KR20010108722A - 피롤리진 유도체가 부착된 신규의 올리고뉴클레오타이드화합물, 이의 제조방법, 이를 포함하는 조성물, 및 이를유전자 관련 질병의 치료, 진단 및 분석에 사용하는 방법 - Google Patents

피롤리진 유도체가 부착된 신규의 올리고뉴클레오타이드화합물, 이의 제조방법, 이를 포함하는 조성물, 및 이를유전자 관련 질병의 치료, 진단 및 분석에 사용하는 방법 Download PDF

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우진석
이의복
권연정
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우진석
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids

Abstract

본 발명은 유전자(DNA 또는 RNA)와 위치-특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체에, 유전자(DNA 또는 RNA)의 특정 염기와 공유결합을 할 수 있는 피롤리진 유도체를 부착시킨 하기 화학식 1의 신규 화합물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 위치-특이적 유전자 공략 물질로서, 유전자 관련 질병의 치료, 진단 및 분석 등 이와 관련된 분야에 상기 화합물을 광범위하게 사용하는 것에 관한 것이다.
(상기 식에서, R1, X, X', Y 및 n은 하기 명세서에서 정의한 바와 같음)

Description

피롤리진 유도체가 부착된 신규의 올리고뉴클레오타이드 화합물, 이의 제조 방법, 이를 포함하는 조성물, 및 이를 유전자 관련 질병의 치료, 진단 및 분석에 사용하는 방법{Novel oligonucleotide compounds having pyrrolizine derivatives, processes for preparing them, compositions containing them and uses thereof in treatment, diagnosis and analysis of gene-related diseases}
본 발명은 유전자(DNA 또는 RNA)와 위치-특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체에, 유전자(DNA 또는 RNA)의 특정 염기와 공유결합할 수 있는 피롤리진 유도체들을 부착시킨 하기 화학식 1의 신규 화합물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 위치-특이적 유전자 공략 물질로서, 유전자 관련 질병의 치료, 진단 및 분석 등 이와 관련된 분야에 상기 화합물을 광범위하게 사용하는 것에 관한 것이다.
[화학식 1]
상기 식에서,
R1은 C1-C10의 알킬기, C3-C7의 시클로알킬기, C3-C6의 알케닐기, 또는 페닐기이고,
X 및 X'는 서로 같거나 다를 수 있고, 각각 하이드록시기, 치환되거나 비치환된 알킬티오기, 치환되거나 비치환된 실릴옥시기, 또는 -OR기(이때, R은 치환되거나 비치환된 알킬, 치환되거나 비치환된 페닐, 또는 치환되거나 비치환된 카바메이트임)이고,
Y는 산소(O), 질소(N), 황(S)을 포함하는 기능기이고,
n은 0-10으로, 올리고뉴클레오타이드 유사체와 피롤리진 유도체간의 링커 길이이다.
본 발명을 보다 상세하게 설명하면, 본 발명의 신규 화합물은 특정 유전자와 위치-특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 부위와 피롤리진 유도체 부위가 결합된 구조를 가지고 있으며, 구체적으로 피롤리진 유도체는 유전자와 공유 결합을 할 수 있는 기능기 X, X'를 포함하는 본체와 올리고뉴클레오타이드 유사체에 결합되어지는 링커를 포함하는 기능기 Y로 구성되어 있다.
따라서, 본 발명에서 얻어진 올리고뉴클레오타이드 유사체와 피롤리진 유도체의 복합체인 화학식 1의 화합물들은 유전자 관련 질병의 치료, 진단, 및 분석을 포함한 의학, 생명공학 등 광범위한 관련분야에 유용하게 이용될 수 있다.
유전자(DNA 또는 RNA)와 위치-특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드들은 해당 유전자의 발현을 막음으로써, 선택성이 있는 치료제로서의 높은 개발 가능성을 가지고 있다. 예를 들어 합성 유전자들은 세포속의 특정 mRNA와 선택적으로 결합을 할 수가 있고 결과적으로, 해당 단백질의 합성을 막음으로써 관련 질병을 치료하고자 하는 방법이 하나의 유전자 치료분야로서 자리를 잡아가고 있다. 보다 구체적으로, 안티센스라 불리는 이러한 합성 유전자들을 이용한 치료제의 개발이 바이러스, 박테리아 및 암 치료 분야에서 폭넓게 시도되고 있다(관련문헌: Uhlmann et al.,Chemical Reviews, 90(4), 543(1990);Crooke, Ciba Found Symp,209, 158(1997)).
하지만, 기존의 안티센스 치료법은 그 효율성에 있어서 많은 문제점을 가지고 있다. 그 중에 가장 큰 문제점은 안티센스와 mRNA간의 결합력이 약하여 목적하는 수준으로 mRNA의 기능을 저하시키기 위해서는 불가피하게도 많은 양의 안티센스를 투여해야 한다는 것이다. 이것은 두 가지 측면에서 큰 문제를 야기시킨다. 그 첫째는, 합성 유전자의 생산단가가 기존의 약들에 비해 매우 높다는 것이다. 그러므로, 경제적인 측면에서, 적은 양의 합성 유전자로도 원하는 안티센스 효과를 보고자 하는 것에 개발의 관심이 집중되고 있다. 둘째로, 많은 양의 합성 유전자를 투여하면, 이로 인해 독성 등 생체내에서 여러 가지 원치 않는 현상들이 나타날 수 있다는 것이다.
따라서, 이러한 문제점들을 해결하고자 많은 노력이 기울여져 왔다. 그 중의 하나가 안티센스에 유전자 반응 물질(gene alkylating agents)을 부착시켜서 mRNA와의 결합력을 높이고자 하는 방안이다. 이러한 개념을 이용한 최초의 작업은 비. 알. 베이커씨(B. R. Baker)에 의하여 1967년에 시도되었다(관련문헌:Design of Active-Site-Directed Irreversible Enzyme Inhibitors, Willy, New York(1967)). 그 후로도 후술한 바와 같이 이와 관련된 여러 시도들이 간간이 발표되었다.
노르와 블라소프(Knorr 및 Vlassov)는 N-(2-클로로에틸)-N-메틸아닐린 그룹을 합성 유전자의 말단에 결합시킨 유전자 공략 물질을 만들었다 (관련문헌:Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol., 32, 291(1985)).
밀러(Miller) 등은 소렐린(psoralen)을 부착시킨 안티센스를 만들고, 이들이UV 빛에 의하여 활성화되어 목적 유전자와 공유결합한다는 사실을 제시하였다(관련문헌:Antisense Res. Dev.4, 231(1994)).
마이어(Meyer) 등은 α-할로카보닐 물질들이 결합된 합성 유전자가 위치-특이적으로 유전자와 반응을 한다는 것을 보여주었다(관련문헌:J. Am. Chem. Soc.111, 8617(1989)).
루크타노프(Lukhtanov) 등은 시클로프로파피롤로인돌 그룹이 부착된 합성 유전자를 만들어 이들이 목적 유전자의 특정 부위에 공유결합함을 보여주었다(관련문헌:J. Am. Chem. Soc., 119, 6214(1997)).
토마츠와 코온(Tomasz와 Kohn)은 비슷한 시기에 합성 유전자에 항암제이며 유전자 반응 물질인 마이토마이신을 부착시켜서 이들이 기존의 안티센스보다 탁월한 약효가 있음을 보여주었다(관련문헌:Bioconjugate Chem.,7, 541(1996);Bioconjugate Chem.,7, 659(1996)).
위의 예들에서 보여준 유전자 반응 물질을 포함한 안티센스가 기존의 단독의 안티센스보다 우수하다는 여러 실험적 결과에도 불구하고, 유전자 반응 물질의 반응성, 합성단가등의 문제점들로 인하여 학문적인 목적외에 이 분야에 이들이 응용된 예는 많지 않았다.
이에, 본 발명의 발명자들은 이러한 종래 기술의 문제점을 극복하고자, 다각적인 연구를 거듭한 끝에 피롤리진 계열의 물질을 합성 유전자에 부착시킨 본 발명의 화합물이 기존에 사용되어 왔던 물질들에 비해 탁월한 효과를 가지고 있음을 밝혀냈다.
구체적으로, 본 발명에서 사용한 유전자 반응 물질인 피롤리진 유도체들은 합성과 반응성 조절이 용이하며 올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체에 효율적으로 결합하고, 따라서 이렇게 하여 얻어진 화학식 1의 화합물들은 대량 생산과 정제가 가능하여 위치-특이적 유전자 공략 물질로서 유전자 관련 질병의 치료, 진단 및 분석목적을 포함한 관련분야에 실제 사용이 가능할 것으로 기대된다.
본 발명의 첫 번째 목적은 유전자(DNA 또는 RNA)와 위치-특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체에, 유전자(DNA 또는 RNA)의 특정 염기와 공유결합할 수 있는 피롤리진 유도체들을 부착시킨 상기 화학식 1의 신규 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 두 번째 목적은 이러한 화학식 1의 화합물을 제조하는 신규의 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 세 번째 목적은 목적하는 유전자에 본 발명의 화합물을 위치-특이적으로 결합시킴으로써, 이 유전자와 관련된 질병을 치료하거나, 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 네 번째 목적은 유효 성분으로서 본 발명의 화합물과 약학적으로 적합한 보조제를 포함하는, 유전자 관련 질병 치료용 조성물, 특히 항암제를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 목적 유전자 검출시 본 발명의 화합물을 사용하여, 보다 용이하고 효율적으로 원하는 유전자를 분석하는 방법을 제공하고자 한다.
도 1은 실시예 1의 화합물을 정제전(A) 및 정제후(B) HPLC 크로마토그라피한 결과를 나타내는 그래프.
도 2는 UV 스펙트럼을 나타내는 그래프로서, 상부 스펙트럼은 실시예 1의 화합물의 UV 스펙트럼 결과이고, 하부 스펙트럼은 일반 DNA의 UV 스펙트럼 결과를 나타내는 도면.
도 3은 실시예 2 화합물의 가수분해산물에 대한 HPLC 추적 그래프.
도 4는 각각 표적 DNA Bcl2-1에 교차-결합한 실시예 2의 화합물(레인 1)과 실시예 3의 화합물(레인 2), 및 표적 DNA Bcl2-1(레인 3)의 DPAGE 사진.
도 5는 H69, H82 및 N417 인체기원 소세포 폐암 세포에 대한 안티센스 올리고데옥시뉴클레오타이드(ODN)들의 시험관내에서의 세포독성을 나타내는 그래프.
본 발명은 유전자(DNA 또는 RNA)와 위치-특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체에, 유전자(DNA 또는 RNA)의 특정 염기와 공유결합할 수 있는 피롤리진 유도체들을 부착시킨 하기 화학식 1의 신규 화합물, 이들의 염 또는 용매 화합물에 관한 것이다.
[화학식 1]
상기 식에서,
R1은 C1-C10의 알킬기, C3-C7의 시클로알킬기, C3-C6의 알케닐기, 또는 페닐기이고,
X 및 X'는 서로 같거나 다를 수 있고, 각각 하이드록시기, 치환되거나 비치환된 알킬티오기, 치환되거나 비치환된 실릴옥시기, 또는 -OR기(이때, R은 치환되거나 비치환된 알킬, 치환되거나 비치환된 페닐, 또는 치환되거나 비치환된 카바메이트임)이고,
Y는 산소(O), 질소(N), 황(S)을 포함하는 기능기이고,
n은 0-10으로, 올리고뉴클레오타이드 유사체와 피롤리진 유도체간의 링커 길이이다.
본 발명의 바람직한 화합물은 상기 화학식 1에서, R1이 C1-C3알킬기이고, X 및 X'는 하이드록시기, 치환되거나 비치환된 저급 알콕시기, 저급 알킬티오기, 치환된 실릴옥시기, 치환되거나 비치환된 페녹시기, 치환되거나 비치환된 O-트리틸기 또는 치환되거나 비치환된 카바메이트기이며, Y가 산소, 질소, 황이고, n이 0-6인 피롤리진 유도체가 부착된 올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체 화합물, 이들의 염, 또는 용매 화합물이다.
본 발명의 더욱 바람직한 화합물은 상기 화학식 1에서, R1이 C1-C3직쇄 알킬기이고, X 및 X'는 하이드록시기, 메톡시기, 에톡시기, 벤질옥시기, 메틸티오기, 에틸티오기, 트리메틸실릴옥시기, t-부틸디메틸실릴옥시기, 페녹시기, O-할로페닐기, O-톨루일기, O-크레솔기, O-트리틸기, O-4,4'-디메톡시트리틸기 또는 이소프로필카바메이트기며, Y가 산소 원자이고, n이 1-6인 피롤리진 유도체가 부착된 올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체 화합물, 이들의 염, 또는 용매 화합물이다.
본 발명의 화합물중 특히 바람직한 화합물은 하기 화학식 2의 화합물이다:
상기 식에서,
R1은 C1-C10의 알킬기, C3-C7의 시클로알킬기, C3-C6의 알케닐기, 또는 페닐기이고,
R7은 메틸기, 에틸기, 프로필기, 페닐기, 벤질기, 카보닐기, 또는 카바메이트기이고,
n은 0-6이다.
본 발명의 화합물중 가장 바람직한 화합물로는 2,3-디하이드로-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체;
2,3-디하이드로-6,7-비스(메톡시메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체;
2,3-디하이드로-6,7-비스(에톡시메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체;
2,3-디하이드로-6,7-비스(벤질옥시메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체;
2,3-디하이드로-6,7-비스(페닐-O-메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체;
2,3-디하이드로-6,7-비스(p-플루오로페닐-O-메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체;
2,3-디하이드로-6,7-비스(p-클로로페닐-O-메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체;
2,3-디하이드로-6,7-비스(p-요오도페닐-O-메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체;
2,3-디하이드로-6,7-비스(p-메톡시페닐-O-메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체;
2,3-디하이드로-6,7-비스(p-톨루일-O-메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체;
2,3-디하이드로-6,7-비스(디메톡시트리틸-O-메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체;
2,3-디하이드로-6,7-비스(이소프로필옥시메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체;
2,3-디하이드로-6,7-비스(하이드록시메틸)-비스(이소프로필카바메이트)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체;
2,3-디하이드로-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(헥실옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체;
2,3-디하이드로-6,7-비스(에톡시메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(헥실옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체;
2,3-디하이드로-6,7-비스(트리메틸실릴옥시메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(부틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체;
2,3-디하이드로-6,7-비스(에톡시메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(부틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체;
2,3-디하이드로-6,7-비스(DMTr-O-메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(부틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체;
2,3-디하이드로-6,7-비스(벤질옥시메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체;
2,3-디하이드로-6,7-비스(p-메톡시페닐-O-메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체;
2,3-디하이드로-6,7-비스(p-클로로페닐-O-메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체;
2,3-디하이드로-6,7-비스(하이드록시메틸)-비스(이소프로필카바메이트)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체, 이들의 염, 또는 용매 화합물을 들 수 있다.
본 발명의 화합물에서, 올리고뉴클레오타이드라 함은 목적 유전자와 위치-특이적으로 결합할 수 있는 모든 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체들을 총칭한다. 여기서 올리고뉴클레오타이드란, 알려진 바와 같이, 일련의 뉴클레오타이드들이 포스페이트 에스테르 결합에 의하여 연결된 구조를 말한다. 이 경우, 각각의 뉴클레오타이드들은 헤테로사이클릭 염기에 부착된 오탄당으로 이루어져 있다. 자연상에서 발견되어지는 염기로는 구아닌, 아데닌, 사이토신, 타이민 및 우라실 등이 있으며, 본 발명에서는 올리고뉴클레오타이드내 염기로서 이들의 유사체들도 포함할 수 있다. 또한, 여기서 오탄당이란 자연상에서 발견되어지는 라이보스 및 데옥시라이보스를 포함한 이들의 당 유도체들을 의미한다. 본 발명에서 뉴클레오타이드를 연결하는 골격구조로는 자연상에서 발견되어지는 포스페이트 에스테르 결합을 비롯하여, 모노포스페이트, 알킬포스페이트, 알켄포스페이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 펩타이드 결합 및 이들의 유사체들이 포함될 수 있다. 본 발명에서는 올리고뉴클레오타이드로서, 목적하는 유전자에 위치-특이적으로 결합되도록 자연적으로 수득하거나 또는 인공적으로 합성한 모든 올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체들을 모두 사용할 수 있다.
본 발명을 보다 상세하게 설명하면, 본 발명의 신규 화합물은 특정 유전자와 위치-특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 부위와 피롤리진 유도체 부위가 결합된 구조를 가지고 있으며, 구체적으로 피롤리진 유도체는 유전자의 특정 염기와 공유결합을 할 수 있는 기능기 X 및 X'을 포함하는 본체와 올리고뉴클레오타이드 유도체에 결합되어지는 링커를 포함하는 기능기 Y로 구성되어 있다.
본 발명에서 사용한 피롤리진 유도체들은 유전자의 특정 염기와 공유결합을 할 수 있는 기능 구조를 갖고 있으면서, 다른 유전자 반응 물질에 비해 그 합성과 반응성 조절이 용이한 특징을 가지고 있다. 따라서, 본 발명의 피롤리진 유도체와 올리고뉴클레오타이드의 복합체는 종래의 유사 화합물들에 비해, 특정 유전자에 효율적으로 결합하고, 또한 대량 생산과 정제가 가능하여 유용한 위치-특이적 유전자 공략 물질(위치-특이적 핵산 알킬화제)로서 유전자 관련 질병의 치료, 진단 및 분석 목적을 포함한 관련 분야에 광범위하게 효과적으로 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 특정 유전자(DNA 또는 RNA)와 위치-특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체에, 유전자의 염기와 공유 결합할 수 있는 피롤리진 유도체들을 부착시킨 상기 화학식 1의 신규 화합물을 제공한다.
본 발명의 화합물중에서 대표적인 것으로 하기 화학식 3 내지 9의 화합물을 그 예로서 들 수 있다.
상기 화학식 3의 2,3-디하이드로-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 화합물은 실험 결과, 목적 유전자를 위치-특이적으로 공략함에 있어 그 효율성이 매우 뛰어난 것으로 나타났고, 화합물의 안정성 또한 비교적 우수하다.
상기 화학식 4의 2,3-디하이드로-6,7-비스(DMTr-O-메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 화합물은 상기 화학식 3의 화합물중 반응성이 너무 높아 불안정한 하이드록시기를 디메톡시트리틸기로 치환하여 그 반응성을 낮춤으로써, 유전자 합성기를 사용한 화학식 4 화합물의 대량 생산을 가능하게 하였으며, 합성 및 정제후, 다시 화학식 3의 화합물로 쉽게 전환이 가능한 특징을 가지고 있다.
2,3-디하이드로-6,7-비스(p-메톡시페닐-O-메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 화합물.
2,3-디하이드로-6,7-비스(p-클로로페닐-O-메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 화합물.
2,3-디하이드로-6,7-비스(벤질옥시메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 화합물.
2,3-디하이드로-6,7-비스(에톡시메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 화합물.
2,3-디하이드로-6,7-비스(하이드록시메틸)-비스(이소프로필카바메이트)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 화합물.
본 발명은 또한, 상기 화학식 1의 피롤리진 유도체가 부착된 올리고뉴클레오타이드 화합물의 제조 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 방법에서는
(1) 5번 위치에 치환기를 가진 디메틸 2,3-디하이드로-1H-피롤리진-6,7-디카복실레이트를 이용하여 다양한 반응성을 가진 피롤리진 화합물을 얻고,
(2) 이를 올리고뉴클레오타이드에 결합시킬 수 있는 적절한 구조로 전환시킨후,
(3) 이를 다시 핵산 합성기등을 사용하여 올리고뉴클레오타이드에 부착시켜서 화학식 1의 구조를 가진 화합물을 제조한다.
본 발명의 방법을 보다 구체적으로 단계별로 설명하면 다음과 같다:
(1) 화학식 10의 화합물인 디메틸 2,3-디하이드로-1H-피롤리진-6,7-디카복실레이트 유도체를 소듐 메톡사이드(Na+MeO-)와 반응시켜서 화학식 11의 화합물을 제조하는 단계(반응식 1 참조):
(이하, R8은 메틸, 에틸, 프로필이고, n은 0-6임);
(2) 화학식 11 화합물의 하이드록시기를 t-부틸디메틸실릴클로라이드 (TBDMSiCl)로 보호한 화학식 12의 화합물을 제조하는 단계(반응식 2 참조);
(3) 화학식 12의 화합물을, 리튬 알루미늄하이드라이드(LiAlH4)와 같은 적당한 반응성 촉매의 존재하에서 환원시켜 화학식 13의 화합물을 제조하는 단계(반응식 3 참조);
(4) 화학식 13 화합물의 하이드록시기를 무수산과 반응시켜 화학식 14의 화합물을 제조한후(반응식 4 참조; 화학식 13의 화합물은 반응성이 매우 커서 보관시 주의를 요함):
(이때, R9는 알킬기임),
(4a) 화학식 14의 화합물에 존재하는 에스테르 방출 그룹을 뉴클레오파일과 반응시켜 화학식 15의 화합물을 제조하거나(반응식 4a 참조): 또는
(이때, 뉴클레오파일 R10S-및 R10O-에서, R10은 치환되거나 비치환된 알킬 또는 페닐을 나타내고, 이하 X 및 X'는 제 1 항에서 정의한 바와 같음);
(5) 화학식 13의 하이드록시기를 뉴클레오파일로 이용하여 새로운 기능기 X 및 X'을 가진 화학식 15의 화합물을 직접 제조하는 단계(반응식 5 참조):
(이때, 알킬 할라이드는 벤질 브로마이드, DMTrCl 등을 포함하는 알킬 브로마이드, 알킬 요오다이드 또는 알킬 클로라이드 등을 말함);
(6) 화학식 15의 화합물을, 테트라부틸암모늄플루오라이드를 이용하여 화학식 16의 화합물로 전환시키는 단계(반응식 6 참조);
(6a) 필요에 따라, 화학식 16의 화합물이 합성 유전자에 결합하기 용이하도록 이들간의 링커 길이를 조절하는 단계(반응식 6a 참조):
(이때, m 및 n은 0-6이 바람직함);
(7) 화학식 16의 화합물을 2-시아노에틸 N,N'-디이소프로필클로로포스포아미다이트와 반응시켜 화학식 18의 화합물인 피롤리진 포스포아미다이트를 제조하는 단계(반응식 7 참조);
(8) 화학식 18의 화합물을 핵산 합성기에서 합성 유전자와 결합시켜 화학식 19의 화합물을 제조하는 단계(반응식 8 참조).
상기 단계 (8)에서, 화학식 18의 화합물은 통상적으로 사용하는 핵산 합성기를 이용하면, 합성의 마지막 단계에서 합성 유전자의 5'- 또는 3'-말단에 결합되어 피롤리진 유도체와 올리고뉴클레오타이드의 복합체인 본 발명의 화합물로 용이하게 제조된다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 화합물은 목적하는 유전자에 위치-특이적으로 결합할 수 있어, 이를 유전자 공략 물질로서 유전자 관련 질병의 치료 및 진단에 이용시, 탁월한 치료 효과를 거둘 수 있다. 이외에도, 본 발명의 화합물이 상호 보완적인 유전 정보를 갖고 있는 유전자와 위치-특이적으로 반응을 한다는 특성을 이용하여 단일 또는 이중 가닥을 갖는 특정 유전자를 분석, 검출하는 관련 분야에서도 본 발명을 유용하게 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물을 유전자 관련 질병의 치료, 진단 또는 분석에 사용하는 방법 및 이 화합물을 유효 성분으로 하는 유전자와 관련된 질병의 치료제, 진단 또는 분석용 조성물을 제공한다.
여기서, 유전자 관련 질병이란 특정 유전자의 발현으로 야기되는 각종 질병, 예를 들면 암, 종양, 간염 및 에이즈 등 각종 바이러스, 박테리아 질병 및 암 등을 말한다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하고자 제시된 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
2,3-디하이드로-6,7-비스(DMTr-O-메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 유도체의 제조
(단계1) 디메틸-2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-1H-피롤리진-6,7-디카복실레이트
디메틸-2,3-디하이드로-5-[4'-(β-아세톡시에틸메틸아미노)페닐]-1H-피롤리진-6,7-디카복실레이트 12.88g을 메탄올 200㎖에 녹인후, 소듐 메톡사이드(Na+MeO-) 2.52g을 첨가하였다. 이를 4시간 동안 상온에서 잘 저어준 후, TLC를 이용하여 반응이 완결되었음을 확인하였다. 이때 TLC의 전개 용매로는 헥산:에틸 아세테이트의 비율이 1:1인 혼합 용매를 사용하였고, 출발 물질과 최종 물질의 Rf수치는 각각 0.5 및 0.15 이었다. 그 결과 얻은 반응 혼합액에 5NaHCO3수용액 500㎖와 CH2Cl2500㎖를 첨가하여 잘 섞어준 후, 원하는 최종 물질을 CH2Cl2층으로 추출하였다. 최종 물질을 포함하는 유기 용매층을 다시 염화 나트륨으로 포화된 수용액으로 처리하고, 최종적으로 무수 Na2SO4로 건조시킨후, 진공에서 농축시켰다. 이렇게 해서 얻은 목적 화합물 11.73g은 추가 정제 과정없이 다음 반응에서 사용하였다.
1H NMR(CDCl3) δ 2.36(s, 2H, C2), 2.85(t, 2H, C1), 2.96(s, 3H, N-CH3), 3.3(s, H6, OCH3), 3.47(t, 2H, Cα), 3.72(t, 2H, Cβ), 3.89(t, 2H, C3), 4.25(s, 2H, C7'), 4.38(s, 2H, C6'), 4.86(s, 1H, OH), 6.78(d, 2H, Ph-Hb), 7.2(d, 2H, Ph-Ha).
(단계 2) 디메틸-2,3-디하이드로-5-[4'-(β- t -부틸디메틸실릴옥시에틸메틸아미노)페닐]-1H-피롤리진-6,7-디카복실레이트
상기 단계 1에서 얻어진 디메틸-2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-1H-피롤리진-6,7-디카복실레이트 12.87g을 DMF 60㎖에 녹인후, TBDMSiCl 7.8g과 이미다졸 7.5g을 첨가하고 잘 저어주었다. 1시간후, 초기 화합물이 완전히 목적 화합물로 전환되었음을 TLC로 확인하고 5NaHCO3수용액 300㎖를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 원하는 화합물을 CH2Cl2(2x300)로 추출한 다음, 염화 나트륨으로 포화된 수용액으로 처리하고, 최종적으로 무수 Na2SO4로 건조시킨후 진공에서 농축시켰다. 농축된 혼합 유기 화합물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그라피(EtOAc:헥산=1:4)를 수행하였다. 이렇게 해서 얻은 순수한 화합물을 포함하는 분획을 혼합하여 농축시키고, 그 결과 목적 화합물인 디메틸-2,3-디하이드로-5-[4'-(β-t-부틸디메틸실릴옥시에틸메틸아미노)페닐]-1H-피롤리진-6,7-디카복실레이트 15.5g을 얻었다.
1H NMR(CDCl3) δ 0.02(s, 6H, Si(CH3)2), 0.82 (s, 9H, C(CH3)3), 2.36(s, 2H, C2), 2.85(t, 2H, C1), 2.96(S, 3H, N-CH3), 3.3(s, H6, OCH3), 3.47 (t, 2H, Cα), 3.72(t, 2H, Cβ), 3.89(t, 2H, C3), 4.25(s, 2H, C7'), 4.38(s, 2H, C6'), 4.86 (s, 1H, OH), 6.78(d, 2H, Ph-Hb), 7.2(d, 2H, Ph-Ha)
(단계 3) 2,3-디하이드로-5-[4'-(β- t -부틸디메틸실릴옥시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(하이드록시메틸)-1 H -피롤리진
리튬 알루미늄하이드라이드 3.62g을 무수 에테르 200㎖에 현탁시키고, 여기에 무수 CH2Cl2에 상기 단계 2에서 얻은 화합물인 디메틸-2,3-디하이드로-5-[4'-(β-t-부틸디메틸실릴옥시에틸메틸아미노)페닐]-1H-피롤리진-6,7-디카복실레이트 15.48g을 녹인 용액을 한 방울씩 가한 다음, 1시간 동안 가열하였다. 이를 다시 25℃로 식히고 과량의 하이드라이드는 수분 에테르와 수분을 차례로 가하여 그의 염이 하얗게 될 때까지 분해시켰다. 이렇게 해서 얻은 반응물을 유리 필터로 걸러 뜨거운 CH2Cl2로 여러번 씻었다. 혼합된 유기층을 진공에서 농축시켜 실리카 겔 컬럼 크로마토그라피(EtOAc:헥산=1:3)를 수행하였다. 이렇게 해서 얻은 순수한 화합물을 포함하는 분획을 혼합하여 농축시키고, 그 결과 목적 화합물인 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-t-부틸디메틸실릴옥시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진 9.6g을 옅은 노란색의 고체 형태로 얻었다.
융점: 94-95oC
1H NMR (DMSO-d6): δ0.01(s, 6H), 0.84(s, 12H), 2.37(p, 2H), 2.78(t, 2H), 2.95(s, 3H), 3.47(t, 2H), 3.76(t, 2H), 3.85(t, 2H), 4.29 (d, 2H), 4.39(d, 2H), 4.44(t, 1H), 4.47(t, 1H), 6.68(d, 2H), 7.72(d, 2H)
LRMS: m/e 431(M+ + 1), 430(M+), 413, 397, 383, 285
위의 물질을 이용하면 화학식 1의 화합물을 만들기 위한 다양한 종류의 피롤리진 중간 물질을 제조할 수 있으며, 이들 물질들에 대한 제조 방법 및 NMR 자료는 후술하는 실시예에 기술되어 있다.
(단계 4) 2,3-디하이드로-5-[4'-(β- t -부틸디메틸실릴옥시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(DMTr-O-메틸)-1 H -피롤리진
2,3-디하이드로-5-[4'-(β-t-부틸디메틸실릴옥시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진 5g을 무수 피리딘 50㎖에 녹인후, 트리에틸아민 8㎖를 첨가하였다. 이 혼합액에, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 8.6g을 피리딘 50㎖에 녹인 혼합액을 첨가하였다. 2시간후, 메탄올 200㎖를 첨가하여 반응을 종료시켰다. 원하는 목적 화합물을 헥산(400㎖x2)로 추출한 다음, 염화 나트륨으로 포화된 수용액으로 처리하고, 최종적으로 무수 Na2SO4로 건조시킨후, 진공에서 농축시켰다. 이렇게 해서 얻은 최종 화합물 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-t-부틸디메틸실릴옥시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(DMTr-O-메틸)-1H-피롤리진 5g은 추가 정제과정없이 다음 반응에서 사용하였다.
(단계 5) 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(DMTr-O-메틸)-1 H -피롤리진
2,3-디하이드로-5-[4'-(β-t-부틸디메틸실릴옥시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(DMTr-O-메틸)-1H-피롤리진 5g을 무수 메틸렌 클로라이드 15㎖에 녹인 후, THF 15㎖에 녹아 있는 1M 테트라부틸암모늄플루오라이드를 넣고 1시간 동안 교반시킨 다음, 반응을 정지시켰다. 이 혼합물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그라피 (헥산:EtOAc:Et3N=3:2:0.1)를 수행하여 목적 화합물 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(DMTr-O-메틸)-1H-피롤리진 3.1g을 얻었다.
융점: 80-83oC
1H NMR (DMSO-d6): δ2.41(p, 2H), 2.91(s, 3H), 2.94(t, 2H), 3.36(t, 2H), 3.52(q, 2H), 3.68(s, 6H), 3.70(s, 6H), 3.74(s, 2H), 3.84(t, 1H), 4.09 (s, 2H), 6.5-7.4(m)
(단계 6) 2,3-디하이드로-6,7-비스(DMTr-O-메틸)-1 H -피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-[(N,N-디이소프로필아미노)-β-시아노에톡시포스파인]
상기 단계 5에서 얻은 화합물인 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(DMTr-O-메틸)-1H-피롤리진 100mg과 무수 CH2Cl25㎖에 녹인무수 디이소프로필에틸아민 용액 0.2㎖에 2-시아노에틸 N,N'-디이소프로필클로로포스포아미다이트 0.1㎖를 아르곤의 존재하에서 반응시켰다. 1시간후, 이 반응 혼합액을 25℃에서 2㎖로 농축시켜 실리카 겔 컬럼 크로마토그라피(EtOAc:헥산:Et3N=1:3:0.1)를 수행한 결과, 목적 화합물인 2,3-디하이드로-6,7-비스(DMTr-O-메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-[(N,N-디이소프로필아미노)-β-시아노에톡시포스파인] 90mg을 얻었다.
1H NMR (DMSO-d6): δ1.17(m, 12H, 4XCH3), 2.44(p, 2H, C2), 2.53(t, 2H, CH2CN), 2.97(s, 3H, NCH3), 3.03(t, 2H, C1), 3.5(m, 6H, Cα, Cβ , 2XNCH), 3.72(m, 12H, 4XOCH3), 3.75(t, 2H, OCH2), 3.85(t, 2H, C3), 3.93(s, 2H, C7'), 4.24(s, 2H, C6'), 6.5∼7.49(m, 30H, Hb Ha 2X트리틸)
(단계 7) 2,3-디하이드로-6,7-비스(DMTr-O-메틸)-1 H -피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 유도체의 제조
공지된 포스포아미다이트 방법을 이용하여 목적 화합물을 합성하는데 통상의 유전자 합성기(Applied Biosystems Model PCR mate)가 사용되었다. 유전자 합성의 마지막 단계에서, 당업자에게 공지된 통상적인 조건을 이용하여 상기 단계 6에서 얻어진 피롤리진 포스포아미다이트를 합성 유전자의 5'-말단에 부착시켰다. 이때, 포스포디에스테르 골격구조를 가진 합성 유전자들은 벅케이지 시약을 사용함으로써 포스포티오에이트 골격구조로 전환시킬 수 있다. 이렇게 해서 얻어진, 합성 유전자를 포함하는 목적 화합물을 55oC에서 16시간 동안 농축 암모니아에 담아, 감압하에 건조시킨후, 다음과 같은 조건의 RP-HPLC에 의해 정제하였다.
HPLC 조건
컬럼: 하이퍼실(Hypersil) 5μ C18, 250 x 4mm
용매A: 아세토나이트릴
용매B: 100mM 트리에틸암모늄아세테이트, pH 7.4
구배: 0∼5min, 30용매 A,
5∼35min, 30∼80용매 B로 점진적으로 전환,
35∼36min, 80용매 B 유지,
36∼38min, 80∼100용매 B로 점진적으로 전환,
38∼45min, 100용매 B 유지,
45∼46min, 100∼30용매 B로 점진적으로 전환,
46∼50min, 30용매 B 유지.
정제 전후, HPLC 크로마토그라피한 결과는 도 1에 제시되어 있다.
이후, 본 화합물을 UV 스펙트럼으로 분석하고, 이를 일반 DNA와 비교하여, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 이에 따르면, 실시예 1의 화합물의 경우, 300nm 이상에서 피롤리진 화합물의 크로모포어(chromophore)에 의한 빛의 흡수가 나타나지만, 일반 DNA의 경우는 300nm 이상에서 빛을 흡수하지 않는 것으로 나타났다.
<실시예 2>
2,3-디하이드로-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 유도체의 제조
상기 실시예 1에서 얻은 염기서열 ACGT를 가진 올리고뉴클레오타이드 (약 5 O.D.)를 물 30㎕에 녹인후 약 5oC로 냉각시켰다. 여기에 HOAc 20㎕를 첨가하고 30초후 Et3N 20㎕를 넣었다. 여기에 다시 냉 에탄올 1㎖를 넣어 올리고뉴클레오타이드를 침전시켰다. 이때 생성된 침전물을 80에탄올로 씻어 준후, 진공하에서 건조시켜 목적 화합물(약 3 O.D.)을 얻었다. 이렇게 해서 얻은 실시예 2의 화합물은 일련의 효소로 처리한 후(DNase I, Snake Venom Phosphodiesterase I 및 CIAP: Woo et al,J. Am. Chem. Soc.115, 3407, 1993 참조), 그 내용물을 RP-HPLC를 사용하여 분석하였다. 그 결과를 통해, 기존의 A, G, C, T의 염기와 더불어 GC001(실시예 2의 화합물에 부착된 피롤리진 유도체인 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진의 명칭)이 정량적으로 검출되었음을 확인할 수 있었다(도 3 참조).
<실시예 3>
2,3-디하이드로-6,7-비스(p-메톡시페닐-O-메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 유도체의 제조
(단계 1) 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-t-부틸실릴옥시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(하이드록시메틸)-1 H -피롤리진 비스아세테이트
상기 실시예 1의 단계 3에서 얻은 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-t-부틸실릴옥시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진 500㎎을 무수 메틸렌클로라이드 7㎖에 녹인후, 트리에틸아민 1.2㎖와 디메틸아미노피리딘을 넣었다. 여기에 아세트산 무수물을 첨가한후, 2시간 동안 반응을 진행시켰다. 다시, 여기에 5NaHCO3수용액 50㎖를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 원하는 화합물을 CH2Cl2(2x50)로 추출한 다음, 이를 염화 나트륨으로 포화된 수용액으로 처리하고, 최종적으로 무수 Na2SO4로 건조시킨후 진공에서 농축시켰다. 농축된 혼합 유기 화합물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그라피(EtOAc:헥산=1:8)를 수행하였다. 이렇게 해서 얻은 순수한 화합물을 포함하는 분획을 혼합하여 농축시켜 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-t-부틸실릴옥시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진 비스아세테이트 300㎎을 얻었다.
1H NMR(CDCl3) δ0.01(s, 6H, Si(CH3)2), 0.85(s, 9H, C(CH3)3), 2.04(s, 3H, COCH3), 2.06(s, 3H, COCH3), 2.44(p, 2H, C2), 2.90(t, 2H, C1), 2.99(S, 3H, N-CH3), 3.48(t, 2H, Cα), 3.77(t, 2H, Cβ), 3.88(t, 2H, C3), 5.00(s, 2H, C7'), 5.03(S, 2H, C6'), 6.71(d, 2H, Ph-Hb), 7.17(d, 2H, Ph-Ha)
(단계 2) 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(p-메톡시페닐-O-메틸)-1 H -피롤리진
상기 단계 1에서 얻은 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-t-부틸실릴옥시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진 비스아세테이트 135㎎을 무수 메틸렌클로라이드 4㎖에 녹여 트리에틸아민 0.7㎖와 4-메톡시페놀을 첨가하고 70시간 동안 반응시켰다. 여기에 5NaHCO3수용액 10㎖를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 원하는 화합물을 CH2Cl2(2x20)로 추출한 다음, 염화 나트륨으로 포화된 수용액으로 처리하고, 최종적으로 무수 Na2SO4로 건조시킨후, 진공에서 농축시켰다. 농축된 혼합 유기 화합물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그라피(EtOAc:헥산=1:8)를 수행하였다. 이렇게 해서 얻은 순수한 화합물을 포함하는 분획을 혼합하여 농축시켜 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-t-부틸실릴옥시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(4-메톡시페녹시메틸)-1H-피롤리진 95㎎을 얻고, 이를 테트라부틸암모늄플루오라이드와 반응시켜 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(p-메톡시페닐-O-메틸)-1H-피롤리진 70㎎을 얻었다.
1H NMR(CDCl3) δ2.45(s, 2H, C2), 2.90(t, 2H, C1), 2.96(s, 3H, N-CH3), 3.47(t, 2H, Cα), 3.74(s, 6H, 2XOCH3), 3.80(t, 2H, Cβ), 3.96(t, 2H, C3), 4.83(s, 2H, C7'), 4.93(s, 2H, C6'), 6.74∼7.3(m, 12H, 3XPh)
(단계 3) 2,3-디하이드로-6,7-비스(p-메톡시페닐-O-메틸)-1 H -피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-[(N,N-디이소프로필아미노)-β-시아노에톡시포스파인]
상기 단계 2에서 얻은 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(p-메톡시페닐-O-메틸)-1H-피롤리진 70mg과 무수 CH2Cl2(5㎖)에 녹인 무수 디이소프로필에틸아민 용액 0.2㎖에 2-시아노에틸 N,N'-디이소프로필클로로포스포아미다이트 0.1㎖를 아르곤의 존재하에서 반응시켰다. 1시간이 경과한 다음, 이 반응 혼합액을 25℃에서 2㎖로 농축시켜 실리카 겔 컬럼 크로마토그라피(EtOAc:헥산:Et3N=1:2:0.1)를 수행한 결과, 목적 화합물인 2,3-디하이드로-6,7-비스(p-메톡시페닐-O-메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-[(N,N-디이소프로필아미노)-β-시아노에톡시포스파인] 65mg을 얻었다.
1H NMR(CDCl3) δ1.13(m, 12H, 4XCH3), 1.57(s, 6H, 2XPh-CH3), 2.46 (p, 2H, C2), 2.53(t, 2H, CNCH2), 2.90(t, 2H, C1), 2.97(s, 3H, NCH3), 3.5(m, 4H, Cα, 2XNCH), 3.75(m, 4H, Cβ, OCH2), 3.94(t, 2H, C3), 4.84(S, 2H, C7'), 4.94(S, 2H, C6'), 6.66∼7.30(12H, 3XPh)
(단계 4) 2,3-디하이드로-6,7-비스(p-메톡시페닐-O-메틸)-1 H -피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드 유도체
상기 실시예 1의 단계 7에서 사용한 방법과 유사하게 목적 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 단지, 실시예 1에서는 일반적인 dG 포스포아미다이트가 사용되었는데 반해, 본 실시예에서는 크로아켐의 quick dG 포스포아미다이트가 사용되었다는 것이 다른 점이었다. 따라서 보호기 제거 과정으로, 55oC에서 2시간 동안 올리고뉴클레오타이드를 암모늄 하이드록사이드로 처리했다.
<실시예 4>
화학식 1의 올리고뉴클레오타이드 유도체의 합성에 관여하는 피롤리진 중간 물질들의 제조
<실시예 4a>
2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(벤질옥시메틸)-1H-피롤리진
(단계 1)2,3-디하이드로-5-[4'-(β-t-부틸실릴옥시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진 1g을 무수 메틸렌클로라이드 10㎖에 녹여 NaH 900㎎을 넣고 30분간 교반시킨후, 벤질브로마이드 1.08㎖를 넣고 2일간 반응시킨후, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산:EtOAc: Et3N=8:1:0.5)를 수행하여 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-t-부틸실릴옥시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(벤질옥시메틸)-1H-피롤리진 800㎎을 얻었다.
1H NMR(DMSO-d6) δ0(s, 6H, SiCH3), 0.83(s, 9H, 3XCH3), 2.36(p, 2H, C2), 2.76(t, 2H, C1), 2.92(S, 3H, N-CH3), 3.38(t, 2H, Cα), 3.54(t, 2H, Cβ), 3.88(t, 2H, C3), 4.23(S, 2H, C7'), 4.35(S, 2H, C6'), 4.41(S, 4H, 2XOCH2), 6.68∼7.34(m, 14H, Ha Hb 2XPh)
(단계 2)2,3-디하이드로-5-[4'-(β-t-부틸실릴옥시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(벤질옥시메틸)-1H-피롤리진 150㎎을 무수 메틸렌클로라이드 3㎖에 녹인후, THF 3㎖에 녹아있는 1M 테트라부틸암모늄플루오라이드를 넣고 2시간 동안 교반시킨후, 반응을 정지시켰다. 이 혼합물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그라피(헥산:EtOAc:Et3N=2:3:0.1)를 수행하여 목적 화합물 80㎎을 얻었다.
융점: 88-89oC
1H NMR (DMSO-d6): δ2.36(p, 2H, C2), 2.76(t, 2H, C1), 2.92(s, 3H, NCH3), 3.38(t, 2H, Cα), 3.54(t, 2H, Cβ), 3.88(t, 2H, C3), 4.23(s, 2H, C7'), 4.36(s, 2H, C6'), 4.41(s, 4H, 2XOCH3), 4.47(t, 1H, OH), 6.68∼7.34(m, 14H, Ph-Hb Ha 2XPh)
<실시예 4b>
2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진 비스이소프로필레이트
(단계 1)2,3-디하이드로-5-[4'-(β-t-부틸실릴옥시에틸메틸아미노)페닐-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진 563㎎을 무수 메틸렌클로라이드 5㎖에 녹인후, 트리에틸아민 1.4㎖와 디메틸아미노피리딘을 넣었다. 여기에 이소부티르산 무수물 0.11㎖를 첨가한후, 1시간 동안 반응시켜 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-t-부틸실릴옥시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진 비스이소프로필레이트 400㎎을 얻었다.
(단계 2)상기 실시예 4a의 실릴기 제거 반응과 유사한 방법을 이용하여 목적 화합물 68㎎을 얻었다.
1H NMR(CDCl3) δ 1.15(m, 12H, 4XCH3), 2.45(p, 2H, C2), 2.56(m, 2H, 2XCH) 2.90(t, 2H, C1), 2.98(s, 3H, NCH3), 3.47(t, 2H, Cα), 3.82(t, 2H, Cβ), 3.92(t, 2H, C3), 4.97(s, 2H, C7'), 5.02(s, 2H, C6'), 6.75(d, 2H, Ph-Hb),7.19(d, 2H, Ph-Ha)
<실시예 4c>
2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(페녹시메틸)-1H-피롤리진
(단계 1)2,3-디하이드로-5-[4'-(β-t-부틸실릴옥시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진 500㎎을 무수 메틸렌클로라이드 7㎖에 녹인후, 트리에틸아민 1.2㎖와 디메틸아미노피리딘을 넣었다. 여기에 아세트산 무수물을 첨가한후, 2시간 동안 반응시켰다. 이 혼합물을 실리카 겔 컬럼크로마토그래피를 수행하여 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-t-부틸실릴옥시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(아실옥시메틸)-1H-피롤리진 300㎎을 얻었다.
(단계 2)2,3-디하이드로-5-[4'-(β-t-부틸실릴옥시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(아실옥시메틸)-1H-피롤리진 300㎎을 무수 메틸렌클로라이드 7㎖에 녹인후, 트리에틸아민 1.7㎖와 페놀 0.537㎖를 넣고 교반시켰다. 11시간후 반응을 정지시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그라피를 수행하여 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-t-부틸실릴옥시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(페녹시메틸)-1H-피롤리진 100㎎을 얻었다.
(단계 3)상기 실시예 4-1의 실릴기 제거 반응과 유사한 방법을 이용하여 목적 화합물 60㎎을 얻었다.
1H NMR(CDCl3) δ2.36(p, 2H, C2), 2.87(t, 2H, C1), 2.91(S, 3H, N-CH3),3.41(t, 2H, Cα), 3.75(t, 2H, Cβ), 3.89(t, 2H, C3), 4.83(S, 2H, C7'), 4.93(S, 2H, C6'), 6.65∼7.30(m, 14H, Ph-Ha Hb 2XPh)
<실시예 4d>
2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(p-메톡시페닐-O-메틸)-1H-피롤리진
1H NMR(CDCl3) δ2.25(s, 6H, PhCH3), 2.46(p, 2H, C2), 2.91(t, 2H, C1), 2.96(S, 3H, N-CH3), 3.47(t, 2H, Cα), 3.80(t, 2H, Cβ), 3.94(t, 2H, C3), 4.84(S, 2H, C7'), 4.94(S, 2H, C6'), 6.74∼7.30(m, 12H, 3XPh)
<실시예 4e>
2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(p-플루오로페녹시메틸)-1H-피롤리진
1H NMR(CDCl3) δ 2.46(p, 2H, C2), 2.91(t, 2H, C1), 2.97(S, 3H, N-CH3), 3.47(t, 2H, Cα), 3.81(t, 2H, Cβ), 3.94(t, 2H, C3), 4.84(S, 2H, C7'), 4.94(S, 2H, C6'), 6.76∼7.30(m, 12H, 3XPh)
<실시예 4f>
2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(p-요오도페녹시메틸)-1H-피롤리진
1H NMR(DMSO-d6) δ 2.42(p, 2H, C2), 2.81(t, 2H, C1), 2.91(S, 3H, N-CH3), 3.37(t, 2H, Cα), 3.52(t, 2H, Cβ), 3.91(t, 2H, C3), 4.64(t, 1H, OH),4.75(S, 2H, C7'), 4.89(S, 2H, C6'), 6.67∼7.55(m, 12H, 3XPh)
<실시예 4g>
2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(p-클로로페녹시메틸)-1H-피롤리진
1H NMR(CDCl3) δ 2.46 (p, 2H, C2), 2.91(t, 2H, C1), 2.97(S, 3H, N-CH3), 3.45(t, 2H, Cα), 3.75(t, 2H, Cβ), 3.93(t, 2H, C3), 4.82(S, 2H, C7'), 5.07(S, 2H, C6'), 6.66∼7.24(m, 12H, 3XPh)
<실시예 4h>
2,3-디하이드로-6,7-비스(DMTr-O-메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-프로판올
1H NMR(DMSO-d6) δ 1.62(m, 2H, O-CH2 CH 2 CH2OH), 2.4(p, 2H, C2), 2.9(s, 3H, N-CH3), 2.93(t, 2H, C1), 3.4∼3.52(m, 8H, Cα, Cβ,O- CH 2 CH 2 CH 2 OH), 3.68(d, 12H, 4XOCH3), 3.76(s, 2H, C7'), 3.83(t, 2H, C3), 4.09(s, 2H, C6'), 4.39(t, 1H, OH), 6.52∼7.41(m, 30H, 트리틸, Ph)
<실시예 4i>
2,3-디하이드로-6,7-비스(DMTr-O-메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-핵산올
1H NMR(CDCCl3) δ 1.34(m, 4H, O-CH2CH2 CH 2 CH 2 CH2CH2OH), 1.54(m, 4H, O-CH2 CH 2 CH2CH2 CH 2 CH2OH), 2.44(q, 2H, C2), 2.96(s, 3H, N-CH3), 3.02(t, 2H, C1), 3.42(t, 2H, Cα), 3.45∼3.63(m, 6H, Cβ, O-O- CH 2 CH2CH2CH2CH2 CH 2 OH), 3.71(d, 12H, 4XOCH3), 3.86(t, 2H, C3), 3.94(s, 2H, C7'), 4.25(s, 2H, C6'), 6.55∼7.5(m, 30H, 트리틸, Ph)
<실시예 5>
실시예 2 및 3의 화합물과 단일 가닥 모델 유전자간의 반응
실시예 2 및 3의 화합물을 이용한 모델 유전자의 표적화(targeting)를 시도해 보았다. 모델 유전자의 염기서열은 Bcl-2 암호 서열중에서 선택했다. Bcl-2 단백질은 세포 자살 주기(programmed cell death 또는 apoptosis)에 관여하는 것으로 알려져 있는 단백질로서, 대부분의 암세포에는 이 단백질이 비정상적으로 많이 존재하며, 암세포의 전이과정에 관여하는 것으로 보고된 바 있다. 과다하게 존재하는 Bcl-2 단백질은 또한 기존의 암 치료과정인 방사선치료와 화학요법시, 암세포가 이에 대한 강한 내성을 갖도록 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 이유로, Bcl-2 단백질의 합성을 억제함으로써 암을 치료하려는 시도가 경쟁적으로 이루어지고 있다. 그중, mRNA를 공략하여 단백질 합성을 저지시키려는 안티센스 접근방안이 가장 각광을 받고 있다. 그러나 이러한 방안은 기존의 안티센스 기술이 가지고 있는 문제점들로 인하여 실질적인 암치료에 적용하기까지 상당한 시일이 걸릴 것으로 예상되어 왔다. 본 발명에서 개발한 화학식 1의 화합물을 이용한 안티센스 방안은 이들의 기존의 문제점들을 해결해 줄 것으로 기대되며, 이러한 이유로 표적 유전자 모델을Bcl-2 mRNA의 염기서열중에서 선택했다.
염기서열, 5'-ACG GGG TGA ACT GGG GGA GGA TT(Bcl2-1로 불림)는 기존의 안티센스 방안에서도 상당히 좋은 표적 부위로 알려져 있어(관련문헌:Journal of the National Cancer Institute, Vol. 89, No. 14, 1017, 1997년), 이 염기서열을 가진 합성 유전자를 모델 표적 유전자로 이용하였다.
표적 유전자 Bcl2-1(0.2 μM)의 5'-말단을32P 방사선 동위원소로 라벨링한후, 마이크로튜브안에서 물 16㎕에 녹였다. 여기에 올리고뉴클레오타이드로서 염기서열 AA TCC TCC CCC AGT TCA CCC를 갖은 실시예 2 또는 3의 화합물(1 μM) 2㎕와 10x 반응 완충액(0.5M MOPS, pH 7.1, 50 mM MgCl2, 3M NaCl) 2㎕를 첨가했다. 잘 섞어준후, 16시간 동안 상온에서 반응을 유지시켰다. 반응결과 얻은 샘플에 냉 에탄올(약 -20oC) 1㎖를 첨가하여 유전자들을 침전시켰다. 침전된 유전자들을 다시 80수용성 에탄올로 씻어주고, 20DPAGE를 사용하여 분석하였다. 이렇게 해서 얻은 결과는 도 4에 제시하였다.
도 4에 따르면, 실시예 2와 3의 화합물들이 모델 표적 유전자와 공유결합을 하고 있어, 변성 조건하에서도 표적 유전자와 결합된 상태로 유지되고 있음을 알 수 있다. 이들이 표적 유전자를 공략하는 효율성을 수치로 나타내면, 실시예 2와 3의 화합물들의 경우 각각 69와 52정도이다.
이하, 본 실시예에서 사용한 실시예 2의 화합물을 이용하여 다양한 암 세포주에서의 세포 독성 및 항암능력을 테스트하고, 그 결과를 기존의 안티센스 치료제의 약효와 비교해 보았다.
<실시예 6>
다양한 암세포주내에서의 실시예 2 화합물의 세포 독성 시험
(1) 세포 배양
시험에 사용된 암세포주는 모두 인체기원의 소세포 폐암 세포주들로서, H69, H82 및 N417를 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 구매하여 사용하였다. 세포 배양액으로는 글루타민(glutamine), 중탄산 나트륨, 젠타마이신 (gentamycin) 및 암포테리신(amphotericin)을 첨가한 RPMI 1640 용액을 5FBS로 보강한 배지를 사용하였으며, 37℃, 5이산화탄소, 95공기 및 100습도의 조건에서 배양하면서, 3∼4일에 한번씩 계대 유지하였다.
(2) 세포 독성 시험
세포를 96 웰 평판 마이크로플레이트(flat-bottom microplate)에 분주하고, 각각 ODN(올리고데옥시뉴클레오타이드; 본 발명의 실시예 2의 화합물) 0.6μM을 첨가하여 96시간 동안 배양하였다. 세포 독성의 측정은 MTT법을 사용하였다. 약물과의 배양이 끝난후, MTT 용액을 각 웰에 가하여 37℃에서 1시간 동안 배양한 다음, MTT 용매를 가하고 실온에서 10분간 진탕하여 MTT를 용해시켰다. 마이크로플레이트 판독기(Microplate reader)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하고, 약물을 가하지 않은 대조군과 비교하여 세포 성장 정도를 측정하였다.
(3) 결과
DOTAP과 반응시킨 ODN을 H69, H82 및 N417 세포에 처리하여 96시간 동안 배양한후, MTT 측정법을 이용하여 ODN의 세포독성을 측정하였다. DOTAP만을 처리한 경우는 세포의 성장이 대조군과 비교하여 유사한 양상을 보였다. 또한, SC-12(Bcl2와 염기서열이 무관한 대조용 유전자), SC-12-001 (SC-12를 가진 실시예 2의 화합물)을 처리한 시험군에서도 대조군에 비해 유의할만한 세포성장의 차이를 보이지 않았다. 반면, 2009(Bcl2를 효율적으로 차단하는 것으로 알려진 안티센스 유전자)를 처리한 시험군에서는 H69, H82 및 N417 세포의 성장률이 각각 대조군의 61, 63및 75정도로, 약한 세포 독성이 나타났다. 2009-001(2009를 가진 실시예 2의 화합물)을 처리한 시험군에서는 위 세포들의 성장률이 각각 대조군의 12, 15및 15로 나타나, 2009보다 월등히 뛰어난 세포 독성이 관찰되었다(도 5 참조).
<실시예 7>
실시예 2의 화합물을 이용한 항암효과에 대한 시험
상기 실시예 6에서 사용한 2009(Bcl2를 효율적으로 차단시키는 것으로 알려진 안티센스 유전자) 및 2009-001(올리고뉴클레오타이드로서 2009를 가진 실시예 2의 화합물)를 A549, SKOV-3, SKMEL-2, XF-498, HCT-15 등의 암세포에 처리하여 표준 세포에 대한 이들 암세포의 성장 정도를 측정하였다. 하기 표 1은 그 결과를 나타낸 것이다.
표준 세포에 대한 암세포의 성장 정도
샘플 ED50 (μM)
A549 SK-OV-3 SK-MEL-2 XF498 HCT15
2009 0.47 0.23 0.42 0.45 0.31
2009-001 0.28 0.08 0.21 >0.6 0.13
이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 개시하고 또한 설명하였으나, 본 발명은 상기한 실시예로만 한정되지는 않으며, 당해 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 후술하는 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지에서 벗어나지 않는 범주에서 다양한 변형 실시가 가능하며, 그와 같은 변경 또한 청구범위내에 속하는 것으로 간주된다.
본 발명의 화합물은 유전자(DNA 또는 RNA)와 위치-특이적으로 결합 할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체에 유전자(DNA 또는 RNA)의 특정 염기와 공유결합할 수 있는 피롤리진 유도체들을 부착시킨 신규의 화합물로서, 이들은 기존의 안티센스 유전자 단독 또는 다른 유전자 공략 물질과 안티센스 유전자의 복합체에 비해, 특정 유전자에 보다 효율적으로 결합하므로, 이를 통해 목적하는 바를 효과적으로 달성할 수 있으며, 또한 본 발명에서 사용한 피롤리진 계열의 물질은 합성과 반응성 조절이 용이하여 대량생산과 정제가 가능한 바, 경제적인 측면에서도 아주 유용하다. 따라서, 본 발명의 화합물은 세포내 유전자의 원하는 부위를 위치-특이적으로 손상시킬수 있는 새로운 도구로서 응용이 가능할 것으로 기대되고, 결과적으로, 전반적인 유전자 관련 분야에 엄청난 파급 효과를 불러 일으킬 것으로 예상된다. 그 실례로서, 본 발명의 화합물을 암 치료를 위한 안티센스 분야에 응용하였을때, 본 발명의 화합물이 기존의 안티센스 치료제보다 효능면에서 월등하다는 것이 기초 시험 결과 밝혀졌다. 이 시험을 토대로 볼 때, 본 발명의 화합물은 궁극적으로, 항암 치료를 비롯한 각종 유전자 관련 질병의 치료뿐 아니라 산업 미생물, 농업, 환경분야 등 유전자 관련 모든 분야에서 응용 가치가 무한한 원천기술로서 그 유용성이 매우 높다고 기대되어진다.

Claims (13)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 피롤리진 유도체가 부착된 올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체의 화합물, 이들의 약학적으로 허용되는 염, 또는 용매 화합물:
    [화학식 1]
    상기 식에서,
    R1은 C1-C10의 알킬기, C3-C7의 시클로알킬기, C3-C6의 알케닐기, 또는 페닐기이고,
    X 및 X'는 서로 같거나 다를 수 있고, 각각 하이드록시기, 치환되거나 비치환된 알킬티오기, 치환되거나 비치환된 실릴옥시기, 또는 -OR기(이때, R은 치환되거나 비치환된 알킬, 치환되거나 비치환된 페닐, 또는 치환되거나 비치환된 카바메이트기임)이고,
    Y는 산소(O), 질소(N), 또는 황(S)을 포함하는 기능기이고,
    n은 0-10으로, 올리고뉴클레오타이드 유사체와 피롤리진 유도체간의 링커 길이이다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 R1이 C1-C3알킬기이고, X 및 X'가 하이드록시기, 치환되거나 비치환된 저급 알콕시기, 저급 알킬티오기, 치환된 실릴옥시기, 치환되거나 비치환된 페녹시기, 치환되거나 비치환된 O-트리틸기 또는 치환되거나 비치환된 카바메이트기이며, Y가 산소, 질소, 또는 황원자이고, n이 0-6인 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 R1이 C1-C3직쇄 알킬기이고, X 및 X'는 하이드록시기, 메톡시기, 에톡시기, 벤질옥시기, 메톡티오기, 에틸티오기, 트리메틸실릴옥시기, t-부틸디메틸실릴옥시기, 페녹시기, O-할로페닐기, O-톨루일기, O-크레솔기, O-트리틸기, O-4,4'-디메톡시트리틸기 또는 이소프로필카바메이트기며, Y가 산소 원자이고, n이 0-6인 것을 특징으로 하는 화합물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 화합물이 2,3-디하이드로-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드;2,3-디하이드로-6,7-비스(DMTr-O-메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드; 2,3-디하이드로-6,7-비스(p-메톡시페닐-O-메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드; 2,3-디하이드로-6,7-비스(p-클로로페닐-O-메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드; 2,3-디하이드로-6,7-비스(벤질옥시메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드; 2,3-디하이드로-6,7-비스(에톡시메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드; 및 2,3-디하이드로-6,7-비스(하이드록시메틸)-비스(이소프로필카바메이트)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-올리고뉴클레오타이드로 구성된 군중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 화합물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오타이드가 목적하는 유전자에 위치-특이적으로 결합하는 안티센스 유전자인 것을 특징으로 하는 화합물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 목적하는 유전자가 발암 유전자인 것을 특징으로 하는 화합물.
  7. (1) 하기 화학식 10의 화합물을 소듐 메톡사이드와 반응시켜서 화학식 11의 화합물을 제조하는 단계(반응식 1);
    (2) 하기 화학식 11 화합물의 하이드록시기를 t-부틸디메틸실릴클로라이드로 보호하는 단계(반응식 2);
    (3) 하기 화학식 12의 화합물을 촉매의 존재하에서 환원시켜서 화학식 13의 화합물을 제조하는 단계(반응식 3);
    (4) 하기 화학식 13의 화합물을 무수산과 반응시켜 화학식 14의 화합물을 제조한후(반응식 4), 이 화합물을 뉴클레오파일과 반응시켜 화학식 15의 화합물을 제조하는 단계(반응식 4a);
    (5) 하기 화학식 15의 화합물을, 테트라부틸암모늄플루오라이드를 이용하여 화학식 16의 화합물로 전환시키는 단계(반응식 6);
    (6) 하기 화학식 16의 화합물을 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포아미다이트와 반응시켜 화학식 18의 피롤리진 포스포아미다이트를 제조하는 단계(반응식 7); 및
    (7) 하기 화학식 18의 화합물을 핵산 합성기내에서 올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체에 결합시키는 단계(반응식 8)에 의해, 하기 화학식 19의 화합물을 제조하는 방법:
    [반응식 1]
    (이하, R8은 메틸, 에틸, 프로필이고, n은 0-6임)
    [반응식 2]
    [반응식 3]
    [반응식 4]
    (이때, 상기 R9는 알킬기임),
    [반응식 4a]
    (이때, 뉴클레오파일 R10S-및 R10O-에서, R10는 치환되거나 비치환된 알킬 또는 페닐을 나타내고, 이하 X 및 X'는 제 1 항에서 정의한 바와 같음);
    [반응식 6]
    [반응식 7]
    [반응식 8]
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 단계 (4) 대신에, 하기 화학식 13의 하이드록시기를 뉴클레오파일로 이용하여 기능기 X 및 X'를 가진 화학식 15의 화합물을 직접 제조하는 단계(반응식 5)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    [반응식 5]
    (상기 반응식에서, 알킬 할라이드는 벤질 브로마이드, DMTrCl 등을 포함하는 알킬 브로마이드, 알킬 요오다이드 및 알킬 클로라이드 등을 말하고, X 및 X'는 제 1 항에서 정의한 바와 같음).
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 (6) 단계후, 올리고뉴클레오타이드 유사체와 결합하기 적합하도록 하기 화학식 16 화합물의 링커 길이를 조절하는 단계(반응식 6a)를 추가로 포함하는 방법:
    [반응식 6a]
    (이때, m 및 n은 0-6임).
  10. 유효 성분으로서 제 1 항의 화합물 및 약학적으로 적합한 보조제를 포함하는 유전자 관련 질병 치료제.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 치료제가 항암제인 것을 특징으로 하는 치료제.
  12. 유효 성분으로서 제 1 항의 화합물 및 약학적으로 적합한 보조제를 포함하는 유전자 관련 질병 진단용 조성물.
  13. 표적 유전자에 위치-특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 제 1 항의 화합물을 사용하여, 여러 가지 유전자가 포함된 유전자 푸울에서 목적하는 유전자를 검출함으로써, 유전자를 분석하는 방법.
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