KR20200120634A - 핵산 분자의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

5' 말단에 인산기를 갖는 제 1 의 1 본쇄 RNA 와 3' 말단에 수산기를 갖는 제 2 의 1 본쇄 RNA 에, RNA 리가아제를 작용시켜, 상기 제 1 의 1 본쇄 RNA 와 상기 제 2 의 1 본쇄 RNA 를 연결하는 공정을 포함하는 1 본쇄 RNA 의 제조 방법. 제 1 의 1 본쇄 RNA 가, 5' 말단측으로부터 차례로, X1 영역 및 Z 영역으로 이루어지는 1 본쇄 RNA 이고 ; 제 2 의 1 본쇄 RNA 가, 5' 말단측으로부터 차례로, X2 영역, Y2 영역, Ly 링커 영역 및 Y1 영역으로 이루어지는 1 본쇄이고 ; X1 영역과 X2 영역이, 서로 상보적인, 적어도 2 뉴클레오티드 길이인 동일한 뉴클레오티드수의 뉴클레오티드 서열이고 ; Y1 영역과 Y2 영역이, 서로 상보적인, 적어도 2 뉴클레오티드 길이인 동일한 뉴클레오티드수의 뉴클레오티드 서열이다.

Description

핵산 분자의 제조 방법
본 발명은, 핵산 분자의 제조 방법에 관한 것이다.
본원은, 2018년 2월 9일에, 일본에 출원된 일본 특허출원 2018-21799호에 기초하여 우선권을 주장하고, 그 내용을 여기에 원용한다.
특허문헌 1 및 2 에는, RNA 간섭법에 사용되는 1 본쇄 RNA 가 개시되어 있고, 이러한 화합물의 제조 방법으로는, 핵산 합성 장치를 사용하여 다단계의 화학 반응에 의해 제조하는 방법이 알려져 있다.
국제 공개 제2012/017919호 국제 공개 제2013/103146호
본 발명은, 1 본쇄 RNA 의 간편한 제조 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명은, 이하의 양태를 포함한다.
본 발명의 일 양태에 관련된 1 본쇄 RNA 의 제조 방법은, 5' 말단에 인산기를 갖는 제 1 의 1 본쇄 RNA 와 3' 말단에 수산기를 갖는 제 2 의 1 본쇄 RNA 에, 국제 생화학 연합이 효소 번호로서 정하는 EC6.5.1.3 으로 분류되고, 2 본쇄 닉 수복 활성을 갖는 RNA 리가아제를 작용시켜, 상기 제 1 의 1 본쇄 RNA 와 상기 제 2 의 1 본쇄 RNA 를 연결하는 공정을 포함하는 1 본쇄 RNA 의 제조 방법으로서, 이하의 a) ∼ g) 의 특징을 갖는 제조 방법이다 :
a) 상기 제 1 의 1 본쇄 RNA 가, 5' 말단측으로부터 차례로, X1 영역 및 Z 영역으로 이루어지는 1 본쇄 RNA 이고 ;
b) 상기 제 2 의 1 본쇄 RNA 가, 5' 말단측으로부터 차례로, X2 영역, Y2 영역, Ly 링커 영역 및 Y1 영역으로 이루어지는 1 본쇄이고 ;
c) 상기 X1 영역과 상기 X2 영역이, 서로 상보적인, 2 이상의 동수의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열이고 ;
d) 상기 Y1 영역과 상기 Y2 영역이, 서로 상보적인, 2 이상의 동수의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열이고 ;
e) 상기 Z 영역이, 임의의 뉴클레오티드수의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 영역이고 ;
f) 상기 Ly 링커 영역이 아미노산으로부터 유도되는 원자단을 갖는 링커 영역이고 ;
g) 상기 제 1 의 1 본쇄 RNA 와 상기 제 2 의 1 본쇄 RNA 의 연결에 의해 생성되는 1 본쇄 RNA 가, 5' 말단측으로부터 차례로, 상기 X2 영역, 상기 Y2 영역, 상기 Ly 링커 영역, 상기 Y1 영역, 상기 X1 영역 및 상기 Z 영역으로 이루어지는 연결 1 본쇄 RNA 이다.
또, 본 발명의 일 양태에 관련된 1 본쇄 RNA 의 제조 방법은, 상기 제조 방법에 있어서, 상기 Z 영역이, 5' 말단측으로부터 차례로, Z1 영역, Lz 링커 영역 및 Z2 영역으로 이루어지는 영역이고, 상기 Lz 링커 영역이 아미노산으로부터 유도되는 원자단을 갖는 링커 영역이고, 상기 Z1 영역과 상기 Z2 영역이, 서로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 제 1 의 1 본쇄 RNA 와 상기 제 2 의 1 본쇄 RNA 의 연결에 의해 생성되는 1 본쇄 RNA 가, 5' 말단측으로부터 차례로, 상기 X2 영역, 상기 Y2 영역, 상기 Ly 링커 영역, 상기 Y1 영역, 상기 X1 영역 및 상기 Z1 영역, 상기 Lz 링커 영역 및 Z2 영역으로 이루어지는 연결 1 본쇄 RNA 인, 제조 방법이다.
또, 본 발명의 일 양태에 관련된 1 본쇄 RNA 의 제조 방법은, 상기 제조 방법에 있어서, 상기 Ly 링커 영역이, 하기 식 (I) 로 나타내는 2 가의 기인, 제조 방법이다.
[화학식 1]
Figure pct00001
(식 중, Y11 및 Y21 은, 각각 독립적으로, 탄소수 1 ∼ 20 의 알킬렌기를 나타내고, Y12 및 Y22 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 혹은 아미노기로 치환되어 있어도 되는 알킬기를 나타내거나, 혹은 Y12 와 Y22 가 그 말단에서 서로 결합하여 탄소수 3 ∼ 4 의 알킬렌기를 나타내고, Y11 에 결합하고 있는 말단의 산소 원자는, 상기 Y1 영역 및 상기 Y2 영역 중 어느 일방의 영역의 말단 뉴클레오티드의 인산에스테르의 인 원자와 결합하고 있고, Y21 에 결합하고 있는 말단의 산소 원자는, 상기 Y1 영역 및 상기 Y2 영역의 Y11 과는 결합하고 있지 않은 타방의 영역의 말단 뉴클레오티드의 인산에스테르의 인 원자와 결합하고 있다)
또, 본 발명의 일 양태에 관련된 1 본쇄 RNA 의 제조 방법은, 상기 제조 방법에 있어서, 상기 Ly 링커 영역이, 하기 식 (I) 로 나타내는 2 가의 기이고, 상기 Lz 링커 영역이, 하기 식 (I') 로 나타내는 2 가의 기인, 제조 방법이다.
[화학식 2]
Figure pct00002
(식 중, Y11 및 Y21 은, 각각 독립적으로, 탄소수 1 ∼ 20 의 알킬렌기를 나타내고, Y12 및 Y22 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 혹은 아미노기로 치환되어 있어도 되는 알킬기를 나타내거나, 혹은 Y12 와 Y22 가 그 말단에서 서로 결합하여 탄소수 3 ∼ 4 의 알킬렌기를 나타내고, Y11 에 결합하고 있는 말단의 산소 원자는, 상기 Y1 영역 및 상기 Y2 영역 중 어느 일방의 영역의 말단 뉴클레오티드의 인산에스테르의 인 원자와 결합하고 있고, Y21 에 결합하고 있는 말단의 산소 원자는, 상기 Y2 영역 및 상기 Y1 영역의 Y11 과는 결합하고 있지 않은 타방의 영역의 말단 뉴클레오티드의 인산에스테르의 인 원자와 결합하고 있다)
[화학식 3]
Figure pct00003
(식 중, Y'11 및 Y'21 은, 각각 독립적으로, 탄소수 1 ∼ 20 의 알킬렌기를 나타내고, Y'12 및 Y'22 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 혹은 아미노기로 치환되어 있어도 되는 알킬기를 나타내거나, 혹은 Y'12 와 Y'22 가 그 말단에서 서로 결합하여 탄소수 3 ∼ 4 의 알킬렌기를 나타내고, Y'11 에 결합하고 있는 말단의 산소 원자는, 상기 Z1 영역 및 상기 Z2 영역 중 어느 일방의 영역의 말단 뉴클레오티드의 인산에스테르의 인 원자와 결합하고 있고, Y'21 에 결합하고 있는 말단의 산소 원자는, 상기 Z2 영역 및 상기 Z1 영역의 Y'11 과는 결합하고 있지 않은 타방의 영역의 말단 뉴클레오티드의 인산에스테르의 인 원자와 결합하고 있다)
또, 본 발명의 일 양태에 관련된 1 본쇄 RNA 의 제조 방법은, 상기 제조 방법에 있어서, 상기 Ly 링커 영역 및 상기 Lz 링커 영역은, 각각 독립적으로, 하기 식 (II-A) 또는 (II-B) 로 나타내는 구조의 2 가의 기인, 제조 방법이다.
[화학식 4]
Figure pct00004
(식 중, n 및 m 은, 각각 독립적으로, 1 내지 20 중 어느 정수 (整數) 를 나타낸다)
또, 본 발명의 일 양태에 관련된 1 본쇄 RNA 의 제조 방법은, 상기 제조 방법에 있어서, 상기 X1 영역, 상기 Y1 영역 및 상기 Z 영역으로 이루어지는 W1 영역, 및 상기 X2 영역 및 상기 Y2 영역으로 이루어지는 W2 영역 중 적어도 일방에, RNA 간섭법의 표적이 되는 유전자의 발현을 억제하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 제조 방법이다.
또, 본 발명의 일 양태에 관련된 1 본쇄 RNA 의 제조 방법은, 상기 제조 방법에 있어서, 상기 RNA 리가아제가, T4 박테리오파지 유래의 T4 RNA 리가아제 2, KVP40 유래의 리가아제 2, Trypanosoma brucei RNA 리가아제, Deinococcus radiodurans RNA 리가아제, 또는 Leishmania tarentolae RNA 리가아제인, 제조 방법이다.
또, 본 발명의 일 양태에 관련된 1 본쇄 RNA 의 제조 방법은, 상기 제조 방법에 있어서, 상기 RNA 리가아제가, 서열 번호 21, 22, 또는 23 에 기재된 아미노산 서열과 95 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 RNA 리가아제인, 제조 방법이다.
또, 본 발명의 일 양태에 관련된 1 본쇄 RNA 의 제조 방법은, 상기 제조 방법에 있어서, 상기 RNA 리가아제가, T4 박테리오파지 유래의 T4 RNA 리가아제 2 또는 KVP40 유래의 RNA 리가아제 2 인, 제조 방법이다.
본 발명의 제조 방법에 의하면, 1 본쇄 RNA 를 간편하게 제조할 수 있다.
도 1 은, 제 1 및 제 2 의 1 본쇄 RNA 의 각 영역의 결합 순서의 일례를 나타내는 모식도이다.
도 2 는, 연결 1 본쇄 RNA 의 제조의 스텝의 일례를 나타내는 모식도이다.
도 3 은, 제 1 및 제 2 의 1 본쇄 RNA 의 각 영역의 결합 순서의 일례를 나타내는 모식도이다.
도 4 는, 연결 1 본쇄 RNA 의 제조의 스텝의 일례를 나타내는 모식도이다.
도 5 는, 실시예 1 에서 사용한, 제 1 및 제 2 의 1 본쇄 RNA 와 생성되는 연결 1 본쇄 RNA 를 나타낸다.
도 6 은, 실시예 2 에서 사용한, 제 1 및 제 2 의 1 본쇄 RNA 와 생성되는 연결 1 본쇄 RNA 를 나타낸다.
본 발명의 일 실시형태에 관련된 제조 방법은, 5' 말단에 인산기를 갖는 제 1 의 1 본쇄 RNA 와 3' 말단에 수산기를 갖는 제 2 의 1 본쇄 RNA 에, 국제 생화학 연합이 효소 번호로서 정하는 EC6.5.1.3 으로 분류되고, 2 본쇄 닉 수복 활성을 갖는 RNA 리가아제를 작용시켜, 상기 제 1 의 1 본쇄 RNA 와 상기 제 2 의 1 본쇄 RNA 를 연결하는 공정을 포함하는 1 본쇄 RNA 의 제조 방법이다. 본 실시형태의 제조 방법에 의해 얻어지는 연결 1 본쇄 RNA 는, 5' 말단측으로부터, X2 영역, Y2 영역, Ly 링커 영역, Y1 영역, X1 영역 및 Z 영역으로 이루어지는 1 본쇄 RNA 이다. 상기 Z 영역은, 5' 말단측으로부터, Z1 영역, 링커 영역 Lz 및 영역 Z2 로 이루어져 있어도 되고, 상기 연결 1 본쇄 RNA 는, X2 영역, Y2 영역, Ly 링커 영역, Y1 영역, X1 영역, Z1 영역, Lz 링커 영역 및 영역 Z2 로 이루어지는 1 본쇄 RNA 여도 된다. 상기 연결 1 본쇄 RNA 는, Y1 영역과 X1 영역과 Z 영역 (또는 Z1 영역) 으로 이루어지는 W1 영역, 및 X2 영역과 Y2 영역으로 이루어지는 W2 영역 중 적어도 일방에, RNA 간섭법의 표적이 되는 유전자의 발현을 억제하는 서열을 포함하고 있어도 된다.
W1 영역 및 W2 영역 중 어느 일방 또는 양자는, 동일한 표적 유전자에 대한 동일한 발현 억제 서열을 2 개 이상 가져도 되고, 동일한 표적에 대한 상이한 발현 억제 서열을 2 개 이상 가져도 되고, 상이한 표적 유전자에 대한 상이한 발현 억제 서열을 2 개 이상 가져도 된다. W1 영역이, 2 개 이상의 발현 억제 서열을 갖는 경우, 각 발현 억제 서열의 배치 지점은, 특별히 제한되지 않고, X1 영역 및 Y1 영역 중 어느 한 영역 또는 양자여도 되고, 양자에 가설되는 영역이어도 된다. W2 영역이, 2 개 이상의 발현 억제 서열을 갖는 경우, 각 발현 억제 서열의 배치 지점은, X2 영역 및 Y2 영역 중 어느 한 영역 또는 양자여도 되고, 양자에 가설되는 영역이어도 된다. 발현 억제 서열은, 표적 유전자의 소정 영역에 대해, 90 ％ 이상의 상보성을 가지고 있는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 95 ％ 이고, 더욱 바람직하게는 98 ％ 이고, 특히 바람직하게는 100 ％ 이다.
이러한 연결 1 본쇄 RNA 는, 5' 말단에 인산기를 갖는 제 1 의 1 본쇄 RNA 와 3' 말단에 수산기를 갖는 제 2 의 1 본쇄 RNA 에 리가아제를 작용시켜, 상기 제 1 의 1 본쇄 RNA 와 상기 제 2 의 1 본쇄를 연결하는 공정으로 제조된다 (도 1 내지 4 참조).
연결 1 본쇄 RNA 는, 분자 내에 있어서 상보성이 있는 서열 부분이 나열되어, 분자 내에서 부분적으로 이중 사슬을 형성할 수 있다. 연결 1 본쇄 RNA 분자는, 도 2 에 나타내는 바와 같이, X1 영역과 X2 영역이 서로 상보성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 추가로 Y1 영역과 Y2 영역이 서로 상보성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 이들 상보성을 갖는 서열과의 사이에서, 이중 사슬이 형성되어, Ly 및 Lz 의 링커 영역이, 그 길이에 따라 루프 구조를 취한다. 도 2 및 도 4 는, 어디까지나, 상기 영역의 연결 순서 및 이중 사슬부를 형성하는 각 영역의 위치 관계를 나타내는 것으로, 예를 들어, 각 영역의 길이, 링커 영역 (Ly 및 Lz) 의 형상 등은, 이것들에 한정되지 않는다.
Y1 영역과 X1 영역과 Z 영역 (또는 Z1 영역) 으로 이루어지는 W1 영역 및 X2 영역과 Y2 영역으로 이루어지는 W2 영역 중 적어도 일방이, RNA 간섭법의 표적이 되는 유전자의 발현을 억제하는 서열을 적어도 하나 포함하고 있어도 된다. 연결 1 본쇄 RNA 에 있어서, W1 영역과 W2 영역은, 완전히 상보적이어도 되고, 하나 혹은 수 개의 뉴클레오티드가 비상보적이어도 되는데, 완전히 상보적인 것이 바람직하다. 상기 하나 혹은 수 개의 뉴클레오티드는, 예를 들어, 1 ∼ 3 개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 1 또는 2 개의 뉴클레오티드이다. Y1 영역은, Y2 영역의 전체 영역에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가지고 있다. Y1 영역과 Y2 영역은, 서로 완전히 상보적인 뉴클레오티드 서열이고, 2 이상의 동수의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열이다. X1 영역은, X2 영역의 전체 영역에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가지고 있다. X1 영역과 X2 영역은, 서로 완전히 상보적인 뉴클레오티드 서열이고, 2 이상의 동수의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열이다. 본 실시형태의 제조 방법에서는, Z 영역은, 임의의 수의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 영역이고, 필수의 서열이 아니고, 뉴클레오티드의 수가 0 인 양태여도 되고, 1 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 양태여도 된다. Z 영역은, 5' 말단으로부터 Z1, Lz 및 Z2 의 각 영역을 연결한 것이어도 된다.
이하에 각 영역의 길이를 예시하지만, 이것에 한정되지 않는다. 본 명세서에 있어서, 뉴클레오티드수의 수치 범위는, 예를 들어, 그 범위에 속하는 양의 정수를 모두 개시하는 것으로, 구체예로서, 「1 ∼ 4 뉴클레오티드」라는 기재는, 「1 뉴클레오티드」, 「2 뉴클레오티드」, 「3 뉴클레오티드」, 및 「4 뉴클레오티드」의 모든 개시를 의미한다 (이하, 동일).
연결 1 본쇄 RNA 분자에 있어서, W2 영역의 뉴클레오티드수 (W2n) 와, X2 영역의 뉴클레오티드수 (X2n) 및 Y2 영역의 뉴클레오티드수 (Y2n) 의 관계는, 예를 들어, 하기 식 (1) 의 조건을 만족한다. W1 영역의 뉴클레오티드수 (W1n) 와, X1 영역의 뉴클레오티드수 (X1n) 및 Y1 영역의 뉴클레오티드수 (Y1n) 의 관계는, 예를 들어, 하기 식 (2) 의 조건을 만족한다.
W2n = X2n ＋ Y2n … (1)
W1n ≥ X1n ＋ Y1n … (2)
연결 1 본쇄 RNA 분자에 있어서, X1 영역의 뉴클레오티드수 (X1n) 와 Y1 영역의 뉴클레오티드수 (Y1n) 의 관계는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 하기 식 중 어느 조건을 만족한다.
X1n = Y1n … (3)
X1n ＜ Y1n … (4)
X1n ＞ Y1n … (5)
본 실시형태의 방법에 있어서, X1 영역의 뉴클레오티드수 (X1n), 즉 X2 영역의 뉴클레오티드수 (X2n) 는, 2 이상이고, 바람직하게는 4 이상이고, 보다 바람직하게는 10 이상이다.
Y1 영역의 뉴클레오티드수 (Y1n), 즉 Y2 영역의 뉴클레오티드수 (Y2n) 는, 2 이상이고, 바람직하게는 3 이상이고, 보다 바람직하게는 4 이상이다.
Z1 영역은, 바람직하게는, Z2 영역의 전체 영역 또는 Z2 영역의 부분 영역에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. Z1 영역과 Z2 영역은, 하나 혹은 수 뉴클레오티드가 비상보적이어도 되지만, 완전히 상보적인 것이 바람직하다.
보다 상세하게는, Z2 영역은, Z1 영역보다, 1 뉴클레오티드 이상 짧은 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것이 바람직하다. 이 경우, Z2 영역의 뉴클레오티드 서열 전체가, Z1 영역의 임의의 부분 영역의 모든 뉴클레오티드와 상보적이 된다. Z2 영역의 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 뉴클레오티드 서열은, Z1 영역의 3' 말단의 뉴클레오티드로부터 시작되어 5' 말단을 향한 뉴클레오티드 서열과 상보성이 있는 서열인 것이 보다 바람직하다.
연결 1 본쇄 RNA 분자에 있어서, X1 영역의 뉴클레오티드수 (X1n) 와 X2 영역의 염기수 (X2n) 의 관계, Y1 영역의 뉴클레오티드수 (Y1n) 와 Y2 영역의 뉴클레오티드수 (Y2n) 의 관계, 그리고 Z1 영역의 뉴클레오티드수 (Z1n) 와 Z2 영역의 뉴클레오티드수 (Z2n) 의 관계는, 하기 식 (6), (7) 및 (8) 의 조건을 각각 만족한다.
X1n = X2n … (6)
Y1n = Y2n … (7)
Z1n ≥ Z2n … (8)
연결 1 본쇄 RNA 의 전체 길이 (뉴클레오티드의 총수) 는, 특별히 제한되지 않는다. 연결 1 본쇄 RNA 에 있어서, 뉴클레오티드수의 합계 (전체 길이의 뉴클레오티드수) 는, 하한이, 전형적으로는 38 이고, 바람직하게는 42 이고, 보다 바람직하게는 50 이고, 더욱 바람직하게는 51 이고, 특히 바람직하게는 52 이고, 그 상한은, 전형적으로는 300 이고, 바람직하게는 200 이고, 보다 바람직하게는 150 이고, 더욱 바람직하게는 100 이고, 특히 바람직하게는 80 이다. 연결 1 본쇄 RNA 에 있어서, 링커 영역 (Ly, Lz) 을 제외한 뉴클레오티드수의 합계는, 하한이, 전형적으로는 38 이고, 바람직하게는 42 이고, 보다 바람직하게는 50 이고, 더욱 바람직하게는 51 이고, 특히 바람직하게는 52 이고, 상한이, 전형적으로는 300 이고, 바람직하게는 200 이고, 보다 바람직하게는 150 이고, 더욱 바람직하게는 100 이고, 특히 바람직하게는 80 이다.
연결 1 본쇄 RNA 에 있어서, Ly 및 Lz 의 링커 영역의 길이는, 특별히 제한되지 않는다. 이들 링커 영역은, 예를 들어, X1 영역과 X2 영역이 이중 사슬을 형성 가능한 길이, 혹은 Y1 영역과 Y2 영역이 이중 사슬을 형성 가능한 길이인 것이 바람직하다. Ly 및 Lz 의 각 링커 영역은, 아미노산으로부터 유도되는 원자단을 갖는 영역이다. 이들 링커 영역 (Ly, Lz) 은, 통상적으로, 비뉴클레오티드의 링커 영역이다.
링커 영역의 주사슬을 형성하는 원자의 수는, 그 상한은, 전형적으로는 100 이고, 바람직하게는 80 이고, 보다 바람직하게는 50 이다.
Ly 링커 영역은, 예를 들어, 하기 식 (I) 로 나타내는 2 가의 기이고, Lz 는, 예를 들어, 하기 식 (I') 로 나타내는 2 가의 기이다.
[화학식 5]
Figure pct00005
(식 중, Y11 및 Y21 은, 각각 독립적으로, 탄소수 1 ∼ 20 의 알킬렌기를 나타내고, Y12 및 Y22 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 혹은 아미노기로 치환되어 있어도 되는 알킬기를 나타내거나, 혹은 Y12 와 Y22 가 그 말단에서 서로 결합하여 탄소수 3 ∼ 4 의 알킬렌기를 나타내고, Y11 에 결합하고 있는 말단의 산소 원자는, Y1 영역 및 Y2 영역 중 어느 일방의 영역의 말단 뉴클레오티드의 인산에스테르의 인 원자와 결합하고 있고, Y21 에 결합하고 있는 말단의 산소 원자는, Y1 영역 및 Y2 영역의 Y11 과는 결합하고 있지 않은 타방의 영역의 말단 뉴클레오티드의 인산에스테르의 인 원자와 결합하고 있다)
[화학식 6]
Figure pct00006
(식 중, Y'11 및 Y'21 은, 각각 독립적으로, 탄소수 1 ∼ 20 의 알킬렌기를 나타내고, Y'12 및 Y'22 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 혹은 아미노기로 치환되어 있어도 되는 알킬기를 나타내거나, 혹은 Y'12 와 Y'22 가 그 말단에서 서로 결합하여 탄소수 3 ∼ 4 의 알킬렌기를 나타내고, Y'11 에 결합하고 있는 말단의 산소 원자는, Z1 영역 및 Z2 영역 중 어느 일방의 영역의 말단 뉴클레오티드의 인산에스테르의 인 원자와 결합하고 있고, Y'21 에 결합하고 있는 말단의 산소 원자는, Z1 영역 및 Z2 영역의 Y'11 과는 결합하고 있지 않은 타방의 영역의 말단 뉴클레오티드의 인산에스테르의 인 원자와 결합하고 있다)
상기 Y11 및 Y21, 그리고, Y'11 및 Y'21 에 있어서의 탄소수 1 ∼ 20 의 알킬렌기는, 탄소수 1 ∼ 10 이 바람직하고, 탄소수 1 ∼ 5 가 보다 바람직하다. 알킬렌기는, 직사슬형이어도 되고, 분기 사슬형이어도 된다.
상기 Y12 및 Y22, 그리고, Y'12 및 Y'22 에 있어서의 아미노기로 치환되어 있어도 되는 알킬기는, 탄소수 1 ∼ 10 이 바람직하고, 탄소수 1 ∼ 5 가 보다 바람직하다. 알킬기는, 직사슬형이어도 되고, 분기 사슬형이어도 된다.
Ly 링커 및 Lz 링커의 바람직한 예로는, 하기 식 (II-A) 또는 (II-B) 로 나타내는 구조의 2 가의 기를 들 수 있다.
[화학식 7]
Figure pct00007
(식 중, n 및 m 은, 각각 독립적으로, 1 내지 20 중 어느 정수를 나타낸다)
n 및 m 은, 1 ∼ 10 중 어느 정수인 것이 바람직하고, 1 ∼ 5 중 어느 정수인 것이 보다 바람직하다.
바람직한 양태에 있어서, Ly 링커 및 Lz 링커는, 각각 독립적으로, 식 (II-A) 또는 (II-B) 중 어느 2 가의 기를 나타낸다.
제 1 의 1 본쇄 RNA 및 제 2 의 1 본쇄 RNA 의 예로는, 구체적으로는, 도 5및 도 6 에 기재한 것이 예시된다.
본 실시형태의 제조 방법에서 실시하는 연결 반응에 있어서는, 국제 생화학 연합이 효소 번호로서 정하는 EC6.5.1.3 으로 분류되는 RNA 리가아제로서, 2 본쇄 닉 수복 활성을 갖는 RNA 리가아제 (이하, 「본 RNA 리가아제」라고 기재하기도 한다) 가 사용된다. 이러한 RNA 리가아제로는, 예를 들어, T4 박테리오파지 유래의 T4 RNA 리가아제 2 가 예시된다. 이 RNA 리가아제 2 는, 예를 들어, (New England BioLabs) 로부터 구입할 수 있다. 또한, RNA 리가아제로는, 비브리오파지 (vibriophage) KVP40 유래의 리가아제 2, Trypanosoma brucei RNA 리가아제, Deinococcus radiodurans RNA 리가아제, 혹은 Leishmania tarentolae RNA 리가아제가 예시된다. 이러한 RNA 리가아제는, 예를 들어, 비특허문헌 (Structure and Mechanism of RNA Ligase, Structure, Vol.12, PP.327-339.) 에 기재된 방법으로 각 생물로부터 추출 및 정제함으로써 얻어진 것을 사용할 수도 있다.
T4 박테리오파지 유래의 T4 RNA 리가아제 2 로는, 서열 번호 21 에 기재된 아미노산 서열과 95 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질로서, 2 본쇄 닉 수복 활성을 갖는 RNA 리가아제도 사용 가능하다. 이러한 RNA 리가아제 2 로는, 서열 번호 21 에 기재된 아미노산 서열의 효소 외에, 그 변이체인 T39A, F65A, F66A (RNA ligase structures reveal the basis for RNA specificity and conformational changes that drive ligation forward, Cell. Vol.127, pp.71-84. 참조) 등을 예시할 수 있다. 이러한 RNA 리가아제 2 는, 예를 들어, 상기 문헌의 기재에 기초하여, ATCC (등록 상표) 11303 으로서 ATCC (American Type Culture Collection) 에 기탁되어 있는, Escherichia coli bacteriophage T4 를 사용하는 방법이나 PCR 등의 방법으로 얻는 것이 가능하다.
KVP40 유래의 RNA 리가아제 2 는, 비특허문헌 (Characterization of bacteriophage KVP40 and T4 RNA ligase 2, Virology, vol.319, PP.141-151.) 에 기재된 방법으로 취득할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, 이하와 같은 방법으로 취득할 수 있다. 즉, 박테리오파지 KVP40 (예를 들어, 기탁 번호 Go008199 로서 JGI 에 기탁되어 있다) 으로부터 추출한 DNA 중, 오픈 리딩 프레임 293 을, NdeI 및 BamHI 에 의해 제한 효소 소화한 후에, 폴리머라아제 연쇄 반응에 의해 증폭시킨다. 얻어진 DNA 를 플라스미드 벡터 pET16b (Novagen) 에 삽입한다. 또는, 당해의 DNA 서열을 PCR 에 의해 인공 합성할 수도 있다. 여기서, DNA 서열 해석에 의해, 원하는 변이체를 얻을 수 있다. 계속해서, 얻어진 벡터 DNA 를 E.coli BL21 (DE3) 에 삽입하고, 0.1 mg/㎖ 암피실린을 함유하는 LB 배지 중에서 배양한다. 이소프로필-β-티오갈락토시드를 0.5 mM 이 되도록 첨가하고, 37 ℃ 에서 3 시간 배양한다. 그 후의 조작은 모두 4 ℃ 에서 실시하는 것이 바람직하다. 먼저, 원심 조작에 의해 균체를 침전시켜, 침전물을 ―80 ℃ 에서 보관한다. 동결된 균체에 버퍼 A [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.2 M NaCl, 10 ％ 수크로오스] 를 첨가한다. 그리고, 라이소자임과 Triton X-100 을 첨가하고, 초음파에 의해 균체를 파쇄하여, 목적물을 용출시킨다. 그 후, 어피니티 크로마토그래피나 사이즈 배제 크로마토그래피 등을 사용하여 목적물을 단리한다. 그리고, 얻어진 수용액을 원심 여과하고, 용리액을 버퍼로 치환함으로써 리가아제로서 사용할 수 있다.
이와 같이 하여, KVP40 유래의 RNA 리가아제 2 를 얻을 수 있다. KVP40 유래의 RNA 리가아제 2 로는, 서열 번호 22 의 아미노산 서열과 95 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질로서, 2 본쇄 닉 수복 활성을 갖는 RNA 리가아제가 사용 가능하다.
Deinococcus radiodurans RNA 리가아제는 비특허문헌 (An RNA Ligase from Deinococcus radiodurans, J Biol Chem., Vol.279, No.49, PP.50654-61.) 에 기재된 방법으로 취득할 수 있다. 예를 들어, ATCC (등록 상표) BAA-816 으로서 ATCC 에 기탁되어 있는 생물학적인 재료로부터, 상기 리가아제를 얻는 것도 가능하다. Deinococcus radiodurans RNA 리가아제로는, 서열 번호 23 의 아미노산 서열과 95 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질로서, 2 본쇄 닉 수복 활성을 갖는 RNA 리가아제를 사용 가능하다. 이러한 리가아제로는, 구체적으로는, 서열 번호 23 의 아미노산 서열로 이루어지는 RNA 리가아제에 더하여, 서열 번호 23 의 RNA 리가아제에 있어서, K165A 혹은 E278A 의 변이를 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 RNA 리가아제가 예시된다 (An RNA Ligase from Deinococcus radiodurans, J Biol Chem., Vol.279, No.49, PP.50654-61.).
Trypanosoma brucei RNA 리가아제는 비특허문헌 (Assiciation of Two Novel Proteins TbMP52 and TbMP48 with the Trypanosoma brucei RNA Editing Complex, Vol.21, No.2, PP.380-389.) 에 기재된 방법으로 취득할 수 있다.
Leishmania tarentolae RNA 리가아제는 비특허문헌 (The Mitochondrial RNA Ligase from Leishmania tarentolae Can Join RNA Molecules Bridged by a Complementary RNA, Vol.274, No.34, PP.24289-24296) 에 기재된 방법으로 취득할 수 있다.
본 RNA 리가아제를 사용하는 본 실시형태의 제조 방법의 반응 조건은, 본 RNA 리가아제가 기능하는 조건이면, 특별히 한정되지 않지만, 하나의 전형적인 예로는, 제 1 핵산 사슬과, 제 2 핵산 사슬과, ATP, 염화마그네슘, 및 DTT 를 함유하는 Tris-HCl 완충액 (pH 7.5) 과, 순수를 혼합하고, 그 혼합액에 본 RNA 리가아제를 첨가하고, 그 후 당해 리가아제가 기능하는 온도 (예를 들어 37 ℃) 에서 소정 시간 (예를 들어 1 시간) 반응시키는 조건을 들 수 있다.
혹은, 본 실시형태의 제조 방법은, 비특허문헌 (Bacteriophage T4 RNA ligase 2 (gp24-1) exemplifies a family of RNA ligases found in all, Proc. Natl. Acad. Sci, 2002, Vol.99, No.20, PP.12709-12714.) 에 기재된 조건에 준하여 실시할 수도 있다.
본 RNA 리가아제를 사용한 제 1 의 1 본쇄 RNA 및 제 2 의 1 본쇄 RNA 의 연결 반응에 의해 얻어진 미정제 생성물은, RNA 를 침전, 추출 및 정제하는 방법을 이용함으로써 통상적으로 단리할 수 있다.
구체적으로는, 연결 반응 후의 용액에 에탄올이나 이소프로필알코올 등의 RNA 에 대해 용해성이 낮은 용매를 첨가함으로써 RNA 를 침전시키는 방법이나, 페놀/클로로포름/이소아밀알코올 (예를 들어, 페놀/클로로포름/이소아밀알코올 = 25/24/1) 의 혼합 용액을 연결 반응 후의 용액에 첨가하고, RNA 를 수층에 추출하는 방법이 채용된다.
연결 RNA 를 정제하는 방법으로는, 역상 칼럼 크로마토그래피나 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 어피니티 칼럼 크로마토그래피, 겔 여과 칼럼 크로마토그래피 등의 공지된 방법을 들 수 있고, 이들 방법을 적절히 조합하여 이용하여, 미정제 생성물로부터 연결한 RNA 를 단리할 수 있다.
제 1 의 1 본쇄 RNA 는, 예를 들어, 고상 합성법에 의해 조제할 수 있다. 보다 구체적으로는, 포스포아미다이트법에 기초하여, 핵산 합성기 (NTS M-4MX-E (니혼 테크노 서비스 주식회사 제조) 를 사용하여 조제할 수 있다. 포스포아미다이트법은, 디블로킹, 커플링, 및 산화의 3 단계를 1 사이클로 하여, 원하는 염기 서열이 얻어질 때까지 이 사이클을 반복하는 방법이다. 각 시약에 관해서, 예를 들어, 고상 담체로서 다공질 유리를 사용하고, 디블로킹 용액으로서 디클로로아세트산톨루엔 용액을 사용하고, 커플링제로서 5-벤질메르캅토-1H-테트라졸을 사용하고, 산화제로서 요오드 용액을 사용하고, 캡핑 용액으로서 무수 아세트산 용액과 N-메틸이미다졸 용액을 사용하여 실시할 수 있다. 고상 합성 후의 고상 담체로부터의 절출 (切出) 과 탈보호는, 예를 들어, 국제 공개 제2013/027843호에 기재된 방법에 따라서 실시할 수 있다. 즉, 암모니아 수용액과 에탄올을 첨가하여 염기부 및 인산기의 탈보호와 고상 담체로부터의 절출을 실시한 후, 고상 담체를 여과하고, 그 후, 테트라부틸암모늄플루오리드를 사용하여 2'-수산기의 탈보호를 실시하여 RNA 를 조제할 수 있다.
이러한 고상 합성법에서 사용하는 아미다이트로는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 하기 구조식 (III-a) 중의, R1 이 터셔리부틸디메틸실릴 (TBDMS) 기, 비스(2-아세톡시)메틸 (ACE) 기, (트리이소프로필실릴옥시)메틸 (TOM) 기, (2-시아노 에톡시)에틸 (CEE) 기, (2-시아노에톡시)메틸 (CEM) 기, 파라톨루일술포닐에톡시메틸 (TEM) 기, (2-시아노에톡시)메톡시메틸 (EMM) 기 등으로 보호된, TBDMS 아미다이트 (TBDMS RNA Amidites, 상품명, ChemGenes Corporation), ACE 아미다이트, TOM 아미다이트, CEE 아미다이트, CEM 아미다이트, TEM 아미다이트 (Chakhmakhcheva 의 총설 : Protective Groups in the Chemical Synthesis of Oligoribonucleotides, Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2013, Vol.39, No.1, pp.1-21.) EMM 아미다이트 (국제 공개 제2013/027843호에 기재) 등을 사용할 수도 있다.
또 Ly 링커 영역 및 Lz 링커 영역에 대해서는, 하기 구조식 (III-b) 에 나타내는 프롤린 골격을 갖는 아미다이트를 국제 공개 제2012/017919호의 실시예 A4 의 방법에서 사용할 수 있다. 또, 하기 구조식 (III-c), (III-d) 및 (III-e) 중 어느 것으로 나타내는 아미다이트 (국제 공개 제2013/103146호의 실시예 A1 ∼ A3 참조) 를 사용함으로써, 동일하게 핵산 합성기에 의해 조제할 수 있다.
5' 말단의 5' 위치의 인산화에는, 5' 말단의 인산화용의 아미다이트를 고상 합성으로 사용해도 된다. 5' 말단의 인산화용의 아미다이트는 시판되는 아미다이트를 사용할 수 있다. 또 고상 합성에 의해, 5' 말단의 5' 위치가 수산기 혹은 보호된 수산기인 RNA 분자를 합성해 두고, 적절히 탈보호를 실시한 후에, 시판되는 인산화제에 의해 인산화함으로써 5' 말단에 인산기를 갖는 1 본쇄 RNA 를 조제할 수 있다. 인산화제로는 하기 구조식 (III-f) 로 나타내는 시판되는 Chemical Phosphorylation Reagent (Glen Research) 가 알려져 있다 (특허문헌 EP0816368).
[화학식 8]
Figure pct00008
식 (III-a) 에 있어서, R2 는 보호기로 보호되어 있어도 되는 핵산염기를 나타내고, R1 은 보호기를 나타낸다.
[화학식 9]
Figure pct00009
[화학식 10]
Figure pct00010
[화학식 11]
Figure pct00011
[화학식 12]
Figure pct00012
[화학식 13]
Figure pct00013
제 2 의 1 본쇄 RNA 는, 고상 합성법, 즉 포스포아미다이트법에 기초하는 핵산 합성기를 사용하여, 동일하게 제조할 수 있다.
뉴클레오티드를 구성하는 염기는, 통상적으로는, 핵산, 전형적으로는 RNA 를 구성하는 천연의 염기이지만, 비천연의 염기를 경우에 따라서는 사용해도 된다. 이러한 비천연의 염기로는, 천연 혹은 비천연의 염기의 수식 아날로그가 예시된다.
염기의 예로는, 예를 들어, 아데닌 및 구아닌 등의 푸린염기, 사이토신, 우라실 및 티민 등의 피리미딘염기 등을 들 수 있다. 염기는, 이 밖에, 이노신, 크산틴, 히포크산틴, 누바라린 (nubularine), 이소구아니신 (isoguanisine), 투베르시딘 (tubercidine) 등을 들 수 있다. 상기 염기는, 예를 들어, 2-아미노아데닌, 6-메틸화푸린 등의 알킬 유도체 ; 2-프로필화푸린 등의 알킬 유도체 ; 5-할로우라실 및 5-할로사이토신 ; 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐사이토신 ; 6-아조우라실, 6-아조사이토신 및 6-아조티민 ; 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 5-할로우라실, 5-(2-아미노프로필)우라실, 5-아미노알릴우라실 ; 8-할로화, 아미노화, 티올화, 티오알킬화, 하이드록실화 및 다른 8-치환 푸린 ; 5-트리플루오로메틸화 및 다른 5-치환 피리미딘 ; 7-메틸구아닌 ; 5-치환 피리미딘 ; 6-아자피리미딘 ; N-2, N-6, 및 O-6 치환 푸린 (2-아미노프로필아데닌을 포함한다) ; 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐사이토신 ; 디하이드로우라실 ; 3-데아자-5-아자사이토신 ; 2-아미노푸린 ; 5-알킬우라실 ; 7-알킬구아닌 ; 5-알킬사이토신 ; 7-데아자아데닌 ; N6,N6-디메틸아데닌 ; 2,6-디아미노푸린 ; 5-아미노-알릴-우라실 ; N3-메틸우라실 ; 치환 1,2,4-트리아졸 ; 2-피리디논 ; 5-니트로인돌 ; 3-니트로피롤 ; 5-메톡시우라실 ; 우라실-5-옥시아세트산 ; 5-메톡시카르보닐메틸우라실 ; 5-메틸-2-티오우라실 ; 5-메톡시카르보닐메틸-2-티오우라실 ; 5-메틸아미노메틸-2-티오우라실 ; 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우라실 ; 3-메틸사이토신 ; 5-메틸사이토신 ; N4-아세틸사이토신 ; 2-티오사이토신 ; N6-메틸아데닌 ; N6-이소펜틸아데닌 ; 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌 ; N-메틸구아닌 ; O-알킬화염기 등을 들 수 있다. 또, 푸린염기 및 피리미딘염기로는, 예를 들어, 미국 특허 제3,687,808호, 「Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering」, 858 ∼ 859 페이지, 크로슈비츠 제이 아이 (Kroschwitz J.I.) 편, John Wiley ＆ Sons, 1990, 및 잉글리시 등 (Englisch 등), Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30권, p.613 에 개시되는 것이 포함된다.
본 실시형태의 방법으로 얻어지는, 5' 말단측으로부터, X1 영역, Y1 영역, Ly 영역, Y2 영역, X2 영역 및 Z 영역으로 이루어지는 1 본쇄 RNA 핵산 분자는, 그 5' 말단과 3' 말단이 미연결이고, 선상 1 본쇄 핵산 분자라고 할 수도 있다. 이러한 1 본쇄 RNA 핵산 분자는, 예를 들어, in vivo 또는 in vitro 에 있어서, 표적 유전자의 발현 억제에 사용할 수 있고, RNA 간섭에 의해, 표적 유전자의 발현 억제를 위해서 사용할 수 있다. 「표적 유전자의 발현 억제」란, 예를 들어, 표적 유전자의 발현을 저해하는 것을 의미한다. 상기 억제의 메커니즘은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 다운 레귤레이션 또는 사이렌싱이어도 된다.
표적 유전자의 발현 억제는, 예를 들어, 표적 유전자로부터의 전사 산물의 생성량의 감소, 전사 산물의 활성의 감소, 표적 유전자로부터의 번역 산물의 생성량의 감소, 또는 번역 산물의 활성의 감소 등에 의해 확인할 수 있다. 번역 산물로서의 단백질은, 예를 들어, 성숙 단백질, 또는 프로세싱 혹은 번역 후 수식을 수용하기 전의 전구체 단백질 등을 들 수 있다.
실시예
이하에, 본 실시형태에 의한 실시예를 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이것들에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
1. 제 1 의 1 본쇄 RNA 의 합성
실시예 1 의 사슬 I 의 RNA 로서, 이하에 나타내는 1 본쇄 RNA (표 2 의 서열 1 ; 서열 번호 1) 를 합성하였다. 상기 사슬 I 는 13 염기 길이로 이루어지고, 제 1 의 1 본쇄 RNA 에 대응한다.
사슬 I (서열 1) : 5'-pGUGUACUCUGCUU-3'
상기 1 본쇄 RNA 는, 포스포아미다이트법에 기초하여, 핵산 합성기 (상품명 NTS M-4MX-E, 니혼 테크노 서비스 주식회사) 를 사용하여 3' 측으로부터 5' 측을 향해 합성하였다. 상기 합성에는, RNA 아미다이트로서, 국제 공개 제2013/027843호의 실시예 2 에 기재된 우리딘 EMM 아미다이트, 실시예 3 에 기재된 시티딘 EMM 아미다이트, 실시예 4 에 기재된 아데노신 EMM 아미다이트, 실시예 5 에 기재된 구아노신 EMM 아미다이트 및, 5' 인산화는 Chemical Phosphorylation Reagent (Glen Research) 를 사용하고, 고상 담체로서 다공질 유리를 사용하고, 디블로킹 용액으로서 고순도 트리클로로아세트산톨루엔 용액을 사용하고, 축합제로서 5-벤질메르캅토-1H-테트라졸을 사용하고, 산화제로서 요오드 용액을 사용하고, 캡핑 용액으로서 페녹시아세트산 용액과 N-메틸이미다졸 용액을 사용하여 실시하였다. 고상 합성 후의 고상 담체로부터의 절출과 탈보호는, 국제 공개 제2013/027843호에 기재된 방법에 따랐다. 즉, 암모니아 수용액과 에탄올을 첨가하고, 잠시 정치 (靜置) 한 후에 고상 담체를 여과하고, 그 후, 테트라부틸암모늄플루오리드를 사용하여 수산기의 탈보호를 실시하였다. 얻어진 RNA 를 주사용 증류수에 의해 사용하여 원하는 농도가 되도록 용해시켰다.
2. 제 2 의 1 본쇄 RNA 의 합성
실시예 1 의 사슬 II 의 RNA 로서, 이하에 나타내는 1 본쇄 RNA (표 2 의 서열 2 ; 서열 번호 2, 3) 를 합성하였다. 상기 사슬 II 는 36 염기 길이로 이루어지고, 제 2 의 1 본쇄 RNA 에 대응한다.
사슬 II (서열 2) : 5'-GCAGAGUACACACAGCAUAUACCKGGUAUAUGCUGU-3'
상기 1 본쇄 RNA 는, 포스포아미다이트법에 기초하여, 핵산 합성기 (상품명 NTS M-4MX-E, 니혼 테크노 서비스 주식회사) 에 의해 합성하였다. 상기 합성에는, RNA 아미다이트로서, 국제 공개 제2013/027843호의 실시예 2 에 기재된 우리딘 EMM 아미다이트, 실시예 3 에 기재된 시티딘 EMM 아미다이트, 실시예 4 에 기재된 아데노신 EMM 아미다이트 및 실시예 5 에 기재된 구아노신 EMM 아미다이트, 및 국제 공개 제2012/017919호의 실시예 A3 에 기재된 리신아미다이트 (Ie) 를 사용하였다. 고상 합성 후의 고상 담체로부터의 절출과 탈보호는, 국제 공개 제2013/027843호에 기재된 방법에 따랐다. 얻어진 RNA 를 주사용 증류수에 의해 원하는 농도가 되도록 용해시켰다.
3. 라이게이션 반응
다음으로, 제 1 RNA 사슬과 제 2 RNA 사슬의 라이게이션 반응을, 160 units/㎖ T4 RNA 리가아제 2, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 400 μM ATP 의 조성으로, 반응 스케일 7.9 ㎖ 로 실시하였다.
얻어지는 연결 1 본쇄 RNA 를 하기에 나타낸다 (서열 15 ; 서열 번호 17, 18).
5'-GCAGAGUACACACAGCAUAUACCKGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUU-3'
구체적으로는, 먼저, 제 1 RNA 사슬이 5.5 μM, 제 2 RNA 사슬이 5.0 μM 이 되도록, 500 mM Tris-HCl (pH 7.5), 20 mM MgCl2, 및 10 mM DTT 를 함유하는 4000 μM 의 ATP 완충액 (10x 완충액) 790 ㎕ 및 주사용 증류수를 함유하는 15 ㎖ 튜브 내에 제 1 RNA 사슬 및 제 2 RNA 사슬을 첨가하고, 65 ℃ 수욕 중에 10 분 정치하였다. 그 후, T4 RNA 리가아제 2 (New England BioLabs 제조) 를 상기의 조성과 반응 스케일이 되도록 첨가하고, 25 ℃ 에서 24 시간 인큐베이트하였다. 반응 후, 반응액을 하기 표 1 에 기재된 조건에서, 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제를 실시하였다. 얻어진 획분을 각각 HPLC 에 의해 분석하였다. 순도 90 ％ 이상의 획분을 모아 혼합하였다. 그 결과, 순도 90 ％, 총수율 11 ％ 에서 목적물을 얻을 수 있었다. 여기서, 총수율이란, 주입한 RNA 사슬의 양에 대한, 라이게이션 반응 후의 생성물을 정제하여 얻어진 1 본쇄 RNA 의 양의 비율이다. 상기 RNA 의 양은, 파장 260 ㎚ 의 자외선의 흡광도에 기초하여 구해진다. 흡광도가 1 을 나타내는 경우의 RNA 의 농도를 33 ㎍/㎖ 로 하여 구한 값이다. 얻어진 시료를 질량 분석 측정에 의해 측정한 결과, 계산치와 합치하고 있는 점에서, 목적물이 얻어지고 있는 것을 확인할 수 있었다 (측정치 : 15715.2464, 이론치 : 15715.2075).
Figure pct00014
[실시예 2]
(Ly, Lz 가 프롤린 유도체를 함유하는 연결 1 본쇄 RNA 의 합성)
얻어지는 연결 1 본쇄 RNA 는 하기에 나타낸다 (서열 16 ; 서열 번호 19, 20).
5'-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACCPGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG-3'
1. 제 1 의 1 본쇄 RNA 의 합성
실시예 2 의 사슬 I 의 RNA 로서, 표 3 에 나타내는 사슬 I (서열 3) 의 1 본쇄 RNA (표 2 의 서열 3 ; 서열 번호 4) 를 합성하였다. 상기 사슬 I 는 16 염기 길이로 이루어지고, 제 1 의 1 본쇄 RNA 에 대응한다.
상기 1 본쇄 RNA 는, 포스포아미다이트법에 기초하여, 핵산 합성기 (상품명 NTS M-4MX-E, 니혼 테크노 서비스 주식회사) 를 사용하여 합성하였다. 상기 합성에는, RNA 아미다이트로서, 국제 공개 제2013/027843호의 실시예 2 에 기재된 우리딘 EMM 아미다이트, 실시예 3 에 기재된 시티딘 EMM 아미다이트, 실시예 4 에 기재된 아데노신 EMM 아미다이트 및 실시예 5 에 기재된 구아노신 EMM 아미다이트, 및 국제 공개 제2012/017919호의 실시예 A3 에 기재된 프롤린아미다이트 (Ib) 를 사용하였다. 5' 인산화는 Chemical Phosphorylation Reagent (Glen Research) 를 사용하였다 (이하, 동일). 고상 합성 후의 고상 담체로부터의 절출과 탈보호는, 국제 공개 제2013/027843호에 기재된 방법에 따랐다. 얻어진 RNA 를, 주사용 증류수를 사용하여 원하는 농도가 되도록 용해시켰다.
2. 제 2 RNA 의 합성
실시예 2 의 사슬 II 의 RNA 로서, 표 3 에 나타내는 사슬 II (서열 4) 의 1 본쇄 RNA (표 2 의 서열 4 ; 서열 번호 5, 6) 를 합성하였다. 상기 사슬 II 는 37 염기 길이로 이루어지고, 제 2 의 1 본쇄 RNA 에 대응한다.
제 2 의 1 본쇄 RNA 사슬의 합성은, 탈보호 이후의 조작은 제 1 의 1 본쇄 RNA 의 합성과 동일하게 실시하였다.
3. 라이게이션 반응
다음으로, 제 1 RNA 사슬 및 제 2 RNA 사슬의 라이게이션 반응을, 58 units/㎖ T4 RNA 리가아제 2, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 400 μM ATP 의 조성으로, 반응 스케일 10 ㎖ 로 실시하였다.
구체적으로는, 먼저, 제 1 RNA 사슬이 4.4 μM, 제 2 RNA 사슬이 4.0 μM 이 되도록, 500 mM Tris-HCl (pH 7.5), 20 mM MgCl2 및 10 mM DTT 를 함유하는 4000 μM ATP 완충액 (10x 완충액) 0.96 ㎖ 및 주사용 증류수를 첨가한 용액에 제 1 RNA 사슬 및 제 2 RNA 사슬을 첨가하고, 65 ℃ 수욕 중에 10 분 정치하였다. 그 후, T4 RNA 리가아제 2 (New England BioLabs) 를 상기의 조성과 반응 스케일이 되도록 첨가하고, 25 ℃ 에서 24 시간 인큐베이트하였다. 반응 후, 반응액을 표 1 에 기재된 조건을 사용하여, 칼럼 크로마토그래피 정제하였다. 얻어진 획분을 HPLC 에 의해 분석하고, 순도 90 ％ 이상의 획분 (크로마토그램에 있어서 검출되는 피크의 총면적에 대해 목적물의 피크 면적이 차지하는 비율이, 90 ％ 이상의 비율이 되는 획분) 을 모아 혼합하였다. 그 결과, 순도 94 ％, 총수율 14 ％ 에서 목적물을 얻을 수 있었다. 또, 얻어진 시료를 질량 분석 측정에 의해 측정한 결과, 계산치와 합치하고 있는 점에서, 목적물이 얻어지고 있는 것을 확인할 수 있었다 (측정치 : 17025.4858, 이론치 : 17025.4672).
[실시예 3 ∼ 6]
이하, 실시예 3 ∼ 6 에 있어서, 표 3 에 기재된 사슬 I (제 1 의 1 본쇄 RNA 에 대응) 및 사슬 II (제 2 의 1 본쇄 RNA 에 대응) 를 각각 핵산 합성기에 의해 합성하여 사용하는 것 이외에는, 실시예 2 와 동일하게, T4 RNA 리가아제 2 를 사용하여 반응을 실시하고, 반응 생성물을 칼럼 크로마토그래피 정제하여, 얻어진 획분을 HPLC 에 의해 분석하였다. 실시예 3 ∼ 6 의 각각에 대해, 순도 90 ％ 이상의 획분 (상기 동일한 정의) 을 모아 혼합하고, 순도 및 총수율을 각각 구하였다. 그 결과를 표 2 에 정리하여 나타낸다.
[참고예 1]
실시예 2 와 동일한 연결 1 본쇄 RNA (서열 16) 를 합성하기 위해서, 표 3 에 나타내는 사슬 I (서열 13) 과 사슬 II (서열 14) 를 핵산 합성기로 합성하여 사용하는 것 이외에는 실시예 2 와 동일한 조작에 의해 실시하였다. 이 때의 사슬 II (서열 14) 에 있어서의 Y1 영역에 대응하는 영역의 뉴클레오티드수는 1 개였다. 라이게이션 반응 후의 반응액을 HPLC 에 의해 분석한 결과, 사슬 I 과 사슬 II 의 피크에는 변화가 보이지 않고, 또, 연결 1 본쇄 RNA 의 용출 위치에는 피크가 검출되지 않았던 점에서, 연결 반응은 진행되어 있지 않은 것이 확인되었다.
Figure pct00015
실시예 및 참고예에 있어서 사용한 사슬 I 및 사슬 II 의 RNA 의 서열을 표 3 에 정리하여 나타낸다.
Figure pct00016
[실시예 7]
제 1 RNA 사슬 및 제 2 RNA 사슬로서 표 3 에 나타내는 사슬 I (서열 11) 및 사슬 II (서열 12) 를 각각 사용하여, 제 1 RNA 사슬 및 제 2 RNA 사슬의 라이게이션 반응을, 58 units/㎖ KVP40 RNA 리가아제 2, 50 mM Tris-HCl (pH7.0), 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 400 μM ATP 의 조성으로, 반응 스케일 15 ㎖ 로 실시하였다.
제 1 RNA 사슬 (서열 11) 이 2.6 μM, 제 2 RNA 사슬 (서열 12) 이 2.4 μM 이 되도록, 500 mM Tris-HCl (pH 7.0), 20 mM MgCl2 및 10 mM DTT 를 함유하는 4000 μM ATP 완충액 (10x 완충액) 166 ㎕ 및 주사용 증류수로 이루어지는 용액에 제 1 RNA 사슬 및 제 2 RNA 사슬을 첨가하고, 37 ℃ 수욕 중에 10 분 정치하였다. 그 후, KVP40 RNA 리가아제 2 (프로테인·익스프레스) 를 상기의 조성과 반응 스케일이 되도록 첨가하고, 25 ℃ 에서 24 시간 인큐베이트하였다. 반응 후, 반응액에 0.2 M 에틸렌디아민사아세트산나트륨 수용액을 1 ㎖ 첨가하고, 65 ℃ 수욕 중에서 10 분 가열함으로써 효소를 실활시켰다. 그대로 표 1 의 조건을 사용하여 HPLC 에 의해 분석하였다.
라이게이션 반응 후, 제 1 의 1 본쇄 RNA 와 제 2 의 1 본쇄 RNA 가 감소하고, 리텐션 타임이 늦은 새로운 피크가 관찰되었다. 이 용출 피크를 질량 분석 측정에 의해 분자량을 확인한 결과, 연결 1 본쇄 RNA 의 계산치와 합치하고 있던 점에서, 라이게이션 반응에 의해 목적하는 연결 1 본쇄 RNA 가 생성된 것을 확인할 수 있었다.
얻어진 획분을 표 1 에 나타내는 조건에서 HPLC 분석을 실시한 후, 순도 95 ％ 이상에서 얻어진 것을 혼합하였다. 그 결과, 순도 98 ％, 총수율 16 ％ 에서 목적물을 얻을 수 있었다.
[비교예 1]
비교예로서, 실시예 2 에서 합성한 연결 1 본쇄 RNA (서열 16) 와 동일한 뉴클레오티드 서열의 1 본쇄 RNA 를, 이하와 같이, 포스포아미다이트법에 기초하여, 핵산 합성기 (상품명 NTS M-4MX-E, 니혼 테크노 서비스 주식회사) 를 사용하여 3' 측으로부터 5' 측을 향해 합성하였다. 상기 합성에는, RNA 아미다이트로서, 국제 공개 제2013/027843호의 실시예 2 에 기재된 우리딘 EMM 아미다이트, 실시예 3 에 기재된 시티딘 EMM 아미다이트, 실시예 4 에 기재된 아데노신 EMM 아미다이트, 실시예 5 에 기재된 구아노신 EMM 아미다이트 및, 5' 인산화는 Chemical Phosphorylation Reagent (Glen Research) 를 사용하고, 고상 담체로서 다공질 유리를 사용하고, 디블로킹 용액으로서 고순도 트리클로로아세트산톨루엔 용액을 사용하고, 축합제로서 5-벤질메르캅토-1H-테트라졸을 사용하고, 산화제로서 요오드 용액을 사용하고, 캡핑 용액으로서 페녹시아세트산 용액과 N-메틸이미다졸 용액을 사용하여 실시하였다. 고상 합성 후의 고상 담체로부터의 절출과 탈보호는, 국제 공개 제2013/027843호에 기재된 방법에 따랐다. 즉, 암모니아 수용액과 에탄올을 첨가하고, 잠시 정치한 후에 고상 담체를 여과하고, 그 후, 테트라부틸암모늄플루오리드를 사용하여 수산기의 탈보호를 실시하였다. 얻어진 RNA 를, 주사용 증류수를 사용하여 원하는 농도가 되도록 용해시켰다.
그 후, 얻어진 RNA 의 미정제 생성체를 표 1 의 조건에 따라서 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다. 얻어진 정제 프랙션을 각각 HPLC 에 의해 분석하였다. 그 중에서 순도 90 ％ 이상의 프랙션은 얻어지지 않았다. 가장 순도가 높은 프랙션을 분석한 결과, 순도 87 ％, 수율 5 ％ 였다.
도 5 는, 실시예 1 에서 사용한 제 1 의 1 본쇄 RNA 및 제 2 의 1 본쇄 RNA, 그리고 상기 1 본쇄 RNA 의 라이게이션 반응에 의해 생성되는 연결 1 본쇄 RNA 를 나타낸다. 도 6 은, 실시예 2 에서 사용한 제 1 의 1 본쇄 RNA 및 제 2 의 1 본쇄 RNA, 그리고 상기 1 본쇄 RNA 의 라이게이션 반응에 의해 생성되는 연결 1 본쇄 RNA 를 나타낸다. 서열 1 ∼ 16 그리고 도 5 및 도 6 중의 「A」, 「G」, 「U」및 「C」의 각각의 약호는 하기에 나타내는 리보스 고리를 함유하는 RNA 의 단위 구조를 의미한다.
A 는, 하기 식으로 나타낸다.
[화학식 14]
Figure pct00017
G 는, 하기 식으로 나타낸다.
[화학식 15]
Figure pct00018
C 는, 하기 식으로 나타낸다.
[화학식 16]
Figure pct00019
U 는, 하기 식으로 나타낸다.
[화학식 17]
Figure pct00020
단, 도 5 및 도 6 에 있어서, RNA 사슬의 3' 측의 말단 부분만은, 인산에스테르 부분은 없고, 리보스의 3 위치가 수산기가 된다.
서열 1 ∼ 16 그리고 도 5 및 도 6 중의 「P」및 「K」의 약호는, 각각이 하기에 나타내는 구조의 아미노산으로부터 유도되는 원자단을 갖는 링커 영역의 구조를 의미한다.
P 는, 하기의 식으로 나타낸다.
[화학식 18]
Figure pct00021
K 는, 하기의 식으로 나타낸다.
[화학식 19]
Figure pct00022
서열 1 ∼ 16 그리고 도 5 및 도 6 중의 「p」의 약호는 리보스 고리의 5' 위치가 인산기〔-O-P(=O)(OH)2〕인 것을 의미한다.
산업상 이용가능성
본 발명에 관련된 1 본쇄 RNA 의 제조 방법은, 1 본쇄 RNA 의 간편한 제조 방법으로서 이용할 수 있다.
<110> Sumitomo Chemical Co., Ltd. <120> Method for producing nucleic acid molecule <130> PC26899 <150> JP2018-21799 <151> 2018-02-09 <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized RNA <400> 1 guguacucug cuu 13 <210> 2 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized RNA <400> 2 gcagaguaca cacagcauau acc 23 <210> 3 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized RNA <400> 3 gguauaugcu gu 12 <210> 4 <211> 14 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized RNA <400> 4 guguacucug cuuc 14 <210> 5 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized RNA <400> 5 agcagaguac acacagcaua uacc 24 <210> 6 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized RNA <400> 6 gguauaugcu gu 12 <210> 7 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized RNA <400> 7 cuguguguac ucugcuuc 18 <210> 8 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence 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agcagaguac acacagcaua uacc 24 <210> 17 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized RNA <400> 17 gcagaguaca cacagcauau acc 23 <210> 18 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized RNA <400> 18 gguauaugcu guguguacuc ugcuu 25 <210> 19 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized RNA <400> 19 agcagaguac acacagcaua uacc 24 <210> 20 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized RNA <400> 20 gguauaugcu guguguacuc ugcuuc 26 <210> 21 <211> 334 <212> PRT <213> bacteriophage T4 <400> 21 Met Phe Lys Lys Tyr Ser Ser Leu Glu Asn His Tyr Asn Ser Lys Phe 1 5 10 15 Ile Glu Lys Leu Tyr Ser Leu Gly Leu Thr Gly Gly Glu Trp Val Ala 20 25 30 Arg Glu Lys Ile His Gly Thr Asn Phe Ser Leu Ile Ile Glu Arg Asp 35 40 45 Lys Val Thr Cys Ala Lys Arg Thr Gly Pro Ile Leu Pro Ala Glu Asp 50 55 60 Phe Phe Gly Tyr Glu Ile Ile Leu Lys Asn Tyr Ala Asp Ser Ile Lys 65 70 75 80 Ala Val Gln Asp Ile Met Glu Thr Ser Ala Val Val Ser Tyr Gln Val 85 90 95 Phe Gly Glu Phe Ala Gly Pro Gly Ile Gln Lys Asn Val Asp Tyr Cys 100 105 110 Asp Lys Asp Phe Tyr Val Phe Asp Ile Ile Val Thr Thr Glu Ser Gly 115 120 125 Asp Val Thr Tyr Val Asp Asp Tyr Met Met Glu Ser Phe Cys Asn Thr 130 135 140 Phe Lys Phe Lys Met Ala Pro Leu Leu Gly Arg Gly Lys Phe Glu Glu 145 150 155 160 Leu Ile Lys Leu Pro Asn Asp Leu Asp Ser Val Val Gln Asp Tyr Asn 165 170 175 Phe Thr Val Asp His Ala Gly Leu Val Asp Ala Asn Lys Cys Val Trp 180 185 190 Asn Ala Glu Ala Lys Gly Glu Val Phe Thr Ala Glu Gly Tyr Val Leu 195 200 205 Lys Pro Cys Tyr Pro Ser Trp Leu Arg Asn Gly Asn Arg Val Ala Ile 210 215 220 Lys Cys Lys Asn Ser Lys Phe Ser Glu Lys Lys Lys Ser Asp Lys Pro 225 230 235 240 Ile Lys Ala Lys Val Glu Leu Ser Glu Ala Asp Asn Lys Leu Val Gly 245 250 255 Ile Leu Ala Cys Tyr Val Thr Leu Asn Arg Val Asn Asn Val Ile Ser 260 265 270 Lys Ile Gly Glu Ile Gly Pro Lys Asp Phe Gly Lys Val Met Gly Leu 275 280 285 Thr Val Gln Asp Ile Leu Glu Glu Thr Ser Arg Glu Gly Ile Thr Leu 290 295 300 Thr Gln Ala Asp Asn Pro Ser Leu Ile Lys Lys Glu Leu Val Lys Met 305 310 315 320 Val Gln Asp Val Leu Arg Pro Ala Trp Ile Glu Leu Val Ser 325 330 <210> 22 <211> 335 <212> PRT <213> Vibrio phage KVP40 <400> 22 Met Ser Phe Val Lys Tyr Thr Ser Leu Glu Asn Ser Tyr Arg Gln Ala 1 5 10 15 Phe Val Asp Lys Cys Asp Met Leu Gly Val Arg Glu Trp Val Ala Leu 20 25 30 Glu Lys Ile His Gly Ala Asn Phe Ser Phe Ile Val Glu Phe Lys Pro 35 40 45 Asn Glu Ala Gln Asp Gly Ala Glu Phe Thr Val Thr Pro Ala Lys Arg 50 55 60 Thr Ser Thr Ile Gly Ala Asn Val Met Gly Asp Tyr Asp Phe Tyr Gly 65 70 75 80 Cys Thr Ser Val Val Glu Ala His Thr Ala Lys Met Glu Ala Ile Ser 85 90 95 Asn Trp Leu Trp Ala Arg Gly Ile Ile Asn Val Gly Glu Thr Ile Ile 100 105 110 Val Tyr Gly Glu Leu Ala Gly Lys Gly Val Gln Lys Glu Val Asn Tyr 115 120 125 Gly Asp Lys Asp Phe Trp Ala Tyr Asp Ile Leu Leu Pro Glu Thr Gly 130 135 140 Lys Phe Leu Asp Trp Asp Val Val Leu Glu Ala Cys Glu Phe Ala Lys 145 150 155 160 Val Lys Thr Thr His Glu Ile Ala Arg Gly Thr Leu Asp Glu Leu Leu 165 170 175 Arg Ile Asp Pro Leu Phe Arg Ser Phe His Thr Pro Ala Asp Val Asp 180 185 190 Gly Asp Asn Val Ala Glu Gly Phe Val Val Lys Gln Leu Arg Asn Glu 195 200 205 Lys Arg Leu His Asn Gly Ser Arg Ala Ile Leu Lys Val Lys Asn Asp 210 215 220 Lys Phe Lys Glu Lys Lys Asn Lys Ala Gly Lys Thr Pro Arg Ala Ala 225 230 235 240 Val Val Leu Thr Glu Glu Gln Glu Lys Leu His Ala Ala Phe Ser Cys 245 250 255 Tyr Leu Thr Glu Asn Arg Leu Arg Asn Val Leu Ser Lys Leu Glu Thr 260 265 270 Val Thr Gln Lys Gln Phe Gly Met Ile Ser Gly Leu Phe Ile Lys Asp 275 280 285 Ala Lys Asp Glu Phe Glu Arg Asp Glu Leu Asn Glu Thr Ala Ile Ala 290 295 300 Arg Asp Asp Trp Asp Val Ile Lys Arg Ser Leu Thr Asn Ile Ala Asn 305 310 315 320 Glu Ile Leu Arg Lys Asn Trp Leu Asp Ile Leu Asp Gly Asn Phe 325 330 335 <210> 23 <211> 342 <212> PRT <213> Deinococcus radiorurans <400> 23 Met Ala Glu Arg Gln Val Ile Lys Glu Arg Ala Gln Leu Phe Pro His 1 5 10 15 Pro Asn Ala Glu Arg Leu Glu Leu Cys Lys Val Gly Thr Phe Gln Leu 20 25 30 Val Val Arg Lys Gly Glu Tyr Arg Asp Gly Asp Pro Ile Val Ile Ala 35 40 45 Pro Glu Lys Ala Val Leu Pro Pro Gln Leu Ala Gly Leu Tyr Thr Asn 50 55 60 Ala Asp Thr Gly Ala Ser Tyr Leu His Gly Ala Glu Lys Asn Arg Val 65 70 75 80 Gly Ser Val Arg Leu Arg Gly Glu Val Ser Gln Gly Val Ile Leu Pro 85 90 95 Leu Asp Gly Leu Glu Asp Ala Pro Phe Gly Glu Asp Leu Ala Glu Arg 100 105 110 Leu Gly Ile Thr Phe Trp Glu Pro Pro Val Pro Val Ser Met Ala Gly 115 120 125 Glu Val Glu Pro Arg Pro Pro Ala Gln His Tyr Lys His His Asp Val 130 135 140 Glu Gln Phe Gly Ile Tyr Val Ser Glu Phe Ala Ser Gly Glu Glu Val 145 150 155 160 Met Val Thr Glu Lys Leu His Gly Thr Gln Gly Val Tyr Phe Arg Thr 165 170 175 Ala Glu Gly Arg Trp Leu Val Thr Ser Lys Gly Leu Ser Arg Gly Gly 180 185 190 Leu Thr Leu Arg Glu Ala Ala Ser Asn Val Tyr Trp Gln Ala Ala Arg 195 200 205 Asn Ser Asn Leu Phe Ala Glu Ala Asp Ala Ala Phe Ser Gly Gly Glu 210 215 220 Val Gln Ile Phe Gly Glu Val Val Pro Val Gln Lys Gly Phe Ser Tyr 225 230 235 240 Gly Gln His Lys Pro Thr Val Phe Val Phe Lys Val Val Tyr Asp Gly 245 250 255 Leu Arg Leu Pro Arg Arg Asp Trp Pro Gln Trp Val Leu Asp His Ala 260 265 270 Val Pro Val Leu Tyr Glu Gly Pro Phe Asp Glu Ala Thr Val Arg Lys 275 280 285 Leu Arg Gly Gly Leu Glu Thr Val Ser Gly Lys Gly Leu His Ile Arg 290 295 300 Glu Gly Val Val Val Ala Pro Lys Val Pro Arg Phe Ala Ala Asp Gly 305 310 315 320 Ser Asp Leu Ser Val Lys Leu Ile Ser Asp Ala Tyr Ala Lys Lys Glu 325 330 335 Thr Gly Glu Glu Tyr Ser 340

Claims (9)

  1. 5' 말단에 인산기를 갖는 제 1 의 1 본쇄 RNA 와 3' 말단에 수산기를 갖는 제 2 의 1 본쇄 RNA 에, 국제 생화학 연합이 효소 번호로서 정하는 EC6.5.1.3 으로 분류되고, 2 본쇄 닉 수복 활성을 갖는 RNA 리가아제를 작용시켜, 상기 제 1 의 1 본쇄 RNA 와 상기 제 2 의 1 본쇄 RNA 를 연결하는 공정을 포함하는 1 본쇄 RNA 의 제조 방법으로서, 이하의 a) ∼ g) 의 특징을 갖는 제조 방법 :
    a) 상기 제 1 의 1 본쇄 RNA 가, 5' 말단측으로부터 차례로, X1 영역 및 Z 영역으로 이루어지는 1 본쇄 RNA 이고 ;
    b) 상기 제 2 의 1 본쇄 RNA 가, 5' 말단측으로부터 차례로, X2 영역, Y2 영역, Ly 링커 영역 및 Y1 영역으로 이루어지는 1 본쇄이고 ;
    c) 상기 X1 영역과 상기 X2 영역이, 서로 상보적인, 2 이상의 동수의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열이고 ;
    d) 상기 Y1 영역과 상기 Y2 영역이, 서로 상보적인, 2 이상의 동수의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열이고 ;
    e) 상기 Z 영역이, 임의의 뉴클레오티드수의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 영역이고 ;
    f) Ly 링커 영역이, 아미노산으로부터 유도되는 원자단을 갖는 링커 영역이고 ;
    g) 상기 제 1 의 1 본쇄 RNA 와 상기 제 2 의 1 본쇄 RNA 의 연결에 의해 생성되는 1 본쇄 RNA 가, 5' 말단측으로부터 차례로, 상기 X2 영역, 상기 Y2 영역, 상기 Ly 링커 영역, 상기 Y1 영역, 상기 X1 영역 및 상기 Z 영역으로 이루어지는 연결 1 본쇄 RNA 이다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 Z 영역이, 5' 말단측으로부터 차례로, Z1 영역, Lz 링커 영역 및 Z2 영역으로 이루어지는 영역이고,
    상기 Lz 링커 영역이, 아미노산으로부터 유도되는 원자단을 갖는 링커 영역이고,
    상기 Z1 영역과 상기 Z2 영역이, 서로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 제 1 의 1 본쇄 RNA 와 상기 제 2 의 1 본쇄 RNA 의 연결에 의해 생성되는 1 본쇄 RNA 가, 5' 말단측으로부터 차례로, 상기 X2 영역, 상기 Y2 영역, 상기 Ly 링커 영역, 상기 Y1 영역, 상기 X1 영역 및 상기 Z1 영역, 상기 Lz 링커 영역 및 상기 Z2 영역으로 이루어지는 연결 1 본쇄 RNA 인, 제조 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 Ly 링커 영역이, 하기 식 (I) 로 나타내는 2 가의 기인, 제조 방법.
    Figure pct00023

    (식 중, Y11 및 Y21 은, 각각 독립적으로, 탄소수 1 ∼ 20 의 알킬렌기를 나타내고, Y12 및 Y22 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 혹은 아미노기로 치환되어 있어도 되는 알킬기를 나타내거나, 혹은 Y12 와 Y22 가 그 말단에서 서로 결합하여 탄소수 3 ∼ 4 의 알킬렌기를 나타내고,
    Y11 에 결합하고 있는 말단의 산소 원자는, 상기 Y1 영역 및 상기 Y2 영역 중 어느 일방의 영역의 말단 뉴클레오티드의 인산에스테르의 인 원자와 결합하고 있고,
    Y21 에 결합하고 있는 말단의 산소 원자는, 상기 Y1 영역 및 상기 Y2 영역의 Y11 과는 결합하고 있지 않은 타방의 영역의 말단 뉴클레오티드의 인산에스테르의 인 원자와 결합하고 있다)
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 Ly 링커 영역이, 하기 식 (I) 로 나타내는 2 가의 기이고, 상기 Lz 링커 영역이, 하기 식 (I') 로 나타내는 2 가의 기인, 제조 방법.
    Figure pct00024

    (식 중, Y11 및 Y21 은, 각각 독립적으로, 탄소수 1 ∼ 20 의 알킬렌기를 나타내고, Y12 및 Y22 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 혹은 아미노기로 치환되어 있어도 되는 알킬기를 나타내거나, 혹은 Y12 와 Y22 가 그 말단에서 서로 결합하여 탄소수 3 ∼ 4 의 알킬렌기를 나타내고,
    Y11 에 결합하고 있는 말단의 산소 원자는, 상기 Y1 영역 및 상기 Y2 영역 중 어느 일방의 영역의 말단 뉴클레오티드의 인산에스테르의 인 원자와 결합하고 있고,
    Y21 에 결합하고 있는 말단의 산소 원자는, 상기 Y2 영역 및 상기 Y1 영역의 Y11 과는 결합하고 있지 않은 타방의 영역의 말단 뉴클레오티드의 인산에스테르의 인 원자와 결합하고 있다)
    Figure pct00025

    (식 중, Y'11 및 Y'21 은, 각각 독립적으로, 탄소수 1 ∼ 20 의 알킬렌기를 나타내고, Y'12 및 Y'22 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 혹은 아미노기로 치환되어 있어도 되는 알킬기를 나타내거나, 혹은 Y'12 와 Y'22 가 그 말단에서 서로 결합하여 탄소수 3 ∼ 4 의 알킬렌기를 나타내고,
    Y'11 에 결합하고 있는 말단의 산소 원자는, 상기 Z1 영역 및 상기 Z2 영역 중 어느 일방의 영역의 말단 뉴클레오티드의 인산에스테르의 인 원자와 결합하고 있고,
    Y'21 에 결합하고 있는 말단의 산소 원자는, 상기 Z2 영역 및 상기 Z1 영역의 Y'11 과는 결합하고 있지 않은 타방의 영역의 말단 뉴클레오티드의 인산에스테르의 인 원자와 결합하고 있다)
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    상기 Ly 링커 영역 및 상기 Lz 링커 영역은, 각각 독립적으로, 하기 식 (II-A) 또는 (II-B) 로 나타내는 구조의 2 가의 기인, 제조 방법.
    Figure pct00026

    (식 중, n 및 m 은, 각각 독립적으로, 1 내지 20 중 어느 정수를 나타낸다)
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 X1 영역, 상기 Y1 영역 및 상기 Z 영역으로 이루어지는 W1 영역, 및 상기 X2 영역 및 상기 Y2 영역으로 이루어지는 W2 영역 중 적어도 일방에, RNA 간섭법의 표적이 되는 유전자의 발현을 억제하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 제조 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 리가아제가, T4 박테리오파지 유래의 T4 RNA 리가아제 2, KVP40 유래의 리가아제 2, Trypanosoma brucei RNA 리가아제, Deinococcus radiodurans RNA 리가아제, 또는 Leishmania tarentolae RNA 리가아제인, 제조 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 리가아제가, 서열 번호 21, 22, 또는 23 에 기재된 아미노산 서열과 95 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 RNA 리가아제인, 제조 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 리가아제가, T4 박테리오파지 유래의 T4 RNA 리가아제 2 또는 KVP40 유래의 RNA 리가아제 2 인, 제조 방법.
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