CN103649311A - 寡核苷酸衍生物、包含寡核苷酸衍生物的治疗用医药组合物及诊断用医药组合物、以及miRNA机能抑制用寡核苷酸衍生物 - Google Patents

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Abstract

一种寡核苷酸衍生物，由通过下述一般式（一般式中，B表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶，X表示硫原子或氧原子，n表示6～60的整数。）表示的重复结构单元（所述一般式中，B以及X，在各个重复结构单元中独立表示）构成，且所述一般式表示的重复结构单元中至少有一个其X是硫原子。
Figure DDA0000427746820000011

Description

寡核苷酸衍生物、包含寡核苷酸衍生物的治疗用医药组合物及诊断用医药组合物、以及miRNA机能抑制用寡核苷酸衍生物
技术领域
本发明涉及一种寡核苷酸衍生物、包含寡核苷酸衍生物的治疗用医药组合物以及治疗用医药组合物、以及诊断用医药组合物、和miRNA机能抑制用寡核苷酸衍生物。
背景技术
近年来，通过RNA干扰（RNAi）的发现、转录组学分析方法的进步等，RNA相关的研究正在飞跃发展。显然，RNA在生物学上控制多种重要的机能。RNA和包含癌症的各种疾病之间的关联性被提出来。
通过RNA的机能控制进行疾病治疗的相关研究盛行起来，以RNA为目标的药品的开发研究也越来越广泛。其中，通过核酸的RNA控制法、是以沃森-克里克模型的碱基对形成为基础，使用作为目标的RNA上的序列特殊的核酸。这样的RNA控制法，由于直接控制RNA，所以能够进行细胞机能的调节。
近年来，作为通过核酸的RNA控制法、确立了反义方法或RNAi法等方法论。此外，以微RNA（以下称为miRNA）的机能抑制为目的的核酸医药相关的研究正在进行（非专利文献1）。
应用了通过核酸的RNA控制法的核酸医药中，存在以下问题：（1）导致通过存在于细胞内外的核酸酶的分解的效果消失；（2）双链构象多态性分析的热不稳定性；（3）细胞以及组织靶向；（4）通过天生免疫应对产生的副作用等。
为克服上述问题，核酸医药的药物开发时，通过在核酸中实施一些化学修饰，赋予对于核酸酶的抵抗性、双链构象多态性分析的热稳定性、先天性免疫应答的回避机能等的机能的研究正在进行中。根据其报告，核酸的糖部2'位羟基甲基化的2’-O-甲基RNA具有核酸酶抵抗性、热稳定性以及先天性免疫应答的回避机能（非专利文献2，3）。此外，还报告称，将核苷糖基呋喃环4’位氧原子置换成硫原子的4’-硫代RNA具有核酸酶抵抗性以及热稳定性（非专利文献4）。
（先行技术文献）
非专利文献
非专利文献1：Robert E.Lanford et al,Science,327,198-201(2010)
非专利文献2：Cummins L.L.et al,Nucleic Acids Res.23,2019-2024(1995)
非专利文献3：Judge A.D.et al,Mol.Ther.13,494-505(2006)
非专利文献4：Hoshika S.,Minakawa N.and Matsuda A.,Nucleic Acids Res.32,3815-3825(2004)
发明内容
（本发明要解决的问题）
然而，非专利文献2以及3中所述的2’-O-甲基RNA中，在生物体内的环境说不上十分稳定，而且，效果的持续性这一点也是残留的问题。此外，非专利文献4中记载的4’-硫代RNA具有核酸酶抵抗性，为了能作为核酸医药在生物体内使用，有望开发核酸酶抵抗性更好的修饰RNA。
鉴于以上事情，本发明以提供一种具有在生物体内使用方面耐性良好的效果持续性、以及热稳定性的寡核苷酸衍生物、包含寡核苷酸衍生物的治疗用医药组合物以及治疗用医药组合物以及诊断用医药组合物、和miRNA机能抑制用寡核苷酸衍生物为目的。
（解决问题的方法）
为达到上述目的，本发明的第1观点相关的寡核苷酸衍生物，由通过下述一般式
[化1]
Figure BDA0000427746800000031
（一般式中，B表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶，X表示硫原子或者氧原子、n表示6～60的整数）表示的重复结构单元构成（所述一般式中，B以及X，在各个重复结构单元中独立表示），所述一般式表示的重复结构单元中至少有一个其X是硫原子。
通过所述一般式表示的重复结构单元中的全部的X都可以是硫原子。
所述寡核苷酸衍生物的5’末端、3’末端、或者5’末端以及3’末端上可以结合有至少一个配位体。
所述寡核苷酸衍生物由miRNA的全序列或部分序列的互补性序列构成。
所述miRNA可以是miRNA21。
所述miRNA可以是miRNA122。
本发明的第2观点相关的治疗用医药组合物包含所述寡核苷酸衍生物。
所述诊断用医药组合物，可以抑制miRNA的机能。
本发明的第3观点相关的诊断用医药组合物包含所述寡核苷酸衍生物。
本发明的第4观点相关的miRNA机能抑制用寡核苷酸衍生物由通过下述一般式
[化2]
Figure BDA0000427746800000041
（一般式中，B表示腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶或尿嘧啶，X表示硫原子或氧原子，n表示6～60的整数）表示的重复结构单元构成（所述一般式中，B以及X独立表示各个重复结构单元），所述一般式表示的重复结构单元中的至少有一个其X是硫原子。
通过所述一般式表示的重复结构单元的全部的X都可以是硫原子。
所述寡核苷酸衍生物的5’末端、3’末端、或者5’末端以及3’末端上结合有至少一个配位体。
所述寡核苷酸衍生物可以由miRNA的全序列或者部分序列的互补性序列构成。
所述miRNA可以是miRNA21。
所述miRNA可以是miRNA122。
（本发明的效果）
根据本发明，可以提供一种能经受住生物体内使用并具有良好的效果持续性以及热稳定性的寡核苷酸衍生物、包含寡核苷酸衍生物的治疗用医药组合物以及治疗用医药组合物以及诊断用医药组合物、和miRNA机能抑制用寡核苷酸衍生物。
附图说明
图1是表示各非共轭AMO21的序列以及Tm值的示意图。
图2是表示各非共轭AMO122的序列以及Tm值的示意图。
图3是表示用于根据各AMO进行miRNA抑制效果的评价的报道载体的示意图。
图4是表示根据各AMO进行的miRNA抑制效果的评价协议的示意图。
图5是表示根据非共轭AMO21的miRNA21的抑制效果的坐标图
图6是表示根据非共轭AMO122的miRNA122抑制效果（共转染24小时后）的坐标图。
图7是表示根据非共轭AMO122的miRNA122抑制效果（共转染48小时后）的坐标图。
图8是表示根据非共轭AMO122的miRNA122抑制效果（共转染72小时后）的坐标图。
图9是表示根据非共轭AMO122的miRNA122抑制效果的随时间变化的坐标图。
图10是表示根据共轭AMO122的miRNA122抑制效果（共转染24小时之后）的坐标图。
图11是表示根据共轭AMO122的miRNA122抑制效果（共转染48小时之后）的坐标图。
图12是表示根据共轭AMO122的miRNA122抑制效果（共转染72小时之后）的坐标图。
图13是表示根据AMO122_SMe_PS的miRNA122抑制效果（共转染48小时之后）的坐标图（实时PCR法）。
具体实施方式
以下对本发明的实施方式进行详细的说明。
（1.寡核苷酸衍生物）
首先，对通过本发明的寡核苷酸衍生物的结构进行详细的说明。
根据本发明寡核苷酸衍生物，由通过下述一般式（1）表示的重复结构单元构成。本说明书中的寡核苷酸衍生物是寡核苷酸中的核苷酸由如下述一般式（1）表示的方式被化学修饰。另外，根据本发明的寡核苷酸衍生物包含：寡核苷酸中至少有一个核苷酸包含如下述一般式（1）表示的方式被化学修饰的寡核苷酸衍生物。这时，适合使用的寡核苷酸衍生物是，寡核苷酸的全长中至少50%以上的核苷酸是如下述一般式（1）表示的方式被化学修饰。
[化3]
上述一般式（1）中，B表示腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶。下式表示各自的结构式及其简称。
[化4]
Figure BDA0000427746800000062
上述一般式（1）中，X表示硫原子和氧原子。本说明书中，X为硫原子时称作PS、X为氧原子时称作PO。PS和PO分别通过下式表示。
[化5]
上述一般式（1）中，n是通过上述一般式（1）表示的重复结构单元的数目，也就是说，表示根据本发明的寡核苷酸衍生物的单体数目，为6～60的整数。关于单体数目（=n），将在后面说明。
上述一般式（1）中，B以及X在各个重复结构单元中独立表示。也就是说，在寡核苷酸衍生物中，可以混合有B以及X各自不同的重复结构单元。例如，寡核苷酸衍生物中的一个重复结构单元中B是腺嘌呤、X是硫原子，同一寡核苷酸衍生物中其他的重复结构单元中B是鸟嘌呤、X是氧原子，同一寡核苷酸衍生物中的其他重复单元中，还可以是B为胞嘧啶、X为氧原子。
根据本发明的寡核苷酸衍生物，所述一般式（1）表示的重复结构单元的至少一个其X为硫原子。也就是说，根据本发明的寡核苷酸衍生物，至少包含一个X为硫原子的通过所述一般式(1)表示的重复结构单元，即PS。
根据本发明的寡核苷酸衍生物，所有所述一般式（1）表示的重复结构单元，X都可以为硫原子。也就是说，寡核苷酸衍生物中包含的所有通过上述一般式（1）表示的重复结构单元都可以是PS。PS构成的寡核苷酸衍生物，即硫代磷酸，由于具有在生物体内使用上耐性良好的效果持续性以及热稳定性，所以可很好地应用于根据本发明的寡核苷酸衍生物。
下面，将对根据本发明的寡核苷酸衍生物的机能进行详细的说明。
根据本发明的寡核苷酸衍生物，可以作为以RNA当成了目标的核酸（反义核酸化合物）被广泛应用。本说明书中，所谓反义核酸化合物，是一种作为目标的RNA的整个序列或者部分序列的互补性序列构成的寡核苷酸衍生物，是指寡核苷酸中的全部或者部分的核苷酸被化学修饰过的部分。可将根据本发明的寡核苷酸衍生物用于例如mRNA的直接控制、miRNA的机能控制等。
将根据本发明的寡核苷酸衍生物用于mRNA的直接控制时，使用作为目标的mRNA的全序列或者部分序列的互补性序列构成的寡核苷酸衍生物。这种情况下，例如，根据以下机制会产生翻译障碍。例如，从pre-mRNA到mRNA的接片中，通过根据本发明的寡核苷酸衍生物与pre-mRNA结合，产生Cap形成阻碍、拼接阻碍、通过RNase切断、腺嘌呤化阻碍等。此外，例如由mRNA翻译的过程中，通过根据本发明的寡核苷酸衍生物与mRNA结合，产生核糖体结合阻碍（Translational Arrest）。根据本发明的寡核苷酸衍生物，由于具有在生物体内耐性良好的效果持续性、以及
热稳定性，所以能够有效的直接控制mRNA。
将根据本发明的寡核苷酸衍生物用于mRNA的直接控制的情况下，优选使用6～60mer的寡核苷酸衍生物，更优选15～25mer的寡核苷酸衍生物。只要是本发明中奏效的寡核苷酸衍生物的长度，就可以适当选择。另外，本发明中，可以理解为包含关于使用根据本发明的寡核苷酸衍生物直接控制mRNA的方法的方式。
根据本发明的寡核苷酸衍生物，例如可以适用于miRNA的机能控制。
近年来，miRNA控制细胞增殖、生殖机能等生物学上重要的机能，被指出与多种疾病具有关联性。作为根据miRNA接受调节的生理机能，广为人知的是分化、细胞增殖、繁殖力、细胞死亡、代谢、造血、心脏发育、形态形成、胰岛素分泌、信号传递等。这样，众所周知，miRNA在细胞的生存中担当着重要的作用，通过miRNA的发现异常等引起的基因发现的失调，是癌症等疾病发生的原因。
近年来，大约有900种miRNA被鉴别出。例如，各种癌症中的上调或下调的miRNA如下所示（表1）。
[表1]
Figure BDA0000427746800000091
例如，miRNA21（序列号1）上调肝癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、肺癌等多种癌症（表1）。
例如，众所周知，miRNA122（序列号2）是在肝脏里特别发现的miRNA，在小白鼠胚形成时增加，控制肝脏的发达。此外，也与胆固醇、脂质的代谢的控制或者HCV的复制相关。
根据本发明的寡核苷酸衍生物，可以由miRNA的全序列或者部分序列的互补性序列构成。这种情况下，可以作为以miRNA为目标的反义核酸（anti-miRNA oligonucleotide;以下称为AMO）使用。根据本发明AMO由miRNA的部分序列的互补性序列构成时，本发明的奏效的序列的话，可以进行适当选择。
miRNA的全序列或者部分序列的互补性序列构成。例如将根据本发明的寡核苷酸衍生物（以下称为根据本发明的AMO）送入生物体内时，根据本发明的AMO在生物体内形成miRNA和双链，产生miRNA的机能控制。由于根据本发明的AMO，具有在生物体内耐性良好的效果持续性、以及热稳定性，所以可以实现miRNA的有效机能控制。
根据本发明的AMO，可以将所有种类的miRNA作为目标。这是由于可以合成具有各种的miRNA的互补性序列的AMO。根据本发明的AMO，例如可以把以下物质作为目标：miRNA21，miRNA122，miRNA224，miRNA10b，miRNA221，miRNA222，miRNA20，miRNA18，miRNA23a，miRNA141，miRNA200b，miRNA27a，miRNA342，miRNA26a，miRNA30d，miRNA26b，miRNA107，miRNA203，miRNA204，miRNA211，miRNA105，miRNA181a，miRNA155，miRNA181b，miRNA25，miRNA424，miRNA151，miRNA223，miRNA25，miRNA17-5p，miRNA125b，miRNA106a，miRNA92，miRNA103，miRNA93，miRNA100，miRNA106b，miRNA20a，miRNA190，miRNA33，miRNA19a，miRNA140，miRNA123，miRNA188，miRNA154，miRNA217，miRNA101，miRNA196，miRNA134，miRNA132，miRNA192，miRNA16，miRNA15，miRNA200a，miRNA200c，miRNA191，miRNA210，miRNA32，miRNA182，miRNA31，miRNA146a等。作为以根据本发明的AMO为目标的miRNA，例如，可以举出“miRBase：the microRNAdatabase（http：//www.mirbase.org/）”中数据库化的miRNA，只要是本发明奏效的miRNA，就可以进行适当选择。
另外，本说明书中，所谓miRNA的机能，是指具有如前面所述的所有种类的miRNA所具有的细胞增殖、生殖机能等的生物学机能。如果是本发明奏效的miRNA的机能，可以适当进行选择。
根据本发明的AMO，为以miRNA-21作为目标，可以由miRNA-21的全序列或者部分序列的互补性序列构成。这种情况下，举例说明包含序列号3的序列的AMO（例如、AMO21-SMe-PS）。AMO21-SMe-PS的重复结构单元的式子如下所示。
[化6]
Figure BDA0000427746800000111
根据本发明的AMO，为以miRNA-122作为目标，可以由miRNA-122的全序列或者部分序列的互补性序列构成。这种情况下，举例说明包含序列号5的序列的AMO（例如、AMO122-SMe-PS）。AMO122-SMe-PS的重复结构单元的式子如下所示。
[化7]
Figure BDA0000427746800000112
使用根据本发明的寡核苷酸衍生物作为AMO时，优选使用6～60mer的AMO，更优选10～40mer的AMO，还更优选15～25mer的AMO。只要是适合本发明的奏效的寡核苷酸衍生物的长度，就可以进行适当选择。
根据本发明的AMO，作为目标的miRNA的全序列或部分序列的互补性序列构成的寡核苷酸衍生物中，1～20mer的寡核苷酸衍生物（以下称为附加序列）可以在5’末端、3’末端、或者5’末端和3’末端的双方结合。例如，以miRNA21为目标、包含序列号4的序列的AMO（32mer）的5mer的附加序列在AMO21-SMe-PS（22mer）的5’末端和3’末端的各端相结合。只要是本发明奏效的附加序列，就可以适当进行选择。
另外，本发明中可以理解为包含使用根据本发明的寡核苷酸衍生物控制miRNA的机能的方法的方式。
关于本发明的寡核苷酸衍生物的miRNA的机能控制的评价，例如，以miRNA122为目标时，在细胞中转染本发明的寡核苷酸衍生物并定量测量细胞内的miRNA122水平，与未处理的细胞进行比较，可以通过确认miRNA122水平降低来进行。此外，例如，给哺乳动物服用本发明的寡核苷酸衍生物并在肝脏中定量测量miRNA122水平，通过确认与服药前相比服药后miRNA122水平降低可以进行评价。
接着，对共轭寡核苷酸衍生物进行详细说明。
根据本发明的寡核苷酸衍生物可以是至少一个配位体结合的共轭寡核苷酸衍生物。本说明书中配位体，是指可以实现根据本发明的寡核苷酸衍生物的细胞靶向、组织靶向、机能性提高等的物质。
共轭寡核苷酸衍生物中，寡核苷酸衍生物的5’末端、3’末端、或者5’末端和3’末端这两者可以使配位体结合。根据普通方法，可以在寡核苷酸衍生物中使配位体结合。
共轭寡核苷酸衍生物中，可以在寡核苷酸衍生物中使多个配位体结合。这种情况下，优选使用2-5个配位体结合了的共轭寡核苷酸衍生物，更优选3个配位体结合了的共轭寡核苷酸衍生物。配位体是3个时，例如，可以在寡核苷酸衍生物的5’末端使3个配位体结合，也可以在3’末端使3个配位体结合，例如，还可以是5’末端使1个配位体结合，3’末端使2个配位体结合。只要是能产生本发明的效果的配位体个数，就可以进行适当选择。
作为可以用于根据本发明的共轭寡核苷酸衍生物的配位体的例子，可以举出生育酚，胆固醇，前列腺特异性膜抗原（PSMA），聚乙二醇，维生素A，叶酸，脂肪链，肽，转铁蛋白，适体，甘露糖，半乳糖胺（N-乙酰基半乳糖胺），对甲氧苯甲酰胺，识别其它表面抗原的低分子化合物或者高分子化合物等，或者上述组合。多个配位体结合了的共轭寡核苷酸衍生物中，可以是同种类的多个配位体结合，也可以是不同种类的配位体结合。只要是对本发明有效的配位体，就可以适当选择。
作为根据本发明的共轭寡核苷酸衍生物，例如，可以举出以下面的miRNA122当作了目标的共轭AMO。
AMO122_SMe_PS_5'Toc（序列号5）AMO122_SMe_PS的5’末端生育酚结合
AMO122_SMe_PS_5'Chol（序列号5）AMO122_SMe_PS的5’末端胆固醇结合
AMO122_SMe_PS_3'Chol（序列号5）AMO122_SMe_PS的3’末端胆固醇结合
AMO21_SMe_PS_5'PMSA（序列号3）AMO021_SMe_PS的5’末端前列腺特异性膜抗原（PSMA）结合
[化8]
Figure BDA0000427746800000131
[化9]
Figure BDA0000427746800000132
[化10]
Figure BDA0000427746800000133
[化11]
Figure BDA0000427746800000141
通过根据本发明的共轭寡核苷酸衍生物实现寡核苷酸衍生物的细胞靶向、组织靶向、机能性提高等。例如，通过将生育酚作为配位体使用的共轭寡核苷酸衍生物，可以实现肝脏组织靶向；通过将前列腺特异性膜抗原（PSMA）作为配位体使用的共轭寡核苷酸衍生物，可以实现前列腺组织靶向，例如，通过将聚乙二醇作为配位体使用的共轭寡核苷酸衍生物改善血液滞留性。此外，多个配位体结合的共轭寡核苷酸衍生物的情况下，例如，通过将多个在某个受体上结合的配位体结合，可以提高配位体和受体之间的相互作用，可以更切实地实现组织靶向。还有，例如通过使用将生育酚和聚乙二醇组合后的配位体进行结合后的共轭寡核苷酸衍生物，可以同时实现组织靶向以及血液滞留性改善，所以更切实地实现肝组织靶向。
接着，对根据本发明的寡核苷酸衍生物的合成方法进行说明。
根据本发明的寡核苷酸衍生物，例如可以使用DNA合成仪、通过amidite法合成。例如通过SME-PS构成的AMO（硫代磷酸）的情况下，使用附着了2’-OMe-4’-硫代（糖基呋喃环2’位羟基被甲基化，糖基呋喃环4’氧原子被硫原子置换）核糖核苷的controlled pore glass（CPG），以及2’-OMe-4’-硫代核糖核苷的amidite体，通过3H-1，2-苯并二硫杂环戊二烯-3-酮-1，1-二氧化物（view cage试剂）将磷酸硫化，从而可以进行合成。共轭寡核苷酸衍生物，例如是AMO122_SMe_PS_5'Toc的情况下，使用由α-生育酚合成的α-生育酚的amidite体，可以同上述一样进行合成。例如是AMO21_SMe_PS_5'PMSA的情况下，使用由L-赖氨酸合成的5'PMSA的配位体的amidite体，可以同上述一样进行合成。用于通过amidite法的缩合反应的各种CPG以及amidite体，可以使用市场上销售的物品。另外，只要是对本发明奏效的合成方法，就可以进行适当选择。
(2.治疗用医药组合物)
包含根据本发明的寡核苷酸衍生物的治疗用医药组合物，例如，以mRNA的直接控制，miRNA的机能控制等为媒介发挥治疗效果。
以miRNA的机能控制为媒介的时候，例如，如前面所述，由于在肝脏癌、胰腺癌、胃癌、乳癌、肺癌等多种癌症中miRNA21上调，所以通过服用miRNA21为目标的AMO，在生物体内控制miRNA21的机能，可以对上述癌症发挥治疗效果。此外，例如，miRNA122如前面所述，由于与HCV的复制相关，通过服用以miRNA122作为目标的AMO，可以抑制miRNA122的机能，针对C型肝炎可以发挥治疗效果。只要是对本发明有效的适用疾病，就可以进行适当选择。
根据本发明的寡核苷酸衍生物，由于具有在生物体内耐性良好的效果持续性、以及热稳定性，所以可以有效实现miRNA的机能控制，有可能得到有效的治疗。
给哺乳动物服用根据本发明的治疗用医药组合物时，可以进行例如注射、口服用药、舌下含药等服药方法。通过注射服药时，可以通过例如静脉内注射，动脉内注射，皮内注射，皮下注射，肌内注射，腹腔内注射等进行，关于剂型，可以通过注射剂，口服剂、片剂，颗粒剂，散剂进行适当调制。注射剂的话，可以通过注射含水注射剂，非水性注射剂，悬浮注射剂，固体注射等进行适当调制。注射剂的话，可以包含增溶剂，缓冲剂，等渗剂，稳定剂，防腐剂，舒缓剂等添加剂。口服剂的话，可以适当包含平时常用的赋形剂，粘合剂，崩解剂，增稠剂，分散剂等。还有，治疗用医药组合物可以适当含有其它活性成分。只要是对本发明有效的服药方法、剂型、添加剂等，就可以进行适当选择。
给哺乳动物服用根据本发明的治疗用医药组合物时，例如，使寡核苷酸衍生物溶解在一般用于注射剂的溶剂里服用，也可以是寡核苷酸衍生物溶解在嵌入脂质体的溶剂里服用。只要是对本发明奏效的服药方法，都可以进行适当选择。
(3.诊断用医药组合物)
包含根据本发明的寡核苷酸衍生物的诊断用医药组合物，例如，可以以miRNA的机能控制等为媒介发挥治疗效果。
例如，对生物体内服用以作为某癌症的生物标志物的miRNA为目标的AMO时，如果结合AMO中从体外可以检测出的追踪剂，则通过目标miRNA中结合AMO，可以通过成像（例如PET）诊断癌症。此外，例如，在从生物体采集的组织、血液等中，通过添加某种标识（例如、荧光标识、放射性同位素标识等）标签过的AMO，可以进行目标miRNA的细胞内发现的确认、机能解析。还能够进行组织、血液等中的目标miRNA的定量测量。而且，例如，通过向生物体内投入AMO抑制目标miRNA的发现，可以进行miRNA发现解析。只要是对本发明奏效的诊断用途，都可以进行适当选择。
根据本发明的AMO，由于具有在生物体内耐性良好的效果持续性以及热稳定性，所以与生物体内稳定地目标miRNA结合的同时，还可以抑制目标miRNA的机能。因此，可以使用AMO做出确切的诊断。
关于根据本发明的诊断用医药组合物的服药方法、剂型、添加剂等，与前面所述相同。
（4.miRNA机能抑制用寡核苷酸衍生物）
本发明的miRNA机能抑制用寡核苷酸衍生物，与前面所述相同，下面一般式（1）
[化12]
Figure BDA0000427746800000161
（一般式中，B表示腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶或者尿嘧啶，X表示硫原子或者氧原子、n表示6～60的整数）表示的重复结构单元（上述一般式（1）中、B以及X，独立表示各个重复结构单元）构成，上述一般式（1）表示的重复结构单元中，至少有一个X是硫原子。此外，本发明的miRNA机能抑制用寡核苷酸衍生物中，与前面所述相同，通过上述一般式（1）表示的所有重复结构单元中，X可以是硫原子。这样由PS构成的miRNA机能抑制用寡核苷酸衍生物，即硫代磷酸具有在生物体内耐性良好的效果持续性以及热稳定性，所以可以很好地应用于本发明。
本发明的miRNA机能抑制用寡核苷酸衍生物与前面所述相同，在5’末端、3’末端、或者5’末端和3’末端中可以至少有一个的配位体结合。这样，通过共轭的miRNA机能抑制用寡核苷酸衍生物实现寡核苷酸衍生物的细胞靶向、组织靶向、机能性提高等。
根据本发明的miRNA机能抑制用寡核苷酸衍生物，可以抑制在生物体内或生物体外miRNA的机能。本发明的miRNA机能抑制用寡核苷酸衍生物，与前面所述相同，可以以所有种类的miRNA为目的。
关于本发明的miRNA机能抑制用寡核苷酸衍生物的miRNA机能抑制的评价，与前面所述相同，例如，以miRNA122为目标时，细胞中转染本发明的miRNA122机能抑制用寡核苷酸衍生物并定量测量细胞内的miRNA122水平，通过与未处理的细胞进行比较确认降低miRNA122水平来进行。此外，例如，还可以给哺乳动物服用本发明的miRNA122机能抑制用寡核苷酸衍生物定量测量肝脏内的miRNA122水平，通过与服用前相比确认服用后miRNA水平降低来进行评价。
本发明的miRNA机能抑制用寡核苷酸衍生物，与前面所述相同，可以由miRNA的全序列和部分序列的互补性序列构成。这种情况下，可以作为以miRNA作为目标的AMO使用。如果将本发明的miRNA机能抑制用寡核苷酸衍生物投入生物体内，则寡核苷酸衍生物在生物体内与miRNA形成双链，实现miRNA的机能抑制。此外，这种情况下的miRNA与前面所述一样，可以是miRNA21，也可以是miRNA122。
另外，本发明并不限定于上述实施方式，也可以进行各种变形和应用。
实施例1
以下列举实施例对本发明进行具体说明。但是，本发明并不限定于这些实施例。此外，如果没有特别注明，“%”表示质量%。
（AMO的合成）
通过以下的方法合成了各AMO。各AMO的名称以及序列号如下所示。另外，以下的实施例中，将与miRNA21完全互补性的AMO称为AMO21，与miRNA完全互补性的AMO称作AMO122。
1.非共轭AMO21
AMO21（32）-SMe（序列号4）
AMO21-SMe-PO（序列号3）
AMO21-SMe-PS（序列号3）
2.非共轭AMO122
AMO122-SMe-PO（序列号5）
AMO122-SMe-PS（序列号5）
3.共轭AMO122
AMO122-SMe-PS-5’Toc（序列号5）
AMO122-SMe-PS-5’Chol（序列号5）
AMO122-SMe-PS-3’Chol（序列号5）
4.共轭AMO21
AMO21-SMe-PS-5’PMSA（序列号3）
5.（比较例）非共轭AMO21
AMO21（32）-Me（序列号4）
AMO21-Me-PO（序列号3）
AMO21-FMe-PO(将AMO21-Me-PO的2’位甲氧基置换为氟)（序列号3）
AMO21-SFMe-PO(将AMO21-SMe-PO的2’位甲氧基置换为氟)（序列号3）
6.（比较例）非共轭AMO122
AMO122-Me-PO（序列号5）
AMO122-Me-PS（序列号5）
7.（比较例）共轭AMO122
AMO122-Me-PS-5’Toc（序列号5）
AMO122-Me-PS-5’Chol（序列号5）
AMO122-Me-PS-3’Chol（序列号5）
8.（比较例）共轭AMO21
AMO21-Me-PS-5’PMSA（序列号3）
非共轭AMO21的重复结构单元的一般式如下所示。
[化13]
Figure BDA0000427746800000191
非共轭AMO122的重复结构单元的一般式如下所示。
[化14]
共轭AMO122以及共轭AMO21的结构式以及重复结构单元的一般式如下所示。
[化15]
Figure BDA0000427746800000202
[化16]
Figure BDA0000427746800000203
[化17]
[化18]
Figure BDA0000427746800000212
[化19]
Figure BDA0000427746800000213
比较例中采用的非共轭AMO21的重复结构单元的一般式如下所示。
[化20]
Figure BDA0000427746800000221
比较例中采用的非共轭AMO122的重复结构单元如下所示。
[化21]
Figure BDA0000427746800000222
比较例中采用的共轭AMO122以及共轭AMO21的结构式以及重复结构单元的一般式如下所示。
[化22]
Figure BDA0000427746800000231
[化23]
Figure BDA0000427746800000232
[化24]
Figure BDA0000427746800000233
[化25]
Figure BDA0000427746800000241
[化26]
Figure BDA0000427746800000242
（通过A.Me-PO构成的AMO以及SMe-PO构成的AMO的合成方法）
利用ABI3400DNA合成仪（Applied Biosysitem社制），根据普通的DNA固相合成法合成。
通过Me-PO构成的AMO的缩合反应中，使用附着有1μmol的2’-OMe（核酸的糖基呋喃环2’位羟基被甲基化）核苷酸的CPG（GlenResearch社制）以及2’-OMe核苷酸的amidite体。将2’-OMe核苷酸的amidite体调制在0.1M的乙腈溶液中并用于缩合反应。
通过SMe-PO构成的AMO的缩合反应中，使用附着了1μmol的2’-OMe-4’-硫代（核酸的糖基呋喃环2’位羟基被甲基化，糖基呋喃环4’位氧原子被硫原子置换）核糖核苷的CPG以及2’-OMe-4’-硫代核糖核苷。附着了2’-OMe-4’-硫代核糖核苷的CPG以及2’-OMe-4’-硫代核糖核苷的amidite体，根据普通方法分别由附着了2’-OMe核苷酸的CPG以及2’-OMe核苷酸的amidite体合成。将2’-OMe-4’-硫代核糖核苷的amidite体调制在0.1M的乙腈溶液中并用于缩合反应。
通过3%TCA（三氯乙酸），除去附着了2’-OMe核苷酸的CPG或者附着了2’-OMe-4’-硫代核糖核苷的CPG的DMTr基之后，使用作为活化剂的1H-四唑，使各自缩合至2’OMe核苷酸的amidite体或2’-OMe-4’-硫代核糖核苷的amidite体。此外，缩合时间设定为600秒。之后，对于未反应的羟基使乙酸酐反应并加盖之后，使用作为氧化剂的碘在水存在的情况下氧化磷酸。通过重复该周期，合成附着在固相（CPG）的AMO。通过SMe-PO构成的AMO的合成方案如下所示。
[化27]
Figure BDA0000427746800000251
（通过B.Me-PS构成的AMO，以及通过SMe-PS构成的AMO的合成方法）
前面所述的A中，换成作为氧化剂的碘，使用3H-1，2-苯并二硫杂环戊二烯-3-对-1，1-二氧化物（view cage试药）使磷酸硫化，与前面所述A一样合成AMO。通过SMe-PS构成的AMO的合成方案如下所示。
[化28]
Figure BDA0000427746800000261
（C.共轭AMO的合成方法）
将α-生育酚的amidite体调制在0.1M的10%THF/乙腈溶液中，通过进行与前面所述B一样的缩合反应，得到AMO122-Me-PS-5’Toc，AMO122-SMe-PS-5’Toc。将α-生育酚的amidite体如下所述由α-生育酚合成。
[化29]
将5’Cholesteryl-TEG（三甘醇）的amidite体（Glen Research社制）调制在0.1M的10%THF/乙腈溶液中，通过进行与所述的B一样的缩合反应，得到AMO122-Me-PS-5’Chol，AMO122-SMe-PS-5’Chol。
使用附着了1μmol的3’Cholesteryl-TEG的CPG树脂（Glen Research社制），通过进行与所述的B同样的缩合反应，得到AMO122-Me-PS-3’Chol，AMO122-SMe-PS-3’Chol。
将5’-PMSA配位体的amidite体调制至0.1M的乙腈溶液中，通过进行与前面所述的B同样的缩合反应，得到AMO21-Me-PS-5’PMSA,AMO21-SMe-PS-5’PMSA。5’-PMSA配位体的amidite体如下所述由L-赖氨酸合成。
[化30]
Figure BDA0000427746800000291
（D.AMO21-FMe-PO以及AMO21-SFMe-PO的合成方法）
比较例的AMO21-FMe-PO,AMO21-SFMe-PO根据普通方法与前面所述A同样合成。
合成完成之后，将附着了AMO的CPG移动至样品瓶内，添加28%氨水/乙醇（3：1，2mL）在55℃环境下静置16小时。进行AMO的抠出、脱保护工作。通过玻璃过滤器过滤反应液，在减压下蒸馏掉溶剂。在5’末端残留的DMTr基的状态下合成的非共轭的AMO通过C18反相高效液相色谱法(HPLC)（J’sphere YMC ODS-M80，150×4.6mm，5-50%乙腈in0.1N TEAA缓冲区，pH7.0）进行部分提纯，回收包含具有DMTr基的完整链长的AMO的馏分并减压蒸馏掉溶剂。使用Sep-Pak C18（Waters）进行残渣的脱盐之后，添加盐酸（pH2.0）以室温加热20分钟进行处理除去5’末端的DMTr基。在稀释了其反应液的氨水溶液中进行中和之后，减压蒸馏掉溶液。将包含共轭以及非共轭的完整链长的AMO的残渣通过C18反相高效液相色谱法(HPLC)（J’sphere YMC ODS-M80，150×4.6mm，5-50%乙腈in0.1N TEAA缓冲区，pH7.0）提纯之后，通过使用Sep-Pak C18进行脱盐，得到高纯度的各AMO。
关于提纯过的各AMO的结构，通过MALDI-TOF/MASS spectrometry（ultraflex TOF/TOF，Bruker Daltonics）解析，求出其分子量。其分析结果如下所示。
AMO21_Me_PO:calculated mass,C231H302N82O150P217276.3(M-H);observedmass,7273.80.
AMO21_SMe_PO:calculated mass,C231H302N82O128P21S227627.80(M-H);observed mass,7626.50.
AMO122_Me_PO:calculated mass,C240H318N85O154P227539.40(M-H);observed mass,7538.52.
AMO122_Me_PS:calculated mass,C240H318N85O132P22S227891.89(M-H);observed mass,7886.64.
AMO122_SMe_PO:calculated mass,C240H318N85O131P22S237906.87(M-H);observed mass,7906.72.
AMO122_SMe_PS:calculated mass,C240H318N85O109P22S458261.36(M-H);observed mass,8261.66.
AMO122_Me_PS_5'Toc:calculated mass,C275H378N86O138P23S238543.28(M-H);observed mass,4546.78.
AMO122_SMe_PS_5'Toc:calculated mass,C275H378N86O115P23S468913.75(M-H);observed mass,8916.81.
AMO122_Me_PS_5'Chol:calculated mass,C281H390N86O140P23S238661.36(M-H);observed mass,8662.17.
AMO122_SMe_PS_5'Chol:calculated mass,C281H390N86O117P23S469030.83(M-H);observed mass,9033.77.
AMO122_Me_PS_3'Chol:calculated mass,C281H390N86O140P23S238661.36(M-H);observed mass,8662.04.
AMO122_SMe_PS_3'Chol:calculated mass,C281H390N86O117P23S469030.83(M-H);observed mass,9032.13.
AMO21_Me_PS_5'PSMA:calculated mass,C252H338N85O143P22S228231.99(M-H);observed mass,8231.99.
AMO21_SMe_PS_5'PSMA:calculated mass,C252H338N85O121P22S448585.49(M-H);observed mass,8585.49
图1表示非共轭AMO21（22mer系列：序列号3，32mer系列：4）的序列以及50%熔化温度（Tm值）。测定的Tm值的结果（测定条件：10mM磷酸盐缓冲液（pH7.0），0.1mM EDTA，1mM氯化钠，3μM strandconcentration）显示，根据本发明的实施例的非共轭AMO21包含作为互补性链RNA的miRNA21以及热量稳定的双链形成能。
图2表示非共轭AMO122（序列号5）的序列以及Tm值。测定Tm值的结果（测定条件与前面所述相同）显示，根据本发明的实施例的非共轭型AMO122包含作为互补性链RNA的miRNA122和热量稳定的双链形成能。
实施例2
（miRNA的报道载体的构筑）
对将miRNA-21完全互补性的序列（序列号6）或者miRNA-122的完全互补性的序列（序列号7）在pmirGLO载体（从Promega社购入）的萤火虫荧光素酶基因的3’非翻译区域部（3’UTR）上排成2个直列的序列进行克隆，构筑成miRNA的报道载体（图3）。pmirGLO载体发现萤火虫荧光素酶（Fluc）和海肾荧光素酶（RIuc）。
实施例3
（AMO的测量）
如图4所示，在96孔板（LumiNunc96微型孔板）的各孔内分别播种作为miRNA用的HeLa细胞（人宫颈癌细胞）或者作为miRNA用的Huh-7细胞（miRNA122高显现的细胞）各10000个细胞，并在37℃、5%CO2的环境下进行孵化。24小时之后，使用脂质体2000（从invitrogen社购入），将AMO以及前面所述的报道载体（0.1μg/孔）共转染并进行孵化。在培养基上使用Opti-MEM(从Invitrogen社购入)。6小时后，完全培养基（包含10%FBS和抗生物质的DMEM）交换培养基并再次进行孵化。共转染24小时之后，48小时之后以及72小时之后，使用裂解（Lysis）缓冲液溶解细胞，使用双荧光素酶报告基因检测系统（Dual-Luciferase ReporterAssay System）（从Promega社购入），测定荧光素酶的活性。Fluc/Rluc的相对比（%）（图5～12）是指通过海肾萤光素酶的活性来补正萤火虫荧光素酶的活性的值，将投入了mirGLO的细胞的活性设为100%时的各AMO投药细胞的活性的相对值。每个实验都进行3次以上，将其平均值和标准偏差作为取值。
（非共轭AMO21活性的评价）
共转染24小时后的结果如图5表示。mirGLO是指只添加了报道载体的控件。mirGLO miR21Scr（Scramble）是指只添加了改变了3’URT的序列的报道载体的控件，由于miRNA21无法结合3’UTR，所以Fluc/Rluc相对比变高。MirGLOmi R21是添加了报道载体以及miRNA21的控件，由于miRNA21结合3’UTR，所以Fluc/Rluc相对比变低。此外，图5中，各AMO的浓度从各AMO的3个栏的左侧依次为50nM，5nM，0.5nM。
与比较例AMO21（32）-Me、AMO21-Me-PO、AMO21-FMe-PO、以及AMO21-SFMe-PO相比，显示AMO21（32）-SMe、AMO21-SMe-PO、以及AMO21-SMe-PS中剂量依赖的Fluc/Rluc的相对比比较高。这是由于根据本发明的实施例非共轭AMO21结合miRNA21，miRNA21无法结合报道载体的3’UTR，使得Fluc/Rluc的相对比变高。由此可知，根据本发明的实施例的AMO21表示了抑制miRNA21的情况。
（非共轭AMO122活性的评价）
共转染24小时之后的结果如图6所示，48小时之后的结果如图7所示，72小时之后的结果如图8所示。在图6～图8中，各AMO的浓度，从各AMO的4个栏的左侧依次为10nM，5nM，1nM，0.5nM。
图6～图8中，与比较例AMO122-Me-PO以及AMO122-Me-PS相比，显示在AMO122-SMe-PO以及AMO122-SMe-PS中剂量依赖的Fluc/Rluc的相对比比较高。
另外，图9表示AMO浓度5nM的非共轭AMO活性的瞬时变化。与比较例AMO122_Me_PO以及AMO122_Me_PS相比，AMO122_SMe_PO以及AMO122_SMe_PS中可以维持良好的AMO122活性，在AMO122_SMe_PS中，随着时间的变化AMO122活性提高。由此可知，根据本发明的实施例AMO122表示了持续抑制miRNA122的情况。
（共轭AMO122活性的评价）
共转染24小时之后的结果如图10所示，48小时之后的结果如图11所示，72小时之后的结果如图12所示。图10～12中，各AMO的浓度从各AMO的4个栏的左侧依次是10nM，5nM，1nM，0.5nM。
图10～12中，与比较例AMO122-Me-PS-5’Ton、
AMO122_Me_PS_5'Chol以及AMO122_Me_PS_3'Chol，在
AMO122_SMe_PS_5'Toc、AMO122_SMe_PS_5'Chol以及
AMO122_SMe_PS_3'Chol中显示剂量依赖的Fluc/Rluc的相对比比较高，其和非共轭的AMO122-SMe-PS是相同的程度。由此可知，根据本发明的实施例共轭AMO和非共轭AMO相同，显示了抑制miRNA的情况。
实施例4
（根据实时PCR法分析）
对Hub-7细胞中的AMO122_SMe_PS、或者作为比较例的AMO122-Me-PS分别进行共转染，根据实时PCR法进行定量测量共转染48小时之后的miRNA122发现水平。
以下，将对实时PCR的步骤进行说明。
在杜尔贝克改性伊格尔培养基（DMEM）（Gibco社）（含有10%牛胎儿血清（FBS）、100units mL-1青霉素、以及100μg mL-1链霉素）中、在37℃、5%CO2的环境下培养Huh-7细胞。
DMEM（Sigma社）（含有10%FBS（Thermo Fisher Scientific社）、100units mL-1青霉素、以及100μg mL-1链霉素）中，在6孔板的各孔内分别播种1.5×105细胞的细胞。24小时之后，根据附加的使用说明书使用脂质体2000（Invitrogen社）转染AMO122_SMe_PS或者AMO122_Me_PS，并在37℃下进行孵化。此时，培养基内使用Opti-MEM（Invitrogen社）。转染6小时后，通过完全培养基（与前面所述DMEM相同）交换培养基，再次在37℃下进行了孵化。转染48小时之后，通过PBS清洗细胞，加上QIAzol Lysis Reagent（QIAGEN社）溶解细胞。使用miRNeasy Mini Kit（QIAG社）进行提纯，提取总RNA。
使用提取的RNA样品10ng，进行逆转录反应。逆转录反应中，通过使用TaqMan（注册商标）Small RNA Assays（Aplied biosystems社）的miRNA122特殊的RT-引物、以及TaqMan（注册商标）MicroRNA ReverseTransciption Kit（Aplied biosystems社）来进行（16℃时30分钟、42℃时30分钟、85度时5分钟）。
混合了上述所得到的逆转录反应液1.33μL、TaqMan（注册商标）SmallRNA Assays（混合了miRNA122特殊的正向引物、miRNA122特殊的反向引物、以及miRNA122特殊的TaqMan（注册商标）MGB探测器）（Apliedbiosystems社）1.0μL、以及TaqMan Universal PCR Master Mix II（Apliedbiosystems社）10μL，并通过实时PCR法测量细胞的miRNA122发现量。实时PCR法中，使用LightCycler（注册商标）480实PCR系统（罗氏诊断应用科学部），以50℃2分钟、95℃10分钟、且95℃15秒以及60℃1分钟循环40次进行。此时，拥有作为内部标准基因的RNU6B发现量，使miRNA122发现量标准化。
结果如图13所示。图13表示设定“NT”（non-treated：未处理的细胞）的miRNA122发现量为100的时候，各AMO的miRNA122发现量相对于“NT”的比例。此外，各AMO的浓度从各AMO的2个栏的左侧依次是5nM、25nM。
与比较例AMO122_Me_PS相比，AMO122_SMe_PS中，更低miRNA122发现水平得到抑制。此外，miRNA122发现水平抑制是剂量依赖的。由此可知，根据实时PCR法的定量测量中，显示了根据本发明的实施例的AMO122抑制miRNA122的情况。
如以上说明，根据本发明的寡核苷酸衍生物，由于具有在生物体内耐性良好的效果持续性以及热稳定性，因此可以实现RNA的有效机能控制。
另外，本发明没有脱离本发明的广义的精神以及范围，使各种各样的实施方式以及变形成为可能。此外，上述实施方式，用于说明本发明，但并不限定本发明的范围。也就是说，本发明的范围，不是通过实施方式，而是通过权利要求的范围表示的。因此，在权利要求的范围内以及与此同等的发明的意义的范围内实施的各种变形，都可以视为本发明的范围。
本发明以2011年6月3日申请过的日本专利申请2011-125734号为基础。本说明书以参照的方式引入日本专利申请2011-125734号的说明书、专利权利要求的范围、图形整体。
<110>  国立大学法人北海道大学
<120>  寡核苷酸衍生物
<130>  12F043-PCT
<150>  JP2011-125734
<151>  2011-06-03
<160>  7
<170>  PatentIn version 3.1
<210>  1
<211>  22
<212>  RNA
<213>  Homo sapiens
<400>  1
UAGCUUAUCAGACUGAUGUU GA                                              22
<210>  2
<211>  23
<212>  RNA
<213>  Homo sapiens
<400>  2
UGGAGUGUGACAAUGGUGUU UGU                                             23
<210>  3
<211>  22
<212>  RNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Antisense RNA
<400>  3
UCAACAUCAGUCUGAUAAGC UA                                              22
<210>  4
<211>  32
<212>  RNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Antisense RNA
<400>  4
UCUUAUCAACAUCAGUCUGA UAAGCUAACC UU                                    32
<210>  5
<211>  23
<212>  RNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Antisense RNA
<400>  5
ACAAACACCA UUGUCACACU CCA                                              23
<210>  6
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Antisense RNA
<400>  6
TCAACATCAG TCTGATAAGC TA                                               22
<210>  7
<211>  23
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Antisense RNA
<400>  7
ACAAACACCA TTGTCACACT CCA                                              23

Claims (15)

1.一种寡核苷酸衍生物，其特征在于，
由一般式
[化1]
Figure FDA0000427746790000011
（式中，B表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶，X表示硫原子或氧原子，n表示6～60的整数）表示的重复结构单元（所述一般式中B以及X在各个重复结构单元中独立表示）构成，且所述一般式表示的重复结构单元中的至少有一个其X为硫原子。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸衍生物，其特征在于，所述一般式表示的重复结构单元中的全部的X均为硫原子。
3.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸衍生物，其特征在于，所述寡核苷酸衍生物的5’末端、3’末端、或者5’末端和3’末端上结合有至少有一个配位体。
4.根据权利要求1至3中任意一项所述的寡核苷酸衍生物，其特征在于，所述寡核苷酸衍生物由miRNA的全序列或者部分序列的互补性序列构成。
5.根据权利要求4所述的寡核苷酸衍生物，其特征在于，所述miRNA为miRNA21。
6.根据权利要求4所述的寡核苷酸衍生物，其特征在于，所述miRNA为miRNA122。
7.一种治疗用医药组合物，其特征在于，包含权利要求1至6中任意一项所述的寡核苷酸衍生物。
8.根据权利要求7所述的治疗用医药组合物，其特征在于，抑制miRNA的机能。
9.一种诊断用医药组合物，其特征在于，包含权利要求4至6中任意一项所述的寡核苷酸衍生物。
10.一种miRNA机能抑制用寡核苷酸衍生物，其特征在于，
由一般式
[化2]
Figure FDA0000427746790000021
（一般式中，B表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶，X表示硫原子或氧原子，n表示6～60的整数）表示的重复结构单元（所述一般式中B以及X在各个重复结构单元中独立表示）构成，且所述一般式表示的重复结构单元中至少有一个其X为硫原子。
11.根据权利要求10所述的miRNA机能抑制用寡核苷酸衍生物，其特征在于，所述一般式表示的重复结构单元中的全部的X均为硫原子。
12.根据权利要求10或11所述的miRNA机能抑制用寡核苷酸衍生物，其特征在于，所述miRNA机能抑制用寡核苷酸衍生物的5’末端、3’末端、或者5’末端和3’末端上结合有至少有一个配位体。
13.根据权利要求10至12中任意一项所述的miRNA机能抑制用寡核苷酸衍生物，其特征在于，所述miRNA机能抑制用寡核苷酸衍生物，由miRNA的全序列或者部分序列的互补性序列构成。
14.根据权利要求13所述的miRNA机能抑制用寡核苷酸衍生物，其特征在于，所述miRNA为miRNA21。
15.根据权利要求13所述的miRNA机能抑制用寡核苷酸衍生物，其特征在于，所述miRNA为miRNA122。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108699558A (zh) * 2016-01-29 2018-10-23 协和发酵麒麟株式会社 核酸复合物

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108138180A (zh) 2015-06-05 2018-06-08 米拉根医疗股份有限公司 用于治疗皮肤t细胞淋巴瘤（ctcl）的mir-155抑制剂
KR20190123351A (ko) * 2017-03-22 2019-10-31 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 개질된 올리고뉴클레오티드 및 이의 치료 용도

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005027962A1 (en) * 2003-09-18 2005-03-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4’-thionucleosides and oligomeric compounds
ATE447024T1 (de) * 2004-02-06 2009-11-15 Dharmacon Inc Stabilisierte rnas als transfektionskontrollen und silencing-reagentien
JP5516453B2 (ja) 2011-02-23 2014-06-11 パナソニック株式会社 コードレスアイロン

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRODERICK等: "microRNA Therapeutics", 《GENE THER.》 *
EDWARD E. MORRISEY: "The magic and mystery of miR-21", 《THE JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION》 *
GIOVANNI等: "Emerging Molecular Targets for the Treatment of Nonalcoholic Fatty Liver Disease", 《ANNU.REV.MED》 *
LANFORD等: "Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection", 《SCIENCE》 *
SHAN等: "Reciprocal effects of micro-RNA-122 on expression of heme oxygenase-1 and hepatitis C virus genes in human hepatocytes", 《GASTROENTEROLOGY》 *
TAKAHASHI等: "Synthesis and characterization of 2’-modified-4’-thioRNA: a comprehensive comparison of nuclease stability", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108699558A (zh) * 2016-01-29 2018-10-23 协和发酵麒麟株式会社 核酸复合物

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