JP2006075082A - オリゴヌクレオチドの架橋反応 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 芳香族基を有するリンカーを介してオリゴヌクレオチドに導入された少なくとも1個の架橋形成基と、該オリゴヌクレオチドと同一又は異なるオリゴヌクレオチドに含まれる少なくとも1個の反応性官能基との間で共有結合を形成する方法。
【選択図】 図6
Description
(1)芳香族基を有するリンカーを介してオリゴヌクレオチドに導入された少なくとも1個の架橋形成基と、該オリゴヌクレオチドと同一又は異なるオリゴヌクレオチドに含まれる少なくとも1個の反応性官能基との間で共有結合を形成する方法。
(8)芳香族基を有するリンカーを介して導入された架橋形成基が、オリゴヌクレオチドの末端に導入されており、その構造が一般式1:
B−D−(1)
(式中、Bは架橋形成基を表し、Dは少なくとも1つの芳香族基を有する二価の有機基を表し、Dはオリゴヌクレオチドの5’末端又は3’末端の、水酸基又はリン酸基の酸素と結合する)
で表される、(1)〜(7)のいずれかに記載の方法。
(10)芳香族基を有するリンカーを介して導入された架橋形成基が、オリゴヌクレオチドの鎖中に導入されており、その構造が一般式3:
で表される、(1)〜(9)のいずれかに記載の方法。
で表される、(10)記載の方法。
(13)芳香族基を有するリンカーを介して架橋形成基が少なくとも末端に導入されたオリゴヌクレオチドと、該架橋形成基と共有結合を形成しうる反応性官能基を少なくとも末端に含むオリゴヌクレオチドとが、該架橋形成基と該反応性官能基との間の共有結合で結合されてなるオリゴヌクレオチド。
(14)(12)記載の二本鎖オリゴヌクレオチド又は(13)記載のオリゴヌクレオチドが固定化された担体。
及び/又は一般式11:
B−D− (1)
(式中、Bは架橋形成基を表し、Dは少なくとも1つの芳香族基を有する二価の有機基を表し、Dはオリゴヌクレオチドの5’末端又は3’末端の、水酸基又はリン酸基の酸素と結合する)で表される。
−(CH2)m−R5−(CH2)n− (5)
で表され、R3は好ましくは一般式6:
−(CH2)t−R6−(CH2)w− (6)
で表され、R4は直接結合又は−R4’−(CH2)j−で表される。
R15は、好ましくは水酸基である。
−(CH2)a−R5 ’−(CH2)b− (7)
で表され、R12は好ましくは一般式8:
−(CH2)c−R6 ’−(CH2)d− (8)
で表され、R13は好ましくは、直接結合又は−(CH2)e−であり、R14は好ましくは、直接結合又は−(CH2)f−である。
本発明の第一実施形態の概念図を、図6のa〜dに示す。
本発明の第二実施形態の概念図を、図6のeに示す。
本発明の第三実施形態の概念図を、図6のfに示す。
(2)アミダイト化合物(Y3)の合成(図1)
(S)−1−アジド−3−(1−ナフチルメトキシ)プロパン−2−オール(化合物g)
アルゴン雰囲気下、(R)−1−O−(1−ナフチルメチル)グリセロール(化合物c)1.90g(8.18mmol)をピリジン80mlに溶解し、塩化トシル2.32g(1.5当量)を加えて室温で4時間撹拌した。反応液にエタノール10mlを加えて過剰の試薬を分解した。減圧下溶媒を留去した後、残渣を酢酸エチル300mlに溶解し、水100mlで2回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液100mlで1回、水100mlで1回、飽和食塩水100mlで1回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮後、得られたオイル状物質をアルゴン雰囲気下、ジメチルホルムアミド80mlに溶解し、アジ化ナトリウム1.60g(3当量)及び塩化アンモニウム1.75g(4当量)を加えて80℃で2時間加熱撹拌した。反応液を室温まで冷ました後、酢酸エチル300mlを加えて、水100mlで5回、飽和食塩水100mlで1回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒:酢酸エチル−ヘキサン)により精製して標記化合物(化合物g)1.30g(収率62%)を無色オイル状物質として得た。
1H NMR (270 MHz, DMSO-d6) δ: 8.11-8.06 (m, 1 H), 7.96-7.87 (m, 2 H), 7.59-7.44 (m, 4 H), 5.29 (d, 1 H, J = 5.3 Hz), 4.94 (s, 2 H), 3.83 (dddt, 1 H, J = 3.6, 5.3, 6.3, 6.4 Hz), 3.51 (dd, 1 H, J = 5.3, 9.9 Hz), 3.46 (dd, 1 H, J = 6.3, 9.9 Hz), 3.29 (dd, 1 H, J = 3.6, 12.6 Hz), 3.21 (ddd, J = 6.4, 12.6 Hz).
(S)−1−アジド−3−(1−ナフチルメトキシ)プロパン−2−オール(化合物g)1.30g(5.05mmol)をエタノール60mlに溶解し、パラジウム−炭素(10%)330mgを加えて、常圧の水素雰囲気化、室温で15時間撹拌した。パラジウム触媒をセライトろ過により除去した後、溶液を減圧下濃縮し、標記化合物(化合物h)1.17g(収率100%)を得た。当化合物は更なる精製をすることなく、後の反応に用いた。
アルゴン雰囲気下、(S)−1−アミノ−3−(1−ナフチルメトキシ)プロパン−2−オール(化合物h)900mg(3.89mmol)をメタノール50mlに溶解し、トリフルオロ酢酸エチル0.93ml(2当量)及びトリエチルアミン1.09ml(2当量)を加えて、室温で3時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒:酢酸エチル−ヘキサン)により精製して標記化合物(化合物i)860mg(収率68%)を白色固体状物質として得た。
1H NMR (270 MHz, DMSO-d6) δ: 9.34 (br t, 1 H, J = 5.7 Hz), 8.12-8.08 (m, 1 H), 7.96-7.87 (m, 2 H), 7.59-7.45 (m, 4 H), 5.12 (d, 1 H, J = 5.3 Hz), 4.94 (s, 2 H), 3.83 (dddt, 1 H, J = 4.6, 5.3, 5.6, 7.7 Hz), 3.50 (dd, 1 H, J = 5.3, 9.9 Hz), 3.45 (dd, 1 H, J = 5.6, 9.9 Hz), 3.32 (ddd, 1 H, J = 4.6, 5.7, 13.2 Hz), 3.17 (ddd, 1 H, J = 6.1, 7.7, 13.2 Hz).
アルゴン雰囲気下、(S)−3−(1−ナフチルメトキシ)−1−トリフルオロアセトアミドプロパン−2−オール(化合物i)510mg(1.56mmol)及びDMAP38mg(0.2当量)をジメチルホルムアミド20mlに溶解し、1,1−カルボニルジイミダゾール190mg(0.75当量)を加えて室温で撹拌した。2時間後、1,1−カルボニルジイミダゾール190mg(0.75当量)を追加してさらに2時間撹拌した。この反応液に6−アミノ−1−ヘキサノール550mg(3当量)を加えて室温で2時間撹拌した。反応液に酢酸エチル150mlを加えて、水50mlで4回、飽和食塩水50mlで1回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒:酢酸エチル−ヘキサン)により精製して標記化合物(化合物j)487mg(収率67%)を白色固体状物質として得た。
1H NMR (270 MHz, DMSO-d6) δ: 9.48 (br s, 1 H), 8.09-8.06 (m, 1 H), 7.96-7.88 (m, 2 H), 7.59-7.44 (m, 4 H), 7.17 (br t, 1 H, J = 5.6 Hz), 5.01 (m, 1 H), 4.97 (d, 1 H, J = 11.9 Hz), 4.91 (d, 1 H, J = 11.9 Hz), 4.33 (t, 1 H, J = 5.2 Hz), 3.68-3.57 (m, 2 H), 3.42-3.34 (m, 4 H), 2.93 (dt, 2 H, J = 5.6, 6.9 Hz), 1.42-1.33 (m, 4 H), 1.27-1.20 (m, 4H).
アルゴン雰囲気下、(S)−2−[N−(6’−ヒドロキシヘキシル)カルバモイル]オキシ−3−(1−ナフチルメトキシ)−1−トリフルオロアセトアミドプロパン(化合物j)188mg(0.40mmol)を塩化メチレン8mlに溶解し、2−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト0.15ml(1.2当量)、1H−テトラゾールのアセトニトリル溶液0.98ml(0.45M,1.1当量)を加え、室温で20分撹拌した。反応液にクロロホルム30mlを加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液10mlで1回、水10mlで1回、飽和食塩水10mlで1回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒:酢酸エチル−ヘキサン−1%トリエチルアミン)により精製して標記化合物(化合物Y3)170mg(収率63%)を白色固体状物質として得た。
31P NMR (109 MHz, DMSO-d6) δ: 147.21.
(R)−1−O−トシル−3−O−ジメトキシトリチルグリセロール(化合物k)
アルゴン雰囲気下、(S)−(+)−2,2−ジメチル−1,3−ジオキソラン−4−メタノール(化合物b)1.24ml(10.0mmol)をピリジン50mlに溶解し、塩化トシル3.81g(2.0当量)を加えて室温で17時間撹拌した。反応液に水15mlを加えて過剰の試薬を分解した。減圧下溶媒を留去した後、残渣を酢酸エチル350mlに溶解し、水100mlで1回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液100mlで1回、水100mlで1回、飽和食塩水100mlで1回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮後、得られたオイル状物質に80%酢酸水溶液70mlを加えて溶解し、室温で20時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮した後トルエンとの共沸により酢酸を除き、さらにピリジンと共沸した。アルゴン雰囲気下、この残渣をピリジン60mlに溶解し、塩化ジメトキシトリチル4.07g(1.2当量)を加え、室温で2時間撹拌した。エタノール10mlを加えて反応を止めた後、減圧下溶媒を留去した。残渣を酢酸エチル350mlに溶解し、水100mlで1回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液100mlで1回、水100mlで1回、飽和食塩水100mlで1回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒:酢酸エチル−ヘキサン)により精製して標記化合物(化合物k)4.51g(収率82%)を白色泡状物質として得た。
1H NMR (270 MHz, DMSO-d6)δ: 7.74 (m, 2 H), 7.45 (m, 2 H), 7.29-7.13 (m, 9 H), 6.88-6.84 (m, 4 H), 5.28 (d, 1 H, J = 5.6 Hz), 4.04 (dd, 1 H, J = 3.6, 9.6 Hz), 3.96 (dd, 1 H, J = 5.4, 9.6 Hz), 3.78 (m, 1 H), 3.74 (s, 6 H), 2.94 (dd, 1 H, J = 5.3, 9.2 Hz), 2.83 (dd, 1 H, J = 6.9, 9.2 Hz), 2.39 (s, 3 H).
アルゴン雰囲気下、(R)−1−O−トシル−3−O−ジメトキシトリチルグリセロール(化合物k)930mg(1.70mmol)をジメチルホルムアミド20mlに溶解し、アジ化ナトリウム440mg(4当量)及び塩化アンモニウム455mg(5当量)を加えて80℃で2時間加熱撹拌した。反応液を室温まで冷ました後、酢酸エチル150mlを加えて、水50mlで4回、飽和食塩水50mlで1回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒:酢酸エチル−ヘキサン)により精製して標記化合物(化合物l)690mg(収率96%)を黄色オイル状物質として得た。
1H NMR (270 MHz, DMSO-d6)δ: 7.41-7.18 (m, 9 H), 6.91-6.86 (m, 4 H), 5.31 (d, 1 H, J = 5.3 Hz), 3.81 (dtdd, 1 H, J = 3.6, 5.3, 6.3, 6.6 Hz), 3.73 (s, 6 H), 3.36 (dd, 1 H, J = 3.6, 12.5 Hz), 3.28 (dd, 1 H, J = 6.3, 12.5 Hz), 3.00 (dd, 1 H, J = 5.3, 9.2 Hz), 2.88 (dd, 1 H, J = 6.6, 9.2 Hz).
(R)−3−ジメトキシトリチルオキシ−1−アジドプロパン−2−オール(化合物l)620mg(1.48mmol)をエタノール20mlに溶解し、パラジウム−炭素(10%)120mgを加えて、常圧の水素雰囲気化、室温で6時間撹拌した。パラジウム触媒をセライトろ過により除去した後、溶液を減圧下濃縮し、標記化合物(化合物m)548mg(収率94%)を白色泡状物質として得た。当化合物は更なる精製をすることなく、後の反応に用いた。
1H NMR (270 MHz, DMSO-d6)δ: 7.42-7.21 (m, 9 H), 6.90-6.86 (m, 4 H), 4.71 (br s, 1 H), 3.73 (s, 6 H), 3.55 (dddd, 1 H, J = 4.0, 5.3, 6.0, 6.9 Hz), 2.94 (dd, 1 H, J = 5.3, 8.9 Hz), 2.83 (dd, 1 H, J = 6.0, 8.9 Hz), 2.68 (dd, 1 H, J = 4.0, 12.8 Hz), 2.46 (dd, 1 H, J = 6.9, 12.8 Hz).
アルゴン雰囲気下、2,6−ナフタレンジカルボン酸ジペンタフルオロフェニルエステル(化合物n)822mg(1.5mmol)及びN,N−ジイソプロピルエチルアミン0.70ml(4.0mmol)をテトラヒドロフラン70mlに溶解し、この溶液に(R)−3−ジメトキシトリチルオキシ−1−アミノプロパン−2−オール(化合物m)520mg(1.32mmol)のテトラヒドロフラン溶液(10ml)を10分かけて滴下した。室温でさらに1時間撹拌した後、溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒:酢酸エチル−ヘキサン)により精製して標記化合物(化合物o)664mg(収率67%)を白色泡状物質として得た。
1H NMR (270 MHz, DMSO-d6)δ: 9.01 (m, 1 H), 8.65 (br t, 1 H, J = 5.6 Hz), 8.51 (m, 1 H), 8.32 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 8.26 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 8.19 (dd, 1 H, J = 1.7, 8.6 Hz), 8.02 (dd, 1 H, J = 1.7, 8.6 Hz), 7.45-7.42 (m, 2 H), 7.31-7.17 (m, 7 H), 6.87-6.83 (m, 4 H), 5.12 (d, 1 H, J = 5.6 Hz), 3.94 (m, 1 H), 3.69 (s, 3 H), 3.68 (s, 3 H), 3.56 (m, 1 H), 3.29 (m, 1 H), 3.05-2.96 (m, 2 H).
アルゴン雰囲気下、6−{N−[(R)−3’−ジメトキシトリチルオキシ−2’−ヒドロキシプロピル]カルバモイル}ナフタレン−1−カルボン酸ペンタフルオロフェニルエステル(化合物o)640mg(0.84mmol)をジメチルホルムアミド20mlに溶解し、1,3−プロパンジアミン0.70ml(10当量)を加えて室温で30分撹拌した。反応液に酢酸エチル150mlを加えて水50mlで5回洗浄し、有機層を減圧下濃縮した。得られた残渣をアルゴン雰囲気下メタノール15mlに溶解し、トリフルオロ酢酸エチル0.50ml(5当量)及びトリエチルアミン0.59ml(5当量)を加えて、室温で14時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒:酢酸エチル−ヘキサン)により精製して標記化合物(化合物p)440mg(収率70%)を白色泡状物質として得た。
1H NMR (270 MHz, DMSO-d6)δ: 9.46 (br s, 1 H), 8.72 (br t, 1 H, J = 5.6 Hz), 8.55 (br t, 1 H, J = 5.6 Hz), 8.47 (m, 1 H), 8.41 (m, 1 H), 8.09-8.05 (m, 2 H), 7.99-7.91 (m, 2 H), 7.44-7.41 (m, 2 H), 7.31-7.16 (m, 7 H), 6.86-6.82 (m, 4 H), 5.10 (d, 1 H, J = 5.3 Hz), 3.93 (m, 1 H), 3.68 (s, 3 H), 3.67 (s, 3 H), 3.53 (m, 1 H), 3.41-3.23 (m, 5 H), 2.99 (m, 2 H), 1.81 (m, 2 H).
アルゴン雰囲気下、6−{N−[(R)−3’−ジメトキシトリチルオキシ−2’−ヒドロキシプロピル]カルバモイル}−2−{N−[N−(トリフルオロアセチル)−3’’−アミノプロピル]カルバモイル}ナフタレン(化合物p)298mg(0.40mmol)を塩化メチレン10mlに溶解し、2−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト0.15ml(1.2当量)、1H−テトラゾールのアセトニトリル溶液0.98ml(0.45M,1.1当量)を加え、室温で2時間撹拌した。反応液にクロロホルム30mlを加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液15mlで2回、飽和食塩水15mlで1回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒:酢酸エチル−ヘキサン−1%トリエチルアミン)により精製して標記化合物(化合物Y4)255mg(収率68%)を白色泡状物質として得た。
31P NMR (109 MHz, DMSO-d6)δ: 149.20, 148,95.
オリゴヌクレオチドの合成はApplied Biosystems394型DNA/RNAシンセサイザー上で行った。
下記の各オリゴヌクレオチドを、デオキシヌクレオシド3’−ホスホロアミダイト(日本テクノサービス社より購入)を原料として、DNA自動合成機(モデル394A;(株)パーキンエルマージャパン・アプライドバイオシステムズ事業部製)で、0.2又は1μmolスケールで合成した。
Xn−Sp25(n=1〜4):5’−Xn−TCTTCCAAGCAATTCCAATGAAAGC−3’(配列番号1)
F−ASSp16Z:5’−F−d(GAATTGCTTGGAAGATZ)−3’
F−ASSp16rG:5’−F−d(GAATTGCTTGGAAGAT)rG−3’
ASSp32:5’−d(GAATTGCTTGGAAGAGTTTCTTGCTTAAAGTC)−3’
(Fはフルオレセインを示す)
3−[2’−デオキシ−5’−O−(4,4−ジメトキシトリチル)−3’−O−スクシニル−β−D−リボフラノシル]−5−(N,N−ジ−n−ブチルホルムアミジノ)アミノ−7−(N,N−ジフェニルカルバモイル)オキシイミダゾ[4,5−b]ピリジン
アルゴン雰囲気下、3−[2’−デオキシ−5’−O−(4,4−ジメトキシトリチル)−β−D−リボフラノシル]−5−(N,N−ジ−n−ブチルホルムアミジノ)アミノ−7−(N,N−ジフェニルカルバモイル)オキシイミダゾ[4,5−b]ピリジン(Nucleic Acids Res.,vol.31,7175−7188(2003)に従って合成)220mg(0.24mmol)をピリジン4mlに溶解し、無水コハク酸72mg(3当量)及びDMAP29mg(1当量)を加えて室温で2日間撹拌した。水0.5mlを加えた後、減圧下溶媒を留去した。残渣をクロロホルム70mlに溶解し、飽和リン酸二水素カリウム水溶液25mlで2回、飽和食塩水25mlで1回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(中性シリカゲル、溶出溶媒:エタノール−クロロホルム)により精製して標記化合物219mg(収率92%)を白色泡状物質として得た。
1H NMR (270 MHz, DMSO-d6) δ: 8.44 (s, 1 H), 8.30 (s, 1 H), 6.65 (s, 1 H), 7.51-7.40 (m, 8 H), 7.31-7.26 (m, 4 H), 7.21-7.13 (m, 7 H), 6.78-6.72 (m, 4 H), 6.43 (t, 1 H, J = 6.5 Hz), 5.57 (m, 1 H), 4.11 (ddd, 1 H, J = 3.6, 4.0, 6.3 Hz), 3.67 (s, 3 H), 3.65 (s, 3 H), 3.43 (t, 2 H, J = 7.3 Hz), 3.24 (t, 2 H, J = 7.2 Hz), 3.31 (dd, 1 H, J = 6.3, 10.2 Hz), 3.16 (dd, 1 H, J = 3.6, 10.2 Hz), 2.55-2.47 (m, 6 H), 1.59-1.41 (m, 4 H), 1.28 (m, 2 H), 1.18 (m, 2 H), 0.90 (t, 3 H, J = 7.3 Hz), 0.82 (t, 3 H, J = 7.3 Hz).
アルゴン置換したガラスバイアル中、3−[2’−デオキシ−5’−O−(4,4−ジメトキシトリチル)−3’−O−スクシニル−β−D−リボフラノシル]−5−(N,N−ジ−n−ブチルホルムアミジノ)アミノ−7−(N,N−ジフェニルカルバモイル)オキシイミダゾ[4,5−b]ピリジン140mg(0.14mmol)、1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩(WSC)27mg(1当量)をジメチルホルムアミド5mlに溶解し、CPG樹脂(CPG inc)400mg(36μmol)を加え密栓して室温で5日間振盪した。CPG樹脂をジメチルホルムアミド、ピリジン及び塩化メチレンで洗浄した後、室温で1時間減圧乾燥した。アルゴン置換したガラスバイアル中、乾燥したCPG樹脂にキャッピイング溶液(0.1MのDMAPを含むピリジン:無水酢酸(9:1)溶液)5mlを加えて密栓し、室温で2時間振盪した。CPG樹脂をピリジン及び塩化メチレンで洗浄して標記化合物(収量32.5μmol/g)を得た。
1−デアザ−2’−デオキシグアノシンCPG樹脂とグアノシンCPG樹脂を用い、3’末端に1−デアザ−2’−デオキシグアノシン又はグアノシンを有するオリゴヌクレオチド(F−ASSp16Z、F−ASSp16rG)をDNA自動合成機により合成した。合成したオリゴヌクレオチドの5’末端に市販のフルオレセインのアミダイト体(グレンリサーチ社)を縮合させ、5’−フルオレセイン−3’−(1−デアザ−2’−デオキシグアノシン)オリゴヌクレオチド(F−ASSp16Z)及び5’フルオレセイン−3’−グアノシンオリゴヌクレオチド(F−ASSp16rG)をそれぞれ合成した。
Xn−Sp25(n=1〜4)、ASSp32、F−ASSp16Z、F−ASSp16rGは、逆相HPLCで分取し精製した。逆相HPLCの条件は以下の通りであった。カラムにはμ−ボンダスフィアー(C−18)カラムΦ3.9x150mm(ウォーターズ社製)を使用した。
A溶液 5%アセトニトリル/0.1MTEAA(pH7.0)
B溶液 50%アセトニトリル/0.1MTEAA(pH7.0)
溶液2
A溶液 5%アセトニトリル/0.1MTEAA(pH7.0)
B溶液 25%アセトニトリル/0.1MTEAA(pH7.0)
カラム温度:50℃
カラムA:μ−ボンダスフィアー(C−18)カラムΦ3.9x150mm(ウォーターズ社製)
カラムB:Inertsil ODS−3(C−18)カラムΦ8.0x300mm(GLScience社製)
F−ASSp16Zの脱グリコシル反応
F−ASSp16Z(1nmol)を0.5Mリン酸緩衝液(pH2;100μL)に溶解し、40℃で30分間加温した。その後NAP10カラム(ファルマシア社)により脱塩し、溶出液を集めた。逆相HPLCにより脱グリコシル化が進行したことを確認した。F−ASSp16Zの3’末端の1−デアザ−2’−デオキシグアノシンの脱グリコシル化されたオリゴヌクレオチドを以下F−ASSp16Z(H+)とする。
3’末端1−デアザ−2’−デオキシグアノシンが脱グリコシル化されたF−ASSp16Z(H+)(12pmol)を、Xn−Sp25(n=1〜3;24pmol)、0.1M HEPES緩衝溶液、5mM塩化ナトリウム、100mM NaCNBH3(水素化ホウ素シアノナトリウム)と混合し(全反応容量30μL)、37℃で加温した。反応開始後一定時間後に反応停止溶液(5μL:10M 尿素、50mM EDTA−Na2、0.05%ブロモフェノールブルー、0.05%キシレンシアノール)に反応液を一定量サンプリングして反応を停止させた。サンプリングした反応停止溶液を、8M 尿素を含む15%ポリアクリルアミドゲルによって分析した。架橋反応によって生成したオリゴヌクレオチドと、未反応のF−ASSp16Z(H+)の蛍光強度をバイオイメージングアナライザー(バイオラド社)によって測定し、架橋率を算出した。
F−ASSp16rG(12pmol)を50mM TEAA緩衝溶液(pH7)及び5〜40μMの過ヨウ素酸ナトリウムを含む反応溶液(20μL)に溶解し、37℃で加温し、F−ASSp16rGの3’末端の過ヨウ素酸酸化を行った。1時間後、Xn−Sp25(24pmol:n=1〜4)、400mM 水素化ホウ素シアノナトリウム(7.5μL)を加え、全量を30μLとし、37℃で加温し架橋反応を行った。一定時間後に2.5μLを反応液よりとり、反応停止溶液(5μL:10M 尿素、50mM EDTA−Na2、0.05%ブロモフェノールブルー、0.05%キシレンシアノール)に加え反応を停止させた。生成物の分析と架橋率の算出は、F−ASSp16Zと同様の方法で行った。
F−ASSp16rG(12pmol)を50mM TEAA緩衝溶液(pH7)及び5〜40μMの過ヨウ素酸ナトリウムを含む反応溶液(20μL)に溶解し、37℃で加温し、F−ASSp16rGの3’末端の過ヨウ素酸酸化を行った。1時間後、X4−Sp35(24pmol)、400mM 水素化ホウ素シアノナトリウム(7.5μL)を加え、全量を30μLとし、37℃で加温し架橋反応を行った。一定時間後に2.5μLを反応液よりとり、反応停止溶液(5μL:10M 尿素、50mM EDTA−Na2、0.05%ブロモフェノールブルー、0.05%キシレンシアノール)に加え反応を停止させた。生成物の分析と架橋率の算出は、F−ASSp16Zと同様の方法で行った。
3’末端1−デアザ−2’−デオキシグアノシンが脱グリコシル化されたF−Sp17Z(H+)(12pmol)とAS−Sp32(24pmol)を滅菌水(12μL)に溶解し、Xn−Sp25(n=1〜3;24pmol)、1M HEPES緩衝溶液(3μL)、100mM 塩化ナトリウム(1.5μL)、400mM 水素化ホウ素シアノナトリウム(7.5μL)と滅菌水を添加し(全反応容量30μL)、37℃で加温した。反応開始後一定時間後に反応停止溶液(5μL:10M 尿素、50mM EDTA−Na2、0.05%ブロモフェノールブルー、0.05%キシレンシアノール)に反応液を一定量サンプリングして反応を停止させた。サンプリングした反応停止溶液を、8M 尿素を含む15%ポリアクリルアミドゲルによって分析した。架橋反応によって生成したオリゴヌクレオチドと、未反応のF−Sp17Z(H+)の蛍光強度をバイオイメージングアナライザー(バイオラド社)によって測定し、架橋率を算出した。
Claims (16)
- 芳香族基を有するリンカーを介してオリゴヌクレオチドに導入された少なくとも1個の架橋形成基と、該オリゴヌクレオチドと同一又は異なるオリゴヌクレオチドに含まれる少なくとも1個の反応性官能基との間で共有結合を形成する方法。
- 芳香族基を有するリンカーを介して架橋形成基が少なくとも1個導入されたオリゴヌクレオチド1と、該オリゴヌクレオチド1にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチド1にハイブリダイズしたときに該架橋形成基と近接する位置に、該架橋形成基と共有結合を形成しうる反応性官能基を少なくとも1個含むオリゴヌクレオチド2とを反応させ、該架橋形成基と該反応性官能基との間で共有結合を形成することを含む、二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する方法。
- 架橋形成基が導入されたオリゴヌクレオチド1と、該架橋形成基と共有結合を形成しうる反応性官能基が導入されたオリゴヌクレオチド2とが、さらなる架橋で結合されている、請求項2記載の方法。
- ハイブリダイズすることによってループを形成しうるオリゴヌクレオチドであって、芳香族基を有するリンカーを介して架橋形成基が少なくとも1個導入されており、かつハイブリダイズしてループを形成したときに該架橋形成基と近接する位置に、該架橋形成基と共有結合を形成しうる反応性官能基を少なくとも1個含む該オリゴヌクレオチドにおいて、該架橋形成基と該反応性官能基との間で共有結合を形成することを含む、二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する方法。
- 芳香族基を有するリンカーを介して架橋形成基が少なくとも末端に導入されたオリゴヌクレオチド1と、該架橋形成基と共有結合を形成しうる反応性官能基を少なくとも末端に含むオリゴヌクレオチド2と、オリゴヌクレオチド1及び2にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド3とを反応させ、該架橋形成基と該反応性官能基との間で共有結合を形成することを含む、二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する方法。
- ループを形成しうるオリゴヌクレオチドであって、芳香族基を有するリンカーを介して架橋形成基が少なくとも1個導入されており、かつ該架橋形成基と共有結合を形成しうる反応性官能基を少なくとも1個含む該オリゴヌクレオチドにおいて、該架橋形成基と該反応性官能基との間で共有結合を形成することを含む、オリゴヌクレオチドの架橋方法。
- 芳香族基が置換又は無置換の1〜5環性芳香族炭化水素基である請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
- 芳香族基を有するリンカーを介して導入された架橋形成基が、オリゴヌクレオチドの末端に導入されており、その構造が一般式1:
B−D−(1)
(式中、Bは架橋形成基を表し、Dは少なくとも1つの芳香族基を有する二価の有機基を表し、Dはオリゴヌクレオチドの5’末端又は3’末端の、水酸基又はリン酸基の酸素と結合する)
で表される、請求項1〜7のいずれか1項記載の方法。 - 請求項2〜5のいずれか1項記載の方法によって形成される二本鎖オリゴヌクレオチド。
- 芳香族基を有するリンカーを介して架橋形成基が少なくとも末端に導入されたオリゴヌクレオチドと、該架橋形成基と共有結合を形成しうる反応性官能基を少なくとも末端に含むオリゴヌクレオチドとが、該架橋形成基と該反応性官能基との間の共有結合で結合されてなるオリゴヌクレオチド。
- 請求項12記載の二本鎖オリゴヌクレオチド又は請求項13記載のオリゴヌクレオチドが固定化された担体。
- 請求項1〜11のいずれか1項記載の方法を実施するためのキットであって、一般式10:
及び/又は一般式11:
- 請求項12記載の二本鎖オリゴヌクレオチドを用いて、二本鎖オリゴヌクレオチドと生体分子との相互作用を検出する方法。
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Cited By (3)
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WO2016093229A1 (ja) * | 2014-12-12 | 2016-06-16 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 核酸複合体、核酸ハイブリダイゼーションの形成方法、医薬組成物、核酸検出用プローブ及び相補鎖核酸複合体 |
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-
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Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
JPN6010035025, Nucl. Acids Res., vol. 30, pages 4918−4925 (2002) * |
JPN6010035026, J. Am. Chem. Soc., vol. 118, pages 7671−7678 (1996) * |
JPN6010035027, Tetrahedron, vol. 53, pages 10409−10432 (1997) * |
JPN6010035028, Bioorg. Med. Chem. Lett., vol. 16, pages 5118−5121 (2006) * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7491857B2 (en) | 2005-07-27 | 2009-02-17 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Oligonucleotide probe |
WO2016093229A1 (ja) * | 2014-12-12 | 2016-06-16 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 核酸複合体、核酸ハイブリダイゼーションの形成方法、医薬組成物、核酸検出用プローブ及び相補鎖核酸複合体 |
JPWO2016093229A1 (ja) * | 2014-12-12 | 2017-09-07 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | ハイブリダイゼーション安定化用核酸複合体、核酸ハイブリダイゼーションの安定化方法、医薬組成物、核酸検出用プローブ、アンチセンス核酸医薬品、microRNA抑制剤及び核酸複合体 |
US12012432B2 (en) | 2014-12-12 | 2024-06-18 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Nucleic acid complex, method for forming nucleic acid hybridization, pharmaceutical composition, nucleic acid probe, and complementary-strand nucleic acid complex |
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