CN111246855A - 用于分子的跨膜递送的化合物和方法 - Google Patents
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Abstract
提供了用于将药物诸如基因药物[例如，siRNA、dsiRNA或反义寡核苷酸(ASO)]递送穿过生物膜的缀合物。本发明的缀合物能够在血浆蛋白质存在和不存在的情况下递送药物。
Description
相关申请的交叉引用
本申请是2017年8月17日提交的美国申请第15/679,192号的部分继续申请，该美国申请第15/679,192号是2017年7月28日提交的美国申请第15/662,665号的部分继续申请，该美国申请第15/662,665号是2017年7月4日提交的美国申请第15/641,251号的部分继续申请，这些申请在此通过引用并入。
发明领域
本发明涉及意欲在体外和体内使用的用于将分子和大分子穿过生物膜递送至细胞中的化合物以及包含化合物和大分子的缀合物、递送系统和方法。
背景
“寡核苷酸药物”(OD)是包含核苷或核苷酸的序列的大分子药物。OD可能有望为许多医学紊乱(disorder)带来革命性的医学治疗。如本领域已知的，OD是单链或双链的、天然或修饰的RNA或DNA分子或其组合。OD的实例尤其是，siRNA(小干扰RNA)、Dicer酶的siRNA底物(dsiRNA)、微小RNA(microRNA；miRNA)、信使RNA(mRNA)药物、或设计成用作反义寡核苷酸(ASO)的DNA序列，所有这些在靶基因表达的下调中都有活性。
在临床实践中实施OD的主要挑战涉及它们与血浆蛋白质，特别是白蛋白结合的优化。未修饰的(“裸的”)寡核苷酸不会显著地结合血浆蛋白质。相比之下，通过添加亲脂性部分诸如胆固醇对OD的修饰(OD的跨膜递送通常所需的修饰)导致与血浆蛋白质(主要与白蛋白)的强烈(avid)结合。OD与血浆蛋白质的强结合可以阻碍药物与其靶细胞膜的结合的可用性，相应地抑制有效的OD摄取进入细胞，潜在地导致OD的功效缺乏。目前，许多OD的递送系统无法克服这一挑战，并且因此需要无血清条件，以便保持OD的生物活性。虽然无血清条件可以在组织培养物中在体外应用，但无血清条件在体内是不可行的，在体内OD不可避免地与血浆蛋白质密切接触。因此，对于在血浆蛋白质存在或不存在的情况下能够将基因药物穿过疏水性磷脂膜递送至细胞中的OD递送系统存在未被满足的需求。
发明概述
本发明基于分子递送系统[(MDS)，在式(II)中描述]，该分子递送系统当与OD缀合时，在无血清[(S-)条件]和血清存在[(S+)条件]的情况下引起OD穿过磷脂膜递送至细胞中以及在基因沉默中的相应活性。结构类似但没有MDS的化学实体是完全无生物活性的(例如，在基因沉默中完全无生物活性)，或可选择地，在(S-)条件下有活性，但在(S+)条件下活性较低或完全无活性，如实施例6中例示的。
在本发明的实施方案中，提供了具有式(I)中阐明的结构的缀合物：
包括由式(I)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中：
D是待穿过生物膜被递送的药物(即，货物药物)，所述药物选自由以下组成的组：小分子药物、肽、蛋白质和OD(即，天然或修饰的单链或双链的DNA或RNA、siRNA、dsiRNA或ASO)；
y、z和w各自是独立地选自0、1、2、3或4的整数，其中如果y、z或w或其组合中的任一个是0，则意味着相应的一个或更多个E部分不存在；y、z或w中的至少一个不同于0；
E、E’或E”可以是相同的或不同的，各自独立地具有通式(II)中阐明的结构：
包括由式(II)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中：
U或Q中的一个独立地不存在，而另一个选自由以下组成的组：–NH–、–N(CH3)–、–N(CH2-CH3)–、–NH-(CH2)2-NH–和–N(CH3)-(CH2)2-N(CH3)–；
G1、G2、G3和G4各自独立地选自由以下组成的组：氢、甲基和乙基；G1、G2、G3和G4部分可以是相同的或不同的；G1、G2、G3和G4中的至少两个是氢原子；
Z选自由以下组成的组：不存在、醚、酯、胺和酰胺；
a、b、c、d是各自独立地选自由0、1、2、3、4、5、6和7组成的组的整数，其中0＝不存在；a、b、c、d可以是相同的或不同的；
e和f是各自独立地选自由1、2和3组成的组的整数；e和f可以是相同的或不同的；
如果每个a或b中的任一个≥2，则相应的烃链可以是饱和的或不饱和的；
W选自包括以下的组：不存在、羟基、二羟基、天然或修饰的核苷以及式(II’)中阐明的结构：
其中J选自不存在、-CH2-、仲胺或叔胺和氧；
并且其中根据式(II’)的部分可以连接至由以下组成的组中的任一个：不存在；氢；D；如本文定义的保护基团(例如，醇的保护基团)；磷酸酯基团、硫酸酯基团或羧基基团；和固体支撑物。在本发明的上下文中，E、E’或E”部分可以经由一个或两个点连接至一个D部分。
在本发明的实施方案中，W是选自天然或修饰的腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的核苷；并且糖部分是核糖或2’-脱氧核糖。
在本发明的另一种实施方案中，W是2’-脱氧尿苷。
在本发明的又另一种实施方案中，W具有式(II’)中阐明的结构，其中J是-CH2-。
在本发明的实施方案中，提供了根据式(II)的E、E’或E”，具有式(III)中阐明的结构：
包括由式(III)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中：U、Q、Z、G3、G4、a、b、c、d、e、f和W各自具有与对于式(II)定义的相同的含义。
在本发明的实施方案中，提供了根据式(III)的E、E’或E”，具有式(IVb)中阐明的结构：
包括由式(IVb)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；其中U、Q、G3、G4、b、c、d、e和f各自具有与式(III)中相同的含义。
本发明还提供了根据式(IVb)的E、E’或E”，具有式(Vb’)中阐明的结构：
包括由式(Vb’)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物。如式(Vb’)中所示的该E、E’或E”部分被命名为Apo-Si-K-18。在该部分被连接至亚磷酰胺基团的情况下，该化合物被命名为Apo-Si-K-18-前体。
本发明还提供了根据式(IVb)的E、E’或E”，具有式(Vb”)中阐明的结构：
包括由式(Vb”)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物；如式(Vb”)中所示的该E、E’或E”部分被命名为Apo-Si-K-13。在该化合物被连接至亚磷酰胺基团的情况下，该化合物被命名为Apo-Si-K-13-前体。
在本发明的实施方案中，提供了根据式(III)的E、E’或E”，具有式(IVc)中阐明的结构：
包括由式(IVc)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；其中U、Q、G3、G4、b、c、d、e和f各自具有与式(III)中相同的含义；J选自由以下组成的组：不存在、-CH2-和氧。
在本发明的实施方案中，提供了根据式(IVc)的E、E’或E”，具有式(Vc”)中阐明的结构：
包括由式(Vc”)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物。如式(Vc”)中所示的该E、E’或E”部分被命名为Apo-Si-K-43。在该化合物被连接至亚磷酰胺基团和DMT基团的情况下，其被命名为Apo-Si-K-43-前体。
在本发明的另一种实施方案中，提供了根据式(IVc)的E、E’或E”，具有式(Vc”’)中阐明的结构：
包括由式(Vc”’)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物。如式(Vc”’)中所示的该E、E’或E”部分被命名为Apo-Si-K-63。在该分子被连接至亚磷酰胺基团和DMT基团的情况下，该化合物被命名为Apo-Si-K-63-前体。
在一些实施方案中，提供了前体分子，该前体分子包含如本文定义的连接至醇的一个或更多个保护基团的本发明的E、E’或E”部分，其中所述基团意欲在E、E’或E”部分与货物药物(例如，大分子药物)缀合期间被去除或修饰。
在实施方案中，前体分子包含根据式(IVc)的E、E’或E”，并且具有式(IVcP)中阐明的以下结构：
包括由式(IVcP)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中：Z、U、Q、G3、G4、a、b、c、d、e、f各自具有与式(IVc)中相同的含义。该前体分子可以用于将E、E’或E”部分附接在5’末端或3’末端或寡核苷酸链内的内部位置处。
在另一种实施方案中，前体分子是根据式(IVcP)，具有式(PP-2)中阐明的以下结构：
包括由式(PP-2)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。该前体分子可以用于将E、E’或E”部分附接在5’末端或3’末端或寡核苷酸链内的内部位置处。如式(PP-2)中所示的该前体分子被命名为Apo-Si-K-43-前体。
在另一种实施方案中，前体分子是根据式(IVcP)，具有式(PP-3)中阐明的以下结构：
包括由式(PP-3)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。如式(PP-3)中所示的该前体分子被命名为Apo-Si-K-63-前体。
在本发明的另一种实施方案中，提供了缀合物，该缀合物包含D与E和E’部分的连接(linkage)，该E和E’部分各自具有式(Vc”’)中阐明的结构并且连接至RNA双链体的5’末端。该缀合物具有式(Cn-12)中阐明的以下结构：
包括由式(Cn-12)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中R和R’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯基团、硫酸酯基团和羧基基团。如式(Cn-12)中所示的该缀合物被命名为Apo-Si-K-63-B。
在本发明的实施方案中，提供了缀合物，该缀合物包含D与两个根据式(Vc”’)的E和E’部分在RNA双链体的5’末端处和在有义(过客)链的内部位置中的连接；该缀合物具有式(Cn-14)中阐明的以下结构：
包括由式(Cn-14)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中R和R’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯基团、硫酸酯基团和羧基基团。如式(Cn-14)中所示的该缀合物被命名为Apo-Si-K-63-C。
在本发明的实施方案中，提供了缀合物，该缀合物包含RNA双链体，诸如siRNA或Dicer酶的底物(dsiRNA)，其中RNA双链体具有24-27个或25-27个核苷酸的长度，并且在其链末端中的两个末端处连接至E、E’或E”部分，E、E’或E”部分各自具有根据式(II)、式(III)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va’)、式(Va”)、式(Va”’)、式(Vb’)、式(Vb”)、式(Vb”’)、式(Vc’)、式(Vc”)或式(Vc”’)中任一项的结构。
在本发明的另一种实施方案中，提供了如上文描述的缀合物，该缀合物包含根据以下选项中的一种的E、E’或E”部分：(1)位于RNA链末端处的两个E、E’或E”部分；或者(2)位于RNA链末端，但也位于siRNA双链体内的内部位置处的三个或更多个E、E’或E”部分；其中E、E’或E”部分中的每一个具有根据式(II)、式(III)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va’)、式(Va”)、式(Va”’)、式(Vb’)、式(Vb”)、式(Vb”’)、式(Vc’)、式(Vc”)或式(Vc”’)中任一项的结构。
本发明的一些实施方案涉及用于在体外或体内将药物穿过生物膜递送至细胞中的方法；该方法包括使细胞与如本文描述的缀合物接触。
另一种实施方案涉及用于治疗有相应需要的患者的医学紊乱的方法；该方法包括向患者施用治疗有效量的包含如本文描述的缀合物的药物组合物。
附图简述
本专利或申请文件包含以彩色展示的至少一幅图。具有彩色附图的本专利或专利申请出版物的副本将在请求和支付必要费用后由主管局提供。
图1(a-b)展示了本发明的缀合物：图(1a)示出了本发明的缀合物，该缀合物包含两个E部分，各自位于siRNA链的5’末端；并且图(1b)示出了在跨膜递送过程之前，当其接近膜时的缀合物，其中siRNA平行于膜表面；其中蓝色和棕色指示siRNA的RNA双链体的每个寡核苷酸链；黄色原子是氧化还原敏感性模块的硫原子，被设计成在细胞质内在还原条件下脱离(disengage)，由此从MDS中释放RNA，以发挥其基因沉默活性；灰色原子和白色原子分别是碳原子和氢原子；红色原子和绿色原子分别是氧原子和氟原子。
图2例示了根据式(Va’)的本发明的E部分的连接模式，以及E部分的相应的氧化还原介导的裂解。图2a示出了RNA链，其中根据式(Va’)的E部分连接在内部位置处；图2b例示了在还原条件下，诸如在细胞质中占优势的那些条件下，根据式(Va’)的E部分的二硫化物基团的氧化还原介导的裂解，随后RNA药物释放。
图3例示了本发明的缀合物的作用机理(MOA)。例示了根据式(Cn-3)的缀合物，其中RNA双链体是25/27个核苷酸长的Dicer底物，具有连接在过客链的5’末端处的磷酸酯基团：图3(a)展示了在细胞质中占优势的还原条件下，E、E’和E”部分的裂解和去除；图3(b)展示了RNA双链体与Dicer核酸内切酶的相互作用，该相互作用诱导双链断裂，留下21/21RNA双链体，具有一种剩余的连接在过客链的5’末端处的E部分的残基；图3(c)展示了通过解旋酶(即，能够分离RNA链的细胞质酶)去除有义链。该事件导致第二种E部分的残余部分(stump)的残基的去除，由此释放完整的反义链，以进入RNA诱导的沉默复合物(RISC)，以便诱导期望的基因沉默[图3(d)]。
图4例示了本发明的缀合物的作用机理(MOA)，其中缀合物根据式(Cn-8)。RNA双链体是25/27个核苷酸长的Dicer底物，具有连接在过客链的5’末端处的磷酸酯基团：图4(a)展示了在细胞质中占优势的还原条件下，E、E’和E”部分的裂解和去除；图4(b)展示了RNA双链体与Dicer核酸内切酶的相互作用，该相互作用诱导双链断裂，留下21/21RNA双链体，E部分的一个剩余的残基连接在过客链的5’末端处；图4(c)展示了通过解旋酶(即，能够分离RNA链的细胞质酶)去除有义链。该事件导致第二个E部分的残余部分的残基的去除，由此释放完整的反义链，以进入RNA诱导的沉默复合物(RISC)，以便诱导期望的基因沉默[图4(d)]。
图5呈现了对于使EGFP基因沉默是特异性的RNA双链体的凝胶电泳，RNA双链体各自包含一条25个核苷酸长的链和一条27个核苷酸长的链(如实施例6中描述的)。用溶于水(泳道A)或在存在10％牛血清白蛋白(BSA)的情况下溶解(泳道B)的缀合物进行电泳。这些双链体是未缀合的(泳道1)；缀合至两个对照Apo-Si-S-1E部分(泳道2)；缀合至两个本发明的Apo-Si-K-13E部分(泳道3)；或者缀合至两个本发明的Apo-Si-K-18E部分(泳道4)。如示出的，在电泳期间，Apo-Si-S-1缀合物显示出与白蛋白紧密结合并且因此不具有无白蛋白的级分，而Apo-Si-K-13和Apo-Si-K-18缀合物均显示出白蛋白结合的级分(箭头#1)和无白蛋白的级分(箭头#2)。
发明详述
本发明涉及缀合物及其前体，所述缀合物及其前体包含连接至分子递送系统(MDS)的大分子药物诸如OD，该分子递送系统(MDS)可以将药物穿过磷脂生物膜递送至细胞中，以在无血清条件下和在血浆蛋白质的存在下均发挥生物性能。该递送系统能够实现大分子药物诸如基因药物例如siRNA或dsiRNA、反义寡核苷酸(ASO)或治疗性蛋白质的跨膜递送。在血浆蛋白质的存在下的活性对于将本发明的缀合物在体内用于局部或全身施用(例如，经由静脉内注射)至活体动物或人类受试者是特别重要的。
在本发明的实施方案中，提供了具有式(I)中阐明的结构的缀合物：
包括由式(I)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中：
D是待穿过生物膜被递送的药物(即，货物药物)，所述药物选自由以下组成的组：小分子药物、肽、蛋白质和OD(即，天然的或修饰的单链或双链的DNA或RNA、siRNA、dsiRNA或ASO)；
y、z和w各自是独立地选自0、1、2、3或4的整数，其中如果y、z或w或其组合中的任一个是0，则意味着相应的一个或更多个E部分不存在；y、z或w中的至少一个不同于0；
E、E’或E”可以是相同的或不同的，各自独立地具有通式(II)中阐明的结构：
包括由式(II)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中：
U或Q中的一个独立地不存在，而另一个选自由以下组成的组：–NH–、–N(CH3)–、–N(CH2-CH3)–、–NH-(CH2)2-NH–和–N(CH3)-(CH2)2-N(CH3)–；
G1、G2、G3和G4各自独立地选自由以下组成的组：氢、甲基或乙基；G1、G2、G3和G4部分可以是相同的或不同的；G1、G2、G3和G4中的至少两个是氢原子；
Z选自由以下组成的组：不存在、醚、酯、胺和酰胺；
a、b、c、d是各自独立地选自由0、1、2、3、4、5、6或7组成的组的整数，其中0＝不存在；a、b、c、d可以是相同的或不同的；
e和f是各自独立地选自由1、2和3组成的组的整数；e和f可以是相同的或不同的；如果每个a或b中的任一个≥2，则相应的烃链可以是饱和的或不饱和的；
W选自包括以下的组：不存在、羟基、二羟基、天然或修饰的核苷以及式(II’)中阐明的结构：
其中J选自不存在、-CH2-、仲胺或叔胺和氧；
并且其中根据式(II’)的部分可以连接至由以下组成的组中的任一个：不存在；氢；D；如本文定义的保护基团(例如，醇的保护基团)；磷酸酯基团、硫酸酯基团或羧基基团；和固体支撑物。在本发明的上下文中，E、E’或E”部分可以经由一个或两个点连接至一个D部分。
在本发明的实施方案中，W是选自天然或修饰的腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的核苷，并且糖部分是核糖或2’-脱氧核糖。
在本发明的另一种实施方案中，W是2’-脱氧尿苷。在本发明的又另一种实施方案中，W具有式(II’)中阐明的结构，其中J是-CH2-。
在实施例6中例示了根据式(II)的化学部分在(S+)条件和(S-)条件两者下能够实现本发明缀合物的跨膜递送的作用。该实施例示出，符合式(II)的结构的E部分显示出相关缀合物在穿过细胞膜递送至细胞中以及在诱导生物效应诸如例如基因沉默这两方面的稳健性能。这种性能在(S-)条件和(S+)条件下均观察到。实施例6描述了本发明的两种缀合物，它们均具有符合式(II)的连接至Dicer底物的E部分，该Dicer底物是被设计成使增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的表达沉默的双链体。一种是Apo-Si-K-18缀合物，具有两个根据式(Vb’)的Apo-Si-K-18的E部分，并且第二种是Apo-Si-K-13缀合物，具有两个根据式(Vb”)的Apo-Si-K-13的E部分。该实施例将这些缀合物在基因沉默方面的性能与三种结构相关的对照缀合物的性能进行了比较，所述对照缀合物包括Apo-Si-K-19、Apo-Si-W和Apo-Si-G部分。尽管这些部分与本发明的E部分结构类似，但不完全符合式(II)，并且在血浆蛋白质存在[S(+)条件]下，它们在递送至细胞中和基因沉默方面分别不能有效地发挥作用。
所有缀合物(本发明的缀合物和对照缀合物两者)的E部分包含固醇骨架和九氟叔丁醇残基。然而，明显地，即使在无血清条件下这也不足以赋予生物活性(例如，在基因沉默中赋予生物活性)。例如，如实施例6中描述的，在血浆蛋白质存在或不存在的情况下，Apo-Si-W缀合物是无活性的。在无血清条件下，每个E部分添加二硫化物基团引起活性(例如，在基因沉默中引起活性)，如本发明的缀合物的性能以及对照缀合物Apo-Si-G的性能所反映的，该对照缀合物Apo-Si-G在无血清的情况下显示出活性。然而，在血浆蛋白质存在下，配置(installment)二硫化物部分本身不足以能够产生性能。相比之下，对于每个E部分添加一个存在的Q或U部分确实在血浆蛋白质存在下赋予活性，这通过在血清(+)条件下由包含Apo-Si-K-18或Apo-Si-K-13部分的缀合物在基因沉默中发挥有效性能来反映。
综上，这些数据支持这样的概念：式(II)确实代表了寡核苷酸药物的跨膜递送和发挥相应的有利生物性能(例如，在基因沉默中发挥相应的有利生物性能)所需的多种决定因素之间的独特、新颖且不可预测的平衡。
在本发明的上下文中，“药物”或“货物药物”(即，部分D)是指待由本发明的缀合物递送的分子，其是小分子药物或大分子，诸如肽、蛋白质或寡核苷酸药物。
在本发明的上下文中，“药物(drug)”或“药物(medicament)”涉及这样的化学物质，当施用至患有疾病的患者时，该化学物质能够对患者发挥有益效果。有益效果可以是症状的改善，或在疾病过程中起作用的剂或物质的作用的抵消。药物可以包括被施用以抑制基因表达的小分子或大分子，诸如蛋白质或单链或双链的RNA或DNA。尤其是，药物可以包括siRNA或ASO。在一些实施方案中，药物旨在治疗退行性紊乱、癌症、缺血性疾病、传染性疾病、毒性损伤疾病、代谢疾病或免疫介导的紊乱。
在本发明的上下文中，术语“寡核苷酸药物”(在下文中也被指定为“OD”)是指包含核苷或核苷酸的药物。寡核苷酸药物(OD)的实例是单链或双链的、天然或修饰的RNA或DNA。OD的实例是siRNA(小干扰RNA)、Dicer酶的底物(dsiRNA)、微小RNA(miRNA)、信使RNA(mRNA)或被设计成用作反义寡核苷酸(ASO)的DNA序列。OD的核苷酸结构单元(building block)之间的连接尤其可以经由磷酸三酯或硫代磷酸酯键进行。
在OD中的更具体的实施方案中，本发明公开了：
“siRNA”，是RNA双链体，其中每条RNA链是19-21个核苷酸长，旨在经由RISC(RNA诱导的沉默复合物)蛋白复合物使基因表达沉默；
Dicer的siRNA底物(“dsiRNA”)，是RNA双链体，其中每条RNA链是24-30个核苷酸长。在实施方案中，dsiRNA双链体由以下组成：一条25个核苷酸的链，同时第二条链由27个核苷酸组成。在另一种实施方案中，dsiRNA双链体由以下组成：一条24个核苷酸的链，同时第二条链由27个核苷酸组成；
“反义寡核苷酸”(ASO)，是合成的、单链的、天然或修饰的DNA或RNA寡核苷酸，通常为15-20个核苷酸长。ASO的序列是反义的，即，它与寻求抑制其合成的蛋白质的特定mRNA的有义序列互补。ASO与所述互补序列的结合阻断了核糖体沿着mRNA移动的能力，由此阻止蛋白质的合成或者加快mRNA的降解速率。
在本发明的上下文中，“核苷”被定义为这样的化学部分，该化学部分包含含氮碱基(核碱基)和五个或六个碳原子的糖(例如，核糖或脱氧核糖)。核碱基选自天然或修饰的嘌呤(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤)和天然或修饰的嘧啶(例如，胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶)。核碱基可以通过本领域已知的多种修饰(例如，甲基化、乙酰化)进行修饰。此外，核苷的糖部分也可以如本领域已知的被修饰[例如，2’-脱氧衍生物，核糖的2’位的甲基化，2’-氟原子的配置，或具有连接2’氧原子和4’碳原子的桥，由此产生锁核酸(LNA)]。因此，使用这样的修饰的核苷也在本发明的范围内。在实施方案中，核苷包括选自天然或修饰的胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的嘧啶衍生物，并且糖部分是核糖或脱氧核糖。
在本发明的上下文中，“核苷酸”是连接至磷酸酯基团的如上文定义的核苷。核苷酸是寡核苷酸的结构单元。
在本发明的上下文中，“前体分子”被定义为附接至如下文定义的保护基团的具有本发明的式(II)、式(III)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va’)、式(Va”)、式(Va”’)、式(Vb’)、式(Vb”)、式(Vb”’)、式(Vc’)、式(Vc”)或式(Vc”’)中任一项阐明的结构的E、E’或E”部分。
在本发明的上下文中，“保护基团”被定义为在缀合物合成期间意欲被去除或修饰的化学基团。这样的去除或修饰可以发生在合成的不同阶段；例如但不限于，在将E、E’或E”部分附接至D期间，在D是大分子药物诸如寡核苷酸药物的情况下。在本发明的优选的实施方案中，保护基团是如下文定义的醇的保护基团。
在本发明的上下文中，“醇的保护基团”是指附接至羟基基团以便在某些化学反应期间“掩蔽”羟基基团并且此后可能被去除的如本领域已知的化学基团。这样的保护基团的实例是乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、苄基(Bn)、β-甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)、二甲氧基三苯甲基[双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基](DMT)、甲氧基甲基醚(MOM)、甲氧基三苯甲基[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基](MMT)、对甲氧基苄基醚(PMB)、新戊酰基(Piv)、四氢吡喃基(THP)、四氢呋喃(THF)、三苯甲基(三苯基甲基，Tr)、甲硅烷基醚[例如，三甲基甲硅烷基(TMS)醚、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)醚、三异丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)醚和三异丙基甲硅烷基(TIPS)醚]、乙氧基乙醚(EE)、亚磷酰胺、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。常用的醇的保护基团是二甲氧基三苯甲基[双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基](DMT)和亚磷酰胺。
在本发明的上下文中，术语“与固体支撑物的附接”意指在化学合成期间，E、E’或E”部分与固体支撑物的附接点。例如，可控孔度玻璃(CPG)可以用作固体支撑物，用于在本发明的缀合物的合成期间附接在寡核苷酸的3’末端处。
根据本发明，术语“生物膜”是指与生物系统相关的任何磷脂膜。这样的磷脂膜的实例是细胞的质膜、细胞内膜或与生物屏障诸如血脑屏障(BBB)、血眼屏障(BOB)或血胎屏障相关的磷脂膜。
在本发明的实施方案中，提供了根据式(II)的E、E’或E”，具有式(III)中阐明的结构：
包括由式(III)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中：U、Q、Z、G3、G4、a、b、c、d、e、f、W各自具有与对于式(II)定义的相同的含义。
在本发明的实施方案中，提供了根据式(III)的E、E’或E”，具有式(IVa)中阐明的结构：
包括由式(IVa)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；其中：Z、U、Q、G3、G4、a、b、c、d、e和f各自具有与式(III)中相同的含义。
在本发明的实施方案中，提供了根据式(III)的E、E’或E”，具有式(IVb)中阐明的结构：
包括由式(IVb)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；其中U、Q、G3、G4、b、c、d、e和f各自具有与式(III)中相同的含义。
在本发明的实施方案中，提供了根据式(III)的E、E’或E”，具有式(IVc)中阐明的结构：
包括由式(IVc)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；其中U、Q、G3、G4、b、c、d、e和f各自具有与式(III)中相同的含义；J选自由以下组成的组：不存在、-CH2-和氧。
本发明还提供了根据式(IVa)的E、E’或E”，具有式(Va’)中阐明的结构：
包括由式(Va’)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物。
本发明还提供了根据式(IVa)的E、E’或E”，具有式(Va”)中阐明的结构：
包括由式(Va”)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物。在分子被连接至亚磷酰胺和DMT基团的情况下，该化合物被命名为Apo-Si-K-29D-前体。
本发明还提供了根据式(IVa)的E、E’或E”，具有式(Va”’)中阐明的结构：
包括由式(Va”’)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物。
本发明还提供了根据式(IVb)的E、E’或E”，具有式(Vb’)中阐明的结构：
包括由式(Vb’)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物。如式(Vb’)中所示的该E、E’或E”部分被命名为Apo-Si-K-18。在化合物被连接至亚磷酰胺基团的情况下，该化合物被命名为Apo-Si-K-18-前体。
本发明还提供了根据式(IVb)的E、E’或E”，具有式(Vb”)中阐明的结构：
包括由式(Vb”)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物。如式(Vb”)中所示的该E、E’或E”部分被命名为Apo-Si-K-13。在化合物被连接至亚磷酰胺基团的情况下，该化合物被命名为Apo-Si-K-13-前体。
本发明还提供了根据式(IVb)的E、E’或E”，具有式(Vb”’)中阐明的结构：
包括由式(Vb”’)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物。如式(Vb”’)中所示的该E、E’或E”部分被命名为Apo-Si-K-11。在分子被连接至亚磷酰胺基团的情况下，该化合物被命名为Apo-Si-K-11-前体。
在实施方案中，本发明提供了根据式(IVc)的E、E’或E”，具有式(Vc’)中阐明的结构：
包括由式(Vc’)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物。如式(Vc’)中所示的该E、E’或E”部分被命名为Apo-Si-K-40。在化合物被连接至亚磷酰胺和DMT基团的情况下，该化合物被命名为Apo-Si-K-40-前体。
在实施方案中，本发明提供了根据式(IVc)的E、E’或E”，具有式(Vc”)中阐明的结构：
包括由式(Vc”)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物。如式(Vc”)中所示的该E、E’或E”部分被命名为Apo-Si-K-43。在化合物被连接至亚磷酰胺和DMT基团的情况下，该化合物被命名为Apo-Si-K-43-前体。
在本发明的另一种实施方案中，提供了根据式(IVc)的E、E’或E”，具有式(Vc”’)中阐明的结构：
包括由式(Vc”’)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物。如式(Vc”’)中所示的该E、E’或E”部分被命名为Apo-Si-K-63。在化合物被连接至亚磷酰胺和DMT基团的情况下，该化合物被命名为Apo-Si-K-63-前体。
在实施方案中，本发明提供了前体分子，该前体分子包含根据式(IVa)的E、E’或E”，并且具有式(IVaP)中阐明的以下结构：
包括由式(IVaP)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中：Z、U、Q、G3、G4、a、b、c、d、e、f各自具有与式(IVa)中相同的含义。该前体分子可以用于将E、E’或E”部分附接在5’末端或3’末端或寡核苷酸链内的内部位置处。
在另一种实施方案中，本发明提供了前体分子，该前体分子包含根据式(IVb)的E、E’或E”，并且具有式(IVbP)中阐明的以下结构：
包括由式(IVbP)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中U、Q、G3、G4、b、c、d、e、f各自具有与式(IVb)中相同的含义。
在仍然另一种实施方案中，本发明提供了前体分子，该前体分子包含根据式(IVc)的E、E’或E”，并且具有式(IVcP)中阐明的以下结构：
包括由式(IVcP)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中：Z、U、Q、G3、G4、a、b、c、d、e、f各自具有与式(IVc)中相同的含义；该前体分子可以用于将E、E’或E”部分附接在5’末端或3’末端或寡核苷酸链内的内部位置处。
在具体的实施方案中，前体分子是根据式(IVcP)，具有式(PP-1)中阐明的以下结构：
包括由式(PP-1)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。该前体分子可以用于将E、E’或E”部分附接在5’末端或3’末端或寡核苷酸链内的内部位置处。如式(PP-1)中所示的该前体分子被命名为Apo-Si-K-40-前体。
在另一种具体的实施方案中，前体分子是根据式(IVcP)，具有式(PP-2)中阐明的以下结构：
包括由式(PP-2)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。该前体分子可以用于将E、E’或E”部分附接在5’末端或3’末端或寡核苷酸链内的内部位置处。如式(PP-2)中所示的该前体分子被命名为Apo-Si-K-43-前体。
在另一种实施方案中，前体分子是根据式(IVcP)，具有式(PP-3)中阐明的以下结构：
包括由式(PP-3)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。如式(PP-3)中所示的该前体分子被命名为Apo-Si-K-63-前体。
根据式(II)、式(III)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va’)、式(Va”)、式(Va”’)、式(Vb’)、式(Vb”)、式(Vb”’)、式(Vc’)、式(Vc”)或式(Vc”’)中任一项的化合物可以用作E、E’或E”部分，以用于连接至D，由此形成对于跨膜递送至细胞中的生物性能而言期望的本发明的缀合物。在D是寡核苷酸药物(OD)的情况下，缀合物可以是根据以下选项中的任一个：
(i).D连接至单个E、E’或E”部分。
(ii).任选地在每条寡核苷酸链的一个末端(例如，5’末端)处，D连接至相同或不同的两个E和E’部分。
(iii).D连接至相同或不同的E、E’和E”部分；E和E’部分连接在每条寡核苷酸链的末端(例如，5末端)处，而E”连接在寡核苷酸链内的内部位置处。
(iv).D连接至相同或不同的若干个(n>3)E部分；一些E部分连接在每条寡核苷酸链的末端(例如，5末端)处，而若干个其他E部分连接在沿寡核苷酸链的若干个内部位置处。
在本发明的实施方案中，提供了缀合物，该缀合物包含D与根据式(Va’)的E和E’部分在RNA双链体的5’末端处的连接；所述缀合物具有式(Cn-1)中阐明的以下结构：
包括由式(Cn-1)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中R和R’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯基团、硫酸酯基团或羧基基团。
在本发明的另一种实施方案中，提供了缀合物，该缀合物包含D与两个根据式(Vc’)的E和E’部分在RNA双链体的5’末端处的连接；所述缀合物具有式(Cn-2)中阐明的以下结构：
包括由式(Cn-2)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中R和R’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯基团、硫酸酯基团或羧基基团。
在本发明的另一种实施方案中，提供了缀合物，该缀合物包含D与E和E’部分(各自具有式(Vc’)中阐明的结构，连接至RNA双链体的5’末端)以及E”部分(具有式(Va’)中阐明的结构，连接在沿寡核苷酸链的内部位置处)的连接；该缀合物具有式(Cn-3)中阐明的以下结构：
包括由式(Cn-3)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中R和R’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯基团、硫酸酯基团或羧基基团。
在本发明的另一种实施方案中，提供了缀合物，该缀合物包含D与根据式(Vc’)的E和E’部分在RNA双链体的5’末端处的连接；以及D与根据式(Vc’)的E”部分连接在沿寡核苷酸链的内部位置处的连接；所述缀合物具有式(Cn-4)中阐明的以下结构：
包括由式(Cn-4)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中R和R’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯基团、硫酸酯基团或羧基基团。
在本发明的另一种实施方案中，提供了缀合物，该缀合物包含D，D是如上文定义的反义寡核苷酸(ASO)，该反义寡核苷酸包含15-25个核苷酸长的单链寡核苷酸，所述单链寡核苷酸选自由以下组成的组：天然或修饰的DNA、RNA、锁核酸核苷酸(LNA)、硫代磷酸核苷酸及其组合。该缀合物具有式(Cn-5)中阐明的以下结构：
包括由式(Cn-5)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；其中Y和Y’各自独立地选自由以下组成的组：氢、-CH2-Z、-CH2-Z’、-CH2-O-Z和-CH2-O-Z’；其中Z和Z’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯、硫酸酯、羧基、1’,2’-二脱氧核糖、核苷酸及其组合；g是选自由0、1、2、3、4、5和6组成的组的整数。
在本发明的另一种实施方案中，提供了缀合物，该缀合物包含D与根据式(Va”)的E和E’部分在RNA双链体的5’末端处的连接。该缀合物具有式(Cn-6)中阐明的以下结构：
包括由式(Cn-6)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中R和R’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯基团、硫酸酯基团和羧基基团。
在本发明的另一种实施方案中，提供了缀合物，该缀合物包含D与两个根据式(Vc”)的E和E’部分在RNA双链体的5’末端处的连接；该缀合物具有式(Cn-7)中阐明的以下结构：
包括由式(Cn-7)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中R和R’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯基团、硫酸酯基团或羧基基团。
在本发明的另一种实施方案中，提供了缀合物，该缀合物包含D与E和E’部分(各自具有式(Vc”)中阐明的结构，并且连接至RNA双链体的5’末端)以及D与根据式(Va”)的E”部分(连接在沿寡核苷酸链的内部位置处)的连接；该缀合物具有式(Cn-8)中阐明的以下结构：
包括由式(Cn-8)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中R和R’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯基团、硫酸酯基团或羧基基团。
在本发明的另一种实施方案中，提供了缀合物，该缀合物包含D与根据式(Vc”)的E和E’部分在RNA双链体的5’末端处的连接；以及D与根据式(Vc”)的E”部分连接在沿寡核苷酸链的内部位置处的连接；所述缀合物具有式(Cn-9)中阐明的以下结构：
包括由式(Cn-9)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中R和R’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯基团、硫酸酯基团或羧基基团。
在本发明的另一种实施方案中，提供了缀合物，该缀合物包含D，D是如上文定义的反义寡核苷酸(ASO)，该反义寡核苷酸包含15-25个核苷酸长的单链寡核苷酸，所述单链寡核苷酸选自由以下组成的组：天然或修饰的DNA、RNA、锁核酸(LNA)核苷酸、硫代磷酸核苷酸及其组合。该缀合物具有式(Cn-10)中阐明的以下结构：
包括由式(Cn-10)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；其中Y和Y’各自独立地选自由以下组成的组：氢、-CH2-Z、-CH2-Z’、-CH2-O-Z和-CH2-O-Z’；其中Z和Z’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯、硫酸酯、羧基、1’,2’-二脱氧核糖、核苷酸及其组合；g是选自由0、1、2、3、4、5和6组成的组的整数。
在本发明的另一种实施方案中，提供了缀合物，该缀合物包含D与E和E’部分的连接，该E和E’部分各自具有式(Va”’)中阐明的结构并且连接至RNA双链体的5’末端；该缀合物具有式(Cn-11)中阐明的以下结构：
包括由式(Cn-11)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中R和R’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯基团、硫酸酯基团和羧基基团。
在本发明的另一种实施方案中，提供了缀合物，该缀合物包含D与E和E’部分的连接，该E和E’部分各自具有式(Vc”’)中阐明的结构并且连接至RNA双链体的5’末端。该缀合物具有式(Cn-12)中阐明的以下结构：
包括由式(Cn-12)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中R和R’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯基团、硫酸酯基团和羧基基团。如式(Cn-12)中所示的该缀合物被命名为Apo-Si-K-63-B。
在本发明的另一种实施方案中，提供了缀合物，该缀合物包含D与E和E’部分(各自具有式(Vc”’)中阐明的结构，并且连接至RNA双链体的5’末端)以及D与根据式(Va”’)的E”部分(连接在沿寡核苷酸链的内部位置处)的连接；该缀合物具有式(Cn-13)中阐明的以下结构：
包括由式(Cn-13)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中R和R’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯基团、硫酸酯基团和羧基基团。
在本发明的另一种实施方案中，提供了缀合物，该缀合物包含D与E和E’部分(各自具有式(Vc”’)中阐明的结构，并且连接至RNA双链体的5’末端)以及D与根据式(Vc”’)的E”部分(连接在沿寡核苷酸链的内部位置处)的连接；该缀合物具有式(Cn-14)中阐明的以下结构：
包括由式(Cn-14)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中R和R’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯基团、硫酸酯基团和羧基基团。如式(Cn-14)中所示的该缀合物被命名为Apo-Si-K-63-C。
本发明的另一种实施方案提供了缀合物，该缀合物包含D，D是如上文定义的反义寡核苷酸(ASO)，该反义寡核苷酸包含15-25个核苷酸长的单链寡核苷酸，所述单链寡核苷酸选自由以下组成的组：天然或修饰的DNA、RNA、锁核酸(LNA)核苷酸、硫代磷酸核苷酸及其组合。该缀合物具有式(Cn-15)中阐明的以下结构：
包括由式(Cn-15)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；其中Y和Y’各自独立地选自由以下组成的组：氢、-CH2-Z、-CH2-Z’、-CH2-O-Z和-CH2-O-Z’；其中Z和Z’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯、硫酸酯、羧基、1’,2’-二脱氧核糖、核苷酸及其组合；g是选自由0、1、2、3、4、5和6组成的组的整数。
在本发明的实施方案中，提供了缀合物或包含缀合物的药物组合物，该缀合物包含RNA双链体，诸如siRNA或Dicer酶的底物(dsiRNA)，其中所述RNA双链体是27-25个或27-24个核苷酸长，在其末端中的两个末端处连接至E、E’或E”部分，E、E’或E”部分各自具有根据式(II)、式(III)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va’)、式(Va”)、式(Va”’)、式(Vb’)、式(Vb”)、式(Vb”’)、式(Vc’)、式(Vc”)或式(Vc”’)中任一项所述的结构，在过客(有义)链的5’末端处和/或引导(反义)链的5’末端处具有磷酸酯基团、硫酸酯基团或羧基基团的潜在另外的连接。
在本发明的另一种实施方案中，提供了如上文描述的缀合物，该缀合物也在其末端中的两个末端处以及还在siRNA双链体内的一个或更多个内部位置处连接至E、E’或E”部分，E、E’或E”部分各自具有根据式(II)、式(III)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va’)、式(Va”)、式(Va”’)、式(Vb’)、式(Vb”)、式(Vb”’)、式(Vc’)、式(Vc”)或式(Vc”’)中任一项的结构，在过客(有义)链的5’末端处和/或引导(反义)链的5’末端处具有磷酸酯基团、硫酸酯基团或羧基基团的潜在另外的连接。
本发明的实施方案还涉及根据本发明的缀合物用于治疗有相应需要的受试者的医学紊乱的用途，所述缀合物包含治疗有用的药物，诸如蛋白质或OD(例如，siRNA、dsiRNA或ASO)。医学紊乱可以是但不限于退行性紊乱，癌症，血管疾病，代谢紊乱，创伤性、毒性或缺血性损伤，感染(例如，病毒感染或细菌感染)或免疫介导的紊乱，其中特定蛋白质在疾病病因学或发病机制中发挥作用。对于这样的医学紊乱，通过siRNA或反义机制调节相应基因的表达，或通过治疗性蛋白质诸如通过抗体、或通过在信号转导中起作用的蛋白质或通过蛋白质替代疗法调节相应蛋白质的活性，可以在抑制疾病相关的过程或在治疗疾病的潜在原因(underlying cause)方面具有有益效果。
例如，根据本发明实施方案的缀合物可以用作反义、siRNA或dsiRNA疗法，这是一种形式的医学治疗，其包括施用单链或双链的核酸序列(DNA、RNA或化学类似物)，该单链或双链的核酸序列结合编码特定蛋白质的DNA序列或结合将该DNA序列翻译成蛋白质的信使RNA(mRNA)。这种治疗可以起抑制疾病相关基因的表达的作用，从而防止可能在疾病病因学或发病机制中发挥作用的疾病相关蛋白质的产生。可选择地，本发明的缀合物可以包含治疗性蛋白质或蛋白质/核酸复合物，诸如能够进行基因编辑的Cas9-RNA复合物。
本发明的实施方案提供了药物组合物，该药物组合物包含本文描述的缀合物和药学上可接受的载体或盐。根据一些实施方案，本发明的缀合物和药物组合物可以在体内、在活体受试者中使用，包括在临床环境中使用。
本发明的其他实施方案包括本发明的缀合物或包含本发明的缀合物的药物组合物，用于治疗有相应需要的患者的医学紊乱。本发明的另外的实施方案包括本发明的缀合物在制备用于治疗有相应需要的患者的医学紊乱的药物组合物中的用途。在一些实施方案中，医学紊乱是癌症、代谢疾病、传染性疾病、退行性疾病、血管疾病或免疫介导的疾病。
与没有本发明的E、E’或E”部分的相同治疗剂的性能相比，根据本发明实施方案的缀合物在改善siRNA、dsiRNA、ASO或治疗性蛋白质诸如抗体递送穿过细胞膜或穿过生物屏障诸如血脑屏障(BBB)方面可以是有利的。因此，本发明的缀合物可以在一个或更多个方面改善大分子药物的性能，诸如例如功效、毒性或药代动力学。
本发明的缀合物，其中D部分是寡核苷酸，可以根据以下方法以非限制性方式合成：首先，基于基因在疾病病因学或发病机制中的作用来选择待沉默的基因。然后，基于如本领域已知的生物信息学方法，设计并确定待掺入缀合物中的核苷酸序列[对于RISC底物，通常是19-21个碱基对的双链siRNA；或对于Dicer底物(dsiRNA)，通常是24-29个碱基对的双链RNA]。合成以寡核苷酸的3’至5’方向进行。使用源自以下的被保护的结构单元应用固相合成：被保护的2’-脱氧核苷(dA、dC、dG和dT)、核糖核苷(A、C、G和U)或化学修饰的核苷，例如[LNA(锁核酸)或BNA(桥接核酸)]。结构单元作为核苷前体被提供，其中5’-羟基基团和3’-羟基基团分别被DMT和亚磷酰胺保护。在核苷酸以根据期望的核苷酸序列确定的顺序偶联至生长的寡核苷酸链的反应期间，这些基团被依次去除。
为了合成本发明的缀合物的目的，E基团作为前体分子被提供，前体分子各自是连接至如上文描述的保护基团的本发明的E、E’或E”部分。虽然保护基团可以是本领域已知的羟基的任何保护基团，但亚磷酰胺和DMT[二甲氧基三苯甲基双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基]通常用于寡核苷酸合成。本发明的缀合物的主要优点是，它们提供如上文针对式(IVa)和式(IVc)描述的将E、E’或E”部分连接至寡核苷酸链的5’末端、连接至寡核苷酸链的3’末端或连接在沿寡核苷酸的内部位置处的选项。因此，本发明的E部分可以整合在与任何固有的天然寡核苷酸结构单元类似的寡核苷酸链中。在链的组装完成后，将产物从固体支撑物释放至溶液中，脱保护并且收集。期望的缀合物然后通过高效液相色谱法(HPLC)分离，以获得高纯度的本发明的期望的缀合物。在siRNA或dsiRNA的情况下，互补的RNA链中的每一条被单独地合成，并且然后在如本领域已知的标准条件中对这两条链进行退火，以产生期望的双链siRNA或dsiRNA，然后使该双链siRNA或dsiRNA经历纯化和等分(aliquoting)。
在本发明的实施方案中，提供了用于将药物递送穿过磷脂生物膜的方法，所述磷脂生物膜选自由细胞膜和生物屏障组成的组，其中所述生物屏障选自血脑屏障、血眼屏障或血胎屏障；所述方法包括使细胞与本发明的缀合物接触。
在本发明的实施方案中，提供了用于将药物递送至生物细胞中的方法，其中所述细胞在培养物中、或在活体动物中或在人类受试者中；所述方法包括使细胞与缀合物或与包含本发明的缀合物的药物组合物接触。
在本发明的实施方案中，提供了本发明的缀合物或包含根据式(I)的缀合物的药物组合物，其中E、E’或E”各自独立地具有式(II)、式(III)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va’)、式(Va”)、式(Va”’)、式(Vb’)、式(Vb”)、式(Vb”’)、式(Vc’)、式(Vc”)或式(Vc”’)中任一项阐明的结构。
本发明还包括用于在体外或体内特异性抑制基因表达的方法。在本发明的一种实施方案中，所述方法可以包括利用根据式(I)、式(II)、式(III)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va’)、式(Va”)、式(Va”’)、式(Vb’)、式(Vb”)、式(Vb”’)、式(Vc’)、式(Vc”)或式(Vc”’)、式(Cn-1)、式(Cn-2)、式(Cn-3)、式(Cn-4)、式(Cn-5)、式(Cn-6)、式(Cn-7)、式(Cn-8)、式(Cn-9)、式(Cn-10)、式(Cn-11)、式(Cn-12)、式(Cn-13)、式(Cn-14)或式(Cn-15)中任一项的缀合物或包含所述缀合物的药物组合物，其中D是被设计成使特定基因的表达沉默的siRNA、dsiRNA或ASO。在一些实施方案中，基因编码在疾病的病因学或发病机制中具有作用的致病蛋白质。在一些实施方案中，D是治疗性蛋白质。
在本发明的又另一种实施方案中，本发明以非限制性方式提供了用于在生物膜内诱导胞吞(endocytosis)或翻转(flip-flop)的方法；所述方法包括使本发明的缀合物或包含所述缀合物的药物组合物与生物膜接触，其中缀合物包含siRNA或dsiRNA双链体，该siRNA或dsiRNA双链体在其两个末端的两个末端处并且可能还在siRNA双链体的内部位置处连接至E、E’或E”部分，其中E、E’或E”部分各自具有式(II)、式(III)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va’)、式(Va”)、式(Va”’)、式(Vb’)、式(Vb”)、式(Vb”’)、式(Vc’)、式(Vc”)或式(Vc”’)中任一项阐明的结构。由于本发明的缀合物的结构，siRNA接近膜，平行于膜的表面，其中E、E’或E”部分朝向膜核心、垂直于膜表面定向(在图1中展示出)。由此产生的高度带负电荷的RNA被迫接近膜表面可以诱导细胞内膜囊泡(内体(endosome)，通过胞吞产生)的形成，并且还诱导缀合物从一个膜小叶移动至另一个膜小叶(翻转)。这两个过程对于siRNA或本发明的其他大分子药物跨膜递送至细胞中的启动和/或传播(propagation)可以是高度有用的。
根据本发明的实施方案的缀合物可以用于治疗医学紊乱。本发明的实施方案包括用于医学治疗的方法，该方法包括向有相应需要的患者施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含根据式(I)、式(II)、式(III)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va’)、式(Va”)、式(Va”’)、式(Vb’)、式(Vb”)、式(Vb”’)、式(Vc’)、式(Vc”)或式(Vc”’)、式(Cn-1)、式(Cn-2)、式(Cn-3)、式(Cn-4)、式(Cn-5)、式(Cn-6)、式(Cn-7)、式(Cn-8)、式(Cn-9)、式(Cn-10)、式(Cn-11)、式(Cn-12)、式(Cn-13)、式(Cn-14)或式(Cn-15)中任一项的缀合物；其中D是对于治疗相应的医学紊乱有用的药物。
在一种实施方案中，所述方法用于用siRNA、dsiRNA或ASO进行基因医学治疗；所述方法包括向有相应需要的患者施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含根据式(I)、式(II)、式(III)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va’)、式(Va”)、式(Va”’)、式(Vb’)、式(Vb”)、式(Vb”’)、式(Vc’)、式(Vc”)或式(Vc”’)、式(Cn-1)、式(Cn-2)、式(Cn-3)、式(Cn-4)、式(Cn-5)、式(Cn-6)、式(Cn-7)、式(Cn-8)、式(Cn-9)、式(Cn-10)、式(Cn-11)、式(Cn-12)、式(Cn-13)、式(Cn-14)或式(Cn-15)中任一项的本发明的缀合物；其中D是在抑制基因表达或阻断在特定患者的疾病中起作用的蛋白质的活性方面有用的siRNA、dsiRNA、ASO或治疗性蛋白质。
在本发明的另一种实施方案中，本发明包括用于通过本发明的缀合物进行疾病的医学治疗的方法，所述缀合物是根据式(I)、式(II)、式(III)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va’)、式(Va”)、式(Va”’)、式(Vb’)、式(Vb”)、式(Vb”’)、式(Vc’)、式(Vc”)或式(Vc”’)、式(Cn-1)、式(Cn-2)、式(Cn-3)、式(Cn-4)、式(Cn-5)、式(Cn-6)、式(Cn-7)、式(Cn-8)、式(Cn-9)、式(Cn-10)、式(Cn-11)、式(Cn-12)、式(Cn-13)、式(Cn-14)或式(Cn-15)中任一项；其中D是必须穿过生物磷脂膜递送至细胞中或通过生物屏障诸如血脑屏障递送的siRNA、dsiRNA、ASO或治疗性蛋白质。所述细胞是体外培养的细胞、或活体动物或人类受试者体内的细胞。在一些实施方案中，细胞是赘生性细胞。在一些实施方案中，赘生性细胞是肿瘤细胞。在一些实施方案中，赘生性细胞是转移中的细胞。细胞可以是真核细胞、被致癌剂(oncogenic agent)转染的真核细胞、人类细胞、为癌前细胞的细胞或其任何组合。细胞可以是体外的，即在细胞培养物中；可以是离体的，即从活体受试者中取出；或可以是体内的，即在活体动物或人类受试者体内。
在本发明的又另一种实施方案中，D是作为替代疗法被施用的蛋白质，例如，以替代突变的、具有功能障碍的蛋白质，由此解决生理需求。在另一种实施方案中，D是在基因调节中具有作用的蛋白质，尤其包括在DNA或RNA编辑(对特定基因的序列进行添加、破坏或改变)中具有作用的蛋白质。在一种实施方案中，所述蛋白质可以是CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复)相关蛋白质的成员。特别地，所述蛋白质可以是Cas9蛋白(CRISPR相关蛋白9)、RNA引导的DNA核酸酶或其类似物，它们可能负载有其引导寡核苷酸序列。
在本发明的一种实施方案中，本发明描述了用于基因治疗医学紊乱的方法，其中所述方法包括向有相应需要的患者施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含根据式(I)、式(II)、式(III)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va’)、式(Va”)、式(Va”’)、式(Vb’)、式(Vb”)、式(Vb”’)、式(Vc’)、式(Vc”)或式(Vc”’)、式(Cn-1)、式(Cn-2)、式(Cn-3)、式(Cn-4)、式(Cn-5)、式(Cn-6)、式(Cn-7)、式(Cn-8)、式(Cn-9)、式(Cn-10)、式(Cn-11)、式(Cn-12)、式(Cn-13)、式(Cn-14)或式(Cn-15)中任一项的缀合物，其中D是与适当的引导寡核苷酸一起施用的CRISPR蛋白，诸如Cas9，由此实现将负载有相应的引导寡核苷酸的蛋白质递送至细胞中，其中CRISPR蛋白可以发挥其基因组编辑活性。在此上下文中，引导寡核苷酸是这样的RNA或DNA的序列，其将Cas9蛋白引导至基因组DNA上的特定基因座(位置)，以便在该位点诱导双链DNA裂解，由此能够修复遗传物质中的局部缺陷。在Cas9的情况下，引导寡核苷酸是短的RNA区段，其序列与靶DNA基因座的序列互补。
因此，根据本发明实施方案的缀合物和相应的药物组合物以及相应的方法尤其在医学紊乱的治疗中可以是有益的，所述医学紊乱尤其选自癌症、毒性损伤、代谢疾病、缺血性疾病、传染性疾病、血管疾病、蛋白质贮积疾病、创伤、免疫介导的疾病或退行性疾病。
因此，在本发明的实施方案中，本发明提供了用于治疗医学紊乱的方法，所述方法包括向有相应需要的患者施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含根据式(I)、式(II)、式(III)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va’)、式(Va”)、式(Va”’)、式(Vb’)、式(Vb”)、式(Vb”’)、式(Vc’)、式(Vc”)或式(Vc”’)、式(Cn-1)、式(Cn-2)、式(Cn-3)、式(Cn-4)、式(Cn-5)、式(Cn-6)、式(Cn-7)、式(Cn-8)、式(Cn-9)、式(Cn-10)、式(Cn-11)、式(Cn-12)、式(Cn-13)、式(Cn-14)或式(Cn-15)中任一项的缀合物；其中D是对于治疗该医学紊乱有用的药物。
根据一些实施方案，医学紊乱是癌症。如本文使用的，术语“癌症”是指显示出致癌细胞(cancer-causing cell)的典型特征的特征的细胞的存在，所述致癌细胞的典型特征诸如不受控制的增殖、专门化功能的损失、永生、显著的转移潜能、抗凋亡活性的显著增加、快速生长和增殖速率、或已知与癌症相关的某些特征形态和细胞标志物。通常，癌细胞呈肿瘤的形式，局部地存在于动物中，或者作为独立的细胞(例如白血病细胞)在血流中循环。
在神经紊乱领域，根据本发明实施方案的缀合物尤其在治疗神经退行性紊乱，诸如阿尔茨海默病、运动神经元病、帕金森病、亨廷顿病、多发性硬化和克-雅病(Creutzfeldt-Jacob disease)方面可以是有用的。
在传染性疾病领域，根据本发明实施方案的缀合物尤其对于递送抗生素以对抗细菌、真菌或其他寄生物感染；或对于递送抗病毒剂以对抗病毒感染可以是有用的。因此，本发明的缀合物可以具有抗感染性质，由此对于治疗传染性疾病，诸如细菌感染或病毒感染可以是有用的。本发明的缀合物对于其可以是有用的病毒感染的实例是但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)；嗜肝病毒诸如丙型肝炎病毒(HCV)或乙型肝炎病毒(HBV)；正粘病毒科(orthomyxoviridae)诸如甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒引起的感染；或副流感病毒引起的感染。因此，本发明的实施方案是与抗病毒药物或抗细菌药物连接的一个或更多个E、E’或E”部分的缀合物。这样的药物尤其可以是基因序列，该基因序列旨在与感染物(infective agent)的遗传物质相互作用，由此干扰在所述病原体的复制、代谢、感染或存活中具有作用的遗传过程。这样的基因序列可以是专门设计成使病毒基因的表达沉默的siRNA或dsiRNA。
本发明的缀合物在对抗感染中的效用可以是在以下应用的至少一种中的效用：将治疗上有用的剂穿过生物膜递送至宿主(例如，人类患者)的细胞中；或穿过生物膜递送至病原体(例如，细菌或病毒)的细胞中。
在代谢紊乱领域，根据本发明实施方案的缀合物尤其对于递送基因治疗可以是有用的，该基因治疗旨在下调负责所述代谢紊乱的一个或更多个基因的表达；或对于施用蛋白质，以替代在疾病病因学或发病机制中具有作用的缺陷的突变蛋白质可以是有用的。
在其他实施方案中，本发明涉及利用本发明的化合物来增强化合物穿过磷脂膜递送至植物细胞中，由此有益于在农业中利用。取决于附接的化合物和期望的适应症，这样的递送可以在农业中具有多种有用的应用。例如，在植物中这样的递送可以帮助改善作物质量和数量，尤其是通过改善植物的遗传或通过根除多种昆虫、细菌或真菌来改善作物质量和数量。
实施例
现在将描述一些实施例，以便进一步说明本发明，并且以便表明本发明的实施方案可以如何在实践中实施。
实施例1：用于合成根据本发明的实施方案的缀合物的一般方法，其中D部分是寡
核苷酸：
首先，基于基因在疾病病因学或发病机制中的作用来选择待沉默的基因。然后，基于本领域已知的生物信息学方法，设计并确定待掺入缀合物中的核苷酸序列[对于RISC底物，通常是19-21个碱基对的双链siRNA；或对于Dicer底物(dsiRNA)，通常是24-29个碱基对的双链RNA]。
合成以寡核苷酸的3’至5’的方向进行。使用源自以下的被保护的结构单元应用固相合成：被保护的2’-脱氧核苷(dA、dC、dG和dT)、核糖核苷(A、C、G和U)或化学修饰的核苷，例如[LNA(锁核酸)或BNA(桥接核酸)]。结构单元作为核苷前体被提供，其中5’-羟基基团和3’-羟基基团分别被DMT和亚磷酰胺保护。在核苷酸以根据期望的核苷酸序列确定的顺序偶联至生长的寡核苷酸链的反应期间，这些基团被依次去除。
为了合成本发明的缀合物的目的，E基团作为前体分子被提供，前体分子各自是连接至如上文描述的保护基团的本发明的E、E’或E”部分。虽然保护基团可以是本领域已知的羟基的任何保护基团，但亚磷酰胺和DMT[二甲氧基三苯甲基双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基]通常用于寡核苷酸合成。本发明的缀合物的主要优点是，它们提供如上文针对式(IVa)和式(IVc)描述的将E、E’或E”部分连接至寡核苷酸链的5’末端、连接至寡核苷酸链的3’末端或连接在沿寡核苷酸的内部位置处的选项。因此，本发明的E部分可以整合在与任何固有的天然寡核苷酸结构单元类似的寡核苷酸链中。在链的组装完成后，将产物从固体支撑物释放至溶液中，脱保护并且收集。期望的缀合物然后通过高效液相色谱法(HPLC)分离，以获得高纯度的本发明的期望的缀合物。在siRNA或dsiRNA的情况下，互补的RNA链中的每一条被单独地合成，并且然后在如本领域已知的标准条件中对这两条链进行退火，以产生期望的双链siRNA或dsiRNA，然后使该双链siRNA或dsiRNA经历纯化和等分。
实施例2：用于化学合成包含本发明的E、E’或E”部分的前体分子的方法。
实施例2a：Apo-Si-K-29E-前体的合成：
2aA.酚2的合成：
在乙腈和甲醇的混合物中将雌二醇用苄基溴和碳酸钾处理。甲醇被用作助溶剂以促进溶解度，导致全部和完全的转化。在过滤并浓缩滤液之后，将粗产物(2)用于下一步。
方案1.酚2的合成
将化合物2用过量的氢化钠处理，随后添加烯丙基溴，这导致向化合物3的完全转化。用OsO4和NaIO4处理烯丙基衍生物2提供了醛4。醛4和N-甲基氨基乙醇之间的还原胺化提供了醇5，随后醇5在Mitsunobu条件下与全氟-t-BuOH反应得到化合物6。最后，苄基保护基团通过氢化被去除，以提供酚2。
2aA1.(8R,9S,13S,14S,17S)-3-苄氧基-17-羟基雌甾-1,3,5(10)-三烯(2)
将雌二醇(2.300g，1.1mol)、苄基溴(200mL，1.68mol)和碳酸钾(304g，2.2mol)在丙酮(2L)和MeOH(0.5L)中的混合物在回流加热持续18h。在室温冷却之后，将反应混合物过滤并且在真空中浓缩。将浓缩物溶解在热甲苯中，并且在减压下浓缩。将粗制材料(化合物2，508g)按原样用于下一步反应。
2aA2.(8R,9S,13S,14S,17S)-17-烯丙氧基-3-苄氧基雌甾-1,3,5(10)-三烯(3)
将氢化钠(110g，矿物油中的60％分散体，2.7mol)分批添加至粗制醇3(508g，约1.1mol)在无水THF(4L)中的溶液。在约30min之后，添加烯丙基溴(240mL，2.7mol)和四丁基碘化铵(40g，108mmol)，并且将得到的混合物在回流加热持续约18小时。允许反应混合物冷却至室温，并且用水(1L)小心地猝灭，将混合物部分地浓缩。将混合物溶解在EtOAc(1.5L)中，并且用水(3×500mL)洗涤。将有机相用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且浓缩，以提供足够纯度的粗制化合物3(550g，1.36mol)，用于下一步。
2aA3.2-(((13S,17S)-3-(苄氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十
氢-6H-环戊[a]菲-17-基)氧基)乙醛(4)
向化合物3(2.0g，5.0mmol)在乙醚(30mL)和水(30mL)中的溶液添加2,6-二甲基吡啶(1.33g，12.4mmol)、高碘酸钠(4.26g，20mmol)和OsO4在tBuOH(2mL)中的2.5％溶液。将混合物在室温搅拌持续16小时。将相分离，并且将水层用乙醚萃取两次。将合并的有机层用饱和的水性硫代硫酸钠和盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且浓缩。进一步纯化提供了醛4(1.51g，3.7mmol，作为澄清的油，75％收率)。
2aA4.2-((2-(((13S,17S)-3-(苄氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-
十氢-6H-环戊[a]菲-17-基)氧基)乙基)(甲基)氨基)乙-1-醇(5)
向化合物4(2.0g，4.9mmol)在二氯乙烷(100mL)中的溶液添加2-(甲基氨基)乙-1-醇(0.79mL，9.8mmol，2当量)并且将得到的混合物搅拌持续15分钟。然后添加AcOH(0.56mL，9.8mmol，2当量)，并且将混合物搅拌持续另外的10分钟。添加NaBH(OAc)3(4.2g，19.6mmol，4当量)并且将得到的混合物搅拌过夜。添加NaOH(1M，400mL)，将混合物振荡并且将层分离。将水层用EtOAc(2×，300mL)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且浓缩，以提供化合物5(2.4g，4.9mmol，定量收率)。
2aA5.2-(((13S,17S)-3-(苄氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十
氢-6H-环戊[a]菲-17-基)氧基)-N-(2-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)
乙基)-N-甲基乙-1-胺(6)
向醇5(2.4g，5mmol)在四氢呋喃(THF)(100mL)中的溶液添加全氟叔丁醇(0.93mL，6.5mmol，1.3当量)、PPh3(2.1g，8.0mmol，1.6当量)和偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD)(1.3mL，6.5mmol，1.3当量)，并且将得到的混合物在室温搅拌过夜。将混合物浓缩，并且将粗制材料通过柱色谱法(20％EtOAc/庚烷+1％NEt3)纯化，以提供作为缓慢固化的无色油的化合物6(2.1g，3.1mmol，62％)。
2aA6.(13S,17S)-17-(2-((2-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)
乙基)(甲基)氨基)乙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-
3-醇(酚2)
将化合物6(7.5g，11.0mmol)溶解在乙酸乙酯(EtOAc，150mL)中，并且添加10％Pd/C(900mg ABCR+900mg Merck)。将混合物在5巴氢气气氛下搅拌持续16小时。将悬浮液经短路径的硅藻土过滤并且浓缩。酚2(5.7g，9.6mmol)作为无色油被分离。
2aB.K-1-7的合成：
酚2的进一步衍生化需要结构单元K-1-7。该化合物通过使用碱性条件下将(使用9-芴基甲基N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(FmocOSu)条件下)芴基基团与硫醇附接来制备。
方案2.K-1-7的合成。
(((9H-芴-9-基)甲基)硫代)-3-甲基丁-1-醇(K-1-7)：
向3-甲基-3-硫代丁醇(13.6g，113mmol)和碳酸钠(24g，340mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(300mL)中的悬浮液添加FmocOSu(25.2g，75.4mmol)。将混合物在40℃搅拌持续2小时，然后冷却至室温。添加乙酸乙酯(200mL)和庚烷(400mL)，并且将混合物用水(3×200mL)洗涤，经硫酸钠干燥并且浓缩。使用快速色谱法(在庚烷中的30％乙酸乙酯(EtOAc))的进一步纯化以76％收率提供了作为粘性油的化合物K-1-7(17.0g，57.2mmol)。
2aC.K-29U的合成：
结构单元K-29U的合成如方案3中所示进行：
方案3.K-29U的合成。
在HNO3存在下用I2处理2-脱氧尿苷，以提供脱氧尿苷的碘代衍生物U-1。在通过柱色谱法纯化之后，使用Heck反应将碘化物U-1与甲基丙烯酸酯偶联，以提供甲酯U-2。将U-2的甲酯用NaOH水解，并且将得到的化合物U-3使用Pd/C和H2氢化以提供中间体U-4。中间体U-4和U-5(可商购)使用作为偶联试剂的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCI)偶联，以提供氯化物U-6。将氯化物U-6在升高的温度用硫代甲苯磺酸钾(PotassiumThiotosylate)处理，以提供结构单元K-29U。
2aC1.1-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-5-碘代嘧啶-2,4(1H,
3H)-二酮(U-1)：
将2-脱氧尿苷(15g，66mmol)和I2(19g，73mmol，1.1当量)溶解在CHCl3(750mL)和HNO3(水溶液，1M，150mL)的混合物中，并且将得到的紫色混合物在回流搅拌持续5小时，之后形成沉淀物。将混合物首先通过空气冷却，然后通过冰浴冷却。将冷却的混合物过滤，并且将残余物用冷CHCl3洗涤。将固体收集并且在真空中干燥，以提供作为灰白色固体的碘化物U-1(20g，57mmol，86％)。
2aC2.(E)-3-(1-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-2,4-二氧代-
1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)丙烯酸甲酯(U-2)：
将碘化物U-1(5.2g，15mmol)溶解在DMF(100mL)和TEA(4.1mL，29.4mmol，2当量)中，并且将丙烯酸甲酯(8.0mL，88.2mmol，6当量)、PPh3(0.77g，2.9mmol，0.2当量)和乙酸钯(0.33g，1.5mmol，0.1当量)添加至混合物。将得到的混合物在100℃搅拌持续4小时。将反应混合物经硅藻土过滤，并且将滤液浓缩。将粗制材料通过柱色谱法(在CH2Cl2中的10％MeOH)纯化，以提供作为缓慢结晶的橙色油的丙烯酸酯U-2(4.0g，13mmol，87％)。
2aC3.(E)-3-(1-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-2,4-二氧代-
1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)丙烯酸(U-3)：
将丙烯酸酯U-2(5.0g，16mmol)溶解在NaOH(水溶液，2M，60mL)中，并且将得到的混合物在室温搅拌持续2小时。将混合物冷却至0℃，并且添加HCl(37％)，直到混合物为约pH1(如通过pH试纸测量的)。将混合物在0℃搅拌持续1小时，之后形成沉淀。将固体通过过滤收集并且转移至烧瓶。将粗制材料与甲苯共蒸发两次，以提供作为灰白的浅棕色固体的粗产物U-3(存在大量水)(3.3g，11mmol，69％)。
2aC4.3-(1-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-2,4-二氧代-1,2,
3,4-四氢嘧啶-5-基)丙酸(U-4)
将粗制羧酸U-3(28.6g，96mmol)溶解在H2O(500mL)中。添加NaOH(10mL，10M)，直到全部溶解。添加Pd/C(10％，3g)，并且将混合物在5巴的H2下搅拌过夜。将混合物经硅藻土过滤并且浓缩，以提供黄色油(50g)。由于混合物含有盐，因此将其溶解在最少量的H2O(130mL的总体积)中，并且酸化至约pH～2(pH试纸)。将粗制混合物使用反相色谱法脱盐。将含有产物的级分汇集、浓缩并且冻干，以提供作为蓬松的白色固体的羧酸U-4(10g，33mmol，35％)。
2aC5.N-(2-(3-氯丙氧基)乙基)-3-(1-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋
喃-2-基)-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)丙酰胺(U-6)
向尿苷羧酸衍生物U-4(5.5g，18.4mmol)和胺U-5(3.2g，18.4mmol)在350mL DMF中的溶液添加TEA(10.3mL，73.5mmol，4当量)、HOBt(3.1g，20.2mmol，1.1当量)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCI，3.9g，20.2mmol，1.1当量)。将得到的悬浮液在室温搅拌持续5天，之后大多数材料溶解。将混合物在真空中浓缩。将粗制混合物通过柱色谱法[在二氯甲烷(DCM)中的7％-8％MeOH]纯化，以提供作为缓慢固化的黄色/橙色油的酰胺U-6(7.2g，17mmol，93％)。
2aC8.S-(3-(2-(3-(1-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-2,4-二
氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)丙酰胺基)乙氧基)丙基)4-甲基苯硫代磺酸酯(K-29U)
将氯化物U-6(3.6g，8.6mmol)溶解在DMF(100mL)中，并且添加TBAI(0.32g，0.86mmol)和甲苯硫代磺酸钾(2.9g，12.9mmol)。将得到的混合物在80℃搅拌持续40小时。将混合物在真空中浓缩。添加EtOAc(500mL)和H2O(300mL)，并且将层分离。将有机层用盐水洗涤。将合并的水层用EtOAc(4×250mL)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥并且浓缩。将粗制混合物使用柱色谱法(在二氯甲烷(DCM)中的3％-7％MeOH)纯化，以提供作为粘性固体的硫代甲苯磺酸酯K-29U(1.75g，3.1mmol，36％)。
2aD.完成Apo-Si-K-29E-前体的合成：
将酚2和结构单元K-1-7在Mitsunobu条件下偶联，以提供保护的硫醇K-29E-1。芴基基团可以在K-29U的存在下通过NaOMe原位去除，以提供二硫化物K-29E-2。使用如本领域已知的标准程序使用氨基磷酸酯部分附接DMT基团。
方案4.Apo-Si-K-29E-前体的合成
2aD1.2-(((13S,14S,17S)-3-(3-(((9H-芴-9-基)甲基)硫代)-3-甲基丁氧基)-
13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-17-基)氧基)-N-(2-((1,1,
1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)乙基)-N-甲基乙-1-胺(K-29E-1)
向酚2(1.47g，2.5mmol)在THF(40mL)中的溶液添加醇K-1-7(1.48g，5.0mmol)、三苯基膦(0.91g，3.5mmol)和偶氮二甲酸二异丙酯(0.6mL，2.9mmol)。将混合物在室温搅拌持续16小时。在浓缩之后，将混合物使用快速色谱法(在庚烷中的20％EtOAc和1％Et3N)进一步纯化，以便以67％收率提供作为澄清油的K-29E-1(1.5g，1.7mmol)。
2aD2.N-(6-((4-(((13S,14S,17S)-17-(2-((2-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲
基)丙-2-基)氧基)乙基)(甲基)氨基)乙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十
氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)-2-甲基丁-2-基)二硫烷基)己基)-3-(1-((2R,4S,5R)-4-羟
基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)丙酰胺(K-29E-2)
将化合物K-29E-1(1当量)和甲苯磺酸酯K-29U(1.5当量)在二氯甲烷中的溶液用在MeOH中的2M NaOMe(4当量)处理。将混合物在室温搅拌持续16小时。将混浊的悬浮液用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并且浓缩。使用闪蒸的进一步纯化提供了化合物K-29E-2。
2aD3.3-(1-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基四
氢呋喃-2-基)-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)-N-(6-((4-(((13S,14S,17S)-17-
(2-((2-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)乙基)(甲基)氨基)乙氧基)-
13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)-2-甲基丁-2-
基)二硫烷基)己基)丙酰胺(K-29E-3)
向K-29E-2(1当量)在吡啶中的溶液添加DMT-Cl(2当量)和DMAP(0.1当量)，并且将得到的混合物在室温搅拌过夜，之后将混合物浓缩。将残余物使用柱色谱法纯化，以提供化合物K-29E-3。
2aD4.3-(1-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(((2-
氰基乙基)(二异丙基氨基)膦基)氧基)四氢呋喃-2-基)-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-
5-基)-N-(6-((4-(((13S,14S,17S)-17-(2-((2-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-
基)氧基)乙基)(甲基)氨基)乙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环
戊[a]菲-3-基)氧基)-2-甲基丁-2-基)二硫烷基)己基)丙酰胺(Apo-Si-K29E-前体)
向化合物K-29E-3(1当量)在二氯甲烷中的溶液添加2-氰基乙基-N,N,N′,N′-四异丙基亚磷酰二胺(1.3当量)，随后逐滴添加0.5M的N-甲基吗啉和0.25M的三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液(1.3当量的N-甲基吗啉至亚磷酰二胺剂)。将得到的混合物在室温搅拌持续2小时，然后用饱和的水性碳酸氢钠猝灭，并且继续搅拌持续另外10分钟。将有机层分离，经硫酸钠干燥并且浓缩。使用快速色谱法的进一步纯化提供了化合物Apo-Si-K-29E-前体。
实施例2b：Apo-Si-K-29D-前体的合成：
2bA.酚1的合成：
方案1.酚1的合成。
将雌二醇用过量的氢化钠处理，随后添加烯丙基溴，这导致向化合物3的完全转化。随后用1.5当量的9-BBN的硼氢化仅产生末端羟基基团，而用BH3的硼氢化选择性低得多，并且提供加合物的混合物。将醇5置于Mitsunobu反应条件，以使其与全氟化叔丁醇偶联，以得到化合物6。化合物8的苄基基团的氢解提供了酚1。总之，酚1由雌二醇经由5个合成步骤以45％总收率制备。
2bA1.(8R,9S,13S,14S,17S)-3-苄氧基-17-羟基雌甾-1,3,5(10)-三烯(2)：
(8R,9S,13S,14S,17S)-3-苄氧基-17-羟基雌甾-1,3,5(10)-三烯(2)的合成在上文第2aA1节中公开。
2bA2.(8R,9S,13S,14S,17S)-17-烯丙氧基-3-苄氧基雌甾-1,3,5(10)-三烯(3)：
(8R,9S,13S,14S,17S)-17-烯丙氧基-3-苄氧基雌甾-1,3,5(10)-三烯(3)的合成在上文第2aA2节中公开。
2bA3.(8R,9S,13S,14S,17S)-3-苄氧基-17-(3-羟基丙氧基)雌甾-1,3,5(10)-三
烯(7)：
在0℃将9-硼双环[3.3.1]壬烷(800mL，在THF中的0.5M溶液，稳定化的，400mmol)逐滴添加至粗制烯烃3(101.2g，251mmol)在THF(1L)中的溶液，并且在完全添加后，将混合物在室温搅拌过夜。将溶液冷却至0℃，并且同时缓慢地逐滴添加30％水性NaOH(150mL，1.3mol)和35％水性NaOH(120mL，1.3mol)，并且将得到的非均相混合物在室温剧烈搅拌持续约1h。然后将反应混合物在EtOAc(2L)和盐水(500mL)之间分配。将有机相用另外的500mL盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。以类似方式重复该程序，并且将两部分合并。通过快速色谱法(硅胶，梯度在庚烷中的25％至35％EtOAc)的浓缩物的进一步纯化以61％收率提供了作为白色固体的醇5(130g，310mmol)(3步)。
2bA4.(8R,9S,13S,14S,17S)-3-苄氧基-17-[3-(全氟叔丁氧基)丙氧基]雌甾-1,
3,5(10)-三烯(8)：
在氮气气氛下将偶氮二甲酸二异丙酯(80mL，407mmol)逐滴添加至醇7(130g，301mmol)、三苯基膦(162g，618mmol)、全氟叔丁醇(70mL，497mmol)在干燥THF(2L)中的搅拌的混合物。将混合物在室温搅拌持续约18h。将反应混合物部分地浓缩，并且添加庚烷(1L)。在完全去除THF之后，沉淀开始。使用过滤去除固体，并且将滤液浓缩。添加乙腈(1.5L)，并且将混合物搅拌持续30分钟，同时沉淀开始。将固体经由过滤收集并且在真空中干燥。化合物8(160g，251mmol)以81％收率作为白色固体被分离。
2bA5.(8R,9S,13S,14S,17S)-3-羟基-17-[3-(全氟叔丁氧基)丙氧基]雌甾-1,3,5
(10)-三烯(酚1)
用在EtOAc(1L)中的苄基醚8(160g，251mmol)装载Parr容器，向其中添加10％碳载钯(4g)。将混合物在室温在氢气压力(5巴)下搅拌。用1H NMR监测反应。在约72h之后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤(用EtOAc冲洗)，并且与新鲜的10％炭载钯(4g)一起重置于氢气气氛(5巴)。在约16h之后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤(用EtOAc冲洗)并且浓缩，以便以91％收率提供作为灰色固体的酚1(125g，228mmol)。
2bB.K-29U的合成：
结构单元K-29U的合成在上文第2aC(2aC1-2aC8)节中描述。
2bC.Apo-Si-K-29D-前体的合成的完成：
合成开始于Boc保护的甲基氨基乙醇和酚1之间的Mitsunobu偶联。该偶联提供约50％的转化。然而，使用柱色谱法分离产物(K-29C-1)，并且可以回收起始材料。使用TFA去除Boc基团允许随后使用NaBH(OAc)3进行还原胺化，一种允许存在胺的酸保护的方法。然后进行使用硫代乙酸酯的原位脱保护来形成二硫化物，随后使用如本领域已知的标准程序附接DMT基团和氨基磷酸酯部分。
方案5.Apo-Si-K-29D-前体的合成
2bC1.(2-(((8R,9S,13S,14S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)
丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-
基)氧基)乙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(K-29C-1)
向酚1(50g，91mmol)和Boc N-甲基乙醇胺(32g，182mmol)的溶液添加PPh3(38g，146mmol)，并且将得到的混合物搅拌直到全部溶解。添加DIAD(23mL，118mmol)，并且将得到的混合物搅拌64h。将混合物浓缩并且添加庚烷。将得到的沉淀过滤掉，并且将滤液浓缩。将粗制材料使用柱色谱法(10％EtOAc/庚烷与0.1％TEA)纯化(三次)。将纯的级分汇集并浓缩，并且提供化合物K-29C-1(51g，73mmol，80％)以及回收酚1(5g，9.5mmol，10％)。
2bC2.2-(((8R,9S,13S,14S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-
2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)
氧基)-N-甲基乙-1-胺(K-29C-2)
将化合物K-29C-1(5.6g，7.9mmol)溶解在EtOAc(100mL)中的2M HCl中，并且将得到的溶液搅拌过夜。添加水性NaOH(2M，150mL)，并且剧烈搅拌直到全部溶解。将层分离，并且将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并且浓缩以提供作为粉红色油状物质的K-29C-2(4.5g，7.4mmol，94％)。
2bC3.S-(2-甲基-4-氧代丁-2-基)硫代乙酸酯(K-5)
在0℃向二甲基丙烯醛(25mL，435mmol)和硫代乙酸(44mL，608mmol，1.4当量)的混合物逐滴添加TEA(31mL，435mmol)。将得到的混合物在室温搅拌过夜。添加EtOAc和NaOH(1M)。将层分离，并且将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且浓缩。将粗制材料通过柱色谱法(在庚烷中的10％EtOAc)纯化，以提供作为黄色油的K-5(22g，137mmol，32％)。
2bC4.S-(4-((2-(((8R,9S,13S,14S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟
甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]
菲-3-基)氧基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲基丁-2-基)硫代乙酸酯(K-29C-3)
向K-29C-2(2.0g，3.3mmol)在二氯乙烷(100mL)中的溶液添加Z-8-1(1.1g，6.6mmol，2当量)、乙酸(0.57mL，9.9mmol，3当量)和NaBH(OAc)3(2.1g，9.9mmol，3当量)，并且将得到的混合物搅拌持续4h。添加NaHCO3(饱和，500mL)，并且将混合物用CH2Cl2(3×，200mL)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且浓缩。将粗制材料使用柱色谱法(在庚烷中的30％EtOAc+0.1％NEt3)纯化，以提供K-29C-3(1.1g，1.5mmol，44％)。
2bC4.N-(6-((4-((2-(((13S,14S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲
基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-
3-基)氧基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲基丁-2-基)二硫烷基)己基)-3-(1-((2R,4S,5R)-4-羟
基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)丙酰胺(K-29C-4)
将化合物K-29C-3(1当量)和甲苯磺酸酯K-29U(1.5当量)在二氯甲烷中的溶液用在MeOH中的2M NaOMe(4当量)处理。将混合物在室温搅拌持续16小时。将混浊的悬浮液用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并且浓缩。使用闪蒸的进一步纯化提供化合物K-29C-4。
2bC5.3-(1-((2R,4S,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基四
氢呋喃-2-基)-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)-N-(6-((4-((2-(((13S,14S,17S)-
17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,
12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲基丁-2-基)
二硫烷基)己基)丙酰胺(K-29C-5)
向K-29C-4(1当量)在吡啶中的溶液添加DMT-Cl(2当量)和DMAP(0.1当量)，并且将得到的混合物在室温搅拌过夜，之后将混合物浓缩。将粗制材料使用柱色谱法纯化，以提供化合物K-29C-5。
2bC6.(2R,3S,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(5-(3-((6-
((4-((2-(((13S,14S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙
氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)乙基)(甲
基)氨基)-2-甲基丁-2-基)二硫烷基)己基)氨基)-3-氧代丙基)-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧
啶-1(2H)-基)四氢呋喃-3-基(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺(Apo-Si-K29D-前体)
向化合物K-29C-5(1当量)在二氯甲烷中的溶液添加2-氰基乙基-N,N,N′,N’-四异丙基亚磷酰二胺(1.3当量)，随后逐滴添加0.5M的N-甲基吗啉和0.25M的三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液(1当量的N-甲基吗啉至亚磷酰二胺剂)。将得到的混合物在室温搅拌持续2小时，然后用饱和的水性碳酸氢钠猝灭，并且继续搅拌持续另外10分钟。将有机层分离，经硫酸钠干燥并且浓缩。使用快速色谱法的进一步纯化提供化合物Apo-Si-K-29D-前体。
实施例2c：Apo-Si-K-18-前体的合成：
2cA.酚2的合成：
酚2的合成在上文第2aA(2aA1-2aA6)节中描述。
2cB.K-1-7的合成：
结构单元K-1-7的合成在上文第2aB(2aA1-2aA6)节中描述。
2cC.K-6的合成：
最后的结构单元K-6通过硫代甲苯磺酸钾对氯己醇的取代反应来制备。
方案3.K-6的合成。
S-(6-羟己基)4-甲基硫代苯磺酸酯(K-6)
将3-氯己-1-醇(5.0mL，36.6mmol)溶解在二甲基甲酰胺(DMF，150mL)中，并且添加对甲苯硫代磺酸钾(KST，12.4g，54.9mmol，1.5当量)和四丁基碘化铵(TBAI，1.35g，3.66mmol，0.1当量)。将得到的混合物在80℃搅拌过夜。添加H2O(500mL)和EtOAc/庚烷(800mL，1/1，v/v)。将层分离，并且将有机层用H2O(300mL)和盐水(300mL)洗涤，经Na2SO4干燥并且浓缩，以提供作为澄清油的K-6(9.0g，31.2mmol，85％)。
2cD.Apo-Si-K-18-前体的合成的完成：
从酚2开始完成Apo-Si-K-18的合成在方案4中示出。使用Mitsunobu条件将结构单元K-1-7偶联至酚2。在将硫上的芴基保护基团脱保护的一些初始测试之后，发现在K-6的存在下，K-18-1可以原位脱保护以形成二硫化物K-18-2。
方案4.Apo-Si-K-18-前体的合成。
使用合适的亚磷酰二胺剂最终附接氨基磷酸酯直接获得Apo-Si-K-18。在用Et3N失活后，实现使用快速色谱法的该材料的纯化，之后暴露于酸不稳定的氨基磷酸酯。
总之，以合理的总收率从雌二醇从酚2以11步制备化合物Apo-Si-K-18(2×350mg)。
2cD1.2-(((13S,14S,17S)-3-(3-(((9H-芴-9-基)甲基)硫代)-3-甲基丁氧基)-
13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-17-基)氧基)-N-(2-((1,1,
1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)乙基)-N-甲基乙-1-胺(K-18-1)
向酚2(1.47g，2.5mmol)在THF(40mL)中的溶液添加醇K-1-7(1.48g，5.0mmol)、三苯基膦(0.91g，3.5mmol)和偶氮二甲酸二异丙酯(0.6mL，2.9mmol)。将混合物在室温搅拌持续16小时。在浓缩之后，将混合物使用快速色谱法(在庚烷中的20％EtOAc和1％Et3N)进一步纯化，以便以67％收率提供作为澄清油的K-18-1(1.5g，1.7mmol)。
2cD2.6-((4-(((13S,14S,17S)-17-(2-((2-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)
丙-2-基)氧基)乙基)(甲基)氨基)乙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-
6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)-2-甲基丁-2-基)二硫烷基)己-1-醇(K-18-2)
将化合物K-18-1(400mg，0.45mmol)和甲苯磺酸酯K-6(388mg，1.34mmol)在二氯甲烷(15mL)中的溶液用在MeOH中的2M NaOMe(0.9mL，1.8mmol)处理。将混合物在室温搅拌持续16小时。将混浊的悬浮液用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并且浓缩。使用快速色谱法(在庚烷中的30％至40％EtOAc+1％Et3N)的进一步纯化以59％收率提供作为无色油的化合物K-18-2(220mg，0.27mmol)。
2cD3.2-氰基乙基(6-((4-(((8R,9S,13S,14S,17S)-17-(2-((2-((1,1,1,3,3,3- 六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)乙基)(甲基)氨基)乙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13, 14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)-2-甲基丁-2-基)二硫烷基)己基)二异丙基 亚磷酰胺(Apo-Si-K-18-前体)。
向化合物K-18-2(656mg，0.79mmol)在二氯甲烷(25mL)中的溶液添加2-氰基乙基-N,N,N′,N′-四异丙基亚磷酰二胺(0.31mL，1mmol)，随后逐滴添加0.5M的N-甲基吗啉和0.25M的三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液(2.1mL，1当量的N-甲基吗啉至亚磷酰二胺剂)。将黄色溶液在室温搅拌持续2小时，然后用饱和的水性碳酸氢钠猝灭，并且继续搅拌持续另外10分钟。将有机层分离，经硫酸钠干燥并且浓缩。使用快速色谱法(在庚烷中的30％EtOAc和1％Et3N)的进一步纯化以59％收率提供作为澄清油的化合物Apo-Si-K-18-前体(480mg，0.47mmol)。此外，以29％收率回收起始材料K-18-2(193mg，0.23mmol)。
实施例2d：Apo-Si-K-13-前体的合成：
2dA.酚1的合成：
酚1的合成在上文第2bA(2bA1-2bA5)节中描述。
2dB.Apo-Si-K-13-前体的合成的完成：
酚1使用Mitsunobu反应条件偶联至Boc保护的甲基氨基乙醇，以中等收率(43％)提供化合物K-13-1。使用三氟乙酸(TFA)去除Boc基团给出作为TFA盐的K-13-2，其用于随后使用三乙酰氧基硼氢化钠作为还原剂的与K-5的还原胺化。纯产物的收率相当低，这是由于乙酸酯从硫醇转移至胺，阻断了部分底物进一步反应成期望的产物。
将在甲醇中的甲醇钠添加至K-13-3和K-6的溶液，这从K-13-3中去除乙酸酯，允许得到的硫醇与K-6反应以形成期望的硫桥。化合物K-13-4与合适的亚磷酰胺剂反应，以提供Apo-Si-K-13-前体。酸不稳定的亚磷酰胺产物的纯化使用快速色谱法用已经被Et3N预处理的二氧化硅完成。
总之，由酚1以五步制备化合物Apo-Si-K-13-前体(622mg)。酚1由雌二醇经由5个合成步骤以45％总收率制备。
方案2.Apo-Si-K-13-前体的合成
2dB1.(2-(((8R,9S,13S,14S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基) 丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)乙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(K-13-1)：
向酚1(23.4g，42.7mmol)在THF(600mL)中的溶液添加三苯基膦(26g，100mmol)、(2-羟乙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(9.8g，61mmol)和逐滴的DIAD(12mL，61mmol)。将混合物在室温搅拌持续16小时。将黄色溶液部分地浓缩，添加庚烷，并且将溶液进一步浓缩以去除所有痕量的THF。将得到的沉淀物过滤掉，并且将滤液浓缩。使用快速色谱法(梯度为在庚烷中的5％至7％EtOAc)的进一步纯化以43％收率提供作为黄色油的化合物K-13-1(13.05g，18.5mmol)。
2dB2.S-(4-((2-(((8R,9S,13S,14S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟
甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]
菲-3-基)氧基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲基丁-2-基)硫代乙酸酯(K-13-3)：
将化合物K-13-1(13.05g，18.5mmol)的溶液溶解在二氯甲烷(65mL)中，并且添加三氟乙酸(40mL)。在将混合物搅拌持续2小时之后，停止鼓泡。将混合物浓缩并且按原样使用。将残余物溶解在1,2-二氯乙烷(400mL)中，并且添加乙酸(5mL，75mmol)、醛K-5(6g，37mmol)，并且继续搅拌持续5分钟。然后，添加三乙酰氧基硼氢化钠(16g，75mmol)，并且将混合物在室温搅拌持续16小时。将混合物用1M NaOH和盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且浓缩。进一步纯化以22％收率提供作为澄清黄色油的化合物K-13-3(3.0g，4mmol)。
2dB3.S-(6-羟己基)4-甲基硫代苯磺酸酯(K-6)：
将3-氯己-1-醇(5.0mL，36.6mmol)溶解在DMF(150mL)中，并且添加KST(12.4g，54.9mmol，1.5当量)和TBAI(1.35g，3.66mmol，0.1当量)。将得到的混合物在80℃搅拌过夜。添加H2O(500mL)和EtOAc/庚烷(800mL，1/1，v/v)。将层分离，并且将有机层用H2O(300mL)和盐水(300mL)洗涤，经Na2SO4干燥并且浓缩，以提供作为澄清油的K-6(9.0g，31.2mmol，85％)。
2dB4.6-((4-((2-(((8R,9S,13S,14S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟 甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a] 菲-3-基)氧基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲基丁-2-基)二硫烷基)己-1-醇(K-13-4)：
将化合物K-13-3(1g，1.34mmol)和甲苯磺酸酯K-6(770mg，2.7mmol)在二氯甲烷(30mL)中的溶液用在MeOH中的2M NaOMe(2mL，4mmol)处理。将混合物在室温搅拌持续16小时。将混浊的悬浮液用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并且浓缩。使用快速色谱法(在庚烷中的30％EtOAc+1％Et3N)的进一步纯化以58％收率提供作为无色油的化合物K-13-4(650mg，0.77mmol)。
2dB5.2-氰基乙基(6-((4-((2-(((8R,9S,13S,14S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3- 六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十 氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲基丁-2-基)二硫烷基)己基)二异丙 基亚磷酰胺(Apo-Si-K-13-前体)：
向化合物K-13-4(650mg，0.77mmol)在二氯甲烷(25mL)中的溶液添加2-氰基乙基-N,N,N′,N′-四异丙基亚磷酰二胺(0.3mL，1mmol)，并且逐滴添加0.5M的N-甲基吗啉和0.25M的三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液(2mL，1当量的N-甲基吗啉至亚磷酰胺剂)。将黄色溶液在室温搅拌持续2小时。然后，将反应混合物用饱和的水性碳酸氢钠猝灭，并且继续搅拌持续另外10分钟。将有机层分离，经硫酸钠干燥并且浓缩。使用快速色谱法(在庚烷中的30％EtOAc和1％Et3N)的进一步纯化以78％收率提供作为澄清油的化合物Apo-Si-K-13(622mg，0.60mmol)。
实施例2e：Apo-Si-K-40-前体的合成：
2eA.酚2的合成：
酚2的合成在上文第2aA(2aA1-2aA6)节中描述。
2eB.K-1-7的合成：
结构单元K-1-7的合成在上文第2aB(2aA1-2aA6)节中描述。
2eC.K-40-2的合成：
方案3：K-40-2的合成
2eC1.2-(6-氯己基)丙二酸二乙酯(K-40-5)
向NaH(2.6g，66mmol，1当量)在DMF(300mL)中的冰冷悬浮液逐滴添加丙二酸二乙酯(20mL，131mmol，2当量)。在添加完成之后，移除冰浴，并且将混合物搅拌持续1小时，同时升温至室温。混合物已经变成澄清溶液。将混合物冷却至0℃并且逐滴添加1-溴-6-氯己烷(9.8mL，66mmol，1当量)。将得到的混合物在0℃搅拌持续1小时，并且在室温搅拌持续另外3小时。将反应用浓HCl(3mL)和H2O(500mL)猝灭。将反应混合物用EtOAc/庚烷(1/1，v/v，3×400mL)萃取。将合并的有机物用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并且浓缩。将粗制材料使用柱色谱法(在庚烷中的5％EtOAc)纯化，以提供作为澄清油的K-40-5(9.7g，35mmol，53％)。
2eC2.2-(6-氯己基)丙-1,3-二醇(K-40-6)
在30分钟内向LiAlH4(2.6g，70mmol)在Et2O(250mL)中的冰冷悬浮液逐滴添加K-40-5(9.7g，35mmol)的溶液，同时保持温度低于10℃。在添加完成之后，将反应混合物在0℃搅拌持续2小时。将反应用H2O(5mL)、NaOH(水性，30％，2.5mL)和H2O(12mL)按此顺序猝灭。将得到的混合物在室温搅拌持续1小时，之后形成不溶性白色沉淀物。将沉淀物过滤掉，并且将滤液浓缩，以提供作为无色油的K-40-6(6.1g，31mmol，90％)。
2eC3.S-(8-羟基-7-(羟甲基)辛基)4-甲基硫代苯磺酸酯(K-40-2)
将氯化物K-40-6(6.1g，31mmol)溶解在DMF(200mL)中，并且添加硫代甲苯磺酸钾(10.7g，47mmol，2当量)和TBAI(1.2g，3.1mmol，0.1当量)。将得到的混合物在80℃搅拌持续24小时，之后将其在真空中浓缩。将粗制材料使用柱色谱法(7:3EtOAc:庚烷)纯化，以提供主要含有产物的一种级分(5.6g)以及含有产物和起始材料两者的第二级分(3.3g)。将后一级分溶解在DMF(100mL)中，并且添加硫代甲苯磺酸钾(4.5g，20mmol)和TBAI(0.37g，1.0mmol)。将得到的混合物在80℃搅拌持续24小时，并且添加EtOAc(350mL)和庚烷(350mL)。将有机物用H2O(500mL)和盐水(250mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并且浓缩。将粗制材料与来自第一柱的含产物的级分合并，并且将粗制材料使用柱色谱法(7:3EtOAc:庚烷)纯化，以提供作为粉红色油的K-40-2(8.2g，24mmol，75％)。
2eD.Apo-Si-K-40-前体的合成的完成：
将酚2和结构单元K-1-7在Mitsunobu条件下偶联，以提供保护的硫醇K-40-1。芴基基团在K-40-2的存在下通过NaOMe原位去除，以提供二硫化物K-40-3。最后，附接DMT保护基团和亚磷酰胺基团以提供最终的化合物Apo-Si-K-40-前体：
2eD1.2-(((13S,14S,17S)-3-(3-(((9H-芴-9-基)甲基)硫代)-3-甲基丁氧基)-
13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-17-基)氧基)-N-(2-((1,1,
1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)乙基)-N-甲基乙-1-胺(K-40-1)
向酚2(1.47g，2.5mmol)在THF(40mL)中的溶液添加醇K-1-7(1.48g，5.0mmol)、三苯基膦(0.91g，3.5mmol)和偶氮二甲酸二异丙酯(0.6mL，2.9mmol)。将混合物在室温搅拌持续16小时。在浓缩之后，将混合物使用快速色谱法(在庚烷中的20％EtOAc和1％Et3N)进一步纯化，以便以67％收率提供作为澄清油的K-40-1(1.5g，1.7mmol)。
2eD2.2-(6-((4-(((13S,17S)-17-(2-((2-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)
丙-2-基)氧基)乙基)(甲基)氨基)乙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-
6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)-2-甲基丁-2-基)二硫烷基)己基)丙-1,3-二醇(K-40-3)
将化合物K-40-1(1当量)和甲苯磺酸酯K-40-2(1.5当量)在二氯甲烷中的溶液用在MeOH中的2M NaOMe(4当量)处理。将混合物在室温搅拌持续16小时。将混浊的悬浮液用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并且浓缩。使用闪蒸的进一步纯化提供化合物K-40-3。
2eD3.2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-8-((4-(((13S,17S)-17-(2-
((2-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)乙基)(甲基)氨基)乙氧基)-13-甲
基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)-2-甲基丁-2-基)二硫
烷基)辛-1-醇(K-40-4)
向K-40-3(1当量)在吡啶中的溶液添加DMT-Cl(2当量)和DMAP(0.1当量)，并且将得到的混合物在室温搅拌过夜，之后将混合物浓缩。将残余物使用柱色谱法纯化，以提供化合物K-40-4。
2eD4.2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-8-((4-(((13S,17S)-17-(2-
((2-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)乙基)(甲基)氨基)乙氧基)-13-甲
基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)-2-甲基丁-2-基)二硫
烷基)辛基(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺(Apo-Si-K40-前体)
向化合物K-40-4(1当量)在二氯甲烷中的溶液添加2-氰基乙基-N,N,N′,N′-四异丙基亚磷酰二胺(1.3当量)，随后逐滴添加0.5M的N-甲基吗啉和0.25M的三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液(1.3当量的N-甲基吗啉至亚磷酰二胺剂)。将得到的混合物在室温搅拌持续2小时，然后用饱和的水性碳酸氢钠猝灭，并且继续搅拌持续另外10分钟。将有机层分离，经硫酸钠干燥并且浓缩。使用快速色谱法的进一步纯化提供化合物Apo-Si-K-40-前体。
实施例2f：Apo-Si-K-43-前体的合成：
Apo-Si-K-43-前体
2fA.酚1的合成：
酚1的合成在上文第2aA(2aA1-2aA6)节中描述。
2fB.结构单元K-43-4的合成：
结构单元K-43-4的合成
使丙二酸二乙酯与氢化钠和溴氯己烷反应，以提供烷基化产物K-43-7。用氢化铝锂处理将二酯还原成二醇K-43-8。使化合物K-43-8与硫代甲苯磺酸钾反应，以提供期望的结构单元K-43-4。
2fB1.2-(6-氯己基)丙二酸二乙酯(K-43-7)
向NaH(2.6g，66mmol，1当量)在DMF(300mL)中的冰冷悬浮液逐滴添加丙二酸二乙酯(20mL，131mmol，2当量)。将得到的混合物搅拌持续1小时，同时升温至室温。将混合物冷却至0℃，并且缓慢添加1,6-溴氯己烷(9.8mL，66mmol，1当量)。将得到的混合物在0℃搅拌持续1小时，并且在室温搅拌持续3小时。将反应用HCl(2M，3mL)猝灭，并且添加水(500mL)。将混合物用EtOAc/庚烷(1/1，v/v，3×400mL)萃取，并且将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且浓缩。通过柱色谱法(在庚烷中的5％EtOAc)的进一步纯化提供作为澄清油的化合物K-43-7(9.7g，34.8mmol，53％)。
2fB2.2-(6-氯己基)丙-1,3-二醇(K-43-8)
向LiAlH4(2.6g，70mmol，2当量)在乙醚(200mL)中的冰冷悬浮液缓慢添加K-43-7(9.7g，35mmol，1当量)在乙醚(50mL)中的溶液，同时保持混合物的温度低于10℃。将得到的混合物在0℃搅拌持续2小时，之后将反应通过添加水(5mL)、NaOH(30％水溶液，2.5mL)和水(12mL)(按此顺序)猝灭。将得到的混合物在室温搅拌持续1小时，之后将形成的固体过滤掉。将滤液在真空中浓缩，以提供作为无色油的化合物K-43-8(6.1g，31mmol，90％)。
2fB3.S-(8-羟基-7-(羟甲基)辛基)4-甲基硫代苯磺酸酯(K-43-4)
向K-43-8(6.1g，31mmol)在DMF(200mL)中的溶液添加硫代甲苯磺酸钾(11g，47mmol，1.5当量)和TBAI(1.2g，3.1mmol)。将得到的混合物在80℃搅拌过夜，之后将混合物浓缩。通过柱色谱法的纯化提供作为粉红色油的K-43-4(5.6g，16mmol，52％)。
2fC.Apo-Si-K-43-前体的合成的完成
酚1使用Mitsunobu反应条件偶联至Boc保护的甲基氨基乙醇，以中等收率(43％)提供化合物K-13-1。使用TFA去除Boc基团给出作为TFA盐的K-13-2，其用于随后使用三乙酰氧基硼氢化钠作为还原剂的与K-5的还原胺化。
Apo-Si-K-43的合成
将在甲醇中的甲醇钠添加至K-43-3和K-43-4的溶液，这从K-43-3中去除乙酸酯，允许得到的硫醇与K-43-4反应以形成期望的硫桥。使化合物K-43-5与DMT-Cl反应，以提供单保护的二醇K-43-6。与合适的亚磷酰胺剂的反应提供Apo-Si-K-43前体(1.6g)。酸不稳定的亚磷酰胺产物的纯化使用快速色谱法用已经被Et3N预处理的二氧化硅完成。
2fC1.(2-(((8R,9S,13S,14S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)
丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-
基)氧基)乙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(K-43-1)
向酚1(23.4g，42.7mmol)在THF(600mL)中的溶液添加三苯基膦(26g，100mmol)、(2-羟乙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(9.8g，61mmol)和逐滴的DIAD(12mL，61mmol)。将混合物在室温搅拌持续16小时。将黄色溶液部分地浓缩，添加庚烷，并且将溶液进一步浓缩以去除所有痕量的THF。将得到的沉淀物过滤掉，并且将滤液浓缩。使用快速色谱法(梯度为在庚烷中的5％至7％EtOAc)的进一步纯化以43％收率提供作为黄色油的化合物K-43-1(13.05g，18.5mmol)。
2fC2.SS-(4-((2-(((8R,9S,13S,14S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟
甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]
菲-3-基)氧基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲基丁-2-基)硫代乙酸酯(K-43-3)
将化合物K-43-1(13.05g，18.5mmol)的溶液溶解在二氯甲烷(65mL)中，并且添加三氟乙酸(40mL)。在将混合物搅拌持续2h之后，停止鼓泡。将混合物浓缩并且按原样使用。将残余物溶解在1,2-二氯乙烷(400mL)中，并且添加乙酸(5mL，75mmol)、醛K-5(6g，37mmol)，并且继续搅拌持续5min。然后，添加三乙酰氧基硼氢化钠(16g，75mmol)，并且将混合物在室温搅拌持续16h。将混合物用1M NaOH和盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且浓缩。进一步纯化以22％收率提供作为澄清黄色油的化合物K-43-3(3.0g，4mmol)。
2fC3.2-(6-((4-((2-(((8R,9S,13S,14S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-
(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环
戊[a]菲-3-基)氧基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲基丁-2-基)二硫烷基)己基)丙-1,3-二醇(K-
43-5)
将化合物K-43-3(2.2g，2.9mmol)和甲苯磺酸酯K-43-4(1.5g，4.4mmol)在甲醇(100mL)中的溶液用在MeOH中的5.4M NaOMe(1.6mL，8.7mmol)处理。将混合物在室温搅拌持续2h。将混合物用NaHCO3和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，并且浓缩。使用快速色谱法(在庚烷中的20％-30％丙酮+1％Et3N)的进一步纯化以50％收率提供作为无色油的化合物K-43-5(1.3g，1.5mmol)。
2fC4.2-((双(4-甲氧基苯基
)(苯基)甲氧基)甲基)-8-((4-((2-(((8R,9S,13S,
14S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,
8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲基
丁-2-基)二硫烷基)辛-1-醇(K-43-6)
向K-43-5(1.3g，1.5mmol，1当量)的溶液添加Et3N(0.2mL，1.5mmol，1当量)和DMAP(17mg，0.15mmol，0.1当量)。向得到的混合物添加DMT-Cl(0.49g，1.5mmol，1当量)。将得到的橙色混合物在室温搅拌过夜，之后其变为黄色。添加甲醇(30mL)，并且将混合物搅拌持续1小时，之后将其浓缩。通过柱色谱法(在庚烷中的20％丙酮和1％Et3N)的纯化提供作为黄色油的化合物K-43-6(1.5g，1.3mmol，86％)。
2fC5.2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-8-((4-((2-(((8R,9S,13S,
14S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,
8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲基
丁-2-基)二硫烷基)辛基(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺(Apo-Si-K-43-前体)。
向化合物K-43-6(1.5g，1.25mmol)在二氯甲烷(25mL)中的溶液添加2-氰基乙基-N,N,N′,N′-四异丙基亚磷酰二胺(0.51mL，1.6mmol，1.3当量)，以及0.5M的N-甲基吗啉和0.25M的三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液(3.3mL，1当量的N-甲基吗啉至亚磷酰胺剂)。将黄色溶液在室温搅拌持续2h。TLC(在庚烷中的20％丙酮和1％Et3N)示出不完全转化，因此添加另外的0.5当量的2-氰基乙基-N,N,N′,N′-四异丙基亚磷酰二胺。将得到的混合物在室温搅拌持续1小时。然后，将反应混合物用饱和的水性碳酸氢钠猝灭。将有机层分离，经硫酸钠干燥并且浓缩。使用快速色谱法(在庚烷中的10％丙酮和1％Et3N)的进一步纯化以91％收率提供作为浅黄色油的化合物Apo-Si-K-43-前体(1.6g，1.1mmol)。
实施例2g：Apo-Si-K-63-前体；式(PP-3)的合成：
Apo-Si-K-63-前体；式(PP-3)
Apo-Si-K-63-前体的结构与Apo-Si-K-43-前体的结构非常类似，唯一的区别是6个碳原子的片段，直链烃。因此，合成非常类似于实施例2f中描述的Apo-Si-K-43-前体的合成。
2gA.酚1的合成：
酚1的合成在上文第2aA(2aA1-2aA6)节中描述。
2gB.结构单元K-43-4的合成：
结构单元K-43-4的合成在上文第2fB(2fB1-2fB3)节中描述。
2gC.直链烃片段：1,6-二溴己烷是可商购的。
2gD.Apo-Si-K-63-前体；式(PP-3)的合成的完成：
实施例3：本发明的E部分在寡核苷酸链内的内部位置处的连接模式：
例示了具有如式(Va’P)中阐明的结构的E部分的前体。起初，E部分呈其保护的形式，在脱氧核糖部分的3’位和5’位分别具有4,4′-二甲氧基三苯甲基(DMT)和亚磷酰胺基团：
寡核苷酸链内的整合以类似于常规寡核苷酸合成中任何核苷结构单元的掺入的方式来进行，导致由此产生的如图2中描述的构型。
实施例4：细胞质中E部分的氧化还原介导的脱离和去除，以释放货物药物(例如，
siRNA)：
尽管siRNA或dsiRNA缀合物的跨膜通过需要如上文描述的至少一个E、E’或E”部分，但一旦缀合物到达细胞质，则期望去除这些部分，并且将它们从身体排出。在货物药物是siRNA或dsiRNA的情况下，这种裂解有益于避免siRNA或dsiRNA与基因沉默蛋白复合物(Dicer和RISC)的相互作用中的空间问题。此外，货物药物与E部分的这样的脱离将使细胞磷脂膜上的缀合物的负担最小化，这从安全性角度来看是有利的。为此，本发明的E部分包含二硫化物部分。在氧化条件下，诸如在细胞外环境中占优势的那些条件下，二硫化物是稳定的，并且因此能够使得缀合物在其体内全身施用后分布在身体内，并且穿过细胞磷脂膜进入细胞。相比之下，细胞质主要由于其高浓度的还原型谷胱甘肽而是高度还原性环境，所述还原型谷胱甘肽在任何活细胞的细胞质中不断产生，在细胞质和细胞外空间之间达到约四个数量级的浓度梯度。由于细胞质中这些显著的还原条件，E部分的二硫化物基团在细胞质环境中经历稳健的还原。因此，存在货物药物(例如，dsiRNA)的释放，以在细胞质中的其靶位点处(例如，在用于基因沉默的Dicer或RISC蛋白复合物处)发挥其药理作用。同时，本发明的E部分经由胆汁和/或尿液直接地或在代谢(例如，肝中的细胞色素-P-450介导的羟基化)后从身体排出，这类似于其他基于固醇的分子(例如，雌激素)。这种氧化还原介导的裂解在图2、图3和图4中例示。这些图展示了含有根据式(Va’)、式(Vc’)或式(Vc”)的E部分的RNA双链体。虽然缀合物在氧化条件下，如在细胞外空间中存在的那些条件下是完整的(图2a)，但进入细胞质后，由于细胞质特征性还原条件导致二硫键的裂解(图3、图4)：货物药物被释放以在其细胞质靶位点(例如，RISC)处发挥其药理活性，而E部分从身体排出，这类似于其他基于固醇的化合物。由巯基基团处的偕二甲基部分提供的空间位阻进一步起赋予处于氧化的二硫化物形式的血液稳定性，并且在裂解后使游离巯基形式稳定的作用。
实施例5：本发明的缀合物的结构的实例：
例示了根据式(Cn-14)的缀合物。缀合物包含D(dsiRNA)与根据式(Vc”’)的E、E’和E”部分位于RNA双链体的5’末端处和沿寡核苷酸链的内部位置处的连接：
在该实例中，R是磷酸酯基团，而R’是氢。如示出的，Dicer底物RNA双链体(dsiRNA)的过客(有义)链的5’末端处的磷酸酯基团可以与Dicer的RNA结合位点的带正电荷的口袋相互作用，由此促进其活性，并且由此导致由该酶介导的整体基因沉默(参见实施例7)。
实施例6：本发明的缀合物在无血清(S-)条件下和在血浆蛋白质存在下[(S+)条
件]的性能：
目标：本实施例旨在证明：在(S-)条件和(S+)条件两者下，包含连接至大分子药物诸如OD的根据式(II)的关键化学部分的缀合物可以进行穿过磷脂膜至细胞中的递送，并且分别发挥基因沉默作用。相比之下，类似化合物(其结构不是根据式(II))应当在跨膜递送中完全无活性，或应当仅在无血清条件下诱导基因沉默。
方法：
E部分：本发明的E、E’或E”部分：根据式(Vb’)的Apo-Si-K-18以及根据式(Vb”)的Apo-Si-K-13，符合式(II)中阐明的所有结构特征。它们的结构如下：
E部分各自连接至dsiRNA双链体的寡核苷酸链的5’末端。根据先前的实施例合成了Apo-Si-K-18和Apo-Si-K-13。此外，以下结构相关的部分(Apo-Si-K-19、Apo-Si-W和Apo-Si-G)用作对照，因为尽管它们与Apo-Si-K-18和Apo-Si-K-13共享基本的结构相似性，但如下所示，这些部分不完全符合式(II)的所有结构特征：(i).在Apo-Si-K-19中，U和Q均存在，而式(II)隐含U或Q中的一个应不存在；(ii).Apo-Si-W不包含二硫化物部分，二硫化物部分是式(II)的组成部分；(iii).在Apo-Si-G中，U和Q均不存在，而式(II)隐含Q或U中的一个应存在。
缀合物：RNA双链体(各自包含一条25个核苷酸长的链和一条27个核苷酸长的链)被设计为Dicer底物(dsiRNA)，旨在使编码EGFP(增强型绿色荧光蛋白)的基因的表达沉默。寡核苷酸序列如下：
反义链序列：
有义RNA序列：
综上，因此合成了5种缀合物，缀合物各自包含用于使EGFP基因沉默的dsiRNA，并且各自附接两个E部分。两种缀合物是本发明的缀合物，包括Apo-Si-K-13部分或Apo-Si-K-18部分，而三种缀合物是对照缀合物，其中dsiRNA双链体附接至Apo-Si-G、Apo-Si-K-19或Apo-Si-W部分。每种缀合物根据其E部分命名。
细胞培养：
从Cell Biolabs获得了HeLa-EGFP细胞系。使细胞在补充有10％FBS(Gibco)、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素(Biological Industries，Israel)和10μg/ml杀稻瘟素的Dulbecco改良的Eagle培养基(Gibco)中生长。将细胞维持在37℃具有5％CO2加湿空气的培养箱中。
在转染前一天，将细胞铺板(40,000个细胞/孔)在具有玻璃底部的24孔黑色板上。在接下来的一天，将细胞与Apo-Si-K-18缀合物或Apo-Si-K-13缀合物(本发明的缀合物)或与相应的对照在10％胎牛血清[FBS，血清(+)条件]的存在下一起孵育。对于在无血清条件下孵育，吸出培养基，将细胞用汉克平衡盐溶液(HBSS)洗涤，并且然后将培养基用无血清的Opti-MEM培养基(Thermo Fisher Scientific)替代。在24小时之后，将培养基用10％FCS培养基替代。所有细胞的孵育期为72小时。在40nM-300nM的剂量范围内，评估缀合物的多种浓度。
基因表达的下调：
在转染后72小时测量基因表达的下调。为此，吸出培养基，并且将细胞用HBSS洗涤。蛋白质表达经由EGFP荧光强度的测量来测量，该强度通过infinite M200-Pro多功能酶标仪(infinite M200-Pro Multimode Reader；Tecan)定量；激发波长488nm，发射波长535nm。实验以一式三份进行，并且将EGFP荧光结果与未处理(即，未被缀合物处理)的细胞的荧光强度进行比较。结果呈现为与对照相比的荧光强度百分比。组间差异的显著性通过双尾t检验来评估，p<0.05被定义为显著。
结果：
本发明的缀合物：Apo-Si-K-13和Apo-Si-K-18：
无血清条件：Apo-Si-K-13缀合物和Apo-Si-K-18缀合物均显示出稳健的细胞摄取和相应的有效基因沉默。Apo-Si-K-13缀合物在40nM的缀合物时显示出75.5±2.0％的沉默(平均值±SD)。在150nM的缀合物时沉默增加至86.6±0.5％。Apo-Si-K-18缀合物在40nM的缀合物时显示出68.4±0.5％的类似的沉默功效(平均值±SD)，其在150nM的缀合物时增加至84.7±0.2％的沉默；[t检验p<0.001，与对照、未处理的细胞相比]。
在血清存在下：在血清存在下，Apo-Si-K-13缀合物和Apo-Si-K-18缀合物均提供了显著的基因沉默。Apo-Si-K-13缀合物在300nM时提供了15.5±3.2％的基因沉默，在600nM时增加至44±1.5％，而Apo-Si-K-18缀合物在300nM时提供了65.4±0.6％的基因沉默(平均值±SD)；(t检验p<0.001，与对照、未处理的细胞相比)。
对照缀合物：Apo-Si-G、Apo-Si-K-19、Apo-Si-W：
无血清条件：在无血清条件下，Apo-Si-G缀合物显示出稳健的细胞摄取和相应的有效基因沉默。Apo-Si-G缀合物在40nM时显示出40.7±2.2％的沉默(平均值+SD)，其在150nM时增加至70.9±1.1％。Apo-Si-K-19在150nM时显示出37.7+0.8％的基因沉默(平均值±SD)；(p<0.001，与对照、未处理的细胞相比)。
在血清存在下：尽管对照缀合物Apo-Si-G、Apo-Si-K-19和Apo-Si-W与本发明的缀合物结构相似，但它们在血清存在下均未显示出任何基因沉默。Apo-Si-W缀合物即使在无血清条件下也未显示出任何基因沉默。
结果的总结：
Apo-Si-K-13缀合物和Apo-Si-K-18缀合物两者当在体外与细胞一起孵育时均显示出稳健的摄取和基因沉默。由这两种缀合物发挥的基因沉默活性分别在培养基中存在或不存在血浆蛋白质时(即，在(S+)条件和(S-)条件下)都是明显的。本发明的缀合物的这种性能与对照缀合物的性能对比鲜明。Apo-Si-G缀合物和Apo-Si-K-19缀合物在无血清(S-)条件下在基因沉默方面有活性，但Apo-Si-W缀合物则无活性；对照缀合物在血浆蛋白质存在[(S+)条件]下在基因沉默方面均无活性。
讨论：
如该实施例所示，具有式(II)中阐明的结构的本发明的关键化学部分确实引起相关缀合物在穿过细胞膜递送至细胞中以及在诱导生物效应(基因沉默)方面的稳健性能。这种性能在(S-)条件和(S+)条件下均观察到。重要的是，本发明的缀合物和对照缀合物组提供了关于根据式(II)的本发明的关键化学部分的重要结构/功能观点：所有缀合物(本发明的缀合物和对照缀合物两者)的E部分包含固醇骨架和九氟叔丁醇残基。然而，明显地，即使在无血清条件下，这也不足以赋予活性(例如，在缀合物Apo-Si-W的结果中所反映的，其未示出活性)。在每个E部分添加二硫化物基团引起了在无血清条件下的活性(例如，在无血清条件下，本发明的缀合物Apo-Si-K-13和Apo-Si-K-18的性能，以及对照缀合物Apo-Si-G的性能)。然而，在血浆蛋白质存在下，这不足以产生性能。
相比之下，对于每个E部分添加一个存在的U或Q部分确实赋予缀合物在血浆蛋白质存在下的活性，这通过在Apo-Si-K-18缀合物或Apo-Si-K-13缀合物的情况下观察到的有效的基因沉默所示出。Apo-Si-K-19提供了出乎意料的观察结果，表明每个E部分U和Q均存在的情况对于相应缀合物的生物性能有害。
综上，这些数据支持这样的概念：式(II)确实代表了多种决定因素之间独特、新颖且不可预测的平衡，所述多种决定因素累积地和相互作用地引起了相应缀合物在跨膜递送和随后的基因沉默方面的期望的性能。
实施例7：5’-磷酸酯对于本发明的Dicer底物的性能的积极影响：
目标：具有式Cn-1、式Cn-2、式Cn-3、式Cn-4、式Cn-6、式Cn-7、式Cn-8或式Cn-9中任一项阐明的结构的Dicer底物也可以在过客(有义)RNA链的5’末端包含磷酸酯基团、硫酸酯基团或羧基基团，旨在与位于Dicer酶上的RNA锚定位点的排列有带正电荷的氨基酸残基的结合口袋相互作用。进行该实验以便证明由这样的带负电荷的部分所发挥的对本发明的Dicer底物性能的有益影响。
方法：实验中使用了两种Dicer底物，每种Dicer底物具有使EGFP基因表达沉默的特定序列，如实施例6中描述的。此外，一种dsiRNA具有附接至过客(有义)链的5’末端的磷酸酯基团[被命名为(P+)dsiRNA]，而另一种dsiRNA，过客(有义)链的5’末端是末端核苷酸的5’-羟基[被命名为(P-)dsiRNA]。使从Cell Biolabs获得的HeLa-GFP细胞系在补充有10％FBS(Gibco)、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素(Biological Industries，Israel)和10μg/ml杀稻瘟素的Dulbecco改良的Eagle培养基(Gibco)中生长。将细胞维持在37℃具有5％CO2加湿空气的培养箱中。在转染前一天，将细胞(40,000个细胞/孔)铺板在24孔黑色玻璃底的板上，该板具有完全培养基而不补充抗生素。在接下来的一天，在使用0.1nM dsiRNA和1ul转染试剂的次优(sub-optimal)条件下，根据制造商的说明，用RNAiMAX(Lipofectamine，Invitrogen)转染细胞。然后将细胞与转染混合物一起孵育24小时，随后添加无抗生素的完全培养基(1ml/孔)。在转染后72小时测量蛋白质下调：为此，吸出培养基，并且将细胞用HBSS洗涤。EGFP荧光强度通过infinite M200-Pro多功能酶标仪(Tecan)定量，激发波长488nm，发射波长535nm。
结果：在采用的低的次优剂量(0.1nM dsiRNA)的情况下，(P-)dsiRNA将EGFP水平下调20±2％(平均值±SD)。相比之下，(P+)dsiRNA使基因表达沉默67±2％(p<0.0001；t检验)。
结论：在过客(有义)链的5’末端处包含磷酸酯基团的Dicer底物与没有该基团的dsiRNA相比在基因沉默方面显示出有利的性能。
实施例8：作为Dicer底物的本发明的缀合物的作用机理：
图3和图4例示了本发明的缀合物的作用机理(MOA)。分别例示了根据式(Cn-3)和式(Cn-9)的缀合物，其中RNA双链体是25/27个核苷酸长的Dicer底物，具有连接至过客链的5’末端的磷酸酯基团：在到达细胞质后，由于明显的还原性环境条件，发生E、E’和E”部分的裂解和去除，每个E部分留下短的残余部分，包含连接至6个碳的烃链的硫醇基团(图3a和图4a)。然后RNA双链体与Dicer核酸内切酶相互作用。这种相互作用通过以下来启动：引导(反义)链双链体的3’末端(其由2个核苷酸的突出端组成)与蛋白质的疏水性口袋的结合，以及过客(有义)链的磷酸酯基团与蛋白质表面上相应的带正电荷的口袋的相互作用。这种锚定将RNA定位在蛋白质上，使其能够进行RNA双链体的准确的双链断裂，留下连接至一种剩余的E残余部分的21/21核苷酸的双螺旋[图3b和图4b]。图3c和图4c展示了通过解旋酶(能够分离RNA链的细胞质酶)去除有义链。该作用去除第二种E残基残余部分，由此释放完整的反义链，以进入RNA诱导的沉默复合物(RISC)，以便诱导期望的基因沉默[图3d和图4d]。
实施例9：在本发明的化合物与血浆蛋白质一起孵育后，观察到白蛋白结合的级分 和无白蛋白的级分两者：
目标：进行该实验以便评估本发明的化合物当与白蛋白一起孵育时是否显示出白蛋白结合的级分和无白蛋白的级分两者，由此支持针对它们在血清(+)条件下观察到的活性的潜在作用机理。
基本原理：本发明的缀合物的主要优点是它们在血浆蛋白质不存在和存在的情况下均显示出生物活性的能力。药物与血浆蛋白质的结合在多个方面，诸如在延长药物在循环中的半衰期和防止降解方面可以是有利的。然而，与白蛋白的结合亲和力太高可不利地限制药物与其靶细胞相互作用的可用性。因此，对于本发明的缀合物，在它们与白蛋白相互作用后具有与血浆蛋白质结合的级分(白蛋白结合的级分)和在细胞外液中自由扩散以到达靶细胞并与靶细胞相互作用的级分(无白蛋白的级分)是期望的。进行本实施例以便证明本发明的缀合物的这些特征。
方法：
凝胶电泳被用于检查本发明的缀合物与牛血清白蛋白(BSA)结合的程度。为了检测游离级分，将RNA样品稀释在Tris缓冲液pH＝8中，并且添加BSA(10％)至2mg/ml的最终浓度(泳道B)。将对照样品在水中稀释(泳道A)。
对于每个组(A或B)，泳道根据下表指定：
将所有样品在25℃孵育过夜。然后将所有泳道的RNA样品装载(每泳道19pmol)在12％天然聚丙烯酰胺凝胶上，并且被诱导以在5V/cm的电场中迁移1小时(Bio-Rad mini-protean仪器，Israel)。
结果：
如图5所示，包含E部分Apo-Si-K-13或Apo-Si-K-18的本发明的缀合物的孵育导致产生两种级分：一种为白蛋白结合的级分(箭头#1)和另一种为无白蛋白的级分(箭头#2)。相比之下，包含E部分Apo-Si-G的对照缀合物仅具有一种级分：仅观察到白蛋白结合的级分。
结论：这些发现证明，包含Apo-Si-K18部分或Apo-Si-K-13部分的本发明的缀合物在与白蛋白接触后显示出两种级分：白蛋白结合的级分和无白蛋白的级分。这可以解释在血浆蛋白质存在(S+)和不存在(S-)的情况下观察到的它们的生物性能(例如，在基因沉默中的生物性能)，因为即使在血浆蛋白质存在下，该缀合物也显示出自由扩散并且与靶细胞相互作用的未结合的级分。相比之下，对照缀合物诸如Apo-Si-G缀合物对白蛋白具有非常大的亲和力，并且因此仅显示出白蛋白结合的级分。这些对照缀合物在与白蛋白相互作用后不具有扩散通过细胞外空间以与靶细胞相互作用所需的游离级分，并且因此仅在无血清条件下有活性。
实施例10：在无血清[(S-)条件]和在血浆蛋白质存在[(S+)条件]的情况下，包含 三个E部分的本发明的缀合物均优于包含仅两个E部分的缀合物：
方法：
这些实验中使用的E部分是具有式(Vc”)中阐明的以下结构的Apo-Si-K-43：
检查了两种包含所述E部分的缀合物：一种包含两个E部分并且另一种包含三个E部分，E部分均连接至寡核苷酸。每种缀合物包含Dicer底物RNA双链体(dsiRNA)，该双链体包含一条25个核苷酸长的链和一条27个核苷酸长的链，旨在使编码EGFP(增强型绿色荧光蛋白)的基因的表达沉默。因此，EGFP基因表达的沉默被选择作为体外跨膜递送后待评估的生物功能，所述体外跨膜递送通过本发明的E部分得以实现。所述dsiRNA的核苷酸序列如上文的实施例6中描述的。
一种缀合物是具有以下结构(即，具有两个E部分)的缀合物(Cn-7)：
第二种缀合物是具有以下结构(即，具有三个E部分)的缀合物(Cn-9)：
在这两种缀合物中，所有R部分和R’部分都是磷酸酯基团。
细胞培养：
从Cell Biolabs获得了HeLa-EGFP细胞系。使细胞在补充有10％FBS(Gibco)、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素(Biological Industries，Israel)和10μg/ml杀稻瘟素的Dulbecco改良的Eagle培养基(Gibco)中生长。将细胞维持在37℃具有5％CO2加湿空气的培养箱中。
在转染前一天，将细胞铺板(40,000个细胞/孔)在具有玻璃底部的24孔黑色板上。在接下来的一天，在10％胎牛血清[FBS，血清(+)条件]存在下，将细胞与缀合物(Cn-7)或缀合物(Cn-9)一起孵育。对于在无血清条件[血清(-)条件]下孵育，吸出培养基，将细胞用汉克平衡盐溶液(HBSS)洗涤，并且然后将培养基用无血清的Opti-MEM培养基(Thermo FisherScientific)替代。在24小时之后，将培养基用10％FCS培养基替代，持续剩余的孵育期(总计72小时)。将细胞与缀合物(Cn-7)或缀合物(Cn-9)一起孵育：在无血清条件[(S-)条件]下剂量为150nM，而在血浆蛋白质存在[(S+)条件]下剂量为600nM。
基因表达的下调：
在转染后72小时测量基因表达的下调。为此，吸出培养基，并且将细胞用HBSS洗涤。蛋白质表达经由EGFP荧光强度的测量来测量，该强度通过infinite M200-Pro多功能酶标仪(Tecan)定量；激发波长488nm，发射波长535nm。实验以一式三份进行，并且将EGFP荧光结果与未处理(即，未被缀合物处理)的细胞的荧光强度进行比较。结果呈现为与另一缀合物的荧光强度相比的荧光强度百分比。缀合物之间差异显著性通过双尾t检验来评估，p<0.05被定义为显著。
结果：
无血清条件：缀合物Cn-7和缀合物Cn-9均显示出显著的细胞摄取以及相应的有效基因沉默。缀合物Cn-7在150nM的缀合物时显示出41.4±1.0％的基因沉默(平均值±SD)。缀合物Cn-9在150nM的缀合物时显示出61.0±0.5％的更高的沉默功效。缀合物之间的差异是统计学显著的[t检验p<0.001，在Cn-7缀合物和Cn-9缀合物之间比较]。
在血清存在下：缀合物Cn-7和缀合物Cn-9均显示出显著的细胞摄取以及相应的有效基因沉默。缀合物Cn-7在600nM浓度的缀合物时提供12.3±1.6％的基因沉默，而Cn-9在该浓度时提供25.4±1.0％的更强的基因沉默(平均值±SD)；[t检验p<0.001，在Cn-7缀合物和Cn-9缀合物之间比较]。
结果的总结：
缀合物Cn-7和缀合物Cn-9当在体外与细胞一起孵育时均显示出显著的摄取和基因沉默。由这两种缀合物发挥的基因沉默活性分别在培养基中存在或不存在血浆蛋白质时(即，在(S+)条件和(S-)条件下)都是明显的。在无血清条件下沉默的幅度更大，可以想象的是，这与在这些条件下缀合物与白蛋白的竞争性结合的相应缺乏一致。重要的是，在(S+)条件和(S-)条件下，与包含仅两个E部分的缀合物(Cn-7)相比，包含三个E部分的缀合物(Cn-9)的基因沉默在统计学上均显著更高。
结论：
·包含2个或3个本发明的E部分的dsiRNA在体外显示出显著的基因沉默。
·所述基因沉默在培养基中存在或不存在血浆蛋白质的情况下发生。
·在提供显著的基因沉默方面，包含三个E部分的缀合物优于包含仅两个E部分的缀合物。
序列表
<110> 艾博森斯有限公司
伊兰·齐夫
约瑟夫·杜布罗夫斯基
哈吉特·格林贝格
<120> 用于分子的跨膜递送的化合物和方法
<130> P-571158-US3
<140>
<141>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> c附接至化学部分
<400> 1
cgguggugca gaugaacuuc aggguca 27
<210> 2
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> a附接至化学部分
<400> 2
acccugaagu ucaucugcac caccg 25
Claims (48)
1.一种缀合物，具有式(I)中阐明的结构：
包括由式(I)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中：
D是待穿过生物膜被递送的药物，所述药物选自由以下组成的组：小分子药物、肽、蛋白质和天然或修饰的单链或双链的DNA或RNA、siRNA、dsiRNA或反义寡核苷酸(ASO)；
y、z和w各自是独立地选自0、1、2、3或4的整数，其中如果y、z或w或其组合中的任一个是0，则意味着相应的一个或更多个E部分不存在；y、z或w中的至少一个不同于0；
E、E’或E”能够是相同的或不同的，各自独立地具有通式(II)中阐明的结构：
包括由式(II)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中：
U或Q中的一个独立地不存在，并且另一个选自由以下组成的组：–NH–、–N(CH3)–、–N(CH2-CH3)–、–NH-(CH2)2-NH–和–N(CH3)-(CH2)2-N(CH3)–；
G1、G2、G3和G4各自独立地选自由以下组成的组：氢、甲基或乙基；G1、G2、G3和G4部分能够是相同的或不同的；G1、G2、G3和G4中的至少两个是氢原子；
Z选自由以下组成的组：不存在、醚、酯、胺和酰胺；
a、b、c、d是各自独立地选自由0、1、2、3、4、5、6或7组成的组的整数，其中0＝不存在；a、b、c、d能够是相同的或不同的；
e和f是各自独立地选自由1、2和3组成的组的整数；e和f能够是相同的或不同的；
如果每个a或b中的任一个>2，则相应的烃链能够是饱和的或不饱和的；
W选自包括以下的组：不存在、羟基、二羟基、天然或修饰的核苷以及式(II’)中阐明的结构：
其中J选自不存在、-CH2-、仲胺或叔胺和氧；
并且其中根据式(II’)的部分能够连接至由以下组成的组中的任一个：不存在；氢；D；如本文定义的保护基团(例如，醇的保护基团)；磷酸酯基团、硫酸酯基团或羧基基团；和固体支撑物；E、E’或E”部分能够经由一个或两个点连接至一个D部分。
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中在E、E’或E”部分中，W是选自天然或修饰的腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的核苷，并且糖部分是核糖或2’-脱氧核糖。
3.根据权利要求2所述的缀合物，其中在E、E’或E”部分中，W是2’-脱氧尿苷。
4.根据权利要求1所述的缀合物，其中在E、E’或E”部分中，W具有式(II’)中阐明的结构，其中J是-CH2-。
5.在本发明的实施方案中，提供了根据式(II)的E、E’或E”，具有式(III)中阐明的结构：
包括由式(III)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中：U、Q、Z、G3、G4、a、b、c、d、e、f、W各自具有与对于式(II)定义的相同的含义。
6.根据权利要求5所述的缀合物，其中E、E’或E”部分具有式(IVa)中阐明的结构：
包括由式(IVa)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；其中：Z、U、Q、G3、G4、a、b、c、d、e和f各自具有与式(III)中相同的含义。
7.根据权利要求5所述的缀合物，其中E、E’或E”部分具有式(IVb)中阐明的结构：
包括由式(IVb)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；其中U、Q、G3、G4、b、c、d、e和f各自具有与式(III)中相同的含义。
8.根据权利要求5所述的缀合物，其中E、E’或E”部分具有式(IVc)中阐明的结构：
包括由式(IVc)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；其中U、Q、G3、G4、b、c、d、e和f各自具有与式(III)中相同的含义；J选自由以下组成的组：不存在、-CH2-和氧。
9.根据权利要求6所述的缀合物，其中E、E’或E”部分具有式(Va’)中阐明的结构：
包括由式(Va’)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物；其中所述分子任选地连接至不存在；氢；D；醇的保护基团；磷酸酯基团、硫酸酯基团或羧基基团；或固体支撑物；E、E’或E”部分能够经由一个或两个点连接至一个D部分。
10.根据权利要求6所述的缀合物，其中E、E’或E”部分具有式(Va”)中阐明的结构：
包括由式(Va”)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物；其中所述分子任选地连接至不存在；氢；D；醇的保护基团；磷酸酯基团、硫酸酯基团或羧基基团；或固体支撑物；E、E’或E”部分能够经由一个或两个点连接至一个D部分。
11.根据权利要求6所述的缀合物，具有式(Va”’)中阐明的结构：
包括由式(Va”’)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物；其中所述分子任选地连接至不存在；氢；D；醇的保护基团；磷酸酯基团、硫酸酯基团或羧基基团；或固体支撑物；E、E’或E”部分能够经由一个或两个点连接至一个D部分。
12.根据权利要求7所述的缀合物，其中E、E’或E”部分具有式(Vb’)中阐明的结构：
包括由式(Vb’)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物；其中所述分子任选地连接至不存在；氢；D；醇的保护基团；磷酸酯基团、硫酸酯基团或羧基基团；或固体支撑物；E、E’或E”部分能够经由一个或两个点连接至一个D部分。
13.根据权利要求7所述的缀合物，其中E、E’或E”部分具有式(Vb”)中阐明的结构：
包括由式(Vb”)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物；其中所述分子任选地连接至不存在；氢；D；醇的保护基团；磷酸酯基团、硫酸酯基团或羧基基团；或固体支撑物；E、E’或E”部分能够经由一个或两个点连接至一个D部分。
14.根据权利要求7所述的缀合物，其中E、E’或E”部分具有式(Vb”’)中阐明的结构：
包括由式(Vb”’)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物；其中所述分子任选地连接至不存在；氢；D；醇的保护基团；磷酸酯基团、硫酸酯基团或羧基基团；或固体支撑物；E、E’或E”部分能够经由一个或两个点连接至一个D部分。
15.根据权利要求8所述的缀合物，其中E、E’或E”部分具有式(Vc’)中阐明的结构：
包括由式(Vc’)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物；其中所述分子任选地连接至不存在；氢；D；醇的保护基团；磷酸酯基团、硫酸酯基团或羧基基团；或固体支撑物；E、E’或E”部分能够经由一个或两个点连接至一个D部分。
16.根据权利要求8所述的缀合物，其中E、E’或E”部分具有式(Vc”)中阐明的结构：
包括由式(Vc”)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物；其中所述分子任选地连接至不存在；氢；D；醇的保护基团；磷酸酯基团、硫酸酯基团或羧基基团；或固体支撑物；E、E’或E”部分能够经由一个或两个点连接至一个D部分。
17.根据权利要求8所述的缀合物，其中根据式(IVc)的E、E’或E”具有式(Vc”’)中阐明的结构：
包括由式(Vc”’)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物；其中所述分子任选地连接至不存在；氢；D；醇的保护基团；磷酸酯基团、硫酸酯基团或羧基基团；或固体支撑物；E、E’或E”部分能够经由一个或两个点连接至一个D部分。
18.一种前体分子，具有式(IVaP)中阐明的结构：
包括由式(IVaP)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中：Z、U、Q、G3、G4、a、b、c、d、e、f各自具有与权利要求6中相同的含义。
19.一种前体分子，具有式(IVbP)中阐明的结构：
包括由式(IVbP)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中U、Q、G3、G4、b、c、d、e、f各自具有与权利要求7中相同的含义。
20.一种前体分子，具有式(IVcP)中阐明的结构：
包括由式(IVcP)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中：Z、U、Q、G3、G4、a、b、c、d、e、f各自具有与权利要求8中相同的含义。
21.根据权利要求20所述的前体分子，具有式(PP-1)中阐明的以下结构：
包括由式(PP-1)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。
22.根据权利要求20所述的前体分子，具有式(PP-2)中阐明的以下结构：
包括由式(PP-2)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。
23.根据权利要求20所述的前体分子，具有式(PP-3)中阐明的以下结构：
包括由式(PP-3)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。
24.根据权利要求1所述的缀合物，包含连接至药物的根据式(II)、式(III)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va’)、式(Va”)、式(Va”’)、式(Vb’)、式(Vb”)、式(Vb”’)、式(Vc’)、式(Vc”)或式(Vc”’)中任一项的E、E’或E”部分。
25.根据权利要求24所述的缀合物，其中所述药物是大分子药物。
26.根据权利要求25所述的缀合物，其中所述大分子药物是寡核苷酸药物(OD)，所述OD包含天然或修饰的寡核苷酸链并且选自siRNA、dsiRNA、mRNA、微小RNA和反义寡核苷酸(ASO)。
27.一种药物组合物，包含根据权利要求24所述的缀合物和药学上可接受的盐或载体。
28.根据权利要求26所述的缀合物，其中所述OD连接至一个、两个、三个或多于三个的E、E’或E”部分。
29.根据权利要求26所述的缀合物，其中所述OD是Dicer底物，一种24个和27个核苷酸的RNA双链体；或25个和27个核苷酸的RNA双链体。
30.根据权利要求29所述的缀合物，任选地在RNA链的一个末端或两个末端处连接至磷酸酯基团、硫酸酯基团或羧基基团。
31.根据权利要求26所述的缀合物，具有式(Cn-1)中阐明的结构：
包括由式(Cn-1)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中R和R’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯基团、硫酸酯基团或羧基基团。
32.根据权利要求26所述的缀合物，具有式(Cn-2)中阐明的结构：
包括由式(Cn-2)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中R和R’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯基团、硫酸酯基团或羧基基团。
33.根据权利要求26所述的缀合物，具有式(Cn-3)中阐明的结构：
包括由式(Cn-3)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中R和R’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯基团、硫酸酯基团或羧基基团。
34.根据权利要求26所述的缀合物，具有式(Cn-4)中阐明的结构：
包括由式(Cn-4)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中R和R’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯基团、硫酸酯基团或羧基基团。
35.根据权利要求26所述的缀合物，具有式(Cn-5)中阐明的结构：
包括由式(Cn-5)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；其中Y和Y’各自独立地选自由以下组成的组：氢、-CH2-Z、-CH2-Z’、-CH2-O-Z和-CH2-O-Z’；其中Z和Z’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯、硫酸酯、羧基、1’,2’-二脱氧核糖、核苷酸及其组合；g是选自由0、1、2、3、4、5和6组成的组的整数。
36.根据权利要求26所述的缀合物，具有式(Cn-6)中阐明的结构：
包括由式(Cn-6)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中R和R’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯基团、硫酸酯基团和羧基基团。
37.根据权利要求26所述的缀合物，具有式(Cn-7)中阐明的结构：
包括由式(Cn-7)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中R和R’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯基团、硫酸酯基团和羧基基团。
38.根据权利要求26所述的缀合物，具有式(Cn-8)中阐明的结构：
包括由式(Cn-8)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中R和R’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯基团、硫酸酯基团和羧基基团。
39.根据权利要求26所述的缀合物，具有式(Cn-9)中阐明的结构：
包括由式(Cn-9)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中R和R’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯基团、硫酸酯基团和羧基基团。
40.根据权利要求26所述的缀合物，具有式(Cn-10)中阐明的结构：
包括由式(Cn-10)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；其中Y和Y’各自独立地选自由以下组成的组：氢、-CH2-Z、-CH2-Z’、-CH2-O-Z和-CH2-O-Z’；其中Z和Z’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯、硫酸酯、羧基、1’,2’-二脱氧核糖、核苷酸及其组合；g是选自由0、1、2、3、4、5和6组成的组的整数。
41.根据权利要求26所述的缀合物，具有式(Cn-11)中阐明的结构：
包括由式(Cn-11)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中R和R’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯基团、硫酸酯基团和羧基基团。
42.根据权利要求26所述的缀合物，具有式(Cn-12)中阐明的结构：
包括由式(Cn-12)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中R和R’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯基团、硫酸酯基团和羧基基团。
43.根据权利要求26所述的缀合物，具有式(Cn-13)中阐明的结构：
包括由式(Cn-13)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中R和R’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯基团、硫酸酯基团和羧基基团。
44.根据权利要求26所述的缀合物，具有式(Cn-14)中阐明的结构：
包括由式(Cn-14)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中R和R’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯基团、硫酸酯基团和羧基基团。
45.根据权利要求26所述的缀合物，具有式(Cn-15)中阐明的结构：
包括由式(Cn-15)中阐明的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；其中Y和Y’各自独立地选自由以下组成的组：氢、-CH2-Z、-CH2-Z’、-CH2-O-Z和-CH2-O-Z’；其中Z和Z’各自独立地选自由以下组成的组：氢、磷酸酯、硫酸酯、羧基、1’,2’-二脱氧核糖、核苷酸及其组合；g是选自由0、1、2、3、4、5和6组成的组的整数。
46.一种用于将药物递送至生物细胞中的方法，其中所述细胞在培养物中、或在活体动物或人类受试者中；所述方法包括使所述细胞与根据权利要求24所述的缀合物接触。
47.一种用于将药物递送穿过磷脂膜的方法，所述方法包括将所述药物与根据式(II)、式(III)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va’)、式(Va”)、式(Va”’)、式(Vb’)、式(Vb”)、式(Vb”’)、式(Vc’)、式(Vc”)或式(Vc”’)中任一项的E、E’或E”部分缀合，并且使所述缀合物与所述磷脂膜接触。
48.一种用于治疗医学紊乱的方法，所述方法包括向有相应需要的患者施用治疗有效量的根据权利要求27所述的药物组合物。
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