JP5201639B2 - Rna選択的ハイブリダイズ試薬及びその利用 - Google Patents
Rna選択的ハイブリダイズ試薬及びその利用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5201639B2 JP5201639B2 JP2010502852A JP2010502852A JP5201639B2 JP 5201639 B2 JP5201639 B2 JP 5201639B2 JP 2010502852 A JP2010502852 A JP 2010502852A JP 2010502852 A JP2010502852 A JP 2010502852A JP 5201639 B2 JP5201639 B2 JP 5201639B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- probe
- rna
- formula
- dna
- group
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 title claims description 26
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 101
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 55
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 26
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 23
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 18
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 claims description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 12
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 claims description 11
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 9
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 7
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 claims description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 67
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 59
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 55
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 23
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical group C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 16
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 15
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 13
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 13
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 13
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 13
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical class [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 12
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 11
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 10
- -1 oxygen ion Chemical class 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 9
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 9
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 9
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 9
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 8
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 8
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 8
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 7
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 6
- 150000004713 phosphodiesters Chemical group 0.000 description 6
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 5
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 5
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 5
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical group 0.000 description 5
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- WYROLENTHWJFLR-ACLDMZEESA-N queuine Chemical compound C1=2C(=O)NC(N)=NC=2NC=C1CN[C@H]1C=C[C@H](O)[C@@H]1O WYROLENTHWJFLR-ACLDMZEESA-N 0.000 description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 4
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 4
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 4
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 4
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- SXADIBFZNXBEGI-UHFFFAOYSA-N phosphoramidous acid Chemical group NP(O)O SXADIBFZNXBEGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 238000007142 ring opening reaction Methods 0.000 description 4
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010047230 Member 1 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 3
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- PASDCCFISLVPSO-UHFFFAOYSA-N benzoyl chloride Chemical compound ClC(=O)C1=CC=CC=C1 PASDCCFISLVPSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940125898 compound 5 Drugs 0.000 description 3
- LBJNMUFDOHXDFG-UHFFFAOYSA-N copper;hydrate Chemical compound O.[Cu].[Cu] LBJNMUFDOHXDFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 3
- ZIEWSZYVEDTXGH-UHFFFAOYSA-N pyrimidine-4-carbonitrile Chemical compound N#CC1=CC=NC=N1 ZIEWSZYVEDTXGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 3
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 125000001981 tert-butyldimethylsilyl group Chemical group [H]C([H])([H])[Si]([H])(C([H])([H])[H])[*]C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium fluoride Chemical compound [F-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- YYROPELSRYBVMQ-UHFFFAOYSA-N 4-toluenesulfonyl chloride Chemical compound CC1=CC=C(S(Cl)(=O)=O)C=C1 YYROPELSRYBVMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100033350 ATP-dependent translocase ABCB1 Human genes 0.000 description 2
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 2
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940122498 Gene expression inhibitor Drugs 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- CUONGYYJJVDODC-UHFFFAOYSA-N malononitrile Chemical compound N#CCC#N CUONGYYJJVDODC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical class O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- AWGLIOYLSPKGDR-UHFFFAOYSA-N (2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)methanol (2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)methyl 4-methylbenzenesulfonate Chemical compound CC1(OCC(O1)CO)C.CC1(OCC(O1)COS(=O)(=O)C1=CC=C(C)C=C1)C AWGLIOYLSPKGDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRKDUHUULIWXFT-UHFFFAOYSA-N (2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)methyl 4-methylbenzenesulfonate Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)OCC1OC(C)(C)OC1 SRKDUHUULIWXFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GVNVAWHJIKLAGL-UHFFFAOYSA-N 2-(cyclohexen-1-yl)cyclohexan-1-one Chemical compound O=C1CCCCC1C1=CCCCC1 GVNVAWHJIKLAGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRCSGZTZZWQAED-UHFFFAOYSA-N 2-butyl-7h-purin-6-amine Chemical compound CCCCC1=NC(N)=C2N=CNC2=N1 DRCSGZTZZWQAED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical group OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- USCCECGPGBGFOM-UHFFFAOYSA-N 2-propyl-7h-purin-6-amine Chemical compound CCCC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 USCCECGPGBGFOM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002103 4,4'-dimethoxytriphenylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)(C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H])C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150065749 Churc1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical class C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 102100038239 Protein Churchill Human genes 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 150000003838 adenosines Chemical class 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- MXOSTENCGSDMRE-UHFFFAOYSA-N butyl-chloro-dimethylsilane Chemical compound CCCC[Si](C)(C)Cl MXOSTENCGSDMRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 229940125773 compound 10 Drugs 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000006837 decompression Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- QWPPOHNGKGFGJK-UHFFFAOYSA-N hypochlorous acid Chemical compound ClO QWPPOHNGKGFGJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- ZLVXBBHTMQJRSX-VMGNSXQWSA-N jdtic Chemical compound C1([C@]2(C)CCN(C[C@@H]2C)C[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]2NCC3=CC(O)=CC=C3C2)=CC=CC(O)=C1 ZLVXBBHTMQJRSX-VMGNSXQWSA-N 0.000 description 1
- 125000005524 levulinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000028161 membrane depolarization Effects 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000324 molecular mechanic Methods 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004123 n-propyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 125000005328 phosphinyl group Chemical group [PH2](=O)* 0.000 description 1
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- JWVCLYRUEFBMGU-UHFFFAOYSA-N quinazoline Chemical compound N1=CN=CC2=CC=CC=C21 JWVCLYRUEFBMGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000020095 red wine Nutrition 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 125000003808 silyl group Chemical group [H][Si]([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 125000005415 substituted alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- HOGVTUZUJGHKPL-HTVVRFAVSA-N triciribine Chemical class C=12C3=NC=NC=1N(C)N=C(N)C2=CN3[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O HOGVTUZUJGHKPL-HTVVRFAVSA-N 0.000 description 1
- GKASDNZWUGIAMG-UHFFFAOYSA-N triethyl orthoformate Chemical compound CCOC(OCC)OCC GKASDNZWUGIAMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004044 trifluoroacetyl group Chemical group FC(C(=O)*)(F)F 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
- C07D487/12—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains three hetero rings
- C07D487/14—Ortho-condensed systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/16—Purine radicals
- C07H19/173—Purine radicals with 2-deoxyribosyl as the saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
Description
(ただし、式(1)及び式(2)中、Zは、炭素原子又は窒素原子を表し、R1は、水素原子又は水酸基保護基を表し、R2は、水素原子又はホスホジエステル基を表す。)
(ただし、式(3)及び式(4)中、Zは、炭素原子又は窒素原子を表し、W1は水素原子又は水酸基保護基を表し、W2は、水酸基保護基、ホスホルアミダイト基又は固相担体に結合される若しくは結合された連結基を表し、R3は、水素原子又はアミノ保護基を表す。)
(ただし、式(5)及び式(6)中、Zは、炭素原子又は窒素原子を表し、X1は、O、S又はSeを表し、X2は、SH(若しくはS−)、S又はSe−、炭素数1〜4個のアルキル基又はモルホリノ基を表す。)
本発明は、以下の式(1)及び式(2)のいずれかで表される新規なヌクレオシド誘導体及びその利用に関する。
(ただし、式(1)及び式(2)中、Zは、炭素原子又は窒素原子を表し、R1は、水素原子又は水酸基保護基を表し、R2は、水素原子又はホスホジエステル基を表す。)
本発明のヌクレオシド誘導体は、式(1)又は式(2)で表される化合物である。これらの化合物において、Zは、炭素原子(CH)又は窒素原子を表している。
オリゴヌクレオチド合成に適したヌクレオシド誘導体としては、以下の式(3)及び式(4)で表される化合物が挙げられる。なお、式(3)及び式(4)におけるZ及びA環は、式(1)及び式(2)におけるZと同義である。
本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の式(5)及び式(6)のいずれかで表される、1種又は2種以上のヌクレオチド誘導体単位を備えることができる。式(5)及び式(6)中のZは、式(1)等におけるZと同義であり、A環についても、式(1)等におけるA環と同義である。
本発明のオリゴヌクレオチドが含むヌクレオチド誘導体単位は、それ自体蛍光を発するため、これを利用したRNA上の変異を検出するためのプローブセットが提供される。このプローブセットは、本発明のヌクレオチド誘導体単位を有する第1のプローブと本発明のヌクレオチド誘導体単位を有しない第2のプローブとから構成できる。第1のプローブは、前記変異部位に対応する位置に本発明のヌクレオチド誘導体単位を備えるようにする。また、このようなヌクレオチド誘導体単位をプローブの3’末端又は5’末端に有するようにする。例えば、図9に示すように、第1のプローブをターゲット鎖(図9に示す例ではRNA)の3’側にハイブリダイズさせる場合には、3’末端に本発明のヌクレオチド誘導体単位を有するようにする。なお、ヌクレオチド誘導体単位は、検出しようとする変異部位において存在可能性のある塩基に対応する(相補する)塩基アナログを有するものであってもよいし、そうでなくともよい。第1のプローブは、1種類であってもよいし2種類以上であってもよい。検出しようとする変異部位に対応する位置に備える本発明のヌクレオチド誘導体単位の種類に応じて第1のプローブの種類(数)が決定される。
Reagents and conditions: (1)Malononitrile, 2-propanol, 90℃, 78 %. (2) p-toluenesulfonilchloride, DMAP, CH2Cl,rt, 83 %. (3) K2CO3, DMF, 60 ℃,51 %. (4)(i)triethyl ortho-formate, 100℃,(ii) NH3 / MeOH, 110℃, 65 %. (5) 80% CH3COOH, 60℃. (6) TBDMS, Imidazole, DMF, 78 %. (7) Benzoyl chloride, pyridine, 87%. (8)TBAF, THF, 77%. (9) 4-4’-Dimethoxytrityl chloride, pyridine, 44 %. (10) i-Pr2NP(Cl)OCE, Huning Base , CH2Cl2, rt, 47%.
Purine 1.0 g (8.3 mmol) を2-propanol 60 mL に溶解し、Malononitrile 2.6 g (39 mmol,4.7 eq) を加え、アルゴン雰囲気下、オイルバスで90℃を保ちながら撹拌する。(黄色透明)99時間撹拌後、原料の消失をTLCで確認し、室温に冷やす。(赤ワイン色)室温に冷やした後、溶液内に結晶物が現れるので、その結晶を氷水で冷却した2-propanolで洗い流しながら吸引ろ過し、結晶物 (1) を得た(光緑色)。得られた結晶を一晩真空ポンプで乾燥し、NMR測定をした(収量 1.5 g, 9.75 mmol, 収率58 %)。
Dimethyl-1,3-dioxolane-4-methanol 1.3 g,1.2 ml (10 mmol) に、1時間乾燥させた 4-Dimethyl amino pyridine 3.7g (3.0 mmol,3.0 eq) を加え、CH2Cl2 100 mL で溶解する。その後、p-Toluenesulfonyl chloride 2.3 g (12 mmol,1.2 eq) を加えた後、初めの30分間冷水に着けながら室温、アルゴン雰囲気下で撹拌する (無色透明)。18時間撹拌後、TLCで原料の消失を確認し、分液ロート(有機溶媒:CDCl3)で分液し油層を無水硫酸Naで脱水する。1時間後、綿栓ろ過し、エバポレーターで濃縮したものをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CHCl3→CHCl3:MeOH=100〜10:1)で目的物を単離し、オイリーな液体 (2) を得た(淡黄色透明〜無色透明)。得た液体を一晩乾燥し、NMR測定をした。(収量 1.85 g, 8.3 mmol, 収率83 %)
5-Aminoimdazo[4,5-b]pyrimidine-6-carbonitrile 0.7 g (4.4 mmol) にK2CO3 0.73 g(5.3 mmol,1.2 eq) を加え、さらに1時間乾燥する。乾燥した後、2,2-Dimethyl-4-(p-toluene -sulfonyloxymethyl)-1,3-dioxolane 1.17 g (5.3 mmol,1.2 eq) をDMF 40 mlに溶解し、その溶液を先ほどの5-Aminoimdazo[4,5-b]pyrimidine-6-carbonitrileとK2CO3のフラスコに加え、アルゴン雰囲気下、オイルバスで60℃に保ちながら撹拌する。(淡赤色)
70時間撹拌後、原料の消失を確認し、分液ロート(有機溶媒:酢エチ)で分液し、油層を無水硫酸Naで脱水する。1時間後、綿栓ろ過し、エバポレーターで濃縮したものをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CHCl3→CHCl3:MeOH=100:1)で目的物を単離し、白色固体(3) を得た(収量 0.25 g, 0.92 mmol, 収率21 %)。
3.69-3.73(2H,q,9-6’-CH2)、4.08-4.12(2H,q,9-6’-CH2)、4.16-4.21(2H,q,9-1’-CH2)、4.29-4.34(2H,q,9-1’-CH2)、4.43-4.49(1H,m,9-2’-CH)、5.11(2H,s,2-NH2)、7.97(1H,s,6-CH)、
8.07(1H,s,8-CH)
HRMS (FAB) calcd for C13H15N5O2 ( MH+ ) ; 273.12258, found ; 273.12291
13-(4’-4’-dimethyl-3’,5’-dioxolane-methyl)-6-aminoimidazo quinazoline 0.27 g (1.0 mmol)に、triethyl orthofomate 8mL を加え、オイルバスで100℃を保ちながら撹拌する(無色透明)。
52h撹拌後、TLCで原料の消失を確認しようとしたところ物質が壊れ始めていたので、ただちに撹拌を止め、エバポレーターで溶媒を減圧除去し濃縮した(濃黄色)。濃縮物をNH3/MeOH に溶解し、100mLのスチール容器に移し、オイルバスで110℃を保ちながら撹拌する。121h撹拌後、TLCで原料の消失を確認し、水流エバポレーターで濃縮する。濃縮したものを(CHCl3:MeOH=5:1)に溶解しシリカを加え、エバポレーターで濃縮することにより物質をシリカに吸着させる。吸着後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(CHCl3:MeOH=15:1→10:1)で目的物を単離し、濃黄色の固体 (4) を得た。得た固体を一晩乾燥し、NMR測定をした(収量 0.15 g, 0.499 mmol, 収率65.0 %)。
(2H,q,12-1’-CH2)、4.36-4.49(2H,q,12-6’-CH2)、4.55-4.58(1H,m,12-2’-CH)、
7.98(2H,s,2-NH2)、8.47(1H,s,2-CH)、8.63(1H,s,7-CH)、9.03(1H,s,11-CH)
13-(2’-4’-hydoroxi)-6-aminoimidazo-quinazoline 0.3 g(1.0 mmol) に、80%希釈酢酸を5mL加え、オイルバスで60℃を保ちながら撹拌する。
撹拌開始9h後、TLCで反応の進行を確認した後、水流エバポレーターで酢酸を減圧除去することで、黄色の固体(5) を得た。得た固体を一晩乾燥し、NMR測定をした。
(2H,s,13-1’-CH2)、4.11-4.17(2H,q,13-1’-CH2)、4.45-4.50(2H,q,12-3’-CH2)、
4.88(2H,t,12-3’-CH2)、5.13-5.15(1H,s,13-2’-CH)、7.97(2H,s,6-NH2) 、8.47(1H,s,2-CH)、8.59 (1H,s,7-CH)、9.01(1H,s,12-CH)
Elemental Anal. Calcd for C11H12N6O2・1/5 H2O: C, 50.29; H, 4.74; N, 30.87.
Found: C, 50.37; H, 4.87; N, 30.89.
13-(2’-1’’,4’-tert-butyldimethyl-silane)-6-aminoimidazo-quinazoline 260 mg (1.0 mmol)に、DMF 10 ml、imidazole 544 mg(8.0 mmol,8.0 eq)、tert-butyldimethyl-chlorosilane 600 mg(4.0 mmol,4.0 eq)を加え、アルゴン雰囲気下、室温で撹拌する(濃黄色透明)。撹拌開始18h後、TLCで目的物の消失を確認し、分液ロート(有機溶媒:酢酸エチル)で分液(NaHCO3×3→飽和食塩水×1)した後、無水Na2SO4で1h脱水した。脱水した後、エバポレーターで濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒: CHCl3:MeOH=20:1〜10:1)で目的物を単離し、エバポレーターで溶媒を減圧除去することで白色の固体 (6) を得た。得た固体一晩真空ポンプで乾燥し、NMR測定をした(収量 380 mg, 0.78 mmol, 収率 77.7 %)。
-0.01(6H,s,13-2’-2’’,3’-2’’-2CH3)、0.57(9H,s,13-3’-3’’-3CH3)、0.82(9H,s,13-2’-3’ ’-3CH3)、
3.57(2H,s,13-1’-CH2)、3.58(2H,q,13-1’-CH2)、4.16(2H,q,12-3’-CH2)、4.19(2H,t,12-3’-CH2)
、4.38-4.40(1H,w,13-2’-CH)、7.92(2H,s,6-NH2) 、8.39(1H,s,2-CH)、8.50 (1H,s,7-CH)
8.93(1H,s,12-CH)
HRMS (FAB) calcd for C23H40N6O2Si2 ( MH+ ) ; 488.27514, found ; 488.27596
13-(2’-1’’,4’-tert-butyldimethyl-silane)-6-aminoimidazo[1’-benzoyl]-quinazoline 530 mg
(1.1 mmol) に、pyridine 20 ml、benzoyl chloride 0.11ml,0.15 mg (1.1 mmol,1.0 eq) 、を加え、アルゴン雰囲気下、室温で撹拌する(黄緑色透明)。
撹拌開始2h後、TLCの結果より、benzoyl chlorideが足りない傾向があったので0.11 ml,0.15 mg (1.1 mmol,1.0 eq) 追加した。撹拌開始7h後、TLCで目的物の消失を確認し、分液ロート(有機溶媒:CHCl3)で分液(NaHCO3×2→飽和食塩水×1)した後、無水Na2SO4で1h脱水した。脱水した後、エバポレーターで濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒:CHCl3→CHCl3:MeOH=10:1) で目的物を単離し、エバポレーターで溶媒を減圧除去することで淡緑色の固体 (7) を得た。得た固体を一晩真空ポンプで乾燥し、NMR測定をした(収量 557 mg, 0.94 mmol, 収率87.0 %)。
0.09(6H,s,13-2’-2’’,3’-2’’-2CH3)、0.79(9H,s,13-3’-3’’-3CH3)、0.93(9H,s,13-2’-3’ ’-3CH3)、
3.60-3.64(2H,s,13-1’-CH2)、3.71-3.74(2H,q,13-1’-CH2)、4.24-4.25(2H,q,12-3’-CH2)、4.67-4.72(2H,t,12-3’-CH2)、4.38-4.40(1H,w,13-2’-CH) 、8.39-8.49(3H,q,6-1’-C6H5)、
7.51(1H,s,2-CH)、7.55 (1H,s,7-CH)、7.60(1H,s,12-CH)、9.60(1H,s,6-NH)
13-(2’-4’-hydoroxi)- 6-aminoimidazo[1’-benzoyl]-quinazoline 557 mg (0.94 mmol) にTHF 20 ml、tetrabutylammonium fluoride,1.0M solution in tetrahydro furan 3.4 g, 3.76 ml (3.76 mmol,4.0 eq) 、を加え、アルゴン雰囲気下、室温で撹拌する(黄緑色透明)。撹拌開始2h後、TLCで目的物の消失を確認し、エバポレーターで濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒:CHCl3:MeOH=20:1〜7:1)で目的物を単離し、エバポレーターで溶媒を減圧除去することで淡緑色の固体 (8) を得た。得た固体を一晩真空ポンプで乾燥し、NMR測定をした(収量 265 mg, 0.73 mmol, 収率77.3 %)。
(2H,s,13-1’-CH2)、4.21-4.27(2H,q,13-1’-CH2)、4.60-4.69(2H,q,12-3’-CH2)、4.85-4.90
(2H,t,12-3’-CH2)、5.20-5.25(1H,s,13-2’-CH)、7.60-7.79(3H,q,6-1’-C6H5)、8.12(1H,s,2-CH)、8.60 (1H,s,7-CH)、8.79(1H,s,12-CH)、9.42(1H,s,6-NH)
13-(2’-4’-hydoroxi)-6-aminoimidazo[1’-benzoyl]-quinazoline 260 mg (0.71 mmol) に、4-4’-Dimethoxytrithyl chloride 240 mg (0.71 mmol,1.0 eq)、pyridine 20 mLを加え、アルゴン雰囲気下、室温で撹拌する。撹拌開始2時間後、TLCの結果より4-4’-Dimethoxytrithyl chlorideが足りない傾向があったので、240 mg (0.71 mmol,1.0 eq)追加した。撹拌開始7時間後、TLCよりこれ以上反応が進まない感じであったので、分液ロート(有機溶媒:CHCl3)で分液(飽和NaHCO3×2→飽和食塩水×1)した後、無水硫酸ナトリウムで1h脱水した。脱水後、エバポレーターで濃縮し、中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒:CHCl3〜CHCl3:MeOH=50:1)で目的物を単離し、エバポレーターで溶媒を減圧除去することで淡黄色の化合物 (9) を固体で得た(収量210 mg,0.314 mmol, 収率44.0 %)。
(2H,s,13-1’-CH2)、4.21-4.27(2H,q,13-1’-CH2)、4.60-4.69(2H,q,12-3’-CH2)、4.85-4.90
(2H,t,12-3’-CH2)、5.20-5.25(1H,s,13-2’-CH)、7.60-7.79(3H,q,6-1’-C6H5)、8.12(1H,s,2-CH)、8.60 (1H,s,7-CH)、8.79(1H,s,12-CH)、9.42(1H,s,6-NH)
-imidazo[1’-benzoyl]-quinazolineの合成
13- [2’-hydoroxi-4’-(4,4’-dimethoxytrityl)] - 6-aminoimidazo[1’-benzoyl]-quinazoline 135
(0.20 mmol)をCH2Cl2 2 mlで溶解した後、Huning Base 68μl(0.40 mmol, 2.0 eq)、i-Pr2NP(Cl)OCE 67μl(0.30 mmol, 1.5 eq)を加え、アルゴン雰囲気下、室温で撹拌した。30分後、TLCで反応の進行を確認した後、撹拌を停止した。その後、分液ロート(有機溶媒:CHCl3)で分液(飽和NaHCO3×2→飽和食塩水×1)した後、無水硫酸ナトリウムで数分脱水処理した。脱水後、エバポレーターで濃縮し、中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒:酢エチ)で目的物を単離し、エバポレーターで溶媒を減圧除去することで淡黄色の化合物 (9) を固体で得た。また、乾燥後、31P NMRにて目的のピーク(149.1, 150.2 ppm)を確認した(収量122.1 mg, 0.314 mmol, 収率47.0 %)。
F-2 5’- d (TTC TGA CTA X ATT TCA GAA) -3’ (19 mer)
F-3 5’- d (AAG GAA AX GAG GAA AGA) -3’ (17 mer)
F-4 5’- d (AAG GAA XX GAG GAA AGA) -3’ (17 mer)
本実施例では、F-3, F-4とそれぞれ相補的なDNA及びRNAとの二重鎖の熱安定性をTm値で評価した。なお、Tm測定におけるそれぞれの鎖の濃度は3μMになるように、測定用緩衝液( 10mM NaPhosphate ( pH7.0 ) - 100mM NaCl ) 200μLに溶解させ、95℃で3分間アニーリングした後、1時間放置し常温に戻し、15分間の脱気を行った。そのサンプルの内150μLを専用セルに入れ測定した。F-3, F-4及び相補DNA, RNAの配列は以下の表に記す。
本実施例では、F-1とそれぞれ相補的なRNAとの二重鎖の熱安定性をTm値で評価した。F-1のTm測定におけるそれぞれの鎖の濃度は3μMになるように、測定用緩衝液( 10mM NaPhosphate ( pH7.0 ) - 100mM NaCl ) 200μLに溶解させ、95℃で3分間アニーリングした後、1時間放置し常温に戻し、15分間の脱気を行った。
本実施例では、実施例1で合成した化合物5を用いて、3環性アナログ体の蛍光特性を評価した。化合物5を1mg量りとりDMSO 500μlに溶解した。十分に溶解した後、10μlを新たなエッペンドルチューブに移し、蒸留水を990μl加えた。その後、蛍光分光装置(日立−F4500)にて蛍光測定を行った。励起、蛍光波長を図13に示す。また、化合物( 5 )を1 mg量り取り、DMSO 500μlに十分に溶解した後、10μlづつを新たなエッペンドルチューブ3本にそれぞれ移し、H2O(蒸留水)、dry MeOH、dry CHCl3それぞれを990μlづつ加えて、3種類のサンプルを作成した。それぞれのサンプルを蛍光セル容器に移し、蛍光分光装置 (日立−F4500)にて蛍光測定を行った。励起光(λex=338 nm)を照射したときのそれぞれの蛍光波長と蛍光強度のグラフを図14に示す。
本実施例では、3環アナログの結合したCPG unit (11)を作製した。すなわち、化合物 (9) 143 mg (0.21 mmol) をpyridine (2 mL) に溶解させ、DMAP 0.5 μg (4.2μmol,0.02 eq)、無水コハク酸63 mg (0.63 mmol, 3.0 eq) を加え、Ar雰囲気下、室温で撹拌した。110時間後、TLCでこれ以上反応が進行しないことを確認し、酢酸エチルで希釈し、水 (×2),NaHCO3 (×1),飽和NaCl水溶液 (×1)で抽出・洗浄を行い、酢酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した。そこから、DMF (4mL) に溶解させ、CPG 0.62 g (0.047 mmol, 1.0 eq) を反応液になじませ、WSC 36 mg (0.188 mmol,4 eq) を加えた。室温で2日間、振とうし、その後、pyridineで洗浄、乾燥させた後に、無水酢酸 1.5 mL, pyridine 13.5 mL, DMAP 0.183 g [0.1 M DMAP in pyridine:Ac2O (9:1) ] を加え、室温で15時間振とうさせた。洗浄液を、Pyridine、MeOH及びアセトンの順に替えて洗浄し乾燥させた。この結果、31.2 μmol / gの活性で生成物を得た。なお、活性は、乾燥したCPG樹脂6 mgをガラスフィルターにのせ、HClO4:EtOH=3:2の溶液を流し込み、その濾液のUV 498 nmの波長 (DMTr基の波長) の吸光度を求め、以下の式に代入することにより算出した。
本実施例では、DNA合成機を用いて、合成したCPG unite (11)(蛍光性アナログQ)請求項を用いて下記塩基配列のX部分(3’末端)に導入した1種類のオリゴヌクレオチド(FK-1)を合成、精製した。また、以下のターゲット配列からなるRNA及びDNA(ウラシルに替えてチミンを塩基とする)を合成、精製した。また、FK-2配列の5’末端のNに、dA, dT, dG, dCそれぞれが組み込まれた4種類のオリゴヌクレオチドも合成、精製した。なお、本実施例で用いる以下のターゲット配列(RNA)は、薬物トランスポーターMDR1(P糖タンパク質)の遺伝子多型の一つである2677G/A/Tを含んでいる(2677位がYに相当している。)
- ACC - UUC - UAG - UUC - UUU) -3’ (31 mer)
FK-1:5’- d (AAA - GAA - CTA - GAA - GGT - Q) -3’ (16 mer)
FK-2:5’- d (Y- CTG - GGA - AGG - TGA - GTC) -3’ (16 mer)
実施例6で合成したFK-1、FK-2(Y:dA、dT、dG、dCの4種類)、及びターゲットRNA鎖(X:rU)の3種のオリゴヌクレオチドをそれぞれの鎖の濃度が3μMになるように、測定用緩衝液( 10mM NaPhosphate ( pH7.0 ) - 100mM NaCl ) 1 mLに溶解させ、95℃で3分間アニーリングした後、1時間放置し常温に戻し、15分間の脱気を行った。計4種類のハイブリダイゼーションサンプルに加えて、FK1-単独のサンプルを蛍光セル容器に移し、蛍光分光装置 (日立−F4500)にて蛍光測定を行った。励起光(λex=338 nm)を照射したときのそれぞれの蛍光波長と蛍光強度のグラフを図15に示す。
実施例6で合成したFK-1、FK-2(Y:dA、dT、dCの3種類)、及びターゲットRNA鎖(X:rU、rG、rA)を所定の組み合わせで、3種のオリゴヌクレオチドをそれぞれの鎖の濃度が3μMになるように、測定用緩衝液( 10mM NaPhosphate ( pH7.0 ) - 100mM NaCl ) 1 mLに溶解させ、95℃で3分間アニーリングした後、1時間放置し常温に戻し、15分間の脱気を行った。計4種類のハイブリダイゼーションサンプルに加えて、FK1-単独のサンプルを蛍光セル容器に移し、蛍光分光装置 (日立−F4500)にて蛍光測定を行った。励起光(λex=338 nm)を照射したときのそれぞれの蛍光波長と蛍光強度のグラフを図16に示す。
Claims (6)
- 以下の式(5)及び式(6)のいずれかで表される、1種又は2種以上のヌクレオチド誘導体単位を備える、RNAハイブリダイズ試薬。
- 前記ヌクレオチド誘導体単位は、式(5)で表され、前記Zは窒素原子ある、請求項1に記載のRNAハイブリダイズ試薬。
- 前記ヌクレオチド誘導体単位を末端に備える、請求項1又は2に記載のハイブリダイズ試薬。
- ステム−ループ構造を形成可能な塩基配列を有し、前記ループに前記ヌクレオチド誘導体単位を備える、請求項1〜3のいずれか一項に記載のハイブリダイズ試薬。
- RNA上の変異を検出するためのプローブセットであって、
以下の式(5)及び式(6)のいずれかで表される1種又は2種以上のヌクレオチド誘導体単位を前記変異部位に相当する5’末端又は3’末端に備える第1のプローブと、
前記変異部位において存在可能性のある塩基に相補的な塩基を有するデオキシヌクレオチドを前記変異部位に相当する3’末端又は5’末端に備える1種又は2種以上の第2のプローブと、
を含むプローブセット。
- 一塩基多型の検出方法であって、
以下のプローブセット:
以下の式(5)及び式(6)のいずれかで表されるヌクレオチド誘導体単位を前記一塩基多型部位に相当する5’末端又は3’末端に備える第1のプローブと、前記一塩基多型部位において存在可能性のある塩基に相補的な塩基を有するデオキシヌクレオチドを前記一塩基多型部位に相当する3’末端又は5’末端に備える1種又は2種以上の第2のプローブと、を含むプローブセット、
から選択される1種の前記第1のプローブと1種の前記第2のプローブとを組み合わせて得られる1種又は2種以上の組み合わせで前記第1のプローブ及び前記第2のプローブと、前記一塩基多型を含む可能性のある遺伝子発現産物としてのRNA試料と、をハイブリダイゼーション可能に接触させる工程と、
前記RNA試料と前記第1のプローブと前記第2のプローブとのハイブリダイズ産物の前記第1のプローブに基づく蛍光シグナルを検出する工程と、
を備える、検出方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010502852A JP5201639B2 (ja) | 2008-03-11 | 2009-03-11 | Rna選択的ハイブリダイズ試薬及びその利用 |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008061751 | 2008-03-11 | ||
JP2008061751 | 2008-03-11 | ||
PCT/JP2009/054675 WO2009113580A1 (ja) | 2008-03-11 | 2009-03-11 | Rna選択的ハイブリダイズ試薬及びその利用 |
JP2010502852A JP5201639B2 (ja) | 2008-03-11 | 2009-03-11 | Rna選択的ハイブリダイズ試薬及びその利用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2009113580A1 JPWO2009113580A1 (ja) | 2011-07-21 |
JP5201639B2 true JP5201639B2 (ja) | 2013-06-05 |
Family
ID=41065241
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010502852A Active JP5201639B2 (ja) | 2008-03-11 | 2009-03-11 | Rna選択的ハイブリダイズ試薬及びその利用 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8609826B2 (ja) |
EP (1) | EP2270015B1 (ja) |
JP (1) | JP5201639B2 (ja) |
CN (1) | CN101970443B (ja) |
CA (1) | CA2722479C (ja) |
WO (1) | WO2009113580A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012105644A (ja) * | 2010-10-28 | 2012-06-07 | Arkray Inc | 多型検出用プローブ、多型検出方法、薬効評価方法、および多型検出用キット |
WO2012074012A1 (ja) | 2010-11-30 | 2012-06-07 | 独立行政法人科学技術振興機構 | ヌクレオシド類縁体又はその塩、オリゴヌクレオチド類縁体、遺伝子発現抑制剤、及び遺伝子検出用核酸プローブ |
AU2012339711B2 (en) | 2011-11-14 | 2014-10-16 | Brigham Young University | Two- chamber dual-pore device |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7629447B2 (en) | 2006-09-12 | 2009-12-08 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Dideoxynucleoside derivatives |
-
2009
- 2009-03-11 WO PCT/JP2009/054675 patent/WO2009113580A1/ja active Application Filing
- 2009-03-11 CA CA2722479A patent/CA2722479C/en active Active
- 2009-03-11 EP EP09719898.0A patent/EP2270015B1/en active Active
- 2009-03-11 CN CN200980108476.4A patent/CN101970443B/zh active Active
- 2009-03-11 JP JP2010502852A patent/JP5201639B2/ja active Active
- 2009-03-11 US US12/921,909 patent/US8609826B2/en active Active
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
JPN6012059156; Collection of Czechoslovak Chemical Communications Vol.53, No.8, 1988, pp.1779-1794 * |
JPN6012059157; Journal of Organic Chemistry Vol.70, No.2, 2005, pp.639-647 * |
JPN6012059158; Journal of the American Chemical Society Vol.126, No.4, 2004, pp.1102-1109 * |
JPN6012059159; Science (Washington DC, United States) Vol.302, No.5646, 2003, pp.868-871 * |
JPN6012059163; Synlett No.9, 2002, pp.1483-1486 * |
JPN6012059165; Journal of American Chemical Society Vol.127, No.12, 2005, pp.4174-4175 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20110033863A1 (en) | 2011-02-10 |
CN101970443A (zh) | 2011-02-09 |
JPWO2009113580A1 (ja) | 2011-07-21 |
WO2009113580A1 (ja) | 2009-09-17 |
CN101970443B (zh) | 2014-03-12 |
US8609826B2 (en) | 2013-12-17 |
EP2270015A1 (en) | 2011-01-05 |
CA2722479C (en) | 2017-01-03 |
EP2270015B1 (en) | 2013-07-10 |
EP2270015A4 (en) | 2012-03-21 |
CA2722479A1 (en) | 2009-09-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CA2574088C (en) | Oligonucleotides comprising a modified or non-natural nucleobase | |
US7144995B2 (en) | Fluorescent nitrogenous base and nucleosides incorporating same | |
RU2708237C2 (ru) | Модифицированные олигонуклеотиды и способ их получения | |
EP2370451B1 (en) | Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids | |
US6143877A (en) | Oligonucleotides including pyrazolo[3,4-D]pyrimidine bases, bound in double stranded nucleic acids | |
JP5493117B2 (ja) | オリゴヌクレオチド誘導体及びその利用 | |
US20080038745A1 (en) | Nucleotide analogs with six-membered rings | |
US7582739B2 (en) | Negatively charged minor groove binders | |
CN110678447B (zh) | 经修饰的核酸单体化合物及寡核酸类似物 | |
JP4202646B2 (ja) | 2−アザプリン化合物及びその使用 | |
JP5201639B2 (ja) | Rna選択的ハイブリダイズ試薬及びその利用 | |
Yanagi et al. | A fluorescent 3, 7-bis-(naphthalen-1-ylethynylated)-2′-deoxyadenosine analogue reports thymidine in complementary DNA by a large emission Stokes shift | |
JP5467275B2 (ja) | 電子移動抑制剤とその利用 | |
JP6621831B2 (ja) | ヌクレオシド誘導体及びその利用 | |
WO2023127857A1 (ja) | 新規人工核酸、その製造方法及び用途 | |
CN101410406B (zh) | 6-修饰的双环核酸类似物 | |
JP6491486B2 (ja) | 8−アザ−3,7−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体、8−アザ−3,7−ジデアザアデニンヌクレオチド誘導体及びポリヌクレオチド誘導体ならびにプローブ | |
EP1466919A1 (en) | Nucleotide analogs with six membered rings | |
Dong | DNA complexes containing novel aromatic residues | |
Seidu-Larry | Studies on the chemical biology of natural and chemical ribonucleotide modifications | |
WO2013175656A1 (ja) | 新規核酸誘導体、及び当該核酸誘導体とアミン化合物のコンジュゲート | |
McLean | | tsT is a highly fluorescent nucleobase molecular rotor | |
WO2014159063A1 (en) | Functionalized 3-alkynyl pyrazolopyrimidine analogues as universal bases and methods of use | |
JP2007015948A (ja) | ヌクレオシド誘導体 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A529 | Written submission of copy of amendment under article 34 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A5211 Effective date: 20100809 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20101118 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20121113 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130110 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130205 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130206 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5201639 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20160222 Year of fee payment: 3 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |