KR20220133878A - 핵산 올리고머의 제조 방법 - Google Patents

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KR20220133878A
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다쿠야 미야가와
마사시 니시오
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스미또모 가가꾸 가부시끼가이샤
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Abstract

본 발명은 핵산 올리고머의 효율적인 제조 방법, 특히, 아인산트리에스테르 결합을 갖는 핵산 전구체를 산화시켜, 인산트리에스테르 결합을 갖는 핵산 분자를 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 또, 식 (I) 로 나타내는 뉴클레오티드를 5' 말단에 갖는 핵산 화합물의, 포스포르아미다이트법에 의한 제조 방법으로서, 5' 말단에 식 (II) (식 (I) 및 (II) 의 치환기의 정의는, 명세서에 정의한 바와 같다.) 로 나타내는 아인산트리에스테르 결합을 갖는 전구체에, 요오드, 피리딘 및 물을 함유하고, 요오드산과 요오드의 몰비 (요오드산 ㏖/요오드 ㏖) 가 30 × 10-3 이하인 산화 용액을 반응시키는 공정을 포함하는 제조 방법을 제공한다.

Description

핵산 올리고머의 제조 방법
본 특허출원은 일본국 특허출원 2020-012787호 (2020년 1월 29 일출원) 에 기초하는 파리 조약 상의 우선권 및 이익을 주장하는 것으로서, 여기에 인용함으로써, 상기 출원에 기재된 내용의 전체가 본 명세서 중에 받아들여지는 것으로 한다.
본 발명은 핵산 올리고머의 제조 방법에 관한 것이다.
핵산 올리고머인 DNA 나 RNA 는, DNA 프로브, RNA 프로브, 안티센스, 리보자임, siRNA, 압타머 등으로서 이용 가능하고, 유용한 소재이다.
핵산 올리고머는, 고상 합성법에 의해서 합성 가능하고, 고상 합성법으로는 뉴클레오시드의 포스포르아미다이트 (이하,「아미다이트」라고 칭한다) 가 원료로서 사용된다. 고상 담체 상에서, 커플링, 산화 및 탈보호의 공정을 거쳐 핵산을 신장시켜 합성된 핵산 올리고머는, 고상 담체로부터 잘라내고, 이어서, 보호기를 제거하여, 목적으로 하는 핵산 올리고머가 제조되고 있다. 이와 같이 하여 합성된 핵산 올리고머의 순도는, 반드시 만족할 수 있는 것이 아니고, 합성은 효율적이 아니었다 (비특허문헌 1).
Tetrahedron 69 (2013) 3615-3637
본 발명은 핵산 올리고머의 효율적인 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해서 예의 연구를 거듭한 결과, 핵산 올리고머의 합성에 있어서, 포스포르아미다이트를 사용한 커플링 반응에 의해서 생성되는 아인산에스테르를 산화할 때에 사용하는 산화 용액으로서, 요오드, 물 및 피리딘을 함유하고, 요오드산의 요오드에 대한 비율이 일정한 수준 이하인 용액을 사용하는 것을 특징으로 하는, 핵산 올리고머의 효율적인 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 아래의 양태를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
항 1. 식 (I) :
[화학식 1]
Figure pct00001
(식 중,
G1 및 G2 는 각각, 독립적으로, 수산기의 보호기를 나타내고, Ba 는, 보호기로 보호되어 있어도 되는 핵산 염기를 나타내고,
R 은, 보호된 수산기, 수소 원자, 불소 원자, 메톡시기, 2-메톡시에틸기, 또는 OQ' 기를 나타내며,
Q' 는, 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합하고 있는 메틸렌기, 4' 위치의 탄소 원자와 결합하고 있는 에틸렌기, 또는 4' 위치의 탄소 원자와 결합하고 있는 에틸리덴기를 나타내고, 그리고,
* 가 붙은 결합은, 핵산의 3' 말단측으로의 결합을 나타낸다.)
로 나타내는 뉴클레오티드를 5' 말단에 갖는 핵산 화합물의, 포스포르아미다이트법에 의한 제조 방법으로서, 5' 말단에 식 (II) :
[화학식 2]
Figure pct00002
(식 중,
G1, G2, Ba, R 및 * 는, 상기 정의한 바와 같다.)
로 나타내는 아인산트리에스테르 결합을 갖는 전구체에, 요오드, 피리딘 및 물을 함유하고, 요오드산과 요오드의 몰비 (요오드산 ㏖/요오드 ㏖) 가 30 × 10-3 이하인 산화 용액 (이하, 본 명세서 중,「본 발명의 산화 용액」이라고 칭한다) 을 반응시키는 공정을 포함하는, 제조 방법.
항 2. 아인산트리에스테르 결합을 갖는 전구체가, 식 (4) :
[화학식 3]
Figure pct00003
(식 중,
G1 은, 수산기의 보호기를 나타내고,
G2 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이한 수산기의 보호기를 나타내며,
Ba 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하고, 보호기로 보호되어 있어도 되는 핵산 염기를 나타내고,
R 은, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하여, 보호된 수산기, 수소 원자, 불소 원자, 메톡시기, 2-메톡시에틸기, 또는 OQ' 기를 나타내고,
Q' 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하여, 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합하고 있는 메틸렌기, 4' 위치의 탄소 원자와 결합하고 있는 에틸렌기, 또는 4' 위치의 탄소 원자와 결합하고 있는 에틸리덴기를 나타내고,
Y 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하여, 산소 원자 또는 황 원자를 나타내고,
n 은, 1 이상 200 까지의 어느 정수를 나타내고,
X 가 OZ 를 나타낼 때, W 는 OV 기를 나타내고, V 는 수산기의 보호기를 나타내며,
X 가 R 기를 나타낼 때, W 는 OZ 로 나타내는 기를 나타내고,
Z 는, 고상 담체 및 연결기로 이루어지는 구조를 갖는 기이다.
그리고, n 이 2 이상의 정수일 때, 식 (4) 로 나타내는 핵산 화합물은, 각각의 5' 말단과 3' 말단의 뉴클레오티드 사이의 적어도 1 개의 뉴클레오티드 대신에, 비뉴클레오티드 링커가 삽입되어 있어도 된다.)
로 나타내는 화합물이고, 인산트리에스테르 결합을 갖는 화합물이, 식 (5) :
[화학식 4]
Figure pct00004
(식 중,
G1, G2, Ba, R, n, W, X, 및 Y 는, 상기한 바와 같고, 그리고,
식 (4) 에 있어서 정의된 바와 같이, 뉴클레오티드 대신에, 비뉴클레오티드 링커가 삽입되어 있어도 된다.)
로 나타내는 핵산 화합물인, 전항 1 에 기재된 제조 방법.
항 3. 식 (5) 의 핵산 화합물을 아미다이트법으로 임의로 사슬 길이를 신장시킨 식 (5') :
[화학식 5]
Figure pct00005
(식 중,
G2, Ba, R, X 및 W 는, 식 (5) 에 대해서 정의된 바와 같고,
G5 는, 수산기의 보호기, 혹은 수소 원자를 나타내며,
m 은, m ≥ n 을 만족하는 정수이고, 그리고,
Y 는, 각각 독립적으로, 산소 또는 황을 나타낸다.
단, 적어도 1 개의 Y 는, 산소 원자이다.)
로 나타내는 핵산 화합물을 얻는 공정,
식 (5') 의 화합물로부터 식 (6) :
[화학식 6]
Figure pct00006
(식 중,
G5, R 및 m 은, 상기한 바와 같고,
Bc 는 각각 독립적으로 동일 또는 상이한 핵산 염기를 나타내며,
G4 는 수소 원자, 알칼리 금속 이온, 암모늄 이온, 알킬암모늄 이온, 또는 하이드록시알킬암모늄 이온을 나타내고,
Y 는, 각각 독립적으로, 산소 또는 황을 나타내며, 또한, 적어도 1 개가, 산소 원자이고, 그리고,
X1 은, 수산기를 나타내며, 또한 W1 은, OV 기를 나타내고, 여기에서 V 는, 수산기의 보호기를 나타내거나, 혹은
X1 은, R 기를 나타내며, 또한 W1 은, 수산기를 나타낸다.)
으로 나타내는 화합물을 잘라내고,
추가로 식 (6) 의 화합물을 탈보호하여, 식 (7) :
[화학식 7]
Figure pct00007
(식 중,
m, Y, G4 및 Bc 는, 상기 정의한 바와 같고,
R' 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하여, 수산기, 수소 원자, 불소 원자, 메톡시기, 2-메톡시에틸기, 또는 OQ' 기를 나타내며,
Q' 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하여, 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합하고 있는 메틸렌기, 4' 위치의 탄소 원자와 결합하고 있는 에틸렌기, 또는 4' 위치의 탄소 원자와 결합하고 있는 에틸리덴기를 나타내고,
그리고,
X10 및 W10 은 각각, 각각 독립적으로, 수산기를 나타내거나, 혹은
X10 은, R' 기를 나타내며, 또한, W10 은, 수산기를 나타낸다.)
로 나타내는 탈보호된 핵산 올리고머를 제조하는 공정을 추가로 포함하는, 전항 2 에 기재된 핵산 올리고머의 제조 방법.
항 4. 비뉴클레오티드 링커가, 아미노산 골격으로 이루어지는 링커인, 전항 2 또는 3 중 어느 하나에 기재된 제조 방법.
항 5. 아미노산 골격으로 이루어지는 링커가, 하기 식 (A14-1), (A14-2) 및 (A14-3) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 구조를 갖는 링커인, 전항 4 에 기재된 제조 방법.
[화학식 8]
Figure pct00008
항 6. 산화 용액의 요오드의 농도가, 0.005 ∼ 2 M 인, 전항 1 ∼ 5 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
항 7. 산화 용액의 요오드의 농도가, 0.005 ∼ 0.2 M 인, 전항 1 ∼ 5 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
항 8. 산화 용액의 요오드의 농도가, 0.007 ∼ 0.1 M 인, 전항 1 ∼ 5 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
항 9. 산화 용액의 요오드의 농도가, 0.008 ∼ 0.07 M 인, 전항 1 ∼ 5 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
항 10. 산화 용액이, 요오드, 피리딘 및 물을 혼합하여 조제되는, 전항 1 ∼ 9 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
항 11. 산화 용액이, 아세토니트릴 및 테트라하이드로푸란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 용매를 추가로 함유하는 산화 용액인, 전항 10 에 기재된 제조 방법.
항 12. 산화 용액이, 아세토니트릴 용매를 추가로 함유하는 산화 용액인, 전항 10 또는 11 에 기재된 제조 방법.
항 13. 산화 용액의 용매가, 피리딘, 물, 아세토니트릴, 및 테트라하이드로푸란을, 1 ∼ 90 : 1 ∼ 50 : 0 ∼ 90 : 0 ∼ 90 의 체적 비율로 혼합한 혼합 용매인, 전항 11 에 기재된 제조 방법.
항 14. 산화 용액의 용매가, 피리딘, 물, 및 아세토니트릴을, 1 ∼ 90 : 1 ∼ 50 : 0 ∼ 90 의 체적 비율로 혼합한 혼합 용매인, 전항 11 또는 12 에 기재된 제조 방법.
항 15. 요오드산과 요오드의 몰비 (요오드산 ㏖/요오드 ㏖) 가 25 × 10-3 이하인, 항 1 ∼ 14 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
항 16. 요오드산과 요오드의 몰비 (요오드산 ㏖/요오드 ㏖) 가 20 × 10-3 이하인, 항 1 ∼ 14 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
항 17. 요오드산과 요오드의 몰비 (요오드산 ㏖/요오드 ㏖) 가 15 × 10-3 이하인, 항 1 ∼ 14 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
항 18. 요오드산과 요오드의 몰비 (요오드산 ㏖/요오드 ㏖) 가 10 × 10-3 이하인, 항 1 ∼ 14 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
항 19. 요오드산과 요오드의 몰비 (요오드산 ㏖/요오드 ㏖) 가 5 × 10-3 이하인, 항 1 ∼ 14 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
항 20. 요오드산과 요오드의 몰비 (요오드산 ㏖/요오드 ㏖) 가 3 × 10-3 이하인, 항 1 ∼ 14 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
항 21. 산화 용액이, 조제부터 산화 반응에 사용하기까지의 시간이 1 주일 이상 경과한 산화 용액인, 항 1 ∼ 20 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
항 22. 산화 용액이, 조제부터 산화 반응에 사용하기까지의 시간이 2 주일 이상 경과한 산화 용액인, 항 1 ∼ 20 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
항 23. 핵산이 리보뉴클레오시드 (RNA) 인, 항 1 ∼ 22 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
항 24. 핵산이, 리보뉴클레오시드 (RNA) 이고, 그 2' 보호기가, 식 (12) 에 나타내는 보호기인, 항 2 ∼ 23 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
식 (12) :
[화학식 9]
Figure pct00009
(식 중,
q 는, 1 ∼ 5 의 정수를 나타내고,
Ra 및 Rb 는 각각, 동일 또는 상이하여, 메틸기, 에틸기 또는 수소 원자를 나타내며,
* 표시가 붙은 결합은, OQ 기의 산소에 결합하고, 그리고,
EW 는, 전자 구인기를 나타낸다.)
항 25. Ra 및 Rb 가 동시에 수소 원자이고, EW 가 시아노기인, 항 24 에 기재된 제조 방법.
항 26. 핵산이 40 사슬 길이 이상의 리보뉴클레오시드 (RNA) 인, 항 1 ∼ 25 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
항 27. 추가로 제 1 항에 기재된 산화 용액을 조제하는 공정을 포함하는, 항 1 ∼ 26 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
본 발명은 효율적인 핵산 올리고머의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 제조 방법에 의해서 제조되는 핵산 올리고머의 순도 향상을 기대할 수 있다.
도 1 은, 본 발명의 제법의 공정 (1) 내지 (6) 의 스킴을 나타내는 도면이다.
상기 식 (I) 로 나타내는 뉴클레오티드를 5' 말단에 갖는 핵산 화합물의 포스포르아미다이트법에 의한 제조 방법으로서, 5' 말단에 상기 식 (II) 로 나타내는 아인산트리에스테르 결합을 갖는 전구체에, 요오드, 피리딘 및 물을 함유하고, 요오드산과 요오드의 몰비 (요오드산 ㏖/요오드 ㏖) 가 30 × 10-3 이하인 산화 용액 (본 발명의 산화 용액) 을 반응시키는 공정을 포함하는 제조 방법에 대해서 설명한다.
아인산트리에스테르 결합을 갖는 핵산 전구체에, 요오드, 피리딘 및 물을 함유하는 산화 용액을 반응시켜, 인산트리에스테르 결합에 산화하는 공정을 포함하는 핵산 화합물의 제조 방법으로서, 상기 산화 용액에 있어서의 요오드산과 요오드의 몰비 (요오드산 ㏖/요오드 ㏖) 가 30 × 10-3 이하인, 제조 방법에 대해서 설명한다.
요오드, 피리딘 및 물을 함유하는 본 발명의 산화 용액 중의 요오드산과 요오드의 몰비 (요오드산 ㏖/요오드 ㏖) 는, 통상적으로 30 × 10-3 이하이다. 요오드산과 요오드의 몰비 (요오드산 ㏖/요오드 ㏖) 는, 바람직하게는, 25 × 10-3 이하, 더욱 바람직하게는, 20 × 10-3 이하, 보다 더 바람직하게는, 15 × 10-3 이하, 보다 더 바람직하게는, 10 × 10-3 이하, 보다 더 바람직하게는, 5 × 10-3 이하, 보다 더 바람직하게는, 3 × 10-3 이하이다. 여기에서, 요오드및 요오드산의 양은, 후술하는 이온 크로마토그래프법에 의해서 측정된 것이다.
상기 산화 용액으로는, 전형적으로는, 요오드와, 물 및 피리딘으로 조제된다. 조제된 용액은, 상기한 요오드산과 요오드의 몰비를 만족하는 것이 사용된다.
산화 용액의 조제부터 핵산 합성까지의 기간, 예를 들어, 25 ∼ 60 ℃ 에서 1 일 이상, 바람직하게는 조제 후 1 주일 이상, 보다 바람직하게는 조제 후 2 주일 이상, 더욱 바람직하게는 조제 후 1 개월 이상 보관하고, 상기 소정의 요오드산과 요오드의 몰비 이하의 용액을 사용할 수 있다. 산화 용액의 조제 후의 보관 온도는, 상기 범위에 한정되지 않고, 0 ∼ 80 ℃ 에서 보관하고, 상기 소정의 조건을 만족하는 것이면 된다.
요오드, 피리딘 및 물을 함유하는 산화 용액 중의 요오드의 농도는, 통상적으로 0.005 ∼ 2 M, 바람직하게는 0.005 ∼ 0.2 M, 보다 바람직하게는, 0.007 ∼ 0.1 M, 더욱 바람직하게는, 0.008 ∼ 0.07 M 으로 조정된다.
상기 산화 용액은, 전형적으로는, 요오드와, 물 및 피리딘으로 조제되지만, 이러한 산화 용액에는, 아세토니트릴 및 테트라하이드로푸란 (THF) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 용매를 혼합하여 사용해도 된다.
산화 용액의 용매는, 용액의 총체적당, 예를 들어, 피리딘을 1 ∼ 90, 물을 1 ∼ 50, 아세토니트릴을 0 ∼ 90, 테트라하이드로푸란을 0 ∼ 90 의 체적 비율로 혼합하여 얻어진 것이고, 바람직하게는, 피리딘을 5 ∼ 90, 물을 2 ∼ 30, 아세토니트릴을 0 ∼ 80, 테트라하이드로푸란을 0 ∼ 80 의 체적 비율로 혼합하여 얻어진 혼합 용매이다. 산화 용액을 조제할 때에 반응계의 교반은 필수는 아니지만, 통상적으로 교반 동력 Pv 가 0.0 ∼ 0.5 ㎾/㎥ 의 범위에서 교반을 행하고, Pv 가 0.1 ∼ 0.3 ㎾/㎥ 인 교반이 바람직하다.
상기와 같이 조제되는 산화 용액은, 요오드의 농도를 산화 반응에서의 사용시보다 고농도로 조제하여 보관할 수도 있다. 이러한 고농도의 산화 용액은, 사용시에, 상기 용매로 희석함으로써 최종적으로 원하는 농도로 조정하여 사용해도 된다.
아인산트리에스테르 결합의 산화 반응에 있어서는, 상기 산화 용액에, N-메틸이미다졸 (NMI), N-메틸모르폴린, 루티딘 및 트리에틸아민으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 화합물을 추가로 첨가해도 된다. 혹은 요오드화칼륨 등의 요오드화물을 첨가해도 된다.
산화 용액의 보관에는, 유리제 용기, 플라스틱제 용기, 또는 금속제 용기를 사용할 수 있다. 플라스틱제 용기로는, 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌제 등의 용기를 사용할 수 있고, 금속제 용기로는, SUS 제 용기 또는 하스텔로이제 등의 용기를 사용할 수 있다.
공기 분위기 하 또는 불활성 가스 분위기 하에서 산화 용액을 보관할 수 있고, 불활성 가스로는, 아르곤, 질소, 이산화탄소 또는 헬륨 등을 사용할 수 있다.
아인산(포스파이트)트리에스테르 결합을 포함하는 화합물로는, 상기 식 (4) 의 화합물이 예시된다. 산화 용액을 작용시켜 생성되는 핵산 화합물로는, 상기 식 (5) 로 나타내는 핵산 화합물이 예시된다.
식 (4) 및 (5) 에 있어서, Q' 로 나타내는, 각각 독립적으로 동일 또는 상이하여, 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합하고 있는 메틸렌기, 4' 위치의 탄소 원자와 결합하고 있는 에틸렌기, 또는 4' 위치의 탄소 원자와 결합하고 있는 에틸리덴기를 나타내는 화합물로서, 구체적으로는 하기 식 (8) 의 구조가 나타내어진다.
[화학식 10]
Figure pct00010
(식 중, Ba 는, 보호되어 있어도 되는 핵산 염기를 나타낸다.)
Z 로 나타내는, 고상 담체, 및 고상 담체와 핵산 올리고머의 3' 말단의 리보스의 2' 위치 혹은 3' 위치의 수산기의 산소 원자를 잇는 연결부로 이루어지는 기로는, 보다 구체적으로는, Z 는, 하기 식 (9) 로 나타내는 구조를 나타내고,
[화학식 11]
Figure pct00011
식 (9) 에 있어서, Sp 는, 스페이서를 나타낸다.
스페이서 (Sp) 로는, 예를 들어, 하기 식 (10) 에 나타내는 구조식을 갖는 것이 예시된다.
[화학식 12]
Figure pct00012
Linker 는, 예를 들어, 하기 식 (11) 에 나타내는 구조여도 되고, 또는 식 (11) 의 구조에 있어서 헥사메틸렌아미노기 부분을 갖지 않는 구조로서, 아미노프로필기가 Si 에 결합한 구조여도 된다. 또는, Linker 는 하기 식 (15) 로 나타내는 구조여도 된다.
[화학식 13]
Figure pct00013
(식 중,
A 는, 수산기, 알콕시기, 또는 알킬기 중 어느 것이어도 된다. 알콕시기로는, 예를 들어 메톡시기 및 에톡시기를 들 수 있다. 알킬기로는, 예를 들어 메틸기, 에틸기, 이소프로필기, n-프로필기를 들 수 있다. Si 는, 담체 표면의 수산기의 산소와 결합하고 있는 것을 나타낸다.)
Solid support 로는, 무기 다공질 담체나 유기계 수지 담체 등을 들 수 있다. 무기 다공질 담체에는, 예를 들어, Controlled Pore Glass (CPG) 를 들 수 있다. 유기계 수지 담체에는, 예를 들어, 폴리스티렌으로 이루어지는 담체를 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 핵산 올리고머 내에 포함되는 뉴클레오시드 (리보스, 및 디옥시리보스) 로는, DNA, RNA, 2'-O-MOE (2'-O-메톡시에틸), 2'-O-Me, 2'-F RNA, 및 상기한 LNA 가 예시되지만, 상기 뉴클레오시드는, 이에 한정되지 않는다.
상기한 산화 용액에 의한 산화 공정을 포함하는 고상 합성법에 의한 핵산 올리고머의 합성 방법은, 전형적으로는, 아래의 공정을 포함한다.
(1) 고상 담체에 링커를 개재하여 결합하고 있는 수산기가 보호된 뉴클레오시드의 5' 위치의 수산기를 탈보호하는 공정,
(2) 상기 공정에서 생성된 5' 위치의 수산기를 포스포르아미다이트 화합물과 커플링 반응시켜 아인산트리에스테르 화합물을 얻는 공정,
(3) 상기 공정에서 생성된 아인산트리에스테르를 산화하여 인산트리에스테르 결합으로 변환하여 신장시킨 핵산 분자를 제조하는 공정, 혹은, 티오인산트리에스테르로 변환하는 임의의 공정,
(4) 상기 공정 (1) ∼ (3), 즉, 생성된 핵산 분자의 5' 위치의 수산기의 탈보호 공정, 5' 위치의 수산기와 아미다이트 화합물의 커플링 공정, 및, 생성된 아인산트리에스테르의 산화 공정으로 구성되는 일련의 반응의 사이클을, 임의의 횟수 반복하여, 고상 담체 상에 핵산 분자를 합성하는 공정, 및
(5) 공정 (4) 에서 생성된 고상 담체 상의 핵산 분자를 잘라냄 및 탈보호하는 공정에 제공하고, 고상 담체로부터 유리시켜, 보호기가 제거된 핵산 올리고머를 제조하는 공정.
단, 상기 핵산 올리고머의 합성 방법에 있어서는, 공정 (2) 또는 (3) 에 계속하여, 포스포르아미다이트 화합물과의 커플링 반응이 진행되지 않은 5' 위치의 수산기를 캡핑하는 공정을 포함하고 있어도 되고, 공정 (4) 를 구성하는 일련의 반응의 사이클 중 어느 공정 사이에 캡핑 공정이 부가되어 있어도 된다.
상기 (5) 의 공정은, 보다 구체적으로는, 공정 (4) 에서 생성된 고상 담체 상의 핵산 분자를, 아래의 공정 (5-1) 및 (5-2) 의 반응의 순으로 실시하고, 이어서 공정 (5-3) 의 반응에 제공함으로써 실시된다. 여기에서 공정 (5-1) 의 반응의 실시는, 임의적이어도 되고, 공정 (5-2) 의 반응의 실시는, 일본 특허공보 제4705716호에 기재된 방법을 이용해도 된다. 그 결과, 고상 담체로부터 유리된 핵산 분자로부터 보호기가 제거된 핵산 올리고머, 혹은, 5' 말단의 수산기가 보호된 핵산 올리고머를 제조할 수 있다.
(5-1) 핵산 분자의 5' 말단의 수산기의 보호기를 탈보호하는 반응,
(5-2) 핵산 분자를 고상 담체로부터 잘라내어 유리시키는 반응, 및,
(5-3) 핵산 분자를 구성하는 리보스의 2' 위치 혹은 3' 말단의 수산기의 3' 위치의 수산기의 보호기를 탈보호하는 반응.
상기 공정 (1) 내지 (6) 의 스킴을 도 1 에 나타낸다. 도 1 에 나타내는 공정 (3) 또는 공정 (4) 에 있어서의 산화 반응이, 상기한 산화 용액을 사용하여 행된다. 스킴 A 에 있어서의 화학식 중의 치환기의 정의는, 상기에서 정의한 바와 같다.
식 (5) 의 핵산 화합물은, 추가로 아미다이트법에 의해서 뉴클레오티드형 또는 비뉴클레오티드형의 링커를 사용하여 임의의 사슬 길이만 신장시키고, 상기 식 (5') 로 나타내는 핵산 화합물의 제조에 사용할 수 있다. 상기 식 (5') 의 고상 담체에 결합한 핵산 화합물로부터 핵산 화합물만을 잘라내어, 상기 식 (6) 으로 나타내는 핵산 올리고머를 얻은 후, 더욱 탈보호하여 상기 식 (7) 로 나타내는 핵산 올리고머를 얻을 수도 있다. 이하, 각 식 중의 치환기에 대해서 더욱 상세하게 설명한다.
Ba 로 나타내는 보호기로 보호되어 있어도 되는 핵산 염기는, 특별히 한정되지 않는다. 당해 핵산 염기로는, 아데닌, 시토신, 구아닌, 우라실, 티민, 5-메틸시토신, 슈도우라실, 1-메틸슈도우라실 등을 들 수 있다. 또, 핵산 염기는, 치환기에 의해서 치환되어 있어도 된다. 그와 같은 치환기로는, 예를 들어, 플루오로기나 클로로기나 브로모기나 요오드기와 같은 할로겐 원자, 아세틸기와 같은 아실기, 메틸기나 에킬기와 같은 알킬기, 벤질기와 같은 아릴알킬기, 메톡시기와 같은 알콕시기, 메톡시에틸기와 같은 알콕시알킬기, 시아노에틸기와 같은 시아노알킬기, 하이드록시기, 하이드록시알킬기, 아실옥시메틸기, 아미노기, 모노알킬아미노기, 디알킬아미노기, 카르복실기, 시아노기, 및 니트로기 등, 그리고 그것들의 2 종류 이상의 치환기의 조합을 들 수 있다.
핵산 염기가 환외 (環外) 에 아미노기를 가질 경우, 당해 아미노기의 보호기로는, 특별히 한정되지 않고, 공지된 핵산 화학에서 사용되는 보호기를 사용할 수 있고, 그와 같은 보호기로는, 예를 들어, 벤조일기, 4-메톡시벤조일기, 아세틸기, 프로피오닐기, 부티릴기, 이소부티릴기, 페닐아세틸기, 페녹시아세틸기, 4-tert-부틸페녹시아세틸기, 4-이소프로필페녹시아세틸기, 및 (디메틸아미노)메틸렌기 등, 그리고 그것들의 2 종류 이상의 보호기의 조합을 들 수 있다.
Ba 는, 보다 구체적으로는,
[화학식 14]
Figure pct00014
(상기 식 중,
R4 는, 수소 원자, 메틸기, 페녹시아세틸기, 4-tert-부틸페녹시아세틸기, 4-이소프로필페녹시아세틸기, 페닐아세틸기, 아세틸기 또는 벤조일기를 나타내고,
R5 는, 수소 원자, 아세틸기, 이소부티릴기 또는 벤조일기를 나타내며,
R6 은, 수소 원자, 페녹시아세틸기, 4-tert-부틸페녹시아세틸기, 4-이소프로필페녹시아세틸기, 페닐아세틸기, 아세틸기 또는 이소부티릴기를 나타내고,
R7 는, 2-시아노에틸기를 나타내고,
R8 은, 수소 원자, 메틸기, 벤조일기, 4-메톡시벤조일기 또는 4-메틸벤조일기를 나타내고, 그리고,
R9 는, 디메틸아미노메틸렌기를 나타낸다.)
중 어느 것으로 나타내는 기를 나타낸다.
G1 로는, 보호기로서 기능할 수 있는 것이면 특별히 제한 없이 사용할 수 있고, 아미다이트 화합물에서 사용되는 공지된 보호기를 널리 사용할 수 있다.
G1 은, 바람직하게는 아래의 기이다.
[화학식 15]
Figure pct00015
(식 중, R1, R2 및 R3 은, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하여 수소 또는 알콕시기를 나타낸다.)
R1, R2 및 R3 은, 1 개가 수소이고, 나머지의 2 개가 동일 또는 상이한 (동일한 것이 바람직하다) 알콕시기인 것이 바람직하고, 알콕시기로는 메톡시기가 특히 바람직하다.
G2 로는, 보호기로서 기능할 수 있는 것이면 특별히 제한 없이 사용할 수 있고, 아미다이트 화합물에서 사용되는 공지된 보호기를 널리 사용할 수 있다. G2 로는, 예를 들어, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 시클로알킬기, 할로알킬기, 아릴기, 헤테로아릴기, 아릴알킬기, 시클로알케닐기, 시클로알킬알킬기, 시크릴알킬기, 하이드록시알킬기, 아미노알킬기, 알콕시알킬기, 헤테로시크릴알케닐기, 헤테로시크릴알킬기, 헤테로아릴알킬기, 실릴기, 실릴옥시알킬기, 모노, 디 또는 트리알킬실릴기, 모노, 디 또는 트리알킬실릴옥시알킬기 등을 들 수 있고, 이것들은 1 개 이상의 전자 구인기로 치환되어 있어도 된다.
G2 는, 바람직하게는, 전자 구인기로 치환된 알킬기이다. 당해 전자 구인기로는, 예를 들어, 시아노기, 니트로기, 알킬술포닐기, 할로겐 원자, 아릴술포닐기, 트리할로메틸기, 트리알킬아미노기 등을 들 수 있고, 바람직하게는 시아노기이다.
G2 로는, 특히 바람직한 것은, 아래의 기이다.
[화학식 16]
Figure pct00016
G3 은, 2 개의 G3 이 서로 결합하여 고리형 구조를 형성하고 있어도 된다. G3 으로는, 양방이 이소프로필기인 것이 바람직하다.
상기 R1, R2, R3 및 G2 의 정의에 있어서의 알킬기는, 직사슬형 또는 분기 사슬형 중 어느 것이어도 되고, 바람직하게는 탄소수 1 ∼ 12 의 알킬기, 보다 바람직하게는 탄소수 1 ∼ 6 의 알킬기이다. 구체적인 알킬기의 예로는, 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 및 헥실을 들 수 있다. 상기 치환기의 정의에 있어서의 알콕시기를 구성하는 알킬기 부분은, 여기에서의 알킬기의 정의와 동일한 정의를 갖는다.
또, 본 발명의 방법에 있어서, 아미다이트 화합물은, 프리의 상태 또는 염의 상태에서 사용할 수 있다. 아미다이트 화합물의 염으로는, 염기 부가염 또는 산 부가염을 들 수 있지만, 특별히 제한되지 않는다. 염기 부가염으로는, 구체적으로는, 나트륨염, 마그네슘염, 칼륨염, 칼슘염, 알루미늄염 등의 무기 염기와의 염 ; 메틸아민, 에틸아민, 에탄올아민 등의 유기 염기와의 염 ; 리신, 오르니틴, 아르기닌 등의 염기성 아미노산과의 염 ; 및 암모늄염을 들 수 있다. 산 부가염으로는, 구체적으로는, 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 질산, 인산 등의 광산 ; 포름산, 아세트산, 프로피온산, 옥살산, 말론산, 말산, 타르타르산, 푸마르산, 숙신산, 락트산, 말레산, 시트르산, 메탄술폰산, 트리플루오로메탄술폰산, 에탄술폰산 등의 유기산 ; 및, 아스파르트산, 글루타민산 등의 산성 아미노산과의 산 부가염을 들 수 있다. 아미다이트 화합물에는, 염, 수화물, 용매화물, 결정 다형 등의 형태도 포함된다.
R 이, 보호된 수산기를 나타낼 때, 그 보호기는, 아미다이트법에 있어서 사용할 수 있는 것이면 되고, 예를 들어, 2'-tert-부틸디메틸실릴 (TBDMS) 기, 2'-비스(2-아세톡시)메틸 (ACE) 기, 2'-(트리이소프로필실릴옥시)메틸 (TOM) 기, 2'-(2-시아노에톡시)에틸 (CEE) 기, 2'-(2-시아노에톡시)메틸 (CEM) 기, 2'-파라-톨루일술포닐에톡시메틸 (TEM) 기, 2'-EMM 기 (국제 공개 2006/022323호) 외에, 국제 공개 제2013/027843호 및 국제 공개 제2019/208571호에 기재된 것을 사용할 수 있다. 이들 리보뉴클레오시드 (RNA) 의 2' 보호기 중, 상기 식 (12) 로 나타내는 보호기가 바람직한 보호기로서 예시된다. 더욱 바람직하게는, EW 로 나타내는 전자 구인기로서 시아노기를 갖는 식 (13) 으로 나타내는 보호기가 예시된다.
[화학식 17]
Figure pct00017
(식 중,
q, Ra 및 Rb 는, 상기 식 (12) 에 있어서의 정의와 동일한 의미이다. 단, Ra 및 Rb 가 동시에 수소 원자를 나타나는 경우는 없다.)
식 (13) 으로 나타내는 보호기는, 예를 들어 국제 공개 제2013/027843호 및 국제 공개 제2019/208571호의 기재에 따라서 합성할 수 있고, 이러한 보호기를 갖는 아미다이트 화합물을 핵산 화합물의 제조에 사용할 수 있다.
핵산의 신장 반응에는, 도 1 의 스킴 A 에 기재된 식 (3) 의 아미다이트 화합물이 사용된다.
비뉴클레오티드 링커로는, 아미노산 골격으로 이루어지는 링커 (예를 들어, 일본 특허공보 제5157168호 또는 일본 특허공보 제5554881호에 기재된 아미노산 골격으로 이루어지는 링커) 가 예시된다. 구체적으로는, 비한정적인 예로서, 예를 들어, 식 (A14-1) 혹은 (A14-2) 혹은 (A14-3) (예를 들어, WO2019/074110 에 기재) 으로 나타내는 링커가 예시된다. 이들 링커 이외에 WO2012/005368, WO2018/182008 또는 WO2019/074110 에 기재된 링커가 예시된다.
[화학식 18]
Figure pct00018
식 (3) 에 있어서의 R 기 및 식 (4) 에 있어서의 R' 기가, 수산기 이외의 치환기인 뉴클레오티드 및 아미다이트는, 일본 특허공보 제3745226호 등에 기재된 공지된 방법, WO2001/053528호 혹은 일본 공개특허공보 2014-221817호 및 그것들에 인용되는 공지된 방법으로 합성되는 뉴클레오시드로부터 제조할 수도 있고, 나아가서는, 시판품으로서 입수 가능한 것을 사용하여, 후술하는 실시예에 기재된 방법에 준거하거나 또는 이들 방법에 적절히 변경을 가한 방법에 의해서 제조할 수 있다.
상기 공정 (1) 내지 (6) 의 아미다이트법에 의한 핵산 화합물의 합성은, 도 1 의 스킴 중의 공정 (3) 에 있어서의 본 발명에 관련되는 산화 반응 공정 이외에는, 일반적으로 공지된 방법 (예를 들어, 상기한 일본 특허공보 제5157168호 또는 일본 특허공보 제5554881호에 기재된 방법) 에 따라서, 탈보호 공정, 축합 공정, 의 각 공정을 반복하여 행함으로써, 핵산 신장 반응을 행할 수 있다. 이하, 각 공정에 대해서 설명한다.
G4 는, 수소 원자, 알칼리 금속 이온, 암모늄 이온, 알킬암모늄 이온, 또는 하이드록시알킬암모늄 이온을 나타낸다. 알칼리 금속 이온으로는, 예를 들어, 나트륨 이온, 및 리튬 이온을 들 수 있다. 또, 알킬암모늄 이온으로서, 구체적인 알킬기의 예로는, 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 및 헥실을 들 수 있지만, 보다 구체적으로는, 예를 들어, 디에틸암모늄 이온, 트리에틸암모늄 이온, 테트라부틸암모늄 이온, 헥실암모늄 이온, 및 디부틸암모늄 이온 등을 들 수 있다. 또, 하이드록시알킬암모늄 이온으로서, 구체적인 하이드록시알킬 부분의 예로는, 예를 들어, 하이드록시메틸, 하이드록시에틸, 하이드록시-n-프로필, 하이드록시이소프로필, 하이드록시-n-부틸, 트리스하이드록시메틸을 들 수 있지만, 보다 구체적인 하이드록시알킬암모늄 이온의 예로는, 트리스하이드록시메틸암모늄 이온 등을 들 수 있다.
G5 는, 수소 원자, 또는 보호기를 나타내고, 보호기를 나타내는 경우에는 G1 과 동일한 보호기를 나타낸다. G5 는 탈보호된 경우에는 수소 원자이지만, 그 경우의 뉴클레오티드 화합물도 또한 일련의 핵산 신장 반응의 공정에 제공된다.
(핵산 신장 반응)
본 명세서에 있어서,「핵산 신장 반응」이란, 포스포디에스테르 결합을 개재하여, 뉴클레오티드를 순차 결합시킴으로써, 올리고뉴클레오티드를 신장시키는 반응을 의미한다. 핵산 신장 반응은, 일반적인 포스포르아미다이트법의 순서에 따라서 행할 수 있다. 핵산 신장 반응은, 포스포르아미다이트법을 채용하는 핵산 자동 합성 장치 등을 사용하여 행해도 된다.
핵산 올리고머의 사슬 길이는, 예를 들어, 2 ∼ 200 mer 이나 10 ∼ 150 mer, 15 ∼ 110 mer 이어도 된다.
공정 (1) 의 5' 탈보호 공정은, 고상 담체 상에 담지되는 RNA 사슬 말단의 5'하이드록실기의 보호기를 탈보호하는 공정이다. 일반적인 보호기로는, 4,4'-디메톡시트리틸기 (DMTr 기) 나 4-모노메톡시트리틸기, 4,4',4"-트리메톡시트리틸기가 사용된다. 탈보호는, 산을 사용하여 행할 수 있다. 탈보호용의 산으로는, 예를 들어, 트리플루오로아세트산, 디클로로아세트산, 트리플루오로메탄술폰산, 트리클로로아세트산, 메탄술폰산, 염산, 아세트산, p-톨루엔술폰산 등을 들 수 있다.
공정 (2) 의 축합 공정은, 상기 탈보호 공정에 의해서 탈보호된 올리고뉴클레오티드 사슬 말단의 5'하이드록실기에 대해서, 도 1 의 스킴 A 에 기재된 하기 식 (3) 으로 나타내는 뉴클레오시드포스포르아미다이트를 결합시키는 반응이다. 또한, 핵산 신장에 사용하는 포스포르아미다이트로는, 식 (3) 또는 (A12) 로 나타내는 아미다이트 화합물을 사용한다. 또, 그 밖에 사용 가능한 포스포르아미다이트로서, 2'-OMe, 2'-F, 2'-O-tert-부틸디메틸실릴기, 2'-O-메톡시에틸기, 2'-H,2'-플루오로-2'-디옥시-β-D-아라비노프라노실 등을 들 수 있다. 상기 뉴클레오시드포스포르아미다이트로는, 5'하이드록실기가 보호기 (예, DMTr 기) 로 보호된 것을 사용한다. 축합 공정은, 상기 뉴클레오시드포스포르아미다이트를 활성화하는 활성화제를 사용하여 행할 수 있다. 활성화제로는, 예를 들어, 5-벤질티오-1H-테트라졸 (BTT), 1H-테트라졸, 4,5-디시아노이미다졸 (DCI), 5-에틸티오-1H-테트라졸 (ETT), N-메틸벤즈이미다졸륨트리플레이트 (N-MeBIT), 벤즈이미다졸륨트리플레이트 (BIT), N-페닐이미다졸륨트리플레이트 (N-PhIMT), 이미다졸륨트리플레이트 (IMT), 5-니트로벤즈이미다졸륨트리플레이트 (NBT), 1-하이드록시벤조트리아졸 (HOBT) 또는 5-(비스-3,5-트리플루오로메틸페닐)-1H-테트라졸 등을 들 수 있다.
도 1 의 스킴 A 에 기재된 식 (3) 으로 나타내는 뉴클레오시드포스포르아미다이트 (이하, 아미다이트라고 호칭한다) 는, 아래와 같다
식 :
[화학식 19]
Figure pct00019
(식 중,
G1, G2, G3, Ba, 및 R 은, 상기한 바와 같다.) 으로 나타내는 화합물.
축합 공정 후에는, 적절히, 미반응의 5'하이드록실기를 캡핑해도 된다. 캡핑은, 무수 아세트산-테트라하이드로푸란 용액, 페녹시아세트산 무수물/N-메틸이미다졸 용액 등의 공지된 캡핑 용액을 사용하여 행할 수 있다.
공정 (3) 의 산화 공정은, 상기 축합 공정에 의해서 형성된 아인산기를 인산기 또는 티오인산기로 변환하는 공정이다. 본 공정은, 3 가의 인으로부터 5 가의 인으로 산화제를 사용하여 변환하는 반응으로서, 고상 담체에 담지되어 있는 올리고핵산 유도체에 산화제를 작용시킴으로써 실시할 수 있다.
아인산기를 인산기로 변환하는 경우에는,「산화제」로서, 예를 들어, 요오드를 사용할 수 있다. 그 산화제는, 0.005 ∼ 2 M 의 농도가 되도록 조제하여 사용할 수 있다. 산화의 산소원으로는 물을 사용할 수 있고, 반응을 진행시키는 염기로는 피리딘, N-메틸이미다졸 (NMI), N-메틸모르폴린, 트리에틸아민을 사용할 수 있다. 또, 용매로는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않지만, 아세토니트릴, 테트라하이드로푸란 (THF) 또는 이것들의 임의의 비율로 혼합하여 사용할 수도 있다. 예를 들어, 요오드/물/피리딘/아세토니트릴, 혹은 요오드/물/피리딘 혹은 요오드/물/피리딘/NMI, 혹은 요오드/물/피리딘/THF 를 사용할 수 있다. 반응 온도는, 5 ℃ ∼ 50 ℃ 가 바람직하다. 반응 시간은, 통상적으로 1 분 ∼ 30 분이 적당하다. 사용하는 시약의 양은 고상 담체에 담지되어 있는 화합물 1 ㏖ 에 대해서 1 ∼ 100 ㏖ 이 바람직하고, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 ㏖ 이다.
아인산트리에스테르기를 티오인산기로 변환하는 경우에는,「산화제」로서, 예를 들어, 황, 3H-1,2-벤조디티올-3-온-1,1-디옥시드 (Beaucage 시약), 3-아미노-1,2,4-디티아졸-5-티온 (ADTT), 5-페닐-3H-1,2,4-디티아졸-3-온 (POS), [(N,N-디메틸아미노메틸리덴)아미노]-3H-1,2,4-디티아졸린-3-티온 (DDTT), 및 페닐아세틸디술파이드 (PADS) 를 사용할 수 있다. 그 산화제는, 0.001 ∼ 2 M 의 농도가 되도록 적당한 용매로 희석하여 사용할 수 있다. 반응에 사용하는 용매로는, 반응에 관여하지 않으면 특별히 한정되지 않는데, 예를 들어, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 피리딘 또는 이것들의 임의의 혼합 용매를 들 수 있다. 산화 공정은, 상기 캡핑 조작 후에 행해도 되고, 반대로, 산화 공정 후에 캡핑 조작을 행해도 되며, 이 순서는 한정되지 않는다.
공정 (5) 에 있어서, 인산보호기를 탈보호하는 공정은, 원하는 서열을 갖는 핵산의 합성이 완료된 후에는, 인산 부분의 보호기를 탈보호하기 위해서 아민 화합물을 작용시킨다. 아민 화합물로는, 예를 들어, 일본 특허공보 제4705716호에 기재되는 디에틸아민 등을 들 수 있다.
신장의 최후에 도입한 뉴클레오시드의 5'하이드록실기의 보호기는, 후술하는 고상 담체로부터의 잘라내기 및 보호기의 탈보호 후, 5' 보호기를 태그로 하는 칼럼 정제를 위해서 사용해도 되고, 칼럼 정제 후, 5'하이드록실기의 보호기를 탈보호해도 된다.
공정 (5) 에 있어서의, 고상 담체 상에서 원하는 사슬 길이로 신장시킨 핵산 올리고머의, 고상 담체로부터의 잘라내기는, 통상적으로 잘단제로서 농암모니아수를 사용하여 행된다.
또한 암모니아 또는 아민 화합물 등을 사용하여, 예를 들어, 고상 담체로부터 올리고뉴클레오티드 사슬을 절단하여 회수한다. 아민 화합물로는, 예를 들어, 메틸아민, 에틸아민, 이소프로필아민, 에틸렌디아민, 디에틸아민 등을 들 수 있다.
공정 (6) 에 있어서, 공정 (5) 에 있어서 고상 담체로부터 잘라내어진 핵산 화합물 (6) 의 리보스의 2 위치 혹은 3 위치의 수산기의 보호기는, 국제 공개 2006/022323호), 국제 공개 제2013/027843호, 또는 국제 공개 제2019/208571호에 기재된 방법에 따라서 제거할 수 있어, 탈보호된 핵산 올리고머 (7) 를 얻을 수 있다.
본 발명의 제조 방법을 이용하여 제조 가능한 핵산 올리고머로는, 핵산 올리고머 내에 포함되는 뉴클레오시드가, RNA, DNA, 그리고 2'-O-MOE, 2'-O-Me, 2'-F 를 갖는 RNA, 및 LNA 인 핵산 올리고머를 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, Xiulong, Shen 등 저, Nucleic Acids Research, 2018, Vol.46, No.46, 1584-1600, 및 Daniel O'Reilly 등 저, Nucleic Acids Research, 2019, Vol.47, No.2, 546-558 에 기재된, 다양한 뉴클레오시드의 예를 들 수 있다.
본 발명의 제조 방법에 있어서 사용 가능한 핵산 올리고머의 전형적인 예를, 실시예에 기재된 예에 추가하여 하기의 예를 나타내지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 서열의 설명 중, U 는 우리딘을, C 는 시티딘을, A 는 아데노신을, 또 G 는 구아노신을 나타낸다.
국제 공개 제2019/060442호에 기재되어 있는, 하기의 서열 (B) 및 (C) 를 갖는 핵산 올리고머를 들 수 있다.
서열 (B) : 5'-AUGGAAU㎃CUCUUGGUU㎃CdTdT-3' (안티센스) (서열 번호 3) 21 mer
서열 (C) : 5'-GU㎃ACmC㎃AGAGU㎃UmUmCmC㎃UmdTdT-3' (센스) (서열 번호 4) 21 mer
서열 (B) 및 (C) 중, Um 은 2'-O-메틸우리딘을, Cm 은 2'-O-메틸시티딘을, 또 dT 는 티미딘을 나타낸다.
Daniel O'Reilly 등 저, Nucleic Acids Research, 2019, Vol.47, No.2, 546-558 에 기재되어 있는 핵산 올리고머 (553 페이지 참조) 를 들 수 있다. 전형예로서, 하기의 서열 (D) 를 갖는 핵산 올리고머를 들 수 있다.
서열 (D) : 5'-AGAGCCAGCCUUCUUAUUGUUUUAGAGCUAUGCUGU-3' (서열 번호 5) 36 mer
JP4965745 에 기재되어 있는 핵산 올리고머를 들 수 있다. 전형예로서, 하기의 서열 (E) 를 갖는 핵산 올리고머를 들 수 있다.
서열 (E) : 5'-CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-P-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU-3' 49 mer. CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC (서열 번호 6), GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU (서열 번호 7).
서열 (E) 중, "P" 는, 아래의 식 (A5) 에 있어서 파선으로 구획되는 부분 구조로 나타내어진다.
Nucleic Acids Research, 2019, Vol.47, No.2 : 547 에 기재되어 있는, 하기의 서열 (F) 를 갖는 핵산 올리고머를 들 수 있다.
서열 (F) : 5'-ACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3' (서열 번호 8) 67 mer
JP 2015-523856, 173 에 기재되어 있는, 하기의 서열 (G) 을 갖는 핵산 올리고머를 들 수 있다.
서열 (E) : 5'-GUUUUCCCUUUUCAAAGAAAUCUCCUGGGCACCUAUCUUCUUAGGUGCCCUCCCUUGUUUAAACCUGACCAGUUAACCGGCUGGUUAGGUUUUU-3' (서열 번호 9) 94 mer
JP 2017-537626 에 기재되어 있는 핵산 올리고머를 들 수 있다. 전형예로서, 하기의 서열 (F) (G) (H) (J) 를 갖는 핵산 올리고머를 들 수 있다.
서열 (F) : 5'-AGUCCUCAUCUCCCUCAAGCGUUUUAGAGCUAGUAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3' (서열 번호 10) 100 mer
서열 (G) : 5'-GCAGAUGUAGUGUUUCCACAGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU-3' (서열 번호 11) 113 mer
서열 (H) : 5'-dAdGdTdCdCdTdCdAdTdCdTdCdCdCdTdCdAdAdGdCGUUUAAGAGCUAUGCUGGUAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU-3' (서열 번호 12) 113 mer
서열 (H) 중, dT 는 티미딘을, dC 는 2'-디옥시시티딘을, dA 는 2'-디옥시아데노신을, 또 dG 는 2'-디옥시구아노신을 나타낸다.
서열 (J) : 5'-AmsGmsUmsCCUCAUCUCCCUCAAGCGUUUAAGAGCUAUGCUGGUAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUmsUmsUmsU-3' (서열 번호 13) 113 mer
서열 (J) 중, Um 은 2'-O-메틸우리딘을, Am 은 2'-O-메틸아데노신을, Gm 은 2'-O-메틸구아노신을, 또 s 는 포스포로티오에이트 수식을 나타낸다.
[실시예]
이하, 실시예에 의해서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
＜측정 방법＞
먼저, 아래의 시험에서 사용한 각종 측정 방법을 아래에 나타낸다.
올리고뉴클레오티드 순도는, HPLC 를 사용하여 측정하였다.
HPLC 측정 조건을 하기 표 1 에 나타낸다.
(측정 방법 1 : 올리고뉴클레오티드 순도의 측정)
Figure pct00020
(측정 방법 2 : 올리고뉴클레오티드 수량의 측정)
상기 미정제 생성물의 OD260 을 측정하였다. OD260 은 1 ㎖ 용액 (pH = 7.5) 에 있어서의 10 ㎜ 광로 길이당 UV260 ㎚ 의 흡광도를 나타낸다. 일반적으로 RNA 에서는 1O D = 40 ㎍ 인 것이 알려져 있는 점에서, 상기 OD260 의 측정값에 기초하여 수량을 산출하였다.
(측정 방법 3 : 요오드산 농도의 측정)
요오드산의 측정은, 이온 크로마토그래프법에 의해서 행하였다. 표준품 (NaIO3) 과 비교하여 농도를 산출하였다. 이온 크로마토그래프법의 측정 조건을 하기 표 2 에 나타낸다.
Figure pct00021
(측정 방법 4 : 요오드 농도의 측정)
요오드의 측정은, 이온 크로마토그래프법에 의해서 행하였다. 표준품 (I2) 과 비교하여 농도를 산출하였다. 이온 크로마토그래프법의 측정 조건을 하기 표 3 에 나타낸다.
Figure pct00022
＜올리고뉴클레오티드의 고상 합성＞
서열 (I) : 5'-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G-3' (서열 번호 1, 2) 53 mer
상기 서열 (I) 에 있어서, "A" 는, 아래의 식 (A1) 에 있어서 파선으로 구획되는 부분 구조로 나타내어진다. " C" 는, 아래의 식 (A2) 에 있어서 파선으로 구획되는 부분 구조로 나타내어진다. " G" 는, 아래의 식 (A3) 에 있어서 파선으로 구획되는 부분 구조로 나타내어진다. "U" 는, 아래의 식 (A4) 에 있어서 파선으로 구획되는 부분 구조로 나타내어진다. " P" 는, 아래의 식 (A5) 에 있어서 파선으로 구획되는 부분 구조로 나타내어진다. 또한, 5' 말단의 "A" 는, 아래의 식 (A6) 에 있어서 파선으로 구획되는 부분 구조로 나타내어진다. 또, 3' 말단의 "G" 는, 아래의 식 (A7) 에 있어서 파선으로 구획되는 부분 구조로 나타내어진다.
AGCAGAGUAC ACACAGCAUA UACC (서열 번호 1)
GGUAUAUGCU GUGUGUACUC UGCUUC (서열 번호 2)
[화학식 20]
Figure pct00023
[화학식 21]
Figure pct00024
[화학식 22]
Figure pct00025
[화학식 23]
Figure pct00026
[화학식 24]
Figure pct00027
[화학식 25]
Figure pct00028
[화학식 26]
Figure pct00029
고상 담체로서, Controlled Pore Glass (CPG) 를 사용하고, 핵산 합성기로서, NTS M-4MX-E (니혼 테크노 서비스사 제조) 혹은 AKTA oligopilot plus100 (GE 헬스케어사 제조) 을 사용하여, 포스포르아미다이트 고상 합성법에 의해서, 상기 서열 (I) 로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 3' 측으로부터 5' 측을 향하여 합성하였다. 합성은, NTS M-4MX-E (니혼 테크노 서비스사 제조) 를 사용한 경우에는, 약 1 μ㏖ 스케일로 실시하고, AKTA oligopilot plus100 (GE 헬스케어사 제조) 을 사용한 경우에는 약 80 μ㏖ 스케일로 실시하였다. 또, 합성에는, US2012/0035246 의 실시예 2 에 기재된 우리딘 EMM 아미다이트, 실시예 3 에 기재된 시티딘 EMM 아미다이트, 실시예 4 에 기재된 아데노신 EMM 아미다이트, 실시예 5 에 기재된 구아노신 EMM 아미다이트 및 WO2017/188042 에 기재된 화합물 (3) 을 사용하고, 디블로킹 용액으로서 고순도 트리클로로아세트산톨루엔 용액을 사용하며, 축합제로서 5-벤질메르캅토-1H-테트라졸을 사용하고, 산화제로서 요오드 용액을 사용하고, 캡핑 용액으로서 페녹시아세트산 무수물 용액과 N-메틸이미다졸 용액을 사용하였다.
[화학식 27]
Figure pct00030
[화학식 28]
Figure pct00031
[화학식 29]
Figure pct00032
[화학식 30]
Figure pct00033
[화학식 31]
Figure pct00034
다음으로, 본 발명의 제법에 의해서 제조되는 핵산 올리고머의 구체적인 제조예를 나타낸다. 여기에서, 하기의 실시예에 있어서 본 발명의 제법에 의해서 제조되는 올리고뉴클레오티드는, 상기 서열 번호 1 및 2 로 나타내는 서열 (I) 을 갖는 핵산 올리고머이다.
또, 아래의 실시예 및 비교예 중에 기재하는 구아노신 유도체는, 하기의 구조식으로 나타내는 화합물을 의미한다. 하기 구조식에 있어서 도시된 써클은, CPG 를 모식적으로 나타내는 것이다.
[화학식 32]
Figure pct00035
(실시예 1)
1.08 μ㏖ 의 구아노신 유도체를 담지한 Controlled Pore Glass (CPG) 와, 식 (A8), 식 (A9), 식 (A10), 식 (A11), 또는 식 (A12) 에 나타내는 아미다이트를 사용하여, 서열 (I) 에 나타내는 핵산 올리고머를 NTS M-4MX-E (니혼 테크노 서비스사 제조) 에 의해서, 3' 측으로부터 5' 측을 향하여 자동 합성하였다. 자동 합성의 순서는, 먼저, 3 ％ 트리클로로아세트산 톨루엔 용액을 각 회 1.4 ㎖ CPG 에 송액하여, 5' 위치의 트리틸 보호기를 탈보호하고, 계속해서, 각종 아미다이트를 0.3 ㎖ 와 축합제로서 5-벤질메르캅토-1H-테트라졸을 각 0.4 ㎖ 분 CPG 에 송액하여, 5' 위치의 수산기에 커플링 반응을 진행시켰다. 계속해서, 11 mM 요오드를 함유하는 아세토니트릴 : 물 : 피리딘 = 58.2 : 34.4 : 7.2 (중량％) 용액을 조제한 후, 25 ℃ 에서 2 년간 보관한 것을 0.7 ㎖ 송액하여, 아인산기를 인산기로 변환하였다. 핵산 합성에 사용했을 때의 산화 용액 중의 요오드의 몰 농도는, 측정 방법 4 에 의해서 측정할 수 있고, 그 농도는 11 mM 이며, 요오드산 농도는, 측정 방법 3 에 의해서 측정할 수 있고, 그 농도는 0.029 mM 이었다. 즉, 합성에 사용했을 때의 산화 용액 중의 요오드의 몰 농도에 대한 요오드산의 몰 농도의 비는 2.6 × 10-3 이었다. 계속해서, 캡핑 용액으로서 0.1 M 페녹시아세트산 무수물 아세토니트릴 용액 0.5 ㎖ 와 10 ％ N-메틸이미다졸/10 ％ 2,6-루티딘아세토니트릴 용액 0.5 ㎖ 를 사용하여, 커플링이 진행되지 않은 반응점에 캡핑을 실시하였다. 또한 이들 공정을 합계 52 회 반복하고, 서열 (I) 에 나타내는 서열의 핵산 올리고뉴클레오티드를 CPG 담체 상에 합성한 후, 5' 위치의 트리틸 보호기를 3 ％ 트리클로로아세트산 톨루엔 용액으로 탈보호하였다. 그 후, 전량의 올리고뉴클레오티드를 담지한 CPG 담체에 대해서, 752 ㎕ 의 암모니아수와 252 ㎕ 의 에탄올을 사용하여, 핵산 올리고머를 고상 담체로부터 유리시킨 후, 질소 불어넣기에 의해서 암모니아수와 에탄올을 제거하였다. 이어서 유리 올리고뉴클레오티드를 400 ㎕ 의 디메틸술폭시드에 용해 후, 니트로메탄 5.3 ㎕ 와 교반자를 넣은 후, 몰레큘러시브 4A 로 탈수 처리를 실시한 1 M 의 불화테트라-n-부틸암모늄 (TBAF) 의 디메틸술폭시드 용액 530 ㎕ (TBAF 의 양은 보호기 1 몰당 10.2 ㏖) 를 스터러에 의한 교반 하 30 ℃ 에서 유입하고, 혼합물을 4 시간 보온함으로써 2'-EMM 보호기의 탈보호를 행하였다. 핵산 올리고머를 침전 조작에 의해서 얻었다. 측정 방법 2 에 의한 측정 결과, 수량은 9.1 ㎎, 측정 방법 1 에 의한 측정 결과, 순도는 61 ％ 였다.
(실시예2)
실시예 1 의 실험에 있어서, 78.20 μ㏖ 의 구아노신 유도체를 담지한 Controlled Pore Glass (CPG) 를 사용하는 스케일로 하고, AKTA oligopilot plus100 (GE 헬스케어사 제조) 을 사용하며, 요오드를 함유하는 산화 용액으로서, 표 2 에 기재된 용액을 사용하는 것 및, 핵산 합성 조작 종료 후, 20.13 μ㏖ 분의 올리고뉴클레오티드를 담지한 CPG 담체를 채취하고, 7.5 ㎖ 의 암모니아수와 2.5 ㎖ 의 에탄올을 사용하여, 핵산 올리고머를 고상 담체로부터 유리시킨 후, 이배퍼레이터에 의한 농축에 의해서 암모니아수와 에탄올을 제거하고, 이어서 유리 올리고뉴클레오티드를 8.0 ㎖ 의 디메틸술폭시드에 용해 후, 니트로메탄 106 ㎕ 와 교반자를 넣은 후, 몰레큘러시브 4A 로 탈수 처리를 실시한 1 M 의 불화테트라-n-부틸암모늄 (TBAF) 의 디메틸술폭시드 용액 10.6 ㎖ (TBAF 의 양은 보호기 1 몰당 10.2 ㏖) 를 사용한 것 이외에는, 동일한 방식으로, 서열 (I) 의 핵산 올리고머를 얻었다. 수량은 170.5 ㎎, 순도는 60 ％ 였다.
(실시예 3)
실시예 1 의 실험에 있어서, 1.10 μ㏖ 의 구아노신 유도체를 담지한 Controlled Pore Glass (CPG) 를 사용하고, 요오드를 함유하는 산화 용액으로서, 표 2 에 기재된 용액을 사용하는 것 이외에는, 동일한 방식으로 서열 (I) 의 핵산 올리고머를 얻었다. 수량은 8.4 ㎎, 순도는 60 ％ 였다.
(실시예 4)
실시예 2 의 실험에 있어서, 산화 용액으로서, 하기 표에 기재된 것을 사용하고, 78.20 μ㏖ 의 구아노신 유도체를 담지한 Controlled Pore Glass (CPG) 를 사용하는 스케일로 하며, 요오드를 함유하는 산화 용액으로서 표 2 에 기재된 산화 용액을 사용하는 것 및, 핵산 합성 조작 종료 후, 20.16 μ㏖ 분의 올리고뉴클레오티드를 담지한 CPG 담체를 채취한 것 이외에는, 동일한 방식으로 서열 (I) 의 핵산 올리고머를 얻었다. 수량은 180.0 ㎎, 순도는 59 ％ 였다.
(실시예 5)
실시예 1 의 방법에 있어서, 1.06 μ㏖ 의 구아노신 유도체를 담지한 Controlled Pore Glass (CPG) 와, 표 2 에 기재된 요오드를 함유하는 산화 용액을 사용하는 것 이외에는, 동일한 방식으로 서열 (I) 의 핵산 올리고머를 얻었다. 수량은 9.1 ㎎, 순도는 56 ％ 였다.
(실시예 6)
실시예 2 의 방법에 있어서, 요오드를 함유하는 산화 용액으로서, 표 2 에 기재된 산화 용액을 사용하는 것 및, 핵산 합성 조작 종료 후, 20.20 μ㏖ 분의 올리고뉴클레오티드를 담지한 CPG 담체를 채취한 것 이외에는, 동일한 방식으로 서열 (I) 의 핵산 올리고머를 얻었다. 수량은 154.8 ㎎, 순도는 57 ％ 였다.
(실시예 7)
실시예 1 의 방법에 있어서, 1.09 μ㏖ 의 구아노신 유도체를 담지한 Controlled Pore Glass (CPG) 와, 표 2 에 기재된 산화 용액을 사용하는 것 이외에는, 동일한 방식으로 서열 (I) 의 핵산 올리고머를 얻었다. 미정제 생성물은 침전 조작에 의해서 얻었다. 수량은 9.2 ㎎, 순도는 49 ％ 였다.
(실시예 8)
실시예 1 의 방법에 있어서, 1.04 μ㏖ 의 구아노신 유도체를 담지한 Controlled Pore Glass (CPG) 와, 표 2 에 기재된 산화 용액을 사용하는 것 이외에는, 동일한 방식으로, 서열 (I) 의 핵산 올리고뉴클레오티드를 얻었다. 수량은 7.7 ㎎, 순도는 46 ％ 였다.
(실시예 9)
실시예 1 의 방법에 있어서, 1.00 μ㏖ 의 구아노신 유도체를 담지한 Controlled Pore Glass (CPG) 와, 표 2 에 기재된 산화 용액을 사용하는 것 이외에는, 동일한 방식으로 서열 (I) 의 핵산 올리고머를 얻었다. 수량은 7.9 ㎎, 순도는 42 ％ 였다.
참고예 1
실시예 1 의 방법에 있어서, 1.04 μ㏖ 의 구아노신 유도체를 담지한 Controlled Pore Glass (CPG) 와 표 2 에 기재된 산화 용액을 사용하는 것 이외에는, 동일한 방식으로 서열 (I) 의 핵산 올리고머를 얻었다. 수량은 7.8 ㎎, 순도는 35 ％ 였다.
실시예 1 ∼ 9, 및 참고예 1 의 결과를, 표 4 에 나타낸다.
Figure pct00036
상기 표의 결과로부터, 일정한 비율의 요오드산의 요오드에 대한 몰비율이 30 × 10-3 이하인 본 발명의 산화 용액을 사용한 경우에는, 참고예 1 의 산화 용액을 사용한 경우와 비교하여, 고순도의 핵산 올리고머가 얻어졌다.
본 발명은 효율적인 핵산 올리고머의 제조 방법을 제공한다. 또, 핵산 올리고머의 제조 방법에 따라서 제조되는 핵산 올리고머의 순도 향상을 기대할 수 있다.
서열표 프리 텍스트
서열표의 서열 번호 1 ∼ 13 은, 본 발명의 제조 방법에 따라서 제조되는 올리고뉴클레오티드의 염기 서열을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> SUMITOMO CHEMICAL COMPANY, LIMITED <120> METHOD FOR PREPARING NUCLEIC ACID OLIGOMER <130> S44384WO01 <150> JP 2020-012787 <151> 2020-01-29 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 1 agcagaguac acacagcaua uacc 24 <210> 2 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 2 gguauaugcu guguguacuc ugcuuc 26 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (7)..(7), (17)..(17) <223> um <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> dT <400> 3 auggaanacu cuuggunacn n 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (2)..(2), (12)..(12), (14)..(15), (19)..(19) <223> um <220> <221> modified_base <222> (5)..(6), (16)..(17) <223> cm <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> dT <400> 4 gnaannaaga gnannnnann n 21 <210> 5 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 5 agagccagcc uucuuauugu uuuagagcua ugcugu 36 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 6 ccaugagaag uaugacaaca gcc 23 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 7 ggcuguuguc auacuucuca ugguu 25 <210> 8 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 8 acagcauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu 60 cggugcu 67 <210> 9 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 9 guuuucccuu uucaaagaaa ucuccugggc accuaucuuc uuaggugccc ucccuuguuu 60 aaaccugacc aguuaaccgg cugguuaggu uuuu 94 <210> 10 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 10 aguccucauc ucccucaagc guuuuagagc uaguaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 11 <211> 113 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 11 gcagauguag uguuuccaca guuuaagagc uaugcuggaa acagcauagc aaguuuaaau 60 aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 113 <210> 12 <211> 113 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1), (8)..(8), (17)..(18) <223> dA <220> <221> modified_base <222> (2)..(2), (19)..(19) <223> dG <220> <221> modified_base <222> (3)..(3), (6)..(6), (9)..(9), (11)..(11), (15)..(15) <223> dT > SUMITOMO CHEMICAL CO., LTD. <220> <221> modified_base <222> (4)..(5), (7)..(7), (10)..(10), (12)..(14), (16)..(16), (20)..(20) <223> dC <400> 12 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuaagagc uaugcuggua acagcauagc aaguuuaaau 60 aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 113 <210> 13 <211> 113 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> am <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> gm <220> <221> modified_base <222> (3)..(3), (110)..(113) <223> um <400> 13 nnnccucauc ucccucaagc guuuaagagc uaugcuggua acagcauagc aaguuuaaau 60 aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuun nnu 113

Claims (27)

  1. 식 (I) :
    Figure pct00037

    (식 중,
    G1 및 G2 는 각각, 독립적으로, 수산기의 보호기를 나타내고, Ba 는, 보호기로 보호되어 있어도 되는 핵산 염기를 나타내고,
    R 은, 보호된 수산기, 수소 원자, 불소 원자, 메톡시기, 2-메톡시에틸기, 또는 OQ' 기를 나타내며,
    Q' 는, 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합하고 있는 메틸렌기, 4' 위치의 탄소 원자와 결합하고 있는 에틸렌기, 또는 4' 위치의 탄소 원자와 결합하고 있는 에틸리덴기를 나타내고, 그리고,
    * 가 붙은 결합은, 핵산의 3' 말단측으로의 결합을 나타낸다.)
    로 나타내는 뉴클레오티드를 5' 말단에 갖는 핵산 화합물의, 포스포르아미다이트법에 의한 제조 방법으로서, 5' 말단에 식 (II) :
    Figure pct00038

    (식 중,
    G1, G2, Ba, R 및 * 는, 상기 정의한 바와 같다.)
    로 나타내는 아인산트리에스테르 결합을 갖는 전구체에, 요오드, 피리딘 및 물을 함유하고, 요오드산과 요오드의 몰비 (요오드산 ㏖/요오드 ㏖) 가 30 × 10-3 이하인 산화 용액을 반응시키는 공정을 포함하는, 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    아인산트리에스테르 결합을 갖는 전구체가, 식 (4) :
    Figure pct00039

    (식 중,
    G1 은, 수산기의 보호기를 나타내고,
    G2 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이한 수산기의 보호기를 나타내며,
    Ba 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하고, 보호기로 보호되어 있어도 되는 핵산 염기를 나타내고,
    R 은, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하여, 보호된 수산기, 수소 원자, 불소 원자, 메톡시기, 2-메톡시에틸기, 또는 OQ' 기를 나타내고,
    Q' 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하여, 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합하고 있는 메틸렌기, 4' 위치의 탄소 원자와 결합하고 있는 에틸렌기, 또는 4' 위치의 탄소 원자와 결합하고 있는 에틸리덴기를 나타내고,
    Y 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하여, 산소 원자 또는 황 원자를 나타내고,
    n 은, 1 이상 200 까지의 어느 정수를 나타내고,
    X 가 OZ 를 나타낼 때, W 는 OV 기를 나타내고, V 는 수산기의 보호기를 나타내며,
    X 가 R 기를 나타낼 때, W 는 OZ 로 나타내는 기를 나타내고,
    Z 는, 고상 담체 및 연결기로 이루어지는 구조를 갖는 기이다.
    그리고, n 이 2 이상의 정수일 때, 식 (4) 로 나타내는 핵산 화합물은, 각각의 5' 말단과 3' 말단의 뉴클레오티드 사이의 적어도 1 개의 뉴클레오티드 대신에, 비뉴클레오티드 링커가 삽입되어 있어도 된다.)
    로 나타내는 화합물이고, 인산트리에스테르 결합을 갖는 화합물이, 식 (5) :
    Figure pct00040

    (식 중,
    G1, G2, Ba, R, n, W, X, 및 Y 는, 상기한 바와 같고, 그리고,
    식 (4) 에 있어서 정의된 바와 같이, 뉴클레오티드 대신에, 비뉴클레오티드 링커가 삽입되어 있어도 된다.)
    로 나타내는 핵산 화합물인, 제조 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    식 (5) 의 핵산 화합물을 아미다이트법으로 임의로 사슬 길이를 신장시킨 식 (5') :
    Figure pct00041

    (식 중,
    G2, Ba, R, X 및 W 는, 식 (5) 에 대해서 정의된 바와 같고,
    G5 는, 수산기의 보호기, 혹은 수소 원자를 나타내며,
    m 은, m ≥ n 을 만족하는 정수이고, 그리고,
    Y 는, 각각 독립적으로, 산소 또는 황을 나타낸다.
    단, 적어도 1 개의 Y 는, 산소 원자이다.)
    로 나타내는 핵산 화합물을 얻는 공정,
    식 (5') 의 화합물로부터 식 (6) :
    Figure pct00042

    (식 중,
    G5, R 및 m 은, 상기한 바와 같고,
    Bc 는 각각 독립적으로 동일 또는 상이한 핵산 염기를 나타내며,
    G4 는 수소 원자, 알칼리 금속 이온, 암모늄 이온, 알킬암모늄 이온, 또는 하이드록시알킬암모늄 이온을 나타내고,
    Y 는, 각각 독립적으로, 산소 또는 황을 나타내며, 또한, 적어도 1 개가, 산소 원자이고, 그리고,
    X1 은, 수산기를 나타내며, 또한 W1 은, OV 기를 나타내고, 여기에서 V 는, 수산기의 보호기를 나타내거나, 혹은
    X1 은, R 기를 나타내며, 또한 W1 은, 수산기를 나타낸다.)
    으로 나타내는 화합물을 잘라내고,
    추가로 식 (6) 의 화합물을 탈보호하여, 식 (7) :
    Figure pct00043

    (식 중,
    m, Y, G4 및 Bc 는, 상기 정의한 바와 같고,
    R' 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하여, 수산기, 수소 원자, 불소 원자, 메톡시기, 2-메톡시에틸기, 또는 OQ' 기를 나타내며,
    Q' 는, 각각 독립적으로, 동일 또는 상이하여, 리보스의 4' 위치의 탄소 원자와 결합하고 있는 메틸렌기, 4' 위치의 탄소 원자와 결합하고 있는 에틸렌기, 또는 4' 위치의 탄소 원자와 결합하고 있는 에틸리덴기를 나타내고,
    그리고,
    X10 및 W10 은 각각, 각각 독립적으로, 수산기를 나타내거나, 혹은
    X10 은, R' 기를 나타내며, 또한, W10 은, 수산기를 나타낸다.)
    로 나타내는 탈보호된 핵산 올리고머를 제조하는 공정을 추가로 포함하는, 핵산 올리고머의 제조 방법.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
    비뉴클레오티드 링커가, 아미노산 골격으로 이루어지는 링커인, 제조 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    아미노산 골격으로 이루어지는 링커가, 하기 식 (A14-1), (A14-2) 및 (A14-3) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 구조를 갖는 링커인, 제조 방법.
    Figure pct00044
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    산화 용액의 요오드의 농도가, 0.005 ∼ 2 M 인, 제조 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    산화 용액의 요오드의 농도가, 0.005 ∼ 0.2 M 인, 제조 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    산화 용액의 요오드의 농도가, 0.007 ∼ 0.1 M 인, 제조 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    산화 용액의 요오드의 농도가, 0.008 ∼ 0.07 M 인, 제조 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    산화 용액이, 요오드, 피리딘 및 물을 혼합하여 조제되는, 제조 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    산화 용액이, 아세토니트릴 및 테트라하이드로푸란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 용매를 추가로 함유하는 산화 용액인, 제조 방법.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,
    산화 용액이, 아세토니트릴 용매를 추가로 함유하는 산화 용액인, 제조 방법.
  13. 제 11 항에 있어서,
    산화 용액의 용매가, 피리딘, 물, 아세토니트릴, 및 테트라하이드로푸란을, 1 ∼ 90 : 1 ∼ 50 : 0 ∼ 90 : 0 ∼ 90 의 체적 비율로 혼합한 혼합 용매인, 제조 방법.
  14. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
    산화 용액의 용매가, 피리딘, 물, 및 아세토니트릴을, 1 ∼ 90 : 1 ∼ 50 : 0 ∼ 90 의 체적 비율로 혼합한 혼합 용매인, 제조 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    요오드산과 요오드의 몰비 (요오드산 ㏖/요오드 ㏖) 가 25 × 10-3 이하인, 제조 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    요오드산과 요오드의 몰비 (요오드산 ㏖/요오드 ㏖) 가 20 × 10-3 이하인, 제조 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    요오드산과 요오드의 몰비 (요오드산 ㏖/요오드 ㏖) 가 15 × 10-3 이하인, 제조 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    요오드산과 요오드의 몰비 (요오드산 ㏖/요오드 ㏖) 가 10 × 10-3 이하인, 제조 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    요오드산과 요오드의 몰비 (요오드산 ㏖/요오드 ㏖) 가 5 × 10-3 이하인, 제조 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    요오드산과 요오드의 몰비 (요오드산 ㏖/요오드 ㏖) 가 3 × 10-3 이하인, 제조 방법.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    산화 용액이, 조제부터 산화 반응에 사용하기까지의 시간이 1 주일 이상 경과한 산화 용액인, 제조 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    산화 용액이, 조제부터 산화 반응에 사용하기까지의 시간이 2 주일 이상 경과한 산화 용액인, 제조 방법.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산이 리보뉴클레오시드 (RNA) 인, 제조 방법.
  24. 제 2 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산이, 리보뉴클레오시드 (RNA) 이고, 그 2' 보호기가, 식 (12) 에 나타내는 보호기인, 제조 방법.
    식 (12) :
    Figure pct00045

    (식 중,
    q 는, 1 ∼ 5 의 정수를 나타내고,
    Ra 및 Rb 는 각각, 동일 또는 상이하여, 메틸기, 에틸기 또는 수소 원자를 나타내며,
    * 표시가 붙은 결합은, OQ 기의 산소에 결합하고, 그리고,
    EW 는, 전자 구인기를 나타낸다.)
  25. 제 24 항에 있어서,
    Ra 및 Rb 가 동시에 수소 원자이고, EW 가 시아노기인, 제조 방법.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산이 40 사슬 길이 이상의 리보뉴클레오시드 (RNA) 인, 제조 방법.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가로 제 1 항에 기재된 산화 용액을 조제하는 공정을 포함하는, 제조 방법.
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114685572B (zh) * 2022-06-02 2022-08-30 上海百力格生物技术有限公司 用于mgb核酸探针合成的氧化剂组合物及探针的合成方法

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6077709A (en) 1998-09-29 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of Survivin expression
CA2361079C (en) 1999-02-05 2010-05-25 Amersham Pharmacia Biotech Inc. Method for deprotecting oligonucleotides
US6261840B1 (en) 2000-01-18 2001-07-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PTP1B expression
JP4709959B2 (ja) * 2001-06-14 2011-06-29 国立大学法人東京工業大学 ヌクレオシドホスホロアミダイト化合物
BRPI0514644A (pt) 2004-08-26 2008-06-17 Nippon Shinyaku Co Ltd composto fosforamidita, composto ácido ribonucléico, e método para produzir oligo-rna
EP2410053B2 (en) 2006-10-18 2020-07-15 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Antisense compounds
HUE026520T2 (en) 2010-07-08 2016-06-28 Bonac Corp Single chain nucleic acid molecule for gene expression control
EP2674494B1 (en) 2010-08-03 2014-12-17 Bonac Corporation Single-stranded RNA molecule having nitrogen-containing alicyclic skeleton
US8691782B2 (en) 2010-08-03 2014-04-08 Bonac Corporation Single-stranded nucleic acid molecule having nitrogen-containing alicyclic skeleton
ES2802996T3 (es) * 2011-08-25 2021-01-22 Bonac Corp Compuesto de tioéter para la protección del grupo 2'-hidroxi en nucleósidos que van a ser utilizados en la síntesis de oligonucleótidos
PE20150336A1 (es) 2012-05-25 2015-03-25 Univ California Metodos y composiciones para la modificacion de adn objetivo dirigida por arn y para la modulacion de la transcripcion dirigida por arn
CA2969619A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Agilent Technologies, Inc. Guide rna with chemical modifications
EP3450439B8 (en) 2016-04-26 2021-06-30 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for producing monomer for single-stranded nucleic acid molecule
US20200038427A1 (en) 2017-03-31 2020-02-06 Bonac Corporation Cyclic nucleic acid molecule having gene expression control function
EP3684931A1 (en) 2017-09-19 2020-07-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating transthyretin (ttr) mediated amyloidosis
EP3696269A4 (en) 2017-10-13 2021-09-01 Bonac Corporation SINGLE STRAND NUCLEIC ACID MOLECULE AND ITS PRODUCTION PROCESS
WO2019189591A1 (ja) * 2018-03-30 2019-10-03 住友化学株式会社 一本鎖ｒｎａの製造方法
WO2019208571A1 (ja) 2018-04-24 2019-10-31 住友化学株式会社 アミダイト化合物及び該化合物を用いたポリヌクレオチドの製造方法
JP7135532B2 (ja) 2018-07-20 2022-09-13 マツダ株式会社 電池状態推定装置、電池状態推定装置の製造方法、電池状態推定方法、および組電池システム

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Tetrahedron 69 (2013) 3615-3637

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