JPH11509528A

JPH11509528A - 架橋性オリゴヌクレオチド

Info

Publication number: JPH11509528A
Application number: JP9501849A
Authority: JP
Inventors: メイヤー，リッチ・ビー・ジュニア; ガンパー，ハワード・ビー; カットヤビン，イゴール・ブイ; ゴール，アレキサンダー・エイ; ペトリー，チャールズ・アール; タボーン，ジョン・シー; ハースト，ジェラルド・ディ
Original assignee: エポック・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 1999-08-24
Also published as: US5935830A; WO1996040711A1; AU6103596A; AU709924B2; US5849482A; CA2223584A1; EP0842186A1

Abstract

(57)【要約】オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）は、一本鎖ＲＮＡ、または一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡにおける標的配列に相補的に配列、およびハイブリダイゼーションの後に標的配列をアルキル化するアルキル化官能基を含む。メッセンジャーＲＮＡのごとき一本鎖ＲＮＡをアルキル化するのに適したＯＤＮはワトソンクリックの意味で標的配列に相補的である。二本鎖ＤＮＡをアルキル化するのに適したＯＤＮは少なくとも１つのアルキル化官能基を有し、フーグスティーンまたは逆フーグスィーンの意味で標的配列に相補的である。これらのＯＤＮにて、標的配列の両鎖をアルキル化する。ＯＤＮの第３のクラスは、二本鎖ＤＮＡの標的配列に相補的な連続的配列において少なくともほぼ２６ヌクレオチド単位を有し、アルキル化官能基は連続的配列におけるヌクレオチド単位に共有結合している。このクラスのＯＤＮでのアルキル化または架橋はリコンビナーゼ酵素の存在下で起こる。

Description

【発明の詳細な説明】架橋性オリゴヌクレオチド発明の背景１．関連出願の相互参照本出願は、（１）１９９３年１月２６日に出願された米国出願第０８／０１１,４８２号の一部継続出願である１９９４年１月２７日に出願された米国出願第０８／２２６,０４０号の一部継続出願であり；（２）１９８８年９月２８日に出願された米国特許出願第２５０,４７４号の一部継続出願である、１９８９年５月１８日に出願された米国出願第０７／３５３,８５７号の一部継続出願である１９９３年４月２０日に出願された米国出願第０８／０４９,８０７号の一部継続出願である１９９４年１１月４日に出願された米国出願第０８／３３４,４９０号の一部継続出願であり；（３）１９８８年９月２８日に出願された米国出願第０７／２５０,４７４号の一部継続出願である１９８９年５月１８日に出願された米国出願第０７／３５３,８５７号の一部継続出願である、１９９１年４月２１日に出願された米国出願第０７／７４８,１３８号の一部継続出願てある、１９９４年１月７日出願の米国出願第０８／１７８,７３３号の一部継続出願である。２．発明の分野本発明は、１以上のヌクレオチド単位に共有結合した架橋剤を有し、古典的なワトソンクリックによって、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡの標的配列に対するHo ogsteenまたは逆Hoogsteen対合によって結合できるオリゴヌクレオチドに指向される。本発明の架橋性オリゴヌクレオチドは治療、診断、ＤＮＡマッピングおよび同様の調査または分析目的で利用することができる。３．先行技術の記載オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）は、遺伝子の阻害のための配列特異的医薬剤として大きな可能性を有する。化学的に合成されたＯＤＮは、相補的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とのハイブリダイゼーションに際して、デュプレックスの形成を通じて特異的遺伝子産物の発現を阻害できる。より詳しくは、これらの「アンチセンス」ＯＤＮは、主として、標的ｍＲＮＡ配列のＲＮａｓｅＨ −媒介切断を介してプロセッシングまたはメッセージの翻訳を阻害すると信じられている。この阻害効果のため、アンチセンスＯＤＮは、抗−ウイルス、抗−寄生虫、および抗癌剤として有用であり得る。しかしながら、「アンチセンス」技術は、例えば、ヌクレアーゼ酵素、および細胞による摂取（または摂取の欠乏）によって、アンチセンスＯＤＮの分解に関するある種の基本的不利に悩まされる。それらの特性を改良するためには、修飾された骨格をもつＯＤＮのごとき修飾されたアンチセンスＯＤＮ（オリゴヌクレオシドメチルホスホネートおよびホスホルチオエート）が調製されている。しかしながら、ヌクレアーゼ酵素に対する耐性のごときいくつかの特性の改良は、しばしば、細胞摂取および特異性の喪失のごとき、他の特性に関する有害な効果を有することが見いだされている。アンチセンスＯＤＮの有効性を改良するためのもう１つのアプローチは、ある部位をアンチセンスＯＤＮに共有結合させることを含み、かかる部位はハイブリダイゼーションに際して標的ＲＮＡと直接的に相互作用し、したがって、ＯＤＮのアンチセンス活性を増強される。この点で使用される基はインターカレーティング基、およびハイブリダイゼーション後に標的ＲＮＡと共有結合する基である。抗−遺伝子ＯＤＮ合理的薬物デザインに対する「アプローチ」の変形は「抗−遺伝子」と呼ばれる。アンチセンスＯＤＮ標的一本鎖ｍＲＮＡ、抗−遺伝子ＯＤＮは二本鎖ＤＮＡにハイブリダイズし、その機能を阻害することができる。より詳しくは、抗−遺伝子ＯＤＮは二本鎖ＤＮＡ標的とで配列−特異的三本鎖複合体を形成し、かくして、選択された標的遺伝子の複製または転写に干渉する。知られているように、ある種のＲＮＡウイルスおよび無核酸ウイロイドを除き、休眠プロウイルスＤＮＡゲノムのごとき、調節制御配列および非−発現遺伝子を含めた、ＤＮＡは全ての遺伝情報の貯蔵庫である。対照的に、アンチセンスＯＤＮについての標的、ｍＲＮＡはＤＮＡにコードされた情報の非常に小さなサブセットを表す。かくして、抗−遺伝子ＯＤＮは広い適用可能性を有し、単にｍＲＮＡプロセッシングおよび翻訳を阻害するアンチセンスＯＤＮよりも潜在的により強力である。生細胞の核における抗−遺伝子ＯＤＮは染色体ＤＮＡとで配列−特異的複合体を形成できる。得られたトリプレックスは標的二本鎖ＤＮＡの制限および／または転写を阻害することが示されている。２つの標的核酸種（すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡ）の既知の安定性に基づき、ＤＮＡ機能との抗−遺伝子干渉はｍＲＮＡ機能の対応するアンチセンス阻害よりも長期に持続する効果を有する。前記したごとく、抗−遺伝子療法は、ある種の条件下では、ＤＮＡは三本鎖複合体を形成し得るという観察に基づく。これらの三本鎖複合体においては、第３の鎖は、ワトソン−クリック塩基対合二重ラセンの主要溝に存在し、そこでは、それは２つの親鎖のうちの１つと水素結合する。結合暗号は、第３の塩基による塩基対合の認識を支配する(後記トリプレット、Hoogeteenまたは逆Hoogeteen対合参照)。各場合において、第３の鎖の塩基がまず提示され、ワトソン−クリックデュプレックスにおける塩基対合が続き、トリプリット：Ａ−Ａ−ＴＧ−Ｇ−ＣＴ−Ａ−ＴＣ−Ｇ−Ｃが可能となる。この塩基対合認識暗号のある種の制限は可能となったトリプリットから明らかである。まず、Ｔ−ＡおよびＣ−Ｇ塩基対の認識に対して能力はない；よって、三重鎖形成はデュプレックスの１つの鎖のプリン塩基および他の鎖のピリミジン塩基の試行に制限される。換言すれば、第３の鎖またはＯＤＮはデュプレックスの１つの鎖にのみ結合し、プリンに対してのみ結合できる。第２に、もしシトシンが第３の鎖に存在すれば（「Ｃ」）、それはプロトン化されて、Ｇ−Ｃ塩基対のギアニンに水素結合できなければならない。シトシンのプロトン化についてのｐＫａは４.６であり、これは、生理学的ｐＨにおいて、Ｃ−Ｇ−Ｃ三連構造の安定性が損なわれるようであることを示唆する。第３に、全ての場合において、三連構造は、第３鎖塩基およびデュプレックス塩基対のプリン残基の愛だの２つの水素結合によって維持される。従って、三本鎖複合体は、一般に、プリンおよびピリミジン対の間の２つの（Ａ−Ｔ）または３つの（Ｇ−Ｃ）水素結合の組合せによって維持される親二本鎖ＤＮＡ（ワトソン−クリックモチーフ）よりも不安定である。前記したごとく三本鎖形成の重要な不利は三本鎖形成の相対的に遅い反応速度である。しかしながら、三本鎖形成は、現実的には細胞において普遍的であって、その存在が当該分野でよく知られているリコンビナーゼ酵素によって細胞において触媒され得る。三本鎖形成のかなり速い速度に加えて、リコンビナーゼ酵素で触媒された三本鎖形成は、（非酵素−媒介三本鎖形成に関連したＡ−ＴおよびＧ−Ｃ認識制限とは対照的に）普遍的配列認識の利点を供する。より詳しくは、リコンビナーゼ酵素−媒介認識モチーフは全ての４種の塩基対を認識し、それにより、いずれの二本鎖ＤＮＡ配列の標的化も可能とする。第２に、リコンビナーゼ酵素および一本鎖ＯＤＮの間に形成された複合体である核蛋白質フィラメントは、小さい裸の抗−遺伝子ＯＤＮが行うよりも、かなり効果的な標的二本鎖ＤＮＡ相同性を探し、かくして、効率的な三本鎖複合体形成に必要な抗−遺伝子ＯＤＮの濃度を低下させる。第３に、酵素−媒介認識に関与する水素結合パターンおよび新規ラセン捩れのため、得られた三本鎖複合体は生理学的ｐＨで安定である。第４に、細胞組換え経路が利用されているので、高次クロマチン構造の該ＤＮＡは標的化のために接近できるであろう。遺伝子発現のレギュレーターとして、および化学治療剤としての配列−特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる概念の最初のデモンストレーションは、ZamecnikおよびStephenson(Proc．Natl．Acad．Sci．USA 75:280(1978))によって記載されている。これらの著者らは、小さいアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドプローブは細胞培養におけるラウス肉腫ウイルスの複製を阻害でき、また、ＲＳＶウイルスＲＮＡ転写はこれらの条件下で阻害されることを示した (Stephensonら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 75:285(1978))。また、Zamecnik ら（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83:4143(1986)）は、ＨＩＶゲノムの一部に相補的なオリゴヌクレオチドは細胞培養において蛋白質発現およびウイルス複製を阻害できることを示している。９５％までの阻害が、約７０μＭのオリゴヌクレオチド濃度で得られた。重要なことには、彼らは、オリゴヌクレオチドは無傷細胞に侵入し、代謝に対して合理的に安定であることを標識したホスフェート実験に関して示した。架橋性アームを持つ標的配列へＯＤＮを結合させるごとき）阻害剤分子を標的に共有結合させる概念は、化学療法適用において「活性−部位−特異的酵素阻害剤」と言われるものを使用した、B．R．Baker，「Design of Active-Site-Direc ted Irreversible Enzyme Inhibitors」，Wiley，New York(1967)のパイオニア業績に関する。架橋をオリゴヌクレオチドに取り込む概念は、幾人かの著者によって時々議論されてきた。例えば、KnorreおよびValssov，Prog．Nucl．Acid Re s．Mol．Biol．32:291(1985)は、オリゴヌクレオチドの３’−または５’−末端いずれかに結合したＮ−（２−クロロエチル）−Ｎ−メチルアニリン基を用い、配列−指向性架橋（「相補的アドレスト修飾」）を議論している。SummertonおよびBartlett，J．Mol．Biol.，122:145(1978)は、そのＣ−４位でシトシン残基に付着し、高度に反応性のブロモメチルケトン基で終わる８−原子鎖がグアノシンのＮ−７に架橋できることを示した。WebbおよびMatteucci，Nucleic Acids R es.，14:7661(1986))は、相補的鎖とゆっくりとした架橋ができる５−メチル− Ｎ，Ｎ−エタノシトシンを含有するオリゴヌクレオチドを調製した。ＤＮＡハイブリッド内のリンカーアームを介する概念的に関連するアルキル化において、Iv ersonおよびDervan，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85:4615(1988)は、圧倒的に、リンカーを担う塩基からのグアニン塩化に位置する２つの対に対して、メチルチオエーテルのＢｒＣＮ活性化によってトリガーされる、対向鎖メチル化を示した。Vlassovら，in Gene 72（1988）313-322は、配列特異的結合、およびプラスミドＤＮＡの、２−クロロエチル−Ｎ−メチルアミノフェニル残基を含有するオリゴヌクレオチド誘導体でのアルキル化を記載する。異なる架橋剤を用いる同様の架橋がShawら，J．Am．Chem．Soc.，1991，113，7765-7766によって記載された。ＯＤＮ、化学的に修飾されたＯＤＮおよびＤＮＡまたはＲＮＡの標的配列の複製または翻訳に影響するまたはそれを阻害するそれらの能力は欧州特許出願８６３０９０９０.８、ＰＣＴ国際公開ＷＯ８７０７６１１、米国特許第４,５９９, ３０３号、ＥＰ０２５９１８６、ＰＣＴ国際公開ＷＯ８５０３０７５、独逸特許ＤＥ３３１０３３７、および刊行物Plakeら，Biochemistry 24:6137(1985);Um laufら，「Triple-helical DNA Pairing Intermediates Formed by recA Protein」，Biol．Chem.，265(28)，16898-16912(1990);およびThuongら，「Chemical syn thesis of natural and modified oligodeoxynucleotides」，Biochemie，1985， 67，673-684に見い出すことができる。ＤＮＡマッピングＯＤＮまたは修飾したＯＤＮを利用する化学療法または潜在的化学療法に加えて、ＤＮＡマッピング（遺伝子マッピング）のために、すなわち、ＤＮＡ配列または部分的ＤＮＡ配列のイン・ビトロ決定のための、広い分野が先行技術で開発されている。かかるＤＮＡ配列決定（遺伝子マッピング）における重要な工程は、標的ＤＮＡのより小さい断片への切断である。本発明の修飾されたＯＤＮこの分野でも利用性を有する。発明の概要（１）１つの態様において、本発明は、内部または末端ヌクレオチド単位へと、オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つの架橋剤を有し、単一の標準的標的配列に十分相補的な塩基配列を有して、標的配列とでワトソン−クリック結合複合体を配列特異的に形成し、しかる後、標的配列と共有結合的に反応するオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）に関する。かかるＯＤＮは（メッセンジャーＲＮＡを標的とする）アンチセンス剤および診断および分析目的の配列特異的プローブとして治療目的で使用できる。（２）第２の態様において、本発明は、内部または末端ヌクレオチド単位へと、オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも２つの親電子架橋剤を有し、かつ二本鎖ＤＮＡにおける標的配列に対してフーグスティーン（Hoogsteen）または逆フーグスティーン（Hoogsteen）対合の意味において相補的であるＯＤＮに関する。該２つの架橋剤はＯＤＮの２つの異なる部位に結合することができる。別法として、ＯＤＮの一方側に結合した架橋剤は２つの架橋性官能基を有し、従って、効果的には、２つの架橋剤よりなる。本発明のこの態様により構築したＯＤＮは、二本鎖ＤＮＡの標的配列とで（フーグスティーン（Hoogsteen）または逆フーグスティーン（Hoogsteen）の意味において）配列特異的三本鎖複合体を形成し、架橋剤は標的ＤＮＡ配列の両ストランドで求核部位と反応する。本発明のこの態様によるＯＤＮは、ウイルス、菌類、寄生虫、細菌または悪性細胞のごとき、侵入する細胞、生物または病原体のＤＮＡを標的化する抗−遺伝子（化学療法）剤として有用である。また、本発明の本態様によるＯＤＮは、ＤＮＡ配列決定、遺伝子マッピングおよび関連するイン・ビトロ分析および診断手法のためのツールとしても有用である。従って、標的ＤＮＡは配列決定すべき（「マッピングすべき」）またはイン・ビトロで分析もしくは調査すべき遺伝子または他のデュプレックスであってよい。（３）第３の態様において、本発明は、二本鎖ＤＮＡにおける標的配列と相同な少なくともほぼ２６ヌクレオチド単位を実質的に連続的配列において有するＯＤＮに関する。（当業者ならば、二本鎖ＯＤＮの１つのストランドの標的配列に相同なＯＤＮの配列がＤＮＡのおける同一標的配列の第２ストランドに対してもワトソン−クリックの意味において相補的であることを容易に理解するであろう）。本発明の本態様によるＯＤＮは、内部または末端ヌクレオチド単位へと、オリゴヌクレオチドに共有結合した１以上の親電子架橋剤を有する。イン・ビトロにおいては、およびリコンビナーゼ酵素の存在下において、これらのＯＤＮは、全長の「４文字暗号」ワトソン−クリックタイプの認識モチーフに基づいて二本鎖ＤＮＡの標的配列とで配列特異的複合体およびＤＮＡの少なくとも１つのストランドとで架橋を形成することができる。また、イン・ビボにおいては、細胞におけるリコンビナーゼ酵素の存在のため、本発明の本態様によるＯＤＮは、二本鎖ＤＮＡの標的配列とで複合体および標的の少なくとも１つのストランドとで架橋を形成する。本発明の本態様では、架橋性官能基は好ましくはＯＤＮの内部にあるヌクレオチド単位に結合する。架橋性官能基は、典型的には、（アルキル、アルコキシ、アミノアルキルまたはアミドアルキル鎖のごとき）リンカーアームおよび、ＤＮＡまたはｍＲＮＡの標的配列とで複合体化した後、標的ＤＮＡと反応してそれとの共有結合を形成できる親電子反応性基を含む。修飾されたＯＤＮおよび標的配列との間の共有結合形成の結果、標的配列の複製および／または発現は阻害され、あるいは、診断またはマッピング適用においては、標的を「標識し」、あるいは切断用の部位を創製する。共有結合した架橋剤を有することに加えて、本発明のＯＤＮは、天然に生じるリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドに対して、糖ならびにリン酸部位の、複素環塩基の修飾のごとき、他の修飾を有することもできる。架橋剤は複素環塩基、糖または修飾糖、またはリン酸または修飾リン酸部位に結合させることができる。発明の詳細な記載一般的具体例当該分野で知られているように、オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）は、リン酸エステル結合によって相互に結合したヌクレオチドの鎖よりなる。各ヌクレオチドは、典型的には、複素環塩基（核酸塩基）、該複素環塩基に結合した糖部位、および該糖部位のヒドロキシル官能基をエステル化するリン酸部位よりなる。主要な天然に生じるヌクレオチドは、複素環塩基としてのウラシル、またはチミジン、シトシン、アデノシンおよびグアニン、および糖部位としてのリボースおよびデオキシリボースを含む。塩基ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの構造化学の前記した簡単な要約を記載したのは、本発明の広い意味では、後記にて詳細に記載するごとく、少なくとも１つの化学的架橋剤基は、ＲＮＡ、一本または二本鎖ＤＮＡの標的配列に相補的なオリゴヌクレオチドに結合するからである。本発明のオリゴヌクレオチドは（唯一のまたは主要な糖成分としてリボースを含有する）リボヌクレオチド、（主要糖成分としてデオキシリボースを含有する）デオキシリボヌクレオチドを含むことができ、確立された技術水準において、修飾された糖または糖アナログを本発明のＯＤＮに取り込むことができる。かくして、リボースおよびデオキシリボースに加えて、糖部位はペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、グルコース、アラビノース、キシロース、リキオース、および糖「アナログ」シクロペンチル基であってよい。該糖はピラノシルまたはフラノシル形態であってよい。本発明の修飾されたＯＤＮにおいて、糖部位は、好ましくは、リボース、デオキシリボース、アラビノース、２−フルオロ−２−デオキシリボースまたは２−Ｑ−メチルリボースのフラノシドであり、糖はαまたはβアノマー立体配置にて各複素環塩基に結合することができる。これらの糖または糖アナログの、およびかかる糖またはアナログが複素環塩基（核酸塩基）に結合した各「ヌクレオチド」の調製は自体公知であり、かかる調製を１以上の特別の実施例にて供する程度以外は本明細書に記載する必要がない。好ましくは、糖部位はリボフラノース、２−デオキシリボフラノースまたはβ立体配置の２−フルオロ−２−デオキシリボフラノースである。本発明の修飾されたオリゴヌクレオチドにおける糖または糖アナログ部位に結合できるリン誘導体（または修飾されたリン酸基）は、モノホスフェート、アルキルホスフェート、アルカンホスフェート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等であり得る。前記リン酸アナログの調製、およびそれらのヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドおよびＯＤＮへのそれらの取り込みは、それ自体公知であり、本明細書に記載する必要がない。好ましくは、本発明の治療オリゴヌクレオチドに取り込まれたリン酸誘導体は「単純な」リン酸であり、これはヌクレオチド結合間でリン酸ジエステルを形成し、本発明の修飾されたＯＤＮの３’ および５’末端において架橋剤を担うことができる。この点に関し、リコンビナーゼ酵素はかかる「単純な」リン酸およびデオキシリボース骨格を認識することな注意されたし。架橋剤は実質的に後記にて説明する。本発明の修飾されたＯＤＮに取り込まれる複素環塩基、または核酸塩基は天然に生じる主要なプリンおよびピリミジン塩基（すなわち、前記したウラシル、またはチミジン、シトシン、アデニンおよびグアニン）、ならびに該主要塩基の天然に生じるおよび合成修飾であってもよい。当業者ならば、種々の複素環塩基および種々の糖部位（および糖アナログ）を含む非常に多数の「合成」非天然ヌクレオシドは先行技術で利用可能となり、適用されるワトソン−クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーンの意味において適用される、ＲＮＡまたはＤＮＡの標的配列に「相補的」であるごとき）本発明の他の基準が満足される限り、本発明の新規ＯＤＮは天然に生じる核酸の主要な５つの塩基成分以外の１または数個の複素環塩基を含み得ることを認識するであろう。しかしながら、好ましくは、本発明の修飾されたＯＤＮにおける複素環塩基はウラシル−５−イル、シトシン−５−イル、アデニン−２−イル、アデニン−７−イル、アデニン−８ −イル、グアニン−７−イル、グアニン−８−イル、４−アミノピロロ［２，３ −ｄ］ピリミジン−５−イル、２−アミノ−４−オキソピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル、４−アミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル、または４−アミノ−６−オキソピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル基から選択され、ここに、プリンは９−位を介してオリゴヌクレオチドの糖部位に結合し、ピリミジンは１−位を介して、ピロロピリミジンは７−位を介して、およびピラゾロピリミジンは１−位を介してオリゴヌクレオチドの糖部位に結合する。本発明において取り込まれる架橋剤は、（１）各架橋剤はＯＤＮ上の部位に共有結合しなければならず、（２）その長さおよび立体配位は、（酵素の助けられまたは助けなくして）、ＯＤＮが標的とハイブリダイズしまたはそれと複合体化した後に、標的配列における適当な反応部位にそれが到達できるようなものでなければならず、（３）標的配列の反応性基と反応する反応性基を有しなければならないという要件を満たす必要がある。前記したごとく、架橋剤は、ＯＤＮの複素環塩基に、糖または修飾された糖残基に、またはリン酸または修飾されたリン酸官能基に共有結合することができる。架橋剤のＯＤＮへのいずれの共有結合も、および２以上の架橋剤のＯＤＮへの共有結合のいずれの組合せも本発明の広い範囲内のものである。単純な言葉では、架橋剤それ自体は概念的には２つの群または部位に分けることができ、すなわち、典型的にはかつ好ましくは親電子脱離基（Ｌ）である反応性基、およびＯＤＮ上の各部位に脱離基Ｌを結合させる「アーム」（Ａ）である。脱離基Ｌは、例えば、クロロ、ヨード、ＳＯ₂Ｒ"'、またはＳ⁺Ｒ"'Ｒ""のごとき基から選択することができ、ここに、Ｒ"'およびＲ""の各々は独立してＣ_1-6アルキルまたはアリールであるか、あるいはＲ"'およびＲ""は一緒になってＣ_1-6 アルキレンブリッジを形成する。クロロ、ブロモおよびヨードが好ましい。これらの基の中では、−ＣＯＣＨ₂Ｉのごときハロアセチル、−Ｎ−［（ＣＨ₂）₂− Ｃｌ］₂のごとき「窒素マスタード」が好ましい。脱離基はその脱離能力によって改変されるであろう。特定の脱離基の性質および反応性に応じて、使用すべき基が各々の場合に選択されて、不可逆的結合プローブの所望の特異性を与える。前記したごとく「アーム」（またはリンカーアーム）Ａは概念的には脱離基ＩにＯＤＮを共有結合させる単一の存在と見ることができ、かつＯＤＮに対する所望の距離および立体的位置に脱離基Ｌを維持するが、実際的には、「アーム」Ａは合成スキームに従って構築することができ、ここに、二官能性分子はその最初の官能基を介して（例えば、３’または５’末端に対するリン酸エスチル結合によって、あるいは複素環塩基に対する炭素−対−炭素結合によって）ＯＤＮに共有結合し、また、その第２の官能基（例えば、アミン）を介して、脱離基を担持する「ヒドロキシカルボニルブリッジ」（アルキルブリッジ、アルキルアリールブリッジまたはアリールブリッジ等）にも共有結合される。かくして、架橋性官能基の一般式は−Ａ−Ｌ、または−Ａ−Ｌ₂であり、ここに、Ｌは前記定義の脱離基であって、ＡはＯＤＮに共有結合した部位である。Ａ「アーム」部位それ自体は標的ＤＮＡ配列とＯＤＮとのハイブリダイゼーションの条件下で非反応性（脱離基Ｌを介する以外）であるべきで、脱離基Ｌを、所望の立体障害位置および標的配列におけるグアノシン残基のＮ−７位のごとき反応の所望の部位から所望の距離に維持するべきである。一般的にいって、Ａ基の長さはほぼ２ないし５０個の炭素の通常のアルキル鎖の長さと等しくあるべきである。架橋官能基の好ましい具体例のクラスについてのより特異的式の例は、 −（ＣＨ₂）_q−Ｙ−（ＣＨ₂）_m−Ｌであり、ここに、Ｌは前記した脱離基であり、ｍおよびｑの各々は独立して包括的に０ないし８であり、ここに、Ｙは「官能性連結基」と定義される。「官能性連結基」は２個の官能基、例えば、−ＮＨ₂および−ＯＨ、または−ＣＯＯＨおよび−ＯＨ、または−ＣＯＯＨおよび−ＮＨ₂を有する基であり、該官能基は（ＣＨ₂）_qおよび（ＣＨ₂）_mブリッジを連結できる。また、アセチレン末端（ＨＣ ≡Ｃ−）はＹの前駆体として適当な官能基である。何故ならば、それは後記するごとく、ある種の複素環にカップリングさせ、しかる後に水素化できるからである。架橋剤の好ましい具体例の他の例およびより特別の式は、 −（ＣＨ₂）_q−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ₂）_m−（Ｘ）_n−Ｎ（Ｒ₁）−（ＣＨ₂）_p− Ｌ、および −（ＣＨ₂）_q’−Ｏ−（ＣＨ₂）ｑ”−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ₂）_m−（Ｘ）_n−Ｎ（Ｒ₁）−（ＣＨ₂）_p−Ｌであり、ここに、ｑ、ｍおよびＬは前記定義に同じであり、ｑ’は包括的に３ないし７であり、ｑ”は包括的に１ないし７であり、Ｘはフェニルまたは（クロロ、ブロモ、低級アルキルまたは低級アルコキシ置換フェニルのごとき）単純に置換フェニルであり、ｎは０または１であり、ｐは１ないし６の整数であり、Ｒ₁ はＨ、低級アルキルまたは（ＣＨ₂）_p−Ｌである。好ましくは、ｐは２である。当業者ならば、構造−Ｎ（Ｒ₁）−（ＣＨ₂）₂−Ｌは優れたアルキル化剤のクラスである「窒素マスタード」を記載することを認識するであろう。本発明の範囲内にある特に好ましいものは、修飾された−ＯＤＮであり、ここに、架橋剤は官能基−Ｎ（Ｒ₁）−（ＣＨ₂）₂−Ｌを含み、ここに、Ｌはハロゲン、好ましくは塩素であり；より好ましいのは修飾されたＯＤＮであり、ここに、架橋剤は基− Ｎ−［（ＣＨ₂）₂−Ｌ］₂）（「官能性」Ｎ−マスタード）を含む。架橋剤の特に好ましい部分構造は基： −ＣＯ−（ＣＨ₂）₃−Ｃ₆Ｈ₄−Ｎ−［（ＣＨ₂）₂Ｃｌ］₂− を含む。特に好ましい具体例において、前記架橋性基は、以下の式：Ｒ’−Ｏ−（ＣＨ₂）₆−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ₂）₃−Ｃ₆Ｈ₄−Ｎ−［（ＣＨ₂）₂ Ｃｌ］₂ ［式中、記号Ｒ’はＯＤＮの５’および３’末端を表す］を持つ、ＯＤＮの５’および３’にテイルを担持するｎ−ヘキシルアミンに結合される。特に（２’−デオキシウリジンの５−位に対するごとき）オリゴヌクレオチドにおける複素環に結合した場合、Ａ−Ｌ基の他の例は３−ヨードアセトアミドプロピル、３−（４−ブロモブチルアミド）プロピル、４−ヨードアセトアミドブチルおよび４−（４−ブロモブチルアミド）ブチル基である。他の好ましい具体例において、架橋性官能基は複素環塩基に、例えば、ＯＤＮのブロックを形成する２’−デオキシウリジン酸のウラシル部位に共有結合する。該結合はアミノ基の仲介により起こり、すなわち、「アーム−脱離基組合せ」（Ａ−Ｌ）はＯＤＮの５−アミノ−２’−デオキシウリジン酸形成単位に結合させることができる。さらに他の好ましい具体例において、「アーム−脱離基組合せ｝（Ａ−Ｌ）は炭素−対−炭素結合によってＯＤＮの２’−デオキシウリジン酸形成単位に結合させる。一般に、５−置換−２’−デオキシウリジンは、反応図式１に示すごとく、Robinsら(Can．J．Chem．60:554(1982); J．Org．Chem．4 8:1854(1983))の一般的手法の適用によって得ることができる。この適用によると、置換１−アルキンの５−ヨード−２’−デオキシウリジンへのパラジウム− 媒介カップリングによりアセチレンがカップリングした生成物を得る。該アセチレンｄＵｒｄアナログを例えばラネーニッケルで還元して飽和化合物が得られ、これを、次いで、後記する自動ＤＮＡ合成器で用いる試薬への直接変換で用いる。反応図式１において，ｑは前記定義に同じであり、Ｙ’はＹ（前記定義）またはＹの適当に保護された誘導体である。Ｙ’は保護されたアミンのごとき適当に保護された求核官能基で終わる基としても定義できる。この反応図式において５ −ヨード−２’−デオキシウリジンにカップリングさせることができる試薬の例はＨＣ≡ＣＣＨ₂ＯＣＨ₂ＣＨ₂Ｎ（ＣＯ）₂Ｃ₆Ｈ₄（フタルイミドエトキシプロピン）、ＨＣ≡ＣＣＨ₂ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨＣＯＣＦ₃（トリフルオロアセトアミドエトキシプロピン）、ＨＣ≡ＣＣＨ₂Ｎ（ＣＯ）₂Ｃ₆Ｈ₄（フタルイミドプロピン）およびＨＣ≡ＣＣＨ₂ＮＨＣＯＣＦ₃（トリフルオロアセトアミドプロピン）である。これらの例において、本反応図式で得られるヌクレオシドを所望のＯＤＮに取り込み、架橋剤のアルキル化部分を、各フタルまたはトリフルオロアセチルブロッキング基の除去後のみに「Ｙ」の末端アミノ基に結合させる。「アーム−脱離基組合せ」（Ａ−Ｌ）のもう１つの特に好ましい例は、ＯＤＮの５−（３−アミノプロピル）−２’−デオキシウリジン形成単位のアミノ官能基への、窒素−マスタードタイプのアルキル化剤（または他のアルキル化剤）の結合である。５−（３−アミノプロピル）−２’−デオキシウリジンヌクレオシド部位を含むＯＤＮ合成用の適当なヌクレオチド形成単位は、Meyerら，J．Am． Chem．Soc．1989,111,8517の教示により、反応図式１と同様にして得ることができる。この特に好ましい具体例において、５−（３−アミノプロピル）−２’− デオキシウリジン部位を有するヌクレオチドをルーチン的合成によってＯＤＮに取り込み、２，３，５，６−テトラフルオロフェニル−４’［ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルブチレート（クロラムブシル２，３，５，６−テトラフルオロフェニルエステル；クロラムブシル自体は商業的に入手可能である）のごとき「窒素マスタード」の活性化形態とＯＤＮとを反応させることによって、架橋性官能基を導入する。架橋剤が複素環塩基に結合されるヌクレオチドの他の例は２’−デオキシ−４ −アミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン誘導体である。これらの誘導体の一般的構造は式１にて後記する。Ａ−Ｌは前記したごとく架橋剤の「アーム」および「脱離基」を表す。Ｒ₁は前記した糖部位を表し、Ｒ₄およびＲ₆は独立してＨ、ＯＲ、ＳＲ、ＮＨＯＲ、ＮＨ₂またはＮＨ（ＣＨ₂）_tＮＨ₂であり、ここに、ＲはＨまたはＣ_1-6アルキル、ｔは０ないし１２である。これらの化合物は出典明示して本明細書の一部とみなすKobnayashi，in Chem．Phar．Bull．21:941-951( 1973)の教示に従い、３，４−ジ置換および３，４，６−トリ置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンから作成できる。本発明の修飾されたＯＤＮの構造につきさらに一般的に言及すると、ボール− およびスティックモデルおよび高分解能コンピューターグラフィックスによる二本鎖ＤＮＡの精査により、プリンの７位およびピリミジンの５位は二本鎖核酸のＢ−形成デュプレックスの主要溝に存在することが示される。これらの位置は、塩基のハイブリダイゼーション特性に干渉することなく、かなりの嵩の側鎖で置き換えることができる。これらの側鎖アームは、ｄＴｈｄまたはｄＣｙｄの誘導体化によって、または複素環塩基の直接的全合成、続いての糖鎖付加によって導入することができる。これらの修飾されたヌクレオシドは、自動ＤＮＡ合成器でのオリゴヌクレオチドへの取り込みのために、適当に活性化されたヌクレオチドに変換することができる。アデニンのアナログであるピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンでは、架橋性アームをプリンの７位と同等の３位に結合させる。架橋性側鎖（アーム＝Ａ）はプリン７または８位から主要溝を横切ってピリミジン５位、ピロロピリミジン５位またはピラゾロピリミジン３位に到達し、修飾されたアナログを含有する塩基対上（オリコーマー３’側）に位置するプリン（好ましくはグアニン）のＮ−７と反応するのに十分な長さであるべきである。架橋性側鎖（アーム＝Ａ）は、塩基が二本鎖複合体内のもう１つの塩基と対合する場合、塩基から話して官能基を保持する。前記したごとく、広くは、アームＡは２ないし５０個の炭素の通常のアルキルと同等の長さである。好ましくは、アームは１ないし１２個の炭素原子のアルキレン基、２ないし１２個の炭素原子および１ないし２個のオレフィン結合のアルケニレン基、２ないし１２個の炭素原子および１または２個のアセチレン結合のアルキニレン基、あるいは末端の地点がオキシ、チオ、アミノまたはその化学的にブロックされた誘導体（例えば、トリフルオロアセトアミド、フタルイミド、ＣＯＮＲ’、ＮＲ’ＣＯおよびＳＯ₂ＮＲ’、ここに、Ｒ’＝ＨまたはＣ_1-6アルキル）のごとき求核基で置換された基を含む。脂肪族または芳香族アミンを含めたかかる官能基は、求核特性を呈し、例示的架橋性官能基の成分として前記した −（ＣＨ₂）_m−Ｌ、 −ＣＯ−（ＣＨ₂）_m−（Ｘ）_n−Ｎ（_R１）−（ＣＨ₂）_p−Ｌ、および −ＣＯ−ＣＨ₂−Ｌのごとき基への結合地点として働くことができる。（ＹがＮＨ₂のごとき求核基で終わる−（ＣＨ₂）_q−ＮＨ₂または−（ＣＨ₂）_q −Ｙ基のごとき）、架橋性官能基Ａ−Ｌ、またはその適当に前駆体を担持するヌクレオシドまたはヌクレオチド単位を調製した後、本発明の修飾されたオリゴヌクレオチドのさらなる調製を技術水準に従って進めることができる。かくして、オリゴヌクレオチドを調製するには、保護された基をヌクレオシドまたはヌクレオチドに導入し、該化合物をオリゴヌクレオチドの合成で使用するために活性化する。保護され活性化された形態への変換は、いくつかのレビューに詳説されている２’−デオキシヌクレオシドにつき記載されている手法に従う。Sonveaux， Bioorganic Chemistry，14:272-325(1986); Jones，in「Oligonucleotide Synth esis，a Practical Approach」，M.J．Gait編，IRL，Press，23-34(1984)参照。正しいヌクレオチドが順次に結合されて、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ注のヌクレオチドの配列に相補的にヌクレオチド鎖を形成する点で、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドについてのものと同様に、活性化されたヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに取り込む。ヌクレオチドは酵素によりまたは化学合成を介して取り込むことができる。ヌクレオチドは、「Oligonucleotide Synthesis；A Practical Ap proach」,前掲中の手法に従い、それらの５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’− （Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミドシアノエチルエステル誘導体に変換し、合成オリゴヌクレオチドに取り込む。次いで、当該分野で一般的に知られた手法により合成後アミノリシスによって、Ｎ−保護基を、他のオリゴヌクレオチドブロッキング基とともに除去する。好ましい具体例において、使用する特定の合成器の手法および指示に従い、活性化されたヌクレオチドを直接自動ＤＮＡ合成器で使用することができる。オリゴヌクレオチドは、標準的な商業的ホスホルアミドまたはＨ−ホスホネート化学を用い、合成器で調製することができる。ハロアシル基（ＣＯ−ＣＨ₂−Ｌ、ここに、Ｌは実施例１についてのハロゲン）または−ＣＯ−（ＣＨ₂）_m−（Ｘ）_n−Ｎ（Ｒ₁）−（ＣＨ₂）_p−Ｌ基（より好ましくは、ＣＯ−（ＣＨ₂）₃−Ｃ₆Ｈ₄−Ｎ−［ＣＨ₂ＣＨ₂Ｃｌ］₂）のごとき脱離基を含有する部位を、オリゴヌクレオチドへの取り込みおよびすべてのブロッキング基の除去に従い、アミノアルキルまたは基（（ＣＨ₂）_p−Ｙ）に付加することができる。例えば、α−ハロアセトアミドの付加は、アミノ基の正の電荷の除去に対応する、ＨＰＬＣでの修飾化合物の変化した移動によって、および２−アミノエタンジオールとの反応によって元のアミノカルキル−オリゴヌクレオチドと同様の逆相ＨＰＬＣ移動度を持つ誘導体を得る正の電荷の引き続いての再付加によって確認することができる。例えば、式−（ＣＨ₂）_q−Ｙ（Ｙはアミンで終わる）によって架橋剤（Ａ−Ｌ部位）がオリゴヌクレオチドの３’および５’末端に結合される状況において、オリゴヌクレオチド合成を行ってまず該アミノアルキルテイルを持つオリゴヌクレオチドが得られ、次いで、これに前記したハロアシル基（ＣＯ−ＣＨ₂−Ｌ）または−ＣＯ−（ＣＨ₂）_m−（Ｘ）_n−Ｎ（Ｒ₁）−（ＣＨ₂）_p−Ｌのごときアルキル化部位を導入する。一般的には、本発明のオリゴヌクレオチドはほぼ３０００までのヌクレオチドを含むことができるが、後記するごとくより短いオリゴヌクレオチドが好ましい。アンチセンス療法用の架橋正オリゴヌクレオチドおよび一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ用のプローブの適用本発明の第１の広い態様において、本発明のＯＤＮを用いて、メッセンジャーＲＮＡのごとき一本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡと架橋結合でハイブリダイズさせる。デュプレックス形成およびメッセンジャーＲＮＡとの架橋は、メッセンジャーＲＮＡを不能とすることによって、それが蛋白質の合成の結果となる遺伝子発現を阻害する点で、治療目的（アンチセンス）で供することができる。イン・ビトロ系におけるハイブリダイゼーションおよび架橋は診断および分析目的で供することができる。本発明の態様に関するＯＤＮの利用の各場合において、ＯＤＮはワトソンクリックの意味において一本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡにおける標的配列に相補的な（または実質的に相補的な）ヌクレオチド配列、および少なくとも１つの共有結合架橋剤を有する。ハイブリダイゼーションプローブとして本発明のＯＤＮを利用するさらなる記載および一本鎖ＤＮＡ（ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）およびヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＶ）配列の断片）への配列特異的架橋の証拠ならびに関連実験は後記する。プローブは当該分野で典型的に使用されるいくつかの方法のうちのいずれによっても標識することができる。通常の検出方法は³Ｈ、¹²⁵Ｉ、³⁵Ｓ、¹⁴Ｃまたは³² Ｐ表式プローブ等でのオートラジオグラフィーの使用である。他のレポーター基は、蛍光体、化学ルミネセンス剤および酵素で標識した抗体に結合するリガンドを含む。別法として、プローブを蛍光体、化学ルミネセンス剤、酵素および酵素基質のごとき標識と直接的に結合させることができる。別法として、同一成分を、標識を結合したリガンドと反応性の抗体のごときリガンド−抗リガンド複合体を介して間接的に結合させることができる。標識の選択は、必要な感度、プローブとの結合の容易性、安定性要件および利用可能な装置に依存する。標識の選択は、標識がプローブに取り込まれる方法を指示する。放射性プローブは、典型的には、所望の放射性同位体を含有する商業的に入手可能なヌクレオチドを用いて作成される。放射性ヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ合成器を用いることによって、ニックトランスレーションによって、ターミナルトランスフェラーゼでのプローブの３’末端における放射性塩基のテイリングによって、放射性ｄＮＴＰの存在下でＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を持つ特異的インサートを有するＭ１３プラスミドをコピーすることによって、プローブに取り込むことができる。非放射性プローブを、シグナル（例えば、蛍光体、化学ルミネセンス剤または酵素）で直接的に標識することができ、あるいはリガンドと結合させることによって間接的に標識することができる。例えば、リガンド分子をプローブに共有結合させることができる。次いで、このリガンドを、酵素または光反応性化合物のごとき、本来的に検出可能であるか、あるいは検出可能シグナルに共有結合される受容体分子に結合させる。リガンドおよび抗体は広く変化させることができる。リガンドが天然「抗リガンド」、すなわち、ビオチン、チロキシンおよびコルチゾルのごときリガンドを有する場合は、それはその標識した天然に生じる抗リガンドと組み合わせて用いることができる。別法として、いずれのハプテンまたは抗原性化合物m適当に標識された抗体と組み合わせて使用することができる。好ましい標識方法は、出典明示して本明細書の一部とみなすLanferら,Proc．Natl. Acad．Sci．USA 78:6633-6637(1981)に開示されてごとく、オリゴヌクレオチドのビオチン−標識アナログを利用する。レポーター基として注目する酵素は、一義的には、ヒドロラーゼ、特にホスアァターゼ、エステラーゼ、ウレアーゼおよびグリコシダーゼ、またはオキシドレダクターゼ、特にペルオキシダーゼとなろう。蛍光化合物はフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンボリフェロン、希土類等を含む。化学ルミネセンス体はルシフェリン、アクリジニウムエステルおよび２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えばルミナールを含む。特別のハイブリダイゼーションは臨界的ではなく、研究者の好みおよび要望で変化するであろう。約２０％ないし約６０％容量、好ましくは約３０％の極性有機溶媒を含む種々のハイブリダイゼーション溶液を使用できる。通常のハイブリダイゼーション溶液は約３０−６０％ｖ／ｖホルムアミド、約０.５ないし１Ｍ塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、トリスＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＳのごとき約０.０５ないし０.１Ｍ緩衝液、ドデシル硫酸ナトリウムのごとき約０.０５％ないし０.５％の洗剤、および１−１０ｍＭＥＤＴＡ、０.０１％ないし５％フィコール（約２５０−５００ｋｄａｌ）、および０.０１％ないし１０％ウシ血清アルブミンを使用する。また、典型的なハイブリダイゼーション溶液には、０.１ないし５ｍｇ／ｍｌからの未標識担体、例えば、部分的に切断された子ウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡ、および／または部分的に切断された酵母ＲＮＡおよび所望により０.５重量／容量％ないし２重量／容量％グリシンが含まれる。アニオン性ポリアクリレートまたはポリメチルアクリレートのごとき、種々の極性水溶性または膨潤性剤、およびデキストラン硫酸のごとき荷電糖ポリマーを含む容量排除剤のような他の添加剤を含むこともできる。特別のハイブリダイゼーション技術は、本発明では必須ではない。ハイブリダイゼーション技術は一般に「Nucleic Acid Hybridization，A Practical Approach」，HamesおよびHiggins編，IRL Press，1985: GallおよびPardue，Proc . Natl．acad．Sci.，USA．63:378-883(1969);およびJohnら，Nature，223:582- 587(1969)に記載されている。ハイブリダイゼーション技術では改良がなされるので、それらを容易に適用することができる。ハイブリダイゼーション溶液に存在する標識プローブの量は広く変化することができる。一般に、化学量論量の標的核酸を超える実質的過剰のプローブを使用して、標的ＤＮＡまたはＲＮＡに対するプローブの結合の率を増強させる。ハイブリダイゼーションの種々の程度のストリンジェンシィーを使用することができる。ハイブリダイゼーションの条件がよりストリンジェントとなると、安定なデュプレックスを形成するためのプローブおよび標的の間に大きな相補性度がなければならない。ストリンジェンシィーの程度は、温度、イオン濃度、極性有機溶媒の包含等によって制御できる。例えば、使用する温度は、通常、約２０ ℃ないし８０℃、通常２５℃ないし７５℃の範囲であろう。例えば、５０％ホルムアミド中の１５−３０ヌクレオチドのプローブでは、最適の温度範囲は２２− ６５℃で変化し得る。ルーチン的実験により、室温で満足できるハイブリダイゼーションを可能とする条件を規定することができる。また、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシィーは、便宜には、約２０％ないし約５０％の範囲内のホルムアミドの濃度の操作を通じて反応体溶液のイオン強度および極性を変化させることによって変化させる。反応容器を商業的に入手可能な音波浴に浸漬することによる超音波での処理は、しばしば、ハイブリダイゼーション速度を加速することができる。使用する特定のハイブリダイゼーション溶液に適した温度および時間でのハイブリダイゼーションの後、プローブ−標的ハイブリッドが結合するガラス、プラスチックまたはフィルター支持体を、典型的には同様の試薬（例えば、塩化ナトリウム、緩衝液、有機溶媒および洗剤）を含有するハイブリダイゼーション溶液として供された洗浄溶液に導入する。これらの試薬はハイブリダイゼーション媒体と同様の濃度であってよいが、しばしば、それらはよりストリンジェントな洗浄条件が望まれる場合低濃度である。支持体を洗浄溶液に維持される時間は数分から数時間以上まで変化させることができる。ハイブリダイゼーションまたは洗浄媒体はストリンジェントであり得る。適当なストリンジェントな洗浄の後、正しいハイブリダイゼーション複合体が今や標識の性質にて検出できる。プローブを標識に直接的に結合させることができる。例えば、標識が放射性である場合、ハイブリダイゼーション複合体基質が会合した支持体表面をＸ−線に暴露する。標識が蛍光性である場合、試料はまず特定の波長の光を照射することによって検出する。試料はこの光を吸収し、次いで、異なる波長の光を放射し、これを検出器で拾う(「Physical Biochemistry」，Freifelder，D．W．H．Freeman & Co.，1982，pp.539-542)。標識が酵素である場合、試料は酵素に適した基質とのインキュベーションによって検出される。生じたシグナルは着色沈殿、着色または蛍光可溶性物質、またはバイオルミネセンスまたは化学ルミネセンスによって生じたホトンであってもよい。ディプステッイクアッセイのための好ましい標識は、着色沈殿を生じて、陽性の読みを示す。例えば、アルカリ性ホスファターゼはデホスフォリレートインドキシルホスフェートであり、次いで、これを還元反応に参画させて、テトラゾリウム塩を高度に着色した不溶性ホルマザンに変換する。ハイブリダイゼーション複合体の検出は、シグナルを生じる複合体を標的およびプローブポリヌキレオチドまたは核酸のデュプレックスへの結合を要する。典型的には、かかる結合は、リガンド結合プローブとシグナルを結合した抗リガンドとの間のごとく、リガンドおよび抗リガンド相互作用を介して起こる。シグナル生成複合体の結合は、超音波エネルギーへの暴露による加速に容易に適用することができる。また、標識はハイブリダイゼーション複合体の間接的検出を可能とする。例えば、標識がハプテンおよび抗原である場合、試料を抗体を使用することによって検出することができる。これらの系において、シグナルは蛍光または酵素分子を抗体に結合させることによって、あるいはある場合には放射性標識に結合させることによって生じさせることができる。(Tijssen，P．「practice and Theory of Enzy,e Immunoassays，Labotaroty Techniques in Biochemistry and molecu lar Biology」，Burdon，R．H．van Knippenberg，P．H.編，Elsevier，1985，pp .9-20)。ハイブリダイゼーション溶液中に存在させる標識プローブの量は、標識の性質、細胞標識核酸に理想的に結合できる標識プローブの量、およびハイブリダイゼーション媒体および／または洗浄媒体の正確なストリンジェンシーに依存して広く変化することができる。一般に、標的の化学量論量を超える実質的なプローブの過剰を使用して、標的核酸へのプローブの結合速度を増強させることとなろう。また、本発明のこの最初の態様は、架橋剤を有する少なくとも１つのＯＤＮおよび前記した標識を含むオリゴヌクレオチドプローブを利用することよりなる、標的一本鎖核酸配列を同定する方法に指向される。１の具体例において、該方法は、（ａ）テストすべき試料中の核酸を変性させ、（ｂ）それに共有結合した架橋剤を有する少なくとも１つの標識ＯＤＮを含むオリゴヌクレオチドプローブ（以後、時々「プローブ」という）を標的核酸にハイブリダイズさせ、ここに、ＯＤＮは標的核酸配列のものと相補的な配列を含み、（ｃ）該試料を洗浄して、未結合プローブを除去し、（ｄ）該試料を検出剤と共にインキュベートし、次いで、（ｅ）試料を観察する工程よりなる。前記方法は当該分野でよく知られた手法によって行うことができる。共有結合した架橋剤を含む標識オリゴヌクレオチドプローブを利用し、前記方法を含む、標的一本鎖核酸配列を同定する方法が本発明で考えられる。かかるアッセイはキットの形態で提供することができる。例えば、典型的なキットは、標的核酸のそれと相補的な配列を有するプローブ試薬（ＯＤＮ）；およびハイブリダイゼーション反応混合物を含む。また、該キットは例えば酵素および該酵素の対する基質のごときシグナル発生系を含む。以下の実施例は本発明を説明するために供するもので、本発明を限定するものではない。「ＲＴ」は室温を意味する。一般法薄層クロマトグラフィーは以下の溶媒混合液を用いてシリカゲル６０Ｆ２５４プレート(Analtech)で行った：Ａ−９０％塩化メチレン：１０％メタノール；Ｂ −５０％酢酸エチル：５０％ヘキサン；Ｃ−７０％酢酸エチル：１０％メタノール：１０％水：１０％アセチン；Ｄ−５０％エーテル：５０％ヘキサン。フラッシュクロマトグラフィーは６０Ｆ２５４シリカ(Merck)を用いて行った。オリゴヌクレオチドはApplied Biosystems モデル３８０Ｂ合成器で合成した。オリゴヌクレオチドはｔ＄ポリヌクレオチドキナーゼ（ＢＲＬ）およびτ−³²Ｐ−ＡＴＰ(New England Nuclear)を用いてアイソトロピックに標識した。実施例１：６−（トリチルアミノ）カプロン酸６−アミノカプロン酸（２６ｇ、０.２モル）をトリエチメアミン（１００ｍＬ）の添加によってジクロロメタン（２００ｍＬ）に溶解させた。塩化トリチル（１２０ｇ、０.４５モル）を添加し、溶液を３６時間撹拌した。得られた溶液を１ＮＨＣｌで抽出し、有機相を蒸発乾固した。残渣を２−プロパノール／１ＮＮａＯＨ（３００ｍＬ／１００ｍＬ）に懸濁させ、３時間還流した。溶液を蒸発させて濃厚なシロップとし、ジクロロメタン（５００ｍＬ）に添加した。水を添加し、酸性化した。相を分離し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固した。残渣を熱２−プロパノールに溶解させ、冷却し、濾過して中間体化合物として有用な４３.５（５８％）の６−（トリチルアミノ）カプロン酸を得た。実施例２５−（トリチルアミノ）ペンチルヒドロキシメチレンマロニトリル氷浴中の６−（トリチルアミノ）カプロン酸（２０.０ｇ、５３ミリモル）およびトリエチルアミン（２０ｍＬ）のジクロロメタン溶液に３０分間にわたってクロロギ酸イソブチル（８.３ｍＬ、６４ミリモル）を滴下した。混合物を氷浴中で２時間撹拌した後、新たに蒸留したマロニトリル（４.２ｇ、６４ミリモル）を一度に添加した。溶液を氷浴中で２時間撹拌し、室温で２時間撹拌した。ジクロロメタン溶液を氷冷２ＮＨＣｌ（３００ｍＬ）で洗浄し、二相混合物を濾過して、沈殿する生成物（１３.２ｇ）を取り出した。相を分離し、有機層を乾燥し、蒸発させて濃厚なシロップとした。該シロップをジクロロメタンで覆い、放置して生成物の微結晶を得た。結晶を濾過し、乾燥して合計収率１９.５ｇ（８７％）の６.３ｇの生成物が得られ、これは中間体として有用である。実施例３５−（トリチルアミノ）ペンチルメトキシメチレンマロニトリル氷浴中で冷却したエーテル／ジクロロメタン（９００ｍＬ／１００ｍＬ）中の実施例２のマロニトリル（１３ｇ、３１ミリモル）の懸濁液を、（Diazald^TM(Al drich Chemical Company)からの）ジアゾメタンの新たに調製したエーテル溶液で処理した。溶液を６時間撹拌し、次いで、酢酸（１０ｍｌ）で中和した。溶液を蒸発乾固し、残渣をジクロロメタン／アセトン（４／１）を溶離剤として用いるシリカゲル上のクロマトグラフィーに付した。生成物を含有する画分をプールし、蒸発させてシロップとした。該シロップをジクロロメタンでトリチュレートして結晶化を誘導した。結晶を濾過し、乾燥して、中間体として有用な８．３ｇ（６１％）のクロマトグラフイー的に純粋な生成物を得た。実施例４５−アミノ−３−［（５−トリチルアミノ）ペンチル］ピラゾール−４−カルボニトリル氷浴中の実施例３の生成物（７.０ｇ、１６ミリモル）のメタノール溶液（１００ｍＬ）にヒドラジン−水和物（７.８ｍＬ、１６０ミリモル）を１５分間にわたって添加した。氷浴中で３０分間撹拌した後、溶液を蒸発乾固させた。残渣を冷メタノールに懸濁し、濾過して、乾燥後に、中間体として有用な７.１ｇ（１００％）の５−アミノ−３−［（５−トリチルアミノ）ペンチル］ピラゾール −４−カルボニトリルを得た。分析試料は水からの再結晶によって調製した。実施例５：５−アミノ−１−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−トルオイル−β−エリスロペントフラノシル）−３−［（５−トリチルアミノ）ペンチル］ピラゾール− ４−カルボジイミド実施例４からのカルボニトリル（３.５ｇ、８ミリモル）の氷冷溶液を水素化ナトリウムで処理し、０−４℃で３０分間撹拌した。１−クロロ−１，２−ジデオキシ−３，５−ジ−Ｏ−トルオイルリボフラノースを添加し、溶液を０−４℃ で１時間撹拌した。溶液を炭酸水素ナトリウムに注ぎ、ジクロロメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固させた。残渣をフラッシュクロマトグラフーイにかけた。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固させた。残渣をトルエン／酢酸エチル（５／１）を溶離剤として用いるシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフーイに付した。主要生成物を単離し、各々、６７％（３ .６ｇ）および２０％（１.２ｇ）Ｎ−１およびＮ−２収率にてＮ−１およびＮ− ２異性体を同定した。Ｎ−１およびＮ−２異性体の混合物ほぼ１ｇも収集した。糖鎖付加物質の全収率は５.８ｇ（９２％）であった。Ｎ−１異性体、５−アミノ−１−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−トルオイル−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル−３−［（５−トリチルアミノ）−ペンチル］ピラゾロ−４−カルボニトリルをさらに精製することなく実施例６で用いた。実施例６１−（２−デオキシーβ−Ｄ−エリスロペントフラノシル）−３−［５−（トリチルアミノ）ペンチル］ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン実施例５のピラゾール−４−カルボニトリルのトルエン（１００ｍＬ）溶液にジエトキシメチルアセトン（１.１ｍＬ、６.７ミリモル）を添加した。溶液を８０−９０℃に５時間維持し、次いで、蒸発させてシロップとした。シロップをジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解させ、ガラス製耐圧瓶中の氷冷メタノール性アンモニア（１００ｍＬ）に添加した。室温での２日後、瓶の内容物を蒸発乾固させた。残渣をメタノールに溶解させ、新たに調製したナトリウムメトキシドでｐＨ８に調整して脱保護を完了させた。一晩撹拌した後、溶液をDowx^R-50 Ｈ＋樹脂で処理し、濾過し、蒸発乾固させた。残渣を溶離剤としてアセトン／ヘキサン（３／２）を用いるシリカゲル上のクロマノトグラフィーに付して２.０ｇ（７７％）の分析的に純粋な生成物を得た。実施例７１−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル）−３−［５−（トリチルアミノ）ペンチル］ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミノ５’ −一リン酸リン酸トリメチル（５ｍＬ）中の実施例６のピラゾロピリミジン−４−アミンの氷冷溶液に塩化ホスホリル（５０μｌ）を添加し、溶液を０−４℃に維持した。反応を、水中の０ないし１００％アセトニトリルの直線グラジエントを用いる逆走ＨＰＬＣによって２５分間にわたってモニターした。５時間撹拌した後、塩化ホスホリル（２５μＬ）のさらなるアリコットを添加し、溶液をさらに３０分間撹拌した。溶液を０.１Ｍ炭酸水素アンモニウムに注ぎ、冷所で一晩維持した。次いで、溶液をエーテルで抽出し、水性層を蒸発乾固させた。残渣を水（５ｍＬ）に溶解させ、２２ｍｍ×５０ｃｍＣ１８カラムを用いる逆相ＨＰＬＣによって精製した。カラムを水で平衡化させ、０ないし１００％アセトニトリルのグラジェントで２０分間にわたって溶出させた。所望の物質を含有する画分をプールし、凍結乾燥して１６０ｍｇ（５６％）のクロノトグラフィー的に純粋なヌクレオチドを得た。実施例８１−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル）−３−｛５−［（６−ビオチンアミド）ヘキサンアミド］ベンチル｝ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン５’−一リン酸実施例７のヌクレオチド、炭素上の水酸化パラジウム（５０ｍｇ）およびシクロヘキサジエン（１ｍＬ）のエタノール溶液（１０ｍＬ）を３日間還流し、濾過し、蒸発乾固させた。残渣をジクロロメタンで洗浄し、トリエチルアミン（１００ｍＬ）を含有するＤＭＦ（１.５ｍＬ）に溶解させ、ビオチニルアミノカプロン酸Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル（５０ｍｇ）で処理した。一晩撹拌した後、さらなる量の６−ビオチニルアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（５０ｍｇ）を添加し、溶液を１８時間撹拌した。反応混合物を蒸発乾固させ、実施例７の手法に従って、クロマトグラフイーに付した。画分をプールし、凍結乾燥して、８０ｍｇのクロマトグラフイー的に純粋なビオチンアミド−置換ヌクレオチドを得た。実施例９１−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル）−３−［５−（６ −ビオチンアミド）−ヘキサンアミドペンチル］ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン５’−三リン酸実施例８のモノホスフェート（８０ｍｇ、約０.１ミリモル）をトリエチルアミン（１４μＬ）を添加したＤＭＦに溶解させた。カルボニルジイミダゾール（８１ｍｇ、０.５ミリモル）を添加し、溶液を室温で１８時間撹拌した。溶液をメタノール（４０μＬ）で処理し、３０分間撹拌した後、ピロリン酸トリブチルアンモニウム（０.５ｍＬＤＭＦ中０.５ｇ）を添加した。２４時間撹拌した後、さらなるアリコットのピロリン酸トリブチルアンモニウムを添加し、溶液を一晩撹拌した。反応混合物を蒸発乾固し、実施例８の手法に従ってクロマトグラフイーに付した。２つの生成物を収集し、各々を別々に濃水酸化アンモニウム（１ｍＬ）で１８時間５５℃で処理した。ＵＶおよびＨＰＬＣ分析は、両生成物がアンモニア処理後に同定されたことを示し、これをプールし、凍結乾燥して３５.２ｍｇのヌクレオチド三リン酸を得た。実施例１０ニックトランスレーション反応実施例９のトリホスフェートをLangerら(前掲)のニックトランスレーションプロトコルを用いてｐＨＰＶ−１６に取り込んだ。実施例９のトリホスフェートで調製したプローブを、商業的に入手可能なｂｉｏ−１１−ｄＵＴＰ(Sigma Chemi cal Co.)を用いて調製したプローブと比較した。フィルターハイブリダイゼーションおよびイン・サイチュ塗布の双方において有意な差異は観察できなかった。より詳しくは、該方法は以下の材料および工程を含むものであった。材料：ＤＮａｓｅ(ＩＣＮ Biomecicals)−４μｇ／ｍＬＤＮＡポリメラーゼ１(U.S．Biochemicals)-８Ｕ／ｍＬｐＨＰＶ−１６−２,１６ｍｇ／ｍＬ、こりはヒト・パピローマウイルスのタイプ１６のゲノム配列を含有するプラスミドである。１０Ｘ−ＤＰ−１Ｍトリス、ｐＨ７.５（２０ｍＬ）；０.５ＭＯＴＴ（８０ｍＬ）；１ＭＭｇＣｌ₂（２.８ｍＬ）：Ｈ₂Ｏ（１７ｍＬ）ヌクレオチド−ミックスＡ−２ｍＭ各ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ＴＴＰ（Phar macia）ミックスＵ−２ｍＭ各ｄＧＴＰ、ＤｃＴＰ、ｄＡＴＰＢｉｏ−１１−ｄＵＴＰ−１.０ｍｇ／ｍＬ（ＢＲＬ）Ｂｉｏ−１２−ｄＡＰＰＴＰ−１.０ｍｇ／ｍＬ工程：１０Ｘ−ＤＰ（４ｍＬ）、ｐＨＶ−１６（２ｍＬ）、ヌクレオチドミックスＡ（６ｍＬ）、Ｂｉｏ−１２−ｄＡＰＰＴＰ（２ｍＬ）、およびＨ₂Ｏ（２０ｍＬ）の氷冷混合物にＤＮａｓｅ（１ｍＬ）およびＤＮＡポリメラーゼ１（２.４ｍＬ）を添加した。反応混合物を１６℃で１時間インキュベートした。Ｂｉｏ−１２−ｄＡＰＰＴＰ（実施例９のトリホスフェートを含む）およビヌクレオチドミックスＡの代わりにＢｉｏ−１１−ｄＵＴＰおよびヌクレオチドミツクスＵを用いて該手法を反復した。核酸はエタノール沈殿によって単離し、ニトロセルロースにスロットしたｐＨＰＶにハイブリダイズさせた。ハイブリダイズさせたビオチニル化プローブを、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質と共にストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートによって可視化させた。ビオチニル化ヌクレオチドを用いて調製したプローブは同一のシグナルを与えた。また、プローブを、イン・サイチュ方式で頸部塗布につきテストし、シグナルおよびバックグラウンドに量的差異は認められなかった。実施例１１：５−アミノ−３−［（５−トリチルアミノ）ペンチル］ピラゾール−４−カルボキシ−アミドシアノアセトアミドをマロノニトリルの代わりに用いる以外は実施例２の方法に従い、５−（トリチルアミノ）ペンチルヒドロキシメチレンシアノアセトアミドを５−（トリチルアミノ）カプロン酸から調製する。これを次いでジアゾメタンで処理し、実施例３の方法に従いメトキシ誘導体が得られ、これを次いで、実施例４におけるごとくヒドロラジン−水和物で処理して、５−アミノ−３−［（５−トリチルアミノ）−ペンチル］ピラゾール−４−カルボキシアミドを得る。実施例１２：４−ヒドロキシ−６−メチルチオ−３−［（５−トリチルアミノ）ペンチル］ピラゾロ−［３,４−ｄ］ピリミジン実施例１１からのカルボキシアミドを上昇した温度においてキサントゲン酸エチルカリウムと反応させ、４−ヒドロキシピラゾロ［３,４−ｄ］ピリミジン− ６−チオールのカリウム塩を得る。この塩を次いでヨードメタンと反応させて、４−ヒドロキシ−６−メチルチオ−３−［（５−トリチルアミノ）ペンチル］ピラゾロ［３,４−ｄ］ピリミジンを得る。実施例１３１−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−４−ヒドロキシ −３−［５−（トリチルアミノ）ペンチル］ピラゾロ［３,４−ｄ］ピリミジン −６−アミン実施例５の方法に従い、実施例１２のピラゾロピリミジンを水素化ナトリウムで処理し、１−クロロ−１，２−ジデオキシ−３，５−ジ−Ｏ−トルオイルリボフラノースと反応させる。得られた化合物をＭＣＰＢＡおよびメタノール性アンモニアと反応させ、トルオイル保護基を除去して、生成物を得る。実施例１４：１−（２−デオキシーβ−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−４−ヒドロキシ −３−［５−（６−ビオチンアミド）ヘキサンアミドペンチル］ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−６−アミン−５’−一リン酸実施例７の方法に従い、実施例１３のピラゾロピリミジンを塩化ホスホリルと反応させて、対応する５’−モノホスフェートを得る。実施例８の方法に従い、上記の５’−モノホスフェートをパラジウム／炭素およびシクロヘキサジエンと反応させ、残渣をＮ−ヒドロキシ−スクシンイミジルビオチニルアミノカプロエートと反応させて、１−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−４−ヒドロキシ−３−［５−（６−ビオチンアミド）ヘキサンアミドペンチル］ピラゾロ［３,４−ｄ］ピリミジン−６−アミン− ５’−一リン酸を得る。実施例１５：１−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−４−ヒドロキシ −３−［５−（６−ビオチンアミド）ヘキサンアミドペンチル］ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−６−アミン−５’−三リン酸実施例９の方法に従い、実施例１４の５’−モノホスフェートをカルボニルジイミダゾールで処理し、次いで、ピロリン酸トリブチルアンモニウムで処理して、対応する５’−トリホスフェートを得る。実施例１６１−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−３−［５−（トリチルアミノ）−ペンチル］ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−ベンゾイルアミン実施例６からの１−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）− ３−［５−（トリチルアミノ）ペンチル］ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン− ４−アミンを塩化ベンゾイルと反応させて、１−（２−デオキシ−３，５−Ｏ− ベンゾイル−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−３−［５−（トリチルアミノ）ペンチル］ピラゾロー［３,４−ｄ］−ピリミジン−４−ジベンゾイルアミンを得る。これを水酸化ナトリウム水溶液で処理して、化合物を部分的に脱保護し、１−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−３−［５−（トリチルアミノ）ペンチル］ピラゾロ［３,４−ｄ］ピリミジン−４−ベンゾイルアミンを得る。実施例１７：１−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−３−［５−（トリフルオロアセトアミド）ペンチル］ピラゾロ［３,４−ｄ］ピリミジン−４− ベンゾイル−アミン実施例８の方法に従い、実施例１６のベンゾイルアミンを炭素上の水酸化パラジウムで処理し、次いで、無水トリフルオロ酢酸で処理して、１−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−３−［５−（トリフルオロアセトアミド）ペンチル］ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−ベンゾイルアミンを得る。実施例１８：１−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−３−［５−（トリフルオロアセトアミド）ペンチル］ピラゾロ［３,４−ｄ］ピリミジン−４−ベンゾイルアミン−３’−Ｏ−（Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイトのシアノエチルエステル実施例１７の化合物を塩化ジメトキシトリチルおよびピリジンと反応させて、対応する５’−ジメトキシトリチル化合物を得る。この化合物を次いでシアノエチルクロロ−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（シンハ(Sinha)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.)１２：４５３９（１９８４）の方法による）と反応させて、３’−Ｏ−活性化ヌクレオシドを得る。実施例１９：５−（４−フタルイミドブト−１−イン−１−イル）−２’−デオキシウリジン５−ヨード−２’−デオキシウリジン（３５４ｍｇ，１ミリモル）を１０ｍｌジメチルホルムアミドに溶解させた。ヨウ化銅（７６ｍｇ，０.４ミリモル）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（２３０ｍｇ，０. ２ミリモル）およびトリエチルアミン（２００ｍｇ，２.０ミリモル）を添加した。４−フタルイミドブト−１−イン（３００ｍｇ，１.５ミリモル）を全て一度に添加し、反応を６０℃にて３時間維持した。澄んだ黄色反応を次いで蒸留させ、塩化メチレンを添加した。ほとんど全ての生成物のフラスコ誘導された結晶化のスクラッチングを濾過し、９５％エタノールから再結晶化して３３５ｍｇ（７８％）の標題の化合物を細い、羽根状針状物として得た。実施例２０：５−（４−フタルイミドブト−１−イル）−２’−デオキシウリジン１.００グラムの５−（４−フタルイミド−１−イン−１−イル）−２’−デオキシウリジンを９５％ＥｔＯＨに溶解させ、約３ｇの中性ラネー・ニッケルを添加した。４８時間後、触媒を注意深い濾過により除去し、濾液を蒸留して固体とし、これをメタノール−水から再結晶して９６０ｍｇ（９７％）の標題の化合物を得た。実施例２１：６−（３−ヨードアセトアミドプロピル）−２’−デオキシウリジン５−（３−トリフルオロアセトアミドプロプ−１−イル）−２’−デオキシウリジン（０.３ｍｍｏｌ）をアンモニアで処理し、次いで、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル α−ヨードアセテート（０.５ｍｍｏｌ）を得る。反応混合物を蒸発乾固し、クロマトグラフィーによって精製して、５−（３−ヨードアセトアミドプロピル）−２’−デオキシウリジンを得る。実施例２２：５−（４−（４−ブロモブチルアミド）ブチル）−２’−デオキシウリジン５−（４−フタルイミドブト−１−イル）−２’−デオキシアリジンをアンモニアで処理し、次いでＮ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−ブロモブチレートで処理して、５−（４−（４−ブロモブチルアミド）ブチル）−２’−デオキシウリジンを得る。合成オリゴヌクレオチドの調製実施例２３：ホスホルアミダイト調製およびＤＮＡ合成ヌクレオシドを、以下の公知の方法に従い５’−ジメトキシトリチル化して、約８５％の収率が得られ、塩化メチレン中のジイソプロピルエチルアミンを含むジイソプロピルアミノ β−シアノエチルクロロホスファイトを用いて（「オリゴヌクレオチド・シンセシス：ア・プラクティカル・アプローチ(Oligonucleoti de Synthesis: A Practical Approach)」、上記に記載のごとく）３’−ホスホルアミダイトを作った。該ホスホルアミダイトをアセトニトリル中の０.２Ｎ溶液とし、自動ＤＮＡシンセサイザーに入れた。これらの新しい修飾されたホスホアミダイト類の取り込みにより、元のホスホルアミダイト類と同様の取り込みが達成された（ＵＶにより放出されたトリチル色分析用試料により判断して９７ −９９％）。オリゴヌクレオチドをＤＮＡシンセサイザーからトリチル化形態で除去し、３０％アンモニアを用いて５５℃にて６時間脱ブロックした。１０μＬの０.５Ｍ炭酸水素ナトリウムを添加して、濃縮間の酸化を妨げた。オリゴヌクレオチドを減圧下で蒸発乾固し、１.０ｍｌの水に再溶解させた。オリゴヌクレオチドを、２０分間にわたる０.１Ｎ酢酸トリエチルアンモニウム中の１５ −５５％アセトニトリルを用いるＨＰＬＣによって精製した未置換オリゴヌクレオチドは１０分に溶出し；アミノ誘導体は１１−１２分かかった。所望のオリゴヌクレオチドを集め、蒸発乾固させ、次いでそれを８０％酢酸水溶液中に９０分間で再溶解させて、トリチル基を除去した。Ｇ２５Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムにより脱塩を行い、適当な画分を採取した。画分を濃縮し、特定の容積とし、全収率を確かめるために希釈の読みを行い、純度を確かめるために分析ＨＰＬＣを行った。オリゴヌクレオチドを使用まで−２０℃にて凍結した。上記方法に従い、ヌクレオシド５−（３−トリフルオロアセトアミドプロプ− １−イル）−２’−デオキシウリジンを、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’ −（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイトシアノエチルエステル誘導体に変換した。これをＤＮＡシンセサイザーに添加し、以下の１４量体のオリゴヌクレオチドを調製した：３’−ＣＴＴＣＣＵ¹ＴＧＴＡＧＧＴＣ−５’ ここに、Ｕ¹は５−（３−アミノプロプ−１−イル）−２’−デオキシウリジン（オリゴＡ）。同様にして、５−（４−フタルイミドブト−１−イル）−２’−デオキシウリジンを、５’−（Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイトシアノエチルエステル誘導体に変換し、上記１４量体オリゴヌクレオチド配列を調製するためにＤＮＡシンセサイザーに添加した。ここにＵ¹ は５−（４−アミノブト−１−イル）−２’−デオキシウリジン（オリゴＣ）。また対応する１４量体のオリゴヌクレオチドを調製し、ここにＵ¹は修飾されないデオキシウリジンである。実施例２４オリゴヌクレオチドの誘導化一般的に、架橋アームをアミノアルキルオリゴヌクレオチドに付加させるために、１０μＬの０.１Ｍホウ酸塩中の１０μｇのアミノアルキルオリゴヌクレオチドおよびα−ハロアセトテートまたは４−ハロブチレート、ｐＨ８.５のごとき１００×モーラー過剰のｎ−ヒドロキシスクシンイミドハロアシラートを室温にて暗所で３０分間インキュベートした。全反応を、蒸留水で平衡化し溶出させるＮＡＰ−１０カラムを通した。ＵＶ吸収に基づく適当な画分を合し、濃縮は、分光光度法により決定した。ハロアシル基の導入はＨＰＬＣにより調べた。２０分の、Ａ（２０％アセトニトリル：８０％０.０２ＮＮａＨ₂ＰＯ₄）およびＢ（２０％アセトニトリル中１.２Ｎ：８０％０.２Ｎ−Ｃｂｚ−２’−ＴＥＳ−β−フェニルイソセリニルＮａＨ₂ＰＯ₄）組成の６０％ないし８０％のＢ化合物の勾配で溶出する Zorbax^Rオリゴヌクレオチドカラム(デュポン（Dupon）)。反応性α−ハロアシル基の存在が、１Ｎシステアミンへの暴露後の対応するアミノアルキルオリゴヌクレオチドに対応するα−ハロアシルアミドアルキルオリゴヌクレオチドの保持時間の復帰により示された。システアミンの導入により、アミノアシルオリゴヌクレオチドおよびα−ハロアシルアミドオリゴヌクレオチド間の同等電荷パターンが生じる。上記方法により、１４量体のオリゴヌクレオチド：３’−ＣＴＴＣＣＵ¹ＴＧＴＡＧＧＴＣ−５’ （ここにＵ¹は５−（３−アミノプロプ−１−イル）−２’−デオキシウリジン（オリゴＡ、実施例２３））をＮ−ヒドロキシスクシンイミド α−ヨードアセテートと反応させて、上記１４量体オリゴヌクレオチドを得た（ここにＵ¹は５−（３−ヨードアセトアミドプロプ−１−イル）−２’−デオキシウリジン（オリゴＢ）。オリゴＡおよびオリゴＢならびに上記の１４量体（ここにＵ¹は修飾されていないデオキシウリジン）をZorbaxカラム中にて、全て同じ配列について、以下の保持時間で分析した：未修飾１４量体、９.３１分；アミノプロピル１４量体（オリゴＡ）、７．３６分；およびヨードアセトアミドープロピル１４量体（オリゴＢ）、１０.０９分。同様にして、アミノプロピル１４量体（オリゴＡ）をＮ−ヒドロキシスクシンイミド４−ブロモブチレートと反応させ、１４量体(ここにＵ¹は５−（３− （４−ブロモブチルアミド）プロプ−１−イル）−２’−デオキシウリジン）を得た。また、アミノブチル１４量体（オリゴＣ、実施例２３）を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド α−ヨードアセテートまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミド４ −ブロモブチレートのいずれかと反応させて、１４量体（ここにＵ¹は５−（４ −ヨードアセトアミドブト−１−イル）−２’−デオキシウリジンまたは５−（４−（４−ブロモブチルアミド）ブト−１−イル）−２’−デオキシウリジン）をそれぞれ得た。分析実施例２５：一本鎖ＤＮＡへの架橋反応の分析標的核酸配列へＤＮＡプローブを架橋させる反応は、２００μＬの０．１ＭＴｒｉｓ、ｐＨ８.０および０.９ＭＮａＣｌ中の１μｇのハロアシルアミドアルキルプローブおよび１０ｎｇの³²Ｐ−標識コルジセピン−テイルド標識標的を含み、２０ないし３０℃にてインキュベートした。一部を２４−または７２−時間の間隔で取り出し、２０μＬの１０ｍＭシステアミンで希釈して、ハロアシルアミド基を冷却した。これらの溶液を室温にて保存し、１μＬを変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）による分析のために使用した。上記方法に従い、２つのモデルのオリゴヌクレオチド配列を使用して、修飾されたプローブのその相補体に対する架橋能力を評価した。ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）またはヒト・サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来の配列を以下に示す：ＨＰＶシステム：ＣＭＶシステム：Ｕ＝５−［３−（α−ヨードアセトアミド）−または３−（４−ブロモブチルアミド）−プロピル］−２’−デオキシウリジン、またはＵ＝５−［３−（α−ヨードアセトアミド）−または４−（４−ブロモブチルアミド）−ブチル］−２’−デオキシウリジン。ＨＰＶの標的は３０量体であって、ＣＭＶについては２４量体である。架橋するプローブは、ＨＰＶについては１４量体であって、ＣＭＶについては２つの１５量体であった。各プローブは前記配列中でＵで示される１つの修飾されたデオキシウリジンを含むものであった。５−（３−ヨードアセトアミドプロピル）サイドアームを含む架橋プローブの限定された量とＨＰＶ標的との反応は、変性ＰＡＧＥゲル上の切断パターン中にて分析でき、分析により、区別される低分子量のバンドの同時出現との架橋ハイブリッドの喪失を示した。このバンドの強度は、最初の反応における架橋の程度に依存する。ゲル上の２つの区別されるバンドへのシグナルの局在化により、標的またはプローブ鎖のいずれかの非−配列指向アルキル化（分子内プローブアルキル化を含む）が起こらなかったと強く示される。隣接するレーンを泳動する標品の１５量体との比較により、主たる切断された断片は９量体であることが示唆される。元のオートラジオグラムの十分な考察により、非常に弱い強度のゆっくり移動するバンドが見られた。このパターンは、Ｇ−２１における主たるアルキル化およびＧ−２０における従たるアルキル化と一致するであろう。架橋可能なＨＰＶハイブリッドのDreidingモデルの考察により、５−（３−ヨードアセトアミドプロピル）サイドアームは、ヘリックスが少し歪むだけで、標的鎖のＧ−２１鎖と接触し得ることが示される。もしアルキル化が修飾されたデオキシウリジン塩基対の２ユニット５’側にて２ユニットに位置する標的鎖上のグアノシンに起これば、ＣＭＶ配列は反応するはずはない。この結果が実際観察された。ＣＭＶとの反応が存在しないことは、さらに、本発明の架橋スキームの特異性を支持する。実施例２６：時間および温度依存時間および温度依存研究を、実施例２５のＨＰＶシステム（ここにＵは５−（３−ヨードアセトアミドプロプ−１−イル）−２’−デオキシウリジン）で行った。標的は、末端基転移酵素でのコルジセピンテーリングにより³²Ｐ−標識し（マニアティス（Maniatis）ら、「モレキュラー・クローニング−ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning‐A Laboratory Manual)」、Cold Spring H arbor Laborator、1982、p239）ｐＨ８.０のＴｒｉｓバッファー中で２０°または３０℃にて過剰プローブとインキュベートした。一部を０、２４、または７２時間のインキュベーション後取り出し、等容の１０ｍＭメルカプトエチルアミン（これはヨードアセトアミドと反応する）で冷却し、変性または非変性ＰＡＧＥによる引き続く分析のために室温にて保存した。変性ＰＡＧＥによりモニターされたハイブリッドの架橋は、両方の温度において２４および７２時間の時点で明らかであった。架橋ハイブリッドの量は温度および時間と共に増加した。約２０％のハイブリッドが、３０°にての７２時間のインキュベーション後架橋した。一定の温度の範囲における別々の実験により、２４時間後に３７℃における架橋の半減期が約２日であって、反応は、５８℃における完了が示された。この時間依存性反応は、ヨードアセトアミド基が加水分解もせず、緩衝液とも反応しないことを暗示する。より高い温度における増加する反応速度は、ハイブリッドが維持され、引き続いてアルキル化の速度が温度と共に予想される増加を呈することを示す。実施例２７：アルキル化の部位特異性アルキル化の部位特異性を解明するために、実施例２５の架橋ＨＰＶハイブリッド（ここにＵは５−（３−ヨードアセトアミドプロプ−１−イル）−２’−デオキシウリジン）を、９０℃にて６０分間ピペリジン溶液に付した。マキサム(M axam)ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ(Proc．Natl．Acad．Sci．USA)74:560(1977)に示されるように、この処理は、定量的に標的鎖をアルキル化部位の３’−側で切断する。得られたデータにより、架橋剤−修飾塩基対の上の第二のグアニン（すなわち、標的塩基上のグアニン）のアルキル化は観察される独占的な反応であることを示し、このことはＨＰＶモデルシステムにおける架橋反応が顕著に特異的であることを示す。抗−遺伝子治療のための２つの架橋機能を有する架橋オリゴヌクレオチドおよび二本鎖ＤＮＡのためのプローブとしての適用ならびにＤＮＡマッピング本発明の第二の広い態様において、ＯＤＮは少なくとも２つの共有結合した架橋剤を有する。本発明のこの態様でのＯＤＮは好ましくは約３００以下であり、好ましくは、約６０のヌクレオチド単位を有する。架橋剤は３’または５’リン酸末端にて結合するか、またはＯＤＮ内の糖もしくは複素環塩基に結合することができる。 −Ｎ−［（ＣＨ₂）₂−Ｌ］₂（二官能基性のＮ−マスタード）の式で示される架橋剤のごとき２つの架橋官能基を有する架橋剤は、２つのアルキル化が可能であり、それゆえ、本発明のこの態様における２つの架橋剤として考慮される。本発明のこの態様により２つの架橋剤を担うＯＤＮは、標的二本鎖ＤＮＡに対し、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン型対合センスの意味において相補的である。本発明のこの態様において、ＯＤＮが１つの共有結合した二官能基性架橋剤（二官能基性Ｎ−マスタード）を有する場合、トリプレックス形成後、修飾されたＯＤＮは、標的二本鎖ＤＮＡ配列の両鎖に付くという証拠がある。代法として、架橋剤は、ＯＤＮの少なくとも２つの異なる部位に付く。この場合もまた、２つの別々の共有結合が、標的ＤＮＡ配列とで形成されることを示す証拠がある。両方の場合において、本発明の本態様により、標的ＤＮＡとで少なくとも２つの共有結合の形成が達成される。上述のごとく、本発明の修飾されたＯＤＮは、標的二本鎖ＤＮＡとでトリプレックスを形成する。これに続いて、標的ＤＮＡ配列を不活性化する架橋が起こる。三本鎖形成および共有架橋に続いて、修飾された標的ＤＮＡはもはや複製も転写も支持しない。ＤＮＡ中の全ての他の欠陥部分と異なり、しかしながら、この修飾は生物体によって到底修復されそうにない。通常、架橋ＤＮＡは、切除修復および相同的組換えの組合せにより修復される。架橋した三本鎖コンプレックスについては、組換えに参画すべき標的遺伝子の無傷のコピーは存在しないであろう。原核モデルとの類似により、真核細胞は、ミスリペアー（またはＳＯＳ）経路を使用し得るのであり、ここに架橋は除去されるが、変異誘発を犠牲とするであろう。このような場合、遺伝子の機能は、得られた変異によって不可逆的にサイレントとなるであろう。抗−遺伝子ＯＤＮ類と組み合わせた組換え酵素の使用は、一本鎖ＯＤＮが、その相補的標的ＤＮＡ配列を「見いだす」効率を有意に増強させる。したがって、三本鎖形成の効率は、抗−遺伝子ＯＤＮが（例えば、核蛋白質コンプレックス中の）組換え酵素と組み合わせた場合に非常に増大する。本発明において、それらの脱活性化が治療的に有利な結果をもたらすように、適当なＤＮＡ配列は有害な構造遺伝子ならびに上流および下流調節制御配列を含む。標的配列は、ウイルス、菌類、寄生虫、細菌および腫瘍細胞のごとき侵入性生物の遺伝子をも含む。調節配列は、転写または複製のいずれかに関与し得る。抗−遺伝子ＯＤＮが、機能の変化のために選択された標的ＤＮＡ配列に従って決定され、設計され、選択されたＤＮＡ配列の２つの鎖のうち１つにおいて、ホモキンランに対しフーグスティーンまたは逆フーグスティーンの意味において相補的な配列を有する。とりわけ好ましい具体例において、抗−遺伝子ＯＤＮは細胞または宿主に投与され、標的細胞核に侵入するに際し、抗−遺伝子ＯＤＮは、核内に存在する組換え酵素と合する。このモードにおいて、ＯＤＮは、選択したいかなる相補的配列にも結合し得る。代わりの具体例において、抗−遺伝子ＯＤＮおよび組換え酵素はｅｘｖｉｖｏにて合され、核蛋白質フィラメントとして細胞または宿主に投与される。この具体例において、核蛋白質フィラメントをリポソーム内にて投与することが有利であろう。好ましい組換え酵素は、ｒｅｃＡ、ヒトのリコンビナーゼならびにドロソフィラDrosophilaのリコンビナーゼのごとき原核および真核の組換え酵素を含むが、ヒトのリコンビナーゼが特に好ましい。上記に述べたごとく、実験的証拠により、本発明の修飾されたＯＤＮ類に取り込まれた最小の２つの架橋剤の両方が実際標的ＤＮＡ配列と反応し、標的配列の両方の鎖が続いて共有的に結合し、修飾されたＯＤＮによって脱活性化されるはずである。本発明の修飾されたＯＤＮのさらなる重要な使用または適用は、大きいＤＮＡ分子のマッピングの分野および分子生物学、遺伝子学ならびに生化学の分野での関連する分析および調査技術においてである。例えば、長い二本鎖ＤＮＡをユニークな部位で長さ１０−２０塩基対に化学的に制限または切断する能力は、大きいＤＮＡ分子の物理的マッピングのための手段を提供するとにより、ヒト・ゲノムプロジェクトを促進することが可能であるであろう技法としてしばしば論じられてきた。本発明のこ態様において、三本鎖コンプレックスを、合成オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）および、二本鎖ＤＮＡ間に走る「相補的な」１０−２０塩基長さのホモプリン間に形成されることが可能である。本発明の修飾されたＯＤＮが、２つのアルキル化剤に適切に付加されているので、デュプレックスの対向鎖における２つのグアニン残基への架橋が起こる。グアニン残基への架橋は、例えば、アルキル化グアニン塩基および糖部分の間のグリコシジル結合の切断に続くホスホジエステル結合の切断を通して、アルキル化ＤＮＡを切断され易くするようにすることが当該分野で知られている。アルキル化部位でのアルキル化ＤＮＡの全切断は、適当な酵素または修飾ＤＮＡに作用する他の試薬の結果として瞬時に起こるであろう。本発明のこの態様における現在好ましいモードにおいては、アルキル化デュプレックスＤＮＡを、アミノ酸、リジン、アルギニンまたはヒスチジンと、または（ヒストンまたはリコンビナーゼ酵素のごとき）ＤＮＡ関連蛋白質とインキュベートする。これにより、各アルキル化部位は、多分、脱プリン化のプロセス（アルキル化グアニン残基のグリコシジル結合の切断）に続くベータ脱離反応を通じて切断部位に変換される。より具体的には、「ＤＮＡマッピング」または「遺伝子マッピング」のための本発明の修飾されたＯＤＮ類の使用あるいは関連精査手法と関連して、以下のことが認識される。該プロセスで用いられる修飾ＯＤＮの構造は、本発明により公知である。したがって、修飾ＯＤＮは、標的ＤＮＡの１またはそれ以上の特異的な約１０−２０塩基対領域（標的領域）にて切断されるように作成できる。標的ＤＮＡの構造はすでに公知であり得、この場合、修飾されたＯＤＮは、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン型対合の規則にしたがって標的領域に対し特異的に作成される。別法として、標的ＤＮＡ内に特異的部位は公知でないかもしれず、この場合、公知配列の修飾ＯＤＮとのハイブリダイゼーションの結果としてもたらされた切断部位は、それにも拘わらず、標的ＤＮＡ中の「マッチング」領域の存在および数についての情報を提供する。したがって、本発明のこの態様におよび実施例において、２０塩基対長のホモプリン／ホモピリミジンを含む二本鎖プラスミドＤＮＡのランは化学的に制限される。切断を行うために、１−１０μｇのプラスミドを、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン型塩基対合規則を用いたホモプリンランと配列特異的三本鎖を形成するように設計された１−１０μＭのＣ⁺／Ｔ、Ｇ／ＡまたはＧ／Ｔモチーフ２０量体のＯＤＮと共にインキュベートする。（Ａリッチなホモプリンランに対しては、Ｃ⁺／ＴまたはＧ／ＡモチーフＯＤＮが使用され；Ｇリッチなホモプリンランに対しては、Ｇ／ＡまたはＧ／ＴモチーフＯＤＮが用いられる）。トリプレックス形成は、一晩１５−３７℃にてｐＨ６.０（Ｃ⁺／Ｔモチーフ）またはｐＨ７.０−７.５（Ｇ／ＡまたはＧ／Ｔモチーフ）にて１０ｍＭＭｇＣｌ₂ の存在下に行う。５−メチルシトシン塩基のためのＣ⁺／Ｔモチーフ鎖中のＣ⁺ シンボルは、シトシンよりも、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン型対合のためにより適している。インキュベーション間に第三の鎖となる修飾ＯＤＮは、内部塩基残基に付加するか、または５’もしくは３’末端に付加された２つのアルキル化基を有してもよい。各アルキル化基は、標的デュプレックスの近くのグアニン残基のＮ−７位と反応する。デュプレックスの二本鎖破壊は、２つのグアニン残基がデュープレックスの反対側の鎖に存在するために起こる。アルキル化基が第三の鎖の内部塩基に付加される場合に、その塩基は、標的デュプレックス中の対立するＧ−ＣまたはＣ−Ｇ塩基対と誤対合を形成するように意図的に設計されるであろう。このことにより、アルキレーターによるグアニンのＮ−７位への接近が可能となる。対照的に、アルキル化基が、フランキングデュプレックス中の標的グアニン残基を標的とするようにＯＤＮの末端に付加される場合に、ＯＤＮ中の末端塩基は、標的の対向塩基対へ水素結合するように設計される。ＯＤＮ類上のアルキル化基の配置についての一般則は、以下の３つの実施例に例示され、ここに、上方の鎖は架橋可能な第三の鎖ＯＤＮであり；Ｘは末端アルキル化基を示し、一方Ｙは、内部５−（３−アミノプロピル）−２’−デオキシウリシン残基に付加されたアルキル化基を示す。標的デュプレックス中に架橋したグアニン塩基は、内太で表し、下線を付す。架橋可能なＯＤＮは配列番号により確認され、二本鎖標的は、単一の配列番号により確認される。実施例１ヒトＨＬＡＤＱＢ１０３０２対立遺伝子中のホモプリンランを標的とするＧ／ＡモチーフＯＤＮ３’−ＸＧＡＧＡＧＡＧＧＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＸ配列番号１５’−ＡＴＡＴＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＡＡ３’−ＴＡＴＡＴＴＣＣＴＣＴＣＴＣＣＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＧＴＴＴ配列番号２実施例２ヒト表皮成長因子受容体中のホモプリンランを標的とするＧ／ＴモチーフＯＤＮ：３’−ＧＧＧＴＧＧＴＧＹＴＧＴＧＹＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴ配列番号３５’−ＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡ３’−ＣＣＣＴＣＣＴＣＧＴＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＴＴ配列番号４実施例３ＨＩＶプロウイルスＤＮＡ中のホモプリンランを標的とするＣ⁺／Ｔ／ＧモチーフＯＤＮ：５’−ＴＴＴＴＣＴＴＴＴＹＧＧＧＧＧＴＸ配列番号５５’−ＴＴＴＴＴＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＣＴＧＧ３’−ＡＡＡＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＣ配列番号６修飾ＯＤＮを標的デュプレックスに複合体化させ、架橋させた後、架橋ＤＮＡを３７℃にて１２−２４時間、１０ｍＭリジン、アルギニンまたはヒスチジンとインキュベートする。前記したごとく、この方法の結果として、各架橋は、脱プリンおよびベータ−脱離経路を通じてニックに変換される。もしアルキル化グアニンがお互いに５−６塩基対内であれば、千鳥状ニックはＤＮＡを破壊する；さもなければ、破壊は、介在するデュプレックスの一部を除去するための、エキソヌクレアーゼIII（３’から５’消化）または子ウシ脾臓ホスホジエステラーゼ（５’から３’へ消化）との軽いインキュベーションにより達成される。エキソヌクレアーゼの選択は、ニックの位置に対する標的鎖の極性に依存する。もし必要ならば、エキソヌクレアーゼ処理に先立ち、トリプレックスを、マグネシウムイオンを過剰なＥＤＴＡと複合体化させ、次いで試料を使い捨てのゲル濾過カートリッジを通して遠心することにより破壊できる。遠心により同時にＯＤＮが除去され、プラスミドがエキソヌクレアーゼ緩衝液に交換される。消化後、後の実験のために、試料をフェノール抽出し、アルコール沈殿させることができる。特別の具体例および実験方法２,３,５,６−テトラフルオロフェニルトリフルオロアセテート２,３,５,６−テトラフルオロフェノール（５５.２ｇ，０.３３モル）、無水トリフルオロ酢酸（６０ｍｌ，０.４２モル）および三フッ化ホウ素エテレート（０.５ｍｌ）の混合物を１６時間還流した。無水トリフルオロ酢酸およびトリフルオロ酢酸を大気圧にて蒸留で除去した。無水トリフルオロ酢酸画分（沸点４０℃）を、０.５ｍｌ三フッ化ホウ素エテレートと共に反応混合物に戻し、混合物を２４時間還流した。このプロセスを２回繰返して、完全な反応を確実とした。大気圧での蒸留後、所望の生成物を無色液体として６２℃／４５ｍｍ（４５℃ ／１８ｍｍ）にて集めた：収率＝８１.３ｇ（９３％）；ｄ＝１.５２ｇ／ｍＬ；ｎ_D ²¹＝１.３７４７；ＩＲ（ＣＨＣｌ₃）３０１０，１８１５，１５２５，１４８５，１２３５，１１８０，１１１０，および９５５ｃｍ^-1．元素分析．Ｃ₈ＨＦ₇Ｏ₂として、計算値：Ｃ，３６.６６；Ｈ，０.３８；Ｆ，５０.７４．実測値：Ｃ，３６.３１；Ｈ，０.４３；Ｆ，５０.９５．２,３,５,６−テトラフルオロフェニル−４’−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルブチレート（クロラムブシル２,３,５,６−テトラフルオロフェニルエステル）５ｍｌの乾燥ジクロロメタン中の０.２５ｇ（０.８２ミリモル）のクロラムブシル（フルカ・エイ・ジイ(Fluka A．G.)より供給）および０.３ｇ（１.１ミリモル）の２,３,５,６−テトラフルオロフェニルトリフルオロアセテートの溶液に、０.２ｍｌの乾燥トリエチルアミンを添加した。混合物をアルゴン下室温にて０.５時間撹拌し、蒸発させた。残渣の油を、ヘキサン−クロロホルム（２：１）を溶出溶媒としたシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーにより精製して、エステルを油として得た：０.２８ｇ（７５％）；シリカゲル上のＴＬＣ（ＣＨＣｌ₃）Ｒ_f ０.６；ＩＲ（ＣＨＣｌ₃中）３０１０，１７８０，１６１３，１５２１，１４８５ｃｍ^-1．２−プロパルギルオキシエチル）アミン (ジョン，アール(John，R.)およびセイツ，ジー(Seitz，G.)、Chem．Ber.,123,133(1990))は、液体アンモニア中、ＮａＮＨ₂存在下にてプロピノールを臭化２−ブロモエチルアンモニウムと縮合させることにより調製した。３−（２−トリフルオロアセトアミドエトキシ）プロピン（２−プロパルギルオキシエチル）アミン（１３.８ｇ，０.１４ｍｏｌ）を撹拌し無水トリフルオロ酢酸（２６ｍｌ，０.１８モル）を滴下しつつイソ−プロパノール−ドライアイス浴中で冷却する。Ｎ−（２−プロパルギルオキシエチル）トリフルオロアセトアミドを８４−８５°／１.７トールにて油として蒸留し、これを冷凍して固化させる；収率１４.４ｇ（５２％）、融点（１６°，ｎ_p ²⁴ １.４１１０．元素分析Ｃ₇Ｈ₈Ｆ₃ＮＯ₂として、計算値：Ｃ，４３.０９，Ｈ，４.１３；Ｎ，７.１８；Ｆ，２９.２１．実測値：Ｃ，４２.８０；Ｎ，７.０６；Ｆ，２９.３８．５−［３−（２−トリフルオロアセトアミドエトキシ）プロピニル］−２’−デオキシウリジン５−ヨード−２’−デオキシウリジン（３.５４ｇ，１０ミリモル）、ヨウ化銅（Ｉ）（０.１９ｇ，１ミリモル）およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０.５８ｇ，０.５ミリモル）の混合物を減圧下６０°にて３時間乾燥し、アルゴン下におく。乾燥ＤＭＦ（２０ｍｌ）中の混合物の懸濁液をアルゴン下で撹拌し、乾燥トリエチルアミン（１.７ｍｌ，１２ミリモル）、次いで３−（２−トリフルオロアセトアミドエトキシ）フロピン（３.１７ｇ，１６ミリモル）で処理する。混合物を室温にて水浴中で冷却し、１７時間撹拌する。混合物を２％酢酸（１００ｍｌ）で処理し、触媒を濾過により除去し、５０％メタノールで洗浄する。濾液を合し、LiChroprep RP-18カラム（５×２５ｃｍ）を通し、カラムを洗浄し、５０％（ｖ／ｖ）メタノール中の１％酢酸で溶出する。主たる生成物の画分を合し、蒸発させ、減圧下で乾燥する。得られた発泡体を１５０ｍｌのエーテルと共に撹拌し、結晶性生成物を得る；収率３.６ｇ（８５％）；融点１４５−１５２℃。５−［３−（２−トリフルオロアセトアミドエトキシ）プロピル］−２’−デオキシウリジンメタノール（２０ｍｌ）中の５−［３−（２−トリフルオロアセトアミドエトキシ）プロピニル］−２’−デオキシウリジン（３.４ｇ，８.１ミリモル）を（３ｍｌ，７９ミリモルの冷９８％ギ酸の、２ｍｌ，５０ミリモルのドライアイス凍結２５％アンモニアへの添加により調製した）ギ酸アンモニウムおよび０.２ｇの１０％Ｐｄ／Ｃと共に室温にて水素雰囲気下で７時間撹拌する。触媒を濾過により除去し、濾液を蒸発させ、生成物をLiChroprep RP-18カラムで精製する。所望の生成物を含む画分を合し、真空中で蒸発乾固し、得られた固体を乾燥エーテルでトリチュレートして、３.０ｇ（８７％生成物、融点１０７−１１０℃ ；ｎｍでのλ_max、０．１Ｍトリエチルアミン−アセテート（ｐＨ７.５）、２２０、２６８）を得る。元素分析Ｃ₁₆Ｈ₂₂Ｆ₃Ｎ₃Ｏ₇として、計算値：Ｃ，４５.１８；Ｈ，５.２１；Ｎ，９.８８；Ｆ，１３.４０．実測値：Ｃ，４５.１６；Ｈ，５.１６；Ｎ，９.８８；Ｆ，１３.４０．合成オリゴヌクレオチド類の調製クロラムブシル残基のオリゴヌクレオチド類の第一級アミノ基の導入オリゴヌクレオチド類のセチルトリメチルアンモニウム塩の調製：１００μＬ分のオリゴヌクレオチドの水溶液（５０−５００μｇ）、一般的にはトリエチルアンモニウム塩を、セチルトリメチルアンモニウム型のDowex 50wx8を充填し、水中の５０％アルコールで予洗したカラム中に注入した。該カラムを５０％水性エタノール（０．１ｍＬ／分）によって溶出させた。オリゴヌクレオチドを含む画分を、２時間にわたりSpeedvac上で乾燥させ、以下の反応にて用いる。オリゴヌクレオチド（５０−１００μｇ）のセチルトリメチルアンモニウム塩のエタノール溶液（５０μＬ）を、アセトニトリル（５０μＬ）中の２,３,５, ６−テトラフルオロフェニル−４’−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルブチレート（クロラムブシルのテトラフルオロフェニルエステル）および３ μＬのジイソプロピルエチルアミンと混合した。３時間室温にて振蘯後、生成物を、アセトン中の２％ＬｉＣｌＯ₄により沈殿させた。生成物を、アセトン（１.５ｍｌ）中の２％ＬｉＣｌＯ₄により水（６０μＬ）から３回再沈殿させた。最終的に、該オリゴヌクレオチドのクロラムブシル誘導体を、約５０−８０％の収率にて逆相クロマトグラフィーによって精製した。生成物を含む画分を、ブタノールの添加により濃縮した。単離されたオリゴヌクレオチドのクロラムブシル誘導体を、アセトン溶液中に、ＬｉＣｌＯ₄と共に沈殿させ、アセトンで洗浄し、減圧下に濃縮した。反応性オリゴヌクレオチドの全ての取り扱いは、可能な限り速く行われ、生成物は氷冷浴中にあった。第三の鎖のオリゴヌクレオチドが、トリプレックス内のデュプレックスＤＮＡ標的の両鎖に架橋することの証明以下の配列を、二官能基性架橋を証明するために用いた：Ｃ：５’−ＸＣＴＴＴＣＣＴＣＴＣＴＴＴＴＣＣＣＣＸ−３’ 配列７Ａ：５’−ＡＡＡＴＡＣＴＧＧＧＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＡＣＧＴＡＴ−３’ Ｂ：３’−ＴＴＴＡＴＧＡＣＣＣＴＣＴＴＴＣＣＴＣＴＣＴＴＴＴＣＣＣＣＴＧＧＧＴＴＧＣＡＴＡ−５’ 配列８鎖ＡおよびＢは、通常の塩基対合によってワトソン−クリック型デュプレックスを形成し、Ｃは第三の鎖であり、これは、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン型水素結合によるデュプレックス内の鎖Ａに対合する。鎖Ｃ中のＸ残基は、アルキル化部位を有し、これは以下の式によって示される。この例において、ｐ−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルブチレート基（ＣＡと指名される）は、一例において、５−（アミノエトキシプロピル）デオキシウリジンに結合し、これは、オリゴヌクレオチドＣの３’−もしくは５’−末端、または両方の末端における末端ヌクレオチドである。第二の場合において、アルキル化基（ＣＡ）は、オリゴヌクレオチドの３’−もしくは５’−末端、または両方の末端においてリン酸にエステル化されているアミノヘキシル基に結合する。アルキル化残基ＣＡは、上記記載の方法によりオリゴヌクレオチドの反応性アミノ基上に置かれる。オリゴヌクレオチド類は、マキサムおよびギルバートの方法(Max am，A.M.;Gilbert，W.(1980)Methods in Enzymology,65,499)を用い、デュポン(NEN Research Products; Boston，MA)からの[Γ-³²Ｐ]ＡＴＰおよびユナイテッド・ステイツ・バイオケミカル(United States Biochemical)からのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで５’−標識された。³²Ｐ−標識生成物を、Dupont Nen sorb^TM２０カラム（Wilmington，DE）を用いて精製した。チェレンコフ計数を、ベックマス・インステルメンツ・インコーポレイテッド(Beckmann Instruments ，Inc.(Fullerton，CA))からのBeckman LS 5000TDにより行った。オリゴヌクレオチド濃度を、Ａ₂₆₀値から計算した。５μＬの水中の標識オリゴヌクレオチド、濃度５×１０^-7Ｍを含むそれぞれのハイブリダイゼーション混合物を、同じ濃度にて相補的に未標識の鎖と混合し、３５０ｍＭＮａＣｌ、１００ｍＭＭｇＣｌ₂、および１２５ｍＭカコジル酸Ｎａを含む、ｐＨ６.０の５μＬの緩衝液と混合した。混合後、混合物を３７ ℃にて１時間インキュベートし、次いで反応性オリゴヌクレオチドの５μＬの溶液（これはこの時まで氷冷して維持されていた）、濃度５×１０^-5を添加し、インキュベーションを、３７°にて数回続けた。電気泳動により、一緒に共有結合している、システム中の３つの鎖全てに対応するより遅く移動するバンドの形成が示され、これは二官能性架橋を示す。切断の位置は、インキュベーション混合物の、水中の１Ｍピロリジンでの１５分間の処理、水からの２回の蒸留、次いで２０％ゲル上のポリアクリルアミドゲル電気泳動によて確かめられた。この分析により、標識された標的鎖の期待される位置での特異的切断が示された；具体的には、グアニン類は、ＡおよびＢの両方の鎖上の鎖Ｃに対し５’に直ちに結合し、これは、鎖の式において下線を付すことによって示す。標的ＤＮＡの１の鎖に対し相同な配列を有する抗−遺伝子治療のための架橋機能を有する架橋オリゴヌクレオチド類および、二本鎖ＤＮＡのためのプローブとしての適用本発明の第三の態様により、ＯＤＮは、少なくとも１つの共有的に付加する架橋機能を有し、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の１の鎖の標的配列に相同的な連続配列中の少なくとも約２６ヌクレオチド単位を有する。本発明のこの態様におけるＯＤＮは、わずかに約３０００ヌクレオチド単位であり、好ましくはわずかに約３００ヌクレオチド単位であり、さらにより好ましくは約６０ヌクレオチド単位である。おおざっぱに言えば、架橋機能は、上記記載の構造のものであり、すなわち、それはＡ−ＬまたはＡ−Ｌ₂機能であって、ＯＤＮの内部ヌクレオチドユニットまたは末端ヌクレオチドユニットのいずれかに共有的に結合し、ここにＡ−Ｌ基またはＡ−Ｌ₂基の性質、ＡおよびＬの記号の意味およびこれらの基の特異的な具体例は、本発明の態様の第一または第二の主たる具体例と関連付けて上記に記載されている。本発明のこの態様による二本鎖ＤＮＡとの架橋のための架橋基の現在好ましい具体例は、反応基およびＮ−マスタードタイプ反応性基としてのα −ハロアシル基を含む。さらにより好ましくは、Ｎ−マスタードタイプ反応性基は、ＯＤＮの５−（３−アミノプロピル）（または同様の）置換２’−デオキシウリジン単位に付加する。Ｎ−マスタードタイプ反応性基は好ましくはビス（２ −クロロエチル）アミン、より好ましくはクロラムブシル由来であり、それゆえＣＯ−（ＣＨ₂）₃−Ｃ₆Ｈ₄−Ｎ−［ＣＨ₂ＣＨ₂Ｃｌ］₂の構造を有する。上記で述べたように、この「クロラムブシル」基は、ＯＤＮを、２,３,５,６−テトラフルオロフェニル−４’−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルブチラートとを反応させることにより、ＯＤＮの５−（３−アミノプロピル）（またはそのような）置換２’−デオキシウリジン単位のアミノ基に付くことができる。代法として、もう１つの好ましい具体例において、架橋基は、以下の部分構造に示されるように、共有的に、アルキルアミン、好ましくはヘキシルアミンテイルを通してＯＤＮの５’または３’末端に共有的に付加する。５’または３’−ＯＰＯ（ＯＨ）−Ｏ−（ＣＨ₂）₆−ＣＯ−（ＣＨ₂）₃−Ｃ₆Ｈ₄ −Ｎ−［ＣＨ₂ＣＨ₂Ｃｌ］₂）好ましくは、架橋基はＯＤＮの内部であるヌクレオチド単位に共有的に付着する。二本鎖ＤＮＡまたはＤＮＡフラグメントへのＯＤＮの配列特異的結合および１のＤＮＡ鎖への架橋は、「４−レター」ワトソン−クリック型認識モチーフに基づき本発明の態様に従い起こる。しかしながら、インビトロではリコンビナーゼ酵素が、結合および架橋が起こるために必要である。リコンビナーゼ酵素は、ｄｓＤＮＡへのＯＤＮのトリプレックスとしての結合を促進する。インビボにおいて、リコンビナーゼ酵素は、ほとんど偏在しており、本発明のこの態様によるＯＤＮ類は、細胞中の固有のリコンビナーゼ酵素の存在が原因であるトリプレックス形成およびその結果としての架橋を経験する。本発明は、しかしながら、特異的な天然のまたはリコンビナーゼ酵素起源のものに限定されず、単細胞生物由来のリコンビナーゼ類ならびに本発明中で機能可能なヒトもしくは哺乳類起源の細胞由来のものも含まれる。ＯＤＮの、二本鎖ＤＮＡへの結合および架橋は、十分な「４−レター」ワトソン−クリック認識モチーフを基礎として起こるので、本発明のこの態様は、発明の従来記載された態様よりも、治療的適用のために、または二本鎖ＤＮＡの配列特異的プローブ（例えば遺伝子マッピングのための）としての広い基礎を提供し、ここに、ｄｓＤＮＡへのＯＤＮの結合は、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン対合に基づく。リコンビナーゼ酵素の作用は、本発明のこの態様に従い必要であるので、この態様により設計されたＯＤＮ類は、それらのヌクレオチド単位に糖部位を含み、これは、リコンビナーゼ酵素による認識と矛盾しない。好ましくは、この態様によるＯＤＮ類は、２’−デオキシリボヌクレオチドおよびその活性中心に作用する等価物、２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチド類（Ｃ₁−Ｃ₆炭素のアルキル）および２’−デオキシ−２−フルオロリボヌクレオチド類からなる。本発明の前記記載の態様において、ｄｓＤＮＡの標的配列は、有害な構造遺伝子および、その脱活性化が治療的に有利な結果をもたらす、関連上流ならびに下流調節制御配列であり得る。標的細胞は、また、ウイルス、菌類、寄生虫、細菌および腫瘍細胞のごとき侵入生物の遺伝子も含む。制御配列は、転写または複製のいずれかに関与する。本発明の抗−遺伝子ＯＤＮは、機能の変化のために選択された標的ＤＮＡ配列により決定され、設計される。ＯＤＮは、選択された標的ＤＮＡの２つの鎖のうちの１つの中の標的配列に相同である（または事実上相同である）配列を有する。それは、ｄｓＤＮＡまたはそのフラグメントの１つの鎖に「相同」であるＯＤＮの配列が、ワトソン−クリックの意味において、ｄｓＤＮＡの他方の鎖またはそのフラグメントに相補的であるという先行による。この具体例のＯＤＮ類または本発明の態様は、診断用、分析用、「遺伝子−マッピング」および第二の具体例または本発明の態様のために上記に記載された目的のごとく使用できる。この具体例の利点は、それが、「４−レター」ワトソンクリック認識モードにおいて働くことである。全ＯＤＮは、ｄｓＤＮＡまたはそのフラグメントに相同である（または事実上相同である）必要はないが、ｄｓＤＮＡの対合配列（またはそのフラグメント）に相同である（または事実上相同である）ＯＤＮ中の連続配列中の約２６、および好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド単位が存在するべきである。さらに、架橋基は、約２６、またはそれ以上の相同である（または事実上相同である）ヌクレオチド単位の中または末端に付加するべきである。本発明に従うＯＤＮ類の、上述状態が満たされたと仮定する場合のｄｓＤＮＡ（またはそのフラグメント）に結合し、それと架橋する能力は以下の実験的実施例に証明される。架橋ＯＤＮ類の二本鎖ＤＮＡへの架橋の実験的実施例インビトロ実施例物質および方法ＲｅｃＡ蛋白質を、ユーエス・バイオケミカル・コーポレイション(US Biochemical Corporation)(Cleaveland，Ohio)から購入した。制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳｃａＩ、ＰｖｕＩおよびＡｓｅＩを、ニュー・イングランド・バイオラブズ(New England Biolabs)(Beverly，MA)から購入した。プロテイナーゼＫは、ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ(Boeringer Mannheim Biochemicals )(Indianapolis，IN)から得た。１９７および２７２ｂｐ長の短いＤＮＡフラグメント（アンプリコンズ）を、ＥｃｏＲＩで直線状にしたｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ（プロメガ(Promega) ）を鋳型として、標準的ＰＣＲプロトコール（パーキン・エルマー・シータス(P erkin Elmer Cetus)(Norwalk,CT)により合成した。増幅反応のためのプライマーのうち１つは、（Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび［Γ−³²Ｐ］ＡＴＰを用いた）選択的な５’−³²Ｐ−末端標識を可能とするために、その合成の間に化学的にリン酸化した。長いｄｓＤＮＡ標的については、ｐＧＥＭ−４ＺプラスミドＤＮＡ（プロメガ（Promega））を、ＳｃａＩ制限エンドヌクレアーゼでの環状化および引き続く両方の鎖の５’−³²Ｐ−末端標識の後用いた。全ての５’−³² Ｐ−末端標識ｄｓＤＮＡ基質を、使用前に、あらゆる可能なエキソヌクレアーゼまたはｓｓＤＮＡ混入を防ぐために、非変性ＰＡＧＥまたはアガロースゲル電気泳動によって精製した。オリゴヌクレオチドを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems ）３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー上にて、標準的なホスホロアミダイト化学により合成し、逆相ＨＰＬＣにより精製した。クロラムブシル反応性基は、オリゴヌクレオチド類の中の５−（３−アミノプロピル）−２’−デオキシウリジン残基または５’−アミノヘキシルリン酸基に、上記の他の場所で述べ、V．Kut yavin，Howard B.，Gamber，Alexander A．GallおよびRich B．Mayer，Jr．(199 3)J．Amer．Chem．Soc．115,9303(ここに引用して本明細書の一部とする)による論文中の、クロラムブシル２,３,５,６−テトラフルオロフェニルエステルでの合成後のアシル化により付加した。標準的反応条件神経コンプレックスを、氷上の１００ｎＭ反応性ＯＤＮ、２μＭＲｅｃＡ蛋白質および１０−１０ｎＭｄｓＤＮＡを混合し、次いで温度を３７℃にまで増加させることにより形成した。反応を、５０μＬ容積中で行い、１０ｍＭトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７.５）、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭＤＴＴ、１ｍＭ Γ−Ｓ−ＡＴＰおよび５％グリセロールを含んでいた。クロラムブシルによるｄｓＤＮＡ標的のアルキル化は、反応を、６時間３７℃にてインキュベートすることにより完結させた。修飾生成物の分析ｄｓＤＮＡの架橋部位を検出するために、反応混合物を、０.５％ＳＤＳおよび２００μｇ／ｍＬプロテイナーゼＫを含む緩衝液で２回希釈した。３０分の３７℃にてのインキュベーション後、試料をフェノール− クロロホルムで１回抽出し、エーテルで１−２回抽出し、エチルアルコールで沈殿させた。アルキル化したグアノシン類の位置でニックを誘導するために、ＤＮＡ沈殿を、１０％ピペリジンで９５℃にて３０分間処理した。試料をエチルアルコールで再び沈殿し、ＤＮＡを遠心により集め、乾燥し、０.１％キシレンシアノールおよびブロモフェノールブルーを含む８０％ホルムアミド中に溶解した。試料を８％変性ＰＡＧＥで分析し、ＤＮＡ切断部位を、マキサム，エイ・エムおよびギルバート，ダブリュ(Maxam，A.M.,& Gilbert，W.)(1977)Prog．Natl. Acad．Sci．U.S.A．74,５６０頁によるマキサムおよびギルバート反応で得られる精製物との、または制限エンドヌクレアーゼ反応により調製したマーカーとの比較により同定した。以下の式２は、ｐＧＥＭ−４ＺプラスミドＤＮＡの１５２３−１７９４領域と同一な２７２ｂｐのアンプリコン(amplicon)のヌクレオチドを書く。以下の表１は、上記インビトロ実験の結果を要約する。表は、オリゴヌクレオチド試薬と相同性のある領域中の２７２ｂｐのアンプリコンの配列を示す。反応性オリゴヌクレオチドの配列が以下に示され、１、１ａおよび２−１２（非相同性領域が下線タイプで示される）と番号を付けられる。Ｕ＊はクロラムブシル基が付加した５−（３−アミノプロピル）−２’−デオキシウリジン残基を意味する。５’−Ｃｈｌｂは６−アミノヘキシルリンカーを通じてオリゴヌクレオチドの５’−リン酸に付加するクロラムブシル基を意味する。表１から分かるように、ＯＤＮ１は５０ヌクレオチド単位を有し、これらは２７２塩基（ｂｐ）アンブリコン対中の対合配列に相同である。架橋基は、相同的配列中の２’−デオキシウリジンに付加する。ＯＤＮ１がアンプリコンに結合し、架橋剤を含む修飾されたデオキシヌクレオチドに塩基が対合するアデニンに、グアニンのうち１つがすぐに隣接するように架橋する。ＯＤＮ１ａはまたアンプリコンに相同的な５０ヌクレオチド単位を有し、その５’末端に架橋基を有する。ＯＤＮ１ａはまたＯＤＮ１ａの５’末端の結合部位のすぐ近くのグアニンへのアンプリコンへ結合し、架橋する。ＯＤＮ２はＯＤＮ１（内部Ｕ＊を有する）に類似するが、ただ４０の相同的ヌクレオチドからなる。ＯＤＮ２ははまたアンプリコンと架橋し、３０の相同的ヌクレオチド類を有するＯＤＮ３および内部に位置する架橋基（Ｕ＊）も架橋する。ＯＤＮ４はただ２０の相同的ヌクレオチドおよび内部に位置する架橋基を有する。ＯＤＮ４はアンプリコンに架橋しないか、または架橋はただ非常に不十分である。ＯＤＮ５は５０ヌクレオチド単位であるが、ただ２５のみがアンプリコンに相同的である。内部架橋剤は相同的配列中にあり、ＯＤＮ５は非常に不十分に架橋するだけである。このことは、２５の相同的ヌクレオチド以上が意味のある架橋のために必要であることを証明する。ＯＤＮ６は２５の相同的ヌクレオチドを有するが、架橋基は相同的領域中にない。ＯＤＮ６は架橋しないか非常に不十分に架橋するだけである。ＯＤＮ７は、２５の相同的ヌクレオチドを有するが、架橋基は相同的領域の中にない。ＯＤＮ７は配列中に３０の相同的ヌクレオチドを有し、架橋基は相同的領域内にある。ＯＤＮ７は２０の非−相同的ヌクレオチドの配列の存在にかかわらず、きわめて明らかに架橋する。ＯＤＮ８は３０の相同性および２０の非相同性ヌクレオチドを、それぞれ連続配列に有する。架橋剤は、非−相同性配列中にあり、ＯＤＮ８は架橋しない。ＯＤＮ９は配列中の４９の相同性単位中にあり、架橋する。ＯＤＮ１０−１２は、それぞれがただ２、３の非相同的ヌクレオチドを有するが、非−相同的単位は架橋基を有するヌクレオチドの近くに（隣またはそれぞれ１および２単位内に）位置する。ＯＤＮ類１０−１２は架橋しないか、または非常に不十分に架橋するだけである。関連する実験において、表１でＯＤＮ１および１ａと指名されるＯＤＮ類を、上記記載の条件下であるが、リコンビナーゼ酵素の非存在下にて２７２ｂｐのアンプリコンとインキュベートした。さらに関連する実験において、内部配置架橋基（表１のＯＤＮ１）および末端に位置する架橋基（表１のＯＤＮ１ａ）の間の架橋の効率を、マキサム・ギルバート配列決定法によりＰＡＧＥ電気泳動中で得られた適当なバンドの強度を考察することにより比較した。内部に位置する架橋基は、末端に位置する架橋基よりも約７倍以上効率的であることが見いだされた。ヒト・ゲノミックＤＮＡとのインビトロおよびインビボ架橋これらの実験にて用いられたＯＤＮ類は、以下の構造を有する５０量体または３０量体であった。５０量体：ＧＧＴＴＡＴＴＴＴＴＧＡＡＧＡＴＡＣＧＡＡＴＴＴＣＵ＊ＣＣＡＧＡＧＡＣＡＣＡＧＣＡＧＧＡＴＴＴＧＴＣＡ−ＨＥＸＡＮＯＬ３０量体：ＧＡＡＧＡＴＡＣＧＡＡＴＴＴＣＵ＊ＣＣＡＧＡＧＡＣＡＣＡＧＣＡ−ＨＥＸＡＮＯＬこれらの構造において、Ｕ＊はクロラムブシル基が付加した５−（３−アミノプロピル）−２’−デオキシウリジン残基を意味する。これらのＯＤＮ類は、ＨＬＡＤＱＢ１対立遺伝子０３０２（Larhammar，D.ら（1983）Proc．Natl．Acad. Sci．U.S.A．80,７３１３−７３１７頁のコード鎖に相補的である。インビトロ実験において、架橋オリゴヌクレオチド類は、リコンビナーゼ酵素（エシェリキア・コリ(Escherichia coli)由来のＲｅｃＡ）の存在下または非存在下にて裸のヒトゲノムＤＮＡに添加した。実験の記述試薬を、ゲノミックＤＮＡ−４０μｇ／ｍｌ；架橋ＯＤＮ−５×１０^-7Ｍ；ＲｅｃＡ＝２×１０^-6Ｍ；ＭｇＣｌ₂−１２ｍＭ；ＡＴＰガンマ−Ｓ−１ｍＭの終濃度となるように混合した。対照反応において、ＲｅｃＡまたはオリゴヌクレオチド類の存在を省略した。溶液を３７℃にて３時間インキュベートし、次いでプロテイナーゼＫ／ＳＤＳで３０分間３７℃にて除タンパクした。ＤＮＡをフェノール：クロロホルム抽出によって回収し、１Ｍピロリジンで９０℃にて３０分間処理し、ＤＮＡを架橋部位で切断した。ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、ライゲーション媒介ＰＣＲ反応を、Chong-Soon Leeら(Biochemistry 1994,33,６０２４頁−６０３０頁）によって記載されるごとく行い、架橋部位においてアルキル化によって起こったニックを可視化した。ＰＡＧＥ電気泳動上で観察されたごとく、この実験の結果は、ヒトのゲノミック対立遺伝子中の対合配列への５０量体および３０量体の結合および引き続く架橋が起ったことであるが、ＯＤＮおよびリコンビナーゼ酵素は両方ともインキュベーション混合物中に存在するときのみである。この実験により、二本鎖ゲノミックＤＮＡ中の配列にワトソン・クリックの意味で相補的である本発明のＯＤＮとインビトロで全ヒトゲノムＤＮＡの部位特異的アルキル化（ＯＤＮへの架橋）が証明される。インビボ細胞培養実験において、５０量体および３０量体ＯＤＮ類を、ＢＳＭＢ−リンパ球細胞培養に、以下に記載する条件下にて添加した。実験の記述ＢＳＭＢ−リンパ球細胞を、４.５×１０⁶細胞／ｍｌとなる密度まで２５ｍｌフラスコ中で増殖させた。培地：５００ｍｌのＬ−グルタミン含有ＲＰＭＩ１６４０（２ｍＭ）（Gibco BRL カタログ番号11875-036）５０ｍｌのＨＩ−ＦＣＳ（ウシ胎児血清：Gibco BRL カタログ番号26140，５５℃にて３０分間の熱による不活性化）５ｍｌの１００×Penn/Strep(Gibco BRL カタログ番号15070-022) ５ｍｌの２００ｍＭＬ−グルタミン（Gibco BRL カタログ番号25030-024）５ｍｌの１ＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.３の１００×ピルビン酸ナトリウム（１１ｍｇ／ｍｌフィルター滅菌）（Gibco BRL カタログ番号15630-023）それぞれの処理につき、２ｍｌをＢＳＭ細胞フラスコ（２５ｍｌ）から採取し、１,２００ｒｐｍにて５分間遠心し、次いで、注意：血清フリー培地は、５０ｍｌのＨＩ−ＦＣＳ（(Gibco BRL カタログ番号2 6140、５５℃にて３０分間熱により不活性化)が存在しない以外は上記培地と同一である中に再懸濁した。それぞれの試料を３７℃にて４８ウェルのマイクロタイタープレート中の５％ＣＯ₂と３.５時間インキュベートした。細胞を１.５ｍｌのプラスチック遠心チューブに移し、５分間２，０００ｒｐｍにて沈殿させ、５００μｌＰＢＳで２回洗浄し、プロテイナーゼＫ／ＳＤＳで３７℃にて一晩脱タンパクした。ＤＮＡをフェノール：クロロホルム抽出およびＲｎａｓｅＡ消化により除タンパクし、１Ｍピロリジンが９０℃にて３０分間処理し、ＤＮＡを架橋部位にて切断した。ピロリジンをエタノール沈殿により除去し、ライゲーション−媒介ＰＣＲ反応をChong-Soon Leeら(上記)により記載し、アルキル化により生じたニックを可視化した。上述の実験により、５０量体および３０量体のＯＤＮ配列は、ヒト・ゲノミックＤＮＡ中の０３０２対立遺伝子に特異的に結合し、アルキル化（架橋）することが示された。上述のことを考慮すれば、本発明のオリゴヌクレオチドの一般的構造は、式３：［式中、Ｂ−Ｒ−Ｐ＊は、所望によりリポーター基を担持するか、あるいは所望により放射活性標識を含んでいてもいオリゴヌクレオチドのヌクレオチド形勢ブロックを示す。Ｂ−Ｒ−Ｐ＊は中間体ヌクレオチド単位および５’−ならびに３ ’末端ヌクレオチド単位を含む。具体的には、Ｂはヌクレオチドのヘテロ環塩基成分を示し、Ｒはピラノースもしくはフラノース環を形成する糖部位、またはその同配体アナログを示し、Ｐ＊はホスフェートモノエステル、ホスフェートジエステルまたはホスフェートトリエステル基を含めたホスフェート基を示し、あるいはＰ＊は該ホスフェート基のモノチオエートまたはジチオエートアナログを示す。Ｐ＊はさらに内部ヌクレオチジル結合中の上記ホスフェート、ホスホチオエートまたはホスホジオチオエート基およびオリゴヌクレオチドの５’ならびに３ ’末端を含む。（Ａ−（Ｌ）_v）_wグルーピングは、基Ａ−Ｌが、標的配列とのハイブリダイゼーション後のみ反応するという意味では、Ｌが脱離基であって、Ａ −（Ｌ）_vが、ＤＮＡまたはＲＮＡの標的配列とハイブリダイゼーションする条件で不活性であるような求電子性アルキル化基を形成する。ｎは５およびほぼ３００の間の値である整数であり；ｖは１または２であり；ｗは１−１０の間であり、該オリゴヌクレオチドはワトソン・クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーンの意味で一本鎖また二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡの標的配列と相補的である配列を含む］で示される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ガンパー，ハワード・ビーアメリカ合衆国98078ワシントン州ウッディンビル、トゥーハンドレッドトゥエルフス・ドライブ・ノース・イースト14048 番 (72)発明者カットヤビン，イゴール・ブイアメリカ合衆国98012ワシントン州ボゼル、ノース・ロード・ナンバー・ビー101、 16520番 (72)発明者ゴール，アレキサンダー・エイアメリカ合衆国98012ワシントン州ボゼル、ノース・ロード・ナンバー・ビー205、 16520番 (72)発明者ペトリー，チャールズ・アールアメリカ合衆国98072ワシントン州ウッディンビル、ワンハンドレッドナインティシックスス・プレイス・ノース・イースト 18459番 (72)発明者タボーン，ジョン・シーアメリカ合衆国98011ワシントン州ボゼル、ワンハンドレッドシックスティシックスス・プレイス・ノース・イースト12117 番 (72)発明者ハースト，ジェラルド・ディアメリカ合衆国77380テキサス州ザ・ウッドランズ、ペインテッド・サンセット 39番

Claims

【特許請求の範囲】１．式：［式中、Ｂ−Ｒ−Ｐ＊は、所望によりレポーター基を担持するか、あるいは所望により放射性標識を含んでいてもよいオリゴヌクレオチドのヌクレオチド形成ブロックを表し；該Ｂ−Ｒ−Ｐ＊中のＢは、ヌクレオチドの複素環塩基成分を表し、該Ｂ−Ｒ−Ｐ＊中のＲはピラノースまたはフラノース環を形成する糖部位、またはその同配体アナログを表し、該Ｂ−Ｒ−Ｐ＊中のＰ＊はホスフェートモノエステル、ホスフェートジエステルまたはホスフェートトリエステル基を含めたホスフェート基を表し、あるいはＰ＊は該ホスフェート基のモノチオエートまたはジチオエートアナログを表し；（Ａ−（Ｌ）_v）_wは、Ｌが親電子脱離基であり、ＡがＬをオリゴヌクレオチドに共有結合させる基であり、かつＡ−（Ｌ）_vｆＤＮＡまたはＲＮＡの標的配列とのハイブリダイゼーションの条件下で不活性であり、かつＡ−（Ｌ）_vがハイブリダイゼーションの後のみに標的配列と反応する親電子アルキル化基を表し；ｎは５およびほぼ３０００の間の値を持つ整数であり；ｖは１または２であり；ｗは１−１０の間であり、該オリゴヌクレオチドはワトソンクリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーンの意味で一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡの標的配列と相補的である配列を含む］で示されるオリゴヌクレオチド。２．該オリゴヌクレオチドが５ないしほぼ３００ヌクレオチド単位を有し、かつワトソンクリックの意味でＲＮＡ、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ中の標的配列と相補的である配列を含む請求項１記載のオリゴヌクレオチド。３．該Ｒ基がβ−２−デオキシリボフラノース、β−リボフラノース、β−２ −Ｏ−メトキシリボフラノース、およびβ−２−デオキシ−２−フルオロリボフラノースを表す請求項２記載のオリゴヌクレオチド。４．該（Ａ−（Ｌ）_v）_wがオリゴヌクレオチドの複素環塩基成分に共有結合した請求項２記載のオリゴヌクレオチド。５．該（Ａ−（Ｌ）_v）_w基が、 −（ＣＨ₂）_q−Ｙ−（ＣＨ₂）_m−Ｌ、 −（ＣＨ₂）_q−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ₂）_m−（Ｘ）_n’−Ｎ（Ｒ₁）−（ＣＨ₂）_p −Ｌ、および −（ＣＨ₂）_q’−Ｏ−（ＣＨ₂）_q”−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ₂）_m−（Ｘ）_a’− Ｎ（Ｒ₁）−（ＣＨ₂）_p−Ｌ［式中、ｍおよびｑの各々が独立して包括的に０ないし８であり、ｑ’が包括的に３ないし７であり、ｑ”が包括的に１ないし７であり、Ｙが、ヒドロカルビル骨格を有し、かつ各末端に−ＮＨ₂、−ＯＨ、ＳＨ、− ＣＯＯＨおよびＣ≡ＣＨから選択される官能基を有する二官能性分子に由来する連結基であり、Ｘがフェニル、またはクロロ、ブロモ、低級アルキルまたは低級アルコキシ基で置換されたフェニルであり、ｎ’が０または１であり、ｐは１ないし６の整数であり、Ｒ₁はＨ、低級アルキルまたは（ＣＨ₂）_p−Ｌである］よりなる群から選択される請求項４記載のオリゴヌクレオチド。６．該（Ａ−（Ｌ）_v）_w基が−（ＣＨ₂）_q−Ｙ−（ＣＨ₂）_m−Ｌである請求項５記載のオリゴヌクレオチド。７．該−（ＣＨ₂）_q−Ｙ−（ＣＨ₂）_m−Ｌ基が３−ヨードアセトアミドプロピル、３−（４−ブロモブチルアミド）プロピル、４−ヨードアセトアミドブチルおよび４−（４−ブロモブチルアミド）ブチルよりなる群から選択される請求項６記載のオリゴヌクレオチド。８．放射性活性標識を担持する請求項６記載のオリゴヌクレオチド。９．Ｌ基がクロロ、ブロモ、ヨード、ＳＯ₂Ｒ"'、およびＳ⁺Ｒ"'Ｒ""よりなる群から選択され、ここに、Ｒ"'およびＲ""の各々は独立してＣ_1-6アルキルまたはアリールであるか、あるいはＲ"'およびＲ""は一緒になってＣ_1-6アルキレン架橋を形成する請求項１記載のオリゴヌクレオチド。１０．該オリゴヌクレオチドが５ないしほぼ３００ヌクレオチド単位を有し、かつフーグスティーンまたは逆フーグスティーンの意味で二本鎖ＤＮＡ中の標的配列に相補的な配列を含み、ここに（Ａ−（Ｌ）_v）_wの定義において、ｗが２ないし１０である場合、ｖが１または２であり、およびｗが１である場合、ｖが２であり、それにより、オリゴヌクレオチドは少なくとも２個のアルキル化剤機能を含む請求項１記載のオリゴヌクレオチド。１１．該架橋剤（Ａ−（Ｌ）_v）_wが複素環塩基に結合した請求項１０記載のオリゴヌクレオチド。１２．該（Ａ−（Ｌ）_v）_wが、 −（ＣＨ₂）_q−Ｙ−（ＣＨ₂）_m−Ｌ、（ＣＨ₂）_q−ＣＯ−ＣＨ₂−Ｌ、−（ＣＨ₂）_q−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ₂）_m−（Ｘ）_n’−Ｎ（Ｒ₁）−（ＣＨ₂）_p−Ｌ、および−（ＣＨ₂）_q’−Ｏ−（ＣＨ₂）_q”−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ₂）_m−（Ｘ）_n’ −Ｎ（Ｒ₁）−（ＣＨ₂）_p−Ｌ［式中、ｍおよびｑは独立して包括的に０ないし８であり、ｑ’は包括的に３ないし７であり、ｑ”は包括的に１ないし７であり、Ｙは、ヒドロカルビル骨格を有し、かつ−ＮＨ₂、−ＯＨ、ＳＨ、−ＣＯＯＨおよびＣ≡ＣＨより選択される官能基を各末端に有する二官能性分子に由来する連結基であり、かつＸはフェニル、またはクロロ、ブロモ、低級アルキルまたは低級アルコキシ基で置換されたフェニルであり、ｎ’は０または１であり、ｐは１ないし６の整数であり、Ｒ₁はＨ、低級アルキルまたは−（ＣＨ₂）_p−Ｌである］よりなる群から選択される請求項１１記載のオリゴヌクレオチド。１３．該架橋剤（Ａ−（Ｌ）_v）_wがウラシル塩基の５−位に結合した請求項１２記載のオリゴヌクレオチド。１４．該（Ａ−（Ｌ）_v）_w基が、 −（ＣＨ₂）₃Ｏ（ＣＨ₂）₂ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₃−Ｃ₆Ｈ₄−Ｎ−［ＣＨ₂ＣＨ₂Ｃｌ］₂および −（ＣＨ₂）₃ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₃−Ｃ₆Ｈ₄−Ｎ−［ＣＨ₂ＣＨ₂Ｃｌ］₂ よりなる群から選択される請求項１３記載のオリゴヌクレオチド。１５．該（Ａ−（Ｌ）_v）_w基が、ほぼ２ないし５０個の炭素の通常のアルキル鎖と長さが等しい請求項１０記載のオリゴヌクレオチド。１６．該架橋剤（Ａ−（Ｌ）_v）_wがホスフェート基に結合された請求項１０記載のオリゴヌクレオチド。１７．３’および５’ホスフェート末端を有し、ここに、該架橋剤（Ａ−（Ｌ）_v）_wが３’および５’ホスフェート末端に結合した請求項１６記載のオリゴヌクレオチド。１８．（Ａ−（Ｌ）_v）_w基が、 −（ＣＨ₂）_q−Ｙ−（ＣＨ₂）_m−Ｌ、（ＣＨ₂）_q−ＣＯ−ＣＨ₂−Ｌ、−（ＣＨ₂）_q−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ₂）_m−（Ｘ）_n’−Ｎ（Ｒ₁）−（ＣＨ₂）_p−Ｌ、および−（ＣＨ₂）_q’−Ｏ−（ＣＨ₂）_q−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ₂）_m−（Ｘ）_n’− Ｎ（Ｒ₁）−（ＣＨ₂）_p−Ｌ［式中、ｍおよびｑは独立して包括的に０ないし８、ｑ’は包括的に３ないし７、ｑ”は包括的に１ないし７であり；Ｙは、ヒドロカルビル骨格を有し、かつ−ＮＨ₂、−ＯＨ、ＳＨ、−ＣＯＯＨおよびＣ≡ＣＨより選択される官能基を各末端に有する二官能性分子に由来する連結基であり、かつＸはフェニル、またはクロロ、ブロモ、低級アルキルまたは低級アルコキシ基で置換されたフェニルであり、ｎ’は０または１であり、ｐは１ないし６の整数であり、Ｒ₁はＨ、低級アルキルまたは−（ＣＨ₂）_p−Ｌである］よりなる群から選択される請求項１７記載のオリゴヌクレオチド。１９．該（Ａ−（Ｌ）_v）_w基が −（ＣＨ₂）₃Ｏ（ＣＨ₂）₂ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₃−Ｃ₆Ｈ₄−Ｎ−［ＣＨ₂ＣＨ₂Ｃｌ］₂、 −（ＣＨ₂）₃ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₃−Ｃ₆Ｈ₄−Ｎ−［ＣＨ₂ＣＨ₂Ｃｌ］₂、および −（ＣＨ₂）₆ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₃−Ｃ₆Ｈ₄−Ｎ−［ＣＨ₂ＣＨ₂Ｃｌ］₂ よりなる群から選択される請求項１０記載のオリゴヌクレオチド。２０．Ｌ基がクロロ、ブロモ、ヨード、ＳＯ₂Ｒ"'、およびＳ⁺Ｒ"'Ｒ""よりなる群から選択され、ここに、Ｒ"'およびＲ""の各々が独立してＣ_1-6アルキルまたはアリールであるか、あるいはＲ"'およびＲ""は一緒になってＣ_1-6アルキレン架橋を形成する請求項１０記載のオリゴヌクレオチド。２１．二本鎖ＤＮＡの標的配列にワトソンクリックの意味において相補的である少なくともほぼ２６ヌクレオチド単位の連続的配列を含み、ここに、該（Ａ− （Ｌ）_v）_w基が、標的配列に相補的な連続的配列に共有結合し、ここに、各オリゴヌクレオチド単位におけるＲ基が２−デオキシリボフラノシル、および２−Ｏ −アルキルリボフラノシル、２−デオキシ−２−フルオロリボフラノシルから選択される請求項１記載のオリゴヌクレオチド。２２．ほぼ３００個以下のヌクレオチド単位を有する請求項２１記載のオリゴヌクレオチド。２３．ほぼ６０個以下のヌクレオチド単位を有する請求項２２記載のオリゴヌクレオチド。２４．該（Ａ−（Ｌ）_v）_w基が二本鎖ＤＮＡの標的配列と相補的な連続的配列の内部にあるヌクレオチド単位に共有結合した請求項２１記載のオリゴヌクレオチド。２５．（Ａ−（Ｌ）_v）_wが −（ＣＨ₂）_q−Ｙ−（ＣＨ₂）_m−Ｌ、（ＣＨ₂）_q−ＣＯ−ＣＨ₂−Ｌ、−（ＣＨ₂）_q−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ₂）_m−（Ｘ）_n’−Ｎ（Ｒ₁）−（ＣＨ₂）_p−Ｌ、および−（ＣＨ₂）_q’−Ｏ−（ＣＨ₂）_q”−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ₂）_m−（Ｘ）_n’ −Ｎ（Ｒ₁）−（ＣＨ₂）_p−Ｌ［式中、ｍおよびｑは独立して包括的に０ないし８、ｑ’は包括的に３ないし７、ｑ”は包括的に１ないし７であり；Ｙは、ヒドロカルビル骨格を有し、かつ−ＮＨ₂、−ＯＨ、ＳＨ、−ＣＯＯＨおよびＣ≡ＣＨより選択される官能基を各末端に有する二官能性分子に由来する連結基であり、かつＸはフェニル、またはクロロ、ブロモ、低級アルキルまたは低級アルコキシ基で置換されたフェニルであり、ｎ’は０または１であり、ｐは１ないし６の整数であり、Ｒ₁はＨ、低級アルキルまたは−（ＣＨ₂）_p−Ｌである］よりなる群から選択される請求項２１記載のオリゴヌクレオチド。２６．該（Ａ−（Ｌ）_v）_w基が −（ＣＨ₂）₃Ｏ（ＣＨ₂）₂ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₃−Ｃ₆Ｈ₄−Ｎ−［ＣＨ₂ＣＨ₂Ｃｌ］₂、 −（ＣＨ₂）₃ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₃−Ｃ₆Ｈ₄−Ｎ−［ＣＨ₂ＣＨ₂Ｃｌ］₂、および −（ＣＨ₂）₆ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₃−Ｃ₆Ｈ₄−Ｎ−［ＣＨ₂ＣＨ₂Ｃｌ］₂ よりなる群から選択される請求項２５記載のオリゴヌクレオチド。２７．該架橋剤（Ａ−（Ｌ）_v）_wがウラシル塩基の５−位に結合した請求項２５記載のオリゴヌクレオチド。２８．該（Ａ−（Ｌ）_v）_w基が、 −（ＣＨ₂）₃Ｏ（ＣＨ₂）₂ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₃−Ｃ₆Ｈ₄−Ｎ−［ＣＨ₂ＣＨ₂Ｃｌ］₂および −（ＣＨ₂）₃ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₃−Ｃ₆Ｈ₄−Ｎ−［ＣＨ₂ＣＨ₂Ｃｌ］₂ よりなる群から選択される請求項２７記載のオリゴヌクレオチド。２９．該−（ＣＨ₂）_q−Ｙ−（ＣＨ₂）_m−Ｌ基が３−ヨードアセトアミドプロピル、３−（４−ブロモブチルアミド）プロピル、４−ヨードアセトアミドブチルおよび４−（４−ブロモブチルアミド）ブチルよりなる群から選択される請求項２５記載のオリゴヌクレオチド。３０．Ｌ基がクロロ、ブロモ、ヨード、ＳＯ₂Ｒ"'、およびＳ⁺Ｒ"'Ｒ""よりなる群から選択され、ここに、Ｒ"'およびＲ""の各々が独立してＣ_1-6アルキルまたはアリールであるか、あるいはＲ"'およびＲ""は一緒になってＣ_1-6アルキレン架橋を形成する請求項２１記載のオリゴヌクレオチド。３１．該架橋剤（Ａ−（Ｌ）_v）_wがホスフェート基に結合している請求項２１記載のオリゴヌクレオチド。３２．（Ａ−（Ｌ）_v）_wが −（ＣＨ₂）_q−Ｙ−（ＣＨ₂）_m−Ｌ、（ＣＨ₂）_q−ＣＯ−ＣＨ₂−Ｌ、−（ＣＨ₂）_q−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ₂）_m−（Ｘ）_n’−Ｎ（Ｒ₁）−（ＣＨ₂）_p−Ｌ、および−（ＣＨ₂）_q’−Ｏ−（ＣＨ₂）_q”−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ₂）_m−（Ｘ）_n’ −Ｎ（Ｒ₁）−（ＣＨ₂）_p−Ｌ［式中、ｍおよびｑは独立して包括的に０ないし８、ｑ’は包括的に３ないし７、ｑ”は包括的に１ないし７であり；Ｙは、ヒドロカルビル骨格を有し、かつ−ＮＨ₂、−ＯＨ、ＳＨ、−ＣＯＯＨおよびＣ≡ＣＨより選択される官能基を各末端に有する二官能性分子に由来する連結基であり、かつＸはフェニル、またはクロロ、ブロモ、低級アルキルまたは低級アルコキシ基で置換されたフェニルであり、ｎ’は０または１であり、ｐは１ないし６の整数であり、Ｒ₁はＨ、低級アルキルまたは−（ＣＨ₂）_p−Ｌである］よりなる群から選択される請求項３１記載のオリゴヌクレオチド。３３．該（Ａ−（Ｌ）_v）_w基が −（ＣＨ₂）₃Ｏ（ＣＨ₂）₂ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₃−Ｃ₆Ｈ₄−Ｎ−［ＣＨ₂ＣＨ₂Ｃｌ］₂、 −（ＣＨ₂）₃ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₃−Ｃ₆Ｈ₄−Ｎ−［ＣＨ₂ＣＨ₂Ｃｌ］₂、および −（ＣＨ₂）₆ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₃−Ｃ₆Ｈ₄−Ｎ−［ＣＨ₂ＣＨ₂Ｃｌ］₂ よりなる群から選択される請求項３２記載のオリゴヌクレオチド。３４．該（Ａ−（Ｌ）_v）_w基が−（ＣＨ₂）₆ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₃−Ｃ₆Ｃ₄−Ｎ −［ＣＨ₂ＣＨ₂Ｃｌ］₂である請求項３２記載のオリゴヌクレオチド。３５．リコンビナーゼ酵素の存在下、標的配列を有する二本鎖ＤＮＡを式：［式中、Ｂ−Ｒ−Ｐ＊は、所望によりレポーター基を担持するか、あるいは所望により放射性標識を含んでもよいオリゴヌクレオチドのヌクレオチド形成ブロックを表し；該Ｂ−Ｒ−Ｐ＊中のＢは、ヌクレオチドの複素環塩基成分を表し、該Ｂ−Ｒ−Ｐ＊中のＲは２−デオキシ−Ｄ−リボフラノースまたは２−デオキシ− ２−フルオロ−Ｄ−リボフラノースより選択される糖部位を表し、該Ｂ−Ｒ−Ｐ＊中のＰ＊はホスフェートモノエステル、ホスフェートジエステルまたはホスフェートシリエステル基を含めたホスフェート基を表し、あるいはＰ＊は該ホスフェート基のモノチオエートまたはジチオエートアナログを表し；（Ａ−（Ｌ）_v）_wは、Ｌが親電子脱離基であり、ＡがＬをオリゴヌクレオチドに共有結合させる基であり、かつＡ−（Ｌ）_vはＤＮＡの標的配列とのハイブリダイゼーションの条件下で不活性であり、かつＡ−Ｌはハイブリダイゼーションの後のみに標的配列と反応する親電子アルキル化剤を表し；ｎは５およびほぼ３０００の間の値の整数であり；ｖは１または２であり；ｗは１−１０の間であり、該オリゴヌクレオチドは、少なくともほぼ２６個のヌクレオチド単位の連続的配列を含み、その配列は、ワトソンクリックの意味で二本鎖ＤＮＡの標的配列と相補的であり、ここに、該（Ａ−（Ｌ）_v）_w基は、標的配列に相補的な連続的配列に共有結合している］のオリゴヌクレオチドと接触させることを特徴とする二本鎖ＤＮＡにおける標的配列と架橋する方法。３６．イン・ビトロで行われる請求項３５記載の方法。３７．オリゴヌクレオチドがほぼ３００個以下のヌクレオチド単位を有する請求項３５記載の方法。３８．ほぼ６０個以下のヌクレオチド単位を有する請求項２７記載のオリゴヌクレオチド。３９．該（Ａ−（Ｌ）_v）_wが −（ＣＨ₂）_q−Ｙ−（ＣＨ₂）_m−Ｌ、（ＣＨ₂）_q−ＣＯ−ＣＨ₂−Ｌ、−（ＣＨ₂）_q−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ₂）_m−（Ｘ）_n’−Ｎ（Ｒ₁）−（ＣＨ₂）_p−Ｌ、および−（ＣＨ₂）_q’−Ｏ−（ＣＨ₂）_q”−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ₂）_m−（Ｘ）_n’ −Ｎ（Ｒ₁）−（ＣＨ₂）_p−Ｌ［式中、ｍおよびｑの各々は独立して包括的に０ないし８、ｑ’は包括的に３ないし７、ｑ”は包括的に１ないし７であり；Ｙは、ヒドロカルビル骨格を有し、かつ−ＮＨ₂、−ＯＨ、ＳＨ、−ＣＯＯＨおよびＣ≡ＣＨより選択される官能基を各末端に有する二官能性分子に由来する連結基であり、かつＸはフェニル、またはクロロ、ブロモ、低級アルキルまたは低級アルコキシ基で置換されたフェニルであり、ｎ’は０または１であり、ｐは１ないし６の整数であり、Ｒ₁はＨ、低級アルキルまたは−（ＣＨ₂）_p−Ｌである］よりなる群から選択される基である請求項３５記載の方法。４０.該（Ａ−（Ｌ）_v）_w基が −（ＣＨ₂）₃Ｏ（ＣＨ₂）₂ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₃−Ｃ₆Ｈ₄−Ｎ−［ＣＨ₂ＣＨ₂Ｃｌ］₂、 −（ＣＨ₂）₃ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₃−Ｃ₆Ｈ₄−Ｎ−［ＣＨ₂ＣＨ₂Ｃｌ］₂、および −（ＣＨ₂）₆ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₃−Ｃ₆Ｈ₄−Ｎ−［ＣＨ₂ＣＨ₂Ｃｌ］₂ よりなる群から選択される請求項３９記載の方法。４１．該（Ａ−（Ｌ）_v）_w基が二本鎖ＤＮＡの標的配列と相補的な連続配列の内部にあるヌクレオチド配列に共有結合した請求項３９記載の方法。