JP7348064B2

JP7348064B2 - 分子を経膜送達するための化合物及び方法

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Publication number: JP7348064B2
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Inventors: ジヴ、イーラン; デュブロヴスキー、ヨセフ; グリムベルグ、ハギット
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Description

本発明は、分子及び高分子を、臨床現場においてインビトロ及びインビボで使用される細胞内に、生体膜を横断して送達するための化合物、送達システム及び方法に関する。

近年の主要な科学進歩の１つは、ヒトゲノムのマッピングが完成したことであり、これにより、薬物療法のための多数の新規標的がもたらされた。このような標的の多くは細胞内に存在し、遺伝物質やタンパク質などの高分子薬物によって対処する必要がある。この分野において特に興味深いのは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用したＲＮＡ干渉によって特定の遺伝子の発現をサイレンシング（抑制）するという最近発見された機能である。ＲＮＡ干渉は、短い（約１９～２７塩基対）二本鎖ＲＮＡ配列（指定ｓｉＲＮＡ）の利用に基づいており、細胞生物学的システム（とりわけ、長い二本鎖ＲＮＡを切断してｓｉＲＮＡを提供するダイサー・タンパク質コンジュゲート、及びＲＮＡ誘導性サイレンシングコンジュゲート（ＲＩＳＣ））と協働して、特異的ｍＲＮＡ配列分解のための翻訳及びマーキングを阻害し、それにより、翻訳段階での遺伝子発現を阻害するように作用することができる。また、特異的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に相補的な、未修飾または化学的に修飾されたＤＮＡ分子の短い配列（通常１３～２５ヌクレオチド）であるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）も、特異的疾患関連標的タンパク質の発現及び産生を阻害するために使用されている。新規な細胞内標的を標的とする他の高分子薬物は、タンパク質薬物である。しかしながら、医療のためのこのようなアプローチの途方もない潜在的利益にもかかわらず、オリゴヌクレオチドの比較的大きいかつ高電荷の構造に起因して、このような高分子の細胞内への送達は、依然として大きな課題である。例えば、ｓｉＲＮＡは、１３ｋＤａの平均分子量を有し、４０～５０個の負に荷電したリン酸基を運ぶ。実際、オリゴヌクレオチドの経膜送達は、非常に大きなエネルギー障壁を克服する必要がある。したがって、インビトロ及びインビボの両方において、生体膜を通過させて高分子薬物を送達するための新規なツールが求められている。

本発明は、新規な分子送達システムに結合されたｓｉＲＮＡなどの高分子薬物を含むコンジュゲート及びその前駆体に焦点を合わせている。この新規な送達システムは、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）などの遺伝薬物を、リン脂質細胞膜などの生物学的障壁を横断して送達するのに特に有利である。この新規な分子送達システムは、膜内部電界によってエネルギーを与えられる経膜送達部分と、細胞質で還元されるように設計された酸化還元感受性ジスルフィド部分とを含み、カーゴ薬物を放出して標的部位でその薬理効果を発揮する。この新規な分子送達システムは、血漿タンパク質の有無にかかわらず作動する。

本発明の一実施形態では、下記の化学式（Ｉ）に示す構造を有するコンジュゲートが提供される。このコンジュゲートは、下記の化学式（Ｉ）に示す構造で表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、金属キレート、または塩の溶媒和物若しくは水和物を含む。

式中、
Ｄは、生体膜を横断して送達される薬物であり、低分子薬物、ペプチド、タンパク質、及び、天然の若しくは修飾された、一本鎖若しくは二本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはＡＳＯからなる群より選択され；
ｙ、ｚ、及びｗは、互いに独立して、０、１、２、３、４、５または６から選択される整数であり、整数が０である場合はそのＥ部分がヌルであることを意味し；ｙ、ｚ、及びｗの少なくとも１つは０ではなく；
Ｅ、Ｅ´、及びＥ´´は、互いに同一であっても異なっていてもよく、互いに独立して、下記の化学式（ＩＩ）に示す構造で表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、金属キレート、または塩の溶媒和物若しくは水和物を含む、下記の化学式（ＩＩ）に示す構造を有する。

式中、
Ｇ_１、Ｇ_２、Ｇ_３、及びＧ_４は、互いに独立して、水素、メチル、及びエチルからなる群より選択され；少なくとも２つのＧ基は水素であり；
Ｚ及びＺ´は、互いに独立して、ヌル、－ＣＨ_２、－ＮＨ－、－Ｎ（Ｒ´）－、－Ｃ（Ｈ）（ＣＨ_２）_ｎ［Ｎ（Ｒ´´）（Ｒ´´´）］－、及び、－Ｎ（Ｒ´）－Ｃ（Ｏ）－Ｃ（Ｈ）（ＣＨ_２）_ｎ［Ｎ（Ｒ´´）（Ｒ´´´）］－からなる群より選択され；Ｒ´、Ｒ´´、及びＲ´´´は、互いに独立して、水素、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４アルキル、及び、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４アルキルアミンからなる群より独立して選択され；アミンは、第一級、第二級、または第三級アミンであり；ｎは、０、１、２、３、または４から選択される整数であり；ｎ＝０はヌルを意味し；Ｚ及びＺ´の少なくとも１つはアミンであり；
Ｌはリンカーであり、ヌル、エーテル、アミド、エステル、炭酸塩、カルバメート基、１～４個の炭素原子を各々含みかつ任意選択でヒドロキシルまたはアミン基によって置換される１個または２個の炭化水素鎖、または、これらの任意の組み合わせから選択され；
Ｋは、ヌル、－ＣＨ－、及び－Ｎ－から選択され；
ａは、０、１、２、３、及び４からなる群より選択された整数であり；
ｂは、０、１、２、３、及び４からなる群より選択された整数であり；
ｃは、１、２、３、及び４からなる群より選択された整数であり；
ｄは、２、３、及び４からなる群より選択された整数であり；
ｅ及びｆは、互いに独立して、０、１、２、及び３からなる群より選択された整数であり；
＊は、水素、Ｄへの結合点、アルコールの保護基への結合点、リン酸、硫酸またはカルボキシル基への結合点、及び、固体支持体への結合点からなる群より選択される。

別の実施形態では、化学式（Ｉ）に係るコンジュゲートであって、Ｅ、Ｅ´、及びＥ´´の少なくとも１つが、下記の化学式（ＩＩＩ）に示す構造で表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、金属キレート、または塩の溶媒和物若しくは水和物を含む、コンジュゲートが提供される。

式中、Ｚ´、Ｒ´、Ｌ、Ｇ_３、Ｇ_４、ａ、ｂ、ｃ、及び＊はそれぞれ、化学式（ＩＩ）で定義したとおりである。

別の実施形態では、化学式（ＩＩＩ）に係るコンジュゲートであって、

さらに別の実施形態では、本発明は、化学式（Ｉ）に係るコンジュゲートであって、Ｅ、Ｅ´、及びＥ´´の少なくとも１つが、下記の化学式（ＶＩ）に示す構造で表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、金属キレート、または塩の溶媒和物若しくは水和物を含む、下記の化学式（ＶＩ）に示す構造を有する、コンジュゲートを提供する。

式中、Ｒ´、Ｇ_３、Ｇ_４、ａ、ｂ、ｃ、及び＊は、それぞれ、化学式（ＩＩ）で定義したとおりである。

より具体的な実施形態では、化学式（ＶＩ）に係るコンジュゲートであって、Ｅ、Ｅ´、及びＥ´´の少なくとも１つが、下記の化学式（ＶＩＩ）または（ＶＩＩａ）に示す構造で表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、金属キレート、または塩の溶媒和物若しくは水和物を含む、下記の化学式（ＶＩＩ）または（ＶＩＩａ）に示す構造を有する、コンジュゲートが提供される。化学式（ＶＩＩ）に係るＥ部分は、アポ－Ｓｉ－Ｋ－９３－Ａとして設計される。

別の実施形態では、本発明は、化学式（ＩＩ）に係るコンジュゲートであって、Ｅ、Ｅ´、及びＥ´´の少なくとも１つが、下記の化学式（ＶＩＩＩ）または（ＶＩＩＩａ）に示す構造で表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、金属キレート、または塩の溶媒和物若しくは水和物を含む、下記の化学式（ＶＩＩＩ）または（ＶＩＩＩａ）に示す構造を有する、コンジュゲートを提供する。化学式（ＶＩＩＩａ）に係るＥ部分は、アポ－Ｓｉ－Ｋ－６３－Ａとして設計される。

本発明のいくつかの実施形態は、薬物を、インビトロまたはインビボで、培養物中または生きている動物若しくはヒト対象中の生体細胞に送達するための方法であって、生体細胞を、上記のコンジュゲートと接触させるステップを含む、方法に関する。

別の実施形態は、医学的疾患を治療する方法であって、対象に対して、上記のコンジュゲートを含有する薬学的組成物を治療有効量で投与するステップを含む、方法に関する。

本発明の別の実施形態は、例えば人間医学また獣医学における医療行為に使用するための上記のコンジュゲートに関する。

本発明の別の実施形態は、対象の医学的疾患を治療するための上記のコンジュゲートを作製するための、化学式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、または（ＶＩＩＩａ）に記載した構造を有するＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分の１以上の使用に関する。本発明の別の実施形態は、対象の医学的疾患を治療するための薬剤の作製におけるコンジュゲートの使用に関する。いくつかの実施形態では、医学的疾患は癌である。別の実施形態では、コンジュゲートは抗感染性を有し得、そのため、例えば細菌感染症またはウイルス感染症などの感染症の治療に有用である。

２つのＥ部分を含み、Ｅ部分の各々がｓｉＲＮＡ二本鎖の５´末端に位置する、本発明のコンジュゲートを示す。コンジュゲートが膜と相互作用するときに、ｓｉＲＮＡが膜の表面に対して平行であり、外膜リーフレットの歪み及び構造的摂動を誘導する位置にある状態を示す。歪み及び構造的摂動の結果として、コンジュゲートによって誘導されるエンドサイトーシスを示す。図中の矢印は、エンドサイトーシス小胞の例である。３つのＥ部分を含む本発明のｓｉＲＮＡコンジュゲートの構造の例であり、細胞外空間に存在する無傷のコンジュゲートを示す。細胞質内の還元条件下でのＥ部分の切断を示す。ＲＮＡ二本鎖の切断を示し、それにより２１／２３ヌクレオチド二本鎖が生成され、また、ガイド鎖の残基部分も除去される。ヘリカーゼによるパッセンジャー鎖の除去を示し、Ｅ部分の残りの２つの断端が、ガイド鎖を残し、ＲＩＳＣ複合体に無傷で送達される準備ができている。本発明のコンジュゲートを１０％ＢＳＡとインキュベートしたときの、タンパク質結合画分及びタンパク質非結合画分（矢印）を示す。プロテイナーゼＫ（ＰＫ）処理によって、全てのタンパク質結合コンジュゲートがリカバーされた。還元グルタチオンとインキュベートしたときの（１ｍＭ、２時間）、本発明のコンジュゲートの還元切断（矢印）を示す。

本発明は、高分子薬物を含むコンジュゲート（conjugate）及びその前駆体に焦点を合わせている。高分子薬物は、これに限定されないが、例えばオリゴヌクレオチド、いくつかの実施形態では、生体膜及び生物学的障壁を横断して薬物を送達するように設計された分子送達システムに結合されたｓｉＲＮＡ、であり得る。この新規な分子送達システムは、膜内部電界によってエネルギーを与えられる経膜送達部分と、細胞質で還元されるように設計された酸化還元感受性ジスルフィド部分とを含み、カーゴ薬物を放出して標的部位でその薬理効果を発揮する。この新規な分子送達システムは、血漿タンパク質の有無にかかわらず作動する。

別の実施形態では、化学式（ＩＩＩ）に係るコンジュゲートであって、Ｅ、Ｅ´、及びＥ´´の少なくとも１つが、下記の化学式（ＩＶ）または（ＩＶａ）に示す構造で表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、金属キレート、または塩の溶媒和物若しくは水和物を含む、下記の化学式（ＩＶ）または（ＩＶａ）に示す構造を有するコンジュゲートが提供される。

別の実施形態では、化学式（ＩＩＩ）に係るコンジュゲートであって、Ｅ、Ｅ´、及びＥ´´の少なくとも１つが、下記の化学式（Ｖ）または（Ｖａ）に示す構造で表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、金属キレート、または塩の溶媒和物若しくは水和物を含む、下記の化学式（Ｖ）または（Ｖａ）に示す構造を有するコンジュゲートが提供される。

本発明のコンジュゲートによって送達される薬物（すなわち、Ｄ部分）は、低分子薬物であってもよいし、高分子薬物、例えばペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチド（例えば、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡ）など、であってもよい。本発明の一実施形態では、送達される高分子としては、遺伝子抑制（サイレンシング）のためのＲＮＡ鎖、すなわちｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）としての役割を果たすように設計されたＤＮＡ配列が挙げられる。

本発明の実施形態は、生体膜を横断して、または、血液脳関門（ＢＢＢ）、血液眼関門（ＢＯＢ）、血液胎児関門（胎盤血液関門）などの生物学的障壁を通過して、薬物を細胞質内に送達するシステムを含む、新規なコンジュゲートに関する。

本発明の文脈における「アルコールの保護基」という用語は、当分野で既知のように、特定の化学反応中にヒドロキシル基を「マスク」するためにヒドロキシル基に結合され、かつその後に除去可能な化学基を指す。このような保護基の例は、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンジル（Ｂｎ）、β－メトキシエトキシメチルエーテル（ＭＥＭ）、ジメトキシトリチル［ビス（４－メトキシフェニル）フェニルメチル］（ＤＭＴ）、メトキシメチルエーテル（ＭＯＭ）、メトキシトリチル［（４－メトキシフェニル）ジフェニルメチル］（ＭＭＴ）、ｐ－メトキシ－ベンジルエーテル（ＰＭＢ）、ピバロイル（Ｐｉｖ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トリチル（トリフェニルメチル、Ｔｒ）、シリルエーテル［例えば、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、トリ－イソ－プロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）、及びトリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）エーテル］、エトキシエチルエーテル（ＥＥ）、ホスホロアミダイト、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）である。

本発明の文脈における「前駆体」という用語は、コンジュゲートの合成中に除去または修飾される化学基に結合される本発明のＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分に関する。このような除去または修飾は、合成の様々な段階、例えば、これに限定しないが、オリゴヌクレオチド薬物などの高分子薬物へのＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分の結合中に生じ得る。

本発明の実施形態はまた、治療を必要とする対象における医学的疾患を治療するための、タンパク質またはオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡまたはＡＳＯ）などの治療上有用な薬物を含む、本発明によるコンジュゲートの使用に関する。医学的疾患は、これに限定しないが、特定のタンパク質が疾患の原因または発症のいずれかに関与し、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス機構を介した各遺伝子の発現の調節、あるいは治療用タンパク質による（例えば、抗体による、またはタンパク質置換療法による）各タンパク質の活性の調節によって、疾患関連プロセスの阻害または疾患の根底原因の治療において有益な効果を有し得る、変性疾患、癌、外傷性傷害、毒性傷害、虚血性傷害、感染症疾患、または免疫媒介性疾患であり得る。

例えば、本発明の実施形態によるコンジュゲートは、特定のタンパク質をコードするＤＮＡ配列に対して、またはタンパク質への翻訳が行われる各メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に対して結合する一本鎖または二本鎖核酸鎖（ＤＮＡ、ＲＮＡまたは化学的類似体）の投与を含む医療形態である、アンチセンスまたはｓｉＲＮＡ療法として使用することができる。この療法は、各遺伝子の発現を阻害するように作用し、それによって、疾患の原因または発症に関与し得る各疾患関連タンパク質の産生を防止する。あるいは、本発明のコンジュゲートは、治療用タンパク質、または、例えばＣａｓ９タンパク質などのタンパク質／核酸複合体を含み得る。

本発明の文脈における「薬物」または「薬剤」という用語は、疾患を患っている対象に投与されたときに、対象に有益な効果をもたらすことができる化学物質に関する。有益な効果は、症状の改善、または、疾患プロセスに関与する因子または物質の拮抗作用であり得る。薬物は、遺伝子発現を阻害するために投与される、タンパク質、または一本鎖若しくは二本鎖のＲＮＡ若しくはＤＮＡなどの低分子または高分子を含み得る。とりわけ、薬物は、ｓｉＲＮＡまたはＡＳＯを含み得る。いくつかの実施形態では、薬物は、変性疾患、癌、虚血性傷害、感染性傷害、毒性傷害、または免疫介在性疾患の治療を目的とする。

本発明による用語「生体膜」は、生物学的システムに関連する任意のリン脂質膜を指す。このようなリン脂質膜の例は、細胞の形質膜、細胞内膜、または、例えば血液脳関門（ＢＢＢ）、血液眼関門（ＢＯＢ）、血液胎盤関門などの生物学的障壁である。

本発明の実施形態は、本明細書に記載されたコンジュゲートと、薬学的に許容される担体または塩とを含む薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明のコンジュゲート及び薬学的組成物は、臨床現場においてインビボで使用され得る。

本発明の別の実施形態では、医学的疾患の治療を必要とする対象における医学的疾患の治療に使用するための、本発明のコンジュゲート、または本発明のコンジュゲートを含む薬学的組成物を含む。本発明のさらなる実施形態は、医学的疾患の治療を必要とする対象における医学的疾患を治療するための医薬組成物を調製するための本発明のコンジュゲートの使用を含む。いくつかの実施形態では、医学的疾患は癌である。

本発明の実施形態によるコンジュゲートは、細胞膜または生物学的障壁（例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）など）を介した、ｓｉＲＮＡ、ＡＳＯ、または治療用タンパク質（例えば抗体など）の送達を改善するのに有利であり得る。これにより、例えば、効能、毒性、または薬物動態などの１以上の側面における高分子薬物の性能が改善される。

本発明のコンジュゲートが他の薬物送達システムに対して有利になるように設計される重要な側面は、アルブミンに対する最適化された好ましい結合親和力に関し得る。これは、一方では、体内での長い滞留時間を可能にすると共に、全身中への広い分配、及び血漿溶解酵素による分解からの保護を与える。そして、他方では、コンジュゲートをリン脂質細胞膜に優先的に結合させ、リン脂質細胞膜を横断して細胞内に輸送するために、コンジュゲートをアルブミンから効果的に離脱させることを可能にする。

本発明のコンジュゲートが他の薬物送達システムに対して有利になるように設計される別の重要な側面は、高分子薬物を放出して標的部位でその薬理効果を発揮し、細胞質中の構築物の選択的切断を提供する、酸化還元反応感受性部分、すなわちジスルフィド基を含むことに関し得る。

本発明の一実施形態では、薬物は、ｓｉＲＮＡ、ＡＳＯ、及び治療用タンパク質からなる群より選択される高分子である。

本発明の一実施形態では、化学式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）または（ＶＩＩＩａ）のいずれかに示す構造を有する本発明のコンジュゲートと、薬学的に許容される塩または担体とを含む薬学的組成物が提供される。

本発明の一実施形態では、薬物を、培養物中または生きている動物若しくはヒト対象中の生体細胞に送達する方法であって、生体細胞を本発明のコンジュゲートと接触させるステップを含む方法を提供する。

本発明の一実施形態では、生体膜が、細胞膜及び生物学的障壁からなる群より選択される方法が提供され、生物学的障壁は、血液脳関門、血液眼関門または血液胎児関門から選択される。

本発明の一実施形態では、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分の各々が互いに独立して、薬物に結合された、化学式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）または（ＶＩＩＩａ）のいずれかに示す構造を有するコンジュゲートを提供する。

上述したように、本発明の範囲はまた、「前駆物質」と称される分子を含む。本発明の文脈において「前駆体」は、化学基に結合された、化学式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）または（ＶＩＩＩａ）のいずれかに示す構造を有するＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分のいずれかを含む分子であって、コンジュゲートの合成中に除去または修飾される、すなわち、Ｄ部分をＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分に結合させる段階で除去または修飾される分子である。このような化学基の例は、ホスホロアミダイト、アジド、アセチレン、ジメトキシトリチル［ビス（４－メトキシフェニル）フェニルメチル］（ＤＭＴ）、またはＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基である。

Ｄがオリゴヌクレオチド薬物（例えばｓｉＲＮＡ）である本発明のより具体的な実施形態では、本発明は、前駆体であって、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分のＤへの結合中に除去または修飾される化学部分がホスホロアミダイト及び／またはＤＭＴを含む前駆体を提供する。

さらに別の前駆体は、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分をタンパク質薬物であるＤに結合させる役割を果たす。この前駆体では、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、下記の構造のうちの１つに結合される。

式中、Ｗは、化学式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）または（ＶＩＩＩａ）のいずれかに示す構造を有するＥ、Ｅ´またはＥ´部分から選択される。この前駆体は、そのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）部分を介してタンパク質のリジン側鎖のアミン基に結合することを目的としている。

本発明の実施形態は、化学式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）または（ＶＩＩＩａ）のいずれかに示す構造を有するコンジュゲートと、薬学的に許容される塩または担体とを含む薬学的組成物をさらに含み得る。

本発明はまた、インビトロまたはインビボで、遺伝子発現を特異的に阻害するための方法を含む。一実施形態では、本方法は、Ｄが特定の遺伝子の発現を抑制するように設計されたｓｉＲＮＡまたはＡＳＯである、化学式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）のいずれかに示す構造を有するコンジュゲート、またはその薬学的組成物の利用を含み得る。いくつかの実施形態では、遺伝子は、疾患の病因または発症に関与する病原性タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、Ｄは、治療用タンパク質である。

本発明の一実施形態では、ｓｉＲＮＡを含むコンジュゲートであって、ｓｉＲＮＡの各末端が、化学式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）または（ＶＩＩＩａ）のいずれかに示す構造を有するＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分に結合された、コンジュゲートが提供される。本発明の別の実施形態では、ｓｉＲＮＡを含むコンジュゲートであって、ｓｉＲＮＡの各末端、及びｓｉＲＮＡ二本鎖内の内部位置が、化学式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）または（ＶＩＩＩａ）のいずれかに示す構造を有するＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分に結合された、コンジュゲートが提供される。

本発明のさらに別の実施形態では、リン脂質膜の外部リーフレットにおける歪み（strain）及び焦点構造摂動（focal structural perturbation）を誘導する方法が提供される。本方法は、本発明のコンジュゲートをリン脂質膜と相互作用させるステップを含む。本発明のコンジュゲートは、ｓｉＲＮＡ二本鎖を含み、ｓｉＲＮＡの各末端、及びｓｉＲＮＡ二本鎖内の内部位置が、化学式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）または（ＶＩＩＩａ）のいずれかに示す構造を有するＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分（すなわち、全部で２～３個の部分）に結合されている。

本発明のコンジュゲートのこの構造に起因して、ｓｉＲＮＡは、膜の表面に平行に接近し、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分は、膜の表面に垂直な膜コアに向かって配向される（図１Ａ、図１Ｂ及び図１Ｃに示す）。この結果、高度に負に荷電したｓｉＲＮＡが膜表面に接近し、これにより、リン脂質膜の外部リーフレットの歪み及び焦点構造摂動が誘導される。このような外膜の歪み及び焦点構造摂動は、とりわけ、エンドサイトーシスの開始、または、ｓｉＲＮＡを有するコンジュゲートの、膜リーフレットの一方から他方への通過（その反対も可）の誘導に有用であり得る。両方のプロセスは、ｓｉＲＮＡの経膜送達の開始及び／または進展に非常に有用である可能性がある。上記のリン脂質膜は、インビトロまたはインビボのいずれかにおける、これに限定しないが、リポソームまたは細胞膜を含む任意のリン脂質膜であり得る。

本発明の実施形態によるコンジュゲートは、医学的疾患の治療のために使用され得る。本発明の実施形態は、医療方法であって、化学式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）または（ＶＩＩＩａ）のいずれかに示す構造を有するコンジュゲート（式中、Ｄは、医学的疾患の治療に有用な薬物である）を含む治療有効量の薬学的組成物を、治療を必要とする対象に投与するステップを含む医療方法を提供する。

一実施形態では、本方法は、ｓｉＲＮＡまたはＡＳＯによる遺伝子治療のためのものであり、化学式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）または（ＶＩＩＩａ）のいずれかに示す構造を有するコンジュゲート（式中、Ｄは、特定の対象（患者）の疾患に関与する遺伝子の発現を阻害するのに有用なｓｉＲＮＡ、ＡＳＯまたは治療用タンパク質である）を含む治療有効量の薬学的組成物を、治療を必要とする対象に投与するステップを含む。

本発明の別の態様では、本発明は、疾患を治療タンパク質によって医学的に治療するための方法であって、Ｄが、リン脂質生体膜を横断して、または血液脳関門などの生物学的障壁を通過して細胞に送達されるタンパク質である方法を含む。Ｄが送達される細胞は、インビトロでの細胞培養物、またはインビボでの生きている動物若しくはヒト対象のいずれかである。いくつかの実施形態では、Ｄが送達される細胞は、新生物細胞である。いくつかの実施形態では、新生物細胞は、腫瘍細胞である。いくつかの実施形態では、新生物細胞は、転移内の細胞である。Ｄが送達される細胞は、真核細胞、発癌性因子によってトランスフェクトされた真核細胞、ヒト細胞、前癌細胞である細胞、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。Ｄが送達される細胞は、インビトロ、すなわち細胞培養物内、エクスビボ、またはインビボ、すなわち、生きている動物またはヒト対象の体内に存在し得る。

本発明のさらに別の実施形態では、Ｄは、置換療法として、例えば、変異した機能不全タンパク質を置換して生理学的必要性に対処するために投与されるタンパク質である。別の実施形態では、Ｄは、遺伝子調節に関与するタンパク質であり、とりわけ、ＤＮＡまたはＲＮＡ編集（特定の遺伝子の配列の追加、分断または変更）に関与するタンパク質を含む。一実施形態では、上記のタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）関連タンパク質のメンバーであり得る。具体的には、上記のタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）、ＲＮＡ誘導ＤＮＡヌクレアーゼ酵素、またはその類似体であってもよく、またはそれらを含んでいてもよく、そのガイドオリゴヌクロエチド配列をロード可能である。

本発明の一実施形態では、医学的疾患の遺伝子治療のための方法であって、化学式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）または（ＶＩＩＩａ）のいずれかにのコンジュゲートを含む、治療有効量の医薬組成物を、治療を必要とする対象に投与するステップを含む方法が提供される。Ｄは、例えばＣａｓ９などのＣＲＩＳＰＲタンパク質であり、適切なガイドオリゴヌクレオチドと共に投与され、これにより、ガイドオリゴヌクレオチドがロードされたタンパク質の細胞内への送達が達成され、ＣＲＩＳＰＲタンパク質がそのゲノム編集活性を発揮することができる。この場合のガイドオリゴヌクレオチドは、Ｃａｓ９タンパク質をＤＮＡ上の特定の遺伝子座（部位）に誘導し、その部位での二本鎖ＤＮＡ切断を誘導して遺伝物質の局所的欠陥の修復を可能にするＲＮＡまたはＤＮＡの配列である。Ｃａｓ９の場合、ガイドオリゴヌクレオチドはＲＮＡの短いセグメントであり、その配列は標的ＤＮＡ遺伝子座の配列に対して相補的である。

したがって、本発明の実施形態によるコンジュゲート、医薬組成物、及び方法は、癌、毒性傷害、虚血性疾患、感染症、タンパク質蓄積症、外傷、免疫介在性疾患、または変性疾患から特に選択される医学的疾患の治療においてとりわけ有益であり得る。

したがって、本発明の一実施形態は、医学的疾患を治療する方法であって、治療を必要としている対象に対して、化学式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）または（ＶＩＩＩａ）のいずれかに示す構造を有し、かつＤが医学的疾患の治療に有用な薬物であるコンジュゲートを含む、治療有効量の薬学的組成物を投与するステップを含む、方法である。

いくつかの実施形態では、医学的疾患は癌である。本明細書で使用されるとき、「癌」という用語は、癌を引き起こす細胞の典型的な特徴、例えば、制御されていない増殖、特殊機能の喪失、不死性、有意な転移能、抗アポトーシス活性の有意な増加、急速な増殖及び増殖速度、または特定の特徴的な形態及び細胞マーカーなどを示す細胞の存在を指す。一般的に、癌細胞は腫瘍の形態であり、動物の体内に局所的に存在するか、または、例えば白血病細胞などの独立細胞として血流中を循環する。

神経学的疾患の分野において、本発明の実施形態によるコンジュゲートは、とりわけ、アルツハイマー病、運動ニューロン病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、及びクロイツフェルト・ヤコブ病などの神経変性疾患の治療に有用であり得る。

感染症の分野において、本発明の実施形態によるコンジュゲートは、とりわけ、抗生物質または抗ウイルス剤を細菌またはウイルス病原体に送達するのに有用であり得る。したがって、本発明のコンジュゲートは、抗感染性を有し得、そのため、例えば細菌感染症またはウイルス感染症などの感染症の治療に有用である。

別の実施形態では、本発明は、リン脂質膜を横断した化合物の細胞内への送達を強化するための、本発明の化合物の使用に関する。結合された化合物及び所望の兆候に応じて、このような送達は、様々な有用な用途を有し得る。例えば、植物においては、このような送達は、とりわけ、植物の遺伝子を改良したり、様々な昆虫、細菌、菌類を根絶したりすることにより、作物の品質と量の向上を助けることができる。

このような送達はまた、細菌またはウイルス病原体への抗生物質または抗ウイルス剤の送達にも有用であり得る。したがって、本発明のコンジュゲートは、抗感染性を有し得、そのため、細菌感染症またはウイルス感染症などの感染症の治療に有用である。したがって、本発明の一実施形態は、抗ウイルス剤または抗菌剤に結合されたＥ、Ｅ´、またはＥ´´部分である。このような薬物は、とりわけ、感染性因子の遺伝物質と相互作用することを目的とした遺伝子配列であり得、このため、感染性因子の遺伝物質の複製または代謝を阻害してその生存に影響を及ぼす。

本発明のコンジュゲートは、生体膜を横断した送達における該コンジュゲートの性質によって、虚血性傷害、毒性傷害、外傷性傷害、または遺伝的病因の医学的疾患などの様々な医学的疾患の治療にも有用であり得る。

実施例

本発明をさらに説明するため、及び本発明の実施形態が実際にどのように実施され得るかを示すために、以下にいくつかの例を説明する。

実施例１：Ｄ部分がオリゴヌクレオチドである、本発明の実施形態によるコンジュゲートを合成するための一般的方法

まず、疾患の原因または発症における役割に基づいて、サイレンシング（抑制）される遺伝子を選択した。次いで、当分野で既知のバイオ情報科学方法論に基づき、コンジュゲートに組み込まれるヌクレオチド配列を設計及び決定した（一般的に、ＲＩＳＣ基質の場合は１９～２１塩基対の二本鎖ＲＮＡ、ダイサー基質の場合は２５～２９塩基対の二本鎖ＲＮＡ）。

合成は、３´から５´の方向に行った。固相合成を、保護された２´－デオキシヌクレオシド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、及びＴ）、リボヌクレオシド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）、または化学的に修飾されたヌクレオシド、例えばＬＮＡ（ロックされた核酸）またはＢＮＡ（架橋された核酸）、から誘導されたホスホロアミダイト構築ブロックを用いて適用した。構築ブロックは、所望のｓｉＲＮＡの配列によって決定された順序で、成長オリゴヌクレオチド鎖に順次結合された。

オリゴヌクレオチドの構築の後に、本発明の１以上のＥ部分を、オリゴヌクレオチドの構築ブロックの一部として加えた。まず、上述したように、Ｅ部分をその前駆体形態で加えた。本発明の化合物の主な利点は、Ｅ、Ｅ´、またはＥ´´部分をオリゴヌクレオチドの５´末端、オリゴヌクレオチドの３´末端、またはオリゴヌクレオチドに沿った内部位置のいずれかに結合させるための、化学式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩＩ）または（ＶＩＩＩａ）に示すような均一な結合部分を提供することである。とりわけ、そのような前駆体部分は、当分野で既知のヒドロキシルのための任意の保護基、ホスホロアミダイト、アジド、アセチレン、ジメトキシトリチル［ビス（４－メトキシフェニル）フェニルメチル］（ＤＭＴ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基を含み得る。鎖の組み立てが完了すると、生成物が、固体支持体から溶液中に放出され、脱保護され、集められた。次に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって所望のコンジュゲートを単離することによって、所望の共役オリゴヌクレオチドが高純度で得られた。ｓｉＲＮＡの場合、相補的なＲＮＡ鎖の各々は別々に合成され、その後、２つの鎖のアニーリングを当分野で既知の標準的な条件下で行うことによって、所望の二本鎖ｓｉＲＮＡが得られた。

実施例２：ステロール１の合成方法；本発明のＥ部分の共通構築ブロック

開始物質であるペルフルオロ－ｔｅｒｔ－ブタノールは、市販されている。合成は、エストラジオールから開始し、下記のスキーム１に従って行った。

エストラジオールをベンジル基で保護することによって化合物１１を得た。アルコール１１（２５．６グラム）を、最適化された反応条件下（臭化アリル、ＮａＨ触媒）でアリル化した。臭化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＩ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）の１６時間の還流によって、アリルエーテル１２（２１．８５ｇ、７７％）が、白色固体（ヘプタン及びＭｅＯＨ中での連続的な粉砕によって精製された）として得られた。標準的な酸化的後処理（ＮａＯＨ／Ｈ_２Ｏ_２）をしたときの、末端アルケン（２１．８グラム）の９－ボラビシクロ［３．３．１］ノナン（９ＢＢＮ）による部位選択的ヒドロホウ素化によって、アルコール１３を得た。アルコール１３（１３．６グラム）と過剰のペルフルオロ－ｔｅｒｔ－ブタノールとを、最適反応条件下［アゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＤＩＡＤ）、ＰＰｈ３、４Ａモレキュラーシーブ（ＭＳ）、ＴＨＦ、室温、１６時間］で光延反応させることにより、所望のエーテル１４を得た。化合物１４を、ＴＨＦと２、２、２－トリフルオロエタノールとの混合物（１：１）を溶媒（５バール、パール反応器）として使用して接触水素化させることによって（１０％Ｐｄ／Ｃ、室温）、フェノール１を灰白色固体として得た（～１８時間後）。

実施例３：アポ－Ｓｉ－Ｋ－９３－Ａ前駆体の合成方法

アミン７の合成：

エストロンをプロパンジオール及びオルトギ酸トリメチルで処理して化合物２を得た。化合物２をＬｉＡｌＨ_４及びＡｌＣｌ_３で処理して開環生成物３を得た。このフェノールをブロモ酢酸メチルでアルキル化して化合物４を得た。光延条件を用いて、ペルフルオロ－ｔｅｒｔ－ブタノール部分に誘導した（化合物５）。化合物５をメチルアミンで処理してアミド６を得た。ＢＨ_３．ＤＭＳを用いてアミドを還元してアミン７を得た。

チオトシラート１４の合成：

チオトシラート１３の合成は、ジアゾ酢酸エチルと３－クロロプロパン－１－オールとの結合によって開始され、これにより、エーテル８を得た。次いで、エステルを還元してアルコール９を得た。マロン酸ジエチルを塩化物９でアルキル化して化合物１０を得た。次に、このアルコールを、ＮＣＳ及びＰＰｈ３を用いて塩素化して塩化物１１を得た。このエステルを、ＬｉＡｌＨ_４を用いて還元してジオール１２を得た。最後に、この塩化物をチオトシラートカリウムで置換して所望の構築ブロックチオトシラート１３を得た。

アポ－Ｓｉ－Ｋ－９３－Ａの合成：

合成は、下記の合成スキーム３に従って行った。

アミン７を１－ブロモ－３－クロロプロパンでアルキル化したが、この条件では収率がかなり低いことが分かった。しかし、アクロレイン由来のチオアルデヒド１４を用いて還元的アミノ化を行うと、はるかに良い収率が得られ、全合成体からチオアセテート交換の必要性が除去された。アクロレインを、塩基存在下でチオ酢酸により処理することによって、良好な転化率が得られた。所望の物質を、フラッシュクロマトグラフィーを用いて５５％の収率で単離した。その後、アルデヒド１４による還元アミノ化によって、化合物１５を５９％の収率で得た。

メタノール中のナトリウムメトキシドをチオアセテート１５及びチオトシラート１３の溶液に添加して、チオアセテート１５からアセテートを除去した。そして、その結果得られたチオールをチオトシラート１３と反応させて、所望の非対称ジスルフィド（１６）を形成した。化合物１６をＤＭＴ－Ｃｌと反応させてモノ－保護ジオール１７を得た。適切なホスホロアミダイト剤と反応させることによって、アポ－Ｓｉ－Ｋ－９３－Ａを得た。酸不安定ホスホロアミダイト生成物の精製は、Ｅｔ３Ｎで前処理したシリカを使用するフラッシュクロマトグラフィーを用いて行った。最終的に、４×２２０ｍｇが得られた。

実験セクション

（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ）－１３－メチル－６、７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６－デカヒドロスピロ［シクロペンタ［ａ］フェナントレン－１７、２´－［１、３］ジオキサン］－３－オール（２）

トルエン（３００ｍＬ）中のエストロンの懸濁液（６７．９ｇ、０．２５１ｍｏｌ）に、１、３－プロパンジオール（７０ｍＬ）及びオルトギ酸トリメチル（１００ｍＬ）を加えた。懸濁液をｐＴｓＯＨ（１ｇ、５ｍｍｏｌ）で処理し、６０°Ｃに１６時間加温した。室温に冷却後、トリエチルアミン（１０ｍＬ）及び水（１００ｍＬ）を加え、撹拌を３０分間続けた。相は分離され、有機相を水（２×１００ｍＬ）及びブライン（塩水）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮した。この粗物質をトルエン（１５０ｍＬ）に溶解させ、さらにヘプタン（７５０ｍＬ）をゆっくり添加して希釈し、白色沈殿を形成させた。この固形物を濾取し、真空で乾燥させた。化合物２（７１．１ｇ、２１７ｍｍｏｌ）が、白色固体として８６％の収率で単離された。

（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－（３－ヒドロキシプロポキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－オール（３）

０°ＣのＴＨＦ（１．５Ｌ）中の化合物２（７１．４ｇ、２１７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＬｉＡｌＨ_４（１０ｇ、２６３ｍｍｏｌ）及びＡｌＣｌ_３（１１６ｇ、８７２ｍｍｏｌ）を注意深く添加した。発熱反応物をさらに３０分間０°Ｃで撹拌し、その後、この固体を５０°Ｃに加温しながら、機械的撹拌（ｒｏｔａｖａｐを使用）を３時間行った。この混合物を０°Ｃに冷却し、水性飽和塩化アンモニウム（１５０ｍＬ）を滴下した。この混合物をさらに３０分間撹拌し、その後、シリカのショートパスで濾過し、固体を酢酸エチルで洗浄した。有機層を回収し、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濃縮した。この粗物質（８９．２）は主に化合物３であったが、精製は次の工程の後に行った。

２－（（（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－（３－ヒドロキシプロポキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）酢酸メチル（４）

粗物質３（８９．４ｇ）をアセトン（１．２５Ｌ）及びＭｅＯＨ（０．２Ｌ）に溶解させ、炭酸カリウム（６０ｇ、４３５ｍｍｏｌ）及びブロモ酢酸メチル（５０ｍＬ、４３５ｍｍｏｌ）で処理した。懸濁液を６０°Ｃに温め、撹拌を１６時間続けた。ＴＬＣに基づき、すべてのフェノール部分をアルキル化した。混合物を室温に冷却し、濾過した。濾液を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーを用いてさらに精製した（ヘプタン中の２０％ないし３０％ＥｔＯＡｃでの溶出により、全ての不純物、１００％ＥｔＯＡｃを除去して所望の材料を得る）。化合物４（５６．７ｇ、１４０．３ｍｍｏｌ）が、黄色油として６５％の収率で単離された。

酢酸メチル２－（（（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－（３－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）プロポキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）（５）

ＴＨＦ（１Ｌ）中の化合物４（５６．７ｇ、１４０．３ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフェニルホスフィン（５５．４ｇ、２１１ｍｍｏｌ）、ノナフルオロ－ｔｅｒｔ－ブチルアルコール（３０ｍＬ）及びジ－ｔｅｒｔ－ブチルアゾジカルボキシレート（３８．５ｇ、１６７ｍｍｏｌ）を加えた。ＴＬＣが完全に転化したとき、混合物を３０分間攪拌した。ヘプタン（５００ｍＬ）を加え、混合物を約５００ｍＬまで部分的に濃縮した。さらに、ヘプタン（１Ｌ）を加え、その混合物を室温で一晩撹拌した。沈殿が形成され、その沈殿を濾取し、濾液を濃縮し、微量のＤＢＡＤ及びトリフェニルホスフィンが混入していたが、化合物５を黄色シロップとして得た。

２－（（（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－（３－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）プロポキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）－Ｎ－メチルアセトアミド（６）

化合物５の粗シロップをＭｅＯＨ（２５０ｍＬ）で希釈し、４０％水性メチルアミン（３５０ｍＬ）を加えた。ＴＬＣが完全な転化を示したとき、白色沈殿物を１時間攪拌した。水（１Ｌ）を加え、固形物を濾取した。残渣を水で洗浄し、ジクロロメタン（１Ｌ）に溶解させた。有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮した。さらに、約７ｃｍのシリカ及びヘプタン中の１５％ＥｔＯＡｃでの初期溶出を用いて精製を行った。カラムからすべての不純物を除去した後、化合物６を１００％ＥｔＯＡｃで溶出させた。微量のトリフェニルホスホキシドが残存していたが、化合物６（８２．０ｇ、１３２ｍｍｏｌ）が白色固体として９４％の収率で単離された。

２－（（（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－（３－（（１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）プロポキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）－Ｎ－メチルエタン－１－アミン（７）

ＴＨＦ（５００ｍＬ）中の化合物６（５６．０ｇ、９０．５ｍｍｏｌ）の６５°Ｃの溶液に、ＢＨ_３．ＤＭＳ（５６ｍＬ、５９０ｍｍｏｌ）を滴下した。還流をさらに５時間継続し、その後、混合物を室温に冷却した。混合物をＭｅＯＨ（３００ｍＬ）に注意深く溶解させ、ＨＣｌ（５０ｍＬ）中の４Ｍジオキサンを加えた。溶液を３０分間還流し、その後、室温に冷却し、濃縮した。混合物をＭｅＯＨ（３００ｍＬ）中に溶解させ、３０分間還流した。冷却及び濃縮後、シロップをＣＨ_２Ｃｌ_２（１Ｌ）中に溶解させ、水性飽和重炭酸ナトリウム（２倍）で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮した。化合物７（５０．０ｇ、８２．６ｍｍｏｌ）が、９１％の収率でゆっくりと固化した透明油状物として単離された。微量のトリフェニルホスホキシドが残存する不純物プロファイルは化合物６と同様であった。

チオトシラート１３の合成：

２－（３クロロプロポキシ）酢酸エチル（８）

ＣＨ_２Ｃｌ_２（２５０ｍＬ）中の３－クロロプロパン－１－オール（２０ｍＬ、２３９ｍｍｏｌ）の溶液に、ジアゾ酢酸エチル（２５ｍＬ、２３９ｍｍｏｌ）を０°Ｃで添加した。その後、ＢＦ_３．ＯＥｔ_２（０．３ｍＬ、２．３９ｍｍｏｌ、０．０１当量）を加えた後、氷浴を除去し、混合物を３７°Ｃに温め、ガスの発生が止まるまで（２時間）その温度で撹拌した。混合物をＨ_２Ｏ（２５０ｍＬ）及びブライン（２５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮し、エーテル８（４４ｇ、２４０ｍｍｏｌ、ｑｕａｎｔ．）を黄色油状物として得た。

２－（３クロロプロポキシ）エタン－１－オール（９）

Ｅｔ_２Ｏ（７５０ｍＬ）中のＬｉＡｌＨ_４（１２ｇ、３１６ｍｍｏｌ）の氷冷懸濁液に、エステル８（５７ｇ、３１６ｍｍｏｌ）の溶液をゆっくり添加し、その結果得られた混合物を室温で一晩撹拌した。ＫＯＨ（ａｑ．２０％５１ｍＬ）を０°Ｃでゆっくり添加することによって反応をクエンチした。混合物を室温で３０分間攪拌した後、セライト上で濾過した。濾液をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮し、アルコール９（３３ｇ、２４０ｍｍｏｌ、７６％）を透明油状物として得た。

２－（３－（２－ヒドロキシエトキシ）プロピル）マロン酸ジエチル（１０）

ＤＭＦ（５００ｍＬ）中のマロン酸ジエチル（２５ｍＬ、１６６ｍｍｏｌ）及びアルコール９（２３ｇ、１６６ｍＬ）の溶液に、Ｋ_２ＣＯ_３（３４ｇ、２４９ｍｍｏｌ）及びＮａＩ（２５ｇ、１６６ｍｍｏｌ）を加え、その結果得られた混合物を９０°Ｃで６４時間撹拌した。Ｈ_２Ｏ（１．５Ｌ）を加え、ＥｔＯＡｃ（３×５００ｍＬ）によって混合物を抽出した。組み合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上に乾燥させ、濃縮した。この粗物質をカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ヘプタンが１：１）を用いて精製し、生成物１０（１７ｇ、６５ｍｍｏｌ、３９％）を透明な黄色がかった油として得た。

２－（３－（２クロロエトキシ）プロピル）マロン酸ジエチル（１１）

ＣＨ_２Ｃｌ_２（５００ｍＬ）中のアルコール１０（１７ｇ、６５ｍｍｏｌ）の溶液にＰＰｈ３（２６ｇ、９８ｍｍｏｌ）及びＮ－クロロコハク酸イミド（１１ｇ、７８ｍｍｏｌ）を加え、その結果得られた混合物を室温で一晩撹拌した。ヘプタン（３００ｍＬ）を添加し、混合物を部分的に濃縮した。形成された固体を濾取し、濾液を濃縮した。この粗物質をカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の２０％ＥｔＯＡｃ）を用いて精製し、塩化物１１（１４ｇ、４９ｍｍｏｌ、７５％）を透明油状物として得た。

２－（３－（２クロロエトキシ）プロピル）プロパン－１、３－ジオール（１２）

Ｅｔ_２Ｏ（５００ｍＬ）中のＬｉＡｌＨ_４（７．３ｇ、１９２ｍｍｏｌ）の氷冷懸濁液に、ジエチルエステル１１（２７ｇ、９６ｍｍｏｌ）の溶液をゆっくり添加し、その結果得られた混合物を室温で一晩撹拌した。ＫＯＨ（ａｑ．２０％３１ｍＬ）を０°Ｃでゆっくり添加することによって反応をクエンチした。混合物を室温で３０分間攪拌した後、セライト上で濾過した。濾液をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮し、ジオール１２（１４ｇ、７３ｍｍｏｌ、７６％）を透明油状物として得た。

Ｓ－（２－（（５－ヒドロキシ－４－（ヒドロキシメチル）ペンチル）オキシ）エチル）４－メチルベンゼン－スルホンチオエート（１３）

ジオール１２（１４ｇ、７３ｍｍｏｌ）の溶液に、チオトシル酸カリウム（２５ｇ、１１０ｍｍｏｌ）及びＴＢＡＩ（２．７ｇ、７．３ｍｍｏｌ）を加え、その結果得られた混合物を８０°Ｃで６４時間撹拌した。混合物を濃縮し、この粗物質をカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中に４０％アセトン）を用いて精製し、チオトシラート１３（５．０ｇ、１４ｍｍｏｌ、２０％）を黄色油状物として得た。

アポ－Ｓｉ－Ｋ－９３－Ａの合成

Ｓ－（３－オキソプロピル）エタンチオエート（１４）

アクロレイン（１１ｇ、１９６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２５０ｍＬ）溶液に、トリエチルアミン（６．９ｍＬ、４９ｍｍｏｌ）及びチオ酢酸（１３．８ｍＬ、１９５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、その後、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン中に１５％ＥｔＯＡｃ）を用いてさらに精製することによって、化合物１４（１４．４ｇ、１０９ｍｍｏｌ）を褐色油状物として５５％の収率で得た。

Ｓ－（６－（（２－（（（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－（３－（（１、１、１、３、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）プロポキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）エチル）（メチル）アミノ）ヘキシル）エタンチオエート（１５）

１、２－ジクロロエタン（５００ｍＬ）中の７（２０．６ｇ、３４ｍｍｏｌ）溶液に、酢酸（８．２ｍＬ、１３６ｍｍｏｌ）及びアルデヒド１４（５．４ｇ、４１ｍｍｏｌ）を添加し、その１分後にトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（３０ｇ、１４１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で２時間撹拌し、その後ジクロロメタンを加え、混合物を１ＭＮａＯＨ、水及びブラインで洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン中に１５％～２５％勾配のアセトン、及び０．１％Ｅｔ３Ｎ）を用いてさらに精製することによって、化合物１５（１４．４ｇ、２０ｍｍｏｌ）が透明油状物として５９％の収率で単離された。

２－（３－（２－（（３－（（２－（（（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－（３－（（１、１、１、１、３、３、３－ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）プロポキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）エチル）（メチル）アミノ）プロピル）ジスルファネイル）エトキシ）プロピル）プロパン－１、３－ジオール（１６）

ＣＨ_２Ｃｌ_２（２００ｍＬ）及びメタノール（２０ｍＬ）中のチオアセテート１５（１．９ｇ、２．６ｍｍｏｌ）及びチオトシラート１３（１．８ｇ、５．１ｍｍｏｌ、２当量）の溶液を、ＭｅＯＨ（１．４２ｍＬ、７．７ｍｍｏｌ、３当量）中の５．４ＭＮａＯＭｅで処理した。混合物を室温で一晩撹拌した。混合物をＮａＨＣＯ_３（２００ｍＬ）及びブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン中に３０％アセトン＋１％Ｅｔ_３Ｎ）を用いてさらに精製することによって、化合物１６（１．２ｇ、１．４ｍｍｏｌ、５３％）を黄色がかった油状物として得た。

２－（（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）－５－（２－（（３－（（２－（（（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－（３－（（１、１、１、３、３、３ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）プロポキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）エチル）（メチル）アミノ）プロピル）ジスルファネイル）エトキシ）ペンタン－１－オール（１７）

１６（１．２ｇ、１．４ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ_３Ｎ（０．１４ｍＬ、１．４ｍｍｏｌ、１当量）及びＤＭＡＰ（１６ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ、０．１当量）を添加した。その結果得られた混合物にＤＭＴ－Ｃ１（０．４７ｇ、１．４ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。その結果得られた黄色混合物を室温で一晩攪拌し、その後、濃縮した。カラムクロマトグラフィー（ヘプタン中に２０％アセトン及び１％Ｅｔ_３Ｎ）による精製によって、モノ保護アルコール１７（１．０ｇ、０．８７ｍｍｏｌ、６３％）を透明の黄色がかった油状物として得た。

２－（（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）－５－（２－（（３－（（２－（（（８Ｒ、９Ｓ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｓ）－１７－（３－（（１、１、１、３、３、３ヘキサフルオロ－２－（トリフルオロメチル）プロパン－２－イル）オキシ）プロポキシ）－１３－メチル－７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－デカヒドロ－６Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）エチル）（メチル）アミノ）プロピル）ジスルファネイル）エトキシ）ペンチル（２－シアノエチル）ジイソプロピルホスホロアミダイト（アポＳｉ－Ｋ－９３－Ａ）。

ジクロロメタン（４０ｍＬ）中のモノ保護ジオール１７（１．０ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）溶液に、２－シアノエチルＮ、Ｎ、Ｎ´、Ｎ´－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．４ｍＬ、１．２５ｍｍｏｌ、１．３当量）、並びに、ジクロロメタン（２．５ｍＬ、ホスホロアミダイト剤に対してＮ－メチルモルホリンの１当量）中の０．５ＭのＮ－メチルモルホリン溶液及び０．２５Ｍトリフルオロ酢酸を加えた。黄色がかった溶液を室温で２時間撹拌した。ＴＬＣは不完全な転化を示したので、さらに、０．２ｍＬの２－シアノエチルＮ、Ｎ、Ｎ´、Ｎ´－テトライソプロピルホスホロジアミダイトを加えた。１時間後、混合物を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でクエンチし、さらに１０分間撹拌した。有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン中に１５％アセトン及び１％Ｅｔ３Ｎ）を用いてさらに精製することにより、化合物アポ－Ｓｉ－Ｋ－９３－Ａ（８８０ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ、７４％）を無色油状物として得た。

実施例４：オリゴヌクレオチド鎖内の内部位置での本発明のＥ部分の結合モード

まず、Ｅ部分は、その前駆体形態にあり、その２つのヒドロキシル基は、ジメトキシトリチル［ビス（４－メトキシフェニル）フェニルメチル］（ＤＭＴ）及びホスホロアミダイトの各々によって保護されている。通常、オリゴヌクレオチドの合成は、保護されたヌクレオチドの３´から５´方向への連続的な付加によって行われる。ホスホロアミダイトは、オリゴヌクレオチド鎖の５´末端のヒドロキシル基との結合に用いられる。その後、ＤＭＴが除去され、各ヒドロキシル基は、鎖に取り込まれる次のヌクレオチドの３´－ヒドロキシルに結合されたホスホロアミダイト部分に結合される。ｓｉＲＮＡのセンス鎖（パッセンジャー鎖）及びガイド鎖（アンチセンス鎖）の両方の合成の完了後、当分野で既知のように、アニーリング手順が行われ、これにより、本発明の最終的なＲＮＡ二本鎖コンジュゲートが得られる。ｓｉＲＮＡの性能を最適化するために、内部位置のＥ部分はセンス鎖（パッセンジャー鎖）に結合される。これは、センス鎖（パッセンジャー鎖）がＲＩＳＣ複合体内で除去され、これにより、ガイド鎖（アンチセンス鎖）がＲＩＳＣ遺伝子サイレンシング装置において間断なく作用することが可能になるためである。

実施例５：カーゴ薬物（例えばｓｉＲＮＡ）を放出するための、細胞質内のＥ部分の酸化還元媒介の脱離及び除去

本発明のＥ、Ｅ´またはＥ´´部分は、ｓｉＲＮＡコンジュゲートの経膜送達に必須であるが、これらの部分は、コンジュゲートが細胞質に到達した後に除去し、体内から排出することが望ましい。カーゴ薬物がｓｉＲＮＡである場合は、ｓｉＲＮＡと遺伝子サイレンシングタンパク質複合体（ダイサー及びＲＩＳＣ）との相互作用における立体干渉の回避に有益であり得る。加えて、このようなカーゴ薬物のＥ部分からの脱離は、細胞リン脂質膜上のコンジュゲートの負荷を最小化するので、安全性の観点から有利であり得る。この目的のために、本発明の全てのＥ部分はジスルフィド部分を含む。細胞外環境で主流であるような酸化的条件下では、ジスルフィド部分は安定性を示す。そのため、コンジュゲートをインビボで全身投与すると、コンジュゲートが体内に広がって、細胞リン脂質膜を通過して細胞内に入ることを可能にする。対照的に、細胞質は、主にグルタチオンの高濃度に起因する高度に還元的な環境であり、約４桁の大きさの細胞質／細胞外空間濃度勾配を示す。細胞質内のこのような顕著な還元条件に起因して、Ｅ部分のジスルフィド基は細胞質環境で還元される。その結果、カーゴ薬物（例えばｓｉＲＮＡ）が放出され、その薬理活性を細胞質の標的部位（例えば、遺伝子サイレンシングのためのダイサーまたはＲＩＳＣタンパク質複合体）で発揮する。同時に、ステロール骨格を有する本発明のＥ部分は、他のステロール系分子（例えばエストロゲン）と同様に、直接にまたは代謝後（例えば、肝臓におけるシトクロムＰ－４５０媒介代謝）に、胆汁及び／または尿によって体内から排泄される。

実施例６：化学式（ＩＶａ）に示す構造を各々有する３つのＥ部分を含む本発明のｓｉＲＮＡコンジュゲートの例示的構造及びその作用モード

コンジュゲートは、図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ及び２Ｄに示されている。最初、コンジュゲートは酸化状態にあり、したがって、ジスルフィド部分を含む。例示されているのはダイサー基質であり、ＲＮＡ鎖は２５及び２７ヌクレオチドの長さを有する。長い方の鎖（ガイド鎖、アンチセンス鎖）は、その３´末端に、酵素との結合に必要な２ヌクレオチドのオーバーハングを有する。加えて、センス鎖（パッセンジャー鎖）は、正に荷電したアミノ酸によって覆われた酵素の各結合ポケットを占めるために、その５´末端に遊離リン酸を有する。Ｅ部分のうちの２つはパッセンジャー鎖に結合される。第１のＥ部分はパッセンジャー鎖の５´末端に結合され、第２のＥ部分はパッセンジャー鎖のほぼ中央に結合される。そして、第３のＥ部分は、ガイド鎖の５´末端に結合される。初めは、コンジュゲートは細胞外空間に特徴的な酸化状態にあり、このため、Ｅ部分のジスルフィド基は保存される。細胞質に入ると、周囲の還元状態に起因してジスルフィド結合は還元され、Ｅ部分はＲＮＡから切断されて体内から排泄され、それぞれが小さな残基断端（図２Ｂ）を残す。次いで、ダイサー酵素によりＲＮＡ二本鎖が切断され、２１／２３のヌクレオチド長さの二本鎖が形成され、これにより、ガイド鎖の断端も除去される（図２Ｃ）。次に、ＲＮＡ二本鎖は、細胞質ＲＮＡ誘導サイレンシングタンパク質複合体（ＲＩＳＣ）に入る準備ができている。まず、酵素ヘリカーゼを作用させて、パッセンジャー鎖の除去を行う。これには、パッセンジャー鎖に結合している２つの残基断端も含まれる。その結果（図２Ｄ）、ガイド鎖は無傷でＲＩＳＣ複合体に送達され、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡと相互作用してその分解を引き起こし、これにより、所望の遺伝子サイレンシングを誘導する。

実施例７：アポ－Ｓｉ－Ｋ－９３－Ａの生物学的性能

アポ－Ｓｉ－Ｋ－９３－Ａの生物学的性能を以下の側面で評価した。これらは全て、臨床現場においてインビボでの、このＥ部分を含むコンジュゲートの用途を予測するのに重要である。これらの実験のために、ダイサー基質であり、ＥＧＦＰ遺伝子をサイレンシングするようにそれぞれ設計された２つのｓｉＲＮＡ二本鎖を使用した。第１の二本鎖では、アポ－Ｓｉ－Ｋ－９３－Ａ部分は、各ＲＮＡ鎖の５´末端に結合されている（この第１の二本鎖はＫ－９３－Ａと命名した）。第２の二本鎖では、アポ－Ｓｉ－Ｋ－９３－Ａ部分は、各ＲＮＡ鎖の５´－末端に結合されているが、第３のアポ－Ｓｉ－Ｋ－９３－Ａ部分は、パッセンジャー（ガイド）鎖に沿った内部位置の１４番目のヌクレオチドの部位に結合されている。したがって、この第２の二本鎖はＫ－９３－Ａ－ｄｅｌ－１４と命名した。これらの各構築物のヌクレオチド配列は下記の通りである（ｒはリボースを意味し、ｍはメチル化を意味する）。

１．Ｋ－９３－Ａ構築物：
センス：５´－ｐｈｏｓ／ｉアポ－Ｓｉ－Ｋ９３－Ａ／ｍＡｍＣｒＣｍＣｒＵｍＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＵｍＣｒＡｍＵｒＣｍＵｒＧｍＣｒＡｒＣｒＣｒＡｒＣｍＣＧｒＵｒＣｒＡ
アンチセンス：５´－ｐｈｏｓ／ｉアポ－ＳｉＫ－９３－Ａ／ｒＣｒＧｍＧｒＵｒＧｒＧｒＵｒＧｍＣｒＡｍＧｒＡｍＵｒＧｒＡｒＡｒＣｒＵｒＧｍＧｒＧｍＵｍＣｍＡ

２．Ｋ－９３－Ａ－ｄｅｌ－１４構築物：
センス：５´ｐｈｏｓ／ｉアポ－Ｓｉ－Ｋ－９３－Ａ／ｍＡｍＣｒＣｍＣｒＵｍＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＵｍＣｒＡ／ｉアポ－ＳｉＫ９３－Ａ／ｒＣｍＵｒＧｍＣｒＡｒＣｒＣｒＡｒＣｍＣＧ
アンチセンス：５´ｐｈｏｓ／ｉアポ－Ｓｉ－Ｋ－９３－Ａ／ｒＣｒＧｍＧｒＵｒＧｒＧｒＵｒＧｍＣｒＡｍＧｒＡｍＵｒＧｒＡｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＧｍＧｒＧｍＵｍＣｍＡ

次いで、両方のコンジュゲートを以下の評価に供した。

１．アルブミンとのインキュベート時のタンパク質非含有画分：

血液への投与時に実施するために、薬物が、血液タンパク質に結合する画分と、細胞外空間を自由に通過して細胞内へ移動する自由画分との両方を有することが有益である。アポ－Ｓｉ－Ｋ－９３－Ａについてこの側面を調べるために、ゲル電気泳動を用いた。２０ｐｍｏｌｅのＲＮＡ試料をＴｒｉｓ緩衝液（ｐｈ＝７．４）で希釈し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えて２ｍｇ／ｍｌの最終濃度にした。全試料を２５℃で一晩インキュベートした。その後、これらのＲＮＡ試料を１２％天然ポリアクリルアミドゲル上にロードし、電場上で５Ｖ／ｃｍ（バイオラッドミニプロテアン）で１時間移動させた。対照サンプルには、ＢＳＡではなく水で希釈したＲＮＡサンプルと、アルブミンのタンパク質分解によってタンパク質結合コンジュゲートを放出することを目的としてプロテイナーゼＫ（シグマ）で３７°Ｃで２時間処理した反応混合物とが含まれる。アルブミンに強力に結合するアポ－Ｓｉコンジュゲートであるアポ－Ｓｉ－Ｓ１を陽性対照として用いた。

２．還元型グルタチオンとのインキュベート時のアポ－Ｓｉ－Ｋ－９３のジスルフィド部分の切断：

アポ－Ｓｉ－Ｋ－９３－Ａのデザインの特質の１つは、細胞質内で主流の還元条件下で選択的に切断され、細胞質遺伝子サイレンシング複合体（ダイサー及びＲＩＳＣ）と相互作用するカーゴ遺伝薬物を放出することを目的として、アポ－Ｓｉ－Ｋ－９３－Ａ部分内にジスルフィド基を取り込むことである。アポ－Ｓｉ－Ｋ－９３－Ａのこの特徴を実証するために、２０ｐｍｏｌｅのＲＮＡ試料を１ｍＭのグルタチオン（シグマ）を補充した３０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐｈ＝７．４）で希釈した。全ての試料を３７°Ｃで２時間インキュベートした。対照試料は水で希釈した。その後、ＲＮＡ試料を１２％天然ポリアクリルアミドゲル上にロードし、電場上で５Ｖ／ｃｍ（バイオラッドミニプロテアン）で１時間移動させた。

３．インビトロでの細胞への導入及び遺伝子サイレンシング：

セルバイオラボ社（Cell Biolabs）から入手したＨｅＬａ－ＥＧＦＰ細胞株を、１０％ＦＢＳ（ギブコ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（バイオロジカルインダストリーズ、イスラエル）及びブラスチシジン１０μｇ／ｍｌが補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ギブコ）中で培養した。細胞は、５％のＣＯ_２加湿空気を含む３７℃のインキュベーター中で維持した。トランスフェクションの前日に、細胞を、抗生物質が補充されていない完全培地を使用して２４ウェルの黒色プレートのガラス底部にプレーティングした（４万細胞／ウェル）。翌日、細胞を、ＭＮＭコンジュゲートに暴露させた。ＭＮＭコンジュゲートは、１０％ＢＳＡと７２時間インキュベートした６００ｎＭのコンジュゲート、または、無血清条件下で２４時間インキュベートした後に完全血清を添加してさらに２４時間インキュベートした、１０、４０若しくは１５０ｎＭのコンジュゲートのいずれかである。トランスフェクションの７２時間後に、タンパク質のダウンレギュレーションを測定した。この目的のために、培地を吸引し、細胞をＨＢＳＳで洗浄した。無限Ｍ２００－Ｐｒｏマルチモードリーダー（テカン）を用いて、励起波長４８８ｎｍ、発光波長５３５ｎｍで、ＥＧＦＰ蛍光強度を定量した。

結果：

図３は、ＢＳＡとインキュベートしたときのタンパク質フリー画分を示す。これは、アポ－Ｓｉ－Ｓ１とは対照的に、ＢＳＡ、Ｋ－９３－Ａ、及びＫ－９３－Ａ－ｄｅｌ－１４と完全に相互作用し、ＢＳＡとはわずかな相互作用しか示さず、興味深いことに、Ｋ－９３－Ａ－ｄｅｌ－１４（アポ９３－ｄｅｌ－１４）において、追加的なＫ－９３－Ａ部分の存在によって有意に除去されない主要な遊離画分が明らかになった（矢印）。プロテイナーゼＫ（ＰＫ）の処理は全てのタンパク質結合アポ－Ｓｉ－Ｓ１をリカバーし、また、Ｋ－９３－Ａコンジュゲート及びＫ－９３－Ａ－ｄｅｌ－１４コンジュゲートの両方においてＢＳＡに結合したＫ－９３－Ａの小画分を放出した。

図４は、Ｋ－９３－Ａコンジュゲート及びＫ－９３－Ａ－ｄｅｌ－１４コンジュゲートの両方を還元グルタチオンでインキュベートすると（１ｍＭで２時間）、Ｋ－９３－Ａコンジュゲート及びＫ－９３－Ａ－ｄｅｌ－１４コンジュゲートの両方がロバストに切断されることを示す（矢印）。重要なことに、第３のＥ部分の結合は、還元反応を減速させなかった。反応は、還元剤（１ｍＭ、２時間）への比較的穏やかな曝露条件で行った。これらの陽性結果は、遺伝子サイレンシングに対する観察された効果と一致した。同一のＥＧＦＰｓｉＲＮＡ配列に結合したＫ－９３－Ａ及びＫ－９３－Ａ－ｄｅｌ－１４は、無血清条件及び血清添加条件の両方で、用量依存的にＥＧＦＰ発現の顕著なノックダウンを誘導した。血清（１０％ＢＳＡ）では、６００ｎＭのＫ－９３－Ａは、ＥＧＦＰ遺伝子の２４．１±５．０％のダウンレギュレーションを誘導したが、内部の第３のＥ部分の追加は、観察された遺伝子サイレンシングの５０．３％±５．０％への顕著な強化に関連した。有効な遺伝子サイレンシングは、無血清条件下でも観察され、Ｋ－９３－Ａによって、１０ｎＭ、４０ｎＭ、及び１５０ｎＭのコンジュゲートとインキュベートした場合、それぞれ、６３．５％、７９．３％、及び８６．３％の遺伝子サイレンシングが誘導された。Ｋ－９３－Ａ－ｄｅｌ－１４は、１０ｎＭ、４０ｎＭ及び１５０ｎＭで処理した場合に、それぞれ、５０．３％、７６．６％及び８４．７％の遺伝子サイレンシングが誘導された。

結論：

インビトロでＨｅＬａ細胞によって評価したように、アポ－Ｓｉ－Ｋ－９３－Ａは好ましい性能プロファイルを示し、これは、生体膜を横断しての細胞内へのｓｉＲＮＡの送達ツールとしての継続的開発に値する。このＥ部分は、アルブミンとインキュベートした場合に、大きな遊離画分、生きている細胞の細胞質内の生理学的レベルに相当するグルタチオンレベルでのジスルフィド部分の強力な還元及び切断を示し、血漿タンパク質の存在下及び非存在下で効果的な遺伝子サイレンシングを達成する。重要なことに、アポ－Ｓｉ－Ｋ－９３－Ａは、遺伝子サイレンシングの望ましい誘導において、２つの部分の結合よりも明らかに優れていることが見出された３つの部分の結合によって反映されるように、その活性において協働性を示した。

実施例８：アポ－Ｓｉ－Ｋ－６３－Ａの生物学的性能

ＥＧＦＰ遺伝子をサイレンシングするように設計された２つのｓｉＲＮＡ二本鎖（各々、ダイサー基質である）を使用した。第１の二本鎖では、アポ－Ｓｉ－Ｋ－６３－Ａ部分が、各ＲＮＡ鎖の５´末端に結合されている。この第１の二本鎖は、Ｋ－６３－Ａと命名した。第２の二本鎖では、アポ－Ｓｉ－Ｋ－６３－Ａ部分が、各ＲＮＡ鎖の５´－末端に結合されているが、第３のアポ－Ｓｉ－Ｋ－６３－Ａ部分は、パッセンジャー（ガイド）鎖に沿った内部位置の１４番目のヌクレオチドの部位に結合されている。したがって、この第２の二本鎖は、Ｋ－６３－Ａ－ｄｅｌ－１４と命名した。これらの各構築物のヌクレオチド配列は下記の通りである。

１．Ｋ－６３－Ａ構築物：
センス：５´－ｐｈｏｓ／ｉアポ－Ｓｉ－Ｋ６３－Ａ／ｍＡｍＣｒＣｍＣｒＵｍＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＵｍＣｒＡｍＵｒＣｍＵｒＧｍＣｒＡｒＣｒＣｒＡｒＣｍＣＧｒＵｒＣｒＡ
アンチセンス：５´－ｐｈｏｓ／ｉアポ－ＳｉＫ－６３－Ａ／ｒＣｒＧｍＧｒＵｒＧｒＧｒＵｒＧｍＣｒＡｍＧｒＡｍＵｒＧｒＡｒＡｒＣｒＵｒＧｍＧｒＧｍＵｍＣｍＡ

２．Ｋ－６３－Ａ－ｄｅｌ－１４構築物：
センス：／５ｐｈｏｓ／ｉアポ－Ｓｉ－Ｋ－６３－Ａ／ｍＡｍＣｒＣｍＣｒＵｍＧｒＡｒＡｒＧｒＵｒＵｍＣｒＡ／ｉアポ－ＳｉＫ６３－Ａ／ｒＣｍＵｒＧｍＣｒＡｒＣｒＡｒＣｍＣＧ
アンチセンス：／５ｐｈｏｓ／ｉアポ－Ｓｉ－Ｋ－６３－Ａ／ｒＣｒＧｍＧｒＵｒＧｒＵｒＧｍＣｒｍＣｒＡｍＧｒＡｍＵｒＧｒＡｒＡｒＣｒＵｒＵｒＣｒＡｒＧｍＧｒＧｍＵｍＣｍＡ

試験目的：

ＥＧＦＰ遺伝子の発現のサイレンシングにおける両構築物の性能の評価：

方法：

ＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞株は、セルバイオラボ社（Cell Biolabs）から入手した。この細胞を、１０％ＦＢＳ（ギブコ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（バイオロジカルインダストリーズ）及びブラスチシジン１０μｇ／ｍｌが補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ギブコ）中で培養した。細胞は、５％のＣＯ_２加湿空気と３７℃のインキュベーター中で維持した。トランスフェクションの前日に、細胞を、２４ウェルの黒色プレートのガラス底部にプレーティングした（４万細胞／ウェル）。翌日、細胞を、１０％血清存在下で、Ｋ－６３－ＡまたはＫ－６３－Ａ－ｄｅｌ－１４に曝露させた。無血清トランスフェクションのために、培地を吸引し、細胞をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄し、次いで、培地を無血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）と２４時間交換し、その後、血清を添加してさらに４８時間インキュベートした。トランスフェクションの７２時間後に、タンパク質発現のダウンレギュレーションを測定した。この目的のために、培地を吸引し、細胞をＨＢＳＳで洗浄した。無限Ｍ２００－Ｐｒｏマルチモードリーダー（テカン）を用いて、励起波長４８８ｎｍ、発光波長５３５ｎｍで、ＥＧＦＰ蛍光強度を定量した。

結果：

２つのＥ部分を有するＫ－６３－Ａ、及び３つのＥ部分を有するＫ－６３－Ａ－ｄｅｌ－１４は、ＲＧＦＰの発現の有効なノックダウンを誘導した。

血清存在下で、６００ｎＭのＫ－６３－Ａは、ＥＧＦＰ発現を７７．６％±１．３（平均±ＳＤ）減少させた。強力な効果がＫ－６３－Ａ－ｄｅｌ－１４で観察され、６００ｎＭはＥＧＦＰ発現を６０．２％±１．０減少させた。

無血清条件下では、本発明のコンジュゲートによって、強力なＧＦＰノックダウンが誘導された。Ｋ－６３－Ａは、細胞を１０ｎＭ、４０ｎＭ及び１５０ｎＭにそれぞれ曝露した場合、ＥＧＦＰ発現をそれぞれ７５．６％±２．６％、４４．１％±０．０５％及び２３．７％±０．６２％減少させた。Ｋ－６３－Ａ－ｄｅｌ－１４は、細胞を１０ｎＭ、４０ｎＭ及び１５０ｎＭにそれぞれ曝露した場合、ＧＦＰ発現をそれぞれ８３．２％±４．０％、５１．４％±０．０７％及び１８．９％±１．３％減少させた。

結論：

Ｋ－６３－Ａは、リン脂質膜を通過させて高分子ｓｉＲＮＡを送達するための強力な部分である。追加的なＫ－６３－Ａ部分の付加は、経膜送達プロセスにおける協働性及び相乗性を示す。

Claims

コンジュゲートであって、
下記の化学式（Ｉ）に示す構造で表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、金属キレート、または前記塩の溶媒和物若しくは水和物を含む、下記の化学式（Ｉ）に示す構造を有するコンジュゲート。

式中、
Ｄは、生体膜を横断して送達される薬物であり、低分子薬物、ペプチド、タンパク質、及び、天然の若しくは修飾された、一本鎖若しくは二本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはＡＳＯからなる群より選択され；
ｙ、ｚ、及びｗは、互いに独立して、０、１、２、３、４、５または６から選択される整数であり、整数が０である場合はそのＥ部分がヌルであることを意味し；ｙ、ｚ、及びｗの少なくとも１つは０ではなく；
Ｅ、Ｅ´、及びＥ´´は、互いに同一であっても異なっていてもよく、互いに独立して、
下記の化学式（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（Ｖ）または（Ｖａ）に示す構造で表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、金属キレート、または前記塩の溶媒和物若しくは水和物を含む。
薬学的組成物であって、
請求項１に記載のコンジュゲートと、
薬学的に許容される塩または担体とを含む、薬学的組成物。