WO2023127857A1 - 新規人工核酸、その製造方法及び用途 - Google Patents

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WO2023127857A1
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optionally substituted
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compound
substituent
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晴久 吉川
育哉 伴
真希 泰永
武 今西
雅人 北村
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株式会社理研ジェネシス
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Definitions

  • the present invention relates to a novel artificial nucleic acid, its production method and uses.
  • Oligonucleotides are short sequences of natural DNA or natural RNA or artificial nucleic acids that can be used to regulate gene expression at the transcription and translation levels of various genes, or to examine the sequence status of genes to detect specific diseases. It has been shown to be very useful for therapy or diagnosis. Techniques for regulating gene expression and testing/diagnosing genetic information can be broadly classified into two types according to the target. The first is when the target is single-stranded RNA or single-stranded DNA, such as messenger RNA (mRNA) or microRNA (miRNA), and the second is when the target is double-stranded genomic DNA.
  • mRNA messenger RNA
  • miRNA microRNA
  • the gene translation process is inhibited by the antisense method in which the oligonucleotide complementarily binds to the single-stranded RNA or single-stranded DNA to form a double strand ( or genetic diagnosis).
  • the oligonucleotide is a double-stranded RNA molecule
  • complementary binding of the oligonucleotide to the target mRNA causes degradation of the target mRNA by the "slicer" enzyme of the RISC complex (RNA interference method).
  • oligonucleotides are endogenous microRNAs that can bind to the 3′UTR region (3′ untranslated region) of the target mRNA and inhibit translation of the target mRNA by virtue of imperfect complementarity. (microRNA mimics). Oligonucleotides can induce gene activation or increased transcription thereof, for example, by complementary binding to long antisense non-coding RNAs or by inhibiting complementary microRNAs, resulting in microRNAs. It can also increase the translation of RNA targets mRNA (anti-microRNA). Oligonucleotides, which are functional materials used in methods for regulating gene expression and testing and diagnosing genetic information, have excellent sequence-specific binding affinity with target nucleic acids and strong resistance to degradative enzymes.
  • DNA and RNA which are natural materials, have poor resistance to degradative enzymes and insufficient binding affinity, and are unsuitable as functional materials. Therefore, many artificial nucleic acids have been developed so far with the aim of improving the functionality of oligonucleotides.
  • Representative examples of artificial nucleic acids include peptide nucleic acids (PNA), crosslinked nucleic acids, morpholino nucleic acids (PMO), and phosphorothioate nucleic acids ( S oligonucleotide) and the like.
  • PNA peptide nucleic acids
  • PMO morpholino nucleic acids
  • S oligonucleotide phosphorothioate nucleic acids
  • the following three types are known as artificial nucleic acids having a spiro ring (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • the purpose of the present invention is to provide novel artificial nucleic acids useful for various genome technologies, methods for producing them, uses thereof, and the like.
  • the present inventors have conducted intensive studies to achieve the above objects, and found that 1,7-dioxaspiro[4.4]nonane skeleton, 1,7-dioxaspiro[4.5]decane skeleton, 1-oxa-7-azaspiro
  • a novel artificial nucleic acid having a [4.4]nonane skeleton or a 1-oxa-7-azaspiro[4.5]decane skeleton was found to be useful in various genome technologies.
  • the inventors of the present invention completed the present invention by conducting further studies based on such findings.
  • Base is an optionally substituted aromatic heterocyclic group or an optionally substituted aromatic hydrocarbon ring group
  • X 1 is a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted alkenyl group, an optionally substituted alkynyl group, or a substituted A cycloalkyl group that may be substituted, or an aryl group that may have a substituent
  • X 2 is a hydrogen atom, or -OR 7
  • R 1 , R 2 and R 7 are the same or different and are a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted alkenyl group, a substituted optionally substituted alkynyl group, optionally substituted cycloalkyl group, optionally substituted cycloalkenyl group, optionally substituted aryl group, hydroxy group-protecting group, substituted a
  • R 1 and R 2 are the same or different and are a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted aryl group, an alkylcarbonyl group, an arylcarbonyl group, an alkylsulfonyl group , an arylsulfonyl group, a group represented by the formula: -Si(R 8 ) 3 (wherein each R 8 is the same or different and is an alkyl group or an aryl group), the formula: -P(R 9a ) (R 9b ) (Wherein R 9a and R 9b are the same or different, hydroxy group, mercapto group, amino group, alkoxy group, haloalkoxy group, cyanoalkoxy group, alkylthio group, haloalkylthio group, cyanoalkylthio group, cyanoalkylthio group
  • Base is optionally substituted 2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-1-yl group, optionally substituted 2-oxo-1,2 -dihydropyrimidin-1-yl group, optionally substituted purin-9-yl group, or optionally substituted 6-oxo-1,6-dihydro-9H-purine-9 Item 12.
  • the compound or a salt thereof according to any one of Items 1 to 11, which is a -yl group.
  • Base is an optionally substituted aromatic heterocyclic group or an optionally substituted aromatic hydrocarbon ring group
  • X 1 is a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted alkenyl group, an optionally substituted alkynyl group, or a substituted A cycloalkyl group that may be substituted, or an aryl group that may have a substituent
  • X 2 is a hydrogen atom, or -OR 7
  • R 7 is a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted alkenyl group, an optionally substituted alkynyl group, or an optionally substituted optionally substituted cycloalkyl group, optionally substituted cycloalkenyl group, optionally substituted aryl group, hydroxy-protecting group, substituted phosphino group, substituted
  • a method for detecting a target nucleic acid comprising: (I) a step of selectively amplifying a target nucleic acid by a nucleic acid amplification method; and (II) a step of detecting the target nucleic acid amplified in the step (I), and the oligonucleotide used for the amplification or detection.
  • a method for detecting a target nucleic acid comprising the oligonucleotide of Item 14 or a salt thereof.
  • a kit for detecting or selectively amplifying a target nucleic acid comprising: (a) a kit comprising a primer and a probe, at least one of which comprises the oligonucleotide of Item 14 or a salt thereof, or (b) a clamp nucleic acid and a primer, the clamp nucleic acid and 15.
  • a composition comprising the compound according to any one of Items 1 to 12 or a salt thereof, or the oligonucleotide according to Item 14 or a salt thereof.
  • Base is an optionally substituted aromatic heterocyclic group or an optionally substituted aromatic hydrocarbon ring group
  • X 1 is a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted alkenyl group, an optionally substituted alkynyl group, or a substituted A cycloalkyl group that may be substituted, or an aryl group that may have a substituent
  • X 2 is a hydrogen atom, or -OR 7
  • R 1 , R 2 and R 7 are the same or different and are a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted alkenyl group, a substituted optionally substituted alkynyl group, optionally substituted cycloalkyl group, optionally substituted cycloalkenyl group, optionally substituted aryl group, hydroxy group-protecting group, substituted a phosphino group having a group, a dihydroxyphosphiny
  • R 2 is a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted alkenyl group, an optionally substituted alkynyl group, or a substituted optionally substituted cycloalkyl group, optionally substituted cycloalkenyl group, optionally substituted aryl group, hydroxy-protecting group, substituted phosphino group, substituted a dihydroxyphosphinyl group that may be substituted, or a hydroxymercaptophosphinyl group that may have a substituent
  • R 5 , R 6 , R X , R Y and X 1 are the same or different and are a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted alkenyl group, a substituted an alkynyl group optionally having a group, a cycloalkyl group optionally having a substituent, or an aryl group optionally having a substituent
  • L is a hydrogen atom, an optionally substituted
  • novel artificial nucleic acids useful for various genome technologies can be provided.
  • FIG. 1A is an example of the kit of the present invention, and is a schematic diagram of a kit including a container containing a composition containing primers and probes.
  • FIG. 1B is an example of the kit of the present invention, and is a schematic diagram of a kit including a container containing a composition containing a primer and a container containing a composition containing a probe.
  • FIG. 1C is an example of the kit of the present invention, which includes a container containing a composition containing a forward primer, a container containing a composition containing a reverse primer, and a container containing a composition containing a probe. It is a schematic diagram of. FIG.
  • FIG. 2 is a graph showing the relationship between the reaction time with CAVP (Crotalus adamanteus Venom phosphodiesterase I) at a final concentration of 2.0 ⁇ g/mL and the residual ratio of undigested oligonucleotides.
  • alkyl group refers to a monovalent group obtained by removing one hydrogen atom from a linear or branched saturated hydrocarbon. Although the number of carbon atoms in the alkyl group is not particularly limited, it is, for example, 1-20, preferably 1-10, more preferably 1-6, and particularly preferably 1-4. Examples of alkyl groups include methyl, ethyl, propyl (eg n-propyl, i-propyl), butyl (eg n-butyl, i-butyl, s-butyl, t -butyl group), pentyl group (e.g.
  • n-pentyl group i-pentyl group, neopentyl group
  • hexyl group heptyl group
  • octyl group e.g. n-octyl group, 2-ethylhexyl group
  • nonyl group decyl and the like.
  • alkylene group refers to a divalent group obtained by removing two hydrogen atoms from a linear or branched saturated hydrocarbon. Although the number of carbon atoms in the alkylene group is not particularly limited, it is, for example, 1-10, preferably 1-8, more preferably 1-6. Examples of alkylene groups include C1 alkylene groups (e.g. methylene groups), C2 alkylene groups (e.g. methylmethylene groups, dimethylene groups), C3 alkylene groups (e.g.
  • trimethylene groups dimethylmethylene groups
  • C4 An alkylene group (eg, tetramethylene group), a C5 alkylene group (eg, pentamethylene group), a C6 alkylene group (eg, hexamethylene group), and the like can be mentioned.
  • alkenyl group refers to a linear or branched monovalent group obtained by removing one hydrogen atom from an unsaturated hydrocarbon containing a carbon-carbon double bond.
  • the number of carbon atoms in the alkenyl group is not particularly limited, it is, for example, 2-20, preferably 2-10, more preferably 2-6.
  • alkenyl groups include ethenyl groups (ie, vinyl groups), propenyl groups (eg, 1-propenyl groups, allyl groups), butenyl groups, pentenyl groups, hexenyl groups, geranyl groups, farnesyl groups, and the like.
  • alkynyl group refers to a linear or branched monovalent group obtained by removing one hydrogen atom from an unsaturated hydrocarbon containing a carbon-carbon triple bond.
  • the number of carbon atoms in the alkynyl group is not particularly limited, it is, for example, 2-20, preferably 2-10, more preferably 2-6.
  • alkynyl groups include ethynyl, propargyl, 1-butynyl and the like.
  • cycloalkyl group refers to a monovalent group derived from a saturated aliphatic hydrocarbon ring. Although the number of carbon atoms in the cycloalkyl group is not particularly limited, it is, for example, 3-20, preferably 5-12, more preferably 5-10. Examples of cycloalkyl groups include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, norbornyl, and adamantyl groups.
  • cycloalkenyl group refers to a monovalent group derived from an unsaturated aliphatic hydrocarbon ring containing a carbon-carbon double bond.
  • the number of carbon atoms in the cycloalkenyl group is not particularly limited, it is, for example, 3-20, preferably 5-12, more preferably 5-10.
  • Examples of cycloalkenyl groups include cyclopropenyl, cyclobutenyl, cyclopentenyl, cyclohexenyl, norbornenyl, adamantenyl groups, and the like.
  • aromatic hydrocarbon ring group refers to a monovalent group derived from an aromatic hydrocarbon ring, and is also referred to as an "aryl group.”
  • the number of constituent atoms of the aromatic hydrocarbon ring is not particularly limited, but is, for example, 6-20, preferably 6-14, more preferably 6-12, particularly preferably 6-10.
  • the aromatic hydrocarbon ring may be a monocyclic ring or a condensed ring (eg, bi- or tricyclic condensed ring). Examples of aromatic hydrocarbon ring groups include phenyl, indenyl, naphthyl, fluorenyl, phenanthrenyl, and anthracenyl groups.
  • heterocycle is used in the sense of including “aliphatic heterocycle” and “aromatic heterocycle”.
  • aliphatic heterocyclic ring refers to at least one heteroatom selected from the group consisting of a carbon atom, a nitrogen atom, an oxygen atom, a sulfur atom, a silicon atom, etc., as a ring-constituting atom. refers to an aliphatic ring containing Although the number of constituent atoms of the aliphatic heterocyclic ring is not particularly limited, it is, for example, 5-20, preferably 5-12, more preferably 6-10. Among the constituent atoms of the aliphatic heterocyclic ring, the number of heteroatoms is not particularly limited, but is, for example, 1-4.
  • aliphatic heterocycles include oxygen-containing aliphatic heterocycles (eg, tetrahydrofuran, dioxolane, pyran, tetrahydropyran, dioxane), sulfur-containing aliphatic heterocycles (eg, tetrahydrothiophene, thiopyran, tetrahydrothiopyran), Nitrogenous aliphatic heterocycles (e.g. pyrrolidine, piperidine, azepane), nitrogen- and oxygen-containing aliphatic heterocycles (e.g. morpholine), nitrogen- and sulfur-containing aliphatic heterocycles (e.g. thiomorpholine), lipids containing siloxane bonds group heterocycles, and the like.
  • oxygen-containing aliphatic heterocycles eg, tetrahydrofuran, dioxolane, pyran, tetrahydropyran, dioxane
  • aromatic heterocyclic ring refers to an aromatic ring containing at least one heteroatom selected from the group consisting of a carbon atom, a nitrogen atom, an oxygen atom, a sulfur atom, etc., as ring-constituting atoms. ring.
  • the number of constituent atoms of the aromatic heterocyclic ring is not particularly limited, it is, for example, 5-20, preferably 5-12, more preferably 5-10.
  • the constituent atoms of the aromatic heterocyclic ring is not particularly limited, but is, for example, 1-4.
  • the aromatic heterocycle may be a monocyclic ring or a condensed ring (eg, bi- or tricyclic condensed ring).
  • aromatic heterocycles include oxygen-containing heteroaromatic rings (e.g. furan, benzofuran, isobenzofuran, chromene, benzopyran, xanthene), sulfur-containing heteroaromatic rings (e.g. thiophene, thianthrene), nitrogen-containing aromatic heterocycles Heterocyclic rings (e.g.
  • pyrrole imidazole, pyrazole, triazole, pyridine, pyrazine, pyrimidine, pyridazine, indole, isoindole, indolizine, purine, quinoline, isoquinoline, 1,8-naphthyridine, quinoxaline, quinazoline, cinnoline, phthalazine, pteridine , carbazole, phenanthridine, acridine, perimidine, phenazine), oxygen- and sulfur-containing aromatic heterocycles (e.g. phenoxathiin), nitrogen- and oxygen-containing aromatic heterocycles (e.g. oxazole, isoxazole, furazane, phenoxazine ), nitrogen- and sulfur-containing aromatic heterocycles (eg, thiazole, isothiazole, phenothiazine), and the like.
  • aromatic heterocycles e.g. pheno
  • heterocyclic group refers to a monovalent group obtained by removing one hydrogen atom from the above heterocyclic ring.
  • aromatic heterocyclic group refers to a monovalent group obtained by removing one hydrogen atom from the above aromatic heterocyclic ring, and is also referred to as a "heteroaryl group”.
  • substituents As used herein, “optionally having a substituent” or “optionally substituted with a substituent” refers to the case where there is no substituent, and one hydrogen atom instead of any hydrogen atom It is used in the sense of including both the case of having a substituent or two or more same or different substituents. In the case of having a substituent, the number of substituents can be selected from the range from 1 to the maximum number that can be substituted, and is not particularly limited, but for example 1 to 3, preferably 1 or 2 is.
  • substituted refers to an atom or atomic group that replaces a hydrogen atom.
  • an alkyl group an alkenyl group, an alkynyl group, a cycloalkyl group, a cycloalkenyl group, an aryl group, an acyl group, an alkylsulfonyl group, an arylsulfonyl group, a cyano group, a heterocyclic group, a combination of two or more of these (e.g., a haloalkyl group , cyanoalkyl group, aralkyl group, alkoxy group, alkylamino group) and the like.
  • the "combination of two or more types" includes any combination of the groups exemplified as the respective substituents.
  • Cy means that the number of carbon atoms in the subsequent group is x or more and y or less. x and y are positive integers and x ⁇ y.
  • haloalkyl group refers to an alkyl group substituted with one or more of the same or different halogen atoms.
  • a preferred example of the haloalkyl group is a C 1-6 haloalkyl group, a more preferred example is a C 1-4 haloalkyl group, and even more preferred examples are a trifluoromethyl group, a trichloromethyl group, or 2, 2,2-trifluoroethyl group.
  • a "cyanoalkyl group” refers to an alkyl group substituted with one or more cyano groups.
  • a preferred example of the cyanoalkyl group is a C 1-6 cyanoalkyl group, a more preferred example is a C 1-4 cyanoalkyl group, and a further preferred example is a cyanomethyl group or a 2-cyanoethyl group. be done.
  • an "aralkyl group” refers to an alkyl group substituted with one or more of the same or different aryl groups.
  • a preferred example of an aralkyl group is a C 6-14 aryl C 1-4 alkyl group, more preferred examples are a phenylmethyl group (ie benzyl group), a phenylethyl group (ie phenethyl group), naphthylmethyl a naphthylethyl group, a triphenylmethyl group (ie, a trityl group), or a fluorenylmethyl group.
  • alkoxy group refers to a group represented by the formula: —O-alkyl.
  • a preferred example of the alkoxy group is a C 1-6 alkoxy group, more preferred examples are a methoxy group, an ethoxy group, a propoxy group (eg n-propoxy group, i-propoxy group) or a butoxy group (eg : t-butoxy group).
  • a haloalkoxy group and a cyanoalkoxy group refer to a group represented by the formula: --O-haloalkyl and a group represented by the formula: --O-cyanoalkyl, respectively.
  • an "alkylthio group” refers to a group represented by the formula: -S-alkyl.
  • a preferred example of the alkylthio group is a C 1-6 alkylthio group, more preferred examples are a methylthio group, an ethylthio group, a propylthio group (eg, n-propylthio group, i-propylthio group), or a butylthio group.
  • a haloalkylthio group and a cyanoalkylthio group refer to a group represented by the formula: --S-haloalkyl and a group represented by the formula: --S-cyanoalkyl, respectively.
  • an "alkylamino group” refers to an amino group substituted with one or two identical or different alkyl groups.
  • Alkylamino groups include monoalkylamino groups and dialkylamino groups.
  • a preferred example of the monoalkylamino group is a mono C 1-6 alkylamino group, and more preferred examples are a monomethylamino group, a monoethylamino group, a monopropylamino group (e.g. mono(n-propyl)amino mono(i-propyl)amino group), or monobutylamino group.
  • dialkylamino group is a di-C 1-6 alkylamino group, and more preferred examples are a dimethylamino group, diethylamino group, dipropylamino group (e.g., di(n-propyl)amino group, di (i-propyl)amino group), or dibutylamino group.
  • substituted phosphino group refers to a group in which at least one hydrogen atom of a phosphino group (—PH 2 ) is substituted with another atom or atomic group.
  • substituted phosphino groups include the formula: -P(R 9a )(R 9b ) (wherein R 9a and R 9b are the same or different and are a hydroxy group, a mercapto group, an amino group, an alkoxy group , a haloalkoxy group, a cyanoalkoxy group, an alkylthio group, a haloalkylthio group, a cyanoalkylthio group, or an alkylamino group).
  • the latter group optionally has a substituent, the following formula: A group represented by (hereinafter referred to as "diphosphate group”), and optionally having a substituent, the following formula: (hereinafter referred to as "triphosphate group”).
  • hydroxy group-protecting group refers to a monovalent group for preventing the hydroxy group from participating in the reaction in the synthesis of a compound or a salt thereof, or in the synthesis of an oligonucleotide or a salt thereof.
  • Protective groups for hydroxy groups include, but are not limited to, groups that are stable under acidic or neutral conditions and cleavable by methods such as hydrogenolysis, hydrolysis, electrolysis, and photolysis. not to be Examples of hydroxy-protecting groups include optionally substituted acyl groups, substituted thiocarbonyl groups, substituted sulfonyl groups, and substituted silyl groups.
  • the hydrocarbon group represented by R may be a linear or branched hydrocarbon group (eg, alkyl group) or a saturated or unsaturated hydrocarbon ring group (eg, cycloalkyl group, aryl group). or a combination thereof (eg, an aralkyl group).
  • Acyl groups include alkylcarbonyl groups, arylcarbonyl groups, and aralkylcarbonyl groups.
  • a preferred example of the alkylcarbonyl group is a (C 1-10 alkyl)carbonyl group, and more preferred examples are an acetyl group, a propionyl group, a butyryl group, an isobutyryl group, a pentanoyl group, a pivaloyl group, a valeryl group and an isovaleryl group. , an octanoyl group, a nonanoyl group, or a decanoyl group.
  • a preferred example of the arylcarbonyl group is a (C 6-14 aryl)carbonyl group, and more preferred examples are a benzoyl group or a naphthoyl group (ie ⁇ -naphthoyl group, ⁇ -naphthoyl group).
  • a preferred example of the aralkylcarbonyl group is (C 6-14 arylC 1-4 alkyl)carbonyl group, and a more preferred example is benzylcarbonyl group.
  • the acyl groups in the "acyloxy group", "acylthio group” and “acylamino group” can be exemplified by the same groups as those described above.
  • the sulfonyl group having a substituent includes a sulfonyl group having an optionally substituted alkyl group and a sulfonyl group having an optionally substituted aryl group.
  • a preferred example of a sulfonyl group having an alkyl group is a C 1-6 alkylsulfonyl group, and more preferred examples are a methanesulfonyl group or an ethanesulfonyl group.
  • a preferred example of a sulfonyl group having an aryl group is a C 6-14 arylsulfonyl group, and more preferred examples are a benzenesulfonyl group or a p-toluenesulfonyl group.
  • substituted silyl group refers to a silyl group (—SiH 3 ) in which at least one hydrogen atom is substituted with another atom or atomic group.
  • silyl group having a substituent is represented by the formula: —Si(R 8 ) 3 (wherein each R 8 is the same or different and is an alkyl group or an aryl group). is the base.
  • Such groups include trialkylsilyl groups (e.g., triC 1-6 alkylsilyl groups such as trimethylsilyl group, triethylsilyl group, triisopropylsilyl group, t-butyldimethylsilyl group), dialkylarylsilyl groups (e.g. : di-C 1-6 alkylC 6-14 arylsilyl group such as dimethylphenylsilyl group), alkyldiarylsilyl group (e.g.
  • C 1-6 alkyldi-C 6-14 arylsilyl group such as t-butyldiphenylsilyl group
  • a triarylsilyl group eg, a tri-C 6-14 arylsilyl group such as a triphenylsilyl group
  • amino group-protecting group refers to a monovalent group for preventing the amino group from participating in the reaction in the synthesis of a compound or a salt thereof, or in the synthesis of an oligonucleotide or a salt thereof.
  • protective groups for amino groups include, but are not limited to, groups that are stable under acidic or neutral conditions and cleavable by methods such as hydrogenolysis, hydrolysis, electrolysis, and photolysis.
  • amino-protecting groups include optionally substituted acyl groups (e.g., optionally substituted alkylcarbonyl groups, optionally substituted arylcarbonyl groups, substituted optionally substituted aralkylcarbonyl group), optionally substituted N,N-dialkylformamidyl group, optionally substituted alkoxycarbonyl group, optionally substituted an optionally substituted alkenyloxycarbonyl group, an optionally substituted aryloxycarbonyl group, an optionally substituted aralkyloxycarbonyl group, and a substituted sulfonyl group.
  • acyl groups e.g., optionally substituted alkylcarbonyl groups, optionally substituted arylcarbonyl groups, substituted optionally substituted aralkylcarbonyl group
  • N,N-dialkylformamidyl group optionally substituted alkoxycarbonyl group
  • optionally substituted an optionally substituted alkenyloxycarbonyl group optionally substituted
  • a preferred example of the N,N-dialkylformamidyl group is an N,N-di(C 1-6 alkyl)formamidyl group, and a more preferred example is N,N-di(C 1-4 alkyl) It is a formamidyl group, and more preferred examples are an N,N-dimethylformamidyl group or an N,N-diethylformamidyl group.
  • a preferred example of the alkoxycarbonyl group is a (C 1-6 alkoxy)carbonyl group, and more preferred examples are a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, a propoxycarbonyl group, or a butoxycarbonyl group (eg, t-butoxycarbonyl base).
  • a preferred example of the alkenyloxycarbonyl group is a (C 2-9 alkenyloxy)carbonyl group, and a more preferred example is an allyloxycarbonyl group.
  • a preferred example of the aryloxycarbonyl group is a (C 6-14 aryloxy)carbonyl group, and more preferred examples are a phenoxycarbonyl group or a naphthoxycarbonyl group.
  • a preferred example of the aralkyloxycarbonyl group is a (C 6-14 arylC 1-4 alkoxy)carbonyl group, and more preferred examples are a benzyloxycarbonyl group or a fluorenylmethyloxycarbonyl group.
  • the term "functional molecular unit substituent” refers to a labeling functional group (e.g., fluorescent labeling functional group, chemiluminescence labeling functional group, radiation-emitting nuclide-containing group), a group having intercalation ability,
  • the concept includes a group capable of cleaving a nucleic acid, a functional group capable of cleaving a nucleic acid, a group capable of translocating into cells or nuclei, and a group having metal chelating ability.
  • fluorescent labeling functional groups include carboxyfluorescein (FAM), fluorescein isothiocyanate (FITC), carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), thiazole orange (1-methyl-4-[(3-methyl-2(3H)- Benzothiazolylidene)methyl]quinolinium p-tosylate) and other fluorescent labeling reagent residues.
  • fluorescent labeling functional groups include residues of chemiluminescent labeling reagents such as tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride.
  • radiation-emitting nuclide-containing groups include groups containing 11 CH 3 —, 14 CH 3 —, 18 F-, or 32 P-.
  • groups having an intercalating ability include groups having an anthracene skeleton, groups having a pyrene skeleton, groups having an anthraquinone skeleton, groups having an acridine skeleton, and groups having a naphthalimide skeleton.
  • Other examples include residues of intercalating agents such as tamoxifen.
  • groups having nucleic acid binding ability include residues of nucleic acid binding agents such as netropsin, distamine, and PI (Pyrrole Imidazole) polyamide.
  • nucleic acid cleaving functional groups include residues of nucleic acid cleaving agents such as endonucleases, bis(bipyridine)chrysenequinone diimine rhodium(II) complexes, and the like.
  • groups capable of intracellular or nuclear localization include TAT (Twin-Arginine Translocation) signal peptide, polyarginine, GalNac (N-acetylgalactosamine), signal peptide derived from SV40T antigen, and the like.
  • Signal peptide residues and the like can be mentioned.
  • groups having metal chelating ability include residues of metal chelating agents such as EDTA, crown ethers and cryptands.
  • hybridize means that all or part of a given polynucleotide or oligonucleotide under stringent conditions, through hydrogen bonding with all or part of another polynucleotide or oligonucleotide Refers to forming a double strand.
  • Stringent conditions may be conditions commonly used by those skilled in the art when performing hybridization of polynucleotides or oligonucleotides.
  • one polynucleotide or oligonucleotide molecule is identical to another when there is at least 50%, preferably at least 75%, more preferably at least 90% sequence identity between the two polynucleotide or oligonucleotide molecules.
  • Stringency in hybridization is known to be a function of temperature, salt concentration, base length and GC content of the polynucleotide or oligonucleotide, and concentration of chaotropic agents contained in the hybridization buffer.
  • stringent conditions for example, the conditions described in Sambrook, J. et al., 1998, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (second edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, etc. can be used.
  • examination refers to examining a test substance such as nucleic acid in a sample for purposes such as diagnosis and research.
  • Test sample means a sample to be tested.
  • the compound or its salt of the present invention is a compound represented by the following formula (1) or its salt. (wherein Base, X 1 , X 2 , R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , Z 1 and Z 2 are the same as above).
  • the compound or salt thereof of the present invention has a 1,7-dioxaspiro[4.4]nonane skeleton, a 1,7-dioxaspiro[4.5]decane skeleton, a 1-oxa-7 -Azaspiro[4.4]nonane skeleton or 1-oxa-7-azaspiro[4.5]decane skeleton.
  • Compound (1) is a "nucleotide” when R 1 or R 2 is an optionally substituted dihydroxyphosphinyl group or an optionally substituted hydroxymercaptophosphinyl group and other groups are referred to as “nucleosides”.
  • Base is preferably an aromatic heterocyclic group optionally having a substituent.
  • the aromatic heterocyclic group is preferably a nitrogen-containing aromatic heterocyclic group.
  • the nitrogen-containing aromatic heterocyclic group is preferably a 6- to 10-membered nitrogen-containing aromatic heterocyclic group.
  • the 6- to 10-membered nitrogen-containing aromatic heterocyclic group is preferably 2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-1-yl group, 2-oxo-1,2-dihydropyrimidine- 1-yl group, purin-9-yl group, or 6-oxo-1,6-dihydro-9H-purin-9-yl group.
  • the substituent with which the aromatic heterocyclic group is substituted is preferably at least one selected from the group consisting of an alkyl group, an acyl group, and an amino group optionally substituted with a protective group for an amino group.
  • the number of substituents is not particularly limited, but is, for example, 1-3.
  • Base is more preferably a thyminyl group optionally having a substituent, a cytosinyl group optionally having a substituent, an adenyl group optionally having a substituent, or having a substituent is a good guanyl group.
  • the substituent is preferably at least one selected from the group consisting of an alkyl group, an acyl group and an N,N-dialkylformamidyl group, more preferably a C 1-4 alkyl group, (C 1-4 alkyl)carbonyl group, (C 6-14 aryl)carbonyl group, or N,N-di(C 1-4 alkyl)formamidyl group.
  • the number of substituents is preferably 1-3.
  • Base is more preferably: 2,4-dioxo-5-methyl-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-1-yl group (eg, thymin-1-yl group), 2-oxo-4-amino-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group (that is, cytosin-1-yl group), 2-oxo-4-acylamino-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group (that is, N-acyl-cytosin-1-yl group), 2-oxo-4-amino-5-methyl-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group (that is, 5-methylcytosin-1-yl group), 2-oxo-4-acylamino-5-methyl-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group (that is, N-acyl-5-methylcytosin-1-yl group), 6-amino-9H-purin-9-yl group (ie, adenin-9-yl group), 6-acylamino
  • N-acyl-guanin-9-yl group and 2-(N,N-dialkylformamidyl) amino-6-oxo-1,6-dihydro-9H-purin-9-yl group (e.g. N-(N,N-dialkylformamidyl)-guanin-9-yl group) It is a group selected from the group consisting of
  • Base is even more preferably: a thymin-1-yl group, 5-methylcytosin-1-yl group, N-acetyl-5-methylcytosin-1-yl group, N-isobutyryl-5-methylcytosin-1-yl group, N-benzoyl-5-methylcytosin-1-yl group, adenin-9-yl group, N-acetyl-adenine-9-yl group, N-isobutyryl-adenin-9-yl group, N-benzoyl-adenine-9-yl group, guanin-9-yl group, N-acetyl-guanin-9-yl group, N-isobutyryl-guanin-9-yl group, It is a group selected from the group consisting of N-benzoyl-guanin-9-yl group and N-(N,N-dimethylformamidyl)-guanin-9-yl group.
  • X 1 is preferably a hydrogen atom, an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, a cycloalkyl group or an aryl group, more preferably a hydrogen atom, an alkyl group or an aryl group, still more preferably a hydrogen atom or an alkyl is a group, more preferably a hydrogen atom or a C 1-4 alkyl group, particularly preferably a hydrogen atom, a methyl group or an ethyl group. In one embodiment, X 1 is preferably a hydrogen atom.
  • R 7 is preferably a hydrogen atom, an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, a cycloalkyl group, a cycloalkenyl group, an aryl group, or a hydroxy-protecting group; More preferably a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group, an alkylcarbonyl group or an arylcarbonyl group, still more preferably a hydrogen atom, an alkyl group or an alkylcarbonyl group, still more preferably a hydrogen atom or a C 1-4 alkyl group , or a C 1-4 alkylcarbonyl group, particularly preferably a hydrogen atom or a C 1-4 alkyl group.
  • R 1 and R 2 are each preferably the following: hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group, an aryl group optionally having a substituent, a hydroxy-protecting group, a phosphino group having a substituent, It is a group selected from the group consisting of an optionally substituted dihydroxyphosphinyl group and an optionally substituted hydroxymercaptophosphinyl group.
  • alkyl group optionally having substituents in the above group preferably has at least one substituent selected from the group consisting of a halogen atom, an alkoxy group, and an aryl group. an alkyl group optionally substituted with an alkoxy group, or an aralkyl group optionally substituted with an alkoxy group.
  • the number of substituents is preferably 1-3.
  • the "optionally substituted aryl group" in the above group preferably has at least one substituent selected from the group consisting of a halogen atom, an alkyl group, and an alkoxy group. aryl group, more preferably an aryl group optionally substituted with an alkoxy group. The number of substituents is preferably 1-3.
  • the “hydroxy-protecting group” in the above group is preferably an alkylcarbonyl group, an arylcarbonyl group, an alkylsulfonyl group, an arylsulfonyl group, or a group of the formula: —Si(R 8 ) 3 (wherein each R 8 is the same or different and is an alkyl group or an aryl group).
  • the “substituted phosphino group” in the above group preferably has the formula: —P(R 9a )(R 9b ) (wherein R 9a and R 9b are the same or different, hydroxy group, mercapto group, amino group, alkoxy group, haloalkoxy group, cyanoalkoxy group, alkylthio group, haloalkylthio group, cyanoalkylthio group, or alkylamino group), more preferably the following formula: (Wherein, R 9c and R 9d are the same or different and are a hydrogen atom or an alkyl group, and R 9e is a hydrogen atom, an alkyl group, a haloalkyl group, or a cyanoalkyl group) is a phosphino group represented by
  • the "optionally substituted dihydroxyphosphinyl group” in the above group is preferably a dihydroxyphosphinyl group, a diphosphate group or a triphosphate group, more preferably a dihydroxyphosphinyl group. It is a finyl group. These may have a hydroxy-protecting group as a substituent, and all or part of the existing hydroxy groups may be substituted with a hydroxy-protecting group.
  • the "optionally substituted hydroxymercaptophosphinyl group" in the above group is preferably a hydroxymercaptophosphinyl group.
  • R 1 and R 2 are each more preferably hydrogen atom, methyl group, ethyl group, propyl group, butyl group, allyl group, benzyl group, trityl group, methoxymethyl group, p-methoxybenzyl group, monomethoxytrityl group, dimethoxytrityl group, acetyl group, isobutyryl group, benzoyl group, methanesulfonyl group, p-toluenesulfonyl group, trimethylsilyl group, triethylsilyl group, triisopropylsilyl group, t-butyldimethylsilyl group, t-butyldiphenylsilyl group, the following formula: is a phosphino group, a dihydroxyphosphinyl group, or a hydroxymercaptophosphinyl group represented by any one of
  • R 1 is a hydrogen atom or an aralkyl group optionally substituted with an alkoxy group (e.g. C 1-4 alkoxy group such as methoxy group, ethoxy group) (e.g.
  • R 2 is a hydrogen atom, an aralkyl group (e.g., a C 7-19 aralkyl group such as a benzyl group), or the following formula: (Wherein, R 9c and R 9d are the same or different and are a hydrogen atom or an alkyl group, and R 9e is a hydrogen atom, an alkyl group, a haloalkyl group, or a cyanoalkyl group) is a combination of phosphino groups represented by
  • R 1 and R 2 are more preferably R 1 is a dimethoxytrityl group such as 4,4'-dimethoxytrityl group and R 2 is the following formula: is a combination of phosphino groups represented by any one of
  • R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are each preferably a hydrogen atom, an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, a cycloalkyl group or an aryl group, more preferably a hydrogen atom, an alkyl group or It is an aryl group, more preferably a hydrogen atom or an alkyl group, still more preferably a hydrogen atom or a C 1-4 alkyl group, particularly preferably a hydrogen atom, a methyl group or an ethyl group.
  • R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are preferably hydrogen atoms.
  • Z 1 is preferably O. Also, in another embodiment, it is preferred that Z 1 is NZ 11 .
  • Z 11 is preferably a hydrogen atom, an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, a cycloalkyl group, an aryl group, an aralkyl group, or a protecting group for an amino group, more preferably a hydrogen atom or an alkyl group. is more preferably a hydrogen atom or a C 1-4 alkyl group, particularly preferably a hydrogen atom, a methyl group or an ethyl group.
  • Z2 is a single bond.
  • Z 1 is O.
  • Z 2 is preferably CZ 21 Z 22 .
  • Z 21 and Z 22 are each preferably a hydrogen atom, an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, a cycloalkyl group, or an aryl group, more preferably a hydrogen atom or an alkyl group, and More preferably, it is a hydrogen atom or a C 1-4 alkyl group, and particularly preferably a hydrogen atom, a methyl group, or an ethyl group.
  • Z 21 and Z 22 are hydrogen atoms (Z 2 is CH 2 ).
  • Compound (1) is preferably any one of the following compounds (1A), (1B), and (1C): (wherein Base, X 2 , R 1 , R 2 and Z 11 are the same as above).
  • compound (1) When compound (1) has an asymmetric carbon, it may be a stereoisomer (R-isomer, S-isomer, ⁇ -isomer, ⁇ -isomer, enantiomer, or diastereomer) or may be a racemate.
  • compound (1) may be any of the following compounds (1A-1), (1A-2), (1B-1), and (1C-1): (wherein Base, X 2 , R 1 , R 2 and Z 11 are the same as above).
  • the salt may or may not be a pharmaceutically acceptable salt.
  • the salt may be an inorganic salt or an organic salt.
  • the salts include alkali metal salts (e.g. sodium salts, potassium salts, lithium salts), alkaline earth metal salts (e.g. calcium salts, magnesium salts), other metal salts (e.g. aluminum salts, iron salts). , zinc salts, copper salts, nickel salts, cobalt salts), ammonium salts, tetramethylammonium salts, amine salts (e.g.
  • t-octylamine salts dibenzylamine salts, morpholine salts, glucosamine salts, phenylglycine alkyl ester salts, ethylenediamine salt, N-methylglucamine salt, guanidine salt, diethylamine salt, triethylamine salt, dicyclohexylamine salt, N,N'-dibenzylethylenediamine salt, chloroprocaine salt, procaine salt, diethanolamine salt, N-benzyl-phenethylamine salt, piperazine salts, tris(hydroxymethyl)aminomethane salts), inorganic acid salts (e.g.
  • organic acid salts e.g. methanesulfonate, trifluoromethanesulfonate, ethanesulfonate, benzenesulfonate, p-toluenesulfonate, acetate, malate, fumarate, succinate, citrate, tart
  • Compound (1) is prepared by, for example, converting compound (2) into formula (2′): Z 11 —NH 2 (wherein Z 11 is the same as described above). It can be obtained by a method including a step of cyclization (or ring closure) in the presence or absence of an amine represented by, but not limited to this method, using a known reaction Can be synthesized: (wherein L 1 is a hydroxy-activating group, L 2 is a hydrogen atom or a hydroxy-activating group, Base, X 1 , X 2 , R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , Z 1 and Z 2 are the same as above).
  • examples of hydroxy-activating groups represented by L 1 include alkylsulfonyl groups (eg, C 1-4 alkylsulfonyl groups such as mesyl group), haloalkylsulfonyl groups (eg, trifluoromethanesulfonyl groups, etc.) fluoro-C 1-4 alkanesulfonyl group), arylsulfonyl group (eg, C 6-10 arylsulfonyl group such as benzenesulfonyl group, nitrobenzenesulfonyl group, tosyl group) and the like.
  • L 2 is a hydroxy-activating group
  • examples of the hydroxy-activating group include the same examples as for L 1 .
  • L2 may be the same as or different from L1 .
  • Compound (2) has, for example, the following formula (3): (Wherein, Z 3 is a single bond or a double bond, and when Z 3 is a single bond, X 3 is OR 1 , Z 4 is CH 2 ⁇ CZ 5 —, and Z 5 is a hydrogen atom , an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted alkenyl group, an optionally substituted alkynyl group, an optionally substituted cycloalkyl group, or an optionally substituted aryl group, when Z 3 is a double bond, X 3 and Z 4 are absent, Base, L 1 , X 1 , X 2 , R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are the same as above) It can be obtained by a method including a step of hydroxylating the compound represented by (e.g., hydroxylation with an oxidizing agent such as osmium tetroxide), but is not limited to this method, and a known reaction can be
  • the compound (3) is, for example, the following formula (4): (Wherein, L 1 , X 1 , R 2 , R 5 , R 6 , R X , and RY are the same as above)
  • a step of oxidizing a compound represented by with an oxidizing agent for example, Swern oxidation using dimethyl sulfoxide as an oxidizing agent and oxalyl chloride or the like as an activating agent
  • a step of oxidizing a compound represented by with an oxidizing agent for example, Swern oxidation using dimethyl sulfoxide as an oxidizing agent and oxalyl chloride or the like as an activating agent
  • a Wittig reaction for example, Swern oxidation using dimethyl sulfoxide as an oxidizing agent and oxalyl chloride or the like as an activating agent
  • a Wittig reaction for example, Swern oxidation using dimethyl sulfoxide as an oxidizing agent and o
  • R X and R Y are each preferably a hydrogen atom, an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, a cycloalkyl group, or an aryl group, more preferably a hydrogen atom, an alkyl group, or an aryl group, still more preferably is an alkyl group, even more preferably a C 1-4 alkyl group such as a methyl group.
  • the cyclization step of compound (2) may be carried out in the presence of a base.
  • bases include inorganic bases [e.g. alkali metal carbonates (e.g. sodium carbonate, potassium carbonate, cesium carbonate), alkali metal hydrogen carbonates (e.g. sodium hydrogen carbonate), alkaline earth metal carbonates (e.g. calcium carbonate), alkali metal hydroxides (e.g. sodium hydroxide, potassium hydroxide), alkaline earth metal hydroxides (e.g. calcium hydroxide), alkali metal hydrides (e.g. hydrogen sodium chloride), metal alkoxides (e.g. sodium methoxide, sodium ethoxide)], organic bases [e.g. tertiary amines (e.g.
  • trialkylamine N-ethyldiisopropylamine
  • cyclic amines e.g. pyridine, 4 -(dimethylamino)pyridine, diazabicycloundecene (DBU), diazabicyclononene (DBN)]]], combinations thereof, and the like.
  • DBU diazabicycloundecene
  • DBN diazabicyclononene
  • the amount of the base to be used is, for example, 1 to 20 mol, preferably 1 to 10 mol, per 1 mol of compound (2).
  • the cyclization step of compound (2) is preferably carried out in the presence of a solvent.
  • solvents include ether solvents (eg tetrahydrofuran), amide solvents (eg N,N-dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide), cyclic amines (eg pyridine, 2,4,6-trimethyl pyridine) and the like.
  • reaction temperature and reaction time are not particularly limited as long as the reaction proceeds.
  • the reaction temperature is, for example, 20 to 170°C, preferably 25 to 150°C or 60 to 120°C.
  • the reaction time is, for example, 0.5-72 hours, 1-24 hours, or 6-12 hours.
  • Base of compounds (1), (1A), (1B), (1C), (2), and (3) can be converted, for example, according to the following reaction scheme.
  • Q 1 is a hydrogen atom or a substituent
  • Q 2 and Q 3 are the same or different and are a hydrogen atom or an amino-protecting group (wherein Q 2 and Q 3 are both hydrogen atoms not)
  • Q 4 , Q 5 , Q 6 and Q 7 are the same or different and are a hydrogen atom or an amino group-protecting group
  • ring G is a 5- or 6-membered nitrogen-containing heterocyclic ring.
  • step (I) a compound (5A) in which Base is “an optionally substituted 2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-1-yl group” is converted to a compound ( 5B) and a phosphoryl halide to give compound (5C).
  • Q 1 is preferably a hydrogen atom or an alkyl group, more preferably a hydrogen atom or a C 1-4 alkyl group.
  • Compound (5B) is preferably a 5-membered nitrogen-containing heterocyclic compound, more preferably triazole.
  • the amount of compound (5B) to be used is generally 5-20 mol, preferably 7-9 mol, per 1 mol of compound (5A).
  • the phosphate halide is preferably phosphate trichloride.
  • the amount of phosphoric acid halide to be used is generally 1-5 mol, preferably 1-3 mol, per 1 mol of compound (5A).
  • the reaction of step (I) is preferably carried out in the presence of a solvent.
  • solvents include nitrile solvents (eg, acetonitrile), ether solvents (eg, tetrahydrofuran), halogen solvents (eg, haloalkanes), and mixed solvents of two or more thereof.
  • nitrile solvents eg, acetonitrile
  • ether solvents eg, tetrahydrofuran
  • halogen solvents eg, haloalkanes
  • mixed solvents of two or more thereof e.g, nitrile solvents (eg, acetonitrile) are preferred.
  • the reaction of step (I) is preferably carried out in the presence of a base.
  • bases include inorganic bases [e.g. alkali metal carbonates (e.g. sodium carbonate, cesium carbonate), alkali metal hydrogencarbonates (e.g. sodium hydrogencarbonate), alkaline earth metal carbonates (e.g. calcium carbonate), alkali metal hydroxides (e.g. sodium hydroxide, potassium hydroxide), alkaline earth metal hydroxides (e.g. calcium hydroxide), metal alkoxides (e.g. sodium methoxide, sodium ethoxide )], organic bases [e.g. tertiary amines (e.g. trialkylamines), cyclic amines (e.g.
  • the amount of the base to be used is generally 5-20 mol, preferably 10-15 mol, per 1 mol of compound (5A).
  • the reaction temperature for the reaction in step (I) is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but is, for example, -5°C to 10°C.
  • step (I) for example, the method described in US Pat. No. 5,359,067 can be adopted.
  • Step (II) is a step of reacting compound (5C) with ammonia to obtain compound (5D).
  • the amount of ammonia to be used is generally 5-100 mol, preferably 20-50 mol, per 1 mol of compound (5C).
  • the reaction of step (II) is preferably carried out in the presence of a solvent.
  • solvents include amide solvents (eg N,N-dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone), ether solvents (eg cyclic ethers such as tetrahydrofuran and dioxane), and these two. Mixed solvents of the above and the like are included.
  • amide solvents eg N,N-dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone
  • ether solvents eg cyclic ethers such as tetrahydrofuran and dioxane
  • Mixed solvents of the above and the like are included.
  • ether solvents are preferred, cyclic ethers are more preferred, and at least one selected from tetrahydrofuran and dioxane is more preferred.
  • the reaction temperature for the reaction in step (II) is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but is, for example, 15-30°C.
  • Step (III) is a step of protecting the amino group of compound (5D) with a protecting group to obtain compound (5E).
  • a known method for example, US Patent Application Publication No. 2007/167387
  • a commonly used method can be adopted.
  • Step (IV)> in compound (5A), Base is converted from "optionally substituted 2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-1-yl group" to "substituent It is a step of converting to a purine-9-yl group which may have
  • step (IV) is a compound (5A ) with compound (5F) to obtain compound (5G).
  • the amount of compound (5F) to be used is generally 1-5 mol, preferably 1-3 mol, per 1 mol of compound (5A).
  • step (IV) is preferably carried out in the presence of a Lewis acid.
  • Lewis acids include trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate.
  • the amount of Lewis acid to be used is generally 0.5-5 mol, preferably 1-3 mol, per 1 mol of compound (5A).
  • the reaction of step (IV) is preferably carried out in the presence of a silylating agent.
  • silylating agents include N,O-bis-trimethylsilylacetamide (BSA), N,O-bis-silyltrifluoroacetamide (BSTFA), hexamethyldisilazane (HMD), N,O-bis-tertiary Butyldimethylsilylacetamide, N-(trimethylsilyl)diethylamine, N-(trimethylsilyl)dimethylamine, N-methoxy-N,O-bis(trimethylsilyl)carbamate, N-methyl-N-trimethylsilylacetamide, N-methyl-N-trimethylsilyl Heptafluorobutyramide, N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide, N-trimethylsilylacetamide, combinations of two or more thereof, and the like.
  • BSA N,O-bis-trimethylsilylacetamide
  • the reaction temperature of the step (IV) is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but is, for example, 30-150°C, preferably 50-120°C.
  • step (IV) for example, the method described in US Patent Application Publication No. 2012/071646 can be adopted.
  • step (V)> in compound (5A), Base is converted from “optionally substituted 2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-1-yl group” to "substituent 6-oxo-1,6-dihydro-9H-purin-9-yl group optionally having
  • step (V) is a compound (5A ) with a compound represented by formula (5H) to give compound (5I).
  • the reaction can be performed under the same conditions as in step (IV).
  • the method for producing compound (1) may further include a step of purifying the intermediate product and the final product by conventional methods such as concentration, recrystallization, silica gel column chromatography, etc., if necessary.
  • composition of the present invention contains compound (1).
  • the composition may contain only one type of compound (1), or may contain two or more types.
  • the composition is Compound (1) wherein Base is a thymin-1-yl group; Base is 5-methylcytosine-1-yl group, N-acetyl-5-methylcytosine-1-yl group, N-isobutyryl-5-methylcytosine-1-yl group, or N-benzoyl-5-methylcytosine- compound (1) which is a 1-yl group; Compound (1), wherein Base is an adenin-9-yl group, an N-acetyl-adenin-9-yl group, an N-isobutyryl-adenin-9-yl group, or an N-benzoyl-adenin-9-yl group; and Base is a guanin-9-yl group, N-acetyl-guanin-9-yl group, N-isobutyryl-guanin-9-
  • Forms of the composition include liquids.
  • the composition When the composition is in liquid form, the composition usually contains a solvent.
  • the solvent known solvents can be used, preferably halogenated hydrocarbon solvents (eg, dichloromethane), nitrile solvents (eg, acetonitrile), aromatic hydrocarbon solvents (eg, toluene, xylene), water , TE buffer and the like.
  • halogenated hydrocarbon solvents eg, dichloromethane
  • nitrile solvents eg, acetonitrile
  • aromatic hydrocarbon solvents eg, toluene, xylene
  • water e.g, TE buffer and the like.
  • dichloromethane, toluene, acetonitrile and the like are preferably used.
  • the composition is usually housed in a container and provided to the user.
  • composition can be used for synthesizing the oligonucleotides or salts thereof described below. Also, the composition can be used as a pharmaceutical composition.
  • Oligonucleotides or salts thereof have the following formula (6): (In the formula, Base, X 1 , X 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , Z 1 and Z 2 are the same as above).
  • Said unit preferably has the following formula (6a): (wherein A 1 is OH, O ⁇ , SH, or S ⁇ , and Base, X 1 , X 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , Z 1 and Z 2 are the above is the same as It is a unit represented by
  • oligonucleotide (6) an oligonucleotide having a unit represented by formula (6) or (6a) or a salt thereof is referred to as "oligonucleotide (6)".
  • oligonucleotide (6) has two or more units represented by formula (6) or (6a), the structure of each unit may be the same or different.
  • Oligonucleotide (6) may contain other units in addition to the units represented by formula (6) or (6a). Examples of other units include the following formulas (7) to (10): [In the formula, R a is a hydrogen atom or a hydroxy group, R b is a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted alkenyl group, an optionally substituted cycloalkyl group, an optionally substituted optionally substituted aryl group, optionally substituted acyl group, substituted sulfonyl group, substituted silyl group, functional molecular unit substituent, or formula: R b1 -X- (wherein , R b1 is an optionally substituted amino group, X is an optionally substituted alkylene group, or at least one methylene group in this alkylene group is —N(R b2 )— (wherein R b2 is a hydrogen atom or an alkyl group), —O—, or —S(
  • the other units are preferably represented by the following formulas (7a) to (10a): (Wherein, A 2 , A 3 , A 4 , and A 5 are the same or different and are OH, O ⁇ , SH, or S ⁇ , and Base, R a , R b , and R c are is the same as and at least one selected from units represented by.
  • the base sequence of the oligonucleotide (6) is not particularly limited as long as it is complementary to the base sequence (full length or part thereof) of the target DNA or target RNA.
  • the length of the oligonucleotide (6) is not particularly limited, and can be selected according to the length of the target base sequence.
  • the lower limit of the length of the oligonucleotide (6) is, for example, 5 mer, preferably 10 mer, more preferably 15 mer
  • the upper limit of the length of the oligonucleotide (6) is, for example, 200 mer, preferably 100 mer, more preferably 50 mer, More preferably, it is a 30mer.
  • the length of oligonucleotide (6) is, for example, 5-200 mer, preferably 5-50 mer, more preferably 10-40 mer, still more preferably 15-30 mer. The longer the length of the oligonucleotide (6), the stronger the binding force to the target base sequence.
  • the ratio of the number of units represented by formula (6) to the total number of nucleotide units is not particularly limited, and the intended use (primer, probe, clamp nucleic acid, pharmaceutical, etc. ) can be designed as appropriate.
  • the binding force with the complementary strand can be reduced, for example, a double-stranded nucleic acid such as siRNA that promotes dissociation in vivo , as a clamp nucleic acid having a site that does not bind to a template in the clamp PCR method.
  • the oligonucleotide (6) may be in the form of a salt. That is, at least one nucleotide unit among the nucleotide units constituting the oligonucleotide (6) may be in the form of a salt.
  • the salt may or may not be a pharmaceutically acceptable salt.
  • the salt may be an inorganic salt or an organic salt. Examples of the salt include alkali metal salts, alkaline earth metal salts, other metal salts, ammonium salts, tetramethylammonium salts, amine salts, inorganic acid salts, and organic acids, as well as the salts exemplified for compound (1). Salts, amino acid salts and the like can be mentioned.
  • the oligonucleotide (6) may be modified with a labeling substance.
  • the labeling substance is not particularly limited, but may be a substance known in the art as a label to be imparted to nucleic acids, such as fluorescent substances, haptens (e.g., biotin, digoxigenin, DNP, etc.), and radioactive isotopes.
  • the oligonucleotide (6) has sequence specificity. Oligonucleotide (6) can be suitably used as a probe for inspecting the base sequence of single-stranded RNA or single-stranded DNA, or for sequence-selective detection.
  • Oligonucleotide (6) is resistant to nuclease degradation. Therefore, it is thought that they can exist in the living body for a long time after administration to the living body. Oligonucleotides (6) can, for example, inhibit transcription of mRNAs of pathogenic biocomponents (proteins) by forming a duplex with sense RNA. Oligonucleotides (6) can also inhibit the growth of infected viruses. Oligonucleotide (6) is useful as a drug, such as an antitumor agent and an antiviral agent, for treating diseases by inhibiting the action of genes.
  • Oligonucleotide (6) is stable and has excellent activity as an antisense or antigene or aptamer, or has excellent activity as a detection agent for a specific gene or as a primer for nucleic acid amplification.
  • Oligonucleotides (6) are various physiologically and biologically active substances, pharmaceutical materials, functional materials of double-stranded oligonucleotides for RNA interference method and decoy method, DNA targeting single-stranded nucleic acids such as cDNA Functional materials such as chips and molecular beacons, various antisense methods (including ribozymes and DNAzymes), antigen methods and functional materials for genome editing such as crispr-cas9, fluorescent and luminescent substances It is useful as a material for high-sensitivity analysis of biological trace components in combination with , and as a material for developing reagents for research such as elucidation of gene functions.
  • Method for producing oligonucleotide (6) can be synthesized according to a conventional method such as a phosphoramidite protocol.
  • the method for producing oligonucleotide (6) comprises (I) the following formula (6B): (In the formula, R 2a is an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted alkenyl group, an optionally substituted cycloalkyl group, or an optionally substituted a cycloalkenyl group, an optionally substituted aryl group, a hydroxy-protecting group, a substituted phosphino group, an optionally substituted dihydroxyphosphinyl group, or a substituted a hydroxymercaptophosphinyl group that may be Base, X 1 , X 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , Z 1 and Z 2 are the same as above) A compound or a salt thereof represented by the following formulas (6C) to (10C
  • oligonucleotide (6) In the method for producing oligonucleotide (6), if necessary, intermediate products and final products are subjected to conventional methods such as concentration, recrystallization, silica gel column chromatography, gel filtration, ethanol precipitation, preparative HPLC, and the like. including the step of purifying by
  • compositions Comprising Oligonucleotides (6)
  • the compositions of the present invention contain oligonucleotides (6).
  • the composition may contain only one type of oligonucleotide (6), or may contain two or more types.
  • the composition can be in any form such as solid or liquid.
  • the composition may be a liquid containing oligonucleotides (6) and a solvent.
  • the solvent known solvents can be used, preferably halogenated hydrocarbon solvents (eg, dichloromethane), nitrile solvents (eg, acetonitrile), aromatic hydrocarbon solvents (eg, toluene, xylene), water is mentioned. Among these, water is more preferred, and water containing a buffer is more preferred.
  • buffers include trishydroxymethylaminomethane (Tris buffer), trishydroxymethylaminomethane-hydrochloric acid (Tris-HCl buffer), trishydroxymethylaminomethane-EDTA (TE buffer), sodium phosphate, 2-morpholinoethane.
  • MES sulfonic acid
  • ADA N-(2-acetamido)iminodiacetic acid
  • ACES piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), N-(2-acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid
  • colamin hydrochloride N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES), N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-methanesulfonic acid (TES), 2-[4 -(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES), acetamidoglycine, tricine, glycinamide, bicine and the like.
  • composition may further contain salt.
  • Salts include metal chlorides, examples of which include NaCl, MgCl2 , KCl, and the like.
  • the composition may further contain additives and co-solvents.
  • additives and co-solvents examples may include dimethylsulfoxide (DMSO), glycerol, formamide, bovine serum albumin, ammonium sulfate, polyethylene glycol (PEG), gelatin, nonionic surfactants.
  • nonionic surfactants include Tween 20 (registered trademark) and Triton X-100 (registered trademark).
  • the composition may be, for example, oligonucleotide (6) supported on a solid phase carrier.
  • Solid phase carriers include inorganic materials and organic materials capable of supporting biopolymers. Glass (eg, porous glass (CPG)), silica gel, and resin (eg, crosslinked non-swelling polystyrene resin (HPS)) are preferred. Among these, HPS and CPG are more preferable.
  • the composition is usually housed in a container and provided to the user.
  • the composition can be used for amplification or detection of target nucleic acids, strand invasion, RNAi, etc., which will be described later. Also, the composition can be used as a pharmaceutical composition.
  • the present invention includes methods for detecting target nucleic acids. Each step of the method is preferably performed in vitro. This method (I) selectively amplifying the target nucleic acid by a nucleic acid amplification method; and (II) detecting the target nucleic acid amplified in step (I).
  • the oligonucleotide used for amplification or detection comprises oligonucleotide (6).
  • a plurality of primer molecules are usually used in the nucleic acid amplification of step (I). At least a portion of the plurality of primer molecules may be oligonucleotides (6). For example, a forward primer containing oligonucleotide (6) and a reverse primer not containing oligonucleotide (6) are used. A plurality of primer molecules and probe molecules may be used in the nucleic acid amplification of step (I). In this case, at least part of the primer molecules and probe molecules may be oligonucleotides (6). For example, a forward primer without oligonucleotide (6), a reverse primer without oligonucleotide (6) and a probe with oligonucleotide (6) are used.
  • the nucleic acid amplification method is not particularly limited as long as it can selectively amplify the target nucleic acid.
  • nucleic acid amplification methods include PCR methods (hot start PCR method, multiplex PCR method, nested PCR method, RT-PCR method, real-time PCR method, digital PCR method, TaqMan (registered trademark) PCR method, clamp PCR method, etc. ), NASBA method (see US Pat. No. 5,130,238), TMA method (see US Pat. No. 5,399,491), TRC method (see US Patent Application Publication No. 2001/0053518), LAMP method (see US Pat. No. 6,410,278), the ICAN method (see US Patent Application Publication No. 2003/073081), the LCR method (see European Patent Application No. 320328), the SDA method (see US Pat. No. 5,455,166). ) and the like.
  • the nucleic acid amplification method of step (I) is preferably clamp PCR method.
  • At least a primer and a clamp nucleic acid are used in the clamp PCR method.
  • Either or both of the primer and clamp nucleic acids may contain oligonucleotides (6).
  • Clamp nucleic acids typically clamp non-target nucleic acids (eg, wild-type genes) in a test sample more strongly than target nucleic acids (eg, mutant genes).
  • a target nucleic acid can be selectively amplified by strongly binding a clamp nucleic acid to a non-target nucleic acid and inhibiting amplification of the non-target nucleic acid.
  • amplification of the wild-type nucleic acid is inhibited by performing nucleic acid amplification in the presence of a clamp nucleic acid having a base sequence completely complementary to the wild-type gene sequence
  • Mutant nucleic acids are selectively amplified.
  • the target site of the target nucleic acid is the mutation site of the mutant gene and the base sequence containing this mutation site (the target site of the target nucleic acid) is "sequence A”
  • the clamp nucleic acid is a non-target It is completely complementary to the base sequence corresponding to sequence A in the wild-type gene, which is a nucleic acid.
  • Oligonucleotide (6) has sequence selectivity.
  • the clamp nucleic acid containing oligonucleotide (6) has weak binding ability to a base sequence that differs even by one base, and can specifically bind to a completely complementary base sequence.
  • the length of the clamp nucleic acid is not particularly limited, it is, for example, 5 to 30 mer.
  • the nucleic acid amplification in step (I) may be a reverse transcription reaction.
  • cDNA is synthesized by RNA-dependent DNA polymerase using RNA as a template. Since oligonucleotide (6) binds to RNA, specific RNA in the test sample and oligonucleotide (6) can be bound to inhibit the reverse transcription reaction from the RNA. Thereby, cDNA can be synthesized more specifically from the target RNA.
  • the synthesized cDNA may be further amplified by the PCR method or the like.
  • the target nucleic acid may be contained in the test sample.
  • a test sample is typically a sample collected from a living body (hereinafter also referred to as a “biological sample”).
  • a sample obtained from a sample collected from a living body by pretreatment such as removal of contaminants, extraction/purification of nucleic acid, and preamplification is used.
  • blood, plasma, serum, pleural effusion, bronchial lavage, bone marrow fluid, lymph, intestinal lavage, excised tissue, nasopharyngeal swab, saliva, nasal discharge, sputum, and the like can be used. Samples obtained by subjecting these to the above-described pretreatment are also included in the "biological sample”.
  • the method of the present invention can detect nucleic acids with extremely high sensitivity, for example, using excised tissue in which normal cells and abnormal cells coexist, gene mutations derived from abnormal cells can be detected.
  • the method of the present invention can also be suitably used when the amount of the test sample is very small, or when the amount of nucleic acid in the test sample is very small.
  • the test sample is a solution containing the target nucleic acid.
  • cells may be solubilized by a known method.
  • test samples such as excrement, sewage, river water, seawater, soil, and samples obtained by subjecting these to the above-described pretreatment can be used. Examples of excreta include urine and feces.
  • a target nucleic acid may be DNA or RNA.
  • DNA may be cDNA synthesized from RNA by reverse transcription reaction.
  • a target nucleic acid can be a gene, a specific region on genomic DNA such as the promoter region of a gene.
  • the detection method of the present invention can be used to detect mutations, polymorphisms, etc. at target sites of target nucleic acids.
  • the detection methods of the invention can also be used for allele determination. It is possible to detect what types of alleles are contained in the test sample.
  • the detection method of the present invention can also be used to detect methylation. By applying the detection method of the present invention after treating the target nucleic acid with bisulfite, the presence or absence of methylated cytosine in the target nucleic acid can be detected.
  • a gene containing a mutation (hereinafter referred to as a mutant gene) has a difference, ie, a mutation, from the base sequence of the wild-type gene. Such differences are due to one or more mutations selected from the group consisting of substitutions, insertions, deletions, inversions, duplications, and translocations, or combinations thereof. Such differences may typically be related to the development and/or susceptibility to treatment of particular diseases.
  • “onset” includes not only the actual onset of the disease but also the risk of onset.
  • therapeutic sensitivity includes not only the response rate of treatment with drugs and the like, but also the intensity of side effects. Examples of the disease include, but are not limited to, cancer, myelodysplastic syndrome, infectious disease, and the like.
  • a preferred example of the above diseases is cancer.
  • Preferred examples of the gene include ABL/BCR fusion gene, HER2 gene, EGFR gene, c-KIT gene, KRAS gene, BRAF gene, PIK3CA gene, FLT3 gene, MYC gene, MYCN gene, MET gene, BCL2 gene, or Examples include the EML4/ALK fusion gene.
  • the amplified nucleic acid can be detected by a known method depending on the nucleic acid amplification method described above.
  • Amplification can be detected qualitatively or quantitatively, for example, by detecting the fluorescence emitted from the reaction solution or the turbidity of the reaction solution.
  • the base sequence analysis method etc. are illustrated as a method of detecting the amplified target nucleic acid.
  • the target nucleic acid can be detected by analyzing the base sequence of the amplified target nucleic acid using a known sequence analyzer (sequencer).
  • the method for detecting the target nucleic acid in the test sample for example, the method described in US Patent Application Publication No. 2015/240299 can be adopted.
  • the present invention includes a method of detecting a target nucleic acid in a test sample, comprising reacting a probe containing an oligonucleotide (6) and a label with a test sample containing the target nucleic acid.
  • the detection method include in situ hybridization and microarray.
  • an oligonucleotide (6) labeled with a fluorescent dye or the like is hybridized with the target nucleic acid in the test sample (e.g., cell), and the target nucleic acid in the test sample is detected by measuring the label. can be detected.
  • a microarray When a microarray is used as the detection method, a microarray on which probes containing the oligonucleotide (6) are immobilized is reacted with a test sample containing the target nucleic acid, and hybridization between the target nucleic acid and the probe is detected to detect the target nucleic acid. can be detected.
  • oligonucleotide (6) it is possible to sequence-selectively detect the target nucleic acid in the test sample.
  • Kit for detecting or selectively amplifying a target nucleic acid comprises an oligonucleotide (6). Note that the target nucleic acid may be contained in, for example, a test sample.
  • oligonucleotides (6) can be used as primers, probes and/or clamp nucleic acids in the amplification and/or detection of target nucleic acids, as described above.
  • Primers, probes and/or clamp nucleic acids can be appropriately designed according to the base sequences of target nucleic acids and non-target nucleic acids.
  • a kit of one embodiment includes primers and/or probes. At least part of the primers and/or probes among these may be oligonucleotides (6).
  • FIG. 1A is a schematic diagram of an example of a kit including a container housing a composition containing primers and probes.
  • the kit 11 includes an outer box 12, a container support provided in the outer box 12 and having a recess formed on the surface, a container 13 attached to the recess and containing a composition containing a primer and a probe, and an attached document 14;
  • the package insert 14 can describe how to handle the kit 11, storage conditions, expiration date, and the like.
  • FIG. 1B is a schematic diagram of an example of a kit including a container containing a composition containing primers and a container containing a composition containing probes.
  • the kit 21 includes an outer box 22, a container support provided in the outer box 22 and having a first concave portion and a second concave portion formed on the surface thereof with a longitudinal interval therebetween, and the first concave portion.
  • a container 23a attached to the second recess and containing a composition including a primer
  • a container 23b attached to the second recess and containing a probe;
  • a kit of another embodiment includes forward primers, reverse primers and probes. At least some of these may be oligonucleotides (6).
  • the composition comprising the forward primer, the composition comprising the reverse primer, and the composition comprising the probe may all be contained in the same container (e.g., a kit as shown in FIG. 1A), or any or two may be contained in the same container (eg, a kit as shown in FIG. 1B), or all three may be contained in separate containers.
  • FIG. 1C is a schematic diagram of an example of a kit including a container containing a composition containing a forward primer, a container containing a composition containing a reverse primer, and a container containing a composition containing a probe.
  • the kit 31 includes an outer box 32, a container support provided in the outer box 32 and having first to third recesses formed on the surface at intervals along the longitudinal direction, and the first recess.
  • a kit of another embodiment includes clamp nucleic acids and primers. At least some of these may be oligonucleotides (6).
  • the kit can be a kit for selectively amplifying target nucleic acids.
  • a composition comprising a clamp nucleic acid and a composition comprising a primer may be housed in the same container (eg, a kit as shown in FIG. 1A) or may be housed in separate containers (eg, kit as shown in FIG. 1B).
  • a kit of yet another embodiment includes clamp nucleic acids, primers and probes. At least some of these may be oligonucleotides (6).
  • the composition comprising the clamp nucleic acid, the composition comprising the primers, and the composition comprising the probes may all be housed in the same container (e.g., a kit as shown in FIG. 1A), or either The two may be contained in the same container (eg, a kit as shown in FIG. 1B) or all three may be contained in separate containers (eg, a kit as shown in FIG. 1C). kit).
  • the kit may contain DNA polymerase, deoxynucleoside triphosphates (dNTPs), reaction buffers, salts, restriction enzymes, and the like.
  • dNTPs deoxynucleoside triphosphates
  • the present invention includes the use of oligonucleotides (6) for detecting or selectively amplifying target nucleic acids.
  • Oligonucleotides (6) used here have, for example, the same characteristics as oligonucleotides (6) contained in the kit.
  • composition (or formulation) of the present invention contains compound (1) or oligonucleotide (6).
  • Pharmaceutical compositions (or formulations) containing compound (1) include, for example, low-molecular drugs such as AZT (azidothymidine), which is a Nucleoside Analogue Reversetranscriptase Inhibitor (NRTI).
  • Pharmaceutical compositions (or formulations) containing oligonucleotide (6) include, for example, antisense, siRNA (small interfering RNA), aptamers, decoy nucleic acids, middle molecules such as CpG oligonucleotides, or high molecular weight nucleic acid drugs. mentioned.
  • compositions include liquid preparations (e.g., injections, eye drops, nasal drops, suspensions, etc.), solid preparations (e.g., tablets, granules, powders, etc.), semi-solid preparations (e.g., ointments, suppositories, etc.). agent, etc.), or other formulations known to those skilled in the art.
  • compositions are parenteral administration agents (eg, subcutaneous administration agents, intravenous administration agents, intranasal administration agents, intrathecal administration agents, intracerebroventricular administration agents, vitreous administration agents, etc.).
  • parenteral administration agents eg, subcutaneous administration agents, intravenous administration agents, intranasal administration agents, intrathecal administration agents, intracerebroventricular administration agents, vitreous administration agents, etc.
  • Other suitable examples of pharmaceutical compositions are topical formulations.
  • a pharmaceutical composition usually further comprises a pharmaceutically acceptable carrier or additive.
  • Carriers include solid carriers and liquid carriers.
  • solid carriers include starch, lactose, calcium sulfate dihydrate, sucrose, talc, gelatin, agar, pectin, gum arabic, magnesium stearate, stearic acid, atelocollagen and the like.
  • liquid carriers include water (including saline) and the like.
  • Additives include stabilizers, examples of which include paraoxybenzoic acid esters such as methylparaben and propylparaben; alcohols such as benzyl alcohol; benzalkonium chloride; phenols such as phenol and cresol). be done.
  • Oligonucleotides (6) have sequence selectivity and are not susceptible to degradation by nucleases. Therefore, a pharmaceutical composition (or formulation) containing compound (1) or oligonucleotide (6) can act by sequence-selectively capturing a target (eg, target gene) in the body.
  • a target eg, target gene
  • the reaction mixture was cooled, quenched with water, and separated into an organic layer and an aqueous layer.
  • the aqueous layer was extracted with dichloromethane, and the organic layer obtained in the first fractionation and the organic layer obtained in the extraction were combined, washed with saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was removed under reduced pressure. Evaporation gave the intermediate.
  • the reaction mixture was cooled, quenched with water, diluted with ethyl acetate, and separated into an organic layer and an aqueous layer.
  • the aqueous layer is extracted with ethyl acetate, the organic layer obtained in the first fractionation and the organic layer obtained in the extraction are combined, washed with saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent is removed. It was distilled off under reduced pressure.
  • the aqueous layer was extracted with ethyl acetate, the organic layer obtained from the first fractionation and the organic layer obtained from the extraction were combined, washed successively with saturated aqueous sodium bicarbonate and saturated brine, and then washed with anhydrous sodium sulfate.
  • the intermediate was obtained by drying with a vacuum and distilling off the solvent under reduced pressure. Subsequently, the resulting intermediate was azeotropically dried with acetonitrile and dissolved in acetonitrile (53 mL) under a nitrogen stream.
  • Thymine (1.07 g, 8.50 mmol) and N,O-bis(trimethylsilyl)acetamide were sequentially added and stirred at 50°C for 15 minutes. Subsequently, trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate (1.2 mL, 6.90 mmol) was added and the mixture was heated under reflux for 2 hours. The reaction solution was ice-cooled, the reaction was stopped with saturated aqueous sodium bicarbonate solution, diluted with ethyl acetate, and the organic layer was fractionated. The obtained organic layer was washed with saturated brine, dried over anhydrous sodium, and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • 4,5-dicyanoimidazole (30 mg, 0.25 mmol) and 2-cyanoethyl N,N,N',N'-tetraisopropylphosphorodiamidite (95 ⁇ L, 0.29 mmol) were added at room temperature, and an additional 1.5 Stirred for hours.
  • the mixture was diluted with ethyl acetate and the organic layer was fractionated. The organic layer was washed with water and saturated brine in that order, dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • the aqueous layer was extracted with ethyl acetate, the organic layer obtained in the first fractionation and the organic layer obtained in the extraction were combined, washed successively with saturated aqueous sodium bicarbonate and saturated brine, and washed with anhydrous sodium sulfate.
  • the intermediate was obtained by drying with a vacuum and distilling off the solvent under reduced pressure. Subsequently, the resulting intermediate was azeotropically dried with acetonitrile and dissolved in acetonitrile (250 mL) under a nitrogen stream.
  • Thymine (5.48 g, 43.47 mmol) and N,O-bis(trimethylsilyl)acetamide (31.6 mL, 127.9 mmol) were sequentially added and stirred at 50°C for 30 minutes. Subsequently, trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate (6.2 mL, 35.80 mmol) was added and the mixture was heated under reflux for 2 hours. The reaction solution was ice-cooled, the reaction was stopped with saturated aqueous sodium bicarbonate solution, diluted with ethyl acetate, and the organic layer was fractionated. The obtained organic layer was washed with saturated brine, dried over anhydrous sodium, and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • the aqueous layer is extracted with ethyl acetate, and the organic layer obtained from the first fractionation and the organic layer obtained from the extraction are combined, washed with 1N hydrochloric acid and saturated brine in that order, and dried over anhydrous sodium. and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • intermediate B-5 was dissolved in pyridine (157 mL), 40% methylamine methanol solution (97 mL, 947 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 24 hours, at 60°C for 4 hours, and at room temperature for 13 hours. The mixture was stirred at 60° C. for 3 hours. After the solvent was distilled off under reduced pressure until the volume of the reaction solution was reduced to half, the solution was diluted with saturated brine and ethyl acetate, and the organic layer was fractionated.
  • the resulting intermediate B-8 was dissolved in pyridine (23 mL), acetic anhydride (764 ⁇ L, 8.08 mmol) and 4-dimethylaminopyridine (33 mg, 0.27 mmol) were added in that order, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. .
  • the reaction solution was ice-cooled, and the reaction was stopped with saturated aqueous sodium bicarbonate, diluted with ethyl acetate and water, filtered through celite, the filtrate was collected, and the organic layer was fractionated. The obtained organic layer was washed with saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • Oligonucleotides were synthesized using the compounds (A( ⁇ )-12, A( ⁇ )-12, B-13, C-8, C-17) obtained in the above synthetic examples, using a standard phosphoramidite protocol. The following oligonucleotides were obtained by synthesizing with an automatic nucleic acid synthesizer (Expedite (trademark) 8909/manufactured by ABI) according to the procedure.
  • Exadite automatic nucleic acid synthesizer
  • Base is a thymin-1-yl group
  • X 1 is a hydrogen atom
  • X 2 is a methoxy group
  • R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are hydrogen atoms
  • Z 1 is O
  • Z 2 is a single bond
  • an ⁇ -form unit hereinafter referred to as (A) ⁇ -T:
  • (A) ⁇ -T modified oligonucleotide an oligonucleotide containing at least one (A) ⁇ -T is referred to as "(A) ⁇ -T modified oligonucleotide”.
  • Base is a thymin-1-yl group
  • X 1 is a hydrogen atom
  • X 2 is a methoxy group
  • R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are hydrogen atoms
  • Z 1 is O
  • Z 2 is a single bond
  • a ⁇ -form unit hereinafter referred to as (A) ⁇ -T:
  • (A) ⁇ -T modified oligonucleotide an oligonucleotide containing at least one (A) ⁇ -T is referred to as "(A) ⁇ -T modified oligonucleotide”.
  • Base is a thymin-1-yl group
  • X 1 is a hydrogen atom
  • X 2 is a methoxy group
  • R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are hydrogen atoms
  • Z 1 is NZ 11
  • Z 11 is a methyl group
  • Z 2 is CZ 21 Z 22
  • Z 21 and Z 22 are hydrogen atoms
  • a ⁇ -form unit hereinafter referred to as (B) ⁇ -T):
  • (B) ⁇ -T an oligonucleotide containing at least one (B) ⁇ -T is referred to as "(B) ⁇ -T modified oligonucleotide”.
  • Base is a thymin-1-yl group
  • X 1 is a hydrogen atom
  • X 2 is a hydrogen atom
  • R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are hydrogen atoms
  • Z 1 is O
  • Z 2 is CZ 21 Z 22
  • Z 21 and Z 22 are hydrogen atoms
  • a ⁇ -form unit hereinafter referred to as (C)H ⁇ -T:
  • (C)H ⁇ -T oligonucleotide containing at least one (C)H ⁇ -T is referred to as "(C)H ⁇ -T modified oligonucleotide”.
  • Base is an adenine-9-yl group
  • X 1 is a hydrogen atom
  • X 2 is a hydrogen atom
  • R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are hydrogen atoms
  • Z 1 is O
  • Z 2 is CZ 21 Z 22
  • Z 21 and Z 22 are hydrogen atoms
  • a ⁇ -form unit hereinafter referred to as (C)H ⁇ -A:
  • (C)H ⁇ -A an oligonucleotide containing at least one (C)H ⁇ -A is referred to as "(C)H ⁇ -A modified oligonucleotide”.
  • the 5′-end of the oligonucleotide protected with a dimethoxytrityl group and supported on the solid phase was cut out from the column with 28% aqueous ammonia (1.5 hours), and the cut-out oligonucleotide was obtained. All protective groups were deprotected by reacting in 28% aqueous ammonia at 60° C. for 16 hours.
  • Oligonucleotides of the present invention ((A) ⁇ -T modified oligonucleotide, (A) ⁇ -T modified oligonucleotide, (B) ⁇ -T modified oligonucleotide, (C) H ⁇ - T-modified oligonucleotide) (antisense strand) and single-stranded DNA (5'-d(agcaaaaacgc)-3'; SEQ ID NO: 7 (sense strand)) or single-stranded RNA (5'-r(agcaaaaaacgc)- The ability of the antisense strand to form a duplex was examined by measuring the melting temperature (Tm) with 3'; SEQ ID NO: 8 (sense strand)).
  • DNA-T a unit (T) (hereinafter referred to as "DNA-T”), which is a unit represented by the formula (7) and in which Base is a thymin-1-yl group and Ra is H, Oligonucleotides synthesized so as to be located at the x position of the antisense strand in Tables 2 and 3 (hereinafter referred to as "DNA-T oligonucleotides”), and units represented by formula (9) Synthesized by incorporating a unit in which Base is a thymin-1-yl group and R b is Me (hereinafter referred to as "NMe-T”) at the x position of the antisense strand in Tables 2 and 3.
  • NMe-T a unit represented by the formula (7) and in which Base is a thymin-1-yl group and Ra is H
  • a modified oligonucleotide (hereinafter referred to as "NMe-T modified oligonucleotide”) was prepared as an antisense strand.
  • a sample solution 120 ⁇ l was prepared with a final concentration of 100 mM sodium chloride, 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.2), 4 ⁇ M antisense strand, and 4 ⁇ M sense strand, and heated from 0°C or 15°C to 110°C. The temperature was raised at 5° C./min, and the absorbance at 260 nm was measured at intervals of 0.5° C. with a spectrophotometer (UV-1800 or UV-1900 manufactured by Shimadzu Corporation). The Tm value was calculated from the obtained measured value by a differentiation method. The results are shown in Tables 2 and 3.
  • Tm value Duplex formation ability
  • Oligonucleotides ((B) ⁇ -T modified oligonucleotides, (C) H ⁇ -T modified oligonucleotides) modified with the compounds (B-13, C-8) of the present invention (represented by SEQ ID NO: 1) antisense strand) has a superior ability to form a double strand with single-stranded DNA than with single-stranded RNA. Therefore, it is suitable as a material for DNA-selective nucleic acid medicine (antigene) and genetic diagnosis.
  • the more the monomer units of the present invention ((A) ⁇ -T, (A) ⁇ -T, (B) ⁇ -T, (C) H ⁇ -T) in the oligonucleotide, the stronger the binding force with the complementary strand. confirmed a downward trend.
  • double-stranded nucleic acid drugs such as siRNA that need to be dissociated in vivo
  • (A) ⁇ -T, (A) ⁇ -T, (B) ⁇ - T or (C) H ⁇ -T-containing clamp oligonucleotides are expected to be used in genetic testing by clamp PCR.
  • Enzymatic Reaction Oligonucleotide No. For 1 to 9, operations ((1) to (3) below) were performed at a temperature of 37° C. using an apparatus (BIO RAD, T100). (1) Enzyme CAVP (Crotalus adamanteus Venom phosphodiesterase I) was added to a final concentration of 2.0 ⁇ g/mL to initiate the reaction. (2) At the end of the reaction time, EDTA was added so that the concentration of the reaction solution became 5.0 mM to terminate the reaction. (3) The reaction time was 0, 10, 20, 40 and 80 minutes.
  • the oligonucleotide (6) of the present invention had superior enzyme resistance compared to natural and conventional non-natural oligonucleotides.
  • Oligonucleotides modified with the compounds of the present invention or their salts (monomer units) have higher enzyme resistance than natural and conventional non-natural oligonucleotides, and have sufficient functionality as materials for nucleic acid medicine and genetic testing. are doing.
  • the compound of the present invention or a salt thereof can be used as a material for DNA-selective nucleic acid medicine (antigene).
  • a double-stranded nucleic acid such as siRNA that promotes in vivo dissociation by using an oligonucleotide modified with a plurality of the compounds of the present invention or salts thereof (monomer units) to reduce the binding force with complementary strands. It is expected to be used as a material for highly sensitive genetic testing such as pharmaceuticals and clamp PCR methods.

Abstract

下記式（１）で表される化合物又はその塩に由来する単位を有する人工核酸が提供される：（式中、Ｂａｓｅは、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、又は置換基を有していてもよい芳香族炭化水素環基であり、Ｘ１は、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、Ｘ２は、水素原子、又は－ＯＲ７であり、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ７は、同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルケニル基、置換基を有していてもよいアリール基、ヒドロキシ基の保護基、置換基を有するホスフィノ基、置換基を有していてもよいジヒドロキシホスフィニル基、又は置換基を有していてもよいヒドロキシメルカプトホスフィニル基であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、Ｚ１は、Ｏ又はＮＺ１１であり、Ｚ１１は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、又はアミノ基の保護基であり、Ｚ２は、単結合又はＣＺ２１Ｚ２２であり、Ｚ２１及びＺ２２は、同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基である）。

Description

新規人工核酸、その製造方法及び用途
　本発明は、新規人工核酸、その製造方法及び用途等に関する。
　オリゴヌクレオチドは、天然ＤＮＡ若しくは天然ＲＮＡ又は人工核酸の短い配列であり、様々な遺伝子の転写及び翻訳レベルにおいて遺伝子の発現を調節したり、遺伝子の配列状況を検査したりすることで特定の疾患を治療或いは診断するために大変有用であることが明らかにされてきている。
　遺伝子の発現を調節したり遺伝子情報を検査・診断したりする手法は、標的により二種類に大別できる。第一は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）やマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のように標的が一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡの場合であり、第二は、標的が二重鎖ゲノムＤＮＡの場合である。
　標的が一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡの場合、オリゴヌクレオチドが一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡと相補的に結合して二重鎖を形成するアンチセンス法により遺伝子の翻訳過程を阻害（あるいは遺伝子診断）することが可能である。また、オリゴヌクレオチドが二重鎖ＲＮＡ分子である場合、オリゴヌクレオチドの標的ｍＲＮＡとの相補的結合は、ＲＩＳＣ複合体の「スライサー」酵素により標的ｍＲＮＡの分解を引き起す（ＲＮＡ干渉法）。ＲＮＡ干渉法の場合、オリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ領域（３’非翻訳領域）と結合して不完全な相補性の効力により標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる内因性マイクロＲＮＡと同等のオリゴヌクレオチドであり得る（マイクロＲＮＡミミックス）。
　オリゴヌクレオチドは、例えば、長いアンチセンス非コーディングＲＮＡと相補的に結合することにより、あるいは相補的マイクロＲＮＡを阻害することにより、遺伝子の活性化又はこれの転写の増加を誘導し得、結果としてマイクロＲＮＡの標的ｍＲＮＡの翻訳を増加することもできる（アンチマイクロＲＮＡ）。
　遺伝子の発現を調節したり遺伝子情報を検査・診断したりする手法に用いられる機能性材料としてのオリゴヌクレオチドには、標的核酸との配列特異的で優れた結合親和性や分解酵素に対する強い抵抗性や生体内での安全性などの特性が求められる。天然素材のＤＮＡやＲＮＡは分解酵素への抵抗性に乏しく、結合親和性も十分でなく、機能性素材として不適である。そのため、これまでにオリゴヌクレオチドの高機能化を目指して数多くの人工核酸が開発されてきた。
　人工核酸の代表的なものとして、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、架橋構造型核酸、モルフォリノ核酸（ＰＭＯ）とともに、核酸のリン酸ジエステル部の非結合酸素原子一つを硫黄原子で置換したホスホロチオエート型核酸（Ｓオリゴヌクレオチド）等を挙げることができる。
　前記人工核酸のうち、スピロ環を有する人工核酸としては、例えば下記の３種類が知られている（非特許文献１及び２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
Bioorg. Med. Chem. 31 (2021) 115966 第71回 日本薬学会 関西支部総会・大会 講演要旨集
　オリゴヌクレオチドの用途の多様化が進む中で既開発の人工核酸の機能性にはまだまだ改善される余地が残されており、さらなる高機能化を目指した新規人工核酸の開発が求められている。
　本発明の目的は、様々なゲノムテクノロジーに有用な新規人工核酸、それらの製造方法及び用途等を提供することにある。
　本発明者らは、前記課題を達成するため鋭意検討した結果、１，７－ジオキサスピロ［４．４］ノナン骨格、１，７－ジオキサスピロ［４．５］デカン骨格、１－オキサ－７－アザスピロ［４．４］ノナン骨格、又は１－オキサ－７－アザスピロ［４．５］デカン骨格を有する新規人工核酸が、様々なゲノムテクノロジーに有用であることを見出した。本発明者らは、かかる知見に基づいて更に検討を重ねて本発明を完成した。
　本発明は、以下の態様を包含する。
［項１］
下記式（１）で表される化合物又はその塩：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （式中、
　Ｂａｓｅは、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、又は置換基を有していてもよい芳香族炭化水素環基であり、
　Ｘ１は、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
　Ｘ２は、水素原子、又は－ＯＲ７であり、
　Ｒ１、Ｒ２、及びＲ７は、同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルケニル基、置換基を有していてもよいアリール基、ヒドロキシ基の保護基、置換基を有するホスフィノ基、置換基を有していてもよいジヒドロキシホスフィニル基、又は置換基を有していてもよいヒドロキシメルカプトホスフィニル基であり、
　Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
　Ｚ１は、Ｏ又はＮＺ１１であり、
　Ｚ１１は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、又はアミノ基の保護基であり、
　Ｚ２は、単結合又はＣＺ２１Ｚ２２であり、
　Ｚ２１及びＺ２２は、同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基である）。
［項２］
Ｚ１がＯである、項１に記載の化合物又はその塩。
［項３］
Ｚ１がＮＺ１１であり、Ｚ２がＣＺ２１Ｚ２２である、項１に記載の化合物又はその塩。
［項４］
Ｚ１１が水素原子又はアルキル基である、項３に記載の化合物又はその塩。
［項５］
Ｚ２１及びＺ２２が、同一又は異なって、水素原子又はアルキル基である、項１～４のいずれかに記載の化合物又はその塩。
［項６］
Ｘ１が水素原子又はアルキル基である、項１～５のいずれかに記載の化合物又はその塩。
［項７］
Ｘ１が水素原子である、項１～６のいずれかに記載の化合物又はその塩。
［項８］
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６が、同一又は異なって、水素原子又はアルキル基である、項１～７のいずれかに記載の化合物又はその塩。
［項９］
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６が水素原子である、項１～８のいずれかに記載の化合物又はその塩。
［項１０］
Ｒ７が水素原子又はアルキル基である、項１～９のいずれかに記載の化合物又はその塩。
［項１１］
Ｒ１及びＲ２が、同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、式：－Ｓｉ(Ｒ８)３（式中、各Ｒ８は、同一又は異なって、アルキル基又はアリール基である）で表される基、式：－Ｐ(Ｒ９ａ)(Ｒ９ｂ)（式中、Ｒ９ａ及びＲ９ｂは、同一又は異なって、ヒドロキシ基、メルカプト基、アミノ基、アルコキシ基、ハロアルコキシ基、シアノアルコキシ基、アルキルチオ基、ハロアルキルチオ基、シアノアルキルチオ基、又はアルキルアミノ基である）で表される基、ジヒドロキシホスフィニル基、又はヒドロキシメルカプトホスフィニル基である、項１～１０のいずれかに記載の化合物又はその塩。
［項１２］
Ｂａｓｅが、置換基を有していてもよい２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－１－イル基、置換基を有していてもよい２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、置換基を有していてもよいプリン－９－イル基、又は置換基を有していてもよい６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル基である、項１～１１のいずれか一項に記載の化合物又はその塩。
［項１３］
項１～１２のいずれか一項に記載の化合物又はその塩を製造する方法であって、下記式（２）で表される化合物又はその塩を、式（２’）：Ｚ１１－ＮＨ２（式中、Ｚ１１は前記と同じである）で表されるアミンの存在下又は非存在下で環化する工程を含む方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （式中、Ｌ１はヒドロキシ活性化基であり、Ｌ２は水素原子又はヒドロキシ活性化基であり、Ｂａｓｅ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＺ２は、前記と同じである）。
［項１４］
下記式（６）で表される単位を有するオリゴヌクレオチド又はその塩：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （式中、
　Ｂａｓｅは、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、又は置換基を有していてもよい芳香族炭化水素環基であり、
　Ｘ１は、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
　Ｘ２は、水素原子、又は－ＯＲ７であり、
　Ｒ７は、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルケニル基、置換基を有していてもよいアリール基、ヒドロキシ基の保護基、置換基を有するホスフィノ基、置換基を有していてもよいジヒドロキシホスフィニル基、又は置換基を有していてもよいヒドロキシメルカプトホスフィニル基であり、
　Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
　Ｚ１は、Ｏ又はＮＺ１１であり、
　Ｚ１１は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、又はアミノ基の保護基であり、
　Ｚ２は、単結合又はＣＺ２１Ｚ２２であり、
　Ｚ２１及びＺ２２は、同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基である）。
［項１５］
標的核酸の検出方法であって、
（Ｉ）標的核酸を、核酸増幅法によって、選択的に増幅する工程、及び
（II）前記工程（Ｉ）で増幅された標的核酸を検出する工程
を含み、前記増幅又は検出に用いられるオリゴヌクレオチドが、項１４に記載のオリゴヌクレオチド又はその塩を含む、標的核酸の検出方法。
［項１６］
標的核酸を検出する、又は標的核酸を選択的に増幅するためのキットであって、
（ａ）プライマー及びプローブを含み、該プライマー及びプローブのうち少なくともいずれかが、項１４に記載のオリゴヌクレオチド又はその塩を含む、キット、又は
（ｂ）クランプ核酸及びプライマーを含み、該クランプ核酸及びプライマーのうち少なくともいずれかが、項１４に記載のオリゴヌクレオチド又はその塩を含む、キット。
［項１７］
項１～１２のいずれか一項に記載の化合物又はその塩、或いは、項１４に記載のオリゴヌクレオチド又はその塩を含有する組成物。
［項１８］
下記式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （式中、
　Ｂａｓｅは、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、又は置換基を有していてもよい芳香族炭化水素環基であり、
　Ｘ１は、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
　Ｘ２は、水素原子、又は－ＯＲ７であり、
　Ｒ１、Ｒ２、及びＲ７は、同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルケニル基、置換基を有していてもよいアリール基、ヒドロキシ基の保護基、置換基を有するホスフィノ基、置換基を有していてもよいジヒドロキシホスフィニル基、又は置換基を有していてもよいヒドロキシメルカプトホスフィニル基であり、
　Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
　Ｌ１は、ヒドロキシ活性化基であり、
　Ｌ２は、水素原子又はヒドロキシ活性化基であり、
　Ｚ２は、単結合又はＣＺ２１Ｚ２２であり、
　Ｚ２１及びＺ２２は、同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基である）
で表される化合物又はその塩。
［項１９］
下記式（４）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 （式中、
　Ｒ２は、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルケニル基、置換基を有していてもよいアリール基、ヒドロキシ基の保護基、置換基を有するホスフィノ基、置換基を有していてもよいジヒドロキシホスフィニル基、又は置換基を有していてもよいヒドロキシメルカプトホスフィニル基であり、
　Ｒ５、Ｒ６、ＲＸ、ＲＹ、及びＸ１は、同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
　Ｌ１は、ヒドロキシ活性化基である）
で表される化合物又はその塩。
　本発明によれば、様々なゲノムテクノロジーに有用である新規人工核酸を提供することができる。
図１Ａは、本発明のキットの一例であり、プライマー及びプローブを含む組成物を収容した容器を含むキットの模式図である。 図１Ｂは、本発明のキットの一例であり、プライマーを含む組成物を収容した容器と、プローブを含む組成物を収容した容器とを含むキットの模式図である。 図１Ｃは、本発明のキットの一例であり、フォワードプライマーを含む組成物を収容した容器と、リバースプライマーを含む組成物を収容した容器と、プローブを含む組成物を収容した容器とを含むキットの模式図である。 図２は、終濃度２．０μｇ／ｍＬのＣＡＶＰ（Crotalus adamanteus Venom ホスホジエステラーゼＩ）との反応時間と未消化オリゴヌクレオチドの残存率との関係を示すグラフである。
１．用語の定義
　本明細書において、「アルキル基」とは、直鎖又は分岐鎖状の飽和炭化水素から１個の水素原子を除いた一価の基をいう。
　アルキル基の炭素原子の数は、特に限定されるものではないが、例えば１～２０、好ましくは１～１０、更に好ましくは１～６、特に好ましくは１～４である。
　アルキル基の例としては、メチル基、エチル基、プロピル基（例：ｎ－プロピル基、ｉ－プロピル基）、ブチル基（例：ｎ－ブチル基、ｉ－ブチル基、ｓ－ブチル基、ｔ－ブチル基）、ペンチル基（例：ｎ－ペンチル基、ｉ－ペンチル基、ネオペンチル基）、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基（例：ｎ－オクチル基、２－エチルヘキシル基）、ノニル基、デシル基などが挙げられる。
　本明細書において、「アルキレン基」とは、直鎖又は分岐鎖状の飽和炭化水素から２個の水素原子を除いた二価の基をいう。
　アルキレン基の炭素原子の数は、特に限定されるものではないが、例えば１～１０、好ましくは１～８、更に好ましくは１～６である。
　アルキレン基の例としては、Ｃ１アルキレン基（例：メチレン基）、Ｃ２アルキレン基（例：メチルメチレン基、ジメチレン基）、Ｃ３アルキレン基（例：トリメチレン基、ジメチルメチレン基）、Ｃ４アルキレン基（例：テトラメチレン基）、Ｃ５アルキレン基（例：ペンタメチレン基）、Ｃ６アルキレン基（例：ヘキサメチレン基）などが挙げられる。
　本明細書において、「アルケニル基」とは、直鎖又は分岐鎖状であり、炭素－炭素二重結合を含む不飽和炭化水素から１個の水素原子を除いた一価の基をいう。
　アルケニル基の炭素原子の数は、特に限定されるものではないが、例えば２～２０、好ましくは２～１０、更に好ましくは２～６である。
　アルケニル基の例としては、エテニル基（即ち、ビニル基）、プロペニル基（例：１－プロペニル基、アリル基）、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、ゲラニル基、ファルネシル基などが挙げられる。
　本明細書において、「アルキニル基」とは、直鎖又は分岐鎖状であり、炭素－炭素三重結合を含む不飽和炭化水素から１個の水素原子を除いた一価の基をいう。
　アルキニル基の炭素原子の数は、特に限定されるものではないが、例えば２～２０、好ましくは２～１０、更に好ましくは２～６である。
　アルキニル基の例としては、エチニル基、プロパルギル基、１－ブチニル基などが挙げられる。
　本明細書において、「シクロアルキル基」とは、飽和脂肪族炭化水素環に由来する一価の基をいう。
　シクロアルキル基の炭素原子の数は、特に限定されるものではないが、例えば３～２０、好ましくは５～１２、更に好ましくは５～１０である。
　シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、ノルボルニル基、アダマンチル基などが挙げられる。
　本明細書において、「シクロアルケニル基」とは、炭素－炭素二重結合を含む不飽和脂肪族炭化水素環に由来する一価の基をいう。
　シクロアルケニル基の炭素原子の数は、特に限定されるものではないが、例えば３～２０、好ましくは５～１２、更に好ましくは５～１０である。
　シクロアルケニル基の例としては、シクロプロペニル基、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基、ノルボルネニル基、アダマンテニル基などが挙げられる。
　本明細書において、「芳香族炭化水素環基」とは、芳香族炭化水素環に由来する一価の基をいい、「アリール基」とも称する。
　芳香族炭化水素環の構成原子の数は、特に限定されるものではないが、例えば６～２０、好ましくは６～１４、更に好ましくは６～１２、特に好ましくは６～１０である。
　芳香族炭化水素環は、単環であってもよく、縮合環（例：二乃至三環式縮合環）であってもよい。
　芳香族炭化水素環基の例としては、フェニル基、インデニル基、ナフチル基、フルオレニル基、フェナントレニル基、アントラセニル基などが挙げられる。
　本明細書において、「複素環」は、「脂肪族複素環」及び「芳香族複素環」を包含する意味で用いられる。
　本明細書において、「脂肪族複素環」とは、環の構成原子として、炭素原子、及び、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、ケイ素原子等からなる群から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を含む脂肪族環をいう。
　脂肪族複素環の構成原子の数は、特に限定されるものではないが、例えば５～２０、好ましくは５～１２、更に好ましくは６～１０である。
　脂肪族複素環の構成原子のうち、ヘテロ原子の数は、特に限定されるものではないが、例えば１～４である。
　脂肪族複素環の例としては、含酸素脂肪族複素環（例：テトラヒドロフラン、ジオキソラン、ピラン、テトラヒドロピラン、ジオキサン）、含硫黄脂肪族複素環（例：テトラヒドロチオフェン、チオピラン、テトラヒドロチオピラン）、含窒素脂肪族複素環（例：ピロリジン、ピペリジン、アゼパン）、含窒素及び酸素脂肪族複素環（例：モルホリン）、含窒素及び硫黄脂肪族複素環（例：チオモルホリン）、シロキサン結合を含有する脂肪族複素環などが挙げられる。
　本明細書において、「芳香族複素環」とは、環の構成原子として、炭素原子、及び、窒素原子、酸素原子、硫黄原子等からなる群から選択される少なくとも一つのヘテロ原子を含む芳香族環をいう。
　芳香族複素環の構成原子の数は、特に限定されるものではないが、例えば５～２０、好ましくは５～１２、更に好ましくは５～１０である。
　芳香族複素環の構成原子のうち、ヘテロ原子の数は、特に限定されるものではないが、例えば１～４である。芳香族複素環の構成原子のうち、炭素原子の数は、特に限定されるものではないが、例えば１～１０である。
　芳香族複素環は、単環であってもよく、縮合環（例：二乃至三環式縮合環）であってもよい。
　芳香族複素環の例としては、含酸素芳香族複素環（例：フラン、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、クロメン、ベンゾピラン、キサンテン）、含硫黄芳香族複素環（例：チオフェン、チアントレン）、含窒素芳香族複素環（例：ピロール、イミダゾール、ピラゾール、トリアゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドール、イソインドール、インドリジン、プリン、キノリン、イソキノリン、１，８－ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、フタラジン、プテリジン、カルバゾール、フェナントリジン、アクリジン、ペリミジン、フェナジン）、含酸素及び硫黄芳香族複素環（例：フェノキサチイン）、含窒素及び酸素芳香族複素環（例：オキサゾール、イソオキサゾール、フラザン、フェノキサジン）、含窒素及び硫黄芳香族複素環（例：チアゾール、イソチアゾール、フェノチアジン）などが挙げられる。
　本明細書において、「複素環基」とは、前記複素環から１個の水素原子を除いた一価の基をいう。「芳香族複素環基」とは、前記芳香族複素環から１個の水素原子を除いた一価の基をいい、「ヘテロアリール基」とも称する。
　本明細書において、「置換基を有していてもよい」又は「置換基で置換されていてもよい」とは、置換基を有しない場合、及び、任意の水素原子に代えて１個の置換基、又は２個以上の同種もしくは異種の置換基を有する場合の両方を含む意味で用いられる。なお、置換基を有する場合、置換基の数は、１から置換可能な最大数までの範囲から選択することができ、特に限定されるものではないが、例えば１～３、好ましくは１又は２である。
　本明細書において、「置換基」とは、水素原子に代わる原子又は原子団をいう。置換基の例としては、ハロゲン原子（例：フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）、オキソ基（＝Ｏ）、チオキソ基（＝Ｓ）、ヒドロキシ基、メルカプト基、アミノ基、カルボキシ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アリール基、アシル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、シアノ基、複素環基、これら２種以上の組合せ（例：ハロアルキル基、シアノアルキル基、アラルキル基、アルコキシ基、アルキルアミノ基）などが挙げられる。
　なお、「２種以上の組合せ」は、各々の置換基として例示した基の任意の組合せを包含する。
　本明細書において、「Ｃｘ－ｙ」とは、後続の基の炭素原子の数がｘ以上ｙ以下であることをいう。ｘ及びｙは正の整数であり、ｘ＜ｙである。
　本明細書において、「ハロアルキル基」は、１個又は２個以上の同種もしくは異種のハロゲン原子で置換されたアルキル基をいう。
　ハロアルキル基の好適な例は、Ｃ１－６ハロアルキル基であり、より好適な例は、Ｃ１－４ハロアルキル基であり、更に好適な例は、トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基、又は２，２，２－トリフルオロエチル基である。
　本明細書において、「シアノアルキル基」は、１個又は２個以上のシアノ基で置換されたアルキル基をいう。
　シアノアルキル基の好適な例は、Ｃ１－６シアノアルキル基であり、より好適な例は、Ｃ１－４シアノアルキル基であり、更に好適な例は、シアノメチル基又は２－シアノエチル基が挙げられる。
　本明細書において、「アラルキル基」は、１個又は２個以上の同種もしくは異種のアリール基で置換されたアルキル基をいう。
　アラルキル基の好適な例は、Ｃ６－１４アリールＣ１－４アルキル基であり、より好適な例は、フェニルメチル基（即ち、ベンジル基）、フェニルエチル基（即ち、フェネチル基）、ナフチルメチル基、ナフチルエチル基、トリフェニルメチル基（即ち、トリチル基）、又はフルオレニルメチル基である。
　本明細書において、「アルコキシ基」は、式：－Ｏ－アルキルで表される基をいう。　アルコキシ基の好適な例は、Ｃ１－６アルコキシ基であり、より好適な例は、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基（例：ｎ－プロポキシ基、ｉ－プロポキシ基）、又はブトキシ基（例：ｔ－ブトキシ基）である。
　なお、ハロアルコキシ基、及び、シアノアルコキシ基は、それぞれ、式：－Ｏ－ハロアルキルで表される基、及び、式：－Ｏ－シアノアルキルで表される基をいう。
　本明細書において、「アルキルチオ基」は、式：－Ｓ－アルキルで表される基をいう。　アルキルチオ基の好適な例は、Ｃ１－６アルキルチオ基であり、より好適な例は、メチルチオ基、エチルチオ基、プロピルチオ基（例：ｎ－プロピルチオ基、ｉ－プロピルチオ基）、又はブチルチオ基である。
　なお、ハロアルキルチオ基、及び、シアノアルキルチオ基は、それぞれ、式：－Ｓ－ハロアルキルで表される基、及び、式：－Ｓ－シアノアルキルで表される基をいう。
　本明細書において、「アルキルアミノ基」は、１個又は２個の同種もしくは異種のアルキル基で置換されているアミノ基をいう。
　アルキルアミノ基は、モノアルキルアミノ基及びジアルキルアミノ基を包含する。
　モノアルキルアミノ基の好適な例は、モノＣ１－６アルキルアミノ基であり、より好適な例は、モノメチルアミノ基、モノエチルアミノ基、モノプロピルアミノ基（例：モノ(ｎ－プロピル)アミノ基、モノ(ｉ－プロピル)アミノ基）、又はモノブチルアミノ基である。
　ジアルキルアミノ基の好適な例は、ジＣ１－６アルキルアミノ基であり、より好適な例は、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジプロピルアミノ基（例：ジ(ｎ－プロピル)アミノ基、ジ(ｉ－プロピル)アミノ基）、又はジブチルアミノ基である。
　本明細書において、「置換基を有するホスフィノ基」とは、ホスフィノ基（－ＰＨ２）の少なくとも１個の水素原子が他の原子又は原子団で置換されている基をいう。
　置換基を有するホスフィノ基の例としては、式：－Ｐ(Ｒ９ａ)(Ｒ９ｂ)（式中、Ｒ９ａ及びＲ９ｂは、同一又は異なって、ヒドロキシ基、メルカプト基、アミノ基、アルコキシ基、ハロアルコキシ基、シアノアルコキシ基、アルキルチオ基、ハロアルキルチオ基、シアノアルキルチオ基、又はアルキルアミノ基である）で表される基などが挙げられる。
　本明細書において、「置換基を有していてもよいジヒドロキシホスフィニル基」とは、ジヒドロキシホスフィニル基（即ち、ホスホノ基）（－Ｐ(＝Ｏ)(ＯＨ)２）、又は少なくとも１個の水素原子が他の原子又は原子団（例：ヒドロキシ基の保護基）で置換されているジヒドロキシホスフィニル基をいう。
　後者の基は、置換基を有していてもよい、下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 で表される基（以下、「二リン酸基」と称する）、及び置換基を有していてもよい、下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 で表される基（以下、「三リン酸基」と称する）を包含する。
　本明細書において、「置換基を有していてもよいヒドロキシメルカプトホスフィニル基」とは、ヒドロキシメルカプトホスフィニル基（－Ｐ(＝Ｏ)(ＯＨ)(ＳＨ)）、又は少なくとも１個の水素原子が他の原子又は原子団（例：ヒドロキシ基の保護基）で置換されているヒドロキシメルカプトホスフィニル基をいう。
　本明細書において、「ヒドロキシ基の保護基」とは、化合物又はその塩の合成、或いは、オリゴヌクレオチド又はその塩の合成においてヒドロキシ基が反応に関与しないようにするための一価の基をいう。
　ヒドロキシ基の保護基は、例えば、酸性又は中性条件で安定であり、加水素分解、加水分解、電気分解、及び光分解のような方法により開裂し得る基などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
　ヒドロキシ基の保護基の例は、置換基を有していてもよいアシル基、置換基を有するチオカルボニル基、置換基を有するスルホニル基、及び置換基を有するシリル基を包含する。
　本明細書において、「アシル基」とは、式：－Ｃ(＝Ｏ)－Ｒ（式中、Ｒは、炭化水素基である）で表される基をいう。Ｒで示される炭化水素基は、直鎖又は分岐鎖状炭化水素基（例：アルキル基）であってもよく、飽和又は不飽和炭化水素環基（例：シクロアルキル基、アリール基）であってもよく、これらの組合せ（例：アラルキル基）であってもよい。
　アシル基は、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基、及びアラルキルカルボニル基を包含する。
　アルキルカルボニル基の好適な例は、(Ｃ１－１０アルキル)カルボニル基であり、より好適な例は、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、バレリル基、イソバレリル基、オクタノイル基、ノナノイル基、又はデカノイル基である。
　アリールカルボニル基の好適な例は、(Ｃ６－１４アリール)カルボニル基であり、より好適な例は、ベンゾイル基、又はナフトイル基（即ち、α－ナフトイル基、β－ナフトイル基）である。
　アラルキルカルボニル基の好適な例は、(Ｃ６－１４アリールＣ１－４アルキル)カルボニル基であり、より好適な例は、ベンジルカルボニル基である。
　なお、「アシルオキシ基」、「アシルチオ基」、及び「アシルアミノ基」におけるアシル基も、上記と同様の基が例示できる。
　本明細書において、「置換基を有するチオカルボニル基」とは、式：－Ｃ(＝Ｓ)－Ａ（式中、Ａは、置換基を有していてもよい複素環基、－ＯＲ、－ＳＲ、－ＮＨ２、－ＮＨＲ、又は－ＮＲ２であり、Ｒは前記と同じである）で表される基をいう。
　「置換基を有するチオカルボニル基」の好適な例は、アリールオキシチオカルボニル基、及びヘテロアリールチオカルボニル基を包含する。
　アリールオキシチオカルボニル基の例としては、－Ｃ(＝Ｓ)－ＯＣ６Ｈ４－ＣＨ３基等の(Ｃ６－１４アリール)オキシチオカルボニル基などが挙げられる。
　ヘテロアリールチオカルボニル基の例としては、－Ｃ(＝Ｓ)－イミダゾリル（例：－Ｃ(＝Ｓ)－(１，３－イミダゾリル)基）等のＣ１－１０ヘテロアリールチオカルボニル基などが挙げられる。
　本明細書において、「置換基を有するスルホニル基」とは、式：－Ｓ(＝Ｏ)２Ｒ（式中、Ｒは、前記と同じである）で表される基をいう。
　置換基を有するスルホニル基は、置換基を有していてもよいアルキル基を有するスルホニル基、及び置換基を有していてもよいアリール基を有するスルホニル基を包含する。　アルキル基を有するスルホニル基の好適な例は、Ｃ１－６アルキルスルホニル基であり、より好適な例は、メタンスルホニル基又はエタンスルホニル基である。
　アリール基を有するスルホニル基の好適な例は、Ｃ６－１４アリールスルホニル基であり、より好適な例は、ベンゼンスルホニル基又はｐ－トルエンスルホニル基である。
　本明細書において、「置換基を有するシリル基」とは、シリル基（－ＳｉＨ３）の少なくとも１個の水素原子が他の原子又は原子団で置換されているシリル基をいう。
　「置換基を有するシリル基」の典型的な例は、式：－Ｓｉ(Ｒ８)３（式中、各Ｒ８は、同一又は異なって、アルキル基又はアリール基である）で表される基である。当該基の例としては、トリアルキルシリル基（例：トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基等のトリＣ１－６アルキルシリル基）、ジアルキルアリールシリル基（例：ジメチルフェニルシリル基等のジＣ１－６アルキルＣ６－１４アリールシリル基）、アルキルジアリールシリル基（例：ｔ－ブチルジフェニルシリル基等のＣ１－６アルキルジＣ６－１４アリールシリル基）、トリアリールシリル基（例：トリフェニルシリル基等のトリＣ６－１４アリールシリル基）などが挙げられる。
　本明細書において、「アミノ基の保護基」とは、化合物又はその塩の合成、或いは、オリゴヌクレオチド又はその塩の合成においてアミノ基が反応に関与しないようにするための一価の基をいう。
　アミノ基の保護基は、例えば、酸性又は中性条件で安定であり、加水素分解、加水分解、電気分解、及び光分解のような方法により開裂し得る基などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
　アミノ基の保護基の例は、置換基を有していてもよいアシル基（例：置換基を有していてもよいアルキルカルボニル基、置換基を有していてもよいアリールカルボニル基、置換基を有していてもよいアラルキルカルボニル基）、置換基を有していてもよいＮ，Ｎ－ジアルキルホルムアミジル基、置換基を有していてもよいアルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいアルケニルオキシカルボニル基、置換基を有していてもよいアリールオキシカルボニル基、置換基を有していてもよいアラルキルオキシカルボニル基、及び置換基を有するスルホニル基を包含する。
　本明細書において、「ホルムアミジル基」とは、式：＝ＣＨ－ＮＨ２で表される基をいう。Ｎ，Ｎ－ジアルキルホルムアミジル基の好適な例は、Ｎ，Ｎ－ジ(Ｃ１－６アルキル)ホルムアミジル基であり、より好適な例は、Ｎ，Ｎ－ジ(Ｃ１－４アルキル)ホルムアミジル基であり、さらに好適な例は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミジル基又はＮ，Ｎ－ジエチルホルムアミジル基である。
　本明細書において、「アルコキシカルボニル基」とは、式：－Ｃ(＝Ｏ)－Ｏ－アルキルで表される基をいう。
　アルコキシカルボニル基の好適な例は、(Ｃ１－６アルコキシ)カルボニル基であり、より好適な例は、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、又はブトキシカルボニル基（例：ｔ－ブトキシカルボニル基）である。
　本明細書において、「アルケニルオキシカルボニル基」とは、式：－Ｃ(＝Ｏ)－Ｏ－アルケニルで表される基をいう。
　アルケニルオキシカルボニル基の好適な例は、(Ｃ２－９アルケニルオキシ)カルボニル基であり、より好適な例は、アリルオキシカルボニル基である。
　本明細書において、「アリールオキシカルボニル基」とは、式：－Ｃ(＝Ｏ)－Ｏ－アリールで表される基をいう。
　アリールオキシカルボニル基の好適な例は、(Ｃ６－１４アリールオキシ)カルボニル基であり、より好適な例は、フェノキシカルボニル基又はナフトキシカルボニル基である。
　本明細書において、「アラルキルオキシカルボニル基」とは、式：－Ｃ(＝Ｏ)－Ｏ－アラルキルで表される基をいう。
　アラルキルオキシカルボニル基の好適な例は、(Ｃ６－１４アリールＣ１－４アルコキシ)カルボニル基であり、より好適な例は、ベンジルオキシカルボニル基又はフルオレニルメチルオキシカルボニル基である。
　本明細書において、「機能性分子ユニット置換基」とは、標識官能基（例：蛍光標識官能基、化学発光標識官能基、放射線放出核種含有基）、インターカレート能を有する基、核酸結合能を有する基、核酸切断活性官能基、細胞内又は核内移行能を有する基、及び金属キレート能を有する基などを包含する概念である。
　蛍光標識官能基の例としては、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、チアゾールオレンジ（1-メチル-4-[(3-メチル-2(3H)-ベンゾチアゾリリデン)メチル]キノリニウム p-トシレート）などの蛍光標識試薬の残基などが挙げられる。化学発光標識官能基の例としては、塩化トリス(ビピリジン)ルテニウム(II)などの化学発光標識試薬の残基などが挙げられる。放射線放出核種含有基の例としては、１１ＣＨ３－、１４ＣＨ３－、１８Ｆ－、又は３２Ｐ－を含有する基などが挙げられる。
　インターカレート能を有する基の例としては、アントラセン骨格を有する基、ピレン骨格を有する基、アントラキノン骨格、アクリジン骨格を有する基、ナフタルイミド骨格を有する基などが挙げられる。また、他の例としては、タモキシフェンなどのインターカレート剤の残基などが挙げられる。
　核酸結合能を有する基の例としては、ネトロプシン、ディスタマイン、ＰＩ(Pyrrole Imidazole)ポリアミドなどの核酸結合剤の残基などが挙げられる。
　核酸切断活性官能基の例としては、エンドヌクレアーゼ、ビス(ビピリジン)クリセンキノンジイミンロジウム(II)錯体などの核酸切断剤の残基などが挙げられる。
　細胞内又は核内移行能を有する基の例としては、ＴＡＴ(Twin-Arginine Translocation)シグナルペプチド、ポリアルギニン、ＧａｌＮａｃ(Ｎ－アセチルガラクトサミン)、ＳＶ４０Ｔ抗原由来のシグナルペプチドなどの細胞内又は核内移行シグナルペプチドの残基などが挙げられる。
　金属キレート能を有する基の例としては、ＥＤＴＡ、クラウンエーテル、クリプタンドなどの金属キレート剤の残基などが挙げられる。
　本明細書において、「ハイブリダイズする」とは、所定のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの全部又は一部分が、ストリンジェントな条件下で、別のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの全部又は一部分と水素結合を介して二重鎖を形成することをいう。「ストリンジェントな条件」は、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行う際に当業者が一般的に用いる条件であればよい。例えば、２つのポリヌクレオチド分子またはオリゴヌクレオチド分子の間に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性があるときに、一方のポリヌクレオチド分子又はオリゴヌクレオチド分子が他方のポリヌクレオチド分子又はオリゴヌクレオチド分子に特異的にハイブリダイズすることができる条件が挙げられる。ハイブリダイゼーションでのストリンジェンシーは、温度、塩濃度、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの塩基長及びＧＣ含量、並びにハイブリダイゼーションバッファーに含まれるカオトロピック剤の濃度の関数であることが知られている。ストリンジェントな条件として、例えば、Sambrook, J.ら, 1998, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第２編), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載された条件などを用いることができる。
　本明細書において、「検査」とは、診断や研究などの目的で試料中の核酸等の被検物質を調べることをいう。「検査試料」とは、検査に供される試料をいう。
　本明細書において、各数値範囲の上限及び下限は任意に組み合わせることができる。
２．式（１）で表される化合物又はその塩
　本発明の化合物又はその塩は、下記式（１）で表される化合物又はその塩である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 （式中、Ｂａｓｅ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｚ１、及びＺ２は、前記と同じである）。
　式（１）に示されるように、本発明の化合物又はその塩は、１，７－ジオキサスピロ［４．４］ノナン骨格、１，７－ジオキサスピロ［４．５］デカン骨格、１－オキサ－７－アザスピロ［４．４］ノナン骨格、又は１－オキサ－７－アザスピロ［４．５］デカン骨格を有することを特徴とする。
　以下、式（Ｎ）で表される化合物又はその塩を、「化合物（Ｎ）」と称する。化合物（１）は、Ｒ１又はＲ２が、置換基を有していてもよいジヒドロキシホスフィニル基又は置換基を有していてもよいヒドロキシメルカプトホスフィニル基である場合、「ヌクレオチド」と称し、それ以外の基である場合、「ヌクレオシド」と称する。
　Ｂａｓｅは、好ましくは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である。
　前記芳香族複素環基は、好ましくは含窒素芳香族複素環基である。
　前記含窒素芳香族複素環基は、好ましくは６～１０員の含窒素芳香族複素環基である。　前記６～１０員の含窒素芳香族複素環基は、好ましくは２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－１－イル基、２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、プリン－９－イル基、又は６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル基である。
　前記芳香族複素環基に置換する置換基は、好ましくはアルキル基、アシル基、及びアミノ基の保護基で置換されていてもよいアミノ基からなる群から選択される少なくとも一種である。前記置換基の数は、特に限定されるものではないが、例えば１～３である。
　Ｂａｓｅは、より好ましくは置換基を有していてもよいチミニル基、置換基を有していてもよいシトシニル基、置換基を有していてもよいアデニル基、又は置換基を有していてもよいグアニル基である。前記置換基は、好ましくはアルキル基、アシル基、及びＮ，Ｎ－ジアルキルホルムアミジル基からなる群から選択される少なくとも一種であり、より好ましくはＣ１－４アルキル基、(Ｃ１－４アルキル)カルボニル基、(Ｃ６－１４アリール)カルボニル基、又はＮ，Ｎ－ジ(Ｃ１－４アルキル)ホルムアミジル基である。前記置換基の数は、好ましくは１～３である。
　Ｂａｓｅは、更に好ましくは、下記：
　２，４－ジオキソ－５－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－１－イル基（例：チミン－１－イル基）、
　２－オキソ－４－アミノ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基（即ち、シトシン－１－イル基）、
　２－オキソ－４－アシルアミノ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基（即ち、Ｎ－アシル－シトシン－１－イル基）、
　２－オキソ－４－アミノ－５－メチル－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基（即ち、５－メチルシトシン－１－イル基）、
　２－オキソ－４－アシルアミノ－５－メチル－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基（即ち、Ｎ－アシル－５－メチルシトシン－１－イル基）、
　６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル基（即ち、アデニン－９－イル基）、
　６－アシルアミノ－９Ｈ－プリン－９－イル基（即ち、Ｎ－アシル－アデニン－９－イル基）、
　２－アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル基（例:グアニン－９－イル基）
　２－アシルアミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル基（例:Ｎ－アシル－グアニン－９－イル基）、及び
　２－（Ｎ，Ｎ－ジアルキルホルムアミジル）アミノ－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル基（例：Ｎ－（Ｎ，Ｎ－ジアルキルホルムアミジル）－グアニン－９－イル基）
からなる群から選択される基である。
　Ｂａｓｅは、更により好ましくは、下記：
　チミン－１－イル基、
　５－メチルシトシン－１－イル基、
　Ｎ－アセチル－５－メチルシトシン－１－イル基、
　Ｎ－イソブチリル－５－メチルシトシン－１－イル基、
　Ｎ－ベンゾイル－５－メチルシトシン－１－イル基、
　アデニン－９－イル基、
　Ｎ－アセチル－アデニン－９－イル基、
　Ｎ－イソブチリル－アデニン－９－イル基、
　Ｎ－ベンゾイル－アデニン－９－イル基、
　グアニン－９－イル基、
　Ｎ－アセチル－グアニン－９－イル基、
　Ｎ－イソブチリル－グアニン－９－イル基、
　Ｎ－ベンゾイル－グアニン－９－イル基、及び
　Ｎ－（Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミジル）－グアニン－９－イル基
からなる群から選択される基である。
　Ｘ１は、好ましくは水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、又はアリール基であり、より好ましくは水素原子、アルキル基、又はアリール基であり、更に好ましくは水素原子又はアルキル基であり、更により好ましくは水素原子又はＣ１－４アルキル基であり、特に好ましくは水素原子、メチル基、又はエチル基である。一実施形態において、Ｘ１は水素原子であることが好ましい。
　Ｘ２で示される「－ＯＲ７」において、Ｒ７は、好ましくは水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アリール基、又はヒドロキシ基の保護基であり、より好ましくは水素原子、アルキル基、アリール基、アルキルカルボニル基、又はアリールカルボニル基、更に好ましくは水素原子、アルキル基、又はアルキルカルボニル基であり、更により好ましくは水素原子、Ｃ１－４アルキル基、又はＣ１－４アルキルカルボニル基であり、特に好ましくは水素原子又はＣ１－４アルキル基である。
　Ｒ１及びＲ２は、それぞれ、好ましくは、下記：
　水素原子、
　置換基を有していてもよいアルキル基、
　置換基を有していてもよいアリール基、
　ヒドロキシ基の保護基、
　置換基を有するホスフィノ基、
　置換基を有していてもよいジヒドロキシホスフィニル基、及び
　置換基を有していてもよいヒドロキシメルカプトホスフィニル基
からなる群から選択される基である。
　上記の群の中の「置換基を有していてもよいアルキル基」は、好ましくはハロゲン原子、アルコキシ基、及びアリール基からなる群から選択される少なくとも一種の置換基を有していてもよいアルキル基であり、より好ましくはアルコキシ基で置換されていてもよいアルキル基、又はアルコキシ基で置換されていてもよいアラルキル基である。前記置換基の数は、好ましくは１～３である。
　上記の群の中の「置換基を有していてもよいアリール基」は、好ましくはハロゲン原子、アルキル基、及びアルコキシ基からなる群から選択される少なくとも一種の置換基を有していてもよいアリール基であり、より好ましくはアルコキシ基で置換されていてもよいアリール基である。前記置換基の数は、好ましくは１～３である。
　上記の群の中の「ヒドロキシ基の保護基」は、好ましくは、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、又は式：－Ｓｉ(Ｒ８)３（式中、各Ｒ８は、同一又は異なって、アルキル基又はアリール基である）で表される基である。
　上記の群の中の「置換基を有するホスフィノ基」は、好ましくは式：－Ｐ(Ｒ９ａ)(Ｒ９ｂ)（式中、Ｒ９ａ及びＲ９ｂは、同一又は異なって、ヒドロキシ基、メルカプト基、アミノ基、アルコキシ基、ハロアルコキシ基、シアノアルコキシ基、アルキルチオ基、ハロアルキルチオ基、シアノアルキルチオ基、又はアルキルアミノ基である）で表される基であり、より好ましくは、下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 （式中、Ｒ９ｃ及びＲ９ｄは、同一又は異なって、水素原子又はアルキル基であり、Ｒ９ｅは、水素原子、アルキル基、ハロアルキル基、又はシアノアルキル基である）
で表されるホスフィノ基である。
　上記の群の中の「置換基を有していてもよいジヒドロキシホスフィニル基」は、好ましくはジヒドロキシホスフィニル基、二リン酸基、又は三リン酸基であり、より好ましくはジヒドロキシホスフィニル基である。これらは、置換基としてヒドロキシ基の保護基を有していてもよく、存在するヒドロキシ基の全部又は一部が、ヒドロキシ基の保護基で置換されていてもよい。
　上記の群の中の「置換基を有していてもよいヒドロキシメルカプトホスフィニル基」は、好ましくはヒドロキシメルカプトホスフィニル基である。
　Ｒ１及びＲ２は、それぞれ、更に好ましくは、
水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、アリル基、ベンジル基、トリチル基、メトキシメチル基、ｐ－メトキシベンジル基、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、アセチル基、イソブチリル基、ベンゾイル基、メタンスルホニル基、ｐ－トルエンスルホニル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、ｔ－ブチルジフェニルシリル基、下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 のいずれかで表されるホスフィノ基、ジヒドロキシホスフィニル基、又はヒドロキシメルカプトホスフィニル基
である。
　Ｒ１及びＲ２の組合せは、好ましくは、Ｒ１が水素原子、又はアルコキシ基（例：メトキシ基、エトキシ基などのＣ１－４アルコキシ基）で置換されていてもよいアラルキル基（例：トリチル基などのＣ７－１９アラルキル基）であり、Ｒ２が水素原子、アラルキル基（例：ベンジル基などのＣ７－１９アラルキル基）、又は下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 （式中、Ｒ９ｃ及びＲ９ｄは、同一又は異なって、水素原子又はアルキル基であり、Ｒ９ｅは、水素原子、アルキル基、ハロアルキル基、又はシアノアルキル基である）
で表されるホスフィノ基である組合せである。
　Ｒ１及びＲ２の組合せは、より好ましくは、Ｒ１が４，４’－ジメトキシトリチル基などのジメトキシトリチル基であり、Ｒ２が下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 のいずれかで表されるホスフィノ基である組合せである。
　Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、それぞれ、好ましくは水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、又はアリール基であり、より好ましくは水素原子、アルキル基、又はアリール基であり、更に好ましくは水素原子又はアルキル基であり、更により好ましくは水素原子又はＣ１－４アルキル基であり、特に好ましくは水素原子、メチル基、又はエチル基である。一実施形態において、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は水素原子であることが好ましい。
　一実施形態において、Ｚ１はＯであることが好ましい。また、別の実施形態において、Ｚ１はＮＺ１１であることが好ましい。当該実施形態において、Ｚ１１は、好ましくは水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、又はアミノ基の保護基であり、更に好ましくは水素原子又はアルキル基であり、更により好ましくは水素原子又はＣ１－４アルキル基であり、特に好ましくは水素原子、メチル基、又はエチル基である。
　一実施形態において、Ｚ２は単結合であることが好ましい。当該実施形態において、Ｚ１がＯであることが好ましい。また、別の実施形態において、Ｚ２はＣＺ２１Ｚ２２であることが好ましい。当該実施形態において、Ｚ２１及びＺ２２は、それぞれ、好ましくは水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、又はアリール基であり、更に好ましくは水素原子又はアルキル基であり、更により好ましくは水素原子又はＣ１－４アルキル基であり、特に好ましくは水素原子、メチル基、又はエチル基である。当該実施形態において、Ｚ２１及びＺ２２は水素原子である（Ｚ２はＣＨ２である）ことが好ましい。
　化合物（１）は、好ましくは、下記化合物（１Ａ）、（１Ｂ）、及び（１Ｃ）のいずれかである：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 （式中、Ｂａｓｅ、Ｘ２、Ｒ１、Ｒ２、及びＺ１１は、前記と同じである）。
　化合物（１）は、不斉炭素が存在する場合、立体異性体（Ｒ体、Ｓ体、α体、β体、エナンチオマー、又はジアステレオマー）であってもよく、ラセミ体であってもよい。例えば、化合物（１）は、下記化合物（１Ａ－１）、（１Ａ－２）、（１Ｂ－１）、及び（１Ｃ－１）のいずれかであってもよい：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 （式中、Ｂａｓｅ、Ｘ２、Ｒ１、Ｒ２、及びＺ１１は、前記と同じである）。
　前記塩は、薬学上許容される塩であってもよく、薬学上許容される塩でなくてもよい。　前記塩は、無機塩であってもよく、有機塩であってもよい。
　前記塩の例としては、アルカリ金属塩（例：ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩）、アルカリ土類金属塩（例：カルシウム塩、マグネシウム塩）、他の金属塩（例：アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩）、アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩、アミン塩（例：ｔ－オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジル－フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩）、無機酸塩（例：フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩）、有機酸塩（例：メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩）、アミノ酸塩（例：グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩）が挙げられる。
３．化合物（１）の製造方法
　化合物（１）は、例えば、下記に示されるように、化合物（２）を、式（２’）：Ｚ１１－ＮＨ２（式中、Ｚ１１は前記と同じである）で表されるアミンの存在下又は非存在下で環化（又は閉環）する工程を含む方法により得ることができるが、この方法に限定されるものではなく、公知の反応を利用して合成することができる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 （式中、Ｌ１はヒドロキシ活性化基であり、Ｌ２は水素原子又はヒドロキシ活性化基であり、Ｂａｓｅ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｚ１、及びＺ２は、前記と同じである）。
　化合物（２）において、Ｌ１で示されるヒドロキシ活性化基の例としては、アルキルスルホニル基（例：メシル基などのＣ１－４アルキルスルホニル基）、ハロアルキルスルホニル基（例：トリフルオロメタンスルホニル基などのフルオロＣ１－４アルカンスルホニル基）、アリールスルホニル基（例：ベンゼンスルホニル基、ニトロベンゼンスルホニル基、トシル基などのＣ６－１０アリールスルホニル基）などが挙げられる。Ｌ２がヒドロキシ活性化基である場合、当該ヒドロキシ活性化基の例としては、Ｌ１の例と同じものが挙げられる。Ｌ２は、Ｌ１と同じであっても異なっていてもよい。
　化合物（２）は、例えば、下記式（３）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 （式中、Ｚ３は単結合又は二重結合であり、Ｚ３が単結合である場合、Ｘ３がＯＲ１であり、Ｚ４がＣＨ２＝ＣＺ５－であり、Ｚ５が水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、Ｚ３が二重結合である場合、Ｘ３及びＺ４が不存在であり、Ｂａｓｅ、Ｌ１、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、前記と同じである）
で表される化合物をヒドロキシ化（例：四酸化オスミニウム等の酸化剤によるヒドロキシ化）する工程を含む方法により得ることができるが、この方法に限定されるものではなく、公知の反応を利用して合成することができる。なお、化合物（３）は、例えば、下記式（４）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 （式中、Ｌ１、Ｘ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、ＲＸ、及びＲＹは、前記と同じである）
で表される化合物を酸化剤で酸化（例えば、ジメチルスルホキシドを酸化剤として用い、塩化オキサリル等を活性化剤として用いるスワーン酸化）し、引き続いてWittig反応、Grignard反応等によりオレフィン化する工程、及び核酸塩基を導入する工程を含む方法により合成することができる。
　ＲＸ及びＲＹは、それぞれ、好ましくは水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、又はアリール基であり、より好ましくは水素原子、アルキル基、又はアリール基であり、更に好ましくはアルキル基であり、更により好ましくはメチル基などのＣ１－４アルキル基である。
　化合物（２）の環化工程を、式（２’）：Ｚ１１－ＮＨ２（式中、Ｚ１１は前記と同じである）で表されるアミンの非存在下で行う場合、Ｚ１がＯである化合物（１）を得ることができる。一方、化合物（２）の環化工程を、前記アミンの存在下で行う場合、Ｚ１がＮＺ１１である化合物（１）を得ることができる。前記アミンの使用量は、例えば、化合物（２）１モルに対して、例えば１～２００モル、好ましくは５０～１００モルである。
　化合物（２）の環化工程は、塩基の存在下で実施してもよい。塩基の例としては、無機塩基［例：アルカリ金属の炭酸塩（例：炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム）、アルカリ金属の炭酸水素塩（例：炭酸水素ナトリウム）、アルカリ土類金属の炭酸塩（例：炭酸カルシウム）、アルカリ金属の水酸化物（例：水酸化ナトリウム、水酸化カリウム）、アルカリ土類金属の水酸化物（例：水酸化カルシウム）、アルカリ金属の水素化物（例：水素化ナトリウム）、金属アルコキシド（例：ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド）］、有機塩基［例：第３級アミン（例：トリアルキルアミン、Ｎ－エチルジイソプロピルアミン）、環状アミン（例：ピリジン、４－(ジメチルアミノ)ピリジン、ジアザビシクロウンデセン(ＤＢＵ)、ジアザビシクロノネン(ＤＢＮ)）］、これらの組合せなどが挙げられる。
　塩基の使用量は、化合物（２）１モルに対して、例えば１～２０モル、好ましくは１～１０モルである。
　化合物（２）の環化工程は、溶媒の存在下で実施することが好ましい。溶媒の例としては、エーテル系溶媒（例：テトラヒドロフラン）、アミド系溶媒（例：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド）、環状アミン（例：ピリジン、２，４，６－トリメチルピリジン）などが挙げられる。
　化合物（２）の環化工程において、反応温度及び反応時間は、反応が進行する限り特に限定されない。反応温度は、例えば２０～１７０℃であり、好ましくは２５～１５０℃又は６０～１２０℃である。反応時間は、例えば０．５～７２時間、１～２４時間、又は６～１２時間である。
　化合物（１）、（１Ａ）、（１Ｂ）、（１Ｃ）、（２）、及び（３）のＢａｓｅは、例えば、下記の反応スキームにより変換することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 （式中、Ｑ１は、水素原子又は置換基であり、Ｑ２及びＱ３は、同一又は異なって、水素原子又はアミノ基の保護基であり（但し、Ｑ２及びＱ３は共に水素原子ではない）、Ｑ４、Ｑ５、Ｑ６、及びＱ７は、同一又は異なって、水素原子又はアミノ基の保護基であり、環Ｇは、５員又は６員の含窒素複素環である）
＜工程（I）＞
　工程（I）は、Ｂａｓｅが「置換基を有していてもよい２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－１－イル基」である化合物（５Ａ）を、化合物（５Ｂ）及びリン酸ハライドと反応させて、化合物（５Ｃ）を得る工程である。
　化合物（５Ａ）において、Ｑ１は、好ましくは水素原子又はアルキル基であり、さらに好ましくは水素原子又はＣ１－４アルキル基である。
　化合物（５Ｂ）は、好ましくは５員の含窒素複素環化合物であり、より好ましくはトリアゾールである。化合物（５Ｂ）の使用量は、化合物（５Ａ）１モルに対して、通常、５～２０モル、好ましくは７～９モルである。
　リン酸ハライドは、好ましくはリン酸トリクロリドである。リン酸ハライドの使用量は、化合物（５Ａ）１モルに対して、通常、１～５モル、好ましくは１～３モルである。
　工程（I）の反応は、溶媒の存在下で実施することが好ましい。溶媒の例としては、ニトリル系溶媒（例：アセトニトリル）、エーテル系溶媒（例：テトラヒドロフラン）、ハロゲン系溶媒（例：ハロアルカン）、これら二種以上の混合溶媒などが挙げられる。これらのうち、ニトリル系溶媒（例：アセトニトリル）が好ましい。
　工程（I）の反応は、塩基の存在下で実施することが好ましい。塩基の例としては、無機塩基［例：アルカリ金属の炭酸塩（例：炭酸ナトリウム、炭酸セシウム）、アルカリ金属の炭酸水素塩（例：炭酸水素ナトリウム）、アルカリ土類金属の炭酸塩（例：炭酸カルシウム）、アルカリ金属の水酸化物（例：水酸化ナトリウム、水酸化カリウム）、アルカリ土類金属の水酸化物（例：水酸化カルシウム）、金属アルコキシド（例：ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド）］、有機塩基［例：第３級アミン（例：トリアルキルアミン）、環状アミン（例：４－(ジメチルアミノ)ピリジン、ジアザビシクロウンデセン(ＤＢＵ)、ジアザビシクロノネン(ＤＢＮ)）］、これらの組合せなどが挙げられる。これらのうち、第３級アミンが好ましく、トリＣ１－４アルキルアミンがより好ましい。塩基の使用量は、化合物（５Ａ）１モルに対して、通常、５～２０モル、好ましくは１０～１５モルである。
　工程（I）の反応の反応温度は、反応が進行する限り特に限定されるものではないが、例えば－５℃～１０℃である。
　工程（I）の反応は、例えば、米国特許第５３５９０６７号明細書に記載された方法を採用することもできる。
＜工程（II）＞
　工程（II）は、化合物（５Ｃ）をアンモニアと反応させて、化合物（５Ｄ）を得る工程である。
　アンモニアの使用量は、化合物（５Ｃ）１モルに対して、通常、５～１００モル、好ましくは２０～５０モルである。
　工程（II）の反応は、溶媒の存在下で実施することが好ましい。溶媒の例としては、アミド系溶媒（例：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドン）、エーテル系溶媒（例：テトラヒドロフラン、ジオキサンなどの環状エーテル）、これら二種以上の混合溶媒などが挙げられる。これらのうち、エーテル系溶媒が好ましく、環状エーテルがより好ましく、テトラヒドロフラン及びジオキサンから選択される少なくとも一種がさらに好ましい。
　工程（II）の反応の反応温度は、反応が進行する限り特に限定されるものではないが、例えば１５～３０℃である。
＜工程（III）＞
　工程（III）は、化合物（５Ｄ）のアミノ基を保護基で保護して、化合物（５Ｅ）を得る工程である。前記アミノ基を保護基で保護する方法は、公知（例えば、米国特許出願公開第２００７／１６７３８７号明細書）又は慣用の方法を採用することができる。
＜工程（IV）＞
　工程（IV）は、化合物（５Ａ）において、Ｂａｓｅを「置換基を有していてもよい２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－１－イル基」から「置換基を有していてもよいプリン－９－イル基」に変換する工程である。
　工程（IV）は、具体的には、Ｂａｓｅが「置換基を有していてもよい２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－１－イル基」である化合物（５Ａ）を化合物（５Ｆ）と反応させて、化合物（５Ｇ）を得る工程である。
　化合物（５Ｆ）の使用量は、化合物（５Ａ）１モルに対して、通常、１～５モル、好ましくは１～３モルである。
　工程（IV）の反応は、ルイス酸の存在下で実施することが好ましい。ルイス酸の例としては、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリルが挙げられる。ルイス酸の使用量は、化合物（５Ａ）１モルに対して、通常、０.５～５モル、好ましくは１～３モルである。
　工程（IV）の反応は、シリル化剤の存在下で実施することが好ましい。シリル化剤の例としては、Ｎ，Ｏ－ビス－トリメチルシリルアセトアミド（ＢＳＡ）、Ｎ，Ｏ－ビス－シリルトリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ）、ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤ）、Ｎ，Ｏ－ビス－ターシャリーブチルジメチルシリルアセトアミド、Ｎ－（トリメチルシリル）ジエチルアミン、Ｎ－（トリメチルシリル）ジメチルアミン、Ｎ－メトキシ－Ｎ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）カルバマート、Ｎ－メチル－Ｎ－トリメチルシリルアセトアミド、Ｎ－メチル－Ｎ－トリメチルシリルヘプタフルオロブチルアミド、Ｎ－メチル－Ｎ－トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド、Ｎ－トリメチルシリルアセトアミド、これら二種以上の組合せなどが挙げられる。これらのうち、Ｎ，Ｏ－ビス－トリメチルシリルアセトアミド（ＢＳＡ）が好ましい。シリル化剤の使用量は、化合物（５Ａ）１モルに対して、通常、１～２０モル、好ましくは３～８モルである。
　工程（IV）の反応の反応温度は、反応が進行する限り特に制限されないが、例えば３０～１５０℃、好ましくは５０～１２０℃である。
　工程（IV）の反応は、例えば米国特許出願公開第２０１２／０７１６４６号明細書に記載された方法を採用することもできる。
＜工程（V）＞
　工程（V）は、化合物（５Ａ）において、Ｂａｓｅを「置換基を有していてもよい２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－１－イル基」から「置換基を有していてもよい６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル基」に変換する工程である。
　工程（V）は、具体的には、Ｂａｓｅが「置換基を有していてもよい２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－１－イル基」である化合物（５Ａ）を、式（５Ｈ）で表される化合物と反応させて、化合物（５Ｉ）を得る工程である。当該反応は、工程（IV）と同様の条件で行うことができる。
　化合物（１）の製造方法は、さらに必要であれば、中間生成物及び最終生成物を、常法、例えば、濃縮、再結晶、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等により精製する工程を含んでもよい。
４．化合物（１）を含む組成物
　本発明の組成物は化合物（１）を含有する。当該組成物は、化合物（１）を１種類のみ含有してもよく、２種類以上を含有してもよい。例えば、当該組成物は、
Ｂａｓｅがチミン－１－イル基である化合物（１）；
Ｂａｓｅが５－メチルシトシン－１－イル基、Ｎ－アセチル－５－メチルシトシン－１－イル基、Ｎ－イソブチリル－５－メチルシトシン－１－イル基、又はＮ－ベンゾイル－５－メチルシトシン－１－イル基である化合物（１）；
Ｂａｓｅがアデニン－９－イル基、Ｎ－アセチル－アデニン－９－イル基、Ｎ－イソブチリル－アデニン－９－イル基、又はＮ－ベンゾイル－アデニン－９－イル基である化合物（１）；及び
Ｂａｓｅがグアニン－９－イル基、Ｎ－アセチル－グアニン－９－イル基、Ｎ－イソブチリル－グアニン－９－イル基、Ｎ－ベンゾイル－グアニン－９－イル基、又はＮ－（Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミジル）－グアニン－９－イル基である化合物（１）
からなる群より選択される、１種類、２種類、３種類、又は４種類の化合物を含有してもよい。
　当該組成物の形態としては、液体が挙げられる。
　当該組成物の形態が液体の場合、当該組成物は、通常、溶媒を含んでいる。溶媒としては、公知の溶媒を使用でき、好ましくは、ハロゲン化炭化水素系溶媒（例：ジクロロメタン）、ニトリル系溶媒（例：アセトニトリル）、芳香族炭化水素系溶媒（例：トルエン、キシレン）、水、ＴＥバッファーなどが挙げられる。これらのうち、ジクロロメタン、トルエン、アセトニトリルなどが好適に用いられる。
　当該組成物は、通常は容器に収容されてユーザに提供される。
　当該組成物は、後述のオリゴヌクレオチド又はその塩の合成に使用され得る。また、当該組成物は、医薬組成物として用いられ得る。
５．オリゴヌクレオチド又はその塩
　本発明のオリゴヌクレオチド又はその塩は、下記式（６）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 （式中、Ｂａｓｅ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｚ１、及びＺ２は、前記と同じである）で表される単位を有する。
　前記単位は、好ましくは、下記式（６ａ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 （式中、Ａ１は、ＯＨ、Ｏ－、ＳＨ、又はＳ－であり、Ｂａｓｅ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｚ１、及びＺ２は、前記と同じである）
で表される単位である。
　以下、式（６）又は（６ａ）で表される単位を有するオリゴヌクレオチド又はその塩を、「オリゴヌクレオチド（６）」と称する。
　オリゴヌクレオチド（６）が、式（６）又は（６ａ）で表される単位を２以上有する場合、各単位の構造は、同一であってもよく、異なっていてもよい。
　オリゴヌクレオチド（６）は、式（６）又は（６ａ）で表される単位に加えて、他の単位を含んでいてもよい。他の単位の例としては、下記式（７）～（１０）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 ［式中、
　Ｒａは、水素原子又はヒドロキシ基であり、
　Ｒｂは、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいアシル基、置換基を有するスルホニル基、置換基を有するシリル基、機能性分子ユニット置換基、又は式：Ｒｂ１－Ｘ－（式中、Ｒｂ１は、置換基を有していてもよいアミノ基であり、Ｘは、置換基を有していてもよいアルキレン基、又はこのアルキレン基中の少なくとも１つのメチレン基が－Ｎ(Ｒｂ２)－（式中、Ｒｂ２は水素原子又はアルキル基である）、－Ｏ－、又は－Ｓ(＝Ｏ)ｋ－（式中、ｋは０、１、又は２である）に置き換わった基である）で表される基であり、
　Ｒｃは、同一又は異なって、単結合又は置換基を有していてもよいアルキレン基であり、
　Ｂａｓｅは、前記と同じである］
で表される単位から選択される少なくとも一種などが挙げられる。
　前記他の単位は、好ましくは、下記式（７ａ）～（１０ａ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 （式中、Ａ２、Ａ３、Ａ４、及びＡ５は、同一又は異なって、ＯＨ、Ｏ－、ＳＨ、又はＳ－であり、Ｂａｓｅ、Ｒａ、Ｒｂ、及びＲｃは、前記と同じである。）
で表される単位から選択される少なくとも一種などが挙げられる。
　なお、他の単位は、例えば、米国特許出願公開第２００３／１０５３０９号明細書、米国特許出願公開第２０１７／０４４５２８号明細書、米国特許出願公開第２００６／１６６９０８号明細書、米国特許出願公開第２０１２／２０８９９１号明細書、米国特許出願公開第２０１５／２６６９１７号明細書、米国特許出願公開第２００３／２０７８４１号明細書（これらは参照として本明細書に組み込まれる）に記載されているヌクレオチドに由来する単位などであってもよい。
　オリゴヌクレオチド（６）の塩基配列は、標的ＤＮＡ又は標的ＲＮＡの塩基配列（全長又はその一部）に対して相補的である限り、特に制限されない。
　オリゴヌクレオチド（６）の長さは、特に限定されるものではなく、標的の塩基配列の長さに応じて選択することができる。オリゴヌクレオチド（６）の長さの下限は、例えば５ｍｅｒ、好ましくは１０ｍｅｒ、さらに好ましくは１５ｍｅｒであり、オリゴヌクレオチド（６）の長さの上限は、例えば２００ｍｅｒ、好ましくは１００ｍｅｒ、より好ましくは５０ｍｅｒ、さらに好ましくは３０ｍｅｒである。オリゴヌクレオチド（６）の長さは、例えば、５～２００ｍｅｒ、好ましくは５～５０ｍｅｒ、より好ましくは１０～４０ｍｅｒ、更に好ましくは１５～３０ｍｅｒである。オリゴヌクレオチド（６）の長さが長くなるほど、標的の塩基配列への結合力は強くなる。
　オリゴヌクレオチド（６）において、ヌクレオチド単位の総数に対して、式（６）で表される単位の数の割合は、特に限定されるものではなく、使用目的（プライマー、プローブ、クランプ核酸、医薬等）に応じて適宜設計することができる。式（６）で表される単位の数の割合を高くすることにより、相補鎖との結合力を低下させることができ、例えば、生体内での解離を促進させたｓｉＲＮＡ等の二本鎖核酸、クランプＰＣＲ法における、テンプレートに結合しない部位を有するクランプ核酸等として利用し得る。
　オリゴヌクレオチド（６）は、塩の形態であってもよい。すなわち、オリゴヌクレオチド（６）を構成するヌクレオチド単位のうち、少なくとも１つのヌクレオチド単位が、塩の形態であってもよい。前記塩は、薬学上許容される塩であってもよく、薬学上許容される塩でなくてもよい。前記塩は、無機塩であってもよく、有機塩であってもよい。前記塩の例としては、化合物（１）で例示した塩と同様、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、他の金属塩、アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩、アミン塩、無機酸塩、有機酸塩、アミノ酸塩などが挙げられる。
　オリゴヌクレオチド（６）は、標識物質により修飾されていてもよい。標識物質としては、特に限定されるものではないが、蛍光物質、ハプテン（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、ＤＮＰなど）、放射性同位体など、核酸に付与する標識として当業界において公知の物質であり得る。
　オリゴヌクレオチド（６）は、配列特異性を有する。オリゴヌクレオチド（６）は、一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡの塩基配列を検査したり、配列選択的に検出するプローブとして好適に利用することができる。
　オリゴヌクレオチド（６）は、ヌクレアーゼに対して分解されにくい。したがって、生体への投与後、長く生体内に存在することができると考えられる。オリゴヌクレオチド（６）は、例えば、センスＲＮＡと二重鎖を形成して病因となる生体内成分（タンパク質）のｍＲＮＡの転写を阻害することができる。また、オリゴヌクレオチド（６）は、感染したウイルスの増殖を阻害することもできる。
　オリゴヌクレオチド（６）は、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤などの遺伝子の働きを阻害して疾病を治療する医薬として有用である。
　また、オリゴヌクレオチド（６）は、安定で優れたアンチセンスもしくはアンチジーン又はアプタマーとしての活性を有し、又は特定遺伝子の検出薬もしくは核酸増幅のためのプライマーとして優れた活性を有する。
　オリゴヌクレオチド（６）は、各種の生理・生物活性物質、医薬品の材料、ＲＮＡ干渉法やデコイ法用などの二重鎖オリゴヌクレオチドの機能性材料、ｃＤＮＡなどの一本鎖核酸を標的とするＤＮＡチップ、モレキュラービーコン（molecular beacon）などの機能性素材、様々なアンチセンス法（リボザイム、ＤＮＡザイムを含む）、アンチジーン法やcrispr-cas9などのゲノム編集用途への機能性素材、蛍光や発光物質との組合せによる生体微量成分の高感度分析用材料や遺伝子機能解明等の研究用試薬の開発素材などとして有用である。
６．オリゴヌクレオチド（６）の製造方法
　オリゴヌクレオチド（６）は、慣用の方法、例えば、ホスホロアミダイトプロトコールなどに従って合成することができる。
　例えば、オリゴヌクレオチド（６）の製造方法は、
（Ｉ）下記式（６Ｂ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 （式中、
　Ｒ２ａは、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルケニル基、置換基を有していてもよいアリール基、ヒドロキシ基の保護基、置換基を有するホスフィノ基、置換基を有していてもよいジヒドロキシホスフィニル基、又は置換基を有していてもよいヒドロキシメルカプトホスフィニル基であり、
　Ｂａｓｅ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｚ１、及びＺ２は、前記と同じである）
で表される化合物又はその塩を、下記式（６Ｃ）～（１０Ｃ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 （式中、
　Ｒ１ａは、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルケニル基、置換基を有していてもよいアリール基、ヒドロキシ基の保護基、置換基を有するホスフィノ基、置換基を有していてもよいジヒドロキシホスフィニル基、又は置換基を有していてもよいヒドロキシメルカプトホスフィニル基であり、
　ＲＡ及びＲＢは、同一又は異なって、水素原子又はアルキル基であり、
　ＲＣは、水素原子、アルキル基、ハロアルキル基、又はシアノアルキル基であり、
　Ｂａｓｅ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｚ１、及びＺ２は、前記と同じである）
で表される化合物又はその塩から選択される少なくとも一種と反応させる工程、及び／又は、
（II）下記式（６Ｃ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 （式中、Ｂａｓｅ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１ａ、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、ＲＡ、ＲＢ、ＲＣ、Ｚ１、及びＺ２は、前記と同じである）
で表される化合物又はその塩を、下記式（６Ｂ）～（１０Ｂ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
 （式中、Ｂａｓｅ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ２ａ、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｚ１、及びＺ２は、前記と同じである）
で表される化合物又はその塩から選択される少なくとも一種と反応させる工程、並びに（III）工程（Ｉ）及び／又は工程（II）で得られた化合物を酸化する（特に、リン原子を酸化する）工程
を含む。
　オリゴヌクレオチド（６）の製造方法は、さらに必要であれば、中間生成物及び最終生成物を、常法、例えば、濃縮、再結晶、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過、エタノール沈殿、分取ＨＰＬＣ等により精製する工程を含む。
７．オリゴヌクレオチド（６）を含む組成物
　本発明の組成物はオリゴヌクレオチド（６）を含有する。当該組成物は、オリゴヌクレオチド（６）を１種類のみ含有してもよく、２種類以上を含有してもよい。
　当該組成物は、固体、液体など任意の形態であり得る。一例として、当該組成物は、オリゴヌクレオチド（６）及び溶媒を含む液体であってもよい。溶媒としては、公知の溶媒を使用でき、好ましくは、ハロゲン化炭化水素系溶媒（例：ジクロロメタン）、ニトリル系溶媒（例：アセトニトリル）、芳香族炭化水素系溶媒（例：トルエン、キシレン）、水が挙げられる。これらのうち、水がより好ましく、バッファーを含有する水がより好ましい。バッファーの例としては、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓバッファー）、トリスヒドロキシメチルアミノメタン－塩酸（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー）、トリスヒドロキシメチルアミノメタン－ＥＤＴＡ（ＴＥバッファー）、リン酸ナトリウム、２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、コラミン塩酸、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－メタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、ビシンなどが挙げられる。
　当該組成物は、さらに塩を含有していてもよい。塩は、金属塩化物を包含し、その例としては、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌなどが挙げられる。
　当該組成物は、さらに添加物及び共溶媒を含有していてもよい。その例としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ホルムアミド、ウシ血清アルブミン、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ゼラチン、非イオン性界面活性剤を含有していてもよい。非イオン性界面活性剤の例としては、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ-１００（登録商標）などが挙げられる。
　別の例として、当該組成物は、例えば、オリゴヌクレオチド（６）を固相担体に担持させたものであってもよい。固相担体には、生体高分子を担持させることのできる無機材料や有機材料が挙げられる。好ましくはガラス（例：多孔質ガラス(CPG)）、シリカゲル、樹脂（例：架橋した非膨潤性のポリスチレン樹脂(HPS)）などが挙げられる。これらのうち、HPSやCPGがより好ましい。
　当該組成物は、通常は容器に収容されてユーザに提供される。
　当該組成物は、後述の標的核酸の増幅又は検出、ストランドインベージョン、ＲＮＡｉなどに使用され得る。また、組成物は、医薬組成物として用いられ得る。
８．標的核酸の検出方法
　本発明は、標的核酸の検出方法を含む。この方法の各工程はインビトロで行われることが好ましい。この方法は、
（Ｉ）標的核酸を、核酸増幅法によって、選択的に増幅する工程、及び
（II）前記工程（Ｉ）で増幅された標的核酸を検出する工程
を含む。前記増幅又は検出に用いられるオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド（６）を含むことが好ましい。
　工程（Ｉ）の核酸増幅では、通常、複数のプライマー分子が用いられる。複数のプライマー分子のうち、少なくとも一部がオリゴヌクレオチド（６）であり得る。例えば、オリゴヌクレオチド（６）を含むフォワードプライマー及びオリゴヌクレオチド（６）を含まないリバースプライマーが用いられる。
　工程（Ｉ）の核酸増幅では、複数のプライマー分子及びプローブ分子が用いられる場合がある。この場合、プライマー分子及びプローブ分子のうち、少なくとも一部がオリゴヌクレオチド（６）であり得る。例えば、オリゴヌクレオチド（６）を含まないフォワードプライマー、オリゴヌクレオチド（６）を含まないリバースプライマー及びオリゴヌクレオチド（６）を含むプローブが用いられる。
　核酸増幅法としては、標的核酸を選択的に増幅できるものである限り、特に制限されない。核酸増幅法の例としては、ＰＣＲ法（ホットスタートＰＣＲ法、マルチプレックスＰＣＲ法、ネステッドＰＣＲ法、ＲＴ－ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、デジタルＰＣＲ法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ法、クランプＰＣＲ法などを含む）、ＮＡＳＢＡ法（米国特許第５１３０２３８号明細書参照）、ＴＭＡ法（米国特許第５３９９４９１号明細書参照）、ＴＲＣ法（米国特許出願公開第２００１／００５３５１８号明細書参照）、ＬＡＭＰ法（米国特許第６４１０２７８号明細書参照）、ＩＣＡＮ法（米国特許出願公開第２００３／０７３０８１号明細書参照）、ＬＣＲ法（欧州特許出願番号３２０３２８号参照）、ＳＤＡ法（米国特許第５４５５１６６号明細書参照）などが挙げられる。
　一実施態様において、工程（Ｉ）の核酸増幅法は、クランプＰＣＲ法であることが好ましい。クランプＰＣＲ法では、少なくともプライマー及びクランプ核酸が用いられる。プライマー及びクランプ核酸のいずれか又は両方が、オリゴヌクレオチド（６）を含み得る。
　クランプ核酸は、通常、標的核酸（例：変異型遺伝子）に比べて、検査試料中の非標的核酸（例：野生型遺伝子）をより強くクランプする。クランプ核酸が非標的核酸に強く結合し、非標的核酸の増幅が阻害されることによって、標的核酸を選択的に増幅することができる。例えば、特定の遺伝子の変異を検出する場合、野生型の遺伝子配列に完全に相補的な塩基配列を有するクランプ核酸の存在下で核酸増幅を行うことにより、野生型の核酸の増幅が阻害され、変異型の核酸が選択的に増幅される。
　具体的には、例えば、標的核酸の標的部位を変異型遺伝子の変異箇所とし、この変異箇所（標的核酸の標的部位）を含む塩基配列を「配列Ａ」とするとき、クランプ核酸は、非標的核酸である野生型遺伝子における配列Ａに相応する塩基配列に対して完全に相補的である。
　オリゴヌクレオチド（６）は、配列選択性を有する。したがって、オリゴヌクレオチド（６）を含むクランプ核酸は、１塩基でも相違する塩基配列に対する結合能は弱く、完全に相補的な塩基配列には特異的に結合し得る。
　クランプ核酸の長さは、特に限定されるものではないが、例えば５～３０ｍｅｒである。
　工程（Ｉ）の核酸増幅は、逆転写反応であってもよい。逆転写反応では、ＲＮＡを鋳型としてＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによってｃＤＮＡが合成される。オリゴヌクレオチド（６）はＲＮＡと結合するため、検査試料中の特定のＲＮＡとオリゴヌクレオチド（６）とを結合させ、当該ＲＮＡからの逆転写反応を阻害することができる。これにより、標的のＲＮＡから、より特異的にｃＤＮＡを合成することができる。合成されたｃＤＮＡをＰＣＲ法などでさらに増幅してもよい。
　標的核酸は、検査試料中に含まれるものであってもよい。検査試料は、典型的には、生体から採取された試料（以下、「生体試料」ともいう）である。通常は、生体から採取された試料から夾雑物の除去、核酸の抽出・精製、プレアンプリフィケーションなどの前処理により得られる試料が用いられる。具体的には、血液、血漿、血清、胸水、気管支洗浄液、骨髄液、リンパ液、腸管洗浄液、切除組織、鼻咽頭拭い液、唾液、鼻汁、喀痰などを用いることができる。またこれらに上記の前処理を行った試料も、「生体試料」に含まれる。本発明の方法は、非常に高感度で核酸を検出し得るため、例えば、正常細胞と異常細胞とが混在する切除組織を用い、異常細胞に由来する遺伝子変異を検出することができる。また、検査試料が微量な場合や、検査試料中の核酸が微量な場合にも、本発明の方法が好適に用いられる。検査試料は標的核酸を含む溶液であることが好ましい。血液や切除組織に含まれる細胞内の標的核酸を検出する場合は、公知の方法により細胞の可溶化を行ってもよい。生体試料の他には、排泄物、下水、河川水、海水、土壌、これらに上記の前処理を行った試料などの検査試料が用いられ得る。排泄物としては、例えば尿、糞便などが挙げられる。
　標的核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。ＤＮＡは、ＲＮＡから逆転写反応により合成されたｃＤＮＡであってもよい。標的核酸は、遺伝子、遺伝子のプロモータ領域などゲノムＤＮＡ上の特定の領域であり得る。本発明の検出方法は、標的核酸の標的部位における変異、多型等の検出に用いられ得る。また、本発明の検出方法は対立遺伝子の決定に用いられ得る。検査試料にどのような型の対立遺伝子が含まれるかを検出することができる。また、本発明の検出方法は、メチル化の検出にも用いられ得る。標的核酸をバイサルファイト処理した後、本発明の検出方法を適用することにより、標的核酸におけるメチル化シトシンの存否を検出することができる。
　変異を含む遺伝子（以下、変異型遺伝子）は、野生型遺伝子の塩基配列との相違、即ち変異を有する。当該相違は、置換、挿入、欠失、逆位、重複、及び転座からなる群から選択される１つ以上の変異又はそれらの組合せに起因するものである。
　当該相違は、通常、特定の疾患の発症及び／又は治療感受性に関連する場合がある。ここで、「発症」とは、疾患の実際の発症のみならず、発症リスクなども含む。また、「治療感受性」とは、薬物などによる治療の奏効率のみならず、副作用の強弱なども含む。上記疾患としては、例えば、癌、骨髄異形成症候群、感染症などが挙げられるが、これらに限定されない。上記疾患の好適な例は、癌である。
　前記遺伝子の好適な例は、ＡＢＬ／ＢＣＲ融合遺伝子、ＨＥＲ２遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、ｃ－ＫＩＴ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＢＲＡＦ遺伝子、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子、ＦＬＴ３遺伝子、ＭＹＣ遺伝子、ＭＹＣＮ遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＢＣＬ２遺伝子、又はＥＭＬ４／ＡＬＫ融合遺伝子などである。
　工程（II）では、上記の核酸増幅の方法に応じて、公知の方法により増幅された核酸を検出することができる。例えば、反応液から生じる蛍光や反応液の濁度を検出することによって、増幅を定性的または定量的に検出することができる。
　また、増幅された標的核酸を検出する方法として、塩基配列解析法などが例示される。増幅された標的核酸の塩基配列を公知の配列解析装置（シーケンサー）を用いて解析することにより、標的核酸を検出することができる。
　なお、検査試料における標的核酸を検出する方法は、例えば米国特許出願公開第２０１５／２４０２９９号明細書に記載の方法を採用することもできる。
　本発明は、オリゴヌクレオチド（６）と標識とを含むプローブと、標的核酸を含む検査試料とを反応させる工程を含む、検査試料中の標的核酸を検出する方法を包含する。当該検出方法の具体例としては、in situ hybridizationやマイクロアレイなどが挙げられる。
　検出方法としてin situ hybridizationを用いる場合、蛍光色素などで標識したオリゴヌクレオチド（６）を検査試料（例：細胞）中の標的核酸とハイブリダイズさせ、標識を測定することによって検査試料中の標的核酸を検出することができる。
　検出方法としてマイクロアレイを用いる場合、オリゴヌクレオチド（６）を含むプローブを固定化したマイクロアレイと、標的核酸を含む検査試料とを反応させ、標的核酸とプローブとのハイブリダイゼーションを検出することにより、標的核酸を検出することができる。
　このように、オリゴヌクレオチド（６）を用いれば、検査試料において標的核酸を配列選択的に検出することが可能である。
９．標的核酸を検出する、又は標的核酸を選択的に増幅するためのキット
　標的核酸を検出する、又は標的核酸を選択的に増幅するためのキットは、オリゴヌクレオチド（６）を含む。なお、標的核酸は、例えば、検査試料に含まれるものであり得る。
　キットにおいて、オリゴヌクレオチド（６）は、上で述べたとおり、標的核酸の増幅及び／又は検出におけるプライマー、プローブ、及び／又はクランプ核酸として用いられ得る。プライマー、プローブ、及び／又はクランプ核酸は、標的核酸や非標的核酸の塩基配列に応じて適宜設計することができる。
　一実施形態のキットは、プライマー及び／又はプローブを含む。これらのうちプライマー及び／又はプローブの少なくとも一部が、オリゴヌクレオチド（６）であり得る。
　図１Ａは、プライマー及びプローブを含む組成物を収容した容器を含むキットの一例の模式図である。キット１１は、外装箱１２と、外装箱１２内に設けられ、表面に凹部が形成された容器支持体と、凹部に装着され、プライマー及びプローブを含む組成物が収容された容器１３と、添付文書１４とを含む。添付文書１４には、キット１１の取り扱い方法、保管条件、使用期限などを記載しておくことができる。
　図１Ｂは、プライマーを含む組成物を収容した容器と、プローブを含む組成物を収容した容器とを含むキットの一例の模式図である。キット２１は、外装箱２２と、外装箱２２内に設けられ、表面に長手方向に沿って間隔をおいて第１の凹部及び第２の凹部が形成された容器支持体と、第１の凹部に装着され、プライマーを含む組成物が収容された容器２３ａと、第２の凹部に装着され、プローブを含むが収容された容器２３ｂと、添付文書２４とを含む。
　別の実施形態のキットは、フォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブを含む。これらのうち少なくとも一部が、オリゴヌクレオチド（６）であり得る。フォワードプライマーを含む組成物、リバースプライマーを含む組成物、及びプローブを含む組成物は、３種類全てが同じ容器に収容されていてもよいし（例：図１Ａに示されるようなキット）、いずれか２種類が同じ容器に収容されていてもよいし（例：図１Ｂに示されるようなキット）、３種類全てが別々の容器に収容されていてもよい。
　図１Ｃは、フォワードプライマーを含む組成物を収容した容器と、リバースプライマーを含む組成物を収容した容器と、プローブを含む組成物を収容した容器とを含むキットの一例の模式図である。キット３１は、外装箱３２と、外装箱３２内に設けられ、表面に長手方向に沿って間隔をおいて第１～第３の凹部が形成された容器支持体と、第１の凹部に装着され、フォワードプライマーを含む組成物が収容された容器３３ａと、第２の凹部に装着され、リバースプライマーを含む組成物が収容された容器３３ｂと、第３の凹部に装着され、プローブを含む組成物が収容された容器３３ｃと、添付文書３４とを含む。
　また別の実施態様のキットは、クランプ核酸及びプライマーを含む。これらのうち少なくとも一部が、オリゴヌクレオチド（６）であり得る。このキットは、標的核酸を選択的に増幅するためのキットであり得る。クランプ核酸を含む組成物及びプライマーを含む組成物は、同じ容器に収容されていてもよいし（例：図１Ａに示されるようなキット）、別々の容器に収容されていてもよい（例：図１Ｂに示されるようなキット）。
　さらに別の実施形態のキットは、クランプ核酸、プライマー及びプローブを含む。これらのうち少なくとも一部が、オリゴヌクレオチド（６）であり得る。クランプ核酸を含む組成物、プライマーを含む組成物、及びプローブを含む組成物は、３種類全てが同じ容器に収容されていてもよいし（例：図１Ａに示されるようなキット）、いずれか２種類が同じ容器に収容されていてもよいし（例：図１Ｂに示されるようなキット）、３種類全てが別々の容器に収容されていてもよい（例：図１Ｃに示されるようなキット）。
　キットには、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、リアクションバッファー、塩、制限酵素等が含まれていてもよい。
　本発明は、標的核酸を検出する、又は標的核酸を選択的に増幅するための、オリゴヌクレオチド（６）の使用を含む。ここで使用されるオリゴヌクレオチド（６）は、例えば、キットに含有されるオリゴヌクレオチド（６）と同じ特徴を有する。
１０．医薬組成物（又は製剤）
　本発明の医薬組成物（又は製剤）は、化合物（１）又はオリゴヌクレオチド（６）を含んでいる。化合物（１）を含む医薬組成物（又は製剤）としては、例えば、核酸系逆転写酵素阻害剤（Nucleoside Analogue Reversetranscriptase Inhibitor：ＮＲＴＩ）であるＡＺＴ（azidothymidine）などの低分子医薬品が挙げられる。オリゴヌクレオチド（６）を含む医薬組成物（又は製剤）としては、例えば、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）、アプタマー、デコイ核酸、ＣｐＧオリゴヌクレオチドなどの中分子、あるいは高分子の核酸医薬品などが挙げられる。
　医薬組成物は、液状製剤（例：注射剤、点眼剤、点鼻剤、懸濁剤など）、固形製剤（例：錠剤、顆粒剤、散剤など）、半固形製剤（例：軟膏剤、坐剤など）、その他当業者に公知の製剤形態のいずれであってもよい。
　医薬組成物の好適な例は、非経口投与製剤（例：皮下投与剤、静脈内投与剤、経鼻腔投与剤、髄腔内投与剤、脳室内投与剤、硝子体投与剤など）である。
　医薬組成物の他の好適な例は、局所用製剤である。
　医薬組成物は、通常、さらに薬学上許容される担体又は添加剤を含んでいる。
　担体は、固体担体及び液体担体を包含する。固体担体の例としては、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム二水和物、ショ糖、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアガム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、アテロコラーゲンなどが挙げられる。液体担体の例としては、水（生理食塩水を含む）などが挙げられる。
　添加剤は、安定剤を包含し、その例としては、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；ベンジルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾール等のフェノール類）などが挙げられる。
　オリゴヌクレオチド（６）は、配列選択性を有し、ヌクレアーゼに対して分解されにくい。したがって、化合物（１）又はオリゴヌクレオチド（６）を含んだ医薬組成物（又は製剤）は、体内においてターゲット（例:標的遺伝子）を配列選択的に捉えて作用し得る。
　以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［化合物（１）の合成例］
　合成例における記号及び略号は、以下のとおりである。
　Ａｃ２Ｏ：無水酢酸
　ＡｃＯＨ：酢酸
　ＡｇＢＦ４：テトラフルオロほう酸銀
　ＡｇＯＴｆ：トリフルオロメタンスルホン酸銀
　ＡＩＢＮ：２，２’－アゾビス(イソブチロニトリル)
　ＢｎＢｒ：ベンジルブロミド
　ＢＳＡ：Ｎ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）アセトアミド
　Ｂｕ３ＳｎＨ：水素化トリブチルスズ
　ＢｚＣｌ：塩化ベンゾイル
　ＣＨ２Ｃｌ２：ジクロロメタン
　ＣＨ２＝ＣＨＣＨ２ＭｇＢｒ：アリルマグネシウムブロミド
　ＣＨ３ＣＮ：アセトニトリル
　（ＣＯＣｌ）２：塩化オキサリル
　ＤＭＡＰ：４－ジメチルアミノピリジン
　ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
　ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
　ＤＭＴｒＣｌ：４，４’－ジメトキシトリチルクロリド
　Ｅｔ３Ｎ：トリエチルアミン
　Ｅｔ２Ｏ：ジエチルエーテル
　ＥｔＯＨ：エタノール
　ＨＣＯＯＮＨ４：ギ酸アンモニウム
　Ｈ２ＳＯ４：硫酸
　（ｉ－Ｐｒ２Ｎ）２ＰＯＣ２Ｈ４ＣＮ：２－シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイト
　ＬｉＯＨ：水酸化リチウム
　Ｍｅｌ：ヨウ化メチル
　ＭｓＣｌ：メタンスルホニルクロリド
　ＮａＢＨ４：水素化ほう素ナトリウム
　ＮａＨ：水素化ナトリウム
　ＮａｌＯ４：過よう素酸ナトリウム
　ＮＭＯ：４－メチルモルホリンＮ－オキシド
　ＯｓＯ４：酸化オスミウム（VIII）
　Ｐｄ（ＯＨ）２－Ｃ：水酸化パラジウム－炭素粉末
　Ｐｈ３Ｐ＋ＣＨ３Ｂｒ－：メチルトリフェニルホスホニウムブロミド
　ＴＢＡＦ：フッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム
　ＴＢＤＰＳＣｌ：ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルクロロシラン
　ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
　ＴＭＳＯＴｆ：トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル
　ＴｓＣｌ：ｐ－トルエンスルホニルクロリド
　ｒｔ：室温
　ｈ：時間
　ｍｉｎ：分
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
＜化合物A-1の合成＞
　アルゴン気流下、化合物1（30.0 g, 96.67 mmol）をジクロロメタン（300 mL）に溶解し、トリエチルアミン（4.2 mL, 299.66 mmol）、ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルクロロシラン（40.0 mL, 154.66 mmol）を氷浴下で順次加え、室温下で19時間攪拌した。反応液を冷却し水で反応を停止させた後、ジクロロメタンで希釈をおこない、有機層と水層にそれぞれ分画した。水層はジクロロメタンで抽出をおこない、最初の分画で得られた有機層と抽出で得られた有機層を合わせて、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝4：1～0：1）によって精製し、化合物A-1（35.4 g, 収率67%）を白色固体として得た。
1H NMR（CDCl3）δ 0.99 (9H, s), 1.37 (3H, s), 1.65 (3H, s), 2.39-2.42 (1H, m), 3.68, 3.78 (2H, ABq, J=11.0 Hz), 3.77-3.88 (2H, m), 4.44 (1H, d, J=5.0 Hz), 4.52, 4.82 (2H, ABq, J=12.0 Hz), 4.70 (1H, dd, J=4.0 Hz, 5.0 Hz), 5.82 (1H, d, J=4.0 Hz), 7.29-7.45 (11H, m), 7.59-7.64 (4H, m). 
＜化合物A-2の合成＞
　アルゴン気流下、化合物A-1（35.4 g, 63.16 mmol）をジクロロメタン（420 mL）に溶解し、トリエチルアミン（27.0 mL, 194.25 mmol）、ｐ－トルエンスルホニルクロリド（15.9 g, 83.88 mmol）、４－ジメチルアミノピリジン（0.79 g, 6.45 mmol）を氷冷下で順次加え、室温下で16時間攪拌した。反応液を冷却し水で反応を停止させた後、ジクロロメタンで希釈をおこない有機層と水層にそれぞれ分画した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝10：1）によって精製し、化合物A-2（44.1 g, 97%）を白色固体として得た。
1H NMR（CDCl3）δ 0.96 (9H, s), 1.29 (3H, s), 1.33 (3H, s), 2.38 (3H, s), 3.55, 3.71 (2H, ABq, J=10.5 Hz), 4.33, 4.49 (2H, ABq, J=10.5 Hz), 4.33 (1H, d, J=4.5 Hz), 4.51, 4.70 (2H, ABq, J=12.0 Hz), 4.57 (1H, dd, J=3.5 Hz, 4.5 Hz), 5.70 (1H, d, J=3.5 Hz), 7.20-7.22 (2H, m), 7.27-7.46 (11H, m), 7.55-7.59 (4H, m), 7.70-7.72 (2H, m). 
＜化合物A-3の合成＞
　化合物A-2（77.54 g, 110.31 mmol）をテトラヒドロフラン（800 mL）に溶解し、フッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（1M in テトラヒドロフラン, 126.0 mL, 126.0 mmol）を順次加え、室温で2.5時間攪拌した。得られた反応液の溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝3：2～0：1）によって精製し、化合物A-3（50.91 g, 99%）を白色固体として得た。
1H NMR（CDCl3）δ 1.27 (3H, s), 1.33 (3H, s), 1.76-1.79 (1H, m), 2.43 (3H, s),  3.38-3.43 (1H, m), 3.78 (1H, dd, J=3.5 Hz, 12.0 Hz), 4.22 (1H, d, J=5.0 Hz), 4.28 (1H, d, J=11.0 Hz), 4.52-4.58 (3H, m), 4.72 (1H, d, J=12.0 Hz), 5.69 (1H, d, J=4.0), 7.30-7.39 (7H, m), 7.78-7.81 (2H, m).
＜化合物A-4の合成＞
　アルゴン気流下、塩化オキサリル（9.7 mL, 113.0 mmol）をジクロロメタン（135 mL）に溶解し、ドライアイス－アセトンで冷却した。ジメチルスルホキシド（12.8 mL, 180.8 mmol）、ジクロロメタン溶液（135 mL）を反応液にゆっくり滴下しそのまま20分攪拌し、化合物A-3（20.4 g, 43.85 mmol）のジクロロメタン溶液（350 mL）を反応液にゆっくり滴下しそのまま15分攪拌した。続いてトリエチルアミン（50.2 mL, 361.6 mmol）を反応液にゆっくり滴下し、室温に昇温後1時間攪拌した。反応液を冷却し、水で反応を停止させた後、有機層と水層にそれぞれ分画した。水層はジクロロメタンで抽出をおこない、最初の分画で得られた有機層と抽出で得られた有機層を合わせて、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去することにより中間体を得た。続いて、アルゴン気流下、水素化ナトリウム（60% in ミネラルオイル, 4.5 g, 113.0 mmol）をジメチルスルホキシド（45 mL）に溶解し、80 ℃で50分攪拌し、室温に冷却後、メチルトリフェニルホスホニウムブロミド（40.3 g, 113.0 mmol）ジメチルスルホキシド溶液（150 mL）を加えて20分間攪拌した。続いて、先に得られた中間体のジメチルスルホキシド溶液（105 mL）を反応液に加えてそのまま1.5時間攪拌した。反応液を冷却し、水で反応を停止させた後、酢酸エチルで希釈をおこない有機層と水層にそれぞれ分画した。水層は酢酸エチルで抽出をおこない、最初の分画で得られた有機層と抽出で得られた有機層を合わせて、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝6：1～1：1）によって精製し、化合物A-4（17.6 g, 84%）を淡黄色油状物として得た。
1H NMR（CDCl3）δ 1.28 (3H, s), 1.32 (3H, s), 2.42 (3H, s), 3.80 (1H, d, J=5.0 Hz), 4.36 (1H, d, J=10.5 Hz), 4.51-4.57 (3H, m), 4.72 (1H, d, J=11.5 Hz), 5.13 (1H, dd, J=1.0 Hz, 11.0 Hz), 5.30 (1H, dd, J=1.0 Hz, 17.0 Hz), 5.76 (1H, d, J=4.0 Hz), 5.82 (1H, dd, J=11.0 Hz, 17.0 Hz), 7.29-7.39 (7H, m), 7.77-7.81 (2H, m).
＜化合物A-5の合成＞
　アルゴン気流下、化合物A-4（2.45 g, 5.31 mmol）を酢酸（37 mL）に溶解し、無水酢酸（27.0 mL, 194.25 mmol）、硫酸（25 mg, 0.25 mmol）を室温下で順次加え、そのまま2時間攪拌した。反応液を冷却し飽和重曹水で中和した後、水と酢酸エチルで希釈をおこない、有機層と水層にそれぞれ分画した。水層は酢酸エチルで抽出をおこない、最初の分画で得られた有機層と抽出で得られた有機層を合わせて、飽和重曹水と飽和食塩水で順次洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去することにより中間体を得た。続いて得られた中間体をアセトニトリルで共沸乾燥をおこない、窒素気流下、アセトニトリル（53 mL）に溶解させた。チミン（1.07 g, 8.50 mmol）、Ｎ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（5.3 mL, 21.24 mmol）を順次加え、50 ℃で15分間攪拌した。続いてトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（1.2 mL, 6.90 mmol）を加えて2時間加熱還流した。反応液を氷冷し飽和重曹水で反応を停止させた後、酢酸エチルで希釈をおこない有機層を分画した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝3：2～1：3）によって精製し、化合物A-5（2.28 g, 75%）を白色泡状固体として得た。
1H NMR（CDCl3）δ 1.91 (3H, d, J=1.0 Hz), 2.07 (3H, s), 2.43 (3H, s), 4.20 (2H, ABq, J=10.0 Hz), 4.40 (1H, d, J=6.0 Hz), 4.54 (2H, ABq, J=11.0 Hz), 5.26-5.35 (2H, m), 5.41 (1H, dd, J=4.5 Hz, 6.0 Hz), 5.72 (1H, d, J=4.5 Hz), 5.87 (1H, dd, J=11.0 Hz, 17.5 Hz), 6.97 (1H, d, J=1.0 Hz), 7.24-7.38 (7H, m), 7.74-7.78 (2H, n), 8.52 (1H, s).
＜化合物A-6の合成＞
　化合物A-5 (8.19 g, 14.43 mmol)をアセトン（140 mL）に溶解し、水（20 mL）、４－メチルモルホリンＮ－オキシド（5.25 g, 44.82 mmol）、酸化オスミウム（VIII）（76 mg, 0.30 mmol）を室温下で順次加え、そのまま22時間攪拌した。続いて4-メチルモルホリンN-オキシド（0.50 g, 4.27 mmol）を加えてさらに1時間攪拌した。飽和硫酸水素カリウム水溶液と水で反応を停止させた後、析出物を濾去し得られた濾液を回収した。回収した濾液を酢酸エチルと飽和重曹水で希釈し有機層と水層にそれぞれ分画した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝1：2～0：1）によって精製し、化合物A-6（6.80 g, 78%）を白色泡状固体として得た。
HRMS(MALDI): calcd for C28H32N2NaO11S [M+Na+] 627.1619, found 627.1611.
＜化合物A-7の合成＞
　窒素気流下、化合物A-6（0.32 g, 5.31 mmol）をピリジン（10 mL）に溶解し、12時間加熱還流した。反応液を冷却し、水で反応を停止させた後、酢酸エチルと飽和食塩水で希釈をおこない有機層を分画した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝1：1）によって精製し、化合物A-7（0.18 g, 82%）を白色泡状固体として得た。
HRMS(MALDI): calcd for C21H24N2NaO8 [M+Na+] 455.1425, found 455.1420.
＜化合物A-8の合成＞
　アルゴン気流下、化合物A-7（1.94 g, 4.49 mmol）をピリジン（20 mL）に溶解し、４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（3.05 g, 8.99 mmol）を室温下で加え、80 ℃で11時間攪拌した。メタノールを加えて反応を停止させた後、酢酸エチル、水で希釈をおこない、有機層と水層にそれぞれ分画した。水層は酢酸エチルで抽出をおこなった。最初の分画で得られた有機層と抽出で得られた有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝3：2～0：1）によって精製し、化合物A-8（2.76 g, 84%）を黄色泡状固体として得た。
HRMS(MALDI): calcd for C42H42N2NaO10 [M+Na+] 757.2732, found 757.2733.
＜化合物A(α)-9、A(β)-9の合成＞
　化合物A-8（2.74 g, 3.73 mmol）をテトラヒドロフラン（42 mL）に溶解し、40%メチルアミン水溶液（4.8 mL, 57.15 mmol）を氷冷下で加え、そのまま30分間、室温下で3時間攪拌した。得られた反応液の減圧留去をおこなった後、残渣を酢酸エチル、水で希釈をおこない、有機層と水層にそれぞれ分画した。水層は酢酸エチルで抽出をおこなった。最初の分画で得られた有機層と抽出で得られた有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝1：0～70：1）によって精製し、化合物A(α)-9（1.14 g, 44%）と化合物A(β)-9（0.79 g, 30%）を白色泡状固体としてそれぞれ得た。
化合物A(α)-9
1H NMR（CDCl3）δ 1.80 (3H, d, J=1.0 Hz), 3.13 (1H, d, J=6.5 Hz), 3.13-3.17 (1H, m), 3.29-3.32 (1H, m), 3.78 (3H, s), 3.78 (3H, s), 3.84, 4.21 (2H, ABq, J=10.0 Hz), 3.94 (1H, t, J=5.5 Hz), 4.05-4.09 (1H, m), 4.79, 4.88 (2H, ABq, J=11.5 Hz), 4.78 (1H, d, J=6.0 Hz), 5.62 (1H, d, J=6.0 Hz), 6.80-6.83 (4H, m), 6.85 (1H, d, J=1.0 Hz), 7.21-7.45 (14H, m), 8.43 (1H, s).
化合物A(β)-9
1H NMR（CDCl3）δ 1.45 (3H, s), 3.07-3.10 (1H, m), 3.50 (1H, t, J=9.0 Hz), 3.76 (1H, d, J=5.5 Hz), 3.77 (6H, s), 3.83, 3.92 (2H, ABq, J=11.0 Hz), 4.00-4.04 (1H, m), 4.22-4.26 (1H, m), 4.30, 4.50 (2H, ABq, J=11.5 Hz), 5.87 (1H, d, J=3.5 Hz), 6.82-6.85 (4H, m), 7.15-7.52 (14H, m), 7.81 (1H, s), 8.97 (1H, brs).
＜化合物A(α)-10の合成＞
　窒素気流下、化合物A(α)-9（0.38 g, 0.54 mmol）をテトラヒドロフラン（6 mL）に溶解し、水素化ナトリウム（60% in ミネラルオイル, 0.066 g, 1.64 mmol）、ヨウ化メチル（0.27 mL, 4.38 mmol）を氷冷下で順次加え、そのまま3時間攪拌した。反応液を冷却し、水で反応を停止させた後、酢酸エチルで希釈をおこない有機層と水層にそれぞれ分画した。水層は酢酸エチルで抽出をおこなった。最初の分画で得られた有機層と抽出で得られた有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝1：1～2：3）によって精製し、化合物A(α)-10（0.35 g, 92%）を白色泡状固体として得た。
1H NMR（CDCl3）δ 1.68 (3H, s), 3.07-3.11 (1H, m), 3.27-3.31 (1H, m), 3.42 (3H, 1H, d, J=1.0 Hz), 3.78 (6H, s), 3.79, 4.30 (2H, ABq, J=10.5 Hz), 3.80-3.82 (1H, m), 4.02 (1H, t, J=6.0 Hz), 4.70 (1H, d, J=5.0 Hz), 4.76, 4.86 (2H, ABq, J=11.5 Hz), 5.82 (1H, d, J=3.5 Hz), 6.77-6.80 (4H, m), 6.90 (1H, s), 7.20-7.45 (14H, m), 8.28 (1H, s).
＜化合物A(β)-10の合成＞
　窒素気流下、化合物A(β)-9（0.79 g, 1.14 mmol）をテトラヒドロフラン（12 mL）に溶解し、水素化ナトリウム（60% in ミネラルオイル, 0.137 g, 3.42 mmol）、ヨウ化メチル（0.57 mL, 9.12 mmol）を氷冷下で順次加え、そのまま3時間攪拌した。反応液を冷却し、水で反応を停止させた後、酢酸エチルで希釈をおこない有機層を分画した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝1：1～1：2）によって精製し、化合物A(β)-10（0.75 g, 93%）を白色泡状固体として得た。
1H NMR（CDCl3）δ 1.21 (3H, d, J=1.0 Hz), 2.96-3.00 (1H, m), 3.47 (1H, dd, J=8.5 Hz, 9.5 Hz), 3.51 (3H, s), 3.69 (1H, dd, J=1.0 Hz, 5.5 Hz), 3.76 (3H, s), 3.77 (3H, s),  3.80, 4.01 (2H, ABq, J=11.0 Hz), 3.85 (1H, d, J=5.5 Hz), 4.15-4.17 (1H, m), 4.23, 4.43 (2H, ABq, J=11.5 Hz), 5.97 (1H, d, J=1.0 Hz), 6.80-6.84 (4H, m), 7.15-7.18 (2H, m), 7.24-7.33 (4H, m), 7.40-7.43 (2H, m), 7.99 (1H, d, J=1.0 Hz), 8.50 (1H, brs).
＜化合物A(α)-11の合成＞
　化合物A(α)-10（0.34 g, 0.48 mmol）をテトラヒドロフラン（14 mL）に溶解し、20%水酸化パラジウム－炭素粉末（34 mg）を室温下で加え、水素雰囲気下、常圧で0.5時間攪拌した。反応液を濾過、溶媒を減圧留去して得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝2：3～1：3）によって精製し、化合物A(α)-11（0.26 g, 88%）を白色泡状固体として得た。
1H NMR（CDCl3）δ 1.74 (3H, d, J=1.5 Hz), 2.81 (1H, d, J=5.5 Hz), 3.16 (1H, dd, J=5.0 Hz, 10.0 Hz), 3.33 (1H, dd, J=5.0 Hz, 10.0 Hz), 3.51 (3H, s), 3.74-3.76 (1H, m), 3.78, 4.22 (2H, ABq, J=11.0 Hz), 3.79 (6H, s), 4.05 (1H, t, J=5.0 Hz), 4.85 (1H, t, J=6.0 Hz), 5.84 (1H, d, J=4.0 Hz), 6.82-6.85 (5H, m), 7.22-7.30 (3H, m), 7.31-7.39 (4H, m), 7.46-7.49 (2H, m), 8.31 (1H, s).
＜化合物A(β)-11の合成＞
　化合物A(β)-10（0.72 g, 1.02 mmol）をテトラヒドロフラン（30 mL）に溶解し、20%水酸化パラジウム－炭素粉末（72 mg）を室温下で加え、水素雰囲気下、常圧で40分間攪拌した。反応液を濾過、溶媒を減圧留去して得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝2：3～1：4）によって精製し、化合物A(β)-11（0.47 g, 75%）を白色泡状固体として得た。
1H NMR（CDCl3）δ 1.29 (3H, d, J=1.0 Hz), 2.46 (1H, d, J=8.0 Hz), 3.08 (1H, dd, J=7.0 Hz, 8.5 Hz), 3.48-3.52 (1H, m), 3.56 (3H, s), 3.69 (1H, dd, J=2.5 Hz, 5.5 Hz), 3.74, 3.86 (2H, ABq, J=10.5 Hz), 3.80 (3H, s), 3.81 (3H, s), 3.87-3.90 (1H, m), 4.19 (1H, dd, J=7.5 Hz, 9.5 Hz), 6.00 (1H, d, J=2.5 Hz), 6.82-6.87 (4H, m), 7.25-7.35 (7H, m), 7.42-7.45 (2H, m), 7.90 (1H, d, J=1.5 Hz), 8.32(1H, brs).
＜化合物A(α)-12の合成＞
　窒素気流下、化合物A(α)-11（0.30 g, 0.48 mmol）をアセトニトリル（3.6 mL）に溶解し、４，５－ジシアノイミダゾール（63 mg, 0.53 mmol）、２－シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（0.19 mL, 0.58 mmol）を氷冷下で順次加え、室温で3時間攪拌した。続いて、４，５－ジシアノイミダゾール（30 mg, 0.25 mmol）、２－シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（95 μL, 0.29 mmol）を室温下で加え、さらに1.5時間攪拌した。水を加えて反応を停止させた後、酢酸エチルで希釈をおこない、有機層を分画した。有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝2：1）によって精製し、化合物A(α)-12（0.25 g, 63%）白色泡状固体として得た。
31P NMR（CDCl3）δ 150.1, 150.9.
HRMS(MALDI): calcd for C43H53N4NaO10P [M+Na+] 839.3392, found 839.3379.
＜化合物A(β)-12の合成＞
　窒素気流下、化合物A(β)-11（0.33 g, 0.53mmol）をアセトニトリル（4.0 mL）に溶解し、４，５－ジシアノイミダゾール（88 mg, 0.75 mmol）、２－シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（0.26 mL, 0.80 mmol）を氷冷下で順次加え、室温で4.5時間攪拌した。水を加えて反応を停止させた後、酢酸エチルで希釈をおこない、有機層を分画した。有機層を水、飽和食塩水で順次洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝2：1）によって精製し、化合物A(β)-12（0.32 g, 75%）白色泡状固体として得た。
31P NMR（CDCl3）δ 150.1, 151.1.
HRMS(MALDI): calcd for C43H53N4NaO10P [M+Na+] 839.3392, found 839.3396.
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
＜化合物B(β)-1の合成＞
　アルゴン気流下、塩化オキサリル（14.2 mL, 166.0 mmol）をジクロロメタン（230 mL）に溶解し、ドライアイス－アセトンで冷却した。ジメチルスルホキシド（20.0mL, 276.6 mmol）、ジクロロメタン溶液（230 mL）を反応液にゆっくり滴下しそのまま30分攪拌し、化合物A-3（51.4 g, 110.7 mmol）のジクロロメタン溶液（430 mL）を反応液にゆっくり滴下しそのまま25分攪拌した。続いてトリエチルアミン（68.0 mL, 486.9 mmol）を反応液にゆっくり滴下し、室温に昇温後40分間攪拌した。反応液を冷却し、水で反応を停止させた後、有機層と水層にそれぞれ分画した。水層はジクロロメタンで抽出をおこない、最初の分画で得られた有機層と抽出で得られた有機層を合わせて、１Ｎ塩酸、飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去することにより中間体を得た。続いて、アルゴン気流下、得られた中間体をジエチルエーテル（540 mL）に溶解し、ドライアイス－アセトンで冷却した。アリルマグネシウムブロミド（0.7M in ジエチルエーテル, 200.0 mL, 143.9 mmol）を反応液にゆっくり滴下した後、室温下で1.5時間攪拌した。反応液を冷却し、1Ｎ塩酸で反応を停止させた後、酢酸エチルで希釈をおこない有機層と水層にそれぞれ分画した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝3：1～2：1）によって精製し、化合物B(α)-1（21.5 g, 38%）を白色固体として、化合物B(β)-1（19.6 g, 35%）を淡黄色油状物として得た。
化合物B(α)-1
1H NMR（CDCl3）δ 1.27 (3H, s), 1.32 (3H, s), 1.88-1.99, 2.13-2.22 (2H, m), 2.43 (3H, s), 3.97 (1H, dd, J=3.0, 10.5), 4.25 (1H, d, J=4.5 Hz), 4.34, 4.60 (2H, ABq, J=11.0), 4.48, 4.71 (2H, ABq, J=11.5), 4.56-4.59 (1H, dd, m), 4.98-5.06 (2H, m), 5.70-5.84 (1H, m), 5.73 (1H, d, J=3.5 Hz), 7.31-7.40 (7H, m), 7.78-7.83 (2H, m).
化合物B(β)-1
1H NMR（CDCl3）δ 1.28 (3H, s), 1.36 (3H, s), 1.90 (1H, d, J=6.5), 1.98-2.09, 2.29-2.35 (2H, m), 2.43 (3H, s), 3.77-3.85 (1H, m), 4.24 (1H, d, J=5.0 Hz), 4.30, 4.59 (2H, ABq, J=10.0), 4.52 (1H, dd, J=3.5, 5.0), 4.60, 4.72 (2H, ABq, J=12.0), 5.06-5.14 (2H, m), 5.64 (1H, d, J=3.5 Hz), 5.75-5.89 (1H, m), 7.26-7.39 (7H, m), 7.77 (2H, d, J=8.5). 
＜化合物B-2の合成＞
　アルゴン気流下、化合物B(β)-1（300 mg, 0.61 mmol）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（6 mL）に溶解し、水素化ナトリウム（60% in ミネラルオイル, 32 mg, 0.79 mmol）を氷冷下で加え、そのまま30分間攪拌した。続いてベンジルブロミド（94 μL, 0.79 mmol）を氷冷下で加え、そのまま4.5時間攪拌した。反応液を冷却し、水で反応を停止させた後、酢酸エチルで希釈をおこない有機層を分画した。水層は酢酸エチルで抽出をおこなった。最初の分画で得られた有機層と抽出で得られた有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝4：1～1：1）によって精製し、化合物B-2（288 mg, 79%）を淡黄色油状物として得た。
1H NMR（CDCl3）δ 1.27 (3H, s), 1.30 (3H, s), 2.15-2.25, 2.28-2.36 (2H, m), 2.39 (3H, s), 3.85 (1H, dd, J=4.0, 7.5), 4.10 (1H, d, J=5.0), 4.35, 4.63 (2H, ABq, J=10.5), 4.38, 4.53 (2H, ABq, J=10.0), 4.42 (1H, dd, J=3.5, 5.0), 4.46, 4.60 (2H, ABq, J=12.5), 5.00-5.10 (2H, m), 5.60 (1H, d, J=3.5), 5.82-5.96 (1H, m), 7.19-7.32 (12H, m), 7.79-7.82 (2H, m).
＜化合物B-3の合成＞
　アルゴン気流下、化合物B-2（15.21 g, 25.57 mmol）を酢酸（122 mL）に溶解し、無水酢酸（19.3 mL, 204.6 mmol）、硫酸（74 mg, 0.75 mmol）を室温下で順次加え、そのまま4時間攪拌した。反応液を冷却し、飽和重曹水で中和した後、水と酢酸エチルで希釈をおこない、有機層と水層にそれぞれ分画した。水層は酢酸エチルで抽出をおこない、最初の分画で得られた有機層と抽出で得られた有機層を合わせて、飽和重曹水と飽和食塩水で順次洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去することにより中間体を得た。続いて得られた中間体をアセトニトリルで共沸乾燥をおこない、窒素気流下、アセトニトリル（250 mL）に溶解させた。チミン（5.48 g, 43.47 mmol）、Ｎ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（31.6 mL, 127.9 mmol）を順次加え、50℃で30分間攪拌した。続いてトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（6.2 mL, 35.80 mmol）を加えて2時間加熱還流した。反応液を氷冷し飽和重曹水で反応を停止させた後、酢酸エチルで希釈をおこない有機層を分画した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝2：1～1：2）によって精製し、化合物B-3（16.35 g, 88%）を白色泡状固体として得た。
1H NMR（CDCl3）δ 1.56 (3H, d, J=1.0), 1.94 (3H, s), 2.29-2.50 (2H, m),2.37 (3H, s), 3.87, 3.89 (1H, dd, J=3.5, 3.5), 4.00, 4.28 (2H, ABq, J=9.5), 4.35 (1H, d, J=5.5), 4.42, 4.58 (2H, ABq, J=11.0), 4.53, 4.71 (2H, ABq, J=10.0), 5.06-5.15 (2H, m), 5.29, 5.31 (1H, dd, J=6.0, 6.0), 5.82-5.96 (1H, m), 6.06 (1H, d, J=7.0), 7.19-7.41 (13H, m), 7.68 (2H, d, J=8.5), 8.14 (1H, s). 
＜化合物B-4の合成＞
　化合物B-3（0.99 g, 1.40 mmol）を１，４ージオキサン（18 mL）と水（6 mL）に溶解し、２，６－ルチジン（0.25 mL, 2.10 mmol）、酸化オスミウム（VIII）（14 mg, 0.056 mmol）、過よう素酸ナトリウム（0.90 g, 4.20 mmol）を室温下で順次加え、そのまま2.5時間攪拌した。反応液を水とジクロロメタンで希釈をおこない、有機層と水層にそれぞれ分画した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去することにより中間体を得た。続いて得られた中間体をエタノール（17 mL）に溶解し、水素化ほう素ナトリウム（74 mg, 1.96 mmol）を氷冷下で加え、室温で30分間攪拌した。水で反応を停止させた後、酢酸エチルと飽和食塩水で希釈をおこない有機層を分画した。水層は酢酸エチルで抽出をおこない、最初の分画で得られた有機層と抽出で得られた有機層を合わせて、1Ｎ塩酸、飽和食塩水で順次洗浄した後、無水ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝3：2～1：4）によって精製し、化合物B-4（0.64 g, 65%）を白色泡状固体として得た。
1H NMR（CDCl3）δ 1.64 (3H, s), 1.69-1.75 (1H, m), 1.86-1.96 (1H, m), 2.01 (3H, s), 2.40 (3H, s), 3.71-3.78 (2H, m), 4.07-4.13 (1H, m), 4.11, 4.31 (2H, ABq, J=9.5), 4.41 (1H, d, J=6.0), 4.45, 4.55 (2H, ABq, J=11.0), 4.65, 4.70 (2H, ABq, J=10.5), 5.38 (1H, t, J=6.0), 6.06 (1H, d, J=6.0), 7.17-7.38 (13H, m), 7.69 (2H, d, J=8.0), 8.79 (1H, s).
＜化合物B-7の合成＞
　アルゴン気流下、化合物B-4（7.22 g, 10.19 mmol）をジクロロメタン（68 mL）に溶解し、トリエチルアミン（2.15 mL, 15.28 mmol)を加えた。氷冷下で反応液にメタンスルホニルクロリド（0.87 mL, 11.21 mmol）を加え、室温で20分攪拌した。水で反応を停止させた後、ジクロロメタンと飽和食塩水で希釈を行い、有機層を分画した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去することにより中間体B-5を得た。
　続いて得られた中間体B-5をピリジン（157 mL）に溶解させ、40%メチルアミンメタノール溶液（97 mL, 947 mmol）を加えて室温で24時間、60℃で4時間、室温で13時間、60℃で3時間攪拌した。反応液の体積が半分になるまで溶媒を減圧留去した後、飽和食塩水、酢酸エチルで希釈して有機層を分画した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体からシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール：トリエチルアミン＝20：1：1～20：2：1）により中間体B-6を得た。
アルゴン気流下、得られた中間体B-6をテトラヒドロフラン（200 mL)に溶解させ、水素化ナトリウム（60% in ミネラルオイル, 998 mg, 24.94 mmol）を加え10分間攪拌した。続いてヨウ化メチル（518 μL, 8.31 mmol）を加えて3時間攪拌した。反応液を冷却し、水で反応を停止させた後、酢酸エチルで希釈をおこない有機層を分画した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝30：1～20：1) によって精製し、化合物B-7（2.04 g, 36%）を白色泡状固体として得た。
1H NMR（CDCl3）δ 1.34 (3H, d, J=1.0), 1.92-2.00 (2H, m), 2.04-2.11 (1H, m), 2.09 (1H, d, J=12.5), 2.31 (3H, s), 2.96-2.99 (1H, m), 3.28 (1H, d, J=12.0), 3.34-3.49 (1H, m), 3.53 (3H, s), 3.82 (1H, dd, J=3.0, 5.5), 4.15 (1H, d, J=6.0), 4.21, 4.59 (2H, ABq, J=10.5), 4.38, 4.73 (2H, ABq, J=11.5), 6.14 (1H, d, J=3.5), 7.14-7.17 (2H, m), 7.31-7.40 (8H, m), 7.76 (1H, d, J=1.0), 8.56 (1H, s).
＜化合物B-10の合成＞
　化合物B-7（1.92 g, 3.69 mmol）をエタノール（77 mL）に溶解し、20%水酸化パラジウム－炭素粉末（1.35 g）、ギ酸アンモニウム（2.33 g, 36.8 mmol）を順次加え、1時間加熱還流した。反応液を濾過、溶媒を減圧留去して得られた粗成績体からシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝50：1～30：1）により中間体B-8を得た。　得られた中間体B-8をピリジン（23 mL）に溶解し、無水酢酸（764 μL, 8.08 mmol）、４－ジメチルアミノピリジン（33 mg, 0.27 mmol）を順次加え、室温で1時間攪拌した。得られた反応液の溶媒を減圧留去し、残渣からシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝30：1）により中間体B-9を得た。
　得られた中間体B-9を酢酸（42 mL）に溶解し、20%水酸化パラジウム－炭素粉末（735 mg）、ギ酸アンモニウム（1.40 g, 22.17 mmol）を順次加え70℃で1時間攪拌した。反応液を濾過、溶媒を減圧留去して得られた粗成績体をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝50:1）によって精製し、化合物B-10（770 mg, 43%)を白色泡状固体として得た。
HRMS(MALDI): calcd for C17H26N3O7 [M+H+] 384.1765, found 384.1771.
＜化合物B-11の合成＞
　アルゴン気流下、化合物B-10（50 mg, 0.13 mmol）をピリジン（0.5 mL）、２，６－ルチジン（0.5 mL）の混合溶媒に溶解し、４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（88 mg, 0.26 mmol）とテトラフルオロほう酸銀（51 mg, 0.26 mmol）を順次加え、室温で1.5時間、50℃で4.5時間、室温で16時間攪拌した。水を加えて反応を停止させた後、酢酸エチルで希釈をおこない有機層を分画した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧蒸留した。得られた粗成績体をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール＝50：1～0：1）によって精製し、化合物B-11（26 mg, 23%）を淡黄色泡状固体として得た。
HRMS(MALDI): calcd for C38H44N3O9 [M+H+] 686.3072, found 686.3075.
＜化合物B-12の合成＞
　化合物B-11（86 mg, 0.12 mmol）を40%メチルアミンメタノール溶液（3.0 mL, 38 mmol）に溶解し、氷冷下で1時間、室温で2時間攪拌した。得られた反応液の溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、化合物B-12（75 mg, 93%）を白色固体として得た。
HRMS(MALDI): calcd for C36H42N3O8 [M+H+] 644.2966, found 644.2970.
＜化合物B-13の合成＞
　アルゴン気流下、化合物B-12（31 mg, 0.04 mmol）をアセトニトリルに溶解し、４，５－ジシアノイミダゾール（6 mg, 0.05 mmol）、２－シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（18 μL, 0.06 mmol）を氷冷下で順次加え、室温で30分間攪拌した。反応液を冷却し、飽和重曹水で反応を停止させた後、酢酸エチルで希釈を行い有機層を分画した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール＝10：1～5：1）によって精製し、化合物B-13（34 mg, 75%）を白色泡状固体として得た。
31P NMR（CDCl3）δ 150.0, 151.0.
HRMS(MALDI): calcd for C45H58N5NaO9P [M+Na+] 866.3864, found 866.3826.
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
＜化合物C-1の合成＞
　アルゴン気流下、化合物B-4（0.55 g, 0.77 mmol）をコリジン（10 mL）に溶解し、165℃で97時間攪拌した。反応液を水と酢酸エチル、飽和食塩水で希釈をおこない、有機層と水層にそれぞれ分画した。得られた有機層を1Ｎ塩酸、飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄した後、無水ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール＝1：0～10：1）によって精製し、化合物C-1（0.24 g, 60%）を白色泡状固体として得た。
1H NMR（CDCl3）δ 1.45 (3H, d, J=1.0), 1.87-2.07 (2H, m), 2.11 (3H, s), 3.23, 4.17 (2H, ABq, J=12.5), 3.33 (1H, dt, J=2.0, 12.0), 3.42-3.47, 4.03-4.08 (2H, m), 4.27 (1H, d, J=5.5), 4.28, 4.59 (2H, ABq, J=11.5), 4.32, 4.63 (2H, ABq, J=10.5), 5.36 (1H, t, J=5.5), 6.33 (1H, d, J=6.0), 7.24-7.42 (10H, m), 7.64 (1H, d, J=1.0), 8.14 (1H, s).
＜化合物C-2の合成＞
　化合物C-1（0.27 g, 0.51 mmol）をテトラヒドロフラン（6 mL）に溶解し、40%メチルアミン水溶液（0.56 mL, 6.71 mmol）を氷冷下で加え、氷冷下で4時間、室温で2時間攪拌した。40%メチルアミン水溶液（0.14 mL, 1.67 mmol）追加した後、室温で1.5時間攪拌した。得られた反応液の溶媒を減圧留去し、残渣を酢酸エチルで希釈をおこない、飽和食塩水で洗浄した後、無水ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝1：4～0：1）によって精製し、化合物C-2（0.21 g, 92%）を白色泡状固体として得た。
1H NMR（CDCl3）δ 1.50 (3H, d, J=1.0), 1.88-2.05 (2H, m), 3.24, 4.23 (2H, ABq, J=12.5), 3.33 (1H, dt, J=2.5, 11.5), 3.43-3.48, 4.00-4.08 (2H, m),3.52 (1H, d, J=9.0), 4.01 (1H, d, J=6.0), 4.32-4.39 (1H, m), 4.35, 4.65 (2H, ABq, J=11.0), 4.47, 4.75 (2H, ABq, J=11.5), 6.07 (1H, d, J=6.0), 7.25-7.40 (10H, m), 7.65 (1H, d, J=1.0), 8.92 (1H, s).
＜化合物C-3の合成＞
　アルゴン気流下、化合物C-2（50 mg, 0.10 mmol）をジクロロメタン（3 mL）に溶解し、４－ジメチルアミノピリジン（49 mg, 0.40 mmol）、クロロチオぎ酸ｐ－トリル（31 μL, 0.20 mmol）を室温下で順次加え、そのまま30分間攪拌した。反応液を水で希釈をおこない、有機層と水層にそれぞれ分画した。得られた有機層を1Ｎ塩酸、水、飽和食塩水で順次洗浄した後、無水ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝3：2～2：3）によって精製し、化合物C-3（62 mg, 95%）を白色泡状固体として得た。
1H NMR（CDCl3）δ 1.51 (3H, s), 1.91-1.99 (1H, m), 2.05-2.09(1H, m), 2.36 (3H,s), 3.21, 4.22 (2H, ABq, J=13.0), 3.33 (1H, dt, J=2.0, 12.5), 3.24, 4.23 (2H, ABq, J=12.5), 3.33 (1H, dt, J=2.5, 11.5), 3.46-3.49, 4.05-4.08 (2H, m), 4.41 (1H, d, J=11.5), 4.45 (1H, d, J=10.5), 4.48 (1H, d, J=5.5), 4.68 (1H, d, J=11.0), 4.76 (1H, d, J=11.0), 5.85 (1H, dd, J=5.5, 6.5), 6.56 (1H, d, J=7.0), 6.91 (2H, d, J=8.0), 7.19 (2H, d, J=8.5), 7.30-7.43 (10H, m), 7.63 (1H, s), 8.09 (1H, s).
＜化合物C-4の合成＞
　アルゴン気流下、化合物C-3（25 mg, 0.038 mmol）をトルエン（0.8 mL）に溶解し、２，２’－アゾビス(イソブチロニトリル)（1.3 mg, 7.74 μmol）、水素化トリブチルスズ（0.10 mL, 0.39 mmol）を室温下で順次加え、80℃で2時間攪拌した。得られた反応液の溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝3：2～1：2）によって精製し、化合物C-4（15 mg, 83%）を白色泡状固体として得た。
1H NMR（CDCl3）δ 1.53 (3H, d, J=1.0), 1.91-2.10 (2H, m), 2.14-2.23 (1H, m), 2.42-2.49 (1H, m), 3.36-3.44 (1H,m), 3.39, 4.11 (2H, ABq, J=12.5), 3.54-3.60 (1H, m), 4.06-4.11 (1H, m), 4.17 (1H, dd, J=2.5, 6.0), 4.30, 4.61 (2H, ABq, J=12.0), 4.38, 4.72 (2H, ABq, J=10.5), 6.43 (1H, dd, J=5.5, 8.0), 7.24-7.40 (10H, m), 7.78 (1H, d, J=1.0), 8.23 (1H, s).
＜化合物C-5の合成＞
　化合物C-4（0.90 g, 1.84 mmol）をテトラヒドロフラン（45 mL）に溶解し、20%水酸化パラジウム－炭素粉末（0.54 g）を室温下で加え、水素雰囲気下、常圧で0.5時間攪拌した。反応液を濾過、溶媒を減圧留去することで中間体を得た。続いて得られた中間体をピリジン（17 mL）に溶解し、無水酢酸（0.42 mL, 3.67 mmol）を加え、室温で15時間攪拌した。得られた反応液の溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール＝100：0～5：1）によって精製し、化合物C-5（0.20 g, 32%）を白色固体として得た。
1H NMR（DMSO-d6）δ 1.56-1.72 (2H, m), 1.77 (3H, d, J=1.0), 2.07 (3H, s), 2.12-2.23 (1H, m), 2.33-2.42 (1H, m), 3.19, 3.78 (2H, ABq, J=12.0), 3.27-3.36 (1H, m), 3.70-3.80 (2H, m), 5.42 (1H, dd, J=1.5, 6.5), 5.64 (1H, d, J=4.5), 6.24 (1H, dd, J=5.5, 9.0), 8.02 (1H, s), 11.4 (1H, s).
＜化合物C-6の合成＞
　アルゴン気流下、化合物C-5（0.13 g, 0.39 mmol）をピリジン（5 mL）、２，６－ルチジン（5 mL）の混合溶媒に溶解し、４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（1.06 g, 3.12 mmol）とトリフルオロメタンスルホン酸銀（0.80 g, 3.12 mmol）を順次加え、60℃で11時間攪拌した。水を加えて反応を停止させた後、酢酸エチルで希釈をおこない有機層を分画した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧蒸留した。得られた粗成績体をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール＝100：0～50：1）によって精製し、化合物C-6（0.19 g, 71%）を淡黄色泡状固体として得た。
1H NMR（DMSO-d6）δ 1.27-1.30 (1H, m), 1.67 (3H, s), 1.77-1.81 (1H, m), 1.95 (3H, s), 2.30-2.38 (1H, m), 2.47-2.57 (1H, m), 2.72-2.79 (1H, m), 2.92, 3.82 (2H, ABq, J=12.5), 3.17-3.22 (1H, m), 3.60-3.64 (1H, m), 3.74 (3H,s),3.74 (3H, s), 5.26 (1H, dd, J=3.5, 7.5), 6.22 (1H, 7, J=7.0), 6.82-6.93 (4H, m), 7.17-7.42 (9H, m), 8.02 (1H, s), 9.31 (1H, s).
＜化合物C-7の合成＞
　化合物C-6（0.18 g, 0.26 mmol）を40%メチルアミンメタノール溶液（7.3 mL, 69.9 mmol）に溶解し、室温下で0.5時間攪拌した。得られた反応液の溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝1：4～0：1）によって精製し、化合物C-7（0.15 g, 90%）を白色泡状固体として得た。
1H NMR（DMSO-d6）δ 1.21-1.30 (1H, m), 1.60 (3H, s), 1.74-1.89 (1H, m), 2.17-2.24 (1H, m), 2.35-2.44 (1H, m), 2.72 (1H, t, J=11.5), 2.98, 3.75 (2H, ABq, J=12.0), 3.15 (1H, dd, J=3.5, 11.5), 3.58-3.61 (1H, m), 3.74 (3H, s), 3.75 (3H, s), 4.14-4.22 (1H, m), 5.14 (1H, d, J=5.0), 6.21 (1H, dd, J=6.0, 7.5), 6.88-6.93 (4H, m), 7.20-7.41 (9H, m), 8.05 (1H, s), 11.4 (1H, s).
＜化合物C-8の合成＞
　アルゴン気流下、化合物C-7（0.14 g, 0.24 mmol）をアセトニトリル（2.2 mL）に溶解し、４，５－ジシアノイミダゾール（40 mg, 0.34 mmol）、２－シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（0.11 mL, 0.36 mmol）を氷冷下で順次加え、室温で2.5時間攪拌した。反応液を冷却し、水で反応を停止させた後、酢酸エチルで希釈を行い有機層を分画した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝1：1～2：3）によって精製し、化合物C-8（0.14 g, 75%）を白色泡状固体として得た。
31P NMR（Acetone-d6）δ 149.3, 149.9.
HRMS(MALDI): calcd for C43H53N4NaO9P [M+Na+] 823.3442, found 823.3458.
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
＜化合物C-9の合成＞
　アルゴン気流下、化合物C-1（5.64 g, 10.5 mmol）をトルエン（90 mL）に溶解し、Ｎ6-ベンゾイルアデニン（4.28g, 17.9 mmol）、Ｎ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（16.6 mL, 67.1 mmol）を順次加え、90℃で30分間攪拌した。続いてトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（3.2 mL, 17.9 mmol）を加えて90℃で2時間攪拌した。反応液を氷冷し飽和重曹水で反応を停止させた後、酢酸エチル、水で希釈をおこない、反応液をセライト濾過して濾液を回収して有機層を分画した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝1：4）によって精製し、化合物C-9（4.73 g, 69%）を白色泡状固体として得た。
1H NMR（CDCl3）δ 1.86-1.98 (2H, m), 2.10 (3H, s), 3.29-3.34 (1H, m), 3.29, 4.23 (2H, ABq, J=12.5), 3.43-3.78, 4.01-4.05 (2H, m), 4.21, 4.56 (2H, ABq, J=11.5), 4.26, 4.57 (2H, ABq, J=11.5), 4.46 (1H, d, J=5.0), 6.01 (1H, dd, J=5.0, 5.0), 6.48 (1H, d, J=5.0), 7.19-7.39 (10H, m), 7.51-7.65 (3H, m), 8.00-8.03 (2H, m), 8.47 (1H, s), 8.79 (1H, s), 8.90 (1H, s).
＜化合物C-10の合成＞
　化合物C-9（4.73 g, 7.28 mmol）をテトラヒドロフラン（80 mL）に溶解し、メタノール（64 mL）、水（16 mL）を順次加えた。続いて2M 水酸化ナトリウム水溶液（4.0mL, 8.00 mmol）を氷浴下で加え、そのまま1時間攪拌した。反応液に酢酸を加えて中和した後、反応液の溶媒を減圧留去し、得られた残渣を酢酸エチル、水で希釈をおこない、有機層を分画した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝1：4～0：1）によって精製し、化合物C-10（4.10 g, 92%）を白色泡状固体として得た。
1H NMR（CDCl3）δ 1.92-2.00 (2H, m), 3.29-3.39 (2H, m), 3.31 (1H, d, J=12.5), 3.42-3.51 (2H, m), 4.02-4.06 (1H, m), 4.15 (1H, d, J=5.5), 4.26 (1H, d, J=11.5), 4.30 (1H, d, J=11.5), 4.48 (1H, d, J=11.5), 4.62 (1H, d, J=11.5), 4.67 (1H, d, J=11.5), 4.83-4.89 (1H, m), 6.23 (1H, d, J=5.0), 7.18-7.41 (10H, m), 7.50-7.64 (3H, m), 8.02 (2H, d, J=7.5), 8.45 (1H, s), 8.74 (1H, s), 8.97 (1H, s).
＜化合物C-11の合成＞
　アルゴン気流下、化合物C-10（4.07 g, 6.70 mmol）をジクロロメタン（98 mL）に溶解し、４－ジメチルアミノピリジン（1.17 g, 9.58 mmol）、クロロチオぎ酸ｐ－トリル（1.2 mL, 8.20 mmol）を室温下で順次加え、そのまま1.5時間攪拌した。反応液を水で希釈をおこない、有機層と水層にそれぞれ分画した。得られた有機層を0.5N塩酸、飽和食塩水で順次洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝1：2～1：4）によって精製し、化合物C-11（4.82 g, 95%）を白色泡状固体として得た。
1H NMR（CDCl3）δ 1.95-2.02 (2H, m), 2.63-2.71 (1H, m), 2.74-2.82 (1H, m), 3.33-3.44 (1H, m), 3.43, 4.15 (2H, ABq, J=13.0), 3.52-3.57 (1H, m), 4.01-4.10 (1H, m), 4.24 (1H, dd, J=3.5, 6.0), 4.29 (1H, d, J=11.5), 4.34 (1H, d, J=11.5), 4.58 (1H, d, J=12.0), 4.67 (1H, d, J=11.5), 6.66 (1H, t, J=6.5), 7.19-7.40 (10H, m), 7.50-7.64 (3H, m), 8.01-8.04 (2H, m), 8.59 (1H, s), 8.76 (1H, s), 8.97 (1H, s).
＜化合物C-12の合成＞
　アルゴン気流下、化合物C-11（4.81 g, 6.34 mmol）をトルエン（126 mL）に溶解し、２，２’－アゾビス(イソブチロニトリル)（0.21 g, 1.29 mmol）、水素化トリブチルスズ（17.4 mL, 64.7 mmol）を室温下で順次加え、80℃で1時間攪拌した。得られた反応液の溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝1：1）によって精製し、化合物C-12（1.99 g, 53%）を白色泡状固体として得た。
1H NMR（CDCl3）δ 1.95-2.02 (2H, m), 2.63-2.71 (1H, m), 2.74-2.82 (1H, m), 3.33-3.44 (1H, m), 3.43, 4.15 (2H, ABq, J=13.0), 3.52-3.57 (1H, m), 4.01-4.10 (1H, m), 4.24 (1H, dd, J=3.5, 6.0), 4.29 (1H, d, J=11.5), 4.34 (1H, d, J=11.5), 4.58 (1H, d, J=12.0), 4.67 (1H, d, J=11.5), 6.66 (1H, t, J=6.5), 7.19-7.40 (10H, m), 7.50-7.64 (3H, m), 8.01-8.04 (2H, m), 8.59 (1H, s), 8.76 (1H, s), 8.97 (1H, s).
＜化合物C-13の合成＞
　アルゴン気流下、化合物C-12（0.40 g, 0.676 mmol）を40%メチルアミンメタノール溶液（4.0 mL, 38.2 mmol）に溶解し、室温下で0.5時間攪拌した。得られた反応液の溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール＝1：0～10：1）によって精製し、化合物C-13（0.32 g, 98%）を白色泡状固体として得た。
1H NMR（CDCl3）δ 1.96-2.03 (2H, m), 2.58-2.71 (2H, m), 3.30-3.48 (1H, m), 3.43, 4.14 (2H, ABq, J=12.5), 3.53-3.59 (1H, m), 4.02-4.07 (2H, m), 4.22 (1H, t, J=4.5), 4.27, 4.57 (2H, ABq, J=12.0), 4.37, 4.70 (2H, ABq, J=11.5), 5.63 (2H, brs), 6.60 (1H, t, J=6.5), 7.22-7.39 (10H, m), 8.32 (1H, s), 8.36 (1H, s).
＜化合物C-14の合成＞
　水素雰囲気下、化合物C-13（320 mg, 0.664 mmol）をメタノール（6.4 mL）に溶解し、20%水酸化パラジウム－炭素粉末（0.31 g）、ギ酸アンモニウム（2.51 g, 39.8 mmol）を順次加え60℃に加熱した。途中でギ酸アンモニウム（1.26 g, 19.9 mmol）を4回追加しながら6時間攪拌して反応液を濾過、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をメタノール（6.4 mL）に溶解し、20%水酸化パラジウム－炭素粉末（0.31 g）を加えて60℃で2.5時間攪拌した。反応液を濾過、溶媒を減圧留去することで中間体を得た。続いて、得られた中間体をピリジン（4 mL）に溶解し、塩化ベンゾイル（0.27 mL, 2.31 mmol）を室温下で加えてそのまま17.5時間攪拌した。反応液に水を加えて反応を停止させた後、酢酸エチルで希釈をおこない有機層を分画した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去することで中間体を得た。続いて、得られた中間体をテトラヒドロフラン（5 mL）に溶解し、1M水酸化リチウム水溶液（2.8 mL, 2.80 mmol）を室温下で加えてそのまま4時間攪拌した。反応液に酢酸を加えて中和した後、反応液の溶媒を減圧留去して中間体を得た。続いて、得られた中間体をピリジン（6 mL）に溶解し、無水酢酸（0.11 mL, 0.924 mmol）を室温下で加えてそのまま15時間攪拌した。反応液の溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール＝20：1～10：1）によって精製し、化合物C-14（73 mg, 24%）を淡黄色固体として得た。
1H NMR（CDCl3）δ 1.76-1.91 (3H, m), 2.15 (3H, s), 2.40 (1H, dd, J=5.0, 14.0), 3.35 (1H, d, J=12.0), 3.39-3.48 (1H, m), 3.81-3.90 (1H, m), 3.93-4.00 (1H, m), 4.04 (1H, d, J=12.5), 5.78 (1H, d, J=5.5), 6.31 (1H, d, J=11.5), 6.42 (1H, dd, J=5.0, 10.0), 7.47-7.65 (3H, m), 8.01-8.04 (2H, m), 8.09 (1H, s), 8.79 (1H, s), 9.14 (1H, s).
＜化合物C-15の合成＞
　アルゴン気流下、化合物C-14（73 mg, 0.163 mmol）をピリジン（1.6 mL）、２，６－ルチジン（1.6 mL）の混合溶媒に溶解し、４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（0.43 g, 1.28 mmol）とトリフルオロメタンスルホン酸銀（0.32 g, 1.28 mmol）を順次加え、60℃で11時間攪拌した。メタノールを加えて反応を停止させた後、酢酸エチルと水で希釈をおこない有機層を分画した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧蒸留した。得られた粗成績体をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝4：1）によって精製し、化合物C-15（95 mg, 79%）を淡黄色泡状固体として得た。
1H NMR（CD3OD）δ1.45-1.49 (1H, m), 1.74-1.94 (1H, m), 2.00 (3H, s), 2.59-2.67 (1H, m), 3.03-3.09 (1H, m), 3.26-3.43 (2H, m), 3.50-3.58 (1H, m), 3.71-3.80 (1H, m), 3.73 (3H, s), 3.76 (3H, s), 4.00 (1H, d, J=12.5), 5.39 (1H, dd, J=3.5, 7.0), 6.56 (1H, t, J=6.5), 6.68 (2H, d, J=8.5), 6.78 (2H, d, J=8.5), 7.13-7.38 (9H, m), 7.55-7.69 (3H, m), 7.90 (1H, s), 8.09-8.12 (2H, m), 8.72 (1H, s), 8.79 (1H, s).
＜化合物C-16の合成＞
　化合物C-15（95 mg, 0.125 mmol）をテトラヒドロフラン（1.5 mL）に溶解し、メタノール（1.2 mL）, 水（0.3 mL）を順次加えた。続いて2M 水酸化ナトリウム水溶液（76 μL, 0.152 mmol）を氷浴下で加え、そのまま1時間攪拌した。反応液に酢酸を加えて中和した後、反応液の溶媒を減圧留去し、得られた残渣を酢酸エチル、水で希釈をおこない、有機層を分画した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝1：4～0：1）によって精製し、化合物C-16（60 mg, 67%）を淡黄色泡状固体として得た。
1H NMR（CD3OD）δ 1.46-1.56 (1H, m), 1.81-1.94 (1H, m), 2.54-2.62 (1H, m), 3.12 (1H, quint, J=6.5), 3.20-3.60 (1H, m), 3.56-3.67 (1H, m), 3.70-3.90 (9H, m), 4.10 (1H, d, J=11.5), 4.51-4.60 (1H, br), 6.48 (1H, t, J=6.5), 6.61 (2H, d, J=9.0), 6.72 (2H, d, J=9.0), 7.13-7.19 (3H, m), 7.25-7.38 (6H, m), 7.52-7.65 (3H, m), 8.06 (2H, d, J=7.0), 8.35 (1H, brs), 8.75 (1H, s), 9.06 (1H, brs).
＜化合物C-17の合成＞
　アルゴン気流下、化合物C-16（50 mg, 0.0700 mmol）をアセトニトリル（1.5 mL）に溶解し、４，５－ジシアノイミダゾール（15 mg, 0.126 mmol）、２－シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（46 μL, 0.140 mmol）を氷冷下で順次加え、室温で3.5時間攪拌した。反応液を冷却し、水で反応を停止させた後、酢酸エチルで希釈を行い、有機層を分画した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた粗成績体をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝1：2～1：4）によって精製し、化合物C-17（32 mg, 51%）を白色泡状固体として得た。
31P NMR（CDCl3）δ 148.7, 150.2.
HRMS(MALDI): calcd for C50H56N7NaO8P [M+Na+] 936.3820, found 936.3802.
［オリゴヌクレオチドの合成例］
　オリゴヌクレオチドは、前記合成例で得られた化合物（A(α)-12、A(β)-12、B-13、C-8、C-17）を用いて、標準的なホスホロアミダイトプロトコールに従って、核酸自動合成機（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ（商標）　８９０９／ＡＢＩ社製）により合成し、下記のオリゴヌクレオチドを得た。
・式（６）において、Ｂａｓｅがチミン－１－イル基であり、Ｘ１が水素原子であり、Ｘ２がメトキシ基であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６が水素原子であり、Ｚ１がＯであり、Ｚ２が単結合であり、α体である単位（以下、(Ａ)α－Ｔという。）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
 を有するオリゴヌクレオチド（以下、少なくとも１の(Ａ)α－Ｔを含むオリゴヌクレオチドを「(Ａ)α－Ｔ修飾オリゴヌクレオチド」という。）
・式（６）において、Ｂａｓｅがチミン－１－イル基であり、Ｘ１が水素原子であり、Ｘ２がメトキシ基であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６が水素原子であり、Ｚ１がＯであり、Ｚ２が単結合であり、β体である単位（以下、(Ａ)β－Ｔという。）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
 を有するオリゴヌクレオチド（以下、少なくとも１の(Ａ)β－Ｔを含むオリゴヌクレオチドを「(Ａ)β－Ｔ修飾オリゴヌクレオチド」という。）
・式（６）において、Ｂａｓｅがチミン－１－イル基であり、Ｘ１が水素原子であり、Ｘ２がメトキシ基であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６が水素原子であり、Ｚ１がＮＺ１１であり、Ｚ１１がメチル基であり、Ｚ２がＣＺ２１Ｚ２２であり、Ｚ２１及びＺ２２が水素原子であり、β体である単位（以下、(Ｂ)β－Ｔという。）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
 を有するオリゴヌクレオチド（以下、少なくとも１の(Ｂ)β－Ｔを含むオリゴヌクレオチドを「(Ｂ)β－Ｔ修飾オリゴヌクレオチド」という。）
・式（６）において、Ｂａｓｅがチミン－１－イル基であり、Ｘ１が水素原子であり、Ｘ２が水素原子であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６が水素原子であり、Ｚ１がＯであり、Ｚ２がＣＺ２１Ｚ２２であり、Ｚ２１及びＺ２２が水素原子であり、β体である単位（以下、(Ｃ)Ｈβ－Ｔという。）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
 を有するオリゴヌクレオチド（以下、少なくとも１の(Ｃ)Ｈβ－Ｔを含むオリゴヌクレオチドを「(Ｃ)Ｈβ－Ｔ修飾オリゴヌクレオチド」という。）
・式（６）において、Ｂａｓｅがアデニン－９－イル基であり、Ｘ１が水素原子であり、Ｘ２が水素原子であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６が水素原子であり、Ｚ１がＯであり、Ｚ２がＣＺ２１Ｚ２２であり、Ｚ２１及びＺ２２が水素原子であり、β体である単位（以下、(Ｃ)Ｈβ－Ａという。）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
 を有するオリゴヌクレオチド（以下、少なくとも１の(Ｃ)Ｈβ－Ａを含むオリゴヌクレオチドを「(Ｃ)Ｈβ－Ａ修飾オリゴヌクレオチド」という。）
　５’－末端がジメトキシトリチル基で保護され、固相に支持された状態のオリゴヌクレオチドに対し、それぞれ、２８％アンモニア水によるカラムからの切り出し（１．５時間）を行い、切り出したオリゴヌクレオチドを２８％アンモニア水中、１６時間、６０℃で反応させ、すべての保護基の脱保護を行った。
　ＮＡＰ－１０カラムによる簡易精製を行い、逆相ＨＰＬＣ［ＷａｋｏＰａｋ（商標） ＷＳ－ＤＮＡカラム、１０．０ｍｍ×２５０ｍｍ）により精製した［条件：０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸バッファー（ｐＨ７．０）中、３ｍｌ／分で３０分の８－１６％アセトニトリルのグラジエント、カラム温度５０℃］。
　合成されたオリゴヌクレオチドの純度は、逆相ＨＰＬＣ［ＷａｋｏＰａｋ（商標） ＷＳ－ＤＮＡカラム、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）により確認した［条件：０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸バッファー（ｐＨ７．０）中、１ｍｌ／分で３０分の８－１６％アセトニトリルのグラジエント、カラム温度５０℃、検出波長２５４ｎｍ］。なお、合成されたオリゴヌクレオチドは、全て純度が９３.２％以上であった。
　また、合成されたオリゴヌクレオチドの分子量は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＡＳＳ測定により決定した。分子量の計算値及び実測値（測定結果）を表１Ａ及び表１Ｂに示す。なお、式（６）で表される単位は、表１Ａ中のアンチセンス鎖（配列番号１～５）又は表１Ｂ中のセンス鎖（配列番号６）のｘの位置に組み込まれている。ｘ以外の塩基配列はすべてＤＮＡ（式（７）Ｒａ＝Ｈ）で構成されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
［試験例］
［試験例１］オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）測定（二重鎖形成能評価）
　前記合成例で得られた化合物（A(α)-12、A(β)-12、B-13、C-8）を、表２及び表３中のアンチセンス鎖（配列番号１～３）のｘの位置に組み込んで合成した本発明のオリゴヌクレオチド（(Ａ)α－Ｔ修飾オリゴヌクレオチド、(Ａ)β－Ｔ修飾オリゴヌクレオチド、(Ｂ)β－Ｔ修飾オリゴヌクレオチド、(Ｃ)Ｈβ－Ｔ修飾オリゴヌクレオチド）（アンチセンス鎖）と、一本鎖ＤＮＡ（5’-d(agcaaaaaacgc)-3’；配列番号７（センス鎖））又は一本鎖ＲＮＡ（5’-r(agcaaaaaacgc)-3’；配列番号８（センス鎖））との融解温度（Ｔｍ）を測定することにより、アンチセンス鎖の二重鎖形成能を調べた。また、対照として、式（７）で表される単位であって、Ｂａｓｅがチミン－１－イル基でありＲａがＨである単位（Ｔ）（以下、「ＤＮＡ－Ｔ」という。）が表２及び表３中のアンチセンス鎖のｘの位置に配置されるように合成したオリゴヌクレオチド（以下、「ＤＮＡ－Ｔオリゴヌクレオチド」という。）、及び、式（９）で表される単位であって、Ｂａｓｅがチミン－１－イル基でありＲｂがＭｅである単位（以下、「ＮＭｅ－Ｔ」という。）を表２及び表３中のアンチセンス鎖のｘの位置に組み込んで合成したオリゴヌクレオチド（以下、「ＮＭｅ－Ｔ修飾オリゴヌクレオチド」という。）をアンチセンス鎖として用意した。
　終濃度をそれぞれ塩化ナトリウム１００ｍＭ、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）１０ｍＭ、アンチセンス鎖４μＭ、センス鎖４μＭとしたサンプル溶液（１２０μｌ）を調製し、０℃もしくは１５℃から１１０℃まで０．５℃／分にて昇温し、０．５℃間隔で２６０ｎｍにおける吸光度を分光光度計（株式会社島津製作所製ＵＶ－１８００もしくはＵＶ－１９００）により測定した。
　得られた測定値から微分法によりＴｍ値を算出した。結果を表２及び表３に示す。
一本鎖ＤＮＡに対する二重鎖形成能（Ｔｍ値）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000045
一本鎖ＲＮＡに対する二重鎖形成能（Ｔｍ値）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
　本発明の化合物（B-13、C-8）を用いて１塩基修飾したオリゴヌクレオチド（(Ｂ)β－Ｔ修飾オリゴヌクレオチド、(Ｃ)Ｈβ－Ｔ修飾オリゴヌクレオチド）（配列番号１で示されるアンチセンス鎖）は、一本鎖ＲＮＡよりも一本鎖ＤＮＡに対して、優れた二重鎖形成能を有することが明らかとなった。したがって、ＤＮＡ選択的な核酸医薬（アンチジーン）や遺伝子診断の素材として適している。また、オリゴヌクレオチド内で本発明のモノマー単位（(Ａ)α－Ｔ、(Ａ)β－Ｔ、(Ｂ)β－Ｔ、(Ｃ)Ｈβ－Ｔ）が多いほど、相補鎖との結合力が下がる傾向が確認された。例えば、生体内で解離させる必要のあるｓｉＲＮＡ等の二本鎖の核酸医薬や、テンプレートに結合しない部位として３’末端に(Ａ)α－Ｔ、(Ａ)β－Ｔ、(Ｂ)β－Ｔ、又は(Ｃ)Ｈβ－Ｔを含むクランプオリゴヌクレオチドを用いたクランプＰＣＲ法での遺伝子検査での活用が期待できる。
［試験例２］オリゴヌクレオチドの酵素耐性能測定
１）酵素耐性能測定用オリゴヌクレオチドの調製
　前記オリゴヌクレオチドの合成例と同様に、配列番号９に示される配列（TTTTTTTTTT）又はその一部が修飾された配列番号１０に示される配列を有する下表のオリゴヌクレオチドを調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000047
２）サンプル溶液の調製
　サンプル溶液は、下表のとおり調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000048
３）酵素反応
　オリゴヌクレオチドＮｏ．１～９について、装置（BIO RAD社製、T100）を用いて、温度３７℃で操作（下記(1)～(3)）を行った。
(1) 酵素ＣＡＶＰ（Crotalus adamanteus Venom ホスホジエステラーゼＩ）を終濃度２．０μｇ／ｍＬとなるように添加し、反応を開始した。
(2) 反応時間終了時に反応液の濃度が５．０ｍＭとなるようにＥＤＴＡを添加し、反応を停止した。
(3) 反応時間は０分、１０分、２０分、４０分、８０分とした。
４）酵素耐性能の評価
　上記３）の酵素反応の終了したサンプル溶液について、下記条件でＨＰＬＣ分析を行った。
（条件）
装置　：Alliance e2695 S eparations Module/2 489 UV/VIS Detector（Waters社製）
カラム：XBridge Oligonucleoties BEH C18 カラム 130Å, 2.5μm, 4.6mm×50mm移動相
・A液：０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸バッファー(pH7.0)
・B液：０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸バッファー(pH7.0):アセトニトリル=1:1(v/v)グラジエント：5～30%（(v/v)B液）、15分)
流速　　　：0.8mL/分
カラム温度：50℃
検出波長　：268nm
注入量　　：15μL
　ＨＰＬＣ分析結果から酵素未消化オリゴヌクレオチドの量を測定し、各反応時間の未消化オリゴヌクレオチドの残存率(％)を、次式により算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000049
５）結果
　結果を、表６及び図２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000050
　結果から明らかなように、本発明のオリゴヌクレオチド（６）は、天然型及び従来の非天然型のオリゴヌクレオチドに比較して優れた酵素耐性を有していた。
　本発明の化合物又はその塩（モノマー単位）で修飾したオリゴヌクオレドは、天然型及び従来の非天然型のオリゴヌクレオチドよりも酵素耐性能が高く、核酸医薬や遺伝子検査の素材として十分な機能性を有している。また、本発明の化合物又はその塩は、ＤＮＡ選択的な核酸医薬（アンチジーン）等の素材として利用し得る。さらに、本発明の化合物又はその塩（モノマー単位）で複数修飾したオリゴヌクレオチドを用いることで相補鎖との結合力を下げることにより生体内での解離を促進させたｓｉＲＮＡ等の二本鎖の核酸医薬やクランプＰＣＲ法などの高感度な遺伝子検査の素材としての活用が期待される。

Claims (19)

  1. 下記式（１）で表される化合物又はその塩：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、
    　Ｂａｓｅは、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、又は置換基を有していてもよい芳香族炭化水素環基であり、
    　Ｘ１は、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
    　Ｘ２は、水素原子、又は－ＯＲ７であり、
    　Ｒ１、Ｒ２、及びＲ７は、同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルケニル基、置換基を有していてもよいアリール基、ヒドロキシ基の保護基、置換基を有するホスフィノ基、置換基を有していてもよいジヒドロキシホスフィニル基、又は置換基を有していてもよいヒドロキシメルカプトホスフィニル基であり、
    　Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
    　Ｚ１は、Ｏ又はＮＺ１１であり、
    　Ｚ１１は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、又はアミノ基の保護基であり、
    　Ｚ２は、単結合又はＣＺ２１Ｚ２２であり、
    　Ｚ２１及びＺ２２は、同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基である）。
  2. Ｚ１がＯである、請求項１に記載の化合物又はその塩。
  3. Ｚ１がＮＺ１１であり、Ｚ２がＣＺ２１Ｚ２２である、請求項１に記載の化合物又はその塩。
  4. Ｚ１１が水素原子又はアルキル基である、請求項３に記載の化合物又はその塩。
  5. Ｚ２１及びＺ２２が、同一又は異なって、水素原子又はアルキル基である、請求項１～４のいずれかに記載の化合物又はその塩。
  6. Ｘ１が水素原子又はアルキル基である、請求項１～５のいずれかに記載の化合物又はその塩。
  7. Ｘ１が水素原子である、請求項１～６のいずれかに記載の化合物又はその塩。
  8. Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６が、同一又は異なって、水素原子又はアルキル基である、請求項１～７のいずれかに記載の化合物又はその塩。
  9. Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６が水素原子である、請求項１～８のいずれかに記載の化合物又はその塩。
  10. Ｒ７が水素原子又はアルキル基である、請求項１～９のいずれかに記載の化合物又はその塩。
  11. Ｒ１及びＲ２が、同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、式：－Ｓｉ(Ｒ８)３（式中、各Ｒ８は、同一又は異なって、アルキル基又はアリール基である）で表される基、式：－Ｐ(Ｒ９ａ)(Ｒ９ｂ)（式中、Ｒ９ａ及びＲ９ｂは、同一又は異なって、ヒドロキシ基、メルカプト基、アミノ基、アルコキシ基、ハロアルコキシ基、シアノアルコキシ基、アルキルチオ基、ハロアルキルチオ基、シアノアルキルチオ基、又はアルキルアミノ基である）で表される基、ジヒドロキシホスフィニル基、又はヒドロキシメルカプトホスフィニル基である、請求項１～１０のいずれかに記載の化合物又はその塩。
  12. Ｂａｓｅが、置換基を有していてもよい２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－１－イル基、置換基を有していてもよい２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基、置換基を有していてもよいプリン－９－イル基、又は置換基を有していてもよい６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル基である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の化合物又はその塩。
  13. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物又はその塩を製造する方法であって、下記式（２）で表される化合物又はその塩を、式（２’）：Ｚ１１－ＮＨ２（式中、Ｚ１１は前記と同じである）で表されるアミンの存在下又は非存在下で環化する工程を含む方法：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、Ｌ１はヒドロキシ活性化基であり、Ｌ２は水素原子又はヒドロキシ活性化基であり、Ｂａｓｅ、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＺ２は、前記と同じである）。
  14. 下記式（６）で表される単位を有するオリゴヌクレオチド又はその塩：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式中、
    　Ｂａｓｅは、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、又は置換基を有していてもよい芳香族炭化水素環基であり、
    　Ｘ１は、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
    　Ｘ２は、水素原子、又は－ＯＲ７であり、
    　Ｒ７は、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルケニル基、置換基を有していてもよいアリール基、ヒドロキシ基の保護基、置換基を有するホスフィノ基、置換基を有していてもよいジヒドロキシホスフィニル基、又は置換基を有していてもよいヒドロキシメルカプトホスフィニル基であり、
    　Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
    　Ｚ１は、Ｏ又はＮＺ１１であり、
    　Ｚ１１は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、又はアミノ基の保護基であり、
    　Ｚ２は、単結合又はＣＺ２１Ｚ２２であり、
    　Ｚ２１及びＺ２２は、同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基である）。
  15. 標的核酸の検出方法であって、
    （Ｉ）標的核酸を、核酸増幅法によって、選択的に増幅する工程、及び
    （II）前記工程（Ｉ）で増幅された標的核酸を検出する工程
    を含み、前記増幅又は検出に用いられるオリゴヌクレオチドが、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド又はその塩を含む、標的核酸の検出方法。
  16. 標的核酸を検出する、又は標的核酸を選択的に増幅するためのキットであって、
    （ａ）プライマー及びプローブを含み、該プライマー及びプローブのうち少なくともいずれかが、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド又はその塩を含む、キット、又は
    （ｂ）クランプ核酸及びプライマーを含み、該クランプ核酸及びプライマーのうち少なくともいずれかが、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド又はその塩を含む、キット。
  17. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物又はその塩、或いは、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド又はその塩を含有する組成物。
  18. 下記式（２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式中、
    　Ｂａｓｅは、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、又は置換基を有していてもよい芳香族炭化水素環基であり、
    　Ｘ１は、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
    　Ｘ２は、水素原子、又は－ＯＲ７であり、
    　Ｒ１、Ｒ２、及びＲ７は、同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルケニル基、置換基を有していてもよいアリール基、ヒドロキシ基の保護基、置換基を有するホスフィノ基、置換基を有していてもよいジヒドロキシホスフィニル基、又は置換基を有していてもよいヒドロキシメルカプトホスフィニル基であり、
    　Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
    　Ｌ１は、ヒドロキシ活性化基であり、
    　Ｌ２は、水素原子又はヒドロキシ活性化基であり、
    　Ｚ２は、単結合又はＣＺ２１Ｚ２２であり、
    　Ｚ２１及びＺ２２は、同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基である）
    で表される化合物又はその塩。
  19. 下記式（４）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     （式中、
    　Ｒ２は、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルケニル基、置換基を有していてもよいアリール基、ヒドロキシ基の保護基、置換基を有するホスフィノ基、置換基を有していてもよいジヒドロキシホスフィニル基、又は置換基を有していてもよいヒドロキシメルカプトホスフィニル基であり、
    　Ｒ５、Ｒ６、ＲＸ、ＲＹ、及びＸ１は、同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキニル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、又は置換基を有していてもよいアリール基であり、
    　Ｌ１は、ヒドロキシ活性化基である）
    で表される化合物又はその塩。
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