WO2021024465A1 - 核酸分子の製造方法 - Google Patents

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WO2021024465A1
WO2021024465A1 PCT/JP2019/031421 JP2019031421W WO2021024465A1 WO 2021024465 A1 WO2021024465 A1 WO 2021024465A1 JP 2019031421 W JP2019031421 W JP 2019031421W WO 2021024465 A1 WO2021024465 A1 WO 2021024465A1
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彬裕 阪田
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住友化学株式会社
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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Y605/01—Ligases forming phosphoric ester bonds (6.5) forming phosphoric ester bonds (6.5.1)
    • C12Y605/01003—RNA ligase (ATP) (6.5.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a nucleic acid molecule.
  • Patent Documents 1 and 2 disclose single-stranded RNA used in the RNA interference method, and as a method for producing such a compound, a method for producing such a compound by a multi-step chemical reaction using a nucleic acid synthesizer is known. ing.
  • An object of the present invention is to provide a simple method for producing single-stranded RNA.
  • the present invention includes the following aspects.
  • the method for producing positive-strand RNA according to one aspect of the present invention is (I) EC6.5.1 defined by the International Biochemical Union as an enzyme number for the first single-strand RNA having a phosphate group at the 5'end and the second single-strand RNA having a hydroxyl group at the 3'end.
  • the reaction product containing the single-strand RNA produced in the ligation step is purified by reverse phase column chromatography using a mobile phase containing at least one ammonium salt selected from the group consisting of monoalkylammonium salts and dialkylammonium salts.
  • a method for producing a single-stranded RNA including a step.
  • the first single-stranded RNA is a single-stranded RNA consisting of an X1 region and a Z region in order from the 5'end side;
  • the second single-stranded RNA is a single-stranded RNA consisting of an X2 region, a Y2 region, a Ly linker region, and a Y1 region in this order from the 5'end side;
  • the X1 region and the X2 region are nucleotide sequences consisting of 5 or more nucleotides complementary to each other;
  • the Y1 region and the Y2 region are nucleotide sequences consisting of two or more nucleotides complementary to each other;
  • the Z region is a region containing a nucleotide sequence of an arbitrary number of nucleotides;
  • the Ly linker region is a linker region having an atomic group derived from a 4 to 30-mer nucleotide sequence or amino acid;
  • a method for producing a single-stranded RNA which is a linked single-stranded RNA composed of the Y1 region, the X1 region, and the Z region.
  • the Z region is a region composed of a Z1 region, an Lz linker region, and a Z2 region in order from the 5'terminal side.
  • the Lz linker region is a linker region having an atomic group derived from an amino acid, and the Z1 region and the Z2 region contain nucleotide sequences complementary to each other, and the first single-stranded RNA and the second
  • the single-stranded RNA generated by ligation with the single-stranded RNA is, in order from the 5'end side, the X2 region, the Y2 region, the Ly linker region, the Y1 region, the X1 region, the Z1 region, and the above. It is a production method which is a linked single-stranded RNA consisting of an Lz linker region and the Z2 region.
  • the method for producing a single-stranded RNA according to one aspect of the present invention is a production method in which the Ly linker region is a divalent group represented by the following formula (I) in the production method.
  • Y 11 and Y 21 each independently represent an alkylene group having 1 to 20 carbon atoms
  • Y 12 and Y 22 can be independently substituted with a hydrogen atom or an amino group, respectively.
  • a good alkyl group is represented, or Y 12 and Y 22 are bonded to each other at their ends to represent an alkylene group having 3 to 4 carbon atoms, and the terminal oxygen atom bonded to Y 11 is the Y1 region and the terminal.
  • the terminal oxygen atom bonded to Y 21 includes a Y 11 of the Y1 region and the Y2 region It is bound to the phosphorus atom of the phosphate ester of the terminal nucleotide of the other unbound region.
  • the Ly linker region is a divalent group represented by the following formula (I)
  • the Lz linker region is , A manufacturing method which is a divalent group represented by the following formula (I').
  • Y 11 and Y 21 each independently represent an alkylene group having 1 to 20 carbon atoms
  • Y 12 and Y 22 can be independently substituted with a hydrogen atom or an amino group, respectively.
  • a good alkyl group is represented, or Y 12 and Y 22 are bonded to each other at their ends to represent an alkylene group having 3 to 4 carbon atoms, and the terminal oxygen atom bonded to Y 11 is the Y1 region and the terminal.
  • the terminal oxygen atom bonded to Y 21 includes a Y 11 of the Y2 region and the Y1 area It is bound to the phosphorus atom of the phosphate ester of the terminal nucleotide of the other unbound region.
  • Y '11 and Y' 21 each independently represents an alkylene group having 1 to 20 carbon atoms
  • Y '12 and Y' 22 are each independently substituted with hydrogen atom or an amino group or represents an alkyl group which may be, or Y '12 and Y' 22 and are bonded to one another at their ends an alkylene group having 3 to 4 carbon atoms
  • oxygen-terminal bonded to Y '11 are oxygen atoms of the being bonded with Z1 region and phosphorus atoms of the phosphoric acid ester of a terminal nucleotide of one of regions of the Z2 area, terminal bonded to Y '21, the Z2 region and wherein the Z1 region of Y '11 is bonded to the phosphorus atom of the phosphoric acid ester of a terminal nucleotide of the other regions that are not bound.
  • the Ly linker region and the Lz linker region are independent of each other according to the following formula (II-A) or (II-II-). It is a manufacturing method which is a divalent group of the structure represented by B).
  • n and m each independently represent an integer from 1 to 20.
  • the method for producing single-stranded RNA is the method for producing single-stranded RNA, which comprises the X1 region, the Y1 region and the Z region, and W2 composed of the X2 region and the Y2 region.
  • a production method comprising at least one of the regions a nucleotide sequence that suppresses the expression of a gene targeted by the RNA interference method.
  • the RNA ligase is T4 RNA ligase 2 derived from T4 bacteriophage, ligase 2 derived from KVP40, Tripanoma brucei RNA ligase, Deinococcus. It is a production method which is a radiodurans RNA ligase or a Leishmania tarentolae RNA ligase.
  • the RNA ligase in the production method, has 95% or more identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9, 10, or 11. It is a production method which is an RNA ligase consisting of an amino acid sequence.
  • the method for producing a single-stranded RNA is a production method in which the RNA ligase is T4 RNA ligase 2 derived from T4 bacteriophage or RNA ligase 2 derived from KVP40 in the production method. is there.
  • single-stranded RNA can be easily produced.
  • 6 is a chromatogram of an ultraviolet detection method (wavelength 260 nm) measured by reverse phase column chromatography using an aqueous solution of hexyl ammonium acetate as mobile phase A in Example 1.
  • 6 is a chromatogram of an ultraviolet detection method (wavelength 260 nm) measured by reverse phase column chromatography using an aqueous solution of dipropylammonium acetate as mobile phase A in Example 1.
  • 6 is a chromatogram of an ultraviolet detection method (wavelength 260 nm) measured by reverse phase column chromatography using an aqueous dibutylammonium acetate solution as mobile phase A in Example 1.
  • 6 is a chromatogram of an ultraviolet detection method (wavelength 260 nm) measured by reverse phase column chromatography using an aqueous solution of diamyl ammonium acetate as mobile phase A in Example 1.
  • 6 is a chromatogram of an ultraviolet detection method (wavelength 260 nm) measured by reverse phase column chromatography using an aqueous solution of tetrabutylammonium phosphate as mobile phase A in Example 1.
  • the sequences of the linked single-stranded RNA produced with the first and second RNAs used in Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 to 3 are shown.
  • the first single-strand RNA having a phosphate group at the 5'end and the second single-strand RNA having a hydroxyl group at the 3'end are combined with the International Biochemical Union. Is classified into EC 6.5.1.3, which is defined as an enzyme number, and RNA ligase having double-strand nick repair activity is allowed to act to link the first single-strand RNA and the second single-strand RNA.
  • the step of producing a single-stranded RNA is included.
  • the linked single-stranded RNA obtained by the production method of the present embodiment is a single-stranded RNA consisting of an X2 region, a Y2 region, a Ly linker region, a Y1 region, an X1 region, and a Z region from the 5'terminal side.
  • the Z region may consist of a Z1 region, an Lz linker region, and a Z2 region from the 5'terminal side, and the linked single-strand RNA is an X2 region, a Y2 region, a Ly linker region, a Y1 region, and an X1 region.
  • Z1 region, Lz linker region and Z2 region may be a single-stranded RNA.
  • the linked single-stranded RNA is targeted by the RNA interference method in at least one of the W1 region consisting of the Y1 region, the X1 region and the Z region (or the Z1 region) and the W2 region consisting of the X2 region and the Y2 region. It may contain a sequence that suppresses the expression of the gene.
  • RNA interference is the introduction of double-stranded RNA consisting of a sense RNA consisting of a sequence identical to at least a part of the mRNA sequence of a target gene and an antisense RNA consisting of a sequence complementary thereto into cells. This is a phenomenon in which the mRNA of the target gene is decomposed, and as a result, the translation inhibition into a protein is induced and the expression of the target gene is inhibited.
  • DICE a type of RNase III nucleolytic enzyme family
  • the target gene is not particularly limited, and a desired gene can be appropriately selected.
  • the nucleotide sequence that suppresses the expression of the target gene is not particularly limited as long as it is a sequence that can suppress the gene expression, and is based on the sequence information of the target gene registered in a known database (for example, GenBank) or the like. It is possible to design by a conventional method.
  • the nucleotide sequence is 80% or 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, and most preferably 100% with respect to a predetermined region of the target gene. Have the sameness.
  • RNA interference for example, a sense RNA having the same sequence as at least a part of the mRNA sequence of the target gene can be used.
  • the number of bases in the nucleotide sequence that suppresses the expression of the target gene by RNA interference is not particularly limited, and is, for example, 19 to 30 bases, preferably 19 to 21 bases.
  • Either one or both of the W1 region and the W2 region may have two or more of the same expression-suppressing sequences for the same target gene, or may have two or more different expression-suppressing sequences for the same target. Alternatively, it may have two or more different expression-suppressing sequences for different target genes.
  • the W1 region has two or more expression-suppressing sequences
  • the location of each expression-suppressing sequence is not particularly limited, and may be either one or both of the X1 region and the Y1 region, or a region spanning both. There may be.
  • each expression-suppressing sequence may be either one or both of the X2 region and the Y2 region, or may be a region spanning both.
  • the expression-suppressing sequence usually has 80% or 85% or more complementarity with respect to a predetermined region of the target gene, preferably 90% or more complementarity, and more preferably 95%. It is more preferably 98%, and particularly preferably 100%.
  • a ligase is allowed to act on a first single-strand RNA having a phosphate group at the 5'end and a second single-strand RNA having a hydroxyl group at the 3'end, and the first single-stranded RNA is described. It is produced in the step of connecting the single-strand RNA and the second single-strand RNA (see FIGS. 1 to 4).
  • a linked single-stranded RNA complementary sequence portions are arranged in the molecule, and a double strand can be partially formed in the molecule.
  • the linked single-stranded RNA molecule contains a nucleotide sequence in which the X1 region and the X2 region are complementary to each other, and further contains a nucleotide sequence in which the Y1 region and the Y2 region are complementary to each other.
  • a duplex is formed between these complementary sequences, and the Ly and Lz linker regions form a loop structure depending on their length.
  • 2 and 4 show the connection order of the regions and the positional relationship of each region forming the double chain portion. For example, the length of each region and the shape of the linker region (Ly and Lz) are shown. Etc. are not limited to these.
  • At least one of the W1 region consisting of the Y1 region, the X1 region and the Z region (or the Z1 region) and the W2 region consisting of the X2 region and the Y2 region has a sequence that suppresses the expression of the gene targeted by the RNA interferometry.
  • the W1 region and the W2 region may be completely complementary, or one or several nucleotides may be non-complementary, but it is preferable that they are completely complementary.
  • the one or several nucleotides are, for example, 1 to 7 nucleotides, preferably 1 to 5 nucleotides.
  • the Y1 region has a nucleotide sequence complementary to the entire region of the Y2 region.
  • the Y1 region and the Y2 region are nucleotide sequences that are completely complementary to each other, and are nucleotide sequences consisting of two or more equal numbers of nucleotides.
  • the X1 region and the X2 region may be completely complementary, or 1 to 5 nucleotides may be non-complementary, and are nucleotide sequences consisting of two or more nucleotides.
  • the Z region is a region containing an arbitrary number of nucleotide sequences, is not an essential sequence, and may have an embodiment in which the number of nucleotides is 0, and contains one or more nucleotides. It may be an embodiment.
  • the Z region may be a concatenation of the Z1, Lz, and Z2 regions from the 5'end.
  • each area is illustrated below, but it is not limited to this.
  • the numerical range of the number of nucleotides discloses, for example, all positive integers belonging to the range, and as a specific example, the description of "1 to 4 nucleotides” is “1 nucleotide”, " Means all disclosures of "2 nucleotides”, “3 nucleotides”, and “4 nucleotides” (the same shall apply hereinafter).
  • the relationship between the number of nucleotides in the W2 region (W2n) and the number of nucleotides in the X2 region (X2n) and the number of nucleotides in the Y2 region (Y2n) is, for example, the condition of the following formula (1). Fulfill.
  • the relationship between the number of nucleotides in the W1 region (W1n), the number of nucleotides in the X1 region (X1n), and the number of nucleotides in the Y1 region (Y1n) satisfies, for example, the condition of the following formula (2).
  • W2n X2n + Y2n ... (1)
  • the relationship between the number of nucleotides in the X1 region (X1n) and the number of nucleotides in the Y1 region (Y1n) is not particularly limited, and for example, any of the following conditions is satisfied.
  • X1n Y1n ... (3)
  • the number of nucleotides in the X1 region (X1n) and the number of nucleotides in the X2 region (X2n) are 2 or more, preferably 4 or more, and more preferably 10 or more.
  • the number of nucleotides in the Y1 region (Y1n) and the number of nucleotides in the Y2 region (Y2n) are 2 or more, preferably 3 or more, and more preferably 4 or more.
  • the Z1 region preferably contains a nucleotide sequence complementary to the entire region of the Z2 region or a partial region of the Z2 region.
  • the Z1 region and the Z2 region may be non-complementary with one or several nucleotides, but are preferably completely complementary.
  • the Z2 region preferably consists of a nucleotide sequence that is one or more nucleotides shorter than the Z1 region.
  • the entire nucleotide sequence of the Z2 region is complementary to all the nucleotides of any subregion of the Z1 region. It is more preferable that the nucleotide sequence from the 5'end to the 3'end of the Z2 region is a sequence complementary to the nucleotide sequence starting from the nucleotide at the 3'end of the Z1 region and toward the 5'end.
  • RNA molecules In a linked single-stranded RNA molecule, the relationship between the number of nucleotides in the X1 region (X1n) and the number of nucleotides in the X2 region (X2n), the relationship between the number of nucleotides in the Y1 region (Y1n) and the number of nucleotides in the Y2 region (Y2n), The relationship between the number of nucleotides in the Z1 region (Z1n) and the number of nucleotides in the Z2 region (Z2n) satisfies the conditions of the following formulas (6), (7) and (8), respectively.
  • Y1n Y2n ... (7)
  • the total length of the linked single-stranded RNA is not particularly limited.
  • the lower limit of the total number of nucleotides is typically 38, preferably 42, more preferably 50, and even more preferably 51.
  • the upper limit thereof is typically 300, preferably 200, more preferably 150, still more preferably 100, and particularly preferably 80.
  • the total number of nucleotides excluding the linker region has a lower limit of typically 38, preferably 42, more preferably 50, and even more preferably 50. It is 51, particularly preferably 52, and the upper limit is typically 300, preferably 200, more preferably 150, even more preferably 100, and particularly preferably 80.
  • the length of the linker region of Ly and Lz is not particularly limited. It is preferable that these linker regions have, for example, a length in which the X1 region and the X2 region can form a duplex, or a length in which the Y1 region and the Y2 region can form a duplex.
  • the upper limit of the number of atoms forming the main chain of the linker region is typically 100, preferably 80, and more preferably 50.
  • the Ly linker region is, for example, a divalent group represented by the following formula (I), and the Lz linker region is, for example, a divalent group represented by the following formula (I').
  • Y 11 and Y 21 each independently represent an alkylene group having 1 to 20 carbon atoms, and Y 12 and Y 22 can be independently substituted with a hydrogen atom or an amino group, respectively.
  • a good alkyl group is represented, or Y 12 and Y 22 are bonded to each other at their ends to represent an alkylene group having 3 to 4 carbon atoms, and the terminal oxygen atom bonded to Y 11 is the Y1 region and Y2.
  • the terminal oxygen atom of the phosphate ester of the terminal nucleotide of any one of the regions is bonded to the phosphorus atom of the phosphate ester, and the terminal oxygen atom bonded to Y 21 is not bonded to Y 11 of the Y1 region and the Y2 region. It is bound to the phosphorus atom of the phosphate ester of the terminal nucleotide in the other region.
  • Y '11 and Y' 21 each independently represents an alkylene group having 1 to 20 carbon atoms
  • Y '12 and Y' 22 are each independently substituted with hydrogen atom or an amino group or represents an alkyl group which may be, or Y '12 and Y' 22 and are bonded to one another at their ends an alkylene group having 3 to 4 carbon atoms
  • oxygen-terminal bonded to Y '11 atom is bonded to the phosphorus atom of the phosphoric acid ester of a terminal nucleotide of one of regions of Z1 region and Z2 region
  • the terminal oxygen atom bonded to Y '21 is the Z1 region and Z2 region
  • the Y '11 is bonded to the phosphorus atom of the phosphoric acid ester of a terminal nucleotide of the other regions that are not bound.
  • Y 11 and Y 21, and an alkylene group of Y '11 and Y' 21 1 to 20 carbon atoms in is preferably 1 to 10 carbon atoms, more preferably 1 to 5 carbon atoms.
  • the alkylene group may be linear or branched chain.
  • the alkyl group may be linear or branched chain.
  • Ly linker region and the Lz linker region include divalent groups having a structure represented by the following formula (II-A) or (II-B).
  • n and m each independently represent an integer from 1 to 20.
  • N and m are each independently preferably an integer of 1 to 10, and more preferably an integer of 1 to 5.
  • the Ly linker region and the Lz linker region each independently represent a divalent group of either formula (II-A) or (II-B).
  • first single-strand RNA and the second single-strand RNA include strand I and strand II of FIG.
  • the Ly linker region may be a linker region consisting of a 4- to 30-mer nucleotide sequence.
  • the Ly linker region may be a linker region consisting of a number of nucleotide sequences smaller than the total number of nucleotides in the X2 region, Y2 region, Y1 region and X1 region.
  • the Ly linker region is composed of a Lya region, a Lyb region and a Lyc region from the 5'end, and the Lya region and the Lyc region are a linker region consisting of a two-base nucleotide sequence that does not form Watson-Crick base pairs with each other. There may be.
  • the Ly linker region consists of a Lya region, a Lyb region and a Lyc region from the 5'end, the Lyb region consists of a 0 to 20-mer nucleotide sequence, and the Lya region and the Lyc region each consist of a 2-base nucleotide sequence linker region.
  • the combination thereof (Lya, Lyc) or (Lyc, Lya) may be selected from the following combinations.
  • (Lya, Lyc) or (Lyc, Lya) (AA, AA), (AA, AC), (AA, AG), (AA, CA), (AA, CC), (AA, CG), (AA) , GA), (AA, GC), (AA, GG), (AC, AA), (AC, AC), (AC, AG), (AC, CA), (AC, CC), (AC, CG) ), (AC, UA), (AC, UC), (AC, UG), (AG, AA), (AG, AC), (AG, AG) (AG, GA), (AG, GG), ( AG, UA), (AG, UC), (AG, UU), (AU, CA), (AU, CC), (AU, CG), (AU, GA), (AU, GC), (AU, GG), (AU, UA), (AU, UC), (AU, UG), (AU, UU), (CA, AA), (AU, GC), (AU, GG), (AU, UA), (AU, UC
  • this RNA ligase In the ligation reaction carried out by the production method of the present embodiment, it is an RNA ligase classified into EC6.5.1.13 defined by the International Union of Biochemistry as an enzyme number, and is an RNA ligase having double-stranded nick repair activity. (Hereinafter, it may be referred to as "this RNA ligase") is used.
  • RNA ligase examples include T4 RNA ligase 2 derived from T4 bacteriophage. This RNA ligase 2 can be purchased from, for example, New England BioLabs.
  • RNA ligase 2 derived from vibriopage KVP40, Trypanosoma brucei RNA ligase, Deinococcus radiodurans RNA ligase, or Leishmania ligase RNA is exemplified.
  • RNA ligase is obtained by, for example, extracting and purifying from each organism by the method described in the non-patent document (Structure and Mechanism of RNA Ligase, Structure, Vol.12, PP.327-339.). It can also be used.
  • RNA ligase 2 derived from T4 bacteriophage
  • a protein consisting of an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 and having double-stranded nick repair activity is also used. It is possible.
  • Such RNA ligase 2 includes, in addition to the enzyme of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, its variants T39A, F65A, or F66A (RNA ligase structures reveal the basis for RNA specificity and conformation changes that drive ligation forward, See Cell. Vol.127, pp.71-84.), Etc.).
  • RNA ligase 2 can be obtained, for example, by a method using Escherichia coli bacteriophage T4 deposited in ATCC (American Type Culture Collection) as ATCC (registered trademark) 11303 or a method such as PCR based on the description in the above-mentioned document. Is possible.
  • RNA ligase 2 derived from KVP40 can be obtained by the method described in the non-patent document (characterization of bacteriophage KVP40 and T4 RNA ligase 2, Virology, vol. 319, PP. 141-151.). Specifically, for example, it can be obtained by the following method. That is, among the DNA extracted from bacteriophage KVP40 (for example, deposited with JGI as deposit number Go008199), the open reading frame 293 is digested with restriction enzymes by NdeI and BamHI, and then amplified by a polymerase chain reaction. The obtained DNA is incorporated into the plasmid vector pET16b (Novagen). Alternatively, the DNA sequence can be artificially synthesized by PCR.
  • a desired mutant can be obtained by DNA sequence analysis.
  • the obtained vector DNA was subjected to E.I. Incorporate into E. coli BL21 (DE3) and incubate in LB medium containing 0.1 mg / mL ampicillin. Add isopropyl- ⁇ -thiogalactoside to 0.5 mM and incubate at 37 ° C. for 3 hours. All subsequent operations are preferably performed at 4 ° C.
  • the cells are precipitated by centrifugation, and the precipitate is stored at ⁇ 80 ° C. Buffer A [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.2 M NaCl, 10% sucrose] is added to the frozen cells.
  • RNA ligase 2 derived from KVP40 can be obtained.
  • RNA ligase 2 As the RNA ligase 2 derived from KVP40, an RNA ligase having a double-stranded nick repair activity, which is a protein consisting of an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 can be used.
  • RNA ligase can be obtained by the method described in the non-patent document (An RNA Ligase from Deinococcus radiodulans, J Biol Chem., Vol. 279, No. 49, PP. 50654-61.). For example, it is also possible to obtain the ligase from a biological material deposited with the ATCC as ATCC® BAA-816.
  • the Deinococcus radiodurans RNA ligase a protein consisting of an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 and having double-stranded nick repair activity can be used.
  • a ligase examples include an RNA ligase having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 and an RNA ligase having a mutation of K165A or E278A in the RNA ligase of SEQ ID NO: 11.
  • Trypanosoma brucei RNA ligase can be obtained in the non-patent document (Assiciation of Two Novel Proteins TbMP52 and TbMP48 with the Trypanosoma brucei RNA Editing Complex, Vol.21, No.2, PP.380-389.) ..
  • Leishmania tarentolae RNA ligase can be described in the non-patent document (The Mitochondrial RNA Ligase from Leishmania tarentolae Can Join RNA Molecule Bridged by a Complementary RNA, Vol. 274, No. 34, PP. 24289-24296). ..
  • the reaction conditions of the production method of the present embodiment using the present RNA ligase are not particularly limited as long as the present RNA ligase functions, but one typical example is a first nucleic acid strand and a second. Nucleic acid chain, Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing ATP, magnesium chloride, and DTT, and pure water are mixed, and this RNA ligase is added to the mixed solution, after which the ligase functions. Examples thereof include conditions for reacting at a temperature (for example, 37 ° C.) for a predetermined time (for example, 1 hour).
  • Non-Patent Document Bacteriophage T4 RNA ligase 2 (gp24-1) exemplifies a family of RNA ligases found in all, Proc. Natl. Acad. Sci, 2002, Vol.99, No. 20, PP.12709-12714.) Can also be performed according to the conditions described.
  • the reaction products containing the single-strand RNA produced in the step of allowing the RNA ligase to act and connecting the first single-stranded RNA and the second single-strand RNA are monoalkylammonium salts and dialkylammonium salts.
  • the steps of purification by reverse phase column chromatography using a mobile phase containing at least one ammonium salt selected from the group consisting of are described below.
  • a mobile phase containing at least one ammonium salt selected from the group consisting of monoalkylammonary salts and dialkylammonary salts is used.
  • ammonium salts are typically ammonium salts composed of organic or inorganic acids and monoalkylamines or dialkylamines.
  • the mobile phase (eluent) is a non-hydrophobic mobile phase, and specific examples thereof include those containing an ammonium salt as described above.
  • Examples of such mobile phases include solvents containing C1-C3 alcohols (eg, methanol, ethanol, 2-propanol or n-propanol), nitriles (eg, acetonitrile) and, in some cases, water.
  • Examples of the acid forming the ammonium salt include carbonic acid, acetic acid, formic acid, trifluoroacetic acid and propionic acid.
  • Such mobile phases typically exemplify eluents consisting of monoalkylamines or dialkylamines / acetic acid / water / acetonitrile.
  • Examples of the concentration of the ammonium salt include those of 1-200 mM, 5-150 mM or 20-100 mM.
  • Examples of the pH range of the mobile phase include a pH range of 6-8 or 6.5-7.5.
  • the mobile phase may contain a triethylammonium salt or the like other than the ammonium salt, but the ratio of at least one ammonium salt selected from the group consisting of monoalkylammonium salt and dialkylammonium salt is based on the total ammonium salt. For example, 30 mol% or more, 40 mol% or more, 50 mol% or more, 60 mol% or more, 70 mol% or more, 80 mol% or more, 90 mol% or more, or at least one ammonium salt selected from the group consisting of monoalkylammonium salts and dialkylammonium salts. Consists of only.
  • the at least one ammonium salt selected include, for example, at least one ammonium salt selected from the group consisting of hexyl ammonium salt, dipropyl ammonium salt, dibutyl ammonium salt, and quaternary ammonium salt. , It is preferable to use an ammonium salt selected from these.
  • silica having one or more of a phenyl group, an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, or a cyanopropyl group fixed as a hydrophobic stationary phase or Polymers are exemplified.
  • examples of the silica or polymer as such a filler include those having a particle size of 2 ⁇ m or more, or 5 ⁇ m or more.
  • a mobile phase containing the ammonium salt is passed through a column containing the packing material, and then a solution in which a single-stranded RNA ligated by rigase is dissolved in the mobile phase is passed. Then, the impurities (unreacted first and / or second) contained in the RNA are bound to the column by a gradient (gradient) that sequentially increases the concentration of the organic solvent in the mobile phase through which the solution is passed. It is carried out by separating and eluting the target RNA molecule (such as RNA strand).
  • the temperature of the reverse phase column chromatography is, for example, 20-100 ° C, 25-80 ° C, or 30-60 ° C.
  • Fractions obtained by reverse phase column chromatography are composed by UV absorption at a wavelength of 260 nm under chromatographic conditions commonly used for nucleic acid separation and analysis, and the selected fractions are collected.
  • the purified object is obtained, and for example, the method described in the non-patent document (Handbook of Analysis of Oligonucleotides and Related Products, CRC Press) can be used.
  • the first single-stranded RNA can be prepared, for example, by a solid-phase synthesis method. More specifically, it can be prepared using a nucleic acid synthesizer (NTS M-4MX-E (manufactured by Nippon Techno Service Co., Ltd.)) based on the phosphoramidite method.
  • NTS M-4MX-E manufactured by Nippon Techno Service Co., Ltd.
  • the phosphoramidite method is a method in which three steps of deblocking, coupling, and oxidation are set as one cycle, and this cycle is repeated until a desired base sequence is obtained.
  • each reagent for example, porous glass is used as the solid phase carrier, dichloroacetic anhydride solution is used as the deblocking solution, 5-benzylthio-1H-tetrazole is used as the coupling agent, and iodine solution is used as the oxidizing agent. It can be carried out using acetic anhydride solution and N-methylimidazole solution as capping solutions. Cutting and deprotection from the solid phase carrier after solid phase synthesis can be performed, for example, according to the method described in International Publication No. 2013/027843.
  • RNA can be prepared by deprotecting hydroxyl groups.
  • butyl R 1 is tert-butyldimethylsilyl (TBDMS) group, bis (2-acetoxy) methyl (ACE) group, (triisopropylsilyloxy) methyl (TOM) group, (2-cyanoethoxy) ethyl (CEE) group, (2-cyanoethoxy) methyl (CEM) group, para-toluylsulfonylethoxymethyl (TEM) TBDMS RNA Amidites (trade name, ChemGenes Corporation), ACE amidite, TOM amidite, CEE amidite, CEM amidite, TEM amidite (Chakhmakhcheva), protected with a group, (2-cyanoethoxy) methoxymethyl (EMM) group, etc.
  • TDMS tert-butyldimethylsilyl
  • ACE acetoxy) methyl
  • TOM triisopropylsilyloxy) methyl
  • CEE (2-cyanoethoxy)
  • amidite having a proline skeleton represented by the following structural formula (III-b) can be used by the method of Example A4 of International Publication No. 2012/017919.
  • amidite represented by any of the following structural formulas (III-c), (III-d) and (III-e) shall be used.
  • it can be prepared by a nucleic acid synthesizer.
  • amidite for phosphorylation at the 5'end may be used in solid phase synthesis.
  • Commercially available amidite can be used as the amidite for phosphorylation at the 5'end.
  • an RNA molecule in which the 5'position at the 5'end is a hydroxyl group or a protected hydroxyl group is synthesized, deprotected as appropriate, and then phosphorylated with a commercially available phosphorylating agent.
  • a single-stranded RNA having a phosphate group at the 5'end can be prepared in.
  • a phosphorylating agent a commercially available Chemical Phosphorylation Reagent (Glen Research) represented by the following structural formula (III-f) is known (Patent Document EP0816368).
  • R 2 represents a nucleobase that may be protected with a protecting group and R 1 represents a protecting group.
  • the second single-stranded RNA can be similarly produced using a nucleic acid synthesizer based on the solid-phase synthesis method, that is, the phosphoramidite method.
  • the bases that make up nucleotides are usually natural bases that make up nucleic acids, typically RNA, but unnatural bases may be used in some cases.
  • Examples of such non-natural bases include modified analogs of natural or non-natural bases.
  • bases examples include purine bases such as adenine and guanine, pyrimidine bases such as cytosine, uracil and thymine.
  • bases include inosine, xanthine, hypoxanthine, nubularine, isoganicine, and tubericine.
  • the base is, for example, an alkyl derivative such as 2-aminoadenine, 6-methylated purine; an alkyl derivative such as 2-propylated purine; 5-halouracil and 5-halocitosine; 5-propynyl uracil and 5-propynylcitosine; -Azouracil, 6-azocitosine and 6-azotimine; 5-uracil (psoid uracil), 4-thiouracil, 5-halouracil, 5- (2-aminopropyl) uracil, 5-aminoallyl uracil; 8-aminoallylated, amination, Thiolization, thioalkylation, hydroxylation and other 8-substituted purines; 5-trifluoromethylation and other 5-substituted pyrimidines; 7-methylguanine; 5-substituted pyrimidines; 6-azapyrimidine; N-2, N -6 and O-6 substituted purines (
  • the single-stranded RNA nucleic acid molecule composed of the X2 region, Y2 region, Ly linker region, Y1 region, X1 region and Z region from the 5'end side obtained by the method of the present embodiment has the 5'end and 3'. It can be said that it is a linear single-stranded nucleic acid molecule that is not linked to the end.
  • Such a single-stranded RNA nucleic acid molecule can be used for suppressing the expression of a target gene in vivo or in vitro, for example, and can be used for suppressing the expression of the target gene by RNA interference.
  • "Suppression of target gene expression" means, for example, inhibiting the expression of a target gene.
  • the mechanism of suppression is not particularly limited and may be, for example, down-regulation or silencing. Suppression of target gene expression is confirmed by, for example, a decrease in the amount of transcript produced from the target gene, a decrease in transcript activity, a decrease in the amount of translation product produced from the target gene, or a decrease in translation product activity. it can.
  • Proteins as translation products include, for example, mature proteins, precursor proteins prior to processing or post-translational modification, and the like.
  • Example 1 1. Synthesis of First Single-Strand RNA
  • the single-strand RNA shown below (strand I in FIG. 11) was synthesized.
  • the strand consists of 26 bases in length and corresponds to the first single-strand RNA.
  • SEQ ID NO: 1 The description of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing indicates the base sequence from the 5'end to the front of "P".
  • the single-strand RNA was synthesized from the 3'side to the 5'side using a nucleic acid synthesizer (trade name NTS M-4MX-E, Nippon Techno Service Co., Ltd.) based on the phosphoramidite method.
  • RNA amidite As RNA amidite, uridine EMM amidite of the following formula (described in Example 2 of International Publication No. 2013/027843), citidine EMM amidite (described in Example 3), and adenosine EMM amidite (described in Example 3), respectively. (Described in Example 4), guanosine EMM amidite (described in Example 5), and proline amidite (IIIb) (described in Example A3 of International Publication No. 2012/017919) for 5'phosphorylation.
  • Second Single-Strand RNA The single-strand RNA shown below (stranded II in FIG. 11) was synthesized. The strand consists of 27 bases in length and corresponds to the second single-strand RNA.
  • SEQ ID NO: 2 indicates the base sequence from the 5'end to the front of "P".
  • the linked single-stranded RNA obtained by ligating the first and second RNAs is shown in strand III below and FIG. Chain III: AGCAGAGUACACACAGCAUAUACCPGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG (5'-3') (SEQ ID NOs: 1 and 2)
  • the base sequence from the 5'-terminal base to the 27th base corresponds to the sequence of SEQ ID NO: 2
  • the base sequence from the 28th base to the 3'-terminal base corresponds to the above-mentioned SEQ ID NO: 1. Corresponds to the array of.
  • FIG. 5 shows the results of separation analysis using 100 mM triethylammonium acetate (pH 7.0) as the mobile phase A and acetonitrile as the mobile phase B. Separation of chain I, which is the raw material of the ligation reaction, and chain III, which is the product, was impossible.
  • FIG. 6 shows the results of separation analysis using 100 mM hexyl ammonium acetate (pH 7.0) as the mobile phase A and acetonitrile as the mobile phase B. It was shown that chains I and II, which are the raw materials for the ligation reaction, and chain III, which is the product, can be separated and separated.
  • FIG. 7 shows the results of separation analysis using 100 mM dipropylammonium acetate (pH 7.0) as the mobile phase A and acetonitrile as the mobile phase B. It was shown that chains I and II, which are the raw materials for the ligation reaction, and chain III, which is the product, can be separated and separated.
  • FIG. 8 shows the results of separation analysis using 100 mM dibutylammonium acetate (pH 7.0) as the mobile phase A and acetonitrile as the mobile phase B. It was shown that chains I and II, which are the raw materials for the ligation reaction, and chain III, which is the product, can be separated and separated.
  • FIG. 9 shows the results of separation analysis using 100 mM diamilammonium acetate (pH 7.0) as the mobile phase A and acetonitrile as the mobile phase B. It was shown that chains I and II, which are the raw materials for the ligation reaction, and chain III, which is the product, can be separated and separated.
  • FIG. 10 shows the results of separation analysis using 10 mM tetrabutylammonium phosphate (pH 7.5) as the mobile phase A and acetonitrile as the mobile phase B. It was shown that chains I and II, which are the raw materials for the ligation reaction, and chain III, which is the product, can be separated and separated.
  • the purity of the target product in the crude product was 61%, and the residual ratios of chain I and chain II were 6.4% and 8.3%, respectively. there were.
  • the area value of the target object was calculated as the purity with respect to the total area value of the obtained chromatogram detected by the UV spectrum having a wavelength of 260 nm in HPLC, and the area value of the raw material with respect to the total area value was calculated as the residual ratio.
  • reaction solution 14 mL was taken out, filtered using Milex-GP (Merck & Co., Inc.), and washed with 1 mL of 100 mM hexyl ammonium acetate (pH 7.0).
  • the composition was 2,500 units T4 RNA ligase 2 (New England Biolabs), 20 mM MgCl 2 , 10 mM DTT, and 2.8 mL of a 4 mM ATP mixture, and the reaction scale was 28.2 mL. Then, the mixture was incubated at 35 ° C. for 24 hours, 1 mL of a 0.2 M aqueous ethylenediaminetetraacetic acid solution was added to the reaction solution, and the mixture was allowed to stand in a water bath at 65 ° C. for 10 minutes to stop the reaction.
  • reaction solution 1 mL was taken out, filtered using Milex-GP (Merck), and washed with 1 mL of distilled water (Otsuka Pharmaceutical).
  • Example 2 1. Synthesis of First Single-Strand RNA
  • the single-strand RNA shown below (stranded IV in FIG. 11) was used as the first single-strand RNA.
  • the strand consists of 23 strands and corresponds to the first single-strand RNA.
  • Chain IV pUCAUCAUCGUCUCAAAUGAGUCU (5'-3') (SEQ ID NO: 3)
  • the single-stranded RNA used was purchased from Sigma-Aldrich Japan.
  • Second Single-Strand RNA As the second single-strand RNA, the single-strand RNA shown below (strand V in FIG. 11) was used. The strand consists of 36 bases in length and corresponds to the second single-strand RNA.
  • Chain V ACUCCAUUUGUUUUGAUGAUGGAUUCUUAUGCUCCA (5'-3') (SEQ ID NO: 4)
  • the single-stranded RNA used was purchased from Sigma-Aldrich Japan.
  • the linked single-stranded RNA obtained by ligating the first and second RNAs is shown below and in FIG. Chain VI: ACUCCAUUUGUUUUGAUGAUGGAUUCUUAUGCUCCAUCAUCAUCGUCUCAAAUGAGUCU (5'-3') (SEQ ID NO: 5)
  • the base sequence from the 5'-terminal base to the 36th base corresponds to the sequence of SEQ ID NO: 4
  • the base sequence from the 37th base to the 3'-terminal base corresponds to the above-mentioned SEQ ID NO: 3.
  • the composition was 1750 units T4 RNA ligase 2 (New England Biolabs), 20 mM MgCl 2 , 10 mM DTT, and 234 ⁇ L of 4 mM ATP mixture, and the reaction scale was 2.4 mL. Then, the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour, 0.1 mL of a 0.2 M aqueous ethylenediaminetetraacetic acid solution was added to the reaction solution, and the mixture was allowed to stand in a water bath at 65 ° C. for 10 minutes to stop the reaction.
  • reaction solution was taken out, filtered using Milex-GP (Merck & Co., Inc.), and washed with 1 mL of 100 mM hexyl ammonium acetate (pH 7.0).
  • Example 2 In Example 2, 1.2 mL was taken out from the reaction solution obtained by stopping ligation, filtered using Milex-GP (manufactured by Merck & Co., Inc.), and washed with 1 mL of 100 mM triethylammonium acetate (pH 7.0). I got it.
  • Example 3 1. Synthesis of First Single-Strand RNA
  • the single-strand RNA shown below (stranded VII in FIG. 11) was synthesized.
  • the strand consists of 23 bases in length and corresponds to the first single-strand RNA.
  • Chain VII pUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUU (5'-3') (SEQ ID NO: 6)
  • the single-stranded RNA was prepared from the 3'side to the 5'side using a nucleic acid synthesizer (trade name NTS M-4MX-E, Nippon Techno Service Co., Ltd.) in Example 1.
  • the single-stranded RNA (strand I) was synthesized in the same manner as in the above synthesis, and further, the solid-phase synthesis was performed by excision and deprotection from the solid-phase carrier in the same manner.
  • Second Single-stranded RNA The single-stranded RNA shown below (stranded VIII in FIG. 11) was synthesized in the same manner as the first single-stranded RNA.
  • the strand consists of 29 bases in length and corresponds to the second single-strand RNA.
  • Chain VIII GCAGAGUACACACAGCAUAUACCCACCGG (5'-3') (SEQ ID NO: 7)
  • Chain IX GCAGAGUACACACAGCAUAUACCCACCGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUU (5'-3') (SEQ ID NO: 8)
  • the base sequence from the 5'-terminal base to the 29th base corresponds to the sequence of SEQ ID NO: 7
  • the base sequence from the 30th base to the 3'-terminal base corresponds to the above-mentioned SEQ ID NO: 6. Corresponds to the array of.
  • the composition was 1750 units T4 RNA ligase 2 (New England Biolabs), 20 mM MgCl 2 , 10 mM DTT, and 2.5 mL of a 4 mM ATP mixture, and the reaction scale was 25 mL. Then, the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour, 1 mL of a 0.2 M aqueous ethylenediaminetetraacetic acid solution was added to the reaction solution, and the mixture was allowed to stand in a water bath at 65 ° C. for 10 minutes to stop the reaction.
  • reaction solution 12.5 mL was taken out, filtered using Milex-GP (Merck & Co., Inc.), and washed with 1 mL of 100 mM hexyl ammonium acetate (pH 7.0).
  • single-stranded RNA can be easily produced.
  • SEQ ID NOs: 1 to 8 indicate the base sequence of RNA.
  • SEQ ID NOs: 9 to 11 represent amino acid sequences.

Abstract

本発明は、（Ｉ）５'末端にリン酸基を有する第１の一本鎖ＲＮＡと３'末端に水酸基を有する第２の一本鎖ＲＮＡに、国際生化学連合が酵素番号として定めるＥＣ６．５．１．３に分類され、二本鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを作用させ、前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとを連結する工程、および（ＩＩ）（Ｉ）の連結工程で生成した一本鎖ＲＮＡを含む反応生成物をモノアルキルアンモニウム塩およびジアルキルアンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも１つのアンモニウム塩を含む移動相を用いた逆相カラムクロマトグラフィーによって精製する工程を含む一本鎖ＲＮＡの製造方法、を提供する。

Description

核酸分子の製造方法
　本発明は、核酸分子の製造方法に関する。
　特許文献１及び２には、ＲＮＡ干渉法に用いられる一本鎖ＲＮＡが開示されており、かかる化合物の製造方法としては、核酸合成装置を用いて多段階の化学反応により製造する方法が知られている。
国際公開第２０１２／０１７９１９号 国際公開第２０１３／１０３１４６号
　本発明は、一本鎖ＲＮＡの簡便な製造方法を提供することを課題とする。
　本発明は、以下の態様を包含する。
　本発明の一態様にかかる一本鎖ＲＮＡの製造方法は、
（Ｉ）５’末端にリン酸基を有する第１の一本鎖ＲＮＡと３’末端に水酸基を有する第２の一本鎖ＲＮＡに、国際生化学連合が酵素番号として定めるＥＣ６．５．１．３に分類され、二本鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを作用させ、前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとを連結する工程、および
（ＩＩ）（Ｉ）の連結工程で生成した一本鎖ＲＮＡを含む反応生成物をモノアルキルアンモニウム塩およびジアルキルアンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも１つのアンモニウム塩を含む移動相を用いた逆相カラムクロマトグラフィーによって精製する工程を含む一本鎖ＲＮＡの製造方法であって、
　ａ）前記第１の一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、Ｘ１領域およびＺ領域からなる一本鎖ＲＮＡであり；
　ｂ）前記第２の一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、Ｘ２領域、Ｙ２領域、Ｌｙリンカー領域およびＹ１領域からなる一本鎖ＲＮＡであり；
　ｃ）前記Ｘ１領域と前記Ｘ２領域とが、互いに相補的な、５以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；
　ｄ）前記Ｙ１領域と前記Ｙ２領域とが、互いに相補的な、２以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；
　ｅ）前記Ｚ領域が、任意のヌクレオチド数のヌクレオチド配列を含む領域であり；
　ｆ）前記Ｌｙリンカー領域が、４～３０量体のヌクレオチド配列またはアミノ酸から誘導される原子団を有するリンカー領域であり；
　ｇ）前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとの連結により生成する一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、前記Ｘ２領域、前記Ｙ２領域、前記Ｌｙリンカー領域、前記Ｙ１領域、前記Ｘ１領域および前記Ｚ領域からなる連結一本鎖ＲＮＡである、一本鎖ＲＮＡの製造方法。
　また、本発明の一態様にかかる一本鎖ＲＮＡの製造方法は、前記製造方法において、前記Ｚ領域が、５’末端側から順に、Ｚ１領域、Ｌｚリンカー領域及びＺ２領域からなる領域であり、前記Ｌｚリンカー領域がアミノ酸から誘導される原子団を有するリンカー領域であり、前記Ｚ１領域と前記Ｚ２領域とが、互いに相補的なヌクレオチド配列を含み、前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとの連結により生成する一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、前記Ｘ２領域、前記Ｙ２領域、前記Ｌｙリンカー領域、前記Ｙ１領域、前記Ｘ１領域、前記Ｚ１領域、前記Ｌｚリンカー領域および前記Ｚ２領域からなる連結一本鎖ＲＮＡである、製造方法である。
　また、本発明の一態様にかかる一本鎖ＲＮＡの製造方法は、前記製造方法において、前記Ｌｙリンカー領域が、下記式（Ｉ）で表される二価の基である、製造方法である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （式中、Ｙ１１及びＹ２１は、それぞれ独立して、炭素数１～２０のアルキレン基を表し、Ｙ１２及びＹ２２は、それぞれ独立して、水素原子もしくはアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ１２とＹ２２とがその末端で互いに結合して炭素数３～４のアルキレン基を表し、Ｙ１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ１領域および前記Ｙ２領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、Ｙ２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ１領域および前記Ｙ２領域のＹ１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
　また、本発明の一態様にかかる一本鎖ＲＮＡの製造方法は、前記製造方法において、前記Ｌｙリンカー領域が、下記式（Ｉ）で表される二価の基であり、前記Ｌｚリンカー領域が、下記式（Ｉ’）で表される二価の基である、製造方法である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （式中、Ｙ１１及びＹ２１は、それぞれ独立して、炭素数１～２０のアルキレン基を表し、Ｙ１２及びＹ２２は、それぞれ独立して、水素原子もしくはアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ１２とＹ２２とがその末端で互いに結合して炭素数３～４のアルキレン基を表し、Ｙ１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ１領域および前記Ｙ２領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、Ｙ２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ２領域および前記Ｙ１領域のＹ１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （式中、Ｙ’１１及びＹ’２１は、それぞれ独立して、炭素数１～２０のアルキレン基を表し、Ｙ’１２及びＹ’２２は、それぞれ独立して、水素原子もしくはアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ’１２とＹ’２２とがその末端で互いに結合して炭素数３～４のアルキレン基を表し、Ｙ’１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｚ１領域および前記Ｚ２領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、Ｙ’２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｚ２領域および前記Ｚ１領域のＹ’１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
　また、本発明の一態様にかかる一本鎖ＲＮＡの製造方法は、前記製造方法において、前記Ｌｙリンカー領域および前記Ｌｚリンカー領域が、それぞれ独立して、下記式（ＩＩ－Ａ）または（ＩＩ－Ｂ）で表される構造の二価の基である、製造方法である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （式中、ｎおよびｍは、それぞれ独立して、１から２０の何れかの整数を表す。）
　また、本発明の一態様にかかる一本鎖ＲＮＡの製造方法は、前記製造方法において、前記Ｘ１領域、前記Ｙ１領域および前記Ｚ領域からなるＷ１領域、および前記Ｘ２領域および前記Ｙ２領域からなるＷ２領域の少なくとも一方に、ＲＮＡ干渉法の標的となる遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド配列を含む、製造方法である。
　また、本発明の一態様にかかる一本鎖ＲＮＡの製造方法は、前記製造方法において、前記ＲＮＡリガーゼが、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４　ＲＮＡリガーゼ２、ＫＶＰ４０由来のリガーゼ２、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｂｒｕｃｅｉ　ＲＮＡリガーゼ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ　ＲＮＡリガーゼ、またはＬｅｉｓｈｍａｎｉａ　ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ　ＲＮＡリガーゼである、製造方法である。
　また、本発明の一態様にかかる一本鎖ＲＮＡの製造方法は、前記製造方法において、前記ＲＮＡリガーゼが、配列番号９、１０、または１１に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるＲＮＡリガーゼである、製造方法である。
　また、本発明の一態様にかかる一本鎖ＲＮＡの製造方法は、前記製造方法において、前記ＲＮＡリガーゼが、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４　ＲＮＡリガーゼ２またはＫＶＰ４０由来のＲＮＡリガーゼ２である、製造方法である。
　本発明の製造方法によれば、一本鎖ＲＮＡを簡便に製造できる。
第１および第２の一本鎖ＲＮＡの各領域の結合順序の一例を示す模式図である。 連結一本鎖ＲＮＡの製造のステップの一例を示す模式図である。 第１および第２の一本鎖ＲＮＡの各領域の結合順序の一例を示す模式図である。 連結一本鎖ＲＮＡの製造のステップの一例を示す模式図である。 移動相Ａとしてトリエチルアンモニウムアセテート水溶液を用いた逆相カラムクロマトグラフィーで測定した紫外検出法（波長２６０ｎｍ）のクロマトグラムである。 実施例１において移動相Ａとしてヘキシルアンモニウムアセテート水溶液を用いた逆相カラムクロマトグラフィーで測定した紫外検出法（波長２６０ｎｍ）のクロマトグラムである。 実施例１において移動相Ａとしてジプロピルアンモニウムアセテート水溶液を用いた逆相カラムクロマトグラフィーで測定した紫外検出法（波長２６０ｎｍ）のクロマトグラムである。 実施例１において移動相Ａとしてジブチルアンモニウムアセテート水溶液を用いた逆相カラムクロマトグラフィーで測定した紫外検出法（波長２６０ｎｍ）のクロマトグラムである。 実施例１において移動相Ａとしてジアミルアンモニウムアセテート水溶液を用いた逆相カラムクロマトグラフィーで測定した紫外検出法（波長２６０ｎｍ）のクロマトグラムである。 実施例１において移動相Ａとしてテトラブチルアンモニウムホスファート水溶液を用いた逆相カラムクロマトグラフィーで測定した紫外検出法（波長２６０ｎｍ）のクロマトグラムである。 実施例１ないし３および比較例１ないし３で用いた第１および第２のＲＮＡと生成する連結一本鎖ＲＮＡの配列を示す。
　本発明の一実施形態にかかる製造方法においては、５’末端にリン酸基を有する第１の一本鎖ＲＮＡと３’末端に水酸基を有する第２の一本鎖ＲＮＡに、国際生化学連合が酵素番号として定めるＥＣ６．５．１．３に分類され、二本鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを作用させ、前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとを連結して一本鎖ＲＮＡを製造する工程を含む。本実施形態の製造方法により得られる連結一本鎖ＲＮＡは、５’末端側から、Ｘ２領域、Ｙ２領域、Ｌｙリンカー領域、Ｙ１領域、Ｘ１領域およびＺ領域からなる一本鎖ＲＮＡである。前記Ｚ領域は、５’末端側から、Ｚ１領域、Ｌｚリンカー領域およびＺ２領域からなっていてもよく、前記連結一本鎖ＲＮＡは、Ｘ２領域、Ｙ２領域、Ｌｙリンカー領域、Ｙ１領域、Ｘ１領域、Ｚ１領域、Ｌｚリンカー領域およびＺ２領域からなる一本鎖ＲＮＡであってもよい。前記連結一本鎖ＲＮＡは、Ｙ１領域とＸ１領域とＺ領域（又はＺ１領域）とからなるＷ１領域、および、Ｘ２領域とＹ２領域とからなるＷ２領域の少なくとも一方に、ＲＮＡ干渉法の標的となる遺伝子の発現を抑制する配列を含んでいてもよい。
　ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、標的遺伝子のｍＲＮＡ配列の少なくとも一部と同一の配列からなるセンスＲＮＡ及びこれと相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入することにより、標的遺伝子のｍＲＮＡが分解され、その結果タンパク質への翻訳阻害を誘導し、標的遺伝子の発現が阻害される現象をいう。ＲＮＡ干渉の機構の詳細については未だに不明な部分もあるが、ＤＩＣＥＲといわれる酵素（ＲＮａｓｅ　ＩＩＩ核酸分解酵素ファミリーの一種）が二本鎖ＲＮＡと接触し、二本鎖ＲＮＡがｓｉＲＮＡと呼ばれる小さな断片に分解されるのが主な機構と考えられている。
　標的となる遺伝子は、特に制限されず、所望の遺伝子を適宜選択することができる。標的となる遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド配列は、遺伝子発現を抑制可能な配列である限り特に制限されず、公知のデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋなど）等に登録されている標的遺伝子の配列情報を基に常法により設計することが可能である。当該ヌクレオチド配列は、標的となる遺伝子の所定の領域に対して、８０％または８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、最も好ましくは１００％の同一性を有する。
　ＲＮＡ干渉により、標的遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド配列としては、例えば、標的遺伝子のｍＲＮＡ配列の少なくとも一部と同一の配列からなるセンスＲＮＡを用いることができる。ＲＮＡ干渉により、標的遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド配列の塩基数は、特に制限されず、例えば１９～３０塩基であり、好ましくは１９～２１塩基である。
　Ｗ１領域およびＷ２領域のいずれか一方または両者は、同じ標的遺伝子に対する同一の発現抑制配列を２つ以上有していてもよいし、同じ標的に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有していてもよいし、異なる標的遺伝子に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有していてもよい。Ｗ１領域が、２つ以上の発現抑制配列を有する場合、各発現抑制配列の配置箇所は、特に制限されず、Ｘ１領域およびＹ１領域のいずれか一領域または両者でもよいし、両者に架かる領域であってもよい。Ｗ２領域が、２つ以上の発現抑制配列を有する場合、各発現抑制配列の配置箇所は、Ｘ２領域およびＹ２領域のいずれか一領域または両者でもよいし、両者に架かる領域であってもよい。発現抑制配列は、標的遺伝子の所定領域に対して、通常８０％または８５％以上の相補性を有しており、９０％以上の相補性を有していることが好ましく、より好ましくは９５％であり、さらに好ましくは９８％であり、特に好ましくは１００％である。
　かかる連結一本鎖ＲＮＡは、５’末端にリン酸基を有する第１の一本鎖ＲＮＡと３’末端に水酸基を有する第２の一本鎖ＲＮＡとにリガーゼを作用させ、前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖とを連結する工程で製造される（図１乃至４参照）。
　連結一本鎖ＲＮＡは、分子内において相補性のある配列部分が並び、分子内で部分的に二重鎖を形成しうる。連結一本鎖ＲＮＡ分子は、図２及び図４に示すように、Ｘ１領域とＸ２領域が互いに相補性を有するヌクレオチド配列を含み、さらにＹ１領域とＹ２領域が互いに相補性を有するヌクレオチド配列を含み、これらの相補性を有する配列との間で、二重鎖が形成され、ＬｙおよびＬｚのリンカー領域が、その長さに応じてループ構造をとる。図２及び図４は、あくまでも、前記領域の連結順序および二重鎖部を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ、リンカー領域（ＬｙおよびＬｚ）の形状等は、これらに限定されない。
　Ｙ１領域とＸ１領域とＺ領域（又はＺ１領域）とからなるＷ１領域およびＸ２領域とＹ２領域とからなるＷ２領域の少なくとも一方が、ＲＮＡ干渉法の標的となる遺伝子の発現を抑制する配列を少なくとも１つ含んでいてもよい。連結一本鎖ＲＮＡにおいて、Ｗ１領域とＷ２領域とは、完全に相補的でもよいし、１もしくは数ヌクレオチドが非相補的であってもよいが、完全に相補的であることが好ましい。前記１若しくは数個のヌクレオチドは、例えば、１～７個のヌクレオチド、好ましくは１～５個のヌクレオチドである。Ｙ１領域は、Ｙ２領域の全領域に対して相補的なヌクレオチド配列を有している。Ｙ１領域とＹ２領域とは、互いに完全に相補的なヌクレオチド配列であり、２つ以上の同数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列である。Ｘ１領域とＸ２領域とは、完全に相補的でもよいし、１～５個のヌクレオチドが非相補的であってもよく、２つ以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列である。本実施形態の製造方法では、Ｚ領域は、任意の数のヌクレオチド配列を含む領域であり、必須の配列ではなく、ヌクレオチドの数が０の態様であってもよく、１つ以上のヌクレオチドを含む態様であってもよい。Ｚ領域は、５’末端からＺ１、ＬｚおよびＺ２の各領域を連結したものであってもよい。
　以下に各領域の長さを例示するが、これに限定されない。本明細書において、ヌクレオチド数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものであり、具体例として、「１～４ヌクレオチド」との記載は、「１ヌクレオチド」、「２ヌクレオチド」、「３ヌクレオチド」、および「４ヌクレオチド」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
　連結一本鎖ＲＮＡ分子において、Ｗ２領域のヌクレオチド数（Ｗ２ｎ）と、Ｘ２領域のヌクレオチド数（Ｘ２ｎ）およびＹ２領域のヌクレオチド数（Ｙ２ｎ）との関係は、例えば、下記式（１）の条件を満たす。Ｗ１領域のヌクレオチド数（Ｗ１ｎ）と、Ｘ１領域のヌクレオチド数（Ｘ１ｎ）およびＹ１領域のヌクレオチド数（Ｙ１ｎ）との関係は、例えば、下記式（２）の条件を満たす。
　　　Ｗ２ｎ＝Ｘ２ｎ＋Ｙ２ｎ　　・・・（１）
　　　Ｗ１ｎ≧Ｘ１ｎ＋Ｙ１ｎ　　・・・（２）
　連結一本鎖ＲＮＡ分子において、Ｘ１領域のヌクレオチド数（Ｘ１ｎ）とＹ１領域のヌクレオチド数（Ｙ１ｎ）との関係は、特に制限されず、例えば、下記式のいずれかの条件を満たす。
　　　Ｘ１ｎ＝Ｙ１ｎ　　・・・（３）
　　　Ｘ１ｎ＜Ｙ１ｎ　　・・・（４）
　　　Ｘ１ｎ＞Ｙ１ｎ　　・・・（５）
　本実施形態の方法において、Ｘ１領域のヌクレオチド数（Ｘ１ｎ）、およびＸ２領域のヌクレオチド数（Ｘ２ｎ）は、２以上であり、好ましくは４以上であり、より好ましくは１０以上である。
　Ｙ１領域のヌクレオチド数（Ｙ１ｎ）、およびＹ２領域のヌクレオチド数（Ｙ２ｎ）は、２以上であり、好ましくは３以上であり、より好ましくは４以上である。
　Ｚ１領域は、好ましくは、Ｚ２領域の全領域またはＺ２領域の部分領域に対して相補的なヌクレオチド配列を含む。Ｚ１領域とＺ２領域とは、１もしくは数ヌクレオチドが非相補的であってもよいが、完全に相補的であることが好ましい。
　より詳しくは、Ｚ２領域は、Ｚ１領域よりも、１ヌクレオチド以上短いヌクレオチド配列からなることが好ましい。この場合、Ｚ２領域のヌクレオチド配列全体が、Ｚ１領域の任意の部分領域の全てのヌクレオチドと相補的となる。Ｚ２領域の５’末端から３’末端までのヌクレオチド配列は、Ｚ１領域の３’末端のヌクレオチドから始まり５’末端に向かってのヌクレオチド配列と相補性のある配列であることがより好ましい。
　連結一本鎖ＲＮＡ分子において、Ｘ１領域のヌクレオチド数（Ｘ１ｎ）とＸ２領域のヌクレオチド数（Ｘ２ｎ）との関係、Ｙ１領域のヌクレオチド数（Ｙ１ｎ）とＹ２領域のヌクレオチド数（Ｙ２ｎ）との関係、並びにＺ１領域のヌクレオチド数（Ｚ１ｎ）とＺ２領域のヌクレオチド数（Ｚ２ｎ）との関係は、下記式（６）、（７）および（８）の条件をそれぞれ満たす。
　　　Ｘ１ｎ≧Ｘ２ｎ　　・・・（６）
　　　Ｙ１ｎ＝Ｙ２ｎ　　・・・（７）
　　　Ｚ１ｎ≧Ｚ２ｎ　　・・・（８）
　連結一本鎖ＲＮＡの全長（ヌクレオチドの総数）は、特に制限されない。連結一本鎖ＲＮＡにおいて、ヌクレオチド数の合計（全長のヌクレオチド数）は、下限が、典型的には、３８であり、好ましくは４２であり、より好ましくは５０であり、さらに好ましくは５１であり、特に好ましくは５２であり、その上限は、典型的には、３００であり、好ましくは２００であり、より好ましくは１５０であり、さらに好ましくは１００であり、特に好ましくは８０である。連結一本鎖ＲＮＡにおいて、リンカー領域（Ｌｙ、Ｌｚ）を除くヌクレオチド数の合計は、下限が、典型的には、３８であり、好ましくは４２であり、より好ましくは５０であり、さらに好ましくは５１であり、特に好ましくは５２であり、上限が、典型的には、３００であり、好ましくは２００であり、より好ましくは１５０であり、さらに好ましくは１００であり、特に好ましくは８０である。
　連結一本鎖ＲＮＡにおいて、ＬｙおよびＬｚのリンカー領域の長さは、特に制限されない。これらのリンカー領域は、例えば、Ｘ１領域とＸ２領域とが二重鎖を形成可能な長さ、あるいはＹ１領域とＹ２領域とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましい。
　リンカー領域の主鎖を形成する原子の数は、その上限は、典型的には、１００であり、好ましくは８０であり、より好ましくは５０である。
　Ｌｙリンカー領域は、例えば、下記式（Ｉ）で表される二価の基であり、Ｌｚリンカー領域は、例えば、下記式（Ｉ’）で表される二価の基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （式中、Ｙ１１及びＹ２１は、それぞれ独立して、炭素数１～２０のアルキレン基を表し、Ｙ１２及びＹ２２は、それぞれ独立して、水素原子もしくはアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ１２とＹ２２とがその末端で互いに結合して炭素数３～４のアルキレン基を表し、Ｙ１１に結合している末端の酸素原子は、Ｙ１領域およびＹ２領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、Ｙ２１に結合している末端の酸素原子は、Ｙ１領域およびＹ２領域のＹ１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （式中、Ｙ’１１及びＹ’２１は、それぞれ独立して、炭素数１～２０のアルキレン基を表し、Ｙ’１２及びＹ’２２は、それぞれ独立して、水素原子もしくはアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ’１２とＹ’２２とがその末端で互いに結合して炭素数３～４のアルキレン基を表し、Ｙ’１１に結合している末端の酸素原子は、Ｚ１領域およびＺ２領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、Ｙ’２１に結合している末端の酸素原子は、Ｚ１領域およびＺ２領域のＹ’１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
　前記Ｙ１１及びＹ２１、並びに、Ｙ’１１及びＹ’２１における炭素数１～２０のアルキレン基は、炭素数１～１０が好ましく、炭素数１～５がより好ましい。アルキレン基は、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよい、
　前記Ｙ１２及びＹ２２、並びに、Ｙ’１２及びＹ’２２におけるアミノ基で置換されていてもよいアルキル基は、炭素数１～１０が好ましく、炭素数１～５がより好ましい。アルキル基は、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよい、
　Ｌｙリンカー領域およびＬｚリンカー領域の好適な例としては、下記式（ＩＩ－Ａ）または（ＩＩ－Ｂ）で表される構造の二価の基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 （式中、ｎおよびｍは、それぞれ独立して、１から２０の何れかの整数を表す。）
　ｎおよびｍは、それぞれ独立して、１～１０のいずれかの整数であることが好ましく、１～５のいずれかの整数であることがより好ましい。
　好ましい態様において、Ｌｙリンカー領域およびＬｚリンカー領域は、それぞれ独立して、式（ＩＩ－Ａ）または（ＩＩ－Ｂ）の何れかの二価の基を表す。
　第１の一本鎖ＲＮＡおよび第２の一本鎖ＲＮＡの例としては、具体的には、図１１の鎖Ｉおよび鎖ＩＩが例示される。
　本明細書及び図面において示す配列においては、「ｐ」の略号は、５’末端の水酸基がリン酸基で修飾されていることを示す。また、配列中の「Ｐ」の略号は、下記構造式（ＩＩＩ－Ａ）で表されるアミダイトを用いて導入される構造である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　本発明の方法においては、Ｌｙリンカー領域が、４～３０量体のヌクレオチド配列からなるリンカー領域であってもよい。かかる例としては、例えば、Ｌｙリンカー領域が、Ｘ２領域、Ｙ２領域、Ｙ１領域およびＸ１領域のヌクレオチド数の総和より少ない数のヌクレオチド配列からなるリンカー領域であってもよい。
　前記Ｌｙリンカー領域は、より詳しくは、５’末端からＬｙａ領域、Ｌｙｂ領域およびＬｙｃ領域からなり、Ｌｙａ領域およびＬｙｃ領域は、互いにワトソンクリック塩基対を形成しない２塩基のヌクレオチド配列からなるリンカー領域であってもよい。
　Ｌｙリンカー領域が、５’末端からＬｙａ領域、Ｌｙｂ領域およびＬｙｃ領域からなり、Ｌｙｂ領域は０から２０量体のヌクレオチド配列からなり、Ｌｙａ領域およびＬｙｃ領域は、それぞれ２塩基のヌクレオチド配列のリンカー領域であり、その組合せである（Ｌｙａ、Ｌｙｃ）または（Ｌｙｃ、Ｌｙａ）は、以下の組み合わせから選ばれるものであってもよい。
（Ｌｙａ、Ｌｙｃ）または（Ｌｙｃ、Ｌｙａ）＝（ＡＡ、ＡＡ）、（ＡＡ、ＡＣ）、（ＡＡ、ＡＧ）、（ＡＡ、ＣＡ）、（ＡＡ、ＣＣ）、（ＡＡ、ＣＧ）、（ＡＡ、ＧＡ）、（ＡＡ、ＧＣ）、（ＡＡ、ＧＧ）、（ＡＣ、ＡＡ）、（ＡＣ、ＡＣ）、（ＡＣ、ＡＧ）、（ＡＣ、ＣＡ）、（ＡＣ、ＣＣ）、（ＡＣ、ＣＧ）、（ＡＣ、ＵＡ）、（ＡＣ、ＵＣ）、（ＡＣ、ＵＧ）、（ＡＧ、ＡＡ）、（ＡＧ、ＡＣ）、（ＡＧ、ＡＧ）（ＡＧ、ＧＡ）、（ＡＧ、ＧＧ）、（ＡＧ、ＵＡ）、（ＡＧ、ＵＣ）、（ＡＧ、ＵＵ）、（ＡＵ、ＣＡ）、（ＡＵ、ＣＣ）、（ＡＵ、ＣＧ）、（ＡＵ、ＧＡ）、（ＡＵ、ＧＣ）、（ＡＵ、ＧＧ）、（ＡＵ、ＵＡ）、（ＡＵ、ＵＣ）、（ＡＵ、ＵＧ）、（ＡＵ、ＵＵ）、（ＣＡ、ＡＡ）、（ＣＡ、ＡＣ）、（ＣＡ、ＡＵ）、（ＣＣ、ＡＡ）、（ＣＣ、ＡＣ）、（ＣＣ、ＡＵ）、（ＣＣ、ＣＣ）、（ＣＣ、ＣＵ）、（ＣＣ、ＵＡ）、（ＣＣ、ＵＣ）、（ＣＣ、ＵＵ）、（ＣＧ、ＡＡ）、（ＣＧ、ＡＣ）、（ＣＧ、ＡＵ）、（ＣＧ、ＧＡ）、（ＣＧ、ＧＣ）、（ＣＧ、ＧＵ）、（ＧＡ、ＡＡ）、（ＧＡ、ＡＧ）、（ＧＡ、ＧＧ）、（ＧＡ、ＧＵ）、（ＧＣ、ＡＡ）、（ＧＣ、ＡＧ）、（ＧＣ、ＡＵ）、（ＧＣ、ＣＡ）、（ＧＣ、ＣＧ）、（ＧＣ、ＣＵ）、（ＧＣ、ＧＡ）、（ＧＣ、ＧＧ）、（ＧＣ、ＧＵ）、（ＧＣ、ＵＡ）、（ＧＣ、ＵＧ）、（ＧＣ、ＵＵ）、（ＧＧ、ＡＡ）、（ＧＧ、ＡＧ）、（ＧＧ、ＡＵ）、（ＧＧ、ＧＡ）、（ＧＧ、ＧＧ）、（ＧＧ、ＧＵ）、（ＧＧ、ＵＵ）、（ＧＵ、ＣＡ）、（ＧＵ、ＣＧ）、（ＧＵ、ＧＵ）、（ＧＵ、ＵＡ）、（ＧＵ、ＵＧ）、（ＧＵ、ＵＵ）、（ＵＡ、ＡＣ）、（ＵＡ、ＡＧ）、（ＵＡ、ＡＵ）、（ＵＣ、ＡＣ）、（ＵＣ、ＡＧ）、（ＵＣ、ＡＵ）、（ＵＣ、ＣＣ）、（ＵＣ、ＣＧ）、（ＵＣ、ＣＵ）、（ＵＣ、ＵＣ）、（ＵＣ、ＵＧ）、（ＵＣ、ＵＵ）、（ＵＧ、ＡＡ）、（ＵＧ、ＡＣ）、（ＵＧ、ＡＧ）、（ＵＧ、ＡＵ）、（ＵＧ、ＧＣ）、（ＵＧ、ＧＧ）、（ＵＧ、ＧＵ）、（ＵＧ、ＵＣ）、（ＵＧ、ＵＧ）、（ＵＧ、ＵＵ）、（ＵＵ、ＣＣ）、（ＵＵ、ＣＧ）、（ＵＵ、ＣＵ）、（ＵＵ、ＧＣ）、（ＵＵ、ＧＧ）、（ＵＵ、ＧＵ）、（ＵＵ、ＵＣ）、（ＵＵ、ＵＧ）、（ＵＵ、ＵＵ）
　本実施形態の製造方法で実施する連結反応においては、国際生化学連合が酵素番号として定めるＥＣ６．５．１．３に分類されるＲＮＡリガーゼであって、二本鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼ（以下、「本ＲＮＡリガーゼ」と記すこともある）が使用される。かかるＲＮＡリガーゼとしては、たとえば、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４　ＲＮＡリガーゼ２が例示される。このＲＮＡリガーゼ２は、例えば、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓから購入できる。さらに、ＲＮＡリガーゼとしては、ビブリオファージ（ｖｉｂｒｉｏｐｈａｇｅ）ＫＶＰ４０由来のリガーゼ２、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｂｒｕｃｅｉ　ＲＮＡリガーゼ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ　ＲＮＡリガーゼ、若しくはＬｅｉｓｈｍａｎｉａ　ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ　ＲＮＡリガーゼが例示される。かかるＲＮＡリガーゼは、たとえば、非特許文献（Structure and Mechanism of RNA Ligase, Structure, Vol.12, PP.327-339.）に記載の方法で各生物から抽出および精製することで得られたものを用いることもできる。
　Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４　ＲＮＡリガーゼ２としては、配列番号９に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、二本鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼも使用可能である。かかるＲＮＡリガーゼ２としては、配列番号９に記載のアミノ酸配列の酵素のほかに、その変異体であるＴ３９Ａ、Ｆ６５Ａ、またはＦ６６Ａ（RNA ligase structures reveal the basis for RNA specificity and conformational changes that drive ligation forward, Cell. Vol.127, pp.71-84.参照）などを例示することができる。かかるＲＮＡリガーゼ２は、例えば、前記文献の記載に基づき、ＡＴＣＣ（登録商標）　１１３０３としてＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されている、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　Ｔ４を用いる方法やＰＣＲ等の方法で得ることが可能である。
　ＫＶＰ４０由来のＲＮＡリガーゼ２は、非特許文献（Characterization of bacteriophage KVP40 and T4 RNA ligase 2, Virology, vol. 319, PP.141-151.）に記載の方法で取得することができる。具体的には、例えば、以下のような方法で取得できる。すなわち、バクテリオファージＫＶＰ４０（例えば、寄託番号Ｇｏ００８１９９としてＪＧＩに寄託されている）から抽出したＤＮＡのうち、オープンリーディングフレーム２９３を、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩによって制限酵素消化したのちに、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅させる。得られたＤＮＡをプラスミドベクターｐＥＴ１６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に組み込む。または、当該のＤＮＡ配列をＰＣＲによって人工合成することもできる。ここで、ＤＮＡ配列解析により、所望の変異体を得ることができる。続いて、得られたベクターＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）に組み込み、０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地中にて培養する。イソプロピル－β－チオガラクトシドを０．５ｍＭになるように添加し、３７℃で３時間培養する。その後の操作はすべて４℃で行うことが好ましい。まず、遠心操作により菌体を沈殿させ、沈殿物を－８０℃にて保管する。凍った菌体にバッファーＡ［５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．２Ｍ　ＮａＣｌ，１０％スクロース］を加える。そして、リゾチームとＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を加え、超音波によって菌体を破砕し、目的物を溶出させる。その後、アフィニティクロマトグラフィやサイズ排除クロマトグラフィーなどを利用して目的物を単離する。そして、得られた水溶液を遠心ろ過し、溶離液をバッファーに置換することによりリガーゼとして使用することができる。
　このようにして、ＫＶＰ４０由来のＲＮＡリガーゼ２を得ることができる。ＫＶＰ４０由来のＲＮＡリガーゼ２としては、配列番号１０のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、二本鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼが使用可能である。
　Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ　ＲＮＡリガーゼは非特許文献（An RNA Ligase from Deinococcus radiodurans, J Biol Chem., Vol. 279, No.49, PP. 50654-61.）に記載の方法で取得することができる。例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）ＢＡＡ－８１６としてＡＴＣＣに寄託されている生物学的な材料から、前記リガーゼを得ることも可能である。Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ　ＲＮＡリガーゼとしては、配列番号１１のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、二本鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを使用可能である。かかるリガーゼとしては、具体的には、配列番号１１のアミノ酸配列からなるＲＮＡリガーゼに加えて、配列番号１１のＲＮＡリガーゼにおいて、Ｋ１６５ＡあるいはＥ２７８Ａの変異を有するアミノ酸配列からなるＲＮＡリガーゼが例示される（An RNA Ligase from Deinococcus radiodurans, J Biol Chem., Vol. 279, No.49, PP. 50654-61.）。
　Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｂｒｕｃｅｉ　ＲＮＡリガーゼは非特許文献（Assiciation of Two Novel Proteins TbMP52 and TbMP48 with the Trypanosoma brucei RNA Editing Complex, Vol.21, No.2, PP.380-389.）に記載の方法で取得することができる。
　Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ　ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ　ＲＮＡリガーゼは非特許文献（The Mitochondrial RNA Ligase from Leishmania tarentolae Can Join RNA Molecules Bridged by a Complementary RNA, Vol. 274, No.34, PP.24289-24296）に記載の方法で取得することができる。
　本ＲＮＡリガーゼを用いる本実施形態の製造方法の反応条件は、本ＲＮＡリガーゼが機能する条件であれば、特に限定されないが、一つの典型的な例としては、第１の核酸鎖と、第２の核酸鎖と、ＡＴＰ、塩化マグネシウム、およびＤＴＴを含むＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）と、純水と、を混合し、その混合液に本ＲＮＡリガーゼを加え、その後当該リガーゼが機能する温度（例えば３７℃）で所定時間（例えば１時間）反応させる条件が挙げられる。
　あるいは、本実施形態の製造方法は、非特許文献（Bacteriophage T4 RNA ligase 2 (gp24-1) exemplifies a family of RNA ligases found in all, Proc. Natl. Acad. Sci, 2002, Vol.99, No.20, PP.12709-12714.）に記載の条件に準じて行うこともできる。
　前記ＲＮＡリガーゼを作用させ、前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとを連結する工程で生成した一本鎖ＲＮＡを含む反応生成物をモノアルキルアンモニウム塩およびジアルキルアンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも１つのアンモニウム塩を含む移動相を用いた逆相カラムクロマトグラフィーによって精製する工程について以下説明する。
　本ＲＮＡリガーゼを用いた第１の一本鎖ＲＮＡおよび第２の一本鎖ＲＮＡの連結反応で得られた粗生成物は、例えば、まず、ＲＮＡを沈殿、抽出する方法で単離してもよい。具体的には、連結反応後の溶液にエタノールやイソプロピルアルコールなどのＲＮＡに対して溶解性の低い溶媒を加えることでＲＮＡを沈殿させる方法や、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（例えば、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール＝２５／２４／１）の混合溶液を連結反応後の溶液に加え、ＲＮＡを水層に抽出する方法を採用してもよい。
　生成した一本鎖ＲＮＡを逆相カラムクロマトグラフィーで精製する工程においては、モノアルキルアンモニウム塩およびジアルキルアンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも１つのアンモニウム塩を含む移動相が使用される。かかるアンモニウム塩としては、典型的には、有機または無機の酸とモノアルキルアミンまたはジアルキルアミンからなるアンモニウム塩が例示される。
　逆相カラムクロマトグラフィーにおいて、移動相（溶離液）となるのは、非疎水性の移動相であり、具体的には、前記のようなアンモニウム塩を含むものが例示される。かかる移動相としては、Ｃ１－Ｃ３アルコール（例えば、メタノール、エタノール、２－プロパノールもしくはｎ－プロパノール）、ニトリル（例えば、アセトニトリル）および場合によっては、水を含む溶媒が、例示される。前記アンモニウム塩を形成する酸としては、例えば、炭酸、酢酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸およびプロピオン酸が例示される。かかる移動相としては、典型的には、モノアルキルアミンまたはジアルキルアミン／酢酸／水／アセトニトリルからなる溶離液が例示される。
　前記アンモニウム塩の濃度としては、例えば、１－２００ｍＭ、５－１５０ｍＭまたは２０－１００ｍＭの濃度が例示される。移動相のｐＨ範囲としては、例えば、ｐＨ：６－８、あるいは６．５－７．５の範囲が例示される。
　移動相は、前記アンモニウム塩以外のトリエチルアンモニウム塩等を含んでいてもよいが、モノアルキルアンモニウム塩およびジアルキルアンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも１つのアンモニウム塩の割合は、全アンモニウム塩に対して、例えば、３０ｍｏｌ％以上、４０ｍｏｌ％以上、５０ｍｏｌ％以上、６０ｍｏｌ％以上、７０ｍｏｌ％以上、８０ｍｏｌ％以上、９０ｍｏｌ％以上あるいはモノアルキルアンモニウム塩およびジアルキルアンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも１つのアンモニウム塩のみからなる。選択される少なくとも１つのアンモニウム塩としては、具体的には、例えば、ヘキシルアンモニウム塩、ジプロピルアンモニウム塩、ジブチルアンモニウム塩、およびジアミルアンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも１つのアンモニウム塩が例示され、これらから選ばれるアンモニウム塩を使用することが好ましい。
　前記逆相カラムクロマトグラフィーの充填剤としては、疎水性の固定相となる、例えば、フェニル基、炭素数１～２０のアルキル基、またはシアノプロピル基のいずれか１つ以上が固定されたシリカまたはポリマーが例示される。かかる充填剤であるシリカまたはポリマーとしては、例えば、粒子径が、２μｍ以上、あるいは、５μｍ以上のものが例示される。
　逆相カラムクロマトグラフィーによる分離は、前記充填剤を含むカラムに前記のアンモニウム塩を含む移動相を通液し、次いで同移動相にリガーゼにより連結された一本鎖ＲＮＡを溶解した溶液を通液し、前記ＲＮＡをカラム内に結合させ、次いで、通液する移動相中の有機溶媒濃度を順次増大させる勾配（グラジエント）により前記ＲＮＡに含まれる不純物（未反応の第１および／または第２のＲＮＡ鎖など）と目的とするＲＮＡ分子とを分離して溶出させることにより実施される。
　逆相カラムクロマトグラフィーの温度は、例えば、２０－１００℃、２５－８０℃、あるいは３０－６０℃である。
　逆相カラムクロマトグラフィーにより得られる画分は、一般的に核酸の分離分析に用いるクロマトグラフィーの条件下で、波長２６０ｎｍのＵＶ吸収で、組成を分析して、選択された画分が集められ、精製された目的物が得られ、たとえば、非特許文献（Handbook of Analysis of Oligonucleotides and Related Products, CRC Press）に記載の方法を用いることができる。
　第１の一本鎖ＲＮＡは、例えば、固相合成法により調製することができる。より具体的には、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（ＮＴＳ　Ｍ－４ＭＸ－Ｅ（日本テクノサービス株式会社製））を用いて調製することができる。ホスホロアミダイト法は、デブロッキング、カップリング、および酸化の３段階を１サイクルとして、望みの塩基配列が得られるまでこのサイクルを繰り返す方法である。各試薬に関して、たとえば、固相担体として多孔質ガラスを使用し、デブロッキング溶液としてジクロロ酢酸トルエン溶液を使用し、カップリング剤として５－ベンジルチオ－１Ｈ－テトラゾールを使用し、酸化剤としてヨウ素溶液を使用し、キャッピング溶液として無水酢酸溶液とＮ－メチルイミダゾール溶液を使用して行うことができる。固相合成後の固相担体からの切出しと脱保護は、たとえば、国際公開第２０１３／０２７８４３号に記載の方法に従って行うことができる。すなわち、アンモニア水溶液とエタノールを加えて塩基部およびリン酸基の脱保護と固相担体からの切り出しを行なったのち、固相担体をろ過し、その後、テトラブチルアンモニウムフルオリドを用いて２’－水酸基の脱保護を行なってＲＮＡを調製することができる。
　かかる固相合成法で使用するアミダイトとしては、特に制限されず、たとえば、下記構造式（ＩＩＩ－ａ）中の、Ｒ１がターシャリブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基、ビス（２－アセトキシ）メチル（ＡＣＥ）基、（トリイソプロピルシリロキシ）メチル（ＴＯＭ）基、（２－シアノエトキシ）エチル（ＣＥＥ）基、（２－シアノエトキシ）メチル（ＣＥＭ）基、パラ―トルイルスルホニルエトキシメチル（ＴＥＭ）基、（２－シアノエトキシ）メトキシメチル（ＥＭＭ）基などで保護された、ＴＢＤＭＳアミダイト（ＴＢＤＭＳ　ＲＮＡ　Ａｍｉｄｉｔｅｓ、商品名、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＡＣＥアミダイト、ＴＯＭアミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト（Chakhmakhchevaの総説：Protective Groups in the Chemical Synthesis of Oligoribonucleotides、Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2013, Vol. 39, No. 1, pp. 1-21.）、ＥＭＭアミダイト（国際公開第２０１３／０２７８４３号に記載）等を使用することもできる。
　またＬｙリンカー領域およびＬｚリンカー領域については、下記構造式（ＩＩＩ―ｂ）に示されるプロリン骨格を有するアミダイトを国際公開第２０１２／０１７９１９号の実施例Ａ４の方法にて使用することができる。また、下記構造式（ＩＩＩ―ｃ）、（ＩＩＩ―ｄ）および（ＩＩＩ－ｅ）のいずれかで表されるアミダイト（国際公開第２０１３／１０３１４６号の実施例Ａ１～Ａ３参照）を使用することにより、同様に核酸合成機にて調製することができる。
　５’末端の５’位のリン酸化には、５’末端のリン酸化用のアミダイトを固相合成にて使用してもよい。５’末端のリン酸化用のアミダイトは市販のアミダイトを使用することができる。また固相合成にて、５’末端の５’位が水酸基若しくは保護された水酸基であるＲＮＡ分子を合成しておき、適宜脱保護を行った後に、市販のリン酸化剤にてリン酸化することで５’末端にリン酸基を有する一本鎖ＲＮＡを調製することができる。リン酸化剤としては下記構造式（ＩＩＩ－ｆ）で示される市販のＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ　（Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）が知られている（特許文献ＥＰ０８１６３６８）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　式（ＩＩＩ－ａ）において、Ｒ２は保護基で保護されていてもよい核酸塩基を示し、Ｒ１は保護基を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　第２の一本鎖ＲＮＡは、固相合成法、即ちホスホロアミダイト法に基づく核酸合成機を用いて、同様に製造することができる。
　ヌクレオチドを構成する塩基は、通常は、核酸、典型的にはＲＮＡを構成する天然の塩基であるが、非天然の塩基を場合によっては、使用してもよい。かかる非天然の塩基としては、天然あるいは非天然の塩基の修飾アナログが例示される。
　塩基の例としては、例えば、アデニンおよびグアニン等のプリン塩基、シトシン、ウラシルおよびチミン等のピリミジン塩基等が挙げられる。塩基は、この他に、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ）等が挙げられる。前記塩基は、例えば、２－アミノアデニン、６－メチル化プリン等のアルキル誘導体；２－プロピル化プリン等のアルキル誘導体；５－ハロウラシルおよび５－ハロシトシン；５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシン；６－アゾウラシル、６－アゾシトシンおよび６－アゾチミン；５－ウラシル（プソイドウラシル）、４－チオウラシル、５－ハロウラシル、５－（２－アミノプロピル）ウラシル、５－アミノアリルウラシル；８－ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化および他の８－置換プリン；５－トリフルオロメチル化および他の５－置換ピリミジン；７－メチルグアニン；５－置換ピリミジン；６－アザピリミジン；Ｎ－２、Ｎ－６、およびＯ－６置換プリン（２－アミノプロピルアデニンを含む）；５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシン；ジヒドロウラシル；３－デアザ－５－アザシトシン；２－アミノプリン；５－アルキルウラシル；７－アルキルグアニン；５－アルキルシトシン；７－デアザアデニン；Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデニン；２，６－ジアミノプリン；５－アミノ－アリル－ウラシル；Ｎ３－メチルウラシル；置換１，２，４－トリアゾール；２－ピリジノン；５－ニトロインドール；３－ニトロピロール；５－メトキシウラシル；ウラシル－５－オキシ酢酸；５－メトキシカルボニルメチルウラシル；５－メチル－２－チオウラシル；５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウラシル；５－メチルアミノメチル－２－チオウラシル；３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウラシル；３－メチルシトシン；５－メチルシトシン；Ｎ４－アセチルシトシン；２－チオシトシン；Ｎ６－メチルアデニン；Ｎ６－イソペンチルアデニン；２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン；Ｎ－メチルグアニン；Ｏ－アルキル化塩基等が挙げられる。また、プリン塩基およびピリミジン塩基には、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、「Ｃｏｎｃｉｓｅ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　Ｏｆ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、８５８～８５９頁、クロシュビッツ　ジェー　アイ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ　Ｊ．Ｉ．）編、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ、１９９０、およびイングリッシュら（Ｅｎｇｌｉｓｃｈら）、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ　Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０巻、ｐ．６１３に開示されるものが含まれる。
　本実施形態の方法で得られる、５’末端側から、Ｘ２領域、Ｙ２領域、Ｌｙリンカー領域、Ｙ１領域、Ｘ１領域およびＺ領域からなる一本鎖ＲＮＡ核酸分子は、その５’末端と３’末端とが未連結であり、線状一本鎖核酸分子ということもできる。かかる一本鎖ＲＮＡ核酸分子は、例えば、ｉｎ　ｖｉｖｏまたはｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、標的遺伝子の発現抑制に使用でき、ＲＮＡ干渉により、標的遺伝子の発現抑制のために使用することができる。「標的遺伝子の発現抑制」とは、例えば、標的遺伝子の発現を阻害することを意味する。前記抑制のメカニズムは、特に制限されず、例えば、ダウンレギュレーションまたはサイレンシングでもよい。
　標的遺伝子の発現抑制は、例えば、標的遺伝子からの転写産物の生成量の減少、転写産物の活性の減少、標的遺伝子からの翻訳産物の生成量の減少、または翻訳産物の活性の減少等によって確認できる。翻訳産物としてのタンパク質は、例えば、成熟タンパク質、または、プロセシングもしくは翻訳後修飾を受ける前の前駆体タンパク質等が挙げられる。
　以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。しかし、本発明はこれら実施例等限定されるものではない。
　［実施例１］
　１．第１の一本鎖ＲＮＡの合成
　以下に示す一本鎖ＲＮＡ（図１１の鎖Ｉ）を合成した。当該鎖は２６塩基長からなり、第１の一本鎖ＲＮＡに対応する。
　　鎖Ｉ：pUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG　(5'-3')　（配列番号１）
　配列表中の配列番号１の記載は、５’末端から「Ｐ」の前までの塩基配列を示す。当該一本鎖ＲＮＡは、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＮＴＳ　Ｍ－４ＭＸ－Ｅ、日本テクノサービス株式会社）を用いて３’側から５’側に向かって合成した。
　当該合成には、ＲＮＡアミダイトとして、それぞれ下記の式のウリジンＥＭＭアミダイト（国際公開第２０１３／０２７８４３号の実施例２に記載）、シチジンＥＭＭアミダイト（同実施例３に記載）、アデノシンＥＭＭアミダイト（同実施例４に記載）、グアノシンＥＭＭアミダイト（同実施例５に記載）、及びプロリンアミダイト（ＩＩＩｂ）（国際公開第２０１２／０１７９１９号の実施例Ａ３に記載）を使用し、５’リン酸化には前記構造式（ＩＩＩ-ｆ）で示されるＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用し、固相担体として多孔質ガラスを使用し、デブロッキング溶液としてトリクロロ酢酸トルエン溶液を使用し、縮合剤として５－ベンジルチオ－１Ｈ－テトラゾールを使用し、酸化剤としてヨウ素溶液を使用し、キャッピング溶液として無水フェノキシ酢酸溶液とＮ－メチルイミダゾール溶液とを使用して行った。
ウリジンＥＭＭアミダイト
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
シチジンＥＭＭアミダイト
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
アデノシンＥＭＭアミダイト
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
グアノシンＥＭＭアミダイト
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
プロリンアミダイト（ＩＩＩｂ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　固相合成後の固相担体からの切出しと脱保護は、国際公開第２０１３／０２７８４３号に記載の方法に従った。すなわち、アンモニア水溶液とエタノールとを加え、しばらく静置した後に固相担体をろ過し、溶媒を留去した。その後、テトラブチルアンモニウムフルオリドを用いて水酸基の脱保護を行った。得られたＲＮＡを注射用蒸留水を用いて所望の濃度となるように溶解した。
　２．第２の一本鎖ＲＮＡの合成
　以下に示す一本鎖ＲＮＡ（図１１の鎖ＩＩ）を合成した。当該鎖は２７塩基長からなり、第２の一本鎖ＲＮＡに対応する。
　　鎖ＩＩ：AGCAGAGUACACACAGCAUAUACCPGG　(5'-3')　（配列番号２）
　当該一本鎖ＲＮＡは、上記と同様の方法により合成した。
　配列表中の配列番号２の記載は、５’末端から「Ｐ」の前までの塩基配列を示す。前記第１および第２のＲＮＡをライゲーションすることで得られる連結一本鎖ＲＮＡを下記鎖ＩＩＩ及び図１１に示す。
鎖ＩＩＩ：
AGCAGAGUACACACAGCAUAUACCPGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG　(5'-3')　（配列番号１，２）
　上記配列中、５’末端の塩基から２７番目の塩基までの塩基配列は前記配列番号２の配列に相当し、また、２８番目の塩基から３’末端の塩基までの塩基配列は前記配列番号１の配列に相当する。
　３．ライゲーション反応目的物の一本鎖ＲＮＡ標品の固相合成
　上記第１および第２のＲＮＡをライゲーションすることで得られる連結一本鎖ＲＮＡの標品を、前記第１および第２のＲＮＡと同様に、固相合成法で合成した。
　４．ＨＰＬＣを用いた精製条件の検討
　上記３種類の合成ＲＮＡを標品として用い、表１に示す条件によって分離分析を行い、精製条件を検討した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　移動相Ａとして１００ｍＭ　トリエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ．７．０）、移動相Ｂとしてアセトニトリルを用いて分離分析を行った結果を図５に示す。ライゲーション反応の原料である鎖Ｉおよび生成物である鎖ＩＩＩの分離は不可能であった。
　移動相Ａとして１００ｍＭ　ヘキシルアンモニウムアセテート（ｐＨ．７．０）、移動相Ｂとしてアセトニトリルを用いて分離分析を行った結果を図６に示す。ライゲーション反応の原料である鎖Ｉおよび鎖ＩＩ、ならびに生成物である鎖ＩＩＩの分離分取が可能であることが示された。
　移動相Ａとして１００ｍＭ　ジプロピルアンモニウムアセテート（ｐＨ．７．０）、移動相Ｂとしてアセトニトリルを用いて分離分析を行った結果を図７に示す。ライゲーション反応の原料である鎖Ｉおよび鎖ＩＩ、ならびに生成物である鎖ＩＩＩの分離分取が可能であることが示された。
　移動相Ａとして１００ｍＭ　ジブチルアンモニウムアセテート（ｐＨ．７．０）、移動相Ｂとしてアセトニトリルを用いて分離分析を行った結果を図８に示す。ライゲーション反応の原料である鎖Ｉおよび鎖ＩＩ、ならびに生成物である鎖ＩＩＩの分離分取が可能であることが示された。
　移動相Ａとして１００ｍＭ　ジアミルアンモニウムアセテート（ｐＨ．７．０）、移動相Ｂとしてアセトニトリルを用いて分離分析を行った結果を図９に示す。ライゲーション反応の原料である鎖Ｉおよび鎖ＩＩ、ならびに生成物である鎖ＩＩＩの分離分取が可能であることが示された。
　移動相Ａとして１０ｍＭ　テトラブチルアンモニウムホスファート（ｐＨ．７．５）、移動相Ｂとしてアセトニトリルを用いて分離分析を行った結果を図１０に示す。ライゲーション反応の原料である鎖Ｉおよび鎖ＩＩ、ならびに生成物である鎖ＩＩＩの分離分取が可能であることが示された。
　５．ライゲーション
　次に、５０ｍＬコニカルチューブの中に蒸留水（大塚製薬社製）を２２．３ｍＬ、５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．０）２．８ｍＬ、０．８７ｍＭの鎖ＩのＲＮＡを７８．１μＬ、０．７４ｍＭの鎖ＩＩのＲＮＡを１０１．３μＬ加え、６５℃に加温した水浴中に１０分間静置し、その後室温にて冷却した。そして、１６２５ｕｎｉｔｓ　Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社）、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　ＤＴＴ、および４ｍＭ　ＡＴＰ混合液２．８ｍＬの組成で、反応スケール２８．２ｍＬで行った。その後、３７℃で１時間インキュベートし、０．２Ｍ　エチレンジアミン四酢酸水溶液１ｍＬを反応液に加えて６５℃の水浴中に１０分間静置し、反応を停止させた。
　得られた反応液から一部を取り出し、ＨＰＬＣによって分析したところ、粗生成物中の目的物の純度は６１％、鎖Ｉおよび鎖ＩＩの残存割合はそれぞれ６．４％、８．３％であった。なお、ＨＰＬＣにおいて波長２６０ｎｍのＵＶスペクトルによって検出し、得られたクロマトグラムの総面積値に対する目的物の面積値を純度として算出し、総面積値に対する原料の面積値を残存割合として算出した。
　続いて、前記反応液を１４ｍＬ取り出し、マイレクス－ＧＰ（メルク社）を用いてろ過し、１００ｍＭ ヘキシルアンモニウムアセテート（ｐＨ．７．０） １ｍＬで洗いこんだ。
　６．精製
　下記表２に記載の条件で、カラムクロマトグラフィーにより精製を行った。ただし、精製前にカラム内に移動相Ａ／移動相Ｂ＝６５／３５の比率で流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで１０分間通液したのちにサンプルを添加した。得られた画分をそれぞれＨＰＬＣにて分析した。なお、ＨＰＬＣにおいて波長２６０ｎｍのＵＶスペクトルによって検出し、得られたクロマトグラムの総面積値に対する目的物の面積値を純度として算出した。
　その結果、得られた画分の中で目的物が最も高純度になった画分は、純度９６．４％となった。得られた試料を質量分析測定によって測定した結果、表３に示すとおり、計算値と合致していることから、目的物が得られていることが確認できた。また、原料である鎖Ｉおよび鎖ＩＩは検出されなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　［比較例１］
　実施例１におけるライゲーションで得られた反応液から１４ｍＬを取り出し、マイレクス－ＧＰ（メルク社製）を用いてろ過し、１００ｍＭ トリエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ．７．０） １ｍＬで洗いこんだ。
　下記表４の条件でカラムクロマトグラフィー精製を行った。ただし、精製前にカラム内に移動相Ａ／移動相Ｂ＝９５／５の比率で流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで１０分間通液したのちにサンプルを添加した。得られた画分をＨＰＬＣにて分析した。なお、実施例１に記載の方法と同様に純度を算出した。
　その結果、目的物が最も高純度になった画分は、純度７７％であった。得られた試料を質量分析測定した結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
　［参考例１］
　５．ライゲーション
　次に、２５０ｍＬポリプロピレン反応器の中に蒸留水（大塚製薬社製）を６８ｍＭ、５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．０）８．６ｍＬ、０．８７ｍＭの鎖ＩのＲＮＡを２０３μＬ、０．７４ｍＭの鎖ＩＩのＲＮＡを２３０μＬ加え、６５℃に加温した水浴中に１０分間静置し、その後室温にて冷却した。そして、２５００ｕｎｉｔｓ　Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社）、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　ＤＴＴ、および４ｍＭ　ＡＴＰ混合液２．８ｍＬの組成で、反応スケール２８．２ｍＬで行った。その後、３５℃で２４時間インキュベートし、０．２Ｍ　エチレンジアミン四酢酸水溶液１ｍＬを反応液に加えて６５℃の水浴中に１０分間静置し、反応を停止させた。
　続いて、得られた反応液を１ｍＬ取り出し、マイレクス－ＧＰ（メルク社）を用いてろ過し、蒸留水（大塚製薬社製）１ｍＬで洗いこんだ。
　６．精製
　下記表５に記載の条件で、カラムクロマトグラフィーにより精製を行った。ただし、精製前にカラム内に移動相Ａ／移動相Ｂ＝６５／３５の比率で流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで１０分間通液したのちにサンプルを添加した。得られた画分をそれぞれＨＰＬＣにて分析し、実施例１と同様の方法で純度および残存割合を算出した。
　その結果、得られた画分のうち、目的物が最も高い純度を示した画分の純度は７９％、鎖Ｉおよび鎖ＩＩの残存割合についてはそれぞれ５．０％、７．１％となった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　これらの結果を表６にまとめた。イオン交換クロマトグラフィー（以下、イオン交換と略記することもある）やトリエチルアンモニウムアセテートを用いた逆相クロマトグラフィー（以下、ＴＥＡＡ精製と略記することもある）では目的物と未反応原料が同時に溶出する一方、ヘキシルアンモニウムアセテートを用いた逆相クロマトグラフィー（以下、ＨＡＡ精製と略記することもある。）では目的物と未反応原料を分離できることが判明した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
　［実施例２］
　１．第１の一本鎖ＲＮＡの合成
　第１の一本鎖ＲＮＡとして、以下に示す一本鎖ＲＮＡ（図１１の鎖ＩＶ）を使用した。当該鎖は２３基長からなり、第１の一本鎖ＲＮＡに対応する。
　　鎖ＩＶ：pUCAUCAUCGUCUCAAAUGAGUCU (5'-3')　（配列番号３）
　当該一本鎖ＲＮＡは、シグマアルドリッチジャパン社から購入したものを使用した。
　２．第２の一本鎖ＲＮＡの合成
　第２の一本鎖ＲＮＡとして、以下に示す一本鎖ＲＮＡ（図１１の鎖Ｖ）を使用した。当該鎖は３６塩基長からなり、第２の一本鎖ＲＮＡに対応する。
　　鎖Ｖ：ACUCCAUUUGUUUUGAUGAUGGAUUCUUAUGCUCCA (5'-3')　（配列番号４）
　当該一本鎖ＲＮＡは、シグマアルドリッチジャパン社から購入したものを使用した。
　上記第１および第２のＲＮＡをライゲーションすることで得られる連結一本鎖ＲＮＡを下記および図１１に示す。
鎖ＶＩ：
ACUCCAUUUGUUUUGAUGAUGGAUUCUUAUGCUCCAUCAUCAUCGUCUCAAAUGAGUCU　(5'-3')　（配列番号５）
　上記配列中、５’末端の塩基から３６番目の塩基までの塩基配列は前記配列番号４の配列に相当し、また、３７番目の塩基から３’末端の塩基までの塩基配列は前記配列番号３の配列に相当する。
　３．ライゲーション
　次に、５０ｍＬコニカルチューブの中に蒸留水（大塚製薬社製）を１．７４ｍＬ、５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．０）２３４μＬ、０．１０ｍＭの鎖ＩＶのＲＮＡを６４．１μＬ、０．１０ｍＭの鎖ＶのＲＮＡを７０．５μＬ加え、６５℃に加温した水浴中に１０分間静置し、その後室温にて冷却した。そして、１７５０ｕｎｉｔｓ　Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社）、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　ＤＴＴ、および４ｍＭ　ＡＴＰ混合液２３４μＬの組成で、反応スケール２．４ｍＬで行った。その後、３７℃で１時間インキュベートし、０．２Ｍ　エチレンジアミン四酢酸水溶液０．１ｍＬを反応液に加えて６５℃の水浴中に１０分間静置し、反応を停止させた。
　得られた反応液から一部を取り出し、ＨＰＬＣによって分析し、実施例１と同様に純度および残存割合を算出した。その結果、粗生成物中の目的物の純度は２９．３％、鎖ＩＶおよび鎖Ｖの残存割合はそれぞれ１３．８％、１１．８％であった。
　続いて、前記反応液を１．２ｍＬ取り出し、マイレクス－ＧＰ（メルク社）を用いてろ過し、１００ｍＭ ヘキシルアンモニウムアセテート（ｐＨ．７．０） １ｍＬで洗いこんだ。
　４．精製
　表２に記載の条件で、カラムクロマトグラフィーにより精製を行った。ただし、精製前にカラム内に移動相Ａ／移動相Ｂ＝６５／３５の比率で流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで１０分間通液したのちにサンプルを添加した。得られた画分をそれぞれＨＰＬＣにて分析し、実施例１と同様の方法で純度を算出した。その結果、得られた画分の中で目的物が最も高純度になった画分の目的物の純度は８０．５％となった。得られた試料を質量分析測定によって測定した結果を表７に示す。計算値と合致していることから、目的物が得られていることが確認できた。また、質量分析では原料である鎖ＩＶおよび鎖Ｖは検出されなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
　［比較例２］
　実施例２において、ライゲーションを停止して得られた反応液から１．２ｍＬを取り出し、マイレクス－ＧＰ（メルク社製）を用いてろ過し、１００ｍＭ トリエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ．７．０） １ｍＬで洗いこんだ。
　表４の条件でカラムクロマトグラフィー精製を行った。ただし、精製前にカラム内に移動相Ａ／移動相Ｂ＝９５／５の比率で流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで１０分間通液したのちにサンプルを添加した。得られた画分をそれぞれＨＰＬＣにて分析し、実施例１と同様の方法で純度および残存割合を算出した。その結果、最も目的物が高純度となった画分について、純度は４７．１％、鎖ＩＶおよび鎖Ｖの残存割合はそれぞれ１．９％、１３．７％となった。得られた試料を質量分析測定によって測定した結果、計算値と合致していることから、目的物が得られることが確認できた。得られた試料を質量分析測定した結果を表７に示す。
　比較例２および実施例２について、目的物が最も高純度となった画分の純度および原料の残存割合を表８にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
　［実施例３］
　１．第１の一本鎖ＲＮＡの合成
　以下に示す一本鎖ＲＮＡ（図１１の鎖ＶＩＩ）を合成した。当該鎖は２３塩基長からなり、第１の一本鎖ＲＮＡに対応する。
　　鎖ＶＩＩ：pUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUU　(5'-3')　（配列番号６）
　当該一本鎖ＲＮＡは、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＮＴＳ　Ｍ－４ＭＸ－Ｅ、日本テクノサービス株式会社）を用いて３’側から５’側に向かって、実施例１における一本鎖ＲＮＡ（鎖Ｉ）の合成と同様のやりかたで合成し、さらに、同様の方法で固相合成後の固相担体からの切出しと脱保護を行った。
　２．第２の一本鎖ＲＮＡの合成
　以下に示す一本鎖ＲＮＡ（図１１の鎖ＶＩＩＩ）を前記第一の一本鎖ＲＮＡと同様の方法で合成した。当該鎖は２９塩基長からなり、第２の一本鎖ＲＮＡに対応する。
　　鎖ＶＩＩＩ：GCAGAGUACACACAGCAUAUACCCACCGG (5'-3')　（配列番号７）
　上記第１および第２のＲＮＡをライゲーションすることで得られる連結一本鎖ＲＮＡを下記に示す。
鎖ＩＸ：
GCAGAGUACACACAGCAUAUACCCACCGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUU　(5'-3')　（配列番号８）
　上記配列中、５’末端の塩基から２９番目の塩基までの塩基配列は前記配列番号７の配列に相当し、また、３０番目の塩基から３’末端の塩基までの塩基配列は前記配列番号６の配列に相当する。
　３．ライゲーション
　次に、５０ｍＬコニカルチューブの中に蒸留水（大塚製薬社製）を１９．６ｍＬ、５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．０）２．５ｍＬ、０．６２ｍＭの鎖ＶＩＩのＲＮＡを１１１．２μＬ、０．４９ｍＭの鎖ＶＩＩＩのＲＮＡを１５４．９μＬ加え、６５℃に加温した水浴中に１０分間静置し、その後室温にて冷却した。そして、１７５０ｕｎｉｔｓ　Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社）、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　ＤＴＴ、および４ｍＭ　ＡＴＰ混合液２．５ｍＬの組成で、反応スケール２５ｍＬで行った。その後、３７℃で１時間インキュベートし、０．２Ｍ　エチレンジアミン四酢酸水溶液１ｍＬを反応液に加えて６５℃の水浴中に１０分間静置し、反応を停止させた。
　得られた反応液から一部を取り出し、実施例１と同様に純度および残存割合を算出した。その結果、粗生成物中の目的物の純度は３３．０％、鎖ＶＩＩおよび鎖ＶＩＩＩの残存割合はそれぞれ１５．７％、２８．１％であった。
　続いて、前記反応液を１２．５ｍＬ取り出し、マイレクス－ＧＰ（メルク社）を用いてろ過し、１００ｍＭ ヘキシルアンモニウムアセテート（ｐＨ．７．０） １ｍＬで洗いこんだ。
　４．精製
　表２に記載の条件で、カラムクロマトグラフィーにより精製を行った。ただし、精製前にカラム内に移動相Ａ／移動相Ｂ＝６５／３５の比率で流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで１０分間通液したのちにサンプルを添加した。得られた画分をそれぞれＨＰＬＣにて分析し、実施例１と同様の方法で純度および残存割合を算出した。その結果、目的物が最も高純度となった画分の純度は９４．２％、鎖ＶＩＩおよび鎖ＶＩＩＩの残存割合についてはそれぞれ０．４％、０．５％となった。得られた試料を質量分析測定によって測定した結果を表９に示す。計算値と合致していることから、目的物が得られていることが確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
　［比較例３］
　実施例３のライゲーション反応で得られた一本鎖ＲＮＡを含む反応液から１２．５ｍＬを取り出し、マイレクス－ＧＰ（メルク社製）を用いてろ過し、１００ｍＭ トリエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ．７．０） １ｍＬで洗いこんだ。
　表４の条件でカラムクロマトグラフィー精製を行った。ただし、精製前にカラム内に移動相Ａ／移動相Ｂ＝９５／５の比率で流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで１０分間通液したのちにサンプルを添加した。得られた画分をそれぞれＨＰＬＣにて分析し、実施例１と同様の方法で純度および残存割合を算出した。その結果、目的物が最も高純度となった画分の純度は３５．５％、鎖ＶＩＩおよび鎖ＶＩＩＩの残存割合はそれぞれ１７．０％、３０．１％となった。得られた試料を質量分析測定によって測定した結果、計算値と合致していることから、目的物が得られることが確認できた。得られた試料を質量分析測定した結果を表９に示す。
　比較例３および実施例３について、目的物が最も高純度となった画分の純度および原料の残存割合を表１０にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
　本発明の製造方法によれば、一本鎖ＲＮＡを簡便に製造できる。
　配列番号１～８は、ＲＮＡの塩基配列を示す。
　配列番号９～１１は、アミノ酸配列を示す。

Claims (14)

  1. （Ｉ）５’末端にリン酸基を有する第１の一本鎖ＲＮＡと３’末端に水酸基を有する第２の一本鎖ＲＮＡに、国際生化学連合が酵素番号として定めるＥＣ６．５．１．３に分類され、二本鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを作用させ、前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとを連結する工程、および
    （ＩＩ）（Ｉ）の連結工程で生成した一本鎖ＲＮＡを含む反応生成物をモノアルキルアンモニウム塩およびジアルキルアンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも１つのアンモニウム塩を含む移動相を用いた逆相カラムクロマトグラフィーによって精製する工程を含む一本鎖ＲＮＡの製造方法であって、
    　ａ）前記第１の一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、Ｘ１領域およびＺ領域からなる一本鎖ＲＮＡであり；
    　ｂ）前記第２の一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、Ｘ２領域、Ｙ２領域、Ｌｙリンカー領域およびＹ１領域からなる一本鎖ＲＮＡであり；
    　ｃ）前記Ｘ１領域と前記Ｘ２領域とが、互いに相補的な、５以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；
    　ｄ）前記Ｙ１領域と前記Ｙ２領域とが、互いに相補的な、２以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；
    　ｅ）前記Ｚ領域が、任意のヌクレオチド数のヌクレオチド配列を含む領域であり；
    　ｆ）前記Ｌｙリンカー領域が、４～３０量体のヌクレオチド配列またはアミノ酸から誘導される原子団を有するリンカー領域であり；
    　ｇ）前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとの連結により生成する一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、前記Ｘ２領域、前記Ｙ２領域、前記Ｌｙリンカー領域、前記Ｙ１領域、前記Ｘ１領域および前記Ｚ領域からなる連結一本鎖ＲＮＡである、
    一本鎖ＲＮＡの製造方法。
  2. 　前記Ｚ領域が、５’末端側から順に、Ｚ１領域、Ｌｚリンカー領域及びＺ２領域からなる領域であり、
    　前記Ｌｚリンカー領域が、アミノ酸から誘導される原子団を有するリンカー領域であり、
    　前記Ｚ１領域と前記Ｚ２領域とが、互いに相補的なヌクレオチド配列を含み、
    　前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとの連結により生成する一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、前記Ｘ２領域、前記Ｙ２領域、前記Ｌｙリンカー領域、前記Ｙ１領域、前記Ｘ１領域、前記Ｚ１領域、前記Ｌｚリンカー領域および前記Ｚ２領域からなる一本鎖ＲＮＡである、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記Ｌｙリンカー領域が、下記式（Ｉ）で表される二価の基である、請求項１または２に記載の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｙ１１及びＹ２１は、それぞれ独立して、炭素数１～２０のアルキレン基を表し、Ｙ１２及びＹ２２は、それぞれ独立して、水素原子もしくはアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ１２とＹ２２とがその末端で互いに結合して炭素数３～４のアルキレン基を表し、
    　Ｙ１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ１領域および前記Ｙ２領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
    　Ｙ２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ１領域および前記Ｙ２領域のＹ１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
  4. 　前記Ｌｙリンカー領域が、下記式（Ｉ）で表される二価の基であり、前記Ｌｚリンカー領域が、下記式（Ｉ’）で表される二価の基である、請求項２または３に記載の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、Ｙ１１及びＹ２１は、それぞれ独立して、炭素数１～２０のアルキレン基を表し、Ｙ１２及びＹ２２は、それぞれ独立して、水素原子もしくはアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ１２とＹ２２とがその末端で互いに結合して炭素数３～４のアルキレン基を表し、
    　Ｙ１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ１領域および前記Ｙ２領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
    　Ｙ２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ２領域および前記Ｙ１領域のＹ１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式中、Ｙ’１１及びＹ’２１は、それぞれ独立して、炭素数１～２０のアルキレン基を表し、Ｙ’１２及びＹ’２２は、それぞれ独立して、水素原子もしくはアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ’１２とＹ’２２とがその末端で互いに結合して炭素数３～４のアルキレン基を表し、
    　Ｙ’１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｚ１領域および前記Ｚ２領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
    　Ｙ’２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｚ２領域および前記Ｚ１領域のＹ’１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
  5. 　前記Ｌｙリンカー領域および前記Ｌｚリンカー領域が、それぞれ独立して、下記式（ＩＩ－Ａ）または（ＩＩ－Ｂ）で表される構造の二価の基である、請求項２、３または４に記載の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式中、ｎおよびｍは、それぞれ独立して、１から２０の何れかの整数を表す。）
  6. 　Ｌｙリンカー領域が、Ｘ２領域、Ｙ２領域、Ｙ１領域およびＸ１領域のヌクレオチド数の総和より少ない数のヌクレオチド配列からなるリンカー領域である、請求項１または２に記載の製造方法。
  7. 　Ｌｙリンカー領域が、５’末端からＬｙａ領域、Ｌｙｂ領域およびＬｙｃ領域からなり、Ｌｙａ領域およびＬｙｃ領域は、互いにワトソンクリック塩基対を形成しない２塩基のヌクレオチド配列からなるリンカー領域である、請求項１、２または６に記載の製造方法。
  8. 　Ｌｙリンカー領域が、５’末端からＬｙａ領域、Ｌｙｂ領域およびＬｙｃ領域からなり、Ｌｙｂ領域は０から２０量体のヌクレオチド配列からなり、Ｌｙａ領域およびＬｙｃ領域は、それぞれ２塩基のヌクレオチド配列のリンカー領域であり、その組合せである（Ｌｙａ、Ｌｙｃ）または（Ｌｙｃ、Ｌｙａ）は、以下の組み合わせから選ばれる、請求項１、２、６または７に記載の製造方法。
    （Ｌｙａ、Ｌｙｃ）または（Ｌｙｃ、Ｌｙａ）＝（ＡＡ、ＡＡ）、（ＡＡ、ＡＣ）、（ＡＡ、ＡＧ）、（ＡＡ、ＣＡ）、（ＡＡ、ＣＣ）、（ＡＡ、ＣＧ）、（ＡＡ、ＧＡ）、（ＡＡ、ＧＣ）、（ＡＡ、ＧＧ）、（ＡＣ、ＡＡ）、（ＡＣ、ＡＣ）、（ＡＣ、ＡＧ）、（ＡＣ、ＣＡ）、（ＡＣ、ＣＣ）、（ＡＣ、ＣＧ）、（ＡＣ、ＵＡ）、（ＡＣ、ＵＣ）、（ＡＣ、ＵＧ）、（ＡＧ、ＡＡ）、（ＡＧ、ＡＣ）、（ＡＧ、ＡＧ）（ＡＧ、ＧＡ）、（ＡＧ、ＧＧ）、（ＡＧ、ＵＡ）、（ＡＧ、ＵＣ）、（ＡＧ、ＵＵ）、（ＡＵ、ＣＡ）、（ＡＵ、ＣＣ）、（ＡＵ、ＣＧ）、（ＡＵ、ＧＡ）、（ＡＵ、ＧＣ）、（ＡＵ、ＧＧ）、（ＡＵ、ＵＡ）、（ＡＵ、ＵＣ）、（ＡＵ、ＵＧ）、（ＡＵ、ＵＵ）、（ＣＡ、ＡＡ）、（ＣＡ、ＡＣ）、（ＣＡ、ＡＵ）、（ＣＣ、ＡＡ）、（ＣＣ、ＡＣ）、（ＣＣ、ＡＵ）、（ＣＣ、ＣＣ）、（ＣＣ、ＣＵ）、（ＣＣ、ＵＡ）、（ＣＣ、ＵＣ）、（ＣＣ、ＵＵ）、（ＣＧ、ＡＡ）、（ＣＧ、ＡＣ）、（ＣＧ、ＡＵ）、（ＣＧ、ＧＡ）、（ＣＧ、ＧＣ）、（ＣＧ、ＧＵ）、（ＧＡ、ＡＡ）、（ＧＡ、ＡＧ）、（ＧＡ、ＧＧ）、（ＧＡ、ＧＵ）、（ＧＣ、ＡＡ）、（ＧＣ、ＡＧ）、（ＧＣ、ＡＵ）、（ＧＣ、ＣＡ）、（ＧＣ、ＣＧ）、（ＧＣ、ＣＵ）、（ＧＣ、ＧＡ）、（ＧＣ、ＧＧ）、（ＧＣ、ＧＵ）、（ＧＣ、ＵＡ）、（ＧＣ、ＵＧ）、（ＧＣ、ＵＵ）、（ＧＧ、ＡＡ）、（ＧＧ、ＡＧ）、（ＧＧ、ＡＵ）、（ＧＧ、ＧＡ）、（ＧＧ、ＧＧ）、（ＧＧ、ＧＵ）、（ＧＧ、ＵＵ）、（ＧＵ、ＣＡ）、（ＧＵ、ＣＧ）、（ＧＵ、ＧＵ）、（ＧＵ、ＵＡ）、（ＧＵ、ＵＧ）、（ＧＵ、ＵＵ）、（ＵＡ、ＡＣ）、（ＵＡ、ＡＧ）、（ＵＡ、ＡＵ）、（ＵＣ、ＡＣ）、（ＵＣ、ＡＧ）、（ＵＣ、ＡＵ）、（ＵＣ、ＣＣ）、（ＵＣ、ＣＧ）、（ＵＣ、ＣＵ）、（ＵＣ、ＵＣ）、（ＵＣ、ＵＧ）、（ＵＣ、ＵＵ）、（ＵＧ、ＡＡ）、（ＵＧ、ＡＣ）、（ＵＧ、ＡＧ）、（ＵＧ、ＡＵ）、（ＵＧ、ＧＣ）、（ＵＧ、ＧＧ）、（ＵＧ、ＧＵ）、（ＵＧ、ＵＣ）、（ＵＧ、ＵＧ）、（ＵＧ、ＵＵ）、（ＵＵ、ＣＣ）、（ＵＵ、ＣＧ）、（ＵＵ、ＣＵ）、（ＵＵ、ＧＣ）、（ＵＵ、ＧＧ）、（ＵＵ、ＧＵ）、（ＵＵ、ＵＣ）、（ＵＵ、ＵＧ）、（ＵＵ、ＵＵ）
  9. 　前記Ｘ１領域、前記Ｙ１領域および前記Ｚ領域からなるＷ１領域、および前記Ｘ２領域および前記Ｙ２領域からなるＷ２領域の少なくとも一方に、ＲＮＡ干渉法の標的となる遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド配列を含む、請求項１から８の何れか一項に記載の製造方法。
  10. 　前記ＲＮＡリガーゼが、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４　ＲＮＡリガーゼ２、ＫＶＰ４０由来のリガーゼ２、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｂｒｕｃｅｉ　ＲＮＡリガーゼ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ　ＲＮＡリガーゼ、またはＬｅｉｓｈｍａｎｉａ　ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ　ＲＮＡリガーゼである、請求項１から９の何れか一項に記載の製造方法。
  11. 　前記ＲＮＡリガーゼが、配列番号９、１０、または１１に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるＲＮＡリガーゼである、請求項１から１０の何れか一項に記載の製造方法。
  12. 　前記ＲＮＡリガーゼが、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４　ＲＮＡリガーゼ２またはＫＶＰ４０由来のＲＮＡリガーゼ２である、請求項１から１１の何れか一項に記載の製造方法。
  13. 　前記アンモニウム塩が、ヘキシルアンモニウム塩、ジプロピルアンモニウム塩、ジブチルアンモニウム塩、およびジアミルアンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも１つのアンモニウム塩である請求項１から１２の何れか一項に記載の製造方法。
  14. 　前記逆相カラムクロマトグラフィーの充填剤が、フェニル基、炭素数１～２０のアルキル基、またはシアノプロピル基のいずれか１つ以上が固定されたシリカまたはポリマーである請求項１から１３のいずれか一項に記載の製造方法。
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