KR20130098340A - 생체분자의 전달을 위한 세라믹 입자를 포함하는 미립자 물질 - Google Patents

생체분자의 전달을 위한 세라믹 입자를 포함하는 미립자 물질 Download PDF

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KR20130098340A
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크리스토프 장 알렉산드르 바베
킴 수잔느 피니
사무엘 나이트
토비 존스톤 파시우라
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오스트레일리안 뉴클리어 사이언스 앤드 테크놀로지 오가니제이션
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Abstract

미립자 물질은 세포들 속으로 입자의 침투를 향상시킬 수 있는 작용기가 갖는 세라믹 매트릭스 및 입자의 구멍 내에 배치되고, 세라믹 매트릭스의 용해에 의해 입자로부터 방출될 수 있는 생체분자를 포함하는 미립자 물질.

Description

생체분자의 전달을 위한 세라믹 입자를 포함하는 미립자 물질 {PARTICULATE SUBSTANCES COMPRISING Ceramic particles for delivery of biomolecules}
본 발명은 생체분자의 전달을 위한 세라믹 입자를 포함하는 미립자 물질과 그들을 만드는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 입자의 구멍 내에 노출할 수 있는 분자를 배치한 작용기를 갖는 세라믹 매트릭스 입자를 포함하는 미립자 물질에 관한 것이다.
siRNA와 유전자 치료의 이용은 의료에 있어서의 잠재적인 주요 발전을 나타낸다. 낭포성 섬유증, 몇몇 암, 그리고 제 1형 당뇨병과 같은 면역 질병, 다발성 경화증 등과 같은 현재 치유 불가능한 질병들의 범위를 치유할 수 있는 잠재력을 보여준다. 그러나, 효과적인 치료를 제공하기 위해서는 작용점에 도달할 때까지 생체 내 효소 저하로부터 siRNA를 보호 할 필요가 있다.
현재, siRNA 치료는 비용이 많이 든다. 이러한 고가의 치료에 대한 주요 시장은 주로 선진국에서 한다. 유전자 치료에 대한 세계 시장은 5십억 달러 이상으로 추정된다.
개발중인 siRNA 치료를 임상 사용하기위한 주요 과제는
· 효소 저하로부터 활성물질의 보호;
· 대상 세포에 들어가기 위한 활성물질 사용(좋은 침투);
· 세포질에서 봉합재로부터의 활성물질의 방출(엔도좀 탈출);
· 유전자를 넉다운(knock down)시킬 수 있는 능력의 확보(nM 농도의 더 좋은 효험); 및
· 낮은 독성의 성취(큰 치료의 창)
를 포함한다.
siRNA들은 중간 크기의(약 14kDa, 3nm 지름, 10nm 길이), 친수성, 강한 음 전하를 갖는 분자이다. 이들은 안정성을 향상시키기 위해 변형되지 않는다면 화학적, 그리고 생물학적으로 불안정하다. 임상효과를 얻기 위해서는, siRNA들은 세포막을 통과할 수 있어야하고 대상세포집단의 세포질 내에 존재해야한다.
과거, 바이러스 성 벡터들을 RNA 또는 DNA에 제공하기 위해 탐색되었다. 그러나 면역 반응의 위험으로부터의 고통과 실험에 투입하기 위한 어려움이 있다. 다양한 비 바이러스성 벡터들(예를 들어, 지질 복합체, 양이온성 폴리머 복합체, 리포좀, 덴드리머, 고분자 나노입자들) 또한 탐색되었다. 이들은 siRNA와 벡터 사이의 상호작용과 siRNA로의 구현의 어려움, 그리고 생체에 저하로 인한 siRNA를 노출 등의 다양한 문제를 제공한다. 특히, 다양한 시스템은 나노입자의 표면에 DNA나 RNA를 흡착하기 위해 고안되었다. 그러나 이들은 일반적으로 흡착된 생체분자가 활성 부위에 도달하기 전에 효소 공격을 받기 쉬운 단점으로 고생하며, 이를 통해 치료효과가 감소된다.
상기 논의는 siRNA와 DNA에 주로 관련된 반면에, 논의된 문제는 siRNA와 DNA에 국한되지 않는다. 그들은 잠재적으로 세포 내 전달이 요구되는, 예를 들어 펩티드, 단백질 등을 포함하는 다양한 범위의 생체 분자에 적용된다. 따라서 이러한 문제들의 해결책은 더 많은 적용이 있을 수 있다. 본 발명의 적용은 따라서 siRNA에 제한적으로 간주되어서는 안된다.
바람직하게는, 현재 본 발명은 적어도 상기 단점 중 하나 이상을 상당히 극복하거나 적어도 부분적으로 상기 요구를 충족시킨다.
발명의 요약
본 발명의 일 관점에 따르면
세포들 속으로의 침투를 촉진할 수 있는 능력이 있는 작용기가 달려있는 세라믹 매트릭스 입자; 및
상기 세라믹 매트릭스의 용해에 의해 상기 입자로부터 방출될 수 있고 입자들의 구멍 내에 배치된 생체분자;를 포함하는 미립자 물질이 제공된다.
여기서 사용 된, "입자의 구멍 내에 배치"되는 생체 분자에 대한 참조는 세라믹 매트릭스의 범위 실시 예에 포함하기 위한 것이며, 이는 효과적으로 세라믹 매트릭스의 구멍 내에 배치 또는 전체에 분산된 생체분자를 갖는 고체 다공성 입자를 형성한다. 이는 생체 분자가 입자의 외부 표면에 부착 또는 결합된 상황을 포함하기 위한 것은 아니다.
일반적으로, 가능한 상대적으로 극단적 상황이 아닌, 생체 분자는 실질적으로 세라믹 매트릭스의 용해가 없을 때 침출에 의해 입자로부터 방출되지 않는다. 그 점에 관해, 여기에 사용된, 생체 분자에 대한 "실질적으로 용해가 없는 경우, 침출에 의한 비 방출" 참조는 미립자 물질의 사용과 스토리지의 제안된 조건 하에서 그것의 침출 범위내에 포함하기 위한 것이다. 가급적이면, 작용기는 실질적으로 침출을 방지하기 위해 생체분자와 상호작용한다.
바람직하게는, 작용기는 입자를 통해 균등하게 분배된다.
본 발명의 일 실시 예에 따르면, 작용기가 달린 세라믹 매트릭스는 기능화된 실리카 매트릭스이다. 하지만, 혼합된 금속 산화물을 포함하는 금속 산화물의 범위는 예를 들어, 티타니아, 알루미나, 지르코니아, 철 산화물, 세리아(ceria), 아연 산화물 등이 적합 할 수 있다. 유기-티타니아 또는 유기-알루미나, 또는 유기-실란에의해서 제공되는 작용기는 유기금속 티타니아 실리카 또는 유기금속-알루미노-실리카를 형성하는 다른 금속 전구체와 공동-농축된다. 추가적인 일 실시 예는 다음과 같은 입자들의 준비와 관한 논의로부터 이해될것이다.
세라믹 매트릭스의 작용기는 세포 속으로 입자들의 침투를 효과적으로 향상시킬 수 있는 어떠한 그룹을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이것은 아미노기를 포함할 수 있다. 더 선호되는 일 실시 예로 작용기는 아미노알킬아미노기, 1차 알킬아미노기, 2차 알킬아미노기, 및 3차 알킬아미노기, 알킬이미다졸기, 알킬아마이드기 또는 알킬아미노산기로 구성된다. 또한 추가적인 실시 예는 다음과 같은 입자들의 준비와 관한 논의로부터 이해될것이다.
본 발명은 생체 분자를 포함하는 미립자 물질에 관한 것이다. 이러한 맥락에서, 용어 "생체 분자"는 생물학적 기원이나 자연의 물질 및 생물학적 활동을 갖는 물질로 나타낼 수 있다. 그 용어는 다양한 분자의 혼합물을 포함하는 하나 이상의 분자를 포함하는 그 물질 범위 내를 포함한다. 생체 분자는 거대분자(macromolecule)일 수 있다. 이는 약 1내지 1000kDa 또는 그 이상의 무게를 갖는 분자이다, 또는 약 1 내지 약 100, 1 내지 50, 1 내지 20, 1 내지 10, 5 내지 1000, 10 내지 1000, 100 내지 1000, 500 내지 1000, 5 내지 100, 5 내지 50, 5 내지 20 또는 10 내지 20kDa, 즉, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000kDa. 어떤 경우에는 1kDa 미만 또는 1000kDa이상의 무게를 갖는 분자일 수 있다. 이것은 지름이 약 0.5 내지 20 nm, 또는 약 1 내지 20, 2 내지 20, 5 내지 20, 10 내지 20, 0.5 내지 10, 0.5 내지 5, 0.5 내지 2, 0.5 내지 1, 1 내지 10, 2 내지 10, 1 내지 5, 5 내지 10 또는 10 내지 20nm일 수 있다, 즉, 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20nm 일 수 있다.
생체 분자는 문제의 특별한 적용에 따라 선택 될 수 있다. 입자에 대해 및/또는 생체 분자의 유지 보존을 달성하기 위해서, 음 전하일 수 있다. 이것은 생체 분자가 예를 들어, 아미노기능화된 세라믹 매트릭스 내 양전하된 아민 그룹들과 같은, 세라믹 매트릭스 상의 작용기와 결합될 수 있도록 한다. 대신에 또는 추가적으로 생체분자는 세라믹 매트릭스의 작용기에 결합될 수 있도록 하는 다른 기능이 있을 수 있다. 대신에 또는 추가적으로 생체분자는 입자 내에 물리적으로 포집될 수 있을정도로 충분히 크다(즉, 충분히 큰 분자량 또는 분자 부피를 갖는다). 그것이 입자의 구멍을 통과하는 것이 불가능할 수 있을 정도로 충분히 클 수 있다.
어떤 일 실시 예에서, 생체분자는 RNA와같은 핵산, 예를들어, siRNA(small interfering RNA), miRNA (microRNA) 또는 리보자임(ribozyme), ASODN (안티센스(antisense) 뉴클레오티드 또는 안티센스(antisense) RNA, DNA 분자, 압타머(aptamer), 폴리펩티드, 펩타이드(peptides), 글라이코프로테인(glycoproteins), 리포프로테인(lipoproteins), 면역글로블린(immunoglobulins)(즉, 항체 및 항체 조각)를 포함하는 단백질, 탄수화물, 지질 또는 이들 둘 이상의 부산물 또는 혼합물일 수 있다. 어느 특정한 실시 예에서, 생체분자는 siRNA일 수 있다. 생체분자는 질병, 장애 또는 상태의 예방상의 또는 치료상의 치료에 대한 표시일 수 있다.
몇몇 실시 예에서 입자의 표면에 표면 처리제가 결합하는 장점이 있을 것이다. 선호되는 실시 예에서는, 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol)(PEG) 사슬은 입자의 표면에 커플링 한다. 대신에 또는 추가적으로, 타겟 그룹은 예를 들어, 쓰이고 있는 종양 또는 특정 기관 또는 다른 타겟인 타겟으로 입자의 타겟팅을 촉진할 수 있는 입자의 표면에 커플링 될 수 있다. 특정 실시 예에서, 말단에 타겟 그룹을 갖는 PEG 사슬은 입자와 커플링될 수 있다.
특정 실시 예에서, 미립자 물질의 입자들은 약 0.1 내지 약 1 마이크론의 평균 입자 크기를 갖는것이 선호된다. 그러나, 약 0.1 내지 약 10 마이크론, 또는 약 0.1 내지 5, 0.1 내지 2, 0.1 내지 1, 0.1 내지 0.5, 0.2 내지 10, 0.5 내지 10, 1 내지 10, 2 내지 10, 5 내지 10, 0.2 내지 2, 0.2 내지 1, 0.2 내지 0.5, 0.5 내지 2 또는 0.5 내지 1 마이크론, 즉 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 마이크론의 크기를 갖을 수 있다.
몇몇 실시 예에서, 평균 입자크기는 약 0.1 마이크론 미만인 것이 선호된다. 예를 들어, 약 20 내지 100nm (0.1 마이크론), 또는 약 20 내지 50nm, 또는 약 50 내지 100nm, 즉, 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90nm 일 수 있다.
크기가 약 1 내지 2 마이크론 이상의 입자들은 세포 내 전달에 적합하지 않다. 그러나, 신체의 다른 곳에서 큰 단백질의 전달에 유용 할 수 있는것으로 여겨진다. 그 점에 관해서, 몇몇 마이크론까지의 입자들이 특히 특화된 식세포 작용하는 세포들에의해 내재화될 수 있다.
입자들은 실질적으로 단분산되거나 입자 크기 분포 곡선에 두 번째 피크를 형성하기 위해 몇 가지 응축이 있을 수 있다. 분포 곡선은 정규, 가우스(Gaussian) 또는 기타 다른 분포일 수 있다. 입자들은 넓은 입자 크기 분포 또는 중간이나 좁은 입자 크기 분포가 있을 수 있다. 입자들은 구형, 또는 대략 구형, 또는 난형 또는 편원의 구형 또는 다면(예를 들어 8 내지 약 60면을 갖는) 또는 다른 모양 일 수 있다. 모양은 불규칙할 수 있다.
입자들은 다공성 물질일 수 있다(즉, 100nm 미만의 구멍 크기). 미세다공성일 수 있다(즉, 1.7nm 미만의 구멍 크기). 선호되는, 입자는 약 1 내지 약 50nm의 평균 구멍 크기를 갖는다. 예를 들어, 평균 구멍 크기는 약 1 내지 20, 1 내지 10, 5 내지 50, 10 내지 50, 20 내지 50, 5 내지 20, 5 내지 10 또는 10 내지 20nm, 예를 들면, 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50nm일 수 있다.
구멍 구조는 상호연결된 구멍으로 구성되거나, 상대적으로 작은 상호연결 채널에의해 연결된 공극률로 구성된다. 구멍 크기는 실질적으로 구멍에서 확산에 의해 생체 분자의 방출을 방지 할 수 있을 정도로 충분히 작을 수 있다. 대신에, 만일 구멍 크기가 생체 분자가 탈출할 수 있을 만큼 작다면, 생체분자는 구멍 표면 상에서 작용기의 인력에 의해 유지될 수 있다. 작용기는 세포로 입자의 침투를 향상시키는 것과 같거나 다를 수 있다.
입자들은 약 1 내지 약 20% w/w, 예를 들어 약 1 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 2, 2 내지 20, 5 내지 20, 10 내지 20, 2 내지 10, 2 내지 5 또는 5 내지 10%, 예로 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20%의 생체분자의 로딩을 가지며 비록 몇몇의 경우에 20% 이상이거나 1% 미만일 수 있다.
쓰이고 있는, 생체분자는 실질적으로 생체 분자를 저하하지 않는 조건에서 입자의 분해에 의해 유리하게 방출될 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 생체 분자를 저하하지 않는 생물학적 배지에 의한 입자의 분해에 의해 방출될 수 있다. 적절한 방출 액체에서 희석시키면 대체적으로 방출 될 수 있다.
일반적으로, 생체 분자는 약 0.5 내지 약 50 시간의 기간에 걸쳐 방출(예. 실질적으로 완전히 방출될수 있는)된다. 예를 들어, 약 0.5 내지 20, 0.5 내지 10, 0.5 내지 5, 0.5 내지 2, 1 내지 50, 5 내지 50, 10 내지 50, 1 내지 20, 1 내지 10, 2 내지 10 또는 5 내지 10 시간, 예를 들어 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 시간일 수 있다. 용해의 속도가 입자의 크기에 의존할 수 있으므로, 이 속도는 다음과 같은 설명에서 논의되는 것과 같이 입자의 크기를 조정하여 조정 될 수 있다.
대부분 바람직하게, 생체 분자는 입자들이 저하제, 예를 들어 효소에 방출될 때 입자로부터 방출되기 전에 저하로부터 보호되고, 그렇지 않으면 생체분자가 저하될 수 있다. 즉, 생체 분자는 세라믹 매트릭스에 의해 저하로부터 보호된다.
일부 실시 예들에서, 고분자 또는 착화제는 생체분자가 엔도좀의 탈출을 촉진하도록 입자의 구멍 내에 배치될 수 있다는 것이 구상 중에 있다. 전형적으로 고분자는 폴리에틸인아민(polyethylinamine), 폴리리신(polylysine), 또는 폴리히스티딘(polyhistidine) 또는 양자 스폰지 효과를 제공하는 임의의 물질이 될 수 있다.
마이크로-입자들의 형성(>100nm)
몇몇의 실시 예에서, 마이크로 스케일의 입자들을 형성하는 것이 유리할 수 있다. 즉, 이 설명의 목적을 위해, 평균 입자 크기가 100nm보다 큰 입자이다.
본 발명의 또 다른 양상에 따르면, 구멍 내에서 분산되는 생체분자를 포함하는 입자를 만드는 방법이 제공되며 상기 방법은 다음을 포함한다:
a) 소수성 상에서 분산된 친수성 상의 액적을 포함하는 에멀전을 형성할 수 있도록
소수성 액체, 제 1 세라믹 전구체 및 계면 활성제를 포함하는 소수성 상; 및
친수성 액체, 제 2 세라믹 전구체 및 생체분자를 포함하는 친수성 상;을 결합하는 단계:
b) 상기 액적 내에 입자가 형성되도록 에멀전을 교반시키는 단계;
여기에서 상기 제 1 세라믹 전구체는 세포로 상기 입자의 침투를 향상시킬 수 있는 능력을 지닌 작용기를 포함한다.
여기에서 사용된“교반하다(agitating)" 라는 용어는 교반의 임의의 형태의 범위 내를 포함하지만, 반드시 저음(stirring), 흔듬(shaking), 스월링(swirling), 초음파처리(sonicating), 깎음(shearing) 등등, 및 이들의 임의의 결합으로 제한되지는 않는다.
입자를 만들 때, 에멀전은 소수성 상과 친수성 상의 결합으로 인해 형성된다. 이는 유-중-수(water-in-oil) (w/o) 에멀전일 수 있다, 이는 소수성 상은 연속 상을 나타내고 친수성 상은 분산된 또는 불연속 상을 나타낸다.
소수성 상은 친유성 상 또는 친지성(lipophilic) 상 일 수 있다. 소수성 상은 계면활성제와 소수성 액체의 결합으로 만들어지고 소수성 상을 형성하기 위해 제 1 세라믹 전구체를 첨가한다, 또는 모든 세가지 구성물의 결합에 의해 만들어지거나, 제 1 세라믹 전구체와 소수성 액체 또는 계면활성제의 결합 및 다른 것의 첨가에 의해 만들어진다. 이 단계는 가급적이면 소수성 및 친수성 상의 결합 이전에 수행한다. 각 결합하는 단계는 결합된 교반시킨 조성물들로 구성된다. 교반은 저음(stirring), 흔듬(shaking), 회전(swirling), 초음파처리(sonicating) 또는 이것들의 결합으로 구성된다. 이는 용액을 형성하기 위한 조성물로 충분하다. 따라서 소수성 상은 제 1 세라믹 전구체 용액 및 소수성 액체의 계면활성제로 나타낼 수 있다.
소수성 상은 3가지 성분을 포함한다:
소수성 액체 - 예를 들어, 이는 식물성 오일, 파라핀 오일, 미네랄 오일 또는 몇몇 다른 적절한 소수성 액체일 수 있다. 이는 소수성 성분의 혼합물을 포함할 수 있는데, 그 예로, 식물성 오일의 혼합물 또는 식물성 오일 및 파라핀 오일의 혼합물. 이것은 일반적으로 적당한 점도이다, 그 예로, 약 0.5 내지 약 1500mPa.s, 또는 약 0.5 내지 1000, 0.5 내지 500, 0.5 내지 250, 0.5 내지 100, 0.5 내지 50, 0.5 내지 20, 0.5 내지 10, 0.5 내지 5, 0.5 내지 1, 1 내지 1500, 10 내지 1500, 100 내지 1500, 250 내지 1500, 500 내지 1500, 1000 내지 1500, 10 내지 1000, 10 내지 200, 200 내지 1000 또는 200 내지 500mPa.s, 예를 들어, 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 또는 1500mPa.s, 또는, 때때로, 1500mPa.s보다 크다. 소수성 액체의 점도는 이 방법에의해 생성된 입자의 크기를 조절하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 보다 점성있는 소수성 액체는 일반적으로 더 점성있는 소수성 상을 제공하고 이는 결국 일반적으로 더 작은 입자 크기를 생산할 것이다.
계면활성제 - 이는 유-중-수(water-in-oil) 에멀전을 지원하는데 적절한 계면활성제이다. 그것은 소수성 액체에서 용해되거나, 또는 소수성 액체와 혼합될 수도 있다. 이는 비이온성 계면활성제이거나 음이온성 계면활성제 또는 쌍성이온성의 계면활성제일 수 있다. 이는 약 8 내지 약 16, 또는 약 8 내지 12, 10 내지 16 또는 8 내지 10의 HLB를 갖는다, 그 예로, 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16일 수 있다. 적절한 계면활성제는 SpanR 20 (소르비탄 모노라우레이트(Sorbitan monolaurate)), AerosolROT (소듐 비스(2-에틸헥실) 설포숙시네이트), SpanR20/TweenR80 혼합물 및 SpanR 20/BrijR 35 혼합물을 포함한다. 보통 혼합된 계면활성제의 사용은 아주 좋은 에멀전을 제공하지만, 최종 입자 크기는 일반적으로 변하지 않는다.
제 1 세라믹 전구체 - 이 성분은 입자들의 세포속으로의 침투를 촉진시킬 수 있는 작용기를 포함한다. 어떤 실시 예에서는, 제 1 세라믹 전구체의 작용기는 생체분자와 화학적으로, 예를 들어, 정전기적으로 반응할 수 있다.
이 성분은 예를 들어 아미노작용기일 수 있다. 또는, 다른 양전하를 갖는 그룹 또는 양전하가 부여될 수 있는 그룹이 사용가능하다. 분자 당 적어도 하나의 아민 그룹이 가지고 아미노기능화된 세라믹 매트릭스로 변환 될 수 있는 화합물일 수 있다. 소수성 액체, 또는 소수성 액체의 계면 활성제의 혼합물 (선택적으로 용액)에 용해 될 수 있다.
적절한 세라믹 전구체는 아미노기능화된 실란, 특히 아미노기능화된 알콕시실란(alkoxysilanes)을 포함한다. 이 실란의 알콕시기는 예를들면 C1 내지 C6 알콕시기(C3 또는 이보다 큰 경우 가지일 수 있는), 보통 C1 내지 C4 알콕시, 그 예로, 메톡시(methoxy), 에톡시(ethoxy), 프로폭시(propoxy), 아이소프로폭시(isopropoxy) 또는 부톡시(butoxy)기일 수있다. 다른 경우에 있어서, 가수분해할 수 있는 그룹들이 사용되어질 수 있는데, 그 예로, 아세톡시(acetoxy), 케톡시모(ketoximo), 이노록시(enoloxy) 등이다. 아미노기능화된 세라믹 전구체는 한 분자 당 하나 이상의, 아민 그룹을 갖고있으며, 그 예로, 한 분자 당 2, 3, 4 또는 5 아민 그룹이다. 발명가들은 디아미노- 및 트라이아미노-세라믹 전구체들이 일반적으로 모노아미노-세라믹 전구체들보다 적절한 생체분자에 결합하기에 더 효과적인 입자들을 생성함을 발견했다. 각 아민기는 독립적으로, 1차, 2차 또는 3차 일 수 있다. 바람직한 전구체, 아민 기는 링커 그룹에 의해 분리된다, 보통 짧은 에틸렌(-CH2CH2-), 프로필렌(-CH2CH2CH2-), 또는 부틸렌(-CH2CH2CH2CH2-) 사슬과 같은 짧은 알킨 사슬이다. 본 발명자들은 부틸렌(butylene)기는 이 그룹이 푸트레신(putrescine) (N-4-N), 스페르미딘(spermidine) (N-3-N-4-N) 및 스페르민(spermine) (N-3-N-4-N-3-N)과 같은 폴리아민 폴리뉴클레오티드 리간드에서 발생하기 때문에 특히 유용할 수 있다고 생각한다. 펜틸렌(pentylene) 및 헥실렌(hexylene)과 관련된 다양한 조합이 유용할 수 있지만, 그룹이 너무 달라 생물발생 배열(biogenic configuration)이 잠재적으로 독성이 있을 수 있다. 특히, 본 발명자들은 에틸렌 스페이서가 siRNA에서 전하의 간격에 허용가능하게 가까운 아민기와 생체 분자가 siRNA인 경우, 사용에 적합한 간격을 만드는 상용 제품에 존재하는 아민기 사이의 거리를 제공하는 것으로 생각한다. 따라서 적절한 전구체는 3-(2-아미노에틸아미노)프로필 트라이메톡시실란, 3-[2-(2-아미노에틸아미노)에틸아미노]프로필 트라이에톡시실란, 3-(2-아미노에틸아미노)프로필 트라이에톡시실란 또는 3-[2-(2-아미노에틸아미노)에틸아미노]프로필 트라이에톡시실란 및 이들 둘 이상의 혼합물을 포함한다. 제 1 세라믹 전구체로써 사용될 수 있는 다른 화합물은 우레아프로필 트라이알콕시실란(ureapropyl trialkoxysilane), 아이소시아네이트 기능화된 알콕시실란(isocyanate functional alkoxysilanes), 카르복실로 기능화된 알콕시실란(carboxylic functional alkoxysilanes), 메르캅토기능성 알콕시실란(mercaptofunctional alkoxysilanes) (예로 메르캅토프로필 트라이알콕시실란(mercaptopropyl trialkoxysilanes)), 양이온성 펩타이드 또는 탄수화물 또는 알콕시실란이 그래프팅된 지질 등을 포함한다. 이들의 둘 이상의 혼합물, 또는 다른 적절한 제 1 세라믹 전구체의 둘 이상의 혼합물 또한 사용될 수 있다.
몇몇의 경우에, 제 1 세라믹 전구체는 혼합물일 수 있다. 이는 실란 세라믹 전구체일 수 있다. 추가적으로 하나 이상의 비-실란 세라믹 전구체일 수 있으며, 예를 들어 지르코니아(zirconia) 전구체, 알루미나(alumina) 전구체, 또는 티타니아(titania) 전구체이다. 이들은 각각 예를 들면 지르코늄(zirconium) 알콕사이드, 알루미늄(aluminium) 알콕사이드 및 티타늄(titanium) 알콕사이드 일 수 있다. 보통 소수성 액체에 계면활성제의 비율은 약 5 내지 약 25% w/v(즉, 100ml 소수성 액체에 약 5 내지 약 25 g의 계면활성제)이거나 약 5 내지 20, 5 내지 15, 10 내지 25, 15 내지 25, 또는 10 내지 20%, 즉, 약 5, 10, 15, 20 또는 25%이다.
보통 소수성 액체의 제 1 세라믹 전구체에 대한 비율은 v/v 기본으로 약 10 내지 약 1000 ppm , 또는 10 내지 500, 10 내지 200, 10 내지 100, 10 내지 50, 20 내지 1000, 50 내지 1000, 100 내지 1000, 200 내지 1000, 500 내지 1000, 20 내지 500, 50 내지 500, 50 내지 200, 200 내지 500 또는 50 내지 200ppm, 그 예로, 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000ppm일 수 있다.
친수성 상은 소지성(lipophobic) 상이다. 이는 수성 상일 수 있다. 친수성 상은 3개의 성분으로 구성된다:
친수성 액체 - 이는 소지성(lipophobic)이다. 이는 보통 예를 들어 물, 순수(pure water)를 포함하는 물, 또는 수용성 용액과 같은 수용성이다. 이는 용해되는 염을 포함할 수 있다.
제 2 세라믹 전구체 - 이는 물에 녹을 수 있는 실리케이트, 특히 메타실리케이트이다. 이는 실리케이트 그 자체(그 예로, 테트라메틸오쏘실리케이트 또는 테트라에틸실리케이트와 같은 테트라알킬실리케이트(tetraalkylsilicate)의 가수분해에 의함) 또는 식 RSi(OR’)xOHySiz, 여기서 x+y+z=3, 을 갖는 종일 수 있다(알킬트라이알콕시실란(alkyltrialkoxysilane), 예를 들면, 메틸트라이메톡시실란(methyltrimethoxysilane) 또는 에틸트라이메톡시실란(ethyltrimethoxysilane)의 예를 들면 가수분해로 인해 생성된 알킬실리케이트로써 여기서 참고됨). 알킬실리케이트의 경우에, 알킬 그룹 R은 제 2 세라믹 전구체가 수용성이도록 충분히 작거나 충분히 친수성이어야 한다. 이것은 예를 들어, 메틸 또는 에틸과 같은 작은 R 그룹 또는 친수성 또는 하이드록실, 나이트로, 설페이트 등과 같은 극성 치환기를 갖는 큰 R 그룹으로 달성될 수 있다.
제 2 세라믹 전구체는 예를 들어, 물유리(waterglass)일 수 있다. 물유리는 보통 수용액 안에서 다양한 가수분해의 정도가 변하는 Na2SiO3에 관한 실증적인 식을 갖는 올리고머 또는 중합된 실리케이트 물질이다. 물유리(waterglass)는 약 1 내지 약 20%, 또는 약 1 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 2, 2 내지 20, 5 내지 20, 10 내지 20, 2 내지 10, 2 내지 5 또는 5 내지 10% 의 고형 항장을 가지며, 예로, 약1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20%일 수 있다. 이는 물에서 약 25 내지 약 30% 실리카 및 약 1 내지 약 20% 소듐 하이드록사이드(sodium hydroxide)를 갖는다. 이는 물에서 약 1:2 내지 약 1:10, 또는 약 1:2 내지 1:5, 1:5 내지 1:10 또는 1:3 내지 1:8로 인해 희석화된다, 그 예로, 약 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 또는 1:10일 수 있다.
제 2 세라믹 전구체는 또한 티타늄 알콕사이드(그 예로 에톡사이드(ethoxide), n 및 아이소 프로폭사이드(iso propoxide), n, 2차(sec) 및 3차(tert) 부톡사이드(butoxide)) 또는 알루미늄 알콕사이드 또는 지르코늄 알콕사이드 또는 변형된 금속 알콕사이드(그 예로 아세틸 아세톤(acetyl acetone) 또는 아세트 산(acetic acid)으로 변형된)일 수 있다. 이는 혼합된 금속 알콕사이드일 수도 있다. 또한 마그네슘 실리케이트, 알루미노-실리케이트 등을 형성하기 위해 마그네슘 염, 지르코늄 염, 또는 알루미늄 염과 같은 다른 금속염일 수 있다. 가수분해되기 이전의 실리콘 알콕사이드일 수 있다.
제 2 세라믹 전구체는 예를 들어, 콜로이드성의 실리카와 같은 세라믹 콜로이드를 포함한다. 세라믹 콜로이드는 50nm보다 작은, 또는 40, 30, 20 또는 10nm보다 작은 입자 지름을 갖거나 약 5 내지 약 50nm 또는 약 5 내지 20, 5 내지 10, 10 내지 50, 20 내지 50 또는 10 내지 20nm. 이는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50nm의 입자 지름(보통 평균 입자 지름이지만 선택적으로 최대크기의 입자 지름)을 갖는다.
몇몇의 경우에 제 2 세라믹 전구체는 둘 이상의 상기 선택의 조합으로 구성된다, 그 예로, 콜로이드성 실리카를 갖는 물 실리케이트의 혼합물로 구성된다.
생체분자 - 생체 분자의 다양한 옵션이 상기 언급되었다. 지적한 것처럼, 이것은 음전하 또는 중성 전하일 수 있다. 이것은 입자(제 1 세라믹 전구체의 유도물질)들의 작용기를 끌어당기기에 선택적으로 결합하기에, 충분한 음전하일 수 있다. 예를 들면 siRNA (작은 인터페링 RNA), miRNA (마이크로 RNA), ASODN (안티센스 뉴클레오티드 또는 안티센스 RNA)인 RNA, 압타머, DNA, 단백질, 당 단백질, 폴리펩티드, 탄수화물 또는 이들 둘 이상의 혼합물 또는 부가물이거나, 또는 이를 포함할 수 있다.
또한 엔드좀 탈출을 용이하도록 생체 분자가 입자의 구멍 내에 배치되도록 폴리머 또는 혼합제를 첨가 할 수 있다. 일반적으로, 고분자는 폴리에틸인아민, 폴리리신, 또는 폴리히스티딘 또는 양성자 스폰지 효과를 제공하는 임의의 물질일 수 있다.
친수성 상은 산성일 수 있다. 이는 제 1 세라믹 전구체(또는 세라믹 전구체가 염기, 예로, 아미노기능화된 세라믹 전구체인 경우, 그것의 컨쥬게이트 산성)의 pKa보다 낮은 pH를 갖는다. 친수성 상은 약 10.5 미만, 또는 약 10, 9, 8, 7, 6, 5.5, 5, 4.5 또는 4 또는 약 3 내지 10.5, 5 내지 10.5, 7 내지 10.5, 9 내지 10.5, 7 내지 10, 9 내지 4, 7 내지 4, 9 내지 7, 5 및 7, 3 내지 6, 또는 약 3 내지 5, 3 내지 4, 4 내지 6, 4 내지 5 또는 3.5 내지 4.5, 예를 들어, 약 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5 또는 6의 pH를 갖는다.
일반적으로 친수성 상을 준비하는 경우, 친수성 액체 및 제 2 세라믹 전구체를 결합할 때, 선택적으로 제 2 세라믹 전구체는 친수성 액체에 용해한다. 이 방법은 친수성 상을 형성하도록 연속적으로 제 1 세라믹 전구체의 pKa보다 낮은 pH로 pH를 조정하는 단계, 예를 들어 약 10.5 보다 낮은 pH 또는 예를 들어 약 7 미만, 또는 약 5 미만, 또는 약 4 미만인 산성 pH, 및 생체 분자를 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 제 2 세라믹 전구체가 물유리 또는 콜로이드 상태의 실리카인 경우, 그 결과는 보통 염기성 용액이다. 따라서 이 방법은 용액을 산성화시키는 단계를 포함한다.
산성화는 편리하게 말한 방출 이전에 여기의 양이온 교환 수지에 용액을 노출시키는 단계에 의해 달성할 수 있는데, 상기 노출하는 단계 이전에, 수지는 산(양성자) 형태로 되어있다. 방출하는 단계는 수지와 용액을 결합시키는 단계, 선택적으로 결과 혼합물을 교반하는 단계, 그 다음 산성화된 용액으로부터 수지를 분리하는 단계(예로, 여과, 디켄팅, 원심분리 등에의해)를 포함할 수 있고 또는 상기 수지의 베드를 통해 용액을 통과하는 단계를 포함할 수 있다. 제 2 세라믹 전구체에 대한 수지의 비율은 원하는 pH(상기 설명한대로)에 도달할 수 있도록 한다. 또는 제 2 세라믹 전구체는 산성화제(예로, 산) 또는 적절한 완충용액의 첨가에 의해 산성화 될 수 있다.
보통 생체분자는 친수성 상 및 소수성 상이 결합되기 바로 전에 산성화된 용액에 첨가될 것이다. 이는 이들이 결합되기 전 바로 직전에 첨가될 수도 있다. 결합되기 전 약 2분 미만 또는 약 1분 미만, 또는 결합되기 약 50, 40, 30, 20, 15 또는 10초 미만의 시간에 첨가되고, 그 예로, 결합되기 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 또는 120초 전일 수 있다. 이것은 생체분자 발생의 불리한 화학 반응의 가능성을 줄인다. 생체 분자는 최종 입자에서 원하는 로딩을 달성하기에 충분한 양으로 친수성 상으로 존재 할 수 있다. 친수성 상에서의 생체분자의 전형적인 농도는 약 1 내지 약 10 mg/ml, 또는 약 1 내지 5, 5 내지 10 또는 2 내지 8, 그 예로, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mg/ml이다. 생체분자는 용액의 형태로 결합 된 친수성 상/ 제 2 세라믹 전구체에 첨가될 수 있다. 이 용액의 용매는 친수성 액체 혼화성이고, 보통 친수성 액체와 동일해야한다. 생체 분자는 수용액에 첨가될 수 있다.
에멀전 형성시, 소수성 및 친수성 상은 선택적으로 교반으로, 결합된다. 교반은 저음, 흔듬, 회전 및 초음파처리 중 하나 이상을 구성한다. 에멀전을 만드는 효과적인 방법은 상기 설명한것과 같이 소수성 상을 준비하고 친수성 상의 첨가를 위한 준비로 동시에 저어주고 초음파 처리한다. 그 다음, 제 2 세라믹 전구체와 결합된 생체분자 및 친수성 액체(예로, 산성화된 수용성 물유리 용액) 결합시켜 친수성 상을 준비하고, 결과 친수성 상은 초음파처리가 유지되는 동안 가능한 빠르게 실행할 수 있도록 초음파처리, 저어진 소수성상에 첨가된다. 초음파 처리는 첨가 후 짧은 시간 동안 지속 할 수 있는데, 예를 들면 약 10 내지 약 120초, 또는 약 10 내지 60, 10 내지 30, 20 내지 120, 60 내지 120, 20 내지 60 또는 20 내지 40초, 그 예로, 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 90 또는 120 초 동안일 수 있다. 에멀전의 과열을 방지하기 위해 초음파 처리는 일반적으로 적절한 기간 후에 꺼진다. 이러한 과열은 예를 들어 생체분자에 악영향을 미칠 수 있다. 초음파 처리는 예를 들어, 약 200 내지 2000W, 또는 약 200 내지 1000, 200 내지 500, 500 내지 2000, 1000 내지 2000, 500 내지 1000 또는 600 내지 800W의 힘으로 실시 할 수도 있고, 그 예로, 약 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 또는 2000W일 수 있다.
친수성 상에 대한 소수성 상의 비율은 약 10 내지 약 50 (즉, 약 10:1 내지 약 50:1), 또는 약 10 내지 40, 10 내지 30, 10 내지 20, 20 내지 50, 30 내지 50, 40 내지 50, 20 내지 40 또는 25 내지 25, 그 예로 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50이다.
제 2 세라믹 전구체에 대한 제 1 세라믹 전구체에 대한 몰 비율이 약 0.2 내지 약 20 mol%, 또는 약 0.5 내지 20, 1 내지 20, 2 내지 20, 5 내지 20, 10 내지 20, 0.2 내지 10, 0.2 내지 5, 0.2 내지 2, 0.2 내지 1, 1 내지 10, 1 내지 5 또는 5 내지 10로 충분하다, 그 예로, 약 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 mol% 이다. 제 1 세라믹 전구체가 아미노기능화된 실란이거나 이를 포함하는 경우에는, 제 2 세라믹 전구체에대한 제 1 세라믹 전구체의 비율은 입자의 전하를 변화시키기 위해 변화될 수 있다. 따라서 양이 적은 (그 예로, 제 2 세라믹 전구체에 대해 약 1 mol% ) 경우, 입자들은 대략 중성 전하일 것이나, 반면에 양이 많을(약 10 mol%) 경우, 양성 전하일 것이다. 만일 아미노기능화되지 않은 실란이 첨가(또는 매우 적은 약, 예를 들어, 약 0.5 mol%미만)되는 경우, 입자들은 음전하 일 수 있다.
상기 설명한대로 준비된 에멀전에서, 친수성 상의 액적은 약 0.1 내지 약 10 마이크론, 또는 약 0.1 내지 5, 0.1 내지 2, 0.1 내지 1, 0.1 내지 0.5, 0.2 내지 10, 0.5 내지 10, 1 내지 10, 2 내지 10, 5 내지 10, 0.2 내지 2, 0.2 내지 1, 0.2 내지 0.5, 0.5 내지 2 또는 0.5 내지 1 마이크론, 그 예로 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 마이크론 평균 지름을 가질 수 있다. 평균은 수 평균 또는 무게 평균 지름일 수 있다. 액적은 실질적으로 단분포이거나 분포 곡선에 제 2 피크를 형성하기 위한 몇몇 응집이 있을 수 있다. 액적은 넓은 입자크기 분포 또는 중간 또는 좁은 입자 크기 분포를 갖는다.
이것은 입자가 제 1 및 제 2 세라믹 전구체의 상호 작용에 의해 액적 내부에 형성되는 것으로 생각되고 있다. 입자를 형성하는 전구체의 농축은 일반적으로 매우 빠르다(밀리초 내지 초). 상호 작용은 반응일 수 있다. 그것은 농축일 수도 있다. 그것은 제 1 세라믹 전구체의 가수 분해를 포함한다. 만일 제 1 세라믹 전구체는 아미노기능화이며 직접 친수성 상에 첨가 된 경우, 빠른 겔화가 적절한 크기의 입자 형성이 방해됨을 발견했다.
결합된 친수성 및 소수성 상을 저어주거나 그렇지 않으면 입자의 형성을 위해 충분한 시간동안 교반할 수 있다. 이것은 적어도 반응 온도에 부분적으로 의존 할지도 모른다. 입자 형성은 임의의 적절한 온도에서 수행한다, 예로, 상온, 또는 약 10내지약 35oC 또는 약 10 내지 30, 10 내지 25, 10 내지 20, 15 내지 35, 20 내지 35, 25 내지 35, 15 내지 30, 15 내지 20 또는 20 내지 25oC, 그 예로, 약 15, 20, 25, 30 또는 35oC이다. 그것은 생체 분자의 변성 온도 보다 낮은 온도에서 수행 할 수 있다. 비록 상들을 젓거나 아니면 필요에 따라 이보다 더 오래 교반한 경우, 입자의 형성은 약 10 내지 약 120 분 정도 걸릴 수 있다. 적절한 시간은 약 10 내지 100, 10 내지 60, 10 내지 30, 20 내지 120, 30 내지 120, 60 내지 120, 30 내지 90 또는 45 내지 75분이다, 그 예로, 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115 또는 120분일 수 있다.
입자가 형성되면, 표면이 기능화 될 수 있다. 이는 제자리에서, 즉, 입자의 분리 또는 고립없이 달성할 수 있다. 표면이 입자를 처리하도록 입자의 형성 후 에멀전에 표면처리제를 첨가하는 단계를 포함한다. 이 표면 기능화는 페길레이션(PEGylation)(즉, 표면에 폴리에틸렌 글라이콜 사슬을 첨가)이다. 표면 처리제는 결합기에 커플링된 폴리에틸렌 글라이콜(PEG) 사슬을 포함한다. PEG 사슬은 약 약 1 내지 약 20kDa, 또는 약 1 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 2, 2 내지 20, 5 내지 20, 10 내지 20, 2 내지 10, 2 내지 5 또는 5 내지 10kDa 무게의 분자량을 갖고, 예로, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20kDa이다. 결합기는 트라이알콕시실란, 즉, 표면 처리제는 트라이알콕시실릴 PEG이다. 적절한 알콕시 기는 메톡시, 에톡시 또는 프로폭시를 포함한다. 다른 가수분해성의 실릴 기가 또한 사용될 수 있다, 예를 들어, 트라이아세톡시(triacetoxy), 트라이옥시모(trioximo), 트라이에놀록시(trienoloxy), 트라이아미도(triamido) 등등. 입자의 표면은 입자의 표면에서 및 내부와 연결된 아미노 기 또는 표면의 OH 중 어느 하나와 반응하는 작용기를 갖는 PEG(또는 다른 적절한 분자)와 표면의 결합에의해 기능화된다. 예를 들어 카르복실 기능화된 PEG 표면 처리제는 입자에 표면 아민기로 아마이드(amide)를 형성한느데 사용될 수 있고, 또는 표면 아민기를 활성화(예를 들어, 숙시니미딜 기 또는 아이소씨오시아네이트 기 형성에 의해) 시키고 아미노기능화된 PEG 표면 처리제와 반응할 수 있다.
PEG 기는 일반적으로 크기(전형적으로 > 1KDa) 때문에 구 내부에 침투하지 않고 입자 표면에 주로 그래프팅된다. 기능화된 PEGs의 범위는 예를 들어, 입자의 표면에 아민과 반응시킨 때 아미드 결합을 생성하는 아이소씨오시아네이트-변형된 PEG 및 카르복시-변형된 PEG, 이것은 그래프팅에 적합하여 상업적으로 활용된다.
입자의 표면을 기능화하기 위해 후속적인 표면 기능화, 예로, 페길레이션은 기본적인 조건에서 제한되어 있지만 적절할 수도 있다. 기본적인 조건에서, 제 1 세라믹 전구체 (예로 아미노에틸아미노프로필트라이에톡시실란(aminoethylaminopropyltriethoxysilane)와 같은 아미노실란)는 어떤 경우에는 제 2 세라믹 전구체 (예를 들어, 물유리 또는 콜로이드성의 실리카)에 직접 첨가될 수 있다. 몇몇의 경우에, 친수성 상의 pH는 제 1 세라믹 전구체의 pKa보다 낮지 않다. 이와 같은 경우에, 처음 형성된 입자(일반적인 조건에서 형성)의 서스펜션은 이어서 산성화된다. 이는 만일 생체분자가 음전하이면 입자에 생체분자의 부착을 향상시키는 것을 촉진한다. 만일 입자가 이어서 표면 처리된다면, PEG-실란 부착을 용이하게 하도록 후속 표면 처리하는 동안 또는 그 전에 산성화를 수행한다. 입자에 양전하의 존재 없이, 입자의 구멍을 통해 그것의 탈출을 방지하도록 충분히 크지 않다면, 생체분자의 방출은 매우 빠르다.
몇몇의 경우에, 표면 처리제는 환자의 타겟을 타겟팅하기 위한 타겟팅 그룹을 포함할 수 있다. 예를 들어, 표면 처리제는 PEG의 말단에 타게팅 그룹을 가지는 트라이알콕시실릴-PEG을 포함한다, 즉, 그것은 트라이알콕시실릴-PEG-타겟팅 그룹구조를 갖는다. 타겟은 예를 들면, 종양 또는 특정 기관 또는 다른 타겟를 위한다. 타겟 그룹, 예를 들면, 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, Fab)일 수 있다. 적절한 대상 그룹의 예시는 항체, 펩타이드 싸이토킨, 펩타이드, 호르몬, 매트릭스 단백질, 세포-표면 수용체, 세포 부착 관여 단백질, 세포 인식 관여 단백질, 세포 운동성 관여 단백질, 세포 모집 관여 단백질, 세포 분화 관여 단백질, 질병 인식 관여 단백질, 헤파린 및 관련된 물질과 같은 생물학적 활성 탄수화물, 상기 열거한 클래스에 포함되지만 이에 제한되는 것은 아닌, 생물학적인 활성화 글라이코프로테인, 상기 클래스의 임의의 요소의 리간드, 상기 클래스의 임의의 요소의 조각들, 상기 클래스의 임의의 요소의 상동기관, 상기 클래스의 임의의 요소의 작용기 또는 친화도를 공유하는 저분자량 물질, 호르몬, 영양물, 약물, 독소, 신경전달물질, 내분비전달물질, 오토크라인(autocrine) 및 파라크라인(paracrine) 전달물질, 피그먼트, 지질, 유지류, 이온 리간드, 대사물질, 이화생성물 등과 같은 다른 저분자량 생체분자이다.
표면 처리제는 소수성 상의 입자 서스펜션에 직접 첨가될 수 있다. 이 반응은 주위 온도 부근에서, 예를 들면, 반응을 달성하기 위한 적절한 시간동안 저으면서 적절히 수행된다. 적절한 시간은 약 8 내지 약 24 시간, 또는 약 8 내지 16, 8 내지 12, 12 내지 24, 18 내지 24 또는 12 내지 18 시간이다, 예로, 약 8, 12, 16, 20 또는 24시간이다. 표면 기능화의 적절한 레벨을 성취하기 위해 충분한 표면 처리제를 사용한다, 예로, 과도한 입자 응축을 방지하기에 충분하거나 사용의 타겟으로 허용가능한 입자의 타겟팅을 제공하기에 충분하다.
입자를 형성 한 후, 이는 완전히 건조시키지 않는 것이 일반적이다. 이는 입자의 응축을 방해하는데, 만일 이것이 발생한 경우, 어떤 상황에서는 곤란한 재서스펜션이 필요하다. 보통 입자들은 원심분리에의해 용액으로부터 분리된다. 적절한 조건은 약 10000 내지 약 50000rpm, 또는 약 10000 내지 30000, 30000 내지 50000 또는 20000 내지 30000rpm이다, 예로, 약 10000, 20000, 30000, 40000 또는 50000rpm. 더 긴 원심 분리가 종종 이용 될지도 모르지만, 적절한 분리는 보통 약 5내지15분 내에 성취된다.
결과 입자들을 불순물 제거를 위해 세척한다. 이 세척 방법은 용매 안에서 입자들의 재서스펜션하는 단계, 용매로부터 적어도 부분적으로 입자를 분리하는 단계(예로, 침전 및/또는 원심분리에 의해) 및 입자로부터 용매를 디켄팅하는 단계와 관련될 수 있다. 용매가 생체분자를 변성시키지 않는 것이 중요하다. 이것은 사용되는 특정 생체 분자에 특이적일 수 있다. 예를 들어 에탄올은 DNA 또는 RNA의 구조에 영향을 주지 않지만, 대부분의 큰 단백질을 변성시킬 수 있다. 세척을 위한 적절한 용매는 헥산, 싸이클로헥산, 톨루엔 등과 같은 탄화수소 및 에탄올 또는 이소프로판올과 같은 알코올을 포함한다. 입자들을 같은 용매 또는 다른 용매로 수 회(예로 2, 3, 4 또는 5 또는 그 이상) 세척한다.
결과 입자들은 적절한 용매 내에 재서스펜션되고 나중에 사용하기 위해 그 용매 중에 서스펜션으로써 저장된다. 용매는 입자가 환자에게 전달된다면 임상적으로 허용할 수 있는 용매이다. 저장에 적절한 용매는 에탄올이다. 보통 입자들은 약 -210 내지 약 +10oC, 또는 약 -210 내지 0, -90 내지 0, -210 내지 -100, -210 내지 -65, -90 내지 -30, -30 내지 0, -30 내지 -10, -20 내지 +10, -10 내지 +10, 0 내지 10 또는 0 내지 5oC 온도에서 저장될 것이다, 그 예로, 약-210, -200, -180, -160, -140, -120, -100, -90, -80, -70, -60, -50, -40, -30, -25, -20, -15, -10, -5, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10oC일 수 있다. 이들은 대략 액체 질소 온도에서 저장될 수 있다. 이는 드라이 아이스 온도에서 저장될 수 있다. 냉장고에서 또는 냉동고에 저장될 수 있다.
상기 구절에서, 참고는 에탈올로 구성된다, 에탈올은 약 30%까지의 물을 포함할 수 있다. 따라서 에탄올은 약 70 내지 약 100% 에탈올일 수 있다, 나머지는 물, 또는 약 80 내지 100, 90 내지 100, 70 내지 90 또는 80 내지 90%이다, 그 예로, 약 70, 80, 90 또는 100% 에탄올이다. 아이소프로판올(Isopropanol), n-프로판올(n-propanol) 또는 n-부탄올(n-butanol)은 또한 물 함량에 근사한 제한으로, 에탈올을 대체할 수 있다. 에탄올 또는 프로판올 사용의 장점은 무균성에 장점이 있는 다른 적용들 또는 환자들에게 전달하기 위한 입자들에 무균성 환경을 제공한다. 몇 가지 예는 메탄올을 사용 할 수 있다.
생체분자는 일반적으로 고가이기 때문에 생체분자에 관련된 방법의 캡슐화 효율은(EE)은 가급적 높다. EE는 예를 들어, 제 1 세라믹 전구체의 종류 및 양, 사용되는 세라믹 전구체에대한 생체 분자의 비율 등을 포함하여 방법의 정확한 성질에 달려있다. 일반적으로 방법은 약 40% 보다 큰 EE을 제공하거나, 약 50, 60, 70 또는 80 %보다 크다. EE는 예를 들어 약 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95 %일 수 있다.
특정 실시 예에서, 생체분자를 포함하는 입자를 제공하는 방법을 제공한다, 이 방법은 다음을 포함한다:
a) 소수성 상에 분산된 친수성 상의 액적을 포함하는 에멀전 형성하기 위해,
소수성 액체, 아미노알킬아미노기능화된 트라이알콕시실란 및 약 8 내지 약 16 사이의 HLB를 갖는 계면활성제를 포함하는 소수성 상; 및
물, 약 pH 5인 물유리 및 생체분자를 포함하는 친수성 상;을 결합하는 단계: 및
b) 상기 액적으로부터 입자와 같은 에멀전을 교반하는 단계.
다른 특정 실시 예에서 생체분자를 포함하는 입자를 만들기 위한 방법을 제공하여, 이는 다음과 같은 방법을 포함한다:
소수성 상을 형성하도록 약 8 내지 약 16 사이의 HLB를 갖는 계면활성제와 소수성 액체를 결합하는 단계 및 아미노알킬아미노기능화된 트라이알콕시실란을 첨가하는 단계;
친수성 상을 형성하도록 물 및 물유리의 결합하는 단계, 약 5 미만으로 pH를 조정하는 단계 및 생체 분자의 첨가하는 단계;
소수성 상 중에 분산된 친수성 상의 액적을 포함하는 에멀젼을 형성하도록 소수성 상 및 친수성 상의 결합하는 단계;
액적으로부터 입자를 형성하도록 에멀전의 교반시키는 단계; 및
입자 표면처리를 위해 입자의 형성 후 에멀전에 표면 처리제를 첨가하는 단계.
이 실시 예에서, 생체분자를 첨가하는 단계는 소수성 및 친수성 상의 결합 단계 이전에 즉시(예로, 1분 미만) 수행된다. 생체분자는 RNA 또는 DNA 또는 이전에 설명했던 다른 생체분자일 수 있다. 이는 siRNA일 수도 있다.
상기 실시 예의 변수에서, 다른 pH 범위는 약 5 미만으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 약 8보다 큰 pH와 같은 기본적은 상태로 사용한다. 본 발명자들은 약 5내지 8의 pH범위 또한 사용가능할 수 있다고 생각한다. 다른 가능한 변형물은 물/물유리(waterglass) 조합대신에 콜로이드성 실리카와 같은 콜로이드성 서스펜션의 사용을 포함한다. 이러한 변형물은 단백질과 같은 상대적으로 큰 생체 분자의 캡슐화에 적합하다.
나노-입자들의 형성(<100nm)
다양한 실시 예에서 특히, 크기 100nm 보다 더 작은 스케일의 입자를 형성하는데 유리할 수 있다. 어떤 경우에 생체 분자의 보다 효과적인 전달을 위해 제공 할 수 있다고 구상된다.
따라서, 본 발명은 또한 구멍 내에 배치된 생체분자를 포함하는 입자를 만들기 위한 방법을 제공하며, 이 방법은 다음을 포함한다:
a) 소수성 상에 분산된 친수성 상의 액적을 포함하는 에멀전을 형성하기 위해,
소수성 액체 및 계면활성제를 포함하는 소수성 상; 및
친수성 액체 및 촉매를 포함하는 친수성 상;을 결합하는 단계:
b) 에멀전에 세라믹 전구체를 첨가시키는 단계 및 세라믹 전구체를 가수분해시키는 단계;
c) 생체분자에 적절한 범위의 친수성 상의 pH를 조절하는 단계;
d) 에멀전에 생체분자 및 기능화된 세라믹 전구체를 첨가하는 단계; 및
e) 입자 액적 내부에 형성되도록 에멀전을 교반하는 단계,
여기서 기능화된 세라믹 전구체는 세포에 입자의 침투를 향상시킬 수 있는 작용기를 포함한다.
마이크로 입자의 준비와 관련하여 상기 설명한 많은 특징 및 실시 예는 본 발명의 측면에 똑같이 적용될 수 있다. 따라서 이러한 특징 및 실시 예는 명시적으로 불필요한 반복을 피하기 위한 참조로 여기에 포함된다. 그 점에서, 본 발명의 양상에 따라 기재된 기능화된 세라믹 전구체는 상기 설명한 제 1 세라믹 전구체에 대응한다. 본 발명의 양상에 따라 기재된 세라믹 전구체는 상기 설명한 제 2 세라믹 전구체에 대응한다.
위의 특징의 혼합 및 상기 언급한 실시 예에도 불구하고, 특히 본 발명의 실시 예에서는 기능화된 세라믹 전구체의 작용기가 화학적으로 예를 들어, 정전기적으로 생체 분자와 상호 작용한다. 예를 들어, 기능화된 세라믹 전구체는 아미노기능화된 알콕시실란과 같은 아미노기능화된 세라믹 전구체일 수 있다. 특정 실시 예에서, 아미노기능화된 세라믹 전구체는 아미노알킬아미노기를 포함한다. 예를 들어, 아미노기능화된 세라믹 전구체는 3-(2-아미노에틸아미노)프로필 트라이메톡시실란, 3-[2-(2-아미노에틸아미노)에틸아미노]프로필 트라이메톡시실란, 3-(2-아미노에틸아미노)프로필트라이에톡시실란 또는 3-[2-(2-아미노에틸아미노)에틸아미노]프로필 트라이에특시실란 또는 이들 둘 이상의 혼합물이다.
계면활성제는 다시 약 8 내지 약 16의 HLB를 갖는다. 좋은 결과는 노닐페놀 에톡시 레이트(nonylphenol ethoxylate)를 달성 할 수 있다는 것이 발견되었다. 소수성 상은 추가적으로 알코올과 같은, 예를 들어, 1-펜탄올인 공동 계면 활성제를 포함 할 수 있다.
나노입자를 준비하는 경우에, 점도는 마이크로-에멀전이 형성되기 때문에 중요하다고 고려되지 않는다(정상 에멀전과 반대로), 이는 열역학적 안정성이 있고 매우 작은(대략 10 nm) 액적으로 구성된다.
어떠한 실시 예에서는, 소수성 액체는 알칸(예로, 헥산(C6) 내지 도데칸(C12)), 싸이클로헥산과 같은 싸이클로알칸, 방향족(예를 들면, 톨루엔, 벤젠) 및 케로신(kerosene)과 같은 혼합물로 구성된다.
친수성 상은 친수성 액체 및 촉매를 포함한다. 예를 들어, 물 및 촉매를 포함하는 친수성 액체는 산성이다. 더욱 일반적으로, 실리콘 알콕사이드의 가수분해에 있어 전형적인 촉매는 산 또는 염기, 플루오라이드(fluorides) 또는 다른 금속 알콕사이드, 예로, 티타늄 알콕사이드일 수 있다.
생체 분자는 상기 설명한 바와 같을 수 있다. 예를 들면, 그것은 음전하이거나 또는 입자의 구멍을 통과 할 수 없을 정도로 충분히 클 수 있다. 생체 분자는 RNA, 안티센스 뉴클레오티드, 및 안티센스(antisense), 압타머(aptamer), DNA, 단백질, 당 단백질, 폴리펩티드, 탄수화물, 또는 이들의 임의의 둘 이상의 혼합물 또는 부가물을 포함 할 수 있다. 특정 실시 예에서 생체 분자는 siRNA를 포함한다.
이 방법은 생체분자 및 생체분자의 변성을 피하기 위해 기능화된 세라믹 전구체의 첨가 이전에, 예를 들어 수산화나트륨(NaOH), 수산화칼륨(KOH) 및 수산화암모늄(NH4OH)와 같은 염기의 첨가로 에멀전의 pH를 조절하는 것을 포함한다. 전형적으로 가수분해는 가수분해된 전구체의 농축을 억제하는 농안 가수분해 반응을 위해 충분한 동력학을 제공하기 위해 낮은 pH(2와 같은)에서 수행한다. 생체분자의 첨가 이전에, pH는 오히려 더 중성 조건으로(즉, pH > 4) 증가한다.
다시, 고분자 또는 착화제는 엔도좀 탈출을 용이하게 하기위하여 생체분자와 입자의 구멍 내에 배치되도록 첨가될 수 있다. 전형적으로, 고분자는 폴리에틸인아민(polyethylinamine), 폴리리신(polylysine) 또는 폴리히스티딘(polyhistidine) 또는 양성자 스폰지 효과를 제공하는 임의의 물질 일 수 있다.
본 발명의 전술한 양상에 따르면, 덧붙여 이 방법은 추가적으로 다음을 포함할 수 있다:
f) 입자의 표면처리를 위해, 입자의 형성 후 에멀전에 표면 처리제를 첨가하는 단계.
표면 처리제는 결합기에 커플링된 폴리에틸렌 글라이콜 사슬을 포함 할 수 있으며, 여기서 결합기는 입자의 표면에 폴리에틸렌 글라이콜 사슬을 결합할 수 있는 결합기를 말한다. 예를 들어, 표면 처리제는 트라이알콕시실릴-PEG와 같은, PEG-실란이다.
표면 처리제는 환자에 있어서 타겟을 타겟팅하는 타겟팅 그룹을 포함 할 수 있다. 예를 들어, 표면 처리제는 트라이알콕시실란 그룹으로부터 PEG의 말단에 타겟팅 그룹을 포함한 트라이알콕시실릴-PEG를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 앞 단락의 설명에 따른 방법에 의해 만들어진 입자를 제공한다.
상기 표시한대로, 생체분자는 질병, 장애 또는 상태의 예방적 또는 치료적 치료에 대한 표시일 수 있다.
따라서, 본 발명의 관점에서 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 여기서 공개되는 미립자 물질을 포함하는 의약 조성물이 제공된다.
약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제는 안전하게 체계적 투여에 사용될 수 있는 고체 또는 액체 필러, 용매, 희석제 또는 캡슐화된 물질일 수 있다. 특정 투여 경로에 따라서, 본 기술 분야에서 잘 알려진 담체를 사용 할 수 있다. 이러한 담체는 설탕, 전분, 셀룰로오스 및 그 유도체, 맥아, 젤라틴, 활석, 황산칼슘, 식물성 기름, 합성유, 폴리올, 알긴산, 인산염 완충 용액, 유화제 등장 식염수 및 염산, 브롬산 및 황산을 포함하는 미네랄 산염과 같은 염, 아세테이트, 프로피온산 및 말론산과 같은 유기산 및 파이로젠-프리 워터(pyrogen-free water)에서 선택할 수 있다. 약학 적으로 허용가능한 담체, 희석제 및 부형제를 설명하는 유용한 참조는 이 참조에 의해 포함되는 Remington’s Pharmaceutical Sciences (맥 출판 회사, 뉴저지 미국, 1991)이다.
투여 형태는 정제, 분산액, 현탁액, 주사제, 용액제, 시럽제, 사탕제, 캡슐제, 좌제, 에어로졸제, 경피 패치 및 이와 같은 것을 포함한다. 이 제형은 또한 주사제 또는 이러한 목적을 위해 특별히 설계된 주입 제어 방출 장치, 또는 이 같은 형태로, 추가적으로 작용하도록 수정된 임플란트의 다른 형태를 포함한다.
임의의 안전한 투여 루트는 본 발명의 미립자 물질을 투여하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 경구, 직장, 비강, 설하, 구강, 정맥 내, 관절 내, 근육 내, 복강 내, 피하, 흡입, 안구내, 복강 내, 뇌실 내, 경피성 및 이와 같은것들에 적용된다.
또 다른 측면에서, 여기에 개시되는 미립자 물질을 투여하는 단계를 포함하는 포유류에서 질병, 장애 또는 상태를 치료하는 방법 또는 상기 포유류에 상기 질병, 장애 또는 상태를 치료하는 약학적 조성물이 제공된다.
또 다른 측면에서 포유동물의 질병, 장애 또는 상태를 치료하는데 사용하기 위해, 여기에 개시된 것과 같은 미립자 물질이 제공된다.
질병, 장애 또는 상태는 유전 질환, 장애 또는 상태(예로, 낭성 섬유증이나 헌팅턴병), 퇴행성 질환, 장애 또는 상태(예로, 노인 관련 황반 변성), 암(예로, 고형 종양, 육종, 림프종, 상피성 암, 골수종, 유방, 자궁 경부, 폐, 전립선 암을 포함하는 흑색종 등이 있으나 그것에 한정하지 않음), 면역 체계의 질병, 장애 또는 상태, 자가 면역 질환 (예로, 제 1 형 당뇨병, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 전신성 포괄적인 루프스) 및 염증성 상태 (예로 천식, 염증성 장 질환, 사구체 신염), 바이러스(예로 C 형 간염, 인플루엔자, 호흡기 세포융합 바이러스 감염, 에이즈), 박테리아(예로 폐렴, 세균성 뇌막염, 백일해, 결핵, 파상풍), 원생동물 (예로 말라리아) 또는 진균류 (예로 칸디다 균)와 같은 병원균에 의한 감염이 원인인 질병, 상태 또는 장애, 순환계 질환, 장애 또는 상태 (예로, 죽상 경화증, 재 협착, 고 콜레스테롤 혈증), 내분비 계 (예로, II 형 당뇨병, 골다공증, 췌장염)의 질병, 장애 또는 상태, 또는 신경성 질병, 장애 또는 상태(예를 들어, 알츠하이머, 파킨슨 병 또는 간질), 이 있으나 이에 제한은 없다.
포유동물은 인간 또는 퍼포먼스 동물(예로 경주마), 국내 애완동물 (예로 개, 고양이) 및 가축 (예로 소, 말, 양, 돼지),을 포함하는 비-인간 포유류가 있으며, 이에 제한은 없다. 더 선호하는 것은, 포유동물은 인간이다.

본 발명의 실시 예는 이제 첨부된 도면을 참조해서만 예시에 의해, 설명될것이다. 이것은 다음과 같은 논의가 어떤 방법으로든 발명에 제한으로 채택되지는 않을 것 있다는 것을 인식해야한다. 그림에서 :
도 1은 본 발명의 입자의 제조를 나타내는 플로우 차트(flow chart)이다;
도 2는 본 발명의 방법에 의해 만들어진 siRNA를 포함하는 입자들의 TEMs를 보여준다;
도 3은 입자들의 입자크기 분포를 나타낸다;
도 4는 본 발명 입자들의 추가적인 TEMs를 나타낸다;
도 5는 입자들로부터 형광 siDNA의 방출에 대한 입자 전하 및 페길레이션(PEGylation)의 영향을 설명하는 그래프를 나타낸다;
도 6는 입자들의 서로다른 페이로드의 방출 키네틱을 나타낸다;
도 7은 비캡슐화된 siRNA의 HPLC 크로마토그램(빨간 줄) 및 본 발명에 따라 제조된 입자들의 방출된 siRNA를 나타낸다;
도 8은 본 발명 입자들의 서스펜션의 사진을 나타낸다;
도 9는 음전하, 중성 및 양전하를 갖는 입자들에 대해, 입자들의 세포 속으로의 침투를 묘사한 현미경사진을 나타낸다;
도 10은 음전하, 중성 및 양전하를 갖는 입자들 내 운반물질의 유지를 설명하는 현미경 사진을 나타낸다;
도 11 및 12는 운반물질(cargo)이 입자들을 보유한 세포로 들어가는 것을 설명하는 현미경 사진이다 - 도 11 은 입자를 나타내고 도 12는 운반물질을 나타낸다;
도 13은 시간의 함수로 HEPG2 세포 내의 siDNA의 분산을 나타낸다;
도 14는 시간의 함수로 헬라(HeLa) 세포들의 siDNA의 분산을 나타낸다.;
도 15는 시간의 함수로 RAW264 세포 내의 siDNA의 분산을 나타낸다;
도 16은 시간의 함수로 siDNA의 분산을 나타낸다;
도 17는 BJ 섬유아세포 내 DPP4의 활성에 대한 본 발명의 입자들의 효과를 나타낸다;
도 18은 올리고뉴클레오티드의 캡슐화되는 프로토타입 방법의 자세한 플로우 차트(flowchart)를 나타낸다;
도 19는 나노 크기의, 본 발명의 입자의 준비를 나타내는 플로우 차트(flow chart)이다;
도 20은 도 19에서 설명된 방법에 따라 만들어진 입자들의 FEG-SEM 이미지를 나타낸다;
도 21은 형광-DNA로 표지된 입자들의 형광 이미지와 상을 나타낸다; 및
도 22는 헬라(HeLa)세포의 나노 입자들의 침투를 보여준다.
변형된 실리카 입자들로부터 siRNA의 캡슐화 및 제어된 방출은 설명되었다. 그 입자들은 비결정성 실리카(SiO2)와 운반물질 유지 및 세포 침투를 돕기 위해 포함된 아미노실란(aminosilanes)의 비율로 구성된다. 입자들은 생체적합성을 위해 변형된 표면이다(순환되는 반감기 ~4시간). 입자들은 포유류의 세포막을 침투할 수 있고 엔도조멀(endosomal)과 세포 내 공간에 그들의 운반물질을 방출할 수 있다.
도 1은 siRNA의 캡슐화를 포함하여 입자들의 합성을 설명한다(대표적인 생체분자, 이는 결과적인 입자들의 운반물질을 나타낸다). 따라서, 도 1의 참고에 따르면, 소수성 연속 상은 30 mL 무거운 파라핀 오일과 4.5 g SPAN-20 (=500 mM)의 결합에 의해 만들어 진다. 이들은 저음으로써 결합된다(30분). 아미노실란(DATMS 또는 TATMS, APTES는 아님)은 원하는 전하를 위해 충분한 양을 첨가했다: 음전하 입자를 위해서는, 첨가 없이, 중성 입자를 위해서는, DATMS (1.5 uL = 실리콘 1mol% ) 및 양전하 입자를 위해서는, DATMS (15 uL = 실리콘 10 mol%). 그 다음 결과 혼합물을 적어도 추가적으로 10분 이상 60분 이내로 교반하였다.
실리카 용액은 4 mL 물유리(waterglass)와 20 mL 물의 결합으로 준비하였다. 충분한 양이온 교환 수지를 혼합물에 추가하고 저음으로써 pH 4.0이 되었다. 실리카 용액을 수지에서 깨끗한 용기로 부었다.
소수성 상은(상기 설명되로 만들어진) 자기적 저음 및 음파처리(3/8" probe)를 동시에 준비되었다, 및 스터러를 작동시켰다. 초음파분쇄기는 소수성과 친수성 상을 결합하기 위한 준비로 70 % 전력 (~ 700 W)로 상승(ramp)했다.
5 mg 운반물질(250 uL 20mg/mL siRNA 용액)은 상기 묘사된것 처럼 준비된 실리카 용액 1.25 mL 와 혼합했다. 10초의 음파처리 후, 실리카/운반물질 혼합물은 초음파분쇄기 활성 영역에 첨가되었다. 음파처리는 30초 동안 계속되었고 초음파분쇄기는 비활성화되었다. 에멀전은 제거되고 자기 스틸러(stirrer)에 넣고 한 시간 동안 저어주었다. 그 후에, PEG5000-실란(10 mg)을 혼합물에 첨가하고 그 결과 입자 서스펜션을 밤새 저었다.
입자들은 원심분리에 의해 에멀전으로부터 수집되었다(10분 동안 15000xg). 에멀전은 그런 다음 점도를 줄이기 위해 0.5 부피 싸이클로헥산으로 희석했고 두번의 싸이클로헥산(약 40 mL)으로 그리고 두 번 100 %의 에탄올(약 40 mL)로 세척하였다. 각 세척 단계는 재서스펜션하는 단계와 입자들을 수집하는 단계 및 상청액을 따라 붓는것을 포함한다. 입자들은 마침내 저장을 위해 -20oC 또는 4oC에서 100% 에탄올 5 mL에서 재서스펜션된다. 입자들은 생물학적 활동의 실질적 손실없이 4oC에서 몇개월간 저장될 수 있지만, 더 낮은 온도에서의 저장은 장기간의 저장을 제공하였다.
상기 방법은 약 300 nm의 질량-가중 평균 직경 (d0.5)에, 100-1000 nm의 입자 크기에 이르는 다양한 입자를 제공한다. 이는 도 2 및 4에서 보여준다. 도 3는 입자의 입자 크기 분포를 보여준다. 약 1 마이크론의 어깨는 아마 응집 입자들의 작은 양을 나타낸다. 상기 방법은 아래 설명한대로 연구에서 사용되지만, 이 방법의 변형은 d0.5<150 nmm에서의 분산입자를 제공한다.
입자들은 첨가된 아미노실란의 양 및/ 또는 유형을 다양화하여 상이한 전하를 가진것으로 제조되었다. DATMS (아미노에틸아미노프로필트라이메톡시실란: 한 분자 당 2개의 질소)은 기준으로써 사용한다. APTES (아미노프로필트라이메톡시실란: 한 분자 당 1개의 질소)가 훨씬 덜 효과적이고 TATMS(아미노에틸아미노에틸아미노프로필트라이메톡시실란: 한 분자 당 3개의 질소)는 DATMS의 결과와 유사함을 보였다.
상기 설명한 바와 같이, 아미노실란을 소수성 상에 첨가하고 친수성 트랜스퍼에의해 친수성 상으로 이동하게 된다. 상 사이를 구획함으로써 포함된 아미노실란의 양이 첨가량보다 적었다. 아미노실란의 친수성 상(즉, 물유리와의 결합)에 직접적인 첨가는 조기 겔화의 원인으로 산성 pH에서 실행가능하지 않았다.
입자들의 전하는 10 mM MOPS (3-N-모르폴리노프로판설폰산(3-N-morpholinopropane sulfonic acid) 완충용액)에서 pH 7.0에서 측정되었다. 입자들의 제타(Zeta) 전위는 다음과 같다:
네거티브(Negative) (아미노실란 없는경우): ξ ≤ -30 mV
뉴트랄(Neutral) (1% DATMS): -5 mv < ξ＜ 5 mV
포지티브(Positive) (10 % DATMS): ξ ≥ +10 mV
간접적인 측정 방법의 사용에도 불구하고, 측정된 전하는 배치(batch)들 사이에서 자주 반복될 수 있었다.
캡슐화 효율(EE)의 비율은 방출된 양으로부터 측정된 실제 로딩(loading)된 siRNA(첨가된 양으로부터 결정된)의 이론적 로딩(loading)과의 비교로 결정되었다. 결과는 아래와 같다:
이론적 로딩(loading): 5%
EE ( 1 mg/mL 방출)
배치 1: 85% +/- 5%
EE ( 0.1 mg/mL 방출)
배치 1: 80% +/- 2%
배치 2: 85% +/- 10%
실제 로딩(loading) 4.2%
이론적 로딩(loading): 10%
EE 75%, 로딩(loading) 7.5%
따라서 더 높은 RNA의 양이 낮은 캡슐화 효율에 도입되었다:
도 5는 다양한 전하와 표면 변형을 갖는 실리카 입자로부터 형광표지된 siDNA의 방출의 효과를 보여준다. 상기 논의한 바와 같이, 입자의 전하는 사용된 아미노실란의 양의 변화에 따라 조절가능하다. 양전하 입자들의 방출은 양전하 입자와 음전하 입자의 페이로드(payload) 사이의 예상되는 인력에의해 예견되듯이 음전하된 입자들보다 매우 느리다. 음전하로 대전된 입자의 경우, 입자 표면상의 PEG의 존재는 페이로드의 방출을 가속화시키는 것으로 보인다.
입자들의 페이로드(payload)의 방출은 주로 입자 매트릭스의 용해에 의한것으로 생각되어진다. 물 매개 내에서(약 1mg/mL 이하의 입자들) 높은 농도에서, 입자들로부터 운반물의 침출은 입자 용해에의한 매개로 제한된다. 즉, 용액은 입자 매트릭스 내에서 포화상태에 도달하고, 이것때문에 페이로드(payload)의 방출이 제한된다. 이는 도 6에 도시되는데, 활성화되고(dot point values) 빠르게 움직이는(square point values) siRNA 분자의 비교적 빠른 방출이 실리카 매트릭스의 용해도에의해 규정된 제한에까지 발생하였다. 입자들의 농도가 다른것은 도 5에서 분명하지 않은것을 알아야한다. 농도는 상당히 실리카의 용해도 한도보다 낮거나(대략 100μg/mL), 또는 이 상태에서 방출 용액은 계속해서 재생되고, 입자의 완전한 분해는 약 12 내지 24시간에 걸처 일어난다. 입자들은 96% 에탄올 속에서 253K에 36일 동안 상기 설명한 바와 같이 저장되었다. 저장 후, 입자들은 완전히 RNase가 없는(free) 물에 용해되었다. HPLC에서 얻은 액체의 용출은 캡슐화 및 방출이 크게 siRNA의 그다지 영향을주지 않았음을 나타내는, 완충액 중에서 캡슐화되지 않은 siRNA의 그것과 매우 유사 프로파일을 나타냈다.
도 7은 캡슐화되지 않은 siRNA 및 본 발명에 따라 제조된 입자들로부터 방출된 siRNA의 HPLC 크로마토그램을 보여준다. 양 입자들 및 대조군(캡슐화되지않은 siRNA)을 15분간 RNase A로 처리했고 RNase 억제제(inhibitor)를 포함하는 PBS 내에서 서스펜션이 되기전에 PBS로 3번 세척했다. 실리카 입자로부터 방출된 물질은 온전한 RNA를 보여준다. 비캡슐화된 siRNA의 비슷한 소화는 완전히 파괴되었다. 이 실험은 효소 저하에 대한 캡슐화된 생체분자를 보호 할 수있는 입자들의 용량을 나타낸다.
도 8은 PBS(왼쪽)나 PBS내 50% 쥐 혈청(오른쪽) 중 하나의 3 mg/L에 현탁된입자들의 사진을 보여준다.
밤새 배양한 후 눈에 띄는 응집은 발생하지는 않는다. 입자들 또한 1,500 ppm BSA에 1, 3, 10 mg/kg으로 정지되었고, 그 다음 2시간 동안 배양되었다. 입자 크기는 크기 프로파일에서는 시간 또는 농도 매개 변화를 밝히지 않고 마스터사이저(mastersizer)(미(Mie) 산란)에 의해 결정되었다.
결론적으로, 4%의 운반물질 양은 보통 성취할 수 있고, 약 8%의 양은 입증되었다. 80% 이상의 캡슐화 효율은 보통 성취할 수 있다. 입자 내 생체분자의 보존은 주로 정전기적인 힘에 의해 중재되는것처럼 보이며 생리학적 pH에서 분해가 제한되는 특성을 보인다. (즉, 매트릭스의 분해에 의하여 대부분의 방출이 일어난다.) 운반물질 보존 특성은 96% 에탄올(EtOH)에서, -20oC에서 40일간 저장 후 변하지 않음을 보여주었다.
포유류 세포에 활용(uptake)
세포 침투와 운반물질 유지에 관한 입자 전하의 영향, 및 세포와 엔도좀 탈츨(endosomal escape)에의 활용의 시간 과정(time course)를 조사하였다.
RITC( 로다민 아이소싸이오시아네이트(rhodamine isothiocyanate))로 표지된 입자와 siRNA 형 시퀀스 DNA로 운반해 온 입자 및 FITC (fluorescene isothiocyanate)로 표시된 입자들은 공유결합으로 합성되었다. 세포들(NIH3T3, HeLa, HEPG2)은 50%의 컨플루언스(confluence)로 배양하였고 상기 설명한 입자들(약 30μg/mL, 100nM DNA와 동등)은 배지에 직접적으로 첨가되었다. 40시간 후, 세포에 침투하지 않고 에피형광성(epifluorescent)의 현미경으로 이미징화된 입자들을 제거하기 위해 배양조직을 PBS (phosphate buffered saline)로 한번 세척되었다.
도 9는 RITC 표지를 모니터링한 결과를 보여준다: 이미지의 각 쌍, 상단의 이미지는 위상 콘트라스트 이미지이며 하단 이미지는 형광 이미지이다. 도 9는 입자들에 양전하가 증가하는것과, 더 많은 입자가 세포에 포함되어 있음을 나타낸다. 따라서, 입자의 양전하는 페이로드(payload)에 결합되는것을 지원할 뿐만 아니라 입자를 세포에 활용하는 것을 돕는다. 도 10은 운반물질이 중성 또는 음전하 입자와 비교하여 세포에 포함됨으로써 양전하 입자내에서 더 효과적으로 유지됨을 설명한다. 이 도면은 전하에 의한 siDNA 유지를 보여준다. 이미지의 각 쌍에서, 상단 이미지는 위상 콘트라스트 이미지이며 하단 이미지는 siDNA 형광 이미지이다.
도 11은 두 개의 서로 다른 세포 라인을 보여주고(즉, 입자 분포), 도 12는 표지된 페이로드를 갖는 동일한 샘플의 현미경 사진이 강조됨을 보여준다(즉, 운반물질 분포). 이들 도면 모두에서 이미지의 각 쌍에서, 상단 이미지가 위상 콘트라스트 이미지이다. 도 11에서 이미지의 각 쌍에서 하단 이미지는 RITC 형광 (적색 채널) 이미지이고, 도 12에서 각 쌍에서 하단 이미지는 siDNA (녹색 채널)의 형광 이미지이다. 이 두 도면을 비교하여 세포 내 침투한 입자로써 입자 내에 siRNA가 유지됨을 확인 할 수 있다. 세포 내부의 녹색과 붉은 점의 콜로케이션(collocation)은 형광 DNA 운반물질이 유지되는 동안(녹색 채널 도트 = DNA) 실리카가 안으로(적색 채널 도트 = 실리카 입자) 침투한것을 의미하며, 따라서 DNA가 성공적으로 세포 내부로 이동하였음을 입증할 수 있다. 도 13에서 15는 본 발명의 입자들의 방법에 의해 다양한 세포 라인으로(도 13: HEPG2; 도 14: HeLa; 도 15: RAW264) 표지된 siDNA 도입의 시간 과정을 보여준다. 각 그림은 세포의 각 시간 후 치료에 형광 분포를 보여준다. 각 경우에, 더 짧은 기간에서 siDNA는 주로 세포 내 입자들 내에 편재를 나타내면서, 좁은 영역에 위치함을 볼 수 있다.
더 긴 기간에서 siDNA는 세포를 통해 분포 및 입자 매트릭스의 분해에 의해 입자들로부터 방출을 나타내면서, 더 넓은 영역으로 확산된다.
도 16은 공초점 현미경을 사용한 비슷한 실험을 보여준다. 도 16에서 각 쌍의 상단 이미지는 핵 염색(파란색 채널)을, 하단 이미지는 siDNA 형광(녹색 채널)을 보여준다. 따라서, 헬라(HeLa) 세포가 25 % 컨플루언스인 폴리 라이신으로 코팅된 커버슬립(coverslips) 상으로 둘러졌다(plate). 이것은 FAM-DNA를 운반하는 RITC-변형된 입자들로 24시간 또는 48 시간동안 처리되었다. 그것들은 PBS로 세척하고 PBS에 3.7% 포름알데하이드로 고정하였다. 그 다음 식염수 내에서 1.2μg /mL Hoescht 33342로 오염시키고 Gelmount과 아크릴로 슬라이드에 장착하며, 100x 배율로 공초점 현미경으로 이미징화하였다. 이미지는 150 x 150 μm, z-축 슬라이스 깊이 350 nm이다. 잘 정의된 대략적인 원 구조는 핵 DNA를 나타낸다. 24시간 후, 입자 내에 편재된 페이로드(payload)를 나타내는, 작고 밝은 영역이 다수 있다. 확산된 소량의 빛은 방출된 페이로드의 소량을 나타낸다. 48시간 후, 포인트 소스는 대체로 사라졌으며, 입자의 분해를 나타낸다. 대신, 각 세포는 세포내로 방출된 페이로드(payload)를 나타내는 밝은 영역의 확산 할로(halo) 광을 갖는다.
유전자 넉다운(Gene Knockdown) 연구
도 17은 넉다운에서 현재 로드된 입자들의 효과를 보여주는 실험의 결과를 보여준다(즉, 유전자 발현의 억제). 이 실험은 인간 BJ 섬유아세포에서의 DPP4의 효과적인 넉다운을 보았다. siRNA는 홀로 비효과적이고, 이는 아마도 현 체계에서 RNase 존재에 의해 불활성화되기 때문이다. 놀랍지않게도, 언로드된 실리카 입자들 또한 비효과적이다. siRNA/Lipo로 표지된 측정은 리포펙타민(Lipofectamine)의 도움으로 감염된 siRNA를 의미하는데, 이는 세포막을 가로질러 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)를 감염시키는것으로 알려져 있다. 이 체계는 독성이 있고 효소 공격으로부터 siRNA를 보호하지 못하는 단점을 갖고 있다. siRNA/나노(nano)로 표지된 측정은 본 발명에 따라 입자들 내에서 siRNA가 캡슐화되었음을 나타낸다. siRNA가 존재하는 각각의 경우에, 그것은 약 200nM에 사용되었다. 결과는 캡슐화된 siRNA이 이 농도의 넉다운에서 효과적임을 보여주고, 그리고 이는 사실 리포펙타민(Lipofectamine)을 갖는 siRNA보다 약간 더 효과적이다.
시험관 내 결론
· 본 발명에 따른 입자로의 생체분자의 캡슐화는 효소 저하로부터 생체분자를 보호할 수 있다.
· 일반적인 배양 조건에 세포를 적용하면, 생체 분자에서 로드된 입자들은 세포질막을 관통할 수 있고 세포 내의 공간에 운반물질을 전달 할 수 있다.
· 본 발명의 입자를 통한 조직 배양 세포로의 생체분자의 전달은 이러한 세포의 mRNA 수준의 용량 의존적으로 감소의 결과가 된다.
· mRNA 수준을 50 % 초과로 감소를 초래하기에 충분한 입자 중에 캡슐화된 siRNA의 용량은 시험관 내에서 그다지 상당한 독성을 나타내지는 않는다.
추가적인 결과 - 입자의 합성
일반적인 합성 방법은 도 18에 있는 플로우 차트에 의해 설명된다. 입자 형성은 계면활성제 용액에 수성 전구체의 첨가로 매우 빠르게 이루어진다. 그러나, 일반적으로 에멀전 형성과 입자 수집 사이에 적어도 12시간이 필요하였다.
올리고뉴클레오타이드의 유지는 운반물질과 입자의 아미노실란 성분사이의 정전기적 상호작용에 의해 강하게 영향을 받는다. 이는 대체물의 양과 종류, 및 캡슐화, 유지, 방출 특성을 결정할 때 형성과 방출의 중요한 요인 모두의 pH 또한 만든다.
파라미터
본 실시 예에서 사용된 계면활성제는 소르비탄 모노라우레이트(Sorbitan monolaurate) (SpanR 20)였다. 계면활성제 농도는 약 17 질량 %로 사용하였다. 소수성 상은 무거운 액체 파라핀이고, 시험된 가장 작은 입자를 제공하였다. 입자들의 크기는 자기적 저음 및 초음파처리를 결합하여 정맥 주사에 적용할 수 있을 크기로 줄였다.
운반물질 유지를 향상키는데 사용되는 선호되는 아미노실란은 DATMS (aminoethylaminopropyl trimethoxysilane)였다. APTES (aminopropyl triethoxysilane) 및 TATMS (aminoethylaminoethylaminopropyl trimethoxysilane) 실험은 더 작은 또는 더 큰 범위에 효과가 있음을 보여준다, 그리고 미세 조정 유지 / 방출 특성에 사용 할 수 있다. 운반물질 양은 입자 제타 포텐셜에 영향을 미칠것으로 예상되고, 아미노실란 변형은 최대 로딩에 영향을 미칠것으로 기대된다.
물유리에 대한 최소 안정성의 pH는 약 5.5이다, 이는 RNA의 최대 안정성의 pH를 나타낸다. 만일 실리케이트 용액이 너무 중성에 가까운 경우, 전구체가 입자 합성에 사용될 수 있기도 전에 동시에 겔이 될 것이다. 만일 용액이 너무 산성인 경우, 뉴클레오티드 운반물질의 상당한 저하가 발생할 것이다. RNA 운반물질을 갖는 pH 3.75 내지 4.00의 전구체는 취급이 다소 어려운 경우에 적합하다는 것이 입증되었다. DNA, LNA, 또는 다른 변형된 올리고뉴클레오타이드는 더 산성인(그리고 따라서 보다 안정) 전구체 용액을 허용할 수 있다.
실시 예- 도 18
DATMS, 로다민(rhodamine), 및 mPEG-5000로 변형된 입자에 siRNA의 캡슐화:
다우엑스(Dowex) 50W의 15g은 100 mL 5M 염산(HCl)과 30분 동안 저어 활성있고, 양자화 형태의 수지로 전환하였다. 그 다음 소결된 유리 필터 경로로, 진공-보조의 여과로 수지를 회복하였고, 여기서 잔여 HCl을 제거하기 위해 100mL milliQ 물로 두번 세척하였다.
9 그램 SpanR 20은 테플론 비커(Teflon beaker)에 무게를 재고 60 mL 액체 파라핀을 추가하였다. 그 결과 혼합물은 30분 동안 저어주어 파라핀에서 SpanR 20의 용해가 완성되었다. 2-프로파논 중의 29μL DATMS 액체 및 6 μL 10 % 로다민-APTES을 저어서 계면 활성제 용액에 추가하였다.
4.0 mL 소듐 실리케이트 용액을 28 mL milliQ 물에 첨가하였다. 이 용액 8.0 mL는 주요 부피(volume)의 뒤따르는 적정을 위해 따로 두었다.
용액의 pH를 계속하여 관찰하기쉽게 pH 검출법을 사용하여, 실리케이트 혼합물의 pH를 약 3.5로 줄이기 위해 활성화 양이온 교환 수지를 추가하였다. 실리케이트 용액을 수지로부터 따라 붓고 pH를 다시 확인하였다.
이 전구체 용액의 2.5 mL를 5 mL 플라스틱 튜브에 옮겼다. 운반물질 RNA 용액의 적절한 부피(<0.5 mL)를 1.5 mL 튜브에 옮겼다.
운반물질 RNA 용액을 실리케이트이트 전구체로 피펫하였다. RNA/실리케이트 혼합물은 계면활성제 용액으로 피펫하였고 25초 동안 저으면서 초음파처리를 계속하였다.
그 결과 생긴 에멀전을 15초 동안 빠르게 저었다. 15 mg mPEG-5000 실란 가루를 에멀전에 첨가하였고 그 결과로 생긴 혼합물을 밤새 저었다.
혼합물은 입자를 분리하기 위해 2000 x g이상에서 5분동안 원심분리하였다. 그 입자들은 파라핀과 계면활성제를 제거하기 위해 싸이클로헥산으로 두번 세척하였고, 각 세척 후 원심분리, 및 그 다음 에탄올로 한번 더 세척하였다. 입자들을 원심분리로 수집하였고, 서스펜션은 따라 부었고, 입자들을 10 mL에서 재서스펜드 하였다.
생성물의 전형적인 무게는 200 mg이 얻어진다. 전형적인 캡슐화 효율은 80% 이상이다. pH 7.4에서 입자의 전형적인 제타(zeta)는 +20 mV이다. 입자들과 결합된 단백질의 전형적인 감소는 기본 실리케이트 입자(페길레이션(PEGylation) 밀도의 측정)와 비교하여 90% 이상이었다.
실시 예 - 도 19
A. 생체 분자 캡슐화를 위한 입자의 마이크로에멀전 합성
0.381 g의 NP9는 유리관 내에서 저음(자기적)으로써 3 mL의 싸이클로헥산(0.2 mol/L)에서 용해시키고 0.065 mL의 1-펜탄올을 공동 계면활성제로서 연속적으로 첨가하엿고 계속 저었다(0.2 몰 / L). 결과 용액은 소수성 상을 구성한다.
0.013 mL의 0.01M 질산(HNO3)은 산 촉매로서 활성하기 위해 첨가되었고, 친수성 상을 구성하고, 용액을 균질화시키기 위해 20분간 저었다. 결과 용액은 마이크로 에멀전의 형태였다.
0.018 mL의 테트라메틸오쏘실리케이트(tetramethylorthosilicate) (TMOS)를 첨가하였고 그 결과 용액을 TMOS를 가수분해하고 가수분해된 전구체 용액을 제공하기 위해 66분 동안 저었다.
pH를 약 4보다 크게 조절하기 위해 0.013 mL의 0.01M NaOH를 첨가하고 5 분동안 저었다.
생체 분자의 첨가는 물 0.010 mL의 첨가하면서 저으면서 시뮬레이션했다. 기능화된 세라믹 전구체로써 0.003 mL의 3 - (2-아미노에틸아미노)프로필트라이메톡시실란(3-(2-aminoethylamino)propyltrimethoxysilane)을 첨가하였고 혼합물을 6.5시간 동안 저어, 점차적으로 용액은 더 흐려졌다. 이는 나노 입자의 서스펜션이 생성된 것이다.
5 mg의 mPEG-실란(MW = 5000)은 첨가되고 남은 용액은 15분간 휘젓는다. ㄱ그 다음 용액을 입자를 분리시키기 위해 원심분리(1분에 13,000)하고 그 입자들을 2 mL 에탄올로 세번 세척하고, 2 mL 에탄올에서 부유하였다.
입자들은 30 내지 100 nm의 크기 범위를 보이는 FEG-SEM에 의해 이미지화되었다. 참고는 도 20으로 구성되어 있다.
B. 생체 분자 캡슐화를 위한 입자의 마이크로에멀전 합성
0.636g의 NP9는 유리관(glass vial)에서 저음(자기적)으로써 5 mL의 싸이클로헥산(0.2 mol/L)안에서 용해되었다. 0.109 mL의 1-펜탄올을 공동 계면활성제로써 계속 저으면서 첨가하였다(0.2 mol/L). 1.14 mL의 싸이클로헥산/NP9/1-펜탄올 용액을 두번째 유리관으로 피펫되었다(x2).
0.011mL의 0.01M 질산(HNO3)을 상기 부표본에 첨가하고, 용액이 균일하도록 40분간 저어서 마이크로에멀전 형성하였다.
0.0125 mL (0.08 mMol)의 테트라메틸오쏘실리케이트( tetramethylorthosilicate)을 부표본에 첨가하였고 결과 용액을 TMOS를 가수분해하기 위해 17.5시간 동안 저어주었다. 0.011 mL의 0.01M NaOH를 양 샘플에 첨가하고 4보다 크게 pH를 조절하기 위해 5분 동안 저었다.
0.006 mL의 플루오로-DNA (fluoro-DNA) 용액(FITC-표지된 DPP4 (21 염기쌍)), 물에 0.5 mg/mL)을 하나의 샘플에 저으면서 첨가하였고 그리고 0.006 mL의 물을 저으면서 두번째 샘플에 첨가하였다.
0.002 mL (0.009 mMol) of 3-(2-아미노에틸아미노)프로필트라이메톡시실란(3-(2-aminoethylamino)propyltrimethoxysilane)을 기능화된 세라믹 전구체로써 각 샘플에 첨가하고 혼합물을 6시간 동안 저어주었다.
0.8 mg의 mPEG-실란(MW = 5000)을 각 샘플에 첨가하고, 그 샘플을 18시간동안 저어 두었다. 1 mL의 아세톤을 각 샘플에 첨가하고 용액을 10분간 저었다.
입자를 분리하기 위해 용액을 원심분리(1분에 13,000)하였고, 그 다음 그 입자들을 2mL의 에탄올로 세번 세척하였다. 플루오로(fluoro)-DNA (CS11-0028)를 포함하는 샘플이 2 mL의 에탄올에서 떠올랐다. 오직 물을 사용하여 만든 샘플(CS11-0029)을 40°C에서 건조하였고 7.3mg으로 무게가 측정되었다.
플루오로(fluoro)-DNA로 표지된 입자들의 몇몇 액적들을 현미경 슬라이드에서 건조하였고 40X 배율 및 4초 노출의 FITC 필터를 장착한 형광 현미경을 사용하여 이미지화 하였다. 참고는 도 21으로 구성되어 있다.
도 22는 AlexaFluor-633로 표지된 실리카 나노입자와 배양된 인간 간세포 형질주입을 설명한다. 세포들은 이미징화 전에 24시간동안 처리되었다.
추가적인 실시 예
공유결합으로 FITC로 표지된 입자들과 홍조소(Phycoerythrin)의 페이로드(payload) 운반된 인자들이 합성될것이다. 헬라(HeLa) 세포들은 50% 컨플루언스로 배양될것이고 상기 묘사된 입자들은(약 30μg/ml) 배지에 직접적으로 첨가될 것이다. 40시간 후, 세포 내로 침투하지 못한 입자들을 제거하기 위해 배양조직은 PBS(phosphate buffered saline)로 한번 세척될 것이고, 그 다음 전달된 홍조소(Phycoerythrin)의 세포내 방출(release)을 확인하기 위해 에피형광(epifluorescent) 현미경에 의해 이미징화한다.
문맥을 달리하거나 특별히 반대로 명시할 필요가 없는이상, 단 정수, 단계 또는 요소로써 여기에 인용된 본 발명의 정수, 단계 또는 요소는 명백하게 단수형 및 복수형 형태를 모두 아우른다.
이 명세서를 통해, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, "포함한다"(“comprise”), 또는 "포함한다"(“comprises”)과 같은 변형 또는 "포함함"(“comprising”)이라는 단어는 단계 또는 요소 또는 단수 또는 단계의 그룹 또는 요소들 또는 단수들을 포함하는 의미이지만, 다른 단계 또는 요소 또는 단수 또는 단계들의 그룹, 단수들의 요소들을 배제된다. 따라서, 이 명세서의 문맥에서, 단어 “포함함"("comprising")은 포함되는 의미로 사용되고 “반드시 전적으로가 아닌, 주로 포함하는”의미로 이해되어야 한다.
전술 한 설명은 본 발명의 성명한 예시로 주어지고 모든 이 같은 변형 및 변화는 이와 같은 본 발명이 속한 기술 분야에서 그 기술분야의 사람들에게 명백할 것임이 여기에 명시된 본 발명의 광범위한 범위 및 영역 내에 떨어질 것으로 간주된다.

Claims (64)

  1. 세포들로 입자들의 침투를 촉진할 수 있는 작용기를 갖는 세라믹 매트릭스의 입자; 및
    상기 세라믹 매트릭스의 용해에 의해 상기 입자로부터 방출될 수 있고, 상기 입자의 구멍 내에 배치된 생체분자;를 포함하는 미립자 물질.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 생체분자는 실질적으로 상기 세라믹 매트릭스의 용해가 없을때 침출에 의해 입자로부터 방출되지 않는 것인, 미립자 물질.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 작용기는 실질적으로 침출을 방지하기 위해 상기 생체분자와 화학적으로 상호작용하는 것인, 미립자 물질.
  4. 제 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    작용기를 갖는 상기 세라믹 매트릭스는 기능화된 실리카 매트릭스를 포함하는 것인, 미립자 물질.
  5. 제 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세라믹 매트릭스의 작용기는 아미노알킬아미노 그룹을 포함하는 것인, 미립자 물질.
  6. 제 1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생체분자는 RNA, 안티센스 뉴클레오티드(antisense nucleotide), 안티센스(antisense), 압타머(aptamer), DNA, 단백질, 당 단백질, 폴리펩티드, 탄수화물이나 혼합물 또는 이들 둘 이상을 포함하는 혼합물 또는 부가물을 포함하는, 미립자 물질.
  7. 제 1항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol) 사슬들은 상기 입자의 표면에 커플링되는 것인, 미립자 물질.
  8. 제 1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 타겟 그룹은 상기 입자의 표면에 커플링되는 것인, 미립자 물질.
  9. 제 1항 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 입자들은0.1에서 10 마이크론 크기의 평균입자, 바람직하게는 0.1에서 1 마이크론을 갖는 것인, 미립자 물질.
  10. 제 1항 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 입자들은 약 20에서 약 100 nm의 평균 입자 크기를 갖는 것인, 미립자 물질.
  11. 제 1항 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 입자들은 약 1에서 약 50 nm 의 구멍 크기를 갖는 것인, 미립자 물질.
  12. 제 1항 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 입자들은 약 1에서 약 20% w/w 의 생체분자의 로딩(loading)을 갖는 것인, 미립자 물질.
  13. 제 1항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 고분자 또는 착화제(complexing agent)는 상기 생체분자의 상기 구멍 내에 배치되는 것인, 미립자 물질.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 고분자는 폴리에틸인아민(polyethylinamine), 폴리리신(polylysine), 또는 폴리히스티딘(polyhistidine), 또는 양자 스폰지 효과를 제공하는 물질인, 미립자 물질.
  15. a) 소수성 상에 분산된 친수성 상의 액적을 포함하는 에멀전을 형성할 수 있도록,
    소수성 액체, 제 1 세라믹 전구체 및 계면 활성제를 포함하는 소수성 상; 및
    친수성 액체, 제 2 세라믹 전구체 및 생체분자를 포함하는 친수성 상;을 결합하는 단계:
    b) 상기 액적 내에 입자가 형성되도록 에멀전을 교반시키는 단계;를 포함하고,
    여기서 상기 제 1 세라믹 전구체는 세포들 속으로 상기 입자의 침투를 향상시킬 수 있는 작용기를 포함하는 것인, 구멍 내에 배치된 생체 분자를 포함하는 입자를 제조하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서,
    소수성 상을 형성하기 위해,
    소수성 액체에 계면활성제를 결합하는 단계; 및
    제 1 세라믹 전구체를 첨가하는 단계;를
    상기 a) 단계 이전에 실시하는 것인, 방법.
  17. 제 15항 또는 16항에 있어서,
    상기 제 1 세라믹 전구체의 작용기는 생체분자와 화학적으로 상호작용, 예를 들어 정전기적인 상호작용을 할 수 있는 것인, 방법.
  18. 제 15항 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 세라믹 전구체는 아미노작용기 세라믹 전구체인 것인, 방법.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 아미노작용기 세라믹 전구체는 아미노작용기 알콕시실란(alkoxysilane)인 것인, 방법.
  20. 제 18항 또는 19항에 있어서,
    상기 아미노작용기 세라믹 전구체는 아미노알킬아미노그룹을 포함하는 것인, 방법.
  21. 제 20항에 있어서,
    상기 아미노작용기 세라믹 전구체는 3-(2-아미노에틸아미노)프로필 트라이메톡시실란,(3-(2-aminoethylamino)propyl trimethoxysilane), 3-[2-(2-아미노에틸아미노)에틸아미노]프로필트라이메톡시실란(3-[2-(2-aminoethylamino)ethylamino]propyl trimethoxysilane), 3-(2-아미노에틸아미노)프로필 트라이에톡시실란(3-(2-aminoethylamino)propyl triethoxysilane) 또는 3-[2-(2-아미노에틸아미노)에틸아미노]프로필 트라이에톡시실란(3-[2-(2-aminoethylamino)ethylamino]propyl triethoxysilane), 또는 이들을 둘 이상 포함하는 혼합물인 것인, 방법.
  22. 제 15항 내지 21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 계면활성제는 약 8에서 약 16의 HLB을 갖는 것인, 방법.
  23. 제 15항 내지 22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 소수성 액체는 약 0.5 내지 약 15000 mPa.s.의 점도를 갖는 것인, 방법.
  24. 제 15항 내지 23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 소수성 액체는 파라핀 오일, 식물성 오일, 또는 미네랄 오일을 포함하는 것인, 방법.
  25. 제 15항 내지 24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 세라믹 전구체는 염기이고 상기 친수성 상은 제 1 세라믹 전구체의 pKa 보다 낮은 pH를 갖는 것인, 방법.
  26. 제 25항에 있어서,
    친수성 상을 형성하기 위해서,
    상기 친수성 액체와 제 2 세라믹 전구체를 결합하는 단계;
    상기 제 1 세라믹 전구체의 pKa 아래로 pH를 조절하는 단계; 및
    상기 생체분자를 첨가하는 단계;를 포함하고,
    상기 단계를 a) 단계 이전에 실시하는 것인, 방법.
  27. 제 26항에 있어서,
    상기 pH를 조절하는 단계는 양이온 교환 수지에 친수성 액체에 상기 제 2 세라믹 전구체의 용액을 노출하는 단계 및 그 다음 용액의 pH가 상기 제 1 세라믹 전구체의 pKa 아래로 원하는 pH에 도달되면 상기 수지에서 상기 용액을 분리하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  28. 제 15항 내지 27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 친수성 액체는 물인 것인, 방법.
  29. 제 15항 내지 28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 2 세라믹 전구체는 물유리 또는 콜로이드 실리카 또는 예비 가수분해된 실리콘 알콕사이드를 포함하는 것인, 방법.
  30. 제 15항 내지 29항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생체분자는 음전하이거나 또는 상기 입자의 구멍을 통과할 수 없을 정도로 충분히 큰 것인, 방법.
  31. 제 30항에 있어서,
    상기 생체분자는 RNA, 안티센스 뉴클레오티드(antisense nucleotide), 안티센스(antisense), 압타머(aptamer), DNA, 단백질, 당 단백질, 폴리펩티드, 탄수화물이나 이들 둘 이상을 포함하는 부가물 또는 혼합물을 포함하는 것인, 방법.
  32. 제 31항에 있어서,
    상기 생체분자는 siRNA를 포함하는 것인, 방법.
  33. 제 15항 내지 32항 중 어느 한 항에 있어서,
    c) 상기 입자 표면을 처리하도록 상기 입자의 형성 후 상기 에멀전에 표면 처리제를 첨가하는 단계;를 더 포함하는 것인, 방법.
  34. 제 33항에 있어서,
    상기 표면 처리제는 연결 그룹과 커플링된 폴리에틸렌 글라이콜 사슬을 포함하고, 상기 연결 그룹은 상기 입자의 표면에 상기 폴리에틸렌 글라이콜 사슬을 연결할 수 있는 것인, 방법.
  35. 제 34항에 있어서,
    상기 표면 처리제는 트라이알콕시실릴-PEG 같은 PEG-실란인 것인, 방법.
  36. 제 33항 내지 35항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표면 처리제는 환자에 있어 타겟을 타겟팅하기 위한 타겟팅 그룹을 포함하는 것인, 방법.
  37. 제 36항에 있어서,
    상기 표면 처리제는 상기 트라이알콕시실란 그룹으로부터 상기 PEG의 말단에 상기 타겟팅 그룹을 포함하는 트라이알콕시실릴- PEG을 포함하는 것인, 방법.
  38. 제 15항 내지 37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고분자 또는 착화제는 상기 생체분자를 상기 입자의 구멍 내에 배치되도록 추가되는 것인, 방법.
  39. 제 38항에 있어서,
    상기 고분자는 폴리에틸인아민, 폴리리신, 또는 폴리히스티딘 또는 양자 스폰지 효과를 제공하는 물질인, 방법.
  40. 그 구멍에 배치 된 생체 분자를 포함하는 입자를 만들기 위한 방법으로서,
    a) 소수성 상에 분산된 친수성 상의 액적을 포함하는 에멀전을 형성하기 위해,
    소수성 액체와 계면 활성제를 포함하는 소수성 상; 및
    친수성 액체와 촉매를 포함하는 친수성 상;을 결합하는 단계;
    b) 상기 에멀전에 세라믹 전구체를 첨가하고 세라믹 전구체를 가수분해하는 단계;
    c) 생체분자에 적절한 범위로 상기 친수성 상의 pH 조절하는 단계;
    d) 상기 생체분자와 기능화된 세라믹 전구체를 상기 에멀전에 첨가하는 단계; 및
    e) 상기 액적 내에 상기 입자가 형성되도록 에멀전을 교반하는 단계;를 포함하고,
    여기에서 상기 기능화된 세라믹 전구체는 세포로 상기 입자의 침투를 향상시킬 수 있는 작용기를 포함하는, 구멍에 배치된 생체분자를 포함하는 입자를 제조하는 방법.
  41. 제 40항에 있어서,
    상기 기능화된 세라믹 전구체의 상기 작용기는 상기 생체분자와 화학적으로 상호작용, 예를 들어 정전기적인 상호작용을 할 수 있는 것인, 방법.
  42. 제 40항 또는 제 41항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기능화된 세라믹 전구체는 아미노작용기 세라믹 전구체인 것인, 방법.
  43. 제 42항에 있어서,
    상기 아미노작용기 세라믹 전구체는 아미노작용기 알콕시실란인 것인, 방법.
  44. 제 42항 또는 43항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아미노작용기 세라믹 전구체는 아미노알킬아미노 그룹을 포함하는 것인, 방법.
  45. 제 44항에 있어서,
    상기 아미노작용기 세라믹 전구체는 3-(2-아미노에틸아미노)프로필 트라이메톡시실란(3-(2-aminoethylamino)propyl trimethoxysilane), 3-[2-(2-아미노에틸아미노)에틸아미노]프로필 트라이메톡시실란(3-[2-(2-aminoethylamino)ethylamino]propyl trimethoxysilane), 3-(2-아미노에틸아미노)프로필 트라이에톡시실란(3-(2-aminoethylamino)propyl triethoxysilane) 또는 3-[2-(2-아미노에틸아미노)에틸아미노]프로필 트라이에톡시실란(3-[2-(2-aminoethylamino)ethylamino]propyl triethoxysilane), 또는 이들을 둘 이상 포함하는 혼합물인 것인, 방법.
  46. 제 40항 내지 45항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 계면활성제는 노닐페놀 에톡시레이트(nonylphenol ethoxylate)와 같이 약 8에서 약 16의 HLB을 갖는 것인, 방법.
  47. 제 40항 내지 46항의 어느 한 항에 있어서,
    상기 소수성 상은 추가적으로 예를 들어 1-펜탄올, 알콜과 같은 공동 계면 활성제를 포함하는 것인, 방법.
  48. 제 40항 내지 47항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 소수성 액체는 헥산(C6)에서 도데칸(C12)과 같은 알칸, 싸이클로헥산과 같은 싸이클로알칸, 톨루엔과 벤젠과 같은 방향족류, 및 케로신(kerosene)과 같은 혼합물을 포함하는 것인, 방법.
  49. 제 40항 내지 48항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 친수성 액체는 물이고, 상기 촉매는 산성인 방법.
  50. 제 40항 내지 49항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생체분자는 음전하이거나 또는 상기 입자의 구멍을 통과할 수 없을 정도로 충분히 큰 것인, 방법.
  51. 제 50항에 있어서,
    상기 생체분자는 RNA, 안티센스 뉴클레오티드(antisense nucleotide), 안티센스(antisense), 압타머(aptamer), DNA, 단백질, 당 단백질, 폴리펩티드, 탄수화물 또는 이들 둘 이상을 포함하는 부가물 또는 혼합물을 포함하는 것인, 방법.
  52. 제 51항에 있어서,
    상기 생체분자는 siRNA을 포함하는 것인, 방법.
  53. 제 40항 내지 52항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생체분자와 상기 기능화된 세라믹 전구체의 첨가 이전에, 예를 들어 수산화나트륨(NaOH), 수산화칼륨(KOH) 및 수산화암모늄(NH4OH)과 같은 염기를 첨가함으로써, 상기 에멀전의 pH가 4보다 크도록 조절하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  54. 제 40항 내지 53항 중 어느 한 항에 있어서,
    f) 상기 입자의 표면 처리를 위해, 상기 입자의 형성 후 표면처리제를 상기 에멀전에 첨가하는 단계;를 더 포함하는, 방법.
  55. 제 54항에 있어서,
    상기 표면 처리제는 연결 그룹과 커플링된 폴리에틸렌 글라이콜 사슬을 포함하고, 연결 그룹은 상기 입자의 상기 표면에 상기 폴리에틸렌 글라이콜 사슬을 연결할 수 있는 것인, 방법.
  56. 제 55항에 있어서, 상기 표면 처리제는 트라이알콕시실릴-PEG 같은 PEG-실란인 방법.
  57. 제 54항 내지 56항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표면 처리제는 환자에 있어, 타겟을 타겟팅하기 위한 타겟팅 그룹을 포함하는 것인, 방법.
  58. 제 57항에 있어서,
    상기 표면 처리제는 상기 트라이알콕시실란 그룹으로부터 상기 PEG의 말단에 상기 타겟팅 그룹을 포함하는 트라이알콕시실릴- PEG을 포함하는 것인, 방법.
  59. 제 40항 내지 58항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 고분자와 착화제는 상기 생체분자를 상기 입자의 구멍 내에 배치하도록 추가되는 것인, 방법.
  60. 제 59항에 있어서,
    상기 고분자는 폴리에틸인아민, 폴리리신, 또는 폴리히스티딘 또는 양자 스폰지 효과를 제공하는 물질인, 방법.
  61. 제 15항 내지 60항의 어느 한 항에 따라 제조된 입자들.
  62. 제 1항 내지 11항 중 어느 한 항에 따른 미립자 물질, 또는 제 61항에 따른 입자들을 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 첨가제와 함께 포함하는 약학적 조성물.
  63. 포유동물의 질병, 장애 또는 상태를 치료하기 위한 제 1항 내지 11항 중 어느 한 항에 따른 미립자 물질 또는 제 61항에 따른 입자들, 또는 제 56항에 따른 약리학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물의 질병, 장애 또는 상태를 치료하는 방법.
  64. 포유 동물의 질병, 장애 또는 상태를 치료하는데 사용되는, 제 1항 내지 11항 중 어느 한 항에 따른 미립자 물질 또는 제 61항에 따른 입자들.
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