TWI837122B - 單股ｒｎａ的製造方法 - Google Patents
單股ｒｎａ的製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- TWI837122B TWI837122B TW108111274A TW108111274A TWI837122B TW I837122 B TWI837122 B TW I837122B TW 108111274 A TW108111274 A TW 108111274A TW 108111274 A TW108111274 A TW 108111274A TW I837122 B TWI837122 B TW I837122B
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- region
- aforementioned
- stranded rna
- rna
- bonded
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 108091069025 single-strand RNA Proteins 0.000 title abstract description 25
- 101710086015 RNA ligase Proteins 0.000 claims abstract description 63
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims abstract description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 12
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims abstract description 11
- 230000008439 repair process Effects 0.000 claims abstract description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 342
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 120
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 119
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims description 86
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 61
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 36
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 34
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 34
- -1 phosphate ester Chemical class 0.000 claims description 34
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims description 32
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 32
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 claims description 31
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 claims description 29
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 28
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 28
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 claims description 28
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 28
- 101710204104 RNA-editing ligase 2, mitochondrial Proteins 0.000 claims description 25
- 101710188535 RNA ligase 2 Proteins 0.000 claims description 24
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 24
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 22
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 21
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 15
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 15
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 12
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 9
- 241000192091 Deinococcus radiodurans Species 0.000 claims description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 6
- 241000222702 Leishmania tarentolae Species 0.000 claims description 5
- 241000223105 Trypanosoma brucei Species 0.000 claims description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 45
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 17
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 14
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 11
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 11
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 10
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 8
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 8
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 5
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 5
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001275947 Vibrio phage KVP40 Species 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000012361 double-strand break repair Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- LCPDWSOZIOUXRV-UHFFFAOYSA-N phenoxyacetic acid Chemical compound OC(=O)COC1=CC=CC=C1 LCPDWSOZIOUXRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 2
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium fluoride Chemical compound [F-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- VXNZUUAINFGPBY-UHFFFAOYSA-N 1-Butene Chemical group CCC=C VXNZUUAINFGPBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WZIMSXIXZTUBSO-UHFFFAOYSA-N 2-[[bis(carboxymethyl)amino]methyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O WZIMSXIXZTUBSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220643855 39S ribosomal protein L9, mitochondrial_F65A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220643856 39S ribosomal protein L9, mitochondrial_F66A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220643848 39S ribosomal protein L9, mitochondrial_T39A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 125000004042 4-aminobutyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000192093 Deinococcus Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- VQTUBCCKSQIDNK-UHFFFAOYSA-N Isobutene Chemical group CC(C)=C VQTUBCCKSQIDNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000010357 RNA editing Methods 0.000 description 1
- 230000026279 RNA modification Effects 0.000 description 1
- 102000003661 Ribonuclease III Human genes 0.000 description 1
- 108010057163 Ribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 101000853443 Trypanosoma brucei brucei (strain 927/4 GUTat10.1) RNA-editing ligase 1, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- IYABWNGZIDDRAK-UHFFFAOYSA-N allene Chemical group C=C=C IYABWNGZIDDRAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 125000004836 hexamethylene group Chemical group [H]C([H])([*:2])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[*:1] 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 125000001972 isopentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 108091064355 mitochondrial RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004123 n-propyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- KWGGNXPSFLENPI-UHFFFAOYSA-N toluene;2,2,2-trichloroacetic acid Chemical compound CC1=CC=CC=C1.OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl KWGGNXPSFLENPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
一種單股RNA之製造方法，其包含使被分類為國際生化學/分子生物學協會所訂定之酵素編號EC6.5.1.3且具有裂口修復活性的RNA連接酶作用於5’末端具有磷酸基之第1單股RNA及第2單股RNA以及5’末端具有羥基之第3單股RNA，而將前述第1單股RNA、前述第2單股RNA及前述第3單股RNA連結的步驟。
Description
本發明係關於單股RNA的製造方法。
本案根據2018年3月30日在日本申請之日本特願2018-069560號主張優先權，並且在此引用其內容。
就可抑制基因表現的核酸分子而言，在專利文獻1中，報導一種核酸化合物。所述核酸亦已知為在核酸化合物之連接子(linker)部分具有胺基酸結構者。再者，此等核酸化合物具有在生體內不容易分解的高生體安定性，並具有「可迴避免疫回應」的特性。
所述具有優異特性之核酸化合物，由於為約50鹼基之長鏈長度，因而在合成方法中謀求更簡便之方法。
[專利文獻1]國際公開第2012/017919號
本發明係以提供單股RNA之簡便製造方法為目的。
本發明人等為達成上述目的而重覆專心研究的結果，得到「在合成約20鹼基長之3個RNA後，藉由使用某種RNA連接酶進行連結(ligation)，而可容易地製造50鹼基長以上之單股RNA」的見解。
再者，發現藉由使用某種RNA連接酶將前述3支單股RNA中之由第一及第二兩條構成之單股RNA與第三RNA進行連結，而可容易地製造出作為目的之50鹼基長以上的單股RNA。
本發明為基於此等見解，進一步重覆檢討而完成，並提供下述單股RNA的製造方法者。
[1]一種單股RNA之製造方法，該製造方法包含使被分類為國際生化學/分子生物學協會所訂定之酵素編號EC6.5.1.3且具有裂口(nick)修復活性的RNA連接酶作用於5’末端具有磷酸基之第1單股RNA、第2單股RNA及5’末端具有羥基之第3單股RNA，而將前述第1單股RNA、前述第2單股RNA、及前述第3單股RNA連結的步驟，其中，a)前述第1單股RNA為從5’末端側依序由X1區域、W1區域、Lw連接子區域及W2區域所構成的單股RNA，b)前述第2單股RNA為從5’末端側依序由Z2區域、Lz連接子區域、Z1區域及Y1區域所構成的單股RNA，c)前述第3單股RNA為從5’末端側依序由X2區域及Y2區域所構成的單股RNA， d)前述X1區域及前述X2區域包含由彼此互補之2個以上且相同數目的核苷酸所構成的核苷酸序列，e)前述Y1區域及前述Y2區域包含由彼此互補之2個以上且相同數目的核苷酸所構成的核苷酸序列，f)前述Z1區域及前述Z2區域包含由彼此互補之1個以上且相同數目的核苷酸所構成的核苷酸序列，g)前述W1區域及前述W2區域各自獨立地包含任意數日之核苷酸序列，h)前述Lz連接子區域及前述Lw連接子區域各自獨立地為具有從胺基酸衍生之原子團的連接子區域，i)藉由前述第1單股RNA、前述第2單股RNA、前述第3單股RNA之連結所生成的單股RNA係從5’末端側依序由前述X2區域、前述Y2區域、前述Z2區域、前述Lz連接子區域、前述Z1區域、前述Y1區域、前述X1區域、前述W1區域、前述Lw連接子區域及前述W2區域所構成的連結單股RNA。
[2]如[1]記載之製造方法，其中前述Lz連接子區域為下述式(I)所表示的二價基。
(式中，Y11及Y21各自獨立地表示碳數1至20之伸烷基； Y12及Y22各自獨立地表示氫原子、或可經胺基取代之烷基，或者，Y12及Y22於其末端互相鍵結而表示碳數3至4之伸烷基；Y11所鍵結之末端的氧原子，與前述Z1區域及前述Z2區域之任一者之末端核苷酸之磷酸酯的磷原子鍵結；Y21所鍵結之末端的氧原子，與前述Z2區域或前述Z1區域之未與前述Y11鍵結之另一末端核苷酸之磷酸酯的磷原子鍵結)。
[3]如[2]記載之製造方法，其中，前述Lz連接子區域為下述式(I)所表示的二價基，前述Lw連接子區域為下述式(I’)所表示的二價基。
(式中，Y11及Y21各自獨立地表示碳數1至20之伸烷基；Y12及Y22各自獨立地表示氫原子、或可經胺基取代之烷基，或者，Y12及Y22於其末端互相鍵結而表示碳數3至4之伸烷基；Y11所鍵結之末端的氧原子，與前述Z1區域及前述Z2區域之任一區域的末端核苷酸之磷酸酯的磷原子鍵結；Y21所鍵結之末端的氧原子，與前述Z2區域及前述Z1區域之未與Y11鍵結之另一區域的末端核苷酸之磷酸酯的磷原子鍵結)。
(式中，Y’11及Y’21各自獨立地表示碳數1至20之伸烷基；Y’12及Y’22各自獨立地表示氫原子、或可經胺基取代之烷基，或者，Y’12及Y’22於其末端互相鍵結而表示碳數3至4之伸烷基；Y’11所鍵結之末端的氧原子，與前述W1區域及前述W2區域之任一者的末端核苷酸之磷酸酯的磷原子鍵結；Y’21所鍵結之末端的氧原子，與前述W2區域或前述W1區域之未與Y’11鍵結合的另一末端核苷酸之磷酸酯的磷原子鍵結)。
[4]如[2]或[3]記載之製造方法，其中，前述式(I)所表示之二價基為下述式(II-A)或(II-B)所表示的二價基，
(式中，n及m各自獨立地表示1至20之任一整數)。
[5]如[3]或[4]記載之製造方法，其中，前述式(I’)所表示之二價基為下述式(II-A)或(II-B)所表示的二價基，
(式中，n及m各自獨立地表示1至20之任一整數)。
[6]如[1]至[5]中任一項記載之製造方法，其中，由前述W1區域、前述X1區域、前述Y1區域及前述Z1區域所構成之區域、以及由前述X2區域、前述Y2區域及前述Z2區域所構成之區域之至少一者，包含抑制基因之表現的核苷酸序列。
[7]如[1]至[6]中任一項記載之製造方法，該製造方法係使下述單股RNA與前述第3RNA反應，其中，該單股RNA係由前述第1單股RNA及前述第2RNA鏈所生成，並且為從5’末端側依序由前述Z2區域、前述Lz連接子區域、前述Z1區域、前述Y1區域、前述X1區域、前述W1區域、前述Lw連接子區域及前述W2區域所構成者。
[8]如[1]至[6]中任一項記載之製造方法，該製造方法係使下述單股RNA與前述第1之RNA反應，其中，該單股RNA係由前述第2單股RNA及前 述第3RNA鏈所生成，並且為從5’末端側依序由前述X2區域、前述Y2區域、前述Z2區域、前述Lz連接子區域、前述Z1區域及前述Y1區域所構成者。
[9]一種股RNA之製造方法，該製造方法包含使被分類為國際生化學/分子生物學協會所制定之酵素編號EC6.5.1.3且具有裂口修復活性之RNA連接酶作用於5’末端具有磷酸基之第1單股RNA及第2單股RNA，而將前述第1單股RNA及前述第2單股RNA連結的步驟；其中a)前述第1單股RNA為從5’末端側依序由Y2a區域、Lz連接子區域、Y1a區域、X1a區域、W1a區域、Lw連接子區域及W2a區域所構成的單股RNA，b)前述第2單股RNA為由X2a區域所構成的單股RNA，c)前述X1a區域及前述X2a區域包含由彼此互補之4個以上且相同數目的核苷酸所構成的核苷酸序列，d)前述Y1a區域及前述Y2a區域包含由彼此互補之1個以上且相同數目的核苷酸所構成的核苷酸序列，e)前述W1a區域及W前述2a區域各自獨立地包含任意數目之核苷酸序列，f)前述Lw連接子區域及前述Lz連接子區域各自獨立地為具有從胺基酸衍生之原子團的連接子區域，g)藉由前述第1單股RNA及前述第2單股RNA之連結所生成的單股RNA，為從5’末端側依序由前述X2a區域、前述Y2a區域、前述Lz連接子區域、前述Y1a區域、前述X1a區域、前述W1a區域、前述Lw連接子區域及前述W2a區域所構成的連結單股RNA。
[10]如[9]記載之製造方法，其中，前述Lz連接子區域為下述式(I)所表示的二價基，
(式中，Y11及Y21各自獨立地表示碳數1至20之伸烷基；Y12及Y22各自獨立地表示氫原子、或可經胺基取代之烷基，或者，Y12及Y22於其末端互相鍵結而表示碳數3至4之伸烷基；Y11所鍵結之末端的氧原子，與前述Y1a區域及前述Y2a區域之任一者的末端核苷酸之磷酸酯的磷原子鍵結；Y21所鍵結之末端的氧原子，與前述Y1a區域及前述Y2a區域之未與Y11鍵結的另一者之末端核苷酸之磷酸酯的磷原子鍵結)。
[11]如[9]記載之製造方法，其中，前述Lz連接子區域為下述式(I)所表示的二價基，前述Lw連接子區域為下述式(I’)所表示的二價基，
(式中，Y11及Y21各自獨立地表示碳數1至20之伸烷基； Y12及Y22各自獨立地表示氫原子、或可經胺基取代之烷基，或者，Y12及Y22於其末端互相鍵結而表示碳數3至4之伸烷基；Y11所鍵結之末端的氧原子，與前述Y1a區域及前述Y2a區域之任一區域的末端核苷酸之磷酸酯的磷原子鍵結；Y21所鍵結之末端的氧原子，與前述Y2a區域及前述Y1a區域之未與Y11鍵結之另一區域的末端核苷酸之磷酸酯的磷原子鍵結)；
(式中，Y’11及Y’21各自獨立地表示碳數1至20之伸烷基；Y’12及Y’22各自獨立地表示氫原子、或可經胺基取代之烷基，或者，Y’12及Y’22於其末端互相鍵結而表示碳數3至4之伸烷基；Y’11所鍵結之末端的氧原子，與前述W1a區域及前述W2a區域之任一區域的末端核苷酸之磷酸酯的磷原子鍵結；Y’21所鍵結之末端的氧原子，與前述W2a區域及前述W1a區域之未與Y’11鍵結之另一區域的末端核苷酸之磷酸酯的磷原子鍵結)。
[12]如[10]或[11]記載之製造方法，其中前述式(I)所表示的二價基為式(II-A)或(II-B)所表示的二價基，
(式中，n及m各自獨立地表示1至20之任一整數)。
[13]如[11]或[12]記載之製造方法，其中前述式(I’)所表示的二價基為式(II-A)或(II-B)所表示的二價基，
(式中，n及m各自獨立地表示1至20之任一整數)。
[14]如[9]至[13]中任一項記載之製造方法，其中，於由前述Y1a區域、前述X1a區域及前述W1a區域所構成之區域、以及由前述X2a區域、前述Y2a區域所構成之區域之至少一者，包含抑制基因之表現的核苷酸序列。
[15]如[1]至[14]中任一項記載之製造方法，其中前，述RNA連接酶，為來自T4噬菌體之T4 RNA連接酶2、來自KVP40之連接酶2、布魯氏錐蟲(Trypanosoma brucei)RNA連接酶、耐輻射奇異球菌(Deinococcus radiodurans)RNA連接酶、或陶氏利什曼原蟲(Leishmania tarentolae)RNA連接酶。
[16]如[1]至[15]中任一項記載之製造方法，其中，前述RNA連接酶為與序列編號21、22、或23記載之胺基酸序列具有95%以上相同性之胺基酸序列所構成的RNA連接酶。
[17]如[1]至[15]中任一項記載之製造方法，其中，前述RNA連接酶為來自T4噬菌體之T4 RNA連接酶2或來自KVP40之RNA連接酶2。
[18]如[1]至[17]中任一項記載之製造方法，其中，前述連接酶為來自T4噬菌體之T4 RNA連接酶2。
根據本發明之方法，可提供單股RNA之簡便製造方法。
第1圖為展示本發明之一實施態樣的第1至第3單股RNA之一例的模式圖。
第2圖為展示本發明之一實施態樣的第1至第3單股RNA之一例的模式圖。
第3圖為展示實施例1及2中所使用之序列的圖。
第4圖為展示實施例1中所合成之連結單股RNA的圖。
第5圖為展示實施例1之液體層析之結果的圖。
第6圖為展示實施例2中所合成之連結單股RNA的圖。
第7圖為展示實施例2之液體層析之結果的圖。
第8圖為展示本發明之一實施態樣的第1至第2單股RNA之一例的模式圖。
第9圖為展示本發明之一實施態樣的第1至第2單股RNA之一例的模式圖。
以下，針對本發明詳細地說明。
此外，在本說明書中，「包含(comprise)」一詞包括「本質上由其所構成(essentially consist of)」之意義，及「僅由其所構成(consist of)」之意義。
在本發明中，「基因」只要未特別說明，包含雙股DNA、單股DNA(正義鏈或反義鏈)、及彼等之片段。又，在本發明中，「基因」只要未特別說明，表示未區別調節區域、編碼區域、外顯子、及內含子者。
在本說明書中，核苷酸數之數值範圍，例如，為揭示屬於該範圍之全部正整數者，具體例而言，「1至4個核苷酸」之記載，係意指「1個核苷酸」、「2個核苷酸」、「3個核苷酸」、及「4個核苷酸」之全部揭示。又，「1至4個鹼基」之記載，意指「1個鹼基」、「2個鹼基」、「3個鹼基」、及「4個鹼基」之全部揭示。在本說明書中，「核苷酸數」及「鹼基數」，表示相互交換之核苷酸序列的長度。
[第一態樣]
本發明之第一態樣的製造方法係單股RNA的製造方法，該製造方法包含使被分類為國際生化學/分子生物學協會所制定之酵素編號EC6.5.1.3且具有裂口修復活性之RNA連接酶作用於5’末端具有磷酸基之第1單股RNA及第2單股RNA與5’末端具有羥基之第3單股RNA，而將前述第1單股RNA、前述第2單股RNA及前述第三單股RNA連結的步驟；其特徵為：a)第1單股RNA為從5’末端側依序由X1區域、W1區域、Lw連接子區域及W2區域所構成的單股RNA，b)第2單股RNA為從5’末端側依序由Z2區域、Lz連接子區域、Z1區域及Y1區域所構成的單股RNA，c)第3單股RNA為從5’末端側依序由X2區域及Y2區域所構成的單股RNA，d)前述X1區域及前述X2區域包含由彼此互補之2個以上且相同數目的核苷酸所構成的核苷酸序列，e)前述Y1區域及前述Y2區域包含由彼此互補之2個以上且相同數目的核苷酸所構成的核苷酸序列，f)前述Z1區域及前述Z2區域包含由彼此互補之1個以上且相同數目的核苷酸所構成的核苷酸序列，g)前述W1區域及前述W2區域各自獨立地包含任意數之核苷酸序列，
h)前述Lz連接子區域及前述Lw連接子區域各自獨立地為具有從胺基酸衍生之原子團的連接子區域，i)藉由前述第1單股RNA、前述第2單股RNA、及前述第3單股RNA之連結所生成的單股RNA，為從5’末端側依序由前述X2區域、前述Y2區域、前述Z2區域、前述Lz連接子區域、前述Z1區域、前述Y1區域、前述X1區域、前述W1區域、前述Lw連接子區域及前述W2區域所構成的連結單股RNA。
此態樣，能以下述兩種形態實施：使下述單股RNA與前述第3之RNA反應的形態，該單股RNA係由前述第1單股RNA及前述第2之RNA鏈所生成，並且為從5’末端側依序由前述Z2區域、前述Lz連接子區域、前述Z1區域、前述Y1區域、前述X1區域、前述W1區域、前述Lw連接子區域及前述W2區域所構成者；或者是，使下述單股RNA與前述第1之RNA反應的形態，該單股RNA係由前述第2單股RNA及前述第3之RNA鏈所生成，並且為從5’末端側依序由前述X2區域、前述Y2區域、前述Z2區域、前述Lz連接子區域、前述Z1區域、前述Y1區域所構成者。
關於藉由本態樣之製造方法所生成的連結單股RNA，係可參照國際公開第2012/005368號、國際公開第2012/017919號、國際公開第2013/103146號等。
本態樣之製造方法中所用的第1單股RNA之鹼基數(Lw連接子區域除外)係無特別限制，下限為例如4個鹼基，較佳為8個鹼基，上限為例如160個鹼基，較佳為30個鹼基。就第1單股RNA之鹼基數的範圍而言，例如，可列舉4至160個鹼基，較佳可例示8至30個鹼基。
本態樣之製造方法中所用的第2單股RNA之鹼基數(Lz連接子區域除外)係無特別限制，下限為例如6個鹼基，較佳為8個鹼基，上限為例如150個鹼基，較佳為30個鹼基。就第2單股RNA之鹼基數的範圍而言，例如，可列舉6至150個鹼基，較佳可例示8至30個鹼基。
本態樣之製造方法中所用的第3單股RNA之鹼基數係無特別限制，下限為例如4個鹼基，較佳為8個鹼基，上限為例如160個鹼基，較佳為30個鹼基。就第3單股RNA之鹼基數的範圍而言，例如，可列舉4至160個鹼基，較佳可例示8至30個鹼基。
X1區域及X2區域包含彼此互補的核苷酸序列。該互補的核苷酸序列之鹼基數，下限為2個鹼基，較佳為4個鹼基，上限為例如150個鹼基，較佳為24個鹼基。就該互補的核苷酸序列之鹼基數的範圍而言，例如，可列舉2至150個鹼基，較佳可例示4至24個鹼基。
Y1區域及Y2區域包含彼此互補的核苷酸序列。該互補的核苷酸序列之鹼基數，下限為2個鹼基，較佳為4個鹼基，上限為例如100個鹼基，較佳為30個鹼基。就該互補的核苷酸序列之鹼基數的範圍而言，例如，可列舉2至100個鹼基，較佳可例示4至30個鹼基。
Z1區域及Z2區域包含彼此互補的核苷酸序列。該互補的核苷酸序列之鹼基數，下限為1個鹼基，較佳為2個鹼基，更佳為4個鹼基，上限為例如100個鹼基，較佳為30個鹼基。就該互補的核苷酸序列之鹼基數的範圍而言，例如，可列舉1至100個鹼基，較佳可例示2至30個鹼基，更佳可例示4至30個鹼基。
W1區域及W2區域分別包含的核苷酸序列之鹼基數係無特別限制，下限為例如1個鹼基，較佳為4個鹼基，上限為例如100個鹼基，較佳為10個鹼基。就前述核苷酸序列之鹼基數的範圍而言，例如，可列舉1至100個鹼基，較佳可例示4至10個鹼基。
藉由本態樣之製造方法所製造的單股RNA之鹼基數(連接子區域除外)係無特別限制，下限為例如38個鹼基，較佳為42個鹼基，上限為例如300個鹼基，較佳為80個鹼基。就前述單股RNA之鹼基數的範圍而言，例如，可列舉38至300個鹼基，較佳可例示42至80個鹼基。
藉由本態樣之製造方法所製造的單股RNA，較佳為由Z1區域、Y1區域、X1區域及W1區域所構成之區域(A1區域)、以及由X2區域、Y2區域及Z2區域所構成之區域(B1區域)中之至少一者，包含抑制基因之表現的核苷酸序列。就抑制基因之表現的方法而言，無特別限制，較佳為RNA干擾法。
RNA干擾(RNAi)意指藉由將雙股RNA導入細胞內，使標的基因之mRNA被分解，其結果誘導對蛋白質之轉譯阻礙，進而阻礙標的基因之表現的現象，其中，該雙股RNA係包含由與標的基因之mRNA序列至少一部分相同之序列所構成的正義RNA、及由與其互補之序列所構成之反義RNA。關於RNA干擾機制之詳細情形雖仍有不明朗部分，然而研判被稱為DICER之酵素(RNase III核酸分解酵素家族之一種)與雙股RNA接觸，使雙股RNA被分解成被稱為siRNA的小片段係主要機制。
成為標的之基因無特別限制，可適當地選擇期望之基因。抑制成為標的基因之表現的核苷酸序列，只要為能抑制基因表現之序列則無 特別限制，可基於周知之數據庫(例如，GenBank等)等所登錄之標的基因的序列資料，依照常法而設計。相對於成為標的基因的預定區域，該核苷酸序列具有較佳90%以上，更佳95%以上，進一步更佳98%以上，最佳100%的相同性。
藉由RNA干擾而抑制標的基因之表現的核苷酸序列，例如，可使用由與標的基因之mRNA序列之至少一部分相同之序列所構成的正義RNA。藉由RNA干擾而抑制標的基因之表現的核苷酸序列之鹼基數係無特別限制，例如，19至30個鹼基，較佳為19至21個鹼基。
A1區域及B1區域之任一者或兩者，可具有2個以上針對相同標的基因之相同的表現抑制序列，亦可具有2個以上針對相同標的之相異的表現抑制序列，也可具有2個以上針對相異標的基因之相異的表現抑制序列。在A1區域具有2個以上表現抑制序列時，各表現抑制序列之配置處無特別限制，可為X1區域、Y1區域及Z1區域之任一區域或二區域以上，亦可為處於二區域以上之區域。在B1區域具有2個以上表現抑制序列時，各表現抑制序列之配置處可為X2區域、Y2區域及Z2區域之任一區域或二區域以上，亦可為處於二區域以上之區域。相對於標的基因之預定區域，表現抑制序列以具有90%以上之互補性為較佳，更佳為95%，進一步更佳為98%，特佳為100%。
該連結單股RNA係藉由使連接酶作用於5’末端具有磷酸基之第1單股RNA及第2單股RNA、及5’末端具有羥基之第3單股RNA，而將前述第1單股RNA、前述第2單股及前述第3單股連結的步驟來製造(參照第1圖)。
連結單股RNA可在分子內排列具有互補性之序列部分，並且在分子內部分地形成雙鏈。連結單股RNA分子如第1圖所示，X1區域及X2區域包含彼此具有互補性之核苷酸序列，再者，Y1區域及Y2區域包含彼此具有互補性之核苷酸序列，再者，Z1區域及Z2區域包含彼此具有互補性之核苷酸序列，此等具有互補性之序列間，成雙鏈，Lw及Lz之連接子區域係因應其長度形成環結構。第1圖為終歸是顯示前述區域之連結順序及形成雙鏈部分之各區域的位置關係者，例如，各區域之長度、連接子區域(Lw及Lz)之形狀等，但不以此等為限。
由Z1區域、Y1區域、X1區域及W1區域所構成之A1區域、及由X2區域及Y2區域所構成之B區域之至少一者，可包含至少一種藉由RNA干擾而抑制標的基因之表現的序列。例如，A1區域可包含與標的基因之mRNA序列至少一部分相同之序列所構成的正義RNA序列，B1區域可包含與前述正義RNA互補之反義RNA序列。或者，例如，B1區域可包含與標的基因之mRNA序列至少一部分相同之序列所構成的正義RNA序列，A1區域可包含與前述正義RNA互補之反義RNA序列。
藉由本態樣之製造方法所製造的單股RNA，可為僅由核糖核苷酸所構成者，亦可為包含去氧核苷酸、非核苷酸等者，再者，也可為包含核糖核苷酸中之偶磷基二酯鍵之氧原子經一部分硫原子置換的偶磷基硫酯鍵者。藉由本態樣之製造方法所製造的單股RNA，較佳為僅由核糖核苷酸構成者。
Lz連接子區域及Lw連接子區域，各自獨立地為具有由胺基酸衍生之原子團的連接子區域，在此之胺基酸可為天然胺基酸及人工胺基酸之任一種，又，亦可為具有取代基或保護基者。
就Lz連接子區域而言，例如，可列舉下述式(I)所表示的二價基：
(式中，Y11及Y21各自獨立地表示碳數1至20之伸烷基；Y12及Y22各自獨立地表示氫原子、或可經胺基取代之烷基，或者，Y12及Y22於其末端互相鍵結而表示碳數3至4之伸烷基；Y11所鍵結之末端的氧原子，與Z1區域及Z2區域之任一者的末端核苷酸之磷酸酯的磷原子鍵結；Y21所鍵結之末端的氧原子，與Z2區域及Z1區域之未與Y11鍵結的另一者之末端核苷酸之磷酸酯的磷原子鍵結)。
又，就Lw連接子區域而言，可列舉下述式(I’)所表示的二價基：
(式中，Y’11及Y’21各自獨立地表示碳數1至20之伸烷基；Y’12及Y’22各自獨立地表示氫原子或可經胺基取代之烷基，或者，Y’12及Y’22於其末端互相鍵結而表示碳數3至4之伸烷基；連接子Lw區域之Y’11所鍵結之末端的氧原子，與W1區域及W2區域之任一者的末端核苷酸之磷酸酯的磷原子鍵結；Y’21所鍵結之末端的氧原子，與W2區域及W1區域之未與Y’11鍵結的另一者之末端核苷酸之磷酸酯的磷原子鍵結)。
前述碳數1至20之伸烷基，可為直鏈狀或分枝鏈狀之任一種，較佳為碳數4至6之伸烷基。前述伸烷基可列舉例如：亞甲基、伸乙基、正伸丙基、異伸丙基、正伸丁基、異伸丁基、第三伸丁基、正伸戊基、異伸戊基、及伸己基等。
前述可經胺基取代之烷基中的烷基，可為直鏈狀或分枝鏈狀之任一種，較佳為碳數1至10之烷基，更佳為碳數1至5之烷基。前述烷基可列舉例如：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、及己基等。前述可經胺基取代之烷基可例示前述所例示之烷基之氫原子的一部份經胺基置換者。
前述可經胺基取代之烷基能具有的胺基之數目無特別限制，較佳為1個。又，前述可經胺基取代之烷基中的胺基之取代位置亦無特別限制，可為任何位置。胺基取代之烷基可舉例如4-胺基丁基。
就上述式(I)及(I’)之任一項所表示的二價基之較佳具體例而言，可列舉下述式(II-A)或(II-B)所表示的二價基：
(式中，n及m各自獨立地表示1至20之任一整數)。
n及m較佳為4至6，n與m可相同，亦可相異。
將本態樣之製造方法所用的第1至第3單股RNA之一例示於第1圖及第2圖。第1圖之上模式圖，表示第1至第3單股RNA，第1圖之下模式圖，表示以連接酶結合成單股RNA的狀態。第2圖表示將第1至第3單股RNA以直線狀並列的狀態。
在本說明書及圖式中所示之序列中，「p」之簡號，表示5’末端之羥基以磷酸基修飾。又，序列中之「P」之簡號，為下述結構式(III-A)所表示之使用亞磷醯胺(amidite)所導入之結構，並且，以下式表示的結構。
本態樣之製造方法所用的第1至第3單股RNA之製造方法，無特別限制，可為周知之固相合成法、液相合成法等，或使用周知之核酸合成裝置等，以化學方式合成。此種合成方法可列舉例如：亞磷醯胺法、H-膦酸酯法、國際公開第2013/027843號所記載之方法等。
單股RNA之5’位的磷酸化，可將5’末端之磷酸化用之亞磷醯胺使用於固相合成中。5’磷酸化亞磷醯胺可使用市售之亞磷醯胺。又，在固相合成中，合成5’末端為羥基之RNA分子，進行脫保護後，藉由市售之磷酸化劑進行磷酸化，可調製5’末端具有磷酸基之單股RNA。磷酸化劑已知有例如下述結構式(III-a)所示的市售之Chemical Phosphorylation Reagent(Glen Research)等(歐州專利申請公開第0816368號說明書)。
又，關於Lz及Lw之連接子區域，可使用如下所示之亞磷醯胺，同樣地藉由核酸合成機調製。就連接子區域之亞磷醯胺而言，例如， 下述結構式(III-b)所示之具有脯胺酸骨架的亞磷醯胺，係可藉由國際公開第2012/017919號之實施例A4所記載的方法調製，下述結構式(III-c)、(III-d)及(III-e)分別表示之下述亞磷醯胺，係可藉由國際公開第2013/103146號之實施例A1至A3所記載的方法調製。
本態樣之製造方法中所使用的RNA連接酶，係被分類為國際生化學/分子生物學協會所制定之酵素編號EC6.5.1.3，並且具有裂口修復活性。該RNA連接酶意指催化ATP+(核糖核苷酸)n-3'-羥基+5'-磷醯基-(核糖核苷酸)m<=>(核糖核苷酸)n+m+AMP+二磷酸酯之反應的酵素，具有修復雙股核酸中之裂口的活性者。
RNA連接酶可例示例如來自T4噬菌體之T4 RNA連接酶2。此RNA連接酶2，例如，可從(New England BioLabs)購入。再者，RNA連接酶可例示：來自弧菌噬菌體(vibriophage)KVP40之連接酶2、布魯氏錐蟲(Trypanosoma brucei)RNA連接酶、耐輻射奇異球菌(Deinococcus radiodurans)RNA連接酶、或陶氏利什曼原蟲(Leishmania tarentolae)RNA連接酶。該RNA連接酶亦可使用，例如，藉由非專利文獻(Structure and Mechanism of RNA Ligase,Structure,Vol.12,PP.327-339.)所記載之方法，從各生物萃取及精製而得到者。
來自T4噬菌體之T4 RNA連接酶2，為由與序列編號10記載之胺基酸序列具有95%以上相同性之胺基酸序列所構成的蛋白質，亦可使用具有雙股裂口修復活性之RNA連接酶。該RNA連接酶2除了序列編號10記載之胺基酸序列之酵素以外，可例示屬於其變異體的T39A、F65A、F66A(參照：RNA ligase structures reveal the basis for RNA specificity and conformational changes that drive ligation forward,Cell.Vol.127,pp.71-84.)等。該RNA連接酶2，例如，可依據前述文獻之記載，藉由使用大腸桿菌噬菌體T4(Escherichia coli bacteriophage T4)之方法或PCR等之方法而得到，其中，該大腸桿菌噬菌體T4係以ATCC(註冊商標)11303寄存於ATCC(美國典型菌種保存中心(American Type Culture Collection))。
來自KVP40之RNA連接酶2可藉由非專利文獻(Characterization ofbacteriophage KVP40 and T4 RNA ligase 2,Virology,vol.319,PP.141-151.)記載之方法取得。具體而言，例如，可藉由如下述之方法取得。亦即，在從噬菌體KVP40(例如，以寄存編號Go008199寄存於JGI)萃取之DNA中，將開放閱讀框(open reading frame)293以NdeI及BamHI進行限制酵素消化後，藉由聚合酶連鎖反應使其增幅。將所得到之DNA組入質體(plasmid)載體pET16b(Novagen)中。或者，亦可將該DNA序列藉由PCR進行人工合成。在此，藉由DNA序列解析，可得到期望之變異體。繼而，將所得到之載體DNA組入E.coli BL21(DE3)，於含有0.1mg/mL胺苄青黴素(ampicillin)之LB培養基中培養。以成為0.5mM之方式添加異丙基-β-硫半 乳糖苷，並於37℃培養3小時。隨後之操作以全部在4℃進行為較佳。首先，藉由離心操作使菌體沉澱，將沉澱物於-80℃保存。在凍結之菌體中添加緩衝液A[50mM Tris-HCl(pH7.5)、0.2M NaCl、10%蔗糖]。接著，添加溶菌黴及Triton X-100，藉由超音波將菌體破碎，使目的物溶出。然後，利用親和性層析或尺寸排除層析等，將目的物單離。接著，將所得到之水溶液離心過濾，藉由將溶離液以緩衝液置換，可作為連接酶使用。
如此之施作可得到來自KVP40之RNA連接酶2。來自KVP40之RNA連接酶2係與序列編號11之胺基酸序列具有95%以上相同性之胺基酸序列所構成的蛋白質，可使用為具有雙股裂口修復活性之RNA連接酶。
耐輻射奇異球菌(Deinococcus radiodurans)RNA連接酶，可藉由非專利文獻(An RNA Ligase from Deinococcus radiodurans,J Biol Chem.,Vol.279,No.49,PP.50654-61.)記載之方法取得。例如，亦可從以ATCC(註冊商標)BAA-816寄存於ATCC之生物學材料得到前述連接酶。耐輻射奇異球菌RNA連接酶係具有與序列編號12之胺基酸序列95%以上相同性之胺基酸序列所構成的蛋白質，可使用為具有雙股裂口修復活性之RNA連接酶。具體而言，該連接酶除序列編號12之胺基酸序列所構成的RNA連接酶以外，可例示在序列編號12之RNA連接酶中，具有K165A或E278A之變異之胺基酸序列所構成的RNA連接酶(An RNA Ligase from Deinococcus radiodurans,J Biol Chem.,Vol.279,No.49,PP.50654-61.)。
布魯氏錐蟲(Trypanosoma brucei)RNA連接酶可依照非專利文獻(Assiciation of Two Novel Proteins TbMP52 and TbMP48 with the Trypanosoma brucei RNA Editing Complex,Vol.21,No.2,PP.380-389.)記載之方法取得。
陶氏利什曼原蟲(Leishmania tarentolae)RNA連接酶，可依照非專利文獻(The Mitochondrial RNA Ligase from Leishmania tarentolae Can Join RNA Molecules Bridged by a Complementary RNA,Vol.274,No.34,PP.24289-24296)記載之方法取得。
其中，RNA連接酶較佳為來自T4噬菌體之T4 RNA連接酶2。
在本態樣之製造方法中，使RNA連接酶作用於第1至第3單股RNA之反應條件，只要為能使RNA連接酶發揮功能而製造出期望之單股RNA的條件，就無特別限制，可適當地設定。
RNA連接酶之使用量，可因應所連結之第1至第3單股RNA之量、反應溫度及反應時間，適當地設定適切的使用量。RNA連接酶之反應時間，例如，可選自0.5至144小時之範圍。RNA連接酶處理之pH，可對應於所使用酵素之最佳pH而適當地設定，例如，可選自pH4至9之範圍。RNA連接酶處理之溫度，可對應於所使用酵素之最佳溫度而適當地設定，例如，可選自0至50℃之範圍。
使RNA連接酶作用於第1至第3單股RNA之反應液中，除此等之外，亦可包含緩衝液、金屬鹽、ATP等。緩衝液可列舉例如：Tris-鹽酸緩衝液、ATP緩衝液、磷酸鉀緩衝液、甘胺酸-鹽酸緩衝液、乙酸緩衝液、檸檬酸緩衝液等。金屬鹽可列舉例如：鎂鹽、鉀鹽、鈣鹽、鈉鹽等。
包含使RNA連接酶作用而製造出之單股RNA的粗生成物，通常可藉由使用沉澱、萃取及精製之方法而將RNA單離。具體而言，可採 用下述方法：在反應後之溶液中，添加乙醇、異丙醇等對RNA之溶解性低的溶劑，而使RNA沉澱之方法；或者是，將酚/氯仿/異戊醇(例如，酚/氯仿/異戊醇=25/24/1)之溶液添加於反應溶液中，使RNA被萃取至水層的方法。然後，可藉由逆相管柱層析、陰離子交換管柱層析、親和性管柱層析等周知之高效液體層析(HPLC)的手法等進行單離、精製。
[第二態樣]
繼而，針對本發明之第二態樣進行說明。
本發明之第二之態樣，為一種單股RNA之製造方法，該製造方法包含使被分類為國際生化學/分子生物學協會所制定之酵素編號EC6.5.1.3，且具有裂口修復活性之RNA連接酶作用於5’末端具有磷酸基之第1單股RNA及第2單股RNA，而將前述第1單股RNA及前述第2單股RNA連結的步驟。藉由前述第1單股RNA及前述第2單股RNA之連結所生成的單股RNA，為從5’末端側依序由X2a區域、Y2a區域、Lz連接子區域、Y1a區域、X1a區域、W1a區域、Lw連接子區域及W2a區域所構成的連結單股RNA(參照第9圖)。本態樣之製造方法係根據以下之a)至g)所規定。
a)第1單股RNA為從5’末端側依序由Y2a區域、Lz連接子區域、Y1a區域、X1a區域、W1a區域、Lw連接子區域及W2a區域所構成的單股RNA。
b)第2單股RNA為由X2a區域所構成的單股RNA。
c)X1a區域及X2a區域包含由彼此互補的4個以上且相同數目的核苷酸所構成的核苷酸序列。
d)Y1a區域及Y2a區域包含由彼此互補的1個以上且相同數目的核苷酸所構成的核苷酸序列。
e)W1a區域及W2a區域各自獨立地包含任意數目之核苷酸序列。
f)Lw連接子區域及Lz連接子區域各自獨立地為具有從胺基酸衍生之原子團的連接子區域。Lw連接子區域及Lz連接子區域，如前述第一態樣所說明。
前述連結單股RNA亦可於由Y1a區域、X1a區域及W1a區域所構成之A區域、以及由X2a區域及Y2a區域所構成之B區域的至少一者，包含抑制基因之表現的核苷酸序列。此種核苷酸序列可包含藉由RNA干擾法而抑制標的基因之表現的序列。
A區域及B區域之任一者或兩者，可具有2個以上針對相同的標的基因之相同表現抑制序列，亦可具有2個以上針對相同標的之相異的表現抑制序列，也可具有2個以上針對相異標的基因之相異的表現抑制序列。在A區域具有2個以上之表現抑制序列時，各表現抑制序列之配置處無特別限制，可為X1a區域及Y1a區域之任一區域或兩者，亦可為處於兩者之區域。在B區域具有2個以上之表現抑制序列時，各表現抑制序列之配置處可為X2a區域及Y2a區域之任一區域或兩者，亦可為處於兩者之區域。相對於標的基因之設定區域，表現抑制序列以具有90%以上之互補性為較佳，更佳為95%，進一步更佳為98%，特佳為100%。
該連結單股RNA係藉由使5’末端具有磷酸基之第1單股RNA及3’末端具有羥基之第2單股RNA與連接酶作用，而將前述第1單股RNA及前述第2單股連結的步驟製造(參照第9圖)。
連結單股RNA可在分子內排列具有互補性之序列部分，並且在分子內部分地形成雙鏈。連結單股RNA分子如第9圖所示，X1a區域及 X2a區域包含具有彼此互補性之核苷酸序列，再者，Y1a區域及Y2a區域包含具有彼此互補性之核苷酸序列，在此等具有互補性之序列間，形成雙鏈，Lw及Lz之連接子區域因應其長度形成環結構。第9圖終歸是顯示前述區域之連結順序及形成雙鏈部分之各區域的位置關係者，例如，各區域之長度、連接子區域(Lw及Lz)之形狀等，但不以此等為限。
由Y1a區域、X1a區域及W1a區域所構成之A區域、及由X2a區域及Y2a區域所構成之B區域之至少一者，可包含至少一個藉由RNA干擾抑制標的基因之表現的序列。在連結單股RNA中，A區域及B區域可完全地互補，亦可1或數個核苷酸非互補，然而以完全互補為較佳。前述1或數個核苷酸，例如，為1至3個核苷酸，較佳為1或2個核苷酸。Y1a區域具有對Y2a區域之全區域互補的核苷酸序列。Y1a區域及Y2a區域為彼此完全互補的核苷酸序列，為1個以上且相同數目的核苷酸所構成的核苷酸序列。X1a區域具有對X2a區域之全區域互補的核苷酸序列。X1a區域及X2a區域為彼此完全互補的核苷酸序列，為2個以上且相同數目的核苷酸所構成的核苷酸序列。本實施形態之製造方法中，W1a區域及W2a區域為包含任意數目之核苷酸序列的區域，其係非必須之序列，可為核苷酸之數為0之態樣，亦可為包含1個以上之核苷酸的態樣。
以下例示各區域之長度，然而不以此為限。
在連結單股RNA分子中，W2a區域之核苷酸數(W2an)、X2a區域之核苷酸數(X2an)及Y2區域之核苷酸數(Y2an)的關係，例如，滿足下述式(1)之條件。W1a區域之核苷酸數(W1an)、X1a區域之核苷酸數(X1an)及Y1a區域之核苷酸數(Y1an)的關係，例如，滿足下述式(2)之條件。
W2an≦X2an+Y2an‧‧‧(1)
W1an≦X1an+Y1an‧‧‧(2)
在連結單股RNA分子中，X1區域之核苷酸數(X1an)及Y1a區域之核苷酸數(Y1an)的關係，無特別限制，例如，滿足下述式之任一條件。
X1an=Y1an‧‧‧(3)
X1an<Y1an‧‧‧(4)
X1an>Y1an‧‧‧(5)
在本實施形態之方法中，X1a區域之核苷酸數(X1an)，亦即，X2a區域之核苷酸數(X2an)為2個以上，較佳為4個以上，更佳為10個以上。
Y1a區域之核苷酸數(Y1an)，亦即，Y2a區域之核苷酸數(Y2an)為1個以上，較佳為2個以上，更佳為4個以上。
W1a區域較佳為包含對於W2a區域之全區域或W2a區域之部分區域互補的核苷酸序列。W1a區域及W2a區域雖可1或數個核苷酸為非互補，然而以完全互補為較佳。
更詳細而言，W2a區域較佳為由比W1a區域短少1個核苷酸以上之核苷酸序列構成。在此情況，W2a區域之核苷酸序列全體，成為與W1a區域之任意部分區域的全部核苷酸互補。W2a區域之從5’末端至3’末端的核苷酸序列，以與從W1a區域之3’末端之核苷酸開始，至5’末端之核苷酸序列具有互補性的序列為更佳。
在連結單股RNA分子中，X1a區域之核苷酸數(X1an)與X2a區域之鹼基數(X2an)的關係、Y1a區域之核苷酸數(Y1an)與Y2a區域之核苷 酸數(Y2an)的關係、以及W1a區域之核苷酸數(W1an)與W2a區域之核苷酸數(W2an)的關係，係分別滿足下述式(6)、(7)及(8)之條件。
X1an=X2an‧‧‧(6)
Y1an=Y2an‧‧‧(7)
W1an≧W2an‧‧‧(8)
在連結單股RNA中，除去連接子區域(Lw、Lz)的核苷酸數目之合計，下限典型為38個，較佳為42個，更佳為50個，進一步更佳為51個，特佳為52個，上限典型為300個，較佳為200個，更佳為150個，進一步更佳為100個，特佳為80個。
在連結單股RNA中，Lw及Lz之連接子區域的長度無特別限制。此等連接子區域，例如，以X1a區域及X2a區域能形成雙鏈之長度，或Y1a區域及Y2a區域能形成雙鏈之長度為較佳。Lw及Lz之各連接子區域，為具有從胺基酸衍生之原子團的區域。此等連接子區域(Lw、Lz)通常為非核苷酸之連接子區域。
形成連接子區域之主鏈的原子數，其上限典型為100個，較佳為80個，更佳為50個。
Lw連接子區域，例如，為上述式(I)所表示的二價基，Lz連接子，例如上述式(I’)所表示的二價基。
在第二態樣中，使RNA連接酶作用於第1及第2單股RNA之反應條件，只要為能使RNA連接酶發揮功能而可製造期望之單股RNA的條件，就無特別限制，可適當地設定。
RNA連接酶可使用與前述第一態樣中所例示者相同者。RNA連接酶之使用量，可因應所連結的第1至第3單股RNA之量、反應溫度及反應時間，而適當地設定適切的使用量。RNA連接酶之反應時間，例如，可從0.5至144小時之範圍選擇。RNA連接酶處理之pH，可對應於使用酵素之最佳pH而適當地設定，例如，可從pH4至9之範圍選擇。RNA連接酶處理之溫度，可對應於使用酵素之最佳溫度而適當地設定，例如，可從0至50℃之範圍選擇。
在使RNA連接酶作用於第1及第2單股RNA的反應液中，除此等外，尚可包含緩衝液、金屬鹽、ATP等。緩衝液可列舉例如：Tris-鹽酸緩衝液、ATP緩衝液、磷酸鉀緩衝液、甘胺酸-鹽酸緩衝液、乙酸緩衝液、檸檬酸緩衝液等。金屬鹽可列舉例如：鎂鹽、鉀鹽、鈣鹽、鈉鹽等。
包含使RNA連接酶作用而製造出之單股RNA的粗生成物，通常可藉由使用將RNA沉澱、萃取及精製之方法而單離。具體而言，可採用下述方法：在反應後之溶液中，添加乙醇、異丙醇等對RNA之溶解性低的溶劑，使RNA沉澱之方法；或者是，將酚/氯仿/異戊醇(例如，酚/氯仿/異戊醇=25/24/1)之溶液添加於反應溶液，使RNA萃取至水層的方法。然後，可藉由逆相管柱層析、陰離子交換管柱層析、親和性管柱層析等周知之高速液體層析(HPLC)的手法等進行單離、精製。
在藉由本發明之方法而製造出之單股RNA中，能抑制成為標的基因的表現者，可使用為以基因為原因之疾病的治療或預防劑。
在化學合成約20個鹼基長之單股RNA時，相對於化學合成約50個鹼基長或其以上之單股RNA的情況，就產率及產量之觀點較優異。 因此，相較於化學合成約50個鹼基長或其以上之單股RNA，藉由化學合成約20個鹼基長之單股RNA並接合(ligation)而連結，除了得到高產率及產量外，由於未接合之RNA鏈於精製中可容易地除去，故在品質方面亦優異。
因此，根據本發明之製造方法，能以高產率、產量及品質製造約50鹼基長或其以上之單股RNA。又，藉由包含利用RNA干擾而抑制標的基因之表現的核苷酸序列，結果能有效率地製造可利用於RNA干擾法之單股RNA，並可期待成本之減低。
以下，列舉實施例將本發明更詳細地說明。然而，本發明不因此等實施例等而受到限定。
實施例1
1.第1單股RNA之合成
合成以下所示之單股RNA(第3圖之鏈I)。該鏈由11個鹼基長構成，對應於第1單股RNA。
鏈I：pCUCUGCUUCPG(5'-3')
該單股RNA係依據亞磷醯胺法，使用核酸合成機(商品名NTS M-4MX-E，日本技術服務股份有限公司)，從3’側向5’側合成。
在該合成中，RNA亞磷醯使用：國際公開第2013/027843號之實施例2所記載的尿苷EMM亞磷醯胺、實施例3所記載之胞苷EMM亞磷醯胺、實施例4所記載之腺苷EMM亞磷醯胺、實施例5所記載之鳥苷EMM亞磷醯胺、及國際公開第2012/017919號之實施例A3所記載之脯胺酸亞磷醯胺(IIIb)，5’磷酸化使用Chemical Phosphorylation Reagent(Glen Research)，固相載體使用多孔質玻璃，解封(deblocking)溶液使用高純度三氯乙酸甲苯溶液，縮合劑使用5-苄基巰基-1H-四唑，氧化劑使用碘溶液，封蓋(capping)溶液使用苯氧基乙酸溶液及N-甲基咪唑溶液而進行。
從固相合成後之固相載體之切出及脫保護，係依照國際公開第2013/027843號記載之方法。亦即，添加氨水溶液及乙醇，靜置片刻後將固相載體過濾，然後，使用氟化四丁基銨進行羥基之脫保護。將所得到之RNA使用注射用蒸餾水溶解，調成期望之濃度。
2.第2單股RNA之合成
合成以下所示之單股RNA(第1圖之鏈II)。該鏈由26個鹼基長構成，對應第2單股RNA。
鏈II：pCAUAUACCPGGUAUAUGCUGUGUGUA(5'-3')(序列編號1)
該單股RNA係依照與上述同樣之方法合成。
3.第3單股RNA之合成
合成以下所示之單股RNA(第1圖之鏈III)。前述鏈由16個鹼基長構成，對應於第3單股RNA。
鏈III：AGCAGAGUACACACAG(5'-3')(序列編號2)
該單股RNA係依照與上述同樣之方法合成。
4.接合
繼而，以16.2μM RNA雙股、50單位/μL T4 RNA連接酶2、50mM Tris-HCl(pH7.5)、2mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP之組成，0.2mL之反應規模進行接合反應。
將上述第1至第3之RNA接合所得到的連結單股RNA示於下述及第4圖。
5'-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACCPGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG-3'(序列編號3、4)
具體而言，首先，以第1之RNA鏈成為5.8Mm，第2之RNA鏈成為5.8μM，第3之鏈成為7.6μM之方式，將500mM Tris-HCl(pH7.5)、20mM MgCl2、10mM DTT、4000μM ATP緩衝液(10x緩衝液)128μL及注射用蒸餾水加入1.5mL試管內，於37℃水浴中靜置10分鐘。然後，將T4 RNA連接酶2(New England BioLabs)以成為上述組成及反應規模之方式添加，並於37℃培養3小時。反應後，將反應液50μL添加至0.2M伸乙二胺四乙酸5μL中，並將此溶液藉由表1之LC條件分析。
HPLC分析之結果，反應後，第1單股RNA、第2單股RNA及第3單股RNA減少，並觀測到停留時間延遲的2支新峰(第5圖)。
將此溶出峰藉由質量分析測定確認分子量時，停留時間小之峰，可確認為由第1單股RNA及第2單股RNA結合而成的第4單股RNA。又，停留時間大之峰，可確認為由第1單股RNA、第2單股RNA及第3單股RNA結合而成的目標連結單股RNA(測定值：17025.4836，理論值17025.4672)。
將反應後之溶液藉由HPLC(波長260nm)分離成各成分，從所得到之層析圖的原料及生成物之面積值分別進行定量。
從其定量值，藉由下述式算出轉化率的結果，轉化率為22%。
轉化率={連結單股RNA量/(第2單股RNA量+第4單股RNA量+連結單股RNA量)}
實施例2
1.第1單股RNA之合成
合成以下所示之單股RNA(第3圖之鏈IV)。該鏈由14個鹼基長構成，對應第1單股RNA。
鏈IV：pGUACUCUGCUUCPG(5'-3')(序列編號5)
該單股RNA係藉由與上述同樣之方法合成。
2.第2單股RNA之合成
合成以下所示之單股RNA(第3圖之鏈V)。該鏈由19個鹼基長構成，對應第2單股RNA。
鏈V：pUACCPGGUAUAUGCUGUGU(5'-3')(序列編號6)
3.第3單股RNA之合成
合成以下所示之單股RNA(第3圖之鏈VI)。該鏈由20個鹼基長構成，對應第3單股RNA。
鏈VI：AGCAGAGUACACACAGCAUA(5'-3')(序列編號7)
4.接合
將藉由上述第1至第3之RNA接合所得到的連結單股RNA示於下述及第6圖。
5'-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACCPGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG-3'(序列編號3、4)
以與上述同樣方式進行接合及分析。
HPLC分析之結果，反應後，第1單股RNA、第2單股RNA及第3單股RNA減少，並觀測到停留時間延遲的2支新峰。
將此溶出峰藉由質量分析測定，確認分子量時，停留時間小之峰，可確認為由第2單股RNA及第3單股RNA結合而成的第4單股RNA。又，停留時間大之峰，可確認為由第1單股RNA、第2單股RNA及第3單股RNA結合成之目標連結單股RNA(測定值：17025.4779、理論值：17025.4672)。
將反應後之溶液藉由HPLC(波長260nm)分離為各成分，從所得到之層析圖的原料及生成物之面積值分別進行定量。
從其定量值，藉由以下之式算出轉化率的結果，轉化率為71%。
轉化率={連結單股RNA量/(第2單股RNA量+第4之單股RNA量+連結單股RNA量)}
實施例3
1.從第1單股RNA及第2單股RNA生成之單股RNA合成
合成以下所示之單股RNA(第3圖之鏈VII)。該鏈由37個鹼基長構成，對應由第1單股RNA及第2單股RNA所生成之RNA。
鏈VII：pCAUAUACCPGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG(5'-3')(序列編號4)
該單股RNA係藉由與上述同樣之方法合成。
2.接合
將由上述第1單股RNA及第2單股RNA所生成之RNA及第3單股RNA(第3圖之鏈III)藉由接合所得到的連結單股RNA示於下述及第6圖。
5'-CAUAUACCPGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG-3'(序列編號3、4)
繼而，將接合反應以16.2μM RNA雙股、50單位/μL之T4 RNA連接酶2、50mM Tris-HCl(pH7.0)、2mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP之組成，並以反應規模21mL進行。
反應後，將反應液使用表2記載之條件，進行管柱層析精製。將所得到之區分(fraction)藉由HPLC分析，將純度90%以上之區分(在層析圖中，相對於檢出之峰之總面積，目的物之峰面積所占的比率成為90%以上之比率的區分)匯集並混合。其結果，可得到純度91%、總產率11%之目的物。又，由於將所得到之試料藉由質量分析測定所測得的結果係與計算值一致，故可確認得到目的物(測定值：17025.4752，理論值：17025.4672)。在其，總產率意指精製接合反應後之生成物所得到的單股RNA之量相對於添加之固相載體之量的比率。前述RNA之量係基於波長260nm之紫外線的吸光度而求得。將吸光度顯示1時的RNA濃度作為33μg/mL所求得之值。
實施例4
1.由第1單股RNA及第2單股RNA所生成之單股RNA合成
合成以下所示之單股RNA(第3圖之鏈VIII)。該鏈由33個鹼基長構成，對應第1單股RNA及第2單股RNA所生成之RNA。
鏈VIII：pUACCPGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG(5'-3')(序列編號4)
該單股RNA係藉由與上述同樣之方法合成。
2.接合
將藉由從上述第1單股RNA及第2單股RNA所生成之RNA及第3之RNA(第3圖、鏈VI)接合，所得到的連結單股RNA示於下述第6圖。
5'-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACCPGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG-3'(序列編號3、4)
繼而，將接合反應以16.2μM RNA雙股、50單位/μL T4 RNA連接酶2、50mM Tris-HCl(pH7.0)、2mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP之組成，並以反應規模19mL進行。
反應後，將反應液使用表2記載之條件，進行管柱層析精製。將所得到之區分藉由HPLC分析，將純度90%以上之區分(在層析圖中，相對於檢出之峰之總面積，目的物之峰面積所占的比率成為90%以上之比率的區分)匯集並混合。其結果，可得到純度94%、總產率11%之目的物。又，由於所得到之試料藉由質量分析測定所測得的結果係與計算值一致，故可確認得到目的物(測定值：17025.4831、理論值：17025.4672)。在此，總產率意指精製接合反應後之生成物所得到的單股RNA之量相對於添加之固相載體之量的比率。前述RNA之量係基於波長260nm之紫外線的吸光度而求得。將吸光度顯示1時的RNA濃度作為33μg/mL所求得之值。
實施例5
1.由第1單股核酸及第2單股核酸生成之單股核酸合成
合成以下所示之單股核酸(第3圖之鏈IX)。該鏈由31個鹼基長構成，對應第1單股RNA及第2單股RNA所生成之RNA。
鏈IX：pCCPGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG(5'-3')(序列編號4)
該單股RNA係藉由與上述同樣之方法合成。
2.第3單股RNA之合成
合成以下所示之單股RNA(第3圖之鏈X)。該鏈由22個鹼基長構成，對應於第2單股核酸。
鏈X：AGCAGAGUACACACAGCAUAUA(5'-3')(序列編號8)
3.接合
將藉由將上述第1至第3之RNA接合所得的連結單股RNA示於下述及第6圖。
5'-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACCPGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG-3'(序列編號3、4)
繼而，將接合反應以16.2μM RNA雙股、50單位/μL T4 RNA連接酶2、50mM Tris-HCl(pH7.0)、2mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP之組成，並以反應規模17mL進行。
反應後，將反應液使用表2記載之條件，進行管柱層析精製。將所得到之區分藉由HPLC分析，將純度90%以上之區分(在層析圖中，相對於檢出之峰之總面積，目的物之峰面積所占的比率成為90%以上之比率的區分)匯集並混合。其結果，可得到純度93%、總產率12%之目的物。又，由於所得到之試料藉由質量分析測定所測得的結果係與計算值一致，故可確認得到目的物(測定值：17025.5004，理論值：17025.4672)。在此，總產 率意指精製接合反應後之生成物所得到的單股RNA之量相對於添加之固相載體之量的比率。前述RNA之量係基於波長260nm之紫外線的吸光度而求得。將吸光度顯示1時的RNA濃度作為33μg/mL所求得之值。
實施例6
1.由第1單股RNA及第2單股RNA所生成之單股RNA合成
合成以下所示之單股RNA(第3圖之鏈XI)。該鏈由30個鹼基長構成，對應於從第1單股RNA及第2單股RNA所生成之RNA。
鏈XI：pCPGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG(5'-3')(序列編號4)
該單股RNA係藉由與上述同樣之方法合成。
2.第3單股RNA之合成
合成以下所示之單股RNA(第3圖之鏈XII)。該鏈由23個鹼基長構成，對應於第2單股RNA。
鏈XII：AGCAGAGUACACACAGCAUAUAC(5'-3')(序列編號9)
3.接合
將藉由將上述第1至第3之RNA接合所得到的連結單股RNA示於下述及第6圖。
5'-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACCPGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG-3'(序列編號3、4)
繼而，將接合反應以16.2μM RNA雙股、50單位/μL T4 RNA連接酶2、50mM Tris-HCl(pH7.0)、2mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP之組成，並以反應規模18mL進行。
反應後，將反應液使用表2記載之條件，進行管柱層析精製。將所得到之區分藉由HPLC分析，將純度90%以上之區分(在層析圖中，相對於檢出之峰之總面積，目的物之峰面積所占的比率成為90%以上之比率的區分)匯集並混合。其結果，得到純度93%、總產率17%之目的物。又，由於所得到之試料藉由質量分析測定所測得的結果係與計算值一致，故可確認得到目的物(測定值：17025.5031，理論值：17025.4672)。其中，總產率意指精製接合反應後之生成物所得到的單股RNA之量相對於添加之固相載體之量的比率。前述RNA之量係基於波長260nm之紫外線的吸光度而求得。其係將吸光度顯示1時的RNA濃度當作33μg/mL所求得之值。
<110> 住友化學股份有限公司(SUMITOMO CHEMICAL COMPANY,LIMITED)
<120> 單股RNA的製造方法
<130> OSP-82361
<140> TW108111274
<141> 2019-03-29
<150> JP2018-069560
<151> 2018-03-30
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鏈II之單股RNA的一部分
<400> 1
<210> 2
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鏈III之單股RNA
<400> 2
<210> 3
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 連結單股RNA之一部分
<400> 3
<210> 4
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 連結單股RNA之一部分
<400> 4 
<210> 5
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鏈IV之單股RNA的一部分
<400> 5 
<210> 6
<211> 14
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鏈V之單股RNA的一部分
<400> 6 
<210> 7
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鏈VI之單股RNA的一部分
<400> 7 
<210> 8
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鏈X之單股RNA
<400> 8 
<210> 9
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鏈XII之單股RNA
<400> 9 
<210> 10
<211> 334
<212> PRT
<213> 噬菌體T4
<400> 10 
<210> 11
<211> 335
<212> PRT
<213> 弧菌噬菌體KVP40
<400> 11 
<210> 12
<211> 342
<212> PRT
<213> 耐輻射奇異球菌
<400> 12 
Claims (20)
- 一種單股RNA之製造方法，該製造方法包含使被分類為國際生化學/分子生物學協會所訂定之酵素編號EC6.5.1.3且具有裂口修復活性的RNA連接酶作用於5’末端具有磷酸基之第1單股RNA及第2單股RNA、以及5’末端具有羥基之第3單股RNA，而將前述第1單股RNA、前述第2單股RNA及前述第3單股RNA連結的步驟，其中，a)前述第1單股RNA為從5’末端側依序由X1區域、W1區域、Lw連接子區域及W2區域所構成的單股RNA，b)前述第2單股RNA為從5’末端側依序由Z2區域、Lz連接子區域、Z1區域及Y1區域所構成的單股RNA，c)前述第3單股RNA為從5’末端側依序由X2區域及Y2區域所構成的單股RNA，d)前述X1區域及前述X2區域包含由彼此互補之2個以上且相同數目的核苷酸所構成的核苷酸序列，e)前述Y1區域及前述Y2區域包含由彼此互補之2個以上且相同數目的核苷酸所構成的核苷酸序列，f)前述Z1區域及前述Z2區域包含由彼此互補之1個以上且相同數目的核苷酸所構成的核苷酸序列，g)前述W1區域及前述W2區域各自獨立地包含任意數目之核苷酸序列，h)前述Lz連接子區域及前述Lw連接子區域各自獨立地為具有從胺基酸衍生之原子團的連接子區域， i)藉由前述第1單股RNA、前述第2單股RNA、前述第3單股RNA之連結所生成的單股RNA係從5’末端側依序由前述X2區域、前述Y2區域、前述Z2區域、前述Lz連接子區域、前述Z1區域、前述Y1區域、前述X1區域、前述W1區域、前述Lw連接子區域及前述W2區域所構成的連結單股RNA。
- 如申請專利範圍第1項所述之製造方法，其中，該Lz連接子區域為下述式(I)所表示的二價基，
- 如申請專利範圍第2項所述之製造方法，其中，前述Lz連接子區域為下述式(I)所表示的二價基，前述Lw連接子區域為下述式(I’)所表示的二價基，
- 如申請專利範圍第2或3項所述之製造方法，其中，前述式(I)所表示的二價基為下述式(II-A)或(II-B)所表示的二價基，
- 如申請專利範圍第3項所述之製造方法，其中，前述式(I’)所表示的二價基係下述式(II-A)或(II-B)所表示的二價基，
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之製造方法，其中，藉由前述第1單股RNA、前述第2單股RNA、及前述第3單股RNA之連結所生成的單股RNA，係在由前述Z1區域、前述Y1區域、前述X1區域及前述W1區域所構成之區域、以及由前述X2區域、前述Y2區域及前述Z2區域所構成之區域中的至少一者，包含抑制基因表現的核苷酸序列。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之製造方法，該製造方法係使下述單股RNA與前述第3RNA反應，其中，該單股RNA係由前述第1單股RNA及前述第2RNA鏈所生成，並且為從5’末端側依序由前述Z2區域、前述Lz連接子區域、前述Z1區域、前述Y1區域、前述X1區域、前述W1區域、前述Lw連接子區域及前述W2區域所構成者。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之製造方法，該製造方法係使下述單股RNA與前述第1RNA反應，其中，該單股RNA係由前述第2單股RNA及前述第3RNA鏈所生成，並且為從5’末端側依序由前述X2區域、前述Y2區域、前述Z2區域、前述Lz連接子區域、前述Z1區域及前述Y1區域所構成者。
- 一種單股RNA之製造方法，該製造方法包含使被分類為國際生化學/分子生物學協會所制定之酵素編號EC6.5.1.3且具有裂口修復活性之RNA連接酶作用於5’末端具有磷酸基之第1單股RNA及第2單股RNA，而將前述第1單股RNA及前述第2單股RNA連結的步驟，其中，a)前述第1單股RNA為從5’末端側依序由Y2a區域、Lz連接子區域、Y1a區域、X1a區域、W1a區域、Lw連接子區域及W2a區域所構成的單股RNA，b)前述第2單股RNA為由X2a區域所構成的單股RNA，c)前述X1a區域及前述X2a區域包含由彼此互補之4個以上且相同數目的核苷酸所構成的核苷酸序列，d)前述Y1a區域及前述Y2a區域包含由彼此互補之1個以上且相同數目的核苷酸所構成的核苷酸序列，e)前述W1a區域及W前述2a區域各自獨立地包含任意數目之核苷酸序列， f)前述Lw連接子區域及前述Lz連接子區域各自獨立地為具有從胺基酸衍生之原子團的連接子區域，g)藉由前述第1單股RNA及前述第2單股RNA之連結所生成的單股RNA，為從5’末端側依序由前述X2a區域、前述Y2a區域、前述Lz連接子區域、前述Y1a區域、前述X1a區域、前述W1a區域、前述Lw連接子區域及前述W2a區域所構成的連結單股RNA。
- 如申請專利範圍第9項所述之製造方法，其中，前述Lz連接子區域為下述式(I)所表示的二價基，
- 如申請專利範圍第9項所述之製造方法，其中，前述Lz連接子區域為下述式(I)所表示的二價基，前述Lw連接子區域為下述式(I’)所表示的二價基，
- 如申請專利範圍第10或11項所述之製造方法，其中，前述式(I)所表示的二價基為式(II-A)或(II-B)所表示的二價基，
- 如申請專利範圍第11項所述之製造方法，其中前述式(I’)所表示的二價基為式(II-A)或(II-B)所表示的二價基，
- 如申請專利範圍第9至11項中任一項所述之製造方法，其中，藉由前述第1單股RNA及前述第2單股RNA之連結所生成的單股RNA，於由前述Y1a區域、前述X1a區域及前述W1a區域所構成之區域、以及由前述X2a區域、前述Y2a區域所構成之區域的至少一者，包含抑制基因之表現的核苷酸序列。
- 如申請專利範圍第1至3、9至11項中任一項所述之製造方法，其中，前述RNA連接酶為來自T4噬菌體之T4 RNA連接酶2、來自KVP40之連接酶2、布魯氏錐蟲(Trypanosoma brucei)RNA連接酶、耐輻射奇異球菌(Deinococcus radiodurans)RNA連接酶、或陶氏利什曼原蟲(Leishmania tarentolae)RNA連接酶。
- 如申請專利範圍第1至3、9至11項中任一項所述之製造方法，其中，前述RNA連接酶為由具有序列編號10、11或12記載之胺基酸序列之胺基酸序列所構成的RNA連接酶。
- 如申請專利範圍第1至3、9至11項中任一項所述之製造方法，其中，前述RNA連接酶為來自T4噬菌體之T4 RNA連接酶2或來自KVP40之RNA連接酶2。
- 如申請專利範圍第1至3、9至11項中任一項所述之製造方法，其中，前述連接酶為來自T4噬菌體之T4 RNA連接酶2。
- 如申請專利範圍第1項所述之製造方法，其中，前述第1單股RNA、前述第2單股RNA及前述第3單股RNA的組合，係下列鏈I、II及III之單股RNA的組合，或下列鏈IV、V及VI之單股RNA的組合；鏈I：pCUCUGCUUCPG鏈II：pCAUAUACCPGGUAUAUGCUGUGUGUA鏈III：AGCAGAGUACACACAG鏈IV：pGUACUCUGCUUCPG鏈V：pUACCPGGUAUAUGCUGUGU鏈VI：AGCAGAGUACACACAGCAUA； 序列中的「p」之簡號表示5’末端之羥基以磷酸基修飾；又，序列中之「P」之簡號係下述結構式(III-A)所表示之使用亞磷醯胺(amidite)所導入之結構，且為以下式表示的結構；
- 如申請專利範圍第9項所述之製造方法，其中，前述第1單股RNA及前述第2單股RNA的組合，係下列鏈III及VII之單股RNA的組合、下列鏈VI及VIII之單股RNA的組合、下列鏈IX及X之單股RNA的組合、或下列鏈XI及XII之單股RNA的組合；鏈III：AGCAGAGUACACACAG鏈VI：AGCAGAGUACACACAGCAUA鏈VII：pCAUAUACCPGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG鏈VIII：pUACCPGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG鏈IX：pCCPGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG鏈X：AGCAGAGUACACACAGCAUAUA鏈XI：pCPGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG鏈XII：AGCAGAGUACACACAGCAUAUAC；序列中的「p」之簡號表示5’末端之羥基以磷酸基修飾；又，序列中之「P」之簡號係下述結構式(III-A)所表示之使用亞磷醯胺(amidite)所導入之結構，且為以下式表示的結構；
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018069560 | 2018-03-30 | ||
| JP2018-069560 | 2018-03-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW202003858A TW202003858A (zh) | 2020-01-16 |
| TWI837122B true TWI837122B (zh) | 2024-04-01 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013103146A1 (ja) | 2012-01-07 | 2013-07-11 | 株式会社ボナック | アミノ酸骨格を有する一本鎖核酸分子 |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013103146A1 (ja) | 2012-01-07 | 2013-07-11 | 株式会社ボナック | アミノ酸骨格を有する一本鎖核酸分子 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6817493B2 (ja) | 一本鎖ｒｎａの製造方法 | |
| AU2017213503B2 (en) | Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof | |
| JP2693643B2 (ja) | キラルリン結合を有するオリゴヌクレオチド | |
| JP2022137068A (ja) | 化学的に修飾されたガイドｒｎａを使用する高特異性ゲノム編集 | |
| US8530640B2 (en) | Bicyclic cyclohexitol nucleic acid analogs | |
| JP6864767B2 (ja) | 核酸分子の製造方法 | |
| EP3702360A1 (en) | Novel processes for the production of oligonucleotides | |
| EP1108724A2 (en) | Synthesis of methoxy nucleosides and enzymatic nucleic acid molecules | |
| US20020068708A1 (en) | Oligonucleotide analogues | |
| CA2989682A1 (en) | Oligonucleotide compositions and methods thereof | |
| JPH11509528A (ja) | 架橋性オリゴヌクレオチド | |
| JP6631751B1 (ja) | ヘアピン型一本鎖ｒｎａ分子の製造方法 | |
| JP6828219B1 (ja) | 核酸分子の製造方法 | |
| TWI837122B (zh) | 單股ｒｎａ的製造方法 | |
| WO2021024467A1 (ja) | 一本鎖ｒｎａの製造方法 | |
| US8981070B2 (en) | Conjugate between a thiophilic solid phase and an oligonucleotide comprising a thiooxonucleotide | |
| EP0931090B1 (en) | Improved chimeric oligonucleotide vectors | |
| Hollenstein | Enzymatic synthesis of base-modified nucleic acids | |
| CN118043460A (zh) | 产品和组合物 | |
| Matthew Piperakis | Synthesis and properties of nucleic acid duplexes and quadruplexes containing 3'-S-phosphorothiolate linkages | |
| JPWO2006043521A1 (ja) | ホスホロチオエート結合を有する光学活性なオリゴ核酸化合物 | |
| JP2002508768A (ja) | ３’−モノリン酸化オリゴヌクレオチド |