子内で部分的に二重鎖を形成しうる。連結一本鎖ＲＮＡ分子は、図２に示すように、Ｘ１領域とＸ２領域が互いに相補性を有するヌクレオチド配列を含み、さらにＹ１領域とＹ２領域が互いに相補性を有するヌクレオチド配列を含み、これらの相補性を有する配列との間で、二重鎖が形成され、ＬｙおよびＬｚのリンカー領域が、その長さに応じてループ構造をとる。図２及び図４は、あくまでも、前記領域の連結順序および二重鎖部を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ、リンカー領域（ＬｙおよびＬｚ）の形状等は、これらに限定されない。
Ｙ１領域とＸ１領域とＺ領域（又はＺ１領域）とからなるＷ１領域およびＸ２領域とＹ２領域とからなるＷ２領域の少なくとも一方が、ＲＮＡ干渉法の標的となる遺伝子の発現を抑制する配列を少なくとも一つ含んでいてもよい。連結一本鎖ＲＮＡにおいて、Ｗ１領域とＷ２領域とは、完全に相補的でもよいし、１もしくは数ヌクレオチドが非相補的であってもよいが、完全に相補的であることが好ましい。前記１若しくは数個のヌクレオチドは、例えば、１〜３個のヌクレオチド、好ましくは１または２個のヌクレオチドである。Ｙ１領域は、Ｙ２領域の全領域に対して相補的なヌクレオチド配列を有している。Ｙ１領域とＹ２領域とは、互いに完全に相補的なヌクレオチド配列であり、２以上の同数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列である。Ｘ１領域は、Ｘ２領域の全領域に対して相補的なヌクレオチド配列を有している。Ｘ１領域とＸ２領域とは、互いに完全に相補的なヌクレオチド配列であり、２以上の同数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列である。本実施形態の製造方法では、Ｚ領域は、任意の数のヌクレオチド配列を含む領域であり、必須の配列ではなく、ヌクレオチドの数が０の態様であってもよく、１以上のヌクレオチドを含む態様であってもよい。Ｚ領域は、５’末端からＺ１、ＬｚおよびＺ２の各領域を連結したものであってもよい。
以下に各領域の長さを例示するが、これに限定されない。本明細書において、ヌクレオチド数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものであり、具体例として、「１〜４ヌクレオチド」との記載は、「１ヌクレオチド」、「２ヌクレオチド」、「３ヌクレオチド」、および「４ヌクレオチド」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
連結一本鎖ＲＮＡ分子において、Ｗ２領域のヌクレオチド数（Ｗ２ｎ）と、Ｘ２領域のヌクレオチド数（Ｘ２ｎ）およびＹ２領域のヌクレオチド数（Ｙ２ｎ）との関係は、例えば、下記式（１）の条件を満たす。Ｗ１領域のヌクレオチド数（Ｗ１ｎ）と、Ｘ１領域のヌクレオチド数（Ｘ１ｎ）およびＹ１領域のヌクレオチド数（Ｙ１ｎ）との関係は、例えば、下記式（２）の条件を満たす。
Ｗ２ｎ＝Ｘ２ｎ＋Ｙ２ｎ ・・・（１）
Ｗ１ｎ≧Ｘ１ｎ＋Ｙ１ｎ ・・・（２）
連結一本鎖ＲＮＡ分子において、Ｘ１領域のヌクレオチド数（Ｘ１ｎ）とＹ１領域のヌクレオチド数（Ｙ１ｎ）との関係は、特に制限されず、例えば、下記式のいずれかの条件を満たす。
Ｘ１ｎ＝Ｙ１ｎ ・・・（３）
Ｘ１ｎ＜Ｙ１ｎ ・・・（４）
Ｘ１ｎ＞Ｙ１ｎ ・・・（５）
本実施形態の方法において、Ｘ１領域のヌクレオチド数（Ｘ１ｎ）、即ちＸ２領域のヌクレオチド数（Ｘ２ｎ）は、２以上であり、好ましくは４以上であり、より好ましくは１０以上である。
Ｙ１領域のヌクレオチド数（Ｙ１ｎ）、即ちＹ２領域のヌクレオチド数（Ｙ２ｎ）は、２以上であり、好ましくは３以上であり、より好ましくは４以上である。
Ｚ１領域は、好ましくは、Ｚ２領域の全領域またはＺ２領域の部分領域に対して相補的なヌクレオチド配列を含む。Ｚ１領域とＺ２領域とは、１もしくは数ヌクレオチドが非相補的であってもよいが、完全に相補的であることが好ましい。
より詳しくは、Ｚ２領域は、Ｚ１領域よりも、１ヌクレオチド以上短いヌクレオチド配列からなることが好ましい。この場合、Ｚ２領域のヌクレオチド配列全体が、Ｚ１領域の任意の部分領域の全てのヌクレオチドと相補的となる。Ｚ２領域の５’末端から３’末端までのヌクレオチド配列は、Ｚ１領域の３’末端のヌクレオチドから始まり５’末端に向かってのヌクレオチド配列と相補性のある配列であることがより好ましい。
連結一本鎖ＲＮＡ分子において、Ｘ１領域のヌクレオチド数（Ｘ１ｎ）とＸ２領域の塩基数（Ｘ２ｎ）との関係、Ｙ１領域のヌクレオチド数（Ｙ１ｎ）とＹ２領域のヌクレオチド数（Ｙ２ｎ）との関係、並びにＺ１領域のヌクレオチド数（Ｚ１ｎ）とＺ２領域のヌクレオチド数（Ｚ２ｎ）との関係は、下記式（６）、（７）および（８）の条件をそれぞれ満たす。
Ｘ１ｎ＝Ｘ２ｎ ・・・（６）
Ｙ１ｎ＝Ｙ２ｎ ・・・（７）
Ｚ１ｎ≧Ｚ２ｎ ・・・（８）
連結一本鎖ＲＮＡの全長（ヌクレオチドの総数）は、特に制限されない。連結一本鎖ＲＮＡにおいて、ヌクレオチド数の合計（全長のヌクレオチド数）は、下限が、典型的には、３８であり、好ましくは４２であり、より好ましくは５０であり、さらに好ましくは５１であり、特に好ましくは５２であり、その上限は、典型的には、３００であり、好ましくは２００であり、より好ましくは１５０であり、さらに好ましくは１００であり、特に好ましくは８０である。連結一本鎖ＲＮＡにおいて、リンカー領域（Ｌｙ、Ｌｚ）を除くヌクレオチド数の合計は、下限が、典型的には、３８であり、好ましくは４２であり、より好ましくは５０であり、さらに好ましくは５１であり、特に好ましくは５２であり、上限が、典型的には、３００であり、好ましくは２００であり、より好ましくは１５０であり、さらに好ましくは１００であり、特に好ましくは８０である。
連結一本鎖ＲＮＡにおいて、ＬｙおよびＬｚのリンカー領域の長さは、特に制限されない。これらのリンカー領域は、例えば、Ｘ１領域とＸ２領域とが二重鎖を形成可能な長さ、あるいはＹ１領域とＹ２領域とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましい。ＬｙおよびＬｚの各リンカー領域は、アミノ酸から誘導される原子団を有する領域である。これらのリンカー領域（Ｌｙ、Ｌｚ）は、通常、非ヌクレオチドのリンカー領域である。
リンカー領域の主鎖を形成する原子の数は、その上限は、典型的には、１００であり、好ましくは８０であり、より好ましくは５０である。
Ｌｙリンカー領域は、例えば、下記式（Ｉ）で表される二価の基であり、Ｌｚは、例えば、下記式（Ｉ’）で表される二価の基である。
Figure 2019156020
 （式中、Ｙ１１及びＹ２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ１２及びＹ２２は、それぞれ独立して、水素原子もしくはアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ１２とＹ２２とがその末端で互いに結合して炭素数３〜４のアルキレン基を表し、Ｙ１１に結合している末端の酸素原子は、Ｙ１領域およびＹ２領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、Ｙ２１に結合している末端の酸素原子は、Ｙ１領域およびＹ２領域のＹ１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
Figure 2019156020
 （式中、Ｙ’１１及びＹ’２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ’１２及びＹ’２２は、それぞれ独立して、水素原子もしくはアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ’１２とＹ’２２とがその末端で互いに結合して炭素数３〜４のアルキレン基を表し、Ｙ’１１に結合している末端の酸素原子は、Ｚ１領域およびＺ２領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、Ｙ’２１に結合している末端の酸素原子は、Ｚ１領域およびＺ２領域のＹ’１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
前記Ｙ１１及びＹ２１、並びに、Ｙ’１１及びＹ’２１における炭素数１〜２０のアルキレン基は、炭素数１〜１０が好ましく、炭素数１〜５がより好ましい。アルキレン基は、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよい、
前記Ｙ１２及びＹ２２、並びに、Ｙ’１２及びＹ’２２におけるアミノ基で置換されていてもよいアルキル基は、炭素数１〜１０が好ましく、炭素数１〜５がより好ましい。アルキル基は、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよい。
ＬｙリンカーおよびＬｚリンカーの好適な例としては、下記式（ＩＩ-Ａ）または（ＩＩ-Ｂ）で表される構造の二価の基が挙げられる。
Figure 2019156020
 （式中、ｎおよびｍは、それぞれ独立して、１から２０の何れかの整数を表す。）
ｎおよびｍは、１〜１０のいずれかの整数であることが好ましく、１〜５のいずれかの整数であることがより好ましい。
好ましい態様において、ＬｙリンカーおよびＬｚリンカーは、それぞれ独立して、式（ＩＩ−Ａ）または（ＩＩ−Ｂ）の何れかの二価の基を表す。
第１の一本鎖ＲＮＡおよび第２の一本鎖ＲＮＡの例としては、具体的には、図５及び図６に記載したものが例示される。
本実施形態の製造方法で実施する連結反応においては、国際生化学連合が酵素番号として定めるＥＣ６．５．１．３に分類されるＲＮＡリガーゼであって、二本鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼ（以下、「本ＲＮＡリガーゼ」と記すこともある）が使用される。かかるＲＮＡリガーゼとしては、たとえば、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４ ＲＮＡリガーゼ２が例示される。このＲＮＡリガーゼ２は、例えば、（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）から購入できる。さらに、ＲＮＡリガーゼとしては、ビブリオファージ（ｖｉｂｒｉｏｐｈａｇｅ）ＫＶＰ４０由来のリガーゼ２、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ ＲＮＡリガーゼ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ ＲＮＡリガーゼ、若しくはＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ ＲＮＡリガーゼが例示される。かかるＲＮＡリガーゼは、たとえば、非特許文献（Structure and Mechanism of RNA Ligase, Structure, Vol.12, PP.327-339.）に記載の方法で各生物から抽出および精製することで得られたものを用いることもできる。
Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４ ＲＮＡリガーゼ２としては、配列番号２１に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、二本鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼも使用可能である。かかるＲＮＡリガーゼ２としては、配列番号２１に記載のアミノ酸配列の酵素のほかに、その変異体であるＴ３９Ａ，Ｆ６５Ａ，Ｆ６６Ａ（RNA ligase structures reveal the basis for RNA specificity and conformational changes that drive ligation forward, Cell. Vol.127, pp.71-84.参照）などを例示することができる。かかるＲＮＡリガーゼ２は、例えば、前記文献の記載に基づき、ＡＴＣＣ（登録商標） １１３０３としてＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されている、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４を用いる方法やＰＣＲ等の方法で得ることが可能である。
ＫＶＰ４０由来のＲＮＡリガーゼ２は、非特許文献（Characterization of bacteriophage KVP40 and T4 RNA ligase 2, Virology, vol. 319, PP.141-151.）に記載の方法で取得することができる。具体的には、例えば、以下のような方法で取得できる。すなわち、バクテリオファージＫＶＰ４０（例えば、寄託番号Ｇｏ００８１９９としてＪＧＩに寄託されている）から抽出したＤＮＡのうち、オープンリーディングフレーム２９３を、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩによって制限酵素消化したのちに、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅させる。得られたＤＮＡをプラスミドベクターｐＥＴ１６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に組み込む。または、当該のＤＮＡ配列をＰＣＲによって人工合成することもできる。ここで、ＤＮＡ配列解析により、所望の変異体を得ることができる。続いて、得られたベクターＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に組み込み、０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地中にて培養する。イソプロピル−β−チオガラクトシドを０．５ｍＭになるように添加し、３７℃で３時間培養する。その後の操作はすべて４℃で行うことが好ましい。まず、遠心操作により菌体を沈殿させ、沈殿物を−８０℃にて保管する。凍った菌体にバッファーＡ［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．２Ｍ ＮａＣｌ，１０％スクロース］を加える。そして、リゾチームとＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加え、超音波によって菌体を破砕し、目的物を溶出させる。その後、アフィニティクロマトグラフィやサイズ排除クロマトグラフィなどを利用して目的物を単離する。そして、得られた水溶液を遠心ろ過し、溶離液をバッファーに置換することによりリガーゼとして使用することができる。
このようにして、ＫＶＰ４０由来のＲＮＡリガーゼ２を得ることができる。ＫＶＰ４０由来のＲＮＡリガーゼ２としては、配列番号２２のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、二本鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼが使用可能である。
Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ ＲＮＡリガーゼは非特許文献（An RNA Ligase from Deinococcus radiodurans, J Biol Chem., Vol. 279, No.49, PP. 50654-61.）に記載の方法で取得することができる。例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）ＢＡＡ−８１６としてＡＴＣＣに寄託されている生物学的な材料から、前記リガーゼを得ることも可能である。Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ ＲＮＡリガーゼとしては、配列番号２３のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、二本鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを使用可能である。かかるリガーゼとしては、具体的には、配列番号２３のアミノ酸配列からなるＲＮＡリガーゼに加えて、配列番号２３のＲＮＡリガーゼにおいて、Ｋ１６５ＡあるいはＥ２７８Ａの変異を有するアミノ酸配列からなるＲＮＡリガーゼが例示される（An RNA Ligase from Deinococcus radiodurans, J Biol Chem., Vol. 279, No.49, PP. 50654-61.）。
Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ ＲＮＡリガーゼは非特許文献（Assiciation of Two Novel Proteins TbMP52 and TbMP48 with the Trypanosoma brucei RNA Editing Complex, Vol.21, No.2, PP.380-389.）に記載の方法で取得することができる。
Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ ＲＮＡリガーゼは非特許文献（The Mitochondrial RNA Ligase from Leishmania tarentolae Can Join RNA Molecules Bridged by a Complementary RNA, Vol. 274, No.34, PP.24289-24296）に記載の方法で取得することができる。
本ＲＮＡリガーゼを用いる本実施形態の製造方法の反応条件は、本ＲＮＡリガーゼが機能する条件であれば、特に限定されないが、一つの典型的な例としては、第１の核酸鎖と、第２の核酸鎖と、ＡＴＰ、塩化マグネシウム、およびＤＴＴを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）と、純水と、を混合し、その混合液に本ＲＮＡリガーゼを加え、その後当該リガーゼが機能する温度（例えば３７℃）で所定時間（例えば１時間）反応させる条件が挙げられる。
あるいは、本実施形態の製造方法は、非特許文献（Bacteriophage T4 RNA ligase 2 (gp24-1) exemplifies a family of RNA ligases found in all, Proc. Natl. Acad. Sci, 2002, Vol.99, No.20, PP.12709-12714.）に記載の条件に準じて行うこともできる。
本ＲＮＡリガーゼを用いた第１の一本鎖ＲＮＡおよび第２の一本鎖ＲＮＡの連結反応で得られた粗生成物は、ＲＮＡを沈殿、抽出および精製する方法を用いることで通常、単離することができる。
具体的には、連結反応後の溶液にエタノールやイソプロピルアルコールなどのＲＮＡに対して溶解性の低い溶媒を加えることでＲＮＡを沈殿させる方法や、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（例えば、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール＝２５／２４／１）の混合溶液を連結反応後の溶液に加え、ＲＮＡを水層に抽出する方法が採用される。
連結ＲＮＡを精製する方法としては、逆相カラムクロマトグラフィーや陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティカラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーなどの公知の方法が挙げられ、これらの方法を適宜組み合わせて用いて、粗生成物から連結したＲＮＡを単離することができる。
第１の一本鎖ＲＮＡは、例えば、固相合成法により調製することができる。より具体的には、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（ＮＴＳ Ｍ−４ＭＸ−Ｅ（日本テクノサービス株式会社製）を用いて調製することができる。ホスホロアミダイト法は、デブロッキング、カップリング、および酸化の３段階を１サイクルとして、望みの塩基配列が得られるまでこのサイクルを繰り返す方法である。各試薬に関して、たとえば、固相担体として多孔質ガラスを使用し、デブロッキング溶液としてジクロロ酢酸トルエン溶液を使用し、カップリング剤として５−ベンジルメルカプト−１Ｈ−テトラゾールを使用し、酸化剤としてヨウ素溶液を使用し、キャッピング溶液として無水酢酸溶液とＮ−メチルイミダゾール溶液を使用して行うことができる。固相合成後の固相担体からの切出しと脱保護は、たとえば、国際公開第２０１３／０２７８４３号に記載の方法に従って行うことができる。すなわち、アンモニア水溶液とエタノールを加えて塩基部およびリン酸基の脱保護と固相担体からの切り出しを行なったのち、固相担体をろ過し、その後、テトラブチルアンモニウムフルオリドを用いて２’−水酸基の脱保護を行なってＲＮＡを調製することができる。
かかる固相合成法で使用するアミダイトとしては、特に制限されず、たとえば、下記構造式（ＩＩＩ−ａ）中の、Ｒ１がターシャリブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基、ビス（２−アセトキシ）メチル（ＡＣＥ）基、（トリイソプロピルシリロキシ）メチル（ＴＯＭ）基、（２−シアノエトキシ）エチル（ＣＥＥ）基、（２−シアノエトキシ）メチル（ＣＥＭ）基、パラ―トルイルスルホニルエトキシメチル（ＴＥＭ）基、（２−シアノエトキシ）メトキシメチル（ＥＭＭ）基などで保護された、ＴＢＤＭＳアミダイト（ＴＢＤＭＳ ＲＮＡ Ａｍｉｄｉｔｅｓ、商品名、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＡＣＥアミダイト、ＴＯＭアミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト（Chakhmakhchevaの総説：Protective Groups in the Chemical Synthesis of Oligoribonucleotides、Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2013, Vol. 39, No. 1, pp. 1-21.）ＥＭＭアミダイト（国際公開第２０１３／０２７８４３号に記載）等を使用することもできる。
またＬｙリンカー領域およびＬｚリンカー領域については、下記構造式（ＩＩＩ―ｂに示されるプロリン骨格を有するアミダイトを国際公開第２０１２／０１７９１９号の実施例Ａ４の方法にて使用することができる。また、下記構造式（ＩＩＩ―ｃ）、（ＩＩＩ―ｄ）および（ＩＩＩ−ｅ）のいずれかで表されるアミダイト（国際公開第２０１３／１０３１４６号の実施例Ａ１〜Ａ３参照）を使用することにより、同様に核酸合成機にて調製することができる。
５’末端の５’位のリン酸化には、５’末端のリン酸化用のアミダイトを固相合成にて使用してもよい。５’末端のリン酸化用のアミダイトは市販のアミダイトを使用することができる。また固相合成にて、５’末端の５’位が水酸基若しくは保護された水酸基であるＲＮＡ分子を合成しておき、適宜脱保護を行った後に、市販のリン酸化剤にてリン酸化することで５’末端にリン酸基を有する一本鎖ＲＮＡを調製することができる。リン酸化剤としては下記構造式（ＩＩＩ−ｆ）で示される市販のＣｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）が知られている（特許文献ＥＰ０８１６３６８）。
Figure 2019156020
式（ＩＩＩ−ａ）において、Ｒ２は保護基で保護されていてもよい核酸塩基を示し、Ｒ１は保護基を示す。
Figure 2019156020
Figure 2019156020
Figure 2019156020
Figure 2019156020
Figure 2019156020
第２の一本鎖ＲＮＡは、固相合成法、即ちホスホロアミダイト法に基づく核酸合成機を用いて、同様に製造することができる。
ヌクレオチドを構成する塩基は、通常は、核酸、典型的にはＲＮＡを構成する天然の塩基であるが、非天然の塩基を場合によっては、使用してもよい。かかる非天然の塩基としては、天然あるいは非天然の塩基の修飾アナログが例示される。
塩基の例としては、例えば、アデニンおよびグアニン等のプリン塩基、シトシン、ウラシルおよびチミン等のピリミジン塩基等があげられる。塩基は、この他に、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ）等があげられる。前記塩基は、例えば、２−アミノアデニン、６−メチル化プリン等のアルキル誘導体；２−プロピル化プリン等のアルキル誘導体；５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン；５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル；８−ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化および他の８−置換プリン；５−トリフルオロメチル化および他の５−置換ピリミジン；７−メチルグアニン；５−置換ピリミジン；６−アザピリミジン；Ｎ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；ジヒドロウラシル；３−デアザ−５−アザシトシン；２−アミノプリン；５−アルキルウラシル；７−アルキルグアニン；５−アルキルシトシン；７−デアザアデニン；Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン；２，６−ジアミノプリン；５−アミノ−アリル−ウラシル；Ｎ３−メチルウラシル；置換１，２，４−トリアゾール；２−ピリジノン；５−ニトロインドール；３−ニトロピロール；５−メトキシウラシル；ウラシル−５−オキシ酢酸；５−メトキシカルボニルメチルウラシル；５−メチル−２−チオウラシル；５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル；５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル；３−メチルシトシン；５−メチルシトシン；Ｎ４−アセチルシトシン；２−チオシトシン；Ｎ６−メチルアデニン；Ｎ６−イソペンチルアデニン；２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン；Ｎ−メチルグアニン；Ｏ−アルキル化塩基等があげられる。また、プリン塩基およびピリミジン塩基には、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、「Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、８５８〜８５９頁、クロシュビッツ ジェー アイ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ Ｊ．Ｉ．）編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９０、およびイングリッシュら（Ｅｎｇｌｉｓｃｈら）、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０巻、ｐ．６１３に開示されるものが含まれる。
本実施形態の方法で得られる、５’末端側から、Ｘ１領域、Ｙ１領域、Ｌｙ領域、Ｙ２領域、Ｘ２領域およびＺ領域からなる一本鎖ＲＮＡ核酸分子は、その５’末端と３’末端とが未連結であり、線状一本鎖核酸分子ということもできる。かかる一本鎖ＲＮＡ核酸分子は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、標的遺伝子の発現抑制に使用でき、ＲＮＡ干渉により、標的遺伝子の発現抑制のために使用することができる。「標的遺伝子の発現抑制」とは、例えば、標的遺伝子の発現を阻害することを意味する。前記抑制のメカニズムは、特に制限されず、例えば、ダウンレギュレーションまたはサイレンシングでもよい。
標的遺伝子の発現抑制は、例えば、標的遺伝子からの転写産物の生成量の減少、転写産物の活性の減少、標的遺伝子からの翻訳産物の生成量の減少、または翻訳産物の活性の減少等によって確認できる。翻訳産物としてのタンパク質は、例えば、成熟タンパク質、または、プロセシングもしくは翻訳後修飾を受ける前の前駆体タンパク質等があげられる。
以下に、本実施形態による実施例を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］
１．第１の一本鎖ＲＮＡの合成
実施例１の鎖ＩのＲＮＡとして、以下に示す一本鎖ＲＮＡ（表２の配列１；配列番号１）を合成した。前記鎖Ｉは１３塩基長からなり、第１の一本鎖ＲＮＡに対応する。
鎖Ｉ（配列１）：５’−ｐＧＵＧＵＡＣＵＣＵＧＣＵＵ−３’
前記一本鎖ＲＮＡは、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＮＴＳ Ｍ−４ＭＸ−Ｅ、日本テクノサービス株式会社）を用いて３’側から５’側に向かって合成した。前記合成には、ＲＮＡアミダイトとして、国際公開第２０１３／０２７８４３号の実施例２に記載のウリジンＥＭＭアミダイト、実施例３に記載のシチジンＥＭＭアミダイト、実施例４に記載のアデノシンＥＭＭアミダイト、実施例５に記載のグアノシンＥＭＭアミダイト及び、５’リン酸化はＣｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用し、固相担体として多孔質ガラスを使用し、デブロッキング溶液として高純度トリクロロ酢酸トルエン溶液を使用し、縮合剤として５−ベンジルメルカプト−１Ｈ−テトラゾールを使用し、酸化剤としてヨウ素溶液を使用し、キャッピング溶液としてフェノキシ酢酸溶液とＮ−メチルイミダゾール溶液を使用して行った。固相合成後の固相担体からの切出しと脱保護は、国際公開第２０１３／０２７８４３号に記載の方法に従った。すなわち、アンモニア水溶液とエタノールを加え、しばらく静置したのちに固相担体をろ過し、その後、テトラブチルアンモニウムフルオリドを用いて水酸基の脱保護を行った。得られたＲＮＡを注射用蒸留水によって用いて所望の濃度となるように溶解した。
２．第２の一本鎖ＲＮＡの合成
実施例１の鎖ＩＩのＲＮＡとして、以下に示す一本鎖ＲＮＡ（表２の配列２；配列番号２，３）を合成した。前記鎖ＩＩは３６塩基長からなり、第２の一本鎖ＲＮＡに対応する。
鎖ＩＩ（配列２）：５’−ＧＣＡＧＡＧＵＡＣＡＣＡＣＡＧＣＡＵＡＵＡＣＣＫＧＧＵＡＵＡＵＧＣＵＧＵ−３’
前記一本鎖ＲＮＡは、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＮＴＳ Ｍ−４ＭＸ−Ｅ、日本テクノサービス株式会社）により合成した。前記合成には、ＲＮＡアミダイトとして、国際公開第２０１３／０２７８４３号の実施例２に記載のウリジンＥＭＭアミダイト、実施例３に記載のシチジンＥＭＭアミダイト、実施例４に記載のアデノシンＥＭＭアミダイト及び実施例５に記載のグアノシンＥＭＭアミダイト、および、国際公開第２０１２／０１７９１９号の実施例Ａ３に記載のリジンアミダイト（Ｉｅ）を用いた。固相合成後の固相担体からの切出しと脱保護は、国際公開第２０１３／０２７８４３号に記載の方法に従った。得られたＲＮＡを注射用蒸留水によって所望の濃度となるように溶解した。
３．ライゲーション反応
次に、第１のＲＮＡ鎖と第２のＲＮＡ鎖のライゲーション反応を、１６０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、４００μＭ ＡＴＰの組成で、反応スケール７．９ｍＬで行った。
得られる連結一本鎖ＲＮＡを下記に示す（配列１５；配列番号１７，１８）。
５’−ＧＣＡＧＡＧＵＡＣＡＣＡＣＡＧＣＡＵＡＵＡＣＣＫＧＧＵＡＵＡＵＧＣＵＧＵＧＵＧＵＡＣＵＣＵＧＣＵＵ−３’
具体的には、まず、第１のＲＮＡ鎖が５．５μＭ、第２のＲＮＡ鎖が５．０μＭとなるよう、５００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１０ｍＭ ＤＴＴを含む４０００μＭのＡＴＰ緩衝液（１０ｘ緩衝液）７９０μＬおよび注射用蒸留水を含む１５ｍＬチューブ内に第１のＲＮＡ鎖および第２のＲＮＡ鎖を加え、６５℃水浴中に１０分静置した。その後、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ製）を上記の組成と反応スケールになるように加え、２５℃で２４時間インキュベートした。反応後、反応液を下記表１に記載の条件で、カラムクロマトグラフィーにより精製を行った。得られた画分をそれぞれＨＰＬＣにて分析した。純度９０％以上の画分を集めて混合した。その結果、純度９０％、総収率１１％で目的物を得ることができた。ここで、総収率とは、仕込んだＲＮＡ鎖の量に対する、ライゲーション反応後の生成物を精製して得られた一本鎖ＲＮＡの量の割合である。前記ＲＮＡの量のは、波長２６０ｎｍの紫外線の吸光度に基づき求められる。吸光度が１を示す場合のＲＮＡの濃度を３３μｇ／ｍＬとして求めた値である。得られた試料を質量分析測定によって測定した結果、計算値と合致していることから、目的物が得られていることが確認できた（測定値：１５７１５．２４６４、理論値：１５７１５．２０７５）。
Figure 2019156020
［実施例２］
（Ｌｙ，Ｌｚがプロリン誘導体を含む連結一本鎖ＲＮＡの合成）
得られる連結一本鎖ＲＮＡは下記に示す（配列１６；配列番号１９，２０）。
５’−ＡＧＣＡＧＡＧＵＡＣＡＣＡＣＡＧＣＡＵＡＵＡＣＣＰＧＧＵＡＵＡＵＧＣＵＧＵＧＵＧＵＡＣＵＣＵＧＣＵＵＣＰＧ−３’
１．第１の一本鎖ＲＮＡの合成
実施例２の鎖ＩのＲＮＡとして、表３に示す鎖Ｉ（配列３）の一本鎖ＲＮＡ（表２の配列３；配列番号４）を合成した。前記鎖Ｉは１６塩基長からなり、第１の一本鎖ＲＮＡに対応する。
前記一本鎖ＲＮＡは、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＮＴＳ Ｍ−４ＭＸ−Ｅ、日本テクノサービス株式会社）を用いて合成した。前記合成には、ＲＮＡアミダイトとして、国際公開第２０１３／０２７８４３号の実施例２に記載のウリジンＥＭＭアミダイト、実施例３に記載のシチジンＥＭＭアミダイト、実施例４に記載のアデノシンＥＭＭアミダイト及び実施例５に記載のグアノシンＥＭＭアミダイト、および、国際公開第２０１２／０１７９１９号の実施例Ａ３に記載のプロリンアミダイト（Ｉｂ）を用いた。５’リン酸化はＣｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いた（以下、同様）。固相合成後の固相担体からの切出しと脱保護は、国際公開第２０１３／０２７８４３号に記載の方法に従った。得られたＲＮＡを、注射用蒸留水を用いて所望の濃度となるように溶解した。
２．第２のＲＮＡの合成
実施例２の鎖ＩＩのＲＮＡとして、表３に示す鎖ＩＩ（配列４）の一本鎖ＲＮＡ（表２の配列４；配列番号５，６）を合成した。前記鎖ＩＩは３７塩基長からなり、第２の一本鎖ＲＮＡに対応する。
第２の一本鎖ＲＮＡ鎖の合成は、脱保護以降の操作は第１の一本鎖ＲＮＡの合成と同様に行った。
３．ライゲーション反応
次に、第１のＲＮＡ鎖および第２のＲＮＡ鎖のライゲーション反応を、５８ｕｎｉｔｓ／ｍＬ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、４００μＭ ＡＴＰの組成で、反応スケール１０ｍＬで行った。
具体的には、まず、第１のＲＮＡ鎖が４．４μＭ、第２のＲＮＡ鎖が４．０μＭとなるよう、５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ ＤＴＴを含む４０００μＭ ＡＴＰ緩衝液（１０ｘ緩衝液）０．９６ｍＬおよび注射用蒸留水を加えた溶液に第１のＲＮＡ鎖および第２のＲＮＡ鎖を加え、６５℃水浴中に１０分静置した。その後、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を上記の組成と反応スケールになるように加え、２５℃で２４時間インキュベートした。反応後、反応液を表１に記載の条件を用いて、カラムクロマトグラフィー精製した。得られた画分をＨＰＬＣにより分析し、純度９０％以上の画分（クロマトグラムにおいて検出されるピークの総面積に対して目的物のピーク面積が占める比率が、９０％以上の割合となる画分）を集めて混合した。その結果、純度９４％、総収率１４％で目的物を得ることができた。また、得られた試料を質量分析測定によって測定した結果、計算値と合致していることから、目的物が得られていることが確認できた（測定値：１７０２５．４８５８、理論値：１７０２５．４６７２）。
［実施例３〜６］
以下、実施例３−６において、表３に記載の鎖Ｉ（第１の一本鎖ＲＮＡに対応）および鎖ＩＩ（第２の一本鎖ＲＮＡに対応）をそれぞれ核酸合成機により合成して用いること以外は、実施例２と同様に、Ｔ４ ＲＮＡ リガーゼ２を用いて反応を行い、反応生成物をカラムクロマトグラフィー精製し、得られた画分をＨＰＬＣにより分析した。実施例３−６のそれぞれについて、純度９０％以上の画分（前記同様の定義）を集めて混合し、純度及び総収率をそれぞれ求めた。その結果を表２にまとめて示す。
［参考例１］
実施例２と同じ連結一本鎖ＲＮＡ（配列１６）を合成するために、表３に示す鎖Ｉ（配列１３）と鎖ＩＩ（配列１４）とを核酸合成機で合成して用いる以外は実施例２と同様の操作にて実施した。このときの鎖ＩＩ（配列１４）におけるＹ１領域に対応する領域のヌクレオチド数は１個であった。ライゲーション反応後の反応液をＨＰＬＣにて分析したところ、鎖Ｉと鎖ＩＩのピークには変化が見られず、また、連結一本鎖ＲＮＡの溶出位置にはピークが検出されなかったことから、連結反応は進行していないことが確認された。
Figure 2019156020
実施例および参考例において使用した鎖Ｉおよび鎖ＩＩのＲＮＡの配列を不表３にまとめて示す。
Figure 2019156020
［実施例７］
第１のＲＮＡ鎖および第２のＲＮＡ鎖として表３に示す鎖Ｉ（配列１１）および鎖ＩＩ（配列１２）をそれぞれ用いて、第１のＲＮＡ鎖および第２のＲＮＡ鎖のライゲーション反応を、５８ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ＫＶＰ４０ ＲＮＡリガーゼ２、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、４００μＭ ＡＴＰの組成で、反応スケール１５ｍＬで行った。
第１のＲＮＡ鎖（配列１１）が２．６μＭ、第２のＲＮＡ鎖（配列１２）が２．４μＭとなるよう、５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ ＤＴＴを含む４０００μＭ ＡＴＰ緩衝液（１０ｘ緩衝液）１６６μＬおよび注射用蒸留水からなる溶液に第１のＲＮＡ鎖および第２のＲＮＡ鎖を加え、３７℃水浴中に１０分静置した。その後、ＫＶＰ４０ ＲＮＡリガーゼ２（プロテイン・エクスプレス）を上記の組成と反応スケールになるように加え、２５℃で２４時間インキュベートした。反応後、反応液に０．２Ｍ エチレンジアミン四酢酸ナトリウム水溶液を１ｍＬ加え、６５℃水浴中にて１０分加熱することにより酵素を失活させた。そのまま表１の条件を使用してＨＰＬＣにて分析した。
ライゲーション反応後、第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡが減少し、リテンションタイムが遅れた新たなピークが観察された。この溶出ピークを質量分析測定によって分子量を確認したところ、連結一本鎖ＲＮＡの計算値と合致していたことから、ライゲーション反応により目的の連結一本鎖ＲＮＡが生成したことが確認できた。
得られた画分を表１に示す条件でＨＰＬＣ分析を行ったのち、純度９５％以上で得られたものを混合した。その結果、純度９８％、総収率１６％にて目的物を得ることができた。
［比較例１］
比較例として、実施例２で合成した連結一本鎖ＲＮＡ（配列１６）と同じヌクレオチド配列の一本鎖ＲＮＡを、以下の通り、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＮＴＳ Ｍ−４ＭＸ−Ｅ、日本テクノサービス株式会社）を用いて３’側から５’側に向かって合成した。前記合成には、ＲＮＡアミダイトとして、国際公開第２０１３／０２７８４３号の実施例２に記載のウリジンＥＭＭアミダイト、実施例３に記載のシチジンＥＭＭアミダイト、実施例４に記載のアデノシンＥＭＭアミダイト、実施例５に記載のグアノシンＥＭＭアミダイト及び、５’リン酸化はＣｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用し、固相担体として多孔質ガラスを使用し、デブロッキング溶液として高純度トリクロロ酢酸トルエン溶液を使用し、縮合剤として５−ベンジルメルカプト−１Ｈ−テトラゾールを使用し、酸化剤としてヨウ素溶液を使用し、キャッピング溶液としてフェノキシ酢酸溶液とＮ−メチルイミダゾール溶液を使用して行った。固相合成後の固相担体からの切出しと脱保護は、国際公開第２０１３／０２７８４３号に記載の方法に従った。すなわち、アンモニア水溶液とエタノールを加え、しばらく静置したのちに固相担体をろ過し、その後、テトラブチルアンモニウムフルオリドを用いて水酸基の脱保護を行った。得られたＲＮＡを、注射用蒸留水を用いて所望の濃度となるように溶解した。
その後、得られたＲＮＡの粗生成体を表１の条件に従ってカラムクロマトグラフィーで精製した。得られた精製フラクションをそれぞれＨＰＬＣによって分析した。そのうち、純度９０％以上のフラクションは得られなかった。最も純度の高いフラクションを分析した結果、純度８７％、収率５％であった。
図５は、実施例１で用いた第１の一本鎖ＲＮＡ及び第２の一本鎖ＲＮＡ、並びに前記一本鎖ＲＮＡのライゲーション反応によって生成される連結一本鎖ＲＮＡを示す。図６は、実施例２で用いた第１の一本鎖ＲＮＡ及び第２の一本鎖ＲＮＡ、並びに前記一本鎖ＲＮＡのライゲーション反応によって生成される連結一本鎖ＲＮＡを示す。配列１〜１６ならびに図５および図６中の「Ａ」、「Ｇ」、「Ｕ」及び「Ｃ」のそれぞれの略号は下記に示すリボース環を含むＲＮＡの単位構造を意味する。
Ａは、下記式で表される。
Figure 2019156020
Ｇは、下記式で表される。
Figure 2019156020
Ｃは、下記式で表される。
Figure 2019156020
Ｕは、下記式で表される。
Figure 2019156020
但し、図５及び図６において、ＲＮＡ鎖の３’側の末端部分のみは、リン酸エステル部分はなく、リボースの３位が水酸基となる。
配列１〜１６ならびに図５および図６中の「Ｐ」および「Ｋ」の略号は、それぞれが下記に示される構造のアミノ酸から誘導される原子団を有するリンカー領域の構造を意味する。
Ｐは、下記の式で表される。
Figure 2019156020
Ｋは、下記の式で表される。
Figure 2019156020
配列１〜１６ならびに図５および図６中の「ｐ」の略号はリボース環の５’位がリン酸基〔−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２〕であることを意味する。
本発明にかかる一本鎖ＲＮＡの製造方法は、一本鎖ＲＮＡの簡便な製造方法として利用できる。

Claims (9)

  1. ５’末端にリン酸基を有する第１の一本鎖ＲＮＡと３’末端に水酸基を有する第２の一本鎖ＲＮＡに、国際生化学連合が酵素番号として定めるＥＣ６．５．１．３に分類され、二本鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを作用させ、前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとを連結する工程を含む一本鎖ＲＮＡの製造方法であって、以下のａ）〜ｇ）の特徴を有する製造方法：
    ａ）前記第１の一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、Ｘ１領域およびＺ領域からなる一本鎖ＲＮＡであり；
    ｂ）前記第２の一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、Ｘ２領域、Ｙ２領域、Ｌｙリンカー領域およびＹ１領域からなる一本鎖であり；
    ｃ）前記Ｘ１領域と前記Ｘ２領域とが、互いに相補的な、２以上の同数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；
    ｄ）前記Ｙ１領域と前記Ｙ２領域とが、互いに相補的な、２以上の同数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；
    ｅ）前記Ｚ領域が、任意のヌクレオチド数のヌクレオチド配列を含む領域であり；
    ｆ）Ｌｙリンカー領域が、アミノ酸から誘導される原子団を有するリンカー領域であり；
    ｇ）前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとの連結により生成する一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、前記Ｘ２領域、前記Ｙ２領域、前記Ｌｙリンカー領域、前記Ｙ１領域、前記Ｘ１領域および前記Ｚ領域からなる連結一本鎖ＲＮＡである。
  2. 前記Ｚ領域が、５’末端側から順に、Ｚ１領域、Ｌｚリンカー領域及びＺ２領域からなる領域であり、
    前記Ｌｚリンカー領域が、アミノ酸から誘導される原子団を有するリンカー領域であり、
    前記Ｚ１領域と前記Ｚ２領域とが、互いに相補的なヌクレオチド配列を含み、 前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとの連結により生成する一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、前記Ｘ２領域、前記Ｙ２領域、前記Ｌｙリンカー領域、前記Ｙ１領域、前記Ｘ１領域および前記Ｚ１領域、前記Ｌｚリンカー領域および前記Ｚ２領域からなる連結一本鎖ＲＮＡである、請求項１に記載の製造方法。
  3. 前記Ｌｙリンカー領域が、下記式（Ｉ）で表される二価の基である、請求項１に記載の製造方法。
    Figure 2019156020
     （式中、Ｙ１１及びＹ２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ１２及びＹ２２は、それぞれ独立して、水素原子もしくはアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ１２とＹ２２とがその末端で互いに結合して炭素数３〜４のアルキレン基を表し、
    Ｙ１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ１領域および前記Ｙ２領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
    Ｙ２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ１領域および前記Ｙ２領域のＹ１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
  4. 前記Ｌｙリンカー領域が、下記式（Ｉ）で表される二価の基であり、前記Ｌｚリンカー領域が、下記式（Ｉ’）で表される二価の基である、請求項２に記載の製造方法。
    Figure 2019156020
     （式中、Ｙ１１及びＹ２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ１２及びＹ２２は、それぞれ独立して、水素原子もしくはアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ１２とＹ２２とがその末端で互いに結合して炭素数３〜４のアルキレン基を表し、
    Ｙ１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ１領域および前記Ｙ２領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
    Ｙ２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ２領域および前記Ｙ１領域のＹ１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
    Figure 2019156020
     （式中、Ｙ’１１及びＹ’２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ’１２及びＹ’２２は、それぞれ独立して、水素原子もしくはアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ’１２とＹ’２２とがその末端で互いに結合し炭素数３〜４のアルキレン基を表し、
    Ｙ’１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｚ１領域および前記Ｚ２領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
    Ｙ’２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｚ２領域および前記Ｚ１領域のＹ’１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
  5. 前記Ｌｙリンカー領域および前記Ｌｚリンカー領域は、それぞれ独立して、下記式（ＩＩ−Ａ）または（ＩＩ−Ｂ）で表される構造の二価の基である、請求項３または４に記載の製造方法。
    Figure 2019156020
     （式中、ｎおよびｍは、それぞれ独立して、１から２０の何れかの整数を表す。）
  6. 前記Ｘ１領域、前記Ｙ１領域および前記Ｚ領域からなるＷ１領域、および前記Ｘ２領域および前記Ｙ２領域からなるＷ２領域の少なくとも一方に、ＲＮＡ干渉法の標的となる遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド配列を含む、請求項１から５の何れか一項に記載の製造方法。
  7. 前記ＲＮＡリガーゼが、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４ ＲＮＡリガーゼ２、ＫＶＰ４０由来のリガーゼ２、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ ＲＮＡリガーゼ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ ＲＮＡリガーゼ、またはＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ ＲＮＡリガーゼである、請求項１から６の何れか一項に記載の製造方法。
  8. 前記ＲＮＡリガーゼが、配列番号２１、２２、または２３に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるＲＮＡリガーゼである、請求項１から６の何れか一項に記載の製造方法。
  9. 前記ＲＮＡリガーゼが、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４ ＲＮＡリガーゼ２またはＫＶＰ４０由来のＲＮＡリガーゼ２である、請求項１から６の何れか一項に記載の製造方法。
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