CN108699558B - 核酸复合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及下述式1表示的核酸复合物。式1中，X为寡核苷酸，L1及L2各自独立地为糖配体，S1、S2及S3各自独立地为接头。式1：

Description

核酸复合物
技术领域
本发明涉及核酸复合物及包含该核酸复合物的药物组合物等。
背景技术
作为核酸药物，已知有核酸适体(Aptamer)、反义核酸、Decoy核酸、核酶、siRNA、miRNA及antimiRNA等。核酸药物由于通用性高(能够控制细胞内的所有基因)，因此期待在临床上应用于目前被认为难以治疗的各种疾病。
另外，核酸药物由于在细胞内的靶向选择性和活性高，因此作为抗体、低分子药物之后的下一代药物而备受期待。
然而，对于核酸药物而言，作为其问题点，可举出难以递送至靶组织。
作为核酸药物在体内的有效递送方法之一，报道了使用靶向化合物与核酸的核酸复合物(偶联物(conjugate))。作为靶向化合物，可举出能够与在细胞外表达的受体结合的配体。其中，特别地，作为能够与在肝细胞中极其高度地表达的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)结合的配体，已报道了多种利用了N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNAc)等的核酸复合物。近年来，报道了将这些配体与siRNA类结合而成的核酸复合物被有效地递送至肝细胞(非专利文献1)。
作为靶向化合物与寡核苷酸的复合物，专利文献1及2中公开了例如以下所示的核酸复合物。
[化学式1]
Figure BDA0001746597290000021
(式中，Ac表示乙酰基。以下，在本说明书中相同。)
另外，专利文献3中公开了具有以下结构的核酸复合物，所述结构具有与专利文献1及2同样的糖配体-系链(tether)单元。
[化学式2]
Figure BDA0001746597290000022
另外，专利文献4中公开了具有以下所示的结构作为糖配体-系链单元的核酸复合物。
[化学式3]
Figure BDA0001746597290000031
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2009/073809号
专利文献2：国际公开第2013/075035号
专利文献3：国际公开第2015/105083号
专利文献4：国际公开第2014/179620号
非专利文献
非专利文献1：美国化学学会杂志(Journal of American Chemical Society)，2014年，第136卷，p16958-16961
发明内容
发明要解决的课题
本发明的目的在于提供新颖的核酸复合物。
用于解决课题的手段
本发明涉及以下的(1)～(22)。
(1)核酸复合物，其由下述式1表示。
式1：
[化学式4]
Figure BDA0001746597290000041
(式1中，
X为寡核苷酸，
L1及L2各自独立地为糖配体，
S1、S2及S3各自独立地为接头(linker)。)
(2)如(1)所述的核酸复合物，其具有下述式2表示的结构。
式2：
[化学式5]
Figure BDA0001746597290000042
(式2中，
X、L1、L2及S3各自与上文中的含义相同，
P1、P2、P3、P4、P5及P6、以及T1及T2各自独立，不存在或者为-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，
Q1、Q2、Q3及Q4各自独立，不存在或者为取代或未取代的碳原子数1～12的亚烷基或-(CH2CH2O)n-CH2CH2-，n为0～99的整数，
B1及B2各自独立地为连接键或下述式2-1表示的任一结构，各结构中的末端的黑圆点各自为与P2或P3、或者P5或P6的键合位点，m1、m2、m3及m4各自独立地为0～10的整数，
式2-1：
[化学式6]
Figure BDA0001746597290000051
p1及p2各自独立地为1、2或3的整数，
q1、q2、q3及q4各自独立地为0～10的整数，
其中，p1及p2各自为2或3的整数时，各P3及P6、Q2及Q4、T1及T2、以及L1及L2可以相同或不同。)
(3)如项2所述的核酸复合物，其中，P1及P4各自独立地为-CO-NH-、-NH-CO-或-O-。
(4)如(2)及(3)所述的核酸复合物，其中，-(P2-Q1)q1-及-(P5-Q3)q3-各自独立，不存在或者为下述式3-1～式3-3表示的任一结构。
式3-1：
[化学式7]
Figure BDA0001746597290000052
式3-2：
[化学式8]
Figure BDA0001746597290000053
式3-3：
[化学式9]
Figure BDA0001746597290000054
(式3-1～式3-3中，
m5及m6各自独立地为0～10的整数，式3-1～式3-3的结构中的末端的黑圆点各自为与B1或B2、或者P1或P4的键合位点。)
(5)如(2)～(4)中任一项所述的核酸复合物，其具有下述式4-1～式4-9表示的任一结构。
式4-1：
[化学式10]
Figure BDA0001746597290000061
式4-2：
[化学式11]
Figure BDA0001746597290000062
式4-3：
[化学式12]
Figure BDA0001746597290000063
式4-4：
[化学式13]
Figure BDA0001746597290000071
式4-5：
[化学式14]
Figure BDA0001746597290000072
式4-6：
[化学式15]
Figure BDA0001746597290000081
式4-7：
[化学式16]
Figure BDA0001746597290000082
式4-8：
[化学式17]
Figure BDA0001746597290000083
式4-9：
[化学式18]
Figure BDA0001746597290000091
(式4-1～4-9中，
X、L1、L2、S3、P3、P6、T1、T2、Q2、Q4、q2及q4各自与上文中的含义相同。)
(6)如(1)所述的核酸复合物，其具有下述式5表示的结构。
式5：
[化学式19]
Figure BDA0001746597290000092
(式5中，
X、S3、P1、P2、P3、Q1、Q2、B1、T1、L1、p1、q1及q2各自与上文中的含义相同。)
(7)如(6)所述的核酸复合物，其中，P1为-CO-NH-、-NH-CO-或-O-。
(8)如(6)或(7)所述的核酸复合物，其具有下述式6-1～式6-9表示的任一结构。
式6-1：
[化学式20]
Figure BDA0001746597290000101
式6-2：
[化学式21]
Figure BDA0001746597290000102
式6-3：
[化学式22]
Figure BDA0001746597290000103
式6-4：
[化学式23]
Figure BDA0001746597290000111
式6-5：
[化学式24]
Figure BDA0001746597290000112
式6-6：
[化学式25]
Figure BDA0001746597290000121
式6-7：
[化学式26]
Figure BDA0001746597290000122
式6-8：
[化学式27]
Figure BDA0001746597290000123
式6-9：
[化学式28]
Figure BDA0001746597290000131
(式6-1～6-9中，
X、S3、P3、Q2、T1、L1及q2各自与上文中的含义相同。)
(9)如(2)～(8)所述的核酸复合物，其具有下述式7-1～式7-9表示的任一结构。
式7-1：
[化学式29]
Figure BDA0001746597290000132
式7-2：
[化学式30]
Figure BDA0001746597290000141
式7-3：
[化学式31]
Figure BDA0001746597290000142
式7-4：
[化学式32]
Figure BDA0001746597290000151
式7-5：
[化学式33]
Figure BDA0001746597290000152
式7-6：
[化学式34]
Figure BDA0001746597290000161
式7-7：
[化学式35]
Figure BDA0001746597290000162
式7-8：
[化学式36]
Figure BDA0001746597290000171
式7-9：
[化学式37]
Figure BDA0001746597290000172
(10)如(1)～(9)中任一项所述的核酸复合物，其具有下述式11表示的结构。
式11：
[化学式38]
Figure BDA0001746597290000181
(式11中，
X、L1、L2、S1及S2各自与上文中的含义相同，
P7及P8各自独立，不存在或者为-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，
Q5、Q6及Q7各自独立，不存在或者为取代或未取代的碳原子数1～12的亚烷基或-(CH2CH2O)n8-CH2CH2-，n8为0～99的整数，
B3为下述式11-1表示的任一结构，曲折线处各自是指与Q5及Q6的连接键，
式11-1：
Figure BDA0001746597290000191
q5及q6各自独立地为0～10的整数。)
(11)如(1)～(10)中任一项所述的核酸复合物，其具有下述式12-1～式12-12表示的任一结构。
式12-1：
[化学式40]
Figure BDA0001746597290000201
式12-2：
[化学式41]
Figure BDA0001746597290000202
式12-3：
[化学式42]
Figure BDA0001746597290000211
式12-4：
[化学式43]
Figure BDA0001746597290000212
式12-5：
[化学式44]
Figure BDA0001746597290000221
式12-6：
[化学式45]
Figure BDA0001746597290000222
式12-7：
[化学式46]
Figure BDA0001746597290000231
式12-8：
[化学式47]
Figure BDA0001746597290000232
式12-9：
[化学式48]
Figure BDA0001746597290000233
式12-10：
[化学式49]
Figure BDA0001746597290000241
式12-11：
[化学式50]
Figure BDA0001746597290000242
式12-12：
[化学式51]
Figure BDA0001746597290000243
(式12-1～12-12中，
X、L1、L2、S1及S2各自与上文中的含义相同，n1’～n12’各自独立地为1～10的整数。)
(12)如(1)～(11)中任一项所述的核酸复合物，其中，上述糖配体为甘露糖或N-乙酰半乳糖胺。
(13)如(1)～(12)中任一项所述的核酸复合物，其中，上述寡核苷酸包含修饰核苷酸。
(14)药物组合物，其含有(1)～(13)中任一项所述的核酸复合物。
(15)如(14)所述的药物组合物，其用于导入至细胞内。
(16)如(15)所述的药物组合物，其中，上述细胞为肝细胞。
(17)如(14)～(16)中任一项所述的药物组合物，其经静脉内施予或经皮下施予。
(18)疾病的治疗或预防方法，所述方法包括下述步骤：将(1)～(13)中任一项所述的核酸复合物或(14)～(17)中任一项所述的药物组合物施予至需要其的患者。
(19)如(18)所述的治疗或预防方法，其中，上述患者为哺乳动物。
(20)下述式8表示的化合物。
式8：
[化学式52]
Figure BDA0001746597290000251
(式8中，
R1及R2各自独立地为氢原子、叔丁氧羰基、苄氧羰基、9-芴甲氧羰基、-CO-R4、或-CO-B4-[(P9-Q8)q7-T3-L3]p3，
P9及T3各自独立，不存在或者为-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，
Q8不存在或者为取代或未取代的碳原子数1～12的亚烷基或-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-，n1为0～99的整数，
B4各自独立地为连接键或下述式8-1表示的任一结构，各结构中的末端的黑圆点各自为与羰基或P9的键合位点，m7、m8、m9及m10各自独立地为0～10的整数，
式8-1：
[化学式53]
Figure BDA0001746597290000261
p3为1、2或3的整数，
q7为0～10的整数，
L3为糖配体，
Y为-O-(CH2)m11-NH-及-NH-CO-(CH2)m12-NH-，m11及m12各自独立地为1～10的整数，
R3为氢原子、叔丁氧羰基、苄氧羰基、9-芴甲氧羰基、-CO-R4、-CO-(CH2CH2O)n2-CH2CH2-N3、或-CO-Q9-B5-(Q10-P10)q8-X1，
P10不存在或者为-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，n2为0～99的整数，
Q9及Q10各自独立，不存在或者为取代或未取代的碳原子数1～12的亚烷基或-(CH2CH2O)n3-CH2CH2-，n3为0～99的整数，
B5为下述式8-2表示的任一结构，曲折线处各自是指与Q9及Q10的连接键，
式8-2：
[化学式54]
Figure BDA0001746597290000271
q8为0～10的整数，
X1为氢原子或固相载体，
R4为经选自下述组中的1个或2个取代基取代的碳原子数2～10的烷基，所述组由经叔丁氧羰基、苄氧羰基、9-芴甲氧羰基取代或未经取代的氨基、羧基、马来酰亚胺基、及芳烷基氧基羰基组成。)
(21)下述式9表示的化合物。
式9：
[化学式55]
Figure BDA0001746597290000281
(式9中，
R5及R6各自独立地为氢原子、叔丁氧羰基、苄氧羰基、9-芴甲氧羰基、-CO-R4’、或-CO-Q11-(P11-Q11’)q9-T4-L4，
P11及T4各自独立，不存在或者为-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，
Q11及Q11’不存在或者为取代或未取代的碳原子数1～12的亚烷基或-(CH2CH2O)n4-CH2CH2-，n4为0～99的整数，
q9为0～10的整数，
L4为糖配体，
Y’为-O-(CH2)m11’-NH-及-NH-CO-(CH2)m12’-NH-，m11’及m12’各自独立地为1～10的整数，
R3’为氢原子、叔丁氧羰基、苄氧羰基、9-芴甲氧羰基、-CO-R4’、-CO-(CH2CH2O)n2’-CH2CH2-N3、或-CO-Q9’-B5’-(Q10’-P10’)q8’-X1’，n2’为0～99的整数，
P10’不存在或者为-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，
Q9’及Q10’各自独立，不存在或者为取代或未取代的碳原子数1～12的亚烷基或-(CH2CH2O)n3’-CH2CH2-，n3’为0～99的整数，
B5’为下述式9-1表示的任一结构，曲折线处各自是指与Q9’及Q10’的连接键，
式9-1：
[化学式56]
Figure BDA0001746597290000291
q8’为0～10的整数，
X1’为氢原子或固相载体，
R4’为经选自下述组中的1个或2个取代基取代的碳原子数2～10的烷基，所述组由经叔丁氧羰基、苄氧羰基、9-芴甲氧羰基取代或未经取代的氨基、羧基、马来酰亚胺基、及芳烷基氧基羰基组成。)
(22)下述式10表示的化合物。
式10：
[化学式57]
Figure BDA0001746597290000301
(式10中，
R7及R8各自独立地为羟基、叔丁氧基、苄氧基、-NH-R10、或-NH-Q12-(P12-Q12’)q10-T5-L5，
P12及T5各自独立，不存在或者为-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，
Q12及Q12’不存在或者为取代或未取代的碳原子数1～12的亚烷基或-(CH2CH2O)n5-CH2CH2-，n5为0～99的整数，
L5为糖配体，
Y2为-O-(CH2)m13-NH-及-NH-CO-(CH2)m14-NH-，m13及m14各自独立地为1～10的整数，
q10为0～10的整数，
R9为氢原子、叔丁氧羰基、苄氧羰基、9-芴甲氧羰基、-CO-R10、-CO-(CH2CH2O)n6-CH2CH2-N3、或-CO-Q13-B6-(Q14-P13)q11-X2，n6为0～99的整数，
P10不存在或者为-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，
Q13及Q14各自独立，不存在或者为取代或未取代的碳原子数1～12的亚烷基或-(CH2CH2O)n7-CH2CH2-，n7为0～99的整数，
B6为下述式10-1表示的任一结构，曲折线处各自是指与Q13及Q14的连接键，
式10-1：
[化学式58]
Figure BDA0001746597290000311
q11为0～10的整数，
X2为氢原子或固相载体，
R10为经选自下述组中的1个或2个取代基取代的碳原子数2～10的烷基，所述组由经叔丁氧羰基、苄氧羰基、9-芴甲氧羰基取代或未经取代的氨基、羧基、马来酰亚胺基、及芳烷基氧基羰基组成。)
发明的效果
通过例如将含有本发明的核酸复合物的药物组合物施予至哺乳动物，能够在生物体内治疗各种相关疾病。
具体实施方式
本发明的核酸复合物为下述式1表示的核酸复合物。
式1：
[化学式59]
Figure BDA0001746597290000321
式1中，
X为寡核苷酸，
L1及L2各自独立地为糖配体，
S1、S2及S3各自独立地为接头。
本发明中，S1及S2可相对于S3在苯环上的取代位置而言分别在邻位、间位、对位与苯环键合，优选为下述式1-1表示的核酸复合物。意味着式1中的S1及S2与苯环的连接键可以在苯环上的除S3的取代位置以外的任意位置。
式1-1：
[化学式60]
Figure BDA0001746597290000322
式1-1中，
X、L1、L2、S1、S2及S3各自与上文中的含义相同。
本说明书中，所谓与上文中的含义相同，以式1-1中为例进行说明时，是指：关于式1-1中的各X、L1、L2、S1及S2，可以为与式1中上述的各X、L1、L2、S1及S2的定义相同的基团。
本发明中，X为寡核苷酸，可使用已知作为核酸药物使用的寡核苷酸。本发明中，所谓核酸药物，是指可作为核酸适体、反义核酸、Decoy核酸、核酶、siRNA、miRNA及antimiRNA等使用的核苷酸。
本发明中，S3与寡核苷酸不仅可介由构成核苷酸的糖部分的3’位或5’位与S3键合，还可以介由构成核苷酸的碱基部分与S3键合。本发明中，寡核苷酸可被理解为具有将S3与寡核苷酸键合的结构的基团，例如，在寡核苷酸介由-O-P(Z)(Z’)O-(式中，Z及Z’各自独立地为氧原子或硫原子。)与S3键合的情况下，可将作为X的寡核苷酸理解为-O-P(Z)(Z’)O-寡核苷酸。
另外，寡核苷酸可以为单链或双链的寡核苷酸。
作为S3的接头与作为X的寡核苷酸在寡核苷酸的3’末端或5’末端键合。在寡核苷酸为双链的情况下，优选作为S3的接头与构成双链核酸的有义链的3’末端或5’末端键合，但并不限定于此种键合。
本发明中，将包含与靶标mRNA互补的碱基序列的核酸称为反义核苷酸，也将包含与反义苷核酸的碱基序列互补的碱基序列的核酸称为有义核苷酸。
构成本发明中使用的核酸复合物的寡核苷酸可以为任意形状，只要在导入至哺乳动物细胞时具有控制靶基因的表达的能力即可，优选使用单链的寡核苷酸或双链的寡核苷酸。
作为寡核苷酸，只要是核苷酸或具有与核苷酸同等功能的分子的聚合物即可，可以为任意分子，可举出例如作为脱氧核糖核苷酸的聚合物的DNA、作为核糖核苷酸的聚合物的RNA、作为DNA与RNA的聚合物的嵌合核酸。另外，就DNA、RNA及嵌合核酸而言，可以为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸等核苷酸中的至少一个被具有与核苷酸同等功能的分子替换而成的核苷酸聚合物。需要说明的是，RNA中的尿嘧啶(U)在DNA中可毫无疑义地与胸腺嘧啶(T)互换读出。
作为具有与核苷酸同等功能的分子，可举出例如对核苷酸施以修饰而成的核苷酸衍生物等，例如为了较之DNA或RNA而言而提高核酸酶抗性或使其稳定、增强与互补链核酸的亲和性、增强细胞透过性、或者使其可被观察到，可优选使用对脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸施以修饰而成的分子等。
作为核苷酸衍生物，可举出例如糖部修饰核苷酸、磷酸二酯键修饰核苷酸、碱基修饰核苷酸等糖部、磷酸二酯键及碱基中的至少一者经修饰的核苷酸等。
作为糖部修饰核苷酸，只要是对核苷酸的糖的化学结构的一部分或全部用任意取代基进行修饰或取代而成的核苷酸、或者用任意原子进行取代而成的核苷酸即可，可以为任意的核苷酸，但优选使用2’-修饰核苷酸。
作为2’-修饰核苷酸，可举出例如核糖的2’-OH基经选自由OR、R、R’OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、Br及I组成的组(R为烷基或芳基，优选为碳原子数1～6的烷基，R’为亚烷基，优选为碳原子数1～6的亚烷基)中的取代基取代而成的2’-修饰核苷酸，作为2’-修饰，可优选举出经F、甲氧基及乙氧基的取代。另外，还可举出经选自由2-(甲氧基)乙氧基、3-氨基丙氧基基、2-[(N,N-二甲基氨基)氧基]乙氧基、3-(N,N-二甲基氨基)丙氧基、2-[2-(N,N-二甲基氨基)乙氧基]乙氧基、2-(甲基氨基)-2-氧代乙氧基、2-(N-甲基氨甲酰基)乙氧基及2-氰基乙氧基组成的组中的取代基取代而成的2’-修饰核苷酸等。
另外，作为糖部修饰核苷酸，还可优选使用通过向糖部导入桥联结构从而具有两个环状结构的桥联结构型人工核酸(Bridged Nucleic Acid)(BNA)。具体而言，可举出2’位的氧原子与4’位的碳原子介由亚甲基桥联而成的锁人工核酸(Locked Nucleic Acid)(LNA)[Tetrahedron Letters，38，8735(1997)及Tetrahedron，54，3607(1998)]、亚乙基桥联结构型人工核酸(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)[Nucleic Acid Research，32，e175(2004)]、限制性乙基(Constrained Ethyl)(cEt)[The Journal of OrganicChemistry 75，1569(2010)]、酰氨基桥联核酸(Amido-Bridged Nucleic Acid)(AmNA)[Chem Bio Chem 13，2513(2012)]及2’-O,4’-C-螺亚环丙基桥联核酸(2’-O,4’-C-Spirocyclopropylene bridged nucleic acid(scpBNA)[Chem.Commun.，51，9737(2015)]等。
此外，作为糖部修饰核苷酸，还可举出肽核酸(PNA)[Acc.Chem.Res.，32，624(1999)]、氧基肽核酸(OPNA)[J.Am.Chem.Soc.，123，4653(2001)]、肽核糖核酸(PRNA)[J.Am.Chem.Soc.，122，6900(2000)]等。
作为磷酸二酯键修饰核苷酸，只要是对核苷酸的磷酸二酯键的化学结构的一部分或全部用任意的取代基进行修饰或取代而成的核苷酸、或者用任意的原子进行取代而成的核苷酸即可，可以为任意的核苷酸，可举出例如磷酸二酯键被取代为硫代磷酸酯键而成的核苷酸、磷酸二酯键被取代为二硫代磷酸酯键而成的核苷酸、磷酸二酯键被取代为膦酸烷基酯键而成的核苷酸、磷酸二酯键被取代为氨基磷酸酯键而成的核苷酸等，优选可举出磷酸二酯键被取代为硫代磷酸酯键而成的核苷酸。
作为碱基修饰核苷酸，只要是对核苷酸的碱基的化学结构的一部分或全部用任意的取代基进行修饰或取代而成的核苷酸、或者用任意的原子进行取代而成的核苷酸即可，可以为任意的核苷酸，可举出例如碱基内的氧原子被替换为硫原子而成的核苷酸、氢原子被替换为碳原子数1～6的烷基、卤素基团而成的核苷酸、甲基被替换为氢原子、羟基甲基、碳原子数2～6的烷基而成的核苷酸、氨基被替换为碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的烷酰基、氧代基、羟基等而成的核苷酸。需要说明的是，代替胞嘧啶(C)而使用5-甲基胞嘧啶(5-mC)作为碱基修饰核苷酸也是本发明的优选方式之一。
作为核苷酸衍生物，还可举出在核苷酸或者糖部、磷酸二酯键或碱基中的至少一者被修饰的核苷酸衍生物上直接或介由接头附加了下述其他化学物质而成的产物，所述其他化学物质为肽、蛋白质、糖、脂质、磷脂、酚嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素、色素等，具体而言，可举出附加有5’-多胺的核苷酸衍生物、附加有胆固醇的核苷酸衍生物、附加有类固醇的核苷酸衍生物、附加有胆酸的核苷酸衍生物、附加有维生素的核苷酸衍生物、附加有Cy5的核苷酸衍生物、附加有Cy3的核苷酸衍生物、附加有6-FAM的核苷酸衍生物、以及附加有生物素的核苷酸衍生物等。
核苷酸衍生物可以与核酸内的其他核苷酸或核苷酸衍生物形成桥联结构，如亚烷基结构、肽结构、核苷酸结构、醚结构、酯结构、及组合了这些结构中的至少一者的结构等。
寡核苷酸还包括其分子中的部分或全部原子被质量数不同的原子(同位素)取代而成的物质。
在本说明书中，所谓“互补”，是指例如像腺嘌呤与胸腺嘧啶或尿嘧啶的关系、及鸟嘌呤与胞嘧啶的关系这样，可介由疏松的氢键在两个碱基之间进行碱基配对的关系。
在本说明书中，所谓“互补的”，是指：不仅包括两个核苷酸序列完全互补的情况，还可在核苷酸序列之间具有0～30％、0～20％或0～10％的错配碱基，例如，与靶标mRNA互补的反义寡核苷酸可在与靶标mRNA的部分碱基序列完全互补的碱基序列中含有一个或多个碱基的替换。具体而言，反义寡核苷酸可相对于靶基因的靶序列而言具有1～8个(优选1～6个、1～4个、1～3个，特别是2个或1个)错配碱基。
另外，所谓“互补的”，包括下述情况：一条核苷酸序列为在与另一条核苷酸序列完全互补的碱基序列中添加及/或缺失了一个或多个碱基而得到的序列。例如，靶标mRNA与反义寡核苷酸可由于反义寡核苷酸中的碱基的添加及/或缺失而在反义链及/或靶标mRNA区域中具有1个或2个凸出碱基。
其中，以下在记载有“互补的”的位置，以也涵盖“互补”的含义的方式记载。
所谓本发明中使用的反义寡核苷酸，是指与编码靶基因的DNA、由编码靶基因的DNA转录的mRNA前体、mRNA、microRNA前体或microRNA互补的寡核苷酸，该反义寡核苷酸通过与作为靶标的DNA、mRNA前体或mRNA形成双链从而抑制DNA、mRNA前体、mRNA、microRNA前体或microRNA的功能。
反义寡核苷酸中不仅涵盖与作为靶标的DNA、mRNA前体、mRNA、microRNA前体或microRNA完全互补的情况，而且还涵盖存在1或数个错配的情况，只要能够在严格的条件下与DNA、mRNA前体、mRNA、microRNA前体或microRNA杂交即可。
就反义寡核苷酸而言，只要为与靶基因杂交的核酸即可，可导入至发夹寡聚物、环状寡聚物的形态中，也可在内部或末端含有凸出(bulge)或环(loop)等结构要素。
反义寡核苷酸的长度为8～80个碱基，优选为8～30个碱基。例如，可以为8～20个碱基、10～20个碱基、13～20个碱基、13～16个碱基、13个碱基、14个碱基、15个碱基、16个碱基、17个碱基、18个碱基、19个碱基、20个碱基。
反义寡核苷酸被导入至细胞内时，与互补的mRNA前体或mRNA结合，在立体上阻碍翻译为蛋白质，从而能够抑制靶基因的表达。
另外，反义寡核苷酸还可在细胞内与互补的microRNA前体或microRNA结合，在立体上阻碍microRNA的功能。
另外，反义寡核苷酸有时也在细胞内与互补的mRNA及mRNA前体结合而将mRNA及mRNA前体切断。作为这样的例子，介由RNaseH(其为将RNA与DNA的双链的RNA链切断的核酸内切酶)的作用是已知的。本发明的细胞内的反义寡核苷酸与mRNA及mRNA前体形成双链时，可被RNaseH所识别从而将互补的mRNA链酶解。
为了诱导基于RNaseH的mRNA及mRNA前体的切断，具有4～80个连续的DNA区域的反义寡核苷酸是优选的。在该情况下，反义寡核苷酸优选具有0～80％的糖部修饰核苷酸，更优选为10～60％，进一步优选为20～50％。另外，具有糖部修饰核苷酸时的连续的DNA区域更优选为4～20个，进一步优选为4～15个，最优选为5～10个。此外，反义寡核苷酸中的糖部修饰核苷酸的位置优选配置于5’末端附近及/或3’末端附近，更优选配置于距5’端为全长的长度的25％以内的位置及/或距3’端为全长的长度的25％以内的位置。
对于反义寡核苷酸而言，也可以使其与互补的寡核酸形成双链，以双链核酸的形式导入至细胞内，由此诱导靶基因的表达抑制(参见国际公开第2005/113571号)。利用配体修饰此时的双链核酸的位置优选为互补的寡核酸的5’末端或3’末端。
本发明中使用的反义寡核苷酸还可以通过使用与靶基因的启动子序列等互补的碱基序列来促进靶基因的表达(参见国际公开第2013/173601号及国际公开第2013/173637号)。
作为制造反义寡核苷酸的方法，没有特别限定，可举出使用已知的化学合成的方法、或者酶转录法等。作为使用已知的化学合成的方法，可举出亚磷酰胺法、硫代磷酸酯法、磷酸三酯法、CEM法[Nucleic Acid Research，35，3287(2007)]等，例如，可通过ABI3900高通量核酸合成仪(Applied Biosystems公司制)来合成。合成结束后，进行从固相的脱离、保护基的脱保护及目标物的纯化等。理想的是，通过纯化而获得纯度为90％以上、优选95％以上的反义寡核苷酸。作为制造本发明的反义寡核苷酸的酶转录法，可举出下述方法：使用具有目标碱基序列的质粒或DNA作为模板，使用噬菌体RNA聚合酶例如T7、T3或SP6RNA聚合酶进行转录。
本发明中使用的双链寡核苷酸可以由任意的寡核苷酸或其衍生物构成，只要为含有与靶标mRNA的一部分碱基序列互补的碱基序列的核酸及/或含有与该核酸的碱基序列互补的碱基序列的核酸即可。
本发明中使用的双链寡核苷酸可以为任意长度，只要含有与靶标mRNA序列互补的碱基序列的核酸、与含有与该核酸的碱基序列互补的碱基序列的核酸能够形成双链即可，能够形成双链的序列的长度通常为11～35个碱基，优选为15～30个碱基，更优选为17～25碱基，进一步优选为17～23个碱基，尤其优选为19～23个碱基。
作为本发明中使用的、抑制靶标蛋白质的表达的双链寡核苷酸，可优选使用：单链核酸，其为含有与靶标mRNA序列互补的碱基序列的核酸，并且可抑制靶标蛋白质的表达；或者双链核酸，其由含有与靶标mRNA序列互补的碱基序列的核酸、和含有与该核酸的碱基序列互补的碱基序列的核酸构成，并且可抑制靶标蛋白质的表达。
双链寡核苷酸也可以通过使用由含有与靶基因的启动子序列等互补的碱基序列的核酸、和含有与该核酸的碱基序列互补的碱基序列的核酸构成的分子来促进靶基因的表达[Nucleic Acid Research，41，10086(2013)，Hepatology，59，216(2014)]。
所谓双链寡核苷酸，是指两条寡核苷酸配对而具有双链区域的核苷酸。所谓双链区域，是指构成双链的核苷酸或其衍生物构成碱基对而形成双链的部分。双链区域通常为11～27个碱基对，优选为15～25个碱基对，更优选为15～23个碱基对，进一步优选为17～21个碱基对。
构成双链寡核苷酸的单链寡核苷酸通常包含11～30个碱基，优选包含15～29个碱基，更优选包含15～27个碱基，进一步优选包含15～25个碱基，尤其优选包含17～23个碱基。
就双链寡核苷酸而言，在紧连着双链区域的3’侧或5’侧具有未形成双链的额外核苷酸或核苷酸衍生物时，将其称为突出部(overhang)。当具有突出部时，构成突出部的核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或它们的衍生物。
作为具有突出部的双链寡核苷酸，可以使用在至少一条链的3’末端或5’末端具有由1～6个碱基(通常为1～3个碱基)构成的突出部的双链寡核苷酸，优选使用具有由2个碱基构成的突出部的双链寡核苷酸，可举出例如具有由dTdT或UU构成的突出部的双链寡核苷酸。突出部可仅存在于反义寡核苷酸中，仅存在于有义寡核苷酸中，以及存在于反义寡核苷酸和有义寡核苷酸这两者中，优选使用在反义寡核苷酸中具有突出部的双链寡核苷酸。需要说明的是，反义寡核苷酸包含双链区域和与其相连的突出部。
作为双链寡核苷酸，可使用由与靶基因的碱基序列或其互补链的碱基序列相同的序列组成的核酸，也可使用由该核酸的至少一条链的5’末端或3’末端被削除1～4个碱基而得到的核酸、和含有与该核酸的碱基序列互补的碱基序列的核酸构成的双链核酸。
双链寡核苷酸可以是RNA彼此形成双链的双链RNA(dsRNA)、DNA彼此形成双链的双链DNA(dsDNA)、或RNA与DNA形成双链的杂合核酸。或者，双链中的一条链或两条链可以是DNA和RNA的嵌合核酸。优选为双链RNA(dsRNA)。
优选反义寡核苷酸的从5’末端起算第2个核苷酸与靶标mRNA序列的3’末端起算的第2个脱氧核糖核苷酸互补，更优选反义寡核苷酸的从5’末端起算的第2～7个核苷酸与靶标mRNA序列的从3’末端起算的第2～7个脱氧核糖核苷酸完全互补，进一步优选反义寡核苷酸的从5’末端起算第2～11个核苷酸与靶标mRNA序列的从3’末端起算第2～11个脱氧核糖核苷酸完全互补。另外，优选反义寡核苷酸的从5’末端起算第11个核苷酸与靶标mRNA序列的从3’末端起算第11个脱氧核糖核苷酸互补，更优选反义寡核苷酸的从5’末端起算第9～13个核苷酸与靶标mRNA序列的从3’末端起算第9～13个脱氧核糖核苷酸完全互补，进一步优选反义寡核苷酸的从5’末端起算第7～15个核苷酸与靶标mRNA序列的从3’末端起算第7～15个脱氧核糖核苷酸完全互补。
就修饰核苷酸而言，优选相对于双链核酸区域内的核苷酸含有50～100％，更优选含有70～100％，进一步优选含有90～100％。
双链寡核苷酸可化学合成，通常可通过使用固相寡核苷酸合成法来进行合成(例如，参见Usman et al.，美国专利第5,804,683号说明书；美国专利第5,831,071号说明书；美国专利第5,998,203号说明书；美国专利第6,117,657号说明书；美国专利第6,353,098号说明书；美国专利第6,362,323号说明书；美国专利第6,437,117号说明书；美国专利第6,469,158号说明书；Scaringe et al.，美国专利第6,111,086号说明书；美国专利第6,008,400号说明书；美国专利第6,111,086号说明书)。
RNA可通过酶合成或部分/全部有机合成而生成，另外，经修饰的核糖核苷酸可通过在体外进行酶合成或有机合成而导入。在一个实施方式中，各链以化学方式制备。以化学方式合成RNA分子的方法在该技术领域中是已知的[参见Nucleic Acids Research，32，936(1998)]。
作为本发明中使用的RNA，可举出包含靶基因的mRNA的连续15～30个碱基(优选为17～25个碱基、更优选为19～23个碱基)序列(以下记为序列X)及与序列X互补的碱基序列(以下记为互补的序列X’)的RNA，可举出例如：由含有序列X的有义寡核苷酸及含有互补的序列X’的反义寡核苷酸构成的双链RNA；具有利用间隔寡核苷酸将该有义寡核苷酸与该反义寡核苷酸连结而成的发夹结构的RNA。
作为含有序列X的有义寡核苷酸，可举出：仅含有序列X作为碱基的RNA(以下记为序列X链)；在序列X链的3’端或5’端或者两端附加有1～6个(优选为2～4个)相同或不同的核苷酸而成的RNA。
作为含有互补的序列X’的反义寡核苷酸，可举出：仅含有互补的序列X’作为碱基的RNA(以下记为互补的序列X’链)；在互补的序列X’链的3’端或5’端或者两端附加有1～6个(优选为2～4个)相同或不同的核苷酸而成的双链RNA等。
作为具有利用间隔寡核苷酸将含有序列X的有义寡核苷酸与含有互补的序列X’的反义寡核苷酸连结而成的发夹结构的RNA的间隔寡核苷酸，优选为6～12个碱基的核苷酸，其5’端的序列优选为两个U。作为间隔寡核苷酸的例子，可举出包含UUCAAGAGA的碱基序列的寡核苷酸。关于利用间隔寡核苷酸进行连结的2个RNA的顺序，任一者均可以为5’侧，优选含有序列X的有义链为5’侧。
附加于序列X链及互补的序列X’链上的核苷酸、以及间隔寡核苷酸的碱基可以为鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶中的任一种或多种，另外，键合于各碱基上的糖可以为核糖、脱氧核糖或2’位的羟基被修饰基团取代而成的核糖中的任意，作为所附加的核苷酸，更优选为尿苷酸(U)及脱氧胸苷酸(dT)中的任一种或两种。另外，可以使附加于序列X链的3’端上的核苷酸的碱基序列为与在靶基因的mRNA内相邻于序列X的核苷酸的碱基序列相同的碱基序列。另外，还可以使附加于互补的序列X’链的3’端上的核苷酸的碱基序列为与在靶基因的mRNA内相邻于序列X的核苷酸的碱基序列互补的碱基序列。
作为本发明中使用的RNA的更优选的例子，例如可举出：双链RNA(a)，其由含有序列X的有义寡核苷酸及含有互补的序列X’的反义寡核苷酸构成，序列X为靶基因的mRNA的连续19～21个碱基的序列，有义寡核苷酸由序列X链及附加于序列X链的3’端上的2～4个相同或不同的核苷酸组成，反义寡核苷酸由互补的序列X’链及附加于互补的序列X’链的3’端上的2～4个相同或不同的核苷酸组成；双链RNA(b)，其由含有序列X的有义寡核苷酸及含有互补的序列X’的反义寡核苷酸构成，序列X为靶基因的mRNA的连续23～25个碱基的序列，有义寡核苷酸为序列X链，反义寡核苷酸为互补的序列X’链；双链RNA(c)，其由含有序列X的有义寡核苷酸及含有互补的序列X’的反义寡核苷酸构成，序列X为靶基因的mRNA的连续23～27个碱基的序列，有义寡核苷酸由序列X链及附加于序列X链的3’端上的2～4个相同或不同的核苷酸组成，反义寡核苷酸由互补的序列X’链及附加于互补的序列X’链的3’端上的2～4个相同或不同的核苷酸组成，附加于互补的序列X’链的3’端上的核苷酸的碱基序列为与在靶基因的mRNA内相邻于序列X的核苷酸的碱基序列互补的碱基序列；等等。
另外，作为本发明中使用的RNA，优选可举出具有利用RNA干扰(RNAi)来抑制该靶基因的表达的作用的RNA。
对于单链寡核苷酸而言，使用固相亚磷酰胺法[参见Nucleic Acids Research，30，2435(1993)]来合成，进行脱保护，并在NAP-5柱(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上进行脱盐。寡聚物使用离子交换高效液相色谱法(IE-HPLC)进行纯化，所述离子交换高效液相色谱法中采用了使用15分钟工序的线性梯度的Amersham Source 15Q柱-1.0cm(高度25cm)(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。就梯度而言，从90：10的缓冲液A：B变化至52：48的缓冲液A：B，缓冲液A是pH为8.5的100mmol/L的Tris，并且缓冲液B是pH为8.5的100mmol/L的Tris(1mol/L的NaCl)。在260nm下对试样进行监测，收集对应于全长寡核苷酸种类的峰并汇总，利用NAP-5柱进行脱盐，并进行冷冻干燥。
各单链寡核苷酸的纯度通过利用Beckman PACE 5000(Beckman Coulter、Inc.，Fullerton，Calif)的毛细管电泳(CE)来确定。CE毛细管具有100μm的内径，含有ssDNA 100RGel(Beckman-Coulter)。典型地，将约0.6nmole的寡核苷酸注射至毛细管，在444V/cm的电场中施行，通过260nm处的UV吸光度来进行检测。改性Tris-硼酸-7mol/L-尿素电泳缓冲液从Beckman-Coulter购入。可获得用于下述实验的、至少为90％纯度(利用CE评价)的单链寡核苷酸。化合物同一性是按照制造商推荐的方案、通过利用VoyagerDE.TM.Biospectometry工作站(Applied Biosystems，Foster City，Calif.)的基质辅助激光解吸电离飞行时间型(MALDI-TOF)质谱法进行验证的。单链寡核苷酸的相对分子质量可在预想的分子质量的0.2％以内得到。
使单链寡核苷酸以100μmol/L的浓度再次悬浮于包含100mmol/L乙酸钾、30mmol/LHEPES的pH为7.5的缓冲液中。将互补的有义链及反义链以同等的摩尔量进行混合，得到50μmol/L双链寡核苷酸的最终溶液。对试样加热5分钟直至95℃，在使用前冷却至室温。双链核酸于-20℃进行保存。使单链寡核苷酸冷冻干燥、或于-80℃储存于无核酸酶的水中。
L1及L2各自独立地为糖配体。
本发明中，糖配体是指能够与在靶细胞中表达的受体结合的来自糖类(单糖、二糖、三糖及多糖等)的基团。本发明中，糖配体通过O-键与作为S1及S2的接头相键合时，除了参与构成糖配体的糖类的键合的羟基以外的部分表示作为来自糖类的基团的糖配体。本发明中，选择成为寡核苷酸的靶细胞的糖配体即可。
作为单糖，可举出例如阿洛糖、醛糖、阿拉伯糖、克拉定糖(cladinose)、赤藓糖(erythrose)、赤藓酮糖(erythrulose)、果糖、D-岩藻糖醇、L-岩藻糖醇、岩藻糖胺(fucosamine)、岩藻糖、墨角藻糖(fuculose)、半乳糖胺、D-半乳糖氨醇(D-galactosaminitol)、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、氨基葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖、葡糖胺醇、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、古洛糖、甘油醛、L-甘油-D-甘露庚糖、甘油、甘油酮、古洛糖、艾杜糖、来苏糖、甘露糖胺、甘露糖、甘露糖-6-磷酸、阿洛酮糖、异鼠李糖、异鼠李糖胺、鼠李糖醇、鼠李糖胺、鼠李糖、核糖、核酮糖、景天庚糖(sedoheptulose)、山梨糖、塔格糖、塔罗糖(talose)、酒石酸、苏糖、木糖、及木酮糖等。
作为二糖、三糖、多糖，可举出例如阿比可糖、阿卡波糖(acarbose)、amicetose、支链淀粉、直链淀粉、芹菜糖、arcanose、蛔糖(ascarylose)、抗坏血酸、2-脱氧-6-鼠李糖、纤维二糖、纤维三糖、纤维素、马铃薯三糖、查尔糖(chalcose)、甲壳素、可立糖(colitose)、环糊精、磁麻糖、糊精、2-脱氧核糖、2-脱氧葡萄糖、2-脱氧毛地黄糖(diginose)、毛地黄糖(digitalose)、毛地黄毒糖(digitoxose)、evalose、evemitrose、低聚果糖(fructo-oligosaccharide)、半乳寡糖(galto-oligosaccharide)、龙胆三糖、龙胆二糖、葡聚糖、糖原、肝糖、金缕梅糖、肝素、菊糖、异左旋葡萄糖酮、异麦芽糖、异麦芽三糖、异葡糖基麦芽糖(isopanose)、曲二糖、乳糖、乳糖胺、乳糖二胺、昆布二糖、左旋葡聚糖、左旋葡萄糖酮、β-麦芽糖、麦芽三糖、低聚甘露糖、甘露三糖、松三糖、松二糖、胞壁酸、碳霉糖、6-脱氧-D-阿洛糖、神经氨糖酸、含有唾液酸的糖链、黑曲霉糖、野艽霉素、诺维糖、夹竹桃糖、潘糖、泊雷糖、车前糖、樱草糖、棉子糖、玫瑰糖(rhodinose)、芦丁糖、箭毒羊角拗糖(sarmentose)、景天庚糖、景天庚醛聚糖(sedoheptulosan)、茄三糖、槐糖、水苏糖、链霉糖、蔗糖、α,α-海藻糖、海藻糖胺、松二糖、泰威糖、木二糖、伞形糖等。
糖类中的各单糖可以为D体或L体，也可以为D体与L体以任意比例形成的混合物。
糖类也可包含：脱氧糖(将醇羟基替换为氢原子而得到的物质)、氨基糖(将醇羟基替换为氨基而得到的物质)、硫代糖(将醇羟基替换为巯基而得到的物质、或将C＝O替换为C＝S而得到的物质、或将环内的氧替换为硫而得到的物质)、硒代糖、碲代糖、氮杂糖(将环内的碳替换为氮而得到的物质)、亚氨基糖(将环内的氧替换为氮而得到的物质)、亚磷糖(将环内的氧替换为磷而得到的物质)、磷杂糖(将环内的碳替换为磷而得到的物质)、C-取代单糖(用碳原子替换非末端碳原子中的氢原子而得到的物质)、不饱和单糖、醛醇(用CHOH基替换羰基而得到的物质)、醛糖酸(将醛基替换为羧基而得到的物质)、酮基醛糖酸、糖醛酸、醛糖二酸等。
关于氨基糖，作为糖类中的氨基单糖，可举出半乳糖胺、葡糖胺、甘露糖胺、岩藻糖胺、异鼠李糖胺、神经氨糖酸、胞壁酸、乳糖二胺、acosamine、bacillosamine、柔红糖胺、脱氧糖胺、福乐糖胺、加洛糖胺、卡糖胺(kanosamine)、kansosamine、碳霉糖胺、海藻糖胺、过骨胺(perosamine)、6-脱氧-L-塔罗糖胺、绛红糖胺(purpurosamine)、紫红糖胺(rhodosamine)等。另外，氨基糖的氨基可被乙酰基等替换。
作为含有唾液酸的糖链，可举出在糖链非还原末端含有NeuAc的糖链，可举出含有NeuAc-Gal-GlcNAc的糖链、Neu5Acα(2-6)Galβ(1-3)GlcNAc等。
糖类中的各单糖可被取代基取代，只要能够与在靶细胞中表达的受体结合即可，例如，羟基可被取代，各单糖中的一个～多个氢原子可被叠氮化物及/或芳基(所述芳基可被取代)取代。
作为糖配体，与作为靶标的各器官相对应地选择与在靶细胞的表面表达的受体结合的糖配体是优选的，例如，靶细胞为肝细胞时，针对在肝细胞表面表达的受体的糖配体是优选的，针对去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的糖配体是更优选的。
作为针对ASGPR的糖配体，优选甘露糖或N-乙酰半乳糖胺，更优选N-乙酰半乳糖胺。
作为与ASGPR的亲和性更高的糖配体，例如Bioorganic Medicinal Chemistry，17，7254(2009)及Journal of American Chemical Society，134，1978(2012)等中记载的糖衍生物是已知的，可使用这些糖衍生物。
本发明中，S1、S2及S3为接头。
S1和S2只要为将作为糖配体的L1和L2、与苯环连结的结构则没有特别限定，可采用核酸复合物中使用的已知结构。S1与S2可以相同，也可以不同。
作为糖配体的L1和L2优选通过糖苷键与S1及S2连结，S1及S2可通过例如-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-键而分别与苯环连结。
S3只要为将作为寡核苷酸的X与苯环连结的结构则没有特别限定，可采用核酸复合物中使用的已知结构。
作为寡核苷酸的X优选通过磷酸二酯键与S3连结，S3可通过例如-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-键而与苯环连结。
关于作为S1、S2及S3的接头，例如可采用国际公开第2009/073809号、国际公开第2013/075035号、国际公开第2015/105083号、国际公开第2014/179620号、国际公开第2015/006740号中公开的结构。
本发明中，核酸复合物优选为具有下述式2表示的结构的核酸复合物。
式2：
[化学式61]
Figure BDA0001746597290000471
式2中，
X、L1、L2及S3各自与上文中的含义相同，
P1、P2、P3、P4、P5及P6、以及T1及T2各自独立，不存在或者为-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，
Q1、Q2、Q3及Q4各自独立，不存在或者为取代或未取代的碳原子数1～12的亚烷基或-(CH2CH2O)n-CH2CH2-，n为0～99的整数，
B1及B2各自独立地为连接键或下述式2-1表示的任一结构，各结构中的末端的黑圆点各自为与P2或P3、或者P5或P6的键合位点，m1、m2、m3及m4各自独立地为0～10的整数，
式2-1：
[化学式62]
Figure BDA0001746597290000472
p1及p2各自独立地为1、2或3的整数，
q1、q2、q3及q4各自独立地为0～10的整数，
其中，p1及p2各自为2或3的整数时，各P3及P6、Q2及Q4、T1及T2、以及L1及L2可以相同或不同。
P1及P4各自独立，不存在或者为-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，优选为-O-、-O-CO-、-NH-CO-或-CO-NH-，更优选为-O-、-NH-CO-或-CO-NH-，进一步优选为-NH-CO-。
P1或P4为例如-NH-CO-时，具有-NH-CO-苯环这样的部分结构。
Q1、Q2、Q3及Q4各自独立，不存在或者为取代或未取代的碳原子数1～12的亚烷基或-(CH2CH2O)n-CH2CH2-，n为0～99的整数，优选为取代或未取代的碳原子数1～12的亚烷基，更优选为未取代的碳原子数1～12的亚烷基，进一步优选为未取代的碳原子数1～6的亚烷基，更进一步优选为未取代的碳原子数1～4的亚烷基。
P2及P5各自独立，不存在或者为-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，优选不存在或者为-CO-O-或-CO-NH-，更优选不存在或者为-CO-NH-。P2及P5为例如-CO-NH-时，具有B1-CO-NH-Q1及B2-CO-NH-Q3这样的部分结构。
优选地，-(P2-Q1)q1-及-(P5-Q3)q3-各自独立，不存在或者为下述式3-1～式3-3表示的任一结构。
式3-1：
[化学式63]
Figure BDA0001746597290000481
式3-2：
[化学式64]
Figure BDA0001746597290000482
式3-3：
[化学式65]
Figure BDA0001746597290000491
式3-1～3-3中，
m5及m6各自独立地为0～10的整数，式3-1～式3-3的结构中的末端的黑圆点各自为与B1或B2、或者P1或P4的键合位点。
B1及B2各自独立地为连接键、或下述式表示的任一结构，各结构中的末端的黑圆点各自为与P2或P3、或者P5或P6的键合位点，m1、m2、m3及m4各自独立地为0～10的整数。
[化学式66]
Figure BDA0001746597290000492
B1及B2优选为来自包含谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、亚氨基二乙酸等非天然氨基酸的氨基酸、或1,3-丙二醇等氨基醇的基团，B1及B2为来自谷氨酸及天冬氨酸的基团时，优选谷氨酸及天冬氨酸的氨基分别键合且P2及P5为-NH-CO-键，B1及B2为来自赖氨酸的基团时，优选赖氨酸的羧基分别键合且P2及P5为-CO-NH-键，B1及B2为来自亚氨基二乙酸的基团时，优选亚氨基二乙酸的氨基分别键合且P2及P5为-CO-键。
本发明中，核酸复合物优选为具有下述式4-1～4-9表示的结构的核酸复合物。
式4-1：
[化学式67]
Figure BDA0001746597290000501
式4-2：
[化学式68]
Figure BDA0001746597290000502
式4-3：
[化学式69]
Figure BDA0001746597290000503
式4-4：
[化学式70]
Figure BDA0001746597290000511
式4-5：
[化学式71]
Figure BDA0001746597290000512
式4-6：
[化学式72]
Figure BDA0001746597290000521
式4-7：
[化学式73]
Figure BDA0001746597290000522
式4-8：
[化学式74]
Figure BDA0001746597290000531
式4-9：
[化学式75]
Figure BDA0001746597290000532
式4-1～4-9中，
X、L1、L2、S3、P3、P6、T1、T2、Q2、Q4、q2及q4各自与上文中的含义相同。
P3及P6各自独立，不存在或者为-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，优选为-O-CO-或-NH-CO-，更优选为-NH-CO-。P3及P6为例如-NH-CO-时，分别具有B1-NH-CO-Q2及B2-NH-CO-Q4这样的部分结构。
T1及T2各自独立，不存在或者为-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，优选为-O-或-S-，更优选为-O-。
本发明中，核酸复合物优选为具有下述式5表示的结构的核酸复合物。
式5中，式2中的P1与P4、P2与P5、P3与P6、Q1与Q3、Q2与Q4、B1与B2、T1与T2、L1与L2、p1与p2、q1与q3以及q2与q4各自相同。
式5：
[化学式76]
Figure BDA0001746597290000541
式5中，
X、S3、P1、P2、P3、Q1、Q2、B1、T1、L1、p1、q1及q2各自与上文中的含义相同。
另外，式5中的X、S3、P1、P2、P3、Q1、Q2、B1、T1、L1、p1、q1及q2各自可以为上述的优选基团，P1优选为-CO-NH-、-NH-CO-或-O-。
式5中的-(P2-Q1)q1-优选不存在或者为上述式3-1～式3-3表示的任一结构。
本发明中，核酸复合物优选为具有下述式6-1～6-9表示的结构的核酸复合物。
式6-1：
[化学式77]
Figure BDA0001746597290000551
式6-2：
[化学式78]
Figure BDA0001746597290000552
式6-3：
[化学式79]
Figure BDA0001746597290000553
式6-4：
[化学式80]
Figure BDA0001746597290000561
式6-5：
[化学式81]
Figure BDA0001746597290000562
式6-6：
[化学式82]
Figure BDA0001746597290000571
式6-7：
[化学式83]
Figure BDA0001746597290000572
式6-8：
[化学式84]
Figure BDA0001746597290000581
式6-9：
[化学式85]
Figure BDA0001746597290000582
式6-1～式6-9中，
X、S3、P3、Q2、T1、及L1各自与上文中的含义相同。
本发明中，核酸复合物优选为具有下述式7-1～式7-9中任一者表示的结构的核酸复合物。
式7-1：
[化学式86]
Figure BDA0001746597290000591
式7-2：
[化学式87]
Figure BDA0001746597290000592
式7-3：
[化学式88]
Figure BDA0001746597290000601
式7-4：
[化学式89]
Figure BDA0001746597290000602
式7-5：
[化学式90]
Figure BDA0001746597290000611
式7-6：
[化学式91]
Figure BDA0001746597290000612
式7-7：
[化学式92]
Figure BDA0001746597290000621
式7-8：
[化学式93]
Figure BDA0001746597290000622
式7-9：
[化学式94]
Figure BDA0001746597290000631
式7-1～式7-9中，
X、L1、L2及S3各自与上文中的含义相同。L1与L2可以相同也可以不同，优选相同。
式7-1～式7-9中，也可以通过向各亚烷基部分导入链长不同的亚烷基链、或者将酰胺键等替换为其他键，从而制造具有式7-1～式7-9表示的结构的核酸复合物以外的核酸衍生物。
本发明中，核酸复合物优选为具有下述式11表示的结构的核酸复合物。
式11：
[化学式95]
Figure BDA0001746597290000632
式11中，
L1、L2、S1及S2各自与上文中的含义相同，
P7及P8各自独立，不存在或者为-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，
Q5、Q6及Q7各自独立，不存在或者为取代或未取代的碳原子数1～12的亚烷基或-(CH2CH2O)n8-CH2CH2-，n8为0～99的整数，
B3在本说明书中被称为分支单元(branch unit)，为下述式11-1表示的任一结构，曲折线处各自是指与Q5及Q6的连接键，
式11-1：
[化学式96]
Figure BDA0001746597290000651
q5及q6各自独立地为0～10的整数。
P7不存在或者为-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，优选为-O-、-NH-CO-或-CO-NH-，更优选为-O-或-NH-CO-。P7为例如-O-时，具有苯环-O-这样的部分结构。
P8不存在或者为-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，当P8存在时，优选为-CO-O-或-CO-NH-，更优选为-CO-NH-。P8为例如-CO-NH-时，具有Q6-CO-NH-这样的部分结构。
Q5、Q6及Q7各自独立，不存在或者为取代或未取代的碳原子数1～12的亚烷基或-(CH2CH2O)n8-CH2CH2-，n8为0～99的整数，优选为取代或未取代的碳原子数1～12的亚烷基，更优选为未取代的碳原子数1～12的亚烷基，进一步优选为未取代的碳原子数1～6的亚烷基，更进一步优选为未取代的碳原子数1～4的亚烷基。
-(P7-Q5)q5-为-O-(CH2)m15-NH-及-NH-CO-(CH2)m16-NH-，m15及m16优选各自独立地为1～10的整数。
本发明中，核酸复合物优选为具有下述式12-1～式12-12中任一者表示的结构的核酸复合物。
式12-1：
[化学式97]
Figure BDA0001746597290000661
式12-2：
[化学式98]
Figure BDA0001746597290000671
式12-3：
[化学式99]
Figure BDA0001746597290000672
式12-4：
[化学式100]
Figure BDA0001746597290000681
式12-5：
[化学式101]
Figure BDA0001746597290000682
式12-6：
[化学式102]
Figure BDA0001746597290000691
式12-7：
[化学式103]
Figure BDA0001746597290000692
式12-8：
[化学式104]
Figure BDA0001746597290000701
式12-9：
[化学式105]
Figure BDA0001746597290000702
式12-10：
[化学式106]
Figure BDA0001746597290000703
式12-11：
[化学式107]
Figure BDA0001746597290000711
式12-12：
[化学式108]
Figure BDA0001746597290000712
式12-1～12-12中，
X、L1、L2、S1及S2各自与上文中的含义相同，n1’～n12’各自独立地为1～10的整数。
对于本发明的核酸复合物而言，在式1表示的核酸复合物中，优选为同时具有式2及式11的结构的核酸复合物，该核酸复合物中，为式11的结构，且式2可以为式4-1～式4-9，也可以为式6-1～式6-9，还可以为式7-1～式7-9，当式2为式4-1～式4-9、式6-1～式6-9或式7-1～式7-9时，式11可以为式12-1～式12-12。对于本发明的核酸复合物而言，在式1表示的核酸复合物中，更优选为下述核酸复合物：同时具有式4-1～式4-9中任一个结构及式12-1～式12-12中任一个结构的核酸复合物；同时具有式6-1～式6-9中任一个结构及式12-1～式12-12中任一个结构的核酸复合物；同时具有式7-1～式7-9中任一个结构及式12-1～式12-12中任一个结构的核酸复合物。
对于本发明的核酸复合物而言，可在氢离子与任一氮原子上的孤立电子对进行了配位的情况下与药学上可允许的阴离子形成盐。
本发明中，作为药学上可允许的阴离子，可举出例如：氯化物离子、溴化物离子、硝酸根离子、硫酸根离子、磷酸根离子等无机离子；乙酸根离子、草酸根离子、马来酸根离子、富马酸根离子、柠檬酸根离子、苯甲酸根离子、甲磺酸根离子等有机酸根离子等。
对本发明的核酸复合物的制造方法进行说明。需要说明的是，在以下所示的制造方法中，当定义的基团在该制造方法的条件下发生变化或不适于实施该制造方法时，可通过使用有机合成化学中常用的保护基的导入及除去方法[例如，有机合成中的保护基，第3版(Protective Groups in Organic Synthesis，third edition)，格林(T.W.Greene)著，John Wiley&Sons Inc.(1999年)等中记载的方法]等来制造目标化合物。另外，还可根据需要改变取代基导入等反应工序的顺序。
式1表示的核酸复合物也可通过固相合成来进行合成。
式1表示的核酸复合物可参考作为核酸复合物而已知的连接结构的合成方法来进行合成。
式1表示的核酸复合物中的、以S1作为接头的L1-苯环单元、以S2作为接头的L2-苯环单元的合成例如以式2表示的核酸复合物为例进行说明。
式2表示的核酸复合物中的L1-苯环单元、L2-苯环单元通过P1、P2、P3、P4、P5、及P6以及T1及T2进行连结。
P1、P2、P3、P4、P5、及P6以及T1及T2的-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-键可参考例如第4版实验化学讲座19“有机化合物的合成I”丸善(1992年)、第4版实验化学讲座20“有机化合物的合成II”丸善(1992年)等中记载的键合反应的方法、并选择适于形成式2表示的结构的原料从而适当进行合成。
另外，从苯环起依次键合具有Q1作为部分结构的化合物、具有B1作为部分结构的化合物，由此能够制造L1-苯环单元的部分结构。
另行合成具有L1和Q2作为部分结构的化合物，并使具有L1和Q2作为部分结构的化合物与具有L1-苯环单元的部分结构(所述L1-苯环单元的部分结构具有苯环、Q1及B1作为部分结构)的化合物键合，由此能够制造L1-苯环单元结构。
关于L2-苯环单元也是同样的，从苯环起依次键合具有Q3作为部分结构的化合物、具有B2作为部分结构的化合物，由此能够制造L2-苯环单元的部分结构。
另行合成具有L2和Q4作为部分结构的化合物，并使具有L2和Q4作为部分结构的化合物与具有L2-苯环单元的部分结构(所述L2-苯环单元的部分结构具有苯环、Q3及B2作为部分结构)的化合物键合，由此能够制造L2-苯环单元结构。
关于具有Q1作为部分结构的化合物、具有Q3作为部分结构的化合物，可举出在碳原子数1～10的亚烷基或-(CH2CH2O)n-CH2CH2-的两末端具有羟基、羧基、氨基、巯基的化合物。
关于具有B1作为部分结构的化合物、具有B2作为部分结构的化合物，可举出具有下述式2-1表示的任一结构且在各结构中的末端的黑圆点处各自具有羟基、羧基、氨基或巯基的化合物。
式2-1：
[化学式109]
Figure BDA0001746597290000731
关于具有B1作为部分结构的化合物、具有B2作为部分结构的化合物的具体例，可举出乙二醇、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、Tris、亚氨基二乙酸、2-氨基-1,3-丙二醇等，优选为谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、亚氨基二乙酸。
在合成具有L1、Q2及B1作为部分结构的化合物之后，与具有Q1和苯环的化合物键合，由此可制造L1-苯环单元结构。
在合成具有L2、Q4及B2作为部分结构的化合物之后，与具有Q3和苯环的化合物键合，由此可制造L2-苯环单元结构。
本发明中，作为[L1-T1-(Q2-P3)q2-]p1-B1-(P2-Q1)q1-P1-的部分结构、与作为[L2-T2-(Q3-P6)q4-]p2-B2-(P5-Q3)q3-P2-的部分结构可以相同或不同，优选相同。
作为与糖配体的L1-T1-Q2相当的单元，可举出例如L3-T1-Q2-COOH、L3-T1-(Q2-P3)q2-1-Q2-NH2等。具体而言，可举出L3-O-碳原子数1～12的亚烷基-COOH、L3-碳原子数1～12的亚烷基-CO-NH-碳原子数2～12的亚烷基-NH2等。
L3只要为通过脱保护而成为L1的糖配体衍生物则没有特别限定。作为糖配体的取代基，只要为糖类化学领域中常用的取代基则没有特别限定，优选为Ac基。
关于以S1作为接头的L1-苯环单元、以S2作为接头的L2-苯环单元的合成，具体而言，可参考实施例中记载的方法为参考，适当增减亚烷基链的碳原子数，或者使用将末端氨基、末端羧基转化为可形成-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-键的基团的化合物而进行合成。另外，关于L1的糖配体，在实施例中示例有甘露糖或N-乙酰半乳糖胺，但也可以变更为其他糖配体来实施。
关于式1表示的核酸复合物中的、以S3作为接头的X-苯环单元的合成，例如以式11表示的核酸复合物为例进行说明。
式11表示的核酸复合物中的X-苯环单元除了寡核苷酸的键以外还具有由P7及P8表示的键。
P7及P8的-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-键可参考例如第4版实验化学讲座19“有机化合物的合成I”丸善(1992年)、第4版实验化学讲座20“有机化合物的合成II”丸善(1992年)中记载的键合反应的方法、并选择适于形成式11表示的结构的原料从而适当进行合成。
另外，从苯环起依次键合具有Q5作为部分结构的化合物、具有B3作为部分结构的化合物，由此能够制造X-苯环单元的部分结构。
另行合成具有X和Q7作为部分结构的化合物、具有X和Q6作为部分结构的化合物，并使具有X和Q7作为部分结构的化合物、具有X和Q6作为部分结构的化合物与具有X-苯环单元的部分结构(所述具有X-苯环单元的部分结构具有苯环及Q5作为部分结构)的化合物键合而构建B3部分，由此能够制造X-苯环单元结构。
具体而言，若以在具有X-苯环单元的部分结构(所述X-苯环单元的部分结构具有苯环及Q5作为部分结构)的化合物的末端具有叠氮基的情况为例，则可通过下述方式来制造X-苯环单元结构：使实施例中公开那样的经末端键合性官能团化的寡核苷酸反应，从而使其环化加成而形成三唑环，构建B3部分。
关于具有Q5作为部分结构的化合物、具有Q6作为部分结构的化合物、具有Q7作为部分结构的化合物，可举出在碳原子数1～10的亚烷基或-(CH2CH2O)n8-CH2CH2-的两末端具有羟基、羧基、氨基、巯基的化合物。
可以分别依次制造L1-苯环单元结构、L2-苯环单元结构、和X-苯环单元结构，优选在合成L1-苯环单元结构及L2-苯环单元结构之后键合X-苯环单元结构。尤其是关于具有寡核苷酸部分的X，优选在接近糖配体复合物合成的最终工序时导入至化合物内。
本发明中，可以以合成中间体的形式得到下述式8～式10表示的化合物。
式8：
[化学式110]
Figure BDA0001746597290000751
(式8中，
R1及R2各自独立地为氢原子、叔丁氧羰基(Boc基)、苄氧羰基(Z基)、9-芴甲氧羰基(Fmoc基)、-CO-R4、或-CO-B4-[(P9-Q8)q7-T3-L3]p3，
P9及T3各自独立，不存在或者为-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，
Q8不存在或者为取代或未取代的碳原子数1～12的亚烷基或-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-，n1为0～99的整数，
B4各自独立地为连接键或下述式8-1表示的任一结构，各结构中的末端的黑圆点各自为与羰基或P9的键合位点，m7、m8、m9及m10各自独立地为0～10的整数，
式8-1：
[化学式111]
Figure BDA0001746597290000761
p3为1、2或3的整数，
q7为0～10的整数，
L3为糖配体，
Y为-O-(CH2)m11-NH-及-NH-CO-(CH2)m12-NH-，m11及m12各自独立地为1～10的整数，
R3为氢原子、叔丁氧羰基、苄氧羰基、9-芴甲氧羰基、-CO-R4、-CO-(CH2CH2O)n2-CH2CH2-N3、或-CO-Q9-B5-(Q10-P10)q8-X1，n2为0～99的整数，
P10不存在或者为-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，
Q9及Q10各自独立，不存在或者为取代或未取代的碳原子数1～12的亚烷基或-(CH2CH2O)n3-CH2CH2-，n3为0～99的整数，
B5为下述式8-2表示的任一结构，曲折线处各自是指与Q9及Q10的连接键，
式8-2：
[化学式112]
Figure BDA0001746597290000771
q8为0～10的整数，
X1为氢原子或固相载体，
R4为经选自下述组中的1个或2个取代基取代的碳原子数2～10的烷基，所述组由经叔丁氧羰基、苄氧羰基、9-芴甲氧羰基取代或未经取代的氨基、羧基、马来酰亚胺基、及芳烷基氧基羰基组成。)
本发明中，可以以合成中间体的形式得到下述式9表示的化合物。
式9：
[化学式113]
Figure BDA0001746597290000781
(式9中，
R5及R6各自独立地为氢原子、叔丁氧羰基、苄氧羰基、9-芴甲氧羰基、-CO-R4’、或-CO-Q11-(P11-Q11’)q9-T4-L4，
P11及T4各自独立，不存在或者为-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，
Q11及Q11’不存在或者为取代或未取代的碳原子数1～12的亚烷基或-(CH2CH2O)n4-CH2CH2-，n4为0～99的整数，
q9为0～10的整数，
L4为糖配体，
Y’为-O-(CH2)m11’-NH-及-NH-CO-(CH2)m12’-NH-，m11’及m12’各自独立地为1～10的整数，
R3’为氢原子、叔丁氧羰基、苄氧羰基、9-芴甲氧羰基、-CO-R4’、-CO-(CH2CH2O)n2’-CH2CH2-N3、或-CO-Q9’-B5’-(Q10’-P10’)q8’-X1’，n2’为0～99的整数，
P10’不存在或者为-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，
Q9’及Q10’各自独立，不存在或者为取代或未取代的碳原子数1～12的亚烷基或-(CH2CH2O)n3’-CH2CH2-，n3’为0～99的整数，
B5’为下述式9-1表示的任一结构，曲折线处各自是指与Q9’及Q10’的连接键，
式9-1：
[化学式114]
Figure BDA0001746597290000791
q8’为0～10的整数，
X1’为氢原子或固相载体，
R4’为经选自下述组中的1个或2个取代基取代的碳原子数2～10的烷基，所述组由经叔丁氧羰基、苄氧羰基、9-芴甲氧羰基取代或未经取代的氨基、羧基、马来酰亚胺基、及芳烷基氧基羰基组成。)
本发明中，可以以合成中间体的形式得到下述式10表示的化合物。
式10：
[化学式115]
Figure BDA0001746597290000801
式10中，
R7及R8各自独立地为羟基、叔丁氧基、苄氧基、-NH-R10、或-NH-Q12-(P12-Q12’)q10-T4-L4，
P12及T4各自独立，不存在或者为-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，
Q12及Q12’不存在或者为取代或未取代的碳原子数1～12的亚烷基或-(CH2CH2O)n2-CH2CH2-，n2为0～99的整数，
L4为糖配体，
Y2为-O-(CH2)m9-NH-及-NH-CO-(CH2)m10-NH-，m9、m10各自独立地为1～10的整数，
q10为0～10的整数，
R9为氢原子、叔丁氧羰基、苄氧羰基、9-芴甲氧羰基、-CO-R10、-CO-(CH2CH2O)n6-CH2CH2-N3、或-CO-Q13-B6-(Q14-P13)q11-X2，n6为0～99的整数，
P13不存在或者为-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-S-CO-、-NH-CO-、-CO-O-、-CO-S-或-CO-NH-，
Q13及Q14各自独立，不存在或者为取代或未取代的碳原子数1～12的亚烷基或-(CH2CH2O)n7-CH2CH2-，n7为0～99的整数，
B6为下述式10-1表示的任一结构，曲折线处各自是指与Q13及Q14的连接键，
式10-1：
[化学式116]
Figure BDA0001746597290000821
q11为0～10的整数，
X2为氢原子或固相载体，
R10为经选自下述组中的1个或2个取代基取代的碳原子数2～10的烷基，所述组由经叔丁氧羰基、苄氧羰基、9-芴甲氧羰基取代或未经取代的氨基、羧基、马来酰亚胺基、及芳烷基氧基羰基组成。)
以下，示出与本发明相关的制造方法作为一例。需要说明的是，在与以下的制造方法1～制造方法17相关的记载中，存在使用与本发明的核酸衍生物等中的式1～式12表示的化合物中相同的符号来作为表示基团的符号的情况，但两者应分开理解，并非通过针对制造方法1～制造方法12所记载的基团的说明来限定性地解释本发明。另外，关于本发明中的核酸衍生物，在制造方法1～制造方法17中，将表示寡核苷酸的X记载为-O-X。
制造方法1
对于本发明中的核酸衍生物而言，可以以具有式(I’)表示的部分结构的化合物的制造方法的形式来示例其制造方法。
[化学式117]
Figure BDA0001746597290000831
(式中，P1为Fmoc等可利用碱进行脱保护的保护基，DMTr表示4,4’-二甲氧基三苯甲基，R表示糖配体-系链单元，R’表示R中的糖配体的各羟基经乙酰基等可利用碱进行脱保护的保护基保护的基团，Polymer表示固相载体，Q’为-CO-。)
工序1
化合物(I-B)可通过下述方式制造：在吡啶等溶剂中，在根据需要而添加的共溶剂的存在下，于0℃与100℃之间的温度，使化合物(I-A)与4,4’-二甲氧基三苯基氯甲烷反应5分钟～100小时。
作为共溶剂，可举出例如甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、乙醚、四氢呋喃、1,2-甲氧基乙烷、二氧杂环己烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、吡啶、水等，它们可以单独使用或混合而使用。
工序2
化合物(I-C)可通过下述方式制造：以无溶剂的条件下或在溶剂中，在1～1000当量的仲胺存在下，于室温与200℃之间的温度，使化合物(I-B)反应5分钟～100小时。
作为溶剂，可举出例如甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、甲苯、乙酸乙酯、乙腈、乙醚、四氢呋喃、1,2-甲氧基乙烷、二氧杂环己烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、吡啶、水等，它们可以单独使用或混合而使用。
作为仲胺，可举出例如二乙胺、哌啶等。
工序3
化合物(1-E)可通过下述方式制造：在无溶剂的条件下或在溶剂中，在1～30当量的碱、缩合剂及根据需要添加的0.01～30当量的添加剂的存在下，于室温与200℃之间的温度，使化合物(I-C)与化合物(I-D)反应5分钟～100小时。
作为溶剂，可举出工序2中示例的溶剂。
作为碱，可举出例如碳酸铯、碳酸钾、氢氧化钾、氢氧化钠、甲醇钠、叔丁醇钾、三乙胺、二异丙基乙基胺、N-甲基吗啉、吡啶、1,8-二氮杂双环[5.4.0]-十一碳-7-烯(DBU)、N,N-二甲基-4-氨基吡啶(DMAP)等。
作为缩合剂，可举出例如1,3-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺·盐酸盐(EDC)、羰基二咪唑、苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐、(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基磷鎓六氟磷酸盐、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物等。
作为添加剂，可举出例如1-羟基苯并三唑(HOBt)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)等。
化合物(I-D)可通过已知的方法(例如参见Journal of American ChemicalSociety，136，16958，(2014))或以其为基准的方法而得到。
工序4
化合物(I-F)可通过下述方式制造：在溶剂中，在1～30当量的碱存在下，于室温与200℃之间的温度，使化合物(I-E)与丁二酸酐反应5分钟～100小时。
作为溶剂，可举出工序2中示例的溶剂。
作为碱，可举出工序3中示例的碱。
工序5
化合物(I-G)可通过下述方式制造：在无溶剂的条件下或在溶剂中，在1～30当量的碱、缩合剂及根据需要添加的0.01～30当量的添加剂的存在下，于室温与200℃之间的温度，使化合物(I-F)与末端经氨基化的固相载体反应5分钟～100小时，然后，于室温与200℃之间的温度与乙酸酐/吡啶溶液反应5分钟～100小时。
作为溶剂，可举出工序2中示例的溶剂。
作为碱、缩合剂及添加剂，分别可举出工序3中示例的物质。
作为经氨基化的固相载体，可举出例如长链烷基胺细孔性玻璃(LCAA-CPG)等，它们可以以市售品的形式得到。
工序6
具有式(I’)表示的糖配体-系链-分支单元的核酸复合物可通过下述方式制造：使用化合物(I-G)，利用已知的寡核苷酸化学合成法将对应的核苷酸链伸长，然后，进行从固相的脱离、保护基的脱保护及纯化。
作为已知的寡核苷酸化学合成法，可举出亚磷酰胺法、硫代磷酸酯法、磷酸三酯法、CEM法(参见Nucleic Acids Research，35，3287(2007))等，例如，可通过ABI3900高通量核酸合成仪(Applied Biosystems公司制)来合成。
对于从固相的脱离、脱保护而言，可通过在化学合成寡核苷酸后，在溶剂中或在无溶剂的条件下，于-80℃至200℃之间的温度，用碱处理10秒至72小时，从而进行制造。
作为碱，可举出例如氨、甲胺、二甲胺、乙胺、二乙胺、异丙胺、二异丙胺、哌啶、三乙胺、乙二胺、1,8-二氮杂双环[5.4.0]-十一碳-7-烯(DBU)、碳酸钾等。
作为溶剂，可举出水、甲醇、乙醇、THF等。
寡核苷酸的纯化可利用C18反相柱或阴离子交换柱、优选前述两种方法的组合来进行。理想的是，纯化后的核酸复合物纯度为90％以上，优选为95％以上。
另外，上述工序3中，也可以根据需要将化合物(I-D)分割为两个单元，分两个阶段与化合物(I-C)缩合来进行。具体而言，例如R-Q’为R-NH-CO-Q4’-CO-的情况下(Q4’为取代或未取代的碳原子数1～12的亚烷基)，在工序3中，利用与工序3同样的方法使化合物(I-C)与CH3CH2-O-CO-Q4’-CO-OH(Q4’与上文中的含义相同)缩合，将得到的化合物的乙酯在乙醇、水等溶剂中用氢氧化锂等碱进行水解，然后进一步与R’-NH2(R’与上文中的含义相同)缩合，由此可得到目标化合物。需要说明的是，CH3CH2-O-CO-Q4’-CO-OH(Q4’与上文中的含义相同)及R’-NH2(R’与上文中的含义相同)可利用已知的方法(例如参见Journal of AmericanChemical Society，136，16958(2014))或以其为基准的方法得到。此处，Q4’中，取代或未取代的碳原子数1～12的亚烷基中的取代基及亚烷基部分与上述相同。
作为示例示出了Q为-CO-的情况，但对于Q并非-CO-时的化合物而言，也可通过适当变更Q的结构，利用与上述同样的方法、已知的方法或它们的组合，并适当变更反应条件而制备。
制造方法2
对于本发明中的核酸衍生物而言，可以以具有式(II’)表示的部分结构的化合物的制造方法的形式来示例其制造方法。
[化学式118]
Figure BDA0001746597290000871
(式中，DMTr、R、R’、X、Q’、及Polymer与上文中的含义相同。TBDMS表示叔丁基二甲基甲硅烷基，Fmoc表示9-芴甲氧羰基)
工序7
化合物(II-A)可通过下述方式制造：在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等溶剂中，优选在2当量的碱的存在下，于0℃～100℃之间的温度，使化合物(I-A)、叔丁基二甲基氯硅烷及二甲基氨基吡啶反应5分钟～100小时。
作为碱，可举出制造方法1的工序3中示例的碱。
工序8
化合物(II-B)可使用化合物(II-A)、在与制造方法1的工序1同样的条件下制造。
工序9
化合物(II-C)可通过下述方式制造：在溶剂中，于室温与200℃之间的温度，使化合物(II-B)与四正丁基氟化铵(TBAF)反应5分钟～100小时。
作为溶剂，可举出工序2中示例的溶剂。
工序10
化合物(II-D)可使用化合物(II-C)、在与制造方法1的工序2同样的条件下制造。
工序11
化合物(II-E)可使用化合物(II-D)及化合物(I-D)、在与制造方法1的工序3同样的条件下制造。
工序12～14
化合物(II’)可使用化合物(II-E)、在与制造方法1的工序4～工序6同样的条件下制造。
另外，在上述工序11中，也可根据需要将化合物(I-D)分割为两个单元，分两个阶段与化合物(II-C)缩合来进行。具体而言，例如R-Q’为-NH-CO-Q4’-CO-的情况下(Q4’为取代或未取代的碳原子数1～12的亚烷基)，在工序11中，利用与工序11同样的方法，使化合物(II-C)与CH3CH2-O-CO-Q4’-CO-OH(Q4’与上文中的含义相同)缩合，将得到的化合物的乙酯在乙醇、水等溶剂中用氢氧化锂等碱进行水解，然后进一步与R’-NH2(R’与上文中的含义相同)缩合，由此可得到目标化合物。需要说明的是，CH3CH2-O-CO-Q4’-CO-OH(Q4’与上文中的含义相同)及R’-NH2(R’与上文中的含义相同)可利用已知的方法(例如参见Journal ofAmerican Chemical Society，136，16958(2014))或以其为基准的方法而得到。
作为示例示出了Q为-CO-的情况，但对于Q并非-CO-时的化合物而言，也可通过适当变更Q的结构，利用与上述同样的方法、已知的方法或它们的组合，并适当变更反应条件而制备。
制造方法3
对于本发明中的核酸衍生物而言，可以以具有式(III’)表示的部分结构的化合物的制造方法的形式来示例其制造方法。
[化学式119]
Figure BDA0001746597290000901
(式中，DMTr、Fmoc、R、R’、Q’、X及Polymer与上文中的含义相同。)
化合物(III’)可使用化合物(III-A)、在与制造方法1的工序1至工序6同样的条件下制造。需要说明的是，化合物(III-A)可以以市售品的形式得到。
工序15
化合物(III-B)可使用化合物(III-A)、在与制造方法1的工序1同样的条件下制造。
化合物(III-A)可以以市售品的形式购入。
工序16
化合物(III-C)可使用化合物(III-B)、在与制造方法1的工序2同样的条件下制造。
工序17
化合物(III-E)可使用化合物(III-C)、在与制造方法1的工序3同样的条件下制造。
工序18～20
化合物(III’)可使用化合物(III-E)、在与制造方法1的工序4～工序6同样的条件下制造。
另外，在上述工序17中，也可根据需要将化合物(I-D)分割为两个单元，分两个阶段与化合物(III-C)缩合来进行。具体而言，例如R-Q’为-NH-CO-Q4’-CO-的情况下(Q4’为取代或未取代的碳原子数1～12的亚烷基)，在工序17中，利用与工序17同样的方法，使化合物(III-C)与CH3CH2-O-CO-Q4’-CO-OH(Q4’与上文中的含义相同)缩合，将得到的化合物的乙酯在乙醇、水等溶剂中用氢氧化锂等碱进行水解，然后进一步与R’-NH2(R’与上文中的含义相同)缩合，由此可得到目标化合物。需要说明的是，CH3CH2-O-CO-Q4’-CO-OH(Q4’与上文中的含义相同)及R’-NH2(R’与上文中的含义相同)可利用已知的方法(例如参见Journal ofAmerican Chemical Society，136，16958(2014))或以其为基准的方法而得到。
作为示例示出了Q为-CO-的情况，但对于Q并非-CO-时的化合物而言，也可通过适当变更Q的结构，利用与上述同样的方法、已知的方法或它们的组合，适当变更反应条件而制备。
制造方法4
对于本发明中的核酸衍生物而言，可以以具有式(IV’)表示的部分结构的化合物的制造方法的形式来示例其制造方法。
[化学式120]
Figure BDA0001746597290000921
(式中，DMTr、Fmoc、R、R’、Q’、X及Polymer与上文中的含义相同。)
化合物(IV’)可使用化合物(IV-A)、在与制造方法1的工序1至工序6同样的条件下制造。需要说明的是，化合物(IV-A)可以以市售品的形式得到。
另外，在上述工序23中，也可根据需要将化合物(I-D)分割为两个单元，分两个阶段与化合物(IV-C)缩合来进行。具体而言，例如R’-Q’为-NH-CO-Q4’-CO-的情况下(Q4’为取代或未取代的碳原子数1～12的亚烷基)，在工序23中，利用与工序23同样的方法使化合物(IV-C)与CH3CH2-O-CO-Q4’-CO-OH(Q4’与上文中的含义相同)缩合，将得到的化合物的乙酯在乙醇、水等溶剂中用氢氧化锂等碱进行水解，然后进一步与R’-NH2(R’与上文中的含义相同)缩合，由此可得到目标化合物。需要说明的是，CH3CH2-O-CO-Q4’-CO-OH(Q4’与上文中的含义相同)及R’-NH2(R’与上文中的含义相同)可利用已知的方法(例如参见Journal ofAmerican Chemical Society，136，16958(2014))或以其为基准的方法而得到。
作为示例示出了Q为-CO-的情况，但对于Q并非-CO-时的化合物，也可通过适当变更Q的结构，利用与上述同样的方法、已知的方法或它们的组合，并适当变更反应条件而制备。
制造方法5
对于本发明中的核酸衍生物而言，可以以具有式(V’)表示的部分结构的化合物的制造方法的形式来示例其制造方法。
[化学式121]
Figure BDA0001746597290000931
(式中，DMTr、R、R’、X、Q’、TBDMS、Fmoc及Polymer与上文中的含义相同。)
化合物(V’)可使用化合物(IV-A)、在与制造方法2的工序1至工序7同样的条件下制造。需要说明的是，化合物(IV-A)可以以市售品的形式得到。
另外，在上述工序31中，也可根据需要将化合物(I-D)分割为两个单元，分两个阶段与化合物(V-D)缩合来进行。具体而言，例如R’-Q’为-NH-CO-Q4’-CO-的情况下(Q4’为取代或未取代的碳原子数1～12的亚烷基)，在工序31中，利用与工序31同样的方法使化合物(V-D)与CH3CH2-O-CO-Q4’-CO-OH(Q4’与上文中的含义相同)缩合，将得到的化合物的乙酯在乙醇、水等溶剂中用氢氧化锂等碱进行水解，然后进一步与R’-NH2(R’与上文中的含义相同)缩合，由此可得到目标化合物。需要说明的是，CH3CH2-O-CO-Q4’-CO-OH(Q4’与上文中的含义相同)及R’-NH2(R’与上文中的含义相同)可利用已知的方法(例如参见Journal ofAmerican Chemical Society，136，16958(2014))或以其为基准的方法而得到。
作为示例示出了Q为-CO-的情况，但对于Q并非-CO-时的化合物，也可通过适当变更Q-OH的结构，利用与上述同样的方法、已知的方法或它们的组合，并适当变更反应条件而制备。
制造方法6
以下示例在寡核苷酸的5’末端键合有糖配体-系链-分支单元的本发明的核酸复合物的制造方法。
[化学式122]
Figure BDA0001746597290000941
(式中，R、R’、Q’、DMTr及X与上文中的含义相同)
工序35
化合物(I-H)可通过下述方式制造：在无溶剂的条件下或在溶剂中，在碱及反应促进剂共存下，于室温与200℃之间的温度，使化合物(II-E)与2-氰乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺反应5分钟～100小时。
作为溶剂，可举出制造方法1的工序2中示例的溶剂。
作为碱，可举出制造方法1的工序3中示例的碱。
作为反应促进剂，可举出例如1H-四唑、4,5-二氰基咪唑、5-乙硫基四唑、5-苄硫基四唑等，可以以市售品的形式购入。
工序36
将寡核苷酸链伸长，最后使用化合物(I-H)，用糖配体-系链-分支单元对寡核苷酸的5’末端进行修饰，然后进行从固相的脱离、保护基的脱保护及纯化，由此能够制造化合物(I”)。此处，从固相的脱离、保护基的脱保护及纯化中，可分别以与制造方法1的工序7同样的方式进行制造。
制造方法7
以下示例在寡核苷酸的5’末端键合有糖配体-系链-分支单元的本发明的核酸复合物的制造方法。
可在与制造方法6的工序35及36同样的条件下进行制造。
[化学式123]
Figure BDA0001746597290000951
(式中，R、R’、Q’、DMTr及X与上文中的含义相同)
制造方法8
以下示例在寡核苷酸的5’末端键合有糖配体-系链-分支单元的本发明的核酸复合物的制造方法。
可在与制造方法6的工序35及36同样的条件下进行制造。
[化学式124]
Figure BDA0001746597290000952
(式中，R、R’、Q’、DMTr及X与上文中的含义相同)
制造方法9
以下示例在寡核苷酸的5’末端键合有糖配体-系链-分支单元的本发明的核酸复合物的制造方法。
可在与制造方法6的工序35及36同样的条件下进行制造。
[化学式125]
Figure BDA0001746597290000961
(式中，R、R’、Q’、DMTr及X与上文中的含义相同)
制造方法10
以下示例在寡核苷酸的5’末端键合有糖配体-系链-分支单元的本发明的核酸复合物的制造方法。
可在与制造方法6的工序35及36同样的条件下进行制造。
[化学式126]
Figure BDA0001746597290000962
(式中，R、R’、Q’、DMTr及X与上文中的含义相同)
制造方法11
将构成双链核酸的在有义链的3’末端或5’末端具有糖配体-系链-分支单元的有义链、和构成双链核酸的反义链各自溶解于水或合适的缓冲液中，并进行混合，由此可得到具有双链核酸的核酸复合物。
作为缓冲液，可举出例如乙酸缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、水等，可以将它们单独或混合而使用。
作为有义链与反义链的混合比，相对于1当量有义链而言，反义链优选为0.5～2当量，更优选为0.9～1.1当量，进一步优选为0.95当量～1.05当量。
另外，可在将该有义链与该反义链混合后适当进行退火处理。退火处理可通过下述方式进行：将有义链与反义链的混合物加热至优选50～100℃、更优选60～100℃、进一步优选80～100℃后，缓慢冷却至室温。
反义链可按照上述的已知寡核苷酸合成法而得到。
制造方法12
对于本发明中的核酸衍生物而言，可以以具有式(VI’)表示的部分结构的化合物的制造方法的形式来示例其制造方法。
[化学式127]
Figure BDA0001746597290000971
(式中，DMTr、R、R’、X、Q’、Polymer、TBS及Fmoc与上文中的含义相同，R0及Rx相同或不同，表示氢原子、C1～C10的亚烷基或C3-C8的亚环烷基，W为C1～C10的亚烷基、C3-C8的亚环烷基，或者可与R0一起形成C4-C8的含氮杂环。)
工序45
化合物(VI-B)可使用化合物(VI-A)、在与制造方法1的工序1同样的条件下制造。
化合物(VI-A)可以以市售品的形式得到、或者利用已知的方法(例如Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters，第11卷，383-386页)或以其为基准的方法而得到。
工序46
化合物(VI-C)可使用化合物(VI-B)、在与制造方法1的工序2同样的条件下进行制造。
工序47
化合物(VI-D)可使用化合物(VI-C)、在与制造方法1的工序3同样的条件下进行制造。
工序48
化合物(VI-E)可使用化合物(VI-D)、在与制造方法1的工序2同样的条件下制造。
工序49
化合物(VI-G)可使用化合物(VI-E)和化合物(VI-F)、在与制造方法1的工序3同样的条件下制造。
工序50
化合物(VI-H)可使用化合物(VI-G)、在与制造方法2的工序9同样的条件下制造。
工序51～53
化合物(VI’)可使用化合物(VI-H)、化合物(VI-I)及化合物(VI-J)、在与制造方法1的工序4～6同样的条件下制造。
工序45～53可利用已知的方法(例如国际公开第2015/105083号记载的方法)或以其为基准的方法来实施。
化合物(VI-F)可利用已知的方法(例如，美国化学学会杂志(Journal ofAmerican Chemical Society)，136卷，16958页，2014年记载的方法)或以其为基准的方法而得到。
制造方法13
式2中P1及P4为-NH-CO-、-O-CO-或-S-CO-的糖配体-系链单元可利用以下的方法制造。
[化学式128]
Figure BDA0001746597290000991
(式中，Q1、Q2、Q3、Q4、Q5、P2、P3、P5、P6、P7、T1、T2、L1、L2、q1、q2、q3及q4各自与上文中的含义相同，q1’表示比q1小1的整数，q2’表示比q2小1的整数，P1’及P4’各自独立地表示-CO-O-、-CO‐NH‐或-CO-S-，Z表示H、OH、NH2、SH、氯原子、溴原子、碘原子、甲磺酰氧基、对甲苯磺酰氧基或羧酸，B1’及B2’表示下述式的结构体中的任一者，PG1、PG2、PG3、PG4、PG5、PG6及PG7各自表示合适的保护基。)
式：
[化学式129]
Figure BDA0001746597290001001
m1、m2、m3或m4各自独立地表示0～10的整数。
工序54
化合物(VII-C)可通过下述方式制造：在四氢呋喃等溶剂中，添加负载于聚合物上的三苯基膦，在冰冷却下，使化合物(VII-A)和化合物(VII-B)与偶氮二羧酸二异丙酯的甲苯溶液反应。
作为溶剂，可举出制造工序1的工序2中示例的溶剂。
化合物(VII-A)可以以市售品的形式得到。
工序55
化合物(VII-D)可使用化合物(VII-C)、在甲醇等溶剂中、在冰冷却下、在碱的存在下进行反应而制造。
作为溶剂，可举出制造工序1的工序2中示例的溶剂。
作为碱，可举出制造工序1的工序3中示例的碱。
工序56
化合物(VII-F)可使用化合物(VII-D)及化合物(VII-E)、在与制造工序1的工序3同样的条件下制造。
工序57
化合物(VII-H)可使用化合物(VII-F)及化合物(VII-G)、在与制造工序1的工序3同样的条件制造。
工序58
化合物(VII-J)可使用化合物(VII-H)及化合物(VII-I)、在与制造工序1的工序3同样的条件下制造。
工序59
化合物(VII-L)可使用化合物(VII-J)及化合物(VII-K)、在与制造工序1的工序3同样的条件下制造。
工序60
化合物(VII-N)可使用化合物(VII-L)及化合物(VII-M)、在与制造工序1的工序3同样的条件下制造。
工序61～63
化合物(VII’)可使用化合物(VII-O)、化合物(VII-P)及化合物(VII-Q)、在与制造工序1的工序3同样的条件制造。
工序DP
可通过适当使用有机合成化学中常用的方法[例如，有机合成中的保护基第3版(Protective Groups in Organic Synthesis，third edition)、格林(T.W.Greene)著，John Wiley&Sons Inc.(1999年)等中记载的方法等]来制造。
化合物(VII-B)、化合物(VII-E)、化合物(VII-G)、化合物(VII-I)、化合物(VII-K)、化合物(VII-M)、化合物(VII-O)、化合物(VII-P)及化合物(VII-Q)可以以市售品的形式得到、或者通过将“实验化学讲座第4版有机合成，p.258，丸善(1992年)”、“March’sAdvanced Organic Chemistry：Reactions，Mechanisms，and Structure，7th Edition”中记载的方法进行组合或以其为基准的方法而得到。
制造方法14
式4中P7为-O-的单元可利用以下的方法制造。
[化学式130]
Figure BDA0001746597290001021
(式中，Q5、Q6、P8、q5各自与上文中的含义相同，Z2表示H、OH、NH2或SH，PG9及PG10各自表示合适的保护基，LC表示糖配体-系链单元，E表示羧酸或马来酰亚胺。)
工序64
化合物(VIII-C)可使用化合物(VIII-A)及化合物(VIII-B)、在与制造工序1的工序3同样的条件下制造。
化合物(VIII-B)可以以市售品的形式得到、或者通过将“实验化学讲座第4版有机合成，p.258，丸善(1992年)”、“March’s Advanced Organic Chemistry：Reactions，Mechanisms，and Structure，7th Edition”中记载的方法组合或以其为基准的方法而得到。
工序65
化合物(VIII’)可使用化合物(VIII-C)及化合物(VIII-D)、在与制造工序1的工序3同样的条件下制造。
化合物(VIII-D)可以以市售品的形式得到、或者通过将“实验化学讲座第4版有机合成，p.258，丸善(1992年)”、“March’s Advanced Organic Chemistry：Reactions，Mechanisms，and Structure，7th Edition”中记载的方法进行组合或以其为基准的方法而得到。
工序DP
可通过适当使用有机合成化学中常用的方法[例如，有机合成中的保护基第3版(Protective Groups in Organic Synthesis，third edition)、格林(T.W.Greene)著，John Wiley&Sons Inc.(1999年)等中记载的方法等]来制造。
制造方法15
式2中P1及P4为-O-的糖配体-系链单元可利用以下的方法制造。
[化学式131]
Figure BDA0001746597290001031
(式中，Q1、Q2、Q3、Q4、P2、P3、P5、P6、T1、T2、L1、L2、q1、q2、q3、q4、Z、B1’或B2’各自与上文中的含义相同，q1’表示比q1小1的整数，q2’表示比q2小1的整数，PG8、PG9、PG10、PG11、PG12、PG13及PG14各自表示合适的保护基)
式：
[化学式132]
Figure BDA0001746597290001041
m1、m2、m3及m4与上文中的含义相同。
工序66
化合物(IX-C)可通过下述方式制造：将化合物(IX-A)和化合物(IX-B)溶解于N,N’-二甲基甲酰胺等溶剂中，加入碳酸氢钾等碱，于室温～200℃反应5分钟～100小时。
作为溶剂，可举出制造工序1的工序2中示例的溶剂。
作为碱，可举出制造工序1的工序3中示例的碱。
工序67
化合物(IX-E)可通过下述方式制造：将化合物(IX-C)和化合物(IX-D)溶解于N,N’-二甲基甲酰胺等溶剂中，加入碳酸氢钾等碱，于室温～200℃反应5分钟～100小时。
作为溶剂，可举出制造工序1的工序2中示例的溶剂。
作为碱，可举出制造工序1的工序3中示例的碱。
化合物(IX-A)可以以市售品的形式得到。
工序68
化合物(IX-G)可使用化合物(IX-E)及化合物(IX-F)、在与制造工序1的工序3同样的条件下制造。
工序69
化合物(IX-I)可使用化合物(IX-G)及化合物(IX-H)、在与制造工序1的工序3同样的条件下制造。
工序70
化合物(IX-K)可使用化合物(IX-I)及化合物(IX-J)、在与制造工序1的工序3同样的条件下制造。
工序71
化合物(IX-M)可使用化合物(IX-K)及化合物(IX-L)、在与制造工序1的工序3同样的条件下制造。
工序72-74
化合物(IX’)可使用化合物(IX-M)、化合物(IX-N)、化合物(IX-O)及化合物(IX-P)、在与制造工序1的工序3同样的条件下制造。
工序DP
可通过适当使用有机合成化学中常用的方法[例如，有机合成中的保护基第3版(Protective Groups in Organic Synthesis，third edition)，格林(T.W.Greene)著，John Wiley&Sons Inc.(1999年)等中记载的方法等]来制造。
化合物(IX’-B)、化合物(IX’-D)、化合物(IX’-F)、化合物(IX’-H)、化合物(IX’-J)、化合物(IX’-L)、化合物(IX’-N)、化合物(IX’-O)及化合物(IX’-P)可以以市售品的形式得到、或者通过将“实验化学讲座第4版有机合成，p.258，丸善(1992年)”、“March’sAdvanced Organic Chemistry：Reactions，Mechanisms，and Structure，7th Edition”中记载的方法组合或以其为基准的方法而得到。
制造方法16
作为式1～式7的核酸复合物的制造方法，也可使用以下的方法。
[化学式133]
Figure BDA0001746597290001051
(式中，LC、Q5、P8、Q6与上文中的含义相同，X1-SH表示在末端具有包含经SH取代的C1～C10烷基的结构的寡核苷酸)
工序75
化合物(X-B)可通过下述方式制造：在溶剂中，于0℃～100℃，使化合物(VIII”)与化合物(X-A)反应10秒～100小时。
作为溶剂，可举出水、磷酸缓冲液、乙酸钠缓冲液、二甲基亚砜等，它们可以单独使用或混合而使用。
化合物(VIII’)可通过使用制造方法14而得到。
化合物(X-B)也可通过已知的方法(例如生物偶联物化学(BioconjugateChemistry)，第21卷，187-202页，2010年；或Current Protocols in Nucleic AcidChemistry，2010年，9月，CHAPTER：Unit 4.41)或以其为基准的方法而得到。
工序76
化合物(X’)可通过下述方式制造：使用化合物(X-B)，在碳酸钠水溶液或氨水中等pH为8以上的条件下，于室温与200℃之间的温度，使其反应5分钟～100小时。
制造方法17
作为式1～式7的核酸复合物的制造方法，也可使用以下的方法。
[化学式134]
Figure BDA0001746597290001061
(式中，LC、Q5、P8、Q6与上文中的含义相同，X2-NH2表示在末端具有包含经NH2取代的C1-C10烷基的结构的寡核苷酸)
工序77
化合物(XI-A)可使用化合物(VIII”’)、通过已知的方法(例如生物偶联物化学(Bioconjugate Chemistry)，第26卷，1451-1455页，2015年中记载的方法)或以其为基准的方法而得到。
化合物(VIII”’)可通过使用制造方法14而得到。
工序78
化合物(XI’)可使用化合物(XI-B)、通过已知的方法(例如生物偶联物化学(Bioconjugate Chemistry)，第26卷，1451-1455页，2015年中记载的方法)或以其为基准的方法而得到。
工序79
另外，作为其他方法，化合物(XI’)可通过已知的方法(例如参见生物偶联物化学(Bioconjugate Chemistry)，第22卷，1723-1728页，2011年)或以其为基准的方法、直接从化合物(XI-A)得到。
本说明书中的核酸复合物也可以以例如酸加成盐、金属盐、铵盐、有机胺加成盐、氨基酸加成盐等盐的形式得到。
作为酸加成盐，可举出例如盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐等无机酸盐、乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐等有机酸盐，作为金属盐，可举出例如钠盐、钾盐等碱金属盐、镁盐、钙盐等碱土金属盐、铝盐、锌盐等，作为铵盐，可举出例如铵、四甲基铵等的盐，作为有机胺加成盐，可举出例如吗啉、哌啶等的加成盐，作为氨基酸加成盐，可举出例如赖氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸等的加成盐。
在想要制备本说明书的核酸复合物的盐的情况下，该复合物以期望的盐的形式得到时直接进行纯化即可，另外，以游离形式得到时，可以将该复合物溶解或悬浮于适当的溶剂中，加入相应的酸或碱，进行分离·纯化。另外，在将形成该复合物盐的抗衡离子转化为不同的抗衡离子时，可以将该复合物盐溶解或悬浮于适当的溶剂中，然后加入数当量～大幅过量的酸、碱及/或盐(氯化钠、氯化铵等无机盐等)，并进行分离、纯化。
本说明书的核酸复合物中有时也可存在几何异构体、光学异构体等立体异构体、互变异构体等，所有可能的异构体及它们的混合物均被包括在本发明内。
另外，本说明书的核酸复合物有时也以与水或各种溶剂的加成物的形式存在，这些加成物也被涵盖在本发明内。
此外，本发明的核酸复合物还涵盖分子中的部分或全部原子被质量数不同的原子(同位素)(例如氘原子等)取代而成的物质。
本发明的药物组合物含有式1表示的核酸复合物。本发明的核酸复合物通过具有L1及L2的糖配体而被靶细胞识别，并被导入至细胞内。
对于本发明的核酸复合物而言，可以将其施予至哺乳动物，在生物体内使靶基因的表达降低或停止，由此抑制靶基因的表达，从而用于与靶基因相关的疾病的治疗。
将本发明的核酸复合物作为治疗剂或预防剂使用时，作为施予途径，优选使用治疗时最有效的施予途径，但并没有特别限定，可举出例如静脉内施予、皮下施予及肌肉内施予等，优选为静脉内施予。
施予量根据施予对象的病状、年龄、施予途径等的不同而不同，例如可以以换算为双链寡核苷酸的1天施予量为0.1μg～1000mg的方式施予，更优选以1天施予量为1～100mg的方式施予。
作为适合于静脉内施予或肌肉内施予的制剂，可举出例如注射剂，也可以将制备的液剂直接作为例如注射剂等形态使用，也可通过例如过滤、离心分离等将溶剂从该液剂中除去而使用，还可将该液剂进行冷冻干燥而使用及/或对加入有例如甘露醇、乳糖、海藻糖、麦芽糖或甘氨酸等赋形剂的液剂进行冷冻干燥而使用。
为注射剂的情况下，优选在液剂或者除去了溶剂或进行了冷冻干燥的组合物中混合例如水、酸、碱、各种缓冲液、生理盐水或氨基酸输液等而制备注射剂。另外，还可以添加例如柠檬酸、抗坏血酸、半胱氨酸或EDTA等抗氧化剂、或者甘油、葡萄糖或氯化钠等等渗剂等而制备注射剂。另外，还可加入例如甘油等冷冻保存剂而进行冷冻保存。
实施例
以下，利用参考例、实施例及试验例对本发明具体地进行说明。但是，本发明并不限定于这些实施例及试验例。需要说明的是，实施例及参考例中示出的质子核磁共振光谱(1H NMR)是在270MHz、300MHz或400MHz下测定的，根据化合物及测定条件的不同，有时无法清楚地观测到交换性质子。另外，作为信号的多重度的表述，使用了通常所使用的表述，br是指broad，表示表观上为宽幅的信号。
UPLC分析中使用了以下的条件。
流动相A：含有0.1％甲酸的水溶液，B：乙腈溶液
梯度：流动相B为10％-90％的线性梯度(3分钟)
柱：Waters公司制ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm，内径2.1×50mm)
流速：0.8mL/min
PDA检测波长：254nm(检测范围为190-800nm)
参考例1糖配体单元的合成
[化学式135]
Figure BDA0001746597290001091
化合物2的合成
工序1
将通过美国化学学会杂志(Journal of American Chemical Society)，第136卷,16958-16961页,2014年中记载的方法合成的化合物1(0.8755g,1.9567mmol)溶解于四氢呋喃(10mL)中，将1,3-二环己基碳二亚胺(DCC,0.4247g,2.0584mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(0.2412g,2.0958mmol)于室温搅拌一晚。将从反应混合物中析出的固体除去，在减压下蒸馏除去溶剂。将得到的混合物溶解于N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入2-氨基乙基马来酰亚胺溴酸盐(0.6479g,2.5491mmol)和二异丙基乙基胺(1.7mL,9.7835mmol)，然后于室温搅拌一晚。在减压下，将反应液中的溶剂蒸馏除去，利用反相柱色谱法(水/甲醇＝80/20)使其洗脱，由此得到化合物2(0.8502g,收率76％)。
ESI-MS m/z:570(M+H)+；
1H-NMR(DMSO-D6)δ:1.45-1.56(4H,m),1.78(3H,s),1.90(3H,s),1.97(2H,t,J＝7.0Hz),2.00(3H,s),2.11(3H,s),3.18-3.19(2H,m),3.38-3.45(3H,m),3.64-3.71(1H,m),3.85-3.89(1H,m),4.01-4.04(3H,m),4.48(1H,d,J＝8.6Hz),4.95-4.98(1H,m),5.21(1H,d,J＝3.5Hz),6.99(2H,s),7.81-7.87(2H,m).
化合物4的合成
工序2
将工序1中记载的化合物1(0.9602g,2.1460mmol)溶解于N,N’-二甲基甲酰胺(10mL)中，加入N-Boc-乙二胺(Sigma-Aldrich公司制,0.6877g,4.292mmol)、二异丙基乙基胺(1.90mL,10.87mmol)、及2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(和光纯药工业公司制,1.6437g,4.3229mmol)，于室温搅拌一整夜。向反应液中加入水，用氯仿萃取2次，然后用饱和食盐水对有机层进行洗涤，用无水硫酸镁进行干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去，得到化合物3的粗纯化物。
ESI-MS m/z:590(M+H)+
工序3
将工序2中合成的化合物3(1.2654g,2.1460mmol)溶解于二氯甲烷(15mL)中，加入三氟乙酸(4mL)，于室温搅拌一晚。向反应液中加入水，用乙酸乙酯进行萃取，然后用饱和食盐水对有机层进行洗涤，用无水硫酸镁进行干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去，利用反相柱色谱法(水/甲醇＝80/20)使其洗脱，由此得到化合物4(0.3879g,收率37％)。
ESI-MS m/z:490(M+H)+；
1H-NMR(DMSO-D6)δ:1.46-1.52(4H,m),1.78(3H,s),1.90(3H,s),2.00(3H,s),2.08(2H,t,J＝7.4Hz),2.11(3H,s),2.85(2H,t,J＝6.3Hz),3.27(2H,dd,J＝12.3,6.2Hz),3.67-3.69(1H,m),3.68-3.73(1H,m),3.86-3.90(1H,m),4.01-4.04(3H,m),4.49(1H,d,J＝8.4Hz),4.97(1H,dd,J＝11.3,3.4Hz),5.22(1H,d,J＝3.5Hz),7.86(1H,d,J＝9.1Hz),7.95-8.02(1H,m).
参考例2分支单元的合成
化合物7的合成
[化学式136]
Figure BDA0001746597290001111
工序4
将((2R,3R)-1,3-二羟基丁烷-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(化合物5,Chem-Impex International,Inc公司制,1.50g,4.58mmol)溶解于吡啶(20mL)中，在冰冷却下，加入4,4’-二甲氧基三苯基氯甲烷(东京化成工业公司制,1.71g,5.04mmol)，然后于室温搅拌2小时。将反应液用冰冷却，加入10％柠檬酸水溶液，用乙酸乙酯进行萃取，然后用饱和食盐水对有机层进行洗涤，用无水硫酸镁进行干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去，用硅胶柱色谱法(己烷/乙酸乙酯＝90/10)对残余物进行纯化，由此得到化合物6(1.07g,收率37％)。
ESI-MS m/z:630(M+H)+
工序5
将工序4中合成的化合物6(1.07g,1.699mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中，于室温加入哌啶(0.336mL,3.40mmol)并搅拌3小时。向反应液中加入水，用乙酸乙酯进行萃取，然后用饱和食盐水对有机层进行洗涤，用无水硫酸镁进行干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去，用氨基硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇＝90/10)对残余物进行纯化，由此得到化合物7(0.59g,收率85％)。
ESI-MS m/z:408(M+H)+
实施例1系链单元的合成1
化合物16的合成
[化学式137]
Figure BDA0001746597290001121
工序6
将5-羟基间苯二甲酸二甲酯(化合物8,和光纯药工业公司制,5.0443g,24mmol)溶解于四氢呋喃(和光纯药工业公司制25mL)中，加入2-(叔丁氧羰基氨基)-1-乙醇(东京化成工业公司制,4.0343g,25.03mmol)、及负载于聚合物上的三苯基膦(Sigma-Aldrich公司制,6.61g,25.2mmol)，然后在冰冷却下，加入40％偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD)甲苯溶液(东京化成工业公司制,13.26mL,25.2mmol)，于室温搅拌一晚。将反应液过滤，在减压下将滤液蒸馏除去，然后用氨基硅胶柱色谱法(己烷/乙酸乙酯＝95/5～80/20)对残余物进行纯化，由此得到化合物9(5.3071g,收率63％)。
ESI-MS m/z:254(M+H)+,以脱Boc体的形式检测
工序7
将工序6中合成的化合物9(5.3071g,15.02mmol)溶解于甲醇(25mL)中，在冰冷却下，加入2mol/L氢氧化钠水溶液(和光纯药工业公司制,13mL)，于室温搅拌4小时。将反应液用冰冷却，加入10％柠檬酸水溶液，用乙酸乙酯进行萃取，然后用饱和食盐水对有机层进行洗涤，用无水硫酸镁进行干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去，由此定量地得到化合物10。
ESI-MS m/z:324(M-H)-
工序8
将工序7中合成的化合物10(1.9296g,5.93mmol)溶解于N,N’-二甲基甲酰胺(70mL)中，加入N-1-(9H-芴-9-基甲氧基羰基)-乙二胺盐酸盐(3.3493g,11.86mmol)、二异丙基乙基胺(5.18mL,29.7mmol)、及2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(4.5168g,11.88mmol)，于室温搅拌4小时。将反应液用冰冷却，加入10％柠檬酸水溶液，用氯仿进行萃取，然后用饱和碳酸氢钠水溶液及饱和食盐水对有机层进行洗涤，用无水硫酸镁进行干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去，用硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇)对残余物进行纯化，由此得到化合物11(3.4407g,收率68％)。
ESI-MS m/z:898(M+HCOO)-
工序9
将工序8中合成的化合物11(1.6087g,1.884mmol)溶解于二氯甲烷(20mL)中，在冰冷却下，加入三氟乙酸(5mL,64.9mmol)，于室温搅拌4小时。在减压下，将反应液中的溶剂蒸馏除去，由此定量地得到化合物12(2.4079g)。
ESI-MS m/z:798(M+HCOO)-
工序10
将工序9中合成的化合物12(386mg,0.512mmol)溶解于四氢呋喃(10mL)中，在冰冷却下，加入苯甲酰氯(175mg,1.024mmol)，于室温搅拌1小时。在减压下将反应液中的溶剂蒸馏除去，用硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇)对残余物进行纯化，由此得到化合物13(373mg,收率82％)。
ESI-MS m/z:888(M+H)+
工序11
将工序10中合成的化合物13(108mg,0.122mmol)溶解于二氯甲烷(5mL)中，于室温加入二乙胺(0.5mL,4.8mmol)，并搅拌1小时。在减压下将溶剂蒸馏除去，由此定量地得到化合物14(54.9mg)。
ESI-MS m/z:444(M+H)+
工序12
加入工序11中合成的化合物14(180mg,0.406mmol)、Nα,Nε-双(叔丁氧羰基)-L-赖氨酸(Novabiochem公司制,295mg,0.852mmol)、二异丙基乙基胺(0.354mL,2.029mmol)、及2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(324mg,0.852mmol)，于室温搅拌一整夜。将反应液用冰冷却，加入10％柠檬酸水溶液，用氯仿进行萃取，然后用饱和食盐水对有机层进行洗涤，用无水硫酸镁进行干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去，用氨基硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇)对残余物进行纯化，由此定量地得到化合物15(450mg)。
ESI-MS m/z:1101(M+H)+
工序13
将工序12中合成的化合物15(2.1558g,1.9593mmol)溶解于二氯甲烷(20mL)中，在冰冷却下，加入三氟乙酸(5mL)，于室温搅拌4小时。在减压下，将反应液中的溶剂蒸馏除去，由此定量地得到化合物16。
ESI-MS m/z:700(M+H)+
实施例2系链单元的合成2
化合物20的合成
[化学式138]
Figure BDA0001746597290001151
工序14
将工序9中合成的化合物12(0.5716g,0.7582mmol)、利用生物偶联物化学(Bioconjugate Chemistry),第22卷,690-699页,2011年中记载的方法合成的十二烷酸单苄酯(0.4859mg,1.5164mmol)、二异丙基乙基胺(0.662mL,3.79mmol)、及2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(0.5766g,1.516mmol)溶解于N,N二甲基甲酰胺(12mL)中，于室温搅拌1小时。将反应液用冰冷却，加入饱和柠檬酸水溶液，用氯仿进行萃取，然后用饱和食盐水对有机层进行洗涤，用无水硫酸镁进行干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去，用硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇)对残余物进行纯化，由此得到化合物17(0.88g,收率84％)。
ESI-MS m/z:1057(M+H)+
工序15
将工序14中合成的化合物17(0.7545g,0.714mmol)溶解于二氯甲烷四氢呋喃(20mL)中，于室温加入二乙胺(5mL,47.9mmol)并搅拌一整夜。在减压下将溶剂蒸馏除去，由此定量地得到化合物18。
ESI-MS m/z:612(M+H)+
工序16
加入工序15中合成的化合物18(0.437g,0.7143mmol)、Nα,Nε-双(叔丁氧羰基)-L-赖氨酸(Novabiochem公司制,0.5483g,1.583mmol)、二异丙基乙基胺(0.624mL,3.57mmol)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(0.5703g,1.5mmol)，于室温搅拌2小时。向反应液中加入10％柠檬酸水溶液，用乙酸乙酯进行萃取，然后用饱和食盐水对有机层进行洗涤，用无水硫酸镁进行干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去，由此得到化合物19的粗产物。
ESI-MS m/z:1269(M+H)+
工序17
将工序16中合成的化合物19(0.906g,0.7143mmol)溶解于二氯甲烷(12mL)中，在冰冷却下，加入三氟乙酸(3mL,38.9mmol)，于室温搅拌4小时。在减压下，将反应液中的溶剂蒸馏除去，由此得到化合物20的粗产物。
ESI-MS m/z:869(M+H)+
实施例3系链单元的合成3
化合物23的合成
[化学式139]
Figure BDA0001746597290001171
工序18
将工序12中合成的化合物15(100mg,0.091mmol)溶解于甲醇(3mL)中，添加乙酸(2μL)后，进行基于钯/碳的催化加氢还原。在减压下，将得到的溶液馏分中的溶剂蒸馏除去，由此定量地得到化合物21。
ESI-MS m/z:967(M+H)+
工序19
将工序18中合成的化合物21(50mg,0.052mmol)及N-(6-马来酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺(48mg,0.155mmol)溶解于四氢呋喃(2mL)中，加入二异丙基乙基胺(0.045mL,0.259mmol)，于室温搅拌一整夜。在减压下将溶剂蒸馏除去，用硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇)对残余物进行纯化，由此得到化合物22(18mg,收率30％)。
ESI-MS m/z:1160(M+H)+
工序20
将工序19中合成的化合物22(18mg,0.016mmol)溶解于二氯甲烷(2mL)中，在冰冷却下，加入三氟乙酸(0.2mL,2.6mmol)，于室温搅拌一整夜。在减压下将反应液中的溶剂蒸馏除去，利用乙醚进行晶析后，以白色固体的形式得到化合物23(7.5mg,收率64％)。
ESI-MS m/z:759(M+H)+
实施例4系链单元的合成4
化合物29的合成
[化学式140]
Figure BDA0001746597290001181
工序21
使用工序7中合成的化合物10(0.9372g,2.8809mmol)、β-丙氨酸甲酯盐酸盐(东京化成工业株式会社制,0.8082g,5.7902mmol)，利用与实施例1的工序8同样的方法，定量地得到化合物24。
ESI-MS m/z:495(M+H)+
工序22
使用工序21中合成的化合物24(0.9622g,1.952mmol)，利用与实施例1的工序9同样的方法，定量地得到化合物25。
ESI-MS m/z:396(M+H)+
工序23
使用工序22中合成的化合物25(0.1146g,0.290mmol)及15-叠氮基-4,7,10,13-四氧杂十五烷酸N-琥珀酰亚胺基酯(N3-PEG4-NHS，东京化成工业株式会社制,0.0750g,0.1931mmol)，利用与实施例3的工序19同样的方法，定量地得到化合物26。
ESI-MS m/z:669(M+H)+
工序24
使用工序23中合成的化合物26(0.1291g,0.193mmol)，利用与实施例1的工序7同样的方法，定量地得到化合物27。
ESI-MS m/z:641(M+H)+
工序25
使用工序24中合成的化合物27(0.1252g,0.193mmol)及L-谷氨酸二叔丁基酯(渡边化学株式会社制,0.1180g,0.399mmol)，利用与实施例1的工序8同样的方法，得到化合物28(0.0521g,收率24％)。
ESI-MS m/z:1124(M+H)+
工序26
使用工序25中合成的化合物28(0.0521g,0.0464mmol)，利用与实施例1的工序9同样的方法，得到化合物29(36mg,收率86％)。
ESI-MS m/z:899(M+H)+
实施例5糖配体-苯环单元的合成1
化合物31的合成
[化学式141]
Figure BDA0001746597290001201
工序27
使用工序13中合成的化合物16(0.2586g,0.3695mmol)和通过美国化学学会杂志(Journal of American Chemical Society),第136卷,16958-16961页,2014年中记载的方法合成的化合物1(0.8559g,1.7927mmol)，利用与实施例1的工序8同样的方法，得到化合物30(0.5272g,收率61％)。
ESI-MS m/z:2418(M+H)+
工序28
使用工序27中合成的化合物30(0.2653g,0.1097mmol)，利用与实施例3的工序21同样的方法，得到化合物31(0.1524g,收率61％)。
ESI-MS m/z:2284(M+H)+
实施例6糖配体-系链单元的合成2
[化学式142]
Figure BDA0001746597290001211
化合物32的合成
工序29
使用工序28中合成的化合物31(0.0152g,0.006657mmol)，利用与实施例3的工序19同样的方法，得到化合物32(0.0077g,收率47％)。
ESI-MS m/z:1239(M+2H)2+
1H-NMR(DMSO-D6)δ:1.11-1.66(34H,m),1.77(12H,d,J＝1.5Hz),1.89(12H,s),2.01-2.14(10H,m),2.01(12H,s),2.10(12H,s),2.92-2.99(4H,m),3.16-3.54(14H,m),3.65-3.74(4H,m),3.81-3.91(4H,m),3.98-4.08(14H,m),4.11-4.24(4H,m),4.48(4H,dd,J＝8.4,1.8Hz),4.93-5.00(4H,m),5.21(4H,d,J＝3.5Hz),6.99(2H,s),7.52(2H,s),7.66-7.75(2H,m),7.78-7.87(6H,m),7.91(1H,br s),8.01-8.08(3H,br m),8.54-8.60(2H,brm).
化合物33的合成
工序30
使用工序28中合成的化合物31(0.0150g,0.00657mmol)，利用与实施例4的工序23同样的方法，得到化合物33(0.0062g,收率37％)。
ESI-MS m/z:1279(M+2H)2+
1H-NMR(DMSO-D6)δ:1.11-1.66(30H,m),1.77(12H,s),1.89(12H,s),2.01-2.14(8H,m),2.01(12H,s),2.10(12H,s),2.33-2.38(2H,m),2.92-2.99(4H,m),3.16-3.54(14H,m),3.58-3.63(16H,m),3.65-3.74(4H,m),3.81-3.91(4H,m),3.98-4.08(12H,m),4.11-4.24(4H,m),4.48(4H,dd,J＝8.4,1.8Hz),4.93-5.00(4H,m),5.21(4H,d,J＝3.5Hz),7.52(2H,s),7.66-7.75(2H,m),7.78-7.87(6H,m),7.91(1H,br s),8.01-8.08(3H,br m),8.54-8.60(2H,br m).
实施例7糖配体-系链单元的合成3
[化学式143]
Figure BDA0001746597290001231
化合物34的合成
工序31
使用工序24中合成的化合物27(0.00436g,0.00681mmol)及参考例1的工序3中合成的化合物4(0.010g,0.020mmol)，利用与实施例1的工序8同样的方法，得到化合物34的粗产物。
ESI-MS m/z:1584(M+H)+
化合物35的合成
工序32
使用工序26中合成的化合物29(0.0100g,0.01112mmol)，利用与实施例1的工序8同样的方法，得到化合物35(0.0223g,收率72％)。
ESI-MS m/z:1393(M+2H)2+
实施例8糖配体-系链-分支单元的合成
化合物40的合成
[化学式144]
Figure BDA0001746597290001241
工序33
使用工序17中合成的化合物20(0.1952g,0.225mmol)和通过美国化学学会杂志(Journal of American Chemical Society),第136卷,16958-16961页、2014年中记载的方法合成的化合物1(0.4162g,0.93mmol)，利用与实施例1的工序8同样的方法，得到化合物36(334.8mg,收率58％)。
ESI-MS m/z:1294(M+2H)2+
工序34
使用工序33中合成的化合物36(0.1459g,0.056mmol)，利用与实施例3的工序18同样的方法，得到化合物37(112mg,收率80％)。
ESI-MS m/z:1249(M+2H)2+
1H-NMR(DMSO-D6)δ:1.11-1.66(44H,m),1.77(12H,d,J＝1.5Hz),1.89(12H,s),2.01-2.20(12H,m),2.01(12H,s),2.10(12H,s),2.92-2.99(4H,m),3.16-3.54(10H,m),3.58-3.64(4H,m),3.65-3.74(4H,m),3.81-3.91(4H,m),3.98-4.08(12H,m),4.11-4.24(4H,m),4.48(4H,dd,J＝8.4,1.8Hz),4.93-5.00(4H,m),5.21(4H,d,J＝3.5Hz),6.99(2H,s),7.52(2H,s),7.66-7.75(2H,m),7.78-7.87(6H,m),7.91(1H,br s),8.01-8.08(3H,brm),8.54-8.60(2H,br m).
工序35
使用工序34中合成的化合物37(0.1091g,0.044mmol)及参考例2的工序5中制造的化合物7(0.0748g,0.184mmol)，利用与实施例1的工序8同样的方法，以粗产物形式得到化合物38。
ESI-MS m/z:1292(M+2H)2+,以脱DMTr体形式检测
工序36
将工序35中合成的化合物38(0.161g,0.05586mmol)溶解于二氯甲烷(5mL)中，加入丁二酸酐(东京化成工业公司制,0.1182g,1.181mmol)、N,N-二甲基氨基吡啶(0.0224g,0.183mmol)、及三乙胺(0.55mL,3.95mmol)，于室温搅拌一晚。将反应液用冰冷却，加入水，用乙酸乙酯萃取2次，然后用饱和食盐水对有机层进行洗涤，用无水硫酸镁进行干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去，由此得到化合物39的粗产物。
ESI-MS m/z:1342(M+2H)2+,以脱DMTr体形式检测
工序37
将工序36中合成的化合物39(0.0816g,0.02734mmol)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(0.0221g,0.05827mmol)、及二异丙基乙基胺(0.02mL,0.1094mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，加入LCAA-CPG(Chem Gene公司制,0.4882g)，于室温搅拌一整夜。将混合物过滤，依次用二氯甲烷、10％甲醇二氯甲烷溶液、及乙醚进行洗涤，然后使其与乙酸酐/吡啶溶液作用，由此得到化合物40(49.5μmol/g,收率89％)。需要说明的是，收率由向固相载体中的导入率算出，所述向固相载体中的导入率可通过将1％三氟乙酸/二氯甲烷溶液添加于固相载体中、根据来自DMTr基的吸收而计算得到。
实施例9核酸复合物的合成1
[化学式145]
Figure BDA0001746597290001271
核酸复合物41的合成
工序38
加入工序29中合成的化合物32、和利用大分子(Molecules),第17卷,13825-13843页,2012年中记载的方法合成的末端经巯基修饰的寡核苷酸，于室温静置4小时。向反应混合物中添加碳酸钠，于4℃静置一晚。利用阴离子交换色谱法(GE Healthcare,MonoQ 5/50GL,10μm,5.0mm x 50mm，基于A液：10mmol/L Tris缓冲液/30％乙腈、B液：10mmol/L Tris缓冲液/30％乙腈/1mol/L NaBr的梯度)或反相液相色谱法(Waters,X BridgeC18,5μm,4.6mm x 250mm，基于0.1mol/L三乙基乙酸铵缓冲液、B液：乙腈的梯度)中的任一方法进行纯化，由此得到寡核苷酸不同的3种单链核酸复合物41。
将利用本实施例合成的核酸复合物的序列及质量分析结果示于第1表中。
第1表
[表1]
Figure BDA0001746597290001281
表中，分别地，n表示DNA，N(M)表示2’-O-甲基修饰RNA，N(F)表示2’-氟修饰RNA，N(L)表示LNA，5(L)表示LNAmC，^表示硫代磷酸酯修饰，ss表示有义链，as表示反义链，带下划线的编号表示相当于实施例中的化合物编号的修饰基。以下，在各表中相同。
核酸复合物42的合成
工序39
就工序38中合成的单链核酸复合物41_3’-AT3-ssRNA而言，利用混合缓冲液(100mmol/L乙酸钾、30mmol/L 2-[4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸、HEPES)-KOH(pH7.4)、2mmol/L乙酸镁)进行浓度调节(50μmol/L)。将前述有义链与反义链(50μmol/L)各自以相同的量进行混合，于80℃静置10分钟。反义链序列如第2表中记载的那样。缓缓降低温度，于37℃静置1小时，得到双链核酸复合物42。
将利用本实施例合成的核酸复合物的序列示于第2表。
第2表
[表2]
Figure BDA0001746597290001291
实施例10核酸复合物的合成2
[化学式146]
Figure BDA0001746597290001292
核酸复合物43的合成
工序40
使用工序32中合成的化合物35和通过ACS Nano,第9卷,9652-9664页,2015年中记载的方法合成的寡核苷酸，利用与实施例9的工序38同样的反应条件、步骤，得到单链核酸复合物43。
将利用本实施例合成的核酸复合物的序列及质量分析结果示于第3表。
第3表
[表3]
Figure BDA0001746597290001301
核酸复合物44的合成
工序41
利用与实施例9的工序39同样的方法，得到双链核酸复合物44。
将利用本实施例合成的核酸复合物的序列示于第4表。
第4表
[表4]
Figure BDA0001746597290001302
实施例11核酸复合物的合成3
[化学式147]
Figure BDA0001746597290001311
核酸复合物45的合成
工序42
使用工序20中合成的化合物23(648nmol)和通过大分子(Molecules),第17卷,13825-13843页,2012年中记载的方法合成的末端经巯基修饰的寡核苷酸(216nmol)，利用与实施例9的工序38同样的方法，得到核酸复合物45。
核酸复合物46的合成
工序43
向工序42中合成的化合物45(100nmol)中加入3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺基酯(6.3mg，20μmol)的二甲基亚砜溶液，在磷酸缓冲液中于室温静置4小时。向反应溶液中添加二硫代苏糖醇(15.4mg，100μmol)，于室温静置一晚。对混合物进行凝胶过滤处理(Nap柱，GE Healthcare公司制，洗脱溶剂：20mmol/L乙酸/乙酸钠缓冲液(pH5.0))及超滤，由此得到核酸复合物46。
核酸复合物47的合成
工序44
使用工序43中合成的化合物46和参考例1的工序1中合成的化合物2，利用与实施例9的工序38同样的方法，得到单链核酸复合物47。
核酸复合物48的合成
工序45
使用工序43中合成的化合物46和通过生物偶联物化学(BioconjugateChemistry)，第14卷，232-238页，2003年中记载的方法合成的甘露糖马来酰亚胺加成物，利用与实施例9的工序38同样的方法，得到单链核酸复合物48。
将利用本实施例合成的核酸复合物的序列及质量分析结果示于第5表。
第5表
[表5]
化合物 序列(5′→3′) 理论分子量 实测值
45_5’-CD45-ASO <u>45</u>C(L)^C(L)^A(L)^A(L)^a^t^g^c^c^a^a^g^A(L^G(L)^T(^T(L) 6479 6479
46_5’-CD45-ASO <u>46</u>C(L)^C(L)^A(L)^A(L)^a^t^g^c^c^a^a^g^A(L)^G(L)^T(L)^T(L) 6832 6832
47_5’-CD45-ASO <u>47</u>C(L)^C(L)^A(L^A(L^a^t^g^c^c^a^a^g^A(L)^G(L)^T(L)^T(L) 8695 8696
48_5’-CD45-ASO <u>48</u>C(L)^C(L)^A(L)^A(L)^a^t^g^c^c^a^a^g^A(L)^G(L)^T(L)^T(L) 8587 8585
实施例12核酸复合物的合成4
核酸复合物49的合成
[化学式148]
Figure BDA0001746597290001331
工序46
使用核酸合成装置(超快速并行合成器(Ultra Fast Parallel Syntheizer)，Sigma公司制,以下称为UFPS)，以0.2μmol规模，进行在反义链的3’末端具有GalNAc基的寡核苷酸复合物的合成(分别称为G-CH1179-s、G-CH0099-s、及G-CH1180-s)。固相载体使用工序37中合成的化合物40。二甲氧基三苯甲基dT亚磷酰胺(SAFC-PROLIGO公司)利用乙腈调节为0.06mol/L。作为亚磷酰胺的活化物，使用5-苄硫基-1H-四唑(SAFC-PROLIGO公司)、及0.06mol/L dT亚磷酰胺的乙腈溶液，时间各设为10分钟而进行缩合反应。反应后，浸渍于28％氨溶液中，于55℃放置4小时。在减压下进行浓缩，加入1-丁醇使反应停止。使用反相液相色谱法(资生堂,CAPSELL PAK C18,SG300,6.0mm x 75mm,基于5％乙腈/0.1％三乙基乙酸铵缓冲液、B液：50％乙腈/水的梯度)进行纯化，由此得到单链核酸复合物49。
将利用本实施例合成的核酸复合物的序列及质量分析结果示于第6表。
第6表
[表6]
化合物 序列(5→3′) 理论分子量 实测值
493′-dT10 Tttttttttt<u>49</u> 5120 5120
比较例1核酸复合物的合成
[化学式149]
Figure BDA0001746597290001341
核酸复合物52的合成
工序47
使用通过美国化学学会杂志(Journal of American Chemical Society),第136卷,16958-16961页,2014年中记载的方法合成的化合物50(0.0796g,0.044mmol)，利用与实施例6的工序29同样的方法，得到化合物51(0.014g,收率19％)。
ESI-MS m/z:994(M+2H)2+
工序48
使用工序47中合成的化合物51，利用与实施例9的工序38同样的方法，得到寡核苷酸不同的3种单链核酸复合物52。
将利用本实施例合成的核酸复合物的序列及质量分析结果示于第7表。
第7表
[表7]
Figure BDA0001746597290001351
核酸复合物53的合成
工序49
使用工序48中合成的化合物52_3’-AT3-ssRNA，利用与实施例9的工序39同样的方法，得到双链核酸复合物53。
将利用本实施例合成的核酸复合物的序列示于第8表。
第8表
[表8]
Figure BDA0001746597290001352
比较例2核酸复合物的合成
核酸复合物54的合成
[化学式150]
Figure BDA0001746597290001353
通过美国化学学会杂志(Journal of American Chemical Society),第136卷,16958-16961页,2014年中记载的方法，得到具有ApoBASO(参见第1表)的单链核酸复合物54。
试验例1核酸复合物针对小鼠原代肝细胞的体外(in vitro)活性
针对实施例9、比较例1及比较例2中合成的各核酸复合物中的ApoBASO(受试物1)、核酸复合物54(受试物2)、52_3’-ApoBASO(受试物3)、52_5’-ApoBASO(受试物4)、41_3’-ApoBASO(受试物5)、41_5’-ApoBASO(受试物6)，分别利用以下的方法，将它们导入至来自CD-one(CD-1)的小鼠原代肝细胞(Life Technologies公司制，目录编号MSCP10)中。
利用Opti-MEM(GIBCO公司，31985)对各核酸复合物进行稀释，使最终浓度成为30、10或3nmol/L，将所述稀释后的各核酸复合物以每孔20μL的方式分别注入于96孔的培养板，然后以细胞数成为12500/80μL/孔的方式，将悬浮于含有原代肝细胞的解冻及培养补充剂(Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements)(Life Technologies公司制，目录编号CM3000)的William’s E培养基(William’s E Medium)(Life Technologies公司制，目录编号A12176-01)中的小鼠原代肝细胞进行接种，在37℃、5％CO2的条件下培养6小时，然后小心去除培养上清液，添加含有原代肝细胞维持补充剂(Primary HepatocyteMaintenance Supplements)(Life Technologies公司制，目录编号CM4000)的William’s E培养基。另外，作为阴性对照组，接种未作任何处理的细胞。
将导入有各制剂的细胞在37℃的5％CO2培养箱内培养18小时，利用经冰冷却的磷酸缓冲生理盐水进行洗涤，使用SuperPrep Cell Lysis&RT Kit for qPCR(东洋纺公司制，目录编号SCQ-201)，按照制品中附带的说明书所记载的方法，回收总RNA，并通过以得到的总RNA为模板的逆转录反应进行cDNA的制作。
以得到的cDNA为模板，并以TaqMan(注册商标)基因表达测定探针(AppliedBiosystems公司制)作为探针，使用QuantStudio 12K Flex实时PCR系统(ABI公司制)，按照附带的使用说明书中记载的方法使其进行PCR反应，由此使载脂蛋白(Apolipoprotein)B(别称为载脂蛋白-B100/载脂蛋白-B48，以下记为apob)基因及作为组成型表达基因的甘油醛3-磷酸脱氢酶(D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，以下记为gapdh)基因进行PCR反应，分别测定mRNA扩增量，以gapdh的mRNA扩增量作为内部对照，算出apob的mRNA的准定量值。将以同样方式测得的阴性对照中的apob的mRNA的准定量值作为1，根据apob的mRNA的准定量值求出apob的mRNA的表达率。将得到的apob的mRNA的表达率的结果以相对于阴性对照的apob mRNA表达率而言的抑制率的形式示于第9表及第10表中。需要说明的是，各表分别表示独立的试验的结果。
第9表
[表9]
Figure BDA0001746597290001371
第10表
[表10]
Figure BDA0001746597290001372
根据第9表及第10表可知，本发明的核酸复合物可抑制导入至小鼠原代肝细胞后的apob基因的mRNA的表达。
试验例2核酸复合物在小鼠中的体内(in vivo)活性
针对实施例9、比较例1及比较例2中合成的各核酸复合物中的ApoBASO(受试物1)、核酸复合物54(受试物2)、52_3’-ApoBASO(受试物3)、52_5’-ApoBASO(受试物4)、41_3’-ApoBASO(受试物5)、41_5’-ApoBASO(受试物6)，分别利用以下的方法实施体内(in vivo)评价试验。需要说明的是，各核酸复合物根据试验利用磷酸缓冲生理盐水(DPBS)(NacalaiTesque公司制)进行稀释而使用。将小鼠(BALB/cA，自CLEA JAPAN获得)驯化饲养后，对各小鼠以0.75mg/kg或0.25mg/kg的量皮下注射施予各核酸复合物。另外，作为对照组，对小鼠仅皮下注射施予DPBS。自施予3天后，从颞浅静脉采集血清。然后使动物安乐死，采集肝脏并用液氮冷冻保存。针对肝脏冷冻样品，使用Trizol(注册商标)RNA分离试剂(LifeTechnologies公司制，目录编号15596026)及RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司制，目录编号74106)，按照制品中附带的说明书所记载的方法，进行总RNA的回收。进而使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche公司制，目录编号04897030001)，按照制品中附带的说明书所记载的方法，并通过以得到的总RNA为模板的逆转录反应进行cDNA的制作。
以得到的cDNA为模板，并以TaqMan(注册商标)基因表达测定探针(AppliedBiosystems公司制)作为探针，使用QuantStudio 12K Flex实时PCR系统(ABI公司制)，按照附带的使用说明书中记载的方法，进行PCR反应，由此使apob基因及gapdh基因进行PCR反应，分别测定mRNA扩增量，以gapdh的mRNA扩增量作为内部对照，算出apob的mRNA的准定量值。将以同样方式测得的对照组中的apob的mRNA的准定量值作为1，根据apob的mRNA的准定量值求出apob的mRNA的表达率。另外，使用LabAssay胆固醇(和光纯药工业公司制，目录编号294-65801)，按照附带的使用说明书中记载的方法，对血清中的总胆固醇浓度进行测定。将得到的apob的mRNA的表达抑制率及血清中总胆固醇浓度示于第11表及第12表。
第11表
[表11]
Figure BDA0001746597290001391
第12表
[表12]
Figure BDA0001746597290001392
由第11表及第12表可知，本发明的核酸复合物(受试物5及6)可在生物体内使apob基因的表达降低，并使血中的总胆固醇浓度减少。
试验例3核酸复合物针对小鼠原代肝细胞的体外活性
针对实施例9及比较例1中得到的各核酸复合物中的53_3’-AT3-siRNA(受试物7)、42_3’-AT3-siRNA(受试物8)，分别利用以下的方法，将它们导入至来自CD-one(CD-1)的小鼠原代肝细胞(Life Technologies公司制，目录编号MSCP10)中。
利用Opti-MEM(GIBCO公司，31985)对各核酸复合物进行稀释，使最终浓度成为300、100或30nmol/L，将所述稀释后的各核酸复合物以每孔20μL的方式分别注入于96孔的培养板，然后以细胞数成为12500/80μL/孔的方式，将悬浮于含有原代肝细胞的解冻及培养补充剂(Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements)(Life Technologies公司制，目录编号CM3000)的William’s E培养基(William’s E Medium)(LifeTechnologies公司制，目录编号A12176-01)中的小鼠原代肝细胞进行接种，在37℃、5％CO2的条件下培养6小时，然后小心除去培养上清液，添加含有原代肝细胞维持补充剂(PrimaryHepatocyte Maintenance Supplements)(Life Technologies公司制，目录编号CM4000)的William’s E培养基。另外，作为阴性对照组，接种未作任何处理的细胞。
将导入有各制剂的细胞在37℃的5％CO2培养箱内培养18小时，利用经冰冷却的磷酸缓冲生理盐水进行洗涤，使用SuperPrep Cell Lysis&RT Kit for qPCR(东洋纺公司制，目录编号SCQ-201)，按照制品中附带的说明书所记载的方法，回收总RNA，并通过以得到的总RNA为模板的逆转录反应进行cDNA的制作。
以得到的cDNA为模板，并以TaqMan(注册商标)基因表达测定探针(AppliedBiosystems公司制)作为探针，使用QuantStudio 12K Flex实时PCR系统(ABI公司制)，按照附带的使用说明书中记载的方法，进行PCR反应，由此使Serpin peptidase inhibitor,clade C(antithrombin),member 1(别称为antithrombin III，以下记为AT3)基因及作为组成型表达基因的甘油醛3-磷酸脱氢酶(D-glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，以下记为gapdh)基因进行PCR反应，分别测定mRNA扩增量，以gapdh的mRNA扩增量作为内部对照，算出AT3的mRNA的准定量值。将以同样方式测得的阴性对照中的AT3的mRNA的准定量值作为1，根据AT3的mRNA的准定量值求出AT3的mRNA的表达率。将得到的AT3的mRNA的表达率的结果以相对于阴性对照的AT3mRNA表达率而言的抑制率的形式示于第13表。
第13表
[表13]
Figure BDA0001746597290001411
由第13表可知，本发明的核酸复合物(受试物8)可抑制导入至小鼠原代肝细胞后的AT3基因的mRNA的表达。
试验例4核酸复合物在小鼠中的体内(in vivo)活性
针对实施例9及比较例1中得到的各核酸复合物中的53_3’-AT3-siRNA(受试物7)、42_3’-AT3-siRNA(受试物8)，分别利用以下的方法实施体内(in vivo)评价试验。需要说明的是，各核酸复合物根据试验利用磷酸缓冲生理盐水(DPBS)(Nacalai Tesque公司制)进行稀释而使用。将小鼠(BALB/cA，自CLEA JAPAN获得)驯化饲养后，对各小鼠以1.5mg/kg或0.5mg/kg的量皮下注射施予各核酸复合物。另外，作为对照组，对小鼠仅皮下注射施予PBS。自施予3天后，在异氟烷麻醉下从后大静脉后部静脉采血。将采集的血液与含有3.2M柠檬酸钠及5mmol/L D-葡萄糖的抗凝固液以体积比9:1进行混合，回收离心后的上清液，从而得到血浆。在采血后使动物安乐死，采集肝脏并用液氮冷冻保存。针对肝脏冷冻样品，使用Trizol(注册商标)RNA分离试剂(Life Technologies公司制，目录编号15596026)及RNeasyMini Kit(QIAGEN公司制，目录编号74106)，按照制品中附带的说明书所记载的方法，进行总RNA的回收。进而使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche公司制，目录编号04897030001)，按照制品中附带的说明书所记载的方法，并通过以得到的总RNA为模板的逆转录反应进行cDNA的制作。
以得到的cDNA为模板，并以TaqMan(注册商标)基因表达测定探针(AppliedBiosystems公司制)作为探针，使用QuantStudio 12K Flex实时PCR系统(ABI公司制)，按照附带的使用说明书中记载的方法，进行PCR反应，由此使AT3基因及gapdh基因进行PCR反应，分别测定mRNA扩增量，将AT3的mRNA扩增量作为内部对照，算出AT3的mRNA的准定量值。将以同样方式测得的对照组中的AT3的mRNA的准定量值作为1，根据AT3的mRNA的准定量值求出AT3的mRNA的表达率。另外，使用小鼠抗凝血酶III ELISA试剂盒(Abcam公司制，目录编号ab108800)，按照附带的使用说明书中记载的方法，对血浆中的AT3蛋白质浓度进行测定。将得到的AT3的mRNA的表达抑制率及血浆中AT3蛋白质浓度示于第14表。
第14表
[表14]
Figure BDA0001746597290001421
由第14表可知，本发明的核酸复合物(受试物8)可在生物体内使AT3基因的表达降低，并使血中的AT3蛋白质浓度减少。
参考例3糖配体单元的合成
化合物56的合成
[化学式151]
Figure BDA0001746597290001422
工序51
利用药物化学杂志(Journal of Medicinal Chemistry),第59卷,2718-2733页,2016年中记载的方法，由化合物55(1.200g,3.640mmol)来合成化合物56(1.050g,收率50％)。
ESI-MS m/z:582(M+H)+
化合物57的合成
[化学式152]
Figure BDA0001746597290001431
工序52
将化合物55(4.000g,10.27mmol)溶解于二氯甲烷(60mL)中，加入2-(2-羟基乙氧基)乙基氨基甲酸苄酯(2.700g,11.30mmol)、及三氟甲磺酸(0.1360mL,1.541mmol)，在回流条件下搅拌一整夜。向反应液中加入10wt％碳酸钾水溶液，与二氯甲烷进行分液后，用水洗涤有机相，用无水硫酸钠进行干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去，置换为2-甲基四氢呋喃并进行浓缩。将残余物滴加于庚烷中，对得到的晶体进行过滤，由此得到化合物57(5.130g,收率88％)。
ESI-MS m/z:570(M+H)+
化合物58的合成
[化学式153]
Figure BDA0001746597290001432
工序53
将工序1中记载的化合物1(898.0mg,2.007mmol)溶解于二氯甲烷(15mL)中，加入1-羟基苯并三唑一水合物(338.0mg,2.208mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(343mg,2.208mmol)、及N-1-Z-1,3-二氨基丙烷盐酸盐(0.4910mL,2.208mmol)，于室温搅拌3小时。向反应液中加入水，用二氯甲烷进行分液后，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤有机层，用无水硫酸钠进行干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去，用硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇＝90/10)对残余物进行纯化，由此得到化合物58(873.0mg,收率68％)。
ESI-MS m/z:639(M+H)+
化合物60的合成
[化学式154]
Figure BDA0001746597290001441
工序54
将工序1中记载的化合物1(3.00g,6.70mmol)溶解于二氯甲烷(60mL)中，于室温加入L-赖氨酸苄酯二对甲苯磺酸盐(1.75g,3.02mmol)、三乙胺(0.935mL,6.70mmol),1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.29g,6.70mmol)、1-羟基苯并三唑一水合物(103mg,0.670mmol)，并搅拌2.5小时。用水和饱和碳酸氢钠水溶液对反应液进行洗涤，用无水硫酸钠进行干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去，用硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇＝90/10)对残余物进行纯化，由此定量地得到化合物59。
ESI-MS m/z:1096(M+H)+
工序55
将工序54中合成的化合物59(2.30g,2.10mmol)溶解于四氢呋喃(46mL)中，于室温加入10％钯碳粉末(含水品,54.29％；424mg)，在氢气氛下搅拌一整夜。将反应液过滤，在减压下将溶剂蒸馏除去，由此定量地得到化合物60。
ESI-MS m/z:1006(M+H)+
化合物62的合成
[化学式155]
Figure BDA0001746597290001451
工序56
将亚氨基二乙酸(东京化成工业公司制,1.5g,6.43mmol)溶解于二氯甲烷(30mL)中，加入五氟三氟乙酸(东京化成工业公司制,2.75mL,16.08mmol)、三乙胺(4.48mL,32.2mmol)，搅拌4小时。向反应液中加入10％柠檬酸水溶液，用氯仿进行萃取，然后用饱和食盐水对有机层进行洗涤，用无水硫酸镁进行干燥。在其中，将工序51中合成的化合物56(2g,3.45mmol)溶解于乙酸乙酯(10mL)和乙腈(10mL)的混合液中，进行基于钯/碳的催化加氢还原。在减压下将得到的溶液部分中的溶剂蒸馏除去，由此得到化合物61的粗产物。
ESI-MS m/z:1091(M+H)+
工序57
使用工序56中合成的化合物61(1.5g,1.37mmol)，利用与参考例1的工序3同样的方法，定量地得到化合物62。
ESI-MS m/z:990(M+H)+
化合物64的合成
[化学式156]
Figure BDA0001746597290001461
工序58
使用N-(叔丁氧羰基)-L-谷氨酸(东京化成工业公司制)，并使用工序51中合成的化合物56(1.855g,3.19mmol)，利用与参考例3的工序56同样的方法，得到化合物63的粗纯化物。
ESI-MS m/z:1105(M+H)+
工序59
使用工序58中合成的化合物63(1.421g,1.2866mmol)，利用与参考例1的工序3同样的方法，定量地得到化合物64。
ESI-MS m/z:1004(M+H)+
参考例4分支单元的合成
化合物66的合成
[化学式157]
Figure BDA0001746597290001462
工序60
将利用有机化学杂志(Journal of Organic Chemistry),第74卷,6837-6842页,2009年中记载的方法合成的化合物65(90mg,0.173mmol)溶解于四氢呋喃(1mL)中，加入负载于聚合物上的三苯基膦(Sigma-Aldrich公司制,63mg,0.189mmol)，在加热回流下搅拌3小时。将反应液过滤，在减压下将溶剂蒸馏除去，由此得到化合物66(70mg,收率82％)。
ESI-MS m/z:516(M+Na)+
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ0.89(3H,s),1.42-1.48(2H,m),1.52-1.61(2H,m),1.85(1H,br s),2.68(2H,t,J＝7.2Hz),3.06-3.07(2H,m),3.39-3.44(3H,m),3.51-3.55(3H,m),3.78(6H,s),6.80-6.85(4H,m),7.17-7.23(1H,m),7.27-7.33(6H,m),7.41-7.43(2H,m).
化合物69的合成
[化学式158]
Figure BDA0001746597290001471
工序61
使用化合物67(东京化成工业公司制,0.500g,3.73mmoL)，利用与参考例2的工序4同样的方法，得到化合物68的粗产物(1.5g)。
ESI-MS m/z:435(M-H)-
工序62
使用工序61中合成的化合物68的粗产物(1.5g)和1,4-二氨基丁烷(东京化成工业公司制,3.29g,37.3mmol)，利用与实施例1的工序8同样的方法，得到化合物69(0.18g,两步收率10％)。
ESI-MS m/z:551(M+HCOO)-
1H-NMR(400MHz,MeOD)：δ1.09(3H,s),1.45-1.52(4H,m),2.80(2H,t,J＝7.2Hz),2.91(2H,s),3.05(1H,d,J＝8.8Hz),3.12-3.16(4H,m),3.24(1H,s),3.43(1H,d,J＝10.8Hz),3.62-3.66(7H,m),6.71-6.76(4H,m),7.05-7.11(1H,m),7.12-7.20(6H,m),7.28-7.32(2H,m).
化合物71的合成
[化学式159]
Figure BDA0001746597290001481
工序63
将利用有机化学杂志(Journal of Organic Chemistry),第74卷,6837-6842页,2009年中记载的方法合成的化合物65(110mg，0.212mmol)溶解于四氢呋喃(2mL)中，加入N-(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧羰基-1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷(东京化成工业公司制,72mg,0.222mmol)，于室温搅拌1小时。向反应液中加入水，用氯仿进行萃取，然后用饱和食盐水对有机层进行洗涤，用无水硫酸镁进行干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去，用氨基硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇＝90/10)对残余物进行纯化，由此得到化合物71(160mg,收率90％)。ESI-MS m/z:845(M+H)+
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ0.88(3H,s),0.91-1.09(3H,m),1.20-1.25(1H,m),1.52-1.59(4H,m),1.80-1.85(2H,m),2.19-2.25(4H,m),2.59-2.68(1H,m),2.84-2.90(4H,m),3.02-3.11(3H,m),3.35-3.44(5H,m),3.49-3.53(5H,m),3.54-3.58(2H,m),3.62(5H,s),3.78(6H,s),4.13(2H,d,J＝6.4Hz),4.21(2H,t,J＝7.2Hz),6.79-6.84(4H,m),7.18-7.21(1H,m),7.24-7.27(2H,m),7.28-7.32(4H,m),7.39-7.44(2H,m).
化合物75的合成
[化学式160]
Figure BDA0001746597290001491
工序64
使用化合物72(AstaTech公司制,100mg,1.148mmol)及Fmoc-Ser(tBuMe2Si)-OH(渡边化学工业公司制,532mg,1.205mmol)，利用与实施例1的工序8同样的方法，得到化合物73(410mg,收率70％)。
ESI-MS m/z:511(M+H)+
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ0.06(6H,s),0.90(9H,s),2.76-2.85(1H,m),3.65-3.86(5H,m),4.02-4.23(3H,m),4.32-4.40(4H,m),5.55(1H,d,J＝8.0Hz),7.31(2H,t,J＝7.6Hz),7.40(2H,t,J＝7.6Hz),7.59(2H,d,J＝7.6Hz),7.76(2H,d,J＝7.6Hz).
工序65
使用工序64中合成的化合物73(410mg,0.803mmol)，利用与参考例2的工序4同样的方法，得到化合物74的粗产物(680mg)。
ESI-MS m/z:814(M+H)+
工序66
使用工序65中合成的化合物74的粗产物(680mg)，利用与参考例2的工序5同样的方法，得到化合物75(330mg,两步收率70％)。
ESI-MS m/z:519(M+H)+
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ0.02-0.09(6H,m),0.89(9H,d,J＝28.8Hz),2.84-2.94(1H,m),3.24-3.30(2H,m),3.46(1H,t,J＝7.2Hz),3.52-3.68(2H,m),3.75-3.80(1H,m),3.82(6H,d,J＝2.4Hz),3.89-3.96(1H,m),4.05-4.17(1H,m),4.27-4.37(1H,m),6.82-6.89(4H,m),7.22-7.27(1H,m),7.29-7.34(6H,m),7.41-7.45(2H,m).
化合物78的合成
[化学式161]
Figure BDA0001746597290001501
工序67
将N-(叔丁氧羰基)-1,3-二氨基丙烷(东京化成工业公司制，1.788g,10.26mmol)溶解于二氯甲烷(22.8mL)中，加入三乙胺(1.907mL,13.68mmol)，于室温搅拌15分钟。向反应液中滴加利用有机化学通讯(Organic Letter),第16卷,6318-6321页,2014年中记载的方法合成的化合物76(1.126g,6.84mmol)的二氯甲烷溶液(5mL)，于室温搅拌2小时。向反应液中加入水，用氯仿进行萃取，然后用饱和食盐水对有机层进行洗涤，用无水硫酸镁进行干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去，用硅胶柱色谱法(庚烷/乙酸乙酯＝35/65)对残余物进行纯化，由此得到化合物77(1.65g，收率80％)。
ESI-MS m/z:303(M+H)+
工序68
使用工序67中合成的化合物77(1.65g,5.46mmol)，利用与参考例1的工序3同样的方法，得到化合物78(1.10g,收率100％)。
ESI-MS m/z:203(M+H)+
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ1.74(2H,dt,J＝12.0,6.0Hz),2.95(2H,t,J＝6.0Hz),3.18(1H,s),3.60(2H,td,J＝6.0,5.2Hz),7.54(2H,dt,J＝8.4,1.8Hz),7.76(2H,dt,J＝8.4,1.8Hz),7.97(1H,br s).
化合物82的合成
[化学式162]
Figure BDA0001746597290001511
工序69
使用化合物79(东京化成公司制,1.2g,4.24mmol)，利用与参考例2的工序4同样的方法，得到化合物79的粗产物。
ESI-MS m/z:608(M+Na)+
工序70
使用工序69中合成的化合物80的粗产物，利用参考例2的工序5或实施例1的工序11中记载的方法，得到化合物81(1.34g,两步收率52％)。
ESI-MS m/z:386(M+Na)+
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ3.34(2H,t,J＝6.4Hz),3.47(2H,t,J＝6.4Hz),3.79(6H,s),6.78-6.84(4H,m),7.17-7.21(1H,m),7.27-7.35(6H,m),7.42-7.46(2H,m).
工序71
使用工序70中合成的化合物81(1.15g,3.16mmol)及Fmoc-Ser(tBuMe2Si)-OH(渡边化学工业公司制,1.677g,3.8mmol)，利用与实施例1的工序8同样的方法，得到化合物82(560mg,收率31％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.00-0.07(6H,m),0.83-0.89(9H,m),3.18-3.26(2H,m),3.39-3.46(2H,m),3.61-3.68(1H,m),3.76(6H,s),3.89(1H,dd,J＝10.0,4.0Hz),4.03(1H,dd,J＝10.0,4.0Hz),4.15-4.20(1H,m),4.22-4.28(1H,m),4.32-4.40(2H,m),5.65-5.88(1H,m),6.76-6.85(4H,m),7.16-7.23(1H,m),7.25-7.34(8H,m),7.36-7.44(4H,m),7.50-7.64(2H,m),7.72-7.79(2H,m).
化合物88-94的合成
使用第15表中记载的化合物及Fmoc-Ser(tBuMe2Si)-OH、Fmoc-Thr(tBuMe2Si)-OH，利用与工序69～71同样的方法，得到第16表中记载的化合物。
将利用本实施例合成的化合物的NMR分析数据示于第17表。
第15表
[表15]
Figure BDA0001746597290001521
第16表
[表16]
Figure BDA0001746597290001522
第17表
[表17]
Figure BDA0001746597290001531
化合物95的合成
[化学式163]
Figure BDA0001746597290001532
工序72
使用工序71中合成的化合物82(2.487g,3.16mmol)，利用与参考例2的工序5同样的方法，得到化合物95(1.2g,收率67％)。
ESI-MS m/z：587(M+Na)+
1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ-0.01-0.07(6H，m)，0.86-0.90(9H，m)，3.15-3.21(2H，m)，3.41-3.48(3H，m)，3.72(1H，dd，J＝10.0，6.4Hz)，3.79(6H，s)，3.84(1H，dd，J＝10.0，4.8Hz)，6.79-6.84(4H，m)，7.18-7.23(1H，m)，7.27-7.33(6H，m)，7.40-7.44(2H，m)，7.72-7.75(1H，br m).
化合物96～102的合成
使用第16表中记载的化合物，利用与工序72同样的方法，得到第18表中记载的化合物。
将利用本实施例合成的化合物的质量分析结果示于第19表。
第18表
[表18]
Figure BDA0001746597290001541
第19表
[表19]
化合物 ESI-MS m/z
96 605(M+H)<sup>+</sup>
97 619(M+H)<sup>+</sup>
98 303(M+H)<sup>+</sup>，以脱DMTr体形式检测
99 649(M+HCOOH)<sup>-</sup>
100 577(M-H)<sup>-</sup>
101 623(M+HCOOH)<sup>-</sup>
102 317(M+H)<sup>+</sup>，以脱DMTr体形式检测
实施例13系链单元的合成
化合物107的合成
[化学式164]
Figure BDA0001746597290001551
工序73
将化合物103(2.00g,9.47mmol)溶解于N,N’-二甲基甲酰胺(40mL)中，于室温加入亚氨基二乙酸二叔丁基酯(5.11g,20.84mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(4.00g,20.84mmol)、1-羟基苯并三唑一水合物(145mg,0.947mmol)，搅拌2小时。向反应液中加入水，用乙酸乙酯进行萃取后，用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤有机层，用无水硫酸钠进行干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去，用硅胶柱色谱法(庚烷/乙酸乙酯＝50/50)对残余物进行纯化。进而用甲醇进行浆料纯化，得到化合物104(4.07g,收率65％)。
ESI-MS m/z:664(M-H)-
工序74
将工序73中合成的化合物104(2.66g,4.00mmol)溶解于四氢呋喃(53mL)中，于室温加入10％钯碳粉末(含水品,54.29％；490mg)，在氢气氛下搅拌3小时。将反应液过滤，在减压下将溶剂蒸馏除去，由此得到化合物105(2.86g,收率113％)。
ESI-MS m/z:634(M-H)-
工序75
将工序74中合成的化合物105(871.0mg,1.370mmol)溶解于N,N’-二甲基甲酰胺(17mL)中，加入O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(625.0mg,1.644mmol)、二异丙基乙基胺(0.5730mL,3.290mmol)、及十二烷二酸单苄酯(527.0mg,1.644mmol)，于室温搅拌一整夜。向反应液中加入水，用乙酸乙酯进行萃取后，用饱和碳酸氢钠水溶液及饱和食盐水对有机层进行洗涤，用无水硫酸钠进行干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去，用硅胶柱色谱法(庚烷/乙酸乙酯＝60/40)对残余物进行纯化，由此得到化合物106(1.030g,收率80％)。
ESI-MS m/z:939(M+H)+
工序76
将工序75中合成的化合物106(1.030g,1.098mmol)溶解于二氯甲烷(10mL)中，加入三氟乙酸(10.00mL,130.0mmol)，于室温搅拌1小时。在减压下将溶剂蒸馏除去，得到化合物107的粗产物。
ESI-MS m/z:713(M-H)-
化合物113的合成
[化学式165]
Figure BDA0001746597290001561
工序77
将化合物108(2.000g,12.98mmol)溶解于N,N’-二甲基甲酰胺(30mL)中，加入碳酸氢钾(1.559g,15.57mmol)及苄基氯(2.328mL,19.47mmol)，于室温搅拌4小时。向反应液中加入饱和氯化铵，用二氯甲烷进行萃取，然后用水洗涤有机层，用无水硫酸钠进行干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去，用硅胶柱色谱法(庚烷/乙酸乙酯＝50/50)对残余物进行纯化，由此得到化合物109(2.850g,收率90％)。
ESI-MS m/z:243(M-H)-
工序78
将工序77中合成的化合物109(2.500g,10.24mmol)溶解于N,N’-二甲基甲酰胺(30mL)中，加入碳酸钾(5.660g,40.90mmol)及溴乙酸叔丁酯(3.300mL,22.52mmol)，于90℃搅拌4小时。向反应液中加入饱和氯化铵，用二氯甲烷萃取，然后用饱和食盐水对有机层进行洗涤，用无水硫酸钠进行干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去，用硅胶柱色谱法(庚烷/乙酸乙酯＝75/25)对残余物进行纯化，由此得到化合物110(4.300g,收率89％)。
ESI-MS m/z:472(M-H)-
工序79
将工序78中合成的化合物110(1.000g,2.116mmol)溶解于二氯甲烷(10mL)中，加入三氟乙酸(10.00mL,130.0mmol)，于室温搅拌6小时。在减压下将溶剂蒸馏除去，得到化合物111的粗产物。
ESI-MS m/z:359(M-H)-
工序80
将工序79中合成的化合物111(350.0mg,0.9710mmol)溶解于N,N’-二甲基甲酰胺(7mL)中，加入1-羟基苯并三唑一水合物(327.0mg,2.137mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(410.0mg,2.137mmol)、及亚氨基二乙酸二叔丁酯(524.0mg,2.137mmol)，于室温搅拌5小时。向反应液中加入水，用乙酸乙酯进行萃取后，用饱和碳酸氢钠水溶液及饱和食盐水对有机层进行洗涤，用无水硫酸钠进行干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去，用硅胶柱色谱法(庚烷/乙酸乙酯＝60/40)对残余物进行纯化，得到化合物112(617.0mg,收率78％)。
ESI-MS m/z:814(M-H)-
工序81
将工序80中合成的化合物112(610.0mg,0.7490mmol)溶解于二氯甲烷(6mL)中，加入三氟乙酸(6mL,78.00mmol)，于室温搅拌1小时。在减压下将溶剂蒸馏除去，得到化合物113的粗产物。
ESI-MS m/z:590(M+H)+
化合物116的合成
[化学式166]
Figure BDA0001746597290001581
工序82
将工序74中合成的化合物114(474mg,0.744mmol)溶解于N,N’-二甲基甲酰胺(10mL)中，于室温加入利用药物化学杂志(Journal of Medicinal Chemistry),第54卷,2433-2446页,2011年中记载的方法合成的反式环己烷-1,4-二甲酸单苄酯(0.234mg,0.893mmol)、二异丙基乙基胺(0.312mL,1.79mmol)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(339mg,0.893mmol)，并搅拌6小时。向反应液中加入水，用乙酸乙酯进行萃取后，用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤有机层，用无水硫酸钠进行干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去，用硅胶柱色谱法(庚烷/乙酸乙酯＝50/50)对残余物进行纯化，由此得到化合物115(448mg,收率68％)。
ESI-MS m/z:879(M-H)-
工序83
将工序82中合成的化合物115(341mg,0.387mmol)溶解于二氯甲烷(3.4mL)中，于室温加入三氟乙酸(3.4mL)，搅拌一整夜。将反应液减压浓缩，用乙酸乙酯进行共沸，用庚烷进行浆料纯化，由此得到化合物116(254mg,收率100％)。
ESI-MS m/z:656(M+H)+
化合物120的合成
[化学式167]
Figure BDA0001746597290001591
工序84
将化合物117(500mg,2.75mmol)溶解于N,N’-二甲基甲酰胺(10mL)中，于室温加入亚氨基二乙酸二叔丁酯(1.48g,6.04mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.16g,6.04mmol)、1-羟基苯并三唑一水合物(42.0mg,0.275mmol)，并搅拌4小时。向反应液中加入水，用乙酸乙酯进行萃取，然后用饱和食盐水对有机层进行洗涤，用无水硫酸钠进行干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去，用硅胶柱色谱法(庚烷/乙酸乙酯＝50/50)对残余物进行纯化，由此得到化合物118(329mg,收率19％)。
ESI-MS m/z:635(M-H)-
工序85
将工序84中合成的化合物118(323mg,0.507mmol)溶解于N,N’-二甲基甲酰胺(6.5mL)中，于室温加入碳酸钾(84.0mg,0.609mmol)、溴乙酸苄酯(139mg,0.609mmol)，并搅拌3小时。向反应液中加入水，用乙酸乙酯进行萃取，然后用饱和食盐水对有机层进行洗涤，用无水硫酸钠进行干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去，用硅胶柱色谱法(庚烷/乙酸乙酯＝50/50)对残余物纯化，由此得到化合物119(313mg,收率79％)。
ESI-MS m/z:783(M-H)-
工序86
将工序85中合成的化合物119(312mg,0.398mmol)溶解于二氯甲烷(3.1mL)中，于室温加入三氟乙酸(3.1mL)并搅拌一整夜。将反应液减压浓缩，用乙酸乙酯进行共沸，由此得到化合物120(252mg,收率113％)。
ESI-MS m/z:561(M+H)+
化合物125的合成
[化学式168]
Figure BDA0001746597290001601
工序87
将化合物103(2.00g,9.47mmol)溶解于N,N’-二甲基甲酰胺(40mL)中，于室温加入2-氨基-1,3-丙二醇(1.90g,20.84mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(4.00g,20.84mmol)、1-羟基苯并三唑一水合物(145mg,0.947mmol)，并搅拌2小时。在减压下将溶剂蒸馏除去，用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/甲醇＝70/30)对残余物进行纯化。进而用乙酸乙酯进行浆料纯化，由此得到化合物121(2.68g,收率79％)。
ESI-MS m/z:356(M-H)-
工序88
将工序87中合成的化合物121(500mg,1.40mmol)悬浮于乙腈(10mL)中，于室温加入丙烯酸叔丁酯(3.59g,28.0mmol)、苄基三甲基氢氧化铵(40％水溶液；1.76mL,702mmol)，并搅拌一整夜。在减压下将溶剂蒸馏除去，加入水，并用乙酸乙酯进行萃取，然后用饱和食盐水对有机层进行洗涤，用无水硫酸钠进行干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去，用硅胶柱色谱法(庚烷/乙酸乙酯＝50/50)对残余物进行纯化，由此得到化合物122(300mg,收率24％)。
ESI-MS m/z:871(M+H)+
工序89
将工序88中合成的化合物122(340mg,0391mmol)溶解于四氢呋喃(6.8mL)中，于室温加入10％钯碳粉末(含水品,54.29％；31.3mg)，在氢气氛下搅拌6小时。将反应液过滤，在减压下将溶剂蒸馏除去，用硅胶柱色谱法(庚烷/乙酸乙酯＝30/70)对残余物进行纯化，由此得到化合物123(235mg,收率72％)。
ESI-MS m/z:841(M+H)+
工序90
将工序89中合成的化合物123(232mg,0.276mmol)溶解于N,N’-二甲基甲酰胺(4.6mL)中，于室温加入十二烷酸单苄酯(0.133mg,0.414mmol)、二异丙基乙基胺(0.145mL,0.829mmol)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(158mg,0.414mmol)，并搅拌一整夜。向反应液中加入水，用乙酸乙酯进行萃取后，用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤有机层，用无水硫酸钠进行干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去，用硅胶柱色谱法(庚烷/乙酸乙酯＝30/70)对残余物进行纯化，由此得到化合物124(274mg,收率87％)。
ESI-MS m/z:1141(M-H)-
工序91
将工序90中合成的化合物124(273mg,0.239mmol)溶解于二氯甲烷(2.7mL)中，于室温加入三氟乙酸(2.7mL)，并搅拌一整夜。将反应液减压浓缩，用乙酸乙酯进行共沸，由此得到化合物125(231mg,收率105％)。
ESI-MS m/z:919(M+H)+
化合物128的合成
[化学式169]
Figure BDA0001746597290001621
工序92
将4-硝基间苯二甲酸103(500mg,2.37mmol)及N-Boc-乙二胺(808mg,5.21mmol)溶解于N,N’-二甲基甲酰胺(10mL)中，于室温加入三乙胺(0.90mL,7.11mmol)、1-羟基苯并三唑一水合物(703mg,5.21mmol)及1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.36g,7.11mmol)，并搅拌16小时。对反应液进行后处理，用硅胶柱色谱法对粗品进行纯化，由此得到化合物126(650mg,收率55％)。
工序93
将工序92中合成的化合物126(500mg,1.01mmol)及锌粉末(330mg,5.05mmol)悬浮于甲醇(3.5mL)及四氢呋喃(3.5mL)中，于0℃滴加氯化铵(378mg,7.07mmol)的水溶液，于室温搅拌24小时。对反应液进行后处理，用硅胶柱色谱法对粗品纯化，由此得到化合物127(160mg,收率34％)。
工序94
将工序93中合成的化合物127(200mg,0.430mmol)及N-Cbz-甘氨酸(90.0mg,0.430mmol)溶解于N,N’-二甲基甲酰胺(2.0mL)中，于室温加入二异丙基乙基胺(0.220mL,1.29mmol)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(245mg,0.645mmol)，并搅拌16小时。对反应液进行后处理，用硅胶柱色谱法对粗品进行纯化，由此得到化合物128(180mg,收率64％)。
ESI-MS m/z:657(M+H)+
化合物130的合成
[化学式170]
Figure BDA0001746597290001631
工序95
将3,5-二硝基苯甲酸128(500mg,2.36mmol)及N-Cbz-乙二胺(588mg,2.83mmol)溶解于N,N’-二甲基甲酰胺(5.0mL)中，于室温加入三乙胺(0.65mL,4.72mmol)、1-羟基苯并三唑一水合物(380mg,2.83mmol)及1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(675mg,3.54mmol)，并搅拌16小时。对反应液进行后处理，用硅胶柱色谱法对粗品进行纯化，由此得到化合物129(445mg,收率48％)。
工序96
将工序95中合成的化合物129(200mg,0.515mmol)溶解于乙醇(5.0mL)中，于室温加入氯化锡(II)(584mg,3.09mmol)及浓盐酸(0.2mL)，于80℃搅拌16小时。对反应液进行后处理，得到化合物130(180mg，收率106％)。
ESI-MS m/z:329(M+H)+
化合物133的合成
[化学式171]
Figure BDA0001746597290001641
工序97
使用实施例1的工序6中合成的化合物9(8.17g,23.12mmol)，利用与实施例1的工序9同样的方法，得到化合物131(3.7g,收率63％)。
ESI-MS m/z:254(M+H)+
工序98
使用工序97中得到的化合物131(3.7g,14.63mmol)，利用与实施例1的工序10同样的方法，得到化合物132(3.82g,收率67％)。
ESI-MS m/z:432(M+HCOO)-
工序99
使用工序98中得到的化合物132(3.82g,9.86mmol)，利用与实施例1的工序7同样的方法，得到化合物133(3.08g,收率87％)。
ESI-MS m/z:360(M+H)+
化合物135的合成
[化学式172]
Figure BDA0001746597290001651
工序100
使用化合物8(2g,9.53mmol)和(叔丁氧羰基氨基)-1-戊醇(东京化成公司制，2g，10mmol)，利用与实施例1的工序6同样的方法，得到化合物134(2.40g,收率63％)。
ESI-MS m/z:296(M+H)+，以脱Boc体形式检测
工序101
使用工序100中合成的化合物134，利用与实施例1的工序7-9、14-17同样的方法，得到化合物135(1.579g,收率21％)。
ESI-MS m/z:910(M+H)+
实施例14糖配体-系链单元的合成
化合物137的合成
[化学式173]
Figure BDA0001746597290001661
工序102
将工序51中合成的化合物56(1.015g,1.748mmol)溶解于N,N’-二甲基甲酰胺(12mL)中，于室温加入10％钯碳粉末(含水品,54.29％；187mg)，在氢气氛下搅拌6小时。将反应液过滤。向滤液中加入工序76中合成的化合物107(250.0mg,0.350mmol)、1-羟基苯并三唑一水合物(26.80mg,0.1750mmol)、及1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(402.0mg,2.099mmol)，于室温搅拌一整夜。向反应液中加入水，用乙酸乙酯进行萃取后，用饱和碳酸氢钠水溶液及饱和食盐水对有机层进行洗涤，用无水硫酸钠进行干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去，用硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇＝87/13)对残余物进行纯化，由此得到化合物136(617.0mg,收率88％)。
ESI-MS m/z:1215(M+2H)2+
工序103
将工序102中合成的化合物136(0.7380g,0.3040mmol)溶解于四氢呋喃(7mL)中，于室温加入10％钯碳粉末(含水品,54.29％；135.90mg)，在氢气氛下搅拌一整夜。将反应液过滤，在减压下将溶剂蒸馏除去，用硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇＝87/13)对残余物纯化，由此得到化合物137(581mg,收率82％)。
ESI-MS m/z:1170(M+2H)2+
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):1.12-2.36(106H,m),2.91-3.19(8H,m),3.23-3.55(14H,m),3.60-3.76(4H,m),3.78-3.94(8H,m),3.95-4.10(16H,m),4.47(4H,d,J＝8.8Hz),4.92-5.01(4H,m),5.17-5.24(4H,m),6.98(1H,s),7.64(2H,s),7.81-7.95(4H,m),8.28-8.38(2H,m),8.44-8.56(2H,m),10.13(1H,s).
化合物139的合成
[化学式174]
Figure BDA0001746597290001671
工序104
将工序52中合成的化合物57(500mg,0.879mmol)溶解于N,N’-二甲基甲酰胺(6.5mL)中，于室温加入10％钯碳粉末(含水品,54.29％；94mg)，在氢气氛下搅拌4小时。将反应液过滤。向滤液中加入工序76中合成的化合物107(126.0mg,0.176mmol)、1-羟基苯并三唑一水合物(13.47mg,0.088mmol)、及1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(202.0mg,1.055mmol)，于室温搅拌一整夜。在减压下将反应液中的溶剂蒸馏除去，用反相柱色谱法(水/乙腈)对残余物进行纯化，由此得到化合物138(249.7mg,收率60％)。
ESI-MS m/z:1191(M+2H)2+
工序105
将工序104中合成的化合物138(0.242g,0.102mmol)溶解于四氢呋喃(3.6mL)及水(1.2mL)中，于室温加入10％钯碳粉末(含水品,54.29％；45mg)，在氢气氛下搅拌4小时。将反应液过滤，在减压下将溶剂蒸馏除去，得到化合物139(216mg,收率93％)。
ESI-MS m/z:1146(M+2H)2+
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):1.15-1.65(20H,m),1.68-2.15(52H,m),3.13-3.29(6H,m),3.40-3.67(16H,m),3.71-3.96(11H,m),3.98-4.14(16H,m),4.55(4H,t,J＝8.8Hz),4.93-5.06(4H,m),5.12-5.28(4H,m),6.56(1H,s),6.98(1H.s),7.64(2H,s),7.77-7.93(4H,m),8.26-8.49(3H,m),10.10(1H,s).
化合物141的合成
[化学式175]
Figure BDA0001746597290001691
工序106
将工序53中合成的化合物58(430mg,0.674mmol)溶解于N,N’-二甲基甲酰胺(6mL)中，于室温加入10％钯碳粉末(含水品,54.29％；79mg)，在氢气氛下搅拌4小时。将反应液过滤。向滤液中加入化合物107(105.0mg,0.148mmol)、1-羟基苯并三唑一水合物(11.31mg,0.074mmol)、及1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(170.0.0mg,0.887mmol)，于室温搅拌一整夜。在减压下将反应液中的溶剂蒸馏除去，用反相柱色谱法(水/乙腈)对残余物进行纯化，由此得到化合物140(218.1mg,收率56％)。
ESI-MS m/z:1329(M+2H)2+
工序107
将工序106中合成的化合物140(0.210g,0.079mmol)溶解于四氢呋喃(3.1mL)及水(1.0mL)中，于室温加入10％钯碳粉末(含水品,54.29％；39mg)，在氢气氛下搅拌4小时。将反应液过滤，在减压下将溶剂蒸馏除去，得到化合物141(192.7mg,收率95％)。
ESI-MS m/z:1284(M+2H)2+
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):1.17-1.65(42H,m),1.69-2.13(61H,m),2.95-3.17(16H,m),3.65-3.77(3H,m),3.79-3.94(6H,m),3.96-4.10(16H,m),4.48(4H,d,J＝8.4Hz),4.96(4H,dd,J＝2.4,11.2Hz),5.21(4H,d,J＝3.2Hz),7.01(1H,s),7.64-7.92(11H,m),8.26-8.48(4H,m),10.14(1H,s).
化合物143的合成
[化学式176]
Figure BDA0001746597290001701
工序108
将工序52中合成的化合物57(450mg,0.791mmol)溶解于N,N’-二甲基甲酰胺(6mL)中，于室温加入10％钯碳粉末(含水品,54.29％；85mg)，在氢气氛下搅拌5小时。将反应液过滤。向滤液中加入工序81中合成的化合物113(94mg,0.158mmol)、1-羟基苯并三唑一水合物(133.0mg,0.871mmol)、及1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(182.0mg,0.950mmol)，于室温搅拌一整夜。在减压下将反应液中的溶剂蒸馏除去，用反相柱色谱法(水/乙腈)对残余物进行纯化，由此得到化合物142(99mg,收率28％)。
ESI-MS m/z:1129(M+2H)2+
工序109
将工序108中合成的化合物142(80mg,0.035mmol)溶解于四氢呋喃(1.7mL)及水(0.85mL)中，于室温加入10％钯碳粉末(含水品,54.29％；26mg)，在氢气氛下搅拌2小时。将反应液过滤，在减压下将溶剂蒸馏除去，得到化合物143(57.5mg,收率75％)。
ESI-MS m/z:1084(M+2H)2+
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):1.69-2.21(46H,m),3.14-3.65(28H,m),3.67-4.22(27H,m),4.43-4.66(4H,m),4.69-4.88(4H,m),4.89-5.08(4H,m),5.12-5.32(4H,m),6.54-6.68(1H,br),7.01(2H,s),7.78-8.09(3H,m),8.13-8.31(2H,m),8.58-8.75(2H,m).
化合物145的合成
[化学式177]
Figure BDA0001746597290001721
工序110
将工序53中合成的化合物58(418mg,0.655mmol)溶解于N,N’-二甲基甲酰胺(6mL)中，于室温加入10％钯碳粉末(含水品,54.29％；77mg)，在氢气氛下搅拌5小时。将反应液过滤。向滤液中加入工序81中合成的化合物113(85mg,0.144mmol)、1-羟基苯并三唑一水合物(121.0mg,0.791mmol)、及1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(165.0mg,0.863mmol)，于室温搅拌一整夜。在减压下将反应液中的溶剂蒸馏除去，用反相柱色谱法(水/乙腈)对残余物进行纯化，由此得到化合物144(99mg,收率28％)。
ESI-MS m/z:1268(M+2H)2+
工序111
将工序110中合成的化合物144(186mg,0.073mmol)溶解于四氢呋喃(2.8mL)及水(0.93mL)中，于室温加入10％钯碳粉末(含水品,54.29％；40mg)，在氢气氛下搅拌2小时。将反应液过滤，在减压下将溶剂蒸馏除去，得到化合物145(156.7mg,收率87％)。
ESI-MS m/z:1222(M+2H)2+
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):1.36-1.62(27H,m),1.67-2.17(64H,m),2.92-3.21(15H,m),3.58-3.77(2H,m),3.80-3.95(7H,m),3.97-4.13(15H,m),4.47(4H,d,J＝8.8Hz),4.88-5.02(7H,m),5.10-5.24(3H,m),6.95-7.00(1H,m),7.26-7.31(2H,m),7.72-7.88(8H,m),8.10-8.20(2H,m),8.51-8.60(2H,m).
化合物147的合成
[化学式178]
Figure BDA0001746597290001731
工序112
将工序109中合成的化合物143(171mg,0.079mmol)溶解于N,N’-二甲基甲酰胺(3.4mL)中，加入甘氨酸苄酯对甲苯磺酸盐(32.0mg,0.095mmol)、1-羟基苯并三唑一水合物(12.09mg,0.079mmol)、及1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(18.16mg,0.095mmol)，于室温搅拌一整夜。在减压下将反应液中的溶剂蒸馏除去，用反相柱色谱法(水/乙腈)对残余物进行纯化，由此得到化合物146(55.7mg,收率31％)。
ESI-MS m/z:1158(M+2H)2+
工序113
将工序112中合成的化合物146(54mg,0.023mmol)溶解于四氢呋喃(0.83mL)及水(0.28mL)中，于室温加入10％钯碳粉末(含水品,54.29％；18mg)，在氢气氛下搅拌2小时。将反应液过滤，在减压下将溶剂蒸馏除去，得到化合物147(50.1mg,收率97％)。
ESI-MS m/z:1112(M+2H)2+
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):0.96-1.06(3H,m),1.71-2.20(54H,m),3.41-3.64(15H,m),3.68-4.20(32H),4.55(4H,d,J＝8.4Hz),4.81(4H,s),4.94-5.02(4H,m),5.17-5.25(4H,m),6.63-6.76(2H,m),6.93-7.02(2H,m),7.84-8.00(3H,m),8.17-8.30(2H,m),8.58-8.70(2H,m).
化合物149的合成
[化学式179]
Figure BDA0001746597290001751
工序114
将化合物56(500mg,0.861mmol)溶解于N,N’-二甲基甲酰胺(10mL)中，于室温加入10％钯碳粉末(含水品,54.29％；92.1mg)，在氢气氛下搅拌2小时。在氩气氛下，于室温加入化合物116(113mg,0.172mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(198mg,1.03mmol)、1-羟基苯并三唑一水合物(13.2mg,0.086mmol)，并搅拌一整夜。用硅藻土将反应液过滤，在减压下将溶剂蒸馏除去，用硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇＝90/10)对残余物进行纯化，进而用反相制备HPLC(乙腈/水)进行纯化，得到化合物148(195mg,收率48％)。
ESI-MS m/z:1186(M+2H)2+
工序115
将工序114中合成的化合物148(194mg,0.082mmol)溶解于四氢呋喃(2.9mg)及水(1.0mL)中，于室温加入10％钯碳粉末(含水品,54.29％；35.7mg)，在氢气氛下搅拌8小时。将反应液过滤，在减压下将溶剂蒸馏除去，得到化合物149(183mg,收率98％)。
ESI-MS m/z:1141(M+2H)2+
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):1.21-1.45(m,40H),1.76-2.18(m,50H),3.00-3.09(m,8H),3.40-4.20(m,32H),4.47(d,J＝8.5Hz,4H),4.96(dd,J＝3.1,11.2Hz,4H),5.21(d,J＝3.1Hz,4H),6.98(s,1H),7.65(s,2H),7.84(d,J＝9.0Hz,4H),8.31(brs,1H),8.44(brs,1H),10.11(s,1H).
化合物151的合成
[化学式180]
Figure BDA0001746597290001761
工序116
将化合物56(500mg,0.861mmol)溶解于N,N’-二甲基甲酰胺(10mL)中，于室温加入10％钯碳粉末(含水品,54.29％；92.1mg)，在氢气氛下搅拌2小时。在氩气氛下，于室温加入化合物120(97.0mg,0.172mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(198mg,1.03mmol)、1-羟基苯并三唑一水合物(13.2mg,0.086mmol)，并搅拌一整夜。用硅藻土将反应液过滤，在减压下将溶剂蒸馏除去，用硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇＝85/15)对残余物进行纯化，进而用反相制备HPLC(乙腈/水)进行纯化，由此得到化合物150(179mg,收率46％)。
ESI-MS m/z:1138(M+2H)2+
工序117
将工序116中合成的化合物150(175mg,0.077mmol)溶解于四氢呋喃(2.6mg)及水(0.9mL)中，于室温加入10％钯碳粉末(含水品,54.29％；32.4mg)，在氢气氛下搅拌1小时。将反应液过滤，在减压下将溶剂蒸馏除去，得到化合物151(160mg,收率95％)。
ESI-MS m/z:1093(M+2H)2+
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):1.23-1.45(m,32H),1.77(s,12H),1.89(s,12H),1.99(s,12H),2.10(s,12H),3.01-3.11(m,8H),3.69-4.02(m,34H),4.47-4.50(m,4H),4.94-4.98(m,4H),5.21(d,J＝3.1Hz,4H),6.92(s,1H),6.94(s,2H),7.87(d,J＝9.4Hz,2H),7.92(d,J＝8.5Hz,2H),8.33(brs,2H),8.50(brs,2H).
化合物153的合成
[化学式181]
Figure BDA0001746597290001781
工序118
将化合物58(500mg,0.784mmol)溶解于N,N’-二甲基甲酰胺(10mL)中，于室温加入10％钯碳粉末(含水品,54.29％；92.1mg)，在氢气氛下搅拌2小时。在氩气氛下，于室温加入化合物125(144mg,0.157mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(180mg,0.941mmol)、1-羟基苯并三唑一水合物(12.0mg,0.078mmol)，并搅拌一整夜。用硅藻土将反应液过滤，在减压下将溶剂蒸馏除去，用硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇＝80/20)对残余物进行纯化，进而用反相制备HPLC(乙腈/水)进行纯化，由此得到化合物152(191mg,收率43％)。
ESI-MS m/z:1431(M+2H)2+
工序119
将工序118中合成的化合物152(186mg,0.065mmol)溶解于四氢呋喃(2.8mg)及水(0.9mL)中，于室温加入10％钯碳粉末(含水品,54.29％；34.3mg)，在氢气氛下搅拌1小时。将反应液过滤，在减压下将溶剂蒸馏除去，得到化合物153(174mg,收率97％)。
ESI-MS m/z:1386(M+2H)2+
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):1.25-4.02(m,164H),4.18-4.26(m,2H),4.47(d,J＝8.1Hz,4H),4.96(dd,J＝3.1,11.2Hz,4H),5.21(d,J＝3.6Hz,4H),7.74-7.91(m,13H),8.18(s,2H),8.36(d,J＝7.2Hz,2H),10.27(brs,1H).
化合物155的合成
[化学式182]
Figure BDA0001746597290001791
工序120
将化合物128(150mg,0.228mmol)溶解于二氯甲烷(1.5mL)中，于室温加入三氟乙酸(1.5mL)并搅拌4小时。将反应液减压浓缩，用乙酸乙酯进行共沸。将残余物溶解于N,N’-二甲基甲酰胺(3mL)中，于室温加入化合物7(574mg,0.571mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(109mg,0.571mmol)、三乙胺(0.159mL,1.14mmol)、1-羟基苯并三唑一水合物(3.50mg,0.023mmol)，并搅拌一整夜。将反应液减压浓缩，用硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇＝90/10)对残余物进行纯化，进而用反相制备HPLC(乙腈/水)进行纯化，由此得到化合物154(242mg,收率44％)。
ESI-MS m/z:1216(M+2H)2+
工序121
将化合物154(242mg,0.100mmol)溶解于四氢呋喃/水(4/1；12mL)中，于室温加入10％钯碳粉末(含水品,54.29％；44.6mg)，在氢气氛下搅拌2小时。在氩气氛下，于室温加入6-马来酰亚胺己酸(23.2mg,0.110mmol)、氯化4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉(55.2mg,0.199mmol)，并搅拌一整夜。用硅藻土将反应液过滤，在减压下将溶剂蒸馏除去，用HP20树脂(丙酮/水)对残余物进行纯化，由此得到化合物155(97.4mg,收率39％)。
ESI-MS m/z:1245(M+2H)2+
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):1.14-2.16(100H,m),2.96-2.98(4H,m),3.24-3.41(18H,m),3.69-3.73(4H,m),3.83-3.91(6H,m),4.14-4.16(2H,m),4.47(4H,d,J＝8.6Hz),4.96(4H,dd,J＝3.6,11.3Hz),5.21(4H,d,J＝3.2Hz),7.01(2H,s),7.73-7.75(2H,m),7.83-7.94(7H,m),8.05-8.08(2H,m),8.14-8.20(3H,m),8.55-8.56(2H,m),10.24(1H,brs).
化合物157的合成
[化学式183]
Figure BDA0001746597290001811
工序122
将工序96中合成的化合物130(75.0mg,0.228mmol)溶解于N,N’-二甲基甲酰胺(3.0mL)中，于室温加入工序55中合成的化合物60(574mg,0.571mmol)、二异丙基乙基胺(0.199mL,1.14mmol)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(217mg,0.571mmol)，并搅拌一整夜。在减压下将溶剂蒸馏除去，用硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇＝90/10)对残余物进行纯化，进而用反相制备HPLC(乙腈/水)进行纯化，由此得到化合物156(202mg,收率38％)。
ESI-MS m/z:1152(M+2H)2+
工序123
将工序122中合成的化合物156(196mg,0.085mmol)溶解于四氢呋喃/水(4/1；10mL)中，于室温加入10％钯碳粉末(含水品,54.29％；36.1mg)，在氢气氛下搅拌2小时。在氩气氛下，于室温加入6-马来酰亚胺己酸(19.8mg,0.094mmol)、氯化4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉(47.0mg,0.170mmol)，并搅拌一整夜。用硅藻土将反应液过滤，在减压下将溶剂蒸馏除去，用HP20树脂(丙酮/水)对残余物进行纯化，由此得到化合物157(42.4mg,收率21％)。
ESI-MS m/z:1182(M+2H)2+
化合物158的合成
[化学式184]
Figure BDA0001746597290001821
工序124
使用工序101中合成的化合物135，利用与实施例8的工序33及34同样的方法，得到化合物158(2.2g,收率58％)。
ESI-MS m/z:2437(M+H)+
化合物161的合成
[化学式185]
Figure BDA0001746597290001831
工序125
使用实施例13的工序99中合成的化合物133(0.101g,0.282mmol)，并使用参考例3的工序57中合成的化合物62(0.607g,0.613mmol)，利用与实施例1的工序8同样的方法得到化合物159(0.25g,收率39％)。
ESI-MS m/z:2304(M+H)+
工序126
使用工序125中合成的化合物159(0.255g,0.111mmol)，利用与实施例3的工序18同样的方法得到化合物160(0.15g,收率63％)。
ESI-MS m/z:2170(M+H)+
工序127
使用工序126中合成的化合物160(20.8mg,9.59μmol)，利用与实施例3的工序19同样的方法得到化合物161(5.5mg,收率24％)。
ESI-MS m/z:1182(M+2H)2+
化合物163的合成
[化学式186]
Figure BDA0001746597290001841
工序128
使用实施例13的工序99中合成的化合物133(0.099g,0.277mmol)，并使用参考例3的工序59中合成的化合物64(0.618g,0.615mmol)，利用与实施例1的工序8同样的方法得到化合物162(0.343g,收率53％)。
ESI-MS m/z:2333(M+H)+
工序129
使用工序128中合成的化合物162，利用与实施例3的工序18及19同样的方法得到化合物163(6.9mg,收率28％)。
ESI-MS m/z:2392(M+H)+
化合物164的合成
[化学式187]
Figure BDA0001746597290001842
工序130
使用实施例5的工序28中合成的化合物31(0.048g,0.021mmol)和3-马来酰亚胺丙酸N-琥珀酰亚胺基酯(东京化成公司制,0.017g,0.064mmol)，利用与实施例5的工序29同样的方法，得到化合物164(0.040g,收率78％)。
ESI-MS m/z:2480(M+HCOO)-
化合物165的合成
[化学式188]
Figure BDA0001746597290001851
工序131
使用实施例8的工序34中合成的化合物37(23.6mg,9.46μmol)和N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐(Sigma-Aldrich公司制,7.21mg,0.028μmol)，利用与实施例1的工序8同样的方法，得到化合物165(9.1mg,收率36％)。
ESI-MS m/z:1310(M+2H)2+
化合物167的合成
[化学式189]
Figure BDA0001746597290001861
工序132
使用实施例5的工序28中合成的化合物31(0.122g,0.054mmol)，并使用以与实施例2的工序14同样的方法合成的己酸单苄酯，利用同一工序中记载的方法，得到化合物166(0.076g,收率56％)。
ESI-MS m/z:2503(M+H)+
工序133
使用工序132中合成的化合物166(0.076g,0.03mmol)，利用与实施例3的工序18同样的方法，得到化合物167(0.030g,收率40％)。
ESI-MS m/z:2412(M+H)+
化合物168的合成
[化学式190]
Figure BDA0001746597290001871
工序134
使用实施例4的工序24中合成的化合物27(4.36mg,0.006mmol)、参考例1的工序3中合成的化合物4(10mg,0.02mmol)，利用与实施例1的工序12同样的方法，得到化合物168(7mg,收率65％)。
ESI-MS m/z:1581(M-H)-
化合物171的合成
[化学式191]
Figure BDA0001746597290001872
工序135
使用工序124中合成的化合物158(0.2011g,0.079mmol)，采用实施例8的工序35得到化合物169(0.129g,收率55％)。
ESI-MS m/z:2972(M+HCOO)-
工序136
使用工序135中合成的化合物169(0.129g,0.044mmol)，采用实施例8的工序36得到化合物170的粗产物。
ESI-MS m/z:1535(M+HCOOH-2H)2-
工序137
使用工序136中合成的化合物170(0.0467g,0.013mmol)，采用实施例8的工序37得到化合物171(19.4μmol/g,收率35％)。
化合物174的合成
[化学式192]
Figure BDA0001746597290001881
工序138
使用实施例8的工序35中合成的化合物37(100mg,0.040mmol)及参考例4的工序60中合成的化合物66，利用与实施例8的工序35同样的方法，得到化合物172(90mg,收率76％)。
ESI-MS m/z:1335(M-DMTr+2H)2+
工序139
使用工序138中合成的化合物172(90mg,0.030mmol)，利用与实施例8的工序36同样的方法，得到化合物173的粗产物。
ESI-MS m/z:1558(M+HCOOH-2H)2-
工序140
使用工序139中合成的化合物173的粗产物，利用与实施例8的工序37同样的方法，得到化合物174(21.5μmol/g,两步收率32％)。
化合物177的合成
[化学式193]
Figure BDA0001746597290001901
工序141
使用实施例14的工序124中合成的化合物158(100mg,0.039mmol)及参考例4的工序60中合成的化合物66，利用与实施例8的工序35同样的方法，得到化合物175(90mg,收率76％)。
ESI-MS m/z:1356(M+2H)2+以脱DMTr体形式检测
工序142
使用工序141中合成的化合物175(90mg,0.030mmol)，利用与实施例8的工序36同样的方法，得到化合物176的粗产物。
ESI-MS m/z:1579(M+HCOOH-2H)2-
工序143
使用工序142中合成的化合物176的粗产物，利用与实施例8的工序37同样的方法，得到化合物177(17.0μmol/g,两步收率26％)。
化合物180的合成
[化学式194]
Figure BDA0001746597290001911
工序144
使用实施例14的工序124中合成的化合物158(100mg,0.039mmol)及参考例4的工序62中合成的化合物69，利用与实施例8的工序35同样的方法，得到化合物178(50mg,收率42％)。
ESI-MS m/z:1363(M+2H)2+以脱DMTr体形式检测
工序145
使用工序144中合成的化合物178(50mg,0.017mmol)，利用与实施例8的工序36同样的方法，得到化合物179的粗产物。
ESI-MS m/z:1587(M+HCOOH-2H)2-
工序146
使用工序145中合成的化合物179的粗产物，利用与实施例8的工序37同样的方法，得到化合物180(0.5μmol/g,两步收率1％)。
化合物183的合成
[化学式195]
Figure BDA0001746597290001921
工序147
使用实施例14的工序124中合成的化合物158(100mg,0.039mmol)及参考例4的工序63中合成的化合物71，利用与实施例8的工序35同样的方法，得到化合物181(40mg,收率30％)。
ESI-MS m/z:1532(M+2H)2+以脱DMTr体形式检测
工序148
使用工序147中合成的化合物181(40mg,0.012mmol)，利用与实施例8的工序36同样的方法，得到化合物182的粗产物。
ESI-MS m/z:1582(M+2H)2+以脱DMTr体形式检测
工序149
使用工序148中合成的化合物182的粗产物，利用与实施例8的工序37同样的方法，得到化合物183(0.2μmol/g,两步收率1％)。
化合物187的合成
[化学式196]
Figure BDA0001746597290001941
工序150
使用实施例8的工序34中合成的化合物158(70mg,0.028mmol)及参考例4的工序68中合成的化合物78，利用与实施例8的工序35同样的方法，得到化合物184(58mg,收率77％)。
ESI-MS m/z:1341(M+2H)2+
工序151
将工序150中合成的化合物184(58mg,0.022mmol)溶解于甲醇(0.15mL)中，加入利用有机化学杂志(Journal of Organic Chemistry),第74卷,6837-6842页,2009年中记载的方法合成的化合物65(16.9mg,0.032mmol)、1mol/L L-抗坏血酸钠水溶液(0.022mL,0.022mmol)、20mmol/L硫酸铜(II)水溶液(0.011mL,0.22μmol)、及10mmol/L三(2-苯并咪唑基甲基)胺/DMSO溶液(0.022mL,0.22μmol)，于室温搅拌3小时。用硅胶柱色谱法(氯仿/甲醇＝80/20)对反应液进行纯化，得到化合物185(7mg,收率10％)。
ESI-MS m/z:1450(M+2H)2+以脱DMTr体形式检测
工序152
使用工序151中合成的化合物185(10mg,3.13μmol)，利用与实施例8的工序36同样的方法，得到化合物186的粗产物。
ESI-MS m/z:1500(M+2H)2+以脱DMTr体形式检测
工序153
使用工序152中合成的化合物186的粗产物，利用与实施例8的工序37同样的方法，得到化合物187(8.4μmol/g,收率27％)。
化合物190的合成
[化学式197]
Figure BDA0001746597290001961
工序154
使用实施例14的工序124中合成的化合物158(74.1mg,0.029mmol)和实施例4的工序72中合成的化合物95(15mg,0.027mmol)，利用与实施例1的工序8同样的方法、或生物偶联物化学(Bioconjugate Chemistry),第26卷,1451-1455页,2015年中记载的方法，得到化合物188的粗产物。
ESI-MS m/z:1392(M+H)+,以脱DMTr体形式检测
工序155
使用工序154中合成的化合物188(0.083g,0.027mmol)，利用专利文献WO2015105083中记载的方法，得到化合物189的粗产物。
ESI-MS m/z:2669(M+H)+,以脱DMTr体形式检测
工序156
使用工序155中合成的化合物189(0.08g,0.027mmol)，利用与实施例8的工序36同样的方法，得到化合物190的粗产物。
ESI-MS m/z:1556(M+HOOH-2H)2-
1H-NMR(400MHz,MeOD)：δ1.45-1.86(48H,m),1.93(12H,s),1.94(12H,s),2.02(12H,s),2.13(12H,s),2.16-2.28(17H,m),2.48(4H,s),3.10-3.16(6H,m),3.36-3.56(19H,m),3.77(6H,s),3.80-3.89(6H,m),3.98-4.35(30H,m),4.53-4.59(4H,m),4.66-4.72(1H,m),5.04-5.10(4H,m),5.31-5.36(4H,m),6.81-6.88(4H,m),7.17-7.23(1H,m),7.26-7.32(6H,m),7.38-7.44(2H,m),7.54(2H,br s),7.90(1H,br s).
化合物191～199的合成
使用实施例8的工序34中合成的化合物37或实施例14的工序124中合成的化合物158和第18表中记载的结构、或参考例4的工序66中合成的化合物75，利用与工序154、155同样的方法，得到第20表及第21表中记载的化合物。
将利用本实施例合成的化合物的质量分析结果示于第22表。
第20表
[表20]
Figure BDA0001746597290001981
第21表
[表21]
Figure BDA0001746597290001991
第22表
[表22]
化合物 ESI-MS m/z
191 1537(M+HCOOH)<sup>2-</sup>
192 1584(M+HCOOH)<sup>2-</sup>
193 1577(M+HCOOH)<sup>2-</sup>
194 1577(M+HCOOH)<sup>2-</sup>
195 1564(M+HCOOH)<sup>2-</sup>
196 1578(M+HCOOH)<sup>2-</sup>
197 1564(M+HCOOH)<sup>2-</sup>
198 1584(M+HCOOH)<sup>2-</sup>
199 1570(M+2HCOOH)<sup>2-</sup>
化合物200的合成[化学式198]
Figure BDA0001746597290002001
工序157
使用工序156中合成的化合物190(g,mmol)，利用与实施例8的工序37同样的方法，得到化合物200(10.0μmol/g)。
化合物201～209的合成
使用第20表及第21表中记载的化合物，利用与工序157同样的方法，得到第23表及第24表中记载的化合物。
将利用本实施例合成的化合物的负载量示于第25表。
第23表
[表23]
Figure BDA0001746597290002011
第24表
[表24]
Figure BDA0001746597290002021
第25表
[表25]
化合物 负载量(μmol/g)
201 2.6
202 23.1
203 22.2
204 32.7
205 30.5
206 18.1
207 20.4
208 12.7
209 2.2
实施例15核酸复合物的合成
核酸复合物210～218的合成
利用与实施例9的工序38同样的方法，使用第26表中记载的化合物，得到第27表及第28表中记载的单链核酸复合物。
将利用本实施例合成的核酸复合物的序列及质量分析结果示于第29表。
第26表
[表26]
Figure BDA0001746597290002031
第27表
[表27]
Figure BDA0001746597290002041
第28表
[表28]
Figure BDA0001746597290002051
第29表
[表29]
Figure BDA0001746597290002061
核酸复合物219的合成
[化学式199]
Figure BDA0001746597290002062
工序158
使用工序134中合成的化合物168，利用与实施例10的工序40同样的方法，得到第30表中记载的单链核酸复合物219。
将利用本实施例合成的核酸复合物的序列及质量分析结果示于第30表。
第30表
[表30]
Figure BDA0001746597290002063
核酸复合物223的合成
[化学式200]
Figure BDA0001746597290002071
工序159
加入实施例8的工序34中合成的化合物37和利用大分子(Molecules)、第17卷、13825-13843页、2012年中记载的方法合成的末端经氨基修饰的寡核苷酸，利用生物偶联物化学(Bioconjugate Chemistry),第22卷,1723-1728页,2011年或生物偶联物化学(Bioconjugate Chemistry),第26卷,1451-1455页,2015年中记载的方法使其反应。利用实施例9的工序38中记载的方法进行纯化，从而得到单链核酸复合物223。
核酸复合物220～233的合成
利用与实施例15的工序159同样的方法，使用第31表及第32表中记载的化合物，得到第33表～第35表中记载的单链核酸复合物。
将利用本实施例合成的核酸复合物的序列及质量分析结果示于第36表。
第31表
[表31]
Figure BDA0001746597290002081
第32表
[表32]
Figure BDA0001746597290002091
第33表[表33]
Figure BDA0001746597290002101
第34表[表34]
Figure BDA0001746597290002111
第35表
[表35]
Figure BDA0001746597290002121
第36表
[表36]
Figure BDA0001746597290002131
核酸复合物234的合成
[化学式201]
Figure BDA0001746597290002132
工序160
使用实施例14的工序157中合成的化合物200，利用与实施例12的工序46同样的方法，得到单链核酸复合物234。
核酸复合物235～250的合成
利用与工序160同样的方法，使用化合物171、174、177、180、183、187、200及第23表及第24表中记载的化合物，分别得到对应的第37表～第40表中记载的单链核酸复合物。
将利用本实施例合成的核酸复合物的序列及质量分析结果示于第41表。
第37表
[表37]
Figure BDA0001746597290002141
第38表
[表38]
Figure BDA0001746597290002151
第39表
[表39]
Figure BDA0001746597290002161
第40表
[表40]
Figure BDA0001746597290002171
第41表
[表41]
Figure BDA0001746597290002181
核酸复合物251～287的合成
利用与实施例9的工序39同样的方法，使用单链核酸复合物(ssRNA)210～233、235～247，得到双链核酸复合物251～287。
将利用本实施例合成的核酸复合物的序列示于第42、43、45、47～54表。
第42表
[表42]
Figure BDA0001746597290002191
第43表
[表43]
Figure BDA0001746597290002201
第44表
[表44]
Figure BDA0001746597290002211
第45表
[表45]
Figure BDA0001746597290002212
第46表
[表46]
Figure BDA0001746597290002213
第47表
[表47]
Figure BDA0001746597290002221
第48表
[表48]
Figure BDA0001746597290002231
第49表
[表49]
Figure BDA0001746597290002241
第50表
[表50]
Figure BDA0001746597290002251
第51表
[表51]
Figure BDA0001746597290002261
第52表
[表52]
Figure BDA0001746597290002271
第53表
[表53]
Figure BDA0001746597290002281
第54表
[表54]
Figure BDA0001746597290002291
第55表
[表55]
Figure BDA0001746597290002292
实施例16糖配体-系链单元的合成
Figure BDA0001746597290002301
工序160
使用实施例13的工序99中合成的化合物133(0.5g,1.365mmol)，利用与实施例4的工序25同样的方法，以粗产物形式得到化合物288。
工序161
使用实施例16的工序160中合成的化合物288(0.296g,0.247mmol)，利用与实施例4的工序26同样的方法，以粗产物形式得到化合物289。
工序162
使用实施例16的工序161中合成的化合物289(0.153g,0.247mmol)及利用无机化学(Inorganic Chemistry),第83卷,1000-1007页,2011年中记载的方法合成的1-(2-叠氮乙基)-r-D-吡喃甘露糖苷(0.221g,0.989mmol)，利用与实施例1的工序8同样的方法，得到化合物290(0.110g,收率31％)。
ESI-MS m/z：720(M+H)+
工序163
使用实施例16的工序162中合成的化合物290(0.110g,0.077mmol)，利用与实施例5的工序28同样的方法，得到化合物291(0.077g,收率77％)。
ESI-MS m/z：1305(M+H)+
工序164
将实施例16的工序163中合成的化合物291(20mg,0.016mmol)、6-叠氮己酸2,5-二氧代-1-吡咯烷基酯(10mg,0.032mmol)溶解于四氢呋喃(2mL)中，加入二异丙基乙基胺(0.027mL,0.078mmol)，于室温搅拌一整夜。利用反相高效液相色谱法(Waters,XBridgeC18,5μm,4.6mmx250mm，基于0.01％三氟乙酸水溶液、B液:乙腈的梯度)对混合物进行纯化，得到化合物292(1.7mg,收率8％)。
ESI-MS m/z：1444(M+H)+
工序165
将实施例16的工序163中合成的化合物291(20mg,0.016mmol)、N-(6-马来酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺(9.6mg,0.031mmol)溶解于四氢呋喃(2mL)中，加入二异丙基乙基胺(0.027mL,0.078mmol)，于室温搅拌一整夜。利用反相高效液相色谱法(Waters,XBridgeC18,5μm,4.6mmx250mm，基于0.01％三氟乙酸水溶液、B液:乙腈的梯度)对混合物进行纯化，得到化合物293(1.8mg,收率8％)。
ESI-MS m/z：1498(M+H)+
实施例17核酸复合物的合成
[化学式203]
Figure BDA0001746597290002321
工序166
使用实施例16的工序164中合成的化合物292，利用与实施例10的工序40同样的方法，得到单链核酸复合物294。
工序167
使用实施例16的工序165中合成的化合物293，利用与实施例9的工序38同样的方法，得到单链核酸复合物295。
将利用本实施例合成的核酸复合物的序列及质量分析结果示于第56表。
第56表
[表56]
Figure BDA0001746597290002331
利用实施例9的工序39同样的方法，使用第56表记载的单链核酸复合物，得到第57表记载的双链核酸复合物。
将利用本实施例合成的核酸复合物的序列示于第58表。
第57表
[表57]
Figure BDA0001746597290002332
第58表
[表58]
Figure BDA0001746597290002333
试验例5核酸复合物针对小鼠原代肝细胞的体外活性
针对实施例及比较例中得到的各核酸复合物中的第59表，分别利用以下的方法，将它们导入至来自CD-one(CD-1)的小鼠原代肝细胞(Life Technologies公司制，目录编号MSCP10)。
利用Opti-MEM(GIBCO公司，31985)对各核酸复合物进行稀释，使最终浓度成为30、10或3nmol/L，将稀释后的各核酸复合物以每孔20μL的方式分别注入于96孔的培养板，然后以细胞数成为12500/80μL/孔的方式，将悬浮于含有原代肝细胞的解冻及培养补充剂(Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements)(Life Technologies公司制，目录编号CM3000)的William’s E培养基(William’s E Medium)(Life Technologies公司制，目录编号A12176-01)中的小鼠原代肝细胞进行接种，在37℃、5％CO2的条件下培养6小时，然后小心除去培养上清液，添加含有原代肝细胞维持补充剂(Primary HepatocyteMaintenance Supplements)(Life Technologies公司制，目录编号CM4000)的William’s E培养基。另外，作为阴性对照组，接种未作任何处理的细胞。
将导入有各制剂的细胞在37℃的5％CO2培养箱内培养18小时，利用经冰冷却的磷酸缓冲生理盐水进行洗涤，使用SuperPrep Cell Lysis&RT Kit for qPCR(东洋纺公司制，目录编号SCQ-201)，按照制品中附带的说明书所记载的方法，回收总RNA，并通过以得到的总RNA为模板的逆转录反应进行cDNA的制作。
以得到的cDNA为模板，并以TaqMan(注册商标)基因表达测定探针(AppliedBiosystems公司制)作为探针，使用QuantStudio 12K Flex实时PCR系统(ABI公司制)，按照附带的使用说明书中记载的方法，进行PCR反应，由此使Serpin peptidase inhibitor,clade C(antithrombin),member 1(别称为antithrombin III，以下记为AT3)基因及作为组成型表达基因的甘油醛3-磷酸脱氢酶(D-glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，以下记为gapdh)基因进行PCR反应，分别测定mRNA扩增量，以gapdh的mRNA扩增量作为内部对照，算出AT3的mRNA的准定量值。将以同样的方式测得的阴性对照中的AT3的mRNA的准定量值作为1，根据AT3的mRNA的准定量值求出AT3的mRNA的表达率。将得到的AT3的mRNA的表达率的结果以相对于阴性对照的AT3 mRNA表达率而言的抑制率的形式示于第60-66表中。
第59表
[表59]
受试物编号 化合物编号
1 AT3-siRNA
2 53(3’-AT3-siRNA)
3 42(3’-AT3-siRNA)
4 264(3’-AT3-siRNA)
5 261(3’-AT3-siRNA)
6 285(3’-AT3-siRNA)
7 251(3’-AT3-siRNA)
8 252(3’-AT3-siRNA)
9 275(3’-AT3-siRNA)
10 276(3’-AT3-siRNA)
11 277(3’-AT3-siRNA)
12 278(3’-AT3-siRNA)
13 279(3’-AT3-siRNA)
14 280(3’-AT3-siRNA)
15 281(3’-AT3-siRNA)
16 282(3’-AT3-siRNA)
17 283(3’-AT3-siRNA)
18 284(3’-AT3-siRNA)
19 262(3’-AT3-siRNA)
20 263(3’-AT3-siRNA)
21 255(3’-AT3-siRNA)
22 253(3’-AT3-siRNA)
23 254(3’-AT3-siRNA)
24 257(3’-AT3-siRNA)
25 256(3’-AT3-siRNA)
26 258(3’-AT3-siRNA)
27 266(3’-AT3-siRNA)
28 265(3’-AT3-siRNA)
29 267(3’-AT3-siRNA)
30 268(3’-AT3-siRNA)
31 269(3’-AT3-siRNA)
32 270(3’-AT3-siRNA)
33 271(3’-AT3-siRNA)
34 272(3’-AT3-siRNA)
35 273(3’-AT3-siRNA)
36 274(3’-AT3-siRNA)
37 286(3’-AT3-siRNA)
38 287(3’-AT3-siRNA)
第60表
[表60]
Figure BDA0001746597290002361
第61表
[表61]
Figure BDA0001746597290002362
第62表
[表62]
Figure BDA0001746597290002363
第63表
[表63]
Figure BDA0001746597290002364
第64表
[表64]
Figure BDA0001746597290002371
第65表
[表65]
Figure BDA0001746597290002372
第66表
[表66]
Figure BDA0001746597290002373
由第60～第66表可知，本发明的核酸复合物(受试物编号3～38)可抑制导入至小鼠原代肝细胞后的AT3基因的mRNA的表达。
试验例6核酸复合物在小鼠中的体内活性
针对实施例及比较例中得到的各核酸复合物中的第59表，分别利用以下的方法实施体内(in vivo)评价试验。需要说明的是，各核酸复合物根据试验利用磷酸缓冲生理盐水(DPBS)(Nacalai Tesque公司制)进行稀释而使用。将小鼠(BALB/cA，自CLEA JAPAN获得)驯化饲养后，对各小鼠以1.5mg/kg或0.5mg/kg的量皮下注射施予各核酸复合物。另外，作为对照组，对小鼠皮下仅注射施予PBS。自施予3天后，在异氟烷麻醉下从后大静脉后部静脉采血。将采集的血液与含有3.2M柠檬酸钠及5mmol/L D-葡萄糖的抗凝固液以体积比9:1混合，回收离心后的上清液，从而得到血浆。在采血后使动物安乐死，采集肝脏并用液氮冷冻保存。针对肝脏冷冻样品，使用Trizol(注册商标)RNA分离试剂(Life Technologies公司制，目录编号15596026)及RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司制，目录编号74106)，按照制品中附带的说明书所记载的方法，进行总RNA的回收。进而使用Transcriptor First Strand cDNASynthesis Kit(Roche公司制，目录编号04897030001)，按照制品中附带的说明书所记载的方法，并通过以得到的总RNA为模板的逆转录反应进行cDNA的制作。以得到的cDNA为模板，并以TaqMan(注册商标)基因表达测定探针(Applied Biosystems公司制)作为探针，使用QuantStudio 12K Flex实时PCR系统(ABI公司制)，按照附带的使用说明书中记载的方法，进行PCR反应，由此使AT3基因及gapdh基因进行PCR反应，分别测定mRNA扩增量，以AT3的mRNA扩增量作为内部对照，算出AT3的mRNA的准定量值。将以同样方式测得的对照组中的AT3的mRNA的准定量值作为1，根据AT3的mRNA的准定量值求出AT3的mRNA的表达率。另外，使用小鼠抗凝血酶III ELISA试剂盒(Abcam公司制，目录编号ab108800)，按照附带的使用说明书中记载的方法，测定血浆中的AT3蛋白质浓度。将得到的AT3的mRNA的表达抑制率及血浆中AT3蛋白质浓度示于表67-69。
第67表
[表67]
Figure BDA0001746597290002391
第68表
[表68]
Figure BDA0001746597290002392
第69表
[表69]
Figure BDA0001746597290002401
由表67～69可知，本发明的核酸复合物(受试物编号3～22、24、25、27～33)可在生物体内使AT3基因的表达降低，并使血中的AT3蛋白质浓度减少。
试验例7核酸复合物针对人原代肝细胞的体外(in vitro)活性
针对实施例15中得到的B2M-siRNA(受试物39)、260_3’-B2M-siRNA(受试物40)，分别利用以下的方法，将它们导入至人原代肝细胞(Biopredic international公司制，目录编号HEP187)。
利用Opti-MEM(GIBCO公司，目录编号31985)对各核酸复合物进行稀释，使最终浓度成为300、100、30、10、3、1nmol/L，将稀释后的各核酸复合物以每孔20μL的方式分别注入于96孔的培养板，然后将以成为1.25×105细胞/mL的方式悬浮于接种培养基(Platingmedium)(Biopredic international公司制，目录编号LV0304-2)中的人原代肝细胞进行接种，使细胞数成为80μL/孔，在37℃、5％CO2的条件下培养6小时，然后小心除去培养上清液，添加培养基(Incubation medium)(Biopredic international公司制，目录编号LV0304-2)。另外，作为阴性对照组，接种未作任何处理的细胞。
将导入有各制剂的细胞在37℃的5％CO2培养箱内培养18小时，利用经冰冷却的磷酸缓冲生理盐水进行洗涤，使用SuperPrep Cell Lysis&RT Kit for qPCR(东洋纺公司制，目录编号SCQ-201)，按照制品中附带的说明书所记载的方法，回收总RNA，并通过以得到的总RNA为模板的逆转录反应进行cDNA的制作。
以得到的cDNA为模板，并以TaqMan(注册商标)基因表达测定探针(AppliedBiosystems公司制)作为探针，使用QuantStudio 12K Flex实时PCR系统(ABI公司制)，按照附带的使用说明书中记载的方法，进行PCR反应，由此使Beta-2微球蛋白(以下记为B2M)基因及作为组成型表达基因的甘油醛3-磷酸脱氢酶(D-glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，以下记为gapdh)基因进行PCR反应，分别测定mRNA扩增量，以gapdh的mRNA扩增量作为内部对照，算出B2M的mRNA的准定量值。将以同样方式测得的阴性对照中的B2M的mRNA的准定量值作为1，根据B2M的mRNA的准定量值求出B2M的mRNA的表达率。将得到的B2M的mRNA的表达率的结果以相对于阴性对照的B2M mRNA表达率而言的抑制率的形式示于表70。
第70表
Figure BDA0001746597290002411
试验例8核酸复合物针对来自人单核细胞的巨噬细胞的mRNA敲减活性的评价
使用含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基(Nacalai Tesque公司制,30264-56)(以下记载为10％FBS RPMI1640培养基)及DNase I溶液(DNase I Solution,StemCellTechnology公司制,07900)，依照附带的操作说明，将人CD14阳性单核细胞(UntouchedFrozen NPB-CD14+Monocytes,Allcells公司制,PB011F)溶解。
然后，以最终浓度成为100ng/mL的方式添加重组人粒细胞单核细胞集落刺激因子(Recombinant Human GM-CSF Protein CF,R&D System公司制,215-GM-050/CF)(以下记载为GM-CSF)，以106细胞/mL的密度接种于多孔板(multiplate)(SUMILON公司制,MS-8196F5)中，在37℃、5％CO2的条件下进行培养。
自开始培养6天后，除去培养上清液，以每孔80uL的方式将包含GM-CSF 100ng/mL的10％FBS RPMI1640培养基添加于各孔中。
作为受试样品，使用以Beta-2微球蛋白(以下记载为B2M)及HPRT-1作为靶标的核酸复合物296_3’-B2M-siRNA(受试物41)，另外使用B2M-siRNA(受试物42)作为分别与这些核酸复合物相对应的对照。受试样品的最终浓度设定为1μmol/L、0.3μmol/L、0.1μmol/L这3点，以N＝3进行实施。
关于核酸复合物溶液的稀释，按照以下步骤进行。使用Opti-MEM(Opti-MEM(R)IReduced Serum Medium)(Life technologies公司制,31985-070)，对在柠檬酸缓冲液(20mM Citrate(pH7),150mM NaCl)中制备的核酸溶液进行稀释。以每份20μL的方式将稀释后的核酸溶液添加至细胞溶液中，在阴性对照组中，添加20μL的不含核酸的柠檬酸缓冲液/Opti-MEM混合溶液，在37℃、5％CO2的条件下培养4天。
在含有RNA的细胞溶解液的制备中，使用SuperPrep Cell Lysis&RT Kit forqPCR(TOYOBO公司制,SCQ-101)，并使用附属于同一试剂盒的RT Kit for qPCR，按照试剂盒中附带的说明书进行逆转录反应，制作cDNA。
以该cDNA作为PCR反应的模板，使用QuantStudio 12K Flex实时PCR系统(AppliedBiosystems公司制)，利用TaqMan探针(Taqman probe)法以下述方式进行实施。在对B2M基因的敲减效果进行定量的情况下，使B2M及作为对照的HPRT-1的基因进行PCR反应，分别测定mRNA扩增量，以HPRT-1的mRNA扩增量作为内部对照，算出B2M的mRNA的准定量值。
在B2M基因的测定中，使用TaqMan探针Hs00187842_m1(Applied Biosystems公司制)，反应试剂使用TaqMan基因表达预混合液(TaqMan Gene Expression Master Mix)(Applied Biosystems公司制,4369542)，按照附带的操作说明而实施。核酸的靶标mRNA量以将阴性对照组(未导入核酸组)中的B2M的mRNA量作为1时的相对比例的形式算出。将以平均值±标准偏差的形式表示该mRNA量的相对比例的结果示于表71。
第71表
[表71]
Figure BDA0001746597290002431
根据上述结果确认到，与作为对照的B2M-siRNA(受试物42)相比，本发明的核酸复合物(受试物41)在来自人单核细胞的巨噬细胞中显示出显著的敲减效果。
产业上的可利用性
本发明的核酸复合物用于施予至哺乳动物，并在生物体内治疗各种相关疾病。
序列表自由文本
序列号1表示ApoBASO的碱基序列。
序列号2表示AT3-ssRNA的碱基序列。
序列号3表示AT3-asRNA的碱基序列。
序列号4表示B2M-ssRNA的碱基序列。
序列号5表示B2M-asRNA的碱基序列。
序列号6表示CD45ASO的碱基序列。
序列号7表示3’-dT10的碱基序列。
序列号8表示Hprt1-ssRNA的碱基序列。
序列号9表示Hprt1-asRNA的碱基序列。
Figure IDA0001746597320000011
Figure IDA0001746597320000021
Figure IDA0001746597320000031
Figure IDA0001746597320000041
Figure IDA0001746597320000051
Figure IDA0001746597320000061
Figure IDA0001746597320000071
Figure IDA0001746597320000081
Figure IDA0001746597320000091
Figure IDA0001746597320000101
Figure IDA0001746597320000111
Figure IDA0001746597320000121
Figure IDA0001746597320000131
Figure IDA0001746597320000141
Figure IDA0001746597320000151
Figure IDA0001746597320000161
Figure IDA0001746597320000171
Figure IDA0001746597320000181
Figure IDA0001746597320000191
Figure IDA0001746597320000201

Claims (8)

1.核酸复合物，其具有下述式7-1～式7-9表示的任一结构，
式7-1：
Figure FDA0003272461820000011
式7-2：
Figure FDA0003272461820000012
式7-3：
Figure FDA0003272461820000021
式7-4：
Figure FDA0003272461820000022
式7-5：
Figure FDA0003272461820000031
式7-6：
Figure FDA0003272461820000032
式7-7：
Figure FDA0003272461820000041
式7-8：
Figure FDA0003272461820000042
式7-9：
Figure FDA0003272461820000051
式7-1～7-9中，
X为寡核苷酸，
L1及L2各自独立地为糖配体，
S3为接头。
2.如权利要求1所述的核酸复合物，其中，所述糖配体为甘露糖或N-乙酰半乳糖胺。
3.如权利要求1所述的核酸复合物，其中，所述寡核苷酸包含修饰核苷酸。
4.药物组合物，其含有权利要求1所述的核酸复合物。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其用于导入至细胞内。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其中，所述细胞为肝细胞。
7.如权利要求4～6中任一项所述的药物组合物，其经静脉内施予或经皮下施予。
8.权利要求1～3中任一项所述的核酸复合物或权利要求4～6中任一项所述的药物组合物在制备用于对需要其的患者的疾病进行治疗或预防的药物中的用途。
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