CN103209688B - 用于递送生物分子的包含陶瓷粒子的粒状物质 - Google Patents

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Abstract

一种粒状物质，其包含带有官能团的陶瓷基质的粒子，所述官能团能够促进所述粒子渗入到细胞中；以及设置在所述粒子的孔隙内的生物分子，所述生物分子通过所述陶瓷基质的溶出而可从所述粒子释放。

Description

用于递送生物分子的包含陶瓷粒子的粒状物质
技术领域
本发明涉及用于递送生物分子的包含陶瓷粒子的粒状物质，以及制备其的方法。更具体地，本发明涉及包含带有官能团的陶瓷基质的粒子的粒状物质，其具有设置在所述粒子的孔隙内的可释放生物分子。
背景技术
siRNA和基因疗法的使用代表卫生保健的一个潜在主要进步。它显示治疗一系列当前非可治愈疾病如囊性纤维化、一些癌症以及免疫疾病如1型糖尿病、多发性硬化等的潜力。然而，对于保护siRNA在体内免于酶降解直至递送至作用部位以提供有效疗法存在需要。
目前，siRNA疗法昂贵。对于这样的昂贵疗法的主要市场主要在更发达的国家。对于基因疗法的全球市场估计为>US$5B。
开发siRNA疗法至临床使用的主要挑战包括：
·保护活性材料免于酶降解；
·使活性材料能够进入靶细胞（良好渗透）；
·活性材料从包封剂中释放到细胞质（内含体逸出）；
·确保击倒基因的能力（优选具有在nM浓度的效力）；和
·实现低毒性（大治疗窗）。
siRNA为中间尺寸化(约14kDa,3nm直径,10nm长度)、亲水性、带强负电的分子。它们是化学和生物不稳定的，除非被修饰以增强稳定性。为了实现临床效果，siRNA必须能够越过细胞膜并且存在于靶细胞群的胞质中。
在过去，病毒载体已被开发以递送RNA或DNA。然而，这些存在免疫反应的风险并且很难进行实践。各种非病毒载体（例如脂质复合物，阳离子聚合物复合物，脂质体，树枝状聚合物，聚合物纳米粒子)也已被开发。这些提供了一系列问题，包括用siRNA实施的困难，siRNA和载体之间的相互作用，以及siRNA暴露于体内降解。尤其是，设计各种系统用于将DNA或RNA吸附到纳米粒子的表面上。然而，这些通常存在所吸附分子在递送至作用位点之前经受酶攻击，由此降低治疗的有效性的缺点。
尽管上述讨论主要涉及siRNA和DNA，但是所讨论的问题不限于siRNA和DNA。它们潜在地应用于广泛的期望进行细胞内递送的生物分子，包括例如肽、蛋白质等。因此对于这些问题的方案可以更广泛地适用。本发明的应用因此不应认为局限于siRNA。
有利地，本发明基本上克服或至少改善上述缺点中的一个或多个并且至少部分地满足上述需要。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供了一种粒状物质，包含：
带有官能团的陶瓷基质的粒子，上述官能团能够促进所述粒子渗入细胞；和
设置在所述粒子孔隙内的生物分子，所述生物分子通过溶解所述陶瓷基质从所述粒子可释放。
如本文中使用的，提及生物分子被“设置在粒子的孔隙内”用于在其范围内包括其中有效形成固体多孔粒子的陶瓷基质具有分散在整个陶瓷基质的孔隙中或设置在陶瓷基质的孔隙中的生物分子的实施方式。这不用于包括其中生物分子附着或结合至粒子的外表面的情形。
通常，除了可能在相对极端条件下之外，生物分子在没有溶解陶瓷基质下通过浸析基本上从所述粒子是不可释放的。在该方面，如本文中使用的，提及生物分子“在没有溶解陶瓷基质下通过浸析基本上从所述粒子是不可释放的”用来在其范围内包括在提出的储存条件下浸析并使用粒状物质。优选地，所述官能团与生物分子相互作用以基本上防止浸析。
优选地，所述官能团均匀地分布在整个粒子中。
根据本发明的一个实施方式，带有官能团的陶瓷基质包括官能化的二氧化硅基质。然而，一系列金属氧化物包括混合金属氧化物可以是合适的，例如二氧化钛、氧化铝、氧化锆、氧化铁、二氧化铈、氧化锌等。所述官能团也可以通过有机二氧化钛或有机-氧化铝提供，或者通过将与另一种金属前体共缩聚以形成有机二氧化钛二氧化硅或有机-铝-二氧化硅的有机-硅烷提供。进一步的实施方式从以下涉及粒子制备的讨论将被理解。
陶瓷基质的官能团可以包括有效促进粒子渗入细胞的任何基团。例如，这可以包括氨基。在一个优选实施方式中，官能团包括氨基烷基烷基、伯烷氨基、仲烷氨基和叔烷氨基、烷基咪唑基、烷基酰胺基或烷基氨基酸基团、进一步的实施方式从以下涉及粒子制备的讨论将被理解。
本发明涉及一种包含生物分子的粒状物质。在此上下文中，术语“生物分子”可以指生物学起源或性质并且具有生物学活性的物质。该术语在其范围内包括包含一种或多种分子（包括不同分子的混合物）的物质。它的分子量可以为约1至约1000kDa以上，或约1至约100，1至50，1至20，1至10，5至1000，10至1000，100至1000，500至1000，5至100，5至50，5至20或10至20kDa，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000kDa。在一些情况下，它的分子可以低于1kDa或大于1000kDa。它的直径可以为约0.5-20nm，或约1至20，2至20，5至20，10至20，0.5至10，0.5至5，0.5至2，0.5至1，1至10，2至10，1至5，5至10或10至20nm，例如约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20nm。
生物分子可以根据讨论的具体应用进行选择。为了实现将生物分子保持在粒子之中和/或之上，它可以带负电。这可以使得生物分子能够结合至陶瓷基质上的官能团，例如结合至氨基官能陶瓷基质的质子化胺基团。替代地或另外地，生物分子可以具有使其能够结合至陶瓷基质的官能团的其他官能度。替代地或另外地，生物分子可以足够大（即，具有足够大的分子量或分子体积）以使其物理地被捕获在粒子中。它可以足够大使其不能通过粒子的孔隙。
在某些实施方式中，生物分子可以是核酸如RNA，例如siRNA(小干扰RNA)、miRNA(微小RNA)或核酶、ASODN(反义核苷酸或反义RNA)、DNA分子、适体、蛋白质包括多肽、肽、糖蛋白、脂蛋白、免疫球蛋白(例如抗体和抗体片段)、碳水化合物、脂质或这些中的任意两种以上的混合物或加合物。在一个特定实施方式中，生物分子是siRNA。生物分子可以指示用于预防性或治疗性治疗疾病、障碍或病症。
在一些实施方式中将表明处理剂结合至粒子的表面将是有利的。在一个优选实施方式中，聚乙二醇(PEG)链偶联至粒子的表面。替代地或另外地，定位基团(靶向基团，targetinggroup)可以偶联至粒子的表面以有利于在应用中将粒子靶向靶标，例如肿瘤或特定器官或其他靶标。在某些实施方式中，在其远端具有定位基团的PEG链可以偶联至粒子。
在某些实施方式中，可以优选粒状物质的粒子的平均粒度为约0.1至约1微米。然然，它们的平均粒度可以为约0.1至10微米，或约0.1至5，0.1至2，0.1至1，0.1至0.5，0.2至10，0.5至10，1至10，2至10，5至10，0.2至2，0.2至1，0.2至0.5，0.5至2或0.5至1微米，例如约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9或10微米。
在一些实施方式中，可以优选所述平均粒度小于约0.1微米。例如，它可以为约20至100nm(0.1微米)，或约20至50nm，或约50至100nm，例如约20、30、40、50、60、70、80或90nm。
注意的是，尺寸高于约1-2微米的粒子可能不适合细胞内递送。然而，认为它们可以可用于在身体内其他地方递送更大的蛋白质。在该方面，多达几微米的粒子可以被内化，尤其通过专化吞噬细胞。
粒子可以基本上是单分散的或者可以存在一些聚集以形成粒度分布曲线中的第二峰。分布曲线可以为正态、高斯或一些其它分布。粒子可以具有宽粒度分布或中度或窄粒度分布。粒子可以为球形或大致球形，或可以为卵形或扁球形或多面体(具有例如8至约60边)或可以为一些其它形状。它们的形状可以是不规则的。
粒子可以为中孔性的(即<100nm孔径)。它们可以为微孔性的(即<1.7nm孔径)。优选地，粒子的平均孔径为约1至约50nm。例如，平均孔径可以为约1至20,1至10,5至50,10至50,20至50,5至20,5至10或10至20nm,例如约1,2,3,4,5,10,15,20,25,30,35,40,45或50nm。
孔隙结构可以包括互连孔隙，或者可以包括通过相对较小互连通道结合的孔穴。孔径可以足够小以便通过从孔隙扩散而基本上防止生物分子释放。替代地，如果孔径使得生物分子可以逃逸，则生物分子可以通过吸引至孔隙表面上的官能团而被保留。官能团可以与促进粒子渗入细胞的那些官能团相同或不同。
粒子的生物分子的装载量为约1至约20%w/w，例如，约1至10,1至5,1至2,2至20,5至20,10至20,2至10,2至5或5至10%,例如约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20%，尽管在一些情况下，它可以低于1%或可以大于20%。
使用中，生物分子有利地通过在基本上不降解生物分子的条件下溶解粒子而可释放。例如，它可以通过基本上不降解生物分子的生物介质溶解粒子而可释放。它可以替代地在适当释放液体中稀释时可释放。
通常，生物分子在约0.5至约50小时时间内可释放(例如基本上完全可释放)。例如，约0.5至20,0.5至10,0.5至5,0.5至2,1至50,5至50,10至50,1至20,1至10,2至10或5至10小时,例如约0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45或50小时。由于溶解速率可能依赖于粒子的大小，所以此速率可以如在后面描述中讨论的通过调节粒子的大小而进行调节。
最有利地，当粒子暴露于降解剂例如酶时，生物分子在其从粒子释放之前被保护以免于降解，否则所述降解剂将能够降解该生物分子。即，生物分子通过陶瓷基质被保护免于降解。
在一些实施方式中，考虑了聚合物或络合剂可以与生物分子一起设置在粒子的孔隙中以促进内含体逃逸。通常该聚合物可以是聚乙烯胺、聚赖氨酸、或聚组氨酸或者提供质子海绵效应的任何物质。
微粒(>100nm)的形成
在一些实施方式中，可以有利地在微观级上形成粒子。即，用于此描述的目的，粒子的平均粒度大于100nm。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于制备包含设置在孔隙中的生物分子的粒子的方法，所述方法包括：
a)组合：
包含疏水液体、第一陶瓷前体和表面活性剂的疏水相；和
包含亲水液体、第二陶瓷前体和生物分子的亲水相，
以形成包含分散在疏水相中的亲水相的液滴的乳液；以及
b)当粒子在所述液滴内形成时搅拌该乳液；
其中第一陶瓷前体包含能够促进粒子渗入细胞的官能团。
如本文中使用的，术语“搅拌”在其范围内包括任何形式的搅拌，包括但不必限于搅动、振荡、涡旋、声处理、剪切等，以及这些的任意组合。
在制备粒子中，通过组合疏水相和亲水相而形成乳液。这可以是油包水(w/o)乳液，其中疏水相表示连续相而亲水相表示分散或不连续相。
疏水相可以是亲油相或亲脂相。疏水相可以通过组合表面活性剂和疏水液体并添加第一陶瓷前体以形成疏水相而制备，或者它可以通过组合所有三种组分而制备，或者它可以通过组合第一陶瓷前体和疏水液体或表面活性剂之一然后添加另一种而制备。这些步骤优选在组合疏水相和亲水相之前进行。每个组合步骤可以包括搅拌已经组合的组分。搅拌可以包括包括搅动、振荡、涡旋、声处理或这些的组合。对于这些组分它足以形成溶液。因此疏水相可以表示第一陶瓷前体和表面活性剂在疏水液体中的溶液。
疏水相包含3种组分：
疏水液体–这可以例如是植物油、石蜡油、矿物油或一些其它合适疏水液体。它可以包括疏水组分的混合物，例如植物油的混合物或植物油和石蜡油的混合物。它通常是中度粘度，例如约0.5至约1500mPa.s，或约0.5至1000,0.5至500,0.5至250,0.5至100,0.5至50,0.5至20,0.5至10,0.5至5,0.5至1,1至1500,10至1500,100至1500,250至1500,500至1500,1000至1500,10至1000,10至200,200至1000或200至500mPa.s，例如约0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45,50,60,70,80,90,100,150,200,250,300,350,400,450,500,600,700,800,900,1000,1100,1200,1300,1400或1500mPa.s，呼和在一些情况下，大于1500mPa.s。疏水液体的粘度可以被使用以控制通过该方法制造的粒子的粒度。因此更粘稠的疏水液体通常将提供更粘性的疏水相，这通常又将提供更小的粒度。
表面活性剂–这可以是用于支持油包水乳液的合适表面活性剂。它可以在疏水液体中可溶或与其混溶。它可以是非离子表面活性剂或者它可以是阴离子表面活性剂或者它可以是两性离子表面活性剂。它的HLB可以为约8至约16，或约8至12,10至16或8至10，例如约8,9,10,11,12,13,14,15或16。合适的表面活性剂包括(单月桂酸山梨醇酐酯)、(双(2-乙基己基)磺基琥珀酸钠)、混合物和 混合物。使用混合表面活性剂通常提供非常细的乳液，但最终粒度通常不变。
第一陶瓷前体–这个组分包括能够促进所得粒子渗入细胞的官能团。在某些实施方式中，第一陶瓷前体的官能团能够与生物分子化学地相互作用，例如静电地相互作用。
这个组分可以例如是氨基官能的。替代地，可以使用其他带正电荷基团或可以导致带正电荷的基团。它可以是每个分子具有至少一个胺基并且能够转化成氨基官能陶瓷基质的化合物。在疏水液体中或者在该疏水液体中的表面活性剂的混合物（可选地溶液）中，它可以是可溶的。
合适的陶瓷前体包括氨基官能硅烷，尤其是氨基官能烷氧基硅烷。这些硅烷的烷氧基可以例如是C1至C6烷氧基(如果C3以上，其可以是支化的)，通常C1至C4烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基或丁氧基。在一些情况下，可以使用其他可水解基团，例如酰氧基、酮肟基、烯醇氧基等。氨基官能陶瓷前体每个分子可以具有多于一个的胺基，例如2,3,4或5个胺基/分子。本发明的发明人已发现二氨基-和三氨基-陶瓷前体通常产生在结合合适生物分子方面比相应单氨基-陶瓷前体更有效的粒子。每个胺基可以独立地是伯、仲或叔的。在优选的前体中，氨基被连接基团分隔开，该连接基团通常是短亚烷基链如亚乙基(-CH2CH2-)、亚丙基(-CH2CH2CH2-)或亚丁基(-CH2CH2CH2CH2-)链。本发明的发明人认为亚丁基可以是特别有用的，因为这个基团出现在天然多胺多核苷酸配体如腐胺(N-4-N)、亚精胺(N-3-N-4-N)和精胺(N-3-N-4-N-3-N)中。涉及亚戊基和亚己基的各种组合也可以是有用的，然而生源构型极不相同的基团可能潜在地是有毒的。尤其是，本发明的发明人认为，亚乙基间隔物提供的胺基团之间的距离可接受地接近siRNA中的电荷间隔并且存在于可商购产品中，使得这种间隔物示于在生物分子是siRNA时使用。因此，合适的前体包括3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷、3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷、3-(2-氨基乙基氨基)丙基三乙氧基硅烷或3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三乙氧基硅烷及其任意两种以上的混合物。可以用作第一陶瓷前体的其他化合物包括脲丙基三烷氧基硅烷、异氰酸酯官能烷氧基硅烷、羧基官能烷氧基硅烷、巯基官能烷氧基硅烷(例如巯丙基三烷氧基硅烷)、阳离子肽或接枝到烷氧基硅烷的碳水化合物或脂质等。也可以使用这些中的任意两种以上的混合物，或任何其他合适第一陶瓷前体的混合物。
在一些情况下，第一陶瓷前体可以是混合物。它可以是硅烷陶瓷前体的混合物。它可以另外包含一种或多种非-硅烷陶瓷前体，例如氧化锆前体、氧化铝前体或二氧化钛前体。这些可以例如分别是烷醇锆、烷醇铝和烷醇钛。
通常表面活性剂对疏水液体的比率为约5至约25%w/v(即约5至约25g表面活性剂对100ml疏水液体)或约5至20,5至15,10至25,15至25或10至20%，例如约5,10,15,20或25%。
通常第一陶瓷前体对疏水液体的比率为约10至约1000ppm（基于v/v），或约10至500,10至200,10至100,10至50,20至1000,50至1000,100至1000,200至1000,500至1000,20至500,50至500,50至200,200至500或50至200ppm,例如约10,20,304,50,60,70,80,90,100,150,200,250,300,350,400,450,500,600,700,800,900或1000ppm。
亲水相可以是疏油相。它可以是含水相。亲水相包含三种组分：
亲水液体–这可以是疏脂的。它通常是含水的，例如，它可以是水，包括纯水，或水溶液。它还可以包含溶解盐。
第二陶瓷前体–这可以是水溶性硅酸盐，特别是偏硅酸盐。它可以是硅酸盐本身(例如通过水解四烷基硅酸盐如四甲基原硅酸盐或四乙基原硅酸盐)，或者可以是具有式RSi(OR’)xOHySiz的物质，其中x+y+z=3(在本文中称为烷基硅酸盐，例如通过水解烷基三烷氧基硅烷例如甲基三甲氧基硅烷或乙基三甲氧基硅烷产生)。在烷基硅酸盐的情况下，烷基R应足够小或者足够亲水以使第二陶瓷前体是水溶性的。应理解，这可以例如用小R基团如甲基或乙基，或者具有亲水或极性取代基如羟基、硝基、硫酸根等的较大R基团实现。
第二陶瓷前体可以例如是水玻璃。水玻璃是通常在水溶液中的具有经验式约Na2SiO3的低聚或聚合硅酸盐材料，具有变化的水合度。水玻璃的固含量可以为约1至约20%，或约1至10,1至5,1至2,2至20,5至20,10至20,2至10,2至5或5至10%,例如约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20%。这可以具有在水中的约25至约30%二氧化硅和约1至约20%氢氧化钠。它可以在水中以约1:2至约1:10的因子稀释，或约1:2至1:5,1:5至1:10或1:3至1:8，例如约1:2,1:3,1:4,1:5,1:6,1:7,1:8,1:9或1:10。
第二陶瓷前体也可以是烷醇钛(例如乙醇化物，正丙醇化物或异丙醇化物，正丁醇化物、仲丁醇化物和叔丁醇化物)或醇化铝或醇化锆或改性金属醇化物(例如用乙酰基丙酮或乙酸改性)。它还可以是混合金属醇化物。它还可以另一种金属盐如镁盐、锆盐和铝盐以形成硅酸镁、硅酸铝等。它可以是预先水解的烷氧基硅。
第二陶瓷前体可以包括陶瓷胶体，例如胶体二氧化硅。陶瓷胶体的粒径可以低于50nm，或低于约40,30,20或10nm，或为约5至约50nm或为约5至20,5至10,10至50,20至50或10至20nm。它的粒径(通常是平均粒径但可选地是最大粒径)可以为约5,10,15,20,25,30,35,40,45或50nm。
在一些情况下，第二陶瓷前体可以包括以上选项的两种以上的组合，例如它可以包括水硅酸盐与胶体二氧化硅的混合物。
生物分子–对于生物分子的各种选择如上所述。如注意到的，这可以带负荷或者可以为中性电荷。它可以带足够负电荷以被吸引至，可选地结合至粒子的官能团（衍生自第一陶瓷前体）。它可以是或者它可以包括RNA，例如siRNA(小干扰RNA)、miRNA(微小RNA)、ASODN(反义核苷酸或反义RNA)、适体、DNA、蛋白质、糖蛋白、多肽、碳水化合物或这些中的任意两种以上的混合物或加合物。
另外，可以添加聚合物或络合剂以使其与生物分子一起设置在粒子的孔隙内以促进内含体逃逸。通常该聚合物可以是聚乙烯胺、聚赖氨酸或聚组氨酸或提供质子海绵效应的任何物质。
亲水相可以是酸性的。它的pH可以抵御第一陶瓷前体的pKa(如果该陶瓷前体是碱，例如氨基官能陶瓷前体，则其共轭酸的pKa)。亲水相的pH可以低于约10.5，或低于约10,9,8,7,6,5.5,5,4.5或4，或为约3至10.5,5至10.5,7至10.5,9至10.5,7至10,9至4,7至4,9至7,5至7,3至6，或约3至5,3至4,4至6,4至5或3.5至4.5,例如约3,3.5,4,4.5,5,5.5或6。
通常在制备亲水相中，亲水液体和第二陶瓷前体组合，可选地第二陶瓷前体溶解在亲水液体中。所述方法可以随后包括将pH调节至低于第一陶瓷前体的pKa的pH，例如低于约10.5的pH，或调节至酸性pH，例如至低于约7、或低于约5、或低于约4的pH，以及添加生物分子以形成亲水相。例如，在第二陶瓷前体是水玻璃或胶体二氧化硅的情况下，这通常导致碱性溶液。因此所述方法大可以包括酸化这种溶液。
酸化可以通过将溶液暴露于阳离子交换树脂而方便实现，其中在所述暴露之前，树脂处于其酸（质子化）形式。暴露可以包括组合树脂和溶液，可选地搅拌所得混合物，然后将树脂与酸化溶液分离(例如通过过滤、倾析、离心等)，或者它可以包括使溶液通过树脂的床。树脂对第二陶瓷前体的比率可以为使得期望pH（如上所述）被实现。替代地，第二陶瓷前体可以通过加入酸化剂（例如酸）或加入合适缓冲液进行酸化。
通常生物分子在亲水相和疏水相组合之前不久添加到酸化溶液中。它可以在它们组合之前立即添加。它可以在它们组合之前少于约2分钟，或者在它们组合之前少于约1分钟，或少于约50,40,30,20,15或10秒添加。这减少了发生生物分子的不利化学反应的可能性。生物分子可以以足够量存在于亲水相中以实现最终粒子中的期望装载量。亲水相中生物分子的典型浓度为约1至约10mg/ml，或约1至5,5至10或2至8，例如约1,2,3,4,5,6,7,8,9或10mg/ml。生物分子可以溶液形式的添加到组合的亲水液体/第二陶瓷前体中。用于这种溶液的溶剂应与亲水液体混溶，并且通常与亲水液体相同。生物分子可以添加到水溶液中。
在形成乳液过程中，疏水相和亲水相组合，可选地在搅拌下。搅拌可以包括搅动、振荡、涡旋和声处理中的一种或多种。制备乳液的一种有效方式是制备如上所述的疏水相并在制备中使其同时搅动和声处理以添加亲水相。亲水相然后通过组合生物分子与该组合的第二陶瓷前体和亲水液体（例如酸化的水玻璃水溶液）制备，并且将所得亲水相尽可能快速地添加到该声处理、搅动的疏水相，同时维持声处理。声处理可以在添加后持续短时间，例如约10至约120秒，或约10至60,10至30,20至120,60至120,20至60或20至40秒，例如约10,20,30,40,50,60,90或120秒。声处理通常在适当时间后关闭以防止乳液过热。这样的过热例如可能不利地影响生物分子。声处理可以以约200至2000W，或约200至1000,200至500,500至2000,1000至2000,500至1000或600至800W,例如约200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1200,1400,1600,1800或2000W的功率进行。
疏水相对亲水相的比率可以为约10至约50(即约10:1至约50:1)，或约10至40,10至30,10至20,20至50,30至50,40至50,20至40或25至25,例如约10,15,20,25,30,35,40,45或50。
第一陶瓷前体对第二陶瓷前体的摩尔比为约0.2至约20mol%，或约0.5至20,1至20,2至20,5至20,10至20,0.2至10,0.2至5,0.2至2,0.2至1,1至10,1至5或5至10,例如约0.5,1,1.5,2,2.5,3,3.5,4,4.5,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20mol%可以是足够的。在第一陶瓷前体是或包括氨基官能硅烷的情况下，第一陶瓷前体对第二陶瓷前体的比率可以变化以改变粒子上的电荷。因此如果该量低(例如相对于第二陶瓷前体为约1mol%)，则粒子将大致为中性电荷，而如果该量更高(约10mol%)，则它们将带正电荷。如果没有添加(或极低量，例如低于约0.5mol%)氨基官能硅烷，则粒子可能带负电荷。
在如上所述制备的乳液中，亲水相的液滴的平均直径可以为约0.1至约10微米，或约0.1至5,0.1至2,0.1至1,0.1至0.5,0.2至10,0.5至10,1至10,2至10,5至10,0.2至2,0.2至1,0.2至0.5,0.5至2或0.5至1微米,例如约0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1,1.5,2,2.5,3,3.5,4,4.5,5,6,7,8,9或10微米。该平均值可以是数均直径或重均直径。液滴可以基本上是单分散的或者可以有一些聚集以形成分布曲线中的第二峰。液体可以具有宽粒度分布或中度或窄粒度分布。
认为粒子通过第一和第二陶瓷前体的相互作用形成在液滴内部。前体缩合形成粒子通常非常快速（几微秒至几秒）。所述相互作用可以是反应。它可以是缩合。它可以包括水解第一陶瓷前体。已经观察到，如果第一陶瓷前体是氨基官能的并且直接添加到亲水相中，则发生快速凝胶化使得适当尺寸化粒子的形成被阻止。
组合的亲水相和疏水相可以搅动或其他方式搅拌足够时间以形成粒子。这可能至少部分地取决于反应温度。粒子形成可以在任何合适温度下进行，例如室温，或约10至约35°C，或约10至30,10至25,10至20,15至35,20至35,25至35,15至30,15至20或20至25°C,例如约15,20,25,30或35°C。它可以在低于生物分子变性温度的温度下进行。粒子的形成可能花费约10至约120分钟，尽管如果期望，组合的相可以搅动或其他方式搅拌比这更长的时间。合适的时间为约10至100,10至60,10至30,20至120,30至120,60至120,30至90或45至75分钟，例如约10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100,105,110,115或120分钟。
一旦粒子已形成，它们可以被表面官能化。这可以原位实现，即不用分开或分离粒子。它可以包括在粒子形成之后向乳液中添加表面处理以表面处理粒子。表面官能化可以是PEG化(即向表面添加聚乙二醇链)。表面处理剂可以包括偶联至结合基团的聚乙二醇(PEG)链。PEG链的分子量可以为约1至约20kDa，或约1至10,1至5,1至2,2至20,5至20,10至20,2至10,2至5或5至10kDa,例如约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20kDa。结合基团可以是三烷氧基硅烷，即表面处理剂可以是三烷氧基甲硅烷基PEG。合适的烷氧基包括甲氧基、乙氧基或丙氧基。其他可水解甲硅烷基也可以使用，例如三乙酰氧基、三肟基、三烯醇氧基、三酰胺基等。粒子的表面可以通过使表面与具有官能团的PEG（或其他合适的分子）反应而官能化，该官能团与表面的OH反应或整合到粒子内部和表面处的氨基发生反应。例如，羧基官能PEG表面处理剂可以用来与粒子上的表面胺基团形成酰胺，或表面胺基团可以被活化（例如通过形成琥珀酰亚胺基或异硫氰酸酯基)，然后与氨基官能PEG表面处理剂反应。
PEG基团通常大(典型地>1KDa)使得它们不渗入球体内部而主要接枝到粒子的表面。一系列功能性PEG可商购获得，其适用于这种接枝，例如异硫氰酸酯-改性PEG和羧基-改性PEG，其在与粒子表面上的胺反应时将产生酰胺键。
随后的表面官能化，例如PEG化，以官能化粒子的表面，可以限于但足够在碱性条件中。在碱性条件中，第一陶瓷前体(例如氨基硅烷如氨基乙基氨基丙基三乙氧基硅烷)在一些情况下可以直接添加到第二陶瓷前体(例如水玻璃或胶体二氧化硅)。在一些情况下，亲水相的pH不低于第一陶瓷前体的pKa。在这样的情况下，初始形成的粒子悬浮液（在碱性条件下形成）可以随后被酸化。如果生物分子带负电荷，这可以用于促进生物分子附着至粒子。如果粒子随后进行表面处理，则酸化可以在随后的表面处理之前或期间进行以有利于PEG-硅烷附着。在粒子上不存在正电荷的情况下，生物分子的释放可以是非常快速的（几分钟数量级），除非它足够大而阻止其逃逸通过粒子的孔隙。
在一些情况下，表面处理剂可以包含用于靶向患者中的靶标的定位基团。例如，表面处理剂可以包含具有在PEG远端处的定位基团的三烷氧基甲硅烷基-PEG，即它可以具有结构三烷氧基甲硅烷基-PEG-定位基团。靶标可以例如是肿瘤或特定器官或一些其它靶标。定位基团可以例如是抗体或抗体片段(例如Fab)。合适定位基团的实例包括抗体、肽细胞因子、肽激素、基质蛋白质、细胞表面受体、细胞粘附中涉及的蛋白质、细胞识别中涉及的蛋白质、细胞运动性中涉及的蛋白质、细胞募集中涉及的蛋白质、细胞分化中涉及的蛋白质、疾病识别中涉及的蛋白质、生物活性碳水化合物如肝素和相关物质，生物活性糖蛋白包括但不限于落入以上所列类别中的那些，上述类别的任何成员的配体、上述类别的任何成员的片段、上述类别的任何成员的类似物、共享上述类别的任何成员的亲和性或功能的低分子量物质，其他低分子量生物分子如激素、营养物、药物、毒素、神经递质、内分泌递质、自分泌和旁分泌递质、颜料、脂质、油类、离子配体、代谢物、分解代谢物等。
表面处理剂可以直接添加至疏水相中的粒子的悬浮液中。反应可以在大约环境温度下进行，例如通过搅动适当时间以实现反应。合适时间为约8至约24小时，或约8至16,8至12,12至24,18至24或12至18小时,例如约8,12,16,20或24小时。可以使用足够的表面处理剂以实现适当水平的表面官能化，例如在使用中足以防止过多粒子聚集或足以提供粒子至靶标的可接受的靶向。
一旦粒子已形成，通常它们不被彻底干燥。这抑制粒子的聚集，如果发生聚集，则它将需要再悬浮，其在一些情况可能很难。通过粒子通过离心分离自溶液。合适的条件为约10000至约50000rpm,或约10000至30000,30000至50000或20000至30000rpm,例如约10000,20000,30000,40000或50000rpm。合适的分离通常在约5至15分钟内实现，尽管有时可以使用更长时间的离心。
所得粒子可以洗涤以除去杂质。洗涤过程可以涉及将粒子再悬浮在溶剂中，使粒子至少部分地与溶剂分离(例如通过沉淀和/或通过离心)并将溶剂从粒子滗析。重要的是，溶剂是不使生物分子变性的溶剂。这可以是对所使用的特定生物分子是特异的。例如，乙醇不影响DNA或RNA的结构，但可以使大多数大蛋白质变性。用于洗涤的合适溶剂包括烃类如己烷、环己烷、甲苯等，以及醇类如乙醇或异丙醇。粒子可以用相同溶剂或不同溶剂洗涤多次(例如2,3,4或5或更多次)。
所得粒子可以再悬浮在合适溶剂中并作为悬浮液储存在该溶剂用于以后使用。如果粒子要递送至患者，则这种溶剂可以是临床可接受的溶剂。用于储存的合适溶剂是遗传。通常粒子的储存温度为约-210至约+10°C，或约-210至0,-90至0,-210至-100,-210至-65,-90至-30,-30至0,-30至-10,-20至+10,-10至+10,0至10或0至5°C,例如约-210,-200,-180,-160,-140,-120,-100,-90,-80,-70,-60,-50,-40,-30,-25,-20,-15,-10,-5,0,1,2,3,4,5,6,7,8,9或10°C。它们可以储存在约液氮温度。它们可以储存在干冰温度。它们可以储存在冷冻机或冰箱中。
在上述段落中，提及乙醇，乙醇包括包含多达约30%水。因此乙醇可以是约70至约100%乙醇，剩余可以是水，或约80至100,90至100,70至90或80至90%，例如约70,80,90或100%乙醇。异丙醇、正丙醇或正丁醇也可以代替乙醇，对水含量具有类似限制。使用乙醇或丙醇的优点是它对用于递送至患者或对于其中无菌性是有益的其他应用提供无菌环境。在一些情况下，可以使用甲醇。
所述方法对于生物分子的包封效率(EE)优选高，因为生物分子通常昂贵。所述EE将取决于所述方法的精确性，包括例如第一陶瓷前体的类型和量、生物分子对所使用的陶瓷前体的比率等。通常所述方法将递送大约约40%，或大于约50,60,70或80%的EE。所述EE可以例如为约40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90或95%。
在一个特定实施方式中，提供了一种用于制备包含生物分子的粒子的方法，所述方法包括：
a)组合：
包含疏水液体、氨基烷烷基官能三烷氧基硅烷和HLB胃约8至约16的表面活性剂的疏水相；和
包含水、处于pH5的水玻璃和生物分子的亲水相，
以形成包含分散在疏水相中的亲水相的液滴的乳液；以及
b)当粒子从液滴形成时搅拌所述乳液。
在另一个特定实施方式中，提供了一种用于制备包含生物分子的方法，所述方法包括：
组合HLB为约8至约16的表面活性剂和疏水液体并添加氨基烷氨基官能三烷氧基硅烷以形成疏水相；
组合水和水玻璃，将pH调节至低于约5并添加生物分子以形成亲水相；
组合所述疏水相和亲水相以形成包含分散在所述疏水相中的亲水相的液滴；
当粒子从液滴形成时搅拌所述乳液；以及
在形成所述粒子后向所述乳液中添加表面处理剂以表面处理所述粒子。
在这个实施方式中，添加生物分子的步骤可以在组合疏水相和亲水相步骤之前马上(例如少于1分钟)进行。生物分子可以是RNA或DNA或之前描述的其他生物分子。它可以是siRNA。
在上述实施方式的变形中，可以使用其他pH范围代替低于约5。例如可以使用碱性条件如大于约8的pH。本发明的发明人认为范围为约5至约8的pH也是可用的。其他可能的变形包括使用胶体悬浮液如胶体二氧化硅代替水/水玻璃组合。这些变形可以适用于相对较大生物分子如蛋白质的包封。
纳米粒子(<100nm)的形成
在各种实施方式中，可以有利地在较小数量级，特别是尺寸小于100nm上形成粒子。考虑了这可以在一些情况下提供更有效的生物分子递送。
因此，本发明还提供一种用于制备包含设置在其孔隙内的生物分子的粒子的方法，所述方法包括：
a)组合：
包含疏水液体和表面活性剂的疏水相；和
包含亲水液体和催化剂的亲水相，
以形成包含分散在疏水相中的亲水相的液滴的乳液；
b)向乳液中添加陶瓷前体并水解该陶瓷前体；
c)将亲水相的pH调节至适用于生物分子的范围；
d)向乳液中添加生物分子和官能化陶瓷前体；以及
e)当粒子在液滴内部形成时搅拌乳液，
其中所述官能化陶瓷前体包含能够促进粒子渗入细胞的官能团。
关于制备微粒的许多上述特征和实施方式可以同样适用于本发明的这个方面。同样，这些特征和实施方式通过引用具体地结合于此以避免不必要的重复。在该方面，依照本发明这个方面描述的官能化陶瓷前体对应于上述第一陶瓷前体。依照本发明这个方面描述的陶瓷前体对应于上述第二陶瓷前体。
尽管并入上述特征实施方式，尤其是本发明的实施方式，官能化陶瓷前体的官能团能够与生物分子化学地相互作用例如静电地相互作用。例如，官能化陶瓷前体可以是氨基官能陶瓷前体，如氨基官能烷氧基硅烷。在某些实施方式中，氨基官能陶瓷前体包含氨基烷基烷基。例如，氨基官能陶瓷前体可以包含3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷、3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷、3-(2-氨基乙基氨基)丙基三乙氧基硅烷或3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三乙氧基硅烷、或这些中的任意两种以上的混合物。
表面活性剂的HLB同样可以为约8至约16。已发现利用壬基酚聚氧乙烯醚可以实现良好结果。疏水相可以另外包含辅助表面活性剂，如醇，例如1-戊醇。
在制备纳米粒子的情况下，认为粘度不是关键，因为形成微乳液（与正常乳液相反），其是热力学稳定的并且由极小(≈10nm)液滴构成。
在某些实施方式中，疏水液体包含烷烃(例如己烷(C6)至十二烷(C12))，环烷烃如环己烷，芳烃(例如甲苯，苯)和掺混物如煤油。
亲水相包含亲水液体和催化剂。例如，亲水液体可以包含水并且催化剂可以是酸。更通常地，用于水解烷氧基硅的典型催化剂可以是酸或碱，氟化物或其他金属醇化物例如醇化钛。
生物分子是如上所述的。例如，它可以带负电荷或足够大以使其不能通过粒子的孔隙。生物分子可以包括RNA、反义核苷酸和反义引物、适体、DNA、蛋白质、糖蛋白、多肽、碳水化合物或这些中的任意两种以上的混合物或加合物。在一个特定实施方式中，生物分子包括siRNA。
所述方法包括调节乳液的pH，例如通过在添加生物分子和官能化陶瓷前体之前添加碱如NaOH、KOH和NH4OH，以避免生物分子的变性。典型地水解在低pH（如2）下进行以确保对于水解反应的足够动力学同时抑制水解前体的缩合。在添加生物分子之前，优选将pH升至更大中性条件(即pH>4)。
同样，可以添加聚合物或络合剂以使其于生物分子一起设置在粒子孔隙内，以有利于内含体逃逸。典型地所述聚合物可以是聚乙烯胺、聚赖氨酸或聚组氨酸或提供质子海绵效应的任何物质。
与关于本发明的之前的方面一样，所述方法可以另外包括：
f)在形成离子后向乳液中添加表面处理剂以表面处理所述粒子。
表面处理剂可以包含偶联至结合基团的聚乙二醇链，所述结合基团能够将该聚乙二醇链结合至粒子的表面。例如，表面处理剂可以是PEG-硅烷，如三烷氧基甲硅烷基-PEG。
表面处理剂可以包含用于靶向患者中的靶标的定位基团。例如，表面处理剂可以包括包含在PEG距离三烷氧基硅烷基的远端处的定位基团。
本发明还提供在任意前述段落中描述的方法制备的粒子。
如以上注意的，生物分子可以指定用于预防或治疗性治疗疾病、障碍或病症。
因此，在本发明的一个方面，提供了一种药物组合物，其包含如本文所公开的粒状物质以及药用载体、稀释剂或赋形剂。
药用载体、稀释剂或赋形剂可以是可以在全身给药中安全使用的固体或液体填料、溶剂、稀释剂或包封物质。取决于具体的给药途径，可以使用本领域熟知的各种各样载体。这些载体可以选自包括以下的组：糖类、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽糖、明胶、滑石、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、褐藻酸、磷酸盐缓冲液、乳化剂、等张盐水和盐类如矿物酸盐包括盐酸盐、溴化物和硫酸盐，有机酸如乙酸盐、丙酸盐和丙二酸盐和无热原水。描述药用载体、稀释剂和赋形剂的有用文献是Remington’sPharmaceuticalSciences(MackPublishingCo.N.J.USA,1991)，通过引用将其结合于此。
剂型包括片剂、分散剂、混悬剂、注射剂、溶液、糖浆、糖锭、胶囊、栓剂、气溶胶、透皮贴剂等。这些剂型也可以包括特别设计用于此目的的注射或植入受控释放装置或者改变以另外地以此方式发挥作用的植入物的其他形式。
任何安全的给药途径可以采用用于给药本发明的粒状物质。例如可以采用经口、直肠、胃肠外、舌下、含服、静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹膜内、脑室内、经皮等。
在另一方面，提供了一种治疗哺乳动物的疾病、障碍或病症的方法，包括向所述哺乳动物给药如本文中公开的粒状物质或药物组合物，由此治疗所述疾病、障碍或病症的步骤。
在另一方面，提供了一种如本文公开的粒状物质，其用于治疗哺乳动物的疾病、障碍或病症。
所述疾病、障碍或病症可以是遗传疾病、障碍或病症(例如囊性纤维化或亨廷顿氏病)、退行性疾病、障碍或病症(例如老年性黄斑退化症)、癌症(例如实体瘤、肉瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、癌、黑素瘤，包括乳腺癌、宫颈癌、肺癌和前列腺癌，尽管不局限于此)，免疫系统的疾病、障碍或病症，包括自身免疫疾病(例如1型糖尿病、多发性硬化、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮)和炎性病症(例如哮喘、炎性肠病、肾小球肾炎)，由病原体如病毒感染引起的疾病、病症或障碍(例如丙肝、流感、呼吸道合胞体病毒感染、AIDS)，细菌(例如肺炎，细菌性脑膜炎，百日咳，肺结核，破伤风)，原生动物(例如疟疾)或真菌(例如念珠菌)，循环系统的疾病、障碍或病症(例如动脉粥样硬化，再狭窄，高胆固醇血症)，内分泌系统的疾病、障碍或病症(例如，II型糖尿病，骨质疏松症，胰腺炎)或神经性疾病、障碍或病症(例如阿尔茨海默病，帕金生病或癫痫)，尽管不局限于此。
哺乳动物可以是人或非人哺乳动物，包括表演动物(例如赛马)、家养宠物(例如狗，猫)和家畜(例如牛、马，羊，猪)，尽管不局限于此。优选地，哺乳动物是人。
附图说明
本发明的实施方式将通过仅实施例的方式，参考附图进行描述。应当理解，以下讨论不应视为以任何方式限制本发明。附图中：
图1是制备本发明的粒子的流程图；
图2示出了通过本发明方法制备的含有siRNA的粒子的TEM；
图3示出了粒子的粒度分布；
图4示出了本发明的粒子的其他TEM；
图5示出了举例说明粒子电荷和PEG化对荧光siDNA从粒子释放的作用的曲线图；
图6示出了举例说明对于粒子中的不同有效载荷的释放动力学的曲线图；
图7示出了从根据本发明制备的粒子释放的未包封siRNA（红色迹线）和siRNA的HPLC色谱图；
图8示出了本发明的粒子的悬浮液的照片；
图9示出了举例说明对于具有负电荷、中性电荷和正电荷的粒子，粒子渗入细胞的显微照片；
图10示出了举例说明负荷在具有负电荷、中性电荷和正电荷的粒子中的保持的显微照片；
图11和12示出了举例说明负荷利用粒子进入细胞的显微照片–图11示出了粒子而图12示出了负荷；
图13示出了作为时间函数的siDNA在HEPG2细胞中的分散；
图14示出了作为时间函数的siDNA在HeLa细胞中的分散；
图15示出了作为时间函数的siDNA在RAW264细胞中的分散；
图16示出了作为时间函数的siDNA在细胞中的分散；
图17示出了本发明的粒子对BJ成纤维细胞中的DPP4的活性的作用；
图18示出了用于包封寡核苷酸的原型方法的详细流程图；
图19示出了在纳米级上制备本发明的粒子的流程图；
图20示出了根据图19所示方法制备的粒子的FEG-SEM图像；
图21示出了用氟-DNA标记的粒子的相和荧光图像；和
图22示出了纳米粒子渗入HeLa细胞。
具体实施方式
描述了siRNA的封装和从改性二氧化硅粒子的受控释放。该粒子由具有并入以有助于载荷保持和细胞渗入的一定比例的氨基硅烷的无定形二氧化硅(SiO2)组成。粒子对于生物相容性进行表面改性(循环半衰期～4h)。所述粒子可以渗透哺乳动物细胞膜并且将它们的载荷释放到内含体和细胞内空间中。
图1示出了粒子的合成，包括封装siRNA(一种代表性生物分子，其表示所得粒子的载荷)。因此参考图1，通过组合30mL重石蜡油和4.5gSPAN-20(=500mM)制成疏水连续相。这些通过搅拌(30分钟)进行组合。然后将氨基硅烷(DATMS或TATMS,不是APTES)以足量加入用于期望电荷：对于负性粒子，没有添加，对于中性粒子，添加DATMS(1.5uL=1mol%，作为硅)并且对于正性粒子，添加DATMS(15uL=10mol%，硅)。然后所得混合物搅拌至少另外的10分钟但不超过60分钟。
然后通过组合4mL水玻璃和20mL水制备二氧化硅溶液。将足够的阳离子交换树脂在搅拌下加入到所得混合物以使pH至4.0。然后将二氧化硅溶液从树脂倾析到新容器中。
将疏水相(如上所述制备)设置成同时进行磁搅拌和声处理(3/8”探针)，并且启动搅拌器。在用于组合疏水相和亲水相的制备中，声处理器斜线升至70%功率(～700W)。
5mg载荷(250uL20mg/mLsiRNA溶液)与1.25mL如上所述制备的二氧化硅溶液混合。在10秒声处理之后，将二氧化硅/载荷混合物加入到声处理器有效区。声处理持续30秒然后停用声处理器。移出乳液并引入至磁搅拌器并搅拌1小时。在此之后，将PEG5000-硅烷(10mg)加入到混合物中并且所得粒子悬浮液搅拌过夜。
通过离心(15000xg达10分钟)从乳液收集粒子。然后将乳液用0.5体积环己烷稀释以减小其粘度，并用环己烷(约40mL)洗涤两次和用100%乙醇(约40mL)洗涤两次。每个洗涤步骤涉及再悬浮和收集粒子以及倾析上清。将粒子最后再悬浮在5mL的100%乙醇中以在-20°C或4°C储存。所述粒子可以在4°C储存几个月而无生物学活性的显著损失。然而，更低的温度储存提供甚至更长期的储存。
上述方法提供粒度范围为100-1000nm的粒子，具有的质量加权平均直径(d0.5)为约300nm。这些显示在图2和4。图3示出了粒子的粒度分布。在约1微米的肩部可能代表少量的聚集粒子。上述方法已被用于下述的研究，然而，该方法的更改可以生产d0.5<150nm的分散粒子。
通过改变加入的氨基硅烷的量和/或类型，制备的粒子具有不同电荷。DATMS(氨基乙基氨基丙基三甲氧基硅烷：2个氮原子/分子)用作标准。APTES(氨基丙基三甲氧基硅烷：1个氮原子/分子)显著更低效并且TATMS(氨基乙基氨基乙基氨基丙基三甲氧基硅烷：三个氮原子/分子)显示与DATMS类似的结果。
如上所述，氨基硅烷加入到疏水相然后通过亲水转移转移至亲水相。由于各相之间的分配，并入的氨基硅烷的量低于添加的量。发现将氨基硅烷直接加入到亲水相(即与水玻璃组合)在酸性pH下不实用，因为这引起提前凝胶化。
粒子的电荷在10mMMOPS(3-N-吗啉代丙烷磺酸缓冲液)中在pH7.0测量。粒子的ζ电势为如下：
天然的（负性的）(无氨基硅烷):ζ≤-30mV
中性的(1%DATMS):-5mv<ζ<5mV
正性(10%DATMS):ζ≥+10mV
尽管使用间接测量方法，但所测得的电荷在各批次之间完全可重复。
百分比封装效率(EE)通过比较siRNA的理论加载（从添加的量确定）与如通过所释放的量测得的实际加载进行确定。结果显示如下：
理论加载：5%
EE(从1mg/mL释放)
批次1:85%+/-5%
EE(从0.1mg/mL释放)
批次1:80%+/-2%
批次2:85%+/-10%
实际加载4.2%
理论加载:10%
EE75%,加载7.5%
因此引入的RNA的量越高，封装效率越低。
图5示出了荧光标记siDNA从不同电荷和表面改性的二氧化硅粒子的释放效果。如上所述，粒子电荷可以通过改变所使用的氨基硅烷的量控制。从带正电荷粒子的释放比从带负电荷的粒子的释放远远更慢，如同通过带正电荷粒子和带负电荷有效载荷之间的预期吸引所预测的。对于带负电荷的粒子，粒子表面上的PEG的存在看起来加速有效载荷的释放。
有效载荷从粒子的释放被认为主要通过溶解粒子基质。在含水介质中的高浓度(≥约1mg/mL粒子)下，载荷从粒子的浸出受限于通过粒子溶解介导的浸出，即所述溶液可以在粒子基质中达到饱和，由此限制有效载荷的释放。这显示在图6中，其中发生活性(圆点值)和杂混(方形点值)siRNA分子的相对快速释放，直至由二氧化硅基质溶解度指示的极限。应注意，这在图5中不明显，因为粒子的浓度不同。在显著低于二氧化硅溶解限度(大约100μg/mL)的浓度下，或在其中释放液体连续更新的情况下，在约12-24小时内发射粒子的完全溶解。如上所述制备的粒子在96%乙醇中在253K下储存36天。在储存后，所述粒子完全溶解在无RNA酶水中。所得液体在HPLC上的洗脱显示与缓冲溶液中的未包封siRNA非常相似的外形，表明封装和释放不显著影响siRNA。
图7示出了未包封siRNA和从根据本发明制备的粒子释放的siRNA的HPLC谱图。两种粒子和参照(未包封siRNA)用RNA酶A处理15分钟，然后在含有RNA酶抑制剂的PBS中悬浮之前用PBS洗涤三次。从二氧化硅粒子释放的材料显示完整RNA。未包封siRNA的类似消化导致完成破坏。这些实验证实粒子保护包封生物分子免于酶降解的能力。
图8示出了相对于PBS（左）或相对于在PBS中的50%鼠血清(右)以3mg/L悬浮的离子的照片。在过夜温育后，没有出现可见的聚集。粒子还以1、3、10mg/kg悬浮在1500ppmBSA中，然后温育2小时。然后通过Mastersizer(Miescattering)确定粒度，表明在尺寸分布上没有时间或浓度介导的移位。
总之，4%的载荷加载可常规地实现，并且8%的加载已得到证实。>80%的包封效率可常规地实现。生物分子在粒子中的保持看起来主要通过静电力介导，在生理pH产生溶解首先的释放特性(即释放主要通过基质溶解发生)。载荷保持特性已证实在96%EtOH中在-20°C储存40天后未改变。
摄入哺乳动物细胞
考察了粒子电荷对细胞渗入和载荷保持的影响，以及摄入细胞中和内含体逃逸的时间过程。
合成用RITC（若丹明异硫氰酸酯）共价标记的且载有具有siRNA-类型序列并且用FITC（荧光异硫氰酸酯）标记的DNA的粒子。将细胞(NIH3T3,HeLa,HEPG2)培养至50%汇合并将如上所述的粒子(约30μg/ml，相当于100nMDNA)直接加入到培养基中。在40h后，将培养物用PBS(磷酸盐缓冲盐水)洗涤以除去粒子（其已渗入到细胞中），然后通过表面荧光显微镜成像。
图9示出了监测RITC标记的结果：在每对图像中，上图是相位对比图像而下图是荧光图像。图9表明，随着粒子上的正电荷增加，更多的粒子被细胞吸收。因此，粒子上的正电荷不仅有助于结合有效载荷而且有助于粒子摄入细胞中。图10显示，相比于中性或带负电荷粒子，载荷更有效地保持在带正电荷粒子中，因为它们被细胞吸收。此图显示通过电荷的siDNA保持。在每对图像中，上图像是相位对比图像而下图是siDNA荧光图像。
图11示出了粒子摄入到两种不同细胞系中(即粒子分布)，并且图12示出了相同样品但具有突出显示的标记有效载荷(即载荷分布)的显微照片。在这些图二者的每对图像中，上图是相位对比图像。在图11中，在每对图中，下图是RITC荧光(红色通道)图像，并且在图12中，在每对图中，下图是siDNA的荧光图像(绿色通道)。通过比较这两个图，可以确定当粒子渗入细胞中时siRNA保持在粒子中。细胞内的绿色和红色点的并置表示二氧化硅已渗入内部(红色通道点=二氧化硅粒子)同时保持器荧光DNA载荷(绿色通道点=DNA)，由此证实DNA已成功地被转染到细胞内。图13至15显示将标记siDNA借助于本发明的粒子引入到各种细胞系的时间过程(图13:HEPG2;图14:HeLa;图15:RAW264)。各个图显示在细胞中的每次后处理的荧光分布。在每种情况下，可以看到，在较短时间期下，siDNA主要位于小区域中，表示位于细胞中的粒子内的定位。在较长时间期下，siDNA扩展到更大区域中，表示粒子通过溶解粒子基质的释放和通过细胞的分布。
图16示出了使用共焦显微镜的类似实验。在图16中，每对的上图示出了核染色(蓝色通道)并且下图示出了siDNA荧光(绿色通道)。因此，将HeLa细胞以25%汇合铺放到聚-赖氨酸涂覆的盖片上。这些用载有FAM-DNA的RITC改性粒子处理24或48h。然后它们用PBS洗涤并用在PBS中的3.7%甲醛固定。然后它们用在等张盐水中的1.2μg/mLHoescht33342染色，安装到具有Gelmount和丙烯酸类(acrylic)的载玻片上，并用共焦显微镜在100x放大率下成像。图像为150x150μm，z-轴片段深度350nm。良好定义的大致圆形结构代表核DNA。在24小时后，有大量小亮区域，代表位于粒子内的有效载荷。少量的扩散发光代表少量释放的有效载荷。在48小时后，点光源很大程度地小时，代表粒子溶解。相反，每个细胞具有亮区域的扩散卤素，代表细胞内的释放有效载荷。
基因敲除研究
图17示出了用来显示敲除中存在的加载粒子的效力(即基因表达的抑制)。此实验着眼于人BJ成纤维细胞中的DPP4的有效性敲除。siRNA单独是有效的，可能因为通过系统中存在的RNA酶失活导致。不出意料地，未加载的二氧化硅粒子也是无效的。测量标记的siRNA/Lipo是指借助于转染的siRNA，已知用来跨越细胞膜转染寡核苷酸。这种系统具有的缺点是，它有毒并且对于siRNA不提供来自酶攻击的保护。测量标记的siRNA/nano表示封装在根据本发明的粒子中的siRNA。在其中存在siRNA的每种情况下，它以约200nM使用。结果表明，封装的siRNA在此浓度下的敲除有效，并且事实上比具有阳离子脂质体(Lipofectamine)的siRNA稍微更有效。
体外结论
·将生物分子封装到根据本发明的粒子中可以保护该生物分子免于酶降解。
·当在正常培养条件下应用于细胞时，加载有生物分子的粒子能够渗透胞质膜并将其载荷递送至细胞内空间。
·生物分子经由本发明粒子递送组织培养细胞导致这些细胞中的mRNA水平的剂量依赖性降低。
·封装在粒子中的siRNA的剂量足以导致mRNA水平>50%降低表明在体外无显著毒性。
另外的结果-粒子的合成
通常合成方法通过图18中的流程图描述。在将含水前体添加到表面活性剂溶液中后粒子形成极快。然而，通常在乳液形成和粒子收集之间允许至少12小时。
寡核苷酸的保持受载荷和粒子的氨基硅烷组分之间的静电相互作用强烈影响。这形成取代的量和类型，以及在决定封装、保持和释放特性方面的形成和释放关键因素的pH。
参数
此实施例中使用的表面活性剂是山梨糖醇酐单月桂酸酯使用的表面活性剂浓度为约17质量%。疏水相为重液体石蜡，这获得所测试的那些中的最小粒子。通过磁搅拌和声处理的组合，粒度减小至对于静脉内注射可接受的值。
用来增强载荷保持的优选氨基硅烷是DATMS(氨基乙基氨基丙基三甲氧基硅烷)。用APTES(氨基丙基三乙氧基硅烷)和TATMS(氨基乙基氨基乙基氨基丙基三甲氧基硅烷)的实验表明，它们在或大或小程度上也具有此效果，并且可以用于精细调节保持/释放特性。预期载荷加载影响粒子ζ电势，并且预期氨基硅烷改性影响最大加载。
对于水玻璃的最小稳定性的pH为大约5.5，其表示对于RNA的最大稳定性的pH。如果硅酸盐溶液太接近中性，则所述前体在它可以用于粒子粒子合成之前自发地凝胶化。如果所述溶液太酸性，则将发生核苷酸载荷的显著降解。在RNA载荷下，已证实如果有点难处理，则3.75-4.00的前体pH是合适的。DNA、LNA或其他修饰的寡核苷酸可以允许更大酸性(并因此更稳定的)前体溶液。
实施例–图18
将siRNA封装入用DATMS、罗丹明和mPEG-5000改性的粒子：
15g的Dowex50W用100mL5MHCl搅拌30分钟以将该树脂转化为活性、质子化形式。然后通过真空辅助过滤到烧结玻璃过滤漏斗中进行回收，其中它用100mLmilliQ水洗涤两次以除去残留HCl。
9克称入到聚四氟乙烯烧杯中并加入60mL液体石蜡。所得混合物搅拌约30分钟以完成在石蜡中的溶解。将在2-丙酮中的29μLDATMS液体和6μL10%罗丹明-APTES加入到搅拌的表面活性剂溶液中。
4.0mL硅酸钠溶液加入到28mLmilliQ水中。留下8.0mL此溶液用于后续主要体积的滴定。
使用pH探针连续地监测溶液pH，添加活化的阳离子交换树脂以将硅酸盐混合物的pH降低至约3.5。将硅酸盐溶液从树脂倾析并再检测pH。
将2.5mL的此前体溶液转移至5mL塑料试管。适当体积的(<0.5mL)的载荷RNA溶液转移至1.5mL试管。
将载荷RNA溶液移液到硅酸盐前体中。将RNA/硅酸盐混合物移液到表面活性剂溶液中并持续声处理搅拌25秒。
所得乳液快速搅拌15分钟。然后将15mgmPEG-5000硅烷粉末加入到该乳液中并将所得混合物搅拌过夜。
然后将混合物在>2000xg离心5分钟以分离粒子。然后粒子用环己烷洗涤两次以除去石蜡和表面活性剂，在每次洗涤后离心，然后用乙醇洗涤一次。通过离心收集粒子，上清倾析，并且将粒子再悬浮在10mL乙醇中。
获得的产物的典型重量为200mg。典型封装效率为>80%。粒子在pH7.4的典型ζ为+20mV。当相比于天然硅酸盐粒子时，结合于粒子的蛋白质的典型减少(PEG化密度的量度)为>90%。
实施例–图19
A.用于生物分子封装的粒子的微乳液合成
将0.381g的NP9通过在玻璃瓶中搅拌(磁力)溶解在3mL的环己烷(0.2mol/L)中，并在持续搅拌下随后加入0.065mL的1-戊醇作为辅助表面活性剂(0.2mol/L)。所得溶液构成疏水相。
加入0.013mL的0.01MHNO3以充当酸催化剂，构成亲水相，并该溶液搅拌20分钟以进行均化。这导致形成微乳液。
加入0.018mL的四甲基原硅酸酯(TMOS)并将所得溶液搅拌66小时以水解TMOS并提供水解后的前体溶液。
加入0.013mL的0.01MNaOH并搅拌5分钟以将pH调节至大于约4。
通过在搅拌下加入0.010mL的水来模拟生物分子的加入。作为官能化陶瓷前体，加入0.003mL的3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷并将该混合物搅拌6.5小时，在该时间内溶液变得逐渐更浑浊。这提供纳米粒子的悬浮液。
加入5mg的mPEG-硅烷(MW=5000)并将该溶液保持搅拌15小时。然后将该溶液离心(13,000达1分钟)以分离粒子，然后该粒子用2mL乙醇洗涤三次，并悬浮在2mL乙醇中。
所述粒子通过FEG-SEM成像，其表明尺寸范围为30–100nm。参考图20。
B.用于生物分子封装的粒子的微乳液合成
将0.636g的NP9通过在玻璃瓶中搅拌（磁力）溶解在5mL的环己烷(0.2mol/L)中。在持续搅拌下加入0.109mL的1-戊醇作为辅助表面活性剂(0.2mol/L)。将1.14mL的环己烷/NP9/1-戊醇溶液移液到第二玻璃瓶(x2)中。
将0.011mL的0.01MHNO3加入到上述子样品中并将溶液搅拌40分钟以进行均化，形成微乳液。
将0.0125mL(0.08mMol)的四甲基原硅酸酯加入到子样品中并将所得溶液搅拌17.5小时以水解TMOS。将0.011mL的0.01MNaOH加入到该两个样品中，然后将它们搅拌5分钟以将pH调节至大于约4。
在搅拌下降0.006mL的氟-DNA溶液(FITC-标记的DPP4(21个碱基对))，在水中为0.5mg/mL在搅拌下加入到一个样品中，并将0.006mL的水在搅拌下加入到第二样品中。
将0.002mL(0.009mMol)的3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷作为官能化陶瓷前体加入到每个样品中并将混合物搅拌6小时。
将0.8mg的mPEG-硅烷(MW=5000)加入到每个样品中，然后将样品保持搅拌18小时。将1mL的丙酮加入到每个样品中并且溶液搅拌10分钟。
然后将溶液离心(13,000达1分钟)以分离粒子，该粒子然后用2mL乙醇洗涤三次。将含氟-DNA的样品(CS11-0028)悬浮在2mL乙醇中。仅适用水支制成的样品(CS11-0029)在40°C干燥并称重为7.3mg。
将几滴用氟-DNA标记的粒子在显微镜用载玻片上干燥并使用装配有FITC过滤器荧光显微镜在40x放大率和4次二次曝光下进行成像。参考图21。
图22示出了培养的人肝细胞用AlexaFluor-633标记的二氧化硅纳米粒子的转染。细胞在成像前处理24小时。
其他实施例
合成用FITC（异硫氰酸荧光素）共价标记并载有藻红蛋白(Phycoerythrin)有效载荷的粒子。将HeLa细胞培养至50%汇合并且如上所述的粒子(约30μg/ml)直接加入到培养基中。在40h之后，培养物用PBS（磷酸盐缓冲盐水）洗涤一次以除去没有深入细胞中的粒子，然后通过表面荧光显微镜成像，从而监测所递送的藻红蛋白的细胞内释放。
除非上下文另有要求或具体地相反说明，作为单数的整数、步骤和构件在本文中陈述的整数、步骤或构件明确地涵盖所陈述整数、步骤或构件的单数和复数形式。
在本说明书通篇中，除非上下文另有要求，术语“包括”或变形“包含”或“含有”应被理解为暗示包括所陈述的步骤或构件或整数，或者步骤或构件或整数的组，但不排除任何其他步骤或构件或整数或步骤、构件或整数的组。因此，在本说明书的上下文中，术语“包括”以包含含义使用并应理解为是指“主要包括但不必是单独地”。
应理解，前面的描述通过本发明的举例说明性实施例给出并且其对于本领域技术人员明显的更改和变形被视为落入本文提出的发明的宽范围和界限内。

Claims (63)

1.一种粒状物质，包含：
带有氨基官能团的官能化的二氧化硅基质的粒子，所述氨基官能团能够促进所述粒子渗入细胞中并且均匀地分布在整个所述粒子中；和
设置在所述粒子的孔隙内的具有亲水性的生物分子，所述生物分子通过溶解所述官能化的二氧化硅基质从所述粒子是可释放的。
2.根据权利要求1所述的粒状物质，其中在没有溶解所述二氧化硅基质下，所述生物分子通过浸出从所述粒子是不可释放的。
3.根据权利要求2所述的粒状物质，其中所述氨基官能团与所述生物分子化学相互作用以防止浸出。
4.根据权利要求1所述的粒状物质，其中所述二氧化硅基质的官能团包括氨基烷基氨基团。
5.根据权利要求1所述的粒状物质，其中所述生物分子为RNA、反义核苷酸、反义引物、适体、DNA、蛋白质、糖蛋白、多肽、碳水化合物或这些中的任意两种以上的混合物或加合物。
6.根据权利要求1所述的粒状物质，其中聚乙二醇链偶联于所述粒子的表面。
7.根据权利要求1所述的粒状物质，其中定位基团偶联于所述粒子的表面。
8.根据权利要求1所述的粒状物质，其中所述粒子的平均粒度为0.1至10微米。
9.根据权利要求1所述的粒状物质，其中所述粒子的平均粒度为20至100nm。
10.根据权利要求1所述的粒状物质，其中所述粒子的孔径为1至50nm。
11.根据权利要求1所述的粒状物质，其中所述粒子的生物分子的加载为1至20％w/w。
12.根据权利要求1所述的粒状物质，其中聚合物或络合剂与所述生物分子一起设置在所述粒子的孔隙中。
13.根据权利要求12所述的粒状物质，其中所述聚合物是聚乙烯胺、聚赖氨酸或聚组氨酸。
14.根据权利要求12所述的粒状物质，其中所述聚合物是提供质子海绵效应的物质。
15.一种用于制备粒子的方法，所述粒子在其孔隙中设置有生物分子，所述方法包括：
a)组合：
包含疏水液体、氨基烷基氨基官能化的陶瓷前体和表面活性剂的疏水相；和
包含亲水液体、第二陶瓷前体和所述生物分子的亲水相，
以形成包含分散在所述疏水相中的所述亲水相的液滴的乳液；和
b)随着所述粒子在所述液滴内形成时搅拌所述乳液；
其中所述氨基烷基氨基官能化的陶瓷前体的氨基烷基氨基团能够促进所述粒子渗入细胞中。
16.根据权利要求15所述的方法，包括以下步骤：
组合所述表面活性剂与所述疏水液体；和
添加所述氨基烷基氨基官能化的陶瓷前体，
以形成所述疏水相，所述这些步骤在步骤a)之前进行。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述氨基烷基氨基官能陶瓷前体的氨基烷基氨基官能团能够与所述生物分子发生化学相互作用。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述氨基烷基氨基官能化的陶瓷前体的氨基烷基氨基官能团能够与所述生物分子发生静电相互作用。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述氨基烷基氨基官能化的陶瓷前体是3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷、3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷、3-(2-氨基乙基氨基)丙基三乙氧基硅烷或3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三乙氧基硅烷，或者这些中的任意两种以上的混合物。
20.根据权利要求15所述的方法，其中所述表面活性剂的HLB为8至16。
21.根据权利要求15所述的方法，其中所述疏水液体的粘度为0.5至15000mPa.s。
22.根据权利要求15至21中任一项所述的方法，其中所述疏水液体是石蜡油、植物油或矿物油。
23.根据权利要求15所述的方法，其中所述氨基烷基氨基官能化的陶瓷前体是碱并且所述亲水相的pH低于所述氨基烷基氨基官能化的陶瓷前体的pKa。
24.根据权利要求23所述的方法，包括以下步骤：
组合所述亲水液体和所述第二陶瓷前体；
将所述pH调节至低于所述氨基烷基氨基官能化的陶瓷前体的pKa；和
添加所述生物分子，
以形成所述亲水相，所述这些步骤在步骤a)之前进行。
25.根据权利要求24所述的方法，其中调节所述pH的步骤包括将所述第二陶瓷前体在所述亲水液体中的溶液暴露于阳离子交换树脂，接着一旦所述溶液的pH已达到低于所述氨基烷基氨基官能化的陶瓷前体的pKa的期望pH时将所述溶液与所述树脂分离。
26.根据权利要求15所述的方法，其中所述亲水液体是水性的。
27.根据权利要求15所述的方法，其中所述第二陶瓷前体是水玻璃或胶体二氧化硅或者预先水解的烷氧基硅。
28.根据权利要求15至27中任一项所述的方法，其中所述生物分子带负电或足够大以至它不能通过所述粒子的孔隙。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述生物分子是RNA、反义核苷酸、和反义引物、适体、DNA、蛋白质、糖蛋白、多肽、碳水化合物或这些中的任意两种以上的混合物或加合物。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述生物分子是siRNA。
31.根据权利要求15至30中任一项所述的方法，另外包括：
c)在形成所述粒子后向所述乳液中添加表面处理剂以对所述粒子进行表面处理。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述表面处理剂包括偶联至结合基团的聚乙二醇链，所述结合基团能够将所述聚乙二醇链结合至所述粒子的表面。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述表面处理剂是PEG-硅烷。
34.根据权利要求31所述的方法，其中所述表面处理剂包含用于靶向患者中的靶标的定位基团。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述表面处理剂包括包含在PEG距离三烷氧基硅烷基的远端处的定位基团的三烷氧基甲硅烷基-PEG。
36.根据权利要求15所述的方法，其中添加聚合物或络合剂以使其与生物分子设置在所述粒子的孔隙内。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述聚合物是聚乙烯胺、聚赖氨酸、或聚组氨酸。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述聚合物是提供质子海绵效应的物质。
39.一种用于制备包含设置在孔隙中的生物分子的粒子的方法，所述方法包括：
a)组合：
包含疏水液体和表面活性剂的疏水相；和
包含亲水液体和催化剂的亲水相，
以形成包含分散在所述疏水相中的所述亲水相的液滴的乳液；
b)向所述乳液中添加陶瓷前体并水解所述陶瓷前体；
c)将所述亲水相的pH调节至适合所述生物分子的范围；
d)将所述生物分子和一个氨基烷基氨基官能化的陶瓷前体添加到所述乳液中；和
e)在所述粒子在所述液滴内形成时搅拌所述乳液，
其中所述氨基烷基氨基官能化的陶瓷前体的氨基烷基氨基基团能够促进所述粒子渗入细胞。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述氨基烷基氨基官能化的陶瓷前体的所述氨基烷基氨基团能够与所述生物分子发生化学相互作用。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述氨基烷基氨基官能化的陶瓷前体的所述氨基烷基氨基团能够与所述生物分子发生静电相互作用。
42.根据权利要求39所述的方法，其中所述氨基烷基氨基官能化的陶瓷前体是3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷、3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷、3-(2-氨基乙基氨基)丙基三乙氧基硅烷或3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三乙氧基硅烷，或者这些中的任意两种以上的混合物。
43.根据权利要求39所述的方法，其中所述表面活性剂的HLB为8至16。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述表面活性剂是壬基酚聚氧乙烯醚。
45.根据权利要求39所述的方法，其中所述疏水相另外包含辅助表面活性剂。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述辅助表面活性剂是醇。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述醇是1-戊醇。
48.根据权利要求39所述的方法，其中所述疏水液体包含烷烃选自己烷(C6)至十二烷(C12)，环己烷，一种芳烃选自甲苯和苯，以及煤油。
49.根据权利要求39所述的方法，其中所述亲水液体是水并且所述催化剂是酸。
50.根据权利要求39所述的方法，其中所述生物分子带负电或者足够大使得它不能通过所述粒子的孔隙。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述生物分子是RNA、反义核苷酸、和反义引物、适体、DNA、蛋白质、糖蛋白、多肽、碳水化合物或这些中的任意两种以上的混合物或加合物。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述生物分子是siRNA。
53.根据权利要求39所述的方法，包括在添加所述生物分子和所述氨基烷基氨基官能化的陶瓷前体之前，将所述乳液的pH调节至大于4。
54.根据权利要求39所述的方法，另外包括：
f)在形成所述粒子后向所述乳液中加入表面处理剂以对所述粒子进行表面处理。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述表面处理剂包含偶联至结合基团的聚乙二醇链，所述结合基团能够将所述聚乙二醇链结合至所述粒子的表面。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述表面处理剂所述PEG-硅烷。
57.根据权利要求54所述的方法，其中所述表面处理剂包含用于靶向患者中的靶标的定位基团。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述表面处理剂包括包含PEG距离三烷氧基硅烷基的远端处的所述定位基团。
59.根据权利要求39所述的方法，其中添加聚合物或络合剂以使其与所述生物分子一起设置在所述粒子的孔隙内。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述聚合物是聚乙烯胺、聚赖氨酸或聚组氨酸。
61.根据权利要求59所述的方法，其中所述聚合物是提供质子海绵效应的物质。
62.一种药物组合物，包含根据权利要求1至14中任一项的粒状物质，以及稀释剂。
63.根据权利要求1至14中任一项的粒状物质，用于治疗哺乳动物的疾病、障碍或病症。
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