BR112013003505A2 - Substância particulada, processo para fazer partículas e composição farmacêutica - Google Patents

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Kim Suzanne Finnie
Samuel Knight
Toby Johnston Passioura
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Abstract

substância particulada, processo para fazer partículas e composição farmacêutica. uma substância particulada que compreende partículas de uma matriz de cerâmica com um grupo funcional, o grupo funcional sendo capaz de promover a penetração das partículas nas células, e uma biomolécula colocada dentro dos poros das partículas, a biomolécula sendo liberável das partículas pela dissolução da matriz de cerâmica.

Description

SUBSTÂNCIA PARTICULADA, PROCESSO PARA FAZER
PARTÍCULAS E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA Campo da invenção
[001] A presente invenção refere-se a substâncias particuladas que compreendem partículas de cerâmicas para administração de biomoléculas e aos métodos para fazê-las. Mais particularmente, a invenção refere-se às substâncias particuladas que compreendem partículas de uma matriz de cerâmica tendo um grupo funcional que possui biomoléculas liberáveis colocadas dentro dos poros das partículas. Antecedentes da invenção
[002] O uso de siRNA e de terapia genética representa um grande avanço potencial na área da saúde. Ele mostra o potencial para tratar uma variedade de doenças atualmente não curáveis como fibrose cística, alguns tipos de câncer e doenças do sistema imunológico, como diabetes tipo 1, esclerose múltipla etc. Há, no entanto, uma necessidade de proteger siRNA da degradação enzimática in vivo até a liberação no local de ação, a fim de proporcionar uma terapia eficaz.
[003] Atualmente, a terapia com siRNA é cara. Os principais mercados para tais terapias caras estão principalmente nos países mais desenvolvidos. Estima-se que o mercado global para a terapia genética seja de mais de 5 bilhões de dólares.
[004] Os principais desafios no desenvolvimento de terapia com siRNA para uso clínico incluem: • proteção do material ativo contra degradação enzimática; • capacidade do material ativo entrar nas células alvo (boa penetração); • liberação do material ativo a partir de um encapsulante no citoplasma (escape endossomal); • garantia da capacidade para anular genes (preferencialmente com eficácia na concentração nM); e • obtenção de baixa toxicidade (grande janela terapêutica).
[005] siRNAs são moléculas de tamanho intermediário (cerca de 14 KDa, 3 nm de diâmetro e 10 nm de comprimento), hidrofílicas e muito carregadas negativamente. Elas são quimicamente e biologicamente instáveis, a menos que sejam modificadas para aumentar a estabilidade. Para alcançar um efeito clínico, siRNAs devem ser capazes de atravessar a membrana celular e estar presentes no citoplasma da população de células alvo.
[006] No passado, os vetores virais foram explorados para liberar RNA ou DNA. No entanto, estes sofrem o risco de reações imunológicas e são difíceis de pôr em prática. Vários vetores não virais (por exemplo, complexos lipídicos, complexos de polímero catiônico, lipossomas, dendrímeros, nanopartículas poliméricas) também têm sido explorados. Estes causam uma variedade de problemas, incluindo a dificuldade de implementação com siRNA, interações entre o siRNA e o vetor e exposição do siRNA à degradação in vivo. Particularmente, vários sistemas foram inventados para adsorver muito DNA ou RNA sobre a superfície das nanopartículas. No entanto, estes geralmente sofrem com a desvantagem de que a biomolécula adsorvida está sujeita ao ataque enzimático antes da liberação no local de ação, reduzindo assim a eficácia do tratamento.
[007] Embora a discussão acima refere-se principalmente ao siRNA e DNA, os problemas discutidos não estão limitados ao siRNA e DNA. Eles aplicam-se potencialmente a uma ampla variedade de biomoléculas, incluindo, por exemplo, peptídeos, proteínas e outros, para os quais a liberação intracelular é desejada. Assim, uma solução para estes problemas pode ser mais amplamente aplicável. A aplicação da invenção não deve, portanto, ser considerada limitada ao siRNA.
[008] Vantajosamente, a presente invenção supera substancialmente ou, pelo menos, melhora uma ou mais das desvantagens acima e satisfaz pelo menos parcialmente a necessidade acima. Resumo da invenção
[009] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecida uma substância particulada que compreende: partículas de uma matriz de cerâmica com um grupo funcional, o grupo funcional sendo capaz de promover a penetração das partículas nas células; e uma biomolécula disposta dentro dos poros das partículas, a biomolécula sendo liberável das partículas por dissolução da matriz de cerâmica.
[010] Conforme usado neste documento, referência às biomoléculas sendo “colocadas dentro dos poros das partículas” destina-se a incluir dentro de seu escopo as modalidades onde a matriz de cerâmica, que efetivamente forma partículas sólidas porosas, tem biomoléculas dispersas em vários pontos ou nos poros da matriz de cerâmica. Isto não pretende incluir situações em que a biomolécula é fixada ou ligada à superfície externa das partículas.
[011] Em geral, exceto possivelmente sob condições relativamente extremas, a biomolécula é substancialmente não liberável das partículas por lixiviação na ausência de dissolução da matriz de cerâmica. Neste sentido, como usado neste documento, referência à biomolécula sendo "substancialmente não liberável por lixiviação na ausência de dissolução" destina-se a incluir dentro de seu escopo a lixiviação sob as condições propostas de armazenamento e uso da substância particulada. Preferencialmente, o grupo funcional interage com a biomolécula para substancialmente prevenir a lixiviação.
[012] Preferencialmente, o grupo funcional é distribuído homogeneamente pelas partículas.
[013] De acordo com uma modalidade da invenção, a matriz de cerâmica com um grupo funcional compreende uma matriz de sílica funcionalizada. No entanto, uma variedade de óxidos metálicos, incluindo óxidos metálicos mistos, pode ser adequada, por exemplo, titânia, alumina, zircônia, óxido de ferro, céria, óxido de zinco e similares. O grupo funcional também pode ser fornecido por uma organotitânia ou organoalumina, ou por um organo-silano que vai co-condense com outro precursor metal formando um organo sílica titânia ou organo-alumino-sílica. Modalidades adicionais serão avaliadas a partir das discussões relativas à preparação das partículas a seguir.
[014] O grupo funcional da matriz de cerâmica pode compreender qualquer grupo que efetivamente promova a penetração das partículas nas células. Por exemplo, isso pode incluir um grupo amino. Em uma modalidade preferencial, o grupo funcional compreende um grupo aminoalquilamino, um grupo alquilamino primário, um grupo alquilamino secundário e um grupo alquilamino terciário, um grupo alquilimidazol, um grupo alquilamida ou um grupo ácido alquilamino. Modalidades adicionais serão avaliadas a partir das discussões relativas à preparação das partículas a seguir.
[015] A presente invenção refere-se a uma substância particulada que compreende uma biomolécula. Neste contexto, o termo "biomolécula" pode referir-se a uma substância de origem biológica ou natural e possuindo atividade biológica. O termo inclui no seu escopo uma substância que compreende uma ou mais moléculas, incluindo uma mistura de moléculas diferentes. A biomolécula pode ser uma macromolécula. Por exemplo, ela pode ter um peso molecular de cerca de 1 a cerca de 1000 KDa ou mais, ou cerca de 1 a cerca de 100, 1 a 50, 1 a 20, 1 a 10, 5 a 1000, 10 a 1000, 100 a 1000, 500 a 1000, 5 a 100, 5 a 50, 5 a 20 ou 10 a 20 KDa, por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1000 KDa. Em alguns exemplos, ela pode ter um peso molecular menor que 1 KDa ou maior que 1000 KDa. Ela pode ter um diâmetro de cerca de 0,5 a 20 nm, ou cerca de 1 a 20, 2 a 20, 5 a 20, 10 a 20, 0,5 a 10, 0,5 a 5, 0,5 a 2, 0,5 a 1, 1 a 10, 2 a 10, 1 a 5, 5 a 10 ou 10 a 20 nm, por exemplo, de cerca de 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou nm.
[016] A biomolécula pode ser selecionada dependendo da aplicação particular em questão. Para alcançar a retenção da biomolécula dentro e/ou nas partículas, ela pode ser negativamente carregada. Isto pode permitir que a biomolécula se ligue a um grupo funcional na matriz da cerâmica, por exemplo, a grupos amina protonados em uma matriz de cerâmica amino funcional. Alternativamente ou adicionalmente, a biomolécula pode ter outra funcionalidade que permite que ela se ligue aos grupos funcionais da matriz de cerâmica. Alternativamente ou adicionalmente, a biomolécula pode ser suficientemente grande (ou seja, ter um peso ou volume molecular suficientemente grande) que é fisicamente preso nas partículas. Ela pode ser suficientemente grande de modo que seja incapaz de passar através dos poros das partículas.
[017] Em certas modalidades, a biomolécula pode ser ácido nucleico como um RNA, por exemplo, um siRNA (RNA interferente pequeno), miRNA (microRNA) ou uma ribozima, um ASODN (nucleotídeo anti-sense ou RNA anti-sense), uma molécula de DNA, um aptâmero, uma proteína inclusive de polipeptídeos, peptídeos, glicoproteínas, lipoproteínas, imunoglobulinas (por exemplo, anticorpos e fragmentos de anticorpos), um carboidrato, um lipídio ou uma mistura ou aduto de quaisquer dois ou mais desses. Em uma modalidade particular, a biomolécula é um siRNA. A biomolécula pode ser indicada para o tratamento profilático ou terapêutico de uma doença, distúrbio ou condição.
[018] Será vantajoso, em algumas modalidades, ligar um agente de tratamento de superfície à superfície das partículas. Em uma modalidade preferencial, cadeias de polietilenoglicol (PEG) são acopladas à superfície das partículas. Alternativamente ou adicionalmente, um grupo alvo pode ser acoplado à superfície das partículas para facilitar o direcionamento das partículas a um alvo, por exemplo, um tumor ou órgão particular ou outro alvo, em uso. Em certas modalidades, cadeias de PEG com grupos alvo em suas extremidades distais podem ser acoplados às partículas.
[019] Em certas modalidades, pode ser preferível que as partículas da substância particulada tenham um tamanho de partícula médio de cerca de 0,1 a cerca de 1 mícron. No entanto, elas podem ter um tamanho de partícula médio de cerca de 0,1 a 10 mícrons, ou de cerca de 0,1 a 5, 0,1 a 2, 0,1 a 1, 0,1 a 0,5, 0,2 a 10, 0,5 a 10, 1 a 10, 2 a 10, 5 a 10, 0,2 a 2, 0,2 a 1, 0,2 a 0,5, 0,5 a 2 ou 0,5 a 1 mícron, por exemplo, cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mícrons.
[020] Em algumas modalidades, pode ser preferível que o tamanho de partícula médio seja menor que 0,1 mícron. Por exemplo, ele pode ser de cerca de 20 a 100 nm (0,1 mícron), ou de cerca de 20 a 50 nm, ou de cerca de 50 a 100 nm, por exemplo, cerca de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90 nm.
[021] Observa-se que as partículas acima de cerca de 1 a 2 mícrons de tamanho podem ser inadequadas para a administração intracelular. No entanto, considera-se que elas podem ser úteis para a administração de proteínas maiores em outras partes do corpo. Neste sentido, partículas de até vários mícrons podem ser internalizadas, particularmente por células fagocíticas especializadas.
[022] As partículas podem ser substancialmente monodispersadas ou pode haver certo grau de agregação para formar um segundo pico na curva de distribuição de tamanho de partícula. A curva de distribuição pode ser a distribuição normal, Gaussiana ou outra. As partículas podem ter uma ampla distribuição de tamanho de partícula ou uma distribuição de tamanho de partícula média ou reduzida. As partículas podem ser esféricas ou aproximadamente esféricas, ou podem ser ovoides ou oblato esferoides ou poliédricas (tendo, por exemplo, de 8 a 60 lados) ou podem ser algum outro formato. Elas podem ter formato irregular.
[023] As partículas podem ser mesoporosas (ou seja, tamanhos de poros de < de 100 nm). Eles podem ser microporosas (ou seja, com tamanhos de poros < de 1,7 nm). Preferencialmente, as partículas têm um tamanho de poro médio de cerca de 1 a cerca de 50 nm. Por exemplo, o tamanho de poro médio pode ser de cerca de 1 a 20, 1 a 10, 5 a 50, 10 a 50, 20 a 50, 5 a 20, 5 a 10 ou 10 a 20 nm, por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 nm.
[024] A estrutura do poro pode compreender poros interconectados, ou pode compreender vãos unidos por canais de interconexão relativamente pequenos. O tamanho dos poros pode ser suficientemente pequeno para evitar substancialmente a liberação da biomolécula por difusão dos poros. Alternativamente, se o tamanho dos poros for tal que a biomolécula possa escapar, a biomolécula pode ser retida por atração aos grupos funcionais nas superfícies dos poros. Os grupos funcionais podem ser iguais ou diferentes daqueles que promovem a penetração das partículas para dentro das células.
[025] As partículas podem ter uma carga de biomolécula de cerca de 1 a cerca de 20% p/p, por exemplo, de cerca de 1 a 10, 1 a 5, 1 a 2, 2 a 20, 5 a 20, 10 a 20, 2 a 10, 2 a 5 ou 5 a 10%, por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20%, embora em alguns casos, elas podem ser menores que 1% ou podem ser maiores que 20%.
[026] Durante o uso, a biomolécula é vantajosamente liberável por dissolução das partículas sob condições que não degradam substancialmente a biomolécula. Por exemplo, ela pode ser liberada pela dissolução das partículas por um meio biológico que não degrade substancialmente a biomolécula. Ela pode ser alternativamente liberada quando diluída em um líquido de liberação adequado.
[027] Geralmente, a biomolécula é liberada (por exemplo, substancialmente completamente liberável) em um período de cerca de 0,5 a cerca de 50 horas. Por exemplo, cerca de 0,5 a 20, 0,5 a 10, 0,5 a 5, 0,5 a 2, 1 a 50, 5 a 50, 10 a 50, 1 a 20, 1 a 10, 2 a 10 ou 5 a 10 horas, por exemplo, cerca de 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 horas. Como a taxa de dissolução pode depender do tamanho das partículas, esta taxa pode ser ajustada ajustando o tamanho das partículas, conforme discutido na descrição a seguir.
[028] Mais vantajosamente, a biomolécula é protegida da degradação antes de sua liberação das partículas quando as partículas são expostas a um agente de degradação, por exemplo, uma enzima, que, de outro modo, seria capaz de degradar a biomolécula. Ou seja, a biomolécula é protegida da degradação pela matriz de cerâmica.
[029] Em algumas modalidades, é previsto que um polímero ou agente complexante pode ser colocado nos poros das partículas com a biomolécula para facilitar o escape endossomal. Tipicamente, o polímero poderia ser uma polietilinamina, uma polilisina ou uma poli-histidina ou qualquer substância que proporcione um efeito esponja de prótons. Formação das micropartículas (> 100nm)
[030] Em algumas modalidades, pode ser vantajoso formar partículas na microescala. Ou seja, para efeitos da presente descrição, partículas com mais de 100 nm de tamanho de partícula médio.
[031] De acordo com outro aspecto da invenção é provido um processo para fazer partículas que compreende uma biomolécula dispersada nos seus poros é fornecido, dito processo compreende: a) combinar: uma fase hidrofóbica que compreende um líquido hidrofóbico, um primeiro precursor de cerâmica e um surfactante; e uma fase hidrofílica que compreende um líquido hidrofílico, um segundo precursor de cerâmica e a biomolécula, de modo a formar uma emulsão que compreende gotículas da fase hidrofílica dispersadas na fase hidrofóbica; e b) agitar a emulsão conforme as partículas se formam dentro das gotículas; em que o primeiro precursor de cerâmica compreende um grupo funcional que é capaz de promover a penetração das partículas nas células.
[032] Conforme usado neste documento, o termo "agitando" inclui, no seu escopo, qualquer forma de agitação, incluindo, mas sem se limitar, a agitar, sacudir, girar, submeter ao ultrassom, cisalhar e assim por diante, e qualquer combinação desses.
[033] Ao fazer as partículas, uma emulsão é formada pela combinação de uma fase hidrofóbica com uma fase hidrofílica. Ela pode ser uma emulsão água em óleo (a/o), em que a fase hidrofóbica representa a fase contínua e a fase hidrofílica representa a fase dispersa ou descontínua.
[034] A fase hidrofóbica pode ser uma fase oleofílica ou uma fase lipofílica. A fase hidrofóbica pode ser feita combinando o surfactante com o líquido hidrofóbico e adicionando o primeiro precursor de cerâmica de modo a formar a fase hidrofóbica, ou ela pode ser feita através da combinação de todos os três componentes, ou ela pode ser feita através da combinação do primeiro precursor de cerâmica com o líquido hidrofóbico ou o surfactante e, a seguir, mediante a adição do outro componente. Estas etapas são realizadas preferencialmente antes de combinar as fases hidrofóbica e hidrofílica. Cada etapa de combinação pode compreender a agitação dos componentes que foram combinados. A agitação pode compreender agitar, sacudir, girar, submeter ao ultrassom, ou uma combinação desses. Ela pode ser suficiente para os componentes formarem uma solução. Assim, a fase hidrofóbica pode representar uma solução do primeiro precursor de cerâmica e o surfactante no líquido hidrofóbico.
[035] A fase hidrofóbica compreende 3 componentes: Líquido hidrofóbico – pode ser, por exemplo, um óleo vegetal, óleo de parafina, óleo mineral ou algum outro líquido hidrofóbico apropriado. Ele pode incluir uma mistura de componentes hidrofóbicos, por exemplo, uma mistura de óleos vegetais ou uma mistura de óleo vegetal e óleo de parafina. Ele comumente possui viscosidade moderada, por exemplo, cerca de 0,5 a cerca de 1500 mPa.s, ou cerca de 0,5 a 1000, 0,5 a 500, 0,5 a 250, 0,5 a 100, 0,5 a 50, 0,5 a 20, 0,5 a 10, 0,5 a 5, 0,5 a 1, 1 a 1500, 10 a 1500, 100 a 1500, 250 a 1500, 500 a 1500, 1000 a 1500, 10 a 1000, 10 a 200, 200 a 1000 ou 200 a 500 mPa.s, por exemplo, cerca de 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250,
300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 ou 1500 mPa.s ou, em algumas ocasiões, maior que 1500 mPa.s. A viscosidade do líquido hidrofóbico pode ser utilizada para controlar o tamanho de partícula das partículas produzidas pelo processo. Assim, um líquido hidrofóbico mais viscoso geralmente fornecerá uma fase hidrofóbica mais viscosa que, por sua vez, irá geralmente produzir um tamanho de partícula menor. Surfactante – este pode ser um surfactante adequado para suportar uma emulsão de água em óleo. Ele pode ser solúvel, ou miscível, com o líquido hidrofóbico. Ele pode ser um surfactante não iônico, ou ele pode ser um surfactante aniônico ou um surfactante zwitteriônico. Ele pode ter um HLB de cerca de 8 a cerca de 16, ou de cerca de 8 a 12, 10 a 16 ou 8 a 10, por exemplo, de cerca de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16. Surfactantes adequados incluem Span® 20 (monolaurato de sorbitano), Aerosol® OT (bis(2-etil-hexil)sulfossuccinato de sódio), misturas de Span® 20/Tween® 80 e misturas de Span® 20/Brij® 35. O uso de surfactantes misturados geralmente fornece uma emulsão muito fina, mas o tamanho da partícula final é geralmente inalterado. Primeiro precursor de cerâmica – este componente inclui um grupo funcional capaz de promover a penetração das partículas resultantes nas células. Em certas modalidades, o grupo funcional do primeiro precursor de cerâmica é capaz de interagir quimicamente, por exemplo, interagir eletrostaticamente com a biomolécula.
[036] Este componente pode ser, por exemplo, amino funcional. Alternativamente, outros grupos positivamente carregados ou grupos que podem se tornar positivamente carregados podem ser usados. Ele pode ser um composto tendo pelo menos um grupo amina por molécula e que é capaz de ser convertido em uma matriz de cerâmica amino funcional. Ele pode ser solúvel no líquido hidrofóbico, ou em uma mistura (opcionalmente uma solução) do surfactante no líquido hidrofóbico.
[037] Precursores de cerâmica apropriados incluem silanos amino funcionais, particularmente alcoxissilanos amino funcionais. Os grupos alcóxi desses silanos podem ser, por exemplo, grupos alcóxi C1 a C6 (que podem ser ramificados se forem C3 ou maiores), comumente alcóxi de C1 a C4, por exemplo, grupos metóxi, etóxi, propóxi, isopropóxi ou butóxi. Em alguns casos, outros grupos hidrolisáveis podem ser usados, por exemplo, acetóxi, cetoximo, enolóxi etc. O precursor de cerâmica amino funcional pode ter mais de um grupo amina por molécula, por exemplo, 2, 3, 4 ou 5 grupos amino por molécula. Os inventores verificaram que os diamino e triaminoprecursores de cerâmica comumente produzem partículas que são mais eficazes na ligação de biomoléculas apropriadas do que os monoaminoprecursores de cerâmica correspondentes. Cada grupo amina pode ser, independente, primário, secundário ou terciário. Em precursores preferidos, os grupos amina são separados por grupos ligantes, comumente cadeias de alquileno curtas como cadeias de etileno (-CH2CH2-), propileno (-CH2CH2CH2-) ou butileno (-CH2CH2CH2CH2-). Os inventores consideram que o grupo butileno pode ser particularmente útil porque este grupo ocorre em ligantes de poliamina polinucleotídeo naturais, como putrescina (N-4-N), espermidina (N-3-N-4-N) e espermina (N-3-N-4-N-3-N). Várias combinações envolvendo pentileno e hexileno também podem ser úteis, porém grupos muito diferentes da configuração biogênica podem ser potencialmente tóxicos. Em particular, os inventores consideram que os espaçadores de etileno proporcionam uma distância entre os grupos amino que é aceitavelmente próxima dos espaçamentos das cargas no siRNA e que está presente em produtos comercialmente disponíveis, tornando este espaçador adequado para uso quando a biomolécula é um siRNA. Os precursores adequados incluem 3-(2-aminoetilamino)propiltrimetoxissilano, 3-[2-(2-aminoetilamino)etilamino]propiltrimetoxissilano, 3-(2-aminoetilamino)propiltrietoxissilano ou 3-[2-(2-aminoetilamino)etilamino]propiltrietoxissilano, e misturas de dois ou mais destes. Outros compostos que podem ser utilizados como o primeiro precursor de cerâmida incluem ureapropiltrialcoxissilano, alcoxissilanos isocianato funcionais, alcoxissilanos carboxílico funcionais, alcoxisslanos mercaptofuncionais (por exemplo, mercaptopropil trialcoxissilanos), peptídeos ou carboidratos catiônicos ou lipídios enxertados em alcoxissilanos, etc. Misturas de dois ou mais destes, ou de quaisquer outros primeiros precursores de cerâmica adequados, também podem ser utilizadas.
[038] Em alguns casos, o primeiro precursor de cerâmica pode ser uma mistura. Ele pode ser uma mistura de precursores de cerâmica de silano. Ele pode adicionalmente compreender um ou mais precursores de cerâmica diferentes de silano, por exemplo, um precursor de zircônia, um precursor de alumina ou um precursor de titânia. Estes podem ser, por exemplo, alcóxidos de zircônio, alcóxidos de alumínio e alcóxidos de titânio, respectivamente.
[039] Comumente, a razão de surfactante para líquido hidrofóbico é de cerca de 5 a cerca de 25% p/v (ou seja,
de cerca de 5 a cerca de 25 g de surfactante por 100 mL de líquido hidrofóbico) ou de cerca de 5 a 20, 5 a 15, 10 a 25, 15 a 25 ou 10 a 20%, por exemplo, cerca de 5, 10, 15, 20 ou 25%.
[040] Comumente, a razão do primeiro precursor de cerâmica para o líquido hidrofóbico é de cerca de 10 a cerca de 1000 ppm em uma base v/v, ou cerca de 10 a 500, 10 a 200, a 100, 10 a 50, 20 a 1000, 50 a 1000, 100 a 1000, 200 a 1000, 500 a 1000, 20 a 500, 50 a 500, 50 a 200, 200 a 500 ou 50 a 200 ppm, por exemplo, cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1000 ppm.
[041] A fase hidrofílica pode ser uma fase lipofóbica. Ela pode ser uma fase aquosa. A fase hidrofílica compreende três componentes: Líquido hidrofílico – ele pode ser lipofóbico. Ele é comumente aquoso, por exemplo, ele pode ser água, incluindo água pura ou uma solução aquosa. Ele também pode compreender sais dissolvidos. Segundo precursor de cerâmica – ele pode ser um silicato solúvel em água, particularmente metassilicato. Ele pode ser um silicato por si só (por exemplo, por hidrólise de um tetra-alquilsilicato como tetametilortossilicato ou tetraetilortossilicato), ou ele pode ser uma espécie com fórmula RSi(OR')xOHySiz, onde x + y + z = 3 (aqui refere-se a um alquilsilicato, gerado, por exemplo, por hidrólise de um alquiltrialcoxissilano, por exemplo, metiltrimetoxissilano ou etiltrimetoxissilano). No caso de um alquilsilicato, o grupo alquila R deve ser suficientemente pequeno ou suficientemente hidrofílico de modo que o segundo precursor de cerâmica seja solúvel em água. Será compreendido que isto pode ser conseguido, por exemplo, com pequenos grupos R como metila ou etila, ou com grupos R maiores tendo substituintes hidrofílicos ou polares tais como hidroxila, nitro, sulfato, etc.
[042] O segundo precursor de cerâmica pode ser, por exemplo, silicato de sódio. Silicato de sódio é um material de silicato polimérico ou oligomérico com fórmula empírica aproximadamente igual a Na2SiO3, com diferentes graus de hidratação, geralmente em solução aquosa. O silicato de sódio pode ter um teor de sólidos de cerca de 1 a cerca de 20%, ou de cerca de 1 a 10, 1 a 5, 1 a 2, 2 a 20, 5 a 20, 10 a 20, 2 a 10, 2 a 5 ou 5 a 10%, por exemplo, de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20%. Ele pode ter de cerca de 25 a cerca de 30% de sílica e cerca de 1 a cerca de 20% de hidróxido de sódio em água. Ele pode ser diluído por um fator de cerca de 1:2, até cerca de 1:10 em água, ou de cerca de 1:2 a 1:5, 1:5 a 1:10 ou 1:3 a 1:8, por exemplo, de cerca de 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 ou 1:10.
[043] O segundo precursor de cerâmica pode também ser um alcóxido de titânio (por exemplo, etóxido, n e isopropóxido, n, sec e terc-butóxido) ou um alcóxido de alumínio ou um alcóxido de zircônio ou um alcóxido de metal modificado (por exemplo, modificado com acetilacetona ou ácido acético). Ele também poderia ser um alcóxido de metal misto. Ele também poderia ser um outro sal de metal como sal de magnésio, sal de zircônio ou sal de alumínio para formar o silicato de magnésio, aluminossilicato e assim por diante. Ele pode ser um alcóxido de silício pré-hidrolisado.
[044] O segundo precursor de cerâmica pode compreender um coloide de cerâmica, por exemplo, sílica coloidal. O coloide de cerâmica pode ter um diâmetro de partícula menor que 50 nm, ou menor que cerca de 40, 30, 20 ou 10 nm, ou de cerca de 5 a cerca de 50 nm ou de cerca de 5 a 20, a 10, 10 a 50, 20 a 50 ou 10 a 20 nm. Ele pode ter um diâmetro de partículas (comumente diâmetro de partícula médio, mas opcionalmente diâmetro de partícula máximo) de cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 nm.
[045] Em alguns casos, o segundo precursor de cerâmica pode compreender uma combinação de dois ou mais das opções acima, por exemplo, ele pode compreender uma mistura de silicato de sódio com sílica coloidal. Biomolécula – várias opções para a biomolécula são citadas acima. Como observado, ela pode ser negativamente carregada ou pode ter carga neutra. Ela pode ser suficientemente negativamente carregada para ser atraída para, opcionalmente ligada ao grupo funcional das partículas (derivadas do primeiro precursor de cerâmica). Ela pode ser, ou pode compreender, um RNA, por exemplo, um siRNA (RNA interferente pequeno), miRNA (microRNA), ASODN (nucleotídeo anti-sense ou RNA anti-sense), um aptâmero, um DNA, uma proteína, uma glicoproteína, um polipeptídeo, um carboidrato ou uma mistura ou aduto de quaisquer dois ou mais desses.
[046] Adicionalmente, um polímero ou agente complexante poderia ser adicionado, de modo que ele seja colocado dentro dos poros das partículas com a biomolécula para facilitar o escape endossomal. Tipicamente, o polímero poderia ser uma polietilinamina, uma polilisina ou uma poli-histidina ou qualquer substância que proporcione um efeito esponja de prótons.
[047] A fase hidrofílica pode ser ácida. Ela pode ter um pH abaixo do pKa do primeiro precursor de cerâmica (ou de seu ácido conjugado se o precursor de cerâmica for uma base, por exemplo, um precursor de cerâmica amino funcional). A fase hidrofílica pode ter um pH menor que cerca de 10,5 ou menor que 10, 9, 8, 7, 6, 5,5, 5, 4,5 ou 4 ou entre cerca de 3 e 10,5, e 10,5, 7 e 10,5, 9 e 10,5, 7 e 10, 9 e 4, 7 e 4, 9 e 7, 5 e 7, 3 e 6 ou cerca de 3 a 5, 3 a 4, 4 a 6, 4 a 5 ou 3,5 a 4,5, por exemplo, cerca de 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5 ou 6.
[048] Comumente, na preparação da fase hidrofílica o líquido hidrofílico e o segundo precursor de cerâmica são combinados, opcionalmente, o segundo precursor de cerâmica é dissolvido no líquido hidrofílico. O processo pode compreender subsequentemente o ajuste do pH até um pH abaixo do pKa do primeiro precursor de cerâmica, por exemplo, um pH menor que cerca de 10,5, ou até um pH ácido, por exemplo, até um pH menor que cerca de 7, ou menor que cerca de 5 ou menor que cerca de 4, e adicionar a biomolécula de modo a formar a fase hidrofílica. Por exemplo, no caso em que o segundo precursor de cerâmica é silicato de sódio ou sílica coloidal, isso geralmente resulta em uma solução básica. O processo pode, portanto, compreender a acidificação desta solução.
[049] A acidificação pode ser convenientemente realizada expondo a solução a uma resina trocadora catiônica, em que, antes da dita exposição, a resina está na sua forma ácida (protonada). A exposição pode compreender combinar a resina e a solução, opcionalmente, agitar a mistura resultante e, em seguida, separar a resina da solução acidificada (por exemplo, por filtração, decantação, centrifugação, etc.),ou ela pode compreender passar a solução através de um leito da resina. A razão de resina para o segundo precursor de cerâmica pode ser tal que o pH desejado (como descrito acima) é alcançado.
Alternativamente, o segundo precursor de cerâmica pode ser acidificado pela adição de um agente acidificante (por exemplo, um ácido) ou de um tampão adequado.
[050] Comumente, a biomolécula será adicionada à solução acidificada pouco antes da fase hidrofílica e da fase hidrofóbica serem combinadas. Ela pode ser adicionada imediatamente antes de elas serem combinadas. Ela pode ser adicionada a menos de cerca de 2 minutos antes de serem combinadas, ou a menos de 1 minuto ou a menos de cerca de 50, 40, 30, 20, 15 ou 10 segundos antes de serem combinadas, por exemplo, cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 ou 120 segundos antes de elas serem combinadas. Isso reduz a possibilidade de ocorrência de reações químicas adversas da biomolécula. A biomolécula pode estar presente na fase hidrofílica em uma quantidade suficiente para alcançar o carregamento desejado nas partículas finais. Uma concentração típica de biomolécula na fase hidrofílica é de cerca de 1 a cerca de 10 mg/mL, ou de cerca de 1 a 5, 5 a 10 ou 2 a 8, por exemplo, de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mg/mL. A biomolécula pode ser adicionada ao líquido hidrofílico/segundo precursor de cerâmica combinados sob a forma de uma solução. O solvente para essa solução deve ser miscível com o líquido hidrofílico e geralmente é igual que o líquido hidrofílico. A biomolécula pode ser adicionada em solução aquosa.
[051] Na formação da emulsão, as fases hidrofóbica e hidrofílica são combinadas, opcionalmente com agitação. A agitação pode compreender um ou mais dentre agitar, sacudir, girar e submeter ao ultrassom. Uma maneira eficaz de fazer a emulsão é preparar a fase hidrofóbica como descrito acima e submetê-la à agitação e ultrassom simultaneamente na preparação para adição da fase hidrofílica. A fase hidrofílica é a seguir preparada pela combinação da biomolécula com o segundo precursor de cerâmica e o líquido hidrofílico combinados (por exemplo, solução de silicato de sódio aquosa acidificada), e a fase hidrofílica resultante é adicionada o mais rapidamente possível à fase hidrofóbica submetida ao ultrassom e agitada, mantendo o ultrassom. O ultrassom pode continuar por um curto período de tempo após a adição, por exemplo, cerca de 10 a cerca de 120 segundos, ou cerca de 10 a 60, 10 a 30, 20 a 120, 60 a 120, 20 a 60 ou 20 a 40 segundos, por exemplo, cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 90 ou 120 segundos. O ultrassom é comumente desligado após um período adequado, de modo a evitar o superaquecimento da emulsão. Tal superaquecimento poderia, por exemplo, afetar desfavoravelmente a biomolécula. O ultrassom pode ser realizado a uma potência de cerca de 200 a 2000 W, ou cerca de 200 a 1000, 200 a 500, 500 a 2000, 1000 a 2000, 500 a 1000 ou 600 a 800 W, por exemplo, de cerca de 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 ou 2000 W.
[052] A razão de fase hidrofóbica para fase hidrofílica pode ser de cerca de 10 a cerca de 50 (ou seja, cerca de 10:1 até cerca de 50:1), ou de cerca de 10 a 40, 10 a 30, a 20, 20 a 50, 30 a 50, 40 a 50, 20 a 40 ou 25 a 25, por exemplo, cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50.
[053] Pode ser suficiente uma razão molar do primeiro precursor de cerâmica para o segundo precursor de cerâmica de cerca de 0,2 a cerca de 20% em mol, ou de cerca de 0,5 a 20, 1 a 20, 2 a 20, 5 a 20, 10 a 20, 0,2 a 10, 0,2 a 5, 0,2 a 2, 0,2 a 1, 1 a 10, 1 a 5 ou 5 a 10, por exemplo, de cerca de 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,
12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20% em mol. No caso do primeiro precursor de cerâmica ser, ou compreender, um silano amino funcional, a razão do primeiro precursor de cerâmica para o segundo precursor de cerâmica pode ser modificada para variar carga sobre as partículas. Assim, se a quantidade for baixa (por exemplo, de cerca de 1% em mol em relação ao segundo precursor de cerâmica), as partículas terão carga quase neutra, enquanto que se a quantidade for mais alta (cerca de 10% em mol), elas serão positivamente carregadas. Se nenhum silano amino funcional for adicionado (ou quantidades muito baixas, por exemplo, menores que cerca de 0,5% em mol), as partículas podem ser negativamente carregadas.
[054] Na emulsão preparada conforme descrito acima, as gotículas da fase hidrofílica podem ter um diâmetro médio de cerca de 0,1 a 10 mícrons, ou de cerca de 0,1 a 5, 0,1 a 2, 0,1 a 1, 0,1 a 0,5, 0,2 a 10, 0,5 a 10, 1 a 10, 2 a 10, a 10, 0,2 a 2, 0,2 a 1, 0,2 a 0,5, 0,5 a 2 ou 0,5 a 1 mícron, por exemplo, cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mícrons. A média pode ser uma média numérica ou um diâmetro de peso médio. As gotículas podem ser substancialmente monodispersas ou pode haver certo grau de agregação para formar um segundo pico na curva de distribuição. As gotículas podem ter uma ampla distribuição de tamanho de partícula ou uma distribuição de tamanho de partícula média ou reduzida.
[055] Acredita-se que as partículas se formam dentro das gotículas pela interação do primeiro e do segundo precursores de cerâmica. A condensação dos precursores para formar as partículas é geralmente muito rápida (de milissegundos a segundos). A interação pode ser uma reação. Ela pode ser uma condensação. Ele pode compreender a hidrólise do primeiro precursor de cerâmica. Observou-se que, se o primeiro precursor de cerâmica é amino funcional e é adicionado à fase hidrofílica diretamente, uma rápida gelificação ocorre de modo que a formação de partículas de tamanho adequado é evitada.
[056] As fases hidrofílica e hidrofóbica combinadas podem ser agitadas ou, de outra forma, agitadas por tempo suficiente para a formação das partículas. Isso pode depender, pelo menos em parte, da temperatura reacional. A formação de partículas pode ser realizada a qualquer temperatura adequada, por exemplo, em temperatura ambiente, ou em cerca de 10 a cerca de 35 ºC, ou de cerca de 10 a 30, 10 a 25, 10 a 20, 15 a 35, 20 a 35, 25 a 35, 15 a 30, 15 a 20 ou 20 a 25 ºC, por exemplo, em cerca de 15, 20, 25, 30 ou 35 ºC. Ela pode ser realizada a uma temperatura abaixo da temperatura de desnaturação da biomolécula. A formação das partículas pode demorar cerca de 10 a cerca de 120 minutos, embora as fases combinadas possam ser agitadas ou, de outra forma, agitadas por mais tempo que isso, caso seja desejado. Tempos adequados são de cerca de 10 a 100, 10 a 60, 10 a 30, 20 a 120, 30 para 120, 60 a 120, 30 a 90 ou 45 a 75 minutos, por exemplo, de cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115 ou 120 minutos.
[057] Uma vez que as partículas se formaram, elas podem ser funcionalizadas na superfície. Isto pode ser realizado in situ, ou seja, sem separação ou isolamento das partículas. Pode-se compreender adicionar um agente de tratamento de superfície à emulsão após a formação das partículas, de modo a tratar a superfície das partículas. A funcionalização da superfície pode ser uma PEGuilação (ou seja,
a adição de cadeias de polietilenoglicol à superfície). O agente de tratamento de superfície pode compreender uma cadeia de polietilenoglicol (PEG) acoplada a um grupo de ligação. A cadeia PEG pode ter um peso molecular de cerca de 1 a cerca de 20 KDa, ou de cerca de 1 a 10, 1 a 5, 1 a 2, 2 a 20, 5 a 20, a 20, 2 a 10, 2 a 5 ou 5 a 10 KDa, por exemplo, de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 KDa. O grupo ligante pode ser um trialcoxissilano, ou seja, o agente de tratamento de superfície pode ser um trialcoxissilil PEG. Grupos alcóxi adequados incluem metóxi, etóxi ou propóxi. Outros grupos silila hidrolisáveis também podem ser utilizados, por exemplo, triacetóxi, trioximo, trienolóxi, triamido, etc. A superfície das partículas pode ser funcionalizada pela reação da superfície com um PEG (ou outra molécula adequada) com um grupo funcional que reage tanto com o OH da superfície ou com grupos amino incorporados dentro e na superfície das partículas. Por exemplo, um agente de tratamento de superfície PEG carboxil funcional pode ser usado para formar uma amida com grupos amina de superfície nas partículas, ou os grupos amina de superfície podem ser ativados (por exemplo, pela formação de grupos succinimidila ou grupos isotiocianato) e, em seguida, reagir com os agentes de tratamento de superfície PEG amino funcionais.
[058] Os grupos PEG são geralmente grandes (tipicamente > 1 KDa) de modo que eles não penetrarão dentro da esfera, mas sim enxertarão primariamente na superfície das partículas. Uma gama de PEGs funcionais é comercialmente disponíveis que é adequada para este enxerto, por exemplo, PEG modificado com isotiocianato e PEG modificado com carbóxi, que produzirão ligações amida ao reagir com aminas na superfície das partículas.
[059] A subsequente funcionalização de superfície, por exemplo, PEGuilação, a fim de funcionalizar a superfície das partículas, pode ser limitada, porém adequada em condições básicas. Em condições básicas, o primeiro precursor de cerâmica (por exemplo, um aminossilano como aminoetilaminopropiltrietoxissilano) pode, em alguns casos, ser adicionado diretamente ao segundo precursor de cerâmica (por exemplo, silicato de sódio ou sílica coloidal). Em alguns casos, o pH da fase hidrofílica não é abaixo do pKa do primeiro precursor de cerâmica. Em tais casos, a suspensão de partículas inicialmente formada (feita sob condições básicas) pode ser subsequentemente acidificada. Isso pode servir para promover a ligação da biomolécula às partículas se a biomolécula for negativamente carregada. Se as partículas têm subsequentemente as superfícies tratadas, a acidificação pode ser realizada antes ou durante o tratamento de superfície subsequente, de modo a facilitar a ligação do PEG-silano. Sem a presença de cargas positivas sobre as partículas, a liberação da biomolécula pode ser muito rápida (da ordem de minutos), a menos que ela seja suficientemente grande para impedir o seu escape através dos poros das partículas.
[060] Em alguns casos, o agente de tratamento de superfície pode compreender um grupo alvo para direcionar um alvo em um paciente. Por exemplo, o agente de tratamento de superfície pode compreender um trialcoxissilil-PEG com o grupo alvo na extremidade distal do PEG, ou seja, ele pode ter a estrutura do grupo alvo trialcoxissilil-PEG. O alvo pode ser, por exemplo, um tumor ou um órgão particular ou algum outro alvo. O grupo alvo pode, por exemplo, ser um anticorpo ou um fragmento de anticorpo (por exemplo, um Fab). Exemplos de grupos alvo adequados incluem anticorpos, citocinas peptídicas, hormônios peptídicos, proteínas da matriz, receptores de superfície celular, proteínas envolvidas na adesão celular, proteínas envolvidas no reconhecimento celular, proteínas envolvidas na motilidade celular, proteínas envolvidas no recrutamento celular, proteínas envolvidas na diferenciação celular, proteínas envolvidas no reconhecimento de doenças, carboidratos biologicamente ativos tais como heparina e substâncias relacionadas, glicoproteínas biologicamente ativas incluindo, mas sem se limitar, àquelas que se enquadram dentro das classes listadas acima, ligantes de qualquer membro das classes acima, fragmentos de qualquer membro das classes acima, homólogos de qualquer membro das classes acima, substâncias de baixo peso molecular compartilhando a afinidade ou a função de qualquer membro das classes acima, outras biomoléculas de baixo peso molecular, tais como hormônios, nutrientes, fármacos, toxinas, neurotransmissores, transmissores endócrinos, transmissores autócrinos e parácrinos, pigmentos, lipídios, óleos, ligantes iônicos, metabólitos, catabólitos, etc.
[061] O agente de tratamento de superfície pode ser adicionado diretamente à suspensão de partículas na fase hidrofóbica. A reação pode ser realizada adequadamente próxima da temperatura ambiente, por exemplo, por agitação por um tempo adequado para realizar a reação. Tempos adequados são de cerca de 8 a cerca de 24 horas, ou de cerca de 8 a 16, 8 a 12, 12 a 24, 18 a 24 ou 12 a 18 horas, por exemplo, de cerca de 8, 12, 16, 20 ou 24 horas. Agente de tratamento de superfície suficiente pode ser utilizado para alcançar um nível adequado de funcionalização de superfície, por exemplo, suficiente para evitar a agregação de partículas excessiva ou suficiente para proporcionar o alvo aceitável das partículas ao alvo em uso.
[062] Uma vez que as partículas tenham se formado, é comum que elas não estejam completamente secas. Isto inibe a agregação das partículas que, se ocorrer, exigiria a ressuspensão que, em algumas circunstâncias, pode ser difícil. Comumente, as partículas são separadas da solução por centrifugação. Condições adequadas são de cerca de 10000 a cerca de 50000 rpm, ou de cerca de 10000 a 30000, 30000 a 50000 ou 20000 para 30000 rpm, por exemplo, de cerca de 10000, 20000, 30000, 40000 ou 50000 rpm. A separação adequada é comumente conseguida em cerca de 5 a 15 minutos, apesar do que centrifugações mais longas podem ser usadas às vezes.
[063] As partículas resultantes podem ser lavadas para remover as impurezas. O processo de lavagem pode envolver a ressuspensão das partículas em um solvente, permitindo que as partículas sejam pelo menos parcialmente separadas do solvente (por exemplo, por sedimentação e/ou por centrifugação) e decantando o solvente das partículas. É importante que o solvente seja um que não desnature a biomolécula. Isso pode ser específico para a biomolécula particular usada. Por exemplo, o etanol não afeta a estrutura do DNA ou RNA, mas pode desnaturar proteínas maiores. Solventes adequados para lavagem incluem hidrocarbonetos tais como hexano, ciclo-hexano, tolueno, etc. e álcoois como o etanol ou isopropanol. As partículas podem ser lavadas várias vezes (por exemplo, 2, 3, 4 ou 5 ou mais vezes), com o mesmo solvente ou com solventes diferentes.
[064] As partículas resultantes podem ser ressuspensas em um solvente adequado e armazenadas como uma suspensão naquele solvente para uso posterior. Este solvente pode ser um solvente clinicamente aceitável se as partículas forem administradas a um paciente. Um solvente adequado para armazenamento é o etanol. Geralmente, as partículas serão armazenadas a uma temperatura de cerca de -210 a cerca de +10 ºC, ou de cerca de -210 a 0, -90 a 0, -210 a -100, -210 a -65, -90 a -30, -30 a 0, -30 a -10, -20 a +10, -10 a +10, 0 a 10 ou 0 a 5 oC, por exemplo, cerca de -210, -200, -180, -160, -140, -120, -100, -90, -80, -70, -60, -50, -40, -30, -25, -20, -15, -10, -5, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 oC. Elas podem ser armazenadas aproximadamente na temperatura do nitrogênio líquido. Elas podem ser armazenadas na temperatura do gelo seco. Elas podem ser armazenadas em um congelador ou refrigerador.
[065] Na passagem acima, onde é feita referência ao etanol, o etanol pode compreender até cerca de 30% de água. Assim, o etanol pode ser de cerca de 70 a cerca de 100% de etanol, sendo o restante água, ou cerca de 80 a 100, 90 e 100, 70 a 90 ou 80 a 90%, por exemplo, cerca de 70, 80, 90 ou 100% de etanol. Isopropanol, n-propanol ou n-butanol também podem ser substituídos por etanol, com restrições semelhantes no conteúdo de água. Uma vantagem do uso de etanol ou propanol é que ele fornece um ambiente estéril para as partículas para administração a um paciente ou para outras aplicações em que a esterilidade é um benefício. Em alguns casos, metanol pode ser utilizado.
[066] A eficiência de encapsulação (EE) do processo em relação à biomolécula é preferencialmente alta, uma vez que a biomolécula é tipicamente cara. A EE vai depender da natureza precisa do processo, incluindo, por exemplo, o tipo e quantidade do primeiro precursor de cerâmica, a razão da biomolécula para os precursores de cerâmica utilizados, etc. Comumente, o processo vai proporcionar uma EE maior que cerca de 40% ou maior que cerca de 50, 60, 70 ou 80%. A EE pode ser, por exemplo, de cerca de 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou 95%.
[067] Em uma modalidade particular, é fornecido um processo para fazer as partículas que compreendem uma biomolécula, o processo compreendendo: a) combinar: uma fase hidrofóbica que compreende um líquido hidrofóbico, um trialcoxissilano aminoalquilamino funcional e um surfactante tendo uma HLB entre cerca de 8 e cerca de 16; e uma fase hidrofílica que compreende água, silicato de sódio em pH de cerca de 5 e a biomolécula, de modo a formar uma emulsão que compreende gotículas da fase hidrofílica dispersas na fase hidrofóbica; e b) agitar a emulsão conforme as partículas se formam das gotículas.
[068] Em outra modalidade particular, é fornecido um processo para fazer as partículas que compreendem uma biomolécula, o processo compreendendo: combinar um surfactante com HLB entre cerca de 8 e cerca de 16 com um líquido hidrofóbico e adicionar um trialcoxissilano aminoalquilamino funcional de modo a formar uma fase hidrofóbica; combinar água e silicato de sódio, ajustar o pH até menos de cerca de 5 e adicionar a biomolécula para formar uma fase hidrofílica; combinar a fase hidrofóbica e a fase hidrofílica de modo a formar uma emulsão que compreende gotículas da fase hidrofílica dispersas na fase hidrofóbica; agitar a emulsão conforme as partículas se formam das gotículas; e adicionar um agente de tratamento de superfície à emulsão após a formação das partículas, de modo a tratar a superfície das partículas.
[069] Nesta modalidade, a etapa de adicionar a biomolécula pode ser realizada imediatamente (por exemplo, em menos de 1 minuto) antes da etapa de combinar as fases hidrofóbica e hidrofílica. A biomolécula pode ser um RNA ou um DNA ou outra biomolécula, conforme descrito anteriormente. Ela pode ser um siRNA.
[070] Nas variantes da modalidade acima, outras faixas de pH podem ser usadas ao invés de menos de cerca de 5. Por exemplo, condições básicas, tais como pH maior que cerca de 8, podem ser usadas. Os inventores consideram que os pHs na faixa de cerca de 5 a cerca de 8 também poderiam ser utilizáveis. Outras variantes possíveis incluem o uso de uma suspensão coloidal, como sílica coloidal, no lugar da combinação água/silicato de sódio. Essas variantes podem ser adequadas para o encapsulamento de biomoléculas relativamente grandes, como proteínas. Formação de nanopartículas (< 100nm)
[071] Em várias modalidades, pode ser vantajoso formar partículas em uma escala menor, particularmente com menos de 100 nm de tamanho. É previsto que isto pode proporcionar uma liberação mais eficaz da biomolécula em alguns casos.
[072] Nesse sentido, a invenção também fornece um processo para fazer partículas, que compreende uma biomolécula disposta nos poros das mesmas, o processo compreendendo: a) combinar: uma fase hidrofóbica que compreende um líquido hidrofóbico e um surfactante; e uma fase hidrofílica que compreende um líquido hidrofílico e um catalisador, de modo a formar uma emulsão que compreende gotículas da fase hidrofílica dispersas na fase hidrofóbica; b) adicionar um precursor de cerâmica à emulsão e hidrolisar o precursor de cerâmica; c) ajustar o pH da fase hidrofílica a uma faixa adequada para a biomolécula; d) adicionar a biomolécula e um precursor de cerâmica funcionalizado à emulsão; e e) agitar a emulsão conforme as partículas se formam dentro das gotículas; em que o primeiro precursor de cerâmica compreende um grupo funcional que é capaz de promover a penetração das partículas nas células.
[073] Muitas das características e das modalidades discutidas acima em relação à preparação das micropartículas podem ser igualmente aplicadas a este aspecto da invenção. Como tais, estas características e modalidades são explicitamente incorporadas neste documento por referência para evitar a repetição desnecessária. Neste sentido, o precursor de cerâmica funcionalizado descrito de acordo com este aspecto da invenção corresponde ao primeiro precursor de cerâmica discutido acima. O precursor de cerâmica descrito de acordo com este aspecto da invenção corresponde ao segundo precursor de cerâmica discutido acima.
[074] Não obstante a incorporação das características e modalidades acima mencionadas, em modalidades particulares da invenção o grupo funcional do precursor de cerâmica funcionalizado é capaz de interagir quimicamente com, por exemplo, interagir eletrostaticamente com a biomolécula. Por exemplo, o precursor de cerâmica funcionalizado pode ser um precursor de cerâmica amino funcional, como um alcoxissilano amino funcional. Em certas modalidades, o precursor de cerâmica amino funcional compreende um grupo aminoalquilamino. Por exemplo, o precursor de cerâmica amino funcional pode compreender 3-(2-aminoetilamino)propiltrimetoxissilano, 3-[2-(2-aminoetilamino)etilamino]propiltrimetoxissilano, 3-(2-aminoetilamino)propiltrietoxissilano ou 3-[2-(2-aminoetilamino)etilamino]propiltrietoxissilano, ou uma mistura de quaisquer dois ou mais destes.
[075] O surfactante pode novamente ter um HLB de cerca de 8 a 16. Verificou-se que bons resultados podem ser obtidos com o etoxilato de nonilfenol. A fase hidrofóbica pode ainda compreender um co-surfactante, como um álcool, por exemplo, 1-pentanol.
[076] No caso da preparação de nanopartículas, a viscosidade não é considerada crítica, pois microemulsões são formadas (ao contrário das emulsões normais), que são termodinamicamente estáveis e consistem em gotículas muito pequenas (≈ 10 nm).
[077] Em certas modalidades, o líquido hidrofóbico compreende um alcano (por exemplo, de hexano (C6) a dodecano (C12)), um cicloalcano tal como ciclo-hexano, compostos aromáticos (por exemplo, tolueno, benzeno) e misturas como querosene.
[078] A fase hidrofílica compreende um líquido hidrofílico e um catalisador. Por exemplo, o líquido hidrofílico pode compreender água e o catalisador pode ser um ácido. Mais geralmente, os catalisadores típicos para a hidrólise dos alcóxidos de silício podem ser ácidos ou bases, fluoretos ou outro alcóxido metálico, por exemplo, alcóxido de titânio.
[079] A biomolécula pode ser como descrito acima. Por exemplo, ela pode ser carregada negativamente ou ser suficientemente grande de modo que seja incapaz de passar pelos poros das partículas. A biomolécula pode compreender um RNA, um nucleotídeo anti-sense, e anti-sense, um aptâmero, um DNA, uma proteína, uma glicoproteína, um polipeptídeo, um carboidrato ou uma mistura ou aduto de quaisquer dois ou mais desses. Em uma modalidade particular, a biomolécula compreende siRNA.
[080] O processo inclui ajustar o pH da emulsão, por exemplo, pela adição de uma base tal como NaOH, KOH e NH4OH antes da adição da biomolécula e do precursor de cerâmica funcionalizado para evitar a desnaturação da biomolécula. Tipicamente, a hidrólise é realizada em pH baixo (por exemplo, 2) para garantir cinética suficiente para a reação de hidrólise e inibir, ao mesmo tempo, a condensação do precursor hidrolisado. Antes da adição da biomolécula, o pH é preferencialmente aumentado até condições mais neutras (ou seja, pH > 4).
[081] Novamente, um polímero ou agente complexante poderia ser adicionado, de modo que ele seja colocado dentro dos poros das partículas com a biomolécula para facilitar o escape endossomal. Tipicamente, o polímero poderia ser uma polietilinamina, uma polilisina ou uma poli-histidina ou qualquer substância que proporcione um efeito esponja de prótons.
[082] Como com o aspecto anterior da invenção, o processo pode compreender adicionalmente: f) adicionar um agente de tratamento de superfície à emulsão após a formação das partículas, de modo a tratar a superfície das partículas.
[083] O agente de tratamento de superfície pode compreender uma cadeia de polietilenoglicol acoplada a um grupo ligante, o dito grupo ligante sendo capaz de ligar a cadeia de polietilenoglicol à superfície das partículas. Por exemplo, o agente de tratamento de superfície pode ser também um PEG-silano, como trialcoxissilil-PEG.
[084] O agente de tratamento de superfície pode compreender um grupo alvo para direcionar um alvo em um paciente. Por exemplo, o agente de tratamento de superfície pode compreender um trialcoxissilil-PEG que compreende o grupo alvo na extremidade distal do PEG do grupo trialcoxissilano.
[085] A invenção também fornece partículas feitas por um processo conforme descrito em qualquer um dos parágrafos anteriores.
[086] Conforme observado acima, as biomoléculas podem ser indicadas para o tratamento profilático ou terapêutico de uma doença, distúrbio ou condição.
[087] Nesse sentido, em um aspecto da invenção é fornecida uma composição farmacêutica que compreende uma substância particulada, conforme divulgado neste documento, juntamente com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
[088] O veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser um enchimento sólido ou líquido, solvente, diluente ou substância encapsuladora que pode ser utilizada com segurança na administração sistêmica. Dependendo da via de administração particular, uma variedade de veículos bem conhecidos na técnica pode ser usada. Estes veículos podem ser selecionados de um grupo incluindo açúcares, amidos, celulose e seus derivados, malte, gelatina, talco, sulfato de cálcio, óleos vegetais, óleos sintéticos, polióis, ácido algínico, soluções tamponadas com fosfato, emulsionantes, solução salina isotônica e sais, tal como os sais de ácido mineral incluindo cloridratos, brometos e sulfatos, ácidos orgânicos tais como acetatos, propionatos e malonatos e água isenta de pirogênio. Uma referência útil que descreve veículos, diluentes e excipientes farmaceuticamente aceitáveis é Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N.J. EUA, 1991) que é incorporada neste documento por referência.
[089] As formas de dosagem incluem comprimidos, dispersões, suspensões, injeções, soluções, xaropes, trociscos, cápsulas, supositórios, aerossóis, emplastros transdérmicos e afins. Essas formas de dosagem também podem incluir injetar ou implantar dispositivos de liberação controlada projetados especificamente para esta finalidade ou outras formas de implantes modificado para atuar adicionalmente desta forma.
[090] Qualquer via segura de administração pode ser utilizada para a administração da substância particulada da invenção. Por exemplo, as vias oral, retal, parenteral, sublingual, bucal, intravenosa, intra-articular, intramuscular, intradérmica, subcutânea, inalatória, intraocular, intraperitoneal, intracerebroventricular, transdérmica e similares podem ser utilizadas.
[091] Em outro aspecto, é fornecido um método de tratamento de uma doença, distúrbio ou condição em um mamífero que inclui a etapa de administrar a substância particulada, conforme divulgado neste documento, ou a composição farmacêutica, ao dito mamífero para tratar, desse modo, a dita doença, distúrbio ou condição.
[092] Em ainda outro aspecto, é fornecida uma substância particulada conforme divulgado neste documento para uso no tratamento de uma doença, distúrbio ou condição em um mamífero.
[093] A doença, distúrbio ou condição pode ser uma doença, distúrbio ou condição genética (por exemplo, fibrose cística ou doença de Huntington), uma doença, distúrbio ou condição degenerativa (por exemplo, degeneração macular relacionada à idade), um câncer (por exemplo, tumores sólidos, sarcomas, linfomas, mielomas, carcinomas, melanomas, incluindo cânceres de mama, de colo do útero, pulmão e próstata, embora não se limitem a estes) uma doença, distúrbio ou condição do sistema imunológico, inclusive de doenças autoimunes (por exemplo, diabetes tipo 1, esclerose múltipla, artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico) e condições inflamatórias (por exemplo, asma, doença inflamatória intestinal, glomerulonefrite), uma doença, condição ou distúrbio causado por infecção por um patógeno, como um vírus (por exemplo, hepatite C, gripe, infecção por vírus sincicial respiratório, AIDS), uma bactéria (por exemplo, pneumonia, meningite bacteriana, coqueluche, tuberculose, tétano), protozoários (por exemplo, malária) ou um fungo (por exemplo, Cândida), uma doença, distúrbio ou condição do sistema circulatório (por exemplo, arteriosclerose, restenose, hipercolesterolemia), uma doença, distúrbio ou condição do sistema endócrino (por exemplo, diabetes do tipo II, osteoporose, pancreatite) ou uma doença, distúrbio ou condição neurológica (por exemplo, doença de Alzheimer, doença de Parkinson ou epilepsia), embora não se limitem a estas.
[094] O mamífero pode ser um mamífero humano ou não humano, inclusive de animais de desempenho (por exemplo, cavalos de corrida), aninais de estimação domésticos (por exemplo, cães, gatos) e animais de criação (por exemplo, gado, cavalos, ovelhas, porcos), embora não se limitem a estes. Preferencialmente, o mamífero é um ser humano. Breve descrição dos desenhos
[095] As modalidades da presente invenção serão agora descritas, apenas a título de exemplo, com referência aos desenhos associados. Deve-se considerar que a discussão a seguir não deve ser tomada como limitação na invenção em nenhum aspecto. Nos desenhos: A figura 1 é um fluxograma da preparação das partículas da presente invenção; A figura 2 mostra TEMs das partículas contendo siRNA, feitas pelo processo da invenção; A figura 3 mostra as distribuições do tamanho de partícula das partículas; A figura 4 mostra TEMs adicionais das partículas da invenção; A figura 5 mostra um gráfico que ilustra o efeito da carga de partículas e da PEGuilação sobre a liberação de siDNA fluorescente das partículas; A figura 6 mostra um gráfico que ilustra a cinética de liberação para diferentes cargas nas partículas; A figura 7 mostra uma cromatograma de HPLC de siRNA não encapsulado (traço vermelho) e siRNA liberado das partículas preparadas de acordo com esta invenção; A figura 8 mostra fotografias de suspensões das partículas da invenção; As figuras 9A/B e C mostram micrografias ilustrando a penetração das partículas nas células para partículas com cargas negativa (9A), neutra (9B) e positiva (9C); As figuras 10A/B e C mostram micrografias ilustrando a retenção da carga nas partículas com cargas negativa, neutra e positiva; As figuras 11A/B e 12A/B mostram micrografias ilustrando que a carga entra nas células com as partículas – as Figuras 11A/B mostram as partículas e as Figuras 12A/B mostram a carga; A figura 13 mostra a dispersão das siDNA nas células HEPG2 em função do tempo; A figura 14 mostra a dispersão de siDNA nas células HeLa em função do tempo; A figura 15 mostra a dispersão de siDNA nas células RAW264 em função do tempo; As figuras 16 A/B mostram a dispersão das siDNA nas células em função do tempo; A figura 17 mostra o efeito das partículas da presente invenção na atividade da DPP4 em fibroblastos BJ; A figura 18 mostra o fluxograma detalhado de um método de protótipo para encapsulamento de oligonucleotídeos; A figura 19 mostra um fluxograma da preparação das partículas da presente invenção, em escala nanométrica; A figura 20 mostra imagens FEG-SEM das partículas feitas de acordo com o processo ilustrado na Figura 19; A figura 21 mostra imagens de fase e fluorescência das partículas marcadas com flúor-DNA; e A figura 22 mostra a penetração das nanopartículas nas células HeLa. Descrição detalhada da invenção
[096] O encapsulamento e a liberação controlada de siRNA das partículas de sílica modificada são descritos. As partículas consistem em sílica amorfa (SiO2) com uma proporção de aminossilanos incorporada para auxiliar a retenção de carga e a penetração na célula. As partículas são de superfície modificada para biocompatibilidade (meia-vida circulante ~ 4 h). As partículas podem penetrar nas membranas celulares mamíferas e liberar a carga nos espaço endossomal e intracelular.
[097] A figura 1 ilustra a síntese das partículas, incluindo o encapsulamento do siRNA (uma biomolécula representativa, que representa a carga das partículas resultantes). Assim, com referência à Figura 1, uma fase contínua hidrofóbica foi feita combinando-se 30 mL de óleo de parafina pesado e 4,5 g de SPAN-20 (= 500 mM). Estes foram combinados por agitação (30 minutos). Aminossilano (DATMS ou
TATMS, não APTES) foi, em seguida, adicionado em quantidade suficiente até a carga desejada: para partículas negativas, nenhuma adição foi feita, para partículas neutras, DATMS (1,5 uL = 1% em mol como silício) e para partículas positivas, DATMS (15 uL = 10% em mol por silício). A mistura resultante foi, a seguir, agitada durante pelo menos mais 10 minutos, mas não durante mais de 60 minutos.
[098] Uma solução de sílica foi, a seguir, preparada pela combinação de 4 mL de silicato de sódio e 20 mL de água. Resina trocadora catiônica suficiente foi adicionada à mistura resultante com agitação até levar o pH para 4,0. A solução de sílica a seguir decantou da resina em um recipiente novo.
[099] A fase hidrofóbica (feita como descrito acima) foi feita para agitação magnética e ultrassom (sonda 3/8”) simultaneamente, e o agitador foi ativado. O ultrassom aumentou gradualmente até 70% de potência (~ 700 W) na preparação para combinar as fases hidrofóbica e hidrofílica.
[100] 5 mg de carga (250 uL de solução de siRNA de 20 mg/mL) foi misturado com 1,25 mL de solução de sílica preparada como descrito acima. Após 10 segundos de ultrassom, a mistura de sílica/carga foi adicionada na zona ativa do ultrassom. O ultrassom continuou durante 30 segundos e o ultrassom foi, em seguida, desativado. A emulsão foi removida e introduzida em um agitador magnético e foi agitada durante 1 hora. Após isso, PEG5000-silano (10 mg) foi adicionado à mistura e a suspensão de partículas resultante foi agitada de um dia para o outro.
[101] As partículas foram coletadas da emulsão por centrifugação (15000 x g durante 10 minutos). A emulsão foi,
a seguir, diluída com 0,5 volume de ciclo-hexano para reduzir a sua viscosidade e foi lavada duas vezes com ciclo-hexano (cerca de 40 mL) e duas vezes com etanol 100% (cerca de 40 mL). Cada etapa de lavagem envolveu a ressuspensão e coleta das partículas e a decantação do sobrenadante. As partículas foram finalmente ressuspensas em 5 mL de etanol 100% para armazenamento a -20 ºC ou 4 ºC. As partículas podem ser armazenadas durante vários meses a 4 ºC sem perda substancial de atividade biológica, porém, uma menor temperatura de armazenamento proporcionará um prazo de armazenamento ainda mais longo.
[102] O método acima fornece partículas que variam em tamanho de 100 a 1000 nm, com um diâmetro médio ponderado pela massa (d0,5) de cerca de 300 nm. Isso é mostrado nas Figuras 2 e 4. A Figura 3 mostra as distribuições do tamanho de partícula das partículas. O ombro a cerca de 1 mícron provavelmente representa uma menor quantidade de partículas agregadas. O método acima foi utilizado nos estudos descritos abaixo, no entanto, modificações do método produziram partículas dispersas com d0,5 < 150 nm.
[103] As partículas foram preparadas com cargas diferentes variando a quantidade e/ou o tipo de aminossilano adicionado. DATMS (aminoetilaminopropiltrimetoxissilano: 2 átomos de nitrogênio por molécula) foi usado como padrão. APTES (aminopropiltrimetoxissilano: 1 átomo de nitrogênio por molécula) foi muito menos eficaz e TATMS (aminoetilaminoetilaminopropiltrimetoxissilano: três átomos de nitrogênio por molécula) mostraram resultados semelhantes ao DATMS.
[104] Conforme observado acima, o aminossilano foi adicionado à fase hidrofóbica e, a seguir, transferido para a fase hidrofílica por transferência hidrofílica. Devido à divisão entre as fases, a quantidade de aminossilano incorporada foi menor que a quantidade adicionada. Verificou-se que a adição direta do aminosilano à fase hidrofílica (ou seja, combinação com o silicato de sódio) não era praticável em pH ácido, uma vez que isto causou a gelificação prematura.
[105] A carga das partículas foi medida em pH 7,0 em MOPS 10 mM (tampão de ácido 3-N-morfolinopropanossulfônico). Os potenciais zeta para as partículas foram os seguintes: Nativa (sem aminossilano): ζ ≤-30 mV Neutra (DATMS 1%): -5 mv < ζ < 5 mV Positiva (DATMS 10%): ζ ≥ +10 mV
[106] Apesar do uso de um método de medição indireta, a carga medida foi bastante repetitiva entre os lotes.
[107] A eficiência de encapsulação porcentual (EE) foi determinada por comparação da carga teórica do siRNA (determinada a partir da quantidade adicionada) com a carga real conforme medido pela quantidade liberada. Os resultados são mostrados abaixo: Carga teórica: 5% EE (da liberação de 1 mg/mL) Lote 1: 85% +/- 5 % EE (da liberação de 0,1 mg/mL) Lote 1: 80% +/- 2% Lote 2: 85% +/- 10% Carga real de 4,2 %
Carga teórica: 10% EE 75%, carga de 7,5%
[108] Assim, quanto maior for a quantidade do RNA introduzido, menor é a eficiência de encapsulação.
[109] A figura 5 mostra o efeito da liberação de um siDNA marcado fluorescente das partículas de sílica de carga diferente e com modificação de superfície. Como discutido acima, a carga da partícula pode ser manipulada mediante a alteração da quantidade de aminossilano usada. A liberação das partículas carregadas positivamente foi muito mais lenta do que das partículas carregadas negativamente, conforme previsto pela atração esperada entre as partículas carregadas positivamente e a carga negativamente carregada. Para as partículas carregadas negativamente, a presença de PEG na superfície das partículas parece acelerar a liberação da carga.
[110] Acredita-se que a liberação da carga das partículas seja principalmente pela dissolução da matriz das partículas. Em concentrações elevadas em meio aquoso (≥ cerca de 1 mg/mL de partículas), a lixiviação da carga das partículas é limitada àquela mediada por dissolução das partículas, ou seja, a solução pode atingir a saturação na matriz da partícula, limitando assim a liberação da carga. Isso é mostrado na Figura 6, em que a liberação relativamente rápida de moléculas de siRA tanto ativas (valores de ponto de partida) quanto misturadas (valores de ponto quadrado) ocorre até um limite determinado pela solubilidade da matriz de sílica. Deve ser observado que isto não é evidente na figura 5, uma vez que as concentrações das partículas era diferente. Nas concentrações substancialmente abaixo do limite de solubilidade da sílica (cerca de 100 µg/mL), ou em situações em que o líquido de liberação é continuamente trocado, a completa dissolução das partículas ocorre durante cerca de 12 a 24 horas. As partículas feitas como descrito acima foram armazenadas durante 36 dias a 253 K em etanol a 96%. Após o armazenamento, as partículas foram completamente dissolvidas em água isenta de RNase. A eluição do líquido resultante em HPLC mostrou um perfil muito semelhante ao do siRNA desencapsulado em uma solução tampão, indicando que o encapsulamento e liberação não afetaram significativamente o siRNA.
[111] A figura 7 mostra uma cromatograma de HPLC de siRNA não encapsulado e siRNA liberado das partículas preparadas de acordo com esta invenção. Tanto as partículas quanto a referência (siRNA não encapsulado) foram tratadas com RNase A durante 15 minutos, a seguir foram lavadas três vezes com PBS antes da suspensão em PBS contendo um inibidor de RNase. O material liberado das partículas de sílica mostra o RNA intacto. A digestão similar do siRNA não encapsulado resultou na destruição completa. Estes experimentos demonstram a capacidade das partículas para proteger a biomolécula encapsulada contra a degradação enzimática.
[112] A figura 8 mostra fotografias das partículas suspensas em 3 mg/L contra PBS (à esquerda) ou contra 50% de soro de murino em PBS (à direita). Após a incubação de um dia para o outro, nenhuma agregação visível ocorreu. As partículas também foram suspensas em 1, 3, 10 mg/Kg em BSA 1500 ppm e foram, a seguir, incubadas durante 2 horas. O tamanho de partícula foi a seguir determinado por Mastersizer (espalhamento Mie), não revelando nenhuma mudança mediada por tempo ou concentração no perfil de tamanho.
[113] Em conclusão, as cargas de 4% são rotineiramente obtidas e cargas de cerca de 8% foram demonstradas. A eficiência de encapsulação de > 80% é rotineiramente atingível. A retenção da biomolécula nas partículas parece ser mediada principalmente por forças eletrostáticas, produzindo características de liberação limitadas por dissolução em pH fisiológico (ou seja, a liberação ocorre predominantemente por dissolução da matriz). As características de retenção de carga se mostraram inalteradas após 40 dias de armazenamento a - 20 ºC em EtOH a 96%. Absorção em Células de Mamíferos
[114] A influência da carga da partícula na penetração da célula e retenção de carga e a duração da absorção nas células e o escape endossomal foram investigados.
[115] Partículas covalentemente marcadas com RITC (isotiocianato de rodamina) e carregando um DNA com uma sequência tipo siRNA e marcadas com FITC (isotiocianato de fluoresceína) foram sintetizadas. As células (NIH3T3, HeLa, HEPG2) foram cultivadas até 50% de confluência e as partículas conforme descritas acima (cerca de 30 μg/mL, equivalente a 100 nM de DNA) foram adicionadas diretamente ao meio de cultura. Após 40 h, as culturas foram lavadas uma vez com PBS (solução salina tamponada com fosfato), para remover as partículas que não tinham penetrado nas células e foram, a seguir, visualizadas por microscopia epifluorescente.
[116] A figura 9 mostra os resultados da monitorização da etiqueta RITC: em cada par de imagens, a imagem superior é uma imagem de contraste de fase e a imagem inferior é uma imagem de fluorescência. A figura 9 indica que, com o aumento da carga positiva nas as partículas, mais partículas são absorvidas pelas células. Assim, uma carga positiva sobre as partículas auxilia não só na ligação da carga, mas também auxilia com a absorção de partículas nas células. A figura 10 ilustra que a carga é mais eficientemente retida nas partículas positivamente carregadas, uma vez que elas são absorvidas pelas células em comparação com as partículas neutras ou negativamente carregadas. Esta figura mostra a retenção do siDNA pela carga. Em cada par de imagens, a imagem superior é uma imagem de contraste de fase e a imagem inferior é uma imagem de fluorescência de siDNA.
[117] As figuras 11A/B mostram a absorção das partículas em duas linhagens celulares diferentes (ou seja, a distribuição de partículas) (figura 11A – células HeLa; figura 11B – células HEPG2) e as figuras 12A/B mostram micrografias das mesmas amostras, mas com a carga marcada em destaque (ou seja, a distribuição de carga) (figura 12A – células HeLa; figura 12B – células HEPG2). Em cada par de imagens em ambas as figuras, a imagem superior é uma imagem de contraste de fase. Na Figura 11, em cada par, a imagem inferior é uma imagem de fluorescência RITC (canal vermelho), e na Figura 12 em cada par, a imagem inferior é uma imagem de fluorescência de siDNA (canal verde). Por comparação dessas duas figuras, pode-se determinar que o siRNA é retido nas partículas conforme as partículas penetram nas células. A colocação dos pontos verde e vermelho dentro da célula significa que a sílica penetrou dentro (pontos de canal vermelho = partículas de sílica), retendo concomitantemente a sua carga de DNA fluorescente (pontos de canal verde = DNA), demonstrando assim que o DNA foi transfectado com sucesso para dentro das células. As Figuras 13 a 15 mostram a duração da introdução de siDNA marcado em várias linhagens celulares (Figura 13: HEPG2; Figura 14: HeLa; Figura 15: RAW264) por meio das partículas da invenção. Cada figura mostra a distribuição de fluorescência em cada momento após o tratamento nas células. Em cada caso, pode ser visto que, em períodos de tempo mais curtos, o siDNA está localizado principalmente em pequenas regiões, representando a localização dentro das partículas localizadas nas células. Em períodos de tempo mais longos, o siDNA espalha-se para dentro de regiões maiores, representando a liberação das partículas, por dissolução da matriz da partícula e a distribuição pelas células.
[118] As figuras 16A/B mostram um experimento similar usando microscopia confocal. Nas figuras 16A/B, a imagem superior de cada par mostra a mancha do núcleo (canal azul) e a imagem inferior mostra a fluorescência de siDNA (canal verde). Assim, as células HeLa foram plaqueadas em lamínolas revestidas com polilisina em 25% de confluência. Estas foram tratadas durante 24 (fig. 16A) ou 48 h (fig. 16B) com partículas modificadas com RITC carregando FAM-DNA. Elas foram, a seguir, lavadas com PBS e fixadas com formaldeído 3,7% em PBS. Elas foram, a seguir, coradas com 1,2 μg/mL de Hoescht 33342 em solução salina isotônica, montadas em lâminas com Gelmount e acrílico e visualizadas com um microscópio confocal com aumento de 100x. As imagens são de 150 x 150 μm, o eixo z divide a profundidade de 350 nm. As estruturas quase redondas bem definidas representam o DNA nuclear. Após 24 horas, há um grande número de pequenas regiões brilhantes, representando a carga localizada dentro das partículas. Uma pequena quantidade de iluminação difusa representa uma pequena quantidade de carga liberada. Após 48 horas, as fontes pontuais desapareceram em grande parte, representando a dissolução das partículas. Em vez disso, cada célula tem um halo difuso da região clara representando a carga liberada dentro da célula. Estudos do silenciamento de gene
[119] A figura 17 mostra os resultados de um experimento para mostrar a eficácia das partículas carregadas presentes no silenciamento (ou seja, inibição da expressão gênica). Este experimento analisou a eficácia do silenciamento de DPP4 em fibroblastos BJ humanos. siRNA sozinho foi ineficaz, possivelmente devido à inativação pela RNase presente no sistema. Obviamente, as partículas de sílica descarregadas também eram ineficazes. A medição rotulada como siRNA/Lipo se refere ao siRNA transfectado através de Lipofectamine®, que é conhecida por transfectar oligonucleotídeos através da membrana celular. Este sistema tem as desvantagens de que é tóxico e não oferece proteção para o siRNA contra o ataque enzimático. A medição rotulada como siRNA/nano representa o siRNA encapsulado em partículas de acordo com a presente invenção. Em cada caso no qual o siRNA estava presente, ele foi usado em cerca de 200nM. Os resultados mostram que o siRNA encapsulado foi eficaz no silenciamento nesta concentração e foi, na verdade um pouco mais eficaz do que de siRNA com Lipofectamine. Conclusões in vitro • O encapsulamento de biomoléculas nas partículas de acordo com a presente invenção pode proteger as biomoléculas contra a degradação enzimática. • Quando aplicadas às células sob condições de cultura normais, as partículas carregadas com biomoléculas são capazes de penetrar na membrana citoplasmática e liberar a sua carga no espaço intracelular. • A liberação das biomoléculas através das partículas da invenção para as células de cultura de tecido resulta na redução dependente de dose dos níveis de mRNA naquelas células. • Doses de siRNA encapsulado em partículas suficientes para resultar em > 50% de redução nos níveis de mRNA não mostram nenhuma toxicidade significativa in vitro. Resultados adicionais - síntese de partículas
[120] O método sintético geral é descrito pelo fluxograma na Figura 18. A formação de partículas foi extremamente rápida na adição do precursor aquoso à solução de surfactante. No entanto, houve um intervalo de pelo menos 12 horas entre a formação da emulsão e a coleta das partículas.
[121] A retenção dos oligonucleotídeos é fortemente influenciada por interações eletrostáticas entre a carga e o componente aminossilano das partículas. Isso compõe a quantidade e o tipo de substituição, e também o pH da formação e dos fatores críticos de liberação na determinação das características de encapsulamento, retenção e liberação. Parâmetros
[122] O surfactante utilizado neste exemplo foi monolaurato de sorbitano (Span® 20). A concentração de surfactante utilizada foi de cerca de 17% em massa. A fase hidrofóbica foi parafina líquida pesada, esta fornecendo as menores partículas dentre aquelas testadas. O tamanho de partícula foi reduzido até um valor aceitável para injeção intravenosa por uma combinação de agitação magnética e ultrassom.
[123] O aminossilano preferencial utilizado para aumentar a retenção de carga foi DATMS (aminoetilaminopropiltrimetoxissilano). Experimentos com APTES (aminopropiltrietoxissilano) e TATMS (aminoetilaminoetilaminopropiltrimetoxisilano) mostram que eles também têm esse efeito até um grau menor ou maior, e eles podem ser úteis nas características de ajuste fino de retenção/liberação. Espera-se que a carga afete o potencial de partícula zeta, e espera-se que a modificação de aminossilano afete a carga máxima.
[124] O pH de estabilidade mínima para o silicato de sódio é de cerca de 5,5, que representa o pH da máxima estabilidade para o RNA. Se a solução de silicato estiver muito próxima da neutralidade, o precursor vai espontaneamente gelificar antes que ele possa ser usado para a síntese de partículas. Se a solução for muito ácida, degradação significativa da carga de nucleotídeo ocorrerá. Com as cargas de RNA, um precursor com pH de 3,75 a 4,00 mostrou ser adequado, ainda que um pouco difícil de manusear. DNA, LNA ou outros oligonucleotídeos modificados podem permitir soluções de precursor mais ácidas (e, portanto, mais estáveis). Exemplo - Figura 18 Encapsulamento do siRNA em partículas modificadas com DATMS, rodamina e mPEG-5000:
[125] 15 g de Dowex 50W foi agitado com 100 mL de HCl 5 M durante 30 minutos para converter a resina na forma ativa protonada. A resina foi, a seguir, recuperada por filtração assistida a vácuo em um funil de filtro de vidro sinterizado, em que ele foi lavado duas vezes com 100 mL de água deionizada (milliQ) para remover o HCl residual.
[126] 9 gramas de Span® 20 foi pesado em um béquer de Teflon e 60mL de parafina líquida foi adicionado. A mistura resultante foi agitada durante cerca de 30 minutos para completar a dissolução do Span® 20 na parafina. 29 µL de líquido DATMS e 6 µL de 10% de rodamina-APTES em 2-propanona foi adicionado à solução de surfactante agitada.
[127] 4,0 mL de solução de silicato de sódio foi adicionada a 28 mL de água deionizada (milliQ). 8,0 mL desta solução foi separada para titulação subsequente do volume principal.
[128] Usando uma sonda de pH para monitorar continuamente o pH da solução, a resina de troca catiônica ativada foi adicionada para reduzir o pH da mistura de silicato até cerca de 3,5. A solução de silicato foi decantada a partir da resina e o pH foi novamente verificado.
[129] 2,5 mL desta solução precursora foi transferido para um tubo de plástico de 5 mL. Um volume apropriado (< 0,5 mL) da carga de solução de RNA foi transferido para um tubo de 1,5 mL.
[130] A carga de solução de RNA foi pipetada no precursor de silicato. A mistura RNA/silicato foi pipetada na solução de surfactante e o ultrassom continuou com a agitação durante 25 segundos.
[131] A emulsão resultante foi rapidamente agitada durante 15 minutos. 15 mg de pó de silano mPEG-5000 foi, em seguida, adicionado à emulsão e a mistura resultante foi agitada de um dia para o outro.
[132] A mistura foi, a seguir, centrifugada durante 5 minutos a > 2000 x g para isolar as partículas. As partículas foram a seguir lavadas duas vezes com ciclo-hexano para remover a parafina e o surfactante, centrifugando após cada lavagem e, em seguida, lavando mais uma vez com etanol. As partículas foram coletadas por centrifugação, o sobrenadante foi decantado e as partículas foram ressuspensas em 10 mL de etanol.
[133] O peso típico do produto obtido foi de 200 mg. A eficiência de encapsulação típica foi > 80%. O zeta típico das partículas em pH 7,4 foi +20 mV. A redução típica da ligação das proteínas às partículas, em comparação com as partículas de silicato naturais (uma medida de densidade de PEGuilação) foi > 90%. Exemplos - Figura 19 A. Síntese de microemulsão de partículas para encapsulamento da biomolécula
[134] 0,381 g de NP9 foi dissolvido em 3 mL de ciclo-hexano (0,2 mol/L), por agitação (magnética) em um frasco de vidro e 0,065 mL de 1-pentanol foi subsequentemente adicionado como um co-surfactante sob agitação contínua (0,2 mol/L). A solução resultante constituiu a fase hidrofóbica.
[135] 0,013 mL de HNO3 0,01 M foi adicionado para atuar como um catalisador ácido, constituindo a fase hidrofílica, e a solução foi agitada durante 20 minutos até homogeneizar. Isto resultou na formação de uma microemulsão.
[136] 0,018 mL de tetrametilortossilicato (TMOS) foi adicionado e a solução resultante foi agitada durante 66 horas para hidrolisar o TMOS e fornecer uma solução precursora hidrolisada.
[137] 0,013 mL de NaOH 0,01 M foi adicionado e agitado durante 5 minutos para ajustar o pH até mais de cerca de 4.
[138] A adição de uma biomolécula foi simulada pela adição de 0,010 mL de água com agitação. Como um precursor de cerâmica funcionalizado, 0,003 mL de 3-(2-aminoetilamino)propiltrimetoxissilano foi adicionado e a mistura foi agitada durante 6,5 horas, durante o que a solução tornou-se progressivamente mais turva. Isso forneceu uma suspensão de nanopartículas.
[139] 5 mg de mPEG-silano (PM = 5000) foi adicionado e a agitação foi mantida sob agitação durante 15 horas. A solução foi a seguir centrifugada (13.000 durante 1 minuto) para isolar as partículas, que foram a seguir lavadas três vezes com 2 mL de etanol e suspensas em 2 mL de etanol.
[140] As partículas foram visualizadas por FEG-SEM, que mostrou uma faixa de tamanho de 30 a 100 nm. É feita referência à Figura 20. B. Síntese de microemulsão de partículas para encapsulamento da biomolécula
[141] 0,636 g de NP9 foram dissolvidas em 5 mL de ciclo-hexano (0,2 mol/L) por agitação (magnética) em um frasco de vidro. 0,109 mL de 1-pentanol foi adicionado como um co-surfactante com agitação contínua (0,2 mol/L). 1,14 mL da solução de ciclo-hexano/NP9/1-pentanol foi pipetado dentro de um segundo frasco de vidro (x2).
[142] 0,011 mL de HNO3 0,01 M foi adicionado às sub-amostras acima e as soluções foram agitadas durante 40 minutos para homogeneizar, formando uma microemulsão.
[143] 0,0125 mL (0,08 mMol) de tetrametilortossilicato foi adicionado às sub-amostras e as soluções resultantes foram agitadas durante 17,5 horas para hidrolisar o TMOS. 0.011 mL de NaOH 0,01 M foi adicionado a ambas as amostras e elas foram agitadas durante 5 minutos para ajustar o pH até mais de cerca de 4.
[144] 0,006 mL da solução de flúor-DNA (DPP4 marcado com FITC (21 pares de bases), 0,5 mg/mL em água) foi adicionado com agitação a uma amostra, e 0,006 mL de água foi adicionado à segunda amostra com agitação.
[145] 0,002 mL (0,009 mMol) de 3-(2-aminoetilamino)propiltrimetoxissilano foi adicionado como o precursor de cerâmica funcionalizado a cada amostra e as misturas foram agitadas durante 6 horas.
[146] 0,8 mg de mPEG-silano (PM = 5000) foi adicionado a cada amostra, e as amostras foram a seguir deixadas sob agitação durante 18 horas. 1 mL de acetona foi adicionado a cada amostra e as soluções foram agitadas durante 10 minutos.
[147] As soluções foram a seguir centrifugadas (13.000 durante 1 minuto) para isolar as partículas, que foram a seguir lavadas três vezes com 2 mL de etanol. A amostra contendo flúor-DNA (CS11-0028) foi suspensa em 2 mL de etanol. A amostra feita utilizando somente água (CS11-0029) foi seca a 40 °C e pesava 7,3 mg.
[148] Várias gotas de partículas marcadas com flúor-DNA foram secas em uma lâmina de microscópio e visualizadas usando um microscópio de fluorescência equipado com um filtro FITC com ampliação de 40x e 4 segundos de exposição. É feita referência à Figura 21.
[149] A figura 22 ilustra a transfecção de hepatócitos humanos cultivados com nanopartículas de sílica marcadas com AlexaFluor-633. As células foram tratadas durante 24 horas antes da visualização (figura superior - imagem de contraste da fase; figura inferior – canal fluorescente vermelho).
Outro Exemplo
[150] Partículas covalentemente marcadas com FITC (isotiocianato de fluoresceína) e com uma carga de ficoeritrina serão sintetizadas. Células HeLa serão cultivadas até 50% de confluência e partículas conforme descrito acima (cerca de 30 μg/mL) serão adicionadas diretamente ao meio de cultura. Após 40 h, as culturas serão lavadas uma vez com PBS (solução salina tamponada com fosfato) para remover as partículas que não tinham penetrado nas células e serão, a seguir, visualizadas por microscopia epifluorescente para, deste modo, monitorar a liberação intracelular da ficoeritrina liberada.
[151] A menos que o contexto especifique de outra forma ou seua especificamente indicado em contrário, os números inteiros, etapas ou elementos da invenção aqui citados como números inteiros, etapas ou elementos no singular claramente abrangem formas singulares e plurais dos números inteiros, etapas ou elementos.
[152] Em todo este relatório descritivo, a menos que o contexto especifique de outra forma, a palavra "compreender" ou variações como “compreende” ou “compreendendo” serão interpretadas como implicando a inclusão de uma etapa ou elemento ou número inteiro ou grupos de etapas ou elementos ou números inteiros estabelecidos, mas não a exclusão de qualquer outra etapa ou elemento ou número inteiro ou grupo de etapas, elementos ou números inteiros. Assim, no contexto deste relatório descritivo, o termo “compreendendo” é usado em um sentido inclusivo e, portanto, deve ser interpretado como significando "incluindo principalmente, mas não necessariamente apenas".
[153] Será percebido que a descrição acima foi dada a título de exemplo ilustrativo da invenção e que todas as modificações e variações da mesma, conforme sejam evidentes para o homem da técnica, são consideradas como estando englobadas no amplo escopo e âmbito da invenção, conforme definido neste documento.

Claims (21)

REIVINDICAÇÕES
1. SUBSTÂNCIA PARTICULADA, caracterizada pelo fato de compreender: partículas de uma matriz de cerâmica com um grupo funcional, o grupo funcional sendo capaz de promover a penetração das partículas nas células e de ser distribuído homogeneamente ao longo das referidas partículas; e uma biomolécula tendo propriedades hidrofílicas disposta dentro dos poros das partículas, a biomolécula sendo liberável das partículas por dissolução da matriz de cerâmica.
2. SUBSTÂNCIA PARTICULADA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o grupo funcional interage quimicamente com a biomolécula para prevenir substancialmente a lixiviação.
3. SUBSTÂNCIA PARTICULADA, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o grupo funcional da matriz de cerâmica compreende um grupo aminofuncional.
4. SUBSTÂNCIA PARTICULADA, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que as cadeias de polietilenoglicol são acopladas à superfície das partículas.
5. SUBSTÂNCIA PARTICULADA, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que um grupo alvo é acoplado à superfície das partículas.
6. SUBSTÂNCIA PARTICULADA, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que as ditas partículas têm um tamanho de partícula médio de cerca de 20 a cerca de 100 nm e têm um tamanho de poro de cerca de 1 a cerca de 50 nm.
7. SUBSTÂNCIA PARTICULADA, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que um polímero ou agente complexante é colocado nos poros das partículas com a biomolécula e proporciona um efeito esponja de prótons.
8. PROCESSO PARA FAZER PARTÍCULAS, caracterizado pelo fato de compreender uma biomolécula disposta nos poros das mesmas, o processo compreendendo: a) combinar: uma fase hidrofóbica que compreende um líquido hidrofóbico, um primeiro precursor de cerâmica e um surfactante; e uma fase hidrofílica que compreende um líquido hidrofílico, um segundo precursor de cerâmica e a biomolécula, de modo a formar uma emulsão que compreende gotículas da fase hidrofílica dispersas na fase hidrofóbica; e b) agitar a emulsão conforme as partículas se formam dentro das gotículas; em que o primeiro precursor de cerâmica compreende um grupo funcional que é capaz de promover a penetração das partículas nas células.
9. PROCESSO PARA FAZER PARTÍCULAS, caracterizado pelo fato de compreender uma biomolécula disposta nos poros das mesmas, o processo compreendendo: a) combinar: uma fase hidrofóbica que compreende um líquido hidrofóbico e um surfactante; e uma fase hidrofílica que compreende um líquido hidrofílico e um catalisador, de modo a formar uma emulsão que compreende gotículas da fase hidrofílica dispersas na fase hidrofóbica;
b) adicionar um precursor de cerâmica à emulsão e hidrolisar o precursor de cerâmica; c) ajustar o pH da fase hidrofílica a uma faixa adequada para a biomolécula; d) adicionar a biomolécula e um precursor de cerâmica funcionalizado à emulsão; e f) agitar a emulsão conforme as partículas que se formam dentro das gotículas, em que o precursor de cerâmica funcionalizado compreende um grupo funcional que é capaz de promover a penetração das partículas nas células.
10. PROCESSO, de acordo com uma qualquer das reivindicações 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o grupo funcional do primeiro precursor de cerâmica ou precursor cerâmico funcionalizado, é capaz de interagir quimicamente com, por exemplo, interagindo eletrostaticamente, com a biomolécula.
11. PROCESSO, de acordo com uma qualquer das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que o primeiro precursor de cerâmica ou precursor cerâmico funcionalizado, é um alcoxissilano aminofuncional.
12. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: combinar o líquido hidrofílico e o segundo precursor de cerâmica; ajustar o pH até abaixo do pKa do primeiro precursor de cerâmica; e adicionar a biomolécula, de modo a formar a fase hidrofílica, as ditas etapas sendo realizadas antes da etapa a).
13. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 12,
caracterizado pelo fato de que a etapa de ajustar o pH compreende expor uma solução do segundo precursor de cerâmica no líquido hidrofílico a uma resina trocadora catiônica e, em seguida, separar a solução da resina uma vez que o pH da solução tenha atingido um pH desejado abaixo do pKa do primeiro precursor de cerâmica.
14. PROCESSO, de acordo com uma qualquer das reivindicações 8 a 13, caracterizado pelo fato de que a biomolécula é negativamente carregada ou é suficientemente grande que é incapaz de passar através dos poros das partículas.
15. PROCESSO, de acordo com uma qualquer das reivindicações 8 a 14, caracterizado pelo fato e compreender adicionalmente adicionar um agente de tratamento de superfície à emulsão após a formação das partículas de modo a tratar a superfície das partículas.
16. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o agente de tratamento de superfície é um PEG-silano, como um trialcoxissilil-PEG.
17. PROCESSO, de acordo com uma qualquer das reivindicações 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que o agente de tratamento de superfície compreende um grupo alvo para alvejar um alvo em um paciente.
18. PROCESSO, de acordo com uma qualquer das reivindicações 8 a 17, caracterizado pelo fato de que um polímero ou agente complexante é adicionado, de modo que ele é colocado dentro dos poros das partículas com a biomolécula e pelo fato de que o polímero é uma polietilinamina, uma polilisina ou uma poli-histidina ou uma substância que proporciona um efeito esponja de prótons.
19. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 9,
caracterizado pelo fato de incluir ajustar o pH da emulsão até mais que 4, por exemplo, pela adição de uma base, como NaOH, KOH e NH4OH, antes da adição da biomolécula e do precursor de cerâmica funcionalizado.
20. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelo fato de compreender uma substância particulada de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7, juntamente com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
21. SUBSTÂNCIA PARTICULADA, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento de uma doença, distúrbio ou condição em um mamífero.
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