CN108350457B - 稳定地含有抑制TGF-β1基因的表达的单链核酸分子的组合物 - Google Patents

稳定地含有抑制TGF-β1基因的表达的单链核酸分子的组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种组合物，其包含缓冲液和包括由5’‑AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC‑P‑GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC‑P‑G‑3’(SEQ ID NO:1)表示的核苷酸序列(在该序列中，P表示由说明书中的(I)表示的脯氨酸衍生物连接子)的单链核酸分子，其中所述组合物的特征在于(a)所述组合物在常温下为溶液的形式，和(b)在25℃、相对湿度60％下保存4周后的该核酸分子的含量相对于保存开始时的含量为80％以上。

Description

稳定地含有抑制TGF-β1基因的表达的单链核酸分子的组合物
技术领域
本发明涉及一种包含抑制TGF-β1基因的表达的单链核酸分子的组合物，所述组合物为显示该核酸分子的改善的稳定性的新组合物，特别是药物组合物。
背景技术
肺纤维化是其中由肺泡的损伤和塌陷而引起在肺的间质中发生纤维化的疾病。在许多情况下，原因是未知的。当无法找到原因时，肺纤维化特别地称为特发性肺纤维化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF)。随着纤维化进展，肺硬化并且氧气交换能力下降。目前，还没有明确的治疗方法，并且其治疗方法几乎为对症疗法。
TGF-β已知为调节细胞增殖和分化的细胞因子并且认为其也在肝或肺纤维化中起重要作用。因此，其作为肺纤维化的治疗靶点而引起关注。
期望核酸药物作为下一代药物发现技术，这是因为其具有小分子药物制品的易制造性与抗体药物的有效性和安全性二者。然而，由于核酸分子在体内的不稳定性、由于增强的先天性免疫应答导致的副作用、和缺乏有效的药物递送系统(DDS)的开发等障碍，药物制品的开发没有如预期进展。
在呼吸系统疾病的情况下，由于药物向肺部的局部给药是可行的，因此肺纤维化为核酸药物的有效的目标疾病。为了应对核酸分子的例如体内稳定性和先天性免疫应答的诱导等问题，已经开发了其中siRNA或miRNA的双链核酸的末端通过各种连接子连接的单链核酸分子(例如，专利文献1-5)。Hamasaki等人报道通过具有携带TGF-β1表达抑制序列(下文中也称为“PK-0051”)的以下结构的单链核酸分子向肺纤维化和急性肺损伤的模型小鼠的气管内给药，症状显著地改善(非专利文献1)。
5’-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G-3’(SEQID NO:1)
(下划线示出TGF-β1表达抑制序列。P为由下式(I)表示的脯氨酸衍生物连接子)。
Figure BDA0001647977330000021
[文献列表]
[专利文献]
专利文献1：WO 2012/017919
专利文献2：WO 2013/103146
专利文献3：WO 2012/005368
专利文献4：WO 2012/077446
专利文献5：WO 2013/133393
[非专利文献]
非专利文献1：PLoS One,2012,7(8):e42655。
发明内容
发明要解决的问题
通常，由于核酸在溶液中易于分解并且不稳定，因此在常温下操作是极其困难的。因此，通常已经采用冷冻干燥保存和包括将50％乙醇添加至Tris-EDTA(TE)缓冲液中并且将其在-20℃下保存而不冷冻的方法。在该情况下，期望能够确保核酸作为有效成分在常温下稳定存在和操作性优异的稳定的核酸制剂的开发。
因此，本发明旨在提供在常温下作为溶液、稳定地包含确认为对肺纤维化或急性肺损伤具有治疗效果的单链核酸分子(PK-0051)的组合物，特别是药物组合物，及其生产方法。
用于解决问题的方案
本发明人已经进行了深入的研究试图去解决前述问题并且出乎意料地发现通过将PK-0051溶解在缓冲液中并且控制PK-0051溶液的pH以落入特定的范围内，PK-0051分子可以长期稳定地保存，其导致了本发明的完成。
因此，本发明如下。
[1]一种组合物，其包括由通过5’-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G-3’(SEQ ID NO:1)示出的核苷酸序列组成的单链核酸分子和缓冲液，
(在所述序列中，P为由下式(I)表示的脯氨酸衍生物连接子)
Figure BDA0001647977330000031
并且具有以下特征：
(a)在常温下为溶液的形式；和
(b)在25℃、相对湿度60％下保存4周后的所述核酸分子的含量相对于保存开始时的含量为80％以上。
[2][1]所述的组合物，其中在40℃、相对湿度75％下保存4周后的所述核酸分子的含量相对于保存开始时的含量为80％以上。
[3][1]或[2]所述的组合物，其中在60℃下保存4周后的所述核酸分子的含量相对于保存开始时的含量为60％以上。
[4][1]所述的组合物，其中暴露于总曝光量120万Lux·hr的所述核酸分子的含量相对于保存开始时的含量为80％以上。
[5][1]至[4]任一项所述的组合物，其中所述缓冲液将所述组合物的pH调节至4.0以上且9.0以下。
[6][1]至[4]任一项所述的组合物，其中所述缓冲液将所述组合物的pH调节至4.4以上且7.4以下。
[7][1]至[4]任一项所述的组合物，其中所述缓冲液将所述组合物的pH调节至4.6以上且7.0以下。
[8][1]至[4]任一项所述的组合物，其中所述缓冲液将所述组合物的pH调节至5.5以上且6.5以下。
[9][1]至[8]任一项所述的组合物，其中所述缓冲液包括选自磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、精氨酸盐酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸三钠二水合物、L-谷氨酸一钠、乙酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、乳酸钠、磷酸二氢钾、氢氧化钠、葡甲胺、甘氨酸、柠檬酸和乙酸的一种以上的缓冲剂。
[10][1]至[9]任一项所述的组合物，其中所述缓冲液包括柠檬酸和/或磷酸。
[11][1]至[10]任一项所述的组合物，其进一步包括等渗剂。
[12][11]所述的组合物，其中所述等渗剂为选自D-山梨醇、氯化钠、甘油、D-甘露醇、氯化钾、乳糖醇和蔗糖的一种以上。
[13][1]至[12]任一项所述的组合物，其用于肺纤维化或急性肺损伤的预防或治疗。
[14][1]至[13]任一项所述的组合物的生产方法，其包括将前述核酸分子溶解在将所述组合物的pH调节至4.6以上且7.0以下的缓冲液中，并将溶液在常温下保存。
[15]一种[1]至[13]任一项所述的组合物的生产方法，其包括将前述核酸分子溶解在将所述组合物的pH调节至5.5以上且6.5以下的缓冲液中，并将溶液在常温下保存。
[16][14]或[15]所述的方法，其中所述缓冲液包括柠檬酸和/或磷酸。
[17][14]至[16]任一项所述的方法，其中所述组合物用于肺纤维化或急性肺损伤的预防或治疗。
[18]一种组合物中的核酸分子的稳定化方法，其包括将所述核酸分子溶解在将所述组合物的pH调节至4.6以上且7.0以下的缓冲液中，并将溶液在常温下保存。
[19]一种组合物中的核酸分子的稳定化方法，其包括将所述核酸分子溶解在将所述组合物的pH调节至5.5以上且6.5以下的缓冲液中，并将溶液在常温下保存。
[20][18]或[19]所述的方法，其中所述缓冲液包括柠檬酸和/或磷酸。
[21][18]至[20]任一项所述的方法，其中所述溶液为肺纤维化或急性肺损伤的预防或治疗用组合物。
发明的效果
根据本发明，可以提供显示作为有效成分的单链核酸分子的改善的稳定性并且在使用时不要求再溶解的新的且容易操作的药物组合物。
附图说明
图1示出用各pH的缓冲液制备的PK-0051溶液的25℃的稳定性试验的结果。
图2示出用各pH的缓冲液制备的PK-0051溶液的40℃的稳定性试验的结果。
图3示出用各pH的缓冲液制备的PK-0051溶液的60℃的稳定性试验的结果。
图4示出用0.05M柠檬酸缓冲液(citrate buffer)(pH 4.0-7.5)制备的PK-0051溶液的60℃的稳定性试验的结果。
图5示出用0.1M柠檬酸缓冲液(pH 4.0-7.8)制备的PK-0051溶液的60℃的稳定性试验的结果。
图6示出用0.05M磷酸缓冲液(phosphate buffer)(pH 4.0-7.9)制备的PK-0051溶液的60℃的稳定性试验的结果。
图7示出用0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(8:2)(pH 4.0-7.8)制备的PK-0051溶液的60℃的稳定性试验的结果。
图8示出用0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(5:5)(pH 4.0-7.8)制备的PK-0051溶液的60℃的稳定性试验的结果。
图9示出用0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(2:8)(pH 4.0-7.8)制备的PK-0051溶液的60℃的稳定性试验的结果。
图10示出用各浓度的柠檬酸缓冲液制备的PK-0051溶液的40℃的稳定性试验的结果。
图11示出用各浓度的柠檬酸缓冲液制备的PK-0051溶液的60℃的稳定性试验的结果。
图12示出1mg/mL PK-0051溶液(pH 6.5)的稳定性试验的结果。
图13示出10mg/mL PK-0051溶液(pH 6.5)的稳定性试验的结果。
图14示出1mg/mL PK-0051溶液(pH 6.0)的稳定性试验的结果。
图15示出PK-0051的各给药组的肺组织中的hTGF-β1的相对量。
图16示出PK-0051的各给药组的肺组织中的羟脯氨酸量。
图17示出10、20、40和80mg/mL PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0))的60℃的稳定性试验的结果。
图18示出1mg/mL PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.5))的光稳定性试验的结果。离子交换HPLC用于测量。
图19示出1mg/mL PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0))的光稳定性试验的结果。离子交换HPLC用于测量。
图20示出1mg/mL PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.5))的光稳定性试验的结果。离子交换HPLC用于测量。
图21示出1mg/mL PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.5))的光稳定性试验的结果。反相HPLC用于测量。
图22示出1mg/mL PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0))的光稳定性试验的结果。反相HPLC用于测量。
图23示出1mg/mL PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.5))的光稳定性试验的结果。反相HPLC用于测量。
具体实施方式
本发明提供能够在常温下以溶液的形式稳定地保存含有抑制TGF-β1基因的表达的核苷酸序列的单链核酸分子PK-0051的包含该核酸分子的组合物(下文中也称为“本发明的组合物”)。如本文所使用的，“常温”意指15-30℃的温度范围，并且“稳定地保存”意指保存开始时(组合物制备时)核酸分子的80％以上在(1)4周以上、优选(2)24周(约6个月)以上、更优选(3)200周(约3.7年)以上保存而不分解。这种保存稳定性可以由以下稳定性试验的结果逐个确认或预测。
(1)在25℃、相对湿度60％下保存4周后的组合物中的核酸分子的含量相对于保存开始时的含量为80％以上。
(2)在40℃、相对湿度75％下保存4周后的组合物中的核酸分子的含量相对于保存开始时的含量为80％以上。
(3)在60℃下保存4周后的组合物中的核酸分子的含量相对于保存开始时的含量为60％以上，优选70％以上，更优选80％以上。可选地，在105℃下保存15min或在121℃下保存15min后的组合物中的核酸分子的含量相对于保存开始时的含量为60％以上，优选70％以上，更优选80％以上。
本发明的组合物可以在高温条件下稳定地保存。而且，即使在冷冻-解冻条件下，其也可以稳定地保存。
此外，“稳定地保存”优选包括“光稳定地保存”。“光稳定地保存”意指保存开始时(组合物制备时)的核酸分子的80％以上即使在暴露于总曝光量120万Lux·hr后仍保存而不分解。这种保存稳定性可以由使用D65灯作为光源在日光荧光灯(daylight fluorescentlamp)(照度1580Lux)下保存4周后的组合物中的核酸分子的含量相对于保存开始时的含量为80％以上的事实来确认或预测。
如本文所使用的，通过使用通过将与试样同量的核酸分子溶解在注射用水中获得的溶液(100％)和通过按9:1、8:2、7:3和6:4(分别为90％、80％、70％和60％)的比例混合所述溶液和注射用水获得的溶液作为校正曲线样品，将各校正曲线样品进样10μL至HPLC以测量峰面积，绘制各校正曲线样品的测量值，横轴(X)为理论含量(％)，纵轴(Y)为峰面积，通过最小二乘法获得回归线(Y＝aX+b)(校正曲线)，并且将在相同条件下通过HPLC测得的试样的峰面积应用至校正曲线以得到理论含量(％)，测定组合物中的核酸分子的含量。上述HPLC的测量条件如下。
反相HPLC
测量装置：LC-10A SHIMAZU HPLC系统(RP-HPLC)，由Shimadzu Corporation制造
检测器：紫外吸光光度计(检测波长：254nm)(由Shimadzu Corporation制造)
柱：X-Bridge OST C18(2.5μm，4.6×50mm)(由Japan Waters制造)
柱温：40℃
流动相A：50mM TEAA(pH 7.0)，0.5％乙腈
流动相B：100％乙腈
流动相的供给：流动相A和流动相B的混合比如下改变以控制浓度梯度。
表1
注入后的时间(分钟) 流动相A(体积％) 流动相B(体积％)
0→12 100→60 0→40
流速：1.0mL/min
离子交换HPLC
测量装置：LC-20A SHIMAZU HPLC系统(AEX-HPLC)，由Shimadzu Corporation制造
检测器：紫外吸光光度计(检测波长：260nm)
柱：DNAPac PA-100(4×250mm)
柱温：80℃
流动相A：25mM Tris-HCL(pH 8.0)，8M尿素，10％乙腈
流动相B：流动相A，700mM高氯酸钠一水合物
流动相的供给：流动相A和流动相B的混合比如下改变以控制浓度梯度。
表2
注入后的时间(分钟) 流动相A(体积％) 流动相B(体积％)
0→20 90→60 10→40
流速：1.0mL/min
1.核酸分子
待包含于本发明的组合物中的作为有效成分的核酸分子通过以下核苷酸序列示出。
5’-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G-3’(SEQID NO:1)
(在该序列中，P为由下式(I)表示的脯氨酸衍生物连接子)。
Figure BDA0001647977330000091
在上述核苷酸序列中，划线的序列为与人TGF-β1mRNA互补的核苷酸序列，并且为结合至mRNA从而发挥RNA干扰作用的TGF-β1表达抑制序列。
待包含于本发明的组合物中的核酸分子可以通过本身已知的方法制造。例如，其可以根据WO2013/133393、PLoS One,2012,7(8):e42655中记载的方法制造。
虽然对本发明的组合物中的核酸分子的含量不特别限定，但是当组合物为药物组合物时，核酸分子的含量相对于整个药物组合物通常为0.0001-60wt％，优选0.001-15wt％，进一步优选0.01-1wt％。
2.缓冲液
本发明的组合物包含缓冲液。在本发明中，缓冲液是指具有缓冲作用的溶液(特别是水溶液)，并且通过包含缓冲剂来构成。本发明中的缓冲剂意指水溶液的pH的稳定剂，并且可以选择通常用于药物生产领域中的稳定剂。
在本发明中，可以通过使用缓冲液防止组合物中的核酸分子的分解。
作为将用于本发明的缓冲液，可以提及将组合物的pH调节至4.0以上且9.0以下的缓冲液。将组合物的pH调节至4.4以上且7.4以下的缓冲液是优选的，并且将组合物的pH调节至4.6以上且7.0以下的缓冲液是更优选的，并且将组合物的pH调节至5.5以上且6.5以下的缓冲液是进一步优选的。
作为将用于在本发明中的缓冲剂，具体地，可以提及选自抗坏血酸、L-天冬氨酸镁、亚硫酸钠、L-精氨酸、L-精氨酸盐酸盐、苯甲酸、苯甲酸钠、ε-氨基己酸、氯化铵、氯化钾、氯化钠、氯化氨基葡萄糖、盐酸三乙醇胺、稀盐酸、柠檬酸、无水柠檬酸、无水柠檬酸钠、柠檬酸水合物、柠檬酸钠水合物、柠檬酸二氢钠、柠檬酸钠、柠檬酸二钠、柠檬酸三钠、柠檬酸三钠二水合物、柠檬酸钾、甘氨酰甘氨酸、甘氨酸、葡萄糖酸-σ-内酯、葡萄糖酸、葡萄糖酸钙水合物、L-谷氨酸、L-谷氨酸一钠、肌酸酐、氯丁醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、琥珀酸、琥珀酸二钠六水合物、乙酸、乙酸铵、乙酸钾、乙酸钠水合物、二异丙胺、二乙醇胺、酒石酸、L-酒石酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠、牛磺酸、碳酸钠、碳酸钠水合物、碳酸氢钠、三异丙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、二氧化碳、乳酸、乳酸钙水合物、乳酸钠溶液、L-组氨酸、4-(2-羟乙基)、冰乙酸、无水右旋糖(ブドウ糖)、富马酸一钠、丙酸钠、苯扎氯铵、芳香烃混合溶剂、硼酸铵、马来酸、无水乙酸钠、无水碳酸钠、无水磷酸氢二钠、无水磷酸三钠、无水磷酸二氢钠、偏磷酸钠、甲基磺酸、硫酸、硫酸铝钾水合物、磷酸、磷酸一氢钠七水合物、磷酸三钠、磷酸氢钠水合物(dibasic sodium phosphate hydrate)、磷酸氢二钠水合物(disodium hydrogenphosphate hydrate)、磷酸二氢钠水合物、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钠一水合物的一种以上的缓冲剂。其中，优选使用包含柠檬酸或其盐或其水合物、或磷酸或其盐或其水合物的缓冲液作为缓冲剂。
因此，作为将用于本发明的组合物的缓冲液，可以优选提及包含柠檬酸和/或磷酸的缓冲液。
在本发明中，缓冲液优选包含作为上述缓冲剂而示例的酸及其盐、或作为上述缓冲剂而示例的两种以上的酸的盐。更优选地，可以提及包含柠檬酸及其盐(例如，柠檬酸和柠檬酸钠、柠檬酸和柠檬酸三钠等)的缓冲液、包含磷酸及其盐(例如，磷酸和磷酸二氢钠等)的缓冲液、和包含两种磷酸盐(例如，磷酸氢二钠和磷酸二氢钠)的缓冲液。特别优选的是包含柠檬酸及其盐的缓冲液和/或包含两种磷酸盐的缓冲液。
将用于本发明的组合物的缓冲液的量可以是任意的，只要其可以调节至期望的pH范围即可。例如，可以适当地确定以使组合物中的缓冲剂的含量落入以下范围内。即，本发明的组合物中的缓冲剂的含量相对于整个组合物通常为0.0001-40wt％，优选0.0005-20wt％，进一步优选0.001-10wt％。
3.其它添加剂
本发明的组合物可以进一步包含溶剂。溶剂的实例包括药学上可接受的有机溶剂(例如，乙醇、丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、水、注射用水、生理盐水和葡萄糖溶液等。一种以上的溶剂可以组合使用。
在本发明中，由于核酸分子可以在短时间内溶解，优选将核酸分子预先溶解在溶剂中并且与缓冲液混合。作为溶剂，水是优选的。在本说明书中，除非另有说明，所述“将核酸分子溶解在缓冲液中”意指不仅将作为固体的核酸分子直接溶解在缓冲液中，而且如上所述，将核酸分子一次性溶解在例如水等溶剂中，并且将得到的溶液与缓冲液混合。
在本发明中，作为相对于整个组合物的总量，溶剂的含量通常为0.0001wt％以上且低于100wt％，优选0.001wt％以上且低于100wt％，进一步优选0.005wt％以上且低于100wt％。
本发明的组合物任选进一步包含等渗剂。等渗剂的实例包括无水右旋糖(ブドウ糖)、D-山梨醇、氯化钠、甘油、D-甘露醇、氯化钾、乳糖醇、蔗糖和葡萄糖(グルコース)等。优选的等渗剂为D-山梨醇、氯化钠、甘油、D-甘露醇、氯化钾、乳糖醇和蔗糖，并且更优选的是氯化钠、氯化钾和蔗糖。一种以上的等渗剂可以组合使用。
当使用等渗剂时，本发明的组合物的渗透压比(本发明的组合物的克分子渗透压浓度(osmolarity)与生理盐水的克分子渗透压浓度的比)优选为0.6-1.4，更优选0.8-1.2，进一步优选1.0。
当本发明的组合物为药物组合物时，组合物可以通过已知的方法配制为例如吸入液剂、注射剂和液剂等，并且通过肠胃外给药(例如，经鼻给药、静脉内给药、滴注、肌内给药、皮下给药等)施用。此外，其可以以适宜的剂型(例如，胶囊剂等)口服给药。优选的给药方法为通过使用喷雾器吸入液滴颗粒。
当本发明的药物组合物为注射剂时，其还可以通过将核酸分子溶解在缓冲液中并且使得到的溶液与脂质膜的构成分子接触而生产为包封核酸分子的脂质体制剂。脂质体制剂可以优选用作用于例如静脉内注射和肌肉注射等全身给药的注射剂。
除了上述组分以外，本发明的药物组合物必要时可以包含药学上可接受的添加剂。当本发明的药物组合物为注射剂时，添加剂的实例包括等渗剂(例如，葡萄糖、D-山梨醇、氯化钠、甘油、D-甘露醇、氯化钾、乳糖醇、蔗糖、葡萄糖等)、舒缓剂(例如，苯甲醇等)、和防腐剂(例如，苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯甲醇等)等。优选的添加剂为苯甲酸甲酯、D-山梨醇、氯化钠、甘油、D-甘露醇、氯化钾、乳糖醇和蔗糖。更优选的添加剂为氯化钠、氯化钾和蔗糖。
当本发明的药物组合物配制为吸入剂时，例如，将通过将核酸分子溶解在例如水等溶剂中获得的溶液与加入缓冲剂的水溶液(例如，柠檬酸及其盐、磷酸及其盐)混合，将混合物过滤以除去细菌，并且将得到的药物溶液填充至例如小瓶和安瓿等密封容器中以生产吸入剂。例如，将核酸分子与包含水和缓冲剂(例如，柠檬酸及其盐、磷酸及其盐)的水溶液混合，通过超声波处理等溶解，过滤以除去细菌，并且将得到的药物溶液填充至例如小瓶和安瓿等密封容器中以产生吸入剂。虽然将使用的密封容器通常为无色且透明的硼硅酸盐玻璃容器，但是也可以使用其中玻璃内部的液体接触部分具有石英样表面性质的容器。
本发明的药物组合物对于涉及TGF-β1表达的异常升高的疾病、特别是肺纤维化和急性肺损伤的治疗或预防是有用的，这是由于其包含作为有效成分的能够抑制TGF-β1的表达的核酸分子。在本发明中，“治疗”包括疾病的改善和预后的改善的含义，并且“预防”包括预防发作和延迟发作的含义。
本发明的药物组合物的剂量也依据给药对象的药物可接受性、给药途径和疾病的严重程度等变化。例如，当其以吸入液剂作为肺纤维化的治疗剂施用至成人时，作为有效成分的核酸分子的剂量为约0.001至约20mg/kg体重，优选约0.005至约5mg/kg体重，更优选约0.01至约1mg/kg体重，所述核酸分子可以每天以1份至几份给药。
本发明还涉及组合物中的核酸分子的稳定化方法，其包括将缓冲液添加至核酸分子中、或包含核酸分子的稳定的组合物的生产方法。作为用于该方法的缓冲液，可以提及与本发明的组合物的前述实例相似的那些，并且优选相似的。
在本发明的稳定化/生产方法中，将添加的缓冲液的量可以是任意的，只要可以将pH调节至期望的范围即可。例如，缓冲剂的量可以适当地确定以落入以下范围内。即，相对于通过所述方法获得的整个组合物，将在本发明的稳定化/生产方法中添加的缓冲剂的量通常为0.0001-40wt％，优选0.0005-20wt％，进一步优选0.001-10wt％。
下文中，将参考实施例详细地描述本发明，其不能认为是限制性的。
实施例
制造例1(单链核酸分子的合成)
携带TGF-β1的表达抑制序列的单链核酸分子PK-0051通过核酸合成仪(商品名：ABI Expedite(注册商标)8909核酸合成系统，Applied Biosystems)基于亚磷酰胺法(phosphoramidite method)合成。对于前述合成，RNA亚磷酰胺(2’-O-TBDMSi，商品名，Samchully Pharm.Co.,Ltd.)用作RNA亚酰胺(amidite)(下文相同)。将前述亚酰胺通过常规的方法脱保护。将合成的RNA通过HPLC纯化。将纯化后的各RNA冷冻干燥。
作为连接子区域，使用L-脯氨酸二酰胺亚酰胺(L-prolinediamideamidite)。下划线示出人TGF-β1基因的表达抑制序列。
5’-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G-3’(SEQID NO:1)
(P为由下式(I)表示的脯氨酸衍生物连接子)。
Figure BDA0001647977330000141
实施例1(pH对保存温度的影响评价)
评价用于核酸吸入(inhalation)的原型的含PK-0051组合物的热稳定性。
1.试验组合物的制备
试验组合物1如下制备。
将97.0mL的0.04M盐酸、50mL的0.04M氯化钾和53mL的注射用水混合以制备0.04M盐酸-氯化钾缓冲液(pH 1.0)。使用该缓冲液，制备0.1mg/mL PK-0051。
试验组合物2如下制备。
将10mL的0.04M磷酸、10mL的0.04M硼酸和10mL的0.04M乙酸混合，并且将混合物用2N NaOH调节至pH 2.0以制备0.04M Britton-Robinson缓冲液。使用该缓冲液，制备0.1mg/mL PK-0051。
除了将pH用2N NaOH调节至各pH以外，通过与试验组合物2相同的方法制备试验组合物3-12。
试验组合物1：PK-0051(0.04M盐酸-氯化钾缓冲液(pH 1.5))，(0.1mg/mL)
试验组合物2：PK-0051(0.04M Britton-Robinson缓冲液(pH 2.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物3：PK-0051(0.04M Britton-Robinson缓冲液(pH 3.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物4：PK-0051(0.04M Britton-Robinson缓冲液(pH 4.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物5：PK-0051(0.04M Britton-Robinson缓冲液(pH 5.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物6：PK-0051(0.04M Britton-Robinson缓冲液(pH 6.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物7：PK-0051(0.04M Britton-Robinson缓冲液(pH 7.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物8：PK-0051(0.04M Britton-Robinson缓冲液(pH 8.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物9：PK-0051(0.04M Britton-Robinson缓冲液(pH 9.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物10：PK-0051(0.04M Britton-Robinson缓冲液(pH 10.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物11：PK-0051(0.04M Britton-Robinson缓冲液(pH 11.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物12：PK-0051(0.04M Britton-Robinson缓冲液(pH 12.0))，(0.1mg/mL)
2.评价方法
将试验组合物1-12分别放置在4个5mL玻璃小瓶中，各自包含其1mL，并且将来自各组合物的1个小瓶在4℃、25℃/60％RH、40℃/75％RH和60℃下保存在稳定性试验器(由ESPEC CORP.制造)中。连续4周每周将试验组合物各自取样50μL并且通过HPLC测量。计算PK-0051的含量，并且基于相对于保存开始时的含量的含量比(％)的减少来评价稳定性。含量的计算方法和测量方法在以下示出。
通过使用将与试验组合物同量的PK-0051溶解在注射用水中获得的溶液(100％)和通过按9:1、8:2、7:3和6:4(分别为90％、80％、70％和60％)的比例混合所述溶液和注射用水获得的溶液作为校正曲线样品，将各校正曲线样品进样10μL至HPLC以测量峰面积，绘制各校正曲线样品的测量值，横轴(X)为理论含量(％)，纵轴(Y)为峰面积，通过最小二乘法获得回归线(Y＝aX+b)(校正曲线)，并且将在相同条件下通过HPLC测得的试验组合物的峰面积应用至校正曲线从而得到理论含量(％)，测定试验组合物中的PK-0051的含量。
测量方法
在以下测量条件下测量校正曲线样品(60％-100％)和试验组合物。
检测器：紫外吸光光度计(检测波长：254nm)
柱：X-Bridge OST C18(2.5μm，4.6×50mm)
柱温：40℃
流动相A：50mM TEAA(pH 7.0)，0.5％乙腈
流动相B：100％乙腈
流动相的供给：流动相A和流动相B的混合比如下改变以控制浓度梯度(表3)。
表3
注入后的时间(分钟) 流动相A(体积％) 流动相B(体积％)
0→12 100→60 0→40
流速：1.0mL/min
3.结果
结果在图1-图3中示出。在60℃、4周保存的最苛刻条件下、在pH范围5-7内未观察到含量的明显下降。
一般而言，核酸易受温度影响并且可以说其在常温或高于常温下长时间保存是不可能的。但结果已经显示通过控制溶液的pH，单链核酸即使在常温或高于常温下也可以长期保存。
实施例2(使用柠檬酸缓冲液和/或磷酸缓冲液在不同pH下的稳定性评价)
评价用于核酸吸入的原型的含PK-0051组合物的各种缓冲液和在各pH下的稳定性。
1.试验组合物
试验组合物13-48如下制备。
将0.1M柠檬酸钠水溶液和0.1M柠檬酸水溶液混合以制备各pH调节至pH4.0-7.5的0.1M柠檬酸缓冲液。将用注射用水制备的2.35mg/mL PK-0051(2.13mL)、注射用水(0.37mL)和各pH的0.1M柠檬酸缓冲液(2.5mL)混合以制备1mg/mL的试验组合物13-48各5mL。
试验组合物49-68如下制备。
将0.1M柠檬酸钠水溶液和0.1M柠檬酸水溶液混合以制备各pH调节至pH4.0-7.8的0.1M柠檬酸缓冲液。将用注射用水制备的5.8mg/mL PK-0051(0.086mL)和各pH的0.1M柠檬酸缓冲液(4.914mL)混合以制备0.1mg/mL的试验组合物49-68各5mL。
试验组合物69-108如下制备。
将0.1M磷酸二氢钠水溶液和0.1M磷酸氢二钠溶液混合以制备各pH调节至pH4.0-7.9的0.1M磷酸缓冲液。将用注射用水制备的1.2mg/mL PK-0051(0.495mL)、注射用水(2.505mL)和各pH的0.1M磷酸缓冲液(3.000mL)混合以制备0.1mg/mL的试验组合物69-108各6mL。
试验组合物109-168如下制备。
将0.1M柠檬酸钠水溶液和0.1M柠檬酸水溶液混合以制备各pH调节至pH4.0-7.8的0.1M柠檬酸缓冲液。同样地，将0.1M磷酸二氢钠水溶液和0.1M磷酸氢二钠溶液混合以制备各pH调节至pH4.0-7.8的0.1M柠檬酸缓冲液。将各自具有相同的pH的0.1M柠檬酸缓冲液:0.1M磷酸缓冲液按8:2(4mL:1mL)、5:5(3mL:3mL)和2:8(1mL:4mL)混合以制备pH 4.0-7.8的0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液(citrate-phosphate buffer)(8:2)、0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液(5:5)和0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液(2:8)。
将用注射用水制备的5.8mg/mL PK-0051(0.1mL)、注射用水(2.9mL)和各pH的0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液(8:2)(3.0mL)混合以制备0.1mg/mL的试验组合物109-128各6mL。除了使用0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液(5:5)(3.0mL)代替各pH的0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液(8:2)(3.0mL)以外，通过与试验组合物109-128相同的方法制备试验组合物129-148。除了使用0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液(2:8)(3.0mL)代替各pH的0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液(8:2)(3.0mL)以外，通过与试验组合物109-128相同的方法制备试验组合物149-168。
1-1.0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.0-7.5)
试验组合物13：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.0))，(1mg/mL)
试验组合物14：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.1))，(1mg/mL)
试验组合物15：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.2))，(1mg/mL)
试验组合物16：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.3))，(1mg/mL)
试验组合物17：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.4))，(1mg/mL)
试验组合物18：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.5))，(1mg/mL)
试验组合物19：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.6))，(1mg/mL)
试验组合物20：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.7))，(1mg/mL)
试验组合物21：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.8))，(1mg/mL)
试验组合物22：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 4.9))，(1mg/mL)
试验组合物23：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.0))，(1mg/mL)
试验组合物24：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.1))，(1mg/mL)
试验组合物25：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.2))，(1mg/mL)
试验组合物26：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.3))，(1mg/mL)
试验组合物27：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.4))，(1mg/mL)
试验组合物28：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.5))，(1mg/mL)
试验组合物29：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.6))，(1mg/mL)
试验组合物30：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.7))，(1mg/mL)
试验组合物31：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.8))，(1mg/mL)
试验组合物32：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.9))，(1mg/mL)
试验组合物33：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0))，(1mg/mL)
试验组合物34：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.1))，(1mg/mL)
试验组合物35：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.2))，(1mg/mL)
试验组合物36：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.3))，(1mg/mL)
试验组合物37：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.4))，(1mg/mL)
试验组合物38：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.5))，(1mg/mL)
试验组合物39：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.6))，(1mg/mL)
试验组合物40：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.7))，(1mg/mL)
试验组合物41：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.8))，(1mg/mL)
试验组合物42：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.9))，(1mg/mL)
试验组合物43：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 7.0))，(1mg/mL)
试验组合物44：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 7.1))，(1mg/mL)
试验组合物45：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 7.2))，(1mg/mL)
试验组合物46：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 7.3))，(1mg/mL)
试验组合物47：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 7.4))，(1mg/mL)
试验组合物48：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 7.5))，(1mg/mL)
1-2.0.1M柠檬酸缓冲液(pH 4.0-7.8)
试验组合物49：PK-0051(0.1M柠檬酸缓冲液(pH 4.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物50：PK-0051(0.1M柠檬酸缓冲液(pH 4.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物51：PK-0051(0.1M柠檬酸缓冲液(pH 4.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物52：PK-0051(0.1M柠檬酸缓冲液(pH 4.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物53：PK-0051(0.1M柠檬酸缓冲液(pH 4.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物54：PK-0051(0.1M柠檬酸缓冲液(pH 5.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物55：PK-0051(0.1M柠檬酸缓冲液(pH 5.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物56：PK-0051(0.1M柠檬酸缓冲液(pH 5.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物57：PK-0051(0.1M柠檬酸缓冲液(pH 5.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物58：PK-0051(0.1M柠檬酸缓冲液(pH 5.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物59：PK-0051(0.1M柠檬酸缓冲液(pH 6.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物60：PK-0051(0.1M柠檬酸缓冲液(pH 6.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物61：PK-0051(0.1M柠檬酸缓冲液(pH 6.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物62：PK-0051(0.1M柠檬酸缓冲液(pH 6.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物63：PK-0051(0.1M柠檬酸缓冲液(pH 6.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物64：PK-0051(0.1M柠檬酸缓冲液(pH 7.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物65：PK-0051(0.1M柠檬酸缓冲液(pH 7.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物66：PK-0051(0.1M柠檬酸缓冲液(pH 7.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物67：PK-0051(0.1M柠檬酸缓冲液(pH 7.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物68：PK-0051(0.1M柠檬酸缓冲液(pH 7.8))，(0.1mg/mL)
1-3.0.05M磷酸缓冲液(pH 4.0-7.9)
试验组合物69：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物70：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.1))，(0.1mg/mL)
试验组合物71：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物72：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.3))，(0.1mg/mL)
试验组合物73：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物74：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.5))，(0.1mg/mL)
试验组合物75：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物76：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.7))，(0.1mg/mL)
试验组合物77：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物78：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 4.9))，(0.1mg/mL)
试验组合物79：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物80：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.1))，(0.1mg/mL)
试验组合物81：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物82：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.3))，(0.1mg/mL)
试验组合物83：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物84：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.5))，(0.1mg/mL)
试验组合物85：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物86：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.7))，(0.1mg/mL)
试验组合物87：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物88：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 5.9))，(0.1mg/mL)
试验组合物89：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物90：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.1))，(0.1mg/mL)
试验组合物91：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物92：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.3))，(0.1mg/mL)
试验组合物93：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物94：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.5))，(0.1mg/mL)
试验组合物95：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物96：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.7))，(0.1mg/mL)
试验组合物97：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物98：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 6.9))，(0.1mg/mL)
试验组合物99：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物100：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.1))，(0.1mg/mL)
试验组合物101：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物102：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.3))，(0.1mg/mL)
试验组合物103：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物104：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.5))，(0.1mg/mL)
试验组合物105：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物106：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.7))，(0.1mg/mL)
试验组合物107：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物108：PK-0051(0.05M磷酸缓冲液(pH 7.9))，(0.1mg/mL)
1-4.0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(8:2)(pH 4.0-7.8)
试验组合物109：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(8:2)(pH4.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物110：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(8:2)(pH4.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物111：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(8:2)(pH4.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物112：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(8:2)(pH4.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物113：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(8:2)(pH4.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物114：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(8:2)(pH5.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物115：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(8:2)(pH5.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物116：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(8:2)(pH5.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物117：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(8:2)(pH5.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物118：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(8:2)(pH5.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物119：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(8:2)(pH6.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物120：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(8:2)(pH6.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物121：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(8:2)(pH6.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物122：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(8:2)(pH6.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物123：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(8:2)(pH6.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物124：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(8:2)(pH7.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物125：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(8:2)(pH7.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物126：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(8:2)(pH7.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物127：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(8:2)(pH7.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物128：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(8:2)(pH7.8))，(0.1mg/mL)
1-5.0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(5:5)(pH 4.0-7.8)
试验组合物129：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(5:5)(pH4.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物130：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(5:5)(pH4.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物131：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(5:5)(pH4.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物132：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(5:5)(pH4.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物133：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(5:5)(pH4.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物134：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(5:5)(pH5.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物135：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(5:5)(pH5.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物136：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(5:5)(pH5.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物137：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(5:5)(pH5.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物138：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(5:5)(pH5.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物139：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(5:5)(pH6.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物140：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(5:5)(pH6.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物141：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(5:5)(pH6.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物142：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(5:5)(pH6.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物143：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(5:5)(pH6.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物144：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(5:5)(pH7.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物145：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(5:5)(pH7.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物146：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(5:5)(pH7.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物147：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(5:5)(pH7.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物148：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(5:5)(pH7.8))，(0.1mg/mL)
1-6.0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(2:8)(pH 4.0-7.8)
试验组合物149：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(2:8)(pH4.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物150：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(2:8)(pH4.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物151：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(2:8)(pH4.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物152：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(2:8)(pH4.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物153：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(2:8)(pH4.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物154：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(2:8)(pH5.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物155：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(2:8)(pH5.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物156：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(2:8)(pH5.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物157：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(2:8)(pH5.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物158：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(2:8)(pH5.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物159：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(2:8)(pH6.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物160：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(2:8)(pH6.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物161：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(2:8)(pH6.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物162：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(2:8)(pH6.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物163：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(2:8)(pH6.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物164：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(2:8)(pH7.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物165：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(2:8)(pH7.2))，(0.1mg/mL)
试验组合物166：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(2:8)(pH7.4))，(0.1mg/mL)
试验组合物167：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(2:8)(pH7.6))，(0.1mg/mL)
试验组合物168：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液:0.05M磷酸缓冲液(2:8)(pH7.8))，(0.1mg/mL)
2.评价方法
将试验组合物13-168分别放置在5个5mL玻璃小瓶中，各自包含其1mL，并且在60℃下保存在稳定性试验器(由ESPEC CORP.制造)中。在第4周通过HPLC测量试验组合物。计算PK-0051的含量，并且基于相对于保存开始时的含量的含量比(％)的减少来评价稳定性。测量方法和含量的计算方法与实施例1中的那些相同。
3.结果
结果在图4-图9中示出。无论使用哪种缓冲液，在60℃下保存4周后在约pH 4.6-约pH 7.4的范围内，含量为80％以上。
实施例3(在柠檬酸缓冲液及其浓度中的稳定性的评价)
评价用于核酸吸入的原型的含PK-0051组合物的热稳定性。
1.试验组合物
试验组合物169如下制备。
将0.1M柠檬酸钠水溶液和0.1M柠檬酸水溶液混合以制备pH 6.8的0.1M柠檬酸缓冲液。将用注射用水制备的20mg/mL PK-0051(0.1mL)、注射用水(9.9mL)和pH 6.8的0.1M柠檬酸缓冲液(10mL)混合以制备20mL的0.1mg/mL的试验组合物169。
试验组合物170如下制备。
将0.1M柠檬酸钠水溶液和0.1M柠檬酸水溶液混合以制备pH 6.8的0.1M柠檬酸缓冲液。将其稀释10倍从而得到pH 6.8的0.01M柠檬酸缓冲液。将用注射用水制备的14.2mg/mL PK-0051(0.0704mL)、注射用水(4.9296mL)和pH 6.8的0.01M柠檬酸缓冲液(5mL)混合以制备10mL的0.1mg/mL试验组合物170。
试验组合物169：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.8))，(0.1mg/mL)
试验组合物170：PK-0051(0.005M柠檬酸缓冲液(pH 6.8))，(0.1mg/mL)
2.评价方法
将试验组合物169和170分别放置在9个5mL玻璃小瓶中，各自包含其1mL，并且将来自各组合物的4个小瓶在40℃/75％RH和60℃下保存在稳定性试验器中并将来自各组合物的1个小瓶在4℃下保存。连续4周每周通过HPLC测量试验组合物。计算PK-0051的含量，并且基于相对于保存开始时的含量的含量比(％)的减少来评价稳定性。测量方法和含量的计算方法与实施例1中的那些相同。
3.结果
结果在图10和图11中示出。结果显示在0.005M和0.05M的柠檬酸缓冲液浓度下，即使在60℃、4周间也没有明显的含量变化。由此暗示了即使当单链核酸的浓度增加时，也可以通过控制柠檬酸缓冲液的浓度来维持核酸稳定性的效果。
实施例4(含PK-0051组合物(pH 6.5)的稳定性评价)
制备10mg/mL和1mg/mL含PK-0051组合物(pH 6.5)并且评价稳定性。
1.试验组合物
10mg/mL含PK-0051组合物(pH 6.5)如下制备。
将柠檬酸水合物(21.0g)溶解在注射用水(1L)中从而得到0.1M柠檬酸溶液。同样地，将柠檬酸三钠二水合物(29.4g)溶解在注射用水(1L)中从而得到0.1M柠檬酸钠溶液。将0.1M柠檬酸溶液添加至0.1M柠檬酸钠溶液中来将pH调节至6.5从而得到0.1M柠檬酸缓冲液(pH 6.5)。将制造例1中合成的PK-0051(10g)溶解在注射用水(500mL)中。向其中添加0.1M柠檬酸缓冲液(pH 6.5)(500mL)并且搅拌混合物。使组合物通过0.22μm聚偏二氟乙烯(PVDF)过滤器从而得到10mg/mL含PK-0051组合物(pH 6.5)。
除了将PK-0051改变为1.0g以外，通过与上述方法相同的方法制备1mg/mL含PK-0051组合物(pH 6.5)。
使用10mg/mL和1mg/mL含PK-0051组合物(pH 6.5)作为试验组合物171和172，评价稳定性。
试验组合物171：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.5))，(1mg/mL)
试验组合物172：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.5))，(10mg/mL)
2.评价方法
将试验组合物171和172分别放置在9个5mL玻璃小瓶中，各自包含其1mL，并且将来自各组合物的4个小瓶在25℃/60％RH、40℃/75％RH和60℃下保存在稳定性试验器中并将来自各组合物的1个小瓶在4℃下保存。连续4周每周通过HPLC测量试验组合物。计算PK-0051的含量，并且基于相对于保存开始时的含量的含量比(％)的减少来评价稳定性。测量方法与实施例1中的方法相同。
通过使用通过将PK-0051溶解在注射用水中制备为1mg/mL而得的溶液(100％)和通过按9:1、8:2、7:3和6:4(分别为90％、80％、70％和60％)的比例混合所述溶液和注射用水而得的溶液作为校正曲线样品，将各校正曲线样品进样10μL至HPLC以测量峰面积，绘制各校正曲线样品的测量值，横轴(X)为理论含量(％)，纵轴(Y)为峰面积，通过最小二乘法获得回归线(Y＝aX+b)(校正曲线)，并且将在相同条件下通过HPLC测得的试验组合物的峰面积应用至校正曲线从而得到理论含量(％)，测定试验组合物中的PK-0051的含量。除了使用1μL进行HPLC以外，通过与上述方法相同的方法测定试验组合物172中的PK-0051的含量。
3.结果
结果在图12和图13中示出。结果显示即使在60℃、4周间也没有明显的含量变化。由此显示1mg/mL和10mg/mL含PK-0051组合物(pH 6.5)具有高的稳定性。
实施例5(含PK-0051组合物(pH 6.0)的稳定性评价)
制备1mg/mL含PK-0051组合物(pH 6.0)，并且评价稳定性。
1.试验组合物
将柠檬酸水合物(21.014g)溶解在注射用水(1L)中从而得到0.1M柠檬酸溶液。同样地，将柠檬酸三钠二水合物(29.41g)溶解在注射用水(1L)中从而得到0.1M柠檬酸钠溶液。将0.1M柠檬酸溶液添加至0.1M柠檬酸钠溶液中来将pH调节至6.0从而得到0.1M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)。将制造例1中合成的PK-0051(347mg)溶解在注射用水(5mL)中。向该溶液(0.144mL)中添加注射用水(4.856mL)和0.1M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)(5mL)并且搅拌混合物。使其通过0.22μm聚偏二氟乙烯(PVDF)过滤器从而得到1mg/mL含PK-0051组合物(pH6.0)。
使用1mg/mL含PK-0051组合物(pH 6.0)作为试验组合物173，评价稳定性。
试验组合物173：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0))，(1mg/mL)
2.评价方法
将试验组合物173放置在5个5mL玻璃小瓶中，各自包含其1mL，并且将1个小瓶在4℃下保存并将4个小瓶在60℃下保存在稳定性试验器中。连续4周每周通过HPLC测量试验组合物。计算PK-0051的含量，并且基于相对于保存开始时的含量的含量比(％)的减少来评价稳定性。测量方法和含量的计算方法与实施例1中的那些相同。
3.结果
结果在图14中示出。结果显示即使在60℃、4周间也没有明显的含量变化。由此显示1mg/mL含PK-0051组合物(pH 6.0)具有高的稳定性。
实施例6(在肺纤维化自发模型小鼠中的肺纤维化抑制效果)
使用肺纤维化自发模型小鼠(Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.,2012,46(3),397-406和PLoS One,2012,7(8):e42655中记载的人TGF-β1转基因小鼠，下文中称为TG小鼠)，确认本发明的组合物的肺纤维化抑制效果。使用肺组织中的羟脯氨酸量作为指标并且根据PLoS One,2012(上述)中记载的方法来确认前述效果。
1.试验组合物
将实施例4中制备的10mg/mL含PK-0051组合物(pH 6.5)用0.05M柠檬酸缓冲液(pH6.5)稀释并且用作试验组合物。基于TG小鼠在试验组合物给药当天的体重进行稀释。
2.分组和试验组合物的给药
使用Micro CT装置(R_mCT2，由Rigaku Corporation制造)，评价TG小鼠的肺中的纤维化，并且将小鼠分组以使肺纤维化程度和在分组时的体重在各组间是均等的。
各给药组在以下示出。在各给药组中，使用11只雄性小鼠。在异氟烷麻醉下，将试验组合物通过使用微型喷雾器(MSA-250-M：由PENNCENTURY制造)向TG小鼠的气管总共施用4次。
·给药组1
将0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.5)1次/周施用至TG小鼠。
·给药组2
将试验组合物按5mg/kg体重1次/2周施用至TG小鼠。
·给药组3
将试验组合物按5mg/kg体重1次/周施用至TG小鼠。
3.肺组织的采样
将戊巴比妥腹腔内施用至TG小鼠(1.22mg/150μL/小鼠-1.62mg/200μL/小鼠)用于麻醉，收集血液样品并且将双侧肺分离并冷冻用于匀浆样品。
4.肺组织中的hTGF-β1的定量
将双侧肺通过珠式细胞破碎装置(MS-100，由TOMY SEIKO CO.,LTD.制造)匀浆，并且将上清液的一部分通过离心回收。使用Human TGF-β1ELISA Set(由BD制造)测定上清液中的hTGF-β1的量。
5.肺组织中的羟脯氨酸的定量
将匀浆后的双侧肺通过在110℃下温育过夜来干燥，并且使用珠式细胞破碎装置再次粉碎。向粉碎的双侧肺中添加6N HCl(1mL)并且将混合物在通风橱中在110℃下温育过夜。此后，将混合物在通风橱中在110℃下温育过夜并干燥。向其中添加2mL的PBS并且将混合物在60℃下温育1hr并通过过滤器从而得到羟脯氨酸量测量用样品。通过PLoSOne.2012；7(8):e42655的方法来测定羟脯氨酸量。
6.结果
结果在图15和图16中示出。图15为示出各给药组中的TGF-β1量的图，其中纵轴示出肺组织的TGF-β1量。图16为示出各给药组中的羟脯氨酸量的图，其中纵轴示出肺组织中的羟脯氨酸量。在TG小鼠/核酸分子溶液(0.1mg/kg)给药组3中，与TG小鼠/0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.5)给药组1相比，肺组织中的TGF-β1量和羟脯氨酸量显著地受到抑制。
由此显示作为本发明中的核酸分子的PK-0051还在体内抑制作为靶点的TGF-β1的表达并且抑制体内的肺纤维化。
实施例7(10、20、40和80mg/mL含PK-0051组合物(pH6.0)的稳定性评价)
制备10、20、40和80mg/mL含PK-0051组合物(pH 6.0)，并且评价稳定性。
1.试验组合物
试验组合物174如下制备。将柠檬酸水合物(105.07g)溶解在注射用水(1L)中从而得到0.5M柠檬酸溶液。同样地，将柠檬酸三钠二水合物(147.05g)溶解在注射用水(1L)中从而得到0.5M柠檬酸钠溶液。将0.5M柠檬酸溶液添加至0.5M柠檬酸钠溶液中来将pH调节至6.0从而得到0.5M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)。将PK-0051(840mg)溶解在注射用水(8mL)中并且用作储备液。将4.02mL的注射用水和0.5mL的0.5M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)添加至0.48mL的储备液中并且将混合物搅拌并通过0.22μm聚偏二氟乙烯(PVDF)过滤器。
除了将3.55mL的注射用水和0.5mL的0.5M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)添加至0.95mL的储备液中并且与其混合以外，通过与用于制备试验组合物174的相同的方法制备试验组合物175。
除了将2.6mL的注射用水和0.5mL的0.5M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)添加至1.9mL的储备液中并且与其混合以外，通过与用于制备试验组合物174的相同的方法制备试验组合物176。
除了将0.69mL的注射用水和0.5mL的0.5M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)添加至3.81mL的储备液中并且与其混合以外，通过与用于制备试验组合物174的相同的方法制备试验组合物177。
试验组合物174：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0))，(10mg/mL)
试验组合物175：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0))，(20mg/mL)
试验组合物176：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0))，(40mg/mL)
试验组合物177：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0))，(80mg/mL)
2.评价方法
将试验组合物174-177分别放置在4个5mL玻璃小瓶中，各自包含其1mL，并且在60℃下保存在稳定性试验器中。将试验组合物每周取出并且稀释10倍。通过HPLC测量10μL的试验组合物174、5μL的试验组合物175、3μL的试验组合物176和2μL的试验组合物177。测量进行至第4周。计算PK-0051的含量，并且基于相对于保存开始时的含量的含量比(％)的减少来评价稳定性。含量的计算方法和测量方法在以下示出。
使用通过将在4℃下分别保存的试验组合物174稀释10倍获得的溶液(100％)和通过按9:1、8:2、7:3和6:4(分别为90％、80％、70％和60％)的比例混合所述溶液和注射用水获得的溶液作为校正曲线样品，将各校正曲线样品进样10μL至HPLC以测量峰面积。通过绘制各校正曲线样品的测量值借助最小二乘法获得回归线(Y＝aX+b)(校正曲线)，横轴(X)为理论含量(％)，纵轴(Y)为峰面积。将在相同条件下通过HPLC测得的试验组合物174的峰面积应用至校正曲线以测定理论含量(％)。除了将使用试验组合物175生产的各校正曲线样品(5μL)用于HPLC以外，通过与上述方法相同的方法测定试验组合物175的含量。除了将使用试验组合物176生产的各校正曲线样品(3μL)用于HPLC以外，通过与上述方法相同的方法测定试验组合物176的含量。除了将使用试验组合物177生产的各校正曲线样品(2μL)用于HPLC以外，通过与上述方法相同的方法测定试验组合物177的含量。
测量方法
在以下测量条件下测量校正曲线样品(60％-100％)和各试验组合物。
离子交换HPLC
测量装置：LC-20ASHIMAZU HPLC系统(AEX-HPLC)，由Shimadzu Corporation制造
检测器：紫外吸光光度计(检测波长：260nm)
柱：DNAPac PA-100(4×250mm)
柱温：80℃
流动相A：25mM Tris-HCL(pH 8.0)，8M尿素，10％乙腈
流动相B：流动相A，700mM高氯酸钠一水合物
流动相的供给：流动相A和流动相B的混合比如下改变以控制浓度梯度(表4)。
[表4]
注入后的时间(分钟) 流动相A(体积％) 流动相B(体积％)
0→20 90→60 10→40
流速：1.0mL/min
3.结果
结果在表5和图17中示出。在60℃下保存4周后，PK-0051的含量在PK-0051的浓度为10mg/mL时约为97％，在浓度为20mg/mL时约为95％，在浓度为40mg/mL时约为91％，并且在浓度为80mg/mL时约为85％。由此显示随着浓度增加，与保存开始时相比，含量的下降增加。另一方面，当PK-0051的浓度为10mg/mL或20mg/mL时，与保存开始时相比，含量的下降小于10％。此外，即使当作为最低含量的PK-0051的浓度为80mg/mL时，含量的下降约为15％。因此，即使在60℃、4周的严苛的保存条件下，也显示PK-0051具有高的稳定性。
[表5]
Figure BDA0001647977330000341
实施例8(1mg/mL含PK-0051组合物(pH5.5、6.0和6.5)的稳定性评价(光稳定性))
使用各自填充有含PK-0051组合物的透明玻璃小瓶和棕色玻璃小瓶以及进一步包装在纸箱中的那些，评价PK-0051对光的稳定性。
1.试验组合物
试验组合物178如下制备。将柠檬酸水合物(21.014g)溶解在注射用水(1L)中从而得到0.1M柠檬酸溶液。同样地，将柠檬酸三钠二水合物(29.41g)溶解在注射用水(1L)中从而得到0.1M柠檬酸钠溶液。将0.1M柠檬酸溶液添加至0.1M柠檬酸钠溶液中来将pH调节至5.5从而得到0.1M柠檬酸缓冲液(pH 5.5)。将PK-0051(210mg)溶解在注射用水(10mL)中并且用作储备液。将9.5mL的注射用水和10.5mL的0.1M柠檬酸缓冲液(pH 5.5)添加至1mL的储备液中并且将混合物搅拌并通过0.22μm聚偏二氟乙烯(PVDF)过滤器。
除了将0.1M柠檬酸溶液添加至0.1M柠檬酸钠溶液中来将pH调节至6.0从而得到0.1M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)和将9.5mL的注射用水和10.5mL的0.1M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)添加至1mL的储备液中并且与其混合以外，通过与用于制备试验组合物178的相同的方法制备试验组合物179。
除了将0.1M柠檬酸溶液添加至0.1M柠檬酸钠溶液中来将pH调节至6.5从而得到0.1M柠檬酸缓冲液(pH 6.5)和将9.5mL的注射用水和10.5mL的0.1M柠檬酸缓冲液(pH 6.5)添加至1mL的储备液中并且与其混合以外，通过与用于制备试验组合物178的相同的方法制备试验组合物180。
试验组合物178：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.5))，(1mg/mL)
试验组合物179：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0))，(1mg/mL)
试验组合物180：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.5))，(1mg/mL)
2.评价方法
将试验组合物178-180分别放置在10个5mL透明玻璃小瓶和10个5mL棕色玻璃小瓶(透明瓶和遮光瓶)中。此外，将同样填充有试验组合物178-180的透明瓶和遮光瓶包装在纸箱中(透明瓶二次包装和遮光瓶二次包装)。将这些在使用D65灯作为光源的日光荧光灯(照度1580Lux)下在25℃/60％RH的稳定性试验器中保存，直至总曝光量达到120万Lux·hr(保存时间32天，总曝光量1,213,743Lux·hr)。当总曝光量达到30万Lux·hr、60万Lux·hr、90万Lux·hr和120万Lux·hr时，将试验组合物取出并且通过反相HPLC和离子交换HPLC测量其10μL。计算PK-0051的含量，并且基于相对于保存开始时的含量的含量比(％)的减少来评价稳定性。含量的计算方法和测量方法在以下示出。
将与以上同样制备(透明瓶、遮光瓶、透明瓶二次包装和遮光瓶二次包装)并且在4℃暗处保存的试验组合物178(100％)和注射用水按9:1、8:2、7:3和6:4的比例混合并且将所述溶液(90％、80％、70％和60％)用作校正曲线样品。将各校正曲线样品(10μL)进样至反相HPLC和离子交换HPLC并且测量峰面积。通过绘制各校正曲线样品的测量值借助最小二乘法获得回归线(Y＝aX+b)(校正曲线)，横轴(X)为理论含量(％)，纵轴(Y)为峰面积。将在相同条件下通过反相HPLC和离子交换HPLC测得的试验组合物178的峰面积应用至校正曲线以测定理论含量(％)。通过与上述方法相同的方法测定试验组合物179和180的含量。
测量方法
在以下测量条件下测量校正曲线样品(60％-100％)和各试验组合物。通过与实施例7中相同的测量方法进行通过离子交换HPLC的测量。
反相HPLC
测量装置：LC-10A SHIMAZU HPLC系统(RP-HPLC)，由Shimadzu Corporation制造
检测器：紫外吸光光度计(检测波长：260nm)
柱：X-Bridge OST C18(2.5μm，4.6×50mm)
柱温：40℃
流动相A：50mM TEAA(pH 7.0)，0.5％乙腈
流动相B：100％乙腈
流动相的供给：流动相A和流动相B的混合比如下改变以控制浓度梯度(表6)。
[表6]
注入后的时间(分钟) 流动相A(体积％) 流动相B(体积％)
0→12 100→60 0→40
流速：1.0mL/min
3.结果
结果在表7-9和图18-23中示出。阐明的是在通过反相HPLC或离子交换HPLC测定的情况下，所有试验组合物未显示明确的含量的变化并且对光是稳定的。由所述结果来看，认为本发明的组合物即使在从生产到使用期间暴露于120万Lux·hr的光量时，也没有由于光导致的制剂质量的下降，并且可以以与非曝光品相同的方式来处理。此外，认为可以使用成本较低的透明玻璃小瓶代替棕色玻璃小瓶。
[表7]
PK-0051在0.05M柠檬酸缓冲液(pH 5.5)中的光稳定性试验
Figure BDA0001647977330000371
[表8]
PK-0051在0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中的光稳定性试验
Figure BDA0001647977330000381
[表9]
PK-0051在0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.5)中的光稳定性试验
Figure BDA0001647977330000391
实施例9(在渗透压比通过等渗剂调节的情况下的含PK-0051组合物的稳定性评 价)
使用各种等渗剂(NaCl、KCl、甘油、D-甘露醇、乳糖醇、D-山梨醇和蔗糖)，将含PK-0051组合物的渗透压比调节至1±0.1并且评价稳定性。
1.试验组合物
试验组合物181如下制备。将柠檬酸水合物(105.07g)溶解在注射用水(1L)中从而得到0.5M柠檬酸溶液。同样地，将柠檬酸三钠二水合物(147.05g)溶解在注射用水(1L)中从而得到0.5M柠檬酸钠溶液。将0.5M柠檬酸溶液添加至0.5M柠檬酸钠溶液中来将pH调节至6.0从而得到0.5M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)。将1g的NaCl溶解在10mL的注射用水中从而得到10％溶液。将PK-0051(210mg)溶解在注射用水(140mL)中并且用作储备液。将0.68mL的NaCl10％溶液、11.82mL的注射用水和1.5mL的0.5M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)添加至1mL的储备液中并且将混合物搅拌并通过0.22μm聚偏二氟乙烯(PVDF)过滤器。
除了使用KCl代替NaCl以及将0.85mL的KCl 10％溶液、11.65mL的注射用水和1.5mL的0.5M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)添加至1mL的储备液中并且与其混合以外，通过与用于制备试验组合物181的相同的方法制备试验组合物182。
除了使用甘油代替NaCl以及将1.8mL的甘油10％溶液、10.7mL的注射用水和1.5mL的0.5M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)添加至1mL的储备液中并且与其混合以外，通过与用于制备试验组合物181的相同的方法制备试验组合物183。
除了使用D-甘露醇代替NaCl以及将3.75mL的D-甘露醇10％溶液、8.75mL的注射用水和1.5mL的0.5M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)添加至1mL的储备液中并且与其混合以外，通过与用于制备试验组合物181的相同的方法制备试验组合物184。
除了使用乳糖醇代替NaCl以及将7.05mL的乳糖醇10％溶液、5.45mL的注射用水和1.5mL的0.5M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)添加至1mL的储备液中并且与其混合以外，通过与用于制备试验组合物181的相同的方法制备试验组合物185。
除了使用D-山梨醇代替NaCl以及将3.75mL的D-山梨醇10％溶液、8.75mL的注射用水和1.5mL的0.5M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)添加至1mL的储备液中并且与其混合以外，通过与用于制备试验组合物181的相同的方法制备试验组合物186。
除了使用蔗糖代替NaCl以及将7mL的蔗糖10％溶液、5.5mL的注射用水和1.5mL的0.5M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)添加至1mL的储备液中并且与其混合以外，通过与用于制备试验组合物181的相同的方法制备试验组合物187。
除了将12.5mL的注射用水和1.5mL的0.5M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)添加至1mL的储备液中并且与其混合以外，通过与用于制备试验组合物181的相同的方法制备试验组合物188。
除了将12.65mL的注射用水和1.35mL的NaCl 10％溶液添加至1mL的储备液中并且与其混合以外，通过与用于制备试验组合物181的相同的方法制备试验组合物189。
试验组合物181：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)/NaCl(渗透压比为1))，(0.1mg/mL)
试验组合物182：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)/KCl(渗透压比为1))，(0.1mg/mL)
试验组合物183：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)/甘油(渗透压比为1))，(0.1mg/mL)
试验组合物184：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)/D-甘露醇(渗透压比为1))，(0.1mg/mL)
试验组合物185：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)/乳糖醇(渗透压比为1))，(0.1mg/mL)
试验组合物186：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)/D-山梨醇(渗透压比为1))，(0.1mg/mL)
试验组合物187：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)/蔗糖(渗透压比为1))，(0.1mg/mL)
试验组合物188：PK-0051(0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0))，(0.1mg/mL)
试验组合物189：PK-0051(NaCl(渗透压比为1))，(0.1mg/mL)
2.评价方法
将试验组合物181-189分别放置在14个5mL玻璃小瓶中，各自包含其1mL，并且在25℃/60％RH、40℃/75％RH和60℃下保存在稳定性试验器中。1和2周后，通过反相HPLC和离子交换HPLC测量各试验组合物(30μL)。
将试验组合物181-189在对应于在60℃下保存4周的条件(105℃和121℃下5min和15min)下进行加速试验。将试验组合物181-189在105℃下5min、105℃下15min、121℃下5min和121℃下15min的4种条件下分别进行高压釜处理，并且通过反相HPLC和离子交换HPLC测量30μL。
通过HPLC测量后，计算PK-0051的含量，并且基于相对于保存开始时的含量的含量比(％)的减少来评价稳定性。含量的计算方法和测量方法在以下示出。
将通过按9:1、8:2、7:3和6:4混合试验组合物188(100％)和注射用水获得的溶液(90％、80％、70％和60％)分别用作校正曲线样品，将各校正曲线样品进样30μL至HPLC以测量峰面积，绘制各校正曲线样品的测量值，横轴(X)为理论含量(％)，纵轴(Y)为峰面积，通过最小二乘法获得回归线(Y＝aX+b)(校正曲线)并且将在相同条件下通过HPLC测得的试验组合物的峰面积应用至校正曲线，由此获得理论含量(％)。
测量方法
在以下测量条件下测量校正曲线样品(60％-100％)和试验组合物。通过与实施例7中相同的测量方法进行通过离子交换HPLC的测量。除了将50mM TEAA(pH 7.3)用作流动相A并且检测波长为254nm以外，通过与实施例8中相同的测量方法进行通过反相HPLC的测量。
3.结果
结果在表10-18中示出。试验组合物181-188在25℃、40℃或60℃下保存2周后未显示PK-0051的含量的明确下降。通过高压釜处理(105℃和121℃下5min和15min)，试验组合物181-188显示PK-0051的含量的下降在约15％以内，由此显示高的稳定性。另一方面，试验组合物189在25℃、40℃或60℃下保存2周后未显示PK-0051的含量的明确下降；然而，明显发现由于高压釜处理(121℃下5min和15min)导致的PK-0051的含量下降(121℃下5min约24％的下降，121℃下15min约41％的下降)。还阐明的是在没有0.05M柠檬酸缓冲液(pH6.0)的情况下，稳定性由于NaCl的影响而下降。以上结果已经阐明等渗剂不使PK-0051在0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中的稳定性下降。
[表10]
PK-0051在0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)/NaCl(渗透压比为1)中的热稳定性
Figure BDA0001647977330000431
[表11]
PK-0051在0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)/KCl(渗透压比为1)中的热稳定性
Figure BDA0001647977330000441
[表12]
PK-0051在0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)/甘油(渗透压比为1)中的热稳定性
Figure BDA0001647977330000451
[表13]
PK-0051在0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)/D-甘露醇(渗透压比为1)中的热稳定性
Figure BDA0001647977330000461
[表14]
PK-0051在0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)/乳糖醇(渗透压比为1)中的热稳定性
Figure BDA0001647977330000471
[表15]
PK-0051在0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)/D-山梨醇(渗透压比为1)中的热稳定性
Figure BDA0001647977330000481
[表16]
PK-0051在0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)/蔗糖(渗透压比为1)中的热稳定性
Figure BDA0001647977330000491
[表17]
PK-0051在0.05M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中的热稳定性
Figure BDA0001647977330000501
[表18]
PK-0051在NaCl(渗透压比为1)中的热稳定性
Figure BDA0001647977330000511
产业上的可利用性
根据本发明，能够抑制TGF-β1的表达的单链核酸分子PK-0051可以在常温下以溶液状态长期稳定地保存。因此，本发明是极其有用的，因为它可以提供可以方便地保存和输送、在使用时不需要通过再溶解来制备并且在处理方面优异的核酸药物制品。
本申请基于在日本提交的专利申请No.2015-215207(提交日期：2015年10月30日)，将其内容完整地引入本文。
序列表
<110> 株式会社博纳克(BONAC CORPORATION)
竹内洋文(TAKEUCHI, Hirofumi)
<120> 稳定地含有抑制TGF-β1基因的表达的单链核酸分子的组合物
<130> 903346
<150> JP 2015-215207
<151> 2015-10-30
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子
<400> 1
agcagaguac acacagcaua uacc 24
<210> 2
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子
<400> 2
gguauaugcu guguguacuc ugcuuc 26

Claims (17)

1.一种组合物，其包括
由通过
5’-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G-3’示出的核苷酸序列组成的单链核酸分子和缓冲液，其中在所述序列中，P为由下式(I)表示的脯氨酸衍生物连接子
Figure FDA0003047490730000011
并且具有以下特征：
(a)在常温下为溶液的形式；和
(b)在25℃、相对湿度60％下保存4周后的所述核酸分子的含量相对于保存开始时的含量为80％以上，
其中所述缓冲液将所述组合物的pH调节至4.6以上且7.0以下。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中在40℃、相对湿度75％下保存4周后的所述核酸分子的含量相对于保存开始时的含量为80％以上。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中在60℃下保存4周后的所述核酸分子的含量相对于保存开始时的含量为60％以上。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中暴露于总曝光量120万Lux·hr的所述核酸分子的含量相对于保存开始时的含量为80％以上。
5.根据权利要求1至4任一项所述的组合物，其中所述缓冲液将所述组合物的pH调节至5.5以上且6.5以下。
6.根据权利要求1至4任一项所述的组合物，其中所述缓冲液包括选自磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、精氨酸盐酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸三钠二水合物、L-谷氨酸一钠、乙酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、乳酸钠、磷酸二氢钾、氢氧化钠、葡甲胺、甘氨酸、柠檬酸和乙酸的一种以上的缓冲剂。
7.根据权利要求1至4任一项所述的组合物，其中所述缓冲液包括柠檬酸和/或磷酸。
8.根据权利要求1至4任一项所述的组合物，其进一步包括等渗剂。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述等渗剂为选自D-山梨醇、氯化钠、甘油、D-甘露醇、氯化钾、乳糖醇和蔗糖的一种以上。
10.根据权利要求1至4任一项所述的组合物，其用于肺纤维化或急性肺损伤的预防或治疗。
11.一种根据权利要求5至10任一项所述的组合物的生产方法，其包括将所述核酸分子溶解在将所述组合物的pH调节至5.5以上且6.5以下的缓冲液中，并将溶液在常温下保存。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述缓冲液包括柠檬酸和/或磷酸。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述组合物用于肺纤维化或急性肺损伤的预防或治疗。
14.一种组合物中的核酸分子的稳定化方法，所述核酸分子由通过5’-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G-3’示出的核苷酸序列组成，其中在所述序列中，P为由下式(I)表示的脯氨酸衍生物连接子
Figure FDA0003047490730000021
所述方法包括将所述核酸分子溶解在将所述组合物的pH调节至5.5以上且6.5以下的缓冲液中，并将溶液在常温下保存。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述缓冲液包括柠檬酸和/或磷酸。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述溶液为肺纤维化或急性肺损伤的预防或治疗用组合物。
17.根据权利要求1至10任一项所述的组合物在制备用于治疗或预防有需要的受试者的肺纤维化或急性肺损伤的药物中的用途。
CN201680064120.5A 2015-10-30 2016-10-28 稳定地含有抑制TGF-β1基因的表达的单链核酸分子的组合物 Active CN108350457B (zh)

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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI830718B (zh) * 2018-02-09 2024-02-01 日商住友化學股份有限公司 核酸分子之製造方法
RU2020130258A (ru) * 2018-03-30 2022-05-04 Торэй Индастриз, Инк. Способ получения шпилечной одноцепочечной молекулы рнк
KR20210069628A (ko) * 2018-10-02 2021-06-11 도레이 카부시키가이샤 헤어핀형 단일쇄 rna 분자의 제조 방법

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69333378T2 (de) 1992-09-17 2004-07-01 Amgen Inc., Thousand Oaks Pharmazeutische zusammensetzungen mit interleukin-1 inhibitoren
JP4956727B2 (ja) 2005-08-30 2012-06-20 倉敷紡績株式会社 Ｒｎａ分離精製方法
TW200808360A (en) * 2006-04-13 2008-02-16 Alcon Mfg Ltd RNAi-mediated inhibition of spleen tyrosine kinase-related inflammatory conditions
US20100099149A1 (en) 2006-10-06 2010-04-22 Dna Genotek Inc. Stabilizing compositions and methods for extraction of ribonucleic acid
WO2009086558A1 (en) * 2008-01-02 2009-07-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids
JP5608998B2 (ja) 2009-03-31 2014-10-22 東洋紡株式会社 保存安定性に優れた核酸増幅検出試薬キット
WO2011099036A2 (en) 2010-02-12 2011-08-18 Intas Biopharmaceuticals Limited Liquid formulation of follicle stimulating hormone
IL265674B2 (en) * 2010-03-24 2024-05-01 Phio Pharm Corp Rana disorder in cutaneous and fibrotic symptoms
ES2550487T3 (es) * 2010-07-08 2015-11-10 Bonac Corporation Molécula de ácido nucleico monocatenario para controlar la expresión génica
US8785121B2 (en) 2010-07-08 2014-07-22 Bonac Corporation Single-stranded nucleic acid molecule for controlling gene expression
EP2628801B1 (en) 2010-08-03 2015-01-07 Bonac Corporation Single-stranded nucleic acid molecule having nitrogen-containing alicyclic skeleton
US8691782B2 (en) * 2010-08-03 2014-04-08 Bonac Corporation Single-stranded nucleic acid molecule having nitrogen-containing alicyclic skeleton
RU2600841C2 (ru) * 2010-08-16 2016-10-27 Острэйлиен Ньюклиар Сайенс Энд Текнолоджи Организейшн Вещества, включающие керамические частицы для доставки биомолекул
AR083445A1 (es) * 2010-10-14 2013-02-27 Univ Mie siARN CONTRA LA FIBROSIS
AU2011326732B2 (en) 2010-11-09 2016-07-21 The Regents Of The University Of California Skin permeating and cell entering (space) peptides and methods of use thereof
JP5854595B2 (ja) 2010-12-07 2016-02-09 株式会社Ｓｈｏｅｉ ヘルメット用ラチェットバックル
WO2013077446A1 (ja) 2011-11-26 2013-05-30 株式会社ボナック 遺伝子発現制御のための一本鎖核酸分子
JP2015501844A (ja) 2011-12-16 2015-01-19 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 修飾ヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸組成物
CN110055247A (zh) 2012-01-07 2019-07-26 株式会社博纳克 具有氨基酸骨架的单链核酸分子
WO2013133393A1 (ja) 2012-03-07 2013-09-12 学校法人東京医科大学 Ｖｅｇｆ遺伝子の発現抑制用一本鎖核酸分子
AU2013234795B2 (en) * 2012-03-21 2016-12-22 Engene, Inc. Dually derivatized chitosan nanoparticles and methods of making and using the same for gene transfer in vivo
EP2906242A1 (en) * 2012-10-14 2015-08-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Delivery of small interfering rna and micro rna through membrane-disruptive, responsive nanoscalle hydrogels
AU2013380825B2 (en) 2012-10-16 2017-07-20 Biomics Biotechnologies Co., Ltd. Lipidosome preparation, preparation method and application thereof
CN102895190A (zh) * 2012-10-16 2013-01-30 百奥迈科生物技术有限公司 脂质体制剂、制备方法及其应用
CN105051064A (zh) 2013-01-24 2015-11-11 葛兰素史克知识产权开发有限公司 抗TNF-α抗原结合蛋白
WO2015093495A1 (ja) * 2013-12-16 2015-06-25 株式会社ボナック ＴＧＦ－β１遺伝子発現制御のための一本鎖核酸分子
MX2016008518A (es) * 2013-12-27 2017-01-26 Bonac Corp Micro-acido ribonucleico (micro-arn) concordante artificial para controlar la expresion genetica y uso del mismo.
WO2016108264A1 (ja) 2014-12-29 2016-07-07 株式会社ボナック 核酸分子を安定に含有する組成物

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