JP6491233B2 - ハイブリダイゼーション安定化用核酸複合体、核酸ハイブリダイゼーションの安定化方法、アンチセンス核酸医薬品及びｍｉｃｒｏＲＮＡ抑制剤 - Google Patents

Description

本発明は、核酸複合体、核酸ハイブリダイゼーションの形成方法、医薬組成物、核酸検出用プローブ及び相補鎖核酸複合体に関する。

外部から生体内に核酸が導入される場合、血液や体液中に存在する核酸分解酵素によって、導入された核酸は容易に分解されるため、標的配列を有するＤＮＡ、ＲＮＡに対して安定的にハイブリダイゼーションを形成することができない。

そこで、核酸の生体内での安定性を向上させるために、該核酸に化学的修飾を行う手法が開発されている。

非特許文献１、２では、修飾核酸として開発されたＬｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（ＬＮＡ）が、ＲＮＡに対するハイブリダイゼーションにおいて高い安定性を示すことが報告されている。また、非特許文献３は、ハイブリダイゼーションを形成する核酸の糖部２’位水酸基をメチル化する化学的修飾（２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ（２’−ＯＭｅ）体）について報告している。

生体内での核酸の持続性を向上させるために、修飾核酸とは異なるアプローチも提案されている。

非特許文献４、５には、ｍｉＲＮＡとハイブリダイゼーションするオリゴ配列に隣接して、相補的２本鎖核酸構造を形成させることで、該オリゴ配列のヌクレアーゼ耐性を向上させることが記載されている。また、非特許文献６、７には、ｍｉＲＮＡとハイブリダイゼーションするオリゴ配列に隣接して形成された相補的２本鎖核酸構造にヘアピンループを形成させることが記載されている。

Ｋｏｓｈｋｉｎ， Ａ．， Ｓｉｎｇｈ， Ｓ．， Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｐ．， Ｒａｊｗａｎｓｈｉ， Ｖ．， Ｋｕｍａｒ， Ｒ．， Ｍｅｌｄｇａａｒｄ， Ｍ．， Ｏｌｓｅｎ， Ｃ．Ｅ． ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ， Ｊ． （１９９８）． ＬＮＡ （ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）： ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｅｎｉｎｅ， ｃｙｔｏｓｉｎｅ， ｇｕａｎｉｎｅ， ５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ， ｔｈｙｍｉｎｅ ａｎｄ ｕｒａｃｉｌ ｂｉｃｙｃｌｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｍｏｎｏｍｅｒｓ， ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｕｎｐｒｅｃｅｄｅｎｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５４， ３６０７-３６３０． Ｏｂｉｋａ， Ｓ．， Ｎａｎｂｕ， Ｄ．， Ｈａｒｉ， Ｙ．， Ａｎｄｏｈ， Ｊ．， Ｍｏｒｉｏ， Ｋ．， Ｄｏｉ， Ｔ． ａｎｄ Ｉｍａｎｉｓｈｉ， Ｔ． （１９９８）． Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｕｐｌｅｘｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｆｉｘｅｄ Ｎ−ｔｙｐｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ， ２’−Ｏ，４’−Ｃ−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３９， ５４０１-５４０４． Ｉｎｏｕｅ， Ｈ．， Ｈａｙａｓｅ， Ｙ．， Ｉｍｕｒａ， Ａ．， Ｉｗａｉ， Ｓ．， Ｍｉｕｒａ， Ｋ． ａｎｄ Ｏｈｔｓｕｋａ， Ｅ． （１９８７）． Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｗｏ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｎｏｎａ（２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ）ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５， ６１３１−６１４８． Ｈａｒａｇｕｃｈｉ， Ｔ．， Ｏｚａｋｉ， Ｙ． ＆ Ｉｂａ， Ｈ． （２００９）． Ｖｅｃｔｏｒｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＲＮＡ ｄｅｃｏｙｓ ａｃｈｉｅｖｅ ｔｈｅ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３７， ｅ４３． Ｈａｒａｇｕｃｈｉ， Ｔ．， Ｎａｋａｎｏ， Ｈ．， Ｔａｇａｗａ， Ｔ．， Ｏｈｋｉ， Ｔ．， Ｕｅｎｏ， Ｙ．， Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｔ． ＆ Ｉｂａ， Ｈ． （２０１２）． Ａ ｐｏｔｅｎｔ ２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＲＮＡ−ｂａｓｅｄ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｗｉｔｈ ｕｎｉｑｕｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４０， ｅ５８． Ｌｅｎｎｏｘ， Ｋ． Ａ． ＆ Ｂｅｈｌｋｅ， Ｍ． Ａ． （２０１０）． Ａ ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ−ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｔｅｎｃｙ． Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２７， １７８８−１７９９． Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ， Ａ．， Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， Ｂ．， Ｄａｌｂｙ， Ａ． Ｂ．， Ｍａｒｓｈａｌｌ， Ｗ． Ｓ．， Ｋａｒｐｉｌｏｗ， Ｊ．， Ｌｅａｋｅ， Ｄ．， Ｋｈｖｏｒｏｖａ， Ａ． ＆ Ｂａｓｋｅｒｖｉｌｌｅ， Ｓ． （２００７）． Ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ ａｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ＲＩＳＣ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． ＲＮＡ １３， ７２３−７３０．

しかしながら、非特許文献１−３の方法は、特に、オリゴ配列中の複数の核酸を修飾する場合に、合成コストが高額になるという難点を有していた。また、非特許文献４−７の方法において、ｍｉＲＮＡとハイブリダイゼーションするオリゴ配列に隣接して形成された相補的２本鎖核酸構造の安定性は、温度、イオン強度、ｐＨなどの外的要因の変化によって変動するため、生体内において相補的２本鎖核酸構造が１本鎖に解離する場合があった。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、標的核酸に対して安定的にハイブリダイゼーションを形成することのできる核酸複合体、核酸ハイブリダイゼーションの形成方法、医薬組成物、核酸検出用プローブ及び相補鎖核酸複合体を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係る核酸複合体は、
一本鎖核酸と、
前記一本鎖核酸の５’末端及び３’末端の少なくとも一方に連結される第一核酸鎖と、前記第一核酸鎖に完全に又は十分に相補的な塩基配列を含む第二核酸鎖と、からなる架橋化二本鎖核酸と、
を含む。

例えば、前記架橋化二本鎖核酸は、前記一本鎖核酸の５’末端に連結される。

例えば、前記架橋化二本鎖核酸は、前記第一核酸鎖及び前記第二核酸鎖の少なくとも一方の糖を介した結合によって架橋されている。

例えば、前記架橋化二本鎖核酸は、前記第一核酸鎖及び前記第二核酸鎖の糖同士の結合によって架橋されている。

例えば、前記第一核酸鎖及び前記第二核酸鎖の糖同士は、アミド結合、オキシム結合、アルキルアミド結合、Ｓ−Ｓ結合及び炭素−炭素結合からなる群より選択される少なくとも１種類の共有結合により結合している。

例えば、前記第一核酸鎖及び前記第二核酸鎖の糖同士は、アミノオキシ基又はアミノ基を有する架橋化試薬により結合している。

例えば、前記架橋化試薬は、
一般式１：
Ｒ_１−ＮＨ−Ｏ−Ｌ_１−Ｄ−Ｌ_２−Ａ （１）
（式中、
Ｒ_１は、水素原子、アルキル基又はアミノ基の保護基であり、
Ｄは、置換若しくは無置換のフェニレン基、置換若しくは無置換のアントリレン基、置換若しくは無置換のナフチレン基、置換若しくは無置換のフェナントリレン基、置換若しくは無置換のアントラキノリレン基、及び置換若しくは無置換のアクリジニレン基から選択される芳香族基又はＣ_２−１０アルキル基であり、
芳香族基の置換基は、ハロゲン原子、Ｃ_１−６アルキル基、ニトロ基、シアノ基、Ｃ_２−６アルケニル基、Ｃ_３−１０シクロアルキル基、Ｃ_１−１０アルコキシ基及びＣ_１−１０アシル基からなる群から選択され、
Ｌ_１は、直接結合又は以下の一般式３又は４：
（式中、Ｒ_３は、Ｃ_１−９アルキレン基又は−（ＣＨ_２）_ｏ−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ−（ＣＨ_２）ｑ−であり、ｏ〜ｑは、それぞれ独立して０〜１５の整数であり、ｏ＋ｐ＋ｑは、１〜１５である）
のいずれかで表される２価の基であり、Ｌ_２は、直接結合又は以下の一般式５又は６：
（式中、Ｒ_４は、Ｃ_１−９アルキレン基又は−（ＣＨ_２）_ｒ−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｓ−（ＣＨ_２）_ｔ−であり、ｒ〜ｔは、それぞれ独立して０〜１５の整数であり、ｒ＋ｓ＋ｔは、１〜１５である）
のいずれかで表される２価の基であり、
Ａは、アミノオキシ基又は保護されたアミノオキシ基である）
で表される化合物又はその塩である。

例えば、前記架橋化試薬は、アミノオキシ基を有し、
前記架橋化二本鎖核酸において、前記第一核酸鎖及び前記第二核酸鎖の糖におけるアルデヒド基同士が、前記架橋化試薬のアミノオキシ基を介して結合している。

本発明の第２の観点に係る核酸ハイブリダイゼーションの形成方法は、
本発明の第１の観点に係る核酸複合体と、前記核酸複合体を構成する一本鎖核酸の塩基配列に対して完全に又は十分に相補的な塩基配列からなる標的核酸と、をハイブリダイゼーションさせる工程を含む。

本発明の第３の観点に係る医薬組成物は、
本発明の第１の観点に係る核酸複合体を含む。

本発明の第４の観点に係る核酸検出用プローブは、
本発明の第１の観点に係る核酸複合体を含む。

本発明の第５の観点に係る相補鎖核酸複合体は、
第一の一本鎖核酸と、前記第一の一本鎖核酸の５’末端又は３’末端に連結される第一の架橋化二本鎖核酸と、を含む第一の核酸複合体と、
前記第一の一本鎖核酸の塩基配列に対して完全に又は十分に相補的な塩基配列からなる第二の一本鎖核酸を含む第二の核酸複合体と、
からなり、前記第一の一本鎖核酸と前記第二の一本鎖核酸とがハイブリダイゼーションしてなる。

例えば、前記第二の核酸複合体は、前記第二の一本鎖核酸の３’末端又は５’末端に連結される第二の架橋化二本鎖核酸を含む。

本発明によれば、標的核酸に対して安定的にハイブリダイゼーションを形成することのできる核酸複合体、核酸ハイブリダイゼーションの形成方法、医薬組成物、核酸検出用プローブ及び相補鎖核酸複合体を提供することができる。

（ａ）は、一本鎖核酸の３’末端に連結された架橋化二本鎖核酸を有する核酸複合体を概略的に表す図であり、（ｂ）は、一本鎖核酸の５’末端に連結された架橋化二本鎖核酸を有する核酸複合体を概略的に表す図であり、（ｃ）は、一本鎖核酸の５’末端及び３’末端の両方に連結された２つの架橋化二本鎖核酸を有する核酸複合体を概略的に表す図であり、（ｄ）は、ヘアピンループ構造を含む架橋化二本鎖核酸を有する核酸複合体を概略的に表す図であり、（ｅ）は、同じ長さの第一核酸鎖及び第二核酸鎖からなる他の態様の架橋化二本鎖核酸を有する核酸複合体を概略的に表す図であり、（ｆ）は、異なる長さの第一核酸鎖及び第二核酸鎖からなる他の態様の架橋化二本鎖核酸を有する核酸複合体を概略的に表す図であり、（ｇ）は、第一核酸鎖の５’末端及び３’末端の両方に一本鎖核酸が連結されている核酸複合体を概略的に表す図であり、（ｈ）は、第一核酸鎖の３’末端に一本鎖核酸が連結され、第二核酸鎖の３’末端に一本鎖核酸がさらに連結されている核酸複合体を概略的に表す図であり、（ｉ）は、架橋部位が２箇所である形態を概略的に表す図であり、（ｊ）は、第一の核酸複合体が一本鎖核酸の３’末端に連結された架橋化二本鎖核酸を有する、相補鎖核酸複合体を概略的に表す図であり、（ｋ）は、第一の核酸複合体が一本鎖核酸の５’末端に連結された架橋化二本鎖核酸を有する、相補鎖核酸複合体を概略的に表す図であり、（ｌ）は、第一の架橋化二本鎖核酸の５’末端に連結された核酸鎖Ｃ１と、第二の架橋化二本鎖核酸の５’末端に連結された核酸鎖Ｃ２と、をさらに有する相補鎖核酸複合体を概略的に表す図である。 実施例の核酸複合体（１架橋体及び２架橋体）及び比較例の分子（０架橋体）を概略的に表す図である。 実施例１〜１０の核酸複合体（ＤＮＡ）の塩基配列及び比較例１〜５の分子（ＤＮＡ）の塩基配列を表す図である。 実施例１１、１２の核酸複合体（ＲＮＡ）の塩基配列及び比較例６〜９の分子（ＲＮＡ）の塩基配列を表す図である。 実施例１３〜１８の核酸複合体（２’−ＯＭｅ ＲＮＡ）の塩基配列及び比較例１０〜１８の分子（２’−ＯＭｅ ＲＮＡ）の塩基配列を表す図である。 （ａ）は、架橋化二本鎖核酸において、第一核酸鎖及び第二核酸鎖の糖におけるアルデヒド基同士を、架橋化試薬を介して結合させる工程を説明した図であり、（ｂ）は、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ_３ＣＮ）による還元反応を説明した図である。 （ａ）は、実施例１、９の核酸複合体について電気泳動を行った結果を示す図であり、（ｂ）は、実施例１４−１７の核酸複合体について電気泳動を行った結果を示す図である。 実施例１−１０の核酸複合体についてＴｍ値を測定した結果を示す図である。 実施例１１、１２の核酸複合体についてＴｍ値を測定した結果を示す図である。 実施例１３−１５、１７の核酸複合体についてＴｍ値を測定した結果を示す図である。 （ａ）は、実施例１４の核酸複合体についてｍｉＲＮＡ抑制活性を測定した結果を示す図であり、（ｂ）は、実施例１５の核酸複合体についてｍｉＲＮＡ抑制活性を測定した結果を示す図であり、（ｃ）は、実施例１７の核酸複合体についてｍｉＲＮＡ抑制活性を測定した結果を示す図であり、（ｄ）は、実施例１７の核酸複合体についてｍｉＲＮＡ抑制活性を測定した結果を示す図である。 （ａ）は、実施例１９、２０の相補鎖核酸複合体の塩基配列及び比較例１９の分子の塩基配列を表す図であり、（ｂ）は、実施例１９の相補鎖核酸複合体を概略的に表す図であり、（ｃ）は、実施例２０の相補鎖核酸複合体を概略的に表す図であり、（ｄ）は、実施例１９、２０の相補鎖核酸複合体及び比較例１９の分子についてＴｍ値を測定した結果を示す図である。 実施例１５、２１〜２３の核酸複合体（２’−ＯＭｅ ＲＮＡ）の塩基配列を表す図である。 （ａ）は、実施例１７の核酸複合体についてトランスフェクション４８時間後のｍｉＲＮＡ抑制活性を測定した結果を示す図であり、（ｂ）は、実施例１４、１５、２１−２３の核酸複合体についてトランスフェクション４８時間後のｍｉＲＮＡ抑制活性を測定した結果を示す図である。

まず、本発明による核酸複合体について詳細に説明する。

本発明による核酸複合体は、
一本鎖核酸と、
一本鎖核酸の５’末端及び３’末端の少なくとも一方に連結される、第一核酸鎖と、第一核酸鎖に完全に又は十分に相補的な塩基配列を含む第二核酸鎖と、からなる架橋化二本鎖核酸と、
を含む。

前述の“一本鎖核酸”とは、“標的核酸の塩基配列に対して完全に又は十分に相補的な塩基配列からなる核酸”をいう。本明細書において、“一本鎖核酸”は、ＤＮＡ；ＲＮＡ；２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ（以下、２’−ＯＭｅ ＲＮＡという）、Ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（以下、ＬＮＡという）等の核酸の糖部を誘導体化した修飾核酸；リン酸ジエステル結合を誘導体化した修飾核酸（例えば、酸素原子を硫黄原子に変換したリン酸チオエステル結合）；その他の修飾核酸；又はそれらの混合物であってもよい。なお、これらの修飾核酸については、例えば、Ｄｅｌｅａｖｅｙ，Ｇ．Ｆ．ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｍ．Ｊ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９，９３７−９５４，２０１２に開示される。

本明細書において、“標的核酸”とは、ＤＮＡ及びＲＮＡのいずれであってもよく、例えば、ｎｏｎ−ｃｏｒｄｉｎｇ ＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ、ｔＲＮＡ等）、ｍＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ等を例示することができる。標的核酸は、生体内に存在するものであってもよいし、生体外に存在するものであってもよい。標的核酸の長さについては、特に限定されるものではないが、例えば、好ましくは５〜３０ｍｅｒ、より好ましくは１０〜２５ｍｅｒである。

本明細書において、“（標的核酸の塩基配列に対して）完全に相補的な塩基配列からなる（一本鎖核酸）”とは、標的核酸の塩基配列のすべての塩基と対合し得る塩基配列のみからなるものである。

本明細書において、“（標的核酸の塩基配列に対して）十分に相補的な塩基配列からなる（一本鎖核酸）”とは、標的核酸の塩基配列の５０％以上１００％未満、好ましくは６０％以上１００％未満、より好ましくは７０％以上１００％未満、さらに好ましくは８０％以上１００％未満、さらにより好ましくは９０％以上１００％未満の塩基と対合し得る塩基配列からなるものである。より具体的には、標的核酸の塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列からなる核酸鎖において、例えば、１又は２〜４の塩基を他の塩基に置換した結果、その置換した位置におけるヌクレオチド残基が対合できなくなった場合（この場合、他の塩基に置換した位置を“ミスマッチ部位”という）；標的核酸の塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列からなる核酸鎖において、例えば、１又は２〜４の塩基を欠失した結果、その欠失した位置におけるヌクレオチド残基が対合できなくなった場合等を挙げることができる。

本明細書において、“標的核酸の塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列からなる一本鎖核酸”及び“標的核酸の塩基配列に対して十分に相補的な塩基配列からなる一本鎖核酸”をあわせて単に“一本鎖核酸”と称する場合がある。なお、“一本鎖核酸”は、図１（ａ）−（ｌ）において、横方向の細線で表される。

前述の“架橋化二本鎖核酸”には、完全に又は十分に相補的な塩基配列からなる二本の核酸鎖からなるものが含まれ、一本鎖核酸の５’末端及び３’末端の少なくとも一方に連結されている（“架橋化二本鎖核酸”は、図１において、横方向の２本の太い矢印線で表される）。“架橋化二本鎖核酸”は、二本の核酸鎖からなっており、一方の核酸鎖（第一核酸鎖）と、該一方の核酸鎖（第一核酸鎖）に対して完全に又は十分に相補的（前述同様）な塩基配列を含む他方の核酸鎖（第二核酸鎖）と、がハイブリダイゼーションしており、さらに、第一核酸鎖及び第二核酸鎖の核酸鎖内において、第一核酸鎖と第二核酸鎖とが連結されて、架橋されているものである（図１において、縦方向の太線は、第一核酸鎖と第二核酸鎖とが架橋していることを表す）。ここで、“架橋化二本鎖核酸”には、核酸鎖外においてヘアピンループ構造を介して２本の核酸鎖が連結されているものも含まれる（図１（ｄ））。この場合のヘアピンループ構造の連結部は、例えば、ポリヌクレオチド（例えば、３〜１０ｍｅｒの塩基（例えば、チミジン）からなるポリヌクレオチド）；炭素数２〜２０のアルキル鎖；ポリヌクレオチド（例えば、３〜１０ｍｅｒ）＋炭素数２〜２０のアルキル鎖；ヌクレオチド＋炭素数２〜２０のアルキル鎖等を例示することができる。この場合の“ヌクレオチド＋炭素数２〜２０のアルキル鎖”の一例（チミジン＋アルキル鎖）を以下に示す。

架橋化二本鎖核酸における２本の核酸鎖（すなわち第一核酸鎖及び第二核酸鎖）は、ＤＮＡ；ＲＮＡ；２’−ＯＭｅ ＲＮＡ、ＬＮＡ等の核酸の糖部を誘導体化した修飾核酸；リン酸ジエステル結合を誘導体化した修飾核酸；その他の修飾核酸；又はそれらの混合物であってもよい。なお、これらの修飾核酸については、前述同様である。また、第一核酸鎖及び第二核酸鎖の長さは、特に限定されるものではないが、例えば、好ましくは５ｂｐ〜３０ｂｐ、より好ましくは７ｂｐ〜２０ｂｐ、さらに好ましくは９ｂｐ〜１２ｂｐである。また、第一核酸鎖と第二核酸鎖とは、長さが同じでもよく、長さが異なっていてもよい。第一核酸鎖と第二核酸鎖とで長さが同じ場合には、前述の図１（ａ）−（ｃ）で示した態様の他、例えば、図１（ｅ）で示すように、第一核酸鎖の３’側に第二核酸鎖に対して完全に又は十分に相補的でない配列部分が存在するとともに、第二核酸鎖の３’側に第一核酸鎖に対して完全に又は十分に相補的でない配列部分が存在する態様も含まれる。また、第一核酸鎖と第二核酸鎖とで長さが異なる場合とは、例えば、図１（ｆ）で示すように、第一核酸鎖の長さよりも第二核酸鎖の長さが短く、第一核酸鎖の５’側及び３’側の両方に第二核酸鎖に対して完全に又は十分に相補的でない配列部分が存在する態様が挙げられる。また、図１（ａ）では架橋化二本鎖核酸の第一核酸鎖の５’末端に一本鎖核酸が連結され、図１（ｂ）では第一核酸鎖の３’末端に一本鎖核酸が連結されているが、図１（ｇ）に示すように、第一核酸鎖の５’末端及び３’末端の両方に一本鎖核酸が連結されていてもよい。また、図１（ｈ）に示すように、第一核酸鎖の３’末端に一本鎖核酸が連結され、第二核酸鎖の３’末端に一本鎖核酸がさらに連結されていてもよい（同様に、第一核酸鎖の５’末端に一本鎖核酸が連結され、第二核酸鎖の５’末端に一本鎖核酸がさらに連結されていてもよい）。また、架橋化二本鎖核酸は、図１（ａ）に示すように一本鎖核酸の３’末端に連結されていてもよく、図１（ｂ）に示すように一本鎖核酸の５’末端に連結されていてもよい。好ましくは、架橋化二本鎖核酸は、図１（ｂ）に示すように、一本鎖核酸の５’末端に連結されている。第一核酸鎖及び第二核酸鎖の核酸鎖同士が架橋されていることで、架橋化二本鎖核酸における第一核酸鎖及び第二核酸鎖の核酸鎖同士の解離を低減させることができ、一本鎖核酸と標的核酸とを安定的にハイブリダイゼーションさせておくことができる。なお、本明細書において、“架橋化二本鎖核酸”を“架橋化アダプター配列”と称する場合がある。

なお、本発明による核酸複合体において、“一本鎖核酸” と“架橋化二本鎖核酸”との間で、核酸の種類が同じでもよく、異なっていてもよい。例えば、“一本鎖核酸”がＲＮＡであり、“架橋化二本鎖核酸”がＤＮＡであってもよい。

架橋化二本鎖核酸は、第一核酸鎖及び第二核酸鎖の２本の核酸鎖同士が連結されて、架橋されているものであるが、架橋の方法については特に制限がなく、第一核酸鎖及び第二核酸鎖の２本の核酸鎖同士を連結することのできる手法であれば、適宜採用することができる。第一核酸鎖及び第二核酸鎖の２本の核酸鎖は、例えば、第一核酸鎖及び第二核酸鎖の少なくとも一方の糖を介した結合によって架橋されていてもよい。また、第一核酸鎖及び第二核酸鎖の２本の核酸鎖は、例えば、第一核酸鎖及び第二核酸鎖の糖同士の結合によって架橋されていてもよく、この場合、第一核酸鎖及び第二核酸鎖の糖同士は、例えば、アミド結合、オキシム結合、アルキルアミド結合、Ｓ−Ｓ結合、炭素−炭素結合（例えば、炭素数２〜１０のアルキル鎖を介した結合）といった共有結合により結合していてもよい。

架橋化二本鎖核酸において、前記第一核酸鎖及び前記第二核酸鎖の糖同士の結合によって架橋されている場合、例えば、核酸の糖が有する反応基又は核酸の糖に導入された反応基が架橋化試薬によって結合されていてもよい。この場合の反応基として、例えば、アルデヒド基、チオール基、アジド基、アミノ基等を挙げることができる。

前記第一核酸鎖及び前記第二核酸鎖の核酸鎖中の糖同士は、例えば、アミノオキシ基又はアミノ基を有する架橋化試薬により結合していてもよい。この場合、糖の反応基（例えば、アルデヒド基、チオール基、アジド基、アミノ基等）にアミノオキシ基又はアミノ基が反応することで、糖の反応基同士が結合する。

アミノオキシ基又はアミノ基を有する架橋化試薬として、例えば、
一般式１：
Ｒ_１−ＮＨ−Ｏ−Ｌ_１−Ｄ−Ｌ_２−Ａ （１）
（式中、
Ｒ_１は、水素原子、アルキル基又はアミノ基の保護基であり、
Ｄは、置換若しくは無置換のフェニレン基、置換若しくは無置換のアントリレン基、置換若しくは無置換のナフチレン基、置換若しくは無置換のフェナントリレン基、置換若しくは無置換のアントラキノリレン基、及び置換若しくは無置換のアクリジニレン基から選択される芳香族基又はＣ_２−１０アルキル基であり、
芳香族基の置換基は、ハロゲン原子、Ｃ_１−６アルキル基、ニトロ基、シアノ基、Ｃ_２−６アルケニル基、Ｃ_３−１０シクロアルキル基、Ｃ_１−１０アルコキシ基及びＣ_１−１０アシル基からなる群から選択され、
Ｌ_１は、直接結合又は以下の一般式３又は４：
（式中、Ｒ_３は、Ｃ_１−９アルキレン基又は−（ＣＨ_２）_ｏ−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ−（ＣＨ_２）ｑ−であり、ｏ〜ｑは、それぞれ独立して０〜１５の整数であり、ｏ＋ｐ＋ｑは、１〜１５である）
のいずれかで表される２価の基であり、Ｌ_２は、直接結合又は以下の一般式５又は６：
（式中、Ｒ_４は、Ｃ_１−９アルキレン基又は−（ＣＨ_２）_ｒ−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｓ−（ＣＨ_２）_ｔ−であり、ｒ〜ｔは、それぞれ独立して０〜１５の整数であり、ｒ＋ｓ＋ｔは、１〜１５である）
のいずれかで表される２価の基であり、
Ａは、アミノオキシ基又は保護されたアミノオキシ基である）
で表される化合物又はその塩を挙げることができる。この架橋化試薬については、特許第５１９６４４８号公報に記載の通りである。

架橋化二本鎖核酸において、第一核酸鎖及び第二核酸鎖の糖におけるアルデヒド基同士が、架橋化試薬のアミノオキシ基（２価）を介して結合していてもよい。この場合、アミノオキシ基を有する架橋化試薬を用いるが、架橋化試薬として、例えば、以下に示されるＮ^１，Ｎ^５−ビス（アミノオキシアセチル）−１，５−ジアミノナフタレン（ａｏＮａｏ）を用いてもよい。

架橋化二本鎖核酸において、第一核酸鎖及び第二核酸鎖の糖におけるアルデヒド基同士を、架橋化試薬のアミノオキシ基（２価）を介して結合させる場合、例えば、第一核酸鎖及び第二核酸鎖の対合する位置でｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅを含むように第一核酸鎖及び第二核酸鎖を合成し；第一核酸鎖及び第二核酸鎖をＵｒａｃｉｌ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＤＧ）で処理して、第一核酸鎖及び第二核酸鎖のｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅにおいてＡＰ ｓｉｔｅを生じさせ（図６（ａ）（ｉ））（ＡＰ ｓｉｔｅは、平衡状態で存在し、開環型はアルデヒド基を有する）；架橋化試薬を加えることでアルデヒド基と連結反応させて、第一核酸鎖と第二核酸鎖とを架橋する（図６（ａ）（ｉｉ））方法が挙げられる。

第一核酸鎖及び第二核酸鎖の２本の核酸鎖は、第一核酸鎖及び第二核酸鎖の少なくとも一方の糖を介した結合によって架橋されていてもよく、例えば、２本の核酸鎖の糖と塩基との結合によって架橋されていてもよい。第一核酸鎖及び第二核酸鎖の２本の核酸鎖の糖と塩基との結合は、例えば、ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅを含むように合成された第一核酸鎖又は第二核酸鎖をＵｒａｃｉｌ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＤＧ）で処理して、第一核酸鎖又は第二核酸鎖のｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅにおいてＡＰ ｓｉｔｅを生じさせ；第二核酸鎖又は第一核酸鎖のグアニン又はアデニンの−ＮＨ基と、第一核酸鎖又は第二核酸鎖に生じたＡＰ ｓｉｔｅのアルデヒド基と、を反応させて、第一核酸鎖と第二核酸鎖とを架橋する方法が挙げられる。

なお、図１（ａ）−（ｃ）では、第一核酸鎖及び第二核酸鎖の核酸鎖同士が架橋されている部位が１箇所のみである架橋化二本鎖核酸を例示しているが、第一核酸鎖及び第二核酸鎖の核酸鎖同士が架橋されている部位は２箇所又は３箇所以上であってもよい（図１（ｉ）に架橋部位が２箇所である形態を示す）。第一核酸鎖及び第二核酸鎖の核酸鎖同士が架橋されている部位の数が多くなると、架橋化二本鎖核酸の第一核酸鎖及び第二核酸鎖の核酸鎖同士の解離をより低減することができる。なお、第一核酸鎖及び第二核酸鎖の核酸鎖同士が架橋されている部位が例えば２箇所又は３箇所以上である場合、各箇所で結合の形態が異なっていてもよい（例えば２箇所である場合、一方の箇所は例えばアミド結合で架橋されているが、他方の箇所は例えばオキシム結合で架橋されていてもよく；例えば一方の箇所と他方の箇所とで使用する架橋化試薬が異なっていてもよい）。また、第一核酸鎖及び第二核酸鎖の核酸鎖同士を架橋する部位については、例えば、１２ｍｅｒの核酸鎖同士を１箇所架橋して架橋化二本鎖核酸とする場合、１２ｍｅｒの核酸鎖の略中央の部位（５’末端から６番目又は７番目の核酸）が連結されて、架橋されていてもよい。

本発明による核酸複合体において、架橋化二本鎖核酸は、一本鎖核酸の５’末端及び３’末端の少なくとも一方に連結されている。すなわち、一本鎖核酸の３’末端に架橋化二本鎖核酸が１つ連結されていてもよく（図１（ａ））、一本鎖核酸の５’末端に架橋化二本鎖核酸が１つ連結されていてもよく（図１（ｂ））、一本鎖核酸の５’末端及び３’末端の両方に架橋化二本鎖核酸が１つずつ連結されていてもよい（図１（ｃ））。一本鎖核酸の５’末端及び３’末端の両方に架橋化二本鎖核酸が１つずつ連結されている場合（図１（ｃ））、２つの架橋化二本鎖核酸の塩基配列は、同一でもよいし、異なっていてもよい。なお、上述の通り、架橋化二本鎖核酸は、図１（ａ）に示すように一本鎖核酸の３’末端に連結されていてもよく、図１（ｂ）に示すように一本鎖核酸の５’末端に連結されていてもよいが、好ましくは、図１（ｂ）に示すように、一本鎖核酸の５’末端に連結されている。

架橋化二本鎖核酸の一本鎖核酸への連結の手段については、特に制限はないが、例えば、一本鎖核酸の５’末端に架橋化二本鎖核酸が連結される場合、一本鎖核酸の５’末端のヌクレオシドと、架橋化二本鎖核酸の一方の核酸鎖の３’末端のヌクレオシドと、がリン酸ジエステル結合することで連結され；例えば、一本鎖核酸の３’末端に架橋化二本鎖核酸が連結される場合、一本鎖核酸の３’末端のヌクレオシドと、架橋化二本鎖核酸の一方の核酸鎖の５’末端のヌクレオシドと、がリン酸ジエステル結合することで連結される。また、一本鎖核酸と、架橋化二本鎖核酸の一方の核酸鎖と、の間に、“リンカー（スペーサー）”を挿入してもよい。本明細書において、“リンカー（スペーサー）”は、例えば、１ｍｅｒのヌクレオチド（例えば、グアニン等）又は２〜２０ｍｅｒのポリヌクレオチド（例えば、複数個のチミジン、ＧＣＣ等）であってもよく、炭素数１〜２０の直鎖アルキル鎖であってもよい。この場合の“炭素数１〜２０の直鎖アルキル鎖“の一例として、プロピルリンカーを以下に示す。

なお、一本鎖核酸と、架橋化二本鎖核酸の一方の核酸鎖と、の間に、上記のようなリンカー（スペーサー）を挿入してもよいし、挿入しなくてもよい。

核酸複合体の合成方法の一例（一本鎖核酸及び架橋化二本鎖核酸のいずれもＤＮＡからなる核酸複合体）について説明する。架橋化二本鎖核酸の第一核酸鎖と、架橋化二本鎖核酸の第二核酸鎖と一本鎖核酸とが繋がった塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、を、各々ＤＮＡ自動合成機によって合成し（第一核酸鎖及び第二核酸鎖の対合する位置でｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅを含むように第一核酸鎖及び第二核酸鎖を合成する）、公知の方法で精製する。合成した上記２種類のＤＮＡ鎖を、Ｕｒａｃｉｌ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＤＧ）を含む溶液に入れて反応させる。得られた反応液にＵＤＧを加え、さらに反応させる。得られた反応液に架橋化試薬としてａｏＮａｏを加えて反応させることで、架橋化二本鎖核酸を形成させる。その後、ＨＰＬＣにより精製し、ＤＮＡからなる核酸複合体を得る。

以上説明したように、本発明による核酸複合体を標的核酸にハイブリダイゼーションさせた場合、標的核酸と、核酸複合体中の一本鎖核酸と、の間のハイブリダイゼーションの安定性が増強される。この理由として、特定の理論に縛られることを望むものではないが、本発明による核酸複合体において、架橋化によって架橋化二本鎖核酸の構造が非常に剛直な構造となって物理的な運動が抑制されることで、隣接部位における（標的核酸と一本鎖核酸との間の）ハイブリダーゼーションの安定化がもたらされることが考えられる。なお、実施例にて後述するように、一本鎖核酸の５’末端及び３’末端の両方に架橋化二本鎖核酸が１つずつ連結されている場合（図１（ｃ））では、構造的に安定な架橋化二本鎖核酸が両端に存在するため、標的核酸と、核酸複合体中の一本鎖核酸と、の間のハイブリダイゼーションの安定性はさらに増強される。

また、架橋化二本鎖核酸が核酸分解酵素に対して非常に高い耐性を有するため、本発明による核酸複合体は、生体内において持続的に効果を発現することができる。

また、本発明による核酸複合体によれば、標的核酸とハイブリダイゼーションする一本鎖核酸に安定化を目的とした化学的修飾を施すことなく、ハイブリダイゼーションを安定させることができるため、合成コストを抑えることができる。

次に、本発明による核酸ハイブリダイゼーションの形成方法について説明する。

本発明による核酸ハイブリダイゼーションの形成方法は、前述の核酸複合体と、核酸複合体を構成する一本鎖核酸（前述同様）の塩基配列に対して完全又は十分に相補的（前述同様）な塩基配列からなる標的核酸と、をハイブリダイゼーションさせる工程を含む。“核酸複合体と標的核酸とをハイブリダイゼーションさせる”工程は、例えば、核酸複合体を生体内に導入して、生体内に存在する標的核酸とハイブリダイゼーションさせること；標的核酸を含む溶液に、核酸複合体を加えて、標的核酸とハイブリダイゼーションさせること；標的核酸が担持された固相に核酸複合体を接触させて、標的核酸とハイブリダイゼーションさせること等を包含する。本発明による核酸ハイブリダイゼーションの形成方法によれば、標的核酸と、核酸複合体中の一本鎖核酸と、の間のハイブリダイゼーションの安定性が増強される。

次に、本発明による医薬組成物について説明する。

本発明による医薬組成物は、前述の核酸複合体を含み、生体内に存在するｎｏｎ−ｃｏｒｄｉｎｇ ＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ、ｔＲＮＡ等）、ｍＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ等を標的としたアンチセンス核酸医薬品として用いることができる。より具体的には、生体内に存在するｎｏｎ−ｃｏｒｄｉｎｇ ＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ、ｔＲＮＡ等）、ｍＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ等の全配列又は一部配列を“標的核酸”として、標的核酸の塩基配列に完全に又は十分に相補的（前述同様）な塩基配列からなる一本鎖核酸を含む核酸複合体を、アンチセンス核酸医薬品として用いることができる。

例えば、本発明による医薬組成物を、ｍｉｃｒｏＲＮＡ抑制剤として用いることができる。この場合、生体内に存在するｍｉｃｒｏＲＮＡの全配列又は一部配列が“標的核酸”となる。ｍｉｃｒｏＲＮＡとしては、例えば、ｍｉＲＮＡ２１、ｍｉＲＮＡ１２２、ｍｉＲＮＡ２２４、ｍｉＲＮＡ１０ｂ，ｍｉＲＮＡ２２１，ｍｉＲＮＡ２２２，ｍｉＲＮＡ２０，ｍｉＲＮＡ１８，ｍｉＲＮＡ２３ａ，ｍｉＲＮＡ１４１，ｍｉＲＮＡ２００ｂ，ｍｉＲＮＡ２７ａ，ｍｉＲＮＡ３４２，ｍｉＲＮＡ２６ａ，ｍｉＲＮＡ３０ｄ，ｍｉＲＮＡ２６ｂ，ｍｉＲＮＡ１０７，ｍｉＲＮＡ２０３，ｍｉＲＮＡ２０４，ｍｉＲＮＡ２１１，ｍｉＲＮＡ１０５，ｍｉＲＮＡ１８１ａ，ｍｉＲＮＡ１５５，ｍｉＲＮＡ１８１ｂ，ｍｉＲＮＡ２５，ｍｉＲＮＡ４２４，ｍｉＲＮＡ１５１，ｍｉＲＮＡ２２３，ｍｉＲＮＡ２５，ｍｉＲＮＡ１７−５ｐ，ｍｉＲＮＡ１２５ｂ，ｍｉＲＮＡ１０６ａ，ｍｉＲＮＡ９２，ｍｉＲＮＡ１０３，ｍｉＲＮＡ９３，ｍｉＲＮＡ１００，ｍｉＲＮＡ１０６ｂ，ｍｉＲＮＡ２０ａ，ｍｉＲＮＡ１９０，ｍｉＲＮＡ３３，ｍｉＲＮＡ１９ａ，ｍｉＲＮＡ１４０，ｍｉＲＮＡ１２３，ｍｉＲＮＡ１８８，ｍｉＲＮＡ１５４，ｍｉＲＮＡ２１７，ｍｉＲＮＡ１０１，ｍｉＲＮＡ１９６，ｍｉＲＮＡ１３４，ｍｉＲＮＡ１３２，ｍｉＲＮＡ１９２，ｍｉＲＮＡ１６，ｍｉＲＮＡ１５，ｍｉＲＮＡ２００ａ，ｍｉＲＮＡ２００ｃ，ｍｉＲＮＡ１９１，ｍｉＲＮＡ２１０，ｍｉＲＮＡ３２，ｍｉＲＮＡ１８２，ｍｉＲＮＡ３１，ｍｉＲＮＡ１４６ａ等を挙げることができる。

例えば、本発明による医薬組成物を、ｍＲＮＡの直接制御に用いることができる。この場合、生体内に存在するｍＲＮＡの全配列又は一部配列が“標的核酸”となる。

本発明による医薬組成物は、前述の核酸複合体を含むため、標的核酸と、核酸複合体中の一本鎖核酸と、の間のハイブリダイゼーションの安定性を増強させることができ、医薬品として高い効果を得ることができる。また、標的核酸と安定的にハイブリダイゼーションできるため、医薬組成物の投与量を抑制できることが期待される。

次に、本発明による核酸検出用プローブについて説明する。

本発明による核酸検出用プローブは、前述の核酸複合体を含み、生体内又は生体外に存在するｎｏｎ−ｃｏｒｄｉｎｇ ＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ、ｔＲＮＡ等）、ｍＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ等を標的とした核酸検出用プローブとして用いることができる。より具体的には、生体内又は生体外に存在するｎｏｎ−ｃｏｒｄｉｎｇ ＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ、ｔＲＮＡ等）、ｍＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ等の全配列又は一部配列を“標的核酸”として、標的核酸の塩基配列に完全に又は十分に相補的（前述同様）な塩基配列からなる一本鎖核酸を含む核酸複合体を、核酸検出用プローブとして用いることができる。標的核酸とのハイブリダイゼーションの検出のために、核酸複合体を蛍光物質で標識してもよい。

本発明による核酸検出用プローブは、前述の核酸複合体を含むため、標的核酸と、核酸複合体中の一本鎖核酸と、の間のハイブリダイゼーションの安定性を増強させることができ、高い感度で核酸を検出することができる。

次に、本発明による相補鎖核酸複合体について説明する。

本発明による相補鎖核酸複合体は、
第一の一本鎖核酸と、第一の一本鎖核酸の５’末端又は３’末端に連結される第一の架橋化二本鎖核酸と、を含む第一の核酸複合体と、
第一の一本鎖核酸の塩基配列に対して完全に又は十分に相補的な塩基配列からなる第二の一本鎖核酸を含む第二の核酸複合体と、
からなり、第一の一本鎖核酸と第二の一本鎖核酸とがハイブリダイゼーションしてなる。

本発明による相補鎖核酸複合体において、例えば、第二の核酸複合体は、第二の一本鎖核酸の３’末端又は５’末端に連結される第二の架橋化二本鎖核酸を含んでいてもよい。この場合、第一の核酸複合体及び第二の核酸複合体の双方が架橋化二本鎖核酸を有している。なお、第一の架橋化二本鎖核酸及び第二の架橋化二本鎖核酸は、図１（ｄ）に示すようなヘアピンループ構造を有していてもよい。

第一の核酸複合体及び第二の核酸複合体の双方が架橋化二本鎖核酸を有している場合の第１の形態の相補鎖核酸複合体の概略図を図１（ｊ）に示す。第一の形態の相補鎖核酸複合体において、第一の核酸複合体は、第一の一本鎖核酸の３’末端に連結される第一の架橋化二本鎖核酸を有し、第二の核酸複合体は、第二の一本鎖核酸の３’末端に連結される第二の架橋化二本鎖核酸を有し、第一の一本鎖核酸と第二の一本鎖核酸とがハイブリダイゼーションしている。

第一の核酸複合体及び第二の核酸複合体の双方が架橋化二本鎖核酸を有している場合の第２の形態の相補鎖核酸複合体の概略図を図１（ｋ）に示す。第一の形態の相補鎖核酸複合体において、第一の核酸複合体は、第一の一本鎖核酸の５’末端に連結される第一の架橋化二本鎖核酸を有し、第二の核酸複合体は、第二の一本鎖核酸の５’末端に連結される第二の架橋化二本鎖核酸を有し、第一の一本鎖核酸と第二の一本鎖核酸とがハイブリダイゼーションしている。

なお、第一の核酸複合体及び第二の核酸複合体の双方が架橋化二本鎖核酸を有している場合、第１の形態の相補鎖核酸複合体及び第２の形態の相補鎖核酸複合体の各々において、第一の架橋化二本鎖核酸と第二の架橋化二本鎖核酸との塩基配列は、同一でもよいし、異なっていてもよい。

本発明による相補鎖核酸複合体は、第一の架橋化二本鎖核酸、又は第一の架橋化二本鎖核酸及び第二の架橋化二本鎖核酸の両方を有するため、二本鎖として安定したハイブリダイゼーションを形成することができる。

なお、本発明による相補鎖核酸複合体は、例えば、図１（ｌ）に示すように、第一の架橋化二本鎖核酸の５’末端に連結された核酸鎖Ｃ１と、第二の架橋化二本鎖核酸の５’末端に連結された核酸鎖Ｃ２と、をさらに有していてもよい。核酸鎖Ｃ１の塩基配列は、核酸鎖Ｃ２の塩基配列に対して完全に又は十分に相補的（前述同様）な塩基配列であり、核酸鎖Ｃ１と核酸鎖Ｃ２とは、安定的にハイブリダイゼーションを形成することができる。核酸鎖Ｃ１と核酸鎖Ｃ２とを有することで、複数の分子が連なった安定的な高分子化構造体が形成され得る。なお、他の観点による相補鎖核酸複合体において、第一の架橋化二本鎖核酸の３’末端に連結された核酸鎖Ｃ１と、第二の架橋化二本鎖核酸の３’末端に連結された核酸鎖Ｃ２と、をさらに有する相補鎖核酸複合体であってもよい（核酸鎖Ｃ１及び核酸鎖Ｃ２については前述同様である）。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例Ａ）
（合成したオリゴヌクレオチドの概略）
標的核酸（標的ＲＮＡ）として、ｍｉＲ２１（配列番号１）及びｍｉＲ２１−Ｍ（ｍｉＲ２１の１塩基ミスマッチ）（配列番号２）（いずれも２２ｍｅｒ）を選択し、ｍｉＲ２１又はｍｉＲ２１−Ｍに対して相補的なオリゴヌクレオチドを合成した。

ｍｉＲ２１及びｍｉＲ２１−Ｍの塩基配列を、以下に示す。
ｍｉＲ２１：
５’ ＵＡＧＣＵＵＡＵＣＡＧＡＣＵＧＡＵＧＵＵＧＡ ３’（配列番号１）
ｍｉＲ２１−Ｍ：
５’ ＵＡＧＣＵＵＡＵＣＡＣＡＣＵＧＡＵＧＵＵＧＡ ３’（配列番号２）

ｍｉＲ２１又はｍｉＲ２１−Ｍに対して相補的なオリゴヌクレオチドについて、より具体的には、図２に示すように、実施例として、標的核酸の塩基配列に対して完全に又は十分に相補的な塩基配列からなる一本鎖核酸（以後、本実施例において単に“相補結合様配列”という）及び２本鎖の架橋化アダプター配列を５’側又は３’側に有する１架橋体（ＣＬ１）（架橋化アダプター配列がヘアピンループ構造になっているもの及び架橋化アダプター配列と相補結合様配列との間にリンカーを挿入したものも含む）；相補結合様配列及び２本鎖の架橋化アダプター配列を５’側及び３’側の両方に有する２架橋体（ＣＬ２）を合成した。また、図２に示すように、比較例として、標的ＲＮＡの塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる一本鎖の核酸鎖（以後、本実施例において単に“相補結合様配列”という）及び相補結合様配列に連結された一本鎖の核酸鎖（以後、本実施例において単に“一本鎖アダプター配列”という）を５’側に有する０架橋体（ＤＳ）；相補結合様配列及び相補結合様配列に連結された二本鎖の核酸鎖（以後、本実施例において単に“二本鎖アダプター配列”という）を５’側 又は３’側に有する０架橋体（ＤＳ）（二本鎖アダプター配列がヘアピンループ構造になっているものも含む）；相補結合様配列及び一本鎖アダプター配列を５’側 及び３’側の両方に有する０架橋体（ＤＳ）；並びに相補結合様配列及び二本鎖アダプター配列を５’側 及び３’側の両方に有する０架橋体（ＤＳ）を合成した。また、コントロール（比較例）として、架橋化アダプター配列を持たない相補結合様配列のみからなる核酸鎖についても合成した。ただし、例外として、比較例１８（ｍＣＬ２（１２−Ｉ×２／３４））（図５）については、架橋化アダプター配列を有するものの、ｍｉＲ２１とハイブリダイゼーションする領域が１０塩基程度の比較例である。なお、図２において、矢印の方向は、５’から３’を示す。

合成したオリゴヌクレオチドの配列を、ＤＮＡ（図３）、ＲＮＡ（図４）及び２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ（２’−ＯＭｅ）ＲＮＡ（図５）としてそれぞれの図に示す。以下、各オリゴヌクレオチドについて説明する。なお、本実施例において、２本鎖の架橋化アダプター配列は、２本の核酸鎖の糖同士の結合によって架橋されている（図６（ａ）、後述）。

（合成したＤＮＡ）
合成したＤＮＡの配列を図３に示す。図３において、下線は、ｍｉＲ２１に相補的な配列を示し、配列中の“Ｘ”は、オリゴ鎖中の架橋部位を表し、縦方向の太線は、架橋化試薬によって核酸鎖同士が架橋していることを表す。なお、図３−５において、「ｕ」はｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅを表す。ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅの構造式を下記に示す。

実施例１として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及び１２ｍｅｒの２本鎖の架橋化アダプター配列を有するｄ５’ＣＬ（１２／３４）を合成した（図３）。

実施例２として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及びリンカーとしてＴ（チミジン）を挟んで１２ｍｅｒの２本鎖の架橋化アダプター配列を有するｄ５’ＣＬ（１２／３４Ｔ）を合成した（図３）。

実施例３として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及び下式のプロピルリンカーを挟んで１２ｍｅｒの２本鎖の架橋化アダプター配列を有するｄ５’ＣＬ（１２／３４Ｐ）を合成した（図３）。

実施例４として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及びリンカーとして８ｍｅｒのＴ（チミジン）を挟んで１２ｍｅｒの２本鎖の架橋化アダプター配列を有するｄ５’ＣＬ（１２／３４Ｔ８）を合成した（図３）。

実施例５として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及び架橋部位の５’側にミスマッチ塩基対を含んだ１２ｍｅｒの２本鎖の架橋化アダプター配列を有するｄ５’ＣＬ（１２−５Ｍ／３４）を合成した（図３）。

実施例６として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及び架橋部位の３’側にミスマッチ塩基対を含んだ１２ｍｅｒの２本鎖の架橋化アダプター配列を有するｄ５’ＣＬ（１２−３Ｍ／３４）を合成した（図３）。

実施例７として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及び１２ｍｅｒの２本鎖の架橋化アダプター配列（架橋化アダプター配列の末端部位が架橋され、架橋化アダプター配列の末端に３ｍｅｒのチミジンが連結されている）を有するｄ５’ＣＬ（１２／３７）を合成した（図３）。

実施例８として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及び架橋部位の３’側に１２ｍｅｒの２本鎖の架橋化アダプター配列（４ｍｅｒのチミジンからなるヘアピンループ構造を有する）を有するｄ５’ＨＰ ＣＬ（５０）を合成した（図３）。

実施例９として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及び１２ｍｅｒの２本鎖の架橋化アダプター配列を両端に有するｄＣＬ２（１２−Ｉ，ＩＩ／４６）を合成した（図３）。

実施例１０として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及び１２ｍｅｒの２本鎖の架橋化アダプター配列（２箇所で架橋されている）を有するｄＣＬ２（１２／３４）を合成した（図３）。

比較例１として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及び１２ｍｅｒの一本鎖アダプター配列を有するｄＳＳ（３４）を合成した（図３）。

比較例２として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及び１２ｍｅｒの二本鎖アダプター配列を有するｄ５’ＤＳ（１２／３４）を合成した（図３）。

比較例３として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及び１２ｍｅｒの二本鎖アダプター配列を有し、４ｍｅｒのチミジンからなるヘアピンループ構造を有するｄ５’ＨＰ５０を合成した（図３）。

比較例４として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及び１２ｍｅｒ、３５ ｍｅｒのＤＮＡを化学的に連結した直鎖アルキルリンカーのヘアピンループを有するｄ５’Ｌｉｇ（１２／３５）を合成した（図３）。

比較例５として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及び１２ｍｅｒの一本鎖アダプター配列を両端に有するｄＳＳ（４６）を合成した（図３）。

（合成したＲＮＡ）
合成したＲＮＡの配列を図４に示す。図４において、下線は、ｍｉＲ２１に相補的な配列を示し、配列中の“Ｘ”は、オリゴ鎖中の架橋部位を表し、縦方向の太線は、架橋化試薬によって核酸鎖同士が架橋していることを表す。

実施例１１として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及び１２ｍｅｒの２本鎖の架橋化アダプター配列を有するｒ５’ＣＬ（１２／３４）を合成した（図４）。

実施例１２として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）（ＲＮＡ）及び１２ｍｅｒの２本鎖の架橋化アダプター配列（ＤＮＡ）を有するｄｒ５’ＣＬ（１２／３４）（キメラ分子）を合成した（図４）。

比較例６として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）からなるｒ−ａｓｍｉ２１を合成した（図４）。

比較例７として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及び１２ｍｅｒの一本鎖アダプター配列を有するｒＳＳ（３４）を合成した（図４）。

比較例８として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及び１２ｍｅｒの二本鎖アダプター配列を有するｒ５’ＤＳ（１２／３４）を合成した（図４）。

比較例９として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及び１２ｍｅｒの二本鎖アダプター配列を有し、４ｍｅｒのウラシルからなるヘアピンループ構造を有するｒＨＰ５０を合成した（図４）。

（合成した２’−ＯＭｅ ＲＮＡ）
合成した２’−ＯＭｅ ＲＮＡの配列を図５に示す。図５において、下線は、ｍｉＲ２１に相補的な配列を示し、配列中の“Ｘ”は、オリゴ鎖中の架橋部位を表し、縦方向の太線は、架橋化試薬によって核酸鎖同士が架橋していることを表し、配列中の“ｍ”は、かっこ内の核酸鎖が２’−ＯＭｅ ＲＮＡであることを表す。

実施例１３として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及び１０ｍｅｒの２本鎖の架橋化アダプター配列を有するｍ５’ＣＬ（１０／３４）を合成した（図５）。

実施例１４として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及び１２ｍｅｒの２本鎖の架橋化アダプター配列を有するｍ５’ＣＬ（１２／３４）を合成した（図５）。

実施例１５として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及び１２ｍｅｒの２本鎖の架橋化アダプター配列を３’側に有するｍ３’ＣＬ（１２／３４）を合成した（図５）。

実施例１６として、ｍｉＲ２１に完全に相補的ではない配列（２箇所のミスマッチ塩基を含む）（相補結合様配列）及び１２ｍｅｒの２本鎖の架橋化アダプター配列を３’側に有するｍ３’ＣＬ（１２／３４−Ｍ）を合成した（図５）。

実施例１７として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及び１２ｍｅｒの２本鎖の架橋化アダプター配列を両端に有するｍＣＬ２（１２−Ｉ×２／４６）を合成した（図５）。

実施例１８として、ｍｉＲ２１に完全に相補的ではない配列（２箇所のミスマッチ塩基を含む）（相補結合様配列）及び１２ｍｅｒの２本鎖の架橋化アダプター配列を両端に有するｍＣＬ２（１２−Ｉ×２／４６Ｍ）を合成した（図５）。

比較例１０として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）を有するｍ−ａｓｍｉＲ２１を合成した（図５）。

比較例１１として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及び１２ｍｅｒの一本鎖アダプター配列を有するｍＳＳ（３４）ｄＵを合成した（図５）。

比較例１２として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及び１２ｍｅｒの一本鎖アダプター配列を有するｍＳＳ（３４）を合成した（図５）。

比較例１３として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及び１２ｍｅｒの二本鎖アダプター配列を有するｍ５’ＤＳ（１２／３４）を合成した（図５）。

比較例１４として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及び１２ｍｅｒの二本鎖アダプター配列を有し、４ｍｅｒのウラシルからなるヘアピンループ構造を有するｍＨＰ５０を合成した（図５）。

比較例１５として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及び１２ｍｅｒの二本鎖アダプター配列を３’側に有するｍ３’ＤＳ（１２／３４）を合成した（図５）。

比較例１６として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及び１２ｍｅｒの１本鎖の架橋化配列を両端に有するｍＳＳ（４６）を合成した（図５）。

比較例１７として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及び１２ｍｅｒの２本鎖の架橋化配列を両端に有するｍＤＳ２（１２×２／４６）を合成した（図５）。

比較例１８として、ｍｉＲ２１とハイブリダイゼーションする領域が１０塩基程度の配列及び１２ｍｅｒの２本鎖の架橋化アダプター配列を両端に有するｍＣＬ２（１２−Ｉ×２／３４）を合成した（図５）。

（オリゴヌクレオチドの合成及び精製）
実施例１−１８、比較例１−１８の分子を作製するために、表１及び表２の通り、各オリゴヌクレオチドを合成した。なお、表１及び表２において、配列中の“ｍ”は、かっこ内の核酸鎖が２’−ＯＭｅ ＲＮＡであることを表し、“Ｘ”は、「ｕ：ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ」を表す。

オリゴヌクレオチドの合成は、３’−ホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓ．社）を用いてＤＮＡ・ＲＮＡ自動合成機（モデル３９００；株式会社パーキンエルマージャパン・アプライドバイオシステムズ事業部製）上で行った。０．２μｍｏｌスケールで合成した。ＨＰＬＣにはＧｉｌｓｏｎの装置を用い、分析はＷａｔｅｒｓ９９６フォトダイオードアレイ検出器を用いて行った。

合成終了後、合成したオリゴヌクレオチドが結合したＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ）をアンモニア−メチルアミン混液（２８％濃アンモニア水：４０％メチルアミン水＝１：１．２ｍＬ）で６５℃、１０分〜１５分間加温してオリゴヌクレオチドのＣＰＧからの切り出しと、塩基部及びリン酸ジエステル部の脱保護と、を行った。反応液は回収して溶媒を留去した。

ＤＮＡ及び２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ ＲＮＡ（２’−ＯＭｅ ＲＮＡ）については、０．２Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ ７．０）２ｍＬに溶解し、逆相のオープンカラム（ＹＭＣカートリッジ５００ｍｇ）を行って粗精製した。

ＲＮＡについては、脱保護反応後に溶媒を留去し、残渣にジメチルスルホキシド（１１５μＬ）、トリエチルアミン（６０μＬ）、トリエチルアミン・３フッ化水素（７５μＬ）を加えて攪拌、溶解後に６５℃、２．５時間加温した。反応液に１．８Ｍ 酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ ７．０）１．７５ｍＬを加え、逆相のオープンカラムを行って粗精製した。

粗精製したオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ及び２’−ＯＭｅ ＲＮＡ）は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。ＨＰＬＣは、Ｇｉｌｓｏｎ社の装置にＷａｔｅｒｓ μ−Ｂｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８ ３００Ａ（内径３．９ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ社）を接続して行った。移動相として、逆相の場合には０．１Ｍ 酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＥＡＡ、ｐＨ７．０）中アセトニトリルの濃度勾配を用いた。合成したオリゴヌクレオチドの種類と逆相ＨＰＬＣの条件を下記に示す。
Ａ溶液：５％アセトニトリル／０．１Ｍ ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）
Ｂ溶液：２５％アセトニトリル／０．１Ｍ ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）

（ＤＮＡの１架橋体（ＣＬ１）及び２架橋体（ＣＬ２）（実施例１−１０）の作製）
１架橋体のｄ５’ＣＬ（１２／３４）（実施例１、図３）は以下の方法で作製した。デオキシウリジン（以下ｄＵ）を含む配列番号３の核酸鎖（３．０ｎｍｏｌ）と配列番号４の核酸鎖（２．５２ｎｍｏｌ）とを、Ｕｒａｃｉｌ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＤＧ）バッファー（×１０，ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ Ｌａｂｓ．，２０μＬ）を含む溶液（総量１９８．５μＬ）に溶解させた。反応液を９０℃で１分加熱し氷冷した後に室温まで徐冷し、室温及び０℃でそれぞれ段階的に５分間放置した。続いて反応液にＵＤＧ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ Ｌａｂｓ．，７．５ｕｎｉｔ，１．５μＬ）を加え、総量２００μＬで３７℃、６０分間反応を行った後、４℃で１５分間放置した。この反応液に２ｍＭ ａｏＮａｏ（２５．２ｎｍｏｌ、１２．６μＬ）、を加えて１７℃で３時間反応をさせた。その後、逆相カラムを用いたＨＰＬＣを用いて精製し、架橋体を得た。精製には下記の溶液を用いた。
Ａ溶液：５％アセトニトリル／０．１Ｍ ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）
Ｂ溶液：２５％アセトニトリル／０．１Ｍ ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）

ｄ５’ＣＬ（１２／３４）（実施例１）における、配列番号３の核酸鎖及び配列番号４の核酸鎖の糖同士の結合の様式について説明する（図６（ａ））。配列番号３の核酸鎖及び配列番号４をＵＤＧで処理すると、核酸鎖中のｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅにおいてＡＰ ｓｉｔｅが生じる（図６（ａ）（ｉ））。ＡＰ ｓｉｔｅは、平衡状態で存在し、開環型はアルデヒド基を有する。これに架橋化試薬（ａｏＮａｏ）を加えると、前述のアルデヒド基と連結反応し、配列番号３の核酸鎖と配列番号４の核酸鎖とが架橋される（図６（ａ）（ｉｉ））。図６（ａ）において、（ｉ）、（ｉｉ）の反応は、段階的又は同時に進行し得る。なお、実施例２〜１８及び比較例１８の２本鎖の架橋化アダプター配列における２本の核酸鎖の糖同士の結合の様式は、上記の実施例１のそれと同様である。

同じく１架橋体である、ｄ５’ＣＬ（１２／３４Ｔ）（実施例２）については配列番号３の核酸鎖及び配列番号５の核酸鎖を用いて、ｄ５’ＣＬ（１２／３４Ｐ）（実施例３）については配列番号３の核酸鎖及びプロピルリンカーを介して配列番号６と配列番号７とを連結させた配列（表１）を用いて、ｄ５’ＣＬ（１２／３４Ｔ８）（実施例４）については配列番号３の核酸鎖及び配列番号８の核酸鎖を用いて、ｄ５’ＣＬ（１２−５Ｍ／３４）（実施例５）については配列番号９の核酸鎖及び配列番号４の核酸鎖を用いて、ｄ５’ＣＬ（１２−３Ｍ／３４）（実施例６）については配列番号１０の核酸鎖及び配列番号４の核酸鎖を用いて、上記同様に作製した。

末端に架橋部を有するｄ５’ＣＬ（１２／３７）（実施例７）は、１２ｍｅｒのａｂａｓｉｃ ｓｉｔｅ用のアミダイト試薬（ａｂａｓｉｃ ＩＩ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ、Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ）を５’末端に結合させた１２ｍｅｒ（ｄ１２Ｚ―Ｉ）（配列番号１１）とそれと相補的な配列を有するｄ３７ｄＵ（配列番号１２）との架橋反応から作製した（ＵＤＧがオリゴの末端には作用しないため、ＡＰ ｓｉｔｅを作製可能な試薬をオリゴ合成段階に導入し、それを架橋して作製した）。５’末端にａｂａｓｉｃ ｓｉｔｅを提示するために、あらかじめｄ１２Ｚ―Ｉ（４ｎｍｏｌ）を酸処理（８０％酢酸５０μＬで室温下３０分間放置）して２Ｍ ＴＥＡＡ（２００μＬ）を加えて中和後、ＮＡＰ―５にて脱塩した。これを上記のｄ５’ＣＬ（１２／３４）（実施例１）と同様の方法でＵＤＧ処理したｄ３７ｄＵ（２ｎｍｏｌ）に加えて５分間氷上に置いた後、２ｍＭ ａｏＮａｏ（２０ｎｍｏｌ、１０μＬ）を加えて１７℃で１６時間反応をさせた。その後、逆相カラムを用いたＨＰＬＣを用いて精製し、架橋体を得た。

ヘアピンループを有する５０ｍｅｒの１本鎖の架橋体であるｄ５’ＨＰ ＣＬ（５０）（実施例８）は、２本鎖の向かい合った部分にデオキシウリジンを有する５０ｍｅｒオリゴ（ｄＨＰ５０ｄＵｄＵ、配列番号１３）を用い、上記ｄ５’ＣＬ（１２／３４）（実施例１）と同様の方法で反応を行った後、逆相ＨＰＬＣによって精製した。

２架橋体のｄＣＬ２（１２−Ｉ，ＩＩ／４６）（実施例９）は、配列番号３の核酸鎖（７．５６ｎｍｏｌ）及び配列番号１４の核酸鎖（７．５６ｎｍｏｌ）を配列番号１５の核酸鎖（２．５２ｎｍｏｌ）と混合し、ｄ５’ＣＬ（１２／３４）（実施例１）と同様の方法でＵＤＧ反応を行った。その後、２ｍＭ ａｏＮａｏ（５０．４ｎｍｏｌ、２５．２μＬ）を加え、ｄ５’ＣＬ（１２／３４）（実施例１）と同様に架橋化反応と精製を行った。

２架橋体のｄＣＬ２（１２／３４）（実施例１０）は、ｄ１２ｄＵｄＵ（配列番号１６）（２．４ｎｍｏｌ）とｄ３４ｄＵｄＵ（配列番号１７）（２．０ｎｍｏｌ）とを混合し、ｄ５’ＣＬ（１２／３４）（実施例１）と同様の方法でＵＤＧ反応を行った。その後、２ｍＭ ａｏＮａｏ（４０ｎｍｏｌ、２０μＬ）を加え、ｄ５’ＣＬ（１２／３４）（実施例１）と同様に架橋化反応と精製を行った。

（ＤＮＡの０架橋体（ＤＳ）（比較例２−４）の作製）
ｄ５’ＤＳ（１２／３４）（比較例２）については、配列番号３０の核酸鎖と配列番号２９の核酸鎖とを等モルずつ加え、ｄ５’ＣＬ（１２／３４）（実施例１）と同様に精製を行い、作製した。

ヘアピンループを有するｄ５’ＨＰ５０（比較例３）は、配列番号３１の核酸鎖を用い、上記ｄ５’ＣＬ（１２／３４）（実施例１）と同様の方法で反応を行い、作製した。

アルキルリンカーを有するヘアピンループオリゴであるｄ５’Ｌｉｇ（１２／３５）（比較例４）を下記の連結反応から作製した。本反応では、３‘末端にアルデヒド基を生成させたオリゴヌクレオチドに対し、１級アミノ基を有するオリゴを作用させ、シッフ塩基を還元することで連結する反応を採用した。作製にあたって、Ｋｏｊｉｍａ， Ｎ．， Ｓｕｇｉｎｏ， Ｍ．， Ｍｉｋａｍｉ， Ａ． Ｎｏｎａｋａ， Ｋ．， Ｆｕｊｉｎａｗａ， Ｙ．； Ｍｕｔｏ， Ｉ．， Ｍａｔｓｕｂａｒａ， Ｋ．， Ｏｈｔｓｕｋａ， Ｅ． ａｎｄ Ｋｏｍａｔｓｕ， Ｙ． Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｍｉｎｏ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｏｆ ａｒｏｍａｔｉｃ ｒｅｓｉｄｕｅ．Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．， ２００６， １６， ５１１８−５１２１．を参照した。
はじめにｄ３５ｄＵ−ｒＵ（配列番号３３）（２ｎｍｏｌ）を１００ｍＭリン酸 緩衝液（ｐＨ６）中、過ヨウ素酸（１６ｎｍｏｌ）を作用させ（反応液４８μＬ）、２７℃で９０分間加温して３’末端を酸化した。続いてｄ３５ｄＵ−ｒＵと相補的な配列を有し、５’末端にアミノリンカー（ｓｓＨ−ｌｉｎｋｅｒ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄ．）を有するアミノ化オリゴ（ｓｓＨ―ｄ１２Ａ；２．４ｎｍｏｌ）（配列番号３２）を滅菌水（６μＬ）に溶解し、あらかじめ酸化させたｄ３５ｄＵ−ｒＵに加えた。混合した溶液を氷上に５分間放置した後に１５０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウム存在下（反応液６０μＬ）で、２７℃で１６時間結合反応を行った。反応後、連結体は架橋化オリゴと同様に逆相ＨＰＬＣによって精製した。ｄ５’Ｌｉｇ（１２／３５）（比較例４）の合成スキームを下記に示す。

精製した架橋化アダプター（実施例１及び実施例９）については、ＬＣ−ＭＳによって分子量を確認するとともに、２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行って、架橋化されていることを確認した。より具体的には、図７（ａ）に示すように、実施例１の１架橋体は、原料である配列番号３の核酸鎖及び配列番号４の核酸鎖よりも遅れて移動し、実施例９の２架橋体は、原料である配列番号１５の核酸鎖よりも遅れて移動することが確認された。ゲルの分析は電気泳動後にＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ．）によって染色し、Ｔｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ９０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ．）によって解析した。

各分子の精製に用いたＨＰＬＣの条件及び各分子の分子量測定の結果を表３に示す。

（ＲＮＡの１架橋体（ＣＬ１）（実施例１１−１２）の作製）
１架橋体のｒ５’ＣＬ（１２／３４）（実施例１１、図４）は以下の方法で作製した。配列番号１８の核酸鎖（７．５６ｎｍｏｌ）と配列番号１９の核酸鎖（２．５２ｎｍｏｌ）を、ＵＤＧバッファー（×１０，２０μＬ）を含む溶液（総量１９８．５μＬ）に溶解させた。反応液を９０℃で１分加熱し氷冷した後に室温まで徐冷し、室温及び０℃でそれぞれ段階的に５分間放置した。続いて反応液にＵＤＧ（７．５ｕｎｉｔ，１．５μＬ）を加え、総量２００μＬで３７℃、６０分間反応を行った後、４℃で１５分間放置した。この反応液に２ｍＭ ａｏＮａｏ（２５．２ｎｍｏｌ、１２．６μＬ）を加えて２７℃で加温して架橋反応を行った。２時間後、反応液を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ１．０７）、２００ｍＭ シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ_３ＣＮ）を含む組成中で還元反応を行った（図６（ｂ））。室温で３０分反応させた後に２Ｍ ＴＥＡＡ緩衝液（４２０μＬ）を加えて中和し、逆相カラムを用いたＨＰＬＣを用いて架橋体を精製した。ＨＰＬＣの溶液にはＤＮＡと同じ溶液を用いて行った。同じく１架橋体であるｄｒ５’ＣＬ（１２／３４）（実施例１２）については、配列番号２０の核酸鎖及び配列番号２１の核酸鎖を用い、上記同様に作製した。

各架橋体の精製に用いたＨＰＬＣの条件を表４に示す。

（ＲＮＡの０架橋体（ＤＳ）（比較例８、９）の作製）
ｒ５’ＤＳ（１２／３４）（比較例８）については、配列番号３７の核酸鎖と配列番号３６の核酸鎖とを等モルずつ加え、ｒ５’ＣＬ（１２／３４）（実施例１１）と同様に精製を行い、作製した。

ヘアピンループを有するｒＨＰ５０（比較例９）は、配列番号３８の核酸鎖を用い、上記ｒ５’ＣＬ（１２／３４）（実施例１１）と同様の方法で反応を行い、作製した。

（２’−ＯＭｅ ＲＮＡの１架橋体（ＣＬ１）及び２架橋体（ＣＬ２）（実施例１３−１８）の作製）
５’側１架橋体であるｍ５’ＣＬ（１２／３４）（実施例１４、図５）は以下の方法で作製した。ｄＵを含む配列番号２４の核酸鎖（３．０ｎｍｏｌ）及び配列番号２３の核酸鎖（２．５２ｎｍｏｌ）を、ＵＤＧバッファー（×１０，２０μＬ）を含む溶液（総量１９８．５μＬ）に溶解させた。反応液を９０℃で１分加熱し氷冷した後に室温まで徐冷し、室温及び０℃でそれぞれ段階的に５分間放置した。続いて反応液にＵＤＧ（７．５ｕｎｉｔ，１．５μＬ）を加え、総量２００μＬで３７℃、６０分間反応を行った後、４℃で１５分間放置した。この反応液に２ｍＭ ａｏＮａｏ（２５．２ｎｍｏｌ、１２．６μＬ）を加えて２７℃で３時間反応をさせた。その後、逆相カラムを用いたＨＰＬＣを用いて精製し、架橋体を得た。その他の１架橋体であるｍ５’ＣＬ（１０／３４）（実施例１３、図５）については配列番号２３の核酸鎖及び配列番号２２の核酸鎖を用いて、ｍ３’ＣＬ（１２／３４）（実施例１５、図５）については配列番号２５の核酸鎖及び配列番号２４の核酸鎖を用いて、ｍ３’ＣＬ（１２／３４−Ｍ）（実施例１６、図５）については配列番号２６の核酸鎖及び配列番号２４の核酸鎖を用いて、同様の方法で反応から精製までを行った。ＨＰＬＣの溶液として、前述（ＤＮＡ作製）と同様の溶液を用いて行った。

２架橋体であるｍＣＬ（１２−Ｉ×２／４６）（実施例１７、図５）については、配列番号２４の核酸鎖（７．５６ｎｍｏｌ）及び配列番号２７の核酸鎖（２．５２ｎｍｏｌ）を混合し、１架橋体のｍ５’ＣＬ（１２／３４）（実施例１４）と同様の方法でＵＤＧ反応を行った。その後、２ｍＭ ａｏＮａｏ（５０．４ｎｍｏｌ、２５．２μｌ）を加え、ｍ５’ＣＬ（１２／３４）（実施例１４）と同様に架橋化反応と精製を行った。同じく２架橋体であるｍＣＬ（１２−Ｉ×２／４６Ｍ）（実施例１８）についても、配列番号２４の核酸鎖及び配列番号２８の核酸鎖を用いて、同様の方法で反応から精製までを行った。

（２’−ＯＭｅ ＲＮＡの分子（比較例１３−１５、１７、１８）の作製）
ｍ５’ＤＳ（１２／３４）（比較例１３）については、配列番号４２の核酸鎖と配列番号４１の核酸鎖とを等モルずつ加え、ｍ３’ ＤＳ（１２／３４）（比較例１５）については、配列番号４２の核酸鎖と配列番号４４の核酸鎖とを等モルずつ加え、ｍＤＳ２（１２×２／４６）（比較例１７）については、配列番号４２の核酸鎖と配列番号４５の核酸鎖とを等モルずつ加え、ｍ５’ＣＬ（１２／３４）（実施例１４）と同様に精製を行い、作製した。

ヘアピンループを有するｍＨＰ５０（比較例１４）は、配列番号４３の核酸鎖を用い、上記ｍ５’ＣＬ（１２／３４）（実施例１４）と同様の方法で反応を行い、作製した。

架橋化アダプター配列を両端に有するｍＣＬ２（１２−Ｉ×２／３４）（比較例１８）については、配列番号２４の核酸鎖及び配列番号４６の核酸鎖を用いてｍ５’ＣＬ（１２／３４）（実施例１４）と同様に作製した。

精製した架橋化アダプターを有する分子は、ＬＣ−ＭＳによって分子量を確認するとともに、２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行って架橋化されていることを確認した。より具体的には、図７（ｂ）に示すように、実施例１４−１６の１架橋体は、原料である配列番号２４の核酸鎖及びｍＳＳ（３４）ｄＵ（比較例１１）の核酸鎖よりも遅れて移動し、実施例１７の２架橋体、比較例１８の分子は、配列番号２７の核酸鎖よりも遅れて移動することが確認された。ゲルの分析は電気泳動後にＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ．）によって染色し、Ｔｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ９０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ．）によって解析した。

各架橋体の精製に用いたＨＰＬＣの条件及び架橋体の分子量測定の結果を表５に示す。

（実施例Ｂ）
（Ｔｍ測定）
実施例Ａにて作製した実施例及び比較例の分子について、融解曲線を測定した。標的となる核酸として、ｍｉＲ２１（配列番号１）及びｍｉＲ２１−Ｍ（配列番号２）を選択した。

実施例１−１５、１７又は比較例１−１１、１３−１７の分子（１３０ ｐｍｏｌ）と、ｍｉＲ−２１又はｍｉＲ−２１−Ｍ（１３０ｐｍｏｌ）と、を混合し、Ｔｍ測定バッファー（１０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ（ｐＨ ７．０）１３０μＬ）に溶解した。サンプルを９０℃で３分間加熱後、室温まで徐冷してアニーリングした後、室温で５分間放置して、１２５μＬを測定用セルに入れて融解曲線を測定した。測定にはＵＶ２５００ＰＣ（島津社製）を用い、５℃〜９０℃の温度範囲を、温度速度０．５℃／ｍｉｎ、測定間隔 ０．２℃、開始保持６００秒、測定前待機０秒で行った。実施例１−１０及び比較例１−５（ＤＮＡ）のＴｍ測定の結果を図８に、実施例１１−１２及び比較例６−９（ＲＮＡ）のＴｍ測定の結果を図９に、実施例１３−１５、１７及び比較例１０−１１、１３−１７（２’−ＯＭｅ ＲＮＡ）のＴｍ測定の結果を図１０にそれぞれ示す。なお、図８−１０において、棒グラフの左に記載されたかっこ内の数値は、ｍｉＲ２１−Ｍ（配列番号２）とのＴｍ値を示す。

図８に示すように、二本鎖アダプター配列を有する比較例２では、一本鎖アダプター配列を有する比較例１、５と同程度のＴｍ値を示した。また、ヌクレオチド又はアルキルリンカーからなるヘアピンループを有するｄ５’ＨＰ５０（比較例３）及びｄ５’Ｌｉｇ（１２／３５）（比較例４）でも、一本鎖アダプター配列を有する比較例１、５と同程度のＴｍ値を示した。一方、架橋化アダプター配列を有する実施例１−８では、比較例１−５に比して、１０℃以上高いＴｍ値を示し、２架橋体（ＣＬ２）である実施例９では、さらに高いＴｍ値を示した。ヘアピンループを有するオリゴ（ｄ５’ＨＰ ＣＬ（５０）：実施例８）においても２本鎖部分を架橋化することで、Ｔｍ値が５６℃にまで上昇することが確認された一方で、架橋化前のオリゴ（ｄ５’ＨＰ５０ｄＵｄＵ、配列番号１３）では、Ｔｍ値が低く安定化効果が得られなかったため、架橋化がＴｍ値の上昇に必要であることが示された。また、架橋部位がアダプターの末端に位置した場合（ｄ５’ＣＬ（１２／３７）：実施例７）でも高いＴｍ値が確認された。なお、架橋化アダプター配列にミスマッチを有する１架橋体（ＣＬ１）の実施例５、６においても、同じく１架橋体（ＣＬ１）の実施例１と同程度のＴｍ値を示した。また、架橋化アダプター配列と一本鎖核酸との間に１ｍｅｒのチミジンからなるリンカーを挿入した１架橋体（ＣＬ１）の実施例２、８ｍｅｒのチミジンからなるリンカーを挿入した１架橋体（ＣＬ１）の実施例４、及びプロピルリンカーを挿入した１架橋体（ＣＬ１）の実施例３では、同じく１架橋体（ＣＬ１）の実施例１よりもわずかにＴｍ値が低下するものの、未架橋体２本鎖よりも高いＴｍ値を維持することも確認した。これらの結果は、架橋化によって安定化された２本鎖部分が、ハイブリ領域と直接結合していない場合においても安定化効果が得られることを示している。

図９に示すように、二本鎖アダプター配列を有する比較例８では、一本鎖アダプター配列を有する比較例７と同程度のＴｍを示した。また、ヘアピンループを有する比較例９でも、一本鎖アダプター配列を有する比較例７と同程度のＴｍを示した。一方、架橋化アダプター配列を有する実施例１１、１２では、比較例６−９に比して、１０℃以上高いＴｍ値を示した。また、一本鎖核酸の部分がＲＮＡであり、架橋化アダプター配列の部分がＤＮＡである、キメラ型分子の実施例１２（ｄｒ５’ＣＬ（１２／３４））においても、高いＴｍ値を有した。

図１０に示すように、二本鎖アダプター配列を有する比較例１３、１５、１７では、一本鎖アダプター配列を有する比較例１１、１６と同程度のＴｍ値を示した。また、ヘアピンループを有する比較例１４でも、一本鎖アダプター配列を有する比較例１１、１６と同程度のＴｍを示した。一方、架橋化アダプター配列を有する実施例１３−１５、１７では、比較例１０−１１、１３−１７に比して、１０℃以上高いＴｍ値を示し、２架橋体（ＣＬ２）である実施例１７では、さらに高いＴｍ値を示した。

なお、図８−１０において、ミスマッチ塩基対を形成する標的ＲＮＡ（ｍｉＲ２１−Ｍ：配列番号２）に対しては、いずれもＴｍ値は低下したが、ハイブリダイゼーションの安定化の効果は、パーフェクトマッチの標的ＲＮＡ（ｍｉＲ２１：配列番号１）と同様に現れた。

以上より、本実施例による１架橋体（ＣＬ１）及び２架橋体（ＣＬ２）は、標的核酸とのハイブリダイゼーションを安定化させることが示された。また、このハイブリダイゼーションを安定化効果は、架橋化アダプター配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、２’−ＯＭｅ ＲＮＡのいずれであっても得られることが確認された。

（実施例Ｃ）
（ｍｉＲＮＡの抑制活性評価）
２’−ＯＭｅ ＲＮＡは、細胞内における安定性に優れており、アンチセンスとしても利用されている。そこで、２’−ＯＭｅ ＲＮＡの実施例１４−１５、１７について、細胞内におけるｍｉＲＮＡ活性の阻害効果を評価した。なお、標的となるｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ−２１（配列番号１）を選択した。

ｍｉＲ−２１の阻害効果の検証には、デュアルルシフェラーゼアッセイ系を採用した。ｐｓｉＣＨＥＣＫ−２（登録商標）ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＲｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅをコードする配列の３’ＵＴＲにのみｍｉＲ−２１の結合配列が導入されたｖｅｃｔｏｒの構築を下記の通り行った。はじめに、制限酵素部位ＳｇｆＩ及びＰｍｅＩの切断認識配列の一部を両末端に有するｍｉＲ−２１とその相補鎖に相当する２本鎖オリゴヌクレオチドを合成した（配列番号４７及び配列番号４８）。オリゴヌクレオチドの５’末端には、ｖｅｃｔｏｒへのライゲーションに必要なリン酸基を合成段階でそれぞれ導入した。続いて、ＳｇｆＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＰｍｅＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で処理したｐｓｉＣＨＥＣＫ−２（登録商標）ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に対し、あらかじめアニーリングした前記２本鎖オリゴヌクレオチドをＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてライゲーションした。得られたｖｅｃｔｏｒは一般的な手法によって大腸菌を用いてクローニングと配列確認を行い、目的部位にｍｉＲ−２１の結合配列が挿入されたｖｅｃｔｏｒ（ｐｓｉＣＨＥＣＫ−２−ｍｉＲ−２１）を得た。

配列番号４７：５’ ｐＣＧＣＡＧＴＡＧＡＧＣＴＣＴＡＧＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧＣＴＡＧＴＴＴ ３’ （ｐ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）
配列番号４８：３’ ＴＡＧＣＧＴＣＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＣＡＡＧＴＴＧＴＡＧＴＣＡＧＡＣＴＡＴＴＣＧＡＴＣＡＡＡｐ ５’ （ｐ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）

細胞にｐｓｉＣＨＥＣＫ−２−ｍｉＲ−２１ ｖｅｃｔｏｒを導入した場合、細胞内のｍｉＲ−２１がＲｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅのｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合し、Ｒｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの発現が抑制されて同酵素由来の発光も検出されない。しかしながら、ｍｉＲ−２１と相補的な配列を有する核酸分子（アンチｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチド：ＡＭＯ）を導入した場合、ｍｉＲ−２１のｍＲＮＡへの結合が競合阻害され、Ｒｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの発現が誘導されて発光が観察されるようになる。ＨｅＬａ細胞はｍｉＲ−２１を多く発現していることから、同細胞を９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ）に２^４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で播種して２４時間培養した後、ｐｓｉＣＨＥＣＫ−２−ｍｉＲ−２１（０．１ｍｇ／ｗｅｌｌ）及び合成したアンチｍｉＲＮＡオリゴ（０．０５〜５０ｎＭ／ｗｅｌｌ）をｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，０．３ｍＬ／ｗｅｌｌ）と共に細胞内に導入した。また、ポジティブコントロールとして、ｍｉＲ−２１の結合配列を持たないｖｅｃｔｏｒ（ｐｓｉＣＨＥＣＫ−２）を細胞に導入した実験も並行して行った。

２４時間培養後、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用してＲｅｎｉｌｌａ及びＦｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅそれぞれの発光強度を測定した。Ｒｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの発光強度を内部標準となるＦｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの発光強度との比で表し（Ｒｌｕｃ／Ｆｌｕｃ）、さらにｍｉＲ−２１の結合配列を持たないｖｅｃｔｏｒから算出した値で正規化し、Ｒｌｕｃ／Ｆｌｕｃの相対値を、それぞれのアンチｍｉＲＮＡオリゴの濃度に対してプロットし、ｍｉＲ−２１の活性阻害効果を評価した（図１１）。また、市販のアンチｍｉＲＮＡオリゴ（ＬＮＡ−ｍｉＲＣＵＲＹ，ＬＮＡ ＮＣ，ｍｅｒｉｄｉａｎ，Ｔｏｕｇｈ Ｄｅｃｏｙ）も同じ条件で細胞に作用させてｍｉＲＮＡの阻害効果を調べた。

比較に用いた市販のアンチｍｉＲＮＡオリゴについて下記に示す。
・ＬＮＡ−ｍｉＲＣＵＲＹ（ｍｉＲＣＵＲＹ， ＬＮＡ ｍｉＲＮＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｈｓａ−ｍｉＲ２１、Ｅｘｉｑｏｎ社）
・ＬＮＡ ＮＣ（ｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ａ、Ｅｘｉｑｏｎ社）
・ｍｅｒｉｄｉａｎ（ｍｉＲＩＤＩＡＮ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ ｈａｒｉｐｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＧＥ Ｈｅｌｔｈｅｃａｒｅ社）
・Ｔｏｕｇｈ ｄｅｃｏｙ（ＭＩＳＳＩＯＮ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｈｕｍａｎ ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、Ｓｉｇｍａ社）

結果を図１１（ａ）〜（ｄ）に示す。なお、各分子の添加濃度は、図１１（ａ）〜（ｄ）の４本のカラムの左から、０ｎＭ、０．５ｎＭ、２ｎＭ、１０ｎＭである。

図１１（ａ）に示されるように、二本鎖アダプター配列を持たない比較例１０（ｍ−ａｓｍｉＲ２１）に比して、二本鎖アダプター配列を有する比較例１３（ｍ５’ＤＳ（１２／３４））では、高いｍｉＲＮＡ抑制活性を示した。また、二本鎖アダプター配列を有する比較例１３（ｍ５’ＤＳ（１２／３４））に比して、架橋化アダプター配列を有する実施例１４（ｍ５’ＣＬ（１２／３４））では、さらに高いｍｉＲＮＡ抑制活性を示した。

図１１（ｂ）に示されるように、二本鎖アダプター配列を持たない比較例１０（ｍ−ａｓｍｉＲ２１）及び３’Ｍｅ３４Ｕ（配列番号４４の核酸鎖）に比して、二本鎖アダプター配列を有する比較例１５（ｍ３’ＤＳ（１２／３４）では、高いｍｉＲＮＡ抑制活性を示した。また、二本鎖アダプター配列を有する比較例１５（ｍ３’ＤＳ（１２／３４）に比して、架橋化アダプター配列を有する実施例１５（ｍ３’ＣＬ（１２／３４））では、さらに高いｍｉＲＮＡ抑制活性を示した。

図１１（ｃ）に示されるように、二本鎖アダプター配列を持たない比較例１０（ｍ−ａｓｍｉＲ２１）及び比較例１６（ｍＳＳ（４６））に比して、両端に二本鎖アダプター配列を有する比較例１７（ｍＤＳ２（１２×２／４６））では、高いｍｉＲＮＡ抑制活性を示した。また、二本鎖アダプター配列を有する比較例１７（ｍＤＳ２（１２×２／４６））に比して、両端に架橋化アダプター配列を有する実施例１７（ｍＣＬ２（１２−Ｉ×２／４６））では、さらに高いｍｉＲＮＡ抑制活性を示した。なお、ｍｉＲ−２１とハイブリダイゼーションする領域が１０塩基程度である比較例１８（ｍＣＬ２（１２−Ｉ×２／３４））では、ｍｉＲＮＡ抑制活性が大きく低下したことから、十分なｍｉＲＮＡ抑制活性を得るためには、ｍｉＲＮＡとの安定な結合が重要であることが示唆された。

図１１（ｄ）に示されるように、両端に架橋化アダプター配列を有する実施例１７（ｍＣＬ２（１２−Ｉ×２／４６））では、ＬＮＡ（ｍｉＲＣＵＲＹ）、ＬＮＡ ＮＣ、ｍｉＲＩＤＩＡＮ及びＴｏｕｇｈ Ｄｅｃｏｙに比して、高いｍｉＲＮＡ抑制活性を示した。市販のアンチｍｉＲＮＡオリゴ（ＬＮＡ−ｍｉＲＣＵＲＹ、ＬＮＡ ＮＣ、ｍｅｒｉｄｉａｎ、Ｔｏｕｇｈ Ｄｅｃｏｙ）も抑制効果を示したが、ｍＣＬ２（１２−Ｉｘ２／４６）（実施例１７）はそれらよりもさらに高い阻害効果を有しており、細胞内においても有効に機能することを確認した。

以上より、本実施例による１架橋体（ＣＬ１）及び２架橋体（ＣＬ２）は、高いｍｉＲＮＡ抑制活性を有することが示された。

（実施例Ｄ）
相補鎖核酸複合体を作製し、融解曲線を測定した。標的となる核酸として、ｍｉＲ２１（配列番号１）を選択した。

実施例１９として、ｄ５’ＣＬ（１２／３４）（実施例１）と、その１本鎖領域に相補的な配列を有する配列番号４９の核酸鎖と、を等モルずつ混合して、ハイブリダイゼーションさせた相補鎖核酸複合体ｄ５’ＣＬ（１２／３４）／ｄｃ３４ｄＵを作製した（図１２（ａ））。ｄ５’ＣＬ（１２／３４）／ｄｃ３４ｄＵ（実施例１９）の模式図を図１２（ｂ）に示す。
配列番号４９：５’ ＴＡＧＣＴＴＡＴＣＡＧＡＣＴＧＡＴＧＴＴＧＡＧＣＴＧＣｕＧＣＴＣＣＧ ３’

実施例２０として、ｄ５’ＣＬ（１２／３４）（実施例１）と、その１本鎖領域に相補的な配列を有し架橋化アダプター配列を有するｄｃＣＬ（１２／３４）と、を等モルずつ混合して、ハイブリダイゼーションさせた相補鎖核酸複合体ｄ５’ＣＬ（１２／３４）／ｄｃＣＬ（１２／３４）を作製した（図１２（ａ））。ｄｃＣＬ（１２／３４）については、配列番号５０の核酸鎖と配列番号５１の核酸鎖とを用いて、ｄ５’ＣＬ（１２／３４）（実施例１）と同様に作製した。ｄ５’ＣＬ（１２／３４）／ｄｃＣＬ（１２／３４）（実施例２０）の模式図を図１２（ｃ）に示す。
配列番号５０：５’ ＴＡＧＣＴＴＡＴＣＡＧＡＣＴＧＡＴＧＴＴＧＡＧＣＴＧＣＸＧＣＴＣＣＧ ３’ （Ｘ＝ｕ：ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）
配列番号５１：３’ＣＧＡＣＧＸＣＧＡＧＧＣ ５’（Ｘ＝ｕ：ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）

比較例１９として、ｄｃ３４ｄＵ（配列番号４９の核酸鎖）と、それに相補的な配列を有するｄ３４ｄＵ（配列番号５２）の核酸鎖と、を等モルずつ混合して、ハイブリダイゼーションさせた分子ｄ３４ｄＵ／ｄｃ３４ｄＵを作製した（図１２（ａ））。
配列番号５２：３’ ＧＣＣＴＣＧＸＣＧＴＣＧＡＴＣＧＡＡＴＡＧＴＣＴＧＡＣＴＡＣＡＡＣＴ ５’ （Ｘ＝ｕ：ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）

実施例１９、２０、比較例１９について、実施例Ｂと同様の方法でＴｍを測定した。結果を図１２（ｄ）に示す。架橋化アダプターを有する相補鎖核酸複合体ｄ５’ＣＬ（１２／３４）／ｄｃ３４ｄＵ（実施例１９）のＴｍ値は、１本鎖構造のみを有する核酸ｄ３４ｄＵ／ｄｃ３４ｄＵ（比較例１９）よりも有意に増加した（約７℃増加）。また、架橋化アダプターを有する核酸分子同士がハイブリダイゼーションしている相補鎖核酸複合体ｄ５’ＣＬ（１２／３４）／ｄｃＣＬ（１２／３４）（実施例２０）ではさらに同程度のＴｍ増加度（約７℃増加）を示し、Ｔｍ安定化の相乗効果が確認された。

以上より、本実施例による相補鎖核酸複合体は、安定的にハイブリダイゼーションが形成されていることが示された。

（実施例Ｅ）
２’−ＯＭｅ ＲＮＡの実施例１４−１５、１７及び実施例２１−２３（後述）について、トランスフェクション４８時間後のｍｉＲＮＡ活性の阻害効果を評価した。

実施例Ａと同様の方法により、以下の実施例２１−２３の分子を合成した。

実施例２１として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及びスペーサー（リンカー）としてＧ（グアニン）を挟んで１１ｍｅｒの２本鎖の架橋化アダプター配列を有するｍ３’ＣＬ（１１／３４）を合成した（図１３）。

実施例２２として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及びスペーサー（リンカー）として３ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（ＧＣＣ）を挟んで９ｍｅｒの２本鎖の架橋化アダプター配列を有するｍ３’ＣＬ（９／３４）を合成した（図１３）。

実施例２３として、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）及び１０ｍｅｒの２本鎖の架橋化アダプター配列を有するｍ３’ＣＬ（１０／３４）を合成した（図１３）。

実施例２１−２３の分子を作製するために、表６に示す各オリゴヌクレオチドを用いた。“ｍ”及び“Ｘ”の表記については、実施例Ａと同様である。

ｍｉＲ−２１の阻害効果の検証には、実施例Ｃと同様にデュアルルシフェラーゼアッセイ系を採用し、その方法についても実施例Ｃと同様に行った。トランスフェクションについても、実施例Ｃと同様に行った。

４８時間培養後、実施例Ｃと同様の方法でｍｉＲ−２１の活性阻害効果を評価した（図１４）。

比較に用いたｍｉＲＩＤＩＡＮ及びＴｏｕｇｈ ｄｅｃｏｙについては、実施例Ｃと同様である。

結果を図１４（ａ）、（ｂ）に示す。なお、各分子の添加濃度は、図１４（ａ）、（ｂ）のカラムの左から、０ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭである。

図１４（ａ）に示されるように、単なる二本鎖アダプター配列を有する比較例１７（ｍＤＳ２（１２×２／４６））に比して、架橋化アダプター配列を有する実施例１７（ｍＣＬ２（１２−Ｉ×２／４６））では、より高いｍｉＲＮＡ抑制活性を示し、トランスフェクション２４時間後よりもｍｉＲＮＡ抑制活性の相違が明確になった。これは、架橋体（実施例１７）の方がよりｍｉＲＮＡ抑制活性の持続性が高いことを示唆している。

図１４（ｂ）に示されるように、相補結合様配列（一本鎖核酸）の３’末端に架橋化アダプター配列を有する実施例１４（ｍ５’ＣＬ（１２／３４））に比して、相補結合様配列（一本鎖核酸）の５’末端側に架橋化アダプター配列を有する実施例２１（ｍ３’ＣＬ（１１／３４））、実施例２２（ｍ３’ＣＬ（９／３４））、実施例２３（ｍ３’ＣＬ（１０／３４））では、より高いｍｉＲＮＡ抑制活性を示した。また、トランスフェクション４８時間後では、２４時間後の結果に比して、ｍｉＲＮＡ抑制活性の違いがさらに顕著になり、相補結合様配列（一本鎖核酸）の５’末端側に架橋化アダプター配列を有する構造が重要であることが明らかとなった。また、ｍｉＲ２１に相補的な配列（相補結合様配列）（一本鎖核酸）と、架橋化アダプター配列と、の間にスペーサー（リンカー）を有する実施例２１（ｍ３’ＣＬ（１１／３４））及び実施例２２（ｍ３’ＣＬ（９／３４））に比して、そのようなスペーサーを有しない実施例２３（ｍ３’ＣＬ（１０／３４））では、より高いｍｉＲＮＡ抑制活性を示し、スペーサーが無く相補結合様配列（一本鎖核酸）と架橋化アダプター配列とが連続している場合には、高いｍｉＲＮＡ抑制活性を示すことが明らかとなった。

以上より、相補結合様配列（一本鎖核酸）の５’末端側に架橋化アダプター配列を有する１架橋体（ＣＬ１）は、高いｍｉＲＮＡ抑制活性を有することが示された。

なお、本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。つまり、本発明の範囲は、実施形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。

本出願は、２０１４年１２月１２日に出願された日本国特許出願２０１４−２５１８４７号に基づくものであり、その明細書、特許請求の範囲、図面および要約書を含むものである。上記日本国特許出願における開示は、その全体が本明細書中に参照として含まれる。

本発明の架橋化２本鎖構造によるハイブリダイゼーションの安定化効果は、ＲＮＡ、ＤＮＡ等を標的とした核酸の検出における高感度化や、核酸医薬における高い薬効に役立つことが考えられる。さらに本発明は、特異な核酸構造体であることから、既存の種々の核酸誘導体モノマーとの併用ができ、既存技術の効果をさらに向上させることが可能である。そのため、本発明の核酸の新しい構造は、核酸を活用する広範な領域で利用することが可能で、産業上においても高い利用可能性を有している。

Claims (10)

1. 標的核酸の塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列又は標的核酸の塩基配列の９０％以上１００％未満の塩基と対合する塩基配列からなり、該標的核酸とハイブリダイゼーションする一本鎖核酸と、
   前記一本鎖核酸の５’末端及び３’末端の少なくとも一方に連結される第一核酸鎖と、前記第一核酸鎖に完全に又は十分に相補的な塩基配列を含む第二核酸鎖と、からなる架橋化二本鎖核酸と、
   を含み、
   前記架橋化二本鎖核酸は、前記第一核酸鎖及び前記第二核酸鎖の少なくとも一方の糖を介した結合によって架橋されている、
   ことを特徴とするハイブリダイゼーション安定化用核酸複合体。
2. 前記架橋化二本鎖核酸は、前記第一核酸鎖及び前記第二核酸鎖の糖同士の結合によって架橋されている、
   ことを特徴とする請求項１に記載のハイブリダイゼーション安定化用核酸複合体。
3. 前記第一核酸鎖及び前記第二核酸鎖の糖同士は、アミド結合、オキシム結合、アルキルアミド結合、Ｓ−Ｓ結合及び炭素−炭素結合からなる群より選択される少なくとも１種類の共有結合により結合している、
   ことを特徴とする請求項２に記載のハイブリダイゼーション安定化用核酸複合体。
4. 前記第一核酸鎖及び前記第二核酸鎖の糖同士は、アミノオキシ基又はアミノ基を有する架橋化試薬により結合している、
   ことを特徴とする請求項３に記載のハイブリダイゼーション安定化用核酸複合体。
5. 前記架橋化試薬は、
   一般式１：
   Ｒ_１−ＮＨ−Ｏ−Ｌ_１−Ｄ−Ｌ_２−Ａ （１）
   （式中、
   Ｒ_１は、水素原子、アルキル基又はアミノ基の保護基であり、
   Ｄは、置換若しくは無置換のフェニレン基、置換若しくは無置換のアントリレン基、置換若しくは無置換のナフチレン基、置換若しくは無置換のフェナントリレン基、置換若しくは無置換のアントラキノリレン基、及び置換若しくは無置換のアクリジニレン基から選択される芳香族基又はＣ_２−１０アルキル基であり、
   芳香族基の置換基は、ハロゲン原子、Ｃ_１−６アルキル基、ニトロ基、シアノ基、Ｃ_２−６アルケニル基、Ｃ_３−１０シクロアルキル基、Ｃ_１−１０アルコキシ基及びＣ_１−１０アシル基からなる群から選択され、
   Ｌ_１は、直接結合又は以下の一般式３又は４：
   （式中、Ｒ_３は、Ｃ_１−９アルキレン基又は−（ＣＨ_２）_ｏ−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ−（ＣＨ_２）_ｑ−であり、ｏ〜ｑは、それぞれ独立して０〜１５の整数であり、ｏ＋ｐ＋ｑは、１〜１５である）
   のいずれかで表される２価の基であり、Ｌ_２は、直接結合又は以下の一般式５又は６：
   （式中、Ｒ_４は、Ｃ_１−９アルキレン基又は−（ＣＨ_２）_ｒ−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｓ−（ＣＨ_２）_ｔ−であり、ｒ〜ｔは、それぞれ独立して０〜１５の整数であり、ｒ＋ｓ＋ｔは、１〜１５である）
   のいずれかで表される２価の基であり、
   Ａは、アミノオキシ基又は保護されたアミノオキシ基である）で表される化合物又はその塩である、
   ことを特徴とする請求項４に記載のハイブリダイゼーション安定化用核酸複合体。
6. 前記架橋化試薬は、アミノオキシ基を有し、
   前記架橋化二本鎖核酸において、前記第一核酸鎖及び前記第二核酸鎖の糖におけるアルデヒド基同士が、前記架橋化試薬のアミノオキシ基を介して結合している、
   ことを特徴とする請求項５に記載のハイブリダイゼーション安定化用核酸複合体。
7. 標的核酸の塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列又は標的核酸の塩基配列の９０％以上１００％未満の塩基と対合する塩基配列からなり、該標的核酸とハイブリダイゼーションする一本鎖核酸と、
   前記一本鎖核酸の５’末端及び３’末端の少なくとも一方に連結される第一核酸鎖と、前記第一核酸鎖に完全に又は十分に相補的な塩基配列を含む第二核酸鎖と、からなる架橋化二本鎖核酸と、
   を含み、
   前記架橋化二本鎖核酸は、前記第一核酸鎖及び前記第二核酸鎖の少なくとも一方の糖を介した結合によって架橋されている、
   ことを特徴とする核酸複合体と、前記核酸複合体を構成する一本鎖核酸の塩基配列に対して完全に又は十分に相補的な塩基配列からなる標的核酸と、をハイブリダイゼーションさせる工程を含む、
   ことを特徴とする核酸ハイブリダイゼーションの安定化方法。
8. 標的核酸の塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列又は標的核酸の塩基配列の９０％以上１００％未満の塩基と対合する塩基配列からなり、該標的核酸とハイブリダイゼーションする一本鎖核酸と、
   前記一本鎖核酸の５’末端及び３’末端の少なくとも一方に連結される第一核酸鎖と、前記第一核酸鎖に完全に又は十分に相補的な塩基配列を含む第二核酸鎖と、からなる架橋化二本鎖核酸と、
   を含み、
   前記架橋化二本鎖核酸は、前記第一核酸鎖及び前記第二核酸鎖の少なくとも一方の糖を介した結合によって架橋されている、
   ことを特徴とする核酸複合体を含むアンチセンス核酸医薬品。
9. 標的核酸の塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列又は標的核酸の塩基配列の９０％以上１００％未満の塩基と対合する塩基配列からなり、該標的核酸とハイブリダイゼーションする一本鎖核酸と、
   前記一本鎖核酸の５’末端及び３’末端の少なくとも一方に連結される第一核酸鎖と、前記第一核酸鎖に完全に又は十分に相補的な塩基配列を含む第二核酸鎖と、からなる架橋化二本鎖核酸と、
   を含み、
   前記架橋化二本鎖核酸は、前記第一核酸鎖及び前記第二核酸鎖の少なくとも一方の糖を介した結合によって架橋されている、
   ことを特徴とする核酸複合体を含むｍｉｃｒｏＲＮＡ抑制剤。
10. 前記架橋化二本鎖核酸は、前記一本鎖核酸の５’末端に連結される、
    ことを特徴とする請求項９に記載のｍｉｃｒｏＲＮＡ抑制剤。