KR20070104563A

KR20070104563A - 생물학적 존재의 제어된 방출

Info

Publication number: KR20070104563A
Application number: KR1020077016764A
Authority: KR
Inventors: 킴 수잔 핀니; 데이비드 자크; 크리스토프 진 알렉산드르 바비; 링겐 공
Original assignee: 오스트레일리언뉴클리어사이언스앤드테크놀로지오거나이제이션
Priority date: 2004-12-20
Filing date: 2005-12-20
Publication date: 2007-10-26
Also published as: JP5727445B2; EP1838289B1; CN101106978A; BRPI0519139A2; EP1838289A1; EP1838289A4; CA2591344C; US9717688B2; US20090252808A1; JP2008538217A; US20150147401A1; NZ556082A; WO2006066317A8; WO2006066317A1; JP2013047264A; JP5593030B2; US8992986B2; MX2007007373A; CA2591344A1

Abstract

생물학적 존재를 방출가능하게 봉입하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 비극성 용매 중 계면활성제의 용액을 전구체 물질 및 상기 생물학적 존재와 합하여 에멀젼을 형성하는 단계를 포함한다. 상기 에멀젼은 비극성 상에 분산된 극성 상을 포함하며, 이때 극성 상이 상기 생물학적 존재를 포함한다. 이어서 상기 생물학적 존재를 포함하는 입자가 극성 상으로부터 형성된다.

미세입자, 생물학적 존재, 단백질, 콜로이드성 실리카, 계면활성제

Description

생물학적 존재의 제어된 방출{CONTROLLED RELEASE OF BIOLOGICAL ENTITIES}

본 발명은 생물학적 존재의 봉입 및 제어된 방출을 위한 세라믹 입자에 관한 것이다.

생체분자 전달 시스템에서 요구되는 특징은 봉입, 보관 및 방출 중에 생체분자의 구조적 온전성을 유지하는 것과 적당한 방출 동역학을 가능하게 하는 작용기전을 갖는 것이다.

일반적인 한 응용분야는 단백질 약물 전달 분야이다. 단백질 약물 전달 응용분야에서 본 기술은 크게는 고분자를 기반으로 한다. 단백질과 같은 생물학적 존재를 위한 봉입제(encapsulant)로서는 고분자 기반 시스템은 몇 가지 단점이 있다;

* 고분자 제조는 화학물질 및/또는 상승된 온도의 사용을 포함할 수 있으며, 이는 단백질을 변성시킬 수 있다;

* 통상, 고분자 매트릭스로부터의 단백질의 방출 작용기전은 고분자 매트릭스의 침식 (즉, 용해)이다. 침식 (따라서 방출) 속도는 보통 고분자 입자의 화학적 환경에 의존적이다 (예를 들면, pH 의존적). 침식은 또한 분해 부산물을 발생시킬 수도 있는데, 이는 단백질을 변성시킬 것이다;

* 고분자는 통상 소수성 표면을 가지므로, 친수성 및 따라서 혈액 중에서의 증대된 안정성을 도입하기 위해서는 표면 처리를 해야 한다;

* 단백질은, 예를 들면 탈수로 인해 보관 중에 손상/변성될 수 있다;

* 고분자성 젤은 건조 중에 심각하게 수축할 수 있으며, 이는 봉입된 단백질의 압착을 초래하여, 그 형태에 변화를 초래할 수 있다.

WO 01/62232 호 (Barbe 및 Bartlett)는 생물학적으로 활성인 물질을 세라믹 봉입제 내에 함유시키는 것에 대해 개시하지만, 상기 특허에 기술된 화학은 더 큰 생체분자의 봉입 및 방출에 대해서는 이상적이지 못하다. 실리카 소구체를 형성하는 데 사용되는 규소 알콕사이드 전구체의 가수분해 시에 방출되는 단쇄 알코올은 단백질 분자를 변성시켜, 생물학적 활성의 상당한 손실을 초래하는 것으로 알려져 있다. 또한, 졸-겔 반응은 보통 산 또는 염기 촉매의 존재 하에서 수행되어서, 대부분의 생물학적 분자와 비적합성인(incompatible) pH를 초래한다. 또한 단백질은 크기 범위가 약 3000 kDa에 이르며, 직경이 10 nm를 초과할 수도 있다. 산성 조건 하에서 형성된 미세공극은 보통 이러한 크기의 분자의 방출을 허용하기에는 너무 작은 반면, 염기성 조건 하에서 형성된 중간세공(mesopore)은 더 크고 작은 단백질의 방출을 가능하게 할 수 있다. 이상적으로는, pH가 약 5 내지 8의 전형적인 생리학적 범위 내로 유지될 수 있는 시스템, 및 규소 알콕사이드의 가수분해를 촉매하기에 적당하지 않은 조건이 요구된다.

JP5 261274 호 (Lion사)는 생체분자를 세라믹 매트릭스 내에 봉입하는 방법을 기술한다. 그러나 특허된 방법에 의해 제조된 입자는 생체분자의 제어된 방출 을 위해 고안된 것이 아니다. 또한, 상기 방법은 생체분자를 극한의 pH 및 고전단과 같은 가혹한 조건에 노출시켜, 이는 민감한 생체분자, 특히 단백질을 변성시키거나, 아니면 훼손시킬 수도 있다. 또한, 상기 방법에서 사용되는 빠른 응집은 매우 폭넓고 조절되지 않은 입자크기 분포를 초래하기 쉽다.

따라서 바람직한 방출 동역학을 나타내고, 봉입, 보관 및 방출 중에 생물학적 존재의 구조적 온전성을 유지시킬 수 있는, 생물학적 존재를 위한 전달 시스템에 대한 필요성이 있다.

발명의 목적

본 발명의 목적은 상기 단점 중 하나 이상을 극복하거나 실질적으로 개선시키는 것이다. 또 다른 목적은 적어도 부분적으로 상기 필요성을 충족시키는 것이다.

발명의 개요

본 발명의 첫 번째 측면에서는, 생물학적 존재를 방출가능하게 봉입시키는 방법으로서,

- 비극성 용매 중에 분산된 에멀젼 액적을 포함하는 에멀젼을 형성시키는 단계로서, 상기 에멀젼 액적은 전구체 물질 및 생물학적 존재를 포함하는 것인 단계; 및

- 상기 에멀젼 액적으로부터 입자를 형성시키는 단계로서, 상기 입자는 상기 생물학적 존재를 그 내부 또는 그 표면에 갖게 되는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

에멀젼을 형성시키는 단계에서는, 제 1 에멀젼이 비극성 용매, 계면활성제 및 전구체 물질로부터 형성되고, 상기 생물학적 존재는 제 1 에멀젼과 합해질 수 있거나, 또는 제 1 에멀젼이 비극성 용매, 계면활성제 및 생물학적 존재로부터 형성되고, 전구체 물질이 상기 에멀젼과 합해질 수 있거나, 또는 상기 생물학적 존재가 전구체 물질과 합해지고, 얻어진 혼합물이 비극성 용매 및 계면활성제와 합해져서 에멀젼을 형성할 수 있거나, 또는 다른 첨가 순서가 채택될 수도 있다. 대안적으로는, 에멀젼을 형성시키는 단계는 계면활성제 및 비극성 용매를 수용액, 경우에 따라서는 산성 수용액과 합하여 제 1 에멀젼을 형성하고, 상기 제 1 에멀젼을 전구체 물질 및 생물학적 존재와 합하여 에멀젼을 형성시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 제 1 에멀젼은 예를 들면 마이크로에멀젼, 또는 작은 액적 크기의 에멀젼일 수 있다.

따라서 본 발명은 생물학적 존재를 방출가능하게 봉입시키는 방법으로서,

a) 비극성 용매 중의 계면활성제 용액을 전구체 물질 및 생물학적 존재와 합하여, 극성 상이 비극성 상에 분산된 에멀젼을 형성시키고, 상기 극성 상이 생물학적 존재를 포함하게 되는 단계; 및

b) 극성 상으로부터 생물학적 존재를 포함하는 입자를 형성시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 극성 상은 또한 전구체 물질을 포함할 수도 있다. 상기 방법의 단계 a)는:

c) 비극성 용매 중의 계면활성제 용액을 전구체 물질과 합하여 제 1 에멀젼을 형성시키는 단계로서, 제 1 에멀젼은 극성 상이 비극성 상에 분산되어 있고, 상 기 전구체 물질은 극성 상에 위치하는 것인 단계; 및

d) 상기 극성 상이 생물학적 존재를 포함하도록 상기 생물학적 존재를 제 1 에멀젼과 합하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 방법은 부가적으로 제 1 에멀젼의 pH를 문제의 생물학적 존재에 적절한 pH로, 즉 상기 생물학적 존재를 분해하거나 변성시키지 않은 pH로 또는 생물학적 존재의 품질을 저하시키지 않을 pH로 조정하는 단계를 포함할 수 있다. pH는 생물학적 존재가 활성인 상태, 예를 들면 생물학적으로 활성인 상태로 잔존하는 pH로 조정될 수 있다. 상기 pH는 약 1 내지 약 11, 또는 약 2 내지 11, 3 내지 11, 4 내지 11, 5 내지 11, 6 내지 11, 7 내지 11, 1 내지 9, 1 내지 7, 1 내지 6, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 7, 3 내지 9, 3 내지7, 3 내지 5, 5 내지 6, 6 내지 7, 7 내지 8, 8 내지 9, 9 내지 10, 5 내지 8, 5 내지 7, 5 내지 8.5, 10 내지 11, 5 내지 7, 8 내지 10, 8.5 내지 10, 9 내지 11 또는 8.5 내지 11, 예를 들면, 약 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5 또는 11일 수 있다. pH의 조정은 단계 d) 이전에 수행해도 된다.

상기 방법의 단계 a)는:

e) 비극성 용매 중 계면활성제의 용액을 산 수용액과 합하여 제 2 에멀젼 (경우에 따라 마이크로에멀젼 또는 작은 액적 크기의 에멀젼일 수 있는 것)을 형성시키는 단계로서, 상기 제 2 에멀젼은 극성 상이 비극성 상 중에 분산되어 있는 것인 단계;

f) 전구체 물질을 제 2 에멀젼에 첨가함에 있어 극성 상에 위치하도록 첨가 하는 단계; 및

g) 생물학적 존재를 첨가함에 있어, 극성 상이 상기 생물학적 존재를 포함하도록 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.

대안적으로는 단계 a)는:

h) 전구체 물질과 생물학적 존재를 합하여 극성 혼합물을 형성하는 단계; 및

i) 상기 극성 혼합물을 계면활성제 용액과 합하여 에멀젼을 형성시키는 단계로서, 상기 에멀젼은 극성 상이 비극성 상 중에 분산되어 있는데, 상기 극성 상이 전구체 물질 및 생물학적 존재를 포함하도록 분산되는 것인 단계를 포함할 수 있다.

이 대안예는 또한 전구체 물질의 pH를 약 1 내지 약 11, 또는 약 3 내지 11, 5 내지 11, 7 내지 11, 7.5 내지 11, 1 내지 9, 1 내지 7, l 내지 5, 3 내지 9, 3 내지 7, 5 내지 9, 5 내지 7, 7.5 내지 9,5, 8.5 내지 9, 9 내지 10, 9.5 내지 10, 9, 내지 9.5, 5 내지 8, 5 내지 7, 5 내지 8.5, 10 내지 11, 5 내지 7, 8 내지 10, 8.5 내지 10, 9 내지 11 또는 8,5 내지 11, 예를 들면 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5 또는 11로 조정하는 단계를 포함할 수도 있다. 이러한 경우, 생물학적 존재가 pH-조정된 전구체 물질의 pH에서 안정한 것이 바람직하다.

또 다른 대안예로서, 단계 a)는:

j) 생물학적 존재를 계면활성제의 용액에 첨가하는 단계; 및

k) pH가 대략 1 내지 약 11, 예를 들면 약 7.5 내지 약 11로 조정된 전구체 물질을 첨가함에 있어, 상기 에멀젼의 극성 상이 전구체 물질 및 생물학적 존재를 포함하도록 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 전구체는 세라믹 전구체를 포함할 수 있다. 콜로이드성 실리카 또는 다른 어떤 세라믹 전구체를 포함할 수 있거나, 두 가지 이상의 상이한 세라믹 전구체의 혼합물일 수 있다. 상기 생물학적 존재는 단백질을 포함할 수 있다. 효소를 포함할 수도 있다. 상기 방법은 부가적으로 단계 b) 전에 겔화 보조제를 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 겔화 보조제는 염 (예를 들면, 염화소듐) 및/또는 수용성 고분자를 포함할 수 있다. 겔화 보조제는 용액으로, 경우에 따라 수용액으로 첨가될 수 있다. 상기 방법은 적어도 부분적으로 입자를 비극성 상으로부터 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 적어도 부분적으로 분리하는 단계는 입자를 포함하는 에멀젼을 침전용 용매와 합하여 입자를 침전시키는 단계로서, 상기 침전용 용매는 상기 비극성 용매와 혼화성인 것인 단계를 포함할 수 있다. 적당한 침전용 용매는 아세톤, 에탄올 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 침전용 용매는 상기 생물학적 존재를 변성시키거나 혹은 손상시키지 않도록 선택될 수 있다. 상기 적어도 부분적으로 분리하는 단계는 부가적으로 또는 대안적으로 상기 입자를 포함하는 에멀젼을 원심분리하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 적어도 부분적으로 분리하는 단계 후에는, 입자가 건조될 수 있다.

따라서 한 실시양태에서는, 상기 방법은:

- 지르코늄 테트라알콕사이드 및 티타늄 테트라알콕사이드에서 선택된 하나 이상의 알콕사이드를 포함하고, pH가 대략 2 내지 약 4로 조정된 전구체 물질에 생 물학적 존재를 첨가하는 단계; 및

- 상기 생물학적/전구체 물질 혼합물을 계면활성제의 용액에 첨가하여, 극성 상이 비극성 상 중에 분산된 에멀젼을 형성시키는 단계로서, 상기 극성 상이 상기 생물학적 존재 및 전구체 물질을 포함하는 것인 단계; 및

- 상기 극성 상으로부터 생물학적 존재를 포함하는 입자를 형성시키는 단계를 포함한다.

또 다른 실시양태에서는, 상기 방법은:

- 수용액 중의 생물학적 존재를 계면활성제의 용액에 첨가하여, 극성 상이 비극성 상 중에 분산된 에멀젼을 형성시키는 단계로서, 상기 극성 상이 생물학적 존재를 포함하는 것인 단계;

- 실리케이트를 포함하고, pH가 대략 8 내지 약 10으로 조정된 전구체 물질을 첨가함에 있어, 상기 에멀젼의 극성 상이 상기 전구체 물질 및 생물학적 존재를 포함하도록 첨가되는 단계;

- pH를 약 6 내지 약 8로 조정하는 단계; 및

한 실시양태에서는, 상기 방법은:

a) 상기 비극성 용매 중의 계면활성제의 용액을 콜로이드성 실리카와 합하여 에멀젼을 형성시키는 단계로서, 상기 에멀젼은 극성 상이 비극성 상 중에 분산된 것인 단계;

b) 상기 에멀젼의 pH를 약 5 내지 약 11의 pH로 조정하는 단계;

c) 상기 에멀젼을 생물학적 존재와 합함에 있어, 극성 상이 생물학적 존재를 포함하도록 합하는 단계; 및

d) 상기 극성 상으로부터 생물학적 존재를 포함하는 입자를 형성시키는 단계를 포함한다.

또 다른 실시양태에서는, 상기 방법은:

a) 상기 비극성 용매 중의 계면활성제 용액을 산 수용액과 합하여 에멀젼을 형성시키는 단계로서, 상기 에멀젼은 극성 상이 비극성 상 중에 분산되어 있는 것인 단계;

b) 콜로이드성 실리카를 상기 에멀젼에 첨가함에 있어, 에멀젼의 pH가 약 5 내지 약 11이 되도록 첨가하는 단계;

c) 생물학적 존재를 에멀젼에 첨가함에 있어, 극성 상이 상기 생물학적 존재를 포함하도록 첨가하는 단계; 및

또 다른 실시양태에서는, 상기 방법은:

a) 전구체 물질 및 생물학적 존재를 합하여 극성 혼합물을 형성시키는 단계;

b) 상기 극성 혼합물의 pH를 약 7.5 내지 약 11로 조정하는 단계;

c) 상기 극성 혼합물을 계면활성제 용액과 합하여, 극성 상이 비극성 상 중에 분산된 에멀젼을 형성시키는 단계로서, 상기 극성 상은 상기 극성 혼합물을 포 함하는 것인 단계; 및

또 다른 실시양태에서는, 상기 방법은:

a) 상기 비극성 용매 중의 계면활성제 용액을, 상기 생물학적 존재를 포함하는 용액 또는 현탁액과 합하는 단계;

b) 전구체 물질의 pH를 약 7.5 내지 약 11로 조정하는 단계;

c) 상기 pH-조정된 전구체 물질을, 상기 생물학적 존재를 포함하는 용액에 첨가하여, 극성 상이 비극성 상 중에 분산된 에멀젼을 형성시키는 단계로서, 상기 극성 상은 상기 생물학적 존재 및 전구체 물질을 포함하는 것인 단계; 및

상기 첫 번째 측면의 또 다른 실시양태에서는, 생물학적 존재를 방출가능하게 봉입하는 방법으로서:

- 전구체 물질, 계면활성제 및 비극성 용매를 합하여, 에멀젼 액적이 상기 비극성 용매 중에 분산된 에멀젼을 형성시키는 단계로서, 상기 에멀젼 액적이 상기 전구체 물질을 포함하는 것인 단계;

- 생물학적 존재를 상기 에멀젼에 첨가하는 단계; 및

- 상기 에멀젼 액적으로부터 입자를 형성시키는 단계로서, 상기 입자는 생물학적 존재를 그 내부 및/또는 표면상에 갖게 되는 단계를 포함하는 방법이 제공된 다.

상기 전구체 물질, 계면활성제 및 비극성 용매를 합하는 단계는, 계면활성제와 비극성 용매를 합하고 (예를 들면, 상기 계면활성제를 비극성 용매에 용해시킴), 그 후 전구체를 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 전구체 물질은 용액, 현탁액, 분산액, 졸 또는 에멀젼일 수 있으며, 입자를 형성할 수 있을 수도 있다. 극성일 수 있다. 수성일 수 있다. 상기 입자를 형성시키는 단계는:

- 경우에 따라, 에멀젼 액적의 pH를, 상기 생물학적 존재가 안정하고/하거나 활성인 pH로 조정하는 단계; 및

- 에멀젼 액적이 입자를 형성하기에 충분한 시간 동안 기다리는 단계를 포함할 수 있다.

상기 입자를 형성시키는 단계는 탈안정화 및/또는 겔화 및/또는 전구체 물질의 응집을 포함할 수 있다. 상기 전구체 물질은 물을 포함할 수 있으며, 수용액, 현탁액, 분산액, 에멀젼 또는 졸일 수 있다. 세라믹 전구체 물질 (즉, 세라믹 물질에 대한 전구체)를 포함할 수 있다. 상기 세라믹 전구체 물질은 금속 산화물 전구체 물질, 예를 들면 금속 옥소 음이온의 수용성 염을 포함할 수도 있다. 상기 금속 옥소 음이온은, 예를 들면 실리케이트, 알루미네이트, 티타네이트, 지르코네이트 또는 다른 어떤 옥소 음이온일 수 있다. 상기 세라믹 전구체는 콜로이드성 실리카 또는 실리카 졸과 같은 실리카 전구체 물질 또는 알콕시실란 (예를 들면, 테트라메틸실란과 같은 테트라알콕시실란) 또는 금속 실리케이트 (예를 들면, 소듐 실리케이트) 또는 이들의 둘 이상의 혼합물을 포함할 수 있다. 상기 세라믹 전구체는 안정한 콜로이드성 분산액을 형성할 수 있는 임의의 함수 금속 산화물을 포함할 수 있다. 상기 산화물은 전이 금속 및 란탄계열을 포함하는 제 2 족 내지 제 4 족 원소의 산화물일 수 있다. 상기 전구체 물질은 일차 입자를 포함할 수 있으며, 일차 입자는 직경이 약 5 내지 약 500 nm, 또는 약 5 내지 약 100 nm, 또는 약 5 내지 약 50 nm일 수 있다. 상기 전구체 물질은 상이한 크기의 일차 입자의 혼합물을 포함할 수 있고, 상이한 크기의 일차 입자는, 전구체 물질을 계면활성제의 용액과 합하는 단계 전에 합해도 된다. 전구체 물질은 알칼리성일 수 있으며, pH가 약 9 내지 약 12일 수 있고, 또는 산성일 수 있어서 pH가 약 0.5 내지 약 3.5 또는 약 3.5 내지 약 5.5일 수 있고, 또는 다른 어떤 pH일 수도 있다. 상기 계면활성제는 음이온성, 양이온성, 비이온성 또는 양쪽이온성일 수 있고, 비극성 용매에 가용성일 수 있다. 상기 에멀젼은 유중수 (W/O) 에멀젼일 수 있다. 상기 에멀젼은 액적 크기가 약 0.01 내지 약 500 마이크론일 수 있다. 에멀젼 액적이 입자를 형성하기에 충분한 시간은 약 1 분 내지 24 시간, 또는 약 1 내지 12 시간일 수 있다. 에멀젼 액적으로부터 입자의 형성 중에, 에멀젼은 교반하거나, 와류하거나, 아니면 휘저을 수 있다.

상기 합하는 단계는 교반, 진탕, 혼합, 와류 또는 휘저음을 포함할 수 있다. 상기 단계는 전구체 물질을 비극성 용매 중의 계면활성제 용액과 합하는 단계를 포함할 수 있다. 생물학적 존재를 첨가하는 단계는 저전단 하에서 수행될 수 있다. 저전단은 상기 생물학적 존재의 훼손, 예를 들면 변성을 피하기에 충분하도록 낮을 수 있다. 생물학적 존재는 용액 또는 현탁액으로 첨가될 수 있다. 상기 생물학적 존재는 생체분자일 수 있으며, 예를 들면 단백질, 펩타이드, 항체, 효소, 다당류, DNA 또는 RNA 가닥 또는 단편, 또는 다른 어떤 생체분자일 수 있다.

상기 입자는 중간다공성일 수 있으며, 평균 세공 크기가 직경으로 약 1 내지 약 50 nm 일 수 있다. 이들은 복수의 일차 입자를 각각 포함하는 응집체를 포함할 수 있다. 입자는 평균 입자 크기가 약 0.05 내지 약 500 마이크론, 또는 약 0.05 내지 약 100 마이크론, 또는 약 0.5 내지 약 50 마이크론일 수 있다. 상기 입자는 넓거나, 중간이거나 좁은 입자 크기 분포를 가질 수 있다.

상기 방법은 부가적으로 하기 단계 중 하나 이상을 포함할 수 있다:

- 생물학적 존재를 첨가하는 단계 이전, 이후 또는 도중에 겔화 보조제를 첨가하는 단계;

- 상기 입자를 비극성 용매로부터 적어도 부분적으로 분리하는 단계;

- 상기 입자를 세정하는 단계; 및

- 상기 입자를 건조하는 단계.

겔화 보조제는 구형 입자의 형성을 보조하기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 겔화 보조제는 용액으로 첨가될 수 있으며, 상기 용액은 생물학적 존재를 첨가할 수도 있다. 겔화 보조제는 수용성 염, 예를 들면 염화소듐일 수 있다. 대안적으로는, 다른 어떤 물질, 예를 들면 히드록시메틸셀룰로오스 또는 히드록시프로필셀룰로오스와 같은 수용성 고분자일 수 있다. 겔화 보조제는 용액으로, 예를 들면 수용액으로, 약 0.1 내지 40% w/v의 농도로 첨가될 수 있다. 겔화 보조제가 염 인 경우, 상기 염의 용액은 약 0.5 내지 6 M일 수 있다. 상기 적어도 부분적으로 분리하는 단계는 원심분리, 여과, 미세여과, 침강 또는 다른 어떤 적당한 방법을 포함할 수 있다. 상기 세정 단계는, 유기 용매일 수 있는 세정 용매, 예를 들면 비극성 용매 또는 비극성 용매와 혼화성인 용매, 또는 극성 용매일 수 있는 세정 용매, 예를 들면 극성 유기 용매, 물 또는 수용액으로 세정하는 단계를 포함할 수 있다. 세정 단계는 반복될 수 있으며, 각 반복은 동일하거나 상이한 세정 용매를 사용할 수 있다. 각 세정 단계 후에는 입자를 세정 용매로부터, 예를 들면 여과 또는 원심분리에 의해 적어도 부분적으로 분리하는 단계가 올 수 있다. 건조 단계는 입자를 기류, 예를 들면 공기, 산소, 질소, 이산화탄소, 또는 생물학적 존재를 손상시키거나 변성시키지 않는 다른 어떤 기체의 기류에 노출시키는 단계를 포함할 수 있다. 건조 단계는 주위온도에서 또는 생물학적 존재를 손상시키거나 변성시키지 않는 다른 온도에서 수행될 수 있다. 건조 단계는 부가적으로 또는 대안적으로 생물학적 존재에 진공을 가하거나 동결건조하는 단계를 포함할 수 있다.

한 실시양태에서는, 생체분자를 방출가능하게 봉입하는 방법으로서:

- 전구체 물질 및 비극성 용매 중 계면활성제의 용액을 합하여, 비극성 용매에 분산된 에멀젼 액적을 포함하는 에멀젼을 형성시키는 단계로서, 상기 에멀젼 액적은 전구체 물질을 포함하는 것인 단계;

- 경우에 따라 에멀젼 액적의 pH를 조정하는 단계;

- 생물학적 존재 및 경우에 따라 겔화 보조제를 에멀젼에 첨가하는 단계;

- 에멀젼 액적이 입자를 형성하기에 충분한 시간 동안 기다리는 단계로서, 상기 입자는 생물학적 존재를 그 내부 및/또는 그 표면에 갖게 되는 단계;

- 입자를 세정하는 단계; 및

- 입자를 건조하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

상기 에멀젼 액적의 pH를 조정하는 단계는 생물학적 존재를 첨가하는 단계 이전에, 동시에 또는 이후에 수행될 수 있다. 가용성 염은 첨가되는 경우에는 생물학적 존재를 첨가하기 전에, 동시에 또는 이후에 첨가될 수 있다.

또 다른 실시양태에서는, 생체분자를 방출가능하게 봉입하는 방법으로서:

- 콜로이드성 실리카 및 비극성 용매 중의 계면활성제 용액을 합하여, 에멀젼 액적이 비극성 용매 중에 분산된 에멀젼을 형성시키는 단계로서, 상기 에멀젼 액적이 상기 콜로이드성 실리카를 포함하는 것인 단계;

- pH 조정 시약을 상기 에멀젼에 첨가하여 pH를 약 5 내지 11로 조정하는 단계; 및

- 생체분자의 용액 또는 현탁액을 첨가하는 단계;

- 가용성 무기 염의 용액을 첨가하는 단계; 및

- 에멀젼 액적으로부터 실리카 입자가 형성되도록 약 1 내지 약 12 시간 동안 기다리는 단계로서, 상기 실리카 입자는 그 내부 및/또는 그 표면에 방출가능하게 봉입된 생체분자를 갖게 되는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 상기 생체분자는 예를 들면 단백질, 펩타이드, DNA 단편, 항체 또는 다당류일 수 있다.

- pH 조정 시약을 상기 에멀젼에 첨가하여 pH를 약 5 내지 약 10으로 조정하는 단계;

- 생체분자의 용액 또는 현탁액을 첨가하는 단계;

- 가용성 무기 염의 용액을 첨가하는 단계;

- 에멀젼 액적으로부터 실리카 입자가 형성되도록 약 1 내지 약 12 시간 동안 기다리는 단계로서, 상기 실리카 입자는 그 내부 및/또는 그 표면에 방출가능하게 봉입된 생체분자를 갖게 되는 단계;

- 상기 실리카 입자를 비극성 용매로부터 적어도 부분적으로 분리하는 단계;

- 실리카 입자를 비극성 용매로 세정하는 단계;

- 경우에 따라, 상기 실리카 입자를 상기 비극성 용매와는 상이한 용매로 세정하는 단계; 및

- 실리카 입자를 건조하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

본 발명의 두 번째 측면에서는, 방출가능한 생물학적 존재를 포함하는 입자로서, 상기 입자는 평균 세공 크기가 직경으로 약 1 내지 50 nm이며, 평균 입자 크기가 약 0.05 내지 약 500 마이크론, 또는 약 0.05 내지 약 100 마이크론인 입자가 제공된다. 또한, 복수의 상기 입자가 제공된다. 상기 생물학적 존재는 입자 전체에 실질적으로 균질하게 분포될 수 있거나, 그 전체에 비균질하게 분포될 수 있다. 상기 입자는, 생물학적 존재가 입자로부터 방출 후에 생물학적으로 활성이 되도록 될 수 있다. 예를 들면, 상기 생물학적 존재가 효소라면, 상기 효소는 입자로부터의 방출 후에 그 효소 활성을 유지할 수 있다. 생물학적 존재는 입자로부터의 방출 후에 그의 봉입 전 활성의 약 50% 이상, 또는 그 활성의 약 60, 70, 80 또는 90% 이상을 유지할 수 있다.

상기 입자는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다:

a) 비극성 용매 중의 계면활성제 용액을 전구체 물질 및 생물학적 존재와 합하여 에멀젼을 형성시키는 단계로서, 상기 에멀젼은 극성 상이 비극성 상 중에 분산되어 있고, 상기 극성 상은 상기 생물학적 존재를 포함하는 것인 단계; 및

b) 극성 상으로부터 상기 생물학적 존재를 포함하는 입자를 형성시키는 단계.

상기 입자는 본 발명의 첫 번째 측면의 방법에 의해 제조될 수도 있다.

상기 입자는 직경이 약 5 내지 500 nm인 일차 입자의 응집체를 포함할 수 있다. 상기 입자는 생물학적 존재가 그 내부 및/또는 그 표면에 방출가능하게 봉입되어 있을 수 있다. 상기 입자 및 상기 일차 입자는 세라믹을 포함할 수 있고, 금속 산화물, 예를 들면 실리카, 지르코니아, 알루미나, 티타니아 또는 이들 중 임의의 둘 이상의 혼합물을 포함할 수 있거나, 규소, 티타늄, 지르코늄 및 알루미늄 중 임의의 둘 이상의 혼합 금속 산화물을 포함할 수 있다. 상기 입자는 중간다공성일 수 있으며, 평균 세공 크기가 직경으로 약 1 내지 50 nm일 수 있다. 상기 입자는 복수의 일차 입자를 포함하는 응집체를 포함할 수 있다. 상기 입자는 평균 입자 크기가 약 0.05 내지 약 500 마이크론, 또는 약 0.5 내지 약 50 마이크론일 수 있다. 상기 생물학적 존재는 생체분자일 수 있으며, 예를 들면 단백질, 펩타이드, 항체, 효소, 다당류, DNA 또는 RNA 가닥 또는 단편, 또는 다른 어떤 생체분자일 수 있다.

본 발명의 세 번째 측면에서는, 생물학적 존재가 그 내부 및/또는 표면에 방출가능하게 봉입된 세라믹 입자로서, 상기 세라믹 입자는 본 발명의 첫 번째 측면의 방법에 의해 제조되는 것인 입자가 제공된다.

본 발명의 네 번째 측면에서는, 생물학적 존재를 환자에게 전달하는 방법으로서, 상기 환자에게 본 발명의 두 번째 또는 세 번째 측면에 따른 하나 이상의 입자를 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 환자에 있어서 상태, 예컨대 질환을 치료하는 목적일 수 있으며, 상기 방법에 의해 상기 생물학적 존재는 상기 상태의 치료에 처방된다. 생물학적 존재는 상기 상태의 치료를 위해 처방될 수 있다. 투여는 주사, 예를 들면 정맥내, 근육내, 피하 또는 다른 어떤 유형의 주사일 수 있거나, 또는 폐, 비강, 경구 또는 경피 전달, 또는 다른 어떤 적당한 전달 방법에 의할 수도 있다. 상기 방법은 임상적으로 허용가능한 담체 내에 하나 이상의 입자를 현탁시키는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 담체는 주사에 적당하거나 폐, 비강, 경구 또는 경피 전달에 적당할 수 있다.

본 발명의 다섯 번째 측면에서는, 생물학적 존재를 액체에 전달하는 방법으로서, 상기 액체를 본 발명의 두 번째 또는 세 번째 측면에 따른 하나 이상의 입자에 노출시키는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 이 측면에서는, 상기 생물학적 존 재가 예를 들면 효소일 수 있다. 상기 생물학적 존재는 상기 액체 중에서 반응을 촉매할 수 있다.

본 발명의 여섯 번째 측면에서는, 생물학적 존재를 환자 또는 액체에 전달하기 위한, 본 발명의 두 번째 또는 세 번째 측면에 따른 입자 또는 입자들의 용도가 제공된다. 상기 용도는 상기 환자에 있어서 상태를 치료하기 위한 목적이거나, 상기 액체 중에서 반응을 촉매하기 위한 목적이거나, 다른 어떤 목적을 위한 것일 수 있다. 상기 용도는 상기 생물학적 존재의 환자 또는 액체에 대한 제어된 방출을 포함할 수 있다.

본 발명의 일곱 번째 측면에서는, 환자에 있어서 상태의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 본 발명의 두 번째 또는 세 번째 측면에 따른 입자, 또는 입자들의 용도가 제공된다. 상기 생물학적 존재는 상기 치료를 위해 처방될 수 있다. 상기 환자는 동물이거나 인간 환자일 수 있으며, 상기 동물은 포유류, 영장류, 조류 또는 다른 어떤 동물일 수 있다.

본 발명의 여덟 번째 측면에서는, 환자에 있어서 상태를 치료하기 위한 약제로서, 상기 약제는 본 발명에 따른 입자, 또는 복수의 상기 입자를 포함하며, 상기 입자 또는 입자들의 생물학적 존재가 상기 상태의 치료를 위해 처방되는 것인 약제가 제공된다. 상기 약제는 또한 하나 이상의 임상적으로 허용가능한 담체 및/또는 보조제를 포함할 수 있다. 상기 약제는 환자에게 주사되거나, 환자에게 폐, 비강, 경구 또는 경피 전달에 적당할 수 있다. 상기 담체 및/또는 보조제는 상기 환자에게 주사되거나, 폐, 비강, 경구 또는 경피 전달에 적당할 수 있다.

본 발명의 바람직한 형태를 이제 첨부된 도면을 참조하여 실시예에 의해 기술할 것이며, 여기서:

도 1은 pH ~10에서의 입자 형성 공정을 나타내는 플로차트를 나타내고;

도 2는 pH ~10에서의 구형 입자의 형성을 가능하게 하는 일부 계면활성제의 구조를 나타내고;

도 3은 각종 계면활성제를 이용하여 제조된 실리카 생성물의 주사전자현미경 사진상을 나타내고;

도 4는 다양한 계면활성제 농도를 이용하여 제조된 실리카 입자의 주사전자현미경 사진상을 나타내고;

도 5는 각종 에멀젼 용매를 이용하여 제조된 실리카 생성물의 주사전자현미경 사진상을 나타내고;

도 6은 다양한 농도의 Ludox SM-30을 이용하여 제조된 실리카 입자의 주사전자현미경 사진상을 나타내고;

도 7은 도 1에 개략적으로 나타내어진 공정을 이용한, 첨가된 Ludox SM-30의 부피에 대한 생성물 수율을 나타내는 그래프이고;

도 8은 산의 함수로서의 콜로이드성 실리카 (30 mL)의 pH의 그래프를 나타내며; (a) Ludox SM-30 및 Bindzil 30/360을 0.5 몰/L 질산으로 적정한 것; (b) Ludox SM-30을 12 몰/L의 아세트산으로 적정한 것;

도 9는 질산으로 적정된 Ludox SM-30을 이용하여 형성된 실리카 생성물의 주 사전자현미경 및 투과전자현미경 사진상을 나타내고;

도 10은 아세트산으로 적정된 Ludox SM-30을 이용하여 형성된 실리카 생성물의 주사전자현미경 사진상을 나타내고;

도 11은 다양한 유형의 콜로이드성 실리카를 이용하여 형성된 실리카 생성물의 주사전자현미경 사진상을 나타내고;

도 12는 광산란에 의해 결정되는, 도 1에 개략적으로 나타내어진 공정을 이용하여 형성된 입자의 입자크기 분포를 도시하는 그래프를 나타내고;

도 13은 입자 제조에 초음파 프로브를 사용한 본 발명의 공정에 의해 제조된 입자의 입자크기 분포를 나타내는 그래프이고;

도 14는 에멀젼 내부의 ph를 6.0으로 저하시킴으로써 형성된 실리카 입자의 주사전자현미경 사진이고;

도 15는 pH = 9.7에서 형성된 입자로부터 알칼리성 포스파타제의 방출을 나타내는 그래프이고;

도 16은 8 시간에 걸쳐 알파-카이모트립신, 서브틸리신 및 알칼리성 포스파타제의 표준화된 방출을 나타내는 그래프이고;

도 17은 pH = 6.0에서 단백질의 봉입과 함께 Span20/케로신 에멀젼을 이용한 입자 합성을 나타내는 플로차트이고;

도 18는 평균 세공 크기가 5.5 및 6.7 nm인 본 발명에 따른 실리카 입자로부터 카이모트립신, 알칼리성 포스파타제 및 우레아제의 방출을 나타내는 그래프이고 (6.7 nm 세공을 갖는 입자로부터의 우레아제의 방출은 여기에 나타내지 않았음을 유념한다);

도 19는 (◆) Bindzil 30/360, (■) Bindzil 15/500 및 (▲) 실리케이트를 이용하여 제조된 실리카로부터 서브틸리신의 방출을 나타내는 그래프이고;

도 20은 실시예 4에 개략적으로 나타내어진 바와 같은, 실리케이트, Bindzil 15/500 (6 nm) 및 Bindzil 30/360 (9 nm) 전구체로부터 만들어진 입자에 대한 세공 크기 분포를 나타내는 그래프이고;

도 21은 본 발명에 따른 실리카 입자의 주사전자현미경 사진이고;

도 22는 입자의 박편 중 C, Fe, Si 및 O의 분포를 나타내는, 페리틴이 없는 대조 시편으로부터의 STEM (주사투과전자현미경 사진) EDX 스펙트럼상이고;

도 23은 본 발명에 따른 입자의 박편 중 C, Fe, Si 및 O의 분포를 나타내는 STEM EDX 스펙트럼상이고;

도 24는 입자의 박편 중 C, Fe, Si 및 O의 분포를 나타내는, 페리틴이 없는 대조 시편으로부터의 STEM EDEX 스펙트럼상이고;

도 25는 알파-카이모트립신의 활성에 대한 본 발명의 봉입 공정의 성분의 효과를 나타내는 그래프이고;

도 26은 본 발명의 봉입 방법의 각종 화학물질을 이용한 치료 후의 서브틸리신의 활성을 나타내는 그래프이고;

도 27은 다양한 봉입 공정을 이용한 봉입 후 및 2 주 후의 알칼리성 포스파타제의 활성을 나타내는 그래프이고;

도 28은 a) HPC 2 mg/mL (◆), b) 5 mg/mL HPC (■), c) 30/360 및 소듐 실 리케이트의 1:1 혼합물 (▲)을 이용하여 제조된 (여기서 표준은 용액으로서의 효소 (●)이다), 서브틸리신을 함유하는 입자에 대한 봉입된 효소 활성의 속도를 나타내는 그래프이고;

도 29는 (A) 실온에서 및 (B) 0℃ 미만에서 보관된 본 발명에 따른 입자를 나타내는 주사전자현미경 사진상이고;

도 30은 다양한 보관 조건 하에서의 서브틸리신의 활성을 나타내는 그래프이고;

도 31은 0℃ 미만에서 2 주 동안 보관 후의 봉입된 알칼리성 포스파타제의 활성의 변화를 나타내는 그래프이고;

도 32는 본 발명에 따라 제조된 알루미나 입자의 광학 현미경 사진이고;

도 33은 본 발명에 따른 지르코노티타네이트 미세입자의 주사전자현미경 사진상이고;

도 34는 본 발명에 따른 Span 20/케로신 에멀젼을 이용하여 수득한 지르코노티타네이트 입자에 대한 입자 크기 분포를 나타내는 그래프이고;

도 35는 본 발명에 따른 지르코노티타네이트 입자로부터 브로멜라인의 표준화된 방출을 나타내는 그래프이다.

본 발명은 입자 내 생물학적 존재 (예를 들면, 생체분자 및/또는 미생물)의 봉입 및 방출에 관한 것이다. 일례로서, 상기 입자는 수성 콜로이드성 실리카 및/또는 실리케이트 염 용액으로부터 유도된 졸-겔 실리카를 포함한다. 중성 pH 근처 및 유기 화학물질의 부재는 생물학적 존재의 원래 구조를 유지하는 데 도움이 될 수 있는, 비교적 온화한 조건이다. 실리카 졸이 전구체로서 사용되는 경우에는, 그 겔은 실리카 일차 입자의 응집의 결과로서 중간다공성이 될 수 있으며, 상기 일차 입자의 크기는 세공 치수를 결정해서, 겔 다공도를 조절할 수 있게 한다. 이러한 다공도의 제어는, 압자 크기 및 형상이 또한 제어될 수 있다면, 제어된 방출 응용분야에 대한 잠재성을 제공한다. 유중수 에멀젼 중에서 단백질이 도핑된 콜로이드성 실리카를 응집시킴으로써, 본 발명자들은 생체분자 (예를 들면, 단백질)와 같은 생물학적 존재의 제어된 방출에 사용될 수 있는 제어된 크기의 구체를 생성하였다. 본 발명의 공정은, 생물학적 존재가 입자 전체에 실질적으로 균질하게 분포된 입자를 생성할 수 있다. 이는 상기 생물학적 존재의 제어된 방출을 용이하게 할 수도 있다.

본 발명에서의 사용에 적당한 용매/계면활성제 혼합물을 선택함에 있어 중요한 고려사항은 생물학적 존재의 파괴를 최소화시키고, 콜로이드성 나노입자와 현저히 상호작용할 수도 있는 물질을 피하는 것이다. 상기 비극성 용매는 용융점이 상기 생물학적 존재가 분해, 변성 또는 열화되는 온도 미만일 수 있다. 상기 온도는 생물학적 존재의 성질에 의존할 것이다. 상기 용융점은 약 60℃ 미만, 또는 약 55, 50, 45, 40 또는 35℃ 미만일 수 있다. 사용될 수 있는 적당한 용매에는 알칸, 예를 들면 장쇄 알칸이 포함된다. 상기 알칸은 선형, 분지형 또는 고리형일 수 있다. 상기 알칸은 약 5 내지 24 개의 탄소 원자, 또는 약 10 내지 24, 20 내지 24, 5 내지 20, 5 내지 10 또는 10 내지 20 개의 탄소 원자를 가질 수 있으며, 약 5, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 24 개의 탄소 원자를 가질 수 있다. 상기 용매는 상이한 화합물의 혼합물, 예를 들면 상이한 알칸의 혼합물일 수 있다. 사용될 수 있는 용매에는 도데칸, 케로신, n-헥산, 시클로헥산 및 톨루엔이 포함된다. 사용될 수 있는 기타 용매에는 할로겐화 용매가 포함된다. 상기 용매는 저극성 용매일 수 있으며, 통상 계면활성제용 용매이다. 상기 용매는 생물학적 존재를 변성시키거나, 아니면 열화 또는 분해시켜서는 안 된다. 상기 용매는 본 발명의 공정 중에 관련 조건 하에 생물학적 존재와 반응하지 않아야 한다. 용매는 저렴한 것으로 선택될 수 있다.

충분히 긴 폴리에톡시 (-O-CH₂-CH₂-) 사슬을 함유하는 계면활성제 (예컨대 Brij 52)는 실리카 구체의 형성을 방지하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들은, 이는 일차 입자 표면에 대한 수소 결합으로 인해 응집 및 겔화를 방지하는 입체적 장벽을 제공하기 때문인 것으로 추론한다. 본 발명에서의 사용에 적당한 계면활성제는 음이온성, 양이온성, 비이온성 또는 양쪽이온성일 수 있으며, 예를 들면 Span 20과 같은 소르비탄 에스테르 및 Aerosol OT와 같은 설포석시네이트를 포함할 수 있다. 겔화 pH에서 콜로이드성 입자와 동일한 전하 부호 (즉 양성 또는 음성)를 갖는 비이온성 계면활성제 또는 이온성 계면활성제가 발마직하다. 따라서 입자가 낮은 pH (예를 들면 약 pH 8 미만)에서 형성되는 경우에는, 긴 폴리에톡시 (-O-CH₂-CH₂-) 사슬을 갖는 계면활성제는 피하도록 통상 권고된다. 입자가 더 높은 pH (예를 들면 약 pH 8 초과)에서 형성되는 경우에는, 폴리옥시에틸렌 사슬을 갖는 트정 계면활성제가 적당한 입자를 생성하는 것으로 밝혀졌다. 겔화 pH는 전구체 물질의 성질에 의존할 수 있다.

상기 전구체 물질은 실리카 졸 또는 콜로이드성 실리카일 수 있으며, 부가적으로 또는 대안적으로 금속 옥소 음이온의 수용성 염을 포함할 수 있다. 수용성 염은 실리케이트, 예를 들면 소듐 실리케이트와 같은 알칼리 실리케이트일 수 있거나, 지르코네이트 또는 다른 어떤 적당한 세라믹 전구체 (즉, 세라믹 물질에 대한 전구체)일 수 있다. 적당한 전구체 물질은 약 9 nm의 일차 입자를 가지고, pH를 10에서 6으로 저하시키면 몇 시간 내에 벌크 겔을 형성하는 콜로이드성 실리카인 Bindzil 30/360 (Eka Chemicals)이다. Snowtex ST-40 (Nissan Chemicals)와 같은 유사한 크기의 기타 브랜드의 콜로이드성 실리카 또한 적당하다. Ludox SM-30 (Grace Davison) 또한 사용될 수 있으나, 이는 살생물제를 함유하므로 본 발명의 일부 응용분야에는 적당하지 않을 수도 있다. 전구체 물질은 직경이 약 5 내지 500 nm, 또는 약 5 내지 250, 5 내지 100, 5 내지 50, 5 내지 40, 5 내지 30, 5 내지 20, 10 내지 100, 20 내지 100, 10 내지 30, 10 내지 20, 100 내지 500, 100 내지 250, 250 내지 500 또는 50 내지 250 nm인 일차 입자를 가질 수 있으며, 직경이 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500 nm인 일차 입자를 가질 수 있다. 상이한 크기의 일차 입자를 갖는 전구체 물질의 혼합물이 사용될 수 있다. 기타 전구체 물질에는 알루미네이트, 지르코네이트, 티타네이트, 기타 금속 옥소 음이온, 및 이들의 혼합물이 포함된다.

본 발명의 공정은 전구체 물질과 비극성 용매 중의 계면활성제 용액을 합하여 에멀젼을 형성시키는 단계를 포함한다. 상기 에멀젼은 유중수 (W/O) 에멀젼일 수 있다. 상기 에멀젼은 액적 크기가 약 0.05 내지 500 마이크론, 또는 약 0.05 내지 250 마이크론, 0.05 내지 100 마이크론, 0.05 내지 50 마이크론, 0.05 내지 25 마이크론, 0.05 내지 10 마이크론, 0.05 내지 5 마이크론, 0.05 내지 2 마이크론, 0.05 내지 1 마이크론, 0.05 내지 0.5 마이크론, 0,1 내지 50 마이크론, 0.5 내지 50 마이크론, 1 내지 50 마이크론, 10 내지 50 마이크론, 25 내지 50 마이크론, 1 내지 20 마이크론, 1 내지 10 마이크론, 1 내지 5 마이크론, 100 내지 500 마이크론, 50 내지 500 마이크론, 250 내지 500 마이크론, 1 내지 250 마이크론, 1 내지 100 마이크론, 1 내지 50 마이크론, 1 내지 20 마이크론, 0,1 내지 100 마이크론, 0.1 내지 10 마이크론 또는 1 내지 2 마이크론일 수 있으며, 액적 크기가 약 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0,6, 0,7, 0.8, 0,9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500 마이크론일 수 있다.

계면활성제 대 비극성 용매의 비는 약 5 내지 30%, 또는 약 5 내지 20, 5 내지 15, 5 내지 10, 10 내지 30, 15 내지 30 또는 10 내지 20%일 수 있으며, 약 5, 10, 15, 20, 25 또는 30% 또는 w/w 또는 w/v 기준일 수 있다. 존재하는 물의 총 함량 (첨가되는 전구체 물질의 양을 결정하는 것)은 물:계면활성제의 몰 비로서 약 2:1 내지 10:1, 또는 약 5:1 내지 10:1 또는 약 2:1 내지 5:1 또는 약 3:1 내지 7:1일 수 있으며, 물:계면활성제의 몰 비로서 약 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 또는 10:1일 수 있다. 생체분자의 첨가량은 수용액 중 상기 생체분자의 용해도에 의존적일 수 있다. 예를 들면 실리카 1g 당 약 20 mg일 수 있다. 생체분자의 양은 적어도 부분적으로 생물학적 존재의 성질 및/또는 그의 목적하는 방출 프로파일에 따라 약 1 내지 50 mg/g 실리카일 수 있고, 약 1 내지 20, 1 내지 10, 1 내지 5, 5 내지 50, 10 내지 50, 25 내지 50, 10 내지 40 또는 10 내지 30 mg/g 일 수 있으며, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 mg/g 실리카일 수 있거나, 다른 어떤 양일 수 있다.

본 발명의 공정에 있어서, 전구체 물질은 그 내부 및/또는 그 표면에 생물학적 물질을 갖는 입자로 전환된다. 상기 입자는 다공성일 수 있으며, 평균 직경이 약 1 내지 50 nm, 또는 약 1 내지 2, 1 내지 10, 1 내지 20, 2 내지 50, 2 내지 20, 2 내지 10, 2 내지 5, 5 내지 20, 10 내지 20, 20 내지 50, 10 내지 40, 5 내지 30 또는 5 내지 10 nm인 세공을 가질 수 있으며, 세공 직경이 약 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 nm일 수 있다. 상기 입자는 직경 (예를 들면 평균 직경)이 약 0.05 내지 500 마이크론, 또는 약 0.05 내지 250 마이크론, 0.05 내지 100 마이크론, 0.05 내지 50 마이크론, 0.05 내지 25 마이크론, 0,05 내지 10 마이크론, 0.05 내지 5 마이크론, 0,05 내지 2 마이크론, 0,05 내지 1 마이크론, 0.05 내지 0.5 마이크론, 0.1 내지 50 마이크론, 0.5 내지 50 마이크론, 1 내지 50 마이크론, 10 내지 50 마이크론, 25 내지 50 마이크론, 1 내지 20 마이크론, 1 내지' 10 마이크론, 1 내지 5 마이크론, 100 내지 500마이크론, 50 내지 500 마이크론, 250 내지 500 마이크론, 1 내지 250 마이크론, 1 내지 100 마이크론, 1 내지 50 마이크론, 1 내지 20 마이크론, 0.1 내지 100 마이크론, 0.1 내지 10 마이크론 또는 1 내지 2 마이크론일 수 있고, 직경이 약 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500 마이크론일 수 있다.

목표 입자 크기의 선택을 지배하는 두 가지 요인은:

- 응집체를 구성하는 일차 입자는 봉입될 생물학적 존재 (예를 들면, 단백질)에 비교가능한 크기일 수 있다. 예를 들면, 일차 입자는 Bindzil 30/360에 있어서 약 9 nm이다. 따라서 생물학적 존재를 충분히 봉입하기 위해서는 일차 입자의 최소 개수가 필요하다.

- 단백질은 친수성 및 소수성 영역을 모두 포함할 수 있어서, 상기 단백질 분자가 유중수 에멀젼의 수상에 위치할 수 있더라도, 계면활성제/용매 경계 근처에 우선적으로 위치하여, 외부 단백질 부하 “쉘”을 형성할 수 있다. 따라서 입자내 과잉의 쓸모없는 공간(dead-space) (즉, 단백질이 수반되지 않은 공간)을 최소화하지만, 그래도 단백질을 유지하기에 충분한 일차 입자를 유지하기 위해, 약 1 마이크론의 목표 입자 크기가 적절할 수 있다.

본 발명자들은, 에멀젼에 겔화 보조제를 첨가하는 것이 실리카의 경우 구형 입자의 형성을 촉진시킬 수 있음을 발견하였다. 겔화 보조제는 염일 수 있거나, 다른 어떤 물질, 예를 들면 히드록시메틸셀룰로오스 또는 히드록시프로필셀룰로오스와 같은 수용성 고분자일 수 있다. 겔화 보조제는 용액으로서, 예를 들면 수용액으로, 약 0.1 내지 40% w/w 또는 w/v, 또는 약 0.1 내지 20, 0.1 내지 10, 0,1 내지 5, 0.1 내지 1, 0.5 내지 40, 1 내지 40, 5 내지 40, 10 내지 40, 20 내지 40, 1 내지 20 또는 5 내지 20% w/w 또는 w/v의 농도로 첨가될 수 있으며, 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0,6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40% w/w 또는 w/v의 농도의 용액으로서 첨가될 수 있다. 겔화 보조제는 수용성일 수 있으며, 용액으로서, 예를 들면 수용액으로서 첨가될 수 있다. 겔화 보조제가 염인 경우, 용액은 염이 약 0.5 내지 6 M일 수 있으며, 약 0.5 내지 3, 약 0.5 내지 1, 약 1 내지 6, 약 3 내지 6, 약 0.5 내지 2 또는 약 1 내지 2 M일 수 있고, 염이 약 0,5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5 또는 6 M일 수 있다. 겔화 보조제와 함께 인산이수소포타슘 (0.0037 - 0.015 M)을 포함시키면, pH를 5 내지 7의 범위로 유지하는 역할을 한다. 인산이수소포타슘의 농도는 0.0037 - 0.01 M, 0.0037 - 0.005 M, 0.005 - 0.015 M, 0.01 - 0.015 M 또는 0.005 - 0.01 M의 범위일 수 있고, 약 0.0037, 0.004, 0,005, 0,006, 0.007, 0.008, 0.009, 0.01, 0.011, 0.012, 0.013, 0.014 또는 0.015 M일 수 있다. 기타 완충용액도 사용될 수 있다. 겔화 보조제는 생물학적 존재의 첨가 이전, 도중 이후에 첨가될 수 있거나, 생물학적 존재와 함께 첨가될 수 있다. 겔화 보조제의 첨가량은 채택된 전구체 및 보조제의 성질에 따라 달라지지만, 콜로이드성 실리카의 경우, 겔화 보조제:실리카의 질량 비로서 통상 약 1:10 내지 1:200, 또는 약 1:10 내지 1:20의 범위이다. 겔화 보조제의 양은 약 1:10 내지 1:100, 1:10 내지 1:50, 1:10 내지 1:20, 1:20 내지 1:100, 1:50 내지 1:100, 1:100 내지 1:200, 1:100 내지 1:150, 1:150 내지 1:200, 1:20 내지 1:80, 1:20 내지 1:50, 1:10 내지 1:15, 1:15 내지 1:20 또는 1:13 내지 1:17일 수 있으며, 겔화 보조제:실리카의 질량 비로서 약 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:20, 1:140, 1:160, 1:180 또는 1:200일 수 있다.

입자가 형성되고 숙성하도록 얼마 동안 기다리는 것이 필요할 수 있는데, 입자들이 손상 없이 세정 및 건조될 수 있게 하기 위해서이다. 그 시간은 약 1 분 내지 24 시간, 또는 약 10 분 내지 24 시간 또는 약 30 분 내지 24 시간 또는 약 0.5 내지 12 시간 또는 0.5 내지 6 또는 1 내지 24 또는 6 내지 24 또는 12 내지 24 또는 1 내지 12 또는 2 내지 8 또는 4 내지 8 시간 또는 약 1 내지 60 분 또는 약 1 내지 30, 1 내지 10, 1 내지 5, 5 내지 60, 5 내지 30 또는 15 내지 30 분일 수 있고, 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 55 분 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 20 또는 24 시간일 수 있다. 상기 기다리는 시간 동안, 에멀젼은 교반, 와류, 아니면 휘저어질 수 있거나, 교반 없이 정치될 수도 있다.

입자가 형성되고 숙성된 후에는, 세정될 수 있다. 입자는 세정 전에 비극성 용매로부터 적어도 부분적으로 분리될 수 있다. 상기 적어도 부분적으로 분리하는 단계는 원심분리, 여과, 미세여과, 침강 또는 다른 어떤 적당한 방법 또는 이러한 방법 중 임의의 둘 이상의 조합을 포함할 수 있다. 세정 단계는 반복될 수 있고, 반복과정의 일부 또는 전체에 있어 상이한 세정 용매로 수행될 수 있다.

사용될 수 있는 세정 용매에는 비극성 용매, 물, 알코올 (생물학적 존재의 민감성에 따라 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 이소부탄올), 알칸, 할로겐화 알칸, 케톤, 에스테르 및 기타 일반적인 용매, 또는 이들의 혼합물이 포함된다. 세정은 입자를 세정 용매 중에 침지시키는 것을 포함할 수 있고, 입자가 침지되어 있는 세정 용매를 휘젓는 것 (예를 들면, 와류, 진탕, 교반)을 포함할 수 있고/있거나, 예를 들면 여과에 의해 상기 세정 용매를 입자 사이로 통과시키는 것을 포함할 수도 있다. 세정은 입자를 세정 용매로부터 적어도 부분적으로 분리하는 것을 부가적으로 포함할 수 있다.

입자는, 예를 들면 기류 하에서 및/또는 가열에 의해 및/또는 진공을 가해서 건조될 수 있다. 입자가 건조되는 온도는 생물학적 존재의 성질에 의존할 수 있으며, 상기 생물학적 존재가 손상되거나 변성될 수 있는 온도 미만이어야 한다. 상기 온도는 예를 들면 약 15 내지 50℃, 또는 약 15 내지 40, 15 내지 30, 15 내지 20, 20 내지 50, 30 내지 50, 또는 20 내지 40℃일 수 있고, 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50℃일 수 있다. 대안적으로는, 상기 입자는 동결건조될 수 있다. 동결건조 온도는 약 -80℃일 수 있다. 상기 온도는 약 -30℃ 미만, 또는 약 -40, -50, -60, -70, -90, -100, -120, -140, -160 또는 -180℃ 미만일 수 있다. 상기 온도는 약 -30 내지 약 -200, 또는 약 -130 내지 -150, -30 내지 -100, -30 내지 -80, -30 내지 -60, -50 내지 -100, -50 내지 -80, -100 내지 -200, -100 내지 -150, -150 내지 -200, -150 내지 -50 또는 -70 내지 -90℃일 수 있고, 약 -30, -40, -50, -60, -70, -80, -90, -100, -110, -120, -130, -140, -150, -160, -170, -180, -190, -196 또는 -200℃일 수 있다. 동결건조 압력은 예를 들면 약 1 내지 약 200 millitorr, 또는 약 1 내지 150, 1 내지 100, 1 내지 50, 1 내지 20, 1 내지 10, 10 내지 100, 10 내지 50, 50 내지 200, 100 내지 200, 150 내지 200, 100 내지 150, 50 내지 100 또는 120 내지 170 millitorr일 수 있고, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200 millitorr일 수 있다. 건조 중의 압력은 0 내지 1 대기압, 또는 0.01 내지 1 , 0,1 내지 1, 0,5 내지 1, 0.01 내지 0.5, 0,01 내지.0.1 또는 0.1 내지 0.5 대기압일 수 있고, 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0,4, 0.5, 0.6, 0,7, 0.8, 0.9 또는 1 대기압일 수 있거나, 다른 어떤 적당한 압력일 수 있다.

본 발명의 입자는 그 내부 또는 표면에 봉입된 생물학적 존재를 전달하는 데 사용될 수 있다. 상기 생물학적 존재는 치료제 물질일 수 있고, 환자에게 상기 입자를 투여함으로써 환자에게 전달될 수 있다. 이는 상기 생물학적 존재가 처방된 상태를 치료하기 위한 목적일 수 있다. 상기 상태는 질환일 수 있다. 생물학적 존재가 처방될 수 있는 상태의 예로는 단일클론 항체에 의해 치료될 수 있는 자가면역 질환, 및 암이 포함되는데, 그 치료에는 효소에 의한 전구약물의 활성화가 포함될 수도 있다. 투여는 예를 들면 유체 중 상기 입자의 현탁액의 주사에 의할 수 있거나, 경구적으로, 폐를 통해, 또는 다른 어떤 경로에 의할 수 있다. 환자는 척추동물일 수 있고, 상기 척추동물은 포유류, 유대류 또는 파충류일 수 있다. 포유류는 영장류 또는 비-인간 영장류 또는 기타 비-인간 포유류일 수 있다. 포유류는 인간, 비-인간 영장류, 말, 쥐, 소, 토끼, 양, 염소, 고양이 및 개로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 포유류는 예를 들면 인간, 말, 소, 암소, 황소, 물소, 양, 개, 고양이, 염소, 라마, 토끼, 유인원, 원숭이 및 낙타에서 선택될 수 있다.

본 발명의 입자는 또한 생물학적 존재를 액체, 예를 들면 반응 혼합물에 전달하기 위해 사용될 수도 있다. 생물학적 존재는 예를 들면 효소와 같은 촉매 물질일 수 있으며, 입자는 생물학적 존재를 반응 혼합물에 전달하여 그 촉매 물질에 의해 촉매되도록 사용될 수 있다. 일례는 서브틸리신과 같은 단백질 절단 효소를 포함하는 입자를 분말화 세탁용 세제에 혼입하여, 세제의 분산 시에 방출되도록 하는 것이다. 두 번째 예는 구강 위생 목적으로 흔히 사용되는 효소, 예컨대 글루코스 옥시다제 및/또는 락토퍼옥시다제를, 치약에 혼입될 수 있는 입자 내에 혼입시키는 것이다.

본 발명의 입자 내의 생물학적 존재의 봉입은, 상기 생물학적 존재를 고전단과 같은 유해한 환경 조건으로부터 보호함으로써, 상기 생물학적 존재의 보다 용이한 취급 또는 연장된 수명을 제공할 수 있다. 상기 봉입은 또한 생물학적 존재의 제어된 방출을 제공할 수 있는데, 이로써 상기 생물학적 존재는 환자 또는 액체에 제어된 속도로 전달된다. 상기 속도는 입자의 세공 크기를 제어함으로써 제어될 수 있다.

겔화 공정

본 발명자들은, 콜로이드성 실리카가 계면활성제 용액에 분산되면 겔화가 자발적으로 일어나고, 이어서 몇 분 후에 입자가 형성 및 숙성된다는 것을 발견하였다. 초기 콜로이드성 현탁액의 pH는 통상 약 pH 10이다. 계면활성제 용액의 첨가 전에 콜로이드성 현탁액의 pH를 저하시키는 것이 가능하지만, 구형 입자가 형성될 수 있는 pH 범위는 한정되어 있다 (채택된 콜로이드 용액/계면활성제/산에 따라 약 7.5 내지 10).

본 공정에서 사용되는 계면활성제는 예를 들면: NP-5, AOT, Span 20, Span 40, Span 60, Span 80 등일 수 있다. 사용될 수 있는 콜로이드에는: Ludox SM-30, Ludox HS-40, Bindzil 30/360, Bindzil 15/500, Snowtex 40, Snowtex UP 등이 포함된다. 바람직하게는, 상기 콜로이드성 입자는 직경이 약 30 nm 미만이어야 하지만, 어느 정도 더 큰 입자도 사용될 수 있다. 콜로이드성 실리카 및 계면활성제 농도는 폭넓을 수 있으며, 용매는 비극성 용매의 범위에서 선택될 수 있다.

콜로이드성 실리카의 물성

콜로이드성 실리카 현탁액은 음으로 하전된 비정질 실리카 입자를 물에 분산시킴으로써 제조된다. 상기 입자는 일반적으로 구형 모양이다. OH^- 이온이 입자의 표면에 존재하고, 전기이중층이 알칼리 이온에 의해 형성된다. 안정화는 음으로 하전된 입자 사이의 척력에 의해 이루어진다. 전하 균형의 교란은 응집을 일으켜서, 현탁액의 고점도 및/또는 겔화를 초래한다. 콜로이드성 실리카는 pH 변화 또는 염, 전해질, 유기 용매 또는 계면활성제의 첨가에 의해 탈안정화될 수 있다.

이러한 요인의 각각의 겔화 시간에 대한 영향은 졸의 특성 및 탈안정화를 유도하는 파라미터 모두에 의존한다. 예를 들면, 농도가 높을수록, 또는 입자 크기가 작을수록, 겔화 시간에 대한 pH의 영향은 더 커진다, 즉 겔화 시간이 더 짧아진다. 그러나 겔화 시간은 pH 조정에 사용된 산의 종류에 따라 달라진다. 유기 산은 통상 SiO₂ 농도 및 입자 크기에 따라 겔화 시간 측면에서 더 나은 안정성을 제공한다. 예를 들면, 동일한 SiO₂ 및 산 농도 하에서, 아세트산은 HCl과 같은 강산에 비해 더 느린 겔화를 초래한다. 이는, 약산으로부터는 H⁺가 더 적게 방출되어, 입자 표면상의 H⁺와 -O^- 사이의 반응을 감소시킨다는 점 때문일 수 있다.

합성 절차

pH 약 10에서 입자를 형성하기 위한 일반화된 합성 절차의 일례를 도 1에 개략적으로 나타내었다.

50 mL의 비극성 유기 용매 중 0.2 몰/L 계면활성제 용액을 제조하였다. 이어서 생물학적 존재, 예를 들면 단백질을 함유하는 콜로이드성 실리카 (pH = 9 이상) 2.16 mL를 주위온도에서 첨가하였다. 약 10 분간 교반한 후, 40 mL의 극성 용매를 첨가하여 에멀젼을 탈안정화시키고 희석하였다. 얻어진 입자를 이어서 여과제거한 후, 용매로 헹구었다. 이어서 입자를 실온에서 건조하였다.

특정 예에서는, NP-5 및 시클로헥산을 사용하여 계면활성제 용액을 제조하였고, 콜로이드성 실리카는 Ludox SM-30이었다. 아세톤을, 에멀젼을 탈안정화 및 희석시키고 입자를 세정하기 위한 극성 용매 아세톤으로서 사용하였다.

대안적으로는, 생물학적 존재를 함유하는 입자를 2000 rpm에서 3 분간 원심분리하여 에멀젼으로부터 제거하고, 이어서 입자를 케로신 및/또는 n-헥산과 같은 온화한 용매로 세정할 수 있다. 입자는 질소 기류 하에 실온에서 건조할 수 있다.

가능한 겔화 작용기전:

콜로이드 용액에는 두 가지 주요 힘: 반데르발스 힘 (FVDW) 및 정전기 힘 (FEL)이 있다. (DLVO 이론에 따르면) 총 힘 (FTOT)은 FVDW 및 FEL의 합이다. 큰 고분자를 함유하는 콜로이드 용액에서는, 힘 한 가지가 더 존재하는데, 고갈력(depletion force) FOS이다. 이러한 상황 하에서, 총 힘은 FTOT = FVDW + FEL + FOS 이다. 콜로이드의 안정성은 pH를 변화시키거나, 염을 첨가하거나 표면 활성제 등을 도입함으로써 이러한 힘을 재배열함으로써 파괴될 수 있다.

열역학적으로 안정한 마이크로에멀젼 (W/O) (이는 통상 계면활성제가 약 10 내지 약 13의 HLB를 갖는 경우에 발생한다)에서는, 계면 장력이 매우 낮다. 콜로이드 용액이 마이크로에멀젼과 혼합되면, 국소적 계면 힘이 콜로이드성 실리카로 하여금 물 액적 내에서 응집하여 큰 입자를 형성하도록 유도할 수 있다. 이러한 응집에 있어서 중요한 한 요인은 콜로이드 농도이다. 응집에 대한 작용기전은 하기와 같은 것으로 생각된다. 콜로이드 현탁액이 계면활성제 용매 혼합물에 첨가되면, 물 및 콜로이드를 함유하는 친수성 도메인이 형성된다. 물 분자의 일부는 계면활성제 분자의 친수성 머리 부분과 상호작용하여 액-액 계면에서 수화층(hydration layer)을 형성할 것이다. 이는 다수의 물 분자가 흡착 및 포집되어, 풀(pool) 내의 자유수의 양을 감소시키므로, 수조 (water pool) 내에서의 콜로이드 농도가 인공적으로 증가되어, 콜로이드의 겔화를 초래한다. 여러 파라미터, 그 중에서도 콜로이드 내 실리카 농도, 계면활성제 농도, 및 물 대 계면활성제의 몰 비가 구형 미세입자의 형성에 영향을 미칠 수 있다.

이 공정에 따라 입자를 형성하기 위해서는, 계면활성제가 그 극성 머리 부분과 수조 사이에 중간 강도의 분자 상호작용을 해야 할 필요가 있을 수 있다. 이 분자 상호작용은 계면활성제 차지면적(surfactant footprint) (A)에 의해 특징지어질 수 있는데, 이는 물 액적 표면의 표면적 (π*d², 여기서 d는 수조 직경이다)을 계면활성제 응집수(aggregation number) (N)로 나누어 계산할 수 있다.

A = (π*d²)/N

문헌에 주어진 값을 이용하여, 사용된 계면활성제의 범위에 대해 차지면적을 계산하였다. 결과를 하기에 나열한다.

액-액 계면의 반-정량적 구조 추정

	Brij 30	NP-5	Triton X-100	AOT
계면활성제 구조	C₁₂H₂₅- (OCH₂CH₂)₄OH	C₉H₁₉-C₆H₄- (OCH₂CH₂)₅OH	C₈H₁₇-C₆H₄- (OCH₂CH₂)_9.5OH	도 2 참조
응집수: N	150 (R=6.4) 45 (R=1.61) 362 (R=12.86)	210 (R=6)	140	60 (R=5) 130 (R=10)
역마이셀 직경	3 nm (R=1.34) 6 nm (R=1.34)	10 nm (R=6) 13 nm	46.5 nm (R=5.5)	4:6 nm (R=5) 6.6 nm (R=10)
차지면적: A (nm²/분자)	0.628 (R=1.61) 0.312 (R=12.86)	1.50 (10 nm 크기) 2.55 (13 nm 크기)	48.5	1.20 (R=5) 1.05 (R=10)
계면활성제의 수/nm²	1.6 (R=1.61) 3.2 (R=12.86)	0.67 (10 nm 크기) 0.39 (13 nm 크기)	0.021	0.83 (R=5) 0.98 (R=10)

R: [물]/[계면활성제] 몰 비

중간 상호작용은 분자 당 약 1 내지 약 5 nm²의 차지면적에 해당하며, 이는 10 nm² 당 약 10^-2 계면활성제 분자에 해당한다. 차지면적 값이 분자 당 약 1 nm² 미만인 임의의 계면활성제 (예를 들면, Brij 30)는 작은 크기의 수조를 갖는 지극히 안정한 마이크로에멀젼을 형성할 수 있었다. 따라서 서브마이크론 구형 입자만이 제조될 수 있다. 더 큰 차지면적 (> 분자 당 약 5 nm²)을 갖는 에멀젼 시스템은 이 공정에 의해 구형 입자를 형성하기에 적당하지 않을 수 있다.

또 다른 가설은, 계면활성제 분자 내 옥시에틸렌 단위가 서브마이크론 입자를 형성하기 위한 일차 입자의 겔화에 역할을 할 수 있다는 것이다. 계면활성제의 극성 머리 부분을 형성하는 옥시에틸렌 단위는 수소 결합에 의해 입자 표면과 상호작용을 할 수 있어서, 실리카 입자 표면과 물 사이의 상호작용에 영향을 미치고, 이는 합체 과정을 제어할 수 있다. 이는, (-OH)와 (-O^-) 사이의 개수 비가 더 높고, 따라서 수소 결합이 더 강한 낮은 pH에서, 일차 콜로이드의 합체가 선호되지 않고, 미세입자가 생성되지 않는 이유를 설명할 수 있다.

상기 가설은 마이크로에멀젼에 대해서만, 즉 계면활성제의 HLB가 약 10 내지 약 13일 때만, 충족될 수 있다. HLB가 약 9 미만인 계면활성제에 대해서는, 입자 형성의 작용기전을 다른 방식으로 이해할 필요가 있다. HLB 값이 3 내지 9의 범위인 물질이 유중수형 에멀젼을 위한 유화제로서 또는 습윤제로서 적당하다는 것은 널리 인정되고 있다. 모든 사용되는 Span 계면활성제는 동일한 친수성 머리 부분을 갖지만 상이한 친유성 꼬리 부분을 가지며, 그들의 HLB 값은 Span 80에 대한 4.3 과 Span 20에 대한 8.6 사이이다. 따라서 W/O 형 에멀젼은 이들 계면활성제에 의해 생성된다. 제시된 작용기전은 하기와 같다. 콜로이드성 실리카 수현탁액이 도입되면, 이는 액-액 계면으로 침투하고 친수성 도메인 (물 액적)을 형성하기 쉬운데, 상기 도메인 내에서는 계면 힘이 콜로이드를 안정화시키는 힘을 교란한다. 그 결과, 콜로이드 용액이 겔화하여 큰 구체를 형성한다. Span 20에 의해 형성된 입자가 Span 80에 의해 형성된 것들보다 훨씬 평활하다는 관찰내용에 대한 가능한 설명은, Span 80의 HLB가 너무 작아서 계면 힘이 매우 강하다는 것이다. 일단 콜로이드성 현탁액이 계면활성제 용액과 만나면, 콜로이드성 실리카의 겔화 속도가 빨라서, 결과적으로 더 작은 입자가 초기에 생성된다. 따라서 거친 표면을 가진 미세입자가 물 액적의 융합 및 분열을 통해 형성된다.

계면활성제 유형의 영향:시험을 거친 계면활성제를 하기 표에 나열하였다. 시클로헥산 용액 중 0.2 몰/L 계면활성제 용액을 제조하였다. Triton X-114, NP-9 및 Triton X-100 시스템에 대해서는, 0.2 몰/L 보조 계면활성제 (1-펜탄올)를 첨가하여 에멀젼 안정성을 촉진하였다. Tween 및 Span 계면활성제는 불안정한 에멀젼을 생성하였다. 절차는, 1.08 mL의 Ludox SM-30을 콜로이드성 실리카로서 첨가한 점을 제외하고는 도 1에 기재된 전형적인 합성 공정을 따랐다. 상응하는 SEM상을 도 3에 나타내었다.

계면활성제 물성 및 상응하는 생성물

NP-5, AOT 및 각종 Span 계면활성제를 이용하여 구형 미세입자가 형성되었다. Brij 30 및 NP-6에 의해 형성된 입자는 응집되는 것으로 보였다. 다른 모든 시스템은 불규칙한 모양의 생성물을 생성하였다.

구형 미세입자의 형성을 초래하는 계면활성제의 구조를 도 2에 나열하였다. 제시된 선택 규칙은 본 실험 결과를 기초로 하기에 거론할 것이다.

계면활성제 농도의 효과:

입자 형상에 대한 계면활성제 농도 효과를 조사하기 위한 계면활성제로서 NP-5를 선택하였다. 계면활성제 농도는 0.05 몰/L 내지 0.5 몰/L로 변화시켰다. 상응하는 SEM상을 도 4에 나타내었다. NP-5 농도를 0.5 몰/L 초과로 증가시키고도 여전히 구형 입자를 생성하는 것이 가능한 것으로 보인다. 그러나 최소 계면활성제 농도는 약 0.1 몰/L이며; 더 낮은 농도는 덜 구형인 입자의 생성과 함께 더 집괴화된 겔 생성물을 초래하였다.

에멀젼 용매의 효과:

도 1에 개략적으로 나타낸 전형적인 합성 절차를 이용하여, 7 가지 상이한 용매를 사용하여 실리카 입자를 생성하였다. 이들은 석유 에테르 (PE: 저분자량 탄화수소의 혼합물), 펜탄, 헥산, 옥탄, 데칸, 도데칸, 케로신 및 시클로헥산이었다. 얻어진 입자의 SEM상을 도 5에 나타내었다. 상기 상은 케로신 (중간 중량 알칸의 혼합물)과 같은 장쇄 알칸이 더 구형인 입자를 생성함을 시사하며, 알칸 사슬이 길수록 생성되는 입자는 더 작아지는 것으로 보인다.

“에멀젼 기법에 의해 제조된 실리카 분말의 크기 및 형태에 대한 반응 조건 및 용매의 효과 (Effect of reaction condition and solvent on the size and morphology of silica powder prepared by an emulsion technique)", W-Kyu Part, 등 Korean J. Ceram., 6, 229-235 (2000)에서는, 에멀젼 중 액적 크기 및 따라서 실리카 겔 입자 크기가 유기 용매의 입체 효과에 의해 상당히 영향을 받을 수 있음이 입증되었다. 이를 확인하기 위해, 저자들은 동일한 화학식을 가지나 다양한 구조를 갖는 옥탄 이성질체, 및 C_nH_2n ₊₂ 알칸 계열을 이용하여 에멀젼을 제조하였다. 옥탄 이성질체 및 알칸 군 계열에서 입자의 평균 크기는 기대한 바대로 사슬 길이가 증가할수록 감소하였다. 이소옥탄으로부터 수득된 평균 크기는 64 ㎛였고, 옥탄의 평균 크기는 46 ㎛였다. 실리카 겔 분말의 평균 크기는 사슬 길이가 증가할수록 75 ㎛에서 28 ㎛로 서서히 감소하였다. n-헥산, n-헵탄, n-옥탄, 노난 및 n-데칸을 사용하여 수득한 입자 크기는 각각 75, 51, 46, 44 및 28 ㎛이었다. 이 숫자들은 본 결과와 일치한다.

또 다른 참고문헌: “AOT 역마이셀 시스템에서의 구리 나노입자 성장 거동에 대한 용매의 효과(Solvent Effects on Copper Nanoparticle Growth Behavior in AOT Reverse Micelle Systems)", J.P. Cason 등, J. Phys. Chemi. B., 105, 2297-2302 (2001)에서는, 구리 입자 성장이 시클로헥산 용매에서보다 이소옥탄 용매에서 현저히 더 빠른 것으로 밝혀졌다. 이 참고문헌에서는 시클로헥산이 이소옥탄보다 약간 더 큰 최종 입자 크기를 지지할 수 있는 것으로 언급하였다. 이러한 의존성은 시클로헥산이 마이셀 꼬리 부분 내로 끼어 들어가고, 계면활성제 꼬리 부분을 효과적으로 용매화할 수 있는 반면, 이소옥탄의 벌크성 성질은 꼬리부분을 그만큼 쉽게 용매화하지 못한다는 사실에 기인한다.

콜로이드 농도의 효과:

다양한 양의 Ludox SM-30을, 10 mmol의 NP-5를 함유하는 에멀젼 50 ml에 첨가하여 실리카 미세입자를 생성하였다. 결과를 하기 표에 나타내며, SEM상을 도 6에 나타내었다. 이들 결과로부터, 콜로이드는 부피가 5.4 mL가 될 때까지 주로 구형 생성물을 생성한 것으로 나타났다. 콜로이드성 실리카의 양이 증가되면, 입자는 응집하기가 더 쉬워지는 것으로 보인다. 2.16 mL의 콜로이드성 실리카를 전형적 합성을 위해 선택하였다. 더 적은 수의 입자가 에멀젼에 존재하면, 입자가 덜 충돌하게 되어 응집된 생성물을 형성할 확률이 감소되는 것으로 보인다. 상기 결과는, 입자 당 계면활성제 분자의 개수가 더 적은 수의 입자에 대해 더 높아서, 집괴화의 발생을 감소시킨다는 사실에 기인할 수 있다.

밀도 (Ludox SM-30) = 1.22 g/cm³

Ludox SM-30 중 SiO₂ = 30 중량%

10 mmol의 NP-5를 사용하여 마이크로에멀젼을 제조하였다.

상기 공정으로부터의 입자 수율 대 초기에 첨가된 실리카의 양을 플롯한 도 7로부터, 생성물 수율이 Ludox SM-30 (실리카: 30 중량%; 밀도: 1.22 g/cm³)에 대해 초기에 첨가된 순수 실리카보다 약간 더 높은 것을 볼 수 있다. 부가적 질량은 흡착된 계면활성제 및 물로 인한 것일 수 있다. 콜로이드성 실리카의 높은 농도는 더 큰 중량 차이를 초래하는 것으로 보이는데, 아마도 더 많은 계면활성제가 흡착하기 때문인 것 같다.

콜로이드 pH의 효과:

도 8은 Ludox 및 Bindzil의 적정 곡선 (pH 대 산 첨가량)을 나타낸다. Ludox SM-30 (30 mL) 및 Bindzil (30/360) (30 mL)의 pH는 0.5 몰/L의 질산을 첨가함에 따라 약 5.5까지 서서히 저하되었다. 급격한 pH 저하가 5.5에서 2.0까지의 pH 범위에 걸쳐 양 시스템 모두에서 일어나며, 그 후 pH는 다시 서서히 저하된다. 반면, Ludox SM-30을 12 몰/L의 초산으로 적정하면, pH 변화는 두 가지 저하 속도를 나타내며, 그 사이의 전환은 pH 5 부근에서 일어난다. 적정 중에 (약 2 시간) 상기 시스템 중 어느 것에서도 겔화는 일어나지 않았다. 그러나 Ludox SM-30을 2 몰/L의 질산으로 적정하였을 때, 4 mmol의 HNO₃을 첨가하자 콜로이드가 겔화하였다. 그 시점에서 pH는 6.65였다. 이는 콜로이드 농도 효과로 인한 것일 수 있다.

도 9는 질산으로 적정된 Ludox SM-30에 의해 형성된 실리카 생성물의 SEM상 및 TEM상을 나타낸다. pH가 9를 초과하면, 구형 생성물이 제조되었다. pH 9 미만에서는, 도 9d 및 e에 나타난 바와 같이 콜로이드성 실리카가 겔화하였지만 구형 입자는 형성하지 않았다.

반면, Ludox SM-30의 pH를 아세트산을 이용하여 저하시키면, pH가 9 초과인 경우에는 대부분의 입자는 구형이었다 (도 10a 및 b). 이는 질산을 이용한 적정의 결과와 일치한다. 이는, 콜로이드의 응집이 매질 pH에 강하게 의존적이지만 pH를 저하시키기 위해 사용된 산의 성질에는 비의존적이기 때문일 수 있다. 불규칙한 형상의 생성물이 pH 8.57에서 제조되었다 (도 10c). pH 7.754, 6.707, 5.869 및 5.378에서는 고체 생성물이 제조되지 않았다.

콜로이드 유형의 효과:

1.62 mL의 다양한 콜로이드성 실리카의 첨가를 이용하여, 전형적인 합성 절차를 따랐으며, 결과는 하기 표에 나열된 바와 같다. 상응하는 SEM/TEM상을 도 11에 나타내었다. Ludox SM-30, Ludox HS-40, Bindzil 30/360, Bindzil 15/500, Snowtex 40 및 Snowtex UP는 미세입자를 형성한 반면, Ludox TM-50, Snowtex 50 및 Snowtex 20L은 집괴화된 생성물 (약 500 nm의 구형 입자)를 생성하였다. Snowtex ZL은 응집된 생성물 (초기 콜로이드 약 70 내지 100 nm)을 형성하였다. Snowtex N은 겔화하지 않았는데, 이는 콜로이드 현탁액 중에 공급자에 의해 이미 혼입된 표면 활성제가 일부 있음을 시사할 수도 있다.

상이한 콜로이드성 실리카에 대한 콜로이드 물성 및 상응하는 생성물

입자 크기 분포:

생성된 입자의 크기 분포는 광산란에 의해 (예를 들면, Malvern Mastersizer 2000을 이용하여) 구할 수 있다. 전형적인 합성법을 이용하여 제조된 실리카 입자의 크기 분포가, 1.62 mL에서 5.40 mL까지 변하는 Ludox SM-30의 양과 함께 도 12에 나타나있다. 일반적으로, 세 개의 구별된 피크가 30 nm에서 100 ㎛까지 나타난다. 약 130 nm에 중심한 가장 작은 피크는 콜로이드 농도에 비의존적인 것으로 보인다. 중간 피크는 Ludox 농도가 증가함에 따라 1.45 ㎛에서 2.2 ㎛까지 약간 증가하였다. 가장 큰 피크 (1-100 ㎛)는 2.62 mL의 Ludox에 대한 17.4 ㎛에서, 23 ㎛ (3.24 mL의 Ludox), 26 ㎛ (4.32 mL의 Ludox) 및 5.40 mL의 Ludox에 대한 30 ㎛까지 변화하였다. 사용된 콜로이드 현탁액의 부피의 증가는, 물 대 계면활성제 비의 증가 및 물 액적의 크기의 증가로 인한 입자 크기의 증가를 초래하였다.

입자 크기 분포를 감소시키기 위해서는, 더 많은 에너지가 시스템에 공급될 수 있다. 이는 예를 들면 더 빠른 교반 또는 전단 혼합을 이용하여 달성될 수 있다. 도 13은 실시예 3에 기재된 방법 (효소 무첨가)을 이용하여 Bindzil 30/360으로부터 제조된 입자에 대해 수득된 입자 크기 분포를 나타내는데, 에멀젼을 혼합하기 위해 교반을 사용한 대신에 과정의 첫 한 시간 동안 초음파 프로브를 이용하여 시스템의 교반 상태를 증가시킨 것이다. 상기 초음파 프로브는 2 초당 1 초의 펄스로 작동시켰다 (50% 작동 사이클). 1 시간 후에, 프로브를 에멀젼으로부터 제거하고, 합성의 나머지 5 시간에 대해 교반을 시작하였다. 입자 크기는 전형적인 크기 범위로부터 명백히 감소되었으며 (도 12에 나타냄), 약 1 마이크론을 중심으로 한다. 큰 입자가 적은 비율로 존재하였다. 증가된 에너지 입력으로 인해, 초음파 1 시간 후에는 시스템의 온도가 60℃까지 현저히 증가하였다. 이는 대부분의 단백질에 대해서는 명백히 적절하지 못하지만, 초음파 프로브 작동 사이클의 조정에 의해, 또는 온도를 저하시키기 위해 빙냉조를 사용함으로써 변경될 수 있다.

단백질의 봉입

특정 단백질은 그 pKa에 따라 높은 pH에서 봉입될 수 있다. 알칼리성 포스파타제는 pKa가 9.5이며, 완전한 효소 활성을 유지하면서 이 효소를 봉입하는 절차를 실시예 1 (하기 참조)에 나타내었다. 그러나 효소의 대부분이 중성 pH 근처에서 최적 활성을 갖는다. 상기한 바와 같이 계면활성제 용액에 첨가하기 전에 콜로이드성 전구체의 pH를 저하시키는 것이 가능하며, pH = 7.5로 저하된 콜로이드에 알파-카이모트립신, 서브틸리신 및 알칼리성 포스파타제를 봉입하는 방법을 실시예 2 (하기 참조)에 기재하였다. 그러나 본 발명자들은 수성 전구체를 계면활성제 용액에 첨가하여 에멀젼을 형성한 후, 산을 첨가하여 pH를 적당한 값으로 저하시키고, 이어서 생물학적 존재를 첨가함으로써 도핑된 입자를 형성할 수 있음을 발견하였다. 입자는 pH 10에서 첨가 후에 신속하게 형성되지만, 본 발명자들은 상기 입자가 형성 직후에는 완전히 조밀하지 않고, 따라서 입자가 에멀젼의 물 액적 중에서 숙성함에 따라 단백질 또는 기타 생물학적 존재가 입자 내로 주입될 수 있는 것으로 추론한다. 통상, 물 액적 내 pH는 단백질의 첨가 전에 6.0으로 저하되었다. 이 방법으로 이용하여 다양한 크기의 효소, 알파-카이모트립신 (약 25 kDa), 서브틸리신 (약 27 kDa), 알칼리성 포스파타제 (약 160 kDa) 및 우레아제 (약 480 kDa)를 봉입하였다. 이 봉입법 (즉, 에멀젼 내부의 pH를 6.0으로 저하시킴)의 대부분에서 사용된 계면활성제는 Span 20이었으나, AOT도 사용되었으며, 두 경우 모두에서 유사한 입자가 형성되었다. Span 20과 함께 이 방법을 이용하여 형성된 입자의 전형적인 SEM상을 도 14에 나타내었다.

상이한 크기의 콜로이드성 전구체입자의 평균 세공 크기에 영향을 미치는 것을 포함하여, 상기와 같은 입자로부터의 알파-카이모트립신, 알칼리성 포스파타제 및 우레아제의 방출 속도를 조정하는 작용기전을 실시예 3 (하기 참조)에서 조사하였다. 실시예 4 (하기 참조) 또한 서브틸리신의 방출량을 제어하기 위한 상이한 크기의 콜로이드 용액의 사용을 기술한다. 페리틴 분자의 위치를 맵핑하기 위해 절단면 TEM을 이용하여 미세입자 내 페리틴의 분포를 실시예 5 (하기 참조)에서 조사하였다. 서브틸리신의 활성에 대한 봉입 공정의 효과를 실시예 6 (하기 참조)에서 조사하였다. 서브틸리신 및 알칼리성 포스파타제의 보관 안정성의 연구를 실시예 7 (하기 참조)에 기술하였다. 대안적 세라믹 (즉, 실리카 이외의 것) 매트릭스 내 효소의 봉입은 실시예 8 (하기 참조)에 기술하였다.

실시예 1. pH = 9.7에서의 알칼리성 포스파타제의 봉입

0.5 mL의 0.5 몰/L 질산을 10 mL의 Bindzil 30/360에 첨가하여 pH 9.7로 하였다. 알카리성 포스파타제 (pH = 9.5에서 400 ㎕의 완충액에 8 mg을 용해시킴)를 2.5 mL의 상기 콜로이드성 실리카 현탁액과 혼합한 후, 50 mL 케로신 중 Span 20 용액 (0.2 몰/L)에 교반과 함께 첨가하였다. 약 10 분간 교반한 후, 입자를 2000 rpm에서 3 분간 원심분리하여 분리하였다. 얻어진 입자를 케로신으로 1회 세정한 후, 헥산으로 3회 세정하고 (각 세정 후에는 상층액을 고체로부터 분리하기 위해 원심분리를 이용하였음), 이어서 질소 기류 하에서 실온에서 건조한 후, 냉동고에 보관하였다.

알칼리성 포스파타제를 대략 0.6% (중량)의 단백질의 부하로 봉입하였다 (단백질 함량 결정에 대해서는 하기 방법을 참조). 효소 활성은 건조 직후에 측정하였고, 용액 중 자유 효소의 활성보다 실제로 더 높은 것으로 밝혀졌다. 이는 기술한 바와 같은 봉입 공정이 상기 단백질을 어떤 유의미한 정도로도 변성시키지 않았음을 나타낸다.

도 15는 상술한 바와 같이 pH = 9.7에서 봉입된 알칼리성 포스파타제의 방출 속도를 나타낸다.

단백질 함량 결정

미세입자의 단백질 함량, 및 미세입자로부터 방출된 단백질의 정량화는 하기와 같은 비신코닌산 (BCA) 분석법을 이용하여 구하였다:

표준 분석법:

시약 A: 소듐 비신코니네이트 (0.1 g), Na₂CO₃2H₂O (2 g), 소듐 타르트레이트 (이수화물) (0.16 g), NaOH (0.4 g), NaHCO₃ (0.95 g), 100 mL로 채움. 필요한 경우, NaOH를 사용하여 pH를 11.25로 조정.

시약 B: CuSO₄5H₂O (0.4 g), 10 mL로 채움.

표준 작업 시약 (standard working solution; SWR) = 100 부피의 시약 A + 2 부피의 시약 B

방법:

미세입자 내 단백질의 정량화:

단백질 함유 미세입자 (20 mg)을 인산염 완충 식염수 (PBS 용액) (400 ㎕)에 현탁시키고, 현탁액을 5 분간 초음파 처리하였다. 상기 현탁액의 샘플 (50 ㎕)을 세 번 취하고, SWR (1 mL)와 합하여 60℃에서 60 분간 인큐베이션하였다. 시료를 3000 rpm로 5 초간 원심분리하고, 용액의 흡광도를 562 nm에서 측정하고, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 및 1.0 mg/mL의 일련의 표준액의 흡광도와 비교하였다.

미세입자로부터 방출된 단백질의 정량화:

단백질 함유 미세입자 (100 mg)을 PBS 용액 (2 mL)에 현탁시키고, 교반하였다. 필요한 시점에 현탁액을 원심분리하고, 샘플 (50 ㎕)을 제거하였다. 각 시점에서의 샘플을 SWR (1 mL)와 합하고 60℃에서 60 분간 인큐베이션하였다. 샘플 흡광도를 562 nm에서 측정하고, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 및 1.0 mg/mL의 일련의 표준액의 흡광도와 비교하였다.

실시예 2. pH = 7.5 (에멀젼 내에서는 pH = 6으로 저하)에서의 알파-카이모트립신, 서브틸리신 및 알칼리성 포스파타제의 봉입

알파-카이모트립신, 서브틸리신 및 알칼리성 포스파타제를, 하기 방법을 사용하여 Bindzil 30/360로부터 형성된 입자 내에 봉입하였다; 4.5 g의 Span 20을 30 ml의 케로신에 교반과 함께 용해시켰다. 1.25 ml의 Bindzil 30/360을 158 ml의 1 M HCl과 혼합하여 pH를 10에서 7.5로 저하시켰다. 4 mg의 단백질을 200 ㎕의 물에 용해시킨 후, 교반과 함께 상기 Bindzil 용액에 분산시켰다. 이어서 상기 단백질을 함유하는 전구체 용액을 상기 에멀젼에 첨가하였다. 수 분간 교반한 후, 72 ㎕의 1 M HCl을 첨가하여 추가로 pH를 6.0로 저하시켰다. 최종적으로, 175 ㎕의 염 용액 2 (조성에 대해서는 실시예 6 참조)를 에멀젼에 첨가하였다. 6 시간 교반 후, 에멀젼을 원심분리하고, 고체를 케로신으로 1회 세정한 후, 헥산으로 2회 세정한 후, 밤새 건조하였다.

100 mg의 샘플을, 서브틸리신 및 알파-카이모트립신의 경우에는 2 ml의 PBS에 분산시키고, 알칼리성 포스파타제의 경우에는 에탄올아민 완충액 (pH = 9.5)에 분산시켰다. 특정 시점에 샘플을 10,000 rpm으로 10 초간 돌리고, 50 ㎕를 제거하였다. 단백질 함량을 실시예 1에 기술한 바와 같이 구하고, 방출 곡선을 계산하였다. 도 16은 8 시간에 걸친 알파-카이모트립신, 서브틸리신 및 알칼리성 포스파타제의 방출을 나타낸다. 신속한 방출 (10 분 후에 거의 완전히 방출됨)은 본 방법을 이용하여 형성된 큰 세공 크기 (8.7 nm)로 인한 것으로 보인다 (하기 실시예 4의 기재 참조).

실시예 3. pH = 6.0에서의 알파-카이모트립신, 알칼리성 포스파타제 및 우레아제의 봉입

알파-카이모트립신,알칼리성 포스파타제 및 우레아제를, 하기 방법을 이용함으로써 Bindzil 30/360으로부터 형성된 입자 내에 봉입하였다:

입자 합성을 기술하는 흐름도를 도 17에 나타내었다. 방출 속도는 실시예 1에 기술한 바와 같이 측정하였다. 케로신 (120 mL) 중 Span 20 (18 g)의 용액을 Bindzil 30/360 콜로이드성 실리카 (3.0 mL; pH 10)와 합하고, 약 500 rpm으로 교반하여 백색 에멀젼을 생성하였다. 이 경우, 생체분자 (단백질)는 에멀젼에 첨가하기 전에 염 용액에 용해시켰다. 생체분자 및 염의 용액 (1.69 ml)의 첨가 및 염산 (0.48 mL, 1 M)을 이용한 pH의 조정으로 pH 약 6의 백색 에멀젼을 제공하였다. 6 시간 동안 교반한 후, 입자를 2000 rpm으로 원심분리하여 분리하고, 추가로 케로신으로 세정하고, 이소프로판올로 2회 세정한 후, 질소 기류 하에서 건조하였다. 얻어진 분말은 생체분자를 봉입하였다.

실리카 내 세공의 크기를 증가시키기 위해 Bindzil 30/360 및 Snowtex ZL의 혼합물을 채택하였다. Snowtex ZL은 70 내지 100 nm의 콜로이드성 입자로 구성되어 있는데, Bindzil 30/360의 9 ml 콜로이드성 입자보다 상당히 더 크다. 알파-카이모트립신, 알칼리성 포스파타제 및 우레아제를 하기 방법에 의해 Bindzil 30/360 및 Snowtex ZL의 혼합물로부터 형성된 입자 내로 봉입하였다:

18 g의 Span 20을 120 mL의 케로신에 교반과 함께 용해시켰다. 1.5 mL의 Bindzil 30/360를 1.5 mL의 Snowtex-ZL과 혼합하고, 상기 에멀젼에 교반과 함께 첨가하였다. 30 mg의 단백질을 0.31 mL의 1 M HCl 및 0.422 ml의 진한 염 용액 (4 배로 농축시킴)의 용액에 용해시키고, 상기 에멀젼에 첨가하였다. 6 시간 후에, 고체를 원심분리에 의해 제거하고, 케로신 및 이소프로판올로 세정하고, 밤새 건조하였다. 방출 속도를 실시예 1에 기술한 바와 같이 측정하고, 도 18에 나타내었다. Bindzil 30/360/Snowtex ZL 혼합물로부터의 우레아제의 방출은 여기서 재현되지 않는데, 그 이유는 흡수 용액의 탁함이 단백질 정량화를 방해하였기 때문이다. Bindzil 30/360/Snowtex ZL 입자 (Bindzil 30/360 입자에 대한 5.5 nm와는 반대되게, 평균 DFT 세공 크기가 6.7 nm임)로부터의 알파-카이모트립신 및 알칼리성 포스파타제의 증가된 방출은 더 큰 세공이 효소의 방출 속도에 상당한 영향을 미침을 나타낸다.

Bindzil 30/360 및 Bindzil 15/500를 모두 이용한 입자의 제조는 실시예 4에 개략적으로 나타낸 방법을 이용하여 수행하였으나, 염 용액의 첨가는 하지 않았다. 생성물은 크게는 구형 입자로 이루어졌으며, 적은 비율의 비-구형 물질이 있었다. 입자 크기 및 다공도 측정은 입자의 크기 및 내부 미세구조가 염 용액을 이용하여 제조된 것과 거의 동일하다는 것을 나타내었다. 염을 이용하여 제조한 입자 및 이용하지 않고 제조한 입자의 비교는, 염을 첨가하는 데 두 가지 주요 장점이 있음을 시사하였다. 첫 번째는 비-구형 물질의 비율을 감소시키는 것이다. 두 번째는 염의 첨가가 더 높은 수율의 단백질 봉입을 초래한다는 것이다. 생물학적 존재로서 알칼리성 포스파타제의 경우, 염 용액 첨가 단계를 생략하면, 단백질 부하가 40% 감소되었다 (동일한 초기 양의 수성 콜로이드 및 효소 용액에 대해 1.5 중량%로부터 1.1 중량%로). 염 용액은, 더 큰 일차 입자 (10 내지 20 nm)를 포함하는, Snowtex-40과 같은 콜로이드 용액을 겔화할 때 더욱 중요해질 수 있다. 그러나 특히 염의 존재가 문제를 일으킬 수 있는 상황 하에서는, 생략될 수도 있다.

200 mL 중 염 용액 조성 (진한 염 용액에 대해서는 50 mL):

0.1 g KH₂PO₄

0.2 g NH₄Cl

0.21 g Na₂SO₄

0.223 g CaCl₂

1.2 g 락트산소듐

0.06 g 시트르산소듐

4.1 g NaCl

1.973 g MgCl₂6H₂O

실시예 4: pH = 6.0에서의 서브틸리신의 봉입. 세공 크기 효과의 결정.

Bidnzil 30/360을 이용하여 제조된 입자로부터 서브틸리신의 방출 속도 측정은, 단백질 방출의 대부분이 0.02 M PBS 용액 중 분말의 침지 후 1 시간 이내에 일어났음을 나타내었다. 세공 크기를 감소시키는 한 가지 가능한 방법은 실리카 전구체로서 더 작은 콜로이드를 사용하는 것이다. Bindzil 30/360는 9 nm 실리카 입자를 30 중량% 용액으로 포함한다. Bindzil 15/500은 6 nm 실리카 입자를 15 중량% 용액으로 포함한다. pH를 6.0으로 저하시키는 데 필요한 산의 양에는 작은 차이가 있다 (Bindzil 30/360 1 mL 당 0.183 mL에 비교하여, Bindzil 15/500 1 mL 당 0.115 mL의 1 M HCl). 이 생성물의 다공도를 하기에 거론한다.

대안적으로는 소듐 실리케이트 용액을 콜로이드성 실리카 대신에 전구체로서 이용할 수 있다. 구형 입자는 먼저 9 g의 Span 20, 60 mL의 케로신, 및 1 mL의 4 M HCl을 함유하는 에멀젼을 제조함으로써 생성하였다. 1 ml의 소듐 실리케이트 용 액 (27%)을 첨가하여, 크기 범위 약 1 내지 100 마이크론의 구형 입자를 형성시켰다. 그러나 이 제조 공정은 극한의 pH와 만나게 되므로 단백질의 봉입에는 적당하지 않다. 소듐 실리케이트 용액의 pH 저하는 즉각적인 침전을 초래한다. pH를 저하시키기 위해서는, 소듐 실리케이트 용액을 희석시키고, 이온 교환 수지를 이용하여 소듐 함량을 감소시킬 필요가 있다.

탈이온화 실리케이트 용액의 제조예:

33 mL의 소듐 실리케이트 용액 (27%)을 증류수를 이용하여 99 mL로 희석하였다. 34.5 g의 듀오라이트(Duolite) 양이온 교환 수지 (H+ 형태)를 교반과 함께 첨가하여 pH를 11.45로 저하시켰다. 듀오라이트 수지를 여과에 의해 제거하고, 31.16 g의 신선한 수지를 첨가하여 pH를 9.8로 저하시켰다.

20 g의 Span 20을 교반과 함께 135 mL의 케로신에 용해시켰다. pH = 9.8의 실리케이트 용액 6 ml를 첨가하고 몇 분간 교반하여 계면활성제 혼합물에 분산시켰다. 1 mL의 1 M HCl를 첨가한 후, 에멀젼을 교반하면서 두었다. 6 시간 후, 고체를 원심분리에 의해 제거하고, 케로신 및 에탄올 (X2)을 이용하여 세정하였다. 동결건조된 샘플의 평균 세공 크기를 하기 표의 다른 콜로이드성 전구체의 것과 비교하였다.

서브틸리신의 봉입:

4.5 g의 Span 20을 30 mL의 케로신에 용해시키고, 용해되도록 교반하였다. 1.25 mL의 Bindzil 15/500 또는 Bindzil 30/360를 혼합물에 첨가하여 에멀젼을 형성시켰다. 상기 에멀젼을 1 M HCl로 산성화 (Bindzil 15/500에 대해서는 144 ㎕, 및 Bindzil 30/360에 대해서는 198 ㎕)한 후, 200 ㎕의 물 중 10 mg의 서브틸리신 및 98 ㎕의 염 용액 4를 첨가하였다. 반응물을 5 시간 동안 교반하였다. 입자를 원심분리에 의해 단리하고, 케로신 및 시클로헥산으로 2회 세정하고, 질소 기류 하에서 건조하여 담백색 분말을 얻었다.

서브틸리신을 하기 방법에 의해 실리케이트 입자 내에 봉입하였다:

18 g의 Span 20을 120 mL의 케로신에 교반과 함께 용해시켰다. 200 ㎕의 물 중 8 mg의 서브틸리신의 용액을 상기 계면활성제 용액에 첨가한 후, 상기 기술한 바와 같이 제조된 4 ml의 탈이온화 실리케이트를 첨가하였다. 0.67 mL의 1 M HCl를 첨가하여 pH를 7.2로 저하시켰다. 상기 용액을 6 시간 동안 교반한 후, 고체를 원심분리에 의해 제거하였다. 입자를 케로신으로 1회 세정한 후, 헥산으로 2회 세정하고 (각 세정 후에는 원심분리하여 상층액을 제거함), 밤새 건조하였다.

도 19는 Bindzil 30/360, Bindzil 15/500, 및 상기 개략적으로 나타낸 바와 같이 합성된 실리케이트 미세입자로부터 서브틸리신에 대한 방출 곡선의 그래프를 나타낸다. 상기 방출 곡선은 유사한 형태지만, 방출된 총 백분율은 입자의 세공 크기에 따라 달라진다. 도 20은 본 실시예에서 사용된 세 개의 상이한 샘플에 대한 세공 크기 분포를 나타낸다. 세공 크기가 작을수록, 입자로부터 방출된 단백질의 전체 백분율은 낮아진다. 사용된 전형적 전구체의 평균 세공 크기를 하기에 표로 나타내었다.

입자 다공도

밀도 기능성 이론 (Density Functional Theory; DFT)을 이용하여 질소 흡착 데이터를 모델링하였는데, 상기 이론은 기체 흡착의 거동을 분자 수준으로 기술하며 광범위한 세공 크기를 모델링하기에 적합하다. 원통형 모양의 세공으로 추정하였다. 평균 세공 크기를 다양한 실리카 전구체에 대해 표로 요약하고, 하기에 표시하였다. 평균 세공 크기는 초기 콜로이드성 입자의 크기 및 겔화 pH에 의해 결정되는 것으로 보인다. 달리 명시되지 않는 한, 상기 제조에 사용된 계면활성제는 Span 20이었다.

실리카 전구체	일차 입자 크기 ( nm )	평균 DFT 세공 크기 ( nm )
실리케이트 용액 (9%)	----	2.1
Bindzil 15/500 - 에멀젼으로서 pH = 6.0으로 저하됨	6	2.7
Bindzil 30/360 - 에멀젼으로서 pH = 6.0으로 저하됨	9	5.5
Bindzil 30/360 - 에멀젼으로서 pH = 6.0으로 저하됨. 계면활성제 = AOT	9	5.8
Bindzil 30/360 - 벤치 상에서 pH = 7.5로 저하된 후, 에멀젼으로서 6.0으로 저하됨.	9	8.7
Bindzil 30/360 - 에멀젼으로서 pH = 10	9	5.9
Ludox SM-30 - 에멀젼으로서 pH = 6.0으로 저하됨	7	6.2
Snowtex-40 - 에멀젼으로서 pH = 6.0으로 저하됨	(10-20)	7.1
Bindzil 30/360 (60%) + Snowtex ST-50 (40%) - 에멀젼으로서 pH = 6.0으로 저하됨	9+(20-30)	6.2
Bindzil 30/360 (50%) + Snowtex ZL (50%) - 에멀젼으로서 pH = 6.0으로 저하됨	9+(70-100)	6.7
Snowtex ZL* - 에멀젼으로서 pH = 6.0으로 저하됨	70-100	45

* 폴리에틸렌 이민 용액의 첨가 시 콜로이드가 겔화됨.

실시예 5. 미세입자 내 페리틴의 분포

본 발명자들은, 단백질 분자 내 소수성 영역의 존재로 인해, 단백질이 물 액적의 내부에서보다 에멀젼의 계면 영역에 잔존하는 경향이 있을 수 있다는 가능성을 고려하였다. 이러한 배향 효과는 단백질이 에멀젼 액적 내부에서 형성되는 미세입자의 외부 쉘에 봉입되도록 할 수 있음을 고려하였다. 입자의 몸체 전체에 대한 봉입된 단백질의 분포를 조사하기 위해, 실리카 입자를 페리틴으로 도핑하였는 데, 페리틴은 철 코어를 함유하고, 따라서 투과전자현미경 (TEM)에 의해 쉽게 검출가능해야 한다.

제조 세부사항: Span 20 (1.8 g)을 케로신 (12 mL)에 용해시켰다. 페리틴 용액 (약 100 mg/mL, 126 ㎕)을 Bindzil 30/360 (300 ㎕)과 혼합하였다. 이 혼합물을 이어서 상기 계면활성제 용액에 500 rpm으로 교반하면서 적가하였다. HCl (1 M, 480 ㎕) 및 진한 염 용액을 혼합하였다. 91 ㎕의 상기 용액을 상기 에멀젼에 첨가하였다. 에멀젼을 2.5 시간 동안 교반하면서 두었고, 그 때 반응 용개의 바닥에 고체 물질이 나타났다. 혼합물을 원심분리 (2000 rpm, 3 분)하고, 고체를 케로신으로 1회, 및 이소프로판올로 2회 세정하였다. 고체 물질을 질소 기류 하에서 건조하였다. 최종 분말은 황토색이었으며, 이는 페리틴이 입자 내에 성공적으로 봉입됨을 나타낸다.

입자 내 단백질 분포의 맵핑(mapping)

입자를 수지에 매립하고, Leica Ultracut UCT 초미세절편기(ultramicrotome) 상의 30° Diatome 다이아몬드 칼을 이용하여 80 nm의 박편을 절단하고, 공극성 탄소가 코팅된 구리 그리드에 적용하였다. 도 21은 입자의 전형적인 스캔을 나타내는데, 중앙 입자상에 칼에 의한 손상이 명백하다. 실리카 입자의 단면의 일부에 걸친 Fe 분포를 주사 TEM (STEM) 에너지 분산 x-선 분광분석 (EDX) 스펙트럼상에 의해 맵핑하였다. 이 기법은 STEM상의 각 화소에서 완전한 EDX 스펙트럼을 채집하고, 이어서 배경 x-선을 제거하기 위해 각 스펙트럼을 가공하는 것을 포함한다. 각각의 관심대상인 원소에 상응하는 스펙트럼의 영역에서의 x-선 강도를 플롯팅함 으로써 원소 분포의 맵을 생성하였다. Fe 분포 맵은 페리틴이 검소 영역 전체에 균일하게 분포되어 있음을 나타내었는데, 이는 상기 단백질이 계면활성제/용매 계면 근처에 잔존하도록 액적 내부에서 배향하지 않음을 시사하였다.

도 22는, STEM의 암시야 영상화 (dark field imaging; DFI) 상 (좌측 상단)의 큰 상자에 해당하는 50 화소 × 50 화소에서의 C, Fe, Si 및 O 분포의 맵을 나타낸다. 하부 패널에 나타내어진 상기 스펙트럼은 STEM DFI 내 작은 십자모양의 위치에서의 페리틴으로 인한 Fe-K x-선 피크를 분명하게 보여준다.

도 23은 STEM DFI 상 (좌측 상단)의 상자에 해당하는 75 화소 × 45 화소 영역 내 C, Fe, Si 및 O 분포의 맵을 나타낸다. 하부 패널에 나타내어진 스펙트럼은 STEM DFI 내 작은 십자모양의 위치에서의 페리틴으로 인한 Fe-K x-선 피크를 분명하게 보여준다. Fe 분포 맵은 페리틴이 분석된 영역 전체에 균일하게 분포되어 있음을 나타낸다.

도 24는 페리틴이 봉입되지 않은 대조 시편으로부터의 STEM EDX 스펙트럼상을 나타내는데, 미소구체의 한 절편에서의 C, Fe, Si 및 O의 분포를 나타낸다. 예측한 바대로, Fe는 검출되지 않았다.

실시예 6. 알파-카이모트립신, 서브틸리신 및 알칼리성 포스파타제의 활성에 대한, 봉입 중에 사용된 다양한 성분의 효과

방출 후 단백질 활성은 본 발명의 입자의 사용에 있어서 명백히 중요한 사안이다. 전체적 분석법의 어느 성분이 활성의 손실에 대해 책임이 있을 수 있는지 확인하기 위한 노력의 일환으로, 알파-카이모트립신 및 서브틸리신 모두를 이용하 여 분석을 수행하였다. 이러한 분석법에서 사용한 다양한 염 용액의 조성을 하기에 기재하였다. 모든 용액은 탈이온수로 50 ml의 부피가 되도록 하였다.

도 25는 알파-카이모트립신의 활성에 대한 봉입 공정의 다양한 성분들의 효과를 나타낸다. Bindzil에의 첨가는 상기 효소의 완전한 변성을 초래하였다. 그러나 이는 Bindzil의 높은 pH (약 10)로 인한 것이 거의 확실하다. pH 10의 Bindzil 이외에, 가장 유해한 화학물질은 입자의 세정에 사용된 이소프로판올인 것으로 보였다. 상기 염 용액들 또한 상기 효소의 활성에 대해 다양한 영향을 미치는 것으로 보인다.

도 26은 서브틸리신의 활성에 대한 동일한 성분/화학물질, 더하기 일부 부가적 세정 용매의

효과를 나타낸다. 서브틸리신의 활성에 있어 두 가지 가장 유해한 화학물질은 산성 조건 (pH 약 2) 및 염 용액 4인 것으로 보여진다. 산성 조건 (< pH 6)은 서브틸리신에 유해한 것으로 알려져 있다. 칼슘 염의 진한 용액인 염 용액 4 또한 유해한 것으로 입증되었다. 상기한 바와 같이, 입자를 세정하기 위해 가끔 사용된 두 가지 화학물질인 에탄올 및 이소프로판올은 모두 효소 활성에 대해 지극히 유해한 것으로 보인다. 헥산 및 시클로헥산은 효소 활성에 대해 유해한 효과를 갖지 않는 것으로 밝혀졌다.

pKa가 9.5인 알칼리성 포스파타제는 더 높은 pH에서 대부분의 효소보다 훨씬 더 안정하다. 이 효소는 pH 약 10에서 봉입의 활성에 대한 효과를 시험하고, 그 결과를 pH 6에서 봉입 절차에 제출된 효소의 활성과 관련시키기 위해 사용하였다. 도 27은 a) 도 17에 기술된 바와 같이 pH = 6.0에서의 봉입 공정, 및 b) 염을 사용하지 않은 동일한 공정 후에 알칼리성 포스파타제의 방출 후 활성을 나타낸다. 이 공정은 염이 존재하거나 존재하지 않거나 대략 50% 활성의 유사한 손실을 초래한다. 반면, (실시예 1에 기재된 바와 같은) pH 9.7에서의 공정은 효소의 pKa의 매우 근접해서 그 촉매 효과를 증가시키는 것으로 보인다. 이는, pH 약 10에서의 봉입이 약 9 초과의 pH를 견딜 수 있거나 심지어는 선호하는 시스템에 유용할 수 있음을 입증한다.

본 발명에 따른 입자로부터 방출된 효소의 추가적 동역학적 연구를 하기에 기재한다. 도 28은 세 개의 샘플의 효소 반응 속도를 표준 (용액 중 효소)과 비교하여 나타낸다. 이 그래프에서는, 선의 기울기가 단위시간 당 효소 단위 당, 형성된 기질의 단위 개수로 나타내어지는 효소의 활성을 나타낸다. 곡선 a) 및 b)는 미세입자 내에 봉입된 서브틸리신을 나타내는데, 염 용액 대신에 히드록시프로필 셀룰로오스 (HPC)를 각각 2 mg/Bindzil의 mL, 및 5 mg/Bindzil의 mL의 농도로 첨가하였다. 염을 HPC로 대체하면 반응 속도를 감소시켰는데, 이는 HPC의 존재가 서브틸리신의 활성을 감소시키는 역할을 하였음을 나타낸다 (합성 세부사항에 대해서는 하기 참조). HPC의 농도가 증가하면, 반응 속도는 늦춰진다. 곡선 c)는, 하기하 는 바와 같이 Bindzil 30/360 및 소듐 실리케이트의 1:1 (w/w) 혼합물에 봉입된 서브틸리신을 나타낸다. 이들 입자는 표준에 비해 유사한 활성을 나타냄을 볼 수 있다.

합성 세부사항:

HPC를 함유하는 샘플에 대한 전구체를, Bindzil 30/360의 mL 당 각각 2 mg 및 5 mg의 HPC에 해당하는 두 가지 상이한 농도로 HPC를 Bindzil 30/360에 용해시킴으로써 제조하였다. 제 3의 샘플의 경우에서는, 전구체가 0.625 mL의 Bidnzil 30/360 및 실시예 4에 기재된 바와 같이 제조된 탈이온화 실리케이트 용액 1.875 mL의 혼합물로 이루어졌다.

각각의 샘플에 대해, 9 g의 Span 20을 60 ml의 케로신에 용해시켰다. 2.5 ml의 상기한 전구체 용액을 교반과 함께 첨가하였다. 에멀젼 내부의 pH는 0.46 mL의 1 M HCl의 첨가에 의해 6.0으로 저하되었다. 이어서 200 ㎕의 물 중 8 mg의 서브틸리신을 함유하는 용액을 첨가한 후, 0.35 mL의 염 용액 1 (상기 기재)을 첨가하였다. 입자는 원심분리를 이용해 단리하고, 건조 전에 케로신 및 헥산으로 세정하였다.

실시예 7. 봉입된 서브틸리신 및 알칼리성 포스파타제의 보관 안정성

미세입자에 봉입된 효소의 보관 안정성은 중요한 고려사항이다. 단백질의 대부분이 0℃ 미만의 온도에서의 장기 보관을 필요로 한다. 하기에 기재된 공정을 이용하여 형성된 미세입자의 구조적 생존능력을 동결-해동 공정 중에 조사하였다. 초기에는, 동결 공정 중의 입자의 물 함량의 팽창이 입자의 파쇄 또는 균열 속도의 증가를 초래하여, 장기간 보관에 대한 생존 능력을 감소시킬 수 있는 것으로 추정되었다. 도 29는 (a) 실온에서 보관된 샘플, 및 (b) 0℃ 미만에서 보관된 샘플의 SEM 현미경사진을 나타낸다. 도 29에는 보관 조건 사이의 입자의 파쇄 또는 균열 정도의 증가에 대한 증거가 없다.

전체 미세입자의 구조적 온전성은 중요하지만, 미세입자의 매트릭스 내에 보관된 단백질의 생존 능력을 또한 조사하였다. 도 30은 약 4℃에서 및 0℃ 미만에서 보관된 서브틸리신의 효소적 활성을, 입자 합성 직후의 샘플의 활성과 비교하여 나타낸다. 나타낸 보관 기간에 걸친 효소적 활성의 대략 80 내지 90% 감소가 있었음을 볼 수 있다. 그러나 4℃ 또는 0℃ 미만에서의 보관 사이에 유의미한 차이점을 볼 수 없었다.

세린 프로테아제인 서브틸리신은 광범위한 화학적 환경에서 강건하고 안정하다. 그러나 프로테아제 효소이므로 자가파괴적이 되어, 장기간에 걸친 보관 안정성을 감소시킨다. 상기 단백질이 장시간 동안 냉동고에서 동결건조된 채로 유지될 수 있는 반면, 동일한 조건 하에서 미세입자 내부에서 효소의 활성이 명백히 축소되었다는 점은 유의미하다. 이는 미세입자 내부의 환경이 본질적으로 준-수성(quasi-aqueous)일 수 있다는 것을 시사한다. 이러한 시사는 하기에 기술한 바와 같이 두 개의 서브틸리신이 도핑된 샘플 및 동결건조된 샘플 하나를 제조함으로써 시험하였다. 양 샘플을 이어서 냉동고에 보관하였다. 이틀간의 보관 후에 동결건조된 샘플의 활성은 건조되지 않은 샘플에 비해 세 배 더 높았으며, 9 일간의 보관 후에도 본질적으로 변하지 않았다. 이는, 물질이 건조 고체처럼 보이더라도, 존재하는 물의 양이 프로테아제 효소의 경우에는 문제가 될 수 있으며, 샘플은 보관 전에 동결건조되어야 함을 확인시켜 준다. 역으로, 도 31에서 볼 수 있듯이, 알칼리성 포스파타제 (실시예 1에 주어진 합성 세부사항)의 활성은 2 주에 걸친 보관에 의해 그다지 영향받지 않으며, 일반적으로 나타낸 기간 내에서 그에 따른 활성의 약간의 손실만을 나타낸다.

합성 세부사항:

18 g의 Span 20을 120 mL의 케로신에 용해시켰다. 5 mL의 Bidnzil 30/360을 교반과 함께 첨가하였다. 0.915 mL의 1 M HCl을 첨가함으로써 pH를 6.0으로 낮추었다. 400 ㎕의 물 중 16 mg의 서브틸리신의 용액을 에멀젼에 첨가한 후, 0.39 mL의 염 용액 1을 첨가하였다. 입자를 원심분리를 통해 단리하고, 건조 전에 케로신 및 헥산으로 세정하였다.

실시예 8. 단백질 봉입을 위한 대안적인 매트릭스

두 가지 대안적인 세라믹 매트릭스를 조사하였다. 첫 번째 알루미나는 하기에 기재한 바와 같이 알루미나 졸로부터 제조되었다. 알루미나 졸은 10:1의 물:알콕사이드 비를 사용하여 물에서의 알루미늄 sec-부톡사이드의 가수분해 및 75℃의 반응 온도에 의해 제조하였다. 혼합물을 30 분간 교반하고, 온도를 81℃로 상승시켜 생성된 알코올을 제거하였다. 이어서 질산을 0.07:1의 H+:알콕사이드 몰 비로 첨가하고, 용액을 1 시간 동안 81℃에서 교반하였다. 이어서 혼합물을 밀봉하고 80℃에서 저장하여 펩타이드화를 완료하였다. 광산란은, 평균 콜로이드 크기가 9 nm임을 나타내었다. 졸을 회전 증발에 의해 10 중량% 알루미나의 농도로 농축시켰 다.

9 g의 Span 20을 60 mL의 케로신에 용해시켰다. 2 mL의 10 중량% 알루미나 졸을 상기 Span 20/케로신 혼합물에, 500 rpm에서의 교반과 함께 첨가하였다. 0.01 g의 KH₂PO₄, 6.69 g의 NaCl 및 1.3 g의 CaCl₂를 함유하는 수용액 50 mL로부터 0.05 mL의 분획을 취하고, 1.3 g의 CaCl₂를 첨가하였다. 교반을 5 시간 동안 연속한 후, 혼합물을 2000 rpm에서 원심분리하여 고체를 제거하고, 이를 건조 전에 케로신으로 1회, 그리고 에탄올로 2회 세정하였다. 광학적 현미경 사진 (도 32)는 입자가 크고 (평균 입자 크기 약 60 마이크론), 샘플은 상당한 부분의, 건조 및 취급 시에 더 큰 구체로부터 파쇄된 비-구형 파편을 함유함을 나타내었다. 알루미나 입자는 또한 어느 정도 기형이었는데, 아마도 알루미나 겔의 연한 성질 때문인 것 같다. 알루미나 입자가 거친 손상으로 인해, 비교적 단단한 겔을 생성하는 것으로 알려진, 제 2의 세라믹 지르코노티타네이트를 조사하였다.

지르코노티타네이트 졸을, 지르코늄 테트라부톡사이드 (ZBT) 및 티타늄 테트라부톡사이드 (TBT)의 1:1 (몰) 혼합물을 이용하여 제조하였다. ZBT 및 TBT의 가수분해를 늦추기 위해 아세트산 (5:1 (몰) 아세트산: (Ti+Zr))을 첨가한 후, 물 (25:1 (몰) H₂O:(Ti+Zr))을 첨가하였다. PCS 측정은 상기 졸이 28 nm의 콜로이드성 입자로 구성되었음을 나타내었다. 졸의 pH는 3.0이었다. 2.5 mL의 상기 졸을, 60 mL의 케로신 중 9 g의 Span 20의 용액에 첨가하였다. 1 시간 동안의 교반 후에, 고체를 원심분리로 제거하고, 케로신 및 에탄올을 이용하여 세정하였다. 구형 미 세입자를 광학 현미경에 의해 관찰하였다. 도 33은 전형적인 SEM상을 나타낸다. 광산란 측정은 입자는 크기가 약 1 내지 100 마이크론 범위이고, 평균 크기가 약 26 마이크론임을 나타낸다 (도 34 참조). 표면적 및 다공도 측정은 물질이 미세다공성이고, 세공 크기 분포에서 두 피크는 1.1 및 2.0 nm임을 나타낸다.

지르코노티타네이트 입자 내 생체분자의 봉입의 일례로서, 브로멜라인 (파인애플 유래의 단백질 분해효소)를 선택하였는데, 그 이유는 그의 비교적 작은 크기 (약 28 kDa) 및 산성 조건 하에서의 안정성 때문이다. 방출 곡선은 도 35에 나타나 있다.

합성 세부사항: 9 g의 Span 20을 60 ml의 케로신에 용해시켰다. 8 mg의 브로멜라인을 200 ㎕의 물에 부분적으로 용해시켰다. 샘플을 원심분리하여 용해되지 않은 단백질을 제거한 후, 상기 기술한 바대로 제조된 지르코노티타네이트 졸 2.5 mL를 첨가하였다. 졸/단백질 혼합물을 계면활성제 용액 내로 교반과 함께 분산시키고, 6 시간 동안 교반하였다. 고체를 원심분리에 의해 제거하고, 케로신으로 1회, 및 헥산으로 2회 세정하였는데, 각 세정 후에 원심분리를 이용하여 상층액을 제거하였다.

고분자성 시스템과의 비교에 의해, 본 발명에 기술된 바와 같은 세라믹 봉입제의 사용은 하기의 장점을 제공한다:

* 제조에 단백질 및 기타 생물학적 존재를 위한 비교적 온화한 조건이 사용되므로, 방출 시 높은 단백질 활성을 유지한다 (실시예 6에서 입증됨). 합성 중에 비교적 무해한 장쇄 유기물에 조금만 노출될 뿐이고, 봉입 매트릭스는 전체적으로 무기질이다. 입자의 합성 및 생물학적 존재의 봉입은 주위 온도에서 수행될 수 있다.

* 방출 작용기전은 제어가능한 크기의 내부 세공을 통한 확산에 의한 것이다. 확산 속도는 국소적 화학적 환경에 덜 의존적이다 (즉, 상이한 환경에 따라 잠재적으로 가변성이 적다).

* 금속 산화물은 본질적으로 친수성이므로, 혈액 중에서 더 안정해야 한다. 신규한 생체분포가 가능할 수 있다.

* 수성 콜로이드로부터 제조된 겔은 본질적으로 준-수성 환경을 제공하고, 얻어지는 입자는 약 10%의 물을 함유할 수 있다. 이는, 실시예 7에 입증된 바와 같이 일부 생물학적 물질에 대해 증대된 보관 안정성에 대한 잠재성을 제공할 수 있다.

부가적으로, 세라믹 시스템은 단백질 약물 전달에 대한 적용에 있어 매력적으로 만드는 고유한 특징을 갖는 데, 하기와 같다:

* 세라믹 입자는 화학적으로 및 생물학적으로 불활성이고, 고분자가 취약해지는 용매/화학물질과는 반응하지 않는다. 상기 입자는 강산성 조건 (예를 들면, 위장) 하에서도 안정하다.

* 세라믹 입자는 열적으로 안정하고 비-인화성이다.

* 실리카 및 기타 경질 금속 산화물은 본질적으로 생체적합성이며, 일부는 신체 내에 천연적으로 존재하기도 한다.

* 상기 입자의 합성은 “생체분자 친화성”이며, 실리카 겔 전구체는 단백질에 온화하다.

* 세라믹 입자는 친수성 표면을 가지며, 이는 혈액 중에서의 안정성을 증대시킨다. 상기 입자는 신규한 생체분포 특성을 제공할 수 있다.

* 세라믹 입자는 기계적으로 강하며 외부 힘에 의해 쉽게 손상되지 않는다.

* 입자의 크기 및 방출 속도에 대한 독립적인 제어를 행사하는 것이 가능하다. 이들 파라미터는 양호한 재현성으로 도입될 수 있다.

* 모든 합성은 주위 온도에서 수행될 수 있다.

* 봉입에 대한 동일한 포괄적 공정이 모든 단백질에 대해 사용될 수 있다.

* 공정은 공업적 양으로 상업적으로 입수가능한 비교적 저렴한 성분을 사용한다.

* 공정은 적은 자본 투자만을 필요로 한다.

* 입자 표면을 기능화하는 것이 가능할 수 있다. 이는 단백질의 표적화 전달에 대한 가능성을 열 수 있다.

본 발명의 방법은 Barbe 및 Bartlett, WO 01/62232 (2001)에 상세설명된 방출 제어 기술을, 약물과 같은 소분자의 방출로부터 더 큰 생체분자, 예컨대 단백질 (효소 포함), 폴리펩타이드, 및 DNA/RNA 단편의 방출에 이르기까지 연장시키기 위해 개발되었다. 상기 공정은 구형 실리카 입자를 형성시키기 위한 용매/계면활성제 에멀젼 시스템의 사용을 기초로 하지만, 단백질 및 기타 생물학적 존재에 더 적합한 화학을 사용한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 적당한 전구체 물질은 상업적 실리카 콜로이드, 또는 콜로이드의 혼합물이며, 필요에 따라 소듐 실리케이트 용액을 첨가하여 입자 세공 크기를 추가 제어할 수 있다. 수성 기재 실리카 전구체의 사용은 두 가지 문제점을 극복하는 데 기여한다. 첫 번째로, 단백질은 통상 규소 알콕사이드의 가수분해에서 생성되는 알코올에 의해 변성되는데, 이는 본 발명의 시스템의 사용으로써 피할 수 있다. 두 번째로, 수성 실리카 겔 전구체의 사용은, 단백질의 방출에 적당한 크기 범위로서 1 내지 15 nm의 크기 범위일 수 있는 세공을 갖는 중간다공성 생성물을 결과로 한다. 수성 기재 실리카 전구체가 저렴한 비용 및 제조의 용이함으로 인해 선호되지만, 필요에 따라 (예를 들면, 염기 중에서 부하물의 보호 목적을 위해) 티타네이트, 지르코네이트 또는 알루미네이트와 같은 기타 수성 기재 세라믹 전구체로 치환될 수도 있다.

본 발명에 기재된 기술에 대한 가능한 응용분야에는

* 단백질 의약/약물 전달 (단백질 약물 전달, 피부 이식, 골재생, 유전자요법),

* 예를 들면 세제, 전분 가수분해/프룩토오스 생성, 과일쥬스 제조, 양조, 섬유, 동물 사료, 제과, 펄프 및 제지 산업, 가죽 공업, 식품 생산 (예를 들면, 치즈)에서의 효소 (생촉매)의 제어된 방출과 같은 바이오기술 응용분야,

* 예를 들면, 바이오센서 및 기타 분석물, 개인용품 (예를 들면, 치약, 콘택트 렌즈 세정), 정밀화학품 생산 (예를 들면, 키랄성 순수 아미노산, 희귀 당류, 반합성 페니실린), DNA-기술 (유전자 공학)에서의 효소의 특수화된 공업적 사용,

* 화장품, 기능성 화장품(cosmeceutical)

* 식품, 기능성 식품(nutraceutical)

* 수의학 응용분야

Claims

하기를 포함하는, 생물학적 존재를 방출가능하게 봉입하는 방법:

a) 비극성 용매 중의 계면활성제 용액을 전구체 물질 및 생물학적 존재와 합하여, 극성 상이 비극성 상에 분산되어 있는 에멀젼을 형성시키는 단계로서, 상기 극성 상이 생물학적 존재를 포함하는 것인 단계; 및

b) 극성 상으로부터 생물학적 존재를 포함하는 입자를 형성시키는 단계.
제 1 항에 있어서, 단계 a)가 하기를 포함하는 것인 방법:

c) 비극성 용매 중의 계면활성제 용액을 전구체 물질과 합하여 제 1 에멀젼을 형성시키는 단계로서, 상기 제 1 에멀젼은 극성 상이 비극성 상에 분산되어 있고, 상기 전구체 물질은 극성 상에 위치하는 것인 단계; 및

d) 극성 상이 생물학적 존재를 포함하도록 제 1 에멀젼을 생물학적 존재와 합하는 단계.
제 2 항에 있어서, 제 1 에멀젼의 pH를 생물학적 존재가 활성으로 잔존하는 pH로 조정하는 단계를 포함하는데, 상기 단계가 단계 d) 전에 수행되는 방법.
제 1 항에 있어서, 단계 a)가 하기를 포함하는 것인 방법:

e) 비극성 용매 중의 계면활성제 용액을 산 수용액과 합하여 제 2 에멀젼을 형성시키는 단계로서, 상기 제 2 에멀젼은 극성 상이 비극성 상에 분산되는 것인 단계;

f) 전구체 물질이 극성 상에 위치하도록 전구체 물질을 제 2 에멀젼에 첨가하는 단계; 및

g) 극성 상이 생물학적 존재를 포함하도록 생물학적 존재를 첨가하는 단계.
제 1 항에 있어서, 단계 a)가 하기를 포함하는 것인 방법:

h) 전구체 물질 및 생물학적 존재를 합하여 극성 혼합물을 형성시키는 단계; 및

i) 극성 혼합물을 계면활성제의 용액과 합하여 에멀젼을 형성시키는 단계로서, 상기 에멀젼은, 극성 상이 전구체 물질 및 생물학적 존재를 포함하도록 극성 상이 비극성 상에 분산되어 있는 것인 단계.
제 5 항에 있어서, 단계 i) 전에, 극성 혼합물의 pH를 약 7.5 내지 약 11로 조정하는 단계를 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 에멀젼이 pH 약 1 내지 약 11인 방법.
제 1 항에 있어서, 전구체가 세라믹 전구체를 포함하는 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 전구체가 콜로이드성 실리카를 포함하는 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 생물학적 존재가 단백질을 포함하는 것인 단계.
제 1 항에 있어서, 생물학적 존재가 효소를 포함하는 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 단계 b) 전에 겔화 보조제를 첨가하는 단계를 부가적으로 포함하는 방법.
제 12 항에 있어서, 겔화 보조제가 염 및 수용성 고분자로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 비극성 상으로부터 입자를 적어도 부분적으로 분리하는 단계를 부가적으로 포함하는 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 적어도 부분적으로 분리하는 단계가, 입자를 포함하는 에멀젼을 침전 용매와 합하여 입자를 침전시키는 단계로서, 상기 침전 용매는 비극성 용매와 혼화성인 것인 단계를 포함하는 것인 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 적어도 부분적으로 분리하는 단계가 입자를 포함하 는 에멀젼을 원심분리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제 14 항에 있어서, 입자를 건조하는 단계를 부가적으로 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 하기를 포함하는 방법:

j) 비극성 용매 중의 계면활성제 용액을 콜로이드성 실리카와 합하여 제 1 에멀젼을 형성시키는 단계로서, 상기 제 1 에멀젼은 극성 상이 비극성 상에 분산되어 있는 것인 단계;

k) 제 1 에멀젼의 pH를 약 1 내지 약 11의 pH로 조정하는 단계;

l) 극성 상이 생물학적 존재를 포함하도록 제 1 에멀젼을 생물학적 존재와 합하는 단계; 및

m) 생물학적 존재를 포함하는 입자를 극성 상으로부터 형성시키는 단계.
제 1 항에 있어서, 하기를 포함하는 방법:

n) 비극성 용매 중의 계면활성제 용액을 산 수용액과 합하여 제 2 에멀젼을 형성시키는 단계로서, 상기 제 2 에멀젼이 극성 상이 비극성 상에 분산되어 있는 것인 단계;

o) 제 2 에멀젼의 pH가 약 1 내지 약 11이 되도록 콜로이드성 실리카를 제 2 에멀젼에 첨가하는 단계;

p) 극성 상이 생물학적 존재를 포함하도록 생물학적 존재를 제 2 에멀젼에 첨가하는 단계; 및

q) 생물학적 존재를 포함하는 입자를 극성 상으로부터 형성시키는 단계.
제 1 항에 있어서, 하기를 포함하는 방법:

r) 전구체 물질 및 생물학적 존재를 합하여 극성 혼합물을 형성시키는 단계;

s) 극성 혼합물의 pH를 약 1 내지 약 11로 조정하는 단계;

t) 극성 혼합물을 계면활성제의 용액과 합하여, 극성 상이 비극성 상에 분산되어 있는 에멀젼을 형성시키는 단계로서, 상기 극성 상이 극성 혼합물을 포함하는 것인 단계; 및

u) 생물학적 존재를 포함하는 입자를 극성 상으로부터 형성시키는 단계.
방출가능한 생물학적 존재를 포함하는 입자로서, 상기 입자는 평균 세공 크기가 직경으로 약 1 내지 50 nm이고, 평균 입자 크기가 약 0.05 내지 500 마이크론인 입자.
제 21 항에 있어서, 하기를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인 입자:

a) 비극성 용매 중의 계면활성제 용액을 전구체 물질 및 생물학적 존재와 합하여 에멀젼을 형성시키는 단계로서, 상기 에멀젼은 극성 상이 비극성 상에 분산되어 있고, 상기 극성 상은 생물학적 존재를 포함하는 것인 단계; 및

b) 생물학적 존재를 포함하는 입자를 극성 상으로부터 형성시키는 단계.
제 21 항에 있어서, 직경이 약 5 내지 500 nm인 일차 입자의 응집체를 포함하는 입자.
제 21 항에 있어서, 생물학적 존재가 단백질을 포함하는 것인 입자.
제 21 항에 있어서, 생물학적 존재가 입자 전체에 실질적으로 균질하게 분포되어 있는 입자.
제 21 항에 있어서, 생물학적 존재가 입자로부터의 방출 후 생물학적으로 활성인 입자.
생물학적 존재를 환자에게 전달하는 방법으로서, 제 21 항에 따른 입자 하나 이상을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
생물학적 존재를 액체에 전달하는 방법으로서, 제 1 항에 따른 입자 하나 이상을 상기 액체에 노출시키는 단계를 포함하는 방법.
환자에 있어서 상태의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 제 21 항에 따른 입자의 용도로서, 상기 생물학적 존재가 상기 치료에 대해 처방된 것인 용도.