PARTÍCULAS SOLIDAS PROVENIENTES DE LA DESESTABILIZACION CONTROLADA DE MICROEMULSIONES
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un proceso para la desestabilización controlada de microemulsiones para formar partículas sólidas. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La distribución controlada de fármacos, por ejemplo para el tratamiento de tumores ha sido lograda mediante diversos métodos. Un método es encapsular un fármaco dentro de una partícula sólida, la cual puede ser distribuida hacia el sitio de acción, tal como el tumor, y allí liberar el fármaco a una velocidad controlada. Con el fin de ser efectivas, tales partículas deben ser de un tamaño apropiado para descargarse de un sitio tumoral. Las partículas que están por arriba de aproximadamente 300 nm de diámetro comúnmente serán atrapadas por los pulmones, el hígado, el bazo y otros órganos, y de este modo no se descargarán preferentemente en el sitio de acción. Las partículas que están de aproximadamente 50 nm de diámetro son capaces de penetrar a través de las paredes de los vasos sanguíneos, y son por lo tanto distribuidos a todo lo largo del cuerpo. De este modo, para esta aplicación, es deseable tener una partícula de aproximadamente 50 a 300 nm REF. : 182328
de diámetro. Con el fin de tener una velocidad de liberación apropiada de un fármaco encapsulado, las partículas deben tener poros nanoescalares . El tamaño de los poros gobierna la velocidad de liberación. Con el fin de elaborar una velocidad de liberación apropiada, los poros deben estar por debajo de aproximadamente 2 nm, y preferentemente deben ser de aproximadamente de 1.5 nanómetro de diámetro. Un requerimiento adicional es que las condiciones de fabricación de las partículas cargadas con fármaco debe ser tal que éstas no degraden significativamente el fármaco. Comúnmente los fármacos anticancerosos por ejemplo, la doxorrubicina, son inestables en solución básica, y así pues es preferible que cualesquiera partículas sean producidas bajo condiciones neutras o acidas. Las nanopartículas de sílice poseen diversas ventajas intrínsecas como portadores de fármacos para aplicaciones in vivo . En particular, éstas son biológicamente inertes, intrínsecamente hidrofílicas (lo cual reduce su detección por el sistema reticuloendotelial ) y proporcionan una vida en anaquel prolongada a su carga. Además, se ha establecido que las partículas esféricas en el intervalo de diámetro de 50-250 nanómetros que poseen las propiedades fisicoquímicas apropiadas pueden ser selectivamente distribuidas en masas tumorales a partir de la circulación general en un periodo de uno a dos días después
de la inyección intravenosa. Las nanopartículas de sílice pueden también ser utilizadas para la liberación de otras sustancias por ejemplo, catalizadores, enzimas, etc. La preparación de las nanopartículas de sílice utilizando la química de sol-gel catalizada por base en microemulsiones, ha sido extensamente investigada. No obstante, ésta química de catálisis por base posee dos desventajas para el encapsulamiento de especies bioactivas: • muchos fármacos (por ejemplo, la doxorrubicina) se descomponen/desnaturalizan bajo condiciones básicas; la catálisis básica o alcalina produce partículas mesoporosas que liberan sus contenidos demasiado rápidamente para cualquier uso práctico. En contraste, la catálisis produce partículas microporosas, las cuales muestran liberación mucho más lenta de las especies encapsuladas . No obstante, debido a los mecanismos intrínsecos de la emulsión de las partículas en el ambiente ácido, el tamaño de las partículas de sílice formadas por la catálisis acida es ya sea menor de 30 nanómetros o mayor de un micrómetro. Existe por lo tanto una necesidad para un método para producir partículas en el intervalo de 50-500 nm con características de liberación sostenida. Las partículas pueden tener un tamaño de partícula apropiada (entre
aproximadamente 30 nm y 1 µm, opcionalmente entre aproximadamente 50 y 250 nm, de diámetro) y un tamaño de poro (por ejemplo, microporoso) para la dirección pasiva hacia los tumores y pueden ser elaboradas bajo condiciones que no degradan un fármaco encapsulado en las partículas. OBJETIVO DE LA INVENCIÓN Un objetivo de la presente invención es superar o mejorar sustancialmente al menos una de las desventajas anteriores. Un objetivo adicional es al menos satisfacer parcialmente la necesidad anterior. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto de la invención, se proporciona un proceso para elaborar una sustancia particulada que comprende: - la provisión de una emulsión que comprende gotitas dispersas en una fase líquida continua, en donde al menos algunas de las gotitas comprenden núcleos; y desestabilizar al menos parcialmente las gotitas para formar la sustancia particulada, la sustancia particulada comprende una pluralidad de partículas. La sustancia particulada puede ser seleccionada por los núcleos o de otro modo derivada de los núcleos. Los núcleos pueden ser partículas primarias. Los núcleos pueden ser núcleos para la formación de partículas primarias. Los núcleos pueden ser núcleos para la formación
de partículas sólidas (incluyendo partículas sólidas porosas) o partículas de gel. El proceso puede comprender el paso de formar partículas primarias a partir de los núcleos. Las partículas de la sustancia particulada pueden ser derivadas de gotitas. Las partículas de la sustancia particulada pueden ser derivadas de partículas primarias (por ejemplo, sembradas por las partículas primarias), las cuales pueden a su vez ser derivadas de los núcleos (por ejemplo, sembradas por los núcleos) o corresponden a los núcleos. Los núcleos pueden ser núcleos sólidos, o pueden ser núcleos de gel o una combinación de los mismos. Los núcleos pueden comprender moléculas poliméricas de silicato. Los núcleos pueden comprender polímeros de pre-cerámica . Los polímeros de pre-cerámica pueden ser capaces de ser convertidos a un material de cerámica, por ejemplo, sílice. El paso de desestabilizar al menos parcialmente las gotitas puede comprender al menos hacer coalescer parcialmente las gotitas. Este puede comprender la combinación de un líquido coalescente y la emulsión. Las partículas de la sustancia particulada pueden ser formadas o derivadas de los núcleos mediante asociación, coalescencia o aglomeración de los núcleos o de las partículas primarias. Al menos algunas de las gotitas pueden comprender una especie condensable. La especie condensable puede ser capaz de reaccionar con las partículas primarias o los núcleos y pueden ser capaces de coalescer o aglomerar las
partículas primarias o los núcleos. La especie condensable puede ser derivada de un tetraalcoxisilano (por ejemplo, tetrametoxisilano o tetraetoxisilano) o un alquiltrialcoxisilano (por ejemplo, aminopropiltrimetoxisilano) , o una mezcla de los mismos, o puede comprender un silicato o un polisilicato o una mezcla de los mismos. Las gotitas pueden comprender una sustancia liberable, y el proceso puede elaborar una sustancia particulada que comprende la sustancia liberable. Las gotitas pueden también comprender una o más sustancias no liberables y el proceso puede hacer una sustancia particulada que comprende las sustancias liberables y no liberables. Los núcleos y las partículas primarias (si están presentes) pueden o no comprender la sustancia liberable (y opcionalmente la sustancia no liberable). La sustancia liberable puede ser liberable a partir de las partículas. La sustancia liberable puede comprender una sustancia liberable simple, o puede comprender dos o más sustancias liberables individuales . El proceso puede comprender además los pasos de: proporcionar una segunda emulsión que comprende gotitas dispersas en una fase líquida continua en donde al menos algunas de las gotitas comprenden núcleos, las gotitas comprenden una segunda sustancia liberable; y - combinar la emulsión y la segunda emulsión;
los pasos son conducidos antes del paso de desestabilizar al menos parcialmente las gotitas. En este caso, el paso de desestabilizar al menos parcialmente las gotitas puede comprender al menos desestabilizar parcialmente las gotitas de la emulsión y de la segunda emulsión. El proceso resultante puede ser adecuado para la elaboración de una sustancia particulada que comprende la sustancia liberable y la segunda sustancia liberable. El paso de proporcionar una emulsión puede comprender la provisión de una microemulsión, en donde al menos algunas de las gotitas comprenden núcleos. Los núcleos pueden ser preformados o pueden ser formados in situ. El paso de provisión de la emulsión puede comprender : - proporcionar una emulsión precursora que comprende gotitas dispersas en una fase líquida continua, en donde al menos algunas de las gotitas comprenden una especie condensable, y formar los núcleos a partir de la especie condensable dentro de las gotitas, tal que al menos algunas de las gotitas comprenden la especie condensable o al menos un condensable parcial del mismo. El paso de formación de los núcleos puede comprender la maduración de la emulsión precursora por un tiempo suficiente para la formación de los núcleos a partir
de la especie condensable. El proceso de proporcionar la emulsión precursora puede comprender los pasos de: proporcionar una emulsión que comprende gotitas en emulsión dispersas en una fase líquida continua, agregar una especie hidrolizable a la emulsión; y hidrolizar al menos parcialmente la especie hidrolizable dentro de las gotitas de la emulsión para formar la especie condensable. La especie hidrolizable puede comprender un tetraalcoxisilano, por ejemplo, tetrametoxisilano o tetraetoxisilano. En una modalidad, se proporciona un proceso para la elaboración de una sustancia particulada que comprende una sustancia liberable, que comprende: proporcionar una emulsión que comprende gotitas dispersas en una fase líquida continúa, en donde al menos algunas de las gotitas comprenden núcleos, los núcleos comprenden la sustancia liberable; y desestabilizar al menos parcialmente las gotitas para formar la sustancia particulada, la sustancia particulada comprende una pluralidad de partículas en donde las partículas comprenden la sustancia liberable. La pluralidad de partículas pueden ser sembradas o
de otro modo derivadas de los núcleos. La pluralidad de partículas pueden ser derivadas de las gotitas. La sustancia liberable puede ser al menos parcialmente inmovilizada en y/o sobre la sustancia particulada, y puede ser liberalmente inmovilizada en ésta y/o sobre ésta. La sustancia liberable puede ser un compuesto orgánico o un compuesto organometálico y puede ser un fármaco. Este puede ser un fármaco anticanceroso, por ejemplo, doxorrubicina. La sustancia liberable puede ser un colorante fluorescente, un producto radiofarmacéutico, una enzima, una hormona, un biocida o alguna otra sustancia. La sustancia liberable puede ser liberable hacia el agua o un fluido acuoso o algún otro solvente. Este puede ser liberable después de la exposición de la sustancia particulada al agua o al fluido acuoso u otro solvente, o después de la inmersión de las partículas en agua o en fluido acuoso, o después de la agitación de las partículas en agua o en fluido acuoso u otro solvente. En otra modalidad más, se proporciona un proceso para elaborar una sustancia particulada, la sustancia particulada comprende primera y segunda sustancias liberables, el método comprende: la provisión de una primera emulsión que comprende gotitas dispersas en una fase líquida continua, en donde al menos algunas de las gotitas comprenden núcleos, la
primera emulsión comprende la primera sustancia liberable; la provisión de una segunda emulsión que comprende gotitas dispersas en una fase líquida continua, en donde al menos algunas de las gotitas comprenden núcleos, la segunda emulsión comprende la segunda sustancia liberable; la combinación de la primera y segunda emulsiones; y desestabilizar al menos parcialmente las gotitas de la primera y segunda emulsiones para formar la sustancia particulada, la sustancia particulada comprende una pluralidad de partículas. Las partículas pueden ser sembradas por los núcleos o de otro modo derivadas de los núcleos. La combinación puede comprender el mezclado, agitación en torbellino, agitación, homogeneización, etc. La primera y segunda emulsiones pueden ser combinadas en cualquier proporción deseada. Estas pueden ser combinadas en una segunda proporción tal que la sustancia particulada comprende la primera y segunda sustancias liberables en una proporción deseada. En otra modalidad más, se proporciona un proceso para elaborar una sustancia particulada que comprende: la provisión de una emulsión que incluye gotitas en emulsión dispersas en una fase líquida continua, - la adición de una especie hidrolizable a la
emulsión, hidrolizar al menos parcialmente la especie hidrolizable dentro de las gotitas en emulsión para formar una especie condensable, - formar núcleos a partir de la especie condensable dentro de las gotitas de la emulsión, tal que al menos algunas de las gotitas contienen una partícula primaria, y al menos algunas de las gotitas que contienen la especie condensable o al menos un condensado parcial de la misma; y la combinación de un líquido de coalescencia y la emulsión para formar la sustancia particulada; La sustancia particulada puede ser suspendida en la fase líquida continua o puede precipitarse de la fase líquida continua. La emulsión puede ser una microemulsión, y puede ser una microemulsión agua en aceite (w/o, por sus siglas en inglés) por ejemplo, las gotitas en emulsión pueden ser acuosas y la fase líquida continua puede ser hidrofóbica (w/o) . Las condiciones (por ejemplo, pH) dentro de las gotitas de la emulsión pueden ser tales como para promover al menos la hidrólisis parcial de la especie hidrolizable, y las gotitas de la emulsión pueden contener un catalizador, por ejemplo, fluoruro, para la hidrólisis de la especie hidrolizable. Las condiciones dentro de las gotitas pueden ser adecuadas para la formación de los núcleos a partir de
especies condensables. Las gotitas pueden ser no básicas y pueden ser acidas, y pueden tener un pH entre aproximadamente 0 y 7. Los núcleos pueden ser sólidos o pueden ser geles. Los núcleos pueden ser porosos o microporosos . Estos pueden tener poros entre aproximadamente 0.5 y 5 nm de diámetro. Los núcleos puede estar entre aproximadamente 1 y 50 nm de diámetro. La especie realizable puede ser una especie, después de la hidrólisis puede formar la especie condensable. Este puede ser por ejemplo un alcoxisilano, y puede ser cualquier di-, tri- o tetra-alcoxisilano o una mezcla de dos o más de éstos. La especie condensable puede ser auto-condensable, y puede ser poli-condensable y/o reticulable. Este puede comprender uno o más productos de hidrólisis de la especie hidrolizable, y puede comprender una especie de silanol. Esta puede tener uno, dos, tres o cuatro grupos silanol por molécula. Esta puede comprender un silano monomérico y/o un oligómero de silano. El paso de combinación puede comprender agregar el líquido de coalescencia a la emulsión, o puede comprender agregar la emulsión al líquido coalescente. Este puede comprender la agitación, revoltura, sonicación o agitación de otro modo ya sea de la emulsión o el líquido coalescente o ambos. El paso de combinación puede desestabilizar las gotitas y/o la emulsión. El paso de combinación puede conducir a la formación de la sustancia particulada. La
sustancia particulada puede comprender una pluralidad de partículas, cada una de las partículas es formada de una o más de los núcleos, por ejemplo, mediante coalescencia de una pluralidad de núcleos o mediante crecimiento de los núcleos. El paso de combinación puede comprender permitir un tiempo suficiente para la formación de la sustancia particulada. El tiempo suficiente puede ser hasta de aproximadamente 10 horas. La formación de la sustancia particulada puede comprender al menos la condensación parcial, la policondensación o la reticulación, de la especie condensable. La formación de la especie particulada puede comprender la reacción de la especie condensable con los núcleos. Las partículas de las sustancias particuladas son porosas y pueden ser microporosas y/o mesoporosas. Esas pueden tener poros entre aproximadamente 0.5 y 5 nm de diámetro. Estas pueden ser esféricas, o pueden ser de una forma irregular o de alguna otra forma. Las partículas pueden tener un tamaño de partícula entre aproximadamente 30 y aproximadamente 5000 nm, o entre aproximadamente 30 y aproximadamente 1000 nm o entre aproximadamente 50 y aproximadamente 300 nm de diámetro. El líquido de coalescencia puede ser miscible con la fase líquida continua, y puede comprender un líquido desestabilizador y puede también comprender un líquido no polar. El líquido desestabilizador puede ser un líquido polar, y puede ser
acetona, etanol o una mezcla de acetona y etanol. En otra modalidad más, las gotitas que comprenden los núcleos tienen un pH mayor de 7, y el paso de proporcionar la emulsión es seguido por el paso de acidificación de las gotitas y adición de una sustancia condensable o un precursor para ésta, tal que durante el paso de desestabilizar al menos parcialmente las gotitas, la sustancia condensable se condensa con el fin de formar las partículas. El precursor puede comprender un silano hidrolizable, por ejemplo, un tetraalcoxisilano, como se describe en la presente. El paso de proporcionar la emulsión puede comprender la combinación (opcionalmente el mezclado o la combinación) de un surfactante, un líquido hidrofóbico, un líquido acuoso básico y una sustancia condensable o el precursor de ésta, y permitiendo que el material condensable se condense para formar los núcleos (o permitiendo que el precursor forme la sustancia condensable y luego permitiendo que la sustancia condensable se condense para formar los núcleos) . La emulsión puede ser una microemulsión. El precursor o la sustancia condensable para los núcleos puede ser el mismo que o diferente del precursor o sustancia condensable para las partículas, como se describe anteriormente. Los precursores típicos comprenden silanos hidrolizables, los cuales pueden hidrolizarse para formar los silanos al menos parcialmente hidrolizados y/o parcialmente
condensados, los cuales son las sustancias condensables que pueden condensarse para formar los núcleos, o para formar las partículas . En otra modalidad más, el proceso de proporcionar la emulsión comprende los pasos de: proporcionar una emulsión básica, dicha emulsión comprende las gotitas en emulsión dispersas en una fase líquida continua; agregar una primera especie hidrolizable a la emulsión; al menos hidrolizar parcialmente la primera especie hidrolizable dentro de las gotitas en emulsión para formar la especie condensable; acidificar la emulsión para formar una emulsión acidificada; y agregar una segunda especie hidrolizable a la emulsión acidificada. El paso de hidrolizar al menos parcialmente puede comprender la formación de núcleos. La emulsión básica puede ser una emulsión agua en aceite y puede ser una microemulsión . El proceso puede también comprender uno o más de los pasos de: separar la sustancia particulada de la fase líquida continua,
lavar la sustancia particulada, y secar y/o liofilizar la sustancia particulada. En una modalidad más, las gotitas en emulsión comprenden una sustancia liberable, y el proceso al menos inmoviliza parcialmente la sustancia liberable en y/o sobre la sustancia particulada. La sustancia liberable puede ser temporalmente o liberablemente inmovilizada en y/o sobre la sustancia particulada. Es decir, la sustancia liberable puede ser inmovilizada sobre la sustancia particulada pero ser capaz al menos parcialmente liberada de ésta cuando se someta a condiciones de liberación apropiadas, por ejemplo, sumergida en un líquido capaz de liberar la sustancia liberable. El líquido puede ser por ejemplo un solvente para la sustancia liberable. La sustancia liberable puede ser un compuesto orgánico o un compuesto organometálico y puede ser un fármaco. Este puede ser un fármaco anticanceroso por ejemplo, doxorrubicina. La sustancia liberable puede ser estable a las condiciones prevalecientes en las gotitas en emulsión antes y durante el proceso. En otra modalidad más, se proporciona un proceso para elaborar la sustancia particulada que comprende los pasos de: proporcionar una microemulsión agua en aceite que tiene gotitas en emulsión dispersas en una fase líquida continua, las gotitas en emulsión comprenden un catalizador
para la hidrólisis de un alcoxisilano; agregar el alcoxisilano a la emulsión; hidrolizar al menos parcialmente el alcoxisilano dentro de las gotitas de la emulsión para formar al menos una especie de silanol; formar núcleos a partir de la especie de silanol dentro de las gotitas en emulsión tal que al menos algunas gotitas que contienen una partícula primaria de entre aproximadamente 1 y 50 nm de diámetro, y al menos algunas gotitas comprenden la especie de silanol; y combinar un líquido de coalescencia y la emulsión para formar la sustancia particulada que tiene un tamaño de partícula entre aproximadamente 30 y 1000 nm, o entre aproximadamente 50 y 300 nm. En otra modalidad más, se proporciona un proceso para elaborar una sustancia particulada que comprende una sustancia liberable que comprende los pasos de: proporcionar una microemulsión agua en aceite que tiene gotitas en emulsión dispersas en una fase líquida continua, las gotitas en emulsión tienen un pH entre aproximadamente 1 y 7 y comprender la sustancia liberable en un catalizador para la hidrólisis de un alcoxisilano, agregar el alcoxisilano a la emulsión, hidrolizar al menos parcialmente el alcoxisilano dentro de las gotitas en emulsión para formar al
menos una especie de silanol, formar un núcleo a partir de la especie de silanol dentro de las gotitas en emulsión tal que al menos algunas gotitas contienen una partícula primara de entre aproximadamente 1 y 50 nm de diámetro y al menos algunas gotitas comprenden la especie de silanol; y combinar un líquido de coalescencia con la emulsión para formar la sustancia particulada que tiene un tamaño de partícula entre aproximadamente 30 y 1000 nm, o entre aproximadamente 50 y 300 nm, la sustancia particulada comprende la sustancia liberable. En otra modalidad más, se proporciona un proceso para elaborar una sustancia particulada que comprende una sustancia liberable que comprende los pasos de: - proporcionar una microemulsión agua en aceite que tiene gotitas en emulsión dispersas en una fase líquida continua, las gotitas en emulsión tienen un pH entre aproximadamente 1 y 7 y comprender la sustancia liberable en un catalizador para la hidrólisis de un alcoxisilano, - agregar el alcoxisilano a la emulsión, hidrolizar al menos parcialmente el alcoxisilano dentro de las gotitas en emulsión para formar al menos una especie de silanol, formar un núcleo a partir de la especie de silanol dentro de las gotitas en emulsión tal que al menos
algunas gotitas contienen una partícula primara de entre aproximadamente 1 y 50 nm de diámetro y al menos algunas gotitas comprenden la especie de silanol; y combinar un líquido de coalescencia con la emulsión para formar la sustancia particulada que tiene un tamaño de partícula entre aproximadamente 30 y 1000 nm, o entre aproximadamente 50 y 300 nm, la sustancia particulada comprende la sustancia liberable. la separación de la sustancia particulada a partir de la fase líquida continua; lavar la sustancia particulada; y secar la sustancia particulada. En otra modalidad más, se proporciona un proceso para elaborar una sustancia particulada que comprende: - la provisión de una emulsión que comprende gotitas en emulsión dispersas en una fase líquida continua, agregar una especie condensable a la emulsión, la especie condensable es capaz de entrar a las gotitas en emulsión; - formar núcleos a partir de la especie condensable dentro de las gotitas en emulsión, tal que al menos algunas gotitas contienen una partícula primaria y al menos algunas gotitas contienen la especie condensable; y combinar un líquido de coalescencia y la emulsión para formar la sustancia particulada.
La especie condensable puede ser un silicato, y puede ser un silicato soluble, por ejemplo, silicato de sodio o silicato de potasio. El proceso puede también comprender la adición de un óxido metálico con la especie condensable. El metal puede ser un metal de transición, por ejemplo, titanio, zirconio, hierro, zinc, vanadio, cromo o hafnio. Otros óxidos tales como aquellos de estaño, aluminio, germanio, calcio o fósforo pueden ser también utilizados. El óxido puede ser agregado en una proporción a la especie condensable de entre aproximadamente 0 y 80%, en una base molar o en una base en peso/peso, o entre aproximadamente 0 y 75%, 0 y 60%, 0 y 50%, 0 y 40%, 0 y 30%, 0 y 20%, 0 y 10%, 20 y 80%, 50 y 80%, 50 y 75%, 25% y 75% ó 25% y 50%, y puede ser agregada en una proporción de aproximadamente 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 u 80% en una base molar o p/p. Las partículas biodegradables y/o las partículas adecuadas para promover la formación de apatita, por ejemplo, para aplicaciones ortopédicas, pueden ser elaboradas de esta manera. En un segundo aspecto de la invención, se proporciona un aspecto para elaborar una sustancia particulada que incluye: la provisión de una emulsión que comprende gotitas dispersas en una fase líquida continua, en donde al menos algunas de las gotitas comprenden una especie condensable;
la maduración de la emulsión por al menos 1 minuto; y desestabilizar al menos parcialmente las gotitas para formar la sustancia particulada, la sustancia particulada comprende partículas derivadas de la especie condensable . La maduración puede ser por al menos 1, 2, 5, 10, 20, ó 30 minutos, ó 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 horas. Esta puede ser entre aproximadamente 1 minuto y 6 horas o entre aproximadamente 1 minuto y 1 hora, y 1 y 30 minutos, 1 y 10 minutos, 10 minutos y 6 horas, 1 y 6 horas, 10 minutos y 1 hora ó 10 y 30 minutos, y puede ser por aproximadamente 1, 2, 5, 10, 20 ó 30 minutos, o 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 horas. La maduración puede ser por un tiempo suficiente para la formación de núcleos a partir de especies condensables. La presente invención también proporciona una sustancia particulada, o una sustancia particulada que comprende una sustancia liberable, cuando se elabora mediante los procesos del primero y segundo aspecto de la invención. La sustancia liberable si está presente, puede estar al menos parcialmente inmovilizada, y puede estar al menos parcialmente liberablemente inmovilizada. En un tercer aspecto de la invención, se proporciona una sustancia particulada microporosa que comprende una sustancia liberable. La sustancia liberable
puede ser liberablemente inmovilizada sobre y/o en la sustancia particulada microporosa. Las partículas de la sustancia particulada pueden estar entre aproximadamente 30 y aproximadamente 5000 nm o entre aproximadamente 30 y aproximadamente 1000 nm o entre aproximadamente 50 y aproximadamente 300 nm de diámetro de partícula medio. La sustancia particulada puede tener un tamaño de poro medio de entre aproximadamente 0.5 y 50 nm de diámetro. Esta puede tener microporos de al menos aproximadamente 1 nm de diámetro, junto con mesoporos de entre aproximadamente 1 y 50 nm, por ejemplo entre aproximadamente 1 y 10 nm. Las partículas de la sustancia particulada pueden comprender núcleos asociados entre si. Estas pueden comprender aglomerados de núcleos. Los núcleos pueden tener un diámetro medio de entre aproximadamente 1 y 50 nm. La sustancia particulada puede ser elaborada mediante el proceso del primero o segundo aspecto de la invención. La sustancia liberable puede ser inestable en un ambiente básico, y puede ser estable en un ambiente ácido, y puede ser un fármaco por ejemplo un fármaco para el tratamiento del cáncer. La sustancia liberable puede ser un colorante fluorescente, un producto radiofarmacéutico, una enzima, una hormona, un biocida o alguna otra sustancia. La sustancia liberable puede ser liberable hacia el agua o un fluido acuoso o algún otro solvente. Este puede ser
liberable después de la exposición de la sustancia particulada al agua o al fluido acuoso u otro solvente, o después de la inmersión de las partículas en agua o en fluido acuoso, o después de la agitación de las partículas en agua o en fluido acuoso u otro solvente. La sustancia liberable puede ser liberable sin degradación sustancial, o disolución o erosión de las partículas de la sustancia particulada. En un periodo prolongado, por ejemplo, mayor de aproximadamente 6 meses, puede tener lugar cierta disolución en las partículas. Esto puede influenciar o contribuir al perfil de liberación. La liberación de la sustancia liberable puede ocurrir mediante difusión fuera de las partículas de la sustancia particulada. En un cuarto aspecto de la invención, se proporciona un método para tratar una condición en un mamífero, por ejemplo, un humano, que comprende administrarle al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de una sustancia particulada de acuerdo a la presente invención, las partículas comprenden una sustancia liberable, la sustancia liberable es indicada para la condición. La sustancia liberable puede ser un fármaco, y el fármaco puede ser un fármaco anticanceroso. La condición puede ser una enfermedad. La condición puede ser por ejemplo el cáncer, diabetes, disfunción hormonal, hipertensión, dolor (por ejemplo, dolor tratable por morfina y/u opiáceos), o asma.
Se proporciona también una sustancia particulada de acuerdo a la presente invención cuando se utiliza para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una condición en un mamífero, por ejemplo, un humano, la sustancia particulada comprende una sustancia liberable, la sustancia liberable es indicada para la condición. La condición puede ser por ejemplo el cáncer, diabetes, disfunción hormonal, hipertensión, dolor (por ejemplo, dolor tratable por morfina y/u opiáceos), o asma. Se proporciona además el uso de una sustancia particulada de acuerdo a la invención para el tratamiento de una condición en un mamífero, por ejemplo un humano, las partículas comprenden una sustancia liberable, la sustancia liberable es indicada para la condición. La condición puede ser por ejemplo el cáncer, diabetes, disfunción hormonal, hipertensión, dolor (por ejemplo, dolor tratable por morfina y/u opiáceos), o asma. En un quinto aspecto de la invención se proporciona un método para distribuir una sustancia liberable, el método comprende exponer una sustancia particulada de acuerdo a la presente invención a un medio capaz de liberar la sustancia liberable, las partículas comprenden la sustancia liberable. La exposición puede comprender sumergir las partículas en el medio, y puede comprender además uno o más de la agitación, revoltura, agitación en torbellino o agitar de otro modo el
medio que tiene las partículas en éste. Alternativamente la exposición puede comprender el medio de paso y/o completamente las partículas. El medio puede ser un fluido, y puede ser un líquido. El medio puede ser un fluido biológico tal como sangre. Éste puede ser un fluido acuoso tal como agua o una solución acuosa. El medio puede ser capaz de disolver la sustancia liberable. La sustancia liberable puede ser por ejemplo un colorante fluorescente, un agente radiofarmacéutico, un fármaco, una enzima, una hormona, un biocida o alguna otra sustancia, o puede ser una mezcla de cualesquiera dos o más de éstas. La exposición puede ser bajo condiciones adecuadas para la liberación de la sustancia liberable hacia el medio. El método puede también comprender el paso de permitir que la sustancia liberable se libere hacia el medio. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Una forma preferida de la presente invención será descrita ahora a manera de ejemplo con referencia a las figuras anexas en las cuales: La Figura 1 muestra un diagrama de flujo de un proceso de acuerdo a la presente invención; Las Figuras 2a-2d muestran las microfotografías electrónicas de transmisión (TEMs por sus siglas en ingles) que ilustran la influencia de la concentración de surfactante inicial [NP-5] sobre la morfología de las partículas finas:
Fig.2 (a) 0.2 mol/litro; Fig.2 (b) 0.4 mol/litro; Fig.2 (c) 0.6 mol/litro; Fig.2 (d) 0.8 mol/litro; Las Figuras 3a-3f muestran las TEMs que ilustran la influencia de la concentración inicial de TMOS (tetrametoxisilano) sobre el tamaño de partícula final con una proporción molar de agua/TMOS = 10: Fig.3a) TMOS 4 mol, Fig.3 (b) TMOS 6 mmol, Fig.3(c) TMOS 8 mmol, Fig.3 (d) TMOS 12 mmol; Las Figuras 4a-4f muestran las TEMs que ilustran la influencia de la naturaleza del surfactante sobre el tamaño de partícula final y la morfología ( [surfactante] =0.2 mol/1): Fig.4(a) Brij30, Fig.4(b) NP-5, Fig.4(c) NP-6, Fig.4(d) Tritón X-114 con 1-pentanol 10 mmol Fig.4(e) NP-9 con 1-pentanol 10 mmol, Fig.4(f) Tritón X-100 con 1-pentanol 10 mmo1 ; Las Figuras 5a-5f muestran las TEMs que ilustran la influencia de la naturaleza del surfactante sobre el tamaño de partícula final y la morfología ( [surfactante] =0.4 mol/1): Fig.5 (a) Brij30, Fig.5(b) NP-5, Fig.5(c) NP-6, Fig.5(d) Tritón X-114 con 1-pentanol 10 mmol, Fig.5(e) NP-9 con 1-pentanol 10 mmol, Fig.5(f) Tritón X-100 con 1-pentanol 10 mmol ; Las Figuras 6a-6c muestran las TEMs que ilustran la influencia del cosurfactante sobre el tamaño de partícula final y la morfología: Fig.6(a) NP-5 0.2 mol/1; Fig.6(b) NP-5
0.4 mol/1; Fig.6(c) NP-5 0.2 mol/1, 1-pentanol 0.2 mol/1; Las Figuras 1 a-l . muestran las microfotografías electrónicas de transmisión que ilustran la influencia del solvente en microemulsión sobre la morfología de la partícula final (después de la desestabilización con 100 mil de acetona/100 ml de solvente correspondiente): Fig.7 (a) benceno de petróleo, 1-hexanol 20 mmol; Fig.7 (b) hexano, 1-hexanol 20 mmol; Fig.7 (c) octano, 1-hexanol 20 mmol; Fig.7 (d) decano, 1-hexanol 20 mmol; Fig.7 (e) dodecano, 1-hexanol 40 mmol; Fig.7 (f) tolueno; Las Figuras 8a-8f muestran las TEMs y un reporte de los resultados, ilustrando la influencia del solvente de microemulsión sobre la morfología de partícula final (después de la desestabilización con 50 ml de etanol/100 ml de solvente correspondiente): Fig.8 (a) benceno de petróleo, 1-hexanol 20 mmol; Fig.8 (b) hexano, 1-hexanol 20 mmol; Fig.8
(c) octano, 1-hexanol 20 mmol; Fig.8 (d) decano, 1-hexanol 20 mmol; Fig.8 (e) dodecano, 1-hexanol 40 mmol; Fig.8 (f) tolueno; Las Figuras 9a-9c muestran las TEMs que ilustran la desestabilización de la microemulsión basada en tolueno, utilizando: Fig.9 (a) NP-5; Fig.9 (b) Tritón X-114; Fig.9 (c) NP-9 como surfactante; Las Figuras lOa-lOd muestran las TEMs que ilustran la influencia del tiempo de maduración antes de la
desestabilización sobre la morfología de la partícula final: Fig.10 (a) maduración 24 horas, Fig.10 (b) maduración 48 horas, Fig.10 (c) maduración 120 horas, Fig.10 (d) maduración 168 horas; Las Figuras lla-lld muestran las TEMs que ilustran la influencia de la naturaleza del alcóxido de silicio sobre la semilla inicial y el tamaño y la morfología de las partículas finales: Fig.11 (a) TMOS 6 mmol antes de la desestabilización; Fig.11 (b) TMOS 6 mmol después de la desestabilización; Fig.11 (c) TEOS 6 mmol antes de la desestabilización; Fig.11 (d) TEOS 6 mmol después de la desestabilización; Las Figuras 12a-12d muestran las TEMs que ilustran la influencia de la manera en que es agregado el agente de desestabilización sobre el tamaño de partícula final, con las partículas obtenidas: Fig.12 (a) mediante vaciado de 50 ml de acetona en la microemulsión; Fig.12 (b) mediante vaciado de la microemulsión en 50 ml de acetona; Fig.12 (c) mediante el vaciado de la microemulsión en 100 ml de acetona; Fig.12 (d) mediante el vaciado de la microemulsión en una mezcla de 100 ml de acetona y 100 ml de ciclohexano; Las Figuras 13a-13d muestran las TEMs que ilustran la influencia de la cantidad de acetona agregada sobre el tamaño de partícula final Fig.13 (a) 50 ml de acetona más 50 ml de ciclohexano; Fig.13 (b) 100 ml de acetona más 100 ml de
ciclohexano; Fig.13 (c) 150 ml de acetona más 150 ml de ciclohexano; Fig.13 (d) 200 ml de acetona más 200 ml de ciclohexano; Las Figuras 14a-14e muestran las TEMs que ilustran la influencia de las condiciones de mezclado sobre el tamaño de partícula final y la morfología: Fig.14 (a) recipiente de 1 litro, barra ' /'; Fig.14 (b) recipiente de 250 ml , barra ' + ' ; Fig.14 (c) recipiente de 250 ml ; barra ' /'; Fig.14 (d) ultrasonicación; Fig.14 (e) combinado acuoso de cloruro de sodio 0.2 mol/1, recipiente de 250 ml , barra '/'; Las Figuras 15a-15f muestran las TEMs que ilustran la influencia del pH de los combinados acuosos (fase discontinua) sobre el tamaño de partícula final y la morfología: Fig.15 (a) pH=7.0; Fig.15 (b) 3.54; Fig.15 (c) 3.04, Fig.15 (d) , 2.70; Fig.15 (e) 1.80; (f) 1.50; Las Figuras 16 muestran las TEMs y los reportes de resultados que ilustran la influencia de la cantidad de acetona sobre la morfología de las partículas finales: Fig.16 (a) 10 ml; Fig.16 (b) 20 ml ; Fig.16 (c) 50 ml ; Fig.16 (d) 100 ml; Fig.16 (e) 200 ml ; Las Figuras 17a-17g muestran las TEMs y los reportes de los resultados que ilustran la influencia de la cantidad de etanol sobre la morfología de las partículas finales: Fig.17 (a) 5 ml ; Fig.17 (b) 10 ml ; Fig.17 (c) 20 ml ; Fig.17 (d) 35 ml ; Fig.17 (e) 50 ml ; Fig.17 (f) 80 ml ; Fig.17
(g) 100 ml; Las Figuras 18a-18d muestran las TEMs y los reportes de resultados que ilustran la influencia de la composición de una mezcla desestabilizadora mixta de etanol/acetona sobre la morfología de partícula final: Fig.18 a) 100 ml de ciclohexano; , 80 ml de acetona, 20 ml de etanol; Fig.18b) 100 ml de ciclohexano, 60 ml de acetona, 40 ml de etanol; Fig.18c) 100 ml de ciclohexano, 40 ml de acetona, 60 ml de etanol; Fig.ldd) 100 ml de ciclohexano, 20 ml de acetona, 80 ml de etanol; Las Figuras 19a-19j muestran las TEMs que ilustran la influencia de la naturaleza del líquido de coalescencia sobre la morfología de la partícula final: Fig.19a) isopropanol, Fig.19b) 1-propanol, Fig.19c) metiletilcetona, Fig.l9d) cloroformo, Fig.l9e) tolueno, Fig.l9f) benceno, Fig.l9g) THF, Fig.l9h) DMF, Fig.l9i) piridina, y Fig.l9j) 1-butanol; Las Figuras 20a-20d muestran las TEMs que ilustran la influencia de la composición del líquido de coalescencia agregado a las microemulsiones sobre la morfología de las partículas finales: ciclohexano mezclado con Fig.20 (a) 40 ml de acetona + 10 ml de 1-propanol, Fig.20b) 30 ml de acetona + 20 ml de 1-propanol, Fig.20c) 20 ml de acetona + 30 ml de 1-propanol, Fig.20d) 10 ml de acetona + 40 ml de 1-propanol;
La Figura 21 muestra una gráfica de la eficiencia de encapsulamiento de la doxorrubicina como una función de la doxorrubicina agregada; La Figura 22 muestra una gráfica que ilustra la descomposición de la doxorrubicina pura en PBS (pH 6.9/25°C) a 37°C; La Figura 23 muestra una gráfica de la velocidad de liberación a corto plazo de la doxorrubicina a partir de las nanopartículas de sílice de acuerdo a la presente invención, en PBS (pH 6.9/25°C) a 37°C; La Figura 24 muestra una gráfica de la liberación a largo plazo de la doxorrubucina a partir de nanopartículas de sílice de acuerdo a la presente invención, en PBS (pH 6.9/25°C) a 37°C; La Figura 25 muestra las gráficas de las isotermas de adsorción-desorción de nitrógeno de las partículas de sílice producidos mediante la desestabilización con acetona de un sistema de microemulsión de acuerdo a la invención, NP-5/ciclohexano/agua a pH=l y pH=7; La Figura 26 es una ilustración esquemática de los diferentes procesos de crecimiento de partícula en microemulsiones; La Figura 27 es un diagrama de flujo que muestra la síntesis típica de partículas a partir de los experimentos adicionales descritos en la presente;
Las Figuras 28a-28e muestran las TEMs que ilustran la influencia de la naturaleza del precursor orgánicamente modificado sobre la morfología de las partículas en los experimentos adicionales descritos en la presente: Fig.28 (a) MTMS; Fig.28 (b) PTMS; Fig.28 (c) OTES; Fig.28 (d) GTES; Fig.28 (e) CheeTES; Fig.28 (f) APTMS; (ORMOCER (25% mol) con TMOS (75% mol) y [N-57]=0.4 mol/1); La Figura 29 es una TEM que ilustra la influencia de APTMS sobre la morfología de las partículas en los experimentos adicionales descritos en la presente (APTMS (25% mol) con TMOS (75% mol) y [N-57]=0.4 mol/1); Las Figuras 30a-30f muestran las microfotografías electrónicas de transmisión que ilustran la influencia de la naturaleza y la proporción de ORMOCER en los experimentos adicionales descritos en la presente: Fig.30 (a) GTMS 5% mol más TMOS 95% mol; Fig.30 (b) GTMS 10% mol más TMOS 90% mol; Fig.30 (c) GTMS 15% mol más TMOS 85% mol; Fig.30 (d) APTMS 5% mol más TMOS 95% mol; Fig.30 (e) APTMS 10% mol más TMOS 90% mol; Fig.30 (f) APTMS 15% mol más TMOS 85% mol; Las Figuras 31a-31c muestran las microfotografías electrónicas de transmisión que ilustran la influencia de la proporción de TMOS y TEOS sobre la morfología de las partículas en los experimentos adicionales descritos en la presente: Fig.31 (a) TEOS 25% mol más TMOS 75% mol; Fig.31 (b) TEOS 50% mol más TMOS 50% mol; Fig.31 (c) TEOS 75% mol
más TMOS 25% mol; La Figura 32 es un diagrama de flujo que muestra un proceso para la desestabilización de un sistema de emulsión múltiple como se describe en los experimentos adicionales descritos en la presente; La Figura 33 muestra los espectros de desplazamiento de UV-visibles de los polvos submicrónicos sintetizados mediante desestabilización de microemulsión y con diferentes colorantes encapsulados: (A) rodamina-B; (B) metil-violeta; (C) colorante doble impurificado mediante mezclado de dos emulsiones; (D) colorante doble mezclado antes de la adición a la emulsión; Las Figuras 34a-34e muestran las microfotografías electrónicas de transmisión que ilustran la desestabilización del sistema mixto de semillas y oligomérico en los experimentos adicionales descritos en la presente: Fig.34 (a) las partículas de semilla sintetizadas en base; Fig.34b) con la adición de 1.269 ml de HN03 1.00 M, 0.024 mmol de F" y 1.2 mmol de TEOS seguido por desestabilización; Fig.34c) con la adición de 1.269 ml de HN03 1.50 M, 0.024 mmol de F" y 1.2 mmol de TEOS seguido por desestabilización; Fig.34d) con la adición de 1.269 ml de HN03 1.00 M, 0.024 mmol de F" y 1.2 mmol de TMOS seguido por la desestabilización; Fig.34e) con la adición de 1.269 ml de HN03 1.50 M, 0.024 mmol de F" y 1.2 mmol de TMOS seguido por desestabilización;
La Figura 35 es un diagrama de flujo que muestra un proceso para la desestabilización de una emulsión que contiene nanopartículas sintetizadas utilizando catálisis con base (por ejemplo semillas) y el monómero hidrolizado en medio ácido; Las Figuras 36a-36h muestran las microfotografías electrónicas de transmisión que ilustran la desestabilización de las microemulsiones que contienen partículas de semilla híbrida en los experimentos adicionales descritos en la presente, en los cuales las semillas son elaboradas a partir de: Fig.36 (a) TMOS 100%; Fig.36 (b) : TMOS 75% + VTMS 25%; Fig.36 (c) : TMOS 75% + MTMS 25%; Fig.36 (d) : TMOS 75% + PTMS 25%; Fig.36 (e): TMOS 75% + OTES 25%; Fig.36 (f) TMOS 75% + APTMS 25%; Fig.36 (g): TMOS 75% + DATMS 25%; Fig.36 (h): TMOS 75% + MPTMS 25%; Las Figuras 37a-37d muestran las microfotografías electrónicas de transmisión que ilustran la desestabilización de emulsiones múltiples en los experimentos adicionales descritos en la presente, utilizando 100 ml de ciclohexano y 100 ml de Fig.37 (a) acetona; Fig.37 (b) etanol; Fig.37 (c) iso-propanol; Fig.37 (d) 1-propanol; La Figura 38 muestra una gráfica de la distribución del tamaño de poro de la muestra LK-425 y LK-428 correspondiente a la isoterma en la Figura 25; La Figura 39 muestra las gráficas de la
distribución del tamaño de partícula de las muestras sintetizadas sin sonicación durante la desestabilización; La Figura 40 muestra las gráficas de la distribución del tamaño de partícula de las muestras sintetizadas con sonicación durante la desestabilización; La Figura 41 muestra una gráfica que ilustra los perfiles de liberación de las partículas que contienen doxorrubicina a pH < 4 a 37 °C; La Figura 42 muestra una comparación de la liberación de la doxorrubicina, y la formación de productos de degradación; La Figura 43 muestra una gráfica que ilustra la liberación de la doxorrubicina a partir de nanopartículas a pH=7.4 ; La Figura 44 muestra una comparación de la descomposición de una muestra de doxorrubicina a pH < 4 y pH 7.4; La Figura 45 muestra una gráfica que ilustra la cantidad total de doxorrubicina liberada de las micropartículas de acuerdo a la invención; La Figura 46 muestra una gráfica que ilustra la liberación acumulativa de la doxorrubicina a partir de las nanopartículas de acuerdo a la invención; La Figura 47 muestra una gráfica que ilustra la liberación continua de la camptotecina a partir de las
nanopartículas de acuerdo a la invención; La Figura 48 muestra una gráfica que ilustra la liberación continua de camptotecina a partir de las nanopartículas de acuerdo a la invención, en la cual la fase acuosa fue reemplazada en cada punto de dato; y Las Figuras 49a-49d muestran las TEMs que ilustran la influencia de la naturaleza del surfactante sobre la morfología del tamaño de partícula antes de y después de la desestabilización por acetona ( [surfactante] =0.2 mol/1): Fig.49a) Tween 21; Fig.49b) Tween 61; Fig.49c) Tween 81; Fig.49d) AOT. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención describe un método para elaborar partículas de un tamaño deseado. En un aspecto, el proceso comprende producir inicialmente una emulsión, por ejemplo una microemulsión, con tamaño de partícula bien controlado a través de procesos bien conocidos, infundiendo una especie hidrolizable dentro de las gotitas en emulsión de la emulsión, hidrolizando la especie hidrolizable en las gotitas en emulsión, para formar una especie condensable y condensar la especie condensable dentro de las gotitas en emulsión utilizando la química de sol-gel bien conocida. Las partículas resultantes son luego sometidas a coalescencia mediante el inicio de una desestabilización controlada de la emulsión para producir una sustancia particulada con el
tamaño de partículas deseado. La química requerida para elaborar partículas que tienen tamaño de poro controlados es bien conocida, y al combinar esta tecnología con el presente proceso para la desestabilización controlada, es posible producir una sustancia particulada que comprende partículas de un tamaño de partícula medio deseado, con tamaño de poro controlado. Las combinaciones particulares del tamaño de partícula y del tamaño de poro son de este modo logrables las cuales fueron hasta ahora difíciles de producir. Si una sustancia liberable tal como un fármaco es incorporada dentro de las gotitas en emulsión de la microemulsión inicial, entonces esa sustancia liberable puede ser liberablemente inmovilizada en y/o sobre la sustancia particulada, que puede ser luego (si la sustancia liberable es un fármaco) utilizada para fines terapéuticos. Mediante control apropiado del tamaño de partícula, la sustancia particulada puede ser dirigida a partes particulares del cuerpo de un paciente, y mediante control apropiado del tamaño de poro, la velocidad de liberación de la sustancia liberable puede ser controlada a una velocidad deseada. El proceso de la presente invención puede ser utilizado para elaborar una sustancia particulada microporosa, la cual puede comprender una sustancia liberable, para el tratamiento de condiciones tales como el cáncer en un mamífero, por ejemplo un humano. La sustancia
liberable puede ser liberablemente inmovilizada sobre y/o en la sustancia particulada microporosa. La sustancia particulada microporosa puede comprender partículas que están entre aproximadamente 30 y aproximadamente 1000 nm de diámetro, o pueden estar entre aproximadamente 30 y 500 o aproximadamente 30 y 100 o aproximadamente 50 y 1000 o aproximadamente 100 y 1000 o aproximadamente 500 y 1000 o aproximadamente 50 y 500 o aproximadamente 50 y 300 o aproximadamente 50 y 250 o aproximadamente 100 y 400 o aproximadamente 100 y 300 o aproximadamente 100 y 250 o aproximadamente 150 y 250 nm, y pueden ser de aproximadamente 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 ó 1000 nm de diámetro. Las partículas de la sustancia particulada pueden ser nanopartículas. Las partículas de la sustancia particulada pueden ser microporosas (es decir éstas pueden tener un diámetro de poro menor de aproximadamente 1.7 nm) y/o mesoporosas. Éstas pueden ser microporosas y mesoporosas. Éstas pueden tener un diámetro de poro medio de menos de aproximadamente 50 nm, o menos de aproximadamente 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6 ó 0.5 nm. Éstas pueden tener un diámetro de poro medio de entre aproximadamente 0.5 y 5 nm, o entre aproximadamente 0.5 y 2 nm o aproximadamente 0.5 y 1 nm o aproximadamente 1 y 5 nm o aproximadamente 2 y 5 mm o
aproximadamente 1 y 2 nm o aproximadamente 4 y 5 nm o entre aproximadamente 5 y 50 nm, 10 y 50 nm, 20 y 50 nm, 10 y 20 nm, 5 y 20 nm o 5 y 10 nm, y pueden tener un diámetro de poro medio de aproximadamente 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 nm. Éstas pueden tener mesoporos entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 nm, y microporos por debajo de aproximadamente 1 nm. El tamaño de poro puede ser diseñado a la medida al ajustar las condiciones bajo las cuales son elaboradas las partículas de la invención. En el proceso de la presente invención, estas partículas son producidas a partir del núcleo. Los núcleos pueden ser partículas primarias. Los núcleos pueden tener un diámetro de partícula medio de aproximadamente 1 y 50 nm, o entre aproximadamente 1 y 20 o aproximadamente 1 y 10 o aproximadamente 1 y 5 o aproximadamente 1 y 2 o aproximadamente 2 y 50 o aproximadamente 5 y 50 o aproximadamente 10 y 50 o aproximadamente 20 y 50 o aproximadamente 2 y 20 o aproximadamente 2 y 10 o aproximadamente 5 y 10 nm, y pueden tener un diámetro de partícula medio de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 nm. El peso de la sustancia liberable puede depender de la naturaleza del fármaco y de la naturaleza de la sustancia particulada, y puede estar entre aproximadamente
0.01 y 100 mg por gramo de sustancia particulada, o entre aproximadamente 0.01 y 20 mg ó 0.01 y 10 mg ó 0.01 y 5 mg o aproximadamente 0.01 y 1 mg o aproximadamente 0.01 y 0.5 mg o aproximadamente 0.01 y 0.1 mg o aproximadamente 0.01 y 0.05 mg o aproximadamente 1 y 100 mg o aproximadamente 10 y 100 mg o aproximadamente 50 y 100 mg o aproximadamente 1 y 10 mg o aproximadamente 5 y 10 mg o aproximadamente 0.1 y 1 mg o aproximadamente 0.1 y 0.5 mg por gramo de sustancia particulada, y puede ser de aproximadamente 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ó 100 mg por gramo de sustancia particulada, o puede ser menor de 0.01 o mayor de 100 mg por gramo de sustancia particulada. El proceso de la invención puede comprender la provisión de una emulsión precursora que tiene una especie condensable en las gotitas en emulsión, en donde las gotitas en emulsión comprenden la fase discontinua de la emulsión. La emulsión puede ser una microemulsión agua en aceite (w/o por sus siglas en ingles), de modo que la especie condensable está localizada en las gotitas en emulsión acuosas ("combinados acuosos") . La emulsión puede ser elaborada mediante : la provisión de una emulsión que comprende gotitas en emulsión dispersas en una fase líquida continua,
la infusión de una especie hidrolizable dentro de las gotitas en emulsión (por ejemplo la fase discontinua) de la emulsión, y la hidrólisis de la especie hidrolizable dentro de las gotitas en emulsión para formar la especie condensable. Alternativamente, la especie condensable puede ser infundida dentro de las gotitas en emulsión. El paso de provisión de una emulsión puede comprender la combinación de un líquido hidrofóbico, un líquido acuoso y un surfactante, en cantidades y bajo condiciones de agitación adecuadas para producir una emulsión. El surfactante puede ser por ejemplo
NP-5 y NP-6 o Tween 21, o una mezcla de cualesquiera dos o tres de éstos. La agitación puede comprender una o más de agitación, agitación en torbellino, sonificación o ultrasonificación, y puede ser leve, moderada o vigorosa. El líquido acuoso puede ser una solución acuosa, y puede comprender componentes que son requeridos en la fase discontinua de la emulsión. El líquido acuoso puede comprender un catalizador para la hidrólisis de la especie hidrolisable, y opcionalmente un catalizador para la condensación de la especie condensable. El catalizador puede ser por ejemplo fluoruro, base (por ejemplo el ion hidróxido, el cual puede ser proveniente de un hidróxido de metal alcalino o amoniaco) , o un alcóxido de metal de transición (por ejemplo isopropóxido de titanio) el cual puede catalizar
la hidrólisis de un alcoxisilano. El líquido acuoso puede comprender una sustancia liberable, que puede ser inmovilizada en y/o sobre la sustancia particulada elaborada mediante el proceso de la invención. La sustancia liberable puede ser un fármaco, y puede ser un fármaco anti-canceroso, y puede ser doxorrubicina, o puede ser un colorante fluorescente, un radiofarmacéutico, una enzima, una hormona, un biocida o alguna otra sustancia. El líquido acuoso puede estar a un pH que no promueve la descomposición de la sustancia liberable. El pH puede estar entre aproximadamente 1 y 8 o entre 1 y 7 o entre aproximadamente 2 y 7, entre aproximadamente 3 y 7, entre aproximadamente 4 y 7, entre aproximadamente 5 y 7, entre aproximadamente 6 y 7, entre aproximadamente 1 y 6, entre aproximadamente 2 y 6, entre aproximadamente 3 y 6, entre aproximadamente 4 y 6, entre aproximadamente 5 y 6, entre aproximadamente 1 y 5, entre aproximadamente 2 y 5, entre aproximadamente 3 y 5, entre aproximadamente 4 y 5, entre aproximadamente 1 y 4, entre aproximadamente 2 y 4, entre aproximadamente 3 y 4, entre aproximadamente 1 y 3, entre aproximadamente 2 y 3 o entre aproximadamente 1 y 2 o entre aproximadamente 7 y 8, y puede ser de aproximadamente 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5 u 8. La especie hidrolizable puede ser una especie que es capaz de ser hidrolizada para producir una especie condensable. Ésta puede ser por ejemplo un silano
hidrolizable. Ésta puede comprender un silano hidrolizable que tiene 1, 2, 3 ó 4 grupos hidrolizables enlazados al silicio, y puede comprender una mezcla de tales silanos, o una mezcla de tales silanos. Los silanos adecuados incluyen, pero no están restringidos a tri- y tetra-alcoxisilanos, tales como tetrametoxisilano (TMOS) , tetraetoxisilano (TEOS) , tetrabutoxisilano (TBOS), tetrapropoxisilano (TPOS), metiltrimetoxisilano (MTMS) , metiltrietoxisilano (MTES) , etiltrietoxisilano (ETES) , octiltrietoxisilano (OTES) , octiltrimetoxisilano (OTMS) , hexadeciltrimetoxisilano (HDTMS) y hexadeciltrietoxisilano (HDTES), octadeciltrimetoxisilano (ODTMS), octadeciltrietoxisilano (ODTES) así como polisilicato de metilo (MPS) , polisilicato de etilo (EPS), polidietoxisilano (PDES), disilicato de hexametilo, disilicato de hexaetilo o trialcoxisilanos funcionales (por ej emplo, metacriloiloxipropiltrimetoxisilano, feniltrietoxisilano (PTES), feniltrimetoxisilano (PTMS), glicidoxipropoxitrimetoxisilano (GLYMO) , glicidoxipropiltrietoxisilano (GLYEO) , mercaptopropiltrietoxisilano (MPTES) , mercaptopropiltrimetoxisilano (MPTMS) , aminopropiltrimetoxisilano (APTMS), aminopropiltrietoxisilano
(APTES) , 3- (2-aminoetilamino) propiltrimetoxisilano (DATMS),
3- [2- (2-aminoetilamino) etilamino] propiltrimetoxisilano (TATMS) , [2- (ciclohexenil) etil] trietoxisilano (CHEETES),
viniltrimetoxisilano (VTMS), viniltrietoxisilano (VTES) o una mezcla de cualesquiera de dos o más de los anteriores. La especie condensable puede comprender al menos 80% de tetraalcoxisilano, o al menos 85, 90 ó 95% de tetraalcoxisilano, y puede comprende aproximadamente 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100% de tetraalcoxisilano. Ésta puede comprender menos de aproximadamente 20% de trialcoxisilano, por ejemplo menos de aproximadamente 15, 10 ó 5% de trialcoxisilano, y puede comprender aproximadamente 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 1 ó 0% de trialcoxisilano. Algunos trialcoxisilanos pueden únicamente ser utilizables en el proceso a baja concentración. La especie hidrolizable puede ser capaz de hidrolizarse para producir una especie condensable. La especie condensable puede ser una especie de silanol, y puede tener 1, 2 3 ó 4 grupos silanol por molécula. Ésta puede ser al menos un material parcialmente condensado que tiene 1 ó más grupos silanol por molécula. Ésta puede ser una mezcla de la especie silanol. La especie hidrolizable puede ser agregada a una emulsión, y puede infundirse dentro de las gotitas en emulsión. Comúnmente, un material en una emulsión puede dividirse entre las dos fases de la emulsión, siendo dependiente la división de las afinidades relativas del material para las dos fases. De este modo, un material altamente hidrofílico estará predominantemente localizado en
la fase acuosa, mientras que un material altamente hidrofóbico estará predominantemente en la fase hidrofóbica. Si el material se divide en la fase acuosa, y reacciona allí, entonces el material adicional puede dividirse en la fase acuosa. La adición de una especie hidrolizable a la fase continua (hidrofóbica) puede conducir a la división de la especie hidrolizable dentro de la fase acuosa (las gotitas en emulsión) , donde las condiciones pueden pertenecer a las que promueven la hidrólisis de la especie hidrolizable para formar la especie condensable, y la formación subsecuente de núcleos. La formación de los núcleos puede comprender al menos la condensación parcial de la especie condensable. La adición de la especie condensable puede o no ser acompañada por al menos la agitación o agitación en torbellino. El movimiento Browniano puede proporcionar suficiente energía para el mezclado sin mezclado externamente aplicado. El proceso de la presente invención puede comprender la hidrólisis de la especie hidrolizable y la condensación de la especie condensable resultante para formar núcleos dentro de las gotitas en emulsión. Si la especie hidrolizable es un alcoxisilano, y las gotitas en emulsión comprenden una solución acida de fluoruro, entonces el paso puede comprender el permitir tiempo suficiente para que el alcoxisilano se hidrolice, y para que la especie condensable resultante se condense para formar núcleos.
Alternativamente, los núcleos y/o las partículas primarias pueden ser formados bajo condiciones básicas y luego acidificados, y la emulsión resultante puede ser desestabilizada para formar la sustancia particulada. Alternativamente, los núcleos y/o las partículas primarias pueden ser preformados. Por ejemplo, los núcleos pueden ser partículas de sílice coloidal o ahumada, de algún otro material coloidal o pueden ser algunas otras partículas de tamaño apropiado. La especie condensable puede ser capaz de formar las partículas de la sustancia particulada a partir de los núcleos, por ejemplo, mediante aglomeración de los núcleos por condensación en presencia de los núcleos. La especie condensable puede ser compatible con los núcleos y puede ser capaz de reaccionar con los núcleos. En una modalidad de la invención, el proceso de provisión de la emulsión comprende los pasos de: proporcionar una emulsión básica, la emulsión comprende gotitas en emulsión dispersas en una fase líquida continua, - la adición de una primera especie hidrolizable a la emulsión; hidrolizar al menos parcialmente la primera especie hidrolizable dentro de las gotitas en emulsión para formar la especie condensable; - acidificar la emulsión para formar una emulsión
acidificada; y agregar una segunda especie hidrolizable a la emulsión acidificada . La emulsión básica puede ser una emulsión de agua en aceite y puede ser una microemulsión. Ésta puede comprender un surfactante, por ejemplo NP9, y puede comprender además un cosurfactante, por ejemplo 1-pentanol. El líquido continuo puede ser un hidrocarburo, por ejemplo ciclohexano. La primera y segunda especies hidrolizables pueden comprender alcoxisilanos, por ejemplo tetraalcoxisilanos, como se describe en otro sitio en la presente. Éstos pueden ser los mismos o pueden ser diferentes. El pH de la emulsión básica puede estar entre aproximadamente 8 y 13 o entre aproximadamente 8 y 10, 8 y 9, 9 y 13, 11 y 13 ó 9 y 11, y puede ser de aproximadamente 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5 ó 13 o puede ser mayor de 13. Después de la adición de la primera especie hidrolizable, la emulsión puede ser madurada por un tiempo suficiente para hidrolizar al menos parcialmente la primera especie hidrolizable dentro de las gotitas en emulsión, para formar la especie condensable, y para formar núcleos, por ejemplo partículas primarias. El tiempo de maduración puede estar entre aproximadamente 5 y 100 horas, o entre aproximadamente 5 y 80, 5 y 60, 5 y 40, 5 y 20, 10 y 100, 20 y 100, 50 y 100, 10 y 50, 20 y 5 ó 40 y 50 horas, y puede ser
de aproximadamente 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 92 ó 96 horas. El tiempo puede depender de la temperatura de maduración, que puede estar entre aproximadamente 15 y 95°C o alguna otra temperatura, por ejemplo a temperatura ambiente o la temperatura de la habitación. La temperatura puede ser por ejemplo de entre aproximadamente 20 y 80, 50 y 80, 10 y 50 ó 30 y 70°C, y puede ser de aproximadamente 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ó 90°C. Después de la acidificación de la emulsión, la emulsión acidificada puede ser agitada o madurada por al menos aproximadamente 1 hora o al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 horas, por ejemplo entre aproximadamente 1 y 10 horas o entre aproximadamente 1 y 8, 1 y 6, 1 y 4, 2 y 10, 5 y 10, 2 y 8 ó 4 y 6 horas, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 horas. La maduración puede estar entre aproximadamente 30 y 90°C, o entre aproximadamente 30 y 70, 30 y 50, 50 y 90, 70 y 90, 40 y 80 ó 30 y 70°C, por ejemplo aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ó 90°C. La adición de la segunda especie hidrolizable puede ser conducida durante o la maduración de este paso final de agitación o maduración. Antes o concurrentemente con la adición de la segunda especie hidrolizable, un surfactante, opcionalmente el mismo que el surfactante utilizado en la elaboración de la emulsión básica, junto con
un solvente y opcionalmente un cosurfactante (que puede ser el mismo que o diferente de aquel utilizado en la emulsión básica), puede ser agregado. El solvente puede ser miscible con o puede ser el mismo que la fase líquida continua. Las proporciones del solvente, el surfactante y el cosurfactante (si están presentes) pueden ser las mismas que o diferentes a las proporciones en la emulsión básica. Después de la adición de la segunda especie hidrolizable, la emulsión acidificada puede ser madurada por un tiempo suficiente para hidrolizar al menos parcialmente la segunda especie hidrolizable. Esto puede ser al menos de aproximadamente 24 horas, o al menos de aproximadamente 30, 36, 42, 48, 54 ó 60 horas, puede estar entre aproximadamente 24 y 60 horas, o entre aproximadamente 24 y 48, 48 y 60, 36 y 54 ó 40 y 50 horas, y puede ser de aproximadamente 30, 36, 42, 48, 54 ó 60 horas . Después del paso de formación de los núcleos, los procesos de la invención comprenden el paso de combinar un líquido coalescente con la emulsión para formar la sustancia particulada. El paso de combinación puede comprender la adición de la emulsión a un líquido de coalescencia, o puede comprender la adición del líquido de coalescencia a la emulsión. La adición puede comprender el goteo, el vaciado o la adición de otro modo, y puede ser acompañada por agitación, agitación en torbellino, mezclado, revoltura, etc.
y puede ser lograda rápidamente o lentamente. La adición puede ser una velocidad entre aproximadamente 1 y 1000 ml/minuto, o entre aproximadamente 1 y 500 ml/minuto, 1 y 200, 1 y 100, 1 y 50, 100 y 1000, 500 y 1000, 10 y 500 ó 100 y 500 ml/minuto, y puede ser a una velocidad de aproximadamente 1, 2, 5, 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ó 1000 ml/minuto, o puede ser a alguna otra velocidad. Después de la adición, se puede dejar tiempo adicional para que proceda la coalescencia de los núcleos. El tiempo adicional puede ser hasta de aproximadamente 10 horas, o hasta de aproximadamente 5, 2 ó 1 hora, o hasta aproximadamente 30, 20, 10, 5, 2, 1 ó 0.5 minutos, y puede ser de aproximadamente 0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 ó 50 minutos, o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 9 ó 10 horas. El líquido de coalescencia puede ser un líquido que es miscible con la fase continua y las gotitas en emulsión. Éste puede comprender un líquido polar, y puede ser por ejemplo acetona o etanol. Éste puede comprender una mezcla de líquidos. Éste puede comprender por ejemplo una mezcla de un líquido desestabilizador, tal como un líquido polar, y un líquido no polar. El líquido no polar puede ser el mismo que la fase continua de la emulsión, o puede ser diferente. Por ejemplo, el líquido de coalescencia puede ser una mezcla de acetona y ciclohexano o una mezcla de etanol y ciclohexano. La proporción de líquido desestabilizador al
líquido no polar puede estar entre aproximadamente 1:3 y 3:1 p/p o v/v, y puede estar entre aproximadamente 1:3 y 2:1, 1:3 y 1:1, 1:3 y 1:2, 1:2 y 3:1, 1:1 y 3:1 ó 2:1 y 3:1, y puede ser de aproximadamente 3:1, 2:1, 1:1, 1:2 ó 1:3 p/p o v/v. La cantidad de líquido de coalescencia puede ser suficiente para provocar la formación de la sustancia particulada. Puede ser suficiente provocar la coalescencia de los núcleos. El líquido de coalescencia puede estar en una cantidad que no conduzca a la formación de un gel. La cantidad de líquido de coalescencia puede estar entre aproximadamente 2 y 6 ml por ml de emulsión, y puede estar entre aproximadamente 3 y 5 ó 2 y 4 ó 4 y 6 ml por ml de emulsión, y puede ser de aproximadamente 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5 ó 6 ml por ml de emulsión, y puede ser alguna otra cantidad dependiendo de la naturaleza de la fase continua y del líquido de coalescencia . El proceso puede también comprender uno o más de los pasos de: separar la sustancia particulada de la fase líquida continua, lavar la sustancia particulada, y secar y/o liofilizar la sustancia particulada. La separación puede comprender uno o más de sedimentación, centrifugación, decantación, ultracentrifugación, filtración, microfiltración o algún otro
proceso de separación adecuado. El lavado puede comprender la exposición de la sustancia particulada a un solvente adecuado, agitando opcionalmente el solvente, y luego separando el solvente de la sustancia particulada. Éste puede comprender la suspensión de la sustancia particulada en el solvente, o puede comprender el paso del solvente a través de la sustancia particulada. El lavado puede eliminar al menos parcialmente el surfactante de la sustancia particulada. El solvente puede ser un solvente para el surfactante. El solvente para el lavado de las partículas puede depender de la solubilidad y el tamaño molecular del impurificante. Si el impurificante es altamente soluble en los solventes polares tales como acetona o solventes menos polares tales como cloroformo, los solventes no polares pueden ser utilizados para el lavado de las partículas. Ya que el balance hidrolífico-lipofílico (HLB por sus siglas en ingles) el surfactante es comúnmente alrededor de 10, el surfactante es en general soluble en los solventes polares o no polares. El secado puede comprender la exposición de la sustancia particulada a un gas, por ejemplo aire, nitrógeno, dióxido de carbono o mezclas de los mismos. El gas puede ser un gas anhidro, y puede ser secado antes del uso. La exposición puede comprender el paso del gas sobre o a través de la sustancia particulada, y puede comprender la succión del gas a través de la sustancia particulada.
Alternativamente, el secado puede comprender la exposición de la sustancia particulada a un vacío parcial. El vacío parcial puede tener una presión absoluta de menos de aproximadamente 0.5 barias, o menos de aproximadamente 0.2, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 ó 0.001 barias, y puede tener una presión absoluta de aproximadamente 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.05, 0.02, 0.01, 0.005, 0.002 ó 0.001 barias. El secado puede ser conducido a una temperatura por debajo de la temperatura de degradación de la sustancia liberable, y puede depender por lo tanto de la naturaleza de la sustancia liberable. El secado puede ser conducido por ejemplo a menos de aproximadamente 100°C, o menos de aproximadamente 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 ó 20°C, y puede ser conducida aproximadamente a 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ó 100°C o en alguna otra temperatura adecuada. La sustancia liberable que no ha sido incorporada dentro de las partículas puede ser recuperada del líquido de coalescencia y reutilizada, si se requiere. Un ejemplo de un proceso para producir la sustancia particulada es resumido en la Figura 1 y puede ser descrito como sigue: 1. Una microemulsión estable es preparada al mezclar un surfactante, un solvente no polar, una solución acuosa que contiene la sustancia liberable (por ejemplo el fármaco) y un catalizador para la reacción de sol-gel
(por ejemplo ácido F~) . 2. La especie hidrolizable (por ejemplo TMOS: tetrametoxisilano) es luego agregada a la microemulsión y se deja difundir lentamente hacia los combinados acuosos (por ejemplo el núcleo de las gotitas en emulsión) donde éste sufre hidrólisis, conduciendo a la formación del núcleo, por ejemplo partículas primarias sólidas . 3. Después de la formación de los núcleos, un solvente polar (por ejemplo acetona), opcionalmente mezclado con un solvente no polar (por ejemplo ciclohexano) , es combinado con la mezcla para desestabilizar la emulsión y hacer coalescer los núcleos sólidos, produciendo de este modo partículas más grandes, que se precipitan de la fase continua. En este paso, el o los solventes pueden ser agregados a la mezcla, o la mezcla puede ser agregada a el o los solventes. 4. Las partículas son luego lavadas, y liofilizadas. Los parámetros de emulsión (proporción de surfactante/agua, proporción TMOS/agua) así como la naturaleza, el volumen y la manera en que es agregado el líquido de coalescencia, pueden controlar el tamaño de partícula final y la distribución de las mismas. El crecimiento de las partículas precursoras sólidas dentro de las gotitas de una emulsión, es gobernado
por los mismos mecanismos que en la suspensión coloidal: la nucleación y el crecimiento ya sea por coagulación o agregación de maduración. Como en la suspensión coloidal, la nucleación en las emulsiones agua en aceite tiene lugar cuando la concentración de la especie condensable presente en las gotitas (la fase discontinua) excede el umbral de nucleación [Cn] . La única diferencia entre ésta y la suspensión coloidal clásica es que, en emulsiones, la solución está compartimentalizada en gotitas pequeñas. De este modo, la concentración de la especie condensable puede cambiar del combinado acuoso a combinado acuoso (por ejemplo de gotita a gotita) . En otras palabras, en emulsiones el número de moléculas de la especie condensable se incrementa con su supersaturación promedio, hasta que la concentración promedio por combinado es mayor que [Cn] . Con base en estas consideraciones, el número de núcleos se incrementa conforme se incrementa la concentración de la especie condensable, y disminuye con el número de gotitas. Ya que el número de moléculas de la especie condensable es proporcional a la cantidad de agua libre disponible por micela, el número de núcleos se incrementa con el incremento del contenido de agua libre. En otras palabras, el número de núcleos se incrementa con la proporción de agua a surfactante (el agua libre puede ser
contrastada con el agua enlazada, por ejemplo el agua que solvata la cabeza hidrofílica del surfactante y que no participa en la hidrólisis de la especie hidrolizable, por ejemplo alcóxido de silicio. La cantidad de agua libre depende de la naturaleza del surfactante (el tamaño y la naturaleza de la cabeza hidrofílica) y la proporción agua a surfactante) . Otra característica específica de las emulsiones, es que las gotitas en emulsión son capaces de intercambiar sus núcleos durante la colisión. Un incremento en la velocidad de intercambio inter-micelar puede inducir una redistribución de la especie condensable antes de que la supersaturación alcance el umbral de nucleación. De este modo, el incremento de la colisión de las micelas puede conducir a una disminución en la velocidad de nucleación. Como con las suspensiones coloidales acuosas, el crecimiento de las partículas sólidas en emulsiones sigue la nucleación. A una primera aproximación, los combinados acuosos (gotitas de fase discontinua) pueden ser observados como micro-reactores en los cuales tiene lugar el crecimiento de las partículas, por la adición de la especie condensable a los núcleos. De este modo, entre mayor sea el número de núcleos, más pequeños son los núcleos. Similarmente, para un número fijo de núcleos, entre más alta sea la supersaturación en el combinado acuoso, más grandes son los núcleos
resultantes . Como se mencionó anteriormente, las emulsiones son sistemas dinámicos y las gotitas en emulsión colisionan constantemente una con la otra, intercambiando el contenido de su núcleo acuoso en el proceso. El crecimiento de las gotitas puede tener lugar mediante colisión de los combinados que contienen los núcleos sólidos o los núcleos con combinados supersaturados que contienen únicamente especies condensables. En otras palabras, el crecimiento puede tener lugar mediante el consumo de las micelas insaturadas (en un proceso afín a la coalescencia) . De este modo, el tamaño de partícula final de las gotitas se incrementa con el número de colisiones o intercambios micelares. La catálisis básica de las reacciones sol-gel promueve la hidrólisis/condensación y, de manera más importante, la disolución. Cuando se combinan con micro-emulsiones, la química de sol-gel catalizada por base, conduce a una nucleación rápida debido a la alta velocidad de hidrólisis. La rápida condensación conduce a un rápido consumo de todas las especies condensables dentro de las micelas, y el crecimiento adicional tiene lugar mediante maduración y depuración de otros combinados micelares. Las altas velocidades de disolución aseguran la producción de partículas esféricas mediante la maduración de los agregados formados durante la colisión de las gotitas que contienen los
núcleos (ver Figura 26) . De este modo, con referencia a la Figura 26, una vez que los núcleos se han formado dentro de las gotitas de la emulsión, la catálisis básica conduce a una hidrólisis rápida y al crecimiento de las partículas, mientras que la catálisis acida no promueve el crecimiento. Si la emulsión es desestabilizada de una manera controlada como se describe en la presente invención, son formados canales polares, conduciendo al crecimiento coloidal para formar partículas nanoporosas en el intervalo de aproximadamente 30 a 1000 nm de diámetro, o aproximadamente 50 a 500 nm. La catálisis acida promueve la hidrólisis pero impide la condensación y la disolución (excepto a pH muy bajo, por ejemplo pH = 0) . En consecuencia, para la síntesis en emulsión de las partículas desilice utilizando catálisis acida, muchos núcleos son generados, pero es observado muy poco crecimiento. De hecho, no se observaron partículas sólidas en las emulsiones catalizadas por acido incluso después de 48 horas de maduración. Un catalizador de condensación tal como un fluoruro debe ser introducido para producir partículas sólidas. Incluso en este caso, los núcleos permanecen muy pequeños (por ejemplo aproximadamente 10 nm) como es revelado por el análisis de TEM directo de las emulsiones antes de la desestabilización (ver FiguraS 11a-lid) . En esta etapa, es probable que los núcleos sean
agregados suaves de polímero lineal. Éstos parecen ser sólidos cuando son observados mediante TEM debido al secado intrínseco para muestrear la preparación. Esto sugiere que, en contraste a la catálisis básica, no tiene lugar la coalescencia entre las gotitas durante las colisiones ínter-micelares. Las partículas crecen para llenar el núcleo de las gotitas al consumir lentamente toda la especie condensable presente en su combinado. Esto es confirmado por la Dispersión de Neutrones de Ángulo Pequeño (SANS por sus siglas en ingles) (los resultados son resumidos en la Tabla 1), que muestra que el tamaño de partícula después de 5 días de maduración permanece similar al tamaño de partícula inicial . Tabla 1: datos de SANS
La base de la presente invención es la desestabilización de una emulsión utilizando un líquido polar como un líquido de coalescencia, o como un componente del mismo, para inducir la coalescencia de las gotitas en emulsión acuosa y de este modo iniciar el crecimiento y la
agregación de los núcleos. La adición de agua (un solvente altamente polar) se sabe que hincha las gotitas en emulsión y produce partículas más grandes. Esto funciona hasta una cierta cantidad de agua, después de los cual son formados dominios de fase múltiple (por ejemplo fase acuosa y emulsión) . En el caso de la acetona, los experimentos de SANS revelan la adición de una pequeña cantidad de acetona que conduce a un hinchamiento significativo de los núcleos de las gotitas (ver Tabla 1) . Esto sugiere que la acetona induce la coalescencia de las gotitas pequeñas dentro de las gotitas más grandes. En contraste al agua, la adición de una cantidad más grande de acetona, no conduce a la formación de dos fases distintas
(por ejemplo agua y emulsión inversa) . De hecho lo que se observa cuando la desestabilización es exitosa es la precipitación lenta de las partículas a partir del sistema de fase simple (por ejemplo acetona + ciclohexano + agua + surfactante) . La desestabilización del sistema en emulsión parece ir a través de los siguientes pasos: Paso 1: cuando la acetona es agregada, las gotitas comienzan a hincharse. • Paso 2: conforme se agrega más acetona, los canales abiertos son creados entre los núcleos de las gotitas formando una fase asociada similar a laminilla o
1
estructura bicontinua. Este fenómeno ha sido observado para la solución de NP5/agua/heptano a una alta proporción de agua a surfactante (C-L Chang, HS Fogler,
Langmuir 1997 , 13, 3295-3307). • Paso 3: la adición posterior de la acetona conduce al hinchamiento de los canales y al final a la destrucción de la estructura de emulsión, revirtiéndose el sistema a una fase simple de solventes mezclados (ciclohexano + agua + acetona) donde el surfactante es molecularmente disperso como en una solución verdadera. El hinchamiento en el canal acuoso permite que los núcleos y otras especies condensables reaccionen libremente, formando partículas por crecimiento coloidal clásico
(por ejemplo la adición del monómero hidrolizado a los núcleos) . Es importante hacer notar que este proceso de desestabilización es también un proceso cinético con una competencia entre la velocidad de coalescencia de las gotitas en emulsión (y la formación resultante de los canales abiertos) con la velocidad de reacción sol-gel (por ejemplo la velocidad de producción de sílice) . Utilizando el modelo mecanístico detallado anteriormente, es posible explicar la influencia de los diferentes parámetros de procesamiento sobre la desestabilización de la emulsión y la morfología de las
partículas finales. Después de la adición del líquido de coalescencia, pueden ser observados cuatro diferentes tipos de comportamiento : • La suspensión permanece clara: no se forman partículas y la desestabilización no es efectiva. La suspensión permanece inicialmente clara y se forma un gel muy lentamente. El gel final aparece como una estructura en forma de esponja, en contraste a los geles coloidales, los cuales aparecen como cuerdas encoladas de partículas. Una desestabilización muy lenta conduce a una agregación lenta de los núcleos de aproximadamente
nm de diámetro en una estructura de gel similar a una esponja tridimensional. • La suspensión forma un gel inmediatamente. El gel final es coloidal, por ejemplo las partículas se fusionan entre sí en una red tridimensional. La desestabilización parcial de las emulsiones conduce a la formación de canales de agua, que induce que algunas partículas crezcan, pero la desestabilización no es
"fuerte" o lo suficientemente rápida y las partículas parcialmente desarrolladas se agregan entre sí. • La suspensión forma partículas de tamaño submicrónico con un tamaño de partícula medio de entre aproximadamente 30 y 1000 nm, o aproximadamente 50 y 300
nm o aproximadamente 150 y 500 nm. Los canales han sido hinchados (o incluso destruidos formando una fase simple) liberando de este modo los núcleos micelares y haciendo posible que sus contenidos de especie condensable participen en el crecimiento de las partículas . Utilizando estos mecanismos es posible postular explicaciones de la influencia de diferentes parámetros de procesamiento . El incremento de la concentración del surfactante se sabe que incrementa la estabilidad de las microemulsiones. Correspondientemente, para una cantidad fija del líquido de coalescencia (por ejemplo acetona), las emulsiones con concentraciones de surfactante cada vez mayores son más difíciles de desestabilizar y dan como resultado la gelificación lenta de los núcleos (ver Figura 2a-2d) . Como se esperaba, un incremento en la cantidad del precursor de sílice conduce a un incremento en el tamaño de partícula. A pH ácido la velocidad de hidrólisis del alcóxido es alta y la velocidad de condensación baja, lo cual significa que el número de moléculas monoméricas es alto y el número de núcleos permanece bajo. Conforme se incrementa la cantidad del precursor de sílice, el número de moléculas precursoras hidrolizadas se incrementa significativamente más que el número de nuevos núcleos. Cuando ocurre la
desestabilización, esto conduce a una mayor proporción de monómero a núcleos y de este modo a partículas más grandes. Aparte del caso de Tritón X-100, el cual forma partículas antes de la desestabilización, dos surfactantes que produjeron partículas submicrónicas fueron NP5 y NP6, los cuales tienen HLB's intermedios alrededor de 10. Un HLB de 10 indica una naturaleza fuertemente anfifílica (por ejemplo hidrofilicidad e hidrofobicidad balanceadas) y denota una interacción molecular de fuerza media entre la cabeza polar de un surfactante y el agua proveniente de la gotita. Tal interacción media conduce a un alto contenido de agua hasta la coalescencia de las gotitas, y la formación de canales abiertos conforme el surfactante con más débil y más fuerte interacción con el agua, permanece como gotitas dispersas. Esto refuerza la importancia de la formación de canales de agua durante la desestabilización, para proporcionar una trayectoria para que el precursor hidrolizado sin reaccionar migre desde su "prisión" micelar original hacia los núcleos y de este modo proporcione materiales para el rendimiento de las partículas. Para HLB<10, no fueron detectadas partículas, sugiriendo que la adición de acetona no tiene éxito en la desestabilización de la emulsión. En contraste, para HLB>10, la desestabilización es a menudo demasiado rápida y los núcleos se agregan para formar un gel antes de que pueda ocurrir el crecimiento, aunque el Tween 21 (HLB
13.3) ha sido encontrado como utilizable. De este modo, un HLB de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 14 puede ser un lineamiento adecuado para el surfactante. Parece también que los surfactantes que tienen entre aproximadamente 4 y 6 unidades oxietileno en su grupo de cabeza polar pueden ser adecuados para el uso en la invención. Cuando la concentración del surfactante es incrementada, es observada una tendencia similar, con la diferencia de que la desestabilización por el Brij 30 produce un gel coloidal con partículas fusionadas, sugiriendo una desestabilización parcial y la coalescencia de las gotitas de agua. La reducción importante en el tamaño de partícula promedio obtenido con NP6 puede ser explicado por un incremento en la estabilidad de la emulsión debido a un incremento en la concentración del surfactante. TMOS se hidroliza más rápidamente que TEOS y en consecuencia para una concentración idéntica de alcóxido dentro de una gotita, el sistema de TMOS puede alcanzar el umbral de nucleación más rápidamente, conduciendo así a la producción de más núcleos. Este número grande núcleos en el sistema de emulsión de TMOS conduce, después de la desestabilización, a la producción de partículas más pequeñas (ya que más núcleos para la misma cantidad de monómero hidrolizado proporciona más y más pequeñas partículas). Fue utilizada una amplia de gama de líquidos
orgánicos con diferentes constantes dieléctricas y polaridades, ya sea por si solos o en combinación con ciclohexano, para desestabilizar una emulsión de NP5 y producir partículas submicrónicas (ver Tabla 2, que muestra los líquidos de acuerdo a su constante dieléctrica) . El efecto sobre el sistema en emulsión y la morfología final difiere drásticamente dependiendo de su polaridad y de su miscibilidad respectiva en agua y ciclohexano. Tabla 2: Líquido de coalescencia clasificado de acuerdo a su constante dieléctrica Parámetros experimentales: NP-5: 10 mmol/pH 1 NH03, agua 60 mmol/F": 0.06 mmol /ciclohexano : 50 ml/TMOS: 6 mmol /maduración 48 hora s /de sest abi 1 i zar por 100 ml después del solvente y 100 ml de ciclohexano.
Éstas pueden ser clasificadas en tres categorías diferentes : • Solventes polares (por ejemplo acetonitrilo, metanol),
que son únicamente miscibles en agua. La adición de tales solventes conduce a un hinchamiento micelar hasta que el sistema sale del dominio de fase W/O hacia una región de dos fases (fase acuosa:W/0 emulsión). • Solventes no polares (por ejemplo tolueno, benceno, cloroformo) , los cuales son únicamente miscibles en ciclohexano. La adición de tal solvente conduce a la contracción de las micelas, pero una gran cantidad da como resultado la producción de una mezcla difásica. • Solventes de polaridad media (desde etanol hasta metiletilcetona), que son miscibles en agua y ciclohexano. La adición incluso en grandes cantidades siempre conduce a la producción de un sistema de una sola fase. Como se describe anteriormente, la clave para una desestabilización exitosa es la formación de un sistema de fase simple que permitirá que el contenido de núcleo de la gotita participe libremente en el crecimiento coloidal y la producción consecuente de partículas submicrónicas. Fenomenológicamente, estos pueden ser realizados ya sea por un hinchamiento sustancial del canal de fase con la formación de una fase bicontinua o simplemente mediante la destrucción de la emulsión en una solución clásica. En otras palabras, para producir partículas submicrónicas, la adición del líquido de coalescencia debe formar un sistema de fase simple
(o bicontinua). Esto requiere que el líquido de coalescencia sea miscible en agua y ciclohexano. Es importante enfatizar que este requerimiento de miscibilidad es necesario pero no suficiente. La cantidad utilizada, así como la constante dieléctrica del líquido desestabilizador (que es mezclado con un líquido no polar para generar el líquido de coalescencia) es importante para el control de la formación de partículas submicrónicas. Dos líquidos desestabilizadores (etanol y acetona) han sido exitosamente utilizados para producir las partículas submicrónicas, aunque siete líquidos diferentes (ver Tabla 2) fueron probados y se encontró que producen una emulsión de fase simple después de la adición. Esto subraya el hecho de que la miscibilidad en la fase continua y el agua, así como la producción de un sistema de fase simple después de la desestabilización, no es suficiente para asegurar la producción de partículas submicrónicas. Los inventores lanzan la hipótesis de que la polaridad o la constante dieléctrica del líquido desestabilizador juega un papel clave en la desestabilización exitosa de la emulsión y la producción de las partículas submicrónicas. La Figura 20 revela que cuando la polaridad del agente desestabilizador es disminuida al sustituir gradualmente la acetona por n-propanol, la morfología del producto final lentamente evoluciona desde partículas
submicrónicas esféricas hasta partículas submicrónicas agregadas que gradualmente se degradan en una sarta fusionada de "perlas" y al final hasta un gel condensado. Esta evolución sugiere que, conforme es disminuida la constante dieléctrica de la mezcla, la energía de desestabilización de líquido desestabilizador es también reducida. Fenomenológicamente, parece que los canales de fase acuosa formados durante la desestabilización no son lo suficientemente grandes para permitir que el contenido de micelas fluya libremente y participe en el crecimiento de las partículas. En otras palabras, conforme disminuye la energía de desestabilización, la movilidad del precursor hidrolizado se vuelve menor que su velocidad de condensación y de este modo la gelificación tiene lugar en vez del crecimiento de las partículas, conduciendo la gelificación del contenido de agua o la fase bicontinua. Esta hipótesis es además confirmada por la estructura muy abierta del gel observado en TEM (Figura 20c y 20d en comparación a 19d-19f) . Por otra parte, cuando la acetona es reemplazada por etanol, la morfología evoluciona progresivamente hacia agregados densos de partículas submicrónicas y de tamaño micrónico. Esta tendencia puede ser explicada por un incremento en la velocidad de desestabilización en una reducción posterior de la velocidad de condensación por una re-esterificación de los silicatos hidrolizados en presencia
de etanol en exceso. Esta disminución en la velocidad de condensación puede conducir a la producción de partículas submicrónicas no completamente condensadas "suaves" que se agregan debido al movimiento Browniano en cúmulos densos. Después del concepto de "energía de desestabilización" discutido anteriormente, parece que la cantidad de energía de desestabilización (por ejemplo una combinación del volumen y la constante dieléctrica) necesita ser lo suficientemente alta para desestabilizar completamente la emulsión, liberando de este modo los contenidos (por ejemplo los alcóxidos hidrolizados) de la gotita en emulsión para permitirles participar en el crecimiento de las partículas . Si es introducido insuficiente líquido de coalescencia, es gradualmente formado un gel por la colisión de los núcleos. Si es utilizado demasiado líquido de coalescencia entonces el sistema puede formar un gel (como en la Figura 17f para el etanol) . Como se puede observar a partir de la Tabla 3 y la Figura 7a-7f, conforme disminuye la constante dieléctrica del líquido no polar del líquido de coalescencia, la morfología del producto final se degrada a partir de las partículas esféricas bien formadas en ciclohexano (ver Figuras 6a-6c) hasta las partículas submicrónicas agregadas en dodecano y decano (Figura 7e y 7d) , la sarta de partículas fusionadas en
octano y los particulados y gel condensado en hexano y éter de petróleo. De este modo, para una energía de desestabilización constante (por ejemplo la misma cantidad de acetona), la desestabilización disminuye con la constante dieléctrica cada vez menor del líquido desestabilizador, conduciendo de este modo gradualmente
(como se observa anteriormente cuando se reemplaza la acetona por un solvente menos polar) a la formación de una red tridimensional. Tabla 3: Influencia de diferentes líquidos no polares
* No aplicable debido a que el éter de petróleo es una mezcla de alcanos y la constante dieléctrica varía dependiendo de sus fracciones volumétricas respectivas
Es importante hacer notar que el líquido de coalescencia contenía 100 ml de ciclohexano, cambiando de este modo la polaridad promedio de la fase aceitosa después de la adición. La Figura 25 muestra la isoterma de adsorción de N2 de una muestra de partículas submicronicas preparadas a pH=l. Los valores clave (área superficial y volumen de poro) son también resumidos en la Tabla 4. Los picos en la distribución de tamaño de poro fueron determinados a partir de la Figura 38. La isoterma revela la presencia de dos regiones de porosidad, dentro de las partículas. Tabla 4: resultados de BET de las partículas de sílice submicrónicas
de las partículas corresponde a la superficie de las partículas densas de sílice de tamaño de alrededor de 6 nm. Esto confirma que el área superficial está relacionada a la superficie interna de las partículas y en consecuencia que las partículas submicrónicas son altamente porosas. Además, la proporción del volumen microporoso disminuye con un incremento en el pH por titulación de las gotitas antes de la desestabilización. Se sabe que la adición de base puede promover la condensación dentro de las gotitas, incrementando de este modo el número de partículas sólidas. Después de la desestabilización, esto incrementará la proporción de mesoporos. Éste proporciona un ejemplo de control de la estructura interna de las partículas y de este modo la cinética de liberación de las moléculas encapsuladas . Una consecuencia adicional de la desestabilización de la emulsión y el crecimiento coloidal por la migración del contenido del núcleo a través de canales de fase polar es la baja eficiencia de encapsulamiento de la sustancia liberable, por ejemplo un fármaco (ver Figura 21) . En la emulsión inicial, el fármaco está compartimentalizado dentro de las gotitas de agua. Si la nucleación y el crecimiento tienen lugar dentro del núcleo de la gotita antes de la desestabilización, entonces el fármaco es encapsulado en la sílice. Después de la desestabilización, los contenidos de las gotitas no condensadas (por ejemplo alcóxido de silicio
hidrolizado + fármaco libre) son diluidos en acetona. Aunque el alcóxido de silicio puede migrar hacia los núcleos y contribuir al crecimiento de las partículas submicrónicas, es improbable que mucho del fármaco será encapsulado en esta etapa. En resumen, las partículas submicrónicas pueden ser producidas por desestabilización de las emulsiones sol-gel catalizadas por ácido. Las partículas resultantes pueden ser utilizadas para encapsular y liberar moléculas pequeñas de una manera controlada en periodos prolongados de tiempo
(hasta 6 meses) . La estructura interna de las partículas de sílice submicrónicas, y de este modo la velocidad de liberación, pueden ser controladas por los parámetros iniciales de sol-gel tales como el pH . La eficiencia de encapsulamiento parece ser dependiente de la solubilidad del fármaco en la mezcla desestabilizadora . Las condiciones necesarias para lograr la desestabilización exitosa parecen ser: Un surfactante con un HLB (balance hidrofílico/lipofílico) entre 10 y 14. Esto se traduce en un buen balance entre las regiones lipofílica e hidrofílica del surfactante , lo cual es requerido para la formación de fases bicontinuas o cristales líquidos, lo cual permite la migración del alcóxido hidrolizado hacia los núcleos, y la participación en el proceso de
crecimiento de las partículas. Con el fin de lograr una desestabilización exitosa el surfactante debe tener una interacción molecular de fuerza media entre su cabeza polar y el combinado acuoso. Esta interacción molecular puede ser caracterizada por la huella digital del surfactante, la cual es calculada al dividir el área superficial de la superficie de la gotita de agua entre el número de agregación del surfactante. Una interacción media corresponde a una huella digital del surfactante entre 1.5 y 10 nm2 por molécula. Una huella digital del surfactante adecuada para un surfactante utilizable en la presente invención puede estar entre aproximadamente 1.5 y aproximadamente 10 nm2/molécula, o entre aproximadamente 1.5 y 5.2 y 5.3 y 5, 1.5 y 3.5 y 10, 2 y 10, 2 y 8, 2 y 6 ó 2 y 4 nm2/molécula, y puede ser de aproximadamente 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 nm2/molécula . Un líquido de coalescencia que no forma dos fases (por ejemplo, agua y la emulsión agua en aceite) cuando se agrega al sistema en emulsión. La formación de las dos fases conducirá a la nucleación heterogénea y a la segregación de las partículas en diferentes fases físicas. En términos del requerimiento de solubilidad, esto significa que el líquido de coalescencia debe ser miscible en las fases aceitosa y acuosa, es decir, debe
tener la polaridad apropiada. • La "energía de desestabilización" (por ejemplo una combinación de la polaridad y el volumen agregado) tiene que ser suficientemente alto para inducir la formación de canales y el flujo libre del contenido de núcleo de la gotita para participar en el crecimiento de los núcleos hacia una partícula submicrónica . Cuando disminuye la energía de desestabilización, ésta reduce la movilidad dentro del canal de fase polar y gradualmente conduce a una evolución de la microestructura final a partir de partículas submicrónicas discretas, a sartas de partículas coalescidas y gel condensado microporoso. Esto podría ser observado como un congelamiento gradual de la estructura bicontinua/canal . El proceso de la presente invención es capaz de producir partículas submicrónicas en un ambiente ácido mediante el uso de un mecanismo de sol-gel en una microemulsión. La catálisis acida es importante en la producción de partículas microporosas que pueden encapsular las moléculas pequeñas, tales como la doxorrubicina y liberarlas de una manera controlada. La presente invención utiliza un nuevo procedimiento para construir las partículas submicrónicas (por ejemplo en el intervalo nanométrico) en emulsión. De manera contraria al primer trabajo (WO01/62332
Barbé & Bartlett "Controlled reléase ceramic partióles, compositions thereof, processes of preparation and methods of use") en el cual fue necesario seleccionar los pares de surfactante/solvente para obtener una emulsión con el tamaño de gotita correcto para generar el tamaño de partícula final deseado, el método de la invención comienza con una microemulsión estable que tiene gotitas de aproximadamente 5 a 10 nm de diámetro, y luego desestabiliza la microemulsión para producir partículas de entre aproximadamente 30 y 100 nm, o aproximadamente 50 y 500 nm o aproximadamente 100 y 400 nm. La sustancia particulada de la invención que tiene un fármaco liberablemente inmovilizado en ésta y/o sobre ésta, puede ser utilizada en el tratamiento de una condición en un mamífero. El mamífero puede ser seleccionado del grupo que consiste de un humano, primate no humano, equino, murino, bovino, leporino, ovino, caprino, felino y canino. El mamífero puede ser seleccionado de un humano, mono, mico, caballo, res, oveja, perro, gato, cabra, llama, conejo y un camello, por ejemplo. La condición puede ser una enfermedad. La condición puede ser por ejemplo el cáncer, diabetes, disfunción hormonal, hipertensión, dolor (por ejemplo dolor tratable por morfina y/u opiáceos) o asma. La doxorrubicina puede ser encapsulada dentro de las partículas submicrónicas y liberarse gradualmente en
solución de PBS (solución salina amortiguada con fosfato). La presente invención puede ser también utilizada para la liberación controlada de otras sustancias, tales como colorantes fluorescentes, agentes radiofarmacéuticos, enzimas, catalizadores, hormonas, biocidas y/o otras sustancias. Las aplicaciones pueden incluir diagnóstico, radiodiagnóstico, radioterapia, biotecnología, bio-reactores, formación de imagen, etc. Ejemplos El siguiente procedimiento experimental general fue utilizado en los experimentos detallados más adelante para preparar las nanopartículas que contienen doxorrubicina, con las variaciones a partir de este procedimiento general detallado para los experimentos individuales: 1. Disolver NP-5 [nonilfenoxipolietoxietanol, C9H?9C6H4 (OCH2CH2)nOH, n=5] 4.40-8.80 g (10-20 mmol) en 50 ml de ciclohexano; 2. Agregar 1.08 ml de ácido nítrico diluido, pH 1
(equivalente a 60 mmol de agua) que contiene 0.06 mmol de NaF y 0.1-1.0 mg de doxorrubicina. Agitar por 20 minutos para producir una microemulsión; 3. Agregar 0.911 ml (6 mmol) de TMOS (tetrametoxisilano) al sistema anterior; 4. Madurar por agitación por 24 a 48 horas; 5. Vaciar la emulsión resultante en una mezcla agitada de
100 ml de acetona anhidra y 100 ml de ciclohexano, y agitar por 10 minutos, para desestabilizar la emulsión y hacer coalescer las partículas; 6. Después de la sedimentación, separar las partículas sólidas de la fase orgánica (líquida) y lavar las partículas tres veces con 50 ml de acetona cada vez. Alternativamente, las partículas pueden ser lavadas utilizando el procedimiento descrito en WO01/62332 (Barbé & Bartlett, "Controlled Reléase Ceramic Particles, Compositions Thereof, Processes of Preparation and Methods of Use") . 7. (Opcional) Mezclar las partículas sólidas con 5 a 10 ml de solución acuosa de cloruro de sodio con una concentración calculada para proporcionar al menos 85% de la masa seca del sólido total (por ejemplo sílice y cloruro de sodio) , luego liofilizar la solución para elaborar el producto seco final. Este procedimiento fue seguido (pasos 1 a 6) con las siguientes variaciones: 1. Efecto de concentración de NP-5 : Las partículas fueron sintetizadas utilizando los siguientes parámetros experimentales: agua (pHl) 60 mmol, F-
0.06 mmol, TMOS 6 mmol, ciclohexano (en el paso 1) 50 ml, maduración 48 horas y desestabilización con una mezcla de 100 ml de acetona/100 ml de ciclohexano. La concentración del
surfactante (NP-5) en el paso 1 fue variada de 0.2 mol/1 a 0.8 mol/1. Las microfotografías de TEM de las partículas resultantes se muestran en la Figura 2a-2d. Resultado: El tamaño de la partícula disminuyó con la concentración cada vez mayor del surfactante. Por arriba de 0.4 mol/1, no se observó coalescencia. 2. Efecto de la concentración de TMOS Las partículas fueron sintetizadas utilizando los siguientes parámetros experimentales: Surfactante NP-5 0.4 mol/1, proporción molar de F"
/TMOS 0.01, agua a pH 1, ciclohexano (en el paso 1) 50 ml, maduración por 48 horas y desestabilización con una mezcla de 100 ml de acetona/100 ml de ciclohexano. La concentración de TMOS en el paso 3 fue incrementada de 4 mmol hasta 12 mmol al tiempo que se mantenía el agua a la proporción molar de TMOS en 10. Las microfotografías de TEM de las partículas resultantes se muestran en la Figura 3a-3d. Resultado: Se encontró que el tamaño de partícula se incrementa con el contenido de TMOS. La coalescencia/fusión de las partículas en [TMOS] =12 mmol es significativa . 3. Efecto del tipo de surfactante Baja concentración : Los siguientes surfactantes fueron utilizados en lugar de NP-5 en el paso 1: (a) Brij 30 (HLB=9), (b) NP-5
(HLB=10), (c) NP-6 (HLB-10.9), (d) Tritón X-114 (HLB=12.4) con 1-pentanol 20 mmol (e) NP-9 (HLB-=13) con 1-pentanol 20 mmol (f) Tritón X-100 (HLB=13.5) con 1-pentanol 20 mmol. Las partículas fueron sintetizadas utilizando los siguientes parámetros experimentales: surfactante 0.2 mol/1, agua (pH 1) 60 mmol, F" 0.06 mmol, TMOS 6 mmol, en 50 ml de ciclohexano (en el paso 1), maduración 48 horas y desestabilización con una mezcla de 100 ml de acetona/100 ml de ciclohexano. Las microfotografías de TEM de las partículas resultantes se muestran en la Figura 4a-4f. Resultado: Los únicos sistemas para formar las esferas de tamaño submicrónico fueron aquellas con NP-5 y NP-6. No tuvo lugar ninguna desestabilización en la muestra Fig.4 (a). La morfología de "gotita coalescida" de la muestra Fig.4 (f) fue el resultado de la naturaleza inestable de la microemulsión utilizada en su síntesis. Alta concentración : Se condujeron los mismos experimentos que a baja concentración (arriba) , incrementando la concentración del surfactante en el paso 1 a 0.4 mol/1. Las microfotografías de TEM de las partículas correspondientes se muestran en la Figura 5a-5f. Resultado: Los únicos sistemas para formar las esferas submicrónicas a esta concentración surfactante fueron aquellas con NP-5. Todas las otras, con la excepción de
aquellas con las partículas producidas por NP-6 de diámetro menor de 20 nm, que sugieren que la microemulsión no es desestabilizada, y las partículas no coalescen, después de la adición de la acetona. El ligero crecimiento observado para los sistemas con NP-6 sugiere una desestabilización reducida.
4 . Efecto del co- surfactante : Las partículas fueron sintetizadas utilizando los siguientes parámetros experimentales: agua (pHl) 60 mmol, F" 0.06 mmol, TMOS 6 mmol, ciclohexano (en el paso 1) 50 ml, maduración 48 horas y desestabilización con una mezcla de 100 ml de acetona/100 ml de ciclohexano. El surfactante en el paso 1 fue: Fig.6 (a) NP-5 0.2 mol/1; Fig.6 (b) NP-5 0.4 mol/1; Fig.6 (c) NP-5 0.2 mol/1, 1-pentanol 0.2 mol/1. Las microfotografías de TEM de las partículas correspondientes se muestran en las Figuras 6a-6c. Resultado: No fue provocado ningún mejoramiento visible por la adición de un co-surfactante (por ejemplo surfactante) a la emulsión. El incremento de la concentración del surfactante (experimento 4 (b) ) fue más efectivo en el estrechamiento de la distribución del tamaño de partícula. 5. Efecto del solvente en mxcroemulsión Desestabilizado utilizando 100 ml de acetona/100 ml de diversos solventes no polares : Las partículas fueron sintetizadas utilizando los
siguientes parámetros experimentales: NP-5 10 mmol (0.2 mol/1), agua (pHl) 60 mmol, F" 0.06 mmol, TMOS 6 mmol, un solvente no polar (en el paso 1) 50 ml, maduración 48 horas y desestabilización con una mezcla de 100 ml de acetona/100 ml del solvente no polar. Se utilizaron varios solventes como la fase continua para la formación de las microemulsiones: Fig.7 (a) bencina de petróleo, 1-hexanol 20 mmol; Fig.7 (b) hexano, 1-hexanol 20 mmol; Fig.7 (c) octano, 1-hexanol 20 mmol; Fig.7 (d) decano, 1-hexanol 20 mmol; Fig.7 (e) dodecano, 1-hexanol 40 mmol; Fig.7 (f) tolueno. El hexanol fue agregado como un cosurfactante con el fin de obtener microemulsiones estables. Las microfotografías de TEM de las partículas correspondientes se muestran en las Figuras 7a-7f. Resultado: Algunas partículas submicrónicas fueron obtenidas para los experimentos 6d y 6e, sugiriendo que fue lograda una desestabilización controlada parcial (por ejemplo coalescencia de partículas) para las emulsiones sintetizadas en decano y dodecano. Desestabilizado por 50 ml de etanol/100 ml de ciclohexano : Se prepararon las mismas emulsiones que se describen en el Ejemplo 6, y se desestabilizaron utilizando una mezcla de 50 ml de etanol/100 ml de ciclohexano en el paso 5. Las microfotografías de TEM de las partículas correspondientes se muestran en las Figuras 8a-8f. Resultado: Fig.8a) bencina de petróleo/1-hexanol
mmol y Fig.db) hexano/1-hexanol 20 mmol, los sistemas formaron partículas submicrónicas. La coalescencia del octano/1-hexanol 20 mmol (experimento Fig.dc) dio como resultado un gel y no tuvo lugar ninguna coalescencia en decano o dodecano (experimentos Fig.dd y F?g.8e) . Microemulsiones de tolueno : Los siguientes surfactantes fueron utilizados en lugar de NP-5: F?g.9 (a) NP-5, F?g.9 (b) Tritón X-114 y F?g.9 (c) NP-9. Las partículas fueron sintetizadas utilizando los siguientes parámetros experimentales: surfactante 20 mmol
(09.2 mol/1), agua (pH 1) 40 mmol, F" 0.06 mmol, TMOS 6 mmol, tolueno 100 ml (en el paso 1 en lugar de ciclohexano) , maduración 24 horas y desestabilización con una mezcla de 100 ml de acetona/100 ml de ciclohexano. Las microfotografías de TEM de las partículas correspondientes son mostradas en la Figura 9. Resultado: Durante la síntesis, las partículas de sílice fueron aisladas de las emulsiones con el tiempo y éstas eventualmente formaron un gel con los tamaños de partícula promedio entre 10 y 50 nm. 6. Efecto del tiempo de maduración Las partículas fueron sintetizadas utilizando los siguientes parámetros experimentales: NP-5 10 mmol (0.2 mol/1), agua (pHl) 60 mmol, F" 0.06 mmol, TMOS 6 mmol y ciclohexano 50 ml . Esta emulsión fue madurada por: F?g.10
(a) 24 horas, Fig.10 (b) 48 horas, Fig.10 (c) 120 horas,
Fig.10 (d) 168 horas, antes de ser desestabilizada con una mezcla de 100 ml de acetona/100 ml de ciclohexano. Las microfotografías de TEM de las partículas correspondientes se muestran en las Figuras lOa-lOd. Resultado: El tiempo de maduración no tuvo influencia significativa en el tamaño de partícula final. 7. Efecto de la especie hidrolizable : Las partículas fueron sintetizadas utilizando los siguientes parámetros experimentales: NP-5 10 mmol (0.2 mol/1), TMOS o TEOS 6 mmol, agua (pHl) 60 mmol, F" 0.06 mmol, ciclohexano (en el paso 1) 50 ml, maduración 48 horas y desestabilización con una mezcla de 100 ml de acetona/100 ml de ciclohexano. Las microfotografías de TEM de las partículas antes y después de la desestabilización se muestran en las Figuras lla-lld. Resultado: Una comparación de las partículas antes y después de la desestabilización muestra claramente que la adición de acetona, la cual a la escala macroscópica da como resultado una desintegración de las microemulsiones estables en un precipitado blanco, induce a la escala microscópica crecimiento sustancial de las partículas. Las partículas finales muestran un tamaño de partícula ligeramente más grande cuando se utiliza TEOS como la especie hidrolizable.
8. Efecto de la condición de precipitación: Las partículas fueron sintetizadas utilizando los siguientes parámetros experimentales: NP-5 10 mmol (0.2 mol/1), agua (pHl) 60 mmol, F" 0.06 mmol, TMOS 6 mmol, ciclohexano (en el paso 1) 50 ml, maduración 48 horas. La desestabilización del paso 5 fue luego conducida de diferentes maneras. 8-1 Secuencia de adición Fig.12 (a) Mediante vaciado de 50 ml de acetona en la microemulsión; Fig.12 (b) mediante vaciado de la microemulsión en 50 ml de acetona; Fig.12 (c) mediante vaciado de la microemulsión en 100 ml de acetona; Fig.12 (d) mediante vaciado de microemulsión en una mezcla de 100 ml de acetona y 100 ml de ciclohexano. Las microfotografías de TEM de las partículas correspondientes se muestran en las Figuras 12a-12d. Resultado: Aunque las partículas submicrónicas son obtenidas en todos los casos, el vaciado de la microemulsión en una solución diluida de acetona (experimento 11-ld) parece haber producido las muestras más homogéneas y menos agregadas . 8-2 Cantidad de líquido de coalescencia Mediante vaciado de la microemulsión: Fig.13 (a) en una mezcla de 50 ml de acetona y 50 ml de ciclohexano; Fig.13 (b) en una mezcla de 100 ml de acetona y 100 ml de
ciclohexano; Fig.13 (c) en una mezcla de 150 ml de acetona y 150 ml de ciclohexano; Fig.13 (d) en una mezcla de 200 ml de acetona y 200 ml de ciclohexano. Las microfotografías de TEM de las partículas correspondientes se muestran en las Figuras 13a-13d. Resultado: Aunque la desestabilización con una mezcla de 50 ml de acetona/50 ml de ciclohexano (experimento ll-2a) produjo partículas submicrónicas, las partículas fueron agregadas en gran medida y fusionadas entre sí. El incremento del volumen de la mezcla desestabilizadora conduce a una menor agregación pero a un incremento en la polidispersión. 8-3 Efecto de la condición de precipitación: Las partículas fueron desestabilizadas utilizando una mezcla de 100 ml de acetona/100 ml de ciclohexano. La desestabilización (paso 5) fue realizada al vaciar la microemulsión en: Fig.14 a) un recipiente de 1 litro agitado con una barra de agitación magnética en forma de varilla; b) un recipiente de 250 ml agitado con una barra de agitación magnética en forma de cruz; c) un recipiente de 250 ml agitado con una barra de agitación en forma de varilla; d) en un recipiente de 250 ml sometido a ultrasonicación por 5 minutos; y e) con cloruro de sodio (0.2 M) agregado. En e) , se agregó 0.135 ml de una solución de cloruro de sodio a 1 mol/1, dentro de la microemulsión, la cual fue luego agitada
hasta que estuvo clara, y luego desestabilizada al vaciar dentro de una mezcla agitada de acetona y ciclohexano en un recipiente de 250 ml agitado con una barra de agitación en forma de varilla, agitando a velocidad de agitación moderada. Las microfotografías de TEM de las partículas correspondientes son presentadas en la Figura 14a-14e. Resultado: El volumen del recipiente, la forma de la barra de agitación magnética, el ultrasonido, o la adición de sal no tuvieron efecto significativo sobre el tamaño de partícula final. 9. Efecto del pH de las gotitas en emulsión : Las partículas fueron sintetizadas utilizando los siguientes parámetros experimentales: NP-5 10 mmol (0.2 mol/1), agua
(pHl) 60 mmol, F~ 0.06 mmol, TMOS 6 mmol, ciclohexano (en el paso 1) 50 ml, maduración 48 horas. El pH de las gotitas de agua fue ajustado de
1.5 hasta 7 por la adición de base (solución acuosa de hidróxido de sodio 1 M) , antes de la desestabilización en una mezcla de 100 ml de acetona/100 ml de ciclohexano. Las microfotografías de TEM de las partículas correspondientes se muestran en la Figura 15. Resultado: No se observó ningún efecto significativo del pH sobre la morfología de las partículas finales. 10. Influencia de la naturaleza en la cantidad de agregado del líquido desestabilizador 10.1 Acetona Las partículas fueron sintetizadas utilizando los siguientes parámetros experimentales: NP-5 10 mmol (0.2
mol/1), agua (pHl) 60 mmol, F" 0.06 mmol, TMOS 6 mmol, ciclohexano (en el paso 1) 50 ml, maduración 48 horas. La microemulsión fue luego desestabilizada en el paso 5 utilizando una mezcla de 100 ml de ciclohexano y diferentes cantidades de acetona: Fig.16 (a) 10 ml, Fig.16 (b) 20 ml, Fig.16 (c) 50 ml, Fig.16 (d) 100 ml y Fig.16 (e) 200 ml . Las microfotografías de TEM de las partículas correspondientes se muestran en las Figuras 16a-16e. Resultado: En los experimentos 10-la y 10-lb (10 ó 20 ml de acetona), no se observó precipitado inmediato, no obstante se formó gradualmente un gel con el tiempo. En el experimento 10-lc (50 ml de acetona), el gel se formó inmediatamente. En los experimentos 10-ld y 10-ld (100 ml o 200 ml de acetona), se formaron partículas submicrónicas esféricas. 10-2 Etanol Las partículas fueron sintetizadas utilizando los siguientes parámetros experimentales: NP-5 10 mmol (0.2 mol/1), agua (pHl) 60 mmol, F" 0.06 mmol, TMOS 6 mmol, ciclohexano (en el paso 1) 50 ml, maduración 48 horas. La microemulsión fue luego desestabilizada en el paso 5 utilizando una mezcla de 100 ml de ciclohexano y diferentes cantidades de etanol: Fig.17 (a) 5 ml ; Fig.17 (b) 10 ml; Fig.17 (c) 20 ml; Fig.17 (d) 35 ml ; Fig.17 (e) 50 ml ; Fig.17 (f) 80 ml; Fig.17 (g) 100 ml . Las microfotografías de TEM de
las partículas correspondientes se muestran en las Figuras 17a-17f . Resultado: Cuando la cantidad del etanol fue de 5 ó 10 ml (experimentos 10-2a bd (10-2b), no se observó ningún precipitado inmediato, no obstante se formó gradualmente un gel con el tiempo. Con 20 ml de etanol (experimento 10-2c) se formó inmediatamente un gel después de vaciar la emulsión en la mezcla de ciclohexano/etanol . A partir de 35 ml a 80 ml de etanol (experimentos 10-2d a 10-2f ) , fueron formadas partículas submicrónicas esféricas aunque la agregación se incrementó con la cantidad de etanol, dando origen a una mezcla de partículas y de gel para la muestra desestabilizada con 80 ml de etanol (experimento 10-2f ) . Un incremento adicional en la cantidad de etanol (experimento 10-2g) condujo a la gelificación. 10-3 Mezcla de acetona y etanol Las partículas fueron sintetizadas utilizando los siguientes parámetros experimentales: NP-5 10 mmol (0.2 mol/1), agua (pHl) 60 mmol, F" 0.06 mmol, TMOS 6 mmol, ciclohexano (en el paso 1) 50 ml, maduración 48 horas. La microemulsión fue luego desestabilizada en el paso 5 utilizando una mezcla de: Fig.18a) 100 ml de ciclohexano, 80 ml de acetona, 20 ml de etanol; Fig.18b) 100 ml de ciclohexano, 60 ml de acetona, 40 ml de etanol; Fig.18c) 100 ml de ciclohexano, 40 ml de acetona, 60 ml de etanol;
Fig.ldd) 100 ml de ciclohexano, 20 ml de acetona, 80 ml de etanol. Las microfotografías de TEM de las partículas correspondientes son presentadas en las Figuras 18a-18d. Resultado: Las partículas submicrónicas fueron formadas con una mezcla de ciclohexano, acetona y etanol. La agregación se incrementa con la proporción cada vez mayor de etanol, dando origen a una estructura de gel para una proporción volumétrica de etanol a acetona mayor de 20/80 (experimentos 10-3b a 10-3d) . 10-4 Otros solventes Las partículas fueron sintetizadas utilizando los siguientes parámetros experimentales: NP-5 10 mmol (0.2 mol/1), agua (pHl) 60 mmol, F" 0.06 mmol, TMOS 6 mmol, ciclohexano (en el paso 1) 50 ml , maduración 48 horas. La microemulsión fue luego desestabilizada en el paso 5 utilizando una mezcla de 100 ml de ciclohexano y diferentes cantidades de los siguientes solventes: (a) iso-propanol : 10 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml (b) 1-propanol: 25 ml, 50 ml, 100 ml, 200 ml (c) metiletilcetona: 25 ml , 50 ml, 100 ml, 200 ml (d) cloroformo: 25 ml, 50 ml, 100 ml (e) tolueno: 100 ml (f) benceno: 100 ml (g) tetrahidrofurano (THF) : 100 ML
(h) dimetilformamida (DMF) : 100 ml (i) piridina: 100 ml (j) 1-butanol: 100 ml (k) acetonitrilo: 2 ml , 5 ml, 10 ml, 20 ml (1) metanol: 2 ml , 5 ml, 10 ml , 20 ml (m) sulfóxido de dimetilo (DMSO) : 2 ml, 5 ml, 10 ml , 20 ml (n) ter-butanol: 100 ml (o) 1-pentanol: 100 ml (p) 1-hexanol: 100 ml (q) diclorometano: 100 ml Las microfotografías de TEM de algunas de las partículas correspondientes se muestran en las Figuras 19a-19j. Todas las muestras en las Figuras 19a-19j fueron obtenidas mediante la desestabilización de la microemulsión con una mezcla de 100 ml de solvente apropiado y 100 ml de hexano. Resultados: La desestabilización utilizando isopropanol y n-propanol condujo a la formación del gel con el tiempo. La desestabilización no tuvo lugar cuando se utilizó acetonitrilo o metanol: no se formaron partículas. El cloroformo condujo a la formación de una estructura de gel coalescido, y el uso de tolueno, benceno o THF condujo a la producción de estructuras de gel finas .
-5 Otras mezclas Las partículas fueron sintetizadas utilizando los siguientes parámetros experimentales: 5 mmol de NP-5, ciclohexano (en el paso 1) 25 ml , pH=l HN03 con agua 30 mmol, F" 0.03 mmol, TMOS 3 mmol y maduración 48 horas. La microemulsión fue luego desestabilizada utilizando una mezcla de 50 ml de ciclohexano y diferentes cantidades de los siguientes solventes:
Para ilustrar, la morfología de LNK-752 a LNK-755 se representa en las Figuras 20a-20d.
11. Encapsulamiento y liberación de la doxorrubicina La Figura 21 muestra la eficiencia de encapsulamiento de doxorrubicina como una función de la cantidad de doxorrubicina agregada a la solución del paso 1. Aproximadamente 30% de la doxorrubicina permaneció encapsulada, el resto se perdió durante el paso de desestabilización (debido a la alta solubilidad de la doxorrubicina en acetona) y el lavado. En amortiguador de fosfato normal, la doxorrubicina se descompone exponencialmente durante los primeros diez días con un decaimiento medio (T?/2) de aproximadamente 4.5 días, como se muestra en la Figura 22. La velocidad de descomposición se vuelve más lenta después de 10 días: aproximadamente 74% de la doxorrubicina desaparece en 2 semanas. La liberación de la doxorrubicina a partir de las nanopartículas es resumida en las Figuras 23 y 24. La Figura 23 muestra el comportamiento de liberación a corto plazo de las nanopartículas sintetizadas utilizando el proceso de la presente invención. La curva inferior representa la doxorrubicina activa (no desnaturalizada) como una función del tiempo, y muestra que puede ser mantenida una concentración casi constante de la doxorrubicina activa por los 30 días. Las curvas más altas representan la cantidad total de la doxorrubicina liberada (por ejemplo
9
activo + inactivo) . La Figura 24 muestra que las nanopartículas sintetizadas utilizando el proceso de la presente invención pueden liberar la doxorrubicina en un periodo de tiempo mayor de seis meses y mantienen una concentración activa in vi tro . Experimentos Adicionales 1) Condiciones de síntesis típica Una solución de surfactante 0.2 M fue preparada en 50 ml de ciclohexano. Se agregó 1.08 ml de ácido nítrico 0.1 M que contenía 0.06 mmol de NaF a la solución surfactante, y la mezcla resultante se agitó por 20 minutos para producir una microemulsión. Se agregaron luego 6 mmol de TMOS dentro del sistema anterior que se agitó por 48 horas. La emulsión fue luego vaciada en una mezcla de agitación elaborada de 100 ml de acetona y 100 ml de ciclohexano, y se dejó en agitación por 10 minutos más. Después de la sedimentación, las partículas fueron separadas de la fase orgánica y lavadas tres veces con acetona. Las partículas fueron luego resuspendidas en aproximadamente 10 ml de la solución acuosa de cloruro de sodio, lavadas adicionalmente por decantación con cloroformo, y finalmente liofilizadas. Se encontró que las partículas fueron distribuidas homogéneamente en la matriz de cloruro de sodio con sílice y una proporción en peso de cloruro de sodio a 85%. Las partículas pudieron también ser utilizadas directamente en la forma de una
suspensión acuosa después del lavado antes de la liofilización . El proceso es mostrado esquemáticamente en la Figura 27. 2) Influencia de la naturaleza del surfactante Esto es discutido en la sección 15. 3) Desestabilización de la mezcla de ORMOCER/TMOS Las partículas fueron sintetizadas de acuerdo al procedimiento típico (ver Figura 27) pero utilizando una mezcla de ORMOSILs y TMOS como el precursor de sílice. Ambos fueron introducidos en la microemulsión al mismo tiempo, 48 horas antes de la desestabilización. Las microfotografías correspondientes de TEM son presentadas en las Figuras 28 y 29. Únicamente dos sistemas híbridos produjeron las partículas (por ejemplo GTMS y APTMS, las Figuras 2d-d y 29 respectivamente) . La introducción de 25% de GTMS (glicidopropoxitrimetoxisilano) condujo a partículas submicrónicas fuertemente agregadas y 25% de APTMS (aminopropiltrimetoxisilano) condujo, después de la desestabilización, a una distribución bimodal de las partículas grandes y pequeñas. Ambos sistemas fueron investigados utilizando porcentajes menores (5-15%) de ORMOSILs. Las microfotografías de TEM correspondientes son presentadas en las Figuras 30a-30d. Éstas muestran la aglomeración cada vez mayor de las partículas submicrónicas para incrementar la cantidad de GTMS que se introduce en el
sistema. En contraste conforme se incrementa la cantidad de
APTMS, disminuye el tamaño de partícula. 4) Desestabilización de la mezcla de TEOS /TMOS Las partículas fueron sintetizadas de acuerdo al procedimiento típico utilizando una mezcla de TMOS/TEOS como precursores de sílice en lugar de un alcóxido de simple. Las microf otograf ías de TEM correspondientes son presentadas en las Figuras 31a-31c. No se observó diferencia significativa con las proporciones cambiantes de TMOS/TEOS. 5) Desestabilización del sistema de emulsiones múltiples Se prepararon dos microemulsiones de acuerdo a las condiciones de síntesis típicas. La emulsión A contiene el colorante A y la emulsión B contiene el colorante b. Inmediatamente antes de la desestabilización las dos emulsiones fueron brevemente mezcladas y agitadas por 10 minutos (ver Figura 32) . La desestabilización por la mezcla de ace t ona /ci clohexano produjo partículas de sílice submicrónicas. Los polvos resultantes fueron caracterizados utilizando la espectroscopia de
Transformación de Fourier de Infrarrojo de
Reflectancia Difusa (DRIFT por sus siglas en ingles) de UV/Vis (ver Figura 33) . Los polvos que contenían los colorantes individuales fueron también sintetizados y analizados para proporcionar una
comparación . 6) Desestabilización de una emulsión que contiene nanopartículas sintetizadas utilizando la catálisis básica (por ejemplo semillas) y la hidrólisis del monómero en medio ácido Las nanopartículas de sílice producidas utilizando la catálisis básica fueron sintetizadas como sigue. NP-9 (6 mmol), 1-pentanol (6 mmol) y ciclohexano (30 ml) se mezclaron entre sí. 0.648 ml de NH40H amoniacal acuoso (1.333 M) que representan un equivalente de 36 mmol de agua se combinó a la solución previa para formar una microemulsión. Se agregó luego TEOS (1.2 mmol) en la microemulsión y el sistema fue madurado por 4d horas. Una fase acuosa acida fue luego agregada a la microemulsión que contiene partículas de sílice de 50 nm y el sistema fue además agitado a 60°C por 5 horas. Se agregaron luego NP-9 (12 mmol), 1-pentanol (12 mmol) y ciclohexano (60 ml) seguidos por la adición de alcóxido de silicio. La mezcla fue adicionalmente madurada por 4d horas y luego desestabilizada utilizando una mezcla de acetona y ciclohexano. La imagen de TEM correspondiente se muestra en la Figura 34. Un resumen del procedimiento sintético se da en la Figura 35. La semilla original sintetizada en base puede también ser elaborada de materiales híbridos (por ejemplo utilizando una mezcla de ORMOSILs y TMOS) . Un procedimiento
de síntesis típica para estas semillas involucró el mezclado de NP-5 (5 mmol) y ciclohexano (25 ml) y 0.54 ml de NH4OH 1.333 M, seguido por la adición de TMOS o un precursor de sílice mixto y madurando por 24 horas. Las microfotografías de TEM correspondientes de las partículas de siembra o semilla son mostradas en la Figura 36 (primer columna) . 0.54 ml de ácido nítrico 1.5 M con 0.03 mmol de F~ fueron luego agregados a la mezcla y el sistema fue adicionalmente agitado a 60°C por 5 horas. Se agregaron 5 ml de NP-5 y 25 ml de ciclohexano, seguido por la adición de 3 mmol de TMOS. El sistema fue adicionalmente madurado 24 horas antes de la desestabilización con una mezcla de acetona y ciclohexano. Las microfotografías de TEM de las partículas resultantes son presentadas en la columna derecha de las Figuras 36a-36h. 7) Desestabilización de un sistema de dos emulsiones en el cual uno contiene nanopartículas (sintetizado en base) y el otro contiene oligómeros (sintetizado en ácido) El procedimiento sintético sigue el esquema en la Figura 32, con la Emulsión 1 que utiliza una catálisis básica y la Emulsión 2 que utiliza catálisis acida. La Emulsión I fue preparada al mezclar NP-9 (6 mmol, 1- pentanol (6 mmol), ciclohexano (30 ml) y 0.646 ml de NH4OH 1.333 M (36 mmol equivalentes de agua) . Se agregó luego TEOS (1.2 mmol) en la microemulsión y el sistema fue madurado por 48 horas. La TEM de las partículas se
muestra en la Figura 33a. • La Emulsión II fue preparada al mezclar NP-5 (6 mmol) y ciclohexano (30 ml ) y 0.648 ml de HN03 de pH 1 con 0.036 mmol de F~ . Se agregó luego TMOS (3.6 mmol) dentro de la microemulsión, y la mezcla resultante se maduró por 48 horas. Las dos emulsiones fueron luego mezcladas y desestabilizadas utilizando una mezcla de 100 ml de ciclohexano y 100 ml de diferentes solventes polares. Las microfotografías de TEM de las partículas correspondientes son presentadas en las Figuras 37a-37d. 8) La distribución de tamaño de poro de las partículas de sílice submicrónicas sintetizadas por desestabilización de la microemulsión Las isotermas de adsorción-desorción de nitrógeno para dos muestras sintetizadas a dos diferentes pHs, han sido discutidas anteriormente. En las Figuras
38 (LK-425, sintetizada a pH 1 y LK-428, sintetizada a pH
7, neutralizada antes de la desestabilización), se presenta la distribución correspondiente del tamaño de poro. Éstas fueron calculadas utilizando un modelo de
Teoría Funcional de Densidad (DFT por sus siglas en ingles) con poros en forma cilindrica (P. ebb, C. Orr en
"Analytical Methods in Fine Particles Technology", p. 81-87, Micromeret ics Corporation Norcross GA, EUA, 1997) .
9) Influencia de la sonicación durante la desestabilización de la distribución del tamaño de partícula La distribución de tamaño de partícula fue medida mediante dispersión dinámica de luz (DLS por sus siglas en ingles) utilizando un instrumento Malvern HPPS. La suspensión de las partículas de sílice fue sonicada por 10 minutos en un baño de agua. 0.5 ml de la suspensión resultante se diluyeron con 5 ml de una solución de hidróxido de sodio pH 9 y se filtró a través de un filtro de 0.8 µm dentro de una cubeta de vidrio. Las mediciones fueron conducidas a 25°C. La distribución resultante del tamaño de partícula es mostrada en la Figura 39. El tamaño de partícula es bimodal con un pico pequeño centrado alrededor de 38 nm y un pico más grande centrado alrededor de 255 nm. Cuando la solución fue sonicada utilizando una sonda de ultrasonido con un ciclo de trabajo de 50% y un tiempo de ciclo de 2 segundos (Procesador Sonicador-Ultrasónico, Heat System-Ultrasonics Inc.) durante el paso de desestabilización, el pico pequeño a 38 nm desapareció (Figura 40), dando origen a una distribución de tamaño monomodal centrada sobre un tamaño promedio de 220 nm. 10) Encapsulamiento de la doxorrubicina en partículas de sílice sintetizadas a diferente pH Las nanopartículas de sílice que contienen doxorrubicina fueron preparadas de acuerdo al siguiente
procedimiento. 20 mmol de NP5 se mezclaron con 100 ml de ciclohexano, 2.16 ml de HN03 a pH=l, 0.12 mmol de F~ y 1.5 mg de doxorrubicina (clorhidrato de doxorrubicina adquirido de Australian Pharmaceutical Ingredients Pty. Ltd.). 12 mmol de TMOS se agregaron luego y la microemulsión fue madurada por 3 días. Luego se agregaron 0.432 ml de NaOH 0.5 M para llevar los combinados acuosos a pH=7. Después de la adición de la base, las muestras fueron agitadas por 2 horas más antes de la desestabilización con 200 ml de acetona y 150 ml de ciclohexano. Después del asentamiento de las partículas en el fondo del recipiente, éstas fueron lavadas con 100 ml de acetona tres veces. Luego las partículas fueron resuspendidas en una solución compuesta de 4.80 g de cloruro de sodio disueltos en 20 ml de agua desionizada. La suspensión fue lavada tres veces mediante decantación utilizando 100 ml de cloroformo cada vez y liofilizadas . 11) Caracterización de la liberación de la doxorrubicina a partir de las partículas de sílice utilizando cromatografía líquida de alta resolución (HPLC por sus siglas en ingles) Todos los solventes utilizados fueron grado HPLC y filtrados a través de un filtro de 0.45 µm antes de la desgasificación por sonicación. El sistema de HPLC consistió de una bomba de HPLC binaria Waters 1525, en combinación con un automuestreador Waters 717 plus, un detector de
absorbancia Waters 2487 Dual ? (480 nm) , y un detector de fluorescencia Waters 2475 multi ? (? de excitación: 363nm, emisión ?: 550 nm) . La columna de HPLC utilizada fue una Waters AtlanticMR dC-18, de 5 µm, de 4.6 mm x 150 mm, con un guarda columna acoplado Waters AtlanticMR dC-18. La fase móvil consistió de ácido acético al 1% en agua, y acetonitrilo, con un gradiente de 5% a 95% de acetonitrilo en 20 minutos, y una velocidad de flujo de 0.8 ml/minuto. Las concentraciones de doxorrubicina fueron determinadas mediante la integración del área bajo la curva y comparación a aquella de las muestras de doxorrubicina estándares a 0.4, 0.8, 2, 4 y 10 µg/ml. La R2 aceptable mínima para la curva estándar fue de 0.9. El procesamiento de los espectros de HPLC de absorbancia y fluorescencia se realizó utilizando el software Waters BreezeMR. 11 . 1 ) Libera ción a pH<4 La liberación de la doxorrubicina fue estudiada a pH<4 (pH aproximadamente 3.4) ya que el compuesto es más estable a este pH . Los experimentos de liberación fueron realizados utilizando nanopartículas (1 g) impurificadas con doxorrubicina. Las partículas fueron suspendidas en solución de ácido acético al 1% en agua Milli-Q (30 ml) . Las muestras fueron incubadas a 37°C con agitación. Fueron tomadas alícuotas de 100 µl después de la centrifugación a 5000 rpm por 5 minutos. Las muestras fueron analizadas mediante HPLC
como se describió previamente. La Figura 41 muestra el perfil de liberación en un periodo de 9 días. La muestra sintetizada a pH=l mostró un incremento en la liberación de doxorrubicina entre un estallido inicial y el día 1. Subsecuente al día 2, ambos sistemas examinados mostraron una disminución lenta en la concentración de doxorrubicina . Esta disminución es debida a la degradación lenta de la doxorrubicina en condiciones acuosas. La Figura 42 muestra una comparación del perfil de liberación de una muestra sintetizada a pH=3 (símbolos de diamante) versus la formación del producto de degradación (símbolos de cuadros) . Se puede observar a partir de esta gráfica que la disminución en la concentración de la doxorrubicina es muy similar a la cantidad de producto de degradación detectado en el trazo de HPLC, con un cambio en la concentración de ambos que es de aproximadamente 0.2 µg/ml entre el día 2 y el día 9. El análisis subsiguiente al día 9 no fue incluido en los datos reportados, ya que la liberación fue enmascarada por cantidades incrementadas de degradación, y la precipitación de un producto de color anaranjado fue evidente en la muestra recogida. El precipitado es atribuido a la solubilidad limitada de la doxorrubicina y los productos de degradación en las soluciones acuosas. 11 . 2) Libera ción a pH=7. 4 Fueron emprendidos estudios de la liberación de
doxorrubicina a pH fisiológico (7.4). Los estudios de liberación fueron realizados en solución salina amortiguada con fosfato 0.02 M (PBS) a 37°C de acuerdo al mismo procedimiento utilizado a pH<4. La Figura 43 muestra las curvas de liberación obtenidas a pH 7.4. En la muestra sintetizada a pH=l, existió un incremento visible en la concentración de doxorrubicina en las primeras 24 a 48 horas. Después de 48 horas, se observa una disminución significativa en la concentración. El análisis de los resultados del día 4 fue difícil, ya que los productos de degradación comenzaron traslapándose con el pico de la doxorrubicina en el tiempo de retención de 11.7-11.8 minutos. Más allá del día 5, no fue posible el análisis, ya que los picos asociados con los productos de degradación comenzaron a empantanar el pico de la doxorrubicina haciéndolo imposible de discernir. La velocidad de descomposición de la doxorrubicina a pH fisiológico (pH 7.4) versus su velocidad de descomposición a pH<4 hace difícil el análisis del sistema. La Figura 44 muestra una comparación de la descomposición de una concentración conocida de la doxorrubicina a pH 7.4 y pH<4. La descomposición incrementada a pH fisiológico es claramente evidente, haciendo difícil el estudio de este sistema, ya que los productos de degradación tienen un tiempo de retención similar a aquel de la doxorrubicina misma.
11 . 3) Libera ción Acumula tiva Para superar este problema se desarrolló un procedimiento experimental alternativo. En oposición a los métodos previos donde una alícuota del líquido fue aislada del volumen total, el nuevo procedimiento involucra la eliminación completa del sobrenadante de cada punto de tiempo. Las nanopartículas de 35 mg impurificadas con doxorrubicina fueron suspendidas en 1 ml de amortiguador de PBS y agitadas a temperatura ambiente. A los puntos de tiempo requeridos (1 hora, 1, 2, 6 y 9 días) las muestras fueron centrifugadas (12,000 rpm, 30 minutos) y el sobrenadante removido. Las partículas fueron resuspendidas en 1 ml de amortiguador de PBS fresco y la agitación fue continuada. El sobrenadante removido fue luego analizado utilizando HPLC de acuerdo al método descrito anteriormente. La Figura 45 muestra la cantidad total de doxorrubicina liberada a partir de las micropartículas entre los puntos de tiempo. La tabla muestra que después de la exposición inicial al agua, se liberaron 0.9 mg de doxorrubicina de los 35 mg de partículas impurificadas. Después de 24 horas, se liberaron 0.7 µg adicionales. Entre los días 2 al 3, y 3 al 6, se liberaron respectivamente aproximadamente 0.3 µg y 0.2 µg. La Figura 46 muestra la liberación acumulativa de la doxorrubicina a partir de las nanopartículas, mostrando que incluso hasta 9 días la doxorrubicina fue liberada, y aparte del estallido inicial de
aproximadamente 0.8 µg, la liberación fue continua sobre el periodo de tiempo mostrado. 12) Encapsulamiento de camptotecina La camptotecina viene en dos formas: 1) la forma de lactona con una alta eficacia anti-cancerosas pero la cual es escasamente soluble en agua, y 2) la forma de carboxilato que es altamente soluble en agua pero la cual es clínicamente inactiva . La transformación de una forma a otra es dependiente del pH. Cuando el pH es mayor de 4, la forma de lactona es transformada en la forma de hidroxiácido (carboxilato) y por debajo de pH 4 ocurre la reacción inversa.
Forma de lactona Forma de hidroxiácido
Camptotecina H H H Topotecan OH CHÍN(CHJ)3 H 9-amipocamptotecina H H
Irinotecan ^c? ^ " ^^ SN-38 OH H CHsCHj La presente invención se refiere a la producción de un sistema práctico de distribución de fármaco. Con el fin de lograr un alto índice terapéutico, es deseable encapsular la forma de lactona hidrofóbica de la camptotecina. No obstante, la presente invención está diseñada para encapsular
únicamente las moléculas hidrofílicas. Para superar esta limitación los inventores diseñaron el siguiente procedimiento de encapsulamiento alternativo. La camptotecina fue disuelta en 0.1 mol/litro de solución de hidróxido de sodio con una concentración de 2 mg/ml. Se agregó 1.08 ml de la solución anterior a 10 mmol de NP-5 mezclado con 50 ml de ciclohexano, para producir una microemulsión con camptotecina en la forma de carboxilato, localizada en los combinados acuosos. Una segunda microemulsión fue producida utilizando el proceso de síntesis típico descrito en el párrafo 1 y en la Figura 27. Después de una maduración de 48 horas, las dos emulsiones fueron mezcladas, y subsecuentemente agitadas por 10 minutos. Las emulsiones mixtas fueron luego desestabilizadas por una mezcla de 100 ml de ciclohexano y 100 ml de acetona. Cuando las partículas submicrónicas resultantes se sedimentaron hacia el fondo del matraz, éstas fueron lavadas 4 veces utilizando 50 ml de ciclohexano y 50 ml de acetona. Luego se mezclaron 50 ml de HN03 0.5 M o una solución 0.1 M que contenía cloruro de sodio (tal que la proporción en peso del Si02 y el cloruro de sodio fue de 15:85) con las partículas de sílice, y la mezcla se agitó por 30 minutos. Esta acidificación fue diseñada para transformar la forma de carboxilato encapsulada de la camptotecina en la forma de lactona dentro de los poros de las partículas submicrónicas
de sílice. La suspensión resultante fue liofilizada para producir un producto amarillo claro, sugiriendo la presencia de la camptotecina en su forma de lactona. 13) Caracterización de la liberación de la camptotecina La liberación de la camptotecina fue analizada utilizando HPLC. El sistema de HPLC consistió en una bomba de HPLC binaria Waters 1525, en combinación con un automuestreador Waters 717 plus, y un detector de fluorescencia Waters 2475 multi ? (? de excitación: 363 nm, ? de emisión: 550 nm) . La columna de HPLC utilizada fue una columna Waters AtlanticMR dC-18, de 5 µm, de 4.6 mm x 150 mm, con el guarda columna Waters AtlanticMR dC-18 acoplado. La fase móvil fue isocrática y consistió de amortiguador de acetato de amonio 0.075 M al 70% (pH 6.4) y 30% de acetonitrilo al cual se agregó el fosfato de ter-butilamonio (TBAP) hasta una concentración final de 5 mM. La velocidad de flujo utilizada fue de 0.8 ml/minuto. Las concentraciones de camptotecina fueron determinadas mediante la integración del área bajo la curva y comparación a aquella de las muestras de camptotecina estándares de a 0.4, 0.8, 2, 4, y 10 µg/ml. La R2 aceptable mínima para la curva estándar fue de 0.9. El procesamiento de los espectros de HPLC fue realizada utilizando el software Waters BreezeMR. Liberación acumula tiva Los estudios de liberación iniciales de la
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camptotecina fueron realizados utilizando un procedimiento de liberación acumulativa. Las muestras de nanopartículas (1 g) encapsuladas con camptotecina fueron suspendidas en la fase móvil de HPLC sin TBAP agregado (30 ml), y se agitaron continuamente. Como lo requirieron los puntos de tiempo, las muestras fueron centrifugadas y fue aislada una alícuota de 100 µl del sobrenadante. El sobrenadante fue analizado utilizando HPLC para determinar la concentración de la camptotecina. La Figura 47 muestra la liberación acumulativa de la camptotecina. A partir de los resultados mostrados en la Figura 47, se puede observar que la cantidad total de la camptotecina liberada es de aproximadamente 3 µg, sostenida en un periodo de hasta 3 días. Se sugiere que la cantidad de camptotecina liberada de las partículas está limitada por la solubilidad de la camptotecina en condiciones acuosas. Se sabe que la camptotecina es solo ligeramente soluble en agua. Libera ción con reempla zo de fase a cuosa Con el conocimiento de que la camptotecina es solo ligeramente soluble en agua, fue conducido un experimento en el cual la fase acuosa fue reemplazada en cada punto de tiempo, para prevenir la saturación de la camptotecina provocada por su solubilidad limitada. Las muestras de camptotecina (33 mg) fueron suspendidas en la fase móvil de HPLC sin el TBAP agregado. A los periodos de tiempo
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requeridos, las partículas fueron convertidas en pellas mediante centrifugación, y el sobrenadante se retiró completamente y se analizó para la concentración de la camptotecina utilizando HPLC. Las partículas fueron luego suspendidas en 1 ml de la fase móvil fresca y la agitación continuó por el tiempo requerido. La Figura 48 muestra la cantidad acumulativa de camptotecina liberada de las partículas. La cantidad total liberada de las partículas en este experimento es casi el doble de la cantidad de liberación en el experimento detallado anteriormente. Esto indica que la liberación de la camptotecina es dependiente de su solubilidad en el medio líquido . 14) Encapsulamiento de otras moléculas Las siguientes moléculas han sido encapsuladas dentro de las partículas de sílice utilizando el proceso de desestabilización con ácido. Naranja II (O-II); rodamina B (R-B); rodamina 6G (R-6G); meti 1-violeta (M-V); sal tetrasódica del ácido cobre (I?)-ftalocianin-tetrasulfónico (CuPC); (tris(2,2-bipiridil ) diclororrutenio ( 11 ) hexahidratado (Rubpy); isot iocianato de rodamina B (RBITC) . La eficiencia del encapsulamiento de cada material puede depender de uno o más de: 1. la polaridad del material, por ejemplo la
solubilidad en agua, ciclohexano, acetona y cloroformo ; 2. su interacción con una matriz de sílice; 3. su tamaño molecular; 4. la existencia de grupos funcionales hidrofílicos tales como hidroxilo que puede formar enlaces de hidrógeno con la superficie de sílice; 5. otros parámetros de procesamiento tales como la cantidad de activos, el volumen de cada uno de los solventes, etc. El material activo puede perderse en dos etapas del proceso: durante la desestabilización, debido a la disolución en la acetona, y durante el lavado de las partículas. Lo último puede ser reducido al mínimo mediante el uso de un solvente no polar para lavar las partículas que contienen moléculas hidrofílicas. 15) Surfactantes alternativos Las síntesis fueron conducidas con varios surfactantes alternativos. Las microfotografías de TEM correspondientes son presentadas en la Figura 49. Las partículas submicrónicas fueron producidas para los surfactantes de Tween pero no para AOT (HLB 10-15) , sugiriendo que en las partículas el HLB y la presencia de la unidad de PEG juegan un papel en la desestabilización exitosa de la emulsión. Debido a que los surfactantes de Tween
produjeron emulsiones inestables, las TEMS de las partículas antes de la desestabilización fueron también registradas y son presentadas en la primera columna de las Figuras 49a-49d. Discusión: 1) Desestabilización de la mezcla de OFMDSIL/TMDS La incorporación de ORMOSIL dentro de la estructura de las partículas es importante debido a que, además de proporcionar matrices híbridas alternativas, ésta ofrece una posible manera para incrementar la eficiencia de encapsulamiento al cambiar el tamaño de poro y la estructura interna de las partículas, así como al proporcionar anclas químicas para las moléculas a encapsular (por ejemplo grupos amino a partir de APTMS que pueden reaccionar con grupos carboxilato en un impurificador) . No obstante, como se muestra en la Figura 29 y en la Figura 30, se ha encontrado que dos sistemas de ORMOSIL (GTES y APTMS) producen partículas submicrónicas y éstas tuvieron fracciones molares relativamente bajas (15% o menos) . Los dos sistemas exitosos tienen un grupo orgánico hidrofílico enlazado al silicio: aminopropilo y glicidoxipropilo. En ácido, el anillo epoxi del grupo glicidoxipropilo es hidrolizado y se abre de acuerdo a la reacción:
El hecho de que los alcóxidos sustituidos con alquilo y arilo (metil (MTMS) , fenil (PTMS), octil (OTES)) no produjeron partículas, sugiere que el grupo orgánico estabiliza la emulsión (quizás actuando como un co-surfactante) previniendo de este modo su desestabilización. El gel obtenido utilizando CHEETES sugiere que el ligando de ciclohexeniletilo disminuye la estabilidad de la emulsión, lo cual da como resultado una desestabilización muy rápida y descontrolada y la producción de un gel denso. La cantidad de silano orgánicamente modificado influye la morfología final de las partículas. La Figura 30 muestra que el incremento de la cantidad de GTMS conduce al incremento de la formación de cuellos o angostamientos y agregación entre las partículas después de la desestabilización. Una posible explicación para esto es que los números cada vez mayores de anillos de glicidilo abiertos actúan como puntos de condensación potenciales entre las partículas, conduciendo a una agregación incrementada. Para APTMS, el tamaño de partícula disminuye conforme se incrementa la cantidad de APTMS introducido. Una posible explicación para esta tendencia se refiere al efecto catalítico del grupo amino sobre la condensación de sol-gel, que conduce a una nucleación más rápida (por ejemplo la producción de más núcleos) y por lo tanto menos crecimiento y partículas más pequeñas.
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2) Desestabilización de la mezcla de TEOS/TMDS: Como se esperaba, no existe diferencia significativa para la morfología para las partículas sintetizadas con TMOS/TEOS puro o con una mezcla de los mismos. Durante la hidrólisis catalizada por ácido, ya sea comenzando a partir de TEOS o TMOS, son producidos los mismos oligómeros de sílice hidrolizados. 3) Desestabilización de un sistema de dos emulsiones (por ejemplo 2 colorantes) Pueden ser encapsulados varios materiales activos dentro de las partículas de sílice producidas por el presente proceso. Los activos pueden ser introducidos ya sea al mezclarlos inicialmente dentro del combinado acuoso, seguido por la adición del precursor de silicio, o al mezclar los diversos sistemas en emulsión en los cuales han sido incorporadas diferentes moléculas activas. La desestabilización de ambos sistemas conduce a la producción de partículas submicrónicas que contienen los diferentes colorantes, aunque no es cierto a qué escala son dispersados los colorantes. No se sabe si la desestabilización de una emulsión múltiple conduce a un mezclado molecular y a la distribución homogénea de los activos dentro de las partículas submicrónicas, o si las partículas submicrónicas contienen nano-dominios de concentración correspondiente a los combinados acuosos iniciales de cada emulsión, antes de la desestabilización.
4) Desestabilización de una emulsión que contiene semillas y monómeros Los resultados en la Figura 34 muestran que semillas de 50 nm sintetizadas en base pueden ser exitosamente incrustadas dentro de las partículas de tamaño micrométrico (y submicrométrico) utilizando desestabilización acida. La hidrólisis catalizada por ácido de TMOS proporciona unidades de sílice oligoméricas pequeñas que actúan como pegamento entre las semillas catalizadas con base, durante la coalescencia de las gotitas, disparada por la introducción de acetona . Esta variación del proceso es importante ya que puede hacer posible la síntesis de partículas con alta carga de fármaco utilizando el proceso catalizado por base y su transformación en partículas submicrónicas microporosas, proporcionándoles de este modo las características de liberación sostenida y superando la característica de difusión rápida de las partículas sintetizadas con base . Las Figuras 36a-36h muestran que este concepto puede ser expandido a las semil las de materiales híbridos , aunque no todas las partículas de ORMOS IL producen partículas submicrónicas después de la desestabili zación . 5) Desestabilización de un sistema de dos emulsiones , conteniendo una nanopartícula (elaboradas en base) y la otra contiene monómeros (ácido) Una manera alternativa para producir partículas submicrónicas compuestas que contienen semi llas mesoporosas dispersas dentro de una matri z de sílice catali zada por
ácido, microporosa, es mezclar dos diferentes emulsiones, una conteniendo la especie catalizada por ácido y la otra las partículas catalizadas por base, rápidamente antes de la desestabilización. Como se muestra en la Figura 37, esto no fue exitoso y fue producida una distribución bimodal, con las partículas de semilla iniciales atrapadas dentro de un gel coloidal de partículas mucho más pequeñas. Esto puede ser explicado por el hecho de que, cuando todas las emulsiones son mezcladas entre sí, el intercambio de los núcleos micelares conduce a un incremento rápido del pH del combinado ácido, lo cual conduce a una condensación rápida de los oligómeros en estos combinados (síntesis ácido-base) y la precipitación de las nanopartículas pequeñas que rápidamente se gelifican. 6) Introducción de ultrasonicación durante la desestabilización para disminuir la polidispersión La Figura 40 muestra que la realización de la desestabilización bajo ultrasonicación es capaz de proporcionar una distribución de partículas de modo simple, más estrechas y ligeramente más pequeñas. Esto contrasta con los primeros hallazgos que sugerían que el método de adición no tenía ninguna influencia sobre el tamaño y morfología de las partículas. Son importantes dos diferentes factores que hay que hacer notar: los análisis previos fueron realizados
utilizando TEM, el cual es un método pobre para analizar la distribución del tamaño de partícula; y la fuente de ultrasonido utilizada en el primer experimento fue un baño en vez de la bocina de ultrasonido que se utilizó en el presente experimento, que es mucho más poderosa. 7) Encapsulamiento y liberación de la doxorrubicina en partículas sintetizadas a diferentes pH La Figura 38 ilustra cómo, mediante el ajuste del pH interno durante la síntesis, es posible cambiar la distribución del tamaño de poro y de este modo la velocidad de liberación del activo. Para demostrar esto, los inventores encapsularon la doxorrubicina a diferentes pH y estudiaron la liberación en varios días a dos pHs, 3.4 y 7.4, utilizando HPLC (ver Figura 41 y 42) . La interpretación de los resultados es hecha difícil por la descomposición rápida de la doxorrubicina durante los experimentos de liberación. No obstante, la Figura 41 sugiere que la liberación de las muestras de doxorrubicina sintetizadas en ácido difirieron de aquellas sintetizadas a pH=7. La concentración de la doxorrubicina disminuyó monótonamente cuando se encapsuló a pH=7, ya que se incrementó gradualmente por dos a tres días en las muestras de ácido antes de la disminución posterior. La disminución de la concentración parece ser debida a la degradación de la doxorrubicina con el tiempo, como se muestra en la Figura 44. Además, como se muestra en la
Figura 42, la generación del producto de degradación corresponde a la disminución observada en la concentración de doxorrubicina. Todo esto sugiere que, cuando se encapsula a pH=7, la doxorrubicina es liberada casi instantáneamente y se degrada después de esto lentamente, como cuando se encapsula en pH más ácido, se libera más gradualmente. Esto es además confirmado por la Figura 46 que muestra una liberación prolongada en 6 días. 8) Encapsulamiento de la camptotecina La camptotecina fue encapsulada y liberada en la forma de lactona y carboxilato. Aunque debido al procedimiento de HPLC utilizado, no es posible determinar de manera precisa la proporción exacta de las dos formas del fármaco encapsulado dentro de las partículas, una proporción sustancial de la camptotecina encapsulada estuvo en la forma de lactona. La comparación entre la cantidad liberada en la Figura 47 y en la Figura 48, muestra que uno de los factores que limitan la liberación de la camptotecina es su pobre solubilidad en agua, lo cual condujo a una mayor cantidad de camptotecina liberada cuando el agua sobrenadante fue cambiada a intervalos regulares (Figura 48). En este caso, después de una liberación inicial gradual en dos días, tuvo lugar una liberación más lenta en los siguientes 4 días, mostrando el potencial para la liberación sostenida de la
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camptotecina para aplicaciones terapéuticas. 9) Surfactantes alternativos Tween 61 (HLB 9.6) y Tween 81 (HLB 10) produjeron emulsiones inestables que generaron partículas submicrónicas antes de la desestabilización. Esas partículas submicrónicas fueron de tamaño similar a aquellas obtenidas después de la desestabilización con ácido. Los inventores lanzaron la hipótesis de que en este caso la formación de partículas submicrónicas tiene lugar antes de la desestabilización. En el caso de Tween 21 (HLB 13.3) se formó una emulsión relativamente estable (por ejemplo aproximadamente transparente en comparación a opaca para los Tweens 61 y 81) . Después de reaccionar por 3 días, las partículas fueron centrifugadas a 12000 rpm por 20 minutos para recuperar un rendimiento relativamente pequeño del producto (con relación al rendimiento normal después de la desestabilización) . Mediante TEM este producto aparecieron ser agregados irregulares grandes y contuvo algo de geles. Únicamente unas pocas partículas aparecieron esféricas. Los inventores lanzaron la hipótesis de que cuando se inicia con una microemulsión estable, la desestabilización con ácido es necesaria para obtener partículas submicrónicas. Los inventores lanzan la hipótesis de que el número de unidades oxietileno en la molécula de surfactante puede jugar un papel importante en el control de la producción de
las partículas submicrónicas. En aquellos surfactantes que proporcionaron un producto aceptable cuando se utilizaron en el proceso de la invención, el número de PEG es relativamente pequeño: 4 para Tween 21, 5 para NP5 y 6 para NP6 en comparación a 9 para NP9, y 7.5 para Tritón X-114 (los últimos dos surfactantes han sido encontrados como inadecuados para el uso en la invención) . Además, el número de unidades oxietileno (las cuales forman la cabeza polar de la molécula surfactante) pueden influir sobre la interacción entre el grupo de cabeza polar del surfactante y el agua que pueden controlar el proceso de coalescencia. Aunque el número de unidades de oxietileno en la molécula surfactante juega un papel crítico en el control de la producción de las partículas submicrónicas, no es suficiente asegurar una desestabilización apropiada de la emulsión. Esto es ejemplificado por el Brij 30, el cual posee 4 unidades oxietileno pero forma emulsiones estables que no producen partículas submicrónicas después de la desestabilización. Además, como se mencionó al principio, con el fin de lograr la desestabilización exitosa, el surfactante debe tener una interacción molecular de fuerza media entre su cabeza polar y el combinado acuoso. Esta interacción molecular puede ser caracterizada por la huella digital del surfactante (A) , que puede ser calculada al dividir el área superficial de la superficie de la gotita de
agua (fl * d , donde d es el diámetro del combinado de agua) entre el número de agregación del surfactante (N) . A=( p * d2) /N Utilizando los valores de la literatura, la huella digital fue calculada para un intervalo de los surfactantes que se utilizaron. Los resultados se listan enseguida. Una interacción media corresponde a una huella digital entre 1.5 y 10 nm2 por molécula.
Parece que los surfactantes con HLB entre aproximadamente 9 y aproximadamente 14 y que tienen entre
aproximadamente 4 y 6 unidades oxietileno y que tienen una huella digital entre 1 y 5 nm2 por molécula, pueden ser adecuados para el uso en la presente invención. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.