RU2600841C2 - Вещества, включающие керамические частицы для доставки биомолекул - Google Patents

Вещества, включающие керамические частицы для доставки биомолекул Download PDF

Info

Publication number
RU2600841C2
RU2600841C2 RU2013111765/15A RU2013111765A RU2600841C2 RU 2600841 C2 RU2600841 C2 RU 2600841C2 RU 2013111765/15 A RU2013111765/15 A RU 2013111765/15A RU 2013111765 A RU2013111765 A RU 2013111765A RU 2600841 C2 RU2600841 C2 RU 2600841C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
particles
biomolecule
paragraphs
ceramic precursor
group
Prior art date
Application number
RU2013111765/15A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2013111765A (ru
Inventor
Кристоф Жан Александр БАРБЕ
Ким Сьюзан ФИННИ
Сэмьюэл НАЙТ
Тоби Джонстон ПАССИУРА
Original Assignee
Острэйлиен Ньюклиар Сайенс Энд Текнолоджи Организейшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2010903683A external-priority patent/AU2010903683A0/en
Application filed by Острэйлиен Ньюклиар Сайенс Энд Текнолоджи Организейшн filed Critical Острэйлиен Ньюклиар Сайенс Энд Текнолоджи Организейшн
Publication of RU2013111765A publication Critical patent/RU2013111765A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2600841C2 publication Critical patent/RU2600841C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5115—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6923—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being an inorganic particle, e.g. ceramic particles, silica particles, ferrite or synsorb
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5192—Processes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/70—Web, sheet or filament bases ; Films; Fibres of the matrix type containing drug
    • A61K9/7023—Transdermal patches and similar drug-containing composite devices, e.g. cataplasms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L15/00—Chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings or absorbent pads
    • A61L15/16—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
    • A61L15/18—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons containing inorganic materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L15/00—Chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings or absorbent pads
    • A61L15/16—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
    • A61L15/42—Use of materials characterised by their function or physical properties
    • A61L15/425—Porous materials, e.g. foams or sponges
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/02—Inorganic materials
    • A61L27/10—Ceramics or glasses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/40—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material
    • A61L27/42—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having an inorganic matrix
    • A61L27/427—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having an inorganic matrix of other specific inorganic materials not covered by A61L27/422 or A61L27/425
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/56—Porous materials, e.g. foams or sponges
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
    • C01B33/00—Silicon; Compounds thereof
    • C01B33/113—Silicon oxides; Hydrates thereof
    • C01B33/12—Silica; Hydrates thereof, e.g. lepidoic silicic acid
    • C01B33/18—Preparation of finely divided silica neither in sol nor in gel form; After-treatment thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/252—Polypeptides, proteins, e.g. glycoproteins, lipoproteins, cytokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/258—Genetic materials, DNA, RNA, genes, vectors, e.g. plasmids
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Ceramic Engineering (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)

Abstract

Группа изобретений относится к медицине. Описано состоящее из частиц вещество, содержащее: частицы керамической матрицы, несущие функциональную группу, способную стимулировать проникновение частиц в клетки; и биомолекулу, находящуюся в порах частиц, где указанная биомолекула может высвобождаться из частиц при растворении керамической матрицы. Вещество обеспечивает хорошую пенетрацию активного вещества в клетки-мишени. 3 н. и 53 з.п. ф-лы, 22 ил.

Description

Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к веществам, содержащим керамические частицы для доставки биомолекул, и к способам получения таких веществ. Более конкретно, настоящее изобретение относится к состоящим из частиц веществам, которые включают частицы керамической матрицы, несущие функциональную группу и имеющие высвобождаемые биомолекулы, присутствующие в порах этих частиц.
Предшествующий уровень техники
Применение киРНК-терапии и генотерапии представляет собой главное перспективное направление в медицине. Оно открывает большие возможности для лечения ряда заболеваний, которые в настоящее время не поддаются лечению, таких как кистозный фиброз, некоторые виды рака и иммунные заболевания, такие как диабет типа 1, рассеянный склероз и т.п. Однако, для осуществления эффективной киРНК-терапии, киРНК, перед ее доставкой на участок действия, должна быть защищена от ферментативного расщепления in vivo.
В настоящее время, киРНК-терапия требует больших расходов. Такая дорогостоящая терапия применяется, главным образом, в наиболее развитых странах. По оценкам специалистов, общие затраты на генотерапию составляют >5 миллиардов долларов США.
Основными задачами при разработке киРНК-терапии для применения в медицине являются:
- защита активного вещества от ферментативного разложения;
- обеспечение доставки активного вещества в клетки-мишени (обеспечение хорошей пенетрации);
- высвобождение активного вещества из инкапсулирующего вещества в цитоплазму (эндосомное высвобождение);
- обеспечение возможности осуществления нокаута генов («отключения» экспрессии генов) (предпочтительно, с эффективностью активного вещества в нМ-концентрациях); и
- достижение низкой токсичности (широкое терапевтическое окно).
КиРНК представляют собой гидрофобные молекулы с высоким отрицательным зарядом, имеющие средние размеры (приблизительно массу 14 кДа, диаметр 3 нм, длину 10 нм). Они являются химически и биологически неустойчивыми, если только они не были модифицированы для повышения стабильности. Для достижения клинического эффекта, киРНК должны обладать способностью проходить через клеточную мембрану и локализоваться в цитоплазме популяции клеток-мишеней.
В последнее время были проведены исследования вирусных векторов на их способность к доставке РНК или ДНК. Однако, такое применение вирусных векторов связано с риском возникновения иммунологических реакций и с трудностями практического осуществления такой доставки. Были также исследованы различные не-вирусные векторы (например, липидные комплексы, катионные полимерные комплексы, липосомы, дендримеры, полимерные наночастицы). В этих исследованиях специалисты столкнулись с рядом проблем, включая трудности, связанные с применением киРНК, а именно, взаимодействия между киРНК и вектором, и чувствительность киРНК к разложению in vivo. В частности, были разработаны различные системы адсорбции ДНК или РНК на поверхности наночастиц. Однако, недостатками таких систем является то, что адсорбированная биомолекула подвергается ферментативной атаке еще до ее доставки на участок действия, что тем самым снижает эффективность лечения.
Хотя вышеописанное обсуждение относится, главным образом, к киРНК и ДНК, однако, обсуждаемые здесь проблемы не ограничиваются только применением киРНК и ДНК. Они могут относиться к биомолекулам широкого ряда, включая, например, пептиды, белки и т.п., которые могли бы быть доставлены вовнутрь клеток. Таким образом, решение указанных проблем может открыть более широкие перспективы. Поэтому, применение настоящего изобретения не должно ограничиваться только киРНК.
Настоящее изобретение позволяет, в основном, успешно решить обсуждаемые проблемы или устранить по меньшей мере один или несколько из вышуказанных недостатков, что, по меньшей мере частично, удовлетворяет описанным выше требованиям.
Описание сущности изобретения
В соответствии с одним из своих аспектов, настоящее изобретение относится к состоящему из частиц веществу, содержащему:
частицы керамической матрицы, несущей функциональную группу, способную стимулировать проникновение частиц в клетки; и
биомолекулу, находящуюся в порах частиц, где указанная биомолекула может высвобождаться из частиц при растворении керамической матрицы.
Используемый здесь термин «биомолекула, находящаяся в порах частиц» входит в объем настоящего изобретения и означает, что керамическая матрица, которая эффективно образует твердые пористые частицы, содержит биомолекулы, диспергированные по всей керамической матрице или находящиеся в порах такой матрицы. При этом не рассматриваются случаи, в которых биомолекула присоединена к внешней поверхности частиц или связана с этой поверхностью.
Вообще говоря, в других возможных относительно экстремальных условиях, биомолекула, в основном, не высвобождается из частиц посредством выщелачивания, в случае, если не происходит растворение керамической матрицы. В этой связи, используемый здесь термин «биомолекула, которая, по существу, не высвобождается посредством выщелачивания в отсутствие растворения» входит в понятие термина «выщелачивание» в предполагаемых условиях хранения и применения вещества, состоящего из частиц. При этом, предпочтительно, чтобы функциональная группа взаимодействовала с биомолекулой и, по существу, предотвращала такое выщелачивание.
Предпочтительно, чтобы функциональная группа была равномерно распределена по всем частицам.
В соответствии с одним из вариантов изобретения, керамическая матрица, несущая функциональную группу, включает матрицу, имеющую функциональную группу двуокиси кремния. Однако, могут быть использованы различные оксиды металлов, включая смешанные оксиды металлов, например, оксид титана, оксид алюминия, двуокись циркония, оксид железа, оксид церия, оксид цинка и т.п. Функциональная группа может быть введена посредством титаноорганического или алюмоорганического соединения или силанорганического соединения, которое конденсируется с соединением-предшественником других металлов, образующих титан-кремнийорганическое соединение или алюмо-кремний-органическое соединение. Другие варианты осуществления изобретения будут очевидны из обсуждения получения указанных частиц, приведенного ниже.
Функциональная группа керамической матрицы может содержать любую группу, которая эффективно стимулирует проникновение частиц в клетки. Так, например, такая группа может включать аминогруппу. В предпочтительном варианте изобретения, функциональная группа включает аминоалкиламиногруппу, первичную алкиламиногруппу, вторичную алкиламиногруппу, третичную алкиламиногруппу, алкилимидазольную группу, алкиламидную группу или алкиламинокислотную группу. Другие варианты осуществления изобретения будут очевидны из обсуждения получения указанных частиц, приведенного ниже.
Настоящее изобретение относится к состоящему из частиц веществу, содержащему биомолекулу. В этом контексте, термин «биомолекула» может означать вещество, имеющее биологическое происхождение или биологическую природу и обладающее биологической активностью. В объем этого термина входит вещество, содержащее одну или несколько молекул, включая смесь различных молекул. Такой биомолекулой может быть макромолекула. Макромолекула может иметь молекулярную массу приблизительно от 1 до 1000 кДа или более, или приблизительно 1-100, 1-50, 1-20, 1-10, 5-1000, 10-1000, 100-1000, 500-1000, 5-100, 5-50, 5-20 или 10 - 20 кДа, например, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 кДа. В некоторых случаях, такая макромолекула может иметь молекулярную массу менее чем 1 кДа или более чем 1000 кДа. Она может иметь диаметр приблизительно 0,5-20 нм, или приблизительно 1-20, 2-20, 5-20, 10-20, 0,5-10, 0,5-5, 0,5-2, 0,5-1, 1-10, 2-10, 1-5, 5-10 или 10-20 нм, например, приблизительно 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или 20 нм.
Выбор биомолекулы может зависеть от конкретного применения. Для сохранения биомолекулы в частицах и/или на частицах, ей может быть сообщен отрицательный заряд. Это позволяет биомолекуле связываться с функциональной группой на керамической матрице, например, с протонированными аминогруппами в керамической матрице с функциональной аминогруппой. Альтернативно или дополнительно, биомолекула может иметь другую функциональную группу, которая позволяет ей связываться с функциональными группами керамической матрицы. Альтернативно или дополнительно, биомолекула может быть достаточно крупной (то есть, она может иметь достаточно большую молекулярную массу или достаточно большой молекулярный объем), в результате чего она может физически захватываться частицами. При этом она может иметь достаточно большой размер, в результате чего она будет неспособна проходить через поры частиц.
В некоторых вариантах изобретения, такой биомолекулой может быть нуклеиновая кислота, такая как РНК, например, киРНК (короткая интерферирующая РНК), миРНК (микроРНК), или рибозим, ASODN (антисмысловой нуклеотид или антисмысловая РНК), молекула ДНК, аптамер, белок, включая полипептиды, пептиды, гликопротеины, липопротеины, иммуноглобулины (например, антитела и фрагменты антител), углевод, липид или смесь или аддукт любой из двух или более перечисленных здесь молекул. В одном конкретном варианте изобретения, такой биомолекулой является киРНК. Эта биомолекула может быть использована для профилактики или лечения заболевания, расстройства или патологического состояния.
В некоторых вариантах изобретения, предпочтительно, чтобы агент для обработки поверхности связывался с поверхностью частиц. В предпочтительном варианте изобретения, полиэтиленгликолевые (ПЭГ) цепи связываются с поверхностью частиц. Альтернативно или дополнительно, нацеливающая группа может быть связана с поверхностью частиц для облегчения нацеливания частиц на используемую мишень, например, на опухоль, на конкретный орган или на другую мишень. В некоторых вариантах изобретения, ПЭГ-цепи, имеющие нацеливающие группы на своих дистальных концах, могут быть связаны с частицами.
В некоторых вариантах изобретения, может оказаться предпочтительным, чтобы частицы состоящего из частиц вещества имели средний размер приблизительно 0,1-1 микрон. Однако, они могут иметь средний размер приблизительно 0,1-10 микрон, или приблизительно 0,1-5, 0,1-2, 0,1-1, 0,1-0,5, 0,2-10, 0,5-10, 1-10, 2-10, 5-10, 0,2-2, 0,2-1, 0,2-0,5, 0,5-2 или 0,5-1 микрон, например, приблизительно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 микрон.
В некоторых вариантах изобретения, может оказаться предпочтительным, чтобы средний размер частиц составлял менее чем приблизительно 0,1 микрон. Так, например, он может составлять приблизительно 20-100 нм (0,1 микрон), или приблизительно 20-50 нм, или приблизительно 50-100 нм, например, приблизительно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90 нм.
Следует отметить, что частицы, имеющие размер приблизительно выше 1-2 микрон, могут оказаться неподходящими для внутриклеточной доставки. Однако, следует принять во внимание, что они могут быть использованы для доставки более крупных белков в какой-либо участок организма. В соответствии с этим, частицы размером до нескольких микрон могут быть интернализованы, в частности, специализированными фагоцитарными клетками.
Частицы могут быть, в основном, монодисперсными либо они могут быть до некоторой степени агрегированными и иметь второй максимум на кривой распределения частиц по размерам. Кривая может иметь нормальное распределение, гауссово распределение или какое-либо другое распределение частиц. Частицы могут иметь широкое, среднее или узкое распределение по размерам. Частицы могут иметь сферическую или почти сферическую форму, либо они могут иметь яйцевидную форму, форму сжатого сфероида или форму многогранника (имеющего, например, от 8 и приблизительно до 60 сторон), либо они могут иметь какую-либо другую форму. Эти частицы могут иметь неправильную форму.
Частицы могут иметь средний размер пор (то есть, размер пор <100 нм). Они могут быть микропористыми (то есть, иметь размер пор <1,7 нм). При этом предпочтительно, чтобы средний размер пор частиц составлял приблизительно 1-50 нм. Так, например, средний размер пор может составлять приблизительно 1-20, 1-10, 5-50, 10-50, 20-50, 5-20, 5-10 или 10-20 нм, например, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 нм.
По своей структуре, поры могут быть связаны друг с другом либо они могут иметь пустоты, соединенные друг с другом относительно небольшими связывающими каналами. Размер пор может быть достаточно малым, настолько, чтобы он, в основном, предотвращал высвобождение биомолекулы из пор посредством диффузии. Альтернативно, если размер пор позволяет биомолекуле высвобождаться из поры, то такая биомолекула может удерживаться путем ее притяжения функциональными группами, присутствующими на поверхности пор. Функциональные группы могут быть идентичны группам, которые стимулируют проникновение частиц в клетки, либо они могут отличаться от этих групп.
Нагрузка биомолекул в частицах может составлять приблизительно 1-20% масс., например, приблизительно 1-10, 1-5, 1-2, 2-20, 5-20, 10-20, 2-10, 2-5 или 5-10%, например, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20%, хотя, в некоторых случаях, такая нагрузка может составлять менее чем 1% или более чем 20%.
Используемая биомолекула преимущественно высвобождается при растворении частиц в условиях, которые, в основном, не способствуют разложению биомолекулы. Так, например, такая биомолекула может высвобождаться при растворении частиц в биологической среде, которая, в основном, не способствует разложению биомолекулы. Альтернативно, такая биомолекула может высвобождаться при ее разведении в жидкости, способствующей высвобождению.
Вообще говоря, биомолекула может высвобождаться (например, в основном, полностью высвобождаться) за период времени приблизительно от 0,5 до 50 часов. Так, например, такой период времени может составлять приблизительно 0,5-20, 0,5-10, 0,5-5, 0,5-2, 1-50, 5-50, 10-50, 1-20, 1-10, 2-10 или 5-10 часов, например, приблизительно 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 часов. Поскольку скорость растворения может зависеть от размера частиц, то такая скорость может быть скорректирована путем регуляции размера частиц, как обсуждается в нижеследующем описании.
Наиболее предпочтительно, чтобы биомолекула была защищена от разложения до ее высвобождения из частиц в том случае, если такие частицы подвергаются воздействию разлагающего агента, например фермента, который может разлагать биомолекулу, если она незащищена. То есть, биомолекулу защищают от разложения с использованием керамической матрицы.
В некоторых вариантах изобретения рассматривается полимер или комплекс-образующий агент, который может находиться в порах частиц вместе с биомолекулой, что облегчает их эндосомное высвобождение. Обычно, полимер может представлять собой полиэтиленамин, полилизин, полигистидин или любое вещество, обладающее эффектом протонной губки.
Образование микрочастиц (>100 нм)
В некоторых вариантах изобретения может оказаться предпочтительным, чтобы образующиеся частицы имели размер в микродиапазоне. То есть, в данном описании, средний размер частиц составляет более чем 100 нм.
В соответствии с другим своим аспектом, настоящее изобретение относится к способу получения частиц, содержащих биомолекулу, диспергированную в порах этих частиц, где указанный способ включает:
a) объединение:
гидрофобной фазы, содержащей гидрофобную жидкость, первый керамический предшественник и поверхностно-активное вещество; и
гидрофильной фазы, содержащей гидрофильную жидкость, второй керамический предшественник и биомолекулу;
с образованием эмульсии, содержащей капельки гидрофильной фазы, диспергированной в гидрофобной фазе; и
b) перемешивание эмульсии по мере формирования частиц внутри капелек;
где первый керамический предшественник содержит функциональную группу, способную стимулировать проникновение частиц в клетки.
Используемый здесь термин «перемешивание» охватывает любой способ перемешивания, включая, но не ограничиваясь ими, размешивание, встряхивание, вихревое перемешивание, обработку ультразвуком, фрагментирование и т.п., и любую их комбинацию.
При изготовлении частиц, эмульсия образуется при объединении гидрофобной фазы с гидрофильной фазой. Такая эмульсия может представлять собой эмульсию типа «вода в масле» (w/o), в которой гидрофобная фаза представляет собой непрерывную фазу, а гидрофильная фаза представляет собой дисперсную или дискретную фазу.
Гидрофобной фазой может быть олеофильная фаза или липофильная фаза. Гидрофобная фаза может быть получена путем объединения поверхностно-активного вещества с гидрофобной жидкостью и добавления первого керамического предшественника с образованием гидрофобной фазы, либо она может быть получена путем объединения всех трех компонентов, либо она может быть получена путем объединения первого керамического предшественника с гидрофобной жидкостью или с поверхностно-активным веществом с последующим добавлением другого компонента. Эти стадии, предпочтительно, проводят перед объединением гидрофобной и гидрофильной фаз. Каждая стадия объединения может включать перемешивание компонентов, которые были предварительно объединены. Такое перемешивание может включать размешивание, встряхивание, вихревое перемешивание, обработку ультразвуком или их комбинацию. Такое перемешивание компонентов может быть достаточным для образования раствора. Таким образом, гидрофобная фаза может представлять собой раствор первого керамического предшественника и поверхностно-активного вещества в гидрофобной жидкости.
Гидрофобная фаза содержит 3 компонента:
Гидрофобную жидкость, которая может представлять собой, например, растительное масло, вазелиновое масло, минеральное масло или какую-либо другую подходящую гидрофобную жидкость. Гидрофобная жидкость может содержать смесь гидрофобных компонентов, например, смесь растительных масел или смесь растительного масла и вазелинового масла. Такая жидкость имеет, в основном, умеренную вязкость, например, приблизительно 0,5 - приблизительно 1500 мПа·с, или приблизительно 0,5-1000, 0,5-500, 0,5-250, 0,5-100, 0,5-50, 0,5-20, 0,5-0, 0,5-5, 0,5-1, 1-500, 10-1500, 100-1500, 250-1500, 500-1500, 1000-1500, 10-1000, 10-200, 200-1000 или 200-500 мПа·с, например, приблизительно 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 или 1500 мПа·с, или, в· некоторых случаях, более чем 1500 мПа·с. Вязкость гидрофобной жидкости может быть использована для регуляции размера частиц, полученных этим способом. Таким образом, более вязкая гидрофобная жидкость, в основном, создает более вязкую гидрофобную фазу, что, в свою очередь, обычно приводит к уменьшению размера частиц.
Поверхностно-активное вещество, которое может представлять собой подходящее поверхностно-активное вещество для сохранения эмульсии «вода в масле». Такое поверхностно-активное вещество может растворяться в гидрофобной жидкости или смешиваться с этой жидкостью. Таким поверхностно-активным веществом может быть неионное поверхностно-активное вещество или анионное поверхностно-активное вещество, либо цвиттерионное поверхностно-активное вещество. Такое поверхностно-активное вещество может иметь ГЛБ, составляющий приблизительно от 8 до 16, или приблизительно 8-12, 10-16 или 8-10, например, приблизительно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16. Подходящими поверхностно-активными веществами являются Span® 20 (монолаурат сорбитана), Aerosol® OT (бис(2-этилгексил)сульфосукцинат натрия), смеси Span® 20/Tween® 80 и смеси Span® 20/Brij® 35. При использовании смешанных поверхностно-активных веществ обычно получают в высокой степени тонкодисперсную эмульсию, но конечный размер частиц обычно остается неизменным.
Первый керамический предшественник, который представляет собой компонент, включающий функциональную группу, способную стимулировать проникновение полученных частиц в клетки. В некоторых вариантах изобретения, функциональная группа первого керамического предшественника обладает способностью химически взаимодействовать, например электростатически взаимодействовать с биомолекулой.
Этот компонент может иметь, например, функциональную аминогруппу. Альтернативно, могут быть использованы и другие положительно заряженные группы или группы, которые могут сообщать положительный заряд. Может быть использовано соединение, имеющее по меньшей мере одну аминогруппу на молекулу и способное превращаться в керамическую матрицу, имеющую функциональную аминогруппу. Это соединение может растворяться в гидрофобной жидкости или в смеси (необязательно в растворе) поверхностно-активного вещества в гидрофобной жидкости.
Подходящими керамическими предшественниками являются силаны, имеющие функциональную амингруппу, в частности алкоксисиланы, имеющие функциональную аминогруппу. Алкоксигруппами таких силанов могут быть, например, C1-C6-алкоксигруппы (которые могут быть разветвленными, если они имеют 3 атома углерода или более), а обычно C1-C4-алкоксигруппы например метокси-, этокси-, пропокси-, изопропокси- или бутоксигруппы. В некоторых случаях могут быть использованы и другие гидролизуемые группы, например ацетокси, кетоксимо, энолокси и т.п. Керамический предшественник с функциональной аминогруппой может иметь более чем одну аминогруппу на молекулу, например, 2, 3, 4 или 5 аминогрупп на молекулу. Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что керамические предшественники, имеющие диамино- и триаминогруппу, обычно образуют частицы, которые более эффективно связываются с подходящими биомолекулами, чем соответствующие керамические предшественники, имеющие моно-аминогруппу. Каждая аминогруппа независимо может представлять собой первичную, вторичную или третичную аминогруппу. В предпочтительных предшественниках, аминогруппы разделены линкерными группами, обычно короткими алкиленовыми цепями, такими как этиленовая (-CH2CH2-), пропиленовая (-CH2CH2CH2-) или бутиленовая (-CH2CH2CH2CH2-) цепи. Авторы настоящего изобретения считают, что бутиленовая группа является особенно предпочтительной, поскольку она присутствует в природных полиамин-полинуклеотидных лигандах, таких как путресцин (N-4-N), спермидин (N-3-N-4-N) и спермин (N-3-N-4-N-3-N). При этом могут быть использованы различные комбинации, включающие пентилен и гексилен, однако группы, которые очень отличаются друг от друга по своей биогенной конфигурации, могут быть токсичными. В частности, авторы настоящего изобретения считают, что этиленовые спейсеры создают некоторое расстояние между аминогруппами, которые находятся достаточно близко от зарядов в киРНК и присутствуют в коммерчески доступных продуктах, что делает этот спейсер подходящим для применения в случае, если биомолекулой является киРНК. Такими подходящими предшественниками являются 3-(2-аминоэтиламино)пропилтриметоксисилан, 3-[2-(2-аминоэтиламино)этиламино]пропилтриметоксисилан, 3-(2- аминоэтиламино)пропилтриэтоксисилан или 3-[2-(2- аминоэтиламино)этиламино]пропилтриэтоксисилан и смеси любых двух или более таких соединений. Другими соединениями, которые могут быть использованы в качестве первого керамического предшественника, являются: триалкоксисилан, содержащий пропилкарбамид; алкоксисиланы с функциональным изоцианатом; алкоксисиланы с функциональной карбоксильной группой; алкоксисиланы с функциональной меркаптогруппой (например, меркаптопропилтриалкоксисиланы), катионные пептиды или углеводы или липиды, присоединенные к алкоксисиланам и т.п. Могут быть также использованы смеси любых двух или более этих предшественников или любых других подходящих первых керамических предшественников.
В некоторых случаях, первым керамическим предшественником может быть смесь. Таким предшественником может быть смесь силановых керамических предшественников. Указанные предшественники могут дополнительно содержать один или более не-силановых керамических предшественников, например предшественник на основе двуокиси циркония, предшественник на основе оксида алюминия или предшественник на основе оксида титана. Такими предшественниками могут быть, например, алкоксиды циркония, алкоксиды алюминия и алкоксиды титана соответственно.
Обычно отношение поверхностно-активного вещества к гидрофобной жидкости составляет приблизительно 5-25% масс./об. (то есть, приблизительно от 5 до 25 г поверхностно-активного вещества на 100 мл гидрофобной жидкости) или приблизительно 5-20, 5-15, 10-25, 15-25 или 10-20%, например приблизительно 5, 10, 15, 20 или 25%.
Обычно отношение первого керамического предшественника к гидрофобной жидкости составляет приблизительно 10-1000 м.д. по объему, или приблизительно 10-500, 10-200, 10-100, 10-50, 20-1000, 50-1000, 100-1000, 200-1000, 500-1000, 20-500, 50-500, 50-200, 200-500 или 50-200 м.д., например, приблизительно 10, 20, 304, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 м.д.
Гидрофильной фазой может быть липофобная фаза. Такой фазой может быть водная фаза. Гидрофильная фаза содержит три компонента:
Гидрофильную жидкость, которая может быть липофобной. Такая жидкость обычно содержит воду, например, она может представлять собой воду, включая чистую воду, или водный раствор. Такая жидкость может также содержать растворенные соли.
Второй керамический предшественник, который может представлять собой водорастворимый силикат, в частности метасиликат. Такой предшественник сам по себе может быть силикатом (например, образующимся в результате гидролиза тетраалкилсиликата, такого как тетраметилортосиликат или тетраэтилортосиликат) либо он может представлять собой молекулу формулы RSi(OR')xOHySiz, где x+y+z=3 (называемую здесь алкилсиликатом, полученным, например, путем гидролиза алкилтриалкоксисилана, например, метилтриметоксисилана или этилтриметоксисилана). В случае алкилсиликата, алкильная группа R должна быть достаточно небольшой или в достаточной степени гидрофильной, то есть, чтобы она сообщала второму керамическому предшественнику растворимость в воде. Следует отметить, что это может быть достигнуто, например, путем введения небольших групп R, таких как метил или этил, или более крупных групп R, имеющих гидрофильные или полярные заместители, такие как гидроксил, нитро, сульфат и т.п.
Вторым керамическим предшественником может быть, например, жидкое стекло. Жидкое стекло представляет собой олигомерное или полимерное силикатное вещество, имеющее эмпирическую формулу приблизительно Na2SiO3 и способное подвергаться гидратации в различной степени, обычно в водном растворе. Жидкое стекло может иметь содержание твердых веществ приблизительно 1-20% или приблизительно 1-10, 1-5, 1-2, 2-20, 5-20, 10-20, 2-10, 2-5 или 5-10%, например, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20%. Такое жидкое стекло может иметь приблизительно 25-30% двуокиси кремния и приблизительно 1 - приблизительно 20% гидроксида натрия в воде. Оно может быть разведено в воде в отношении приблизительно 1:2 - приблизительно 1:10, или приблизительно 1:2-1:5, 1:5-1:10 или 1:3-1:8, например, приблизительно 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 или 1:10.
Вторым керамическим предшественником может быть также алкоксид титана (например, этоксид, н-пропоксид и изопропоксид, н-бутоксид, втор-бутоксид и трет-бутоксид), или алкоксид алюминия, или алкоксид циркония, или модифицированный алкоксид металла (например, модифицированный ацетилацетоном или уксусной кислотой). Этот предшественник может также представлять собой смешанный алкоксид металла. Он может также представлять собой соль другого металла, такую как соль магния, соль циркония или соль алюминия, которые образуют силикат магния, алюмо-силикат и т.п. Он может также представлять собой предварительно гидролизованный алкоксид кремния.
Второй керамический предшественник может содержать керамический коллоид, например коллоидную двуокись кремния. Керамический коллоид может иметь частицы диаметром менее 50 нм или приблизительно менее 40, 30, 20 или 10 нм, или приблизительно 5-50 нм, или приблизительно 5-20, 5-10, 10-50, 20-50 или 10-20 нм. Такой керамический коллоид может иметь диаметр частиц (обычно средний диаметр частиц, и, необязательно, максимальный диаметр частиц), составляющий приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 нм.
В некоторых случаях, второй керамический предшественник может содержать комбинацию из двух или более вышеуказанных вариантов, например он может содержать смесь водного раствора силиката и коллоидной двуокиси кремния.
Биомолекула представляет собой различные варианты биомолекул, описанных выше. Как указывалось выше, такая биомолекула может быть отрицательно заряженной, либо она может быть нейтральной. Такая биомолекула может иметь отрицательный заряд, достаточный для ее присоединения к функциональной группе частиц и, необязательно, для ее связывания с такой функциональной группой (происходящей от первого керамического предшественника). Указанная биомолекула может представлять собой или содержать РНК, например, киРНК (короткую интерферирующую РНК), миРНК (микроРНК), ASODN (антисмысловой нуклеотид или антисмысловую РНК), аптамер, ДНК, белок, гликопротеин, полипептид, углевод или смесь или аддукт любой из двух или более из перечисленных здесь молекул.
Кроме того, полимер или комплекс-образующий агент могут быть добавлены так, чтобы они осаждались в порах частиц вместе с биомолекулой для облегчения ее эндосомного высвобождения. Обычно, полимер может представлять собой полиэтиленамин, полилизин, полигистидин или любое вещество, обладающее эффектом протонной губки.
Гидрофильная фаза может быть кислотной. Она может иметь рН ниже pKa первого керамического предшественника (или его кислоты, если таким керамическим предшественником является основание, например, керамический предшественник с функциональной аминогруппой). Гидрофильная фаза может иметь рН менее чем приблизительно 10,5, или менее чем приблизительно 10, 9, 8, 7, 6, 5,5, 5, 4,5 или 4, или в пределах приблизительно 3-10,5, 5-10,5, 7-10,5, 9-10,5, 7-10, 9-4, 7-4, 9-7, 5-7, 3-6 или приблизительно 3-5, 3-4, 4-6, 4-5 или 3,5-4,5, например, приблизительно 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5 или 6.
Обычно при получении гидрофильной фазы, гидрофильную жидкость и второй керамический предшественник объединяют, причем второй керамический предшественник растворяют, но необязательно, в гидрофильной жидкости. Такой способ может включать последующее доведение pH первого керамического предшественника до значения ниже pKa, например, до pH менее чем приблизительно 10,5, или до кислотного pH, например, до pH менее чем приблизительно 7, или менее чем приблизительно 5, или менее чем приблизительно 4, и добавление биомолекулы с образованием гидрофильной фазы. Так, например, если вторым керамическим предшественником является жидкое стекло или коллоидная двуокись кремния, то в этом случае обычно образуется основный раствор. Поэтому, такой способ может включать подкисление указанного раствора.
Обычно подкисление осуществляют путем обработки раствора катионообменной смолой, где указанная смола, перед такой обработкой, присутствует в кислотной (протонированной) форме. Обработка может включать объединение смолы и раствора, размешивание, но необязательно, полученной смеси, а затем отделение смолы от подкисленного раствора (например, путем фильтрации, декантирования, центрифугирования и т.п.) либо она может включать пропускание раствора через слой смолы. Отношение смолы ко второму керамическому предшественнику может быть скорректировано так, чтобы достигался нужный рН (как описано выше). Альтернативно, второй керамический предшественник может быть подкислен путем добавления подкисляющего агента (например, кислоты) или подходящего буфера.
Обычно биомолекулу добавляют к подкисленному раствору непосредственно перед объединением гидрофильной фазы и гидрофобной фазы. Такая биомолекула может быть добавлена непосредственно перед объединением этих фаз. Она может быть добавлена приблизительно менее чем за 2 минуты до объединения фаз, или приблизительно менее чем за 1 минуту, или приблизительно менее чем за 50, 40, 30, 20, 15 или 10 секунд, например, приблизительно за 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 или 120 секунд до объединения фаз. Это снижает вероятность вступления биомолекулы в нежелательные химические реакции. Биомолекула может присутствовать в гидрофильной фазе в количестве, достаточном для достижения ее желательной загрузки в конечные частицы. Типичная концентрация биомолекулы в гидрофильной фазе составляет приблизительно 1-10 мг/мл, или приблизительно 1-5, 5-10 или 2-8, например, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мг/мл. Биомолекула может быть добавлена к объединенной гидрофильной жидкости/второму керамическому предшественнику в форме раствора. Растворитель для этого раствора должен смешиваться с гидрофильной жидкостью и, в основном, он должен быть таким же, как гидрофильная жидкость. Биомолекула может быть добавлена в виде водного раствора.
При получении эмульсии, гидрофобную и гидрофильную фазы объединяют при перемешивании, но необязательно. Перемешивание может включать одну или несколько процедур смешивания, встряхивания, вихревого перемешивания и обработки ультразвуком. Эффективным способом приготовления эмульсии является получение гидрофобной фазы, описанной выше, и одновременное перемешивание и обработка ультразвуком при добавлении гидрофильной фазы. Затем получают гидрофильную фазу путем объединения биомолекулы со вторым керамическим предшественником, объединенным с гидрофильной жидкостью (например, с подкисленным водным раствором жидкого стекла), а затем полученную гидрофильную фазу добавляют, как можно быстрее, к обработанной ультразвуком и к перемешанной гидрофобной фазе, продолжая обработку ультразвуком. Обработка ультразвуком может быть продолжена в течение непродолжительного периода времени после добавления, например, приблизительно в течение 10-120 секунд, или приблизительно 10-60, 10-30, 20-120, 60-120, 20-60 или 20-40 секунд, например, приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 90 или 120 секунд. Обработку ультразвуком обычно прекращают через соответствующий период времени в целях предотвращения перегревания эмульсии. Такое перегревание может, например, негативно влиять на биомолекулу. Обработка ультразвуком может быть осуществлена при мощности приблизительно 200-2000 Вт, или приблизительно 200-1000, 200-500, 500-2000, 1000-2000, 500-1000 или 600-800 Вт, например, приблизительно 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 или 2000 Вт.
Отношение гидрофобной фазы к гидрофильной фазе может составлять приблизительно 10-50 (то есть, приблизительно 10:1-50:1) или приблизительно 10-40, 10-30, 10-20, 20-50, 30-50, 40-50, 20-40 или 25-25, например, приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50.
При этом может оказаться достаточным, чтобы молярное отношение первого керамического предшественника ко второму керамическому предшественнику составляло приблизительно 0,2-20 моль%, или приблизительно 0,5-20, 1-20, 2-20, 5-20, 10-20, 0,2-10, 0,2-5, 0,2-2, 0,2-1, 1-10, 1-5 или 5-10, например, приблизительно 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 моль%. В случае, если первый керамический предшественник представляет собой или содержит силан с функциональной аминогруппой, то отношение первого керамического предшественника ко второму керамическому предшественнику может варьироваться в целях изменения заряда на частицах. Таким образом, если количество первого керамического предшественника является небольшим (например, приблизительно 1 моль% по отношению ко второму керамическому предшественнику), то такие частицы являются почти нейтральными, а при большем количестве (приблизительно 10 моль%), они являются положительно заряженными. Если силан с функциональной аминогруппой не добавляли (или добавляли в очень небольших количествах, например, приблизительно менее чем 0,5 моль%), то частицы могут быть отрицательно заряженными.
В эмульсии, полученной как описано выше, капельки гидрофильной фазы могут иметь средний диаметр приблизительно 0,1-10 микрон, или приблизительно 0,1-5, 0,1-2, 0,1-1, 0,1-0,5, 0,2-10, 0,5-10, 1-10, 2-10, 5-10, 0,2-2, 0,2-1 , 0,2-0,5, 0,5-2 или 0,5-1 микрон, например, приблизительно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 микрон. Средняя величина диаметра может быть среднечисленной или средневесовой величиной. Капельки могут быть, в основном, монодисперсными либо они могут быть в определенной степени агрегированы с образованием второго максимума на кривой распределения. Эти капельки могут иметь широкое гранулометрическое распределение либо среднее или узкое гранулометрическое распределение.
Следует отметить, что частицы, при взаимодействии первого и второго керамических предшественников, образуют капельки в своей внутренней части. Конденсация предшественников с образованием частиц обычно происходит очень быстро (за миллисекунды или секунды). Такое взаимодействие может представлять собой химическую реакцию. Оно может представлять собой реакцию конденсации. Такое взаимодействие может включать гидролиз первого керамического предшественника. Было замечено, что если первый керамический предшественник имеет функциональную аминогруппу и был добавлен непосредственно к гидрофильной фазе, то происходит быстрое гелеобразование, что не позволяет получить частицы нужного размера.
Объединенные гидрофильные и гидрофобные фазы могут быть перемешаны или смешаны каким-либо другим образом в течение периода времени, достаточного для образования частиц. Это может зависеть, по меньшей мере частично, от температуры реакции. Образование частиц может происходить при любой подходящей температуре, например, при комнатной температуре или приблизительно при 10-35°C или приблизительно 10-30, 10-25, 10-20, 15-35, 20-35, 25-35, 15-30, 15-20 или 20-25°C, например, приблизительно при 15, 20, 25, 30 или 35°C. Такое образование частиц может наблюдаться при температуре ниже температуры денатурации биомолекулы. Образование частиц может происходить приблизительно за 10-120 минут, хотя объединенные фазы могут быть перемешаны или смешаны каким-либо другим образом в течение более длительного периода времени, чем это желательно. Подходящие периоды времени составляют приблизительно 10-100, 10-60, 10-30, 20-120, 30-120, 60-120, 30-90 или 45-75 минут, например, приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115 или 120 минут.
После образования частиц, к их поверхности может быть присоединена функциональная группа. Это может быть осуществлено in situ, то есть, без разделения или выделения частиц. Такое присоединение может включать добавление агента для обработки поверхности к эмульсии после образования частиц в целях обработки поверхности таких частиц. Присоединение функциональной группы к поверхности может быть осуществлено посредством ПЭГилирования (то есть, присоединения полиэтиленгликолевых цепей к поверхности). Агент для обработки поверхности может включать полиэтиленгликолевую (ПЭГ) цепь, связанную со связывающей группой. ПЭГ-цепь может иметь молекулярную массу приблизительно 1-20 кДа, или приблизительно 1-10, 1-5, 1-2, 2-20, 5-20, 10-20, 2-10, 2-5 или 5-10 кДа, например, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 кДа. Связывающей группой может быть триалкоксисилан, то есть, агентом для обработки поверхности может быть триалкоксисилил-ПЭГ. Подходящими алкоксигруппами являются метокси, этокси или пропокси. Могут быть также использованы и другие гидролизуемые силильные группы, например, триацетокси, триоксимо, триенолокси, триамидо и т.п. На поверхность частиц может быть присоединена функциональная группа посредством реакции взаимодействия поверхности с ПЭГ (или с другой подходящей молекулой), имеющим функциональную группу, которая реагирует либо с OH, находящейся на поверхности, либо с аминогруппами, находящимися внутри частиц или на поверхности частиц. Так, например, для образования амида поверхностных аминогрупп на частицах может быть использован агент для обработки поверхности, такой как ПЭГ с функциональной карбоксильной группой, либо поверхностные аминогруппы могут быть активированы (например, путем образования сукцинимидильных групп или изотиоцианатных групп), а затем подвергнуты реакции взаимодействия с агентами для обработки поверхностей, такими как ПЭГ с функциональной аминогруппой.
ПЭГ-группы, в основном, являются крупными молекулами (обычно >1 кДа), а поэтому они не проникают вовнутрь сферы, а присоединяются, главным образом, к поверхности частиц. Существует ряд коммерчески доступных ПЭГ с функциональными группами, которые являются подходящими для такого присоединения к поверхности частиц, например, ПЭГ, модифицированный изоцианатом и ПЭГ, модифицированный карбоксигруппой, которые могут продуцировать амидные связи при их взаимодействии в аминами на поверхности частиц.
Последующее присоединение функциональных групп к поверхности частиц, например, ПЭГилирование, осуществляемое в целях такого присоединения, может быть проведено на ограниченном, но адекватном уровне, в основных условиях. В основных условиях, первый керамический предшественник (например, аминосилан, такой как аминоэтиламинопропилтриэтоксисилан), может быть, в некоторых случаях, непосредственно добавлен ко второму керамическому предшественнику (например, к жидкому стеклу или к коллоидной двуокиси кремния). В некоторых случаях, pH гидрофильной фазы является не ниже pKa первого керамического предшественника. В таких случаях, предварительно обработанная суспензия частиц (приготовленная в основных условиях) может быть затем подкислена. Такое подкисление может стимулировать присоединение биомолекулы к частицам в том случае, если эта биомолекула является отрицательно заряженной. Если поверхность частиц подвергают последующей обработке, то подкисление может быть осуществлено до или во время последующей обработки поверхности для облегчения присоединения ПЭГ-силана. Если на частицах отсутствуют положительные заряды, то высвобождение биомолекулы может происходить очень быстро (порядка нескольких минут), при условии, что она не будет иметь достаточно большой размер, который будет препятствовать ее высвобождению через поры частиц.
В некоторых случаях, агент для обработки поверхности может включать нацеливающую группу для доставки к мишени у пациента. Так, например, агент для обработки поверхности может включать триалкоксисилил-ПЭГ, имеющий нацеливающую группу у дистального конца ПЭГ, то есть, он может иметь структуру «триалкоксисилил-ПЭГ-нацеливающая группа». Мишенью может быть, например, опухоль или конкретный орган, или какая-либо другая мишень. Нацеливающей группой может быть, например, антитело или фрагмент антитела (например, Fab). Примерами подходящих нацеливающих групп являются антитела; пептидные цитокины; пептидные гормоны; белки матрикса; рецепторы клеточной поверхности; белки, участвующие в клеточной адгезии; белки, участвующие в распознавании клеток; белки, сообщающие клеткам подвижность; белки, участвующие в рекрутинге клеток; белки, участвующие в дифференцировке клеток; белки, участвующие в распознавании заболевания; биологически активные углеводы, такие как гепарин и родственные ему вещества; биологически активные гликопротеины, включая, но не ограничиваясь ими, гликопротеины, принадлежащие к перечисленным выше классам; лиганды любого члена вышеуказанных классов; фрагменты любого члена вышеуказанных классов; гомологи любого члена вышеуказанных классов; низкомолекулярные вещества, обладающие такой же аффинностью или функцией, как и любой член вышеуказанных классов; другие низкомолекулярные биомолекулы, такие как гормоны, микроэлементы, лекарственные средства, токсины, нейромедиаторы, медиаторы эндокринной, аутокринной и паракринной системы, пигменты, липиды, масла, лиганды ионов, метаболиты, катаболиты и т.п.
Агент для обработки поверхности может быть непосредственно добавлен к суспензии частиц в гидрофобной фазе. Реакция может быть осуществлена при температуре, близкой к температуре окружающей среды, например, путем перемешивания в течение периода времени, достаточного для прохождения реакции. Подходящий период времени составляет приблизительно от 8 до 24 часов, или приблизительно 8-16, 8-12, 12-24, 18-24 или 12-18 часов, например, приблизительно 8, 12, 16, 20 или 24 часа. Для достижения достаточного уровня функционализации поверхности может быть использован агент для обработки поверхности в количестве, достаточном для предотвращения избыточной агрегации частиц, или в количестве, достаточном для обеспечения приемлемого нацеливания частиц на мишень при их использовании.
После образования частиц, их обычно сушат не полностью. Это позволяет ингибировать агрегацию частиц, но, если она все же происходит, может потребоваться ресуспендирование, которое, в некоторых случаях, представляет определенные трудности. Обычно частицы отделяют от раствора путем центрифугирования. Подходящими условиями являются условия центрифугирования приблизительно при 10000-50000 об/мин, или приблизительно 10000-30000, 30000-50000 или 20000-30000 об/мин, например, приблизительно 10000, 20000, 30000, 40000 или 50000 об/мин. Подходящее разделение обычно достигается приблизительно за 5-15 минут, но иногда центрифугирование может быть проведено в течение более длительного периода времени.
Полученные частицы могут быть подвергнуты промывке для удаления примесей. Способ промывки может включать ресуспендирование частиц в растворителе, по меньшей мере частичное отделение частиц от растворителя (например, путем осаждения и/или центрифугирования) и декантирование растворителя из частиц. Важно отметить, что растворитель не должен денатурировать биомолекулу. Этот растворитель может быть специфичным к конкретно используемой биомолекуле. Так, например, этанол не влияет на структуру ДНК или РНК, но может денатурировать большинство высокомолекулярных белков. Подходящими растворителями для промывки являются углеводороды, такие как гексан, циклогексан, толуол и т.п., а также спирты, такие как этанол или изопропанол. Частицы могут быть подвергнуты многократной промывке (например, 2, 3, 4, 5 или более раз) либо одним и тем же растворителем, либо различными растворителями.
Полученные частицы могут быть ресуспендированы в подходящем растворителе и могут храниться в этом растворителе в качестве суспензии до их применения. В случае доставки частиц пациенту, этот растворитель может быть клинически приемлемым. Подходящим растворителем для хранения является этанол. Обычно частицы хранят при температуре приблизительно от -210 до +10°C, или приблизительно от -210 до 0, от -90 до 0, от -210 до -100, от -210 до -65, от -90 до -30, от -30 до 0, от -30 до -10, от -20 до +10, от -10 до +10, от 0 до 10 или от 0 до 5°C, например, приблизительно при -210, -200, -180, -160, -140, -120, -100, -90, -80, -70, -60, -50, -40, -30, -25, -20, -15, -10, -5, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10°C. Они могут храниться приблизительно при температуре жидкого азота. Эти частицы могут храниться при температуре сухого льда. Эти частицы могут храниться в холодильнике или в рефрижераторе.
В приведенном выше описании, относящемся к этанолу, этот этанол может содержать приблизительно до 30% воды. Так, например, таким этанолом может быть приблизительно 70-100% этанол, либо приблизительно 80-100, 90-100, 70-90 или 80-90%, например, приблизительно 70, 80, 90 или 100% этанол, где остальную часть составляет вода. Этанол может быть также заменен изопропанолом, н-пропанолом или н-бутанолом, с аналогичным ограниченным содержанием воды. Преимущество использования этанола или пропанола заключается в том, что они создают стерильные условия для частиц, доставляемых пациенту, или для частиц, применяемых в других целях, при которых желательно обеспечивать стерильность. В некоторых случаях может быть использован метанол.
В способе, относящемся к биомолекуле, желательно, чтобы эффективность инкапсулирования (ЭИ) была высокой, поскольку биомолекула обычно является дорогостоящим материалом. ЭИ зависит от конкретно применяемого способа, например, от типа и количества первого керамического предшественника, от отношения количества биомолекулы к количеству используемых керамических предшественников и т.п. Обычно ЭИ в способе доставки составляет приблизительно более чем 40%, или приблизительно более чем 50, 60, 70 или 80%. ЭИ может, например, составлять приблизительно 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95%.
В своем конкретном варианте, настоящее изобретение относится к способу получения частиц, содержащих биомолекулу, где указанный способ включает:
a) объединение:
гидрофобной фазы, содержащей гидрофобную жидкость, триалкоксисилан с функциональной аминоалкиламиногруппой и поверхностно-активное вещество, имеющее ГЛБ приблизительно 8-16; и
гидрофильной фазы, содержащей воду, жидкое стекло приблизительно при рН 5, и биомолекулу;
с образованием эмульсии, содержащей капельки гидрофильной фазы, диспергированной в гидрофобной фазе; и
b) перемешивание эмульсии по мере формирования частиц внутри капелек.
В другом своем конкретном варианте, настоящее изобретение относится к способу получения частиц, содержащих биомолекулу, где указанный способ включает:
объединение поверхностно-активного вещества, имеющего ГЛБ приблизительно 8-16, с гидрофобной жидкостью, и добавление триалкоксисилана с функциональной аминоалкиламиногруппой с получением гидрофобной фазы;
объединение воды и жидкого стекла, доведение рН до значения приблизительно менее чем 5, и добавление биомолекулы с получением гидрофильной фазы;
объединение гидрофобной фазы и гидрофильной фазы с образованием эмульсии, содержащей капельки гидрофильной фазы, диспергированной в гидрофобной фазе;
перемешивание эмульсии по мере формирования частиц внутри капелек; и
добавление агента для обработки поверхности к эмульсии после образования частиц в целях обработки поверхности частиц.
В этом варианте изобретения, стадия добавления биомолекулы может быть осуществлена непосредственно (например, менее чем за 1 минуту) до проведения стадии объединения гидрофобной и гидрофильной фаз. Биомолекулой может быть РНК или ДНК, либо другая биомолекула, описанная выше. Такой молекулой может быть киРНК.
В вариантах вышеописанного варианта изобретения, где рН имеет значения приблизительно менее чем 5, могут быть использован рН, имеющий значения в других интервалах. Так, например, могут быть использованы основные условия, при которых рН составляет приблизительно более чем 8. Авторы настоящего изобретения считают, что могут быть также использованы рН в пределах приблизительно 5-8. Другим возможным вариантом, вместо комбинации воды/жидкого стекла, является применение коллоидной суспензии, такой как коллоидная двуокись кремния. Эти варианты могут оказаться подходящими для инкапсулирования относительно крупных биомолекул, таких как белки.
Образование наночастиц (<100 нм)
В различных вариантах изобретения может оказаться предпочтительным, чтобы образующиеся частицы имели меньший размер, а в частности, менее чем 100 нм. Следует отметить, что в некоторых случаях такой размер позволит осуществлять более эффективную доставку биомолекулы.
В соответствии с этим, настоящее изобретение также относится к способу получения частиц, содержащих биомолекулу, находящуюся в порах этих частиц, где указанный способ включает:
a) объединение:
гидрофобной фазы, содержащей гидрофобную жидкость и поверхностно-активное вещество; и
гидрофильной фазы, содержащей гидрофильную жидкость и катализатор;
с образованием эмульсии, содержащей капельки гидрофильной фазы, диспергированной в гидрофобной фазе; и
b) добавление керамического предшественника к эмульсии и гидролиз керамического предшественника;
с) доведение рН гидрофильной фазы до значений в интервале, подходящем для биомолекулы;
d) добавление биомолекулы и керамического предшественника, содержащего функциональную группу, к эмульсии; и
е) перемешивание эмульсии по мере формирования частиц внутри капелек;
где указанный керамический предшественник содержит функциональную группу, способную стимулировать проникновение частиц в клетки.
Многие отличительные признаки и варианты получения микрочастиц, обсуждаемые выше, могут быть в равной степени применены и в этом аспекте изобретения. А поэтому, во избежание ненужного повторения, эти отличительные признаки и варианты точно вводятся в настоящее описание посредством ссылки. В соответствии с этим, керамический предшественник с функциональной группой, описанный в данном аспекте изобретения, соответствует первому керамическому предшественнику, обсуждаемому выше. Керамический предшественник, описанный в данном аспекте изобретения, соответствует второму керамическому предшественнику, обсуждаемому выше.
Помимо описанных выше отличительных признаков и вариантов следует указать, что в конкретных вариантах изобретения, функциональная группа керамического предшественника, содержащего такую группу, обладает способностью химически взаимодействовать, например, электростатически взаимодействовать с биомолекулой. Так, например, керамическим предшественником с функциональной группой может быть керамический предшественник с функциональной аминогруппой, такой как алкоксисилан с функциональной аминогруппой. В некоторых вариантах изобретения, керамический предшественник с функциональной аминогруппой содержит аминоалкиламиногруппу. Так, например, керамический предшественник с функциональной аминогруппой может содержать 3-(2-аминоэтиламино)пропилтриметоксисилан, 3-[2-(2-аминоэтиламино)этиламино]пропилтриметоксисилан, 3-(2-аминоэтиламино)пропилтриэтоксисилан или 3-[2-(2-аминоэтиламино)этиламино]пропилтриэтоксисилан или смесь любых двух или более из указанных соединений.
И в этом случае, поверхностно-активное вещество может иметь ГЛБ приблизительно 8-16. Было обнаружено, что хорошие результаты могут быть получены с использованием этоксилата нонилфенола. Гидрофобная фаза может дополнительно содержать вторичное поверхностно-активное вещество, такое как спирт, например, 1-пентанол.
В случае получения наночастиц, вязкость не играет решающей роли, поскольку в этом случае образуются микроэмульсии (в противоположность обычным эмульсиям), которые являются термодинамически стабильными и состоят из очень мелких (≈10 нм) капелек.
В некоторых вариантах изобретения, гидрофобная жидкость включает алкан (например, от гексана (С6) до додекана (С12)), циклоалкан, такой как циклогексан, ароматические соединения (например, толуол, бензол) и смеси, такие как керосин.
Гидрофильная фаза включает гидрофильную жидкость и катализатор. Так, например, гидрофильная жидкость может содержать воду, а катализатором может быть кислота. Более конкретно, типичным катализатором для гидролиза алкоксидов кремния могут быть кислоты или основания, фториды или другие алкоксиды металлов, например, алкоксид титана.
Биомолекулой может быть биомолекула, описанная выше. Так, например, она может быть отрицательно заряженной или иметь достаточно большой размер, который не позволяет ей проходить через поры частиц. Биомолекула может содержать РНК, антисмысловой нуклеотид, антисмысловую молекулу, аптамер, ДНК, белок, гликопротеин, полипептид, углевод или смесь или аддукт любых двух или более из указанных соединений. В конкретном варианте изобретения, биомолекула содержит киРНК.
Такой способ включает коррекцию рН эмульсии, например, путем добавления основания, такого как NaOH, KOH и NH4OH, перед добавлением биомолекулы и керамического предшественника с функциональной группой во избежание денатурации биомолекулы. Обычно, гидролиз проводят при низких рН (таких, как рН 2) для обеспечения достаточной кинетики реакции гидролиза при ингибировании конденсации гидролизованного предшественника. Перед добавлением биомолекулы, рН, предпочтительно, повышают до более нейтральных значений (то есть, pH>4).
И в этом случае, полимер или комплекс-образующий агент могут быть добавлены так, чтобы они осаждались в порах частиц вместе с биомолекулой для облегчения эндосомного высвобождения. Обычно, полимер представляет собой полиэтиленамин, полилизин, полигистидин или любое вещество, обладающее эффектом протонной губки.
Как и в предыдущем аспекте изобретения, указанный способ может также включать:
f) добавление агента для обработки поверхности к эмульсии после образования частиц в целях обработки поверхности частиц.
Агент для обработки поверхности может содержать полиэтиленгликолевую цепь, связанную со связывающей группой, где указанная связывающая группа обладает способностью связывать полиэтиленгликолевую цепь с поверхностью частиц. Так, например, агентом для обработки поверхности может быть ПЭГ-силан, такой как триалкоксисилил-ПЭГ.
Агент для обработки поверхности может содержать нацеливающую группу для доставки биомолекулы к мишени у пациента. Так, например, агент для обработки поверхности может содержать триалкоксисилил-ПЭГ, имеющий нацеливающую группу у дистального конца ПЭГ, который расположен за триалкоксисилановой группой.
Настоящее изобретение также относится к частицам, полученным способом, описанным в любом из предшествующих параграфов.
Как указывалось выше, биомолекулы могут быть использованы для профилактики или лечения заболевания, расстройства или состояния.
В соответствии с этим, в одном из своих аспектов, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей состоящее из частиц вещество, описанное в настоящей заявке, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем.
Фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем могут быть твердый иди жидкий наполнитель, растворитель, разбавитель или вещество для инкапсулирования, которые могут быть использованы для безопасного системного введения. В зависимости от конкретного способа введения могут быть использованы различные носители, хорошо известные специалистам. Такие носители могут быть выбраны из группы, включающей сахара, крахмалы, целлюлозу и ее производные, солод, желатин, тальк, сульфат кальция, растительные масла, синтетические масла, полиолы, альгиновую кислоту, забуференные фосфатом растворы, эмульгаторы, изотонический физиологический раствор и соли, такие как соли минеральных кислот, включая гидрохлориды, бромиды и сульфаты, органические кислоты, такие как ацетаты, пропионаты и малонаты, и апирогенную воду. Подходящие примеры фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей и наполнителей можно найти в руководстве Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N.J. USA, 1991), которое вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Лекарственными формами являются таблетки, дисперсии, суспензии, инъекции, растворы, сиропы, пастилки, капсулы, суппозитории, аэрозоли, чрескожные пластыри и т.п. Такими лекарственными формами могут быть также инъецируемые или имплантируемые устройства с регулируемым высвобождением, изготовленные специально для этих целей, или другие формы имплантатов, модифицированные так, чтобы, в этом способе, их действие было аддитивным.
Введение состоящих из частиц веществ согласно изобретению может быть осуществлено любым безопасным способом введения. Так, например, таким способом может быть пероральное введение, ректальное введение, парентеральное введение, подъязычное введение, трансбуккальное введение, внутривенное введение, внутрисуставное введение, внутримышечное введение, интрадермальное введение, подкожное введение, введение путем ингаляции, внутриглазное введение, внутрибрюшинное введение, интрацеребровентрикулярное введение, чрескожное введение и т.п.
В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания, расстройства или состояния у млекопитающего, включающему стадию введения состоящего из частиц вещества, описанного в настоящей заявке, или фармацевтической композиции указанному млекопитающему для лечения указанного заболевания, расстройства или состояния.
В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к состоящему из частиц веществу, описанному в настоящей заявке, которое может быть использовано для лечения заболевания, расстройства или состояния у млекопитающего.
Таким заболеванием, расстройством или состоянием могут быть, но не ограничиваются ими, генетическое заболевание, расстройство или состояние (например, кистозный фиброз или болезнь Гентингтона), дегенеративное заболевание, расстройство или состояние (например, возрастная дегенерация желтого пятна), рак (например, солидные опухоли, саркомы, лимфомы, миеломы, карциномы, меланомы, включая, но не ограничиваясь ими, рак молочной железы, шейки матки, легких и предстательной железы), заболевание, расстройство или нарушение иммунной системы, включая аутоиммунные заболевания (например, диабет типа I, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, системная красная волчанка) и воспалительные состояния (например, астма, воспалительное заболевание кишечника, гломерулонефрит), заболевание, состояние или расстройство, вызываемые патогенными инфекциями, такими как вирус (например, вирус гепатита С, вирус гриппа; респираторно-синцитиальный вирус; вирус, вызывающий СПИД); бактерия (например, бактерия, вызывающая пневмонию, бактериальный менингит, коклюш, туберкулез, столбняк); простейшие (например, вызывающие малярию) или грибки (например, Candida), заболевание, расстройство или нарушение системы кровообращения (например, атеросклероз, рестеноз, гиперхолестеринемия), заболевание, расстройство или нарушение эндокринной системы (например, диабет типа II, остеопороз, панкреатит) или нервное заболевание, расстройство или состояние (например, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона или эпилепсия).
Млекопитающим может быть человек или млекопитающее, не являющееся человеком, включая, но не ограничиваясь ими, животные, участвующие в цирковых представлениях (например, скаковые лошади), домашние питомцы (например, собаки, кошки) и сельскохозяйственные животные (например, крупный рогатый скот, лошади, овцы, свиньи). Предпочтительным млекопитающим является человек.
Краткое описание графического материала
Осуществление настоящего изобретения описано ниже со ссылками на прилагаемый графический материал, представленный лишь в иллюстративных целях. Следует отметить, что нижеследующее обсуждение никоим образом не должно рассматриваться как ограничение настоящего изобретения. В данном графическом материале:
На фиг. 1 представлена блок-схема получения частиц согласно изобретению;
На фиг. 2 представлены фотографии киРНК-содержащих частиц, полученных на трансмиссионном электронном микроскопе (ТЭМ), где указанные частицы были получены способом согласно изобретению;
На фиг. 3 представлено распределение частиц по размерам;
На фиг. 4 также представлены ТЭМ-фотографии частиц согласно изобретению;
На фиг. 5 представлен график, иллюстрирующий влияние заряда и ПЭГилирования частиц на высвобождение флуоресцентной киДНК из этих частиц;
На фиг. 6 представлен график, иллюстрирующий кинетику высвобождения различных полезных веществ в частицах;
На фиг. 7 представлена ВЭЖХ-хроматограмма инкапсулированной киРНК (красная линия) и киРНК, высвобожденной из частиц, полученных в соответствии с настоящим изобретением;
На фиг. 8 представлены фотографии суспензий частиц согласно изобретению;
На фиг. 9 представлены микрофотографии, иллюстрирующие проникновение частиц в клетки, где указанные частицы являются отрицательно заряженными, нейтральными и положительно заряженными;
На фиг. 10 представлены микрофотографии, иллюстрирующие удерживание загруженного вещества в частицах, которые являются отрицательно заряженными, нейтральными и положительно заряженными;
На фиг. 11 и 12 представлены микрофотографии, указывающие на то, что загруженное вещество поступает в клетки вместе с частицами, где на фиг. 11 показаны частицы, а на фиг. 12 показано загруженное вещество;
На фиг. 13 показаны дисперсии киДНК в клетках HEPG2 в зависимости от времени;
На фиг. 14 показаны дисперсии киДНК в клетках HeLa в зависимости от времени;
На фиг. 15 показаны дисперсии киДНК в клетках RAW264 в зависимости от времени;
На фиг. 16 показаны дисперсии киДНК в клетках в зависимости от времени;
На фиг. 17 проиллюстрировано влияние частиц согласно изобретению на активность DPP4 в фибробластах BJ;
На фиг. 18 представлена детальная блок-схема осуществления метода-прототипа инкапсулирования олигонуклеотидов;
На фиг. 19 представлена блок-схема получения частиц согласно изобретению в наномасштабе;
На фиг. 20 представлены ФЭГ-СЭМ-изображения частиц, полученных способом, проиллюстрированным на фиг. 19;
На фиг. 21 представлены фазовые и флуоресцентные изображения частиц, меченных фтор-ДНК; и
На фиг. 22 проиллюстрировано проникновение наночастиц в клетки HeLa.
Подробное описание изобретения
Описаны инкапсулирование и регулируемое высвобождение киРНК из модифицированных частиц двуокиси кремния. Эти частицы состоят из аморфной двуокиси кремния (SiO2), содержащей определенное количество аминосиланов, введенных для удерживания загруженного вещества и его проникновения в клетки. Эти частицы имеют поверхность, модифицированную в целях сообщения им биологической доступности (время полужизни в кровотоке составляет ~4 часа). Такие частицы могут проникать через клеточные мембраны млекопитающих и высвобождать загруженное в них вещество в эндосомное и внутриклеточное пространство.
На фиг. 1 проиллюстрирован синтез частиц, включая инкапсулирование киРНК (репрезентативной биомолекулы. которая представляет собой загруженное вещество, состоящее из полученных частиц). Таким образом, как показано на фиг.1, гидрофобная непрерывная фаза была получена путем объединения 30 мл тяжелого вазелинового масла и 4,5 г SPAN-20 (=500 мМ). Эти компоненты были объединены путем перемешивания (30 минут). Затем добавляли аминосилан (DATMS или TATMS, но не APTES) в количестве, достаточном для сообщения желаемого заряда: для отрицательно заряженных частиц, добавление не проводили; для нейтральных частиц добавляли DATMS (1,5 мкл = 1 моль% по содержанию кремния); а для положительно заряженных частиц добавляли DATMS (15 мкл = 10 моль% по содержанию кремния). Затем полученную смесь перемешивали по меньшей мере еще 10 минут, но не более, чем 60 минут.
Затем получали раствор двуокиси кремния путем объединения 4 мл жидкого стекла и 20 мл воды. К полученной смеси, при перемешивании, добавляли катионообменную смолу в количестве, достаточном для доведения рН до 4,0. После этого, раствор двуокиси кремния декантировали из смолы и загружали в свежий контейнер.
Гидрофобную фазу (полученную как описано выше) помещали в магнитное устройство для одновременного перемешивания и обработки ультразвуком (зонд 3/8"), и включали смеситель. При приготовлении препарата для объединения гидрофобной и гидрофильной фаз, ультразвуковой аппарат переводили на 70% мощность (~700 Вт).
5 мг загруженного вещества (250 мкл 20 мг/мл раствора киРНК) смешивали с 1,25 мл раствора двуокиси кремния, полученного как описано выше. После обработки ультразвуком в течение 10 секунд, смесь двуокиси кремния/загруженного вещества добавляли в активную зону ультразвукового устройства. Обработку ультразвуком проводили в течение 30 секунд, а затем ультразвуковое устройство выключали. Полученную эмульсию помещали в магнитную мешалку, после чего осуществляли перемешивание в течение 1 часа. Затем к смеси добавляли ПЭГ5000-силан (10 мг), и полученную суспензию частиц перемешивали в течение ночи.
Частицы собирали из эмульсии путем центрифугирования (15000 × g в течение 10 минут). Затем эмульсию разводили 0,5 объема цислогексана для снижения вязкости, два раза промывали циклогексаном (приблизительно 40 мл) и два раза 100% этанолом (приблизительно 40 мл). Каждая стадия промывки включала ресуспендирование, сбор частиц и декантирование супернатанта. И наконец, частицы ресуспендировали в 5 мл 100% этанола для хранения при -20°C или 4°C. Эти частицы могут храниться в течение нескольких месяцев при 4°C без значительной потери биологической активности, однако более низкая температура хранения позволяет даже увеличить срок хранения.
Вышеописанный метод позволяет получить частицы, размер которых составляет 100-1000 нм, а средневзвешенный диаметр (d0,5) составляет приблизительно 300 нм. Эти частицы показаны на фиг. 2 и 4. На фиг. 3 представлено распределение частиц по размерам. Плечо кривой размером приблизительно 1 микрон вероятно представляет небольшое количество агрегированных частиц. Вышеописанный метод был применен в описанных ниже исследованиях, однако, модификации этого метода позволяют получить диспергированные частицы с d0,5<150 нм.
Частицы с различными зарядами были получены путем изменения количества и/или типа добавляемого аминосилана. DATMS (аминоэтиламинопропилтриметоксисилан: 2 атома азота на молекулу) использовали в качестве стандарта. APTES (аминопропилтриметоксисилан: 1 атом азота на молекулу) был гораздо менее эффективным, а TATMS (аминоэтиламиноэтиламинопропилтриметоксисилан: три атома азота на молекулу) давал результаты, аналогичные результатам, полученным для DATMS.
Как указывалось выше, аминосилан добавляли к гидрофобной фазе, а затем смесь переносили в гидрофильную фазу путем гидрофильного переноса. Вследствие распределения между фазами, количество включенного аминосилана было меньше, чем количество добавленного аминосилана. Было обнаружено, что непосредственное добавление аминосилана к гидрофильной фазе (то есть, в комбинации с жидким стеклом) при кислотном pH является нежелательным, поскольку это приводит к преждевременному образованию геля.
Заряд частиц измеряли при pH 7,0 в 10 мМ MOPS (в буфере 3-N-морфолинопропансульфоновой кислоты). Частицы имели следующие дзета-потенциалы:
Нативные (без аминосилана): ζ≤-30 мВ
Нейтральные (1% DATMS): -5 мВ<ζ<5 мВ
Положительно заряженные (10% DATMS): ζ≥+10 мВ
Несмотря на непрямой метод измерения, заряд, измеренный для разных партий, имел абсолютно одинаковые значения.
Процент эффективности инкапсулирования (ЭИ) определяли путем сравнения теоретической нагрузки киРНК (определенной по добавленному количеству) с фактической нагрузкой, измеренной по высвобождаемому количеству. Результаты представлены ниже:
Теоретическая загрузка: 5%
ЭИ (высвобождение от 1 мг/мл)
Партия 1: 85%±5%
ЭИ (высвобождение от 0,1 мг/мл)
Партия 1: 80%±2%
Партия 2: 85%±10%
Фактическая нагрузка 4,2%
Теоретическая загрузка: 10%
ЭИ 75%, нагрузка 7,5%
Таким образом, чем выше количество вводимой РНК, тем ниже эффективность инкапсулирования.
На фиг.5 проиллюстрирован эффект высвобождения флуоресцентно меченной киДНК из частиц двуокиси кремния, имеющих различные заряды и модификации поверхности. Как обсуждалось выше, заряд частиц можно варьировать путем изменения количества используемого аминосилана. Высвобождение из положительно заряженных частиц происходило гораздо медленнее, чем из отрицательно заряженных частиц, как было предсказано по притяжению между положительно заряженными частицами и отрицательно заряженной полезной нагрузкой. Что касается отрицательно заряженных частиц, то очевидно, что присутствие ПЭГ на поверхности частиц способствует ускорению высвобождения полезной нагрузки.
Очевидно, что высвобождение полезной нагрузки из частиц происходит, главным образом, благодаря растворению матрицы, состоящей из этих частиц. При высоких концентрациях частиц в водной среде (приблизительно ≥1 мг/мл частиц), выщелачивание загруженного вещества из частиц ограничено степенью растворения частиц, то есть, раствор может достигать своего насыщения матрицей частиц, что ограничивает высвобождение полезной нагрузки. Это показано на фиг.6, где относительно быстрое высвобождение активных (значения, обозначенные точками) и скремблированных (значения, обозначенные квадратиками) молекул киРНК имеет предел, который определяется растворимостью матрицы, состоящей из двуокиси кремния. Следует отметить, что на фиг.5 это не заметно, поскольку частицы имеют различные концентрации. При концентрации значительно ниже предела растворимости двуокиси кремния (приблизительно 100 мкг/мл), или в случае непрерывного пополнения высвобождаемой жидкости, полное растворение частиц происходит приблизительно за 12-24 часа. Частицы, изготовленные как описано выше, хранили в течение 36 дней при температуре 253°K в 96% этаноле. После хранения, частицы полностью растворяли в воде, не содержащей РНКазы. При элюировании полученной жидкости с помощью ВЭЖХ было обнаружено, что профиль растворимости киРНК был почти аналогичен профилю растворимости неинкапсулированной киРНК в буферном растворе, что указывало на то, что инкапсулирование и высвобождение не оказывали значительного влияния на киРНК.
На фиг. 7 представлена ВЭЖХ-хроматограмма неинкапсулированной киРНК и киРНК, высвобожденной из частиц, полученных в соответствии с настоящим изобретением. Частицы и контроль (неинкапсулированная киРНК) обрабатывали РНКазой А в течение 15 минут, а затем три раза промывали PBS перед суспендированием в PBS, содержащем ингибитор РНКазы. Материал, высвобождаемый из частиц двуокиси кремния, указывал на интактную РНК. Аналогичный гидролиз неинкапсулированной киРНК приводил к полной ее деструкции. Эти эксперименты продемонстрировали способность частиц защищать инкапсулированную биомолекулу от ферментативного расщепления.
На фиг.8 представлены фотографии частиц, суспендированных при 3 мг/л либо в буфере PBS (слева), либо в 50% мышиной сыворотке в PBS (справа). После инкубирования в течение ночи какой-либо видимой агрегации не наблюдалось. Частицы также суспендировали при концентрации 1, 3, 10 мг/кг в 1500 м.д. BSA, а затем инкубировали в течение 2 часов. Затем определяли размер частиц на устройстве Mastersizer (по рассеиванию Ми), в результате чего было установлено, что какого-либо изменения размера в зависимости от времени или концентрации не происходило.
В результате можно сделать вывод, что 4%-ная нагрузка вещества может быть осуществлена рутинным способом, причем, в данном случае была продемонстрирована нагрузка приблизительно 8%. При этом, эффективность инкапсулирования >80% может быть достигнута рутинным способом. Очевидно, что удерживание биомолекулы в частицах опосредуется, главным образом, электростатическими силами, которые характеризуют высвобождение, зависимое от растворения при физиологическом pH (то есть, высвобождение происходит преимущественно благодаря растворению матрицы). Было показано, что параметры удерживания загруженного вещества остаются неизменными после 40-дневного хранения при -20°C в 96% EtOH.
Проникновение в клетки млекопитающих
Было исследовано влияние заряда частиц на способность их проникновения в клетки и на удерживание загруженного вещества, а также на время их поступления в клетки и эндосомное высвобождение.
Были синтезированы частицы, ковалентно помеченные РИТЦ (родаминизотиоцианатом) и несущие ДНК, имеющую последовательность киРНК-типа, и частицы, меченные ФИТЦ (флуоресцеинизотиоцианатом). Клетки (NIH3T3, HeLa, HEPG2) культивировали до 50% конфлюэнтности, и частицы, описанные выше (приблизительно 30 мкг/мл, эквивалентные 100 нМ ДНК), добавляли непосредственно в культуральную среду. Через 40 часов, культуры один раз промывали PBS (забуференным фосфатом физиологическим раствором) для удаления частиц, которые не проникали в клетки, а затем эти культуры визуализировали на эпифлуоресцентном микроскопе.
На фиг.9 представлены результаты мониторинга РИТЦ-метки: для каждой пары изображений, верхнее изображение представляет собой фазово-контрастное изображение, а нижнее изображение представляет собой флуоресцентное изображение. На фиг.9 показано, что чем больше положительный заряд частиц, тем лучше эти частицы поглощаются клетками. Таким образом, положительный заряд частиц способствует не только связыванию полезной нагрузки, но также и поглощению частиц клетками. На фиг.10 показано, что загруженное вещество более эффективно удерживается в положительно заряженных частицах по мере их поглощения клетками, в отличие от нейтральных частиц или отрицательно заряженных частиц. На этой фиг. показано удерживание киДНК под действием заряда. Из каждой пары изображений, верхнее изображение представляет собой фазово-контрастное изображение, а нижнее изображение представляет собой флуоресцентное изображение киДНК.
На фиг.11 проиллюстрировано поглощение частиц двумя различными клеточными линиями (то есть, распределение частиц), а на фиг.12 представлены микрофотографии тех же самых образцов, но с меченной полезной нагрузкой, которые видны на фотографии как световые блики (то есть, распределение загруженного вещества). На этих фигурах, верхнее изображение из каждой пары изображений представляет собой фазово-контрастное изображение. На фиг.11, нижнее изображение из каждой пары изображений представляет собой РИТЦ-флуоресцентное изображение (в красном диапазоне), а на фиг.12, нижнее изображение из каждой пары изображений представляет собой флуоресцентное изображение киДНК (в зеленом диапазоне). При сравнении этих двух фигур можно сделать вывод, что киРНК удерживается в частицах при их проникновении в клетки. Присутствие зеленых и красных точек внутри клетки означает, что двуокись кремния проникает вовнутрь (красные точки = частицы двуокиси кремния) с удерживанием своей флуоресцентной ДНК-нагрузки (зеленые точки = ДНК), что указывает на то, что ДНК была успешно перенесена вовнутрь клеток. На фиг. 13-15 указано время введения меченной киДНК в различные клеточные линии (фиг.13: HEPG2; фиг.14: HeLa; фиг.15: RAW264) с помощью частиц согласно изобретению. На каждой фиг. показано распределение флуоресценции за каждый период времени после обработки клеток. В каждом случае можно было видеть, что за более короткие периоды времени, киДНК локализуется, главным образом, в небольших областях, что указывает на присутствие киДНК внутри частиц, локализованных в клетках. В течение более длительных периодов времени, киДНК распределяется по более обширным областям, что указывает на высвобождение киДНК из частиц благодаря растворению матрицы этих частиц и распределению киДНК в клетках.
На фиг. 16 проиллюстрирован аналогичный эксперимент, проведенный на конфокальном микроскопе. На фиг. 16, верхнее изображение из каждой пары изображений относится к окрашенному ядру (синий цвет), а нижнее изображение относится к флуоресценции киДНК (зеленый цвет). Таким образом, клетки HeLa высевали на покровные стекла, покрытые полилизином, при 25% конфлюэнтности. Затем эти клетки обрабатывали в течение 24 или 48 часов РИТЦ-модифицированными частицами, несущими FAM-ДНК. После этого клетки промывали PBS и фиксировали 3,7% формальдегидом в PBS. Полученные клетки окрашивали 1,2 пг/мл реагента Hoescht 33342 в изотоническом физиологическом растворе, фиксировали на предметных стеклах с помощью реагента Gelmount и акриловой кислоты, и получали изображения на конфокальном микроскопе с увеличением 100 ×. Изображения имели размер 150 × 150 мкм, а глубина слоя на оси z составляла 350 нм. Такие четко охарактеризованные структуры, имеющие почти округлую форму, представляли собой ядерную ДНК. Через 24 часа наблюдалось большое число небольших ярких областей, соответствующих полезной нагрузке, локализованной в частицах. Небольшое количество рассеянного света соответствует небольшому количеству высвобожденной полезной нагрузки. Через 48 часов, точечные источники, в основном, исчезали, что указывало на растворение частиц. Вместо этого, каждая клетка имела область в виде диффузного светового гало, указывающую на высвобождение полезной нагрузки внутри клетки.
Исследования на нокаут гена
На фиг.17 представлены результаты эксперимента на эффективность присутствующих загруженных частиц при нокауте гена (то есть, при «отключении» экспрессии гена). В этом эксперименте проводили исследование на эффективность нокаута DPP4 в человеческих фибробластах BJ. Неэффективной оказалась киРНК, взятая отдельно, что, вероятно, обусловлено инактивацией РНКазой, присутствующей в этой системе. Неожиданно было обнаружено, что неэффективными являются также ненагруженные частицы двуокиси кремния. Выражение «меченая киРНК/Lipo» означает киРНК, трансфецированную с помощью липофектамина (Lipofectamine®), который, как известно, способствует переносу олигонуклеотидов через клеточную мембрану. Эта система имеет тот недостаток, что она является токсичной и не обеспечивает защиту киРНК от ферментативной атаки. Выражение «меченая киРНК/нано» означает киРНК, инкапсулированную в частицах согласно изобретению. В каждом случае, киРНК, если она присутствовала, использовалась в концентрации приблизительно 200 нМ. Результаты показали, что, при данной концентрации, инкапсулированная киРНК является эффективной с точки зрения ингибирования экспрессии гена, и, фактически, даже немного более эффективной, чем киРНК с липофектамином.
Результаты эксперимента in vitro
- Инкапсулирование биомолекул в частицы согласно изобретению может обеспечивать защиту биомолекул от ферментативного разложения.
- Частицы, нагруженные биомолекулами, при нанесении на клетки в обычных условиях культивирования, обладают способностью проникать через цитоплазматическую мембрану и доставлять загруженное вещество во внутриклеточное пространство.
- Доставка биомолекул с помощью частиц согласно изобретению в клетки тканевой культуры приводит к дозозависимому снижению уровней мРНК в этих клетках.
- Дозы киРНК, инкапсулированной в частицах, которые являются достаточными для >50% снижения уровней мРНК, не обладают значительной токсичностью, как было установлено in vitro.
Дополнительные результаты - синтез частиц
Общий метод синтеза проиллюстрирован на блок-схеме, представленной на фиг. 18. Образование частиц происходило очень быстро после добавления водного предшественника к раствору поверхностно-активного вещества. Однако период времени между образованием эмульсии и сбором частиц составлял, в основном, по меньшей мере 12 часов.
На удерживание олигонуклеотидов значительное влияние оказывают электростатические взаимодействия между загруженным веществом и аминосилановым компонентом частиц. Это позволяет определить количество и тип замещения, а также pH при образовании и высвобождении, которые являются важными факторами при определении параметров инкапсулирования, удерживания и высвобождения.
Параметры
Поверхностно-активным веществом, используемым в этом примере, является сорбитанмонолаурат (Span® 20). Концентрация используемого поверхностно-активного вещества составляла приблизительно 17% по массе. Гидрофобная фаза представляла собой тяжелое жидкое вазелиновое масло, которое позволяло получить самые мелкие частицы из всех тестируемых частиц. Размер частиц был снижен до величины, приемлемой для внутривенной инъекции, посредством применения комбинированного метода перемешивания с помощью магнитной мешалки и обработки ультразвуком.
Предпочтительным аминосиланом, используемым для повышения уровня удерживания загруженного вещества, является DATMS (аминоэтиламинопропилтриметоксисилан). Эксперименты, проводимые с использованием APTES (аминопропилтриэтоксисилана) и TATMS (аминоэтиламиноэтиламинопропилтриметоксисилана), показали, что эти вещества также в меньшей или большей степени являются эффективными и могут быть использованы для тонкой коррекции параметров удерживания/высвобождения. Загруженное вещество, как и предполагалось, влияет на дзета-потенциал частиц, а модификация аминосиланом, как и предполагалось, влияет на максимальную нагрузку.
pH для обеспечения минимальной стабильности жидкого стекла составляет приблизительно 5,5, и соответствует рН для максимальной стабильности РНК. Если рН раствора силиката очень близок к нейтральному, то соединение-предшественник будет спонтанно образовывать гель еще до его использования для синтеза частиц. Если раствор имеет высокую степень кислотности, то может происходить значительное разложение нуклеотидной нагрузки. Было подтверждено, что при РНК-нагрузке, подходящим рН предшественника является рН 3,75-4,00, но при этом могут возникнуть некоторые трудности с обработкой. ДНК, LNA или другие модифицированные олигонуклеотиды позволят получить более кислотные (а следовательно, и более стабильные) растворы предшественника.
Пример - Фиг. 18
Инкапсулирование киРНК в частицы, модифицированные DATMS, родамином и мПЭГ-5000:
15 г Dowex 50W смешивали со 100 мл 5 M HCl в течение 30 минут для превращения смолы в активную протонированную форму. Затем смолу регенерировали путем вакуумной фильтрации в фильтрующую воронку из спеченного стекла, где эту смолу два раза промывали 100 мл воды milliQ для удаления остаточной HCl.
9 граммов Span® 20 взвешивали в тефлоновом химическом стакане и добавляли 60 мл жидкого вазелинового масла. Полученную смесь перемешивали приблизительно в течение 30 минут до полного растворения Span® 20 в вазелиновом масле. К перемешиваемому раствору поверхностно-активного вещества добавляли 29 мкл жидкого DATMS и 6 мкл 10% родамина-APTES в 2-пропаноне.
4,0 мл раствора силиката натрия добавляли к 28 мл воды milliQ. 8,0 мл этого раствора оставляли для последующего титрования основного объема.
С использованием pH-зонда для непрерывного мониторинга рН раствора, активированную катионообменную смолу добавляли для доведения рН силикатной смеси приблизительно до 3,5. Силикатный раствор декантировали из смолы и снова определяли рН.
2,5 мл этого раствора предшественника переносили в 5-миллилитровую пластиковую пробирку. Соответствующий объем (<0,5 мл) раствора РНК-загрузки переносили в 1,5 мл пробирку.
Раствор РНК-нагрузки пипетировали в силикатный предшественник. Смесь РНК/силиката пипетировали в раствор поверхностно-активного вещества и, перемешивая, обрабатывали ультразвуком в течение 25 секунд.
Полученную эмульсию быстро перемешивали в течение 15 минут. Затем в эмульсию добавляли 15 мг порошка мПЭГ5000-силана, и полученную смесь перемешивали в течение ночи.
Затем смесь центрифугировали в течение 5 минут при >2000 × g для выделения частиц. Полученные частицы два раза промывали циклогексаном для удаления парафина и поверхностно-активного вещества, при этом после каждой промывки частицы центрифугировали, а после этого еще раз промывали этанолом. Частицы собирали центрифугированием, супернатант декантировали, и частицы ресуспендировали в 10 мл этанола.
Обычно, вес полученного продукта составлял 200 мг. Эффективность инкапсулирования обычно составляла >80%. Дзета-потенциал частиц при pH 7,4 обычно составлял +20 мВ. Снижение уровня связывания белка с частицами, по сравнению с нативными силикатными частицами (уровня плотности ПЭГилирования) составляло >90%.
Примеры - Фиг. 19
A. Получение микроэмульсии частиц для инкапсулирования биомолекул
0,381 г NP9 растворяли в 3 мл циклогексана (0,2 моль/л) при перемешивании (с помощью магнитной мешалки) в стеклянном сосуде, а затем добавляли 0,065 мл 1-пентанола в качестве вторичного поверхностно-активного вещества (0,2 моль/л) при постоянном перемешивании. Полученный раствор составлял гидрофобную фазу.
Затем добавляли 0,013 мл 0,01 M HNO3, действующей как кислотный катализатор и составляющей гидрофильную фазу, после чего раствор перемешивали в течение 20 минут до гомогенности. В результате чего была получена микроэмульсия.
Затем добавляли 0,018 мл тетраметилортосиликата (TMOS), и полученный раствор перемешивали в течение 66 часов для гидролиза TMOS, в результате чего получали гидролизованный раствор предшественника.
Затем добавляли 0,013 мл 0,01 M NaOH, и смесь перемешивали в течение 5 минут для доведения рН до значения приблизительно выше 4.
Присоединение биомолекулы стимулировали путем добавления 0,010 мл воды при перемешивании. После этого добавляли 0,003 мл 3-(2-аминоэтиламино)пропилтриметоксисилана в качестве керамического предшественника с функциональной группой, затем смесь перемешивали в течение 6,5 часа, и за это время раствор постепенно становился более мутным. В результате была получена суспензия наночастиц.
Добавляли 5 мг мПЭГ-силана (MW=5000), и раствор оставляли на 15 часов при перемешивании. Затем раствор центрифугировали (13000 об/мин) для выделения частиц, и эти частицы три раза промывали 2 мл этанола и суспендировали в 2 мл этанола.
Частицы визуализировали с помощью ФЭГ-СЭМ, которая показала, что размер частиц составляет в пределах 30-100 нм. См. фиг. 20.
B. Получение микроэмульсии частиц, используемых для инкапсулирования биомолекулы
0,636 г NP9 растворяли в 5 мл циклогексана (0,2 моль/л) при перемешивании (с помощью магнитной мешалки) в стеклянном сосуде. Затем добавляли 0,109 мл 1-пентанола в качестве вторичного поверхностно-активного вещества (0,2 моль/л) при постоянном перемешивании. 1,14 мл раствора циклогексана/NP9/1-пентанола пипетировали во второй стеклянный сосуд (×2).
Затем к полученным выше подобразцам добавляли 0,011 мл 0,01 M HNO3, и растворы перемешивали в течение 40 минут до гомогенности, в результате чего получали микроэмульсию.
К подобразцам добавляли 0,0125 мл (0,08 ммоль) тетраметилортосиликата, и полученные растворы перемешивали в течение 17,5 часа для гидролиза TMOS. Затем к обоим образцам добавляли 0,011 мл 0,01 M NaOH, и эти смеси перемешивали в течение 5 минут для доведения рН до значения приблизительно выше 4.
К одному образцу добавляли, при перемешивании, 0,006 мл раствора фтор-ДНК (ФИТЦ-меченого DPP4 (21 пара оснований)), 0,5 мг/мл в воде), а ко второму образцу добавляли, при перемешивании, 0,006 мл воды.
К каждому образцу добавляли 0,002 мл (0,009 ммоль) 3-(2-аминоэтиламино)пропилтриметоксисилана в качестве керамического предшественника с функциональной группой, и смеси перемешивали в течение 6 часов.
К каждому образцу добавляли 0,8 мг мПЭГ-силана (MW=5000), и образцы оставляли на 18 часов при перемешивании. Затем, к каждому образцу добавляли 1 мл ацетона, и растворы перемешивали в течение 10 минут.
Затем растворы центрифугировали (13000 об/мин) для выделения частиц, и эти частицы три раза промывали 2 мл этанола. Образец, содержащий фтор-ДНК (CS11-0028), суспендировали в 2 мл этанола. Образец, полученный только с использованием воды (CS11-0029), сушили при 40°C, и после сушки его вес составлял 7,3 мг.
Несколько капель частиц, меченных фтор-ДНК, сушили на предметном стекле микроскопа и визуализировали на флуоресцентном микроскопе, снабженном ФИТЦ-фильтром с увеличением 40 × и с экспонированием 4 секунды. См. фиг. 21.
На фиг. 22 проиллюстрирована трансфекция культивированых человеческих гепатоцитов с наночастицами, содержащими двуокись кремния и меченными AlexaFluor-633. До визуализации, клетки обрабатывали в течение 24 часов.
Дополнительный пример
Могут быть синтезированы частицы, ковалентно меченные ФИТЦ (флуоресцеин-изотиоцианатом) и несущие фикоэритрин в качестве полезной нагрузки. Клетки HeLa могут быть культивированы до 50% конфлюэнтности, и описанные частицы (приблизительно 30 мкг/мл) могут быть добавлены непосредственно в культуральную среду. Через 40 часов, культуры могут быть один раз промыты PBS (забуференным фосфатом физиологическим раствором) для удаления частиц, не проникающих в клетки, а затем эти культуры могут быть визуализированы на эпифлуоресцентном микроскопе для мониторинга внутриклеточного высвобождения доставленного фикоэритрина.
Если в контексте настоящего описания не дано конкретных или противоречащих указаний относительно целых значений, стадий или элементов настоящего изобретения, то подразумевается, что употребляемые здесь слова «целые значения», «стадии» или «элементы» настоящего изобретения охватывают их грамматические формы как в единственном числе, так и во множественном числе.
В описании настоящей заявки, если это не оговорено особо, слово «включать», либо его варианты, такие как «включает» или «включающий», указывают на включение указанной стадии или указанного элемента, или группы стадий или элементов или целых чисел, но не означают исключение какой-либо другой стадии, или элемента, или целого числа, или группы стадий, или элементов, или целых чисел. Таким образом, в контексте настоящего описания термин «включающий» используется в инклюзивном смысле, и при этом, подразумевается, что этот термин означает, что такое «включение является преимущественным, но не обязательно исключительным».
Следует отметить, что представленное выше описание приводится лишь в целях иллюстрации настоящего изобретения и что в настоящее изобретение могут быть внесены любые модификации и изменения, которые будут очевидны для специалиста в данной области, но которые не выходят за рамки широкого объема и существа описанного здесь изобретения.

Claims (56)

1. Состоящее из частиц вещество для доставки биомолекулы, содержащее:
частицы керамической матрицы из оксида металла, несущей функциональную амино группу, где указанная функциональная амино группа способна стимулировать проникновение частиц в клетки и однородна распределена по всем указанным частицам; и
биомолекулу, имеющую гидрофильные свойства и находящуюся в порах частиц, где указанная биомолекула выбрана из РНК, антисмыслового нуклеотида, антисмысловой молекулы, аптамера, ДНК, белка, гликопротеина, полипептида, углевода или смеси, или аддукта любых двух или более из указанных соединений, где указанная биомолекула может высвобождаться из частиц при растворении керамической матрицы.
2. Состоящее из частиц вещество по п. 1, где указанная биомолекула не высвобождается из частиц посредством выщелачивания, если не происходит растворения керамической матрицы.
3. Состоящее из частиц вещество по п. 2, где функциональная амино группа химически взаимодействует с биомолекулой, что предотвращает выщелачивание.
4. Состоящее из частиц вещество по любому из пп. 1-3, где указанная керамическая матрица из оксида металла, несущая функциональную амино группу, содержит матрицу из двуокиси кремния с функциональной группой.
5. Состоящее из частиц вещество по любому из пп. 1-3, где указанная функциональная амино группа керамической матрицы содержит аминоалкиламиногруппу.
6. Состоящее из частиц вещество по любому из пп. 1-3, где частицы содержат агент для обработки поверхности, содержащий полиэтиленгликолевую цепь, связанную со связывающей группе, где связывающая группа обладает способностью связывать полиэтиленгликолевую цепь с поверхностью частиц.
7. Состоящее из частиц вещество по п. 6, где агент для обработки поверхности содержит нацеливающую группу для доставки биомолекулы к мишени у пациента.
8. Состоящее из частиц вещество по любому из пп. 1-3, где указанные частицы имеют средний размер 0,1-10 микрон, предпочтительно 0,1-1 микрон.
9. Состоящее из частиц вещество по любому из пп. 1-3, где указанные частицы имеют средний размер 20-100 нм.
10. Состоящее из частиц вещество по любому из пп. 1-3, где указанные частицы имеют размер пор 1-50 нм.
11. Состоящее из частиц вещество по любому из пп. 1-3, где указанные частицы имеют загрузку биомолекул 1-20 масс. %.
12. Состоящее из частиц вещество по любому из пп. 1-3, где вещество дополнительно содержит полимер или комплекс-образующий агент, который находится в порах частиц вместе с биомолекулой.
13. Состоящее из частиц вещество по п. 12, где указанный полимер представляет собой полиэтиленамин, полилизин, полигистидин или вещество, обладающее эффектом протонной губки.
14. Способ получения частиц, содержащих керамическую матрицу из оксида металла, имеющую биомолекулу, находящуюся в ее порах, где указанный способ включает:
a) объединение:
гидрофобной фазы, содержащей гидрофобную жидкость, первый керамический предшественник и поверхностно-активное вещество; и
гидрофильной фазы, содержащей гидрофильную жидкость, второй керамический предшественник и биомолекулу, с образованием эмульсии, содержащей капельки гидрофильной фазы, диспергированной в гидрофобной фазе; и
b) перемешивание эмульсии по мере образования частиц внутри капелек;
где первый керамический предшественник содержит функциональную амино группу, способную стимулировать проникновение частиц в клетки, и
где указанная биомолекула выбрана из РНК, антисмыслового нуклеотида, антисмысловой молекулы, аптамера, ДНК, белка, гликопротеина, полипептида, углевода или смеси, или аддукта любых двух или более из указанных соединений.
15. Способ по п. 14, включающий стадии:
объединения поверхностно-активного вещества с гидрофобной жидкостью; и
добавления первого керамического предшественника, с получением гидрофобной фазы, где указанные стадии проводят перед стадией а).
16. Способ по п. 14 или 15, где указанная функциональная группа первого керамического предшественника способна химически взаимодействовать, например электростатически взаимодействовать, с указанной биомолекулой.
17. Способ по п. 14 или 15, где указанным керамическим предшественником с функциональной аминогруппой является алкоксисилан с функциональной аминогруппой.
18. Способ по п. 17, где указанный керамический предшественник с функциональной аминогруппой содержит аминоалкиламиногруппу.
19. Способ по п. 18, где керамическим предшественником с функциональной аминогруппой является 3-(2-аминоэтиламино)пропилтриметоксисилан, 3-[2-(2-аминоэтиламино)этиламино]пропилтриметоксисилан, 3-(2-аминоэтиламино)пропилтриэтоксисилан или 3-[2-(2-аминоэтиламино)этиламино]пропилтриэтоксисилан или смесь любых двух или более из указанных соединений.
20. Способ по любому из пп. 14-15, где поверхностно-активное вещество имеет ГЛБ 8-16.
21. Способ по любому из пп. 14-15, где указанная гидрофобная жидкость имеет вязкость 0,5-15000 мПа·с.
22. Способ по любому из пп. 14-15, где указанная гидрофобная жидкость содержит вазелиновое масло, растительное масло или минеральное масло.
23. Способ по любому из пп. 14-15, где первым керамическим предшественником является основание, а гидрофильная фаза имеет рН ниже pKa первого керамического предшественника.
24. Способ по п. 23, включающий стадии:
объединения гидрофильной жидкости и второго керамического предшественника,
доведения рН до значения ниже pKa первого керамического предшественника; и
добавления биомолекулы, с получением гидрофильной фазы, где указанные стадии проводят перед стадией а).
25. Способ по п. 24, где стадия коррекции рН включает обработку раствора второго керамического предшественника в гидрофильной жидкости катионообменной смолой, а затем отделение раствора от смолы после достижения рН раствора нужного значения, которое составляет ниже pKa первого керамического предшественника.
26. Способ по любому из пп. 14, 15, 24, 25, где гидрофильная жидкость является водной.
27. Способ по любому из пп. 14, 15, 24, 25, где второй керамический предшественник включает жидкое стекло, или коллоидную двуокись кремния, или предварительно гидролизованный алкоксид кремния.
28. Способ по любому из пп. 14, 15, 24, 25, где указанная биомолекула является отрицательно заряженной или имеет достаточно большой размер, который не позволяет ей проходить через поры частиц.
29. Способ по любому из пп. 14, 15, 24, 25, где указанная биомолекула содержит киРНК.
30. Способ по любому из пп. 14, 15, 24, 25, который также включает:
с) добавление агента для обработки поверхности к эмульсии после образования частиц в целях обработки поверхности частиц.
31. Способ по п. 30, где агент для обработки поверхности содержит полиэтиленгликолевую цепь, связанную со связывающей группой, где указанная связывающая группа обладает способностью связывать полиэтиленгликолевую цепь с поверхностью частиц.
32. Способ по п. 31, где агентом для обработки поверхности является ПЭГ-силан, такой как триалкоксисилил-ПЭГ.
33. Способ по п. 30, где агент для обработки поверхности содержит нацеливающую группу для доставки биомолекулы к мишени у пациента.
34. Способ по п. 33, где агент для обработки поверхности содержит триалкоксисилил-ПЭГ, имеющий нацеливающую группу у дистального конца ПЭГ, который расположен за триалкоксисилановой группой.
35. Способ по любому из пп. 14, 15, 24, 25, 31, 32, 33, 34, где полимер или комплекс-образующий агент добавляют так, чтобы они находились в порах частиц вместе с биомолекулой.
36. Способ по п. 35, где указанным полимером является полиэтиленамин, полилизин, полигистидин или вещество, обладающее эффектом протонной губки.
37. Способ получения частиц, содержащих керамическую матрицу из оксида металла, имеющую биомолекулу, находящуюся в ее порах, где указанный способ включает:
а) объединение:
гидрофобной фазы, содержащей гидрофобную жидкость и поверхностно-активное вещество; и
гидрофильной фазы, содержащей гидрофильную жидкость и катализатор;
с образованием эмульсии, содержащей капельки гидрофильной фазы, диспергированной в гидрофобной фазе; и
b) добавление керамического предшественника к эмульсии и гидролиз керамического предшественника;
c) доведение рН гидрофильной фазы до значений в интервале, подходящем для биомолекулы;
d) добавление биомолекулы и керамического предшественника, содержащего функциональную амино группу, к эмульсии; и
e) перемешивание эмульсии по мере образования частиц внутри капелек;
где керамический предшественник содержит функциональную амино группу, способную стимулировать проникновение частиц в клетки, и
где указанная биомолекула выбрана из РНК, антисмыслового нуклеотида, антисмысловой молекулы, аптамера, ДНК, белка, гликопротеина, полипептида, углевода или смеси, или аддукта любых двух или более из указанных соединений.
38. Способ по п. 37, где указанная функциональная амино группа керамического предшественника с функциональной группой способна химически взаимодействовать, например электростатически взаимодействовать, с указанной биомолекулой.
39. Способ по п. 37, где указанным керамическим предшественником с функциональной аминогруппой является алкоксисилан с функциональной аминогруппой.
40. Способ по п. 37, где указанный керамический предшественник с функциональной аминогруппой содержит аминоалкиламиногруппу.
41. Способ по п. 40, где керамическим предшественником с функциональной аминогруппой является 3-(2-аминоэтиламино)пропилтриметоксисилан, 3-[2-(2-аминоэтиламино)этиламино]пропилтриметоксисилан, 3-(2-аминоэтиламино)пропилтриэтоксисилан или 3-[2-(2-аминоэтиламино)этиламино]пропилтриэтоксисилан или смесь любых двух или более из указанных соединений.
42. Способ по любому из пп. 37, 38, 39, 40, 41, где указанное поверхностно-активное вещество, такое как этоксилат нонилфенола, имеет ГЛБ 8-16.
43. Способ по любому из пп. 37, 38, 39, 40, 41, где указанная гидрофобная фаза дополнительно содержит вторичное поверхностно-активное вещество, такое как спирт, например, 1-пентанол.
44. Способ по любому из пп. 37, 38, 39, 40, 41, где гидрофобная жидкость содержит алкан, например, от гексана (С6) до додекана (С12), циклоалкан, такой как циклогексан, ароматические соединения, такие как толуол и бензол, и смеси, такие как керосин.
45. Способ по любому из пп. 37, 38, 39, 40, 41, где гидрофильная жидкость содержит воду, а катализатор представляет собой кислоту.
46. Способ по любому из пп. 37, 38, 39, 40, 41, где указанная биомолекула является отрицательно заряженной или имеет достаточно большой размер, который не позволяет ей проходить через поры частиц.
47. Способ по п. 37, 38, 39, 40, 41, где указанная биомолекула содержит киРНК.
48. Способ по любому из пп. 37, 38, 39, 40, 41, включающий доведение рН эмульсии до значения более чем 4, например, путем добавления основания, такого как NaOH, KOH и NH4OH, перед добавлением биомолекулы и керамического предшественника с функциональной группой.
49. Способ по любому из пп. 37, 38, 39, 40, 41, который дополнительно включает:
f) добавление агента для обработки поверхности к эмульсии после образования частиц в целях обработки поверхности частиц.
50. Способ по п. 49, где указанный агент для обработки поверхности содержит полиэтиленгликолевую цепь, связанную со связывающей группой, где указанная связывающая группа обладает способностью связывать полиэтиленгликолевую цепь с поверхностью частиц.
51. Способ по п. 50, где указанным агентом для обработки поверхности является ПЭГ-силан, такой как триалкоксисилил-ПЭГ.
52. Способ по п. 49, где агент для обработки поверхности содержит нацеливающую группу для доставки биомолекулы к мишени у пациента.
53. Способ по п. 52, где указанный агент для обработки поверхности содержит триалкоксисилил-ПЭГ, имеющий нацеливающую группу у дистального конца ПЭГ, который расположен за триалкоксисилановой группой.
54. Способ по любому из пп. 37, 38, 39, 40, 41, 50, 51, 52, 53, где полимер или комплекс-образующий агент добавляют так, чтобы они находились в порах частиц вместе с биомолекулой.
55. Способ по п. 54, где указанным полимером является полиэтиленамин, полилизин, полигистидин или вещество, обладающее эффектом протонной губки.
56. Состоящее из частиц вещество по любому из пп. 1, 2, 3, 7, 13, которое может быть использовано для лечения заболевания, расстройства или состояния у млекопитающего.
RU2013111765/15A 2010-08-16 2011-08-15 Вещества, включающие керамические частицы для доставки биомолекул RU2600841C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2010903683 2010-08-16
AU2010903683A AU2010903683A0 (en) 2010-08-16 Ceramic particles for delivery of biomolecules
PCT/AU2011/001040 WO2012021922A1 (en) 2010-08-16 2011-08-15 Particulate substances comprising ceramic particles for delivery of biomolecules

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2013111765A RU2013111765A (ru) 2014-09-27
RU2600841C2 true RU2600841C2 (ru) 2016-10-27

Family

ID=45604603

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2013111765/15A RU2600841C2 (ru) 2010-08-16 2011-08-15 Вещества, включающие керамические частицы для доставки биомолекул

Country Status (13)

Country Link
US (2) US20130259942A1 (ru)
EP (1) EP2605755B1 (ru)
JP (1) JP5968317B2 (ru)
KR (3) KR20130098340A (ru)
CN (1) CN103209688B (ru)
AU (1) AU2011291431B2 (ru)
BR (1) BR112013003505A2 (ru)
CA (1) CA2808019C (ru)
MX (1) MX2013001875A (ru)
NZ (1) NZ606493A (ru)
RU (1) RU2600841C2 (ru)
SG (1) SG187697A1 (ru)
WO (1) WO2012021922A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2757829C1 (ru) * 2020-10-28 2021-10-21 федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ульяновский государственный технический университет" Устройство сравнения двоичных чисел

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9119875B2 (en) 2013-03-14 2015-09-01 International Business Machines Corporation Matrix incorporated fluorescent porous and non-porous silica particles for medical imaging
AU2016346703B2 (en) 2015-10-30 2020-07-02 Hirofumi Takeuchi Composition stably containing single-stranded nucleic acid molecule that suppresses expression of TGF-β1 gene
CN109328249A (zh) 2016-04-05 2019-02-12 纳米医药有限公司 含有具有可释放掺杂剂的陶瓷颗粒的纳米纤维垫
CN107344125A (zh) * 2016-05-05 2017-11-14 李榕生 流体驱动方式特异的廉价的艾滋病诊断用微流控装置
GB201904336D0 (en) * 2019-03-28 2019-05-15 Sisaf Ltd A delivery system

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1645597A1 (en) * 2003-07-09 2006-04-12 Tokyo University of Science, Educational Foundation Conjugate of fine porous particles with polymer molecules and utilization thereof

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003048901A (ja) * 2001-08-09 2003-02-21 Oji Paper Co Ltd 長鎖キシロオリゴ糖組成物およびその製造方法
CA2587392C (en) * 2004-11-15 2013-02-12 Australian Nuclear Science & Technology Organisation Solid particles from controlled destabilisation of microemulsions
KR20070104563A (ko) * 2004-12-20 2007-10-26 오스트레일리언뉴클리어사이언스앤드테크놀로지오거나이제이션 생물학적 존재의 제어된 방출
EP1853318B1 (en) * 2005-02-14 2016-05-18 Australian Nuclear Science And Technology Organisation Layered nanoparticles
CA2599951A1 (en) * 2005-03-04 2006-09-14 Altairnano, Inc. Ceramic structures for controlled release of biologically active substances
CN101242814A (zh) * 2005-06-17 2008-08-13 澳大利亚核科学技术组织 包含可释放掺杂剂的粒子
EP2056794A4 (en) * 2006-08-08 2012-12-26 Univ Texas MULTIPLE ADMINISTRATION OF ACTIVE SUBSTANCES
WO2009009188A2 (en) * 2007-04-19 2009-01-15 3M Innovative Properties Company Uses of water-dispersible silica nanoparticles for attaching biomolecules
JP2009073805A (ja) * 2007-08-31 2009-04-09 National Cardiovascular Center 遺伝子導入剤、核酸複合体及び遺伝子導入材料
WO2010090596A1 (en) * 2009-02-04 2010-08-12 Agency For Science, Technology And Research Hollow silica particle with a polymer thereon

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1645597A1 (en) * 2003-07-09 2006-04-12 Tokyo University of Science, Educational Foundation Conjugate of fine porous particles with polymer molecules and utilization thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ХАРКЕВИЧ Д. А. Фармакология. Москва, Медицина, 1987, с.47-48. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2757829C1 (ru) * 2020-10-28 2021-10-21 федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ульяновский государственный технический университет" Устройство сравнения двоичных чисел

Also Published As

Publication number Publication date
RU2013111765A (ru) 2014-09-27
CN103209688B (zh) 2016-05-11
US20240325541A1 (en) 2024-10-03
CN103209688A (zh) 2013-07-17
CA2808019A1 (en) 2012-02-23
MX2013001875A (es) 2013-06-28
EP2605755A1 (en) 2013-06-26
WO2012021922A1 (en) 2012-02-23
KR20190006576A (ko) 2019-01-18
KR20130098340A (ko) 2013-09-04
KR20200134312A (ko) 2020-12-01
EP2605755A4 (en) 2015-02-25
EP2605755B1 (en) 2019-07-31
JP2013537540A (ja) 2013-10-03
BR112013003505A2 (pt) 2021-10-13
JP5968317B2 (ja) 2016-08-10
SG187697A1 (en) 2013-03-28
KR102369175B1 (ko) 2022-03-02
AU2011291431A1 (en) 2013-02-21
CA2808019C (en) 2019-12-03
NZ606493A (en) 2015-09-25
AU2011291431B2 (en) 2013-09-26
US20130259942A1 (en) 2013-10-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240325541A1 (en) Particulate substances comprising ceramic particles for delivery of biomolecules
Arsianti et al. Assembly of polyethylenimine-based magnetic iron oxide vectors: insights into gene delivery
Graf et al. Surface functionalization of silica nanoparticles supports colloidal stability in physiological media and facilitates internalization in cells
Qi et al. Quantum dot− amphipol nanocomplex for intracellular delivery and real-time imaging of siRNA
Tu et al. Mesoporous silica nanoparticle-coated microneedle arrays for intradermal antigen delivery
CN109549933B (zh) 一种pH响应的纳米载体及其制备方法与应用
Sokolova et al. Calcium phosphate nanoparticles as versatile carrier for small and large molecules across cell membranes
CN113499319A (zh) 囊封有生物活性成分的空心二氧化硅纳米粒子、其制备方法和应用
WO2006055447A2 (en) Nanoparticles having a magnetic core and a cationic organo-silane coating for the delivery of oligonucleotides
CN108434122B (zh) 聚电解质杂化中空二氧化硅纳米颗粒及其制备方法与应用
CN107029252B (zh) 一种特异性磁性Endoglin适配体成像探针系统的制备方法
CN111481673B (zh) 一种多活性组分制剂的制备方法
CN105327356B (zh) 一种磁性多聚糖纳米凝胶材料的制备方法
Bakhtiar et al. Intracellular delivery of p53 gene and MAPK siRNA into breast cancer cells utilizing barium salt nanoparticles
Cruz-Acuña et al. From oleic acid-capped iron oxide nanoparticles to polyethyleneimine-coated single-particle magnetofectins
CN112535739B (zh) 一种基于肿瘤自身微环境提高基因转染效率的纳米颗粒及其制备方法和应用
CN107158401B (zh) 一种聚乙二醇修饰的钙基纳米药物递送颗粒及其制备方法和应用
CN113786390A (zh) 负载siRNA的仿生化ZIF-8纳米传递系统，及其制备方法和应用
CN113633779A (zh) 基于表面毛刺结构纳米粒子的基因递送载体及其制备方法
Levina et al. Methods of the synthesis of silicon-containing nanoparticles intended for nucleic acid delivery
CN109718382A (zh) 一种纳米药物的制备方法、由此得到的纳米药物及其应用
CN112891564B (zh) 一种阳离子诱导自组装正电荷金纳米颗粒材料的制备方法
Xu et al. A facile approach to construct hybrid multi-shell calcium phosphate gene particles
CN108042508B (zh) 一种杆状包裹磁性氧化铁内核的放射状孔道的氧化硅纳米颗粒的制备方法及应用
CN109200294A (zh) 类病毒基因—药物共传递纳米载体及其制备方法和应用