JP6853193B2 - 核酸複合体 - Google Patents
核酸複合体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6853193B2 JP6853193B2 JP2017563894A JP2017563894A JP6853193B2 JP 6853193 B2 JP6853193 B2 JP 6853193B2 JP 2017563894 A JP2017563894 A JP 2017563894A JP 2017563894 A JP2017563894 A JP 2017563894A JP 6853193 B2 JP6853193 B2 JP 6853193B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- compound
- mmol
- nucleic acid
- synthesized
- equation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 0 C*CC*C([C@](CC(*C)=C1)C=C1C(*)=*)=*C Chemical compound C*CC*C([C@](CC(*C)=C1)C=C1C(*)=*)=*C 0.000 description 17
- ODPIVNPENCSAAS-UHFFFAOYSA-N CC(C)(C)CCOC(CN(CC(OC(C)(C)C)=O)C(c1cc(C(N(CC(OC(C)(C)C)=O)CC(OC(C)(C)C)=O)=O)cc(O)c1)=O)=O Chemical compound CC(C)(C)CCOC(CN(CC(OC(C)(C)C)=O)C(c1cc(C(N(CC(OC(C)(C)C)=O)CC(OC(C)(C)C)=O)=O)cc(O)c1)=O)=O ODPIVNPENCSAAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JGLDLPLXFRIRDO-UHFFFAOYSA-N CC(NC1C(OCCCCC=O)OC(CO)=CC1)=O Chemical compound CC(NC1C(OCCCCC=O)OC(CO)=CC1)=O JGLDLPLXFRIRDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JGLKYLNSRWBWFQ-UHFFFAOYSA-M CCCCCCCCCOP([O-])(OCCCCCCNC(CCC(N(Cc1ccccc1-1)c(cccc2)c2-c2c-1nn[n]2CCOCCOCCOCCOCCC(NCCOc1cc(C(NCCCNCCNC(CCCCOC(C(C2O)NC(C)=O)OC(CO)C2O)=O)=O)cc(C(NCCC(NCCNC(CCCCOC(C(C2O)NC(C)=O)OC(CO)C2O)=O)=O)=O)c1)=O)=O)=O)=O Chemical compound CCCCCCCCCOP([O-])(OCCCCCCNC(CCC(N(Cc1ccccc1-1)c(cccc2)c2-c2c-1nn[n]2CCOCCOCCOCCOCCC(NCCOc1cc(C(NCCCNCCNC(CCCCOC(C(C2O)NC(C)=O)OC(CO)C2O)=O)=O)cc(C(NCCC(NCCNC(CCCCOC(C(C2O)NC(C)=O)OC(CO)C2O)=O)=O)=O)c1)=O)=O)=O)=O JGLKYLNSRWBWFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- RCMJDENZHKZDAY-PRMTZZCJSA-M CCC[C@](C)(CC1)CC11CCC(CC)(CCCCOP(OCCCNC(CCCCCCCCCCC(NCCOc2cc(C(NCCNC([C@H](CCCCNC(CCCCOC(C(C3O)NC(C)=O)OC(CO)C3O)=O)NC(CCCCOC(C(C3O)NC(C)=O)OC(CO)C3O)=O)=O)=O)cc(C(NCCNC([C@H](CCCCNC(CCCCOC(C([C@H]3O)NC(C)=O)OC(CO)C3O)=O)NC(CCCCOC(C(C3O)NC(C)=O)OC(CO)C3O)=O)=O)=O)c2)=O)=O)([S-])=O)CC1 Chemical compound CCC[C@](C)(CC1)CC11CCC(CC)(CCCCOP(OCCCNC(CCCCCCCCCCC(NCCOc2cc(C(NCCNC([C@H](CCCCNC(CCCCOC(C(C3O)NC(C)=O)OC(CO)C3O)=O)NC(CCCCOC(C(C3O)NC(C)=O)OC(CO)C3O)=O)=O)=O)cc(C(NCCNC([C@H](CCCCNC(CCCCOC(C([C@H]3O)NC(C)=O)OC(CO)C3O)=O)NC(CCCCOC(C(C3O)NC(C)=O)OC(CO)C3O)=O)=O)=O)c2)=O)=O)([S-])=O)CC1 RCMJDENZHKZDAY-PRMTZZCJSA-M 0.000 description 1
- OHLSDXWDSVWYAH-VFKLOAJASA-N C[C@H](C1OC)C(OCCCCC(C)=O)O[C@@H](CO)C1O Chemical compound C[C@H](C1OC)C(OCCCCC(C)=O)O[C@@H](CO)C1O OHLSDXWDSVWYAH-VFKLOAJASA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
- C07C237/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
- C07C237/04—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
- C07C237/10—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to an acyclic carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C247/00—Compounds containing azido groups
- C07C247/02—Compounds containing azido groups with azido groups bound to acyclic carbon atoms of a carbon skeleton
- C07C247/04—Compounds containing azido groups with azido groups bound to acyclic carbon atoms of a carbon skeleton being saturated
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C271/00—Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
- C07C271/06—Esters of carbamic acids
- C07C271/08—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms
- C07C271/10—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
- C07C271/16—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to carbon atoms of hydrocarbon radicals substituted by singly-bound oxygen atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
- C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
また、核酸医薬は、細胞内における標的選択性と活性の高さから抗体、低分子医薬に次ぐ、次世代医薬として期待されている。
しかしながら、核酸医薬は、標的組織への送達が困難であることが問題点として挙げられる。
(1)
下記式1で表される核酸複合体。
式1:
Xは、オリゴヌクレオチドであり、
L1およびL2は、それぞれ独立して、糖リガンドであり、
S1、S2およびS3は、それぞれ独立して、リンカーである。)
(2)
下記式2で表される構造を有する、(1)に記載の核酸複合体。
式2:
X、L1、L2およびS3は、それぞれ前記と同義であり、
P1、P2、P3、P4、P5およびP6、ならびにT1およびT2は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−CO−、−NH−、−O−、−S−、−O−CO−、−S−CO−、−NH−CO−、−CO−O−、−CO−S−もしくは−CO−NH−であり、
Q1、Q2、Q3およびQ4は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数1〜12のアルキレンまたは−(CH2CH2O)n−CH2CH2−であり、nは0〜99の整数であり、
B1およびB2は、それぞれ独立して、結合手であるか、または、下記式2−1で表されるいずれかの構造であり、各構造における末端の黒丸点は、それぞれ、P2またはP3あるいはP5またはP6との結合点であり、m1、m2、m3およびm4は、それぞれ独立して、0〜10の整数であり、
式2−1:
q1、q2、q3およびq4は、それぞれ独立して、0〜10の整数であり、
ただし、p1およびp2がそれぞれ2または3の整数であるとき、それぞれのP3およびP6、Q2およびQ4、T1およびT2ならびにL1およびL2は、同一または異なっていてもよい。)
(3)
P1およびP4が、それぞれ独立して−CO−NH−、−NH−CO−または−O−である請求項2に記載の核酸複合体。
(4)
−(P2−Q1)q1−および−(P5−Q3)q3−がそれぞれ独立して、存在しないか、または下記式3−1〜式3−3で表されるいずれかの構造である、(2)および(3)に記載の核酸複合体。
式3−1:
m5およびm6は、それぞれ独立して、0〜10の整数であり、式3−1〜式3−3の構造における末端の黒丸点は、それぞれ、B1またはB2あるいはP1またはP4との結合点である。)
(5)
下記式4−1〜式4−9で表されるいずれかの構造を有する、(2)〜(4)のいずれか一項に記載の核酸複合体。
式4−1:
X、L1、L2、S3、P3、P6、T1、T2、Q2、Q4、q2およびq4はそれぞれ前記と同義である。)
(6)
下記式5で表される構造を有する、(1)に記載の核酸複合体。
式5:
X、S3、P1、P2、P3、Q1、Q2、B1、T1、L1、p1、q1およびq2はそれぞれ前記と同義である。)
(7)
P1が−CO−NH−、−NH−CO−または−O−である(6)に記載の核酸複合体。
(8)
下記式6−1〜式6−9で表されるいずれかの構造を有する、(6)または(7)に記載の核酸複合体。
式6−1:
X、S3、P3、Q2、T1、L1およびq2は、それぞれ前記と同義である。)
(9)
下記式7−1〜式7−9で表されるいずれかの構造を有する、(2)〜(8)に記載の核酸複合体。
式7−1:
下記式11で表される構造を有する、(1)〜(9)のいずれかに記載の核酸複合体。
式11:
X、L1、L2、S1およびS2は、それぞれ前記と同義であり、
P7およびP8は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−CO−、−NH−、−O−、−S−、−O−CO−、−S−CO−、−NH−CO−、−CO−O−、−CO−S−もしくは−CO−NH−であり、
Q5、Q6およびQ7は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数1〜12のアルキレンまたは−(CH2CH2O)n8−CH2CH2−であり、n8は0〜99の整数であり、
B3は、下記式11−1で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Q5およびQ6との結合手を意味し、
式11−1:
(11)
下記式12−1〜式12−12で表されるいずれかの構造を有する、(1)〜(10)のいずれかに記載の核酸複合体。
式12−1:
X、L1、L2、S1およびS2は、それぞれ前記と同義であり、n1’〜n12’はそれぞれ独立して、1〜10の整数である。)
(12)
前記糖リガンドが、マンノースまたはN−アセチルガラクトサミンである、(1)〜(11)のいずれかに記載の核酸複合体。
(13)
前記オリゴヌクレオチドが修飾ヌクレオチドを含む、(1)〜(12)のいずれかに記載の核酸複合体。
(14)
(1)〜(13)のいずれかに記載の核酸複合体を含む、医薬組成物。
(15)
細胞内に導入するための、(14)に記載の医薬組成物。
(16)
前記細胞が肝細胞である、(15)に記載の医薬組成物。
(17)
静脈内投与または皮下投与される、(14)〜(16)のいずれかに記載の医薬組成物。
(18)
(1)〜(13)のいずれかに記載の核酸複合体または(14)〜(17)のいずれかに記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患の治療または予防方法。
(19)
前記患者が哺乳動物である、(18)に記載の治療または予防方法。
(20)
下記式8で表される化合物。
式8:
R1およびR2は、それぞれ独立して、水素原子、t−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、−CO−R4、または−CO−B4−[(P9−Q8)q7−T3−L3]p3であり、
P9およびT3は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−CO−、−NH−、−O−、−S−、−O−CO−、−S−CO−、−NH−CO−、−CO−O−、−CO−S−もしくは−CO−NH−であり、
Q8は、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数1〜12のアルキレンまたは−(CH2CH2O)n1−CH2CH2−であり、n1は0〜99の整数であり、
B4は、それぞれ独立して、結合手であるか、または、下記式8−1で表されるいずれかの構造であり、各構造における末端の黒丸点は、それぞれ、カルボニル基またはP9との結合点であり、m7、m8、m9およびm10は、それぞれ独立して、0〜10の整数であり、
式8−1:
q7は、0〜10の整数であり、
L3は、糖リガンドであり、
Yは−O−(CH2)m11−NH−および−NH−CO−(CH2)m12−NH−であり、m11およびm12は、それぞれ独立して、1〜10の整数であり、
R3は、水素原子、t−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、−CO−R4、−CO−(CH2CH2O)n2−CH2CH2−N3、または−CO−Q9−B5−(Q10−P10)q8−X1であり、
P10は、存在しないか、または、−CO−、−NH−、−O−、−S−、−O−CO−、−S−CO−、−NH−CO−、−CO−O−、−CO−S−もしくは−CO−NH−であり、n2は0〜99の整数であり、
Q9およびQ10は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数1〜12のアルキレンまたは−(CH2CH2O)n3−CH2CH2−であり、n3は0〜99の整数であり、
B5は、下記式8−2で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Q9およびQ10との結合手を意味し、
式8−2:
X1は、水素原子または固相担体であり、
R4は、t−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基で置換もしくは無置換のアミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、およびアラルキルオキシカルボニル基からなる群から選択される1または2個の置換基で置換された炭素数2〜10のアルキル基である。)
(21)
下記式9で表される化合物。
式9:
R5およびR6は、それぞれ独立して、水素原子、t−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、−CO−R4’、または−CO−Q11−(P11−Q11’)q9−T4−L4であり、
P11およびT4は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−CO−、−NH−、−O−、−S−、−O−CO−、−S−CO−、−NH−CO−、−CO−O−、−CO−S−もしくは−CO−NH−であり、
Q11およびQ11’は、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数1〜12のアルキレンまたは−(CH2CH2O)n4−CH2CH2−であり、n4は0〜99の整数であり、
q9は、0〜10の整数であり、
L4は、糖リガンドであり、
Y’は−O−(CH2)m11’−NH−および−NH−CO−(CH2)m12’−NH−であり、m11’およびm12’は、それぞれ独立して、1〜10の整数であり、
R3’は、水素原子、t−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、−CO−R4’、−CO−(CH2CH2O)n2’−CH2CH2−N3、または−CO−Q9’−B5’−(Q10’−P10’)q8’−X1’であり、n2’は0〜99の整数であり、
P10’は、存在しないか、または、−CO−、−NH−、−O−、−S−、−O−CO−、−S−CO−、−NH−CO−、−CO−O−、−CO−S−もしくは−CO−NH−であり、
Q9’およびQ10’は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数1〜12のアルキレンまたは−(CH2CH2O)n3’−CH2CH2−であり、n3’は0〜99の整数であり、
B5’は、下記式9−1で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Q9’およびQ10’との結合手を意味し、
式9−1:
X1’は、水素原子または固相担体であり、
R4’は、t−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基で置換もしくは無置換のアミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、およびアラルキルオキシカルボニル基からなる群から選択される1または2個の置換基で置換された炭素数2〜10のアルキル基である。)
(22)
下記式10で表される化合物。
式10:
R7およびR8は、それぞれ独立して、ヒドロキシ基、t−ブトキシ基、ベンジルオキシ基、−NH−R10、または−NH−Q12−(P12−Q12’)q10−T5−L5であり、
P12およびT5は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−CO−、−NH−、−O−、−S−、−O−CO−、−S−CO−、−NH−CO−、−CO−O−、−CO−S−もしくは−CO−NH−であり、
Q12およびQ12‘は、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数1〜12のアルキレンまたは−(CH2CH2O)n5−CH2CH2−であり、n5は0〜99の整数であり、
L5は、糖リガンドであり、
Y2は−O−(CH2)m13−NH−および−NH−CO−(CH2)m14−NH−であり、m13およびm14は、それぞれ独立して、1〜10の整数であり、
q10は、0〜10の整数であり、
R9は、水素原子、t−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、−CO−R10、−CO−(CH2CH2O)n6−CH2CH2−N3、または−CO−Q13−B6−(Q14−P13)q11−X2であり、n6は0〜99の整数であり、
P10は、存在しないか、または、−CO−、−NH−、−O−、−S−、−O−CO−、−S−CO−、−NH−CO−、−CO−O−、−CO−S−もしくは−CO−NH−であり、
Q13およびQ14は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数1〜12のアルキレンまたは−(CH2CH2O)n7−CH2CH2−であり、n7は0〜99の整数であり、
B6は、下記式10−1で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Q13およびQ14との結合手を意味し、
式10−1:
X2は、水素原子または固相担体であり、
R10は、t−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基で置換もしくは無置換のアミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、およびアラルキルオキシカルボニル基からなる群から選択される1または2個の置換基で置換された炭素数2〜10のアルキル基である。)
式1:
Xは、オリゴヌクレオチドであり、
L1およびL2は、それぞれ独立して、糖リガンドであり、
S1、S2およびS3は、それぞれ独立して、リンカーである。
式1−1:
X、L1、L2、S1、S2およびS3は、それぞれ前記と同義である。
本明細書において、前記と同義とは、式1−1中を例示して説明すると、式1−1中のX、L1、L2、S1およびS2それぞれについて、式1において前記するX、L1、L2、S1およびS2それぞれについての定義と同様の基であり得ることを意味している。
本発明においては、S3とオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドを構成する糖部分の3’位または5’位を介してS3と結合するだけでなく、ヌクレオチドを構成する塩基部分を介してS3と結合していてもよい。本発明においては、オリゴヌクレオチドは、S3とオリゴヌクレオチドを結合する構造を有する基として理解されてよく、例えば、オリゴヌクレオチドが、−O−P(Z)(Z’)O−(式中、ZおよびZ’は、それぞれ独立して、酸素原子またはイオウ原子である。)を介してS3と結合している場合、Xとしてのオリゴヌクレオチドとしては、−O−P(Z)(Z’)O−オリゴヌクレオチドとして理解されてもよい。
また、オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドであってもよい。
S3のリンカーとXのオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの3’末端または5’末端で結合する。オリゴヌクレオチドが二本鎖である場合には、S3のリンカーは、二本鎖核酸を構成するセンス鎖の3’末端または5’末端と結合していることが好ましいが、当該結合に限定されるものではない。
本発明において、標的mRNAに対して相補的な塩基配列を含む核酸をアンチセンスヌクレオチドと称し、アンチセンスヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸をセンスヌクレオチドとも称する。
ヌクレオチドと同等の機能を有する分子としては、例えば、ヌクレオチドに修飾を施したヌクレオチド誘導体等が挙げられ、例えばDNAまたはRNAと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上もしくは安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーを上げるため、細胞透過性を上げるため、または可視化させるために、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドに修飾を施した分子等が好適に用いられる。
糖部修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよいが、2’−修飾ヌクレオチドが好ましく用いられる。
2’−修飾ヌクレオチドとしては、例えばリボースの2’−OH基がOR、R、R’OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、BrおよびIからなる群(Rはアルキルまたはアリール、好ましくは炭素数1〜6のアルキルであり、R’はアルキレン、好ましくは炭素数1〜6のアルキレンである)から選択される置換基で置換された2’−修飾ヌクレオチドが挙げられ、2’−修飾としては、好ましくはF、メトキシ基およびエトキシ基での置換が挙げられる。また、2−(methoxy)ethoxy基、3−aminopropoxy基、2−[(N,N−dimethylamino)oxy]ethoxy基、3−(N,N−dimethylamino)propoxy基、2−[2−(N,N−Dimethylamino)ethoxy]ethoxy基、2−(methylamino)−2−oxoethoxy基、2−(N−methylcarbamoyl)ethoxy基および2−cyanoethoxy 基からなる群から選択される置換基で置換された2’−修飾ヌクレオチド等も挙げられる。
また、糖部修飾ヌクレオチドとしては、糖部に架橋構造を導入することにより2つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸(Bridged Nucleic Acid)(BNA)も好適に用いられる。具体的には、2’位の酸素原子と4’位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸(Locked Nucleic Acid)(LNA) [Tetrahedron Letters, 38, 8735 (1997)およびTetrahedron, 54, 3607 (1998)]、エチレン架橋構造型人工核酸(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)[Nucleic Acid Research, 32, e175 (2004)]、Constrained Ethyl (cEt)[The Journal of Organic Chemistry 75, 1569 (2010)]、Amido−Bridged Nucleic Acid (AmNA)[Chem Bio Chem 13, 2513 (2012)]および2’−O,4’−C−Spirocyclopropylene bridged nucleic acid (scpBNA)[Chem. Commun., 51, 9737 (2015)]等が挙げられる。
さらにペプチド核酸(PNA)[Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999)]、オキシペプチド核酸(OPNA)[J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)]、ペプチドリボ核酸(PRNA)[J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)]等も糖部修飾ヌクレオチドとして挙げられる。
リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、リン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロジチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がアルキルホスホネート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロアミデート結合に置換されたヌクレオチド等が挙げられ、好ましくはリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチドが挙げられる。
塩基修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの塩基の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、塩基内の酸素原子が硫黄原子で置換されたもの、水素原子が炭素数1〜6のアルキル基、ハロゲン基で置換されたもの、メチル基が水素原子、ヒドロキシメチル基、炭素数2〜6のアルキル基で置換されたもの、アミノ基が炭素数1〜6のアルキル基、炭素数1〜6のアルカノイル基、オキソ基、ヒドロキシ基等に置換されたものが挙げられる。なお、シトシン(C)の代わりに5−メチルシトシン(5−mC)を塩基修飾ヌクレオチドとして用いることも、本発明の好ましい形態の一つである。
ヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドまたは糖部、リン酸ジエステル結合もしくは塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド誘導体に、ペプチド、蛋白質、糖、脂質、リン脂質、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、色素等、別の化学物質を、直接またはリンカーを介して付加したものもあげられ、具体的には、5’−ポリアミン付加ヌクレオチド誘導体、コレステロール付加ヌクレオチド誘導体、ステロイド付加ヌクレオチド誘導体、胆汁酸付加ヌクレオチド誘導体、ビタミン付加ヌクレオチド誘導体、Cy5付加ヌクレオチド誘導体、Cy3付加ヌクレオチド誘導体、6−FAM付加ヌクレオチド誘導体、およびビオチン付加ヌクレオチド誘導体等が挙げられる。
ヌクレオチド誘導体は、核酸内の他のヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体とアルキレン構造、ペプチド構造、ヌクレオチド構造、エーテル構造、エステル構造、およびこれらの少なくとも一つを組み合わせた構造等の架橋構造を形成してもよい。
オリゴヌクレオチドは、その分子中の一部あるいは全部の原子が質量数の異なる原子(同位体)で置換されたものも包含する。
本明細書において「相補的」とは、2つのヌクレオチド配列が完全に相補する場合だけでなく、ヌクレオチド配列間で0〜30%、0〜20%または0〜10%のミスマッチ塩基を有することができ、例えば、標的mRNAに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的mRNAの部分塩基配列と完全に相補する塩基配列において、1つまたは複数の塩基の置換を含んでよいことを意味する。具体的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の標的配列に対して1〜8個、好ましくは1〜6個、1〜4個、1〜3個、特に2個または1個のミスマッチ塩基を有していてもよい。
また、「相補的」とは、一方のヌクレオチド配列が、他方のヌクレオチド配列と完全に相補する塩基配列において、1つまたは複数の塩基が付加および/または欠失した配列である場合を包含する。例えば、標的mRNAとアンチセンスオリゴヌクレオチドとは、アンチセンスオリゴヌクレオチドにおける塩基の付加および/または欠失により、アンチセンス鎖および/または標的mRNA領域に1個または2個のバルジ塩基を有してもよい。
ただし、以下、「相補的」と記載する箇所において、「相補」の意味も包含する形で記載する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドには、標的となるDNA、mRNA前駆体、mRNA、microRNA前駆体またはmicroRNAと完全に相補的であるもののみならず、DNA、mRNA前駆体、mRNA、microRNA前駆体またはmicroRNAとストリジェントな条件でハイブリダイズできる限り、1もしくは数個のミスマッチが存在するものも含まれる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとは、標的遺伝子にハイブリダイズする核酸であれば、ヘアピンオリゴマー、環状オリゴマーの形態中に導入されてもよく、内部または末端のバルジまたはループ等の構造要素を含有してもよい。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内に導入されると、相補的なmRNA前駆体またはmRNAと結合し蛋白質に翻訳されるのを立体的に阻害して、標的遺伝子の発現を抑制することができる。
またアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内において、相補的なmicroRNA前駆体またはmicroRNAと結合し、microRNAの機能を立体的に阻害することもできる。
またアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内において、相補的なmRNA及びmRNA前駆体と結合し、mRNA及びmRNA前駆体を切断することもある。このような例として、RNAとDNAの二重鎖のRNA鎖を切断するエンドヌクレアーゼであるRNaseHを介した作用が知られている。本発明の細胞内のアンチセンスオリゴヌクレオチドがmRNA及びmRNA前駆体と二重鎖を形成するとRNaseHに認識され、相補的なmRNA鎖を酵素的に分解することができる。
RNaseHによるmRNA及びmRNA前駆体の切断を誘導するには、4〜80個の連続したDNA領域を持つアンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましい。この場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは0〜80%の糖部修飾ヌクレオチドを持つことが好ましく、10〜60%がより好ましく、20〜50%がさらに好ましい。また、糖部修飾ヌクレオチドを持つ場合の連続したDNA領域は、4〜20個がより好ましく、4〜15個がさらに好ましく、5〜10個が最も好ましい。更に、アンチセンスオリゴヌクレオチドにおける糖部修飾ヌクレオチドの位置は、5’末端近傍および/または3’末端近傍に配置することが好ましく、5’端から全長の長さの25%以内の位置および/または3’端から全長の長さの25%以内の位置に配置することがより好ましい。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的なオリゴ核酸と二重鎖を形成させ、二重鎖核酸として細胞内に導入することで標的遺伝子の発現抑制を誘導することもできる(国際公開第2005/113571号を参照)。この場合の二重鎖核酸をリガンドで修飾する位置は、相補的なオリゴ核酸の5’末端または3’末端が好ましい。
本発明で用いられる二本鎖のオリゴヌクレオチドは、標的mRNA配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とが、二重鎖を形成することができればいずれの長さでもよいが、二重鎖を形成できる配列の長さは、通常11〜35塩基であり、15〜30塩基が好ましく、17〜25塩基がより好ましく、17〜23塩基がさらに好ましく、19〜23塩基が特に好ましい。
本発明で用いられる、標的タンパク質の発現を抑制する二本鎖のオリゴヌクレオチドとしては、標的mRNA配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸であって、かつ標的タンパク質の発現を抑制する一本鎖核酸、もしくは標的mRNA配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とからなり、かつ標的タンパク質の発現を抑制する二本鎖核酸が好適に用いられる。
二本鎖のオリゴヌクレオチドを構成する一本鎖のオリゴヌクレオチドは、通常11〜30塩基からなるが、15〜29塩基からなることが好ましく、15〜27塩基からなることがより好ましく、15〜25塩基からなることがさらに好ましく、17〜23塩基からなることが特に好ましい。
突出部を有する二本鎖のオリゴヌクレオチドとしては、少なくとも一方の鎖の3’末端または5’末端に1〜6塩基、通常は1〜3塩基からなる突出部を有するものが用いられるが、2塩基からなる突出部を有するものが好ましく用いられ、例えばdTdTまたはUUからなる突出部を有するものが挙げられる。突出部は、アンチセンスオリゴヌクレオチドのみ、センスオリゴヌクレオチドのみ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドとセンスオリゴヌクレオチドの両方に有することができるが、アンチセンスオリゴヌクレオチドに突出部を有する二本鎖のオリゴヌクレオチドが好ましく用いられる。なお、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、二重鎖領域とそれに続く突出部とを含む。
二本鎖のオリゴヌクレオチドは、RNA同士が二重鎖を形成した二本鎖RNA(dsRNA)、DNA同士が二重鎖を形成した二本鎖DNA(dsDNA)、またはRNAとDNAが二重鎖を形成したハイブリッド核酸であってもよい。あるいは、二本鎖のうちの一方もしくは両方の鎖がDNAとRNAとのキメラ核酸であってもよい。好ましくは二本鎖RNA(dsRNA)である。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの5’末端から2番目のヌクレオチドは、標的mRNA配列の3’末端から2番目のデオキシリボヌクレオチドと相補であることが好ましく、アンチセンスオリゴヌクレオチドの5’末端から2〜7番目のヌクレオチドが、標的mRNA配列の3’末端から2〜7番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがより好ましく、アンチセンスオリゴヌクレオチドの5’末端から2〜11番目のヌクレオチドが、標的mRNA配列の3’末端から2〜11番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがさらに好ましい。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドの5’末端から11番目のヌクレオチドが、標的mRNA配列の3’末端から11番目のデオキシリボヌクレオチドと相補であることが好ましく、アンチセンスオリゴヌクレオチドの5’末端から9〜13番目のヌクレオチドが、標的mRNA配列の3’末端から9〜13番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがより好ましく、アンチセンスオリゴヌクレオチドの5’末端から7〜15番目のヌクレオチドが、標的mRNA配列の3’末端から7〜15番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがさらに好ましい。
RNAは、酵素的または部分/全有機合成によって生成してもよく、また修飾されたリボヌクレオチドは、インビトロで酵素的または有機合成によって導入することができる。一つの態様において、それぞれの鎖は、化学的に調製される。RNA分子を化学的に合成する方法は、当該技術分野において公知である[Nucleic Acids Research, 32, 936 (1998)を参照]。
配列Xを含むセンスオリゴヌクレオチドとしては、塩基として配列Xのみを含んでいるRNA(以下、配列X鎖とする)、配列X鎖の3’端もしくは5’端または両端に1〜6個、好ましくは2〜4個のヌクレオチドが同一または異なって付加されたRNAが挙げられる。
相補的配列X’を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、塩基として相補的配列X’のみを含んでいるRNA(以下、相補的配列X’鎖とする)、相補的配列X’鎖の3’端もしくは5’端または両端に1〜6個、好ましくは2〜4個のヌクレオチドが同一または異なって付加された、二本鎖RNA等が挙げられる。
配列X鎖および相補的配列X’鎖に付加されるヌクレオチド、ならびにスペーサーオリゴヌクレオチドの塩基は、グアニン、アデニン、シトシン、チミンおよびウラシルのいずれか1種または複数種でもよく、またそれぞれの塩基に結合する糖が、リボース、デオキシリボースまたは2’位の水酸基が修飾基で置換されたリボースのいずれでもよいが、付加されるヌクレオチドとしては、ウリジル酸(U)およびデオキシチミジル酸(dT)のいずれか1種または2種がより好ましい。また、配列X鎖の3’端に付加されるヌクレオチドの塩基の配列を、標的遺伝子のmRNA内で配列Xと隣接するヌクレオチドの塩基の配列と同じ塩基配列としてもよい。また、相補的配列X’鎖の3’端に付加されるヌクレオチドの塩基の配列を、標的遺伝子のmRNA内で配列Xと隣接するヌクレオチドの塩基の配列と相補的な塩基配列としてもよい。
また、本発明で用いられるRNAとしては、好ましくはRNA干渉(RNAi)を利用した該標的遺伝子の発現抑制作用を有するRNAが挙げられる。
一本鎖のオリゴヌクレオチドは、100mmol/L 酢酸カリウム、30mmol/L HEPES、pH 7.5からなる緩衝液中に100μmol/L濃度にて再懸濁させる。相補的センス鎖およびアンチセンス鎖を同等のモル量で混合して、50μmol/L二本鎖のオリゴヌクレオチドの最終溶液を得る。試料を95℃まで5分間加熱して、使用前に室温に冷却させる。二本鎖核酸は、−20℃にて保存する。一本鎖のオリゴヌクレオチドは、凍結乾燥させるか、またはヌクレアーゼフリー水中に、−80℃で貯蔵する。
本発明において、糖リガンドとしては、標的細胞に発現している受容体に結合可能な糖類(単糖、二糖、三糖および多糖等)に由来する基を意味する。本発明においては、糖リガンドがO−結合によりS1およびS2のリンカーに結合している場合には、糖リガンドを構成する糖類の結合に関与する水酸基を除いた部分が糖類に由来する基としての糖リガンドを意味する。
本発明においては、オリゴヌクレオチドの標的細胞となる糖リガンドを選択すればよい。
単糖としては、例えば、アロース、アルトース、アラビノース、クラジノース、エリトロース、エリスルロース、フルクトース、D−フシトール、L−フシトール、フコサミン、フコース、フクロース、ガラクトサミン、D−ガラクトサミニトール、N−アセチル−ガラクトサミン、ガラクトース、グルコサミン、N−アセチル−グルコサミン、グルコサミニトール、グルコース、グルコース−6−リン酸、グロース、グリセルアルデヒド、L−グリセロ−D−マンノ−ヘプトース、グリセロール、グリセロン、グロース、イドース、リキソース、マンノサミン、マンノース、マンノース−6−リン酸、プシコース、キノボース、キノボサミン、ラムニトール、ラムノサミン、ラムノース、リボース、リブロース、セドヘプツロース、ソルボース、タガトース、タロース、酒石酸、トレオース、キシロース、およびキシルロース等が挙げられる。
二糖、三糖、多糖としては、例えば、アベクオース、アクラボース、アミセトース、アミロペクチン、アミロース、アピオース、アルカノース、アスカリロース、アスコルビン酸、ボイビノース、セロビオース、セロトリオース、セルロース、カコトリオース、カルコース、キチン、コリトース、シクロデキストリン、シマロース、デキストリン、2−デオキシリボース、2−デオキシグルコース、ジギノース、ジギタロース、ジギトキソース、エバロース、エベミトロース(evemitrose)、フルクトオリゴ糖、ガルトオリゴ糖(galto−oligosaccharide)、ゲンチアノース、ゲンチオビオース、グルカン、グルコーゲン、グリコーゲン、ハマメロース、ヘパリン、イヌリン、イソレボグルコセノン、イソマルトース、イソマルトトリオース、イソパノース、コジビオース、ラクトース、ラクトサミン、ラクトースジアミン、ラミナラビオース、レボグルコサン、レボグルコセノン、β−マルトース、マルトリオース、マンナン−オリゴ糖、マンニノトリオース、メレチトース、メリビオース、ムラミン酸、ミカロース、ミシノース、ノイラミン酸、シアル酸含有糖鎖、ニゲロース、ノジリミシン、ノビオース、オレアンドロース、パノース、パラトース、プランテオース、プリメベロース、ラフィノース、ロジノース、ルチノース、サルメントース、セドヘプツロース、セドヘプツロサン、ソラトリオース、ソホロース、スタキオース、ストレプトース、スクロース、α,α−トレハロース、トラハロサミン、ツラノース、チベロース、キシロビオース、ウンベリフェロース等が挙げられる。
糖類は、デオキシ糖(アルコールヒドロキシ基を水素原子に置換したもの)、アミノ糖(アルコールヒドロキシ基をアミノ基に置換したもの)、チオ糖(アルコールヒドロキシ基をチオールに置換したもの、またはC=OをC=Sに置換したもの、または環酸素を硫黄に置換したもの)、セレノ糖、テルロ糖、アザ糖(環炭素を窒素に置換したもの)、イミノ糖(環酸素を窒素に置換したもの)、ホスファノ糖(環酸素をリンに置換したもの)、ホスファ糖(環炭素をリンに置換したもの)、C−置換単糖(非末端炭素原子における水素原子を炭素原子で置換したもの)、不飽和単糖、アルジトール(カルボニル基をCHOH基で置換したもの)、アルドン酸(アルデヒド基をカルボキシ基に置換したもの)、ケトアルドン酸、ウロン酸、アルダル酸等を含んでいてもよい。
アミノ糖としては、糖類におけるアミノ単糖として、ガラクトサミン、グルコサミン、マンノサミン、フコサミン、キノボサミン、ノイラミン酸、ムラミン酸、ラクトースジアミン、アコサミン、バシロサミン、ダウノサミン、デソサミン、フォロサミン、ガロサミン、カノサミン、カンソサミン(kansosamine)、ミカミノース、ミコサミン、ペロサミン、プノイモサミン、プルプロサミン(purpurosamine)、ロドサミン等が挙げられる。また、アミノ糖のアミノ基は、アセチル基等で置換されていてもよい。
シアル酸含有糖鎖としては、NeuAcを糖鎖非還元末端に含有する糖鎖が挙げられ、NeuAc−Gal−GlcNAcを含有する糖鎖や、Neu5Acα(2−6)Galβ(1−3)GlcNAc等が挙げられる。
糖類における各単糖は、標的細胞に発現している受容体に結合可能であることを限度として、置換基で置換されていてもよく、例えば、水酸基が置換されていてもよく、各単糖における水素原子がアジドおよび/または置換されていてもよいアリール基で1〜複数置換されていてもよい。
ASGPRに対してより親和性の高い糖リガンドとして、例えばBioorganic Medicinal Chemistry, 17,7254 (2009)、およびJournal of American Chemical Society, 134, 1978 (2012)等に記載の糖誘導体が知られており、これらを用いてもよい。
S1とS2は、糖リガンドであるL1とL2と、ベンゼン環とを連結する構造であれば特に限定されるものではなく、核酸複合体において用いられる公知の構造を採用してもよい。S1とS2は、同一であってもよく、異なっていてもよい。
糖リガンドであるL1とL2は、S1およびS2とグリコシド結合により連結していることが好ましく、S1およびS2は、ベンゼン環と、例えば、−CO−、−NH−、−O−、−S−、−O−CO−、−S−CO−、−NH−CO−、−CO−O−、−CO−S−もしくは−CO−NH−結合によりそれぞれ連結していてもよい。
オリゴヌクレオチドであるXは、S3とホスホジエステル結合により連結していることが好ましく、S3は、ベンゼン環と、例えば、−CO−、−NH−、−O−、−S−、−O−CO−、−S−CO−、−NH−CO−、−CO−O−、−CO−S−もしくは−CO−NH−結合により連結していてもよい。
式2:
X、L1、L2およびS3は、それぞれ前記と同義であり、
P1、P2、P3、P4、P5およびP6、ならびにT1およびT2は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−CO−、−NH−、−O−、−S−、−O−CO−、−S−CO−、−NH−CO−、−CO−O−、−CO−S−もしくは−CO−NH−であり、
Q1、Q2、Q3およびQ4は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数1〜12のアルキレンまたは−(CH2CH2O)n−CH2CH2−であり、nは0〜99の整数であり、
B1およびB2は、それぞれ独立して、結合手であるか、または、下記式2−1で表されるいずれかの構造であり、各構造における末端の黒丸点は、それぞれ、P2またはP3あるいはP5またはP6との結合点であり、m1、m2、m3およびm4は、それぞれ独立して、0〜10の整数であり、
式2−1:
q1、q2、q3およびq4は、それぞれ独立して、0〜10の整数であり、
ただし、p1およびp2がそれぞれ2または3の整数であるとき、それぞれのP3およびP6、Q2およびQ4、T1およびT2ならびにL1およびL2は、同一または異なっていてもよい。
P1またはP4が、例えば、−NH−CO−である場合、−NH−CO−ベンゼン環という部分構造を有する。
式3−1:
m5およびm6は、それぞれ独立して、0〜10の整数であり、式3−1〜式3−3の構造における末端の黒丸点は、それぞれ、B1またはB2あるいはP1またはP4との結合点である。
式4−1:
X、L1、L2、S3、P3、P6、T1、T2、Q2、Q4、q2およびq4はそれぞれ前記と同義である。
式5では、式2におけるP1とP4、P2とP5、P3とP6、Q1とQ3、Q2とQ4、B1とB2、T1とT2、L1とL2、p1とp2、q1とq3ならびにq2とq4がそれぞれ同一である。
式5:
X、S3、P1、P2、P3、Q1、Q2、B1、T1、L1、p1、q1およびq2はそれぞれ前記と同義である。
また、式5におけるX、S3、P1、P2、P3、Q1、Q2、B1、T1、L1、p1、q1およびq2は、各々、上述した好適な基であって良いが、P1が−CO−NH−、−NH−CO−または−O−であることが好ましい。
式5における−(P2−Q1)q1−は、存在しないか、または上記式3−1〜式3−3で表されるいずれかの構造であることが好適である。
式6−1:
X、S3、P3、Q2、T1、およびL1は、それぞれ前記と同義である。
式7−1:
X、L1、L2およびS3は、それぞれ前記と同義である。L1とL2は同一であってもよく、異なっていてもよく、同一であることが好適である。
式7−1〜式7−9において、各アルキレン基部分を鎖長の異なるアルキレン鎖を導入することにより、また、アミド結合等を他の結合に置換することにより、式7−1〜式7−9で表される構造を有する核酸複合体以外の核酸誘導体を製造することもできる。
式11:
L1、L2、S1およびS2は、それぞれ前記と同義であり、
P7およびP8は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−CO−、−NH−、−O−、−S−、−O−CO−、−S−CO−、−NH−CO−、−CO−O−、−CO−S−もしくは−CO−NH−であり、
Q5、Q6およびQ7は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数1〜12のアルキレンまたは−(CH2CH2O)n8−CH2CH2−であり、n8は0〜99の整数であり、
B3は、本明細書中ではブランチャーユニットと呼ばれ、下記式11−1で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Q5およびQ6との結合手を意味し、
式11−1:
式12−1:
X、L1、L2、S1およびS2は、それぞれ前記と同義であり、n1’〜n12’はそれぞれ独立して、1〜10の整数である。
本発明において、製薬上許容し得る陰イオンとしては、例えば塩化物イオン、臭化物イオン、硝酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン等の無機イオン、酢酸イオン、シュウ酸イオン、マレイン酸イオン、フマル酸イオン、クエン酸イオン、安息香酸イオン、メタンスルホン酸イオン等の有機酸イオン等が挙げられる。
式1で表される核酸重合体は、固相合成によっても合成することができる。
式1で表される核酸複合体における、S1をリンカーとしたL1−ベンゼン環ユニットやS2をリンカーとしたL2−ベンゼン環ユニットの合成は、例えば、式2で表される核酸複合体を例として説明する。
式2で表される核酸複合体におけるL1−ベンゼン環ユニットやL2−ベンゼン環ユニットは、P1、P2、P3、P4、P5、およびP6ならびにT1およびT2により連結している。
P1、P2、P3、P4、P5、およびP6ならびにT1およびT2の−CO−、−NH−、−O−、−S−、−O−CO−、−S−CO−、−NH−CO−、−CO−O−、−CO−S−または−CO−NH−結合は、例えば、第4版実験化学講座19「有機化合物の合成I」丸善(1992年)、第4版実験化学講座20「有機化合物の合成II」、丸善(1992年))等に記載の結合反応の方法を参考にして、式2で表される構造を形成するのに適切な原料を選択することにより適宜合成することができる。
また、ベンゼン環から順次、Q1を部分構造として有する化合物、B1を部分構造として有する化合物を結合させることで、L1−ベンゼン環ユニットの部分構造を製造することができる。
L1とQ2を部分構造として有する化合物を別途合成し、L1とQ2を部分構造として有する化合物をベンゼン環、Q1およびB1を部分構造として有するL1−ベンゼン環ユニットの部分構造を有する化合物と結合させることにより、L1−ベンゼン環ユニット構造を製造することができる。
L2−ベンゼン環ユニットについても同様に、ベンゼン環から順次、Q3を部分構造として有する化合物、B2を部分構造として有する化合物を結合させることで、L2−ベンゼン環ユニットの部分構造を製造することができる。
L2とQ4を部分構造として有する化合物を別途合成し、L2とQ4を部分構造として有する化合物をベンゼン環、Q3およびB2を部分構造として有するL2−ベンゼン環ユニットの部分構造を有する化合物と結合させることにより、L2−ベンゼン環ユニット構造を製造することができる。
B1を部分構造として有する化合物、B2を部分構造として有する化合物としては、下記式2−1で表されるいずれかの構造を有し、各構造における末端の黒丸点において、それぞれ、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、またはチオール基を有する化合物が挙げられる。
式2−1:
L2、Q4およびB2を部分構造として有する化合物を合成してから、Q3とベンゼン環を有する化合物と結合することにより、L2−ベンゼン環ユニット構造を製造してもよい。
本発明においては、[L1−T1−(Q2−P3)q2−]p1−B1−(P2−Q1)q1−P1−である部分構造と、[L2−T2−(Q3−P6)q4−]p2−B2−(P5−Q3)q3−P2−である部分構造とは同一または異なっていても良いが、同一であることが好ましい。
L3は、脱保護することにより、L1となる糖リガンド誘導体であれば特に限定されない。糖リガンドの置換基としては、糖質化学の分野で汎用される置換基であれば特に限定されないが、Ac基が好ましい。
式11で表される核酸複合体におけるX−ベンゼン環ユニットは、オリゴヌクレオチドの結合以外に、P7およびP8により表される結合を有する。
P7およびP8の−CO−、−NH−、−O−、−S−、−O−CO−、−S−CO−、−NH−CO−、−CO−O−、−CO−S−または−CO−NH−結合は、例えば、第4版実験化学講座19「有機化合物の合成I」丸善(1992年)、第4版実験化学講座20「有機化合物の合成II」、丸善(1992年))に記載の結合反応の方法を参考にして、式11で表される構造を形成するのに適切な原料を選択することにより適宜合成することができる。
また、ベンゼン環から順次、Q5を部分構造として有する化合物、B3を部分構造として有する化合物を結合させることで、X−ベンゼン環ユニットの部分構造を製造することができる。
具体的には、ベンゼン環およびQ5を部分構造として有するX−ベンゼン環ユニットの部分構造を有する化合物の末端にアジド基を有する場合を例にとると、実施例に開示するような末端結合性官能基化したオリゴヌクレオチドを反応させることにより、環化付加させて、トリアゾール環を形成させて、B3部分を構築することにより、X−ベンゼン環ユニット構造を製造することができる。
式8:
R1およびR2は、それぞれ独立して、水素原子、t−ブトキシカルボニル基(Boc基)、ベンジルオキシカルボニル基(Z基)、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc基)、−CO−R4、または−CO−B4−[(P9−Q8)q7−T3−L3]p3であり、
P9およびT3は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−CO−、−NH−、−O−、−S−、−O−CO−、−S−CO−、−NH−CO−、−CO−O−、−CO−S−もしくは−CO−NH−であり、
Q8は、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数1〜12のアルキレンまたは−(CH2CH2O)n1−CH2CH2−であり、n1は0〜99の整数であり、
B4は、それぞれ独立して、結合手であるか、または、下記式8−1で表されるいずれかの構造であり、各構造における末端の黒丸点は、それぞれ、カルボニル基またはP9との結合点であり、m7、m8、m9およびm10は、それぞれ独立して、0〜10の整数であり、
式8−1:
q7は、0〜10の整数であり、
L3は、糖リガンドであり、
Yは−O−(CH2)m11−NH−および−NH−CO−(CH2)m12−NH−であり、m11およびm12は、それぞれ独立して、1〜10の整数であり、
R3は、水素原子、t−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、−CO−R4、−CO−(CH2CH2O)n2−CH2CH2−N3、または−CO−Q9−B5−(Q10−P10)q8−X1あり、n2は0〜99の整数であり、
P10は、存在しないか、または、−CO−、−NH−、−O−、−S−、−O−CO−、−S−CO−、−NH−CO−、−CO−O−、−CO−S−もしくは−CO−NH−であり、
Q9およびQ10は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数1〜12のアルキレンまたは−(CH2CH2O)n3−CH2CH2−であり、n3は0〜99の整数であり、
B5は、下記式8−2で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Q9およびQ10との結合手を意味し、
式8−2:
X1は、水素原子または固相担体であり、
R4は、t−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基で置換もしくは無置換のアミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、およびアラルキルオキシカルボニル基からなる群から選択される1または2個の置換基で置換された炭素数2〜10のアルキル基である。)
式9:
(式9中、
R5およびR6は、それぞれ独立して、水素原子、t−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、−CO−R4’、または−CO−Q11−(P11−Q11’)q9−T4−L4であり、
P11およびT4は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−CO−、−NH−、−O−、−S−、−O−CO−、−S−CO−、−NH−CO−、−CO−O−、−CO−S−もしくは−CO−NH−であり、
Q11およびQ11’は、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数1〜12のアルキレンまたは−(CH2CH2O)n4−CH2CH2−であり、n4は0〜99の整数であり、
q9は、0〜10の整数であり、
L4は、糖リガンドであり、
Y’は−O−(CH2)m11’−NH−および−NH−CO−(CH2)m12’−NH−であり、m11’およびm12’は、それぞれ独立して、1〜10の整数であり、
R3’は、水素原子、t−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、−CO−R4’、−CO−(CH2CH2O)n2’−CH2CH2−N3、または−CO−Q9’−B5’−(Q10’−P10’)q8’−X1’であり、n2’は0〜99の整数であり、
P10’は、存在しないか、または、−CO−、−NH−、−O−、−S−、−O−CO−、−S−CO−、−NH−CO−、−CO−O−、−CO−S−もしくは−CO−NH−であり、
Q9’およびQ10’は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数1〜12のアルキレンまたは−(CH2CH2O)n3’−CH2CH2−であり、n3’は0〜99の整数であり、
B5’は、下記式9−1で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Q9’およびQ10’との結合手を意味し、
式9−1:
X1’は、水素原子または固相担体であり、
R4’は、t−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基で置換もしくは無置換のアミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、およびアラルキルオキシカルボニル基からなる群から選択される1または2個の置換基で置換された炭素数2〜10のアルキル基である。)
式10:
R7およびR8は、それぞれ独立して、ヒドロキシ基、t−ブトキシ基、ベンジルオキシ基、−NH−R10、または−NH−Q12−(P12−Q12’)q10−T4−L4であり、
P12およびT4は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−CO−、−NH−、−O−、−S−、−O−CO−、−S−CO−、−NH−CO−、−CO−O−、−CO−S−もしくは−CO−NH−であり、
Q12およびQ12’は、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数1〜12のアルキレンまたは−(CH2CH2O)n2−CH2CH2−であり、n2は0〜99の整数であり、
L4は、糖リガンドであり、
Y2は−O−(CH2)m9−NH−および−NH−CO−(CH2)m10−NH−であり、m9、m10は、それぞれ独立して、1〜10の整数であり、
q10は、0〜10の整数であり、
R9は、水素原子、t−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、−CO−R10、−CO−(CH2CH2O)n6−CH2CH2−N3、または−CO−Q13−B6−(Q14−P13)q11−X2であり、n6は0〜99の整数であり、
P13は、存在しないか、または、−CO−、−NH−、−O−、−S−、−O−CO−、−S−CO−、−NH−CO−、−CO−O−、−CO−S−もしくは−CO−NH−であり、
Q13およびQ14は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数1〜12のアルキレンまたは−(CH2CH2O)n7−CH2CH2−であり、n7は0〜99の整数であり、
B6は、下記式10−1で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Q13およびQ14との結合手を意味し、
式10−1:
X2は、水素原子または固相担体であり、
R10は、t−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基で置換もしくは無置換のアミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、およびアラルキルオキシカルボニル基からなる群から選択される1または2個の置換基で置換された炭素数2〜10のアルキル基である。)
製造方法1
本発明における核酸誘導体は、式(I’)で表される部分構造を有する化合物の製造方法として、その製造方法を例示することができる。
化合物(I−B)は、化合物(I−A)とp,p’−ジメトキシトリチルクロリドを、ピリジン等の溶媒中、必要に応じて共溶媒の存在下、0℃と100℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
共溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2−ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2−ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)、N,N−ジメチルアセトアミド、N−メチルピロリドン、ピリジン、水等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
化合物(I−C)は、化合物(I−B)を、無溶媒でまたは溶媒中、1〜1000当量の2級アミン存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2−ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2−ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)、N,N−ジメチルアセトアミド、N−メチルピロリドン、ピリジン、水等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
2級アミンとしては、例えばジエチルアミン、ピペリジン等が挙げられる。
化合物(1−E)は、化合物(I−C)と化合物(I−D)を、無溶媒でまたは溶媒中、1〜30当量の塩基、縮合剤および必要に応じて0.01〜30当量の添加剤の存在下、室温と200 ℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、工程2で例示したものが挙げられる。
塩基としては、例えば炭酸セシウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、カリウム tert−ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N−メチルモルホリン、ピリジン、1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]−7−ウンデセン(DBU)、N,N−ジメチル−4−アミノピリジン(DMAP)等が挙げられる。
縮合剤としては、例えば1,3−ジシクロヘキサンカルボジイミド(DCC)、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド・塩酸塩(EDC)、カルボニルジイミダゾール、ベンゾトリアゾール−1−イルオキシトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルホロホスファート、(ベンゾトリアゾール−1−イルオキシ)トリピロリジノホスホニウム ヘキサフルオロホスファート、O−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスファート(HATU)、O−(ベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスファート(HBTU)、ヨウ化 2−クロロ−1−メチルピリジニウム等が挙げられる。
添加剤としては、例えば1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、4−ジメチルアミノピリジン(DMAP)等が挙げられる。
化合物(I−D)は、公知の方法(例えば、Journal of American Chemical Society, 136, 16958, (2014)を参照)もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
化合物(I−F)は、化合物(I−E)とコハク酸無水物を、溶媒中、1〜30当量の塩基存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
化合物(I−G)は、化合物(I−F)と末端がアミノ化された固相担体とを、無溶媒でまたは溶媒中、1〜30当量の塩基、縮合剤および必要に応じて0.01〜30当量の添加剤の存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間〜100時間反応した後、無水酢酸/ピリジン溶液と室温と200℃の間の温度で5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、工程2で例示したものが挙げられる。
塩基、縮合剤および添加剤としては、それぞれ工程3で例示したものが挙げられる。
アミノ化された固相担体としては、例えば長鎖アルキルアミン細孔性ガラス(LCAA−CPG)等 があげられ、これらは市販品として得ることができる。
式(I’)で表される糖リガンド−テザー−ブランチャーユニットを有する核酸複合体は、化合物(I−G)を用い、公知のオリゴヌクレオチド化学合成法で対応するヌクレオチド鎖を伸長した後に、固相からの脱離、保護基の脱保護および精製を行うことで製造することができる。
本発明における核酸誘導体は、式(II’)で表される部分構造を有する化合物の製造方法として、その製造方法を例示することができる。
化合物(II−A)は、化合物(I−A)、t−ブチルジメチルシリルクロリドおよびジメチルアミノピリジンをN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)等の溶媒中、好ましくは2等量の塩基の存在下、0℃〜100℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
塩基としては、製造方法1の工程3で例示したものが挙げられる。
化合物(II−B)は、化合物(II−A)を用い、製造方法1の工程1と同様の条件にて製造することができる。
化合物(II−C)は、化合物(II−B)とフッ化n−テトラブチルアンモニウム(TBAF)を、溶媒中、室温と200℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、工程2で例示したものが挙げられる。
化合物(II−D)は、化合物(II−C)を用い、製造方法1の工程2と同様の条件にて製造することができる。
化合物(II−E)は、化合物(II−D)および化合物(I−D)を用い、製造方法1の工程3と同様の条件にて製造することができる。
化合物(II’)は、化合物(II−E)を用い、製造方法1の工程4〜工程6と同様の条件にて製造することができる。
本発明における核酸誘導体は、式(III’)で表される部分構造を有する化合物の製造方法として、その製造方法を例示することができる。
化合物(III−B)は、化合物(III−A)を用い、製造法1の工程1と同様の条件にて製造することができる。
化合物(III−A)は市販品として購入することができる。
化合物(III−C)は、化合物(III−B)を用い、製造法1の工程2と同様の条件にて製造することができる。
化合物(III−E)は、化合物(III−C)を用い、製造法1の工程3と同様の条件にて製造することができる。
化合物(III’)は、化合物(III−E)を用い、製造方法1の工程4〜工程6と同様の条件にて製造することができる。
本発明における核酸誘導体は、式(IV’)で表される部分構造を有する化合物の製造方法として、その製造方法を例示することができる。
本発明における核酸誘導体は、式(V’)で表される部分構造を有する化合物の製造方法として、その製造方法を例示することができる。
オリゴヌクレオチドの5’末端に糖リガンド−テザー−ブランチャーユニットが結合した、本発明の核酸複合体の製造方法を以下に例示する。
化合物(I−H)は、化合物(II−E)と2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホジアミダイトを、無溶媒でまたは溶媒中、塩基および反応促進剤共存下、室温と200℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、製造方法1の工程2で例示したものが挙げられる。
塩基としては、製造方法1の工程3で例示したものが挙げられる。
反応促進剤としては、例えば、1H−テトラゾール、4,5−ジシアノイミダゾール、5−エチルチオテトラゾール、5−ベンジルチオテトラゾール等があげられ、市販品として購入できる。
オリゴヌクレオチド鎖を伸長し、最後に化合物(I−H)を用い、オリゴヌクレオチドの5’末端を糖リガンド−テザー−ブランチャーユニットで修飾した後、固相からの脱離、保護基の脱保護および精製を行うことにより、化合物(I’’)を製造することができる。ここで、固相からの脱離、保護基の脱保護および精製は、それぞれ製造方法1の工程7と同様にして製造できる。
オリゴヌクレオチドの5’末端に糖リガンド−テザー−ブランチャーユニットが結合した、本発明の核酸複合体の製造方法を以下に例示する。
オリゴヌクレオチドの5’末端に糖リガンド−テザー−ブランチャーユニットが結合した、本発明の核酸複合体の製造方法を以下に例示する。
オリゴヌクレオチドの5’末端に糖リガンド−テザー−ブランチャーユニットが結合した、本発明の核酸複合体の製造方法を以下に例示する。
オリゴヌクレオチドの5’末端に糖リガンド−テザー−ブランチャーユニットが結合した、本発明の核酸複合体の製造方法を以下に例示する。
二本鎖核酸を構成するセンス鎖の3末端’または5’末端に糖リガンド−テザー−ブランチャーユニットを有するセンス鎖と、二本鎖核酸を構成するアンチセンス鎖とを、水または適当な緩衝液にそれぞれ溶解し、混合することにより二本鎖核酸を有する核酸複合体を得ることができる。
緩衝液としては、例えば酢酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、水等が挙げられ、これらを単独または混合して用いられる。
本発明における核酸誘導体は、式(VI’)で表される部分構造を有する化合物の製造方法として、その製造方法を例示する事ができる。
化合物(VI−B)は化合物(VI−A)を用い、製造方法1の工程1と同様の条件にて製造する事ができる。
化合物(VI−A)は市販品として、または公知の方法(例えばバイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レターズ,第11巻,383−386頁)もしくはそれに準じた方法で得る事ができる。
化合物(VI−C)は化合物(VI−B)を用い、製造方法1の工程2と同様の条件にて製造する事ができる。
化合物(VI−D)は化合物(VI−C)を用い、製造方法1の工程3と同様の条件にて製造する事ができる。
化合物(VI−E)は化合物(VI−D)を用い、製造方法1の工程2と同様の条件にて製造する事ができる。
化合物(VI−G)は化合物(VI−E)と化合物(VI−F)とを用い、製造方法1の工程3と同様の条件にて製造する事ができる。
化合物(VI−H)は化合物(VI−G)を用い、製造方法2の工程9と同様の条件にて製造する事ができる。
化合物(VI’)は化合物(VI−H)、化合物(VI−I)および化合物(VI−J)を用い、製造方法1の工程4〜6と同様の条件にて製造する事ができる。
化合物(VI−F)は公知の方法(例えば、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ(Journal of American Chemical Society), 136巻, 16958貢, 2014年記載の方法)、またはそれに準じた方法で得る事ができる。
式2においてP1およびP4が−NH−CO−、−O−CO−または−S−CO−である、糖リガンド−テザーーユニットは以下の方法で製造することができる。
式:
化合物(VII−C)は、化合物(VII−A)と化合物(VII−B)を、テトロヒドロフラン等の溶媒中、トリフェニルホスフィンポリマー担持体を加え、氷冷下、ジイソプロピルアゾジカルボキシレートトルエン溶液を反応させる事により製造する事ができる。
溶媒としては製造工程1の工程2で例示したものが挙げられる。
化合物(VII−A)は市販品として得る事ができる。
化合物(VII−D)は化合物(VII−C)を用い、メタノール等の溶媒中、氷冷下、塩基の存在下、反応させる事により製造する事ができる。
溶媒としては、製造工程1の工程2で例示したものが挙げられる。
塩基としては、製造工程1の工程3で例示したものが挙げられる。
化合物(VII−F)は化合物(VII−D)および化合物(VII−E)を用い、製造工程1の工程3と同様の条件で製造する事ができる。
化合物(VII−H)は化合物(VII−F)および化合物(VII−G)を用い、製造工程1の工程3と同様の条件で製造する事ができる。
化合物(VII−J)は化合物(VII−H)および化合物(VII−I)を用い、製造工程1の工程3と同様の条件で製造する事ができる。
化合物(VII−L)は化合物(VII−J)および化合物(VII−K)を用い、製造工程1の工程3と同様の条件で製造する事ができる。
化合物(VII−N)は化合物(VII−L)および化合物(VII−M)を用い、製造工程1の工程3と同様の条件で製造する事ができる。
化合物(VII’)は化合物(VII−O)、化合物(VII−P)および化合物 (VII−Q)を用い、製造工程1の工程3と同様の条件で製造する事ができる。
工程DP
有機合成化学で常用される方法[例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第3版(Protective Groups in Organic Synthesis, third edition)、グリーン(T.W.Greene)著、John Wiley&Sons Inc.(1999年)等に記載の方法等]を適切に用いることで製造することができる。
化合物(VII−B)、化合物(VII−E)、化合物(VII−G)、化合物(VII−I)、化合物(VII−K)、化合物(VII−M)、化合物(VII−O)、化合物(VII−P)および化合物(VII−Q)は市販品として、または「実験化学講座第4版 有機合成、p. 258、丸善(1992年)」、「March’s Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 7th Edition」に記載の方法を組み合わせる事、もしくはそれに準じた方法で得る事ができる。
式4においてP7が−O−である、ユニットは以下の方法で製造することができる。
化合物(VIII−C)は化合物(VIII−A)および化合物(VIII−B)を用い、製造工程1の工程3と同様の条件で製造する事ができる。
化合物(VIII−B)は市販品として、または「実験化学講座第4版 有機合成、p. 258、丸善(1992年)」、「March’s Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 7th Edition」に記載の方法を組み合わせる事、もしくはそれに準じた方法で得る事ができる。
化合物(VIII’)は化合物(VIII−C)および化合物(VIII−D)を用い、製造工程1の工程3と同様の条件で製造する事ができる。
化合物(VIII−D)は市販品として、または「実験化学講座第4版 有機合成、p. 258、丸善(1992年)」、「March’s Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 7th Edition」に記載の方法を組み合わせる事、もしくはそれに準じた方法で得る事ができる。
有機合成化学で常用される方法[例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第3版(Protective Groups in Organic Synthesis, third edition)、グリーン(T.W.Greene)著、John Wiley&Sons Inc.(1999年)等に記載の方法等]を適切に用いることで製造することができる。
式2においてP1およびP4が−O−である、糖リガンド−テザーユニットは以下の方法で製造することができる。
式:
化合物(IX−C)は化合物(IX−A)と化合物(IX−B)をN,N’−ジメチルホルムアミドな等の溶媒に溶解し、炭酸水素カリウム等の塩基を加えて、室温〜200℃にて5分間〜100時間反応させる事により製造する事ができる。
溶媒としては、製造工程1の工程2に例示したものが挙げられる。
塩基としては、製造工程1の工程3で例示したものが挙げられる。
化合物(IX−E)は化合物化合物(IX−C)と化合物(IX−D)をN, N’−ジメチルホルムアミド等の溶媒に溶解し、炭酸水素カリウム等の塩基を加えて、室温〜200℃で5分間〜100時間反応させる事により製造する事ができる。
溶媒としては、製造工程1の工程2で例示したものが挙げられる。
塩基としては、製造工程1の工程3で例示したものが挙げられる。
化合物(IX−A)は市販品として得る事ができる。
化合物(IX−G)は化合物(IX−E)および化合物(IX−F)を用い、製造工程1の工程3と同様の条件で製造する事ができる。
化合物(IX−I)は化合物(IX−G)および化合物(IX−H)を用い、製造工程1の工程3と同様の条件で製造する事ができる。
化合物(IX−K)は化合物(IX−I)および化合物(IX−J)を用い、製造工程1の工程3と同様の条件で製造する事ができる。
化合物(IX−M)は化合物(IX−K)および化合物(IX−L)を用い、製造工程1の工程3と同様の条件で製造する事ができる。
化合物(IX’)は化合物(IX−M)、化合物(IX−N)、化合物(IX−O)および化合物(IX−P)を用い、製造工程1の工程3と同様の条件で製造する事ができる。
有機合成化学で常用される方法[例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第3版(Protective Groups in Organic Synthesis, third edition)、グリーン(T.W.Greene)著、John Wiley&Sons Inc.(1999年)等に記載の方法等]を適切に用いることで製造することができる。
式1〜式7の核酸複合体の製造方法として、以下の方法も用いる事ができる。
化合物(X−B)は化合物(VIII’’)と化合物(X−A)を溶媒中、0℃〜100℃で10秒間〜100時間反応させる事により製造する事ができる。
溶媒としては水、リン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、ジメチルスルホキシド等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
化合物(VIII’)は製造法14を用いることで、得ることができる。
化合物(X’)は化合物(X−B)を用いて炭酸ナトリウム水溶液またはアンモニア水中等pH8以上の条件下、室温と200℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させる事により製造する事ができる。
式1〜式7の核酸複合体の製造方法として、以下の方法も用いる事ができる。
化合物(XI−A)は化合物(VIII’’’)を用いて、公知の方法(例えばバイオコンジュゲート・ケミストリー(Bioconjugate Chemistry), 第26巻, 1451−1455頁, 2015年に記載の方法)またはそれに準じた方法で得る事ができる。
化合物(VIII’’’)は製造法14を用いることで、得ることができる。
化合物(XI’)は化合物(XI−B)を用いて、公知の方法(例えばバイオコンジュゲート・ケミストリー(Bioconjugate Chemistry), 第26巻, 1451−1455頁, 2015年に記載の方法)またははそれに準じた方法で得る事ができる。
また別の方法として、化合物(XI’)は、公知の方法(例えばバイオコンジュゲートケミストリー(Bioconjugate Chemistry), 第22巻,1723−1728頁, 2011年を参照)あるいははそれに準じた方法で、化合物(XI−A)から直接得る事ができる。
本発明の核酸複合体は、哺乳動物に投与して、生体内において、標的遺伝子の発現を低下または停止させることで抑制し、標的遺伝子に関連する疾患の治療に用いることができる。
本発明の核酸複合体を治療剤または予防剤として使用する場合、投与経路としては、治療に際し最も効果的な投与経路を使用するのが望ましく、特に限定されるものではないが、例えば、静脈内投与、皮下投与及び筋肉内投与等が挙げられ、好ましくは静脈内投与である。
投与量は、投与対象の病状や年齢、投与経路等によって異なるが、例えば二本鎖のオリゴヌクレオチドに換算した1日投与量が0.1μg〜1000 mgとなるように投与すればよく、1日投与量が1〜100 mgとなるように投与することがより好ましい。
注射剤の場合、液剤または溶媒を除去または凍結乾燥した組成物に、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理食塩水またはアミノ酸輸液等を混合して注射剤を調製することが好ましい。また、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システインもしくはEDTA等の抗酸化剤、またはグリセリン、ブドウ糖もしくは塩化ナトリウム等の等張化剤等を添加して注射剤を調製することも可能である。また、例えばグリセリン等の凍結保存剤を加えて凍結保存することもできる。
UPLC分析は以下の条件を用いた。
移動相A: 0.1%ギ酸含有水溶液、B; アセトニトリル溶液
グラジエント: 移動相Bが10%-90%のリニアグラジエント(3分間)
カラム: Waters社製ACQUITY UPLC BEH C18 (1.7 μm、内経 2.1 x 50 mm)
流速: 0.8 mL/min
PDA検出波長: 254 nm (検出範囲190-800 nm)
工程1
ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー (Journal of American Chemical Society), 第136巻, 16958-16961頁, 2014年に記載された方法で合成した化合物1 (0.8755 g, 1.9567 mmol)をテトラヒドロフラン (10 mL)に溶解し、1, 3−ジシクロヘキサンカルボジイミド(DCC, 0.4247 g, 2.0584 mmol)とN-ヒドロキシスクシミド (0.2412 g, 2.0958 mmol)を室温にて一晩撹拌した。反応混合物から析出した固体を除き、減圧下、溶媒を留去した。得られた混合物をN, N’-ジメチルホルムアミド (DMF)に溶解し、2-アミノエチルマレイミド臭酸塩 (0.6479 g, 2.5491 mmol)とジイソプロピルエチルアミン (1.7 mL, 9.7835 mmol)を加えた後、室温で一晩撹拌した。減圧下、反応液の溶媒を留去し、逆相カラムクロマトグラフィー (水/メタノール=80/20)で溶出させることにより、化合物2 (0.8502 g, 収率76%)を得た。
ESI-MS m/z: 570 (M + H)+;
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.45-1.56 (4H, m), 1.78 (3H, s), 1.90 (3H, s), 1.97 (2H, t, J= 7.0 Hz), 2.00 (3H, s), 2.11 (3H, s), 3.18-3.19 (2H, m), 3.38-3.45 (3H, m), 3.64-3.71 (1H, m), 3.85-3.89 (1H, m), 4.01-4.04 (3H, m), 4.48 (1H, d, J= 8.6 Hz), 4.95-4.98 (1H, m), 5.21 (1H, d, J = 3.5 Hz), 6.99 (2H, s), 7.81-7.87 (2H, m).
工程2
工程1に記載の化合物1 (0.9602 g, 2.1460 mmol)をN,N’-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、N-Boc-エチレンジアミン (シグマアルドリッチ社製, 0.6877 g, 4.292 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (1.90 mL, 10.87 mmol)、および2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロリン酸塩 (和光純薬工業社製, 1.6437 g, 4.3229 mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。反応液に水を加え、クロロホルムで2回抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、化合物3の粗精製物を得た。
ESI-MS m/z: 590 (M + H)+
工程2で合成した化合物3 (1.2654 g, 2.1460 mmol)をジクロロメタン (15 mL)に溶解し、トリフルオロ酢酸 (4 mL)を加えて、室温にて一晩攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、逆相カラムクロマトグラフィー (水/メタノール=80/20)で溶出させることにより、化合物4 (0.3879 g, 収率37 %)を得た。
ESI-MS m/z: 490 (M + H)+;
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.46-1.52 (4H, m), 1.78 (3H, s), 1.90 (3H, s), 2.00 (3H, s), 2.08 (2H, t, J = 7.4 Hz), 2.11 (3H, s), 2.85 (2H, t, J = 6.3 Hz), 3.27 (2H, dd, J = 12.3, 6.2 Hz), 3.67-3.69 (1H, m), 3.68-3.73 (1H, m), 3.86-3.90 (1H, m), 4.01-4.04 (3H, m), 4.49 (1H, d, J = 8.4 Hz), 4.97 (1H, dd, J = 11.3, 3.4 Hz), 5.22 (1H, d, J = 3.5 Hz), 7.86 (1H, d, J = 9.1 Hz), 7.95-8.02 (1H, m).
(9H-フルオレン-9-イル)メチル((2R,3R)-1,3-ジヒドロキシブタン-2-イル)カルバマート (化合物5, Chem-Impex International, Inc社製, 1.50 g, 4.58 mmol)をピリジン (20 mL)に溶解し、氷冷下、4,4’-ジメトキシトリチルクロライド (東京化成工業社製, 1.71 g, 5.04 mmol)を加えた後、室温にて2時間攪拌した。反応液を氷冷し、10%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル=90/10)で精製することにより、化合物6 (1.07 g, 収率37%)を得た。
ESI-MS m/z: 630 (M + H)+
工程4で合成した化合物6 (1.07 g, 1.699 mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にてピペリジン (0.336 mL, 3.40 mmol)を加えて3時間攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=90/10)で精製することにより、化合物7 (0.59 g, 収率85 %)を得た。
ESI-MS m/z: 408 (M + H)+
5-ヒドロキシイソフタル酸ジメチル(化合物8, 和光純薬工業社製, 5.0443 g, 24 mmol)をテトラヒドロフラン (和光純薬工業社製25 mL)に溶解し、2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-1-エタノール (東京化成工業社製, 4.0343 g, 25.03 mmol)、およびトリフェニルホスフィン ポリマー担持体 (シグマアルドリッチ社製, 6.61 g, 25.2 mmol)を加えた後、氷冷下、40%ジイソプロピルアゾジカルボキシレート(DIAD)トルエン溶液 (東京化成工業社製, 13.26 mL, 25.2 mmol)を加え、室温にて一晩攪拌した。反応液をろ過し、減圧下、ろ液を留去した後、残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル=95/5〜80/20)で精製することにより、化合物9 (5.3071 g, 収率63%)を得た。
ESI-MS m/z: 254 (M + H)+, 脱Boc体として検出
工程6で合成した化合物9 (5.3071 g, 15.02 mmol)をメタノール (25 mL)に溶解し、氷冷下、2mol/L水酸化ナトリウム水溶液 (和光純薬工業社製, 13 mL)を加え、室温にて4時間攪拌した。反応液を氷冷し、10%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去することにより、化合物10を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 324 (M - H)-
工程7で合成した化合物10 (1.9296 g, 5.93 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (70 mL)に溶解し、N-1-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニル)-エチレンジアミン塩酸塩 (3.3493 g, 11.86mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (5.18 mL, 29.7 mmol)、および2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩 (4.5168 g, 11.88 mmol)を加えて、室温にて4時間攪拌した。反応液を氷冷し、10%クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール)で精製することにより、化合物11 (3.4407 g, 収率68%)を得た。
ESI-MS m/z: 898 (M + HCOO)-
工程8で合成した化合物11 (1.6087 g, 1.884 mmol)をジクロロメタン (20 mL)に溶解し、氷冷下、トリフルオロ酢酸 (5mL, 64.9 mmol)を加えて、室温にて4時間攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去することにより、化合物12 (2.4079 g)を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 798(M + HCOO)-
工程9で合成した化合物12 (386 mg, 0.512 mmol)をテトラヒドロフラン (10 mL)に溶解し、氷冷下、塩化ベンゾイル (175 mg, 1.024mmol)を加えて、室温にて1時間攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール)で精製することにより、化合物13 (373 mg, 収率82%)を得た。
ESI-MS m/z: 888(M + H)+
工程10で合成した化合物13 (108 mg, 0.122 mmol)をジクロロメタン (5 mL)に溶解し、室温にてジエチルアミン (0.5 mL,4.8 mmol)を加えて1時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去することにより、化合物14 (54.9 mg)を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 444(M + H)+
工程11で合成した化合物14 (180 mg, 0.406 mmol)、Nα,Nε-ビス(tert-ブトキシカルボニル)-L-リジン (ノババイオケム社製, 295 mg, 0.852 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.354 mL,2.029 mmol)、および2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩 (324 mg, 0.852 mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。反応液を氷冷し、10%クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール)で精製することにより、化合物15 (450 mg)を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 1101(M + H)+
工程12で合成した化合物15 (2.1558 g, 1.9593 mmol)をジクロロメタン (20 mL)に溶解し、氷冷下、トリフルオロ酢酸 (5 mL)を加えて、室温にて4時間攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去することにより、化合物16を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 700(M + H)+
工程9で合成した化合物12 (0.5716 g, 0.7582 mmol)、バイオコンジュゲート・ケミストリー (Bioconjugate Chemistry), 第22巻, 690-699頁, 2011年に記載された方法で合成したドデカン酸モノベンジルエステル (0.4859 mg, 1.5164 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.662 mL, 3.79 mmol)、および2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩 (0.5766 g, 1.516 mmol)をN,Nジメチルホルムアミド(12 mL)に溶解し、室温にて1時間攪拌した。反応液を氷冷し、飽和クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール)で精製することにより、化合物17 (0.88 g, 収率84%)を得た。
ESI-MS m/z: 1057(M + H)+
工程14で合成した化合物17 (0.7545 g, 0.714 mmol)をジクロロメタンテトラヒドロフラン(20 mL)に溶解し、室温にてジエチルアミン (5 mL,47.9 mmol)を加えて終夜攪拌した。減圧下、溶媒を留去することにより、化合物18を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 612(M + H)+
工程15で合成した化合物18 (0.437 g, 0.7143 mmol)、Nα,Nε-ビス(tert-ブトキシカルボニル)-L-リジン (ノババイオケム社製, 0.5483 g, 1.583 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.624 mL, 3.57 mmol)、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩 (0.5703 g, 1.5 mmol)を加えて、室温にて2時間攪拌した。反応液に10%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去することにより、化合物19の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1269(M + H)+
工程16で合成した化合物19 (0.906 g, 0.7143 mmol)をジクロロメタン (12 mL)に溶解し、氷冷下、トリフルオロ酢酸 (3mL, 38.9 mmol)を加えて、室温にて4時間攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去することにより、化合物20の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 869(M + H)+
工程12で合成した化合物15 (100 mg, 0.091 mmol)をメタノール (3 mL)に溶解し、酢酸 (2 μL)を添加した後、パラジウム/炭素による接触水素還元を行った。得られた溶液留分を減圧下、溶媒を留去することにより、化合物21を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 967 (M + H)+
工程18で合成した化合物21 (50 mg, 0.052 mmol)およびN-(6-マレイミドカプロイルオキシ)スクシミド (48 mg, 0.155 mmol)をテトラヒドロフラン (2 mL)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン (0.045 mL, 0.259 mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール)で精製することにより、化合物22 (18 mg, 収率30%)を得た。
ESI-MS m/z: 1160 (M + H)+
工程19で合成した化合物22 (18 mg, 0.016 mmol)をジクロロメタン (2 mL)に溶解し、氷冷下、トリフルオロ酢酸 (0.2 mL, 2.6 mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、ジエチルエーテルにて晶析した後、化合物23 (7.5 mg, 収率64%)を白色固体として得た。
ESI-MS m/z: 759 (M + H)+
工程7で合成した化合物10 (0.9372 g, 2.8809 mmol)、β-アラニンメチルエステル塩酸塩 (東京化成工業株式会社製, 0.8082 g, 5.7902 mmol)を用い、実施例1の工程8と同様の方法で化合物24を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 495 (M + H)+
工程21で合成した化合物24 (0.9622 g, 1.952 mmol)を用い、実施例1の工程9と同様の方法で化合物25を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 396 (M + H)+
工程22で合成した化合物25 (0.1146 g, 0.290 mmol)およびN-スクシンイミジル15-アジド-4,7,10,13-テトラオキサペンタデカン酸(N3-PEG4-NHS, 東京化成工業株式会社製, 0.0750 g, 0.1931 mmol)を用い、実施例3の工程19と同様の方法で化合物26を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 669 (M + H)+
工程23で合成した化合物26 (0.1291 g, 0.193 mmol)を用い、実施例1の工程7と同様の方法で化合物27を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 641 (M + H)+
工程24で合成した化合物27 (0.1252 g, 0.193 mmol)およびL-グルタミン酸 ジ-tert-ブチルエステル (渡辺化学株式会社製, 0.1180 g, 0.399 mmol)を用い、実施例1の工程8と同様の方法で化合物28 (0.0521 g, 収率24%)を得た。
ESI-MS m/z: 1124 (M + H)+
工程25で合成した化合物28 (0.0521 g, 0.0464 mmol)を用い 、実施例1の工程9と同様の方法で化合物29 (36 mg, 収率86%)を得た。
ESI-MS m/z: 899 (M + H)+
工程13で合成した化合物16 (0.2586 g, 0.3695 mmol)とジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー (Journal of American Chemical Society), 第136巻, 16958-16961頁, 2014年に記載された方法で合成した化合物1 (0.8559 g, 1.7927 mmol)を用い、実施例1の工程8と同様の方法で化合物30 (0.5272 g, 収率61%)を得た。
ESI-MS m/z: 2418 (M + H)+
工程27で合成した化合物30 (0.2653 g, 0.1097 mmol)を用い、実施例3の工程21と同様の方法で化合物31 (0.1524 g, 収率61%)を得た。
ESI-MS m/z: 2284 (M + H)+
工程29
工程28で合成した化合物31 (0.0152 g, 0.006657 mmol)を用い、実施例3の工程19と同様の方法で化合物32 (0.0077 g, 収率47%)を得た。
ESI-MS m/z: 1239(M + 2H)2+
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.11-1.66 (34H, m), 1.77 (12H, d, J = 1.5 Hz), 1.89 (12H, s), 2.01-2.14 (10H, m), 2.01 (12H, s), 2.10 (12H, s), 2.92-2.99 (4H, m), 3.16-3.54 (14H, m), 3.65-3.74 (4H, m), 3.81-3.91 (4H, m), 3.98-4.08 (14H, m), 4.11-4.24 (4H, m), 4.48 (4H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz), 4.93-5.00 (4H, m), 5.21 (4H, d, J = 3.5 Hz), 6.99 (2H, s), 7.52 (2H, s), 7.66-7.75 (2H, m), 7.78-7.87 (6H, m), 7.91 (1H, br s), 8.01-8.08 (3H, br m), 8.54-8.60 (2H, br m).
工程30
工程28で合成した化合物31 (0.0150 g, 0.00657 mmol)を用い、実施例4の工程23と同様の方法で化合物33 (0.0062 g, 収率37%)を得た。
ESI-MS m/z: 1279(M + 2H)2+
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.11-1.66 (30H, m), 1.77 (12H, s), 1.89 (12H, s), 2.01-2.14 (8H, m), 2.01 (12H, s), 2.10 (12H, s), 2.33-2.38 (2H, m), 2.92-2.99 (4H, m), 3.16-3.54 (14H, m), 3.58-3.63 (16H, m), 3.65-3.74 (4H, m), 3.81-3.91 (4H, m), 3.98-4.08 (12H, m), 4.11-4.24 (4H, m), 4.48 (4H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz), 4.93-5.00 (4H, m), 5.21 (4H, d, J = 3.5 Hz), 7.52 (2H, s), 7.66-7.75 (2H, m), 7.78-7.87 (6H, m), 7.91 (1H, br s), 8.01-8.08 (3H, br m), 8.54-8.60 (2H, br m).
工程31
工程24で合成した化合物27 (0.00436 g, 0.00681 mmol)および参考例1の工程3で合成した化合物4 (0.010 g, 0.020 mmol)を用い、実施例1の工程8と同様の方法で化合物34の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1584(M + H)+
工程32
工程26で合成した化合物29 (0.0100 g, 0.01112 mmol)を用い、実施例1の工程8と同様の方法で化合物35 (0.0223 g, 収率72%)を得た。
ESI-MS m/z: 1393(M + 2H)2+
工程17で合成した化合物20 (0.1952 g, 0.225 mmol)とジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー (Journal of American Chemical Society), 第136巻, 16958-16961頁、2014年に記載された方法で合成した化合物1(0.4162 g, 0.93 mmol)を用い、実施例1の工程8と同様の方法で化合物36 (334.8 mg, 収率58%)を得た。
ESI-MS m/z: 1294 (M + 2H)2+
工程33で合成した化合物36 (0.1459 g, 0.056 mmol)を用い、実施例3の工程18と同様の方法で化合物37 (112 mg, 収率80%)を得た。
ESI-MS m/z: 1249 (M + 2H)2+
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.11-1.66 (44H, m), 1.77 (12H, d, J = 1.5 Hz), 1.89 (12H, s), 2.01-2.20 (12H, m), 2.01 (12H, s), 2.10 (12H, s), 2.92-2.99 (4H, m), 3.16-3.54 (10H, m), 3.58-3.64 (4H, m), 3.65-3.74 (4H, m), 3.81-3.91 (4H, m), 3.98-4.08 (12H, m), 4.11-4.24 (4H, m), 4.48 (4H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz), 4.93-5.00 (4H, m), 5.21 (4H, d, J = 3.5 Hz), 6.99 (2H, s), 7.52 (2H, s), 7.66-7.75 (2H, m), 7.78-7.87 (6H, m), 7.91 (1H, br s), 8.01-8.08 (3H, br m), 8.54-8.60 (2H, br m).
工程34で合成した化合物37 (0.1091 g, 0.044 mmol)および参考例2の工程5で製造した化合物7 (0.0748 g, 0.184 mmol)を用い、実施例1の工程8と同様の方法で化合物38を粗生成物として得た。
ESI-MS m/z: 1292 (M + 2H)2+, 脱DMTr体として検出
工程35で合成した化合物38 (0.161 g, 0.05586 mmol)をジクロロメタン (5 mL)に溶解し、コハク酸無水物 (東京化成工業社製, 0.1182 g, 1.181 mmol)、N,N-ジメチルアミノピリジン (0.0224 g,0.183 mmol)、およびトリエチルアミン(0.55 mL, 3.95 mmol)を加えて、室温にて一晩攪拌した。反応液を氷冷し、水を加え、酢酸エチルで2回抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去することにより、化合物39の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1342(M + 2H)2+, 脱DMTr体として検出
工程36で合成した化合物39 (0.0816 g, 0.02734 mmol)、O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロリン酸塩 (0.0221 g, 0.05827 mmol)、およびジイソプロピルエチルアミン(0.02 mL, 0.1094 mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド(4 mL)に溶解し、LCAA-CPG (Chem Gene社製, 0.4882 g)を加え、室温にて終夜攪拌した。混合物を濾別し、ジクロロメタン、10%メタノールジクロロメタン溶液、およびジエチルエーテルで順次洗浄した後、無水酢酸/ピリジン溶液と作用させることにより、化合物40 (49.5 μmol/g, 収率89%)を得た。なお、収率は1%トリフルオロ酢酸/ジクロロメタン溶液を固相担持体に添加し、DMTr基に由来する吸収から計算できる固相担体への導入率より算出した。
工程38
工程29で合成した化合物32と、モレキュールズ (Molecules), 第17巻, 13825-13843頁, 2012年に記載された方法で合成した末端がメルカプト基で修飾されたオリゴヌクレオチドを加えて、室温にて4時間静置した。反応混合物に炭酸ナトリウムを加え、4℃で一晩静置した。陰イオン交換クロマトグラフィー (GE Healthcare, MonoQ 5/50GL, 10μm, 5.0 mm x 50 mm、A液: 10 mmol/L Tris緩衝液/30%アセトニトリル, B液: 10 mmol/L Tris緩衝液/30%アセトニトリル/1 mol/L NaBrによるグラジエント)あるいは逆相液体クロマトグラフィー (ウォーターズ, X BridgeC18, 5μm, 4.6 mmx250 mm、0.1 mol/L酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液, B液:アセトニトリルによるグラジエント)のいずれかの方法で精製することにより、オリゴヌクレオチドが異なる3種類の1本鎖の核酸複合体41を得た。
本実施例により合成した核酸複合体の配列および質量分析結果を第1表に示す。
工程39
工程38で合成した1本鎖の核酸複合体41_3’-AT3-ssRNAは、混合緩衝液(100 mmol/L酢酸カリウム、30 mmol/L 2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸、HEPES)-KOH(pH 7.4)、2 mmol/L酢酸マグネシウム)にて濃度調整(50 μmol/L)した。前述センス鎖とアンチセンス鎖(50 μmol/L)を各々等量混合し、80 ℃で10分間静置した。アンチセンス鎖配列は、第2表に記載されている通りである。徐々に温度を下げ、37 ℃で1時間静置し、2本鎖の核酸複合体42を得た。
本実施例により合成した核酸複合体の配列を第2表に示す。
工程40
工程32で合成した化合物35とエーシーエス・ナノ(ACS Nano), 第9巻, 9652-9664頁, 2015年に記載された方法で合成したオリゴヌクレオチドを用い、実施例9の工程38と同様の反応条件、手順にて1本鎖の核酸複合体43を得た。
本実施例により合成した核酸複合体の配列および質量分析結果を第3表に示す。
工程41
実施例9の工程39と同様の方法で2本鎖の核酸複合体44を得た。
本実施例により合成した核酸複合体の配列を第4表に示す。
工程42
工程20で合成した化合物23 (648 nmol)とモレキュールズ (Molecules), 第17巻, 13825-13843頁, 2012年に記載された方法で合成した末端がメルカプト基で修飾されたオリゴヌクレオチド (216 nmol)を用い、実施例9の工程38と同様の方法で核酸複合体45を得た。
工程43
工程42で合成した化合物45 (100 nmol)にN-スクシイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート(6.3 mg, 20 μmol)のジメチルスルホキシド溶液を加え、リン酸緩衝液中で室温、4時間静置した。反応溶液にジチオトレイトール (15.4 mg, 100 μmol)を添加し、室温で一晩静置した。混合物をゲルろ過処理 (Napカラム、GE ヘルスケア社製、溶出溶媒: 20 mmol/L 酢酸/酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0))および限外濾過を行うことで核酸複合体46を得た。
工程44
工程43で合成した化合物46と参考例1の工程1で合成した化合物2を用い、実施例9の工程38と同様の方法で1本鎖の核酸複合体47を得た。
工程45
工程43で合成した化合物46とバイオコンジュゲート・ケミストリー (Bioconjugate Chemistry), 第14巻, 232-238頁, 2003年に記載された方法で合成したマンノースマレイミド付加体を用い、実施例9の工程38と同様の方法で1本鎖の核酸複合体48を得た。
本実施例により合成した核酸複合体の配列および質量分析結果を第5表に示す。
アンチセンス鎖の3’末端にGalNAc基を有する、オリゴヌクレオチド複合体の合成 (それぞれG-CH1179-s、G-CH0099-s、およびG-CH1180-sと呼ぶ)を、核酸合成装置 (ウルトラ ファスト パラレル シンセサイザー(Ultra Fast Parallel Syntheizer)、シグマ社製、以下UFPS)を用いて、0.2μmolスケールで行った。固相担体には、工程37で合成した化合物40を用いた。ジメトキシトリチルdTホスホアミダイト (SAFC-PROLIGO社)はアセトニトリルにて0.06 mol/Lに調整した。ホスホロアミダイトのアクチベーターとして5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール (SAFC-PROLIGO社)、および0.06 mol/L dTホスホアミダイトのアセトニトリル溶液を用いて、時間は各10分間とし縮合反応を行った。反応後、28%アンモニア溶液に浸し、55 ℃で4時間放置した。減圧下濃縮し、1-ブタノールを加えて反応を停止した。逆相液体クロマトグラフィー (資生堂, CAPSELL PAK C18, SG300, 6.0 mm x 75 mm, 5%アセトニトリル/0.1%酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液, B液:50%アセトニトリル/水によるグラジエント)を用いて精製することにより、1本鎖の核酸複合体49を得た。
本実施例により合成した核酸複合体の配列および質量分析結果を第6表に示す。
工程47
ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー (Journal of American Chemical Society), 第136巻, 16958-16961頁, 2014年に記載された方法で合成した化合物50 (0.0796 g, 0.044 mmol)を用い、実施例6の工程29と同様の方法で化合物51 (0.014 g, 収率19%)を得た。
ESI-MS m/z: 994 (M + 2H)2+
工程47で合成した化合物51を用い、実施例9の工程38と同様の方法で、オリゴヌクレオチドが異なる3種類の1本鎖の核酸複合体52を得た。
本実施例により合成した核酸複合体の配列および質量分析結果を第7表に示した。
工程49
工程48で合成した化合物52_3’-AT3-ssRNAを用い、実施例9の工程39と同様の方法で2本鎖の核酸複合体53を得た。
本実施例により合成した核酸複合体の配列を第8表に示す。
核酸複合体54の合成
実施例9、比較例1および比較例2で合成した各核酸複合体のうち、ApoBASO(被検物1)、核酸複合体54(被検物2)、52_3’-ApoBASO(被検物3)、52_5’-ApoBASO(被検物4)、41_3’-ApoBASO(被検物5)、41_5’-ApoBASO(被検物6)について、それぞれ以下の方法により、シーディーワン(CD-1)由来マウス初代肝細胞 (ライフテクノロジー社製、カタログ番号MSCP10)に導入した。
最終濃度が30, 10または3 nmol/Lとなるように、オプティメム (Opti-MEM、ギブコ(GIBCO)社、31985)で希釈した各核酸複合体を、96ウェルの培養プレートに、20μLずつ分注した後、プライマリヘパトサイトゾウイングアンドプレーティングサプリメント (Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements ) (ライフテクノロジー社製、カタログ番号CM3000)を含むウィリアムズイーメディウム (William’s E Medium) (ライフテクノロジー社製、カタログ番号A12176-01)に懸濁させたマウス初代肝細胞を、細胞数12500/80μL/ウェルとなるように播種し、37℃、5%CO2条件下で6時間培養したのちに、培養上清を注意深く除去し、プライマリヘパトサイトメンテナンスサプリメント (Primary Hepatocyte Maintenance Supplements) (ライフテクノロジー社製、カタログ番号CM4000)を含むウィリアムズイーメディウムを添加した。また陰性対照の群として何も処理しない細胞を播種した。
各製剤を導入した細胞を37℃の5%CO2インキュベーター内で18時間培養し、氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、スーパープレップセルリシスアンドアールティーキットフォーキューピーシーアール (東洋紡社製、カタログ番号SCQ-201)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、全RNAの回収と、得られた全RNAを鋳型とする逆転写反応によるcDNAの作製を行った。
得られたcDNAを鋳型とし、タックマン (登録商標)ジーンエクスプレッションアッセイズプローブ (アプライドバイオシステムズ社製)をプローブとして、クオントスタジオ12ケーフレックスリアルタイムピーシーアールシステム (ABI社製)を用い、添付された使用説明書に記載された方法に従ってPCR反応させることにより、Apolipoprotein B (別名Apolipoprotein-B100/Apolipoprotein-B48、以下apobと表す)遺伝子および構成的発現遺伝子であるグリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素 (D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、以下gapdhと表す)遺伝子をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、gapdhのmRNA増幅量を内部対照として、apobのmRNAの準定量値を算出した。同様に測定した陰性対照におけるapobのmRNAの準定量値を1として、apobのmRNAの準定量値から、apobのmRNAの発現率を求めた。得られたapobのmRNAの発現率の結果を、陰性対照のapob mRNA発現率に対する抑制率として第9表および第10表に示す。なお、各表は、それぞれ独立した試験の結果を示している。
実施例9、比較例1及び比較例2で合成した各核酸複合体のうち、ApoBASO(被検物1)、核酸複合体54 (被検物2)、52_3’-ApoBASO(被検物3)、52_5’-ApoBASO(被検物4)、41_3’-ApoBASO(被検物5)、41_5’-ApoBASO(被検物6)について、それぞれ以下の方法によりin vivo評価試験を実施した。なお、各核酸複合体は、試験に合わせてリン酸緩衝化生理食塩水 (DPBS) (ナカライテスク社製)で希釈して用いた。マウス (BALB/cA、日本クレアより入手)を馴化飼育後、各核酸複合体を0.75 mg/kgまたは0.25 mg/kgずつマウスに皮下注投与した。また、コントロール群としてはDPBSのみをマウスに皮下注投与した。投与から3日後に浅側頭静脈より血清を採取した。その後に動物を安楽死させ、肝臓を採取し液体窒素で凍結保存した。肝臓凍結サンプルをトリゾール (登録商標)アールエヌエーアイソレーションリージェンツ (ライフテクノロジーズ社(Life Technologies)社製、カタログ番号15596026)およびアールエヌエーイージーミニキット (キアゲン(QIAGEN)社製、カタログ番号74106)を用い、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、全RNAの回収を行った。さらにトランスクリプターファーストストランドシーディーエヌエーシンセシスキット (ロシュ社(Roche社)製、カタログ番号04897030001)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、得られた全RNAを鋳型とする逆転写反応によるcDNAの作製を行った。
得られたcDNAを鋳型とし、タックマン(登録商標)ジーンエクスプレッションアッセイズプローブ (アプライドバイオシステムズ社製)をプローブとして、クオントスタジオ12ケーフレックスリアルタイムピーシーアールシステム(ABI社製)を用い、添付された使用説明書に記載された方法に従ってPCR反応させることにより、apob遺伝子およびgapdh遺伝子をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、gapdhのmRNA増幅量を内部対照として、apobのmRNAの準定量値を算出した。同様に測定したコントロール群におけるapobのmRNAの準定量値を1として、apobのmRNAの準定量値から、apobのmRNAの発現率を求めた。また、血清中の総コレステロール濃度を、ラボアッセイコレステロール (和光純薬工業社製、カタログ番号294-65801)を用い添付された使用説明書に記載された方法に従って測定した。得られたapobのmRNAの発現抑制率および血清中総コレステロール濃度を第11表および第12表に示す。
実施例9および比較例1で得られた各核酸複合体のうち、53_3’-AT3-siRNA(被検物7)、42_3’-AT3-siRNA(被検物8)について、それぞれ以下の方法により、シーディーワン(CD-1)由来マウス初代肝細胞 (ライフテクノロジー社製、カタログ番号MSCP10)に導入した。
最終濃度が300, 100または30 nmol/Lとなるように、オプティメム (Opti-MEM、ギブコ(GIBCO)社、31985)で希釈した各核酸複合体を、96ウェルの培養プレートに、20μLずつ分注した後、プライマリヘパトサイトゾウイングアンドプレーティングサプリメント(Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements ) (ライフテクノロジー社製、カタログ番号CM3000)を含むウィリアムズイーメディウム (William’s E Medium) (ライフテクノロジー社製、カタログ番号A12176-01)に懸濁させたマウス初代肝細胞を、細胞数12500/80μL/ウェルとなるように播種し、37℃、5%CO2条件下で6時間培養したのちに、培養上清を注意深く除去し、プライマリヘパトサイトメンテナンスサプリメント (Primary Hepatocyte Maintenance Supplements) (ライフテクノロジー社製、カタログ番号CM4000)を含むウィリアムズイーメディウムを添加した。また陰性対照の群として何も処理しない細胞を播種した。
各製剤を導入した細胞を37℃の5%CO2インキュベーター内で18時間培養し、氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、スーパープレップセルリシスアンドアールティーキットフォーキューピーシーアール (東洋紡社製、カタログ番号SCQ-201)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、全RNAの回収と、得られた全RNAを鋳型とする逆転写反応によるcDNAの作製とを行った。
得られたcDNAを鋳型とし、タックマン (登録商標)ジーンエクスプレッションアッセイズプローブ (アプライドバイオシステムズ社製)をプローブとして、クオントスタジオ12ケーフレックスリアルタイムピーシーアールシステム (ABI社製)を用い、添付された使用説明書に記載された方法に従ってPCR反応させることにより、Serpin peptidase inhibitor, clade C (antithrombin), member 1 (別名antithrombin III、以下AT3と表す)遺伝子および構成的発現遺伝子であるグリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素 (D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、以下gapdhと表す)遺伝子をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、gapdhのmRNA増幅量を内部対照として、AT3のmRNAの準定量値を算出した。同様に測定した陰性対照におけるAT3のmRNAの準定量値を1として、AT3のmRNAの準定量値から、AT3のmRNAの発現率を求めた。得られたAT3のmRNAの発現率の結果を、陰性対照のAT3 mRNA発現率に対する抑制率として第13表に示す。
実施例9および比較例1で得られた各核酸複合体のうち、53_3’-AT3-siRNA(被検物7)、42_3’-AT3-siRNA(被検物8)について、それぞれ以下の方法によりin vivo評価試験を実施した。なお、各核酸複合体は、試験に合わせてリン酸緩衝化生理食塩水(DPBS)(ナカライテスク社製)で希釈して用いた。マウス(BALB/cA、日本クレアより入手)を馴化飼育後、各核酸複合体を1.5 mg/kgまたは0.5 mg/kgずつマウスに皮下注投与した。また、コントロール群としてはPBSのみをマウスに皮下注投与した。投与から3日後にイソフルラン麻酔下で後大静脈後部静脈より採血した。採血した血液を3.2 Mクエン酸ナトリウムおよび5 mmol/L D-グルコースを含む抗凝固液と体積比9:1で混合し、遠心後の上清を回収することで血漿を得た。動物は採血後に安楽死させ、肝臓を採取し液体窒素で凍結保存した。肝臓凍結サンプルをトリゾール(登録商標)アールエヌエーアイソレーションリージェンツ (ライフテクノロジーズ社(Life Technologies)社製、カタログ番号15596026)およびアールエヌエーイージーミニキット(キアゲン(QIAGEN)社製、カタログ番号74106)を用い、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、全RNAの回収を行った。さらにトランスクリプターファーストストランドシーディーエヌエーシンセシスキット (ロシュ社(Roche社)製、カタログ番号04897030001)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、得られた全RNAを鋳型とする逆転写反応によるcDNAの作製を行った。
得られたcDNAを鋳型とし、タックマン(登録商標)ジーンエクスプレッションアッセイズプローブ(アプライドバイオシステムズ社製)をプローブとして、クオントスタジオ12ケーフレックスリアルタイムピーシーアールシステム(ABI社製)を用い、添付された使用説明書に記載された方法に従ってPCR反応させることにより、AT3遺伝子およびgapdh遺伝子をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、AT3のmRNA増幅量を内部対照として、AT3のmRNAの準定量値を算出した。同様に測定したコントロール群におけるAT3のmRNAの準定量値を1として、AT3のmRNAの準定量値から、AT3のmRNAの発現率を求めた。また、血漿中のAT3タンパク質濃度を、アンチトロンビンスリーマウスエライザキット(アブカム社製、カタログ番号ab108800)を用い添付された使用説明書に記載された方法に従って測定した。得られたAT3のmRNAの発現抑制率および血漿中AT3タンパク質濃度を第14表に示す。
化合物55(1.200 g, 3.640 mmol)から、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー(Journal of Medicinal Chemistry), 第59巻, 2718-2733頁, 2016年に記載された方法で化合物56(1.050 g, 収率50%)を合成した。
ESI-MS m/z: 582 (M + H)+
化合物55(4.000g, 10.27 mmol)をジクロロメタン(60 mL)に溶解し、ベンジル-2-(2-ヒドロキシエトキシ)エチルカーバメイト(2.700 g, 11.30 mmol)、およびトリフルオロメタンスルホン酸(0.1360 mL, 1.541 mmol)を加えて、還流条件下で終夜攪拌した。反応液に10 wt% 炭酸カリウム水溶液を加え、ジクロロメタンと分液した後、有機相を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、2-メチルテトラヒドロフランへと置換濃縮した。残渣をへプタンに滴下し、得られた結晶をろ過することにより、化合物57(5.130 g, 収率88%)を得た。
ESI-MS m/z: 570 (M + H)+
工程1に記載の化合物1(898.0 mg, 2.007 mmol)をジクロロメタン(15 mL)に溶解し、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物(338.0 mg, 2.208 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩(343 mg, 2.208 mmol)、およびN-1-Z-1, 3-ジアミノプロパン塩酸塩(0.4910 mL, 2.208 mmol)を加え、室温で3時間攪拌した。反応液に水を加え、ジクロロメタンで分液した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=90/10)で精製することにより、化合物58(873.0 mg, 収率68%)を得た。
ESI-MS m/z: 639 (M + H)+
工程1に記載の化合物1 (3.00 g, 6.70 mmol)をジクロロメタン (60 mL)に溶解し、室温にてL-リジンベンジルエステル二p-トルエンスルホン酸塩 (1.75 g, 3.02 mmol)、トリエチルアミン(0.935 mL, 6.70 mmol), 1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (1.29 g, 6.70 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール1水和物 (103 mg, 0.670 mmol)を加えて2.5時間撹拌した。反応液を水と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=90/10)で精製することにより、化合物59を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 1096 (M + H)+
工程54で合成した化合物59 (2.30 g, 2.10 mmol)をテトラヒドロフラン (46 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 424 mg)を加え、水素雰囲気下で終夜撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去することにより、化合物60を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 1006 (M + H)+
イミノ二酢酸 (東京化成工業社製, 1.5 g, 6.43 mmol,)を塩化メチレン(30 mL)に溶解し、ペンタフルオロトリフルオロ酢酸(東京化成工業社製, 2.75 mL, 16.08 mmol)、トリエチルアミン(4.48 mL, 32.2 mmol)を加えて4時間撹拌した。反応液に10%クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。そこに、工程51で合成した化合物56(2 g, 3.45 mmol)を酢酸エチル(10 mL)とアセトニトリル(10 mL)との混合液に溶解し、パラジウム/炭素による接触水素還元を行った。得られた溶液部分を減圧下、溶媒を留去する事により、化合物61の粗製生物を得た。
ESI-MS m/z: 1091(M+H)+
工程56で合成した化合物61(1.5 g,1.37 mmol)を用い、参考例1の工程3と同様の方法で化合物62を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 990(M+H)+
N-(t-ブトキシカルボニル)-L-グルタミン酸 (東京化成工業社製)を用いて、工程51で合成した化合物56(1.855 g, 3.19 mmol)を用い、参考例3の工程56と同様の方法で化合物63の粗精製物を得た。
ESI-MS m/z: 1105(M+H)+
工程58で合成した化合物63(1.421 g, 1.2866 mmol)を用い、参考例1の工程3と同様の方法で化合物64を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 1004(M+H)+
ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー(Journal of Organic Chemistry), 第74巻, 6837-6842頁, 2009年に記載された方法で合成した化合物65 (90 mg, 0.173 mmol) をテトラヒドロフラン (1 mL) に溶解し、トリフェニルホスフィン、ポリマー担持 (シグマアルドリッチ社製, 63 mg, 0.189 mmol) を加えて、加熱環流下3時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去することにより、化合物66 (70 mg, 収率82%)を得た。
ESI-MS m/z: 516 (M+Na)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ0.89 (3H, s), 1.42-1.48 (2H, m), 1.52-1.61 (2H, m), 1.85 (1H, br s), 2.68 (2H, t, J= 7.2 Hz), 3.06-3.07 (2H, m), 3.39-3.44 (3H, m), 3.51-3.55 (3H, m), 3.78 (6H, s), 6.80-6.85 (4H, m), 7.17-7.23 (1H, m), 7.27-7.33 (6H, m), 7.41-7.43 (2H, m).
化合物67 (東京化成工業社製, 0.500 g, 3.73 mmoL)を用いて参考例2の工程4と同様の方法で化合物68の粗生成物 (1.5 g) を得た。
ESI-MS m/z: 435 (M-H)-
工程61で合成した化合物68の粗生成物(1.5 g) と1,4-Diaminobutane (東京化成工業社製, 3.29 g, 37.3 mmol)を用いて実施例1の工程8と同様の方法で化合物69 (0.18 g, 2 段階収率10%)を得た。
ESI-MS m/z: 551 (M+HCOO)-
1H-NMR (400 MHz, MeOD):δ1.09 (3H, s), 1.45-1.52 (4H, m), 2.80 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.91 (2H, s), 3.05 (1H, d, J = 8.8 Hz), 3.12-3.16 (4H, m), 3.24 (1H, s), 3.43 (1H, d, J = 10.8 Hz), 3.62-3.66 (7H, m), 6.71-6.76 (4H, m), 7.05-7.11 (1H, m), 7.12-7.20 (6H, m), 7.28-7.32 (2H, m).
ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー(Journal of Organic Chemistry), 第74巻, 6837-6842頁, 2009年に記載された方法で合成した化合物65 (110 mg, 0.212 mmol) をテトラヒドロフラン (2 mL) に溶解し、N-(1R,8S,9s)-Bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethyloxycarbonyl-1,8-diamino-3,6-dioxaoctane (東京化成工業社製, 72 mg, 0.222 mmol) を加えて、室温にて1時間撹拌した。反応液に水を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=90/10)で精製することにより、化合物71 (160 mg, 収率90 %)を得た。ESI-MS m/z: 845 (M+H)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ0.88 (3H, s), 0.91-1.09 (3H, m), 1.20-1.25 (1H, m), 1.52-1.59 (4H, m), 1.80-1.85 (2H, m), 2.19-2.25 (4H, m), 2.59-2.68 (1H, m), 2.84-2.90 (4H, m), 3.02-3.11 (3H, m), 3.35-3.44 (5H, m), 3.49-3.53 (5H, m), 3.54-3.58 (2H, m), 3.62 (5H, s), 3.78 (6H, s), 4.13 (2H, d, J = 6.4 Hz), 4.21 (2H, t, J = 7.2 Hz), 6.79-6.84 (4H, m), 7.18-7.21 (1H, m), 7.24-7.27 (2H, m), 7.28-7.32 (4H, m), 7.39-7.44 (2H, m).
化合物72(AstaTech社製, 100 mg, 1.148 mmol)およびFmoc-Ser(tBuMe2Si)-OH (渡辺化学工業社製, 532 mg, 1.205 mmol)を用いて実施例1の工程8と同様の方法で化合物73(410 mg, 収率70%)を得た。
ESI-MS m/z: 511 (M+H)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ 0.06 (6H, s), 0.90 (9H, s), 2.76-2.85 (1H, m), 3.65-3.86 (5H, m), 4.02-4.23 (3H, m), 4.32-4.40 (4H, m), 5.55 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.31 (2H, t, J = 7.6 Hz), 7.40 (2H, t, J= 7.6 Hz), 7.59 (2H, d, J = 7.6 Hz), 7.76 (2H, d, J = 7.6 Hz).
工程64で合成した化合物73(410 mg, 0.803 mmol)を用いて参考例2の工程4と同様の方法で化合物74の粗生成物(680 mg)を得た。
ESI-MS m/z: 814 (M+H)+
工程65で合成した化合物74の粗生成物(680 mg)を用いて参考例2の工程5と同様の方法で化合物75(330 mg, 2段階収率70%)を得た。
ESI-MS m/z: 519 (M+H)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ0.02-0.09 (6H, m), 0.89 (9H, d, J = 28.8 Hz), 2.84-2.94 (1H, m), 3.24-3.30 (2H, m), 3.46 (1H, t, J = 7.2 Hz), 3.52-3.68 (2H, m), 3.75-3.80 (1H, m), 3.82 (6H, d, J= 2.4 Hz), 3.89-3.96 (1H, m), 4.05-4.17 (1H, m), 4.27-4.37 (1H, m), 6.82-6.89 (4H, m), 7.22-7.27 (1H, m), 7.29-7.34 (6H, m), 7.41-7.45 (2H, m).
N-(Tert-ブトキシカルボニル)-1,3-ジアミノプロパン(東京化成工業社製,1.788 g, 10.26 mmol)をジクロロメタン(22.8 mL)に溶解し、トリエチルアミン(1.907 mL, 13.68 mmol)を加え、室温で15分撹拌した。反応液に、オーガニックレター(Organic Letter), 第16巻, 6318-6321頁, 2014年に記載された方法で合成した化合物76(1.126 g, 6.84 mmol)のジクロロメタン溶液(5 mL)を滴下し、室温で2時間撹拌した。反応液に水を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘプタン/酢酸エチル=35/65)で精製することにより、化合物77(1.65 g,収率80%)を得た。
ESI-MS m/z: 303 (M+H)+
工程67で合成した化合物77(1.65 g, 5.46 mmol)を用いて参考例1の工程3と同様の方法で化合物78(1.10 g, 収率100%)を得た。
ESI-MS m/z: 203 (M+H)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ1.74 (2H, dt, J = 12.0, 6.0 Hz), 2.95 (2H, t, J = 6.0 Hz), 3.18 (1H, s), 3.60 (2H, td, J= 6.0, 5.2 Hz), 7.54 (2H, dt, J = 8.4, 1.8 Hz), 7.76 (2H, dt, J = 8.4, 1.8 Hz), 7.97 (1H, br s).
化合物79 (東京化成社製, 1.2 g, 4.24mmol)を用いて参考例2の工程4と同様の方法で化合物79の粗製生物を得た。
ESI-MS m/z: 608(M+Na)+
工程69で合成した化合物80の粗生成物を用いて参考例2の工程5もしくは実施例1の工程11に記載された方法で化合物81 (1.34 g, 2段階収率52%) を得た。
ESI-MS m/z: 386(M+Na)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ3.34 (2H, t, J = 6.4 Hz), 3.47 (2H, t, J = 6.4 Hz), 3.79 (6H, s), 6.78-6.84 (4H, m), 7.17-7.21 (1H, m), 7.27-7.35 (6H, m), 7.42-7.46 (2H, m).
工程70で合成した化合物81(1.15 g,3.16 mmol)およびFmoc-Ser(tBuMe2Si)-OH(渡辺化学工業社製, 1.677 g, 3.8 mmol)を用いて実施例1の工程8と同様の方法で化合物82(560 mg, 収率31%)を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 0.00-0.07 (6H, m), 0.83-0.89 (9H, m), 3.18-3.26 (2H, m), 3.39-3.46 (2H, m), 3.61-3.68 (1H, m), 3.76 (6H, s), 3.89 (1H, dd, J = 10.0, 4.0 Hz), 4.03 (1H, dd, J = 10.0, 4.0 Hz), 4.15-4.20 (1H, m), 4.22-4.28 (1H, m), 4.32-4.40 (2H, m), 5.65-5.88 (1H, m), 6.76-6.85 (4H, m), 7.16-7.23 (1H, m), 7.25-7.34 (8H, m), 7.36-7.44 (4H, m), 7.50-7.64 (2H, m), 7.72-7.79 (2H, m).
第15表に記載された化合物およびFmoc-Ser(tBuMe2Si)-OH , Fmoc-Thr(tBuMe2Si)-OHを用いて、工程69〜71と同様の方法により第16表に記載した化合物を得た。
本実施例により合成した化合物のNMR分析データを第17表に示す。
工程71で合成した化合物82(2.487 g, 3.16 mmol)を用いて参考例2の工程5と同様の方法で化合物95を得た(1.2 g, 収率67%)。
ESI-MS m/z: 587(M+Na)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ-0.01-0.07 (6H, m), 0.86-0.90 (9H, m), 3.15-3.21 (2H, m), 3.41-3.48 (3H, m), 3.72 (1H, dd, J= 10.0, 6.4 Hz), 3.79 (6H, s), 3.84 (1H, dd, J = 10.0, 4.8 Hz), 6.79-6.84 (4H, m), 7.18-7.23 (1H, m), 7.27-7.33 (6H, m), 7.40-7.44 (2H, m), 7.72-7.75 (1H, br m).
第16表に記載した化合物を用いて工程72と同様の方法により第18表に記載した化合物を得た。
本実施例により合成した化合物の質量分析結果を第19表に示す。
化合物103 (2.00 g, 9.47 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (40 mL)に溶解し、室温にてイミノ二酢酸ジ-tert-ブチルエステル (5.11 g, 20.84 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (4.00 g, 20.84 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール1水和物 (145 mg, 0.947 mmol)を加えて2時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=50/50)で精製した。さらにメタノールでスラリー精製することにより、化合物104 (4.07 g, 収率65 %)を得た。
ESI-MS m/z: 664 (M - H)-
工程73で合成した化合物104 (2.66 g, 4.00 mmol)をテトラヒドロフラン (53 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 490 mg)を加え、水素雰囲気下で3時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去することにより、化合物105 (2.86 g, 収率113%)を得た。
ESI-MS m/z: 634 (M - H)-
工程74で合成した化合物105(871.0 mg, 1.370 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド(17 mL)に溶解し、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イン)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩(625.0 mg, 1.644 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン(0.5730 mL, 3.290 mmol)、およびドデカン二酸モノベンジルエステル(527.0 mg, 1.644 mmol)を加え、室温で終夜攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(へプタン/酢酸エチル=60/40)で精製することにより、化合物106(1.030 g, 収率80%)を得た。
ESI-MS m/z: 939 (M + H)+
工程75で合成した化合物106(1.030 g, 1.098 mmol)をジクロロメタン(10 mL)に溶解し、トリフルオロ酢酸(10.00 mL, 130.0 mmol)を加え、室温で1時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去し、化合物107の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 713 (M - H)-
化合物108(2.000 g, 12.98 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド(30 mL)に溶解し、炭酸水素カリウム(1.559 g, 15.57 mmol)および塩化ベンジル(2.328 mL, 19.47 mmol)を加えて、室温にて4時間攪拌した。反応液に飽和塩化アンモニウムを加え、ジクロロメタンで抽出した後、有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(へプタン/酢酸エチル=50/50)で精製することにより、化合物109(2.850 g, 収率90%)を得た。
ESI-MS m/z: 243 (M - H)-
工程77で合成した化合物109(2.500 g, 10.24 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド(30 mL)に溶解し、炭酸カリウム(5.660 g, 40.90 mmol)およびtert-ブチルブロモ酢酸(3.300 mL, 22.52 mmol)を加え、90℃で4時間攪拌した。反応液に飽和塩化アンモニウムを加え、ジクロロメタンで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(へプタン/酢酸エチル=75/25)で精製することにより、化合物110(4.300 g, 収率89%)を得た。
ESI-MS m/z: 472 (M - H)-
工程78で合成した化合物110(1.000 g, 2.116 mmol)をジクロロメタン(10 mL)に溶解し、トリフルオロ酢酸(10.00 mL, 130.0 mmol)を加え、室温で6時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去し、化合物111の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 359 (M - H)-
工程79で合成した化合物111(350.0 mg, 0.9710 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド(7 mL)に溶解し、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物(327.0 mg, 2.137 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩(410.0 mg, 2.137 mmol)、およびイミノジ酢酸ジ-tert-ブチルエステル(524.0 mg, 2.137 mmol)を加え、室温で5時間攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(へプタン/酢酸エチル=60/40)で精製することにより、化合物112(617.0 mg, 収率78%)を得た。
ESI-MS m/z: 814 (M - H)-
工程80で合成した化合物112(610.0 mg, 0.7490 mmol)をジクロロメタン(6 mL)に溶解し、トリフルオロ酢酸(6 mL, 78.00 mmol)を加え、室温で1時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去し、化合物113の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 590 (M + H)+
工程74で合成した化合物114 (474 mg, 0.744 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にてジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー (Journal of Medicinal Chemistry), 第54巻, 2433-2446頁, 2011年に記載された方法で合成したtrans-シクロヘキサン-1,4-ジカルボン酸モノベンジルエステル (0.234 mg, 0.893 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.312 mL, 1.79 mmol)、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート (339 mg, 0.893 mmol)を加えて6時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=50/50)で精製することにより、化合物115 (448 mg, 収率68 %)を得た。
ESI-MS m/z: 879 (M - H)-
工程82で合成した化合物115 (341 mg, 0.387 mmol)をジクロロメタン (3.4 mL)に溶解し、室温にてトリフルオロ酢酸 (3.4 mL)を加えて終夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、酢酸エチルで共沸し、ヘプタンでスラリー精製することにより、化合物116 (254 mg, 収率100%)を得た。
ESI-MS m/z: 656 (M + H)+
化合物117 (500 mg, 2.75 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にてイミノジ酢酸ジ-tert-ブチルエステル (1.48 g, 6.04 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (1.16 g, 6.04 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール1水和物 (42.0 mg, 0.275 mmol)を加えて4時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=50/50)で精製することにより、化合物118 (329 mg, 収率19 %)を得た。
ESI-MS m/z: 635 (M - H)-
工程84で合成した化合物118 (323 mg, 0.507 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (6.5 mL)に溶解し、室温にて炭酸カリウム (84.0 mg, 0.609 mmol)、ブロモ酢酸ベンジル (139 mg, 0.609 mmol)を加えて3時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=50/50)で精製することにより、化合物119 (313 mg, 収率79 %)を得た。
ESI-MS m/z: 783 (M - H)-
工程85で合成した化合物119 (312 mg, 0.398 mmol)をジクロロメタン (3.1 mL)に溶解し、室温にてトリフルオロ酢酸 (3.1 mL)を加えて終夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、酢酸エチルで共沸することにより、化合物120 (252 mg, 収率113%)を得た。
ESI-MS m/z: 561 (M + H)+
化合物103 (2.00 g, 9.47 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (40 mL)に溶解し、室温にて2-アミノ-1,3-プロパンジオール (1.90 g, 20.84 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (4.00 g, 20.84 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール1水和物 (145 mg, 0.947 mmol)を加えて2時間撹拌した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (酢酸エチル/メタノール=70/30)で精製した。さらに酢酸エチルでスラリー精製することにより、化合物121 (2.68 g, 収率79 %)を得た。
ESI-MS m/z: 356 (M - H)-
工程87で合成した化合物121 (500 mg, 1.40 mmol)をアセトニトリル (10 mL)に懸濁し、室温にてアクリル酸tert-ブチルエステル (3.59 g, 28.0 mmol)、ベンジルトリメチルアンモニウムヒドロキシド (40%水溶液; 1.76 mL, 702 mmol)を加えて終夜撹拌した。減圧下、溶媒を留去し、水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=50/50)で精製することにより、化合物122 (300 mg, 収率24 %)を得た。
ESI-MS m/z: 871 (M + H)+
工程88で合成した化合物122 (340 mg, 0391 mmol)をテトラヒドロフラン (6.8 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 31.3 mg)を加え、水素雰囲気下で6時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=30/70)で精製することにより、化合物123 (235 mg, 収率72 %)を得た。
ESI-MS m/z: 841 (M + H)+
工程89で合成した化合物123 (232 mg, 0.276 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (4.6 mL)に溶解し、室温にてドデカン酸モノベンジルエステル (0.133 mg, 0.414 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.145 mL, 0.829 mmol)、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート (158 mg, 0.414 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=30/70)で精製することにより、化合物124 (274 mg, 収率87 %)を得た。
ESI-MS m/z: 1141 (M - H)-
工程90で合成した化合物124 (273 mg, 0.239 mmol)をジクロロメタン (2.7 mL)に溶解し、室温にてトリフルオロ酢酸 (2.7 mL)を加えて終夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、酢酸エチルで共沸することにより、化合物125 (231 mg, 収率105%)を得た。
ESI-MS m/z: 919 (M + H)+
4-ニトロイソフタル酸103 (500 mg, 2.37 mmol)およびN-Boc-エチレンジアミン (808 mg, 5.21 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にてトリエチルアミン (0.90 mL, 7.11 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物(703 mg, 5.21 mmol)および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩(1.36 g, 7.11 mmol)を加えて16時間撹拌した。反応液を後処理し、粗体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、化合物126 (650 mg, 収率55 %)を得た。
工程92で合成した化合物126 (500 mg, 1.01 mmol)および亜鉛末 (330 mg, 5.05 mmol)をメタノール (3.5 mL)およびテトラヒドロフラン (3.5 mL)に懸濁し、0℃にて塩化アンモニウム (378 mg, 7.07 mmol)の水溶液を滴下し、室温にて24時間撹拌した。反応液を後処理し、粗体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、化合物127 (160 mg, 収率34 %)を得た。
工程93で合成した化合物127 (200 mg, 0.430 mmol)およびN-Cbz-グリシン (90.0 mg, 0.430 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (2.0 mL)に溶解し、室温にてジイソプロピルエチルアミン (0.220 mL, 1.29 mmol)、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート (245 mg, 0.645 mmol)を加えて16時間撹拌した。反応液を後処理し、粗体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、化合物128 (180 mg, 収率64 %)を得た。
ESI-MS m/z: 657 (M + H)+
3,5-ジニトロ安息香酸128 (500 mg, 2.36 mmol)およびN-Cbz-エチレンジアミン (588 mg, 2.83 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (5.0 mL)に溶解し、室温にてトリエチルアミン (0.65 mL, 4.72 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物(380 mg, 2.83 mmol)および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩(675 mg, 3.54 mmol)を加えて16時間撹拌した。反応液を後処理し、粗体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、化合物129 (445 mg, 収率48 %)を得た。
工程95で合成した化合物129 (200 mg, 0.515 mmol)をエタノール (5.0 mL)に溶解し、室温にて塩化スズ(II) (584 mg, 3.09 mmol)および濃塩酸 (0.2 mL)を加え、80℃で16時間撹拌した。反応液を後処理し、化合物130 (180 mg,収率106%)を得た。
ESI-MS m/z: 329 (M + H)+
実施例1の工程6で合成した化合物9(8.17 g, 23.12 mmol)を用いて実施例1の工程9と同様の方法で化合物131を得た(3.7 g, 収率63%)。
ESI-MS m/z: 254(M+H)+
工程97で得られた化合物131(3.7 g, 14.63 mmol)を用いて実施例1の工程10と同様の方法で化合物132を得た(3.82 g, 収率67%)。
ESI-MS m/z: 432(M+HCOO)-
工程98で得られた化合物132(3.82 g, 9.86 mmol)を用いて実施例1の工程7と同様の方法で化合物133を得た(3.08 g, 収率87%)。
ESI-MS m/z: 360(M+H)+
化合物8(2g, 9.53mmol)とert-ブトキシカルボニルアミノ)-1-ペンタノール (東京化成社製,,2g,10mmol)を用い、実施例1の工程6と同様の方法で化合物134を得た(2.40 g, 収率63%)。
ESI-MS m/z: 296(M+H)+, 脱Boc体として検出
工程100で合成した化合物134を用いて、実施例1の工程7-9, 14-17と同様の方法で化合物135を得た(1.579g,収率21%) 。
ESI-MS m/z: 910 (M+H)+
工程51で合成した化合物56 (1.015 g, 1.748 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (12 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 187 mg)を加え、水素雰囲気下で6時間撹拌した。反応液をろ過した。ろ液に工程76で合成した化合物107(250.0 mg, 0.350 mmol), 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物(26.80 mg, 0.1750 mmol)、および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩(402.0 mg, 2.099 mmol)を加え、室温で終夜攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=87/13)で精製することにより、化合物136(617.0 mg, 収率88%)を得た。
ESI-MS m/z: 1215 (M + 2H) 2+
工程102で合成した化合物136 (0.7380 g, 0.3040 mmol)をテトラヒドロフラン (7 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 135.90 mg)を加え、水素雰囲気下で終夜撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=87/13)で精製することにより、化合物137(581 mg, 収率82%)を得た。
ESI-MS m/z: 1170 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.12-2.36 (106H, m), 2.91-3.19 (8H, m), 3.23-3.55 (14H, m), 3.60-3.76 (4H, m), 3.78-3.94 (8H, m), 3.95-4.10 (16H, m), 4.47 (4H, d, J = 8.8 Hz), 4.92-5.01 (4H, m), 5.17-5.24 (4H, m), 6.98 (1H, s), 7.64 (2H, s), 7.81-7.95 (4H, m), 8.28-8.38 (2H, m), 8.44-8.56 (2H, m), 10.13 (1H, s).
工程52で合成した化合物57 (500 mg, 0.879 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (6.5 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 94 mg)を加え、水素雰囲気下で4時間撹拌した。反応液をろ過した。ろ液に工程76で合成した化合物107(126.0 mg, 0.176 mmol), 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物(13.47 mg, 0.088 mmol)、および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩(202.0 mg, 1.055 mmol)を加え、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー(水/アセトニトリル)で精製することにより、化合物138(249.7 mg, 収率60%)を得た。
ESI-MS m/z: 1191 (M + 2H) 2+
工程104で合成した化合物138 (0.242 g, 0.102 mmol)をテトラヒドロフラン (3.6 mL)および水(1.2 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 45 mg)を加え、水素雰囲気下で4時間攪拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物139(216 mg, 収率93%)を得た。
ESI-MS m/z: 1146 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.15-1.65 (20H, m), 1.68-2.15 (52H, m), 3.13-3.29 (6H, m), 3.40-3.67 (16H, m), 3.71-3.96 (11H, m), 3.98-4.14 (16H, m), 4.55 (4H, t, J = 8.8 Hz), 4.93-5.06 (4H, m), 5.12-5.28 (4H, m), 6.56 (1H, s), 6.98 (1H. s), 7.64 (2H, s), 7.77-7.93 (4H, m), 8.26-8.49 (3H, m), 10.10 (1H, s).
工程53で合成した化合物58 (430 mg, 0.674 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (6 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 79 mg)を加え、水素雰囲気下で4時間撹拌した。反応液をろ過した。ろ液に化合物107(105.0 mg, 0.148 mmol), 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物(11.31 mg, 0.074 mmol)、および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩(170.0.0 mg, 0.887 mmol)を加え、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー(水/アセトニトリル)で精製することにより、化合物140(218.1 mg, 収率56%)を得た。
ESI-MS m/z: 1329 (M + 2H) 2+
工程106で合成した化合物140 (0.210 g, 0.079 mmol)をテトラヒドロフラン (3.1 mL)および水(1.0 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 39 mg)を加え、水素雰囲気下で4時間攪拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物141(192.7 mg, 収率95%)を得た。
ESI-MS m/z: 1284 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.17-1.65 (42H, m), 1.69-2.13 (61H, m), 2.95-3.17 (16H, m), 3.65-3.77 (3H, m), 3.79-3.94 (6H, m), 3.96-4.10 (16H, m), 4.48 (4H, d, J = 8.4 Hz), 4.96 (4H, dd, J = 2.4, 11.2 Hz), 5.21 (4H, d, J = 3.2 Hz), 7.01 (1H, s), 7.64-7.92 (11H, m), 8.26-8.48 (4H, m), 10.14 (1H, s).
工程52で合成した化合物57 (450 mg, 0.791 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (6 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 85 mg)を加え、水素雰囲気下で5時間撹拌した。反応液をろ過した。ろ液に工程81で合成した化合物113(94 mg, 0.158 mmol), 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物(133.0 mg, 0.871 mmol)、および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩(182.0 mg, 0.950 mmol)を加え、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー(水/アセトニトリル)で精製することにより、化合物142(99 mg, 収率28%)を得た。
ESI-MS m/z: 1129 (M + 2H) 2+
工程108で合成した化合物142 (80 mg, 0.035 mmol)をテトラヒドロフラン (1.7 mL)および水(0.85 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 26 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物143(57.5 mg, 収率75%)を得た。
ESI-MS m/z: 1084 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.69-2.21 (46H, m), 3.14-3.65 (28H, m), 3.67-4.22 (27H, m), 4.43-4.66 (4H, m), 4.69-4.88 (4H, m), 4.89-5.08 (4H, m), 5.12-5.32 (4H, m), 6.54-6.68 (1H, br), 7.01 (2H, s), 7.78-8.09 (3H, m), 8.13-8.31 (2H, m), 8.58-8.75 (2H, m).
工程53で合成した化合物58 (418 mg, 0.655 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (6 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 77 mg)を加え、水素雰囲気下で5時間撹拌した。反応液をろ過した。ろ液に工程81で合成した化合物113(85 mg, 0.144 mmol), 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物(121.0 mg, 0.791 mmol)、および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩(165.0 mg, 0.863 mmol)を加え、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー(水/アセトニトリル)で精製することにより、化合物144(99 mg, 収率28%)を得た。
ESI-MS m/z: 1268 (M + 2H) 2+
工程110で合成した化合物144 (186 mg, 0.073 mmol)をテトラヒドロフラン (2.8 mL)および水(0.93 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 40 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物145(156.7 mg, 収率87%)を得た。
ESI-MS m/z: 1222 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.36-1.62 (27H, m), 1.67-2.17 (64H, m), 2.92-3.21 (15H, m), 3.58-3.77 (2H, m), 3.80-3.95 (7H, m), 3.97-4.13 (15H, m), 4.47 (4H, d, J = 8.8 Hz), 4.88-5.02 (7H, m), 5.10-5.24 (3H, m), 6.95-7.00 (1H, m), 7.26-7.31 (2H, m), 7.72-7.88 (8H, m), 8.10-8.20 (2H, m), 8.51-8.60 (2H, m).
工程109で合成した化合物143 (171 mg, 0.079 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (3.4 mL)に溶解し、グリシンベンジル p-トルエンスルホン酸塩(32.0 mg, 0.095 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物(12.09 mg, 0.079 mmol)、および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩(18.16 mg, 0.095 mmol)を加え、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー(水/アセトニトリル)で精製することにより、化合物146(55.7 mg, 収率31%)を得た。
ESI-MS m/z: 1158 (M + 2H)2+
工程112で合成した化合物146 (54 mg, 0.023 mmol)をテトラヒドロフラン (0.83 mL)および水(0.28 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 18 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物147(50.1 mg, 収率97%)を得た。
ESI-MS m/z: 1112 (M + 2H)2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 0.96-1.06 (3H, m), 1.71-2.20 (54H, m), 3.41-3.64 (15H, m), 3.68-4.20 (32H), 4.55 (4H, d, J = 8.4 Hz), 4.81 (4H, s), 4.94-5.02 (4H, m), 5.17-5.25 (4H, m), 6.63-6.76 (2H, m), 6.93-7.02 (2H, m), 7.84-8.00 (3H, m), 8.17-8.30 (2H, m), 8.58-8.70 (2H, m).
化合物56 (500 mg, 0.861 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 92.1 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。アルゴン雰囲気下、室温にて化合物116 (113 mg, 0.172 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (198 mg, 1.03 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール1水和物 (13.2 mg, 0.086 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液をセライトでろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=90/10)で精製し、さらに逆相分取HPLC (アセトニトリル/水)で精製することにより、化合物148 (195 mg, 収率48%)を得た。
ESI-MS m/z: 1186 (M + 2H) 2+
工程114で合成した化合物148 (194 mg, 0.082 mmol)をテトラヒドロフラン (2.9 mg)および水 (1.0 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 35.7 mg)を加え、水素雰囲気下で8時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物149(183 mg, 収率98%)を得た。
ESI-MS m/z: 1141 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.21-1.45 (m, 40H), 1.76-2.18 (m, 50H), 3.00-3.09 (m, 8H), 3.40-4.20 (m, 32H), 4.47 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 4.96 (dd, J = 3.1, 11.2 Hz, 4H), 5.21 (d, J = 3.1 Hz, 4H), 6.98 (s, 1H), 7.65 (s, 2H), 7.84 (d, J = 9.0 Hz, 4H), 8.31 (brs, 1H), 8.44 (brs, 1H), 10.11 (s, 1H).
化合物56 (500 mg, 0.861 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 92.1 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。アルゴン雰囲気下、室温にて化合物120 (97.0 mg, 0.172 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (198 mg, 1.03 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール1水和物 (13.2 mg, 0.086 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液をセライトでろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=85/15)で精製し、さらに逆相分取HPLC (アセトニトリル/水)で精製することにより、化合物150 (179 mg, 収率46%)を得た。
ESI-MS m/z: 1138 (M + 2H) 2+
工程116で合成した化合物150 (175 mg, 0.077 mmol)をテトラヒドロフラン (2.6 mg)および水 (0.9 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 32.4 mg)を加え、水素雰囲気下で1時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物151(160 mg, 収率95%)を得た。
ESI-MS m/z: 1093 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.23-1.45 (m, 32H), 1.77 (s, 12H), 1.89 (s, 12H), 1.99 (s, 12H), 2.10 (s, 12H), 3.01-3.11 (m, 8H), 3.69-4.02 (m, 34H), 4.47-4.50 (m, 4H), 4.94-4.98 (m, 4H), 5.21 (d, J = 3.1 Hz, 4H), 6.92 (s, 1H), 6.94 (s, 2H), 7.87 (d, J = 9.4 Hz, 2H), 7.92 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 8.33 (brs, 2H), 8.50 (brs, 2H).
化合物58 (500 mg, 0.784 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 92.1 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。アルゴン雰囲気下、室温にて化合物125 (144 mg, 0.157 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (180 mg, 0.941 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール1水和物 (12.0 mg, 0.078 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液をセライトでろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=80/20)で精製し、さらに逆相分取HPLC (アセトニトリル/水)で精製することにより、化合物152 (191 mg, 収率43%)を得た。
ESI-MS m/z: 1431 (M + 2H) 2+
工程118で合成した化合物152 (186 mg, 0.065 mmol)をテトラヒドロフラン (2.8 mg)および水 (0.9 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 34.3 mg)を加え、水素雰囲気下で1時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物153(174 mg, 収率97%)を得た。
ESI-MS m/z: 1386 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ):1.25-4.02 (m, 164H), 4.18-4.26 (m, 2H), 4.47 (d, J= 8.1 Hz, 4H), 4.96 (dd, J = 3.1, 11.2 Hz, 4H), 5.21 (d, J = 3.6 Hz, 4H), 7.74-7.91 (m, 13H), 8.18 (s, 2H), 8.36 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 10.27 (brs, 1H).
化合物128 (150 mg, 0.228 mmol)をジクロロメタン (1.5 mL)に溶解し、室温にてトリフルオロ酢酸 (1.5 mL)を加えて4時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、酢酸エチルで共沸するした。残渣をN, N’-ジメチルホルムアミド (3 mL)に溶解し、室温にて化合物7 (574 mg, 0.571 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (109 mg, 0.571 mmol)、トリエチルアミン (0.159 mL, 1.14 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール1水和物(3.50 mg, 0.023 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=90/10)で精製し、さらに逆相分取HPLC (アセトニトリル/水)で精製することにより、化合物154 (242 mg, 収率44%)を得た。
ESI-MS m/z: 1216 (M + 2H) 2+
化合物154 (242 mg, 0.100 mmol)を テトラヒドロフラン/水 (4/1; 12 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 44.6 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。アルゴン雰囲気下、室温にて6-マレイミドヘキサン酸 (23.2 mg, 0.110 mmol)、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド (55.2 mg, 0.199 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液をセライトでろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をHP20レジン (アセトン/水)で精製精製することにより、化合物155 (97.4 mg, 収率39%)を得た。
ESI-MS m/z: 1245 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ):1.14-2.16 (100H, m), 2.96-2.98 (4H, m), 3.24-3.41 (18H, m), 3.69-3.73 (4H, m), 3.83-3.91 (6H, m), 4.14-4.16 (2H, m), 4.47 (4H, d, J= 8.6 Hz), 4.96 (4H, dd, J = 3.6, 11.3 Hz), 5.21 (4H, d, J = 3.2 Hz), 7.01 (2H, s), 7.73-7.75 (2H, m), 7.83-7.94 (7H, m), 8.05-8.08 (2H, m), 8.14-8.20 (3H, m), 8.55-8.56 (2H, m), 10.24 (1H, brs).
工程96で合成した化合物130 (75.0 mg, 0.228 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド (3.0 mL)に溶解し、室温にて工程55で合成した化合物60 (574 mg, 0.571 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.199 mL, 1.14 mmol)、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート (217 mg, 0.571 mmol)を加えて終夜撹拌した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=90/10)で精製し、さらに逆相分取HPLC (アセトニトリル/水)で精製することにより、化合物156 (202 mg, 収率38%)を得た。
ESI-MS m/z: 1152 (M + 2H) 2+
工程122で合成した化合物156 (196 mg, 0.085 mmol)を テトラヒドロフラン/水 (4/1; 10 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 36.1 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。アルゴン雰囲気下、室温にて6-マレイミドヘキサン酸 (19.8 mg, 0.094 mmol)、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド (47.0 mg, 0.170 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液をセライトでろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をHP20レジン (アセトン/水)で精製精製することにより、化合物157 (42.4 mg, 収率21%)を得た。
ESI-MS m/z: 1182 (M + 2H) 2+
工程101で合成した化合物135を用い、実施例8の工程33および34と同様の方法で化合物158 (2.2 g, 収率58%)を得た。
ESI-MS m/z: 2437(M+H)+
実施例13の工程99で合成した化合物133(0.101 g, 0.282 mmol)を用いて、参考例3の工程57で合成した化合物62(0.607 g, 0.613 mmol)を用い、実施例1の工程8と同様の方法によって化合物159 (0.25 g, 収率39%)を得た。
ESI-MS m/z: 2304(M+H)+
工程125で合成した化合物159(0.255 g, 0.111 mmol)を用いて、実施例3の工程18と同様の方法によって化合物160 (0.15 g, 収率63%)を得た。
ESI-MS m/z: 2170(M+H)+
工程126で合成した化合物160(20.8 mg, 9.59 μmol)を用いて、実施例3の工程19と同様の方法によって化合物161 (5.5 mg, 収率24%)を得た。
ESI-MS m/z: 1182(M+2H)2+
実施例13の工程99で合成した化合物133(0.099g, 0.277 mmol)を用いて、参考例3の工程59で合成した化合物64(0.618 g, 0.615 mmol)を用い、実施例1の工程8と同様の方法によって化合物162 (0.343 g, 収率53%)を得た。
ESI-MS m/z: 2333(M+H)+
工程128で合成した化合物162を用いて、実施例3の工程18および19と同様の方法で化合物163 (6.9 mg, 収率28%)を得た。
ESI-MS m/z: 2392(M+H)+
実施例5の工程28で合成した化合物31(0.048 g, 0.021 mmol)と3-マレイミドプロピオン酸 N-スクシンイミジル (東京化成社製, 0.017 g, 0.064 mmol)を用いて実施例5の工程29と同様の方法で化合物164 (0.040 g, 収率78%)を得た。
ESI-MS m/z: 2480(M+HCOO)-
実施例8の工程34で合成した化合物37(23.6 mg, 9.46 μmol)とN-(2-アミノエチル)マレイミド トリフルオロ酢酸塩 (シグマアルドリッチ社製, 7.21 mg, 0.028 μmol)を用いて実施例1の工程8と同様の方法で化合物165 (9.1 mg, 収率36%)を得た。
ESI-MS m/z: 1310(M+2H)2+
実施例5の工程28で合成した化合物31(0.122 g, 0.054 mmol)を用いて実施例2の工程14と同様の方法で合成したヘキサン酸モノベンジルエステルを用い、同工程記載の方法にて化合物166 (0.076 g, 収率56%)を得た。
ESI-MS m/z: 2503(M+H)+
工程132で合成した化合物166(0.076 g, 0.03 mmol)を用いて実施例3の工程18と同様の方法にて化合物167 (0.030 g, 収率40%)を得た。
ESI-MS m/z: 2412(M+H)+
実施例4の工程24で合成した化合物27 (4.36 mg, 0.006mmol)、参考例1の工程3で合成した化合物4 (10 mg, 0.02 mmol) を用い、実施例1の工程12と同様の方法で化合物168 (7 mg, 収率65%)を得た。
ESI-MS m/z: 1581 (M - H)-
工程124で合成した化合物158(0.2011 g, 0.079 mmol)を用いて、実施例8の工程35を用いて化合物169を得た(0.129 g, 収率55%)。
ESI-MS m/z: 2972 (M+HCOO)-
工程135で合成した化合物169(0.129 g, 0.044 mmol)を用いて、実施例8の工程36を用いて化合物170の粗製生物を得た。
ESI-MS m/z: 1535 (M+HCOOH-2H)2-
工程136で合成した化合物170(0.0467 g, 0.013 mmol)を用いて、実施例8の工程37を用いて化合物171を得た(19.4 μmol/g, 収率35%)。
実施例8の工程35で合成した化合物37 (100 mg, 0.040mmol) および参考例4の工程60で合成した化合物66を用い、実施例8の工程35と同様の方法で化合物172 (90 mg, 収率76%) を得た。
ESI-MS m/z: 1335 (M-DMTr+2H)2+
工程138で合成した化合物172 (90 mg, 0.030 mmol) を用い、実施例8の工程36と同様の方法で化合物173の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1558 (M+HCOOH-2H)2-
工程139で合成した化合物173の粗生成物を用い、実施例8の工程37と同様の方法で化合物174 (21.5 μmol/g, 2段階収率32%) を得た。
実施例14の工程124で合成した化合物158 (100 mg, 0.039 mmol) および参考例4の工程60で合成した化合物66を用い、実施例8の工程35と同様の方法で化合物175 (90 mg, 収率76%) を得た。
ESI-MS m/z: 1356 (M+2H)2+ 脱DMTr体として検出
工程141で合成した化合物175 (90 mg, 0.030 mmol) を用い、実施例8の工程36と同様の方法で化合物176の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1579 (M+HCOOH-2H)2-
工程142で合成した化合物176の粗生成物を用い、実施例8の工程37と同様の方法で化合物177 (17.0 μmol/g, 2段階収率26%) を得た。
実施例14の工程124で合成した化合物158 (100 mg, 0.039 mmol) および参考例4の工程62で合成した化合物69を用い、実施例8の工程35と同様の方法で化合物178 (50 mg, 収率42%) を得た。
ESI-MS m/z: 1363 (M+2H)2+ 脱DMTr体として検出
工程144で合成した化合物178 (50 mg, 0.017 mmol) を用い、実施例8の工程36と同様の方法で化合物179の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1587 (M+HCOOH-2H)2-
工程145で合成した化合物179の粗生成物を用い、実施例8の工程37と同様の方法で化合物180 (0.5 μmol/g, 2段階収率1%) を得た。
実施例14の工程124で合成した化合物158 (100 mg, 0.039 mmol) および参考例4の工程63で合成した化合物71を用い、実施例8の工程35と同様の方法で化合物181 (40 mg, 収率30%) を得た。
ESI-MS m/z: 1532 (M+2H)2+ 脱DMTr体として検出
工程147で合成した化合物181 (40 mg, 0.012 mmol) を用い、実施例8の工程36と同様の方法で化合物182の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1582 (M+2H)2+ 脱DMTr体として検出
工程148で合成した化合物182の粗生成物を用い、実施例8の工程37と同様の方法で化合物183 (0.2 μmol/g, 2段階収率1%) を得た。
実施例8の工程34で合成した化合物158 (70 mg, 0.028 mmol) および参考例4の工程68で合成した化合物78を用い、実施例8の工程35と同様の方法で化合物184 (58 mg, 収率77%) を得た。
ESI-MS m/z: 1341 (M+2H)2+
工程150で合成した化合物184 (58 mg, 0.022 mmol) をメタノール (0.15 mL) に溶解し、ジャーナルオブオーガニックケミストリー(Journal of Organic Chemistry), 第74巻, 6837-6842頁, 2009年に記載された方法で合成した化合物65 (16.9 mg, 0.032 mmol)、1 mol /L SODIUM L-ASCORBATE水溶液 (0.022 mL, 0.022 mmol)、20 mmol/L 硫酸銅(II)水溶液 (0.011 mL, 0.22 μmol)、及び10 mmol/L Tris(2-benzimidazolylmethyl)amine / DMSO溶液 (0.022 mL, 0.22μmol)を加え、室温にて3時間撹拌した。反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=80/20)にて精製し、化合物185 (7 mg, 収率10%) を得た。
ESI-MS m/z: 1450 (M+2H)2+ 脱DMTr体として検出
工程151で合成した化合物185 (10 mg, 3.13 μmol) を用い、実施例8の工程36と同様の方法で化合物186の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1500 (M+2H)2+ 脱DMTr体として検出
工程152で合成した化合物186の粗生成物を用い、実施例8の工程37と同様の方法で化合物187 (8.4 μmol/g,収率27%) を得た。
実施例14の工程124で合成した化合物158(74.1 mg, 0.029 mmol)と実施例4の工程72で合成した化合物95(15 mg, 0.027 mmol)を用いて、実施例1の工程8と同様の方法、またはバイオコンジュゲートケミストリー, 第26巻,1451-1455頁, 2015年に記載の方法にて化合物188の粗製生物を得た。
ESI-MS m/z: 1392(M +H)+, 脱DMTr体として検出
工程154で合成した化合物188(0.083 g, 0.027 mmol)を用いて、特許文献WO2015105083に記載の方法により化合物189の粗製生物を得た。
ESI-MS m/z: 2669(M+H)+ , 脱DMTr体として検出
工程155で合成した化合物189(0.08 g, 0.027 mmol)を用いて、実施例8の工程36と同様の方法で化合物190の粗製生物を得た。
ESI-MS m/z: 1556(M+HOOH-2H)2-
1H-NMR (400 MHz, MeOD):δ1.45-1.86 (48H, m), 1.93 (12H, s), 1.94 (12H, s), 2.02 (12H, s), 2.13 (12H, s), 2.16-2.28 (17H, m), 2.48 (4H, s), 3.10-3.16 (6H, m), 3.36-3.56 (19H, m), 3.77 (6H, s), 3.80-3.89 (6H, m), 3.98-4.35 (30H, m), 4.53-4.59 (4H, m), 4.66-4.72 (1H, m), 5.04-5.10 (4H, m), 5.31-5.36 (4H, m), 6.81-6.88 (4H, m), 7.17-7.23 (1H, m), 7.26-7.32 (6H, m), 7.38-7.44 (2H, m), 7.54 (2H, br s), 7.90 (1H, br s).
実施例8の工程34で合成した化合物37または実施例14の工程124で合成した化合物158と第18表記載の構造、または参考例4の工程66で合成した化合物75を用い、工程154,155と同様の方法にて第20表および第21表に記載した化合物を得た。
本実施例により合成した化合物の質量分析結果を第22表に示す。
工程156で合成した化合物190(g, mmol)を用いて、実施例8の工程37と同様の方法で化合物200を得た(10.0 μmol/g)。
第20表および第21表に記載した化合物を用いて、工程157と同様の方法で第23表および第24表記載の化合物を得た。
本実施例により合成した化合物の担持量を第25表に示す。
核酸複合体210〜218の合成
実施例9の工程38と同様の方法で第26表記載の化合物を用いて第27表および第28表記載の一本鎖の核酸複合体を得た。
本実施例により合成した核酸複合体の配列および質量分析結果を第29表に示す。
工程134で合成した化合物168を用いて実施例10の工程40と同様の方法で第30表記載の一本鎖の核酸複合体219を得た。
本実施例により合成した核酸複合体の配列および質量分析結果を第30表に示す。
実施例8の工程34で合成した化合物37とモレキュールズ(Molecules)、第17巻、13825-13843頁、2012年に記載された方法で合成した末端がアミノ基で修飾されたオリゴヌクレオチドを加えて、バイオコンジュゲートケミストリー, 第22巻,1723-1728頁, 2011年もしくはバイオコンジュゲートケミストリー, 第26巻,1451-1455頁, 2015年に記載の方法にて反応させた。実施例9の工程38中に記載した方法で精製することにより、一本鎖の核酸複合体223を得た。
実施例15の工程159と同様の方法で第31表および第32表記載の化合物を用いて第33表〜第35表記載の一本鎖の核酸複合体を得た。
本実施例により合成した核酸複合体の配列および質量分析結果を第36表に示す。
実施例14の工程157で合成した化合物200を用いて実施例12の工程46と同様の方法で一本鎖の核酸複合体234を得た。
工程160と同様の方法で化合物171,174,177,180,183,187,200および第23表および第24表記載の化合物を用いてそれぞれ対応する第37表〜第40表記載の一本鎖の核酸複合体を得た。
本実施例により合成した核酸複合体の配列および質量分析結果を第41表に示す。
実施例9の工程39と同様の方法で一本鎖の核酸複合体(ssRNA)210〜233, 235〜247を用いて2本鎖の核酸複合体251〜287を得た。
本実施例により合成した核酸複合体の配列を第42, 43, 45, 47〜54表に示す。
実施例13の工程99で合成した化合物133 (0.5 g, 1.365 mmol)を用いて、実施例4の工程25と同様の方法で化合物288を粗生成物として得た。
実施例16の工程160で合成した化合物288(0.296 g, 0.247 mmol)を用いて、実施例4の工程26と同様の方法で化合物289を粗生成物として得た。
実施例16の工程161で合成した化合物289(0.153 g, 0.247 mmol)およびインオーガニック・ケミストリー (Inorganic Chemistry), 第83巻, 1000-1007頁, 2011年に記載された方法で合成した1-(2-アジドエチル)−r−D-マンノピラノシド (0.221g, 0.989 mmol)を用いて、実施例1の工程8と同様の方法で化合物290を得た(0.110 g, 収率31%)。
ESI-MS m/z: 720 (M + H)+
実施例16の工程162で合成した化合物290(0.110 g, 0.077 mmol)を用いて、実施例5の工程28と同様の方法で化合物291を得た(0.077 g, 収率77%)。
ESI-MS m/z: 1305 (M + H)+
実施例16の工程163で合成した化合物291(20 mg, 0.016 mmol)、2, 5-ジオキソピロリジン-1-イル 6-アジドヘキサン酸(10 mg, 0.032 mmol)をテトラヒドロフラン (2 mL)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン (0.027 mL, 0.078 mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。混合物を逆相高速液体クロマトグラフィー(ウォーターズ, X BridgeC18, 5μm, 4.6 mmx250 mm、0.01%トリフルオロ酢酸水溶液, B液:アセトニトリルによるグラジエント)によって精製し、化合物292を得た(1.7 mg, 収率8%)。
ESI-MS m/z: 1444 (M + H)+
実施例16の工程163で合成した化合物291(20 mg, 0.016 mmol)、N-(6-マレイミドカプロイルオキシ)スクシミド (9.6 mg, 0.031 mmol)をテトラヒドロフラン (2 mL)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン (0.027 mL, 0.078 mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。混合物を逆相高速液体クロマトグラフィー(ウォーターズ, X BridgeC18, 5μm, 4.6 mmx250 mm、0.01%トリフルオロ酢酸水溶液, B液:アセトニトリルによるグラジエント)によって精製し、化合物293を得た(1.8 mg, 収率8%)。
ESI-MS m/z: 1498 (M + H)+
実施例16の工程164で合成した化合物292を用いて実施例10の工程40と同様の方法で一本鎖の核酸複合体294を得た。
実施例16の工程165で合成した化合物293を用いて実施例9の工程38と同様の方法で一本鎖の核酸複合体295を得た。
本実施例により合成した核酸複合体の配列を第58表に示す。
実施例および比較例で得られた各核酸複合体のうち、第59表について、それぞれ以下の方法により、シーディーワン(CD-1)由来マウス初代肝細胞 (ライフテクノロジー社製、カタログ番号MSCP10)に導入した。
最終濃度が30, 10または3 nmol/Lとなるように、オプティメム (Opti-MEM、ギブコ(GIBCO)社、31985)で希釈した各核酸複合体を、96ウェルの培養プレートに、20μLずつ分注した後、プライマリヘパトサイトゾウイングアンドプレーティングサプリメント(Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements ) (ライフテクノロジー社製、カタログ番号CM3000)を含むウィリアムズイーメディウム (William’s E Medium) (ライフテクノロジー社製、カタログ番号A12176-01)に懸濁させたマウス初代肝細胞を、細胞数12500/80μL/ウェルとなるように播種し、37℃、5%CO2条件下で6時間培養したのちに、培養上清を注意深く除去し、プライマリヘパトサイトメンテナンスサプリメント (Primary Hepatocyte Maintenance Supplements) (ライフテクノロジー社製、カタログ番号CM4000)を含むウィリアムズイーメディウムを添加した。また陰性対照の群として何も処理しない細胞を播種した。
各製剤を導入した細胞を37℃の5%CO2インキュベーター内で18時間培養し、氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、スーパープレップセルリシスアンドアールティーキットフォーキューピーシーアール (東洋紡社製、カタログ番号SCQ-201)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、全RNAの回収と、得られた全RNAを鋳型とする逆転写反応によるcDNAの作製とを行った。
得られたcDNAを鋳型とし、タックマン (登録商標)ジーンエクスプレッションアッセイズプローブ (アプライドバイオシステムズ社製)をプローブとして、クオントスタジオ12ケーフレックスリアルタイムピーシーアールシステム (ABI社製)を用い、添付された使用説明書に記載された方法に従ってPCR反応させることにより、Serpin peptidase inhibitor, clade C (antithrombin), member 1 (別名antithrombin III、以下AT3と表す)遺伝子および構成的発現遺伝子であるグリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素 (D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、以下gapdhと表す)遺伝子をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、gapdhのmRNA増幅量を内部対照として、AT3のmRNAの準定量値を算出した。同様に測定した陰性対照におけるAT3のmRNAの準定量値を1として、AT3のmRNAの準定量値から、AT3のmRNAの発現率を求めた。得られたAT3のmRNAの発現率の結果を、陰性対照のAT3 mRNA発現率に対する抑制率として第60-66表に示す。
実施例および比較例で得られた各核酸複合体のうち、第59表について、それぞれ以下の方法によりin vivo評価試験を実施した。なお、各核酸複合体は、試験に合わせてリン酸緩衝化生理食塩水(DPBS)(ナカライテスク社製)で希釈して用いた。マウス(BALB/cA、日本クレアより入手)を馴化飼育後、各核酸複合体を1.5 mg/kgまたは0.5 mg/kgずつマウスに皮下注投与した。また、コントロール群としてはPBSのみをマウスに皮下注投与した。投与から3日後にイソフルラン麻酔下で後大静脈後部静脈より採血した。採血した血液を3.2 Mクエン酸ナトリウムおよび5 mmol/L D-グルコースを含む抗凝固液と体積比9:1で混合し、遠心後の上清を回収することで血漿を得た。動物は採血後に安楽死させ、肝臓を採取し液体窒素で凍結保存した。肝臓凍結サンプルをトリゾール(登録商標)アールエヌエーアイソレーションリージェンツ (ライフテクノロジーズ社(Life Technologies)社製、カタログ番号15596026)およびアールエヌエーイージーミニキット(キアゲン(QIAGEN)社製、カタログ番号74106)を用い、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、全RNAの回収を行った。さらにトランスクリプターファーストストランドシーディーエヌエーシンセシスキット (ロシュ社(Roche社)製、カタログ番号04897030001)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、得られた全RNAを鋳型とする逆転写反応によるcDNAの作製を行った。得られたcDNAを鋳型とし、タックマン(登録商標)ジーンエクスプレッションアッセイズプローブ(アプライドバイオシステムズ社製)をプローブとして、クオントスタジオ12ケーフレックスリアルタイムピーシーアールシステム(ABI社製)を用い、添付された使用説明書に記載された方法に従ってPCR反応させることにより、AT3遺伝子およびgapdh遺伝子をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、AT3のmRNA増幅量を内部対照として、AT3のmRNAの準定量値を算出した。同様に測定したコントロール群におけるAT3のmRNAの準定量値を1として、AT3のmRNAの準定量値から、AT3のmRNAの発現率を求めた。また、血漿中のAT3タンパク質濃度を、アンチトロンビンスリーマウスエライザキット(アブカム社製、カタログ番号ab108800)を用い添付された使用説明書に記載された方法に従って測定した。得られたAT3のmRNAの発現抑制率および血漿中AT3タンパク質濃度を表67-69に示す。
実施例15で得られたB2M-siRNA(被検物39)、260_3’-B2M-siRNA(被検物40)について、それぞれ以下の方法により、ヒト初代肝細胞 (Biopredic international社製、カタログ番号HEP187)に導入した。
最終濃度が300, 100, 30, 10, 3, 1 nmol/Lとなるように、オプティメム (Opti-MEM、ギブコ(GIBCO)社、カタログ番号31985)で希釈した各核酸複合体を、96ウェルの培養プレートに、20 μLずつ分注した後、Plating medium(Biopredic international社製、カタログ番号LV0304-2)に1.25×105cells/mLとなるように懸濁させたヒト初代肝細胞を、細胞数80 μL/ウェルとなるように播種し、37℃、5%CO2条件下で6時間培養したのちに、培養上清を注意深く除去し、Incubation medium(Biopredic international社製、カタログ番号LV0304-2)を添加した。また陰性対照の群として何も処理しない細胞を播種した。
各製剤を導入した細胞を37 ℃の5% CO2インキュベーター内で18時間培養し、氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、スーパープレップセルリシスアンドアールティーキットフォーキューピーシーアール (東洋紡社製、カタログ番号SCQ-201)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、全RNAの回収と、得られた全RNAを鋳型とする逆転写反応によるcDNAの作製とを行った。
得られたcDNAを鋳型とし、タックマン (登録商標)ジーンエクスプレッションアッセイズプローブ (アプライドバイオシステムズ社製)をプローブとして、クオントスタジオ12ケーフレックスリアルタイムピーシーアールシステム (ABI社製)を用い、添付された使用説明書に記載された方法に従ってPCR反応させることにより、Beta-2 microglobulin (以下B2Mと表す)遺伝子および構成的発現遺伝子であるグリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素 (D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、以下gapdhと表す)遺伝子をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、gapdhのmRNA増幅量を内部対照として、B2MのmRNAの準定量値を算出した。同様に測定した陰性対照におけるB2MのmRNAの準定量値を1として、B2MのmRNAの準定量値から、B2MのmRNAの発現率を求めた。得られたB2MのmRNAの発現率の結果を、陰性対照のB2M mRNA発現率に対する抑制率として表70に示す。
10%ウシ胎児血清を含むアールピーエムアイ1640培地 (RPMI1640培地, ナカライテスク社製, 30264-56)(以下10%FBS RPMI1640培地と記載)及びDNase I溶液 (DNase I Solution , StemCell Technology社製, 07900)を用い、ヒトCD14陽性単球細胞 (Untouched Frozen NPB-CD14+ Monocytes, Allcells社製, PB011F)を添付のプロトコルに従って融解した。
その後、組み換えヒト顆粒球単球コロニー刺激因子 (Recombinant Human GM-CSF Protein CF, R&D System社製, 215-GM-050/CF) (以下GM-CSFと記載)を最終濃度100 ng/mLとなるように添加し、106 cells/mLの密度でマルチプレート (SUMILON社製, MS-8196F5)に播種し、37 ℃、5%CO2条件下で培養した。
培養開始から6日後に培養上清を除去し、GM-CSF 100 ng/mLを含む10%FBS RPMI1640培地を80uLずつ各ウェルに添加した。
被験サンプルとしては、Beta-2 Microglobulin(以下B2Mと記載)およびHPRT-1を標的とする核酸複合体296_3’-B2M-siRNA(被検物41)、またこれらの核酸複合体にそれぞれ対応するコントロールとしてB2M-siRNA(被検物42)を用いた。被験サンプルの最終濃度は1 μmol/L、0.3 μmol/L、0.1 μmol/Lの3点を設定し、N=3で実施した。
核酸複合体溶液の希釈については以下の手順で行った。クエン酸緩衝液 (20 mM Citrate(pH7), 150 mM NaCl)で調製された核酸溶液をオプティメム (Opti-MEM(R) I Reduced Serum Medium, Life technologies社製, 31985-070)を用いて希釈した。希釈した核酸溶液を20 μLずつ細胞溶液に添加し、陰性対照群には核酸非含有のクエン酸緩衝液/オプティメム混合溶液を20 μL添加し、37 ℃、5%CO2条件下で4日間培養した。
RNAを含む細胞溶解液の調製にはスーパープレップセルライシスキット (SuperPrep■ Cell Lysis & RT Kit for qPCR, TOYOBO社製, SCQ-101)を用い、同キット付属のアールティーキット (RT Kit for qPCR)を用いてキットに添付された説明書に従って逆転写反応を行い、cDNAを作成した。
このcDNAをPCR反応の鋳型とし、QuantStudio 12K Flex リアルタイムPCRシステム (アプライドバイオシステムズ社製)を用い、タックマンプローブ (Taqman probe)法により下記の通り実施した。B2M遺伝子のノックダウン効果を定量する場合、B2M及び対照としてHPRT-1の遺伝子をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、HPRT-1のmRNA増幅量を内部対照として、B2MのmRNAの準定量値を算出した。
B2M遺伝子の測定にはタックマンプローブHs00187842_m1 (アプライドバイオシステムズ社製)を用い、反応試薬にはTaqMan Gene Expression Master Mix (アプライドバイオシステムズ社製, 4369542)を用いて添付のプロトコルに従って実施した。核酸の標的mRNA量は、陰性対照群(核酸未導入群)におけるB2MのmRNA量を1としたときの相対的な割合として算出した。そのmRNA量の相対的な割合を平均±標準偏差で表した結果を表71に示す。
配列番号2は、AT3-ssRNAの塩基配列を示す。
配列番号3は、AT3-asRNAの塩基配列を示す。
配列番号4は、B2M-ssRNAの塩基配列を示す。
配列番号5は、B2M-asRNAの塩基配列を示す。
配列場号6は、CD45ASOの塩基配列を示す。
配列番号7は、3'-dT10の塩基配列を示す。
配列番号8は、Hprt1-ssRNAの塩基配列を示す。
配列番号9は、Hprt1-asRNAの塩基配列を示す。
Claims (7)
- 前記糖リガンドが、マンノースまたはN−アセチルガラクトサミンである、請求項1に記載の核酸複合体。
- 前記オリゴヌクレオチドが修飾ヌクレオチドを含む、請求項1又は2に記載の核酸複合体。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸複合体を含む、医薬組成物。
- 細胞内に導入するための、請求項4に記載の医薬組成物。
- 前記細胞が肝細胞である、請求項5に記載の医薬組成物。
- 静脈内投与または皮下投与される、請求項4〜6のいずれか1項に記載の医薬組成物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016016707 | 2016-01-29 | ||
JP2016016707 | 2016-01-29 | ||
PCT/JP2017/003249 WO2017131236A1 (ja) | 2016-01-29 | 2017-01-30 | 核酸複合体 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2017131236A1 JPWO2017131236A1 (ja) | 2018-11-22 |
JP6853193B2 true JP6853193B2 (ja) | 2021-03-31 |
Family
ID=59398306
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017563894A Active JP6853193B2 (ja) | 2016-01-29 | 2017-01-30 | 核酸複合体 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10745700B2 (ja) |
EP (1) | EP3409780B1 (ja) |
JP (1) | JP6853193B2 (ja) |
KR (1) | KR20180103166A (ja) |
CN (1) | CN108699558B (ja) |
AU (1) | AU2017213404A1 (ja) |
CA (1) | CA3012967A1 (ja) |
ES (1) | ES2858090T3 (ja) |
SG (1) | SG11201806372UA (ja) |
TW (1) | TWI733751B (ja) |
WO (1) | WO2017131236A1 (ja) |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7022687B2 (ja) * | 2016-06-30 | 2022-02-18 | 協和キリン株式会社 | 核酸複合体 |
WO2018164275A1 (ja) | 2017-03-10 | 2018-09-13 | 国立研究開発法人国立成育医療研究センター | アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび糖原病Ia型予防または治療用組成物 |
ES2942575T3 (es) | 2017-04-28 | 2023-06-02 | Kyowa Kirin Co Ltd | Derivado de oligonucleótido o sal del mismo |
WO2019027015A1 (ja) * | 2017-08-02 | 2019-02-07 | 協和発酵キリン株式会社 | 核酸複合体 |
WO2019027009A1 (ja) * | 2017-08-02 | 2019-02-07 | 協和発酵キリン株式会社 | 核酸複合体 |
US11660347B2 (en) | 2017-12-01 | 2023-05-30 | Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. | Nucleic acid, composition and conjugate containing same, preparation method, and use thereof |
JP6884268B2 (ja) | 2018-03-09 | 2021-06-09 | 第一三共株式会社 | 糖原病Ia型治療薬 |
JP2021528068A (ja) * | 2018-06-21 | 2021-10-21 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | 全lnaオリゴヌクレオチドのハイブリダイズ |
CN111655849B (zh) | 2018-08-21 | 2024-05-10 | 苏州瑞博生物技术股份有限公司 | 一种核酸、含有该核酸的药物组合物和缀合物及其用途 |
US11896674B2 (en) | 2018-09-30 | 2024-02-13 | Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. | SiRNA conjugate, preparation method therefor and use thereof |
JP2022506517A (ja) * | 2018-11-02 | 2022-01-17 | アルブータス・バイオファーマー・コーポレイション | 標的指向化二価結合体 |
EP3888663A1 (en) * | 2018-11-30 | 2021-10-06 | Kyowa Kirin Co., Ltd. | Nucleic acid complex |
WO2021049504A1 (ja) | 2019-09-10 | 2021-03-18 | 第一三共株式会社 | 肝臓送達用GalNAc-オリゴヌクレオチドコンジュゲートおよび製造方法 |
BR112022005013A2 (pt) * | 2019-09-17 | 2022-06-21 | Purdue Research Foundation | Imageamento direcionado à proteína de ativação de fibroblasto (fap) e terapia de cânceres e outras doenças inflamatórias e fibróticas |
WO2023143374A1 (zh) * | 2022-01-30 | 2023-08-03 | 成都凌泰氪生物技术有限公司 | 一种配体、其制备方法及应用 |
WO2023187760A1 (en) * | 2022-04-01 | 2023-10-05 | Genevant Sciences Gmbh | Mannose-targeted compositions |
CN116444589B (zh) * | 2023-06-15 | 2023-09-19 | 北京悦康科创医药科技股份有限公司 | 新型GalNAc化合物及其硫代寡核苷酸缀合物和偶联方法 |
Family Cites Families (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6469158B1 (en) | 1992-05-14 | 2002-10-22 | Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated | Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozymes |
US5977343A (en) | 1992-05-14 | 1999-11-02 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozymes |
US5804683A (en) | 1992-05-14 | 1998-09-08 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Deprotection of RNA with alkylamine |
DE69431669T2 (de) | 1993-09-02 | 2003-10-23 | Ribozyme Pharm Inc | Enzymatische nukleiksaüre die nicht-nukleotide enthaltet |
US5889136A (en) | 1995-06-09 | 1999-03-30 | The Regents Of The University Of Colorado | Orthoester protecting groups in RNA synthesis |
JP2000501414A (ja) * | 1995-11-22 | 2000-02-08 | ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー | 生体分子の細胞取り込みを高めるリガンド |
US5998203A (en) | 1996-04-16 | 1999-12-07 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Enzymatic nucleic acids containing 5'-and/or 3'-cap structures |
US6111086A (en) | 1998-02-27 | 2000-08-29 | Scaringe; Stephen A. | Orthoester protecting groups |
US20080199960A1 (en) | 2004-05-13 | 2008-08-21 | Juliano Rudolph L | Methods for the Delivery of Oligomeric Compounds |
CA2930393C (en) | 2007-12-04 | 2022-11-29 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides |
ES2370638B1 (es) * | 2010-03-05 | 2012-11-16 | Universidad De Castilla La Mancha | Dendrimeros como vehiculos no virales para terapia genica |
JP2014504295A (ja) * | 2010-12-17 | 2014-02-20 | アローヘッド リサーチ コーポレイション | siRNA用ガラクトースクラスター−薬物動態調節剤標的指向部分 |
CN103649311A (zh) * | 2011-06-03 | 2014-03-19 | 国立大学法人北海道大学 | 寡核苷酸衍生物、包含寡核苷酸衍生物的治疗用医药组合物及诊断用医药组合物、以及miRNA机能抑制用寡核苷酸衍生物 |
KR20220045091A (ko) | 2011-11-18 | 2022-04-12 | 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 트랜스티레틴(TTR) 관련 질병을 치료하기 위한 RNAi 제제, 조성 및 그의 사용방법 |
EP3919620A1 (en) | 2012-05-02 | 2021-12-08 | Sirna Therapeutics, Inc. | Short interfering nucleic acid (sina) compositions |
TW201808342A (zh) | 2012-05-02 | 2018-03-16 | 喜納製藥公司 | 包含四galnac之新穎結合物及傳送寡核苷酸之方法 |
JP2015518711A (ja) | 2012-05-16 | 2015-07-06 | ラナ セラピューティクス インコーポレイテッド | Bdnf発現を調節するための組成物及び方法 |
JP2016522674A (ja) | 2012-05-16 | 2016-08-04 | ラナ セラピューティクス インコーポレイテッド | 遺伝子発現を調節するための組成物及び方法 |
PL2920304T3 (pl) * | 2012-11-15 | 2019-07-31 | Roche Innovation Center Copenhagen A/S | Koniugaty oligonukleotydowe |
AU2014259759B2 (en) | 2013-05-01 | 2020-06-18 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods |
DK3019200T3 (da) | 2013-07-11 | 2022-06-20 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Oligonukleotid-ligand-konjugater og fremgangsmåde til fremstiling deraf |
US9943604B2 (en) | 2013-09-20 | 2018-04-17 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Targeted therapeutic nucleosides and their use |
WO2015105083A1 (ja) | 2014-01-07 | 2015-07-16 | 塩野義製薬株式会社 | アンチセンスオリゴヌクレオチド及び糖誘導体を含む二本鎖オリゴヌクレオチド |
JP7022687B2 (ja) * | 2016-06-30 | 2022-02-18 | 協和キリン株式会社 | 核酸複合体 |
-
2017
- 2017-01-30 KR KR1020187024809A patent/KR20180103166A/ko unknown
- 2017-01-30 CN CN201780008949.8A patent/CN108699558B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2017-01-30 EP EP17744465.0A patent/EP3409780B1/en active Active
- 2017-01-30 SG SG11201806372UA patent/SG11201806372UA/en unknown
- 2017-01-30 AU AU2017213404A patent/AU2017213404A1/en not_active Abandoned
- 2017-01-30 US US16/073,112 patent/US10745700B2/en active Active
- 2017-01-30 WO PCT/JP2017/003249 patent/WO2017131236A1/ja active Application Filing
- 2017-01-30 JP JP2017563894A patent/JP6853193B2/ja active Active
- 2017-01-30 CA CA3012967A patent/CA3012967A1/en active Pending
- 2017-01-30 ES ES17744465T patent/ES2858090T3/es active Active
- 2017-02-02 TW TW106103567A patent/TWI733751B/zh not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3409780B1 (en) | 2021-01-20 |
JPWO2017131236A1 (ja) | 2018-11-22 |
EP3409780A1 (en) | 2018-12-05 |
WO2017131236A1 (ja) | 2017-08-03 |
AU2017213404A1 (en) | 2018-09-20 |
TWI733751B (zh) | 2021-07-21 |
ES2858090T3 (es) | 2021-09-29 |
US20190055558A1 (en) | 2019-02-21 |
TW201730200A (zh) | 2017-09-01 |
US10745700B2 (en) | 2020-08-18 |
EP3409780A4 (en) | 2019-09-25 |
CA3012967A1 (en) | 2017-08-03 |
SG11201806372UA (en) | 2018-08-30 |
CN108699558A (zh) | 2018-10-23 |
KR20180103166A (ko) | 2018-09-18 |
CN108699558B (zh) | 2021-12-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6853193B2 (ja) | 核酸複合体 | |
JP7022687B2 (ja) | 核酸複合体 | |
WO2019027015A1 (ja) | 核酸複合体 | |
JPWO2017010575A1 (ja) | β2GPI遺伝子発現抑制核酸複合体 | |
CA3118142A1 (en) | Therapeutic methods | |
WO2012074038A1 (ja) | 修飾1本鎖ポリヌクレオチド | |
JP6667179B2 (ja) | オリゴヌクレオチド誘導体及びそれを用いたオリゴヌクレオチド構築物並びにそれらの製造方法 | |
WO2019027009A1 (ja) | 核酸複合体 | |
WO2020111280A1 (ja) | 核酸複合体 | |
JP2019024444A (ja) | 核酸複合体 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200129 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200129 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210216 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210311 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6853193 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |