WO2018212236A1 - オリゴヌクレオチドの製造方法 - Google Patents

オリゴヌクレオチドの製造方法 Download PDF

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WO2018212236A1
WO2018212236A1 PCT/JP2018/018924 JP2018018924W WO2018212236A1 WO 2018212236 A1 WO2018212236 A1 WO 2018212236A1 JP 2018018924 W JP2018018924 W JP 2018018924W WO 2018212236 A1 WO2018212236 A1 WO 2018212236A1
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substituted
oligonucleotide
hydroxy
protecting group
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PCT/JP2018/018924
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Inventor
祐大 菅原
Original Assignee
日産化学株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a novel oligonucleotide, and a nucleoside compound and an oligonucleotide compound having a highly stable pseudo-solid phase protecting group in the nucleobase portion.
  • oligonucleotides such as DNA probes, siRNA, antisense DNA and antisense RNA have been actively used in recent years.
  • Known methods for chemically synthesizing such oligonucleotides include the phosphoramidite method and the H-phosphonate method.
  • the process optimization and automation of the solid phase synthesis method by the phosphoramidite method are progressing, and therefore the synthesis method is advantageous in terms of speed and is most widely used.
  • the solid-phase synthesis method is limited in scale-up due to equipment constraints, and requires excessive reagents and raw materials.
  • confirmation of the progress of the reaction, analysis of the intermediate structure, etc. are difficult.
  • liquid phase synthesis methods are being considered.
  • a liquid phase synthesis method using a pseudo solid phase protecting group or the like that extends a nucleotide in the 5 ′ direction has been reported (see, for example, Patent Documents 1 and 2).
  • a liquid phase synthesis method capable of extending nucleotides in both the 3 ′ direction and the 5 ′ direction a synthesis method in which a pseudo solid phase protecting group is introduced into a nucleic acid base part has been reported (for example, see Patent Document 3).
  • the pseudo solid phase protecting group reported in Patent Document 3 is bonded to the nucleoside part of a nucleoside or oligonucleotide by an amide bond, but the stability may be low depending on the type of nucleobase. In the production of nucleotides, when the pseudo solid phase protecting group is removed from the nucleobase, the yield of the target oligonucleotide is reduced. It was sought after.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a novel oligonucleotide, and a nucleoside compound and an oligonucleotide compound having a highly stable pseudo solid phase protecting group in the nucleobase portion.
  • the binding part of the pseudo solid-phase protecting group to the nitrogen atom or oxygen atom of the nucleic acid base part is a methyleneoxy group, whereby The present inventors have found that the problem can be solved and completed the present invention.
  • the present invention includes the following.
  • R 1 is independently a C1-40 alkyl group, a C2-40 alkenyl group or a C2-40 alkynyl group
  • s is an integer of 1 to 5
  • L 1 and L 3 are each independently a single bond, a C 1-6 alkylene group, a C 2-6 alkenylene group or a C 2-6 alkynylene group
  • L 2 and L 4 each independently represent a single bond, —COO— or —OCO—, —CON (R 2 ) — or —N (R 2 ) CO—
  • R 2 represents a hydrogen atom, C1 A -6 alkyl group, a C1-6 haloalkyl group, a C2-6 alkenyl group or a C2-6 haloalkenyl group), -C (O)-or -O-
  • L 5 and L 6 may each independently have a hydrogen atom, a C1-40 alkyl group, a C2-40 alkenyl group or a C2
  • a method for producing an oligonucleotide comprising a coupling step of reacting with a nucleoside or oligonucleotide having a hydroxy group substituted at the 3′-position or 5′-position with a reactive phosphorus-containing group.
  • the method further comprises a de-temporary protecting group step including a reaction of removing the temporary protecting group of the nucleoside or oligonucleotide having the nucleoside or oligonucleotide having the hydroxy group at the 5′-position or the 3′-position.
  • a nucleoside or oligonucleotide having at least one nucleobase substituted with a protecting group represented by the formula (II) and having a hydroxy group at the 5′-position or the 3′-position is located at the 3′-position or the 5′-position. Having a hydroxy group substituted with a basic protecting group; Or 2.
  • the 5′-hydroxy group of a nucleoside or oligonucleotide having at least one nucleobase substituted with a protecting group represented by the formula (II) and having a hydroxy group at the 5′-position React with a nucleoside or oligonucleotide which is a hydroxy group substituted at the 3 ′ position with a reactive phosphorus-containing group; To 4.
  • the 3′-hydroxy group of a nucleoside or oligonucleotide having at least one nucleobase substituted with a protecting group represented by the formula (II) and having a hydroxy group at the 3 ′ position is used.
  • To 4. The manufacturing method as described in any one of these.
  • the reactive phosphorus-containing group is a hydroxyphosphinyl group, and the coupling step forms a phosphite diester bond.
  • the reactive phosphorus-containing group is a substituted hydroxy (dialkylamino) phosphino group, and the coupling step forms a phosphite triester bond.
  • To 6. The manufacturing method as described in any one of these.
  • the method further includes a step of converting the phosphite triester bond, including a reaction of converting the phosphite triester bond into a phosphotriester bond or a thiophosphate triester bond.
  • a step of converting the phosphite triester bond including a reaction of converting the phosphite triester bond into a phosphotriester bond or a thiophosphate triester bond.
  • the method further includes a purification step of generating a precipitate by mixing the reaction solution and a polar solvent after the reaction of at least one step, and obtaining the generated precipitate by solid-liquid separation.
  • a purification step of generating a precipitate by mixing the reaction solution and a polar solvent after the reaction of at least one step, and obtaining the generated precipitate by solid-liquid separation.
  • the polar solvent is an alcohol solvent having 1 to 6 carbon atoms or a nitrile solvent having 1 to 6 carbon atoms, The manufacturing method as described in.
  • the temporary protecting group is a tert-butyldimethylsilyl group, a trityl group, a monomethoxytrityl group or a dimethoxytrityl group, and the basic protecting group is a levulinyl group or a 3-benzoylpropionyl group.
  • the temporary protecting group is a levulinyl group or 3-benzoylpropionyl group
  • the basic protecting group is a tert-butyldimethylsilyl group, a triisopropylsilyl group, a tert-butyldiphenylsilyl group, a trityl group, a monomethoxytrityl group, or 2. a dimethoxytrityl group; To 12.
  • the manufacturing method as described in any one of these.
  • Base Z is each independently a nucleobase, a nucleobase substituted with a basic protecting group, or a nucleobase substituted with a protecting group represented by the following formula (II), and at least one Base Z is A nucleobase substituted with a protecting group of formula (II),
  • X is each independently a hydrogen atom, a halogen atom, an unsubstituted or substituted hydroxy group, or an organic group that bridges to the 4′-position carbon atom
  • Each Y is independently a hydrogen atom, an unsubstituted or substituted hydroxy group, an unsubstituted or substituted sulfanyl group, a borohydride group, or a substituted amino group
  • R is a hydrogen atom, a basic protecting group or a temporary protecting group
  • Z is a hydrogen atom, a basic protecting group or a temporary protecting group
  • Each V is independently an oxygen atom or a sulfur atom;
  • nucleobase substituted by the protecting group represented by the formula (II) is each independently thymine or uracil. Or 17. Or a tautomer or salt thereof.
  • X is each independently a hydrogen atom, a hydroxy group, or a hydroxy group substituted with a basic protecting group, 16.
  • X is each independently a hydrogen atom, a hydroxy group, or a hydroxy group substituted with a basic protecting group, 16.
  • X is a hydrogen atom, 19. Or a tautomer or salt thereof.
  • Y is each independently a hydrogen atom, a hydroxy group or a hydroxy group substituted with a basic protecting group, 16.
  • Y is each independently a hydrogen atom, a hydroxy group or a hydroxy group substituted with a basic protecting group, 16.
  • Y is independently a hydroxy group substituted with a C1-6 alkyl group substituted with a hydrogen atom, a hydroxy group or a cyano group, 21. Or a tautomer or salt thereof.
  • R is a hydrogen atom or a temporary protecting group
  • Z is a basic protecting group
  • the temporary protecting group is a tert-butyldimethylsilyl group, a trityl group, a monomethoxytrityl group or a dimethoxytrityl group
  • the basic protecting group is a levulinyl group or a 3-benzoylpropionyl group, 23. Or a tautomer or salt thereof.
  • Z is a hydrogen atom or a temporary protecting group
  • R is a basic protecting group
  • the temporary protecting group is a levulinyl group or 3-benzoylpropionyl group
  • the basic protecting group is a tert-butyldimethylsilyl group, a triisopropylsilyl group, a tert-butyldiphenylsilyl group, a trityl group, a monomethoxytrityl group, or A dimethoxytrityl group, 25.
  • a tautomer or salt thereof is a tert-butyldimethylsilyl group, a triisopropylsilyl group, a tert-butyldiphenylsilyl group, a trityl group, a monomethoxytrityl group, or A dimethoxytrityl group, 25.
  • a tautomer or salt thereof is a tautomer or salt thereof.
  • R 1 is independently a C1-40 alkyl group, a C2-40 alkenyl group or a C2-40 alkynyl group, s is an integer of 1 to 5, L 1 and L 3 are each independently a single bond, a C 1-6 alkylene group, a C 2-6 alkenylene group or a C 2-6 alkynylene group, L 2 and L 4 each independently represent a single bond, —COO— or —OCO—, —CON (R 2 ) — or —N (R 2 ) CO— (wherein R 2 represents a hydrogen atom, C1 A -6 alkyl group, a C1-6 haloalkyl group, a C2-6 alkenyl group or a C2-6 haloalkenyl group), -C (O)-or -O-, L
  • Each R 1 is independently a C1-40 alkyl group, a C2-40 alkenyl group or a C2-40 alkynyl group, s is an integer of 1 to 5, L 1 and L 3 are each independently a single bond, a C 1-6 alkylene group, a C 2-6 alkenylene group or a C 2-6 alkynylene group, L 2 and L 4 each independently represent a single bond, —COO— or —OCO—, —CON (R 2 ) — or —N (R 2 ) CO— (wherein R 2 represents a hydrogen atom, C1 A -6 alkyl group, a C1-6 haloalkyl group, a C2-6 alkenyl group or a C2-6 haloalkenyl group), -C (O)-or -O-, L 5 and L 6 are each independently a hydrogen atom, a C 1-6 alkyl group, a C 1-6 hal
  • nucleoside or oligonucleotide having a pseudo solid phase protecting group with higher stability.
  • the nucleoside or oligonucleotide can be used for mass synthesis of oligonucleotides.
  • n- means normal, “i-” means iso, “s-” and “sec-” mean secondary, “t-” and “tert-” mean tertiary, “Ph” ”Is phenyl,“ Py ”is pyridyl or pyridine,“ Me ”is methyl,“ Et ”is ethyl,“ Bu ”is butyl,“ Bn ”is benzyl,“ Boc ”is tertiary butoxycarbonyl,“ TBS ”is tertiary Libutyldimethylsilyl, “TIPS” means triisopropylsilyl, “TBDPS” means tertiary butyldiphenylsilyl, “DMTr” means 4,4′-dimethoxytrityl, and “rt” means room temperature .
  • halogen atom is a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom.
  • alkyl group means a linear or branched monovalent group of a saturated aliphatic hydrocarbon.
  • C 1-6 alkyl group means an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl. Group, tert-butyl group, n-pentyl group, isopentyl group, neopentyl group, n-hexyl group and isohexyl group.
  • C1-40 alkyl group means an alkyl group having 1 to 40 carbon atoms, and in addition to the above examples of “C1-6 alkyl group”, a decyl group, a pentadecyl group, a hexadecyl group, a heptadecyl group, an octadecyl group , Nonadecyl group, icosyl group, docosyl group, triacontyl group, tetracontyl group, and isomers thereof.
  • C10-30 alkyl group means an alkyl group having 10 to 30 carbon atoms
  • C15-25 alkyl group means an alkyl group having 15 to 25 carbon atoms
  • C15 The “-20 alkyl group” means an alkyl group having 15 to 20 carbon atoms, and specific examples thereof are included in the examples of the “C1-40 alkyl group”.
  • alkenyl group means a linear or branched, monovalent group of an unsaturated aliphatic hydrocarbon having one or more double bonds at any position.
  • C2-6 alkenyl group means an alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms, such as ethenyl group (vinyl group), 1-propenyl group, 2-propenyl group (allyl group), isopropenyl group, Examples thereof include 1-butenyl group, 2-butenyl group, 3-butenyl group (homoallyl group), 4-pentenyl group, 5-hexenyl group and the like.
  • C2-40 alkenyl group means an alkenyl group having 2 to 40 carbon atoms, and in addition to the above examples of “C2-6 alkenyl group”, 2-decenyl group, 10-decenyl group, 18-octadecenyl group , 20-icosenyl group, 30-triacontenyl group, 40-tetracontenyl group, and isomers thereof.
  • the “C10-30 alkenyl group” means an alkenyl group having 10 to 30 carbon atoms, and specific examples thereof are included in the above examples of “C2-40 alkenyl group”.
  • alkynyl group means a linear or branched, unsaturated aliphatic hydrocarbon monovalent group having one or more triple bonds at an arbitrary position.
  • C2-6 alkynyl group means an alkynyl group having 2 to 6 carbon atoms, such as ethynyl group, 1-propynyl group, 2-propynyl group, 1-butynyl group, 2-butynyl group, 3- Examples include butynyl group, 4-pentynyl group, and 5-hexynyl group.
  • C2-40 alkynyl group means an alkynyl group having 2 to 40 carbon atoms, and in addition to the above examples of “C2-6 alkynyl group”, 10-decynyl group, 18-octadecynyl group, 20-icosinyl group , 30-triacontinyl group, 40-tetracontinyl group and the like.
  • the “C1-6 alkylene group” means a divalent group obtained by removing one hydrogen atom at an arbitrary position from the “C1-6 alkyl group”.
  • a methylene group an ethylene group (ethanediyl group), Propane-1,3-diyl group, propane-2,2-diyl group, 2,2-dimethyl-propane-1,3-diyl group, hexane-1,6-diyl group, 3-methylbutane-1,2- And diyl group.
  • the “C2-6 alkylene group” means a straight chain or branched divalent group having 2 to 6 carbon atoms in the “C1-6 alkylene group”, for example, an ethylene group (ethanediyl group) Propane-1,3-diyl group, propane-2,2-diyl group, hexane-1,6-diyl group, 3-methylbutane-1,2-diyl group and the like.
  • the “C2-6 alkenylene group” means a divalent group obtained by removing one hydrogen atom at an arbitrary position from the “C2-6 alkenyl group”.
  • the “C2-6 alkynylene group” means a divalent group obtained by removing one hydrogen atom at any position from the “C2-6 alkynyl group”, and includes, for example, an ethyne-1,2-diyl group, propyne -1,3-diyl group, but-1-yne-1,4-diyl group, but-1-in-1,3-diyl group, but-2-yne-1,4-diyl group, penta-2 -In-1,5-diyl group, penta-2-in-1,4-diyl group, hexa-3-in-1,6-diyl group and the like.
  • the “C 1-6 haloalkyl group” means a group in which one or more of the above “halogen atoms” is replaced with a hydrogen atom at any position of the “C 1-6 alkyl group”.
  • a monofluoromethyl group Monofluoroethyl group, monofluoropropyl group, 2,2,3,3,3-pentafluoropropyl group, monochloromethyl group, trifluoromethyl group, trichloromethyl group, 2,2,2-trifluoroethyl group, 2 2,2-trichloroethyl group, 1,2-dibromoethyl group, 1,1,1-trifluoropropan-2-yl group and the like.
  • C2-6 haloalkenyl group means a group in which one or more “halogen atoms” are substituted with a hydrogen atom at any position of the “C2-6 alkenyl group”.
  • the “C3-6 cycloalkyl group” is any monocyclic, condensed polycyclic, bridged cyclic or spirocyclic aliphatic hydrocarbon having 3 to 6 carbon atoms constituting the ring. Means a monovalent group in which one hydrogen atom is removed, and specific examples thereof include a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, and a cyclohexyl group.
  • C1-6 alkoxy group means a group in which the “C1-6 alkyl group” is bonded to an oxy group (—O—).
  • C1-6 haloalkoxy group means a group in which the “C1-6 haloalkyl group” is bonded to an oxy group (—O—).
  • “Mono C1-6 alkylamino group” means a group in which one C1-6 alkyl group is bonded to an amino group, such as a methylamino group, an ethylamino group, an n-propylamino group, an isopropylamino group. N-butylamino group, isobutylamino group, sec-butylamino group, tert-butylamino group, n-pentylamino group, isopentylamino group, neopentylamino group, n-hexyl group amino and isohexylamino group, etc. Is mentioned.
  • the “di-C 1-6 alkylamino group” means a group in which two identical or different “C 1-6 alkyl groups” are bonded to an amino group, such as a dimethylamino group, a diethylamino group, a di-n— Propylamino group, diisopropylamino group, di-n-butylamino group, diisobutylamino group, di-t-butylamino group, di-n-pentylamino group, di-n-hexylamino group, N-ethyl-N- Methylamino group, N-methyl-Nn-propylamino group, N-isopropyl-N-methylamino group, Nn-butyl-N-methylamino group, N-isobutyl-N-methylamino group, N- t-butyl-N-methylamino group, N-methyl-Nn-pentylamino group, Nn
  • C1-6 alkoxycarbonyl group “mono C1-6 alkylaminocarbonyl group”, “diC1-6 alkylaminocarbonyl group” and the like are the above-mentioned “C1-6 alkoxy group”, “mono C1-6 alkylamino group”, respectively.
  • group and the “di-C 1-6 alkylamino group” mean a group bonded to a carbonyl group (—C (O) —).
  • C1-6 alkoxy C1-6 alkyl group means a group in which one C1-6 alkoxy group is substituted at any position of the “C1-6 alkyl group”.
  • C1-6 alkylsulfonyl group and “C1-6 haloalkylsulfonyl group” mean groups in which the “C1-6 alkyl group” and “C1-6 haloalkyl group” are bonded to a sulfonyl group, respectively.
  • C6-10 aryl group is a monocyclic or bicyclic aromatic hydrocarbon in which all atoms constituting the ring are carbon atoms and 6 to 10 carbon atoms, A monovalent group from which one hydrogen atom has been removed is meant, and specific examples include a phenyl group and a naphthyl group.
  • the “5-10 membered heteroaryl group” means that the number of atoms constituting the ring is 5 to 10, and 1 to 5 heteroatoms (the hetero atom is a nitrogen atom) in the atoms constituting the ring.
  • the monocyclic “5-10 membered heteroaryl group” includes 2-thienyl group, 3-thienyl group, 2-furyl group, 3-furyl group, 2-pyranyl group, 3-pyranyl group, 4-pyranyl group 1-pyrrolyl group, 2-pyrrolyl group, 3-pyrrolyl group, 1-imidazolyl group, 2-imidazolyl group, 4-imidazolyl group, 1-pyrazolyl group, 3-pyrazolyl group, 4-pyrazolyl group, 5-pyrazolyl group 2-thiazolyl group, 4-thiazolyl group, 5-thiazolyl group, 3-isothiazolyl group, 4-isothiazolyl group, 5-isothiazolyl group, 1,2,4-triazol-1-yl group, 1,2,4- Triazol-3-yl group, 1,2,4-triazol-5-yl group, 1,2,3-triazol-1-yl group, 1,2,3-triazol-4-yl group, 1,2, 3-Tria Allyl-5-
  • the condensed polycyclic “5-10 membered heteroaryl group” includes 2-benzofuranyl group, 3-benzofuranyl group, 4-benzofuranyl group, 5-benzofuranyl group, 6-benzofuranyl group, 7-benzofuranyl group, 1-isofuranyl group, Benzofuranyl group, 4-isobenzofuranyl group, 5-isobenzofuranyl group, 2-benzothienyl group, 3-benzothienyl group, 4-benzothienyl group, 5-benzothienyl group, 6-benzothienyl group 7-benzothienyl group, 1-isobenzothienyl group, 4-isobenzothienyl group, 5-isobenzothienyl group, 2-benzothiazolyl group, 4-benzothiazolyl group, 5-benzothiazolyl group, 6-benzothiazolyl group, 7- Benzothiazolyl group, 2-chromenyl group, 3-chromenyl group, 4-chro
  • Alkyl group means a monovalent group in which a hydrogen atom at an arbitrary position of the “C1-6 alkyl group” is replaced by the “C6-10 aryl group”.
  • heteroaryl group means a monovalent group in which a hydrogen atom at an arbitrary position of the “C1-6 alkyl group” is replaced by the “5-10 membered heteroaryl group”.
  • the “C6-10 arylmethyl group” means a group in which one “C6-10 aryl group” is bonded to a methyl group.
  • the “diC6-10 arylmethyl group” means a group in which the two “C6-10 aryl groups” are bonded to a methyl group.
  • acyl group means a group in which one of the above “C1-6 alkyl group”, “C6-10 aryl group” or “aralkyl group” is bonded to a carbonyl group (—CO—).
  • the methylene group of the “C1-6 alkyl group” or “aralkyl group” is not replaced, or —O—, —NR 11 — (R 11 represents a hydrogen atom or a C1-6 alkyl group).
  • acyl group examples include acetyl group, pivaloyl group, benzoyl group, levulinyl group, 3-benzoylpropionyl group and the like.
  • C6-10 arylsulfonyl group means a group in which the “C6-10 aryl group” is bonded to a sulfonyl group.
  • C6-10 arylaminocarbonyl group “5-10 membered heteroarylaminocarbonyl group”, “C6-10 arylsulfonylaminocarbonyl group” and “aralkylaminocarbonyl group” are the same as the above “C6-10 aryl group”.
  • “5-10 membered heteroaryl group” and “C6-10 arylsulfonyl group” and “aralkyl group” mean a group substituted on the nitrogen atom of aminocarbonyl (H 2 N—C (O) —) group .
  • the “aminocarbonyl group” is used interchangeably with the “carbamoyl group” in the present specification.
  • the “mono C1-6 alkylcarbamoyl group” and the “diC1-6 alkylcarbamoyl group” are the same as the above “mono C1 "-6 alkylaminocarbonyl group” and “di-C1-6 alkylaminocarbonyl group” are synonymous with "N- (C6-10 aryl) carbamoyl group", “N- (5-10 membered heteroaryl) carbamoyl group” , “N- (C6-10 arylsulfonyl) carbamoyl group” and “N-aralkylcarbamoyl group” are the above “C6-10 arylaminocarbonyl group", “5-10 membered heteroarylaminocarbonyl group”, “C6 -10 arylsulfonylaminocarbonyl group "and” aralkylaminocarbonyl group " It is synonymous.
  • the “3-11 membered nitrogen-containing non-aromatic heterocyclic group” is a monocyclic or condensed polycyclic group containing at least one nitrogen atom and comprising 3 to 11 atoms constituting the ring ( In the condensed polycyclic, a non-aromatic ring may be condensed to a non-aromatic ring or an aromatic ring.),
  • a bridged ring or a spiro ring non-aromatic heterocyclic compound Is a monovalent group obtained by removing one hydrogen atom at the position of azetidinyl, pyrrolidinyl, 2-oxopyrrolidinyl, piperidinyl, 3-oxopiperidinyl, piperazinyl, morpholino, A morpholino group, a homomorpholino group, a homopiperazino group, etc. are mentioned.
  • the “reactive phosphorus-containing group” is a group containing a phosphorus atom, and forms an internucleoside bond including a phosphoric diester structure, a thiophosphoric diester structure, a phosphoric triester structure, or a thiophosphate triester structure.
  • Useful groups include, for example, a hydroxyphosphinyl group, a substituted hydroxy (dialkylamino) phosphino group, and the like. Reactive phosphorus-containing groups known in the art can be used in the present invention.
  • “Substituted hydroxy (dialkylamino) phosphino group” means that the “hydroxy (dialkylamino) phosphino group” has a hydrogen atom of a hydroxy group bonded to a phosphorus atom replaced by a C1-6 alkyl group or the like. Means that Here, the C1-6 alkyl group or the like is unsubstituted or substituted with one or more substituents selected from the group consisting of a halogen atom and a cyano group. Examples of the “substituted hydroxy (dialkylamino) phosphino group” include a cyanoethoxy (diisopropylamino) phosphino group.
  • C1-40 alkylthio group “C3-6 cycloalkylthio group”, “C6-10 arylthio group”, “5-10 membered heteroarylthio group”, “aralkylthio group”, “heteroaralkylthio group” and the like
  • nucleoside which is a structural unit of oligonucleotide refers to a nucleobase having a sugar (eg, ribose, 2′-deoxyribose, ribose having 2 ′ and 4 ′ bridged, 2 ′ and 3 ′). It means a compound bonded to the 1 'position of the' position bridged ribose etc.) by N-glycosidation.
  • sugar eg, ribose, 2′-deoxyribose, ribose having 2 ′ and 4 ′ bridged, 2 ′ and 3 ′.
  • the ribose and 2′-deoxyribose are unsubstituted or substituted with a C1-6 alkyl group, a halogen atom, a hydroxy group, an amino group, a hydroxy group substituted with a basic protecting group, or a basic protecting group. Substituted with one or more substituents selected from the group consisting of selected amino groups.
  • the C1-6 alkyl group is unsubstituted or independently selected from a halogen atom, a C1-6 alkoxycarbonyl group, a mono C1-6 alkylaminocarbonyl group, a diC1-6 alkylaminocarbonyl group, and the like. Substituted with one or more substituents.
  • the C1-6 alkoxycarbonyl group, mono C1-6 alkylaminocarbonyl group, diC1-6 alkylaminocarbonyl group and the like are unsubstituted or monoalkylamino group, diC1-6 alkylamino group, C6- Substituted by a 10 aryl group, a 5-10 membered heteroaryl group or a 3-11 membered nitrogen-containing non-aromatic heterocyclic group.
  • the 2′-hydroxy group of ribose is unsubstituted or substituted with a basic protecting group.
  • Examples of the basic protective group for the amino group substituted with the basic protective group include the same groups as the “basic protective group for amino group” in the nucleobase described later.
  • the ribose in which the 2′-position and the 4′-position are cross-linked is not limited as long as the 2′-position and the 4′-position of the nucleoside are cross-linked via a cross-linking group.
  • a C2-6 alkylene group [the alkylene group is unsubstituted or substituted by a C1-6 alkyl group.
  • one or two methylene groups of the alkylene group are not replaced, or —O—, —NR 11 — (R 11 represents a hydrogen atom or a C 1-6 alkyl group), —S—, — CO—, —CS—, —COO—, —OCONR 12 — (R 12 represents a hydrogen atom or a C 1-6 alkyl group), —CONR 13 — (R 13 represents a hydrogen atom or a C 1-6 alkyl group) And —CSNR 14 — (wherein R 14 is replaced with a group selected from a hydrogen atom or a C 1-6 alkyl group)].
  • Specific examples include compounds of the following formula.
  • the nucleoside sugar is preferably ribose or 2'-deoxyribose, particularly preferably 2'-deoxyribose.
  • nucleobase is not particularly limited as long as it is used for nucleic acid synthesis.
  • pyrimidine bases such as cytosyl group, uracil group, thyminyl group, 5-methylcytosyl group, adenyl group, etc.
  • purine bases such as a guanyl group.
  • nucleobase substituted with a basic protecting group means, for example, that an amino group is substituted with a basic protecting group in an adenyl group, guanyl group, or cytosyl group that is a nucleobase having an amino group, In the case of a nucleobase having a hydroxy group, the hydroxy group is substituted with a basic protecting group, in the case of a nucleobase having a sulfanyl group, the sulfanyl group is substituted with a basic protecting group, or a carbonyl group Means that the nucleobase has a carbonyl group in the form of a hydroxy group conjugated with an amino group or a hydroxy group substituted on the ring, and the hydroxy group is substituted with a basic protecting group, etc. 3 Preferred are nucleobases protected by a protecting group that can withstand the deprotection conditions of the temporary protecting group at the 'position or 5' position.
  • the “basic protecting group for amino group” in the nucleobase is not particularly limited, and for example, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, 3rd edition, John Willy and.
  • the protecting group described in Sands (JOHN WILLY & SONS) publication (1999) etc. can be mentioned.
  • Specific examples of such “amino basic protecting group” include, for example, pivaloyl group, pivaloyloxymethyl group, trifluoroacetyl group, phenoxyacetyl group, 4-isopropylphenoxyacetyl group, 4-tert-butylphenoxyacetyl group.
  • phenoxyacetyl group, 4-isopropylphenoxyacetyl group, acetyl group, benzoyl group, isobutyryl group, and dimethylformamidinyl group are preferable.
  • “basic protecting group for amino group” in the nucleobase include C6-10 arylaminocarbonyl group, 5-10 membered heteroarylaminocarbonyl group, C6-10 arylsulfonylaminocarbonyl group, mono C1- Examples include aminocarbonyl-type protecting groups such as 6 alkylaminocarbonyl groups and aralkylaminocarbonyl groups.
  • the C6-10 arylaminocarbonyl group includes a phenylaminocarbonyl group (wherein the phenylaminocarbonyl group is unsubstituted or is a halogen atom, nitro group, cyano group, C1-6 alkylsulfonyl group, C1-6 At least one selected from the group consisting of a haloalkylsulfonyl group, a C1-6 alkoxy group, a C1-6 haloalkoxy group, a C1-6 alkyl group, a C2-6 alkenyl group, a C1-6 haloalkyl group and a C2-6 haloalkenyl group Substituted with two substituents).
  • the C6-10 aryl of the aminocarbonyl type protecting group is preferably phenyl, 2-nitrophenyl, 2-trifluoromethylphenyl, 3-trifluoromethylphenyl, 4-trifluoromethylphenyl, 2-chlorophenyl, 2-chloro Fluorophenyl, 2-methylphenyl, 2-cyanophenyl, 2-trifluoromethoxyphenyl, 2-chloro-6-trifluoromethylphenyl, 2-chloro-4-trifluoromethylphenyl, 2,6-dichlorophenyl, 2, 6-difluorophenyl, 2,6-dimethylphenyl, pentafluorophenyl, 2-methoxyphenyl, 2,3-dimethoxyphenyl, 2,4-dimethoxyphenyl, 2,5-dimethoxyphenyl, 2,6-dimethoxyphenyl, 3 , 4,5-trimethoxyphenyl, , 3,4-trimethoxyphenyl,
  • the 5- to 10-membered heteroarylaminocarbonyl group is preferably a 2-pyridylaminocarbonyl group, a 3-pyridylaminocarbonyl group, or a 4-pyridylaminocarbonyl group.
  • the C6-10 arylsulfonylaminocarbonyl group is preferably an N- (p-toluenesulfonyl) aminocarbonyl group or a benzenesulfonylaminocarbonyl group.
  • the mono C1-6 alkylaminocarbonyl group is preferably an ethylaminocarbonyl group.
  • the aralkylaminocarbonyl group is preferably a benzylaminocarbonyl group.
  • the protecting group for the amino group of the adenyl group is preferably a phenylaminocarbonyl group (the phenylaminocarbonyl group includes a halogen atom, a nitro group, a cyano group, a C1-6 alkylsulfonyl group, a C1-6 haloalkylsulfonyl group, and a C1- Or a pyridylaminocarbonyl group, more preferably a 2-nitrophenylaminocarbonyl group, a 2-trifluoromethylphenylaminocarbonyl group, or a pyridylaminocarbonyl group, which is substituted with at least one substituent selected from the group consisting of 6 haloalkyl groups.
  • Pentafluorophenylaminocarbonyl group 2-chloro-6-trifluoromethylphenylaminocarbonyl group, 2-chloro-4-trifluoromethylphenylaminocarbonyl group, 3-pyridylaminocarbonyl group, or 4-pyridylaminocarbonyl group It is a group, particularly preferably a 2-chloro-6-trifluoromethyl-phenylaminocarbonyl group.
  • aminocarbonyl group a 3-pyridylaminocarbonyl group, or a 4-pyridylaminocarbonyl group, more preferably a phenylaminocarbonyl group, a 2,3-dimethoxyphenylaminocarbonyl group, or a 2,4-dimethoxyphenylaminocarbonyl group.
  • the “basic protecting group for hydroxy group” in the nucleobase is not particularly limited, and for example, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, 3rd edition, John Willy and Any protecting groups described in Sands (JOHN WILLY & SONS) publication (1999) and the like can be mentioned.
  • a C1-6 alkyl group (methyl group, tert-butyl group, etc.), C6-10 arylmethyl group (benzyl group, p-methoxybenzyl group, etc.), C1-6 alkoxy C1-6 alkyl group (methoxy group) Methyl group, methoxyethyl group, cyanoethoxymethyl group, ethoxyethyl group, etc.), 2-tetrahydropyranyl group, cyanoethyl group, carbamoyl group (phenylcarbamoyl group, 1,1-dioxothiomorpholine-4-thiocarbamoyl group, etc.) ), Acyl group (acetyl group, pivaloyl group, isobutyryl group, benzoyl group, phenoxyacetyl group, levulinyl group, 3-benzoylpropionyl group, etc.), silyl group (trimethylsilyl group, triethyl
  • an acetyl group, a benzoyl group, a benzyl group, or a p-methoxybenzyl group is preferable.
  • Examples of the “basic protecting group for sulfanyl group” in the nucleobase include a protecting group that forms a disulfide bond in addition to the protecting group similar to the “basic protecting group for hydroxy group”.
  • nucleobase includes, in addition to the above-mentioned groups, a nucleobase having an arbitrary substituent (for example, a halogen atom, a C1-6 alkyl group, an aralkyl group, a C1-6 alkoxy group, an acyl group, a C1- 6 alkoxy C1-6 alkyl group, hydroxy group, amino group, mono C1-6 alkylamino group, diC1-6 alkylamino group, carboxy group, cyano group, nitro group, etc.
  • an arbitrary substituent for example, a halogen atom, a C1-6 alkyl group, an aralkyl group, a C1-6 alkoxy group, an acyl group, a C1- 6 alkoxy C1-6 alkyl group, hydroxy group, amino group, mono C1-6 alkylamino group, diC1-6 alkylamino group, carboxy group, cyano group, nitro group, etc.
  • Modified nucleobases eg, 8-bromoadenyl group, 8-bromoguanyl group, 5-bromocytosyl group, 5-iodocytosyl group, 5-bromouracil group, 5-iodouracil group, 5-fluorouracil group, 5- Methylcytosyl group, 8-oxoguanyl group, hypoxanthinyl group, etc.
  • demethylated modified nucleobase eg, 5-demethylation of thymine
  • Journal of Medicinal Chemistry 2016, Vol. 59, No. 21, pp. 9645-9667), Medicinal Chemistry Communications (2014, Vol. 5, pp. 1454-1471), Future Medicinal Chemistry ( 2011, Vol. 3, No. 3, pp. 339-365), etc. disclose examples of modification of the base moiety in nucleotides, and these can be used.
  • extension reaction cycle refers to a reaction of a 3′-hydroxy group or 5′-hydroxy group of a nucleoside or oligonucleotide having a pseudo solid phase protecting group with a nucleoside or oligonucleotide having a reactive phosphorus-containing group.
  • the extension reaction cycle may be, for example, a nucleoside or oligonucleotide transient having at least one nucleobase substituted with a pseudo solid phase protecting group and having a hydroxy group substituted with a temporary protecting group at the 3′-position or the 5′-position.
  • a step including a reaction for removing a protecting group to produce a nucleoside or oligonucleotide having a hydroxy group at the 3′-position or the 5′-position, and reacting the produced hydroxy group with a nucleoside or oligonucleotide having a reactive phosphorus-containing group And obtaining an oligonucleotide in which these are bound via a phosphite diester bond or a phosphite triester bond, etc.
  • the pseudo-solid phase protecting group used in the present invention means that the reaction substrate has the protecting group so that the reaction substrate and the reaction product are solubilized in a low polarity solvent, and the reaction in the liquid phase is possible.
  • Examples of the pseudo solid phase protecting group used in the present invention include groups represented by the following formula (II).
  • * indicates a binding position with a nucleobase
  • Each R 1 is independently a C1-40 alkyl group, a C2-40 alkenyl group or a C2-40 alkynyl group
  • s is an integer of 1 to 5
  • L 1 and L 3 are each independently a single bond, a C 1-6 alkylene group, a C 2-6 alkenylene group or a C 2-6 alkynylene group
  • L 2 and L 4 each independently represent a single bond, —COO— or —OCO—, —CON (R 2 ) — or —N (R 2 ) CO—
  • R 2 represents a hydrogen atom, C1 A -6 alkyl group, a C1-6 haloalkyl group, a C2-6 alkenyl group or a C2-6 haloalkenyl group), -C (O)-or -O-
  • L 3 represents a C 1-6 alkylene group, a C 2-6 alkenylene group or C 2- A 6-alkynylene group is preferred.
  • L 1 is a C 1-6 alkylene group, a C 2-6 alkenylene group or a C 2-6 alkynylene group, and L 2 is a single bond
  • L 3 is preferably a single bond.
  • pseudo solid phase protecting group used in the present invention for example, ⁇ [3,4,5-tris (octadecyloxy) benzoyl] oxy ⁇ methyl group and 2- [N-methyl-3,4,5-tris (octadecyloxy) benzamido] ethoxysuccinyloxymethyl group ([(3 - ⁇ 2- [N-methyl-3,4,5-tris (octadecyloxy) benzamido] ethoxycarbonyl ⁇ propanoyl) oxy] methyl group) Etc.
  • the temporary protecting group used in the present invention is a protecting group that protects the 5′-position hydroxy group or the 3′-position hydroxy group, and is a protecting group that is deprotected in the “elongation reaction cycle”.
  • the deprotected 5′-position or 3′-position hydroxy group is utilized for conjugation with another nucleoside or oligonucleotide reactive phosphorus-containing group in an extension reaction cycle.
  • Examples of the temporary protecting group include protecting groups as described in the following documents. Protective Groups in Organic Synthesis, Greene T. W. and Wuts PGM, published by Wiley Interscience, 1999 and Protecting Groups, Kocienski P. J., 1994, Georg Thieme Verlag.
  • the basic protecting group used in the present invention is an amino group, a carbonyl group, a hydroxy group or a sulfanyl group in a nucleobase, a 2′-position hydroxy group or an amino group, a 3′-position hydroxy group or a 5′-position hydroxy group, Or a protective group for protecting a hydroxy group of a phosphodiester bond, a thiophosphate diester bond or a phosphite diester bond, or a sulfanyl group of a thiophosphate diester bond, and is not deprotected in the “elongation reaction cycle”, and
  • the “pseudo solid phase protecting group” is a general protecting group having no function.
  • Examples of the basic protecting group include protecting groups described in the following documents. Protective Groups in Organic Synthesis, Greene T. W. and Wuts PGM, published by Wiley Interscience, 1999 and Protecting Groups, Kocienski P. J., 1994, Georg Thieme Verlag.
  • a functional group (hydroxy group, amino group, sulfanyl group, etc.) substituted with a pseudo-solid phase protecting group, a temporary protecting group, or a basic protecting group is a group in which the hydrogen atom of the functional group is replaced by the protecting group. means.
  • a nucleobase substituted with a pseudo-solid phase protecting group or a basic protecting group means a nucleobase in which a hydrogen atom of a functional group (hydroxy group, amino group, sulfanyl group, etc.) of the nucleobase is replaced by the protecting group.
  • the functional group possessed by the nucleobase includes a functional group generated by conjugation.
  • a phosphodiester bond substituted with a basic protecting group means that when the phosphodiester bond has a hydroxy group, the hydroxy group is substituted with a basic protecting group; Is included.
  • a phosphite diester bond substituted with a basic protecting group means that when the phosphite diester bond has a hydroxy group, the hydroxy group is substituted with a basic protecting group. It is included in “ester bond”.
  • Thiophosphate diester bond substituted with a basic protecting group means that when the thiophosphate diester bond has a hydroxy group or a sulfanyl group, the hydroxy group or sulfanyl group is substituted with a basic protecting group, Included in “thiophosphate triester bond” and “thiophosphate-O, O, S-triester bond”.
  • the “organic group that crosslinks to the 4′-position carbon atom” means an organic group that crosslinks the 2′-position and the 4′-position of the sugar, and is not particularly limited, but for example, a C2-6 alkylene group [ The alkylene group is unsubstituted or substituted with a C1-6 alkyl group.
  • one or two methylene groups of the alkylene group are not substituted, or —O—, —NR 11 — (R 11 represents a hydrogen atom or a C 1-6 alkyl group), —S—, —CO—, —CS—, —COO—, —OCONR 12 — (R 12 represents a hydrogen atom or a C 1-6 alkyl group), —CONR 13 — (R 13 represents a hydrogen atom or a C 1-6 alkyl group) ) And —CSNR 14 — (wherein R 14 represents a hydrogen atom or a C1-6 alkyl group)].
  • a method for producing the oligonucleotide according to the present invention (hereinafter also referred to as “the production method of the present invention”) will be described. Specifically, from a nucleoside or oligonucleotide having at least one nucleobase substituted with a pseudo solid phase protecting group (hereinafter also referred to as “n-polymerized oligonucleotide”), a nucleoside or oligonucleotide (hereinafter referred to as “p”).
  • n + p polymerization oligonucleotide A method for producing an oligonucleotide having at least one nucleobase extended with a pseudo-solid phase protecting group (hereinafter also referred to as “n + p polymerization oligonucleotide”) will be described.
  • the n-polymerized oligonucleotide means an oligonucleotide in which n nucleosides are bonded via a phosphorus-containing group.
  • n 1, the n-polymerized oligonucleotide is interpreted as a nucleoside, and a p-polymerized oligonucleotide. The same applies to nucleotides.
  • each nucleobase part may be the same or different
  • n polymerized oligonucleotides contain two or more pseudo solid phases.
  • each pseudo solid phase protecting group may be the same or different.
  • each basic protecting group is the same.
  • the n polymerized oligonucleotides have an organic group that crosslinks to 2 or more 4′-position carbon atoms, the organic groups that crosslink to each 4′-position carbon atom are the same, May be different. The same applies to p-polymerized oligonucleotides.
  • the method for producing an oligonucleotide includes a nucleoside having at least one nucleobase substituted with a pseudo-solid phase protecting group and having a hydroxy group at the 5′-position or 3′-position or the 5′-hydroxy group or 3 of the oligonucleotide. Reacting the '-hydroxy group with a reactive phosphorus-containing group at the 3'-position or 5'-position of the nucleoside or oligonucleotide which is a hydroxy group substituted at the 3'-position or 5'-position with a reactive phosphorus-containing group, Including a coupling step.
  • the method for producing an oligonucleotide includes at least one extension reaction cycle including the coupling step.
  • the method for producing the oligonucleotide may be the H-phosphonate method or the phosphoramidite method.
  • the oligonucleotide production method preferably includes the following steps a to c in the extension reaction cycle.
  • the order of the process a to the process c is performed in the order of the process a, the process b, and the process c, or the order of the process a, the process c, and the process b.
  • a preferred order is the order of step a, step b, step c.
  • Step a includes removing a temporary protecting group of a nucleoside or oligonucleotide having at least one nucleobase substituted with a pseudo-solid phase protecting group and having an extended terminal hydroxy group substituted with a temporary protecting group. This is a temporary removal protecting group step.
  • step b a nucleoside or oligonucleotide having a reactive phosphorus-containing group is added to a nucleoside or oligonucleotide having a hydroxy group from which the temporary protecting group has been removed, and a phosphite diester is added via the hydroxy group. It is a coupling step including condensation through a bond or a phosphite triester bond.
  • Step b1 is step b in the case of the H-phosphonate method.
  • the reactive phosphorus-containing group is a hydroxyphosphinyl group, and a phosphite diester bond is formed.
  • Step b2 is step b in the case of the phosphoramidite method.
  • the reactive phosphorus-containing group is a substituted hydroxy (dialkylamino) phosphino group, and a phosphite triester bond is formed.
  • Step c2 is a step of converting the phosphite triester bond, which includes converting the phosphite triester bond formed in step b2 into a phosphate triester bond or a thiophosphate triester bond. .
  • the amino group of the aminophosphate diester bond is substituted with one or two C1-6 alkyl groups.
  • the phosphoric acid triester bond is a group in which the hydrogen atom of one hydroxy group of the phosphoric acid diester bond is replaced by a basic protecting group, for example, a C1-40 alkyl group, a C3-6 cycloalkyl group, a C6— Examples include a bond replaced by a 10 aryl group, a 5-10 membered heteroaryl group, an aralkyl group, a heteroaralkyl group, or the like.
  • the phosphite triester bond is a group in which the hydrogen atom of one hydroxy group of the phosphite diester bond is replaced by a basic protecting group, such as a C1-40 alkyl group, a C3-6 cycloalkyl group, Examples include a bond replaced by a C6-10 aryl group, a 5-10 membered heteroaryl group, an aralkyl group, a heteroaralkyl group, or the like.
  • a thiophosphoric acid-O, O, S-triester bond is a group in which the hydrogen atom of one sulfanyl group of a thiophosphoric acid diester bond is replaced by a basic protecting group or the like, and is a C1-40 alkyl group, C3-6 cycloalkyl group.
  • the C1-40 alkyl group in the phosphoric acid triester bond, the phosphite triester bond and the thiophosphoric acid-O, O, S-triester bond is unsubstituted or is a halogen atom, cyano Substituted by a group or the like.
  • the C3-6 cycloalkyl group, the C6-10 aryl group, the 5-10 membered heteroaryl group, the aralkyl group and the heteroaralkyl group are unsubstituted or a C1-6 alkyl group, a halogen atom, Substituted by a cyano group or the like.
  • the method for producing an oligonucleotide includes step a, step b1 and step c1 in the extension reaction cycle.
  • the order of the process a, the process b1, and the process c1 is this order or the order of the process a, the process c1, and the process b1, and preferably the order of the process a, the process b1, and the process c1.
  • the oligonucleotide production method includes step a, step b2 and step c2 in this order in the extension reaction cycle.
  • the order of the process a, the process b2, and the process c2 is this order or the order of the process a, the process c2, and the process b2, and preferably the order of the process a, the process b2, and the process c2.
  • the number n of nucleosides contained in the nucleoside or oligonucleotide having a pseudo solid phase protecting group used in step a is not particularly limited as long as it is an arbitrary integer of 1 or more, but is preferably 1 to 50, more preferably 1 To 30, more preferably from 1 to 10, even more preferably from 1 to 5, even more preferably 1 or 2, particularly preferably 1, ie the use of nucleosides.
  • the number p of nucleosides contained in the nucleoside or oligonucleotide having a reactive phosphorus-containing group used in step b is not particularly limited as long as it is an arbitrary integer of 1 or more, but is preferably 1 to 50, more preferably 1 To 30, more preferably 1 to 5, even more preferably 1 or 2, particularly preferably 1, that is to say the use of nucleosides.
  • the reaction mixture obtained at the process c can also be used for the process a as it is.
  • step a can be performed at the same time by appropriately raising the temperature after the reaction in step c.
  • the method for producing an oligonucleotide can further purify a nucleoside or oligonucleotide by easily and effectively removing excess raw materials and by-products by including the following step e.
  • Step e is a separation obtained by mixing the reaction mixture obtained in any of steps a to c with a polar solvent to precipitate a nucleoside or oligonucleotide having a pseudo solid phase protecting group, and solid-liquid separation. It is a process.
  • step e is a step unique to liquid phase synthesis using a pseudo solid phase protecting group, which cannot exist in a normal liquid phase synthesis method without using a pseudo solid phase protecting group or in a solid phase synthesis method. is there.
  • the polar solvent may be added to the reaction mixture, or the reaction mixture may be added to the polar solvent.
  • the reaction mixture is added to the polar solvent.
  • the number of steps e included in the extension reaction cycle is not particularly limited. Step e can be performed after any step from step a to step c. Step e is independently included after each step from step a to step c, for example, 0 to 5 times, preferably 0 to 3 times, more preferably 0 to 2 times, and still more preferably 0 or 1 included.
  • at least one of steps a to c includes one or more steps e.
  • the extension reaction cycle preferably includes 1 to 3 steps e.
  • Step e is included once in at least one after step a, after step b and after step c in the extension reaction cycle, so that by-product generation can be strictly controlled and controlled. It is preferable from the viewpoint of being able to lead to the oligonucleotide. More preferably, step e is included once after step a, once after step c, or once after each of step a and step c in the extension reaction cycle.
  • step e If it is a situation where the amount of by-products generated can be controlled by controlling the equivalent of raw materials and controlling the reaction, it is preferable to perform step e after performing steps a to c as basic units.
  • the method for producing an oligonucleotide may further include step f.
  • a desired oligonucleotide can be isolated and manufactured.
  • Step f is a deprotection step for removing the basic protecting group, temporary protecting group and pseudo solid phase protecting group of the oligonucleotide obtained in steps a to c and e, and can also be referred to as a total deprotecting step. .
  • Oligonucleotide production methods are mainly classified into method A or method B depending on the extension direction of the oligonucleotide.
  • Method A the hydroxy group at the 5 'position is converted by steps a to c, and the nucleoside or oligonucleotide is extended to the 5' position.
  • Method B the hydroxy group at the 3 'position is converted by steps a to c, and the nucleoside or oligonucleotide is extended to the 3' position.
  • Method A is Having at least one nucleobase substituted with a pseudo-solid phase protecting group represented by the formula (II), having a hydroxy group substituted with a basic protecting group at the 3 ′ position, and temporarily protecting at the 5 ′ position
  • a de-temporary protecting group step (step a) comprising a reaction of removing the temporary protecting group of the first nucleoside or first oligonucleotide having a hydroxy group substituted with a group to form a 5′-hydroxy group; 3'-hydroxy of the second nucleoside or second oligonucleotide having a 5'-hydroxy group formed and a reactive phosphorus-containing group at the 3 'position and a hydroxy group substituted with a temporary protecting group at the 5' position
  • the phosphite diester bond of the conjugate is changed to a phosphodiester bond, a thiophosphate diester bond, a boranophosphate diester bond, an aminophosphate diester bond, a phosphate triester bond, or a thiophosphate-O, O, S-triester bond.
  • a conversion step (step c) including a reaction for converting, or a reaction for converting a phosphite triester bond of a conjugate into a phosphate triester bond or a thiophosphate triester bond. is there.
  • Step a comprising a reaction of removing a temporary protecting group of a third nucleoside or third oligonucleotide having a hydroxy group substituted with a group to generate a 3′-hydroxy group; The resulting 3′-hydroxy group and the 5′-hydroxy of the fourth nucleoside or fourth oligonucleotide having a reactive phosphorus-containing group at the 5 ′ position and a hydroxy group substituted with a temporary protecting group at the 3 ′ position A reaction of reacting a group to form a phosphite diester bond or a phosphite triester bond to obtain a conjugate of a third nucleoside or third oligonucleotide and a
  • the phosphite diester bond of the conjugate is changed to a phosphodiester bond, a thiophosphate diester bond, a boranophosphate diester bond, an aminophosphate diester bond, a phosphate triester bond, or a thiophosphate-O, O, S-triester bond.
  • a conversion step (step c) including a reaction for converting, or a reaction for converting a phosphite triester bond of a conjugate into a phosphate triester bond or a thiophosphate triester bond. is there.
  • the coupling step forms a phosphite diester bond (ie, in the case of the H-phosphonate method)
  • the phosphite diester bond is converted into a phosphodiester bond, thiophosphoric acid in the conversion step. Converted to a diester bond, a boranophosphate diester bond, an aminophosphate diester bond, a phosphate triester bond, or a thiophosphate-O, O, S-triester bond.
  • the coupling step forms a phosphite triester bond (ie in the case of the phosphoramidite method)
  • the phosphite triester bond is converted to a phosphotriester bond or a thiophosphate triester bond.
  • Step a in each case of method A or method B is shown in Scheme 1 or 2.
  • n Represents an arbitrary integer of 1 or more, and represents a nucleoside when n 1.
  • n represents an arbitrary integer of 1 or more
  • Base z independently represents a nucleobase, a nucleobase substituted with a basic protecting group, or a nucleobase substituted with a pseudo solid phase protecting group.
  • R represents a temporary protecting group
  • X represents each independently a hydrogen atom, a halogen atom, an unsubstituted or substituted hydroxy group, or an organic group that bridges to the 4′-position carbon atom
  • V represents each Independently represents an oxygen atom or a sulfur atom
  • each Y independently represents a hydrogen atom, an unsubstituted or substituted hydroxy group, an unsubstituted or substituted sulfanyl group, a borohydride group, or a substituted amino group.
  • each Base Z represents a basic protecting group.
  • V is a sulfur atom
  • Y bonded to the phosphorus atom to which the sulfur atom is bonded represents a substituted hydroxy group.
  • at least one Base Z is a nucleobase substituted with a pseudo-solid phase protecting group.
  • each nucleobase part may be the same or different, and (ia) or (ia) In the case of having two or more quasi-solid phase protecting groups, each quasi-solid phase protecting group may be the same or different, and (ia) or (ia) has two or more basic protecting groups.
  • Each basic protecting group may be the same or different, and when n polymerized oligonucleotides have an organic group that crosslinks to 2 or more 4'-position carbon atoms, each 4'-position carbon atom
  • the organic groups that crosslink with each other may be the same or different.
  • n Represents an arbitrary integer of 1 or more, and represents a nucleoside when n 1.
  • the pseudo-solid phase protecting group is preferably contained in at least one Base Z.
  • the pseudo solid phase protecting group of the present invention contained in Base z is a group represented by the following formula (II).
  • * indicates a binding position with a nucleobase
  • Each R 1 is independently a C1-40 alkyl group, a C2-40 alkenyl group or a C2-40 alkynyl group
  • s is an integer of 1 to 5
  • L 1 and L 3 are each independently a single bond, a C 1-6 alkylene group, a C 2-6 alkenylene group or a C 2-6 alkynylene group
  • L 2 and L 4 each independently represent a single bond, —COO— or —OCO—, —CON (R 2 ) — or —N (R 2 ) CO— (wherein R 2 represents a hydrogen atom, C1 A -6 alkyl group, a C1-6 haloalkyl group, a C2-6 alkenyl group or a C2-6 haloalkenyl group), -C (O)-
  • the pseudo-solid phase protecting group is preferably a group represented by the following formula (IIa).
  • * represents a bonding position with the nucleobase
  • R 1 is each independently a C1-40 alkyl group, a C2-40 alkenyl group or a C2-40 alkynyl group
  • s is 1 to And an integer of 5
  • L 5 and L 6 each independently represents a hydrogen atom or a C 1-6 alkyl group.
  • the pseudo solid phase protecting group contained in Base z is a group represented by the following formula (III).
  • * represents a binding position with a nucleobase
  • R 1 is a C1-40 alkyl group, a C2-40 alkenyl group or a C2-40 alkynyl group
  • s is an integer of 1 to 5.
  • R 1 of the pseudo-solid phase protecting group represented by formula (II), formula (IIa) or formula (III) included in Base z is preferably a C10-30 alkyl group or a C10-30 alkenyl group. More preferably, it is a C10-30 alkyl group, still more preferably a C15-25 alkyl group, still more preferably a C15-20 alkyl group, and particularly preferably an octadecyl group.
  • S of the pseudo-solid phase protecting group represented by formula (II), formula (IIa) or formula (III) contained in Base z is preferably an integer of 2 to 4, more preferably 3. . In formula (II), formula (IIa) or formula (III), when s is 2 to 5, each R 1 may be the same or different.
  • the pseudo solid phase protecting group of the present invention is particularly useful when introduced into thymine or uracil.
  • nucleobases nucleobase nucleobase substituted with basic protected substituted nucleobase or a pseudo solid phase protecting group group, preferably, cytosine, uracil, thymine, 5-methylcytosine, adenine and guanine More preferably selected independently from thymine or uracil, particularly preferably thymine.
  • the temporary protecting group R that can be used for the hydroxy group at the extended end of the oligonucleotide is not particularly limited as long as it can be deprotected with a fluorine reagent, acid or base, and can be used as a protecting group for the hydroxy group.
  • Examples of the temporary protecting group R that can be deprotected with a fluorine reagent include silyl groups (tert-butyldimethylsilyl group, triethylsilyl group, trimethylsilyl group, etc.).
  • Examples of the temporary protecting group R that can be deprotected with an acid include a xanthenyl group (9- (9-phenyl) xanthenyl group, 9-phenylthioxanthenyl group, etc.), a C1-6 alkoxy C1-6 alkyl group (1-methoxy- 1-methylethyl group, 1,3-dioxolan-2-yl group, 1,3-benzodioxol-2-yl group, etc.), alkylthioalkyl group (1,3-dithiolan-2-yl group, 1, 3-benzodithiol-2-yl group), C1-6 alkoxycarbonyl group (such as tert-butyloxycarbonyl group), and triarylmethyl group (such as trityl group, dimethoxytrityl group, monomethoxytrityl group) and the like.
  • a xanthenyl group (9- (9-phenyl) xanthenyl group, 9
  • Examples of the temporary protecting group R that can be deprotected with a base include a levulinyl group and a 3-benzoylpropionyl group.
  • a levulinyl group and a 3-benzoylpropionyl group Preferably, tert-butyldimethylsilyl group, trityl group, 9- (9-phenyl) xanthenyl group, 9-phenylthioxanthenyl group, 1,1-bis (4-methoxyphenyl) -1-phenylmethyl group (dimethoxy) Trityl group) and 1- (4-methoxyphenyl) -1,1-diphenylmethyl group (monomethoxytrityl group).
  • a tert-butyldimethylsilyl group, a monomethoxytrityl group, and a dimethoxytrityl group are preferable, and a tert-butyldimethylsilyl group and a dimethoxytrityl group are preferable.
  • a dimethoxytrityl group is particularly preferable.
  • X is preferably a hydrogen atom, an unsubstituted or substituted hydroxy group, or an organic group that crosslinks to the 4'-position carbon atom.
  • the “substituted hydroxy group” in X is preferably a hydroxy group substituted with a basic protecting group.
  • Examples of the basic protecting group of the “hydroxy group substituted with the basic protecting group” include, for example, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, 3rd edition, John Willy and Sons ( And protecting groups described in JOHN WILLY & SONS) (1999).
  • C1-6 alkyl group (methyl group, tert-butyl group, etc.), C6-10 arylmethyl group (benzyl group, p-methoxybenzyl group, etc.), diC6-10 arylmethyl group (diphenylmethyl group) Etc.), C1-6 alkoxy C1-6 alkyl group (methoxymethyl group, methoxyethyl group, ethoxyethyl group, cyanoethoxymethyl group, etc.), 2-tetrahydropyranyl group, cyanoethyl group, carbamoyl group (phenylcarbamoyl group, 1) , 1-dioxothiomorpholine-4-thiocarbamoyl group), acyl group (acetyl group, pivaloyl group, benzoyl group, levulinyl group, 3-benzoylpropionyl group, etc.), silyl group (triisopropylsilyl group, tert-butyl
  • a tert-butyldimethylsilyl group, a triisopropylsilyl group, or a tert-butyldiphenylsilyl group is preferable, and a tert-butyldimethylsilyl group or a triisopropylsilyl group is more preferable.
  • a levulinyl group or 3-benzoylpropionyl group is preferable, and a levulinyl group is more preferable.
  • X is more preferably a hydrogen atom, a hydroxy group, or a hydroxy group substituted with a C 1-6 alkyl group, a tert-butyldimethylsilyl group, a triisopropylsilyl group, or a tert-butyldiphenylsilyl group, and more preferably A hydrogen atom or a hydroxy group substituted with a C1-6 alkyl group or a triisopropylsilyl group.
  • the C1-6 alkyl group is unsubstituted or substituted with a group selected from the group consisting of a C1-6 alkoxycarbonyl group, a mono C1-6 alkylaminocarbonyl group, and a diC1-6 alkylaminocarbonyl group.
  • X is particularly preferably a hydrogen atom.
  • X is more preferably a C2-6 alkylene group (the alkylene group is unsubstituted or substituted with a methyl group, wherein one or two methylene groups of the alkylene group are , Not replaced, or —O—, —NR 11 — (R 11 represents a hydrogen atom or a methyl group), —CO—, —CS—, —COO—, —OCONR 12 — (R 12 represents hydrogen) Substituted with a group selected from: —CONR 13 — (R 13 represents a hydrogen atom or methyl group) and —CSNR 14 — (R 14 represents a hydrogen atom or methyl group); The organic group which bridge
  • X is more preferably an ethylene group (one or two methylene groups of the ethylene group are not substituted or —O—, —CONR 13 — (R 13 represents a hydrogen atom or a methyl group) and — An organic group that bridges the 4′-position carbon atom represented by CSNR 14 — (wherein R 14 represents a hydrogen atom or a methyl group).
  • the basic protecting group for Z those exemplified as the basic protecting group for “hydroxy group substituted with basic protecting group” for X can be mentioned.
  • a tert-butyldimethylsilyl group, a triisopropylsilyl group, a tert-butyldiphenylsilyl group, a levulinyl group or a 3-benzoylpropionyl group is preferable, a levulinyl group or a 3-benzoylpropionyl group is more preferable, and a levulinyl group is still more preferable.
  • a protecting group that is not deprotected under conditions for deprotecting the temporary protecting group can be used.
  • a temporary protecting group that is deprotected with an acid a protective group that is not deprotected with an acid but is deprotected with a base or a fluorine reagent is used as a basic protecting group among those listed as the temporary protecting group. be able to.
  • a temporary protecting group that is deprotected with a base a protecting group that is not deprotected with a base but is deprotected with an acid or a fluorine reagent is used as a basic protecting group among those listed as the temporary protecting group.
  • a temporary protecting group that is deprotected with a base a protecting group that is not deprotected with a base but is deprotected with an acid or a fluorine reagent is used as a basic protecting group among those listed as the temporary protecting group.
  • a temporary protecting group that is deprotected with a fluorine reagent among those listed as the temporary protecting group, a protecting group that is not deprotected with a fluorine reagent but is deprotected with an acid or base is used as a basic protecting group. Can be used. Those skilled in the art can appropriately select the above protecting groups.
  • the temporary protecting group in X and Z is a levulinyl group or a 3-benzoylpropionyl group
  • the temporary protecting group is a silyl group such as a tert-butyldimethylsilyl group or a triethylsilyl group, or a trityl group or a dimethoxytrityl group.
  • a triarylmethyl group such as a monomethoxytrityl group is preferable.
  • the temporary protecting group is a levulinyl group or 3-benzoylpropionyl group
  • the basic protecting group in X and Z is a silyl group such as a tert-butyldimethylsilyl group or a triethylsilyl group, or a trityl group, a dimethoxytrityl group, a mono group A triarylmethyl group such as a methoxytrityl group is preferred.
  • a levulinyl group or 3-benzoylpropionyl group or the like is used as a temporary protecting group.
  • N can also be said to be the number of nucleosides contained in the nucleoside or oligonucleotide having a pseudo solid phase protecting group used in step a, and the preferred embodiment thereof is as described above.
  • V is preferably an oxygen atom.
  • Y independently represents a hydrogen atom, an unsubstituted or substituted hydroxy group, an unsubstituted or substituted sulfanyl group, a borohydride group, or a substituted amino group.
  • the substituted hydroxy group is the same as the group that replaces the hydroxy group in the “phosphate triester bond” converted in step c described later.
  • the substituted sulfanyl group is the same as the group that replaces the sulfanyl group in the “thiophosphoric acid-O, O, S-triester bond” converted in step c described later.
  • the substituted amino group is the same as the group that replaces the amino group in the “aminophosphate diester bond” converted in the step c described later.
  • the phosphorus-containing group including Y has, for example, the following structure (or a structure obtained by adding a salt to the following structure).
  • Y bonded to the phosphorus atom to which the oxygen atom is bonded is preferably independently a hydrogen atom, an unsubstituted or substituted hydroxy group, or an unsubstituted or substituted sulfanyl. More preferably a hydrogen atom or an unsubstituted or substituted hydroxy group, still more preferably a hydrogen atom, a hydroxy group or a 2-cyanoethoxy group, still more preferably a hydroxy group or 2 -A cyanoethoxy group.
  • V is a sulfur atom
  • each Y bonded to the phosphorus atom to which the sulfur atom is bonded is preferably a substituted hydroxy group, more preferably a 2-cyanoethoxy group.
  • Step a is performed in a solvent that does not affect the reaction. Since the higher the solubility in the solvent, the better the reactivity can be expected, it is preferable to select a low polarity solvent having a high solubility of the target compound.
  • halogen solvents such as chloroform, dichloromethane and 1,2-dichloroethane
  • aromatic solvents such as benzene, toluene, xylene and mesitylene
  • ester solvents such as ethyl acetate and isopropyl acetate
  • hexane, pentane and heptane Aliphatic solvents such as octane, nonane and cyclohexane
  • ether solvents such as tetrahydrofuran, diethyl ether, cyclopentyl methyl ether and tert-butyl methyl ether.
  • solvents may be used as a mixture of two or more in any ratio.
  • nitrogen-containing aromatic solvents such as pyridine, nitrile solvents such as acetonitrile and propionitrile, amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide and N-methylpyrrolidone
  • a polar solvent such as a system solvent may be mixed and used at an arbitrary ratio as long as n polymerization oligonucleotides can be dissolved.
  • the solvents used in Step a are dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, benzene, toluene, xylene, mesitylene, hexane, pentane, heptane, nonane, cyclohexane, ethyl acetate, isopropyl acetate, tetrahydrofuran, tert-butyl methyl ether.
  • Cyclopentyl methyl ether, or a combination thereof is preferred, dichloromethane and tetrahydrofuran are more preferred, and tetrahydrofuran is particularly preferred.
  • the concentration of the n-polymerized oligonucleotide in step a is not particularly limited as long as it is dissolved, but is preferably 1 to 30% by weight.
  • the fluorine reagent, acid or base used in step a is not particularly limited as long as good deprotection of the temporary protecting group can be achieved.
  • a person skilled in the art can select an appropriate fluorine reagent, acid or base depending on the type of temporary protecting group.
  • Fluorine reagents include hydrogen fluoride pyridine salt, tetrabutylammonium fluoride, hydrogen fluoride triethylamine salt, hydrofluoric acid, ammonium fluoride, ammonium fluoride hydrofluoride adduct, potassium fluoride or fluoride.
  • a hydrogen fluoride adduct of potassium is preferable.
  • a pyridine salt of hydrogen fluoride or tetrabutylammonium fluoride is more preferable, and tetrabutylammonium fluoride is particularly preferable.
  • the acid is preferably trifluoroacetic acid, dichloroacetic acid, trifluoromethanesulfonic acid, trichloroacetic acid, methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, hydrochloric acid, acetic acid, ammonium cerium nitrate, phosphonic acid or phosphoric acid.
  • trifluoroacetic acid More preferred are dichloroacetic acid, trifluoromethanesulfonic acid, trichloroacetic acid, methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, hydrochloric acid, acetic acid or ammonium cerium nitrate, trifluoroacetic acid, dichloroacetic acid, trifluoromethanesulfonic acid, trichloroacetic acid, methanesulfonic acid, p-Toluenesulfonic acid or acetic acid is more preferred, and acetic acid is particularly preferred.
  • hydrogen chloride aqueous solution, 1,4-dioxane solution, etc.
  • hydrogen chloride-1,4-dioxane solution is particularly preferable.
  • the base include hydrazine derivatives (hydrazine monohydrate, hydrazine acetate, hydrazinium sulfate, methyl hydrazine, isopropyl hydrazine hydrochloride, tert-butyl hydrazine, acetohydrazide, methyl carbazate, phenyl hydrazine, p-toluenesulfonyl hydrazine, Cyclopentyl hydrazine hydrochloride, cyclohexyl hydrazine hydrochloride, benzyl hydrazine hydrochloride, 2,2,2-trifluoroethyl hydrazine (70% aqueous solution) and 2-cyanoethyl hydrazine),
  • a hydrazine derivative is preferable, and hydrazine monohydrate or methyl hydrazine is more preferable.
  • fluorine reagents, acids and bases can be used by diluting with the above-mentioned low polarity solvent.
  • deprotection with enzymes such as Chirazyme L-2 and Chirazyme L-5 is also possible.
  • the amount of the fluorine reagent, acid or base used in step a can be used in an amount of 1 to 100 mol, preferably 1 to 40 mol, more preferably 1 to 20 mol, with respect to 1 mol of n polymerization oligonucleotides. More preferably 1 to 10 moles, and even more preferably 1 to 8 moles. Among these, the lower limit is preferably 2 moles, more preferably 3 moles, and even more preferably 4 moles.
  • the 5′-position or 3′-position hydroxy group of the p-polymerized oligonucleotide (iii) or (v) Must be removed by quenching to induce deprotection of the temporary protecting group R.
  • the quench treatment is performed with a silicon reagent or an organic base when the deprotecting agent is a fluorine reagent or acid, and with a ketone compound when the deprotecting agent is the base.
  • the silicon reagent used for the quenching process is not particularly limited as long as it can quench the fluorine reagent, but hexamethyldisiloxane [TMS 2 O], trimethylsilyl chloride [TMSCl], hexamethyldisilazane, Trimethylsilyl bromide, trimethylsilyl iodide, trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate, triethylsilyl chloride, triisopropylsilyl chloride, tert-butyldimethylsilyl chloride, tert-butyldiphenylsilyl chloride, phenyldimethylsilyl chloride, diphenylmethylsilyl chloride, triphenylsilyl chloride TMS 2 O and TMSCl are more preferable, and TMS 2 O is particularly preferable.
  • the organic base used for the quench treatment is not particularly limited as long as it can neutralize the above-mentioned acid, but is not limited to pyridine, 2,4,6-trimethylpyridine, benzimidazole, 1,2,4. -Triazole, N-phenylimidazole, 2-amino-4,6-dimethylpyrimidine, 1,10-phenanthroline, imidazole, N-methylimidazole, 2-chlorobenzimidazole, 2-bromobenzimidazole, 2-methylimidazole, 2 -Phenylbenzimidazole, N-phenylbenzimidazole, 5-nitrobenzimidazole are preferred, pyridine, 2,4,6-trimethylpyridine, benzimidazole, 1,2,4-triazole, N-phenylimidazole, N-methylimidazole 2-amino-4 6-dimethylpyrimidine, more preferably 1,10-phenanthroline, pyridine is particularly preferred.
  • the ketone compound used in the quenching treatment is not particularly limited as long as it can consume the above-mentioned base, and examples thereof include acetylacetone and acetone, and acetylacetone is preferable.
  • the amount of the silicon reagent, organic base, or ketone compound used for the quench treatment in step a is, for example, 0.01 to 100 moles, preferably 0.1 to 50 moles per mole of the fluorine reagent, acid, or base. Mol, more preferably 1 to 20 mol, still more preferably 1 to 3 mol.
  • step a and subsequent step b (step b1 or step b2) or step c (step c1 or step c2) in the liquid phase continuously, during the deprotection reaction of temporary protecting group R in step a, or It is preferable to add a cation scavenger after the deprotection reaction.
  • a cation scavenger may or may not be added.
  • the cation scavenger is not particularly limited as long as reprotection (returning the raw material) by the removed protecting group R or side reaction to the deprotected functional group does not proceed, but pyrrole, 2-methylpyrrole, 3- Pyrrole derivatives such as methylpyrrole, 2,3-dimethylpyrrole, 2,4-dimethylpyrrole; indole, 4-methylindole, 5-methylindole, 5-methoxyindole, 6-methylindole, 7-methylindole, 5, Indole derivatives such as 6-dimethylindole and 6,7-dimethylindole can be used.
  • pyrrole, 3-methylpyrrole, 2,4-dimethylpyrrole, indole, 4-methylindole, 5-methylindole, 6-methylindole, 7-methylindole, 5, 6-dimethylindole and 6,7-dimethylindole are preferred, pyrrole, 3-methylpyrrole and indole are more preferred, pyrrole and indole are more preferred, and indole is particularly preferred.
  • the amount of the cation scavenger used is, for example, 1 to 50 moles, preferably 1 to 15 moles, more preferably 1 to 5 moles per mole of n polymerized oligonucleotides (ia or ib). is there.
  • step b or step c is performed. Before step b or step c, if necessary, liquid separation treatment and solvent distillation remove the solvent to be used in step b, perform step e, and deprotect the 5′-hydroxy group of the n-polymerized oligonucleotide. And the like, or the deprotection body (iib) of the 3′-position hydroxy group can be isolated.
  • Step b (Process b) (Coupling process) First, in each case of Method A or Method B, Step b (Step b1) of the H-phosphonate method and Step b (Step b2) of the phosphoramidite method are shown in Schemes 3 to 6.
  • Step b1 in the H-phosphonate method of Method A includes the 5′-position hydroxy substrate (ia) of the n-polymerized oligonucleotide obtained in Step a in Method A and the 5′-position hydroxy group protected by a temporary protecting group R.
  • step c1 in the step of condensing the 5′-position hydroxy substrate of the n + p polymerized oligonucleotide (via) obtained in step c1 in the method A and the p polymerized oligonucleotide (iii), is there.
  • Base in the compound (iii) independently represents a nucleobase substituted with a nucleobase or a basic protecting group, and other symbols are as defined above. It is synonymous with.
  • the case of having two or more nucleobase portions and the case of having two or more basic protecting groups are the same as defined above.
  • Step b2 in the phosphoramidite method of Method A includes the 5′-position hydroxy substrate (ia) of the n-polymerized oligonucleotide obtained in Step a in Method A and the 5′-position hydroxy group protected by a temporary protecting group R.
  • step c2 in the step of condensing the 5′-hydroxy substrate of n + p polymerized oligonucleotide (viii) obtained in step c2 in Method A and the p polymerized oligonucleotide (va), is there.
  • n, Base z , R, X, V, Y, Z, p, and Base are the same as defined in Scheme 3, and Pr represents a dialkylamino group.
  • the two alkyl groups may form a 3-11 membered nitrogen-containing non-aromatic heterocyclic group together with the nitrogen atom to which they are bonded.
  • each symbol is synonymous with the definition in Scheme 3.
  • step c1 in the step of condensing the 3′-position hydroxy substrate of the n + p polymerized oligonucleotide (viib) obtained in step c1 in the method B and the p polymerized oligonucleotide (iii). is there.
  • Step b2 in the phosphoramidite method of Method B includes the 3′-hydroxy substrate (iib) of the n-polymerized oligonucleotide obtained in Step a of Method B and the 3′-position hydroxy group protected by a temporary protecting group R.
  • Scheme 6 each symbol has the same definition as in Scheme 4.
  • step c2 in the step of condensing the 3′-position hydroxy substrate of the n + p polymerization oligonucleotide (viiii) obtained in step c2 in the method B and the p polymerization oligonucleotide (vb), is there.
  • nucleoside number p contained in the nucleoside or oligonucleotide having the reactive phosphorus-containing group used in step b can be said to be the nucleoside number p contained in the nucleoside or oligonucleotide having the reactive phosphorus-containing group used in step b, and the preferred embodiment thereof is as described above.
  • the nucleobase of the nucleobase substituted with a nucleobase or basic protecting group in Base is preferably independently selected from cytosine, uracil, thymine, 5-methylcytosine, adenine and guanine, More preferably, it is independently selected from thymine or uracil, particularly preferably thymine.
  • Pr is a dialkylamino group, and the two alkyl groups together with the nitrogen atom to which they are attached may form a 3-11 membered nitrogen-containing non-aromatic heterocyclic group.
  • Pr is preferably a diC1-6 alkylamino group or a morpholino group, and more preferably a diisopropylamino group.
  • step b1 which is a coupling step by the H-phosphonate method, will be described.
  • solvent used in step b1 include the same solvents as in step a.
  • pyridine dichloromethane, tetrahydrofuran, toluene and the like are preferable, and pyridine is particularly preferable.
  • step b1 When using a solvent other than a nitrogen-containing aromatic solvent such as pyridine in step b1, it is preferable to add a nucleophile such as pyridine.
  • the nucleophilic agent is not particularly limited as long as a good coupling reaction can be achieved.
  • the nucleophile used in step b1 is one mole of the n-polymerized oligonucleotide (ia or iib) obtained in step a or n + p polymerized oligonucleotide (via or viib) obtained in step c1.
  • the amount is, for example, 1 to 100 mol, preferably 1 to 20 mol, more preferably 1 to 10 mol, per mol of the hydroxy compound.
  • the amount of p-polymerized oligonucleotide (iii or iiib) used in step b1 is 1 mol of hydroxy polymer (ia or iib) of n-polymerized oligonucleotide obtained in step a or n + p obtained in step c1.
  • it is 1 to 10 moles, more preferably 1 to 5 moles, still more preferably 1 to 3 moles, and particularly preferably 1 mole per 1 mole of the hydroxy form of the individual polymerization oligonucleotide (via or viib). To 1.6 moles.
  • the condensing agent used in step b1 is not particularly limited as long as the coupling reaction proceeds satisfactorily, and examples thereof include condensing agents usually used in the H-phosphonate method.
  • 2,2-dimethylbutyryl chloride isobutyryl chloride, 1-adamantyl chloride, diphenyl chlorophosphate, 2,4,6-triisopropylbenzenesulfonyl chloride, bis (2-oxo-3-oxazolidinyl) phosphinic acid chloride
  • bispentafluorophenyl carbonate is preferable
  • 2,2-dimethylbutyryl chloride and isobutyryl chloride are more preferable
  • 2,2-dimethylbutyryl chloride is particularly preferable.
  • the condensing agent used in step b1 is a hydroxy compound (nia or iib) of n-polymerized oligonucleotide obtained in step a or hydroxy of n + p-polymerized oligonucleotide (via or viib) obtained in step c1.
  • n-polymerized oligonucleotide obtained in step a or hydroxy of n + p-polymerized oligonucleotide (via or viib) obtained in step c1.
  • 1 to 200 moles preferably 1 to 50 moles, more preferably 1 to 10 moles, and further preferably 4 to 6 moles per mole of the body.
  • the reaction temperature in step b1 is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but is preferably ⁇ 10 ° C. to 60 ° C., more preferably 0 ° C. to 50 ° C., further preferably 0 ° C. to 30 ° C., and 20 ° C. to 30 ° C. Even more preferred.
  • the reaction time varies depending on the type of n-polymerized oligonucleotide used, the type of solvent, the type of nucleophile, the type of condensing agent, the reaction temperature, etc., but preferably 1 minute to 12 hours, and 2 minutes to 6 hours. More preferred is 5 minutes to 3 hours.
  • the obtained solution is subjected to a capping reaction as necessary.
  • the capping reaction may be carried out using an acid anhydride such as acetic anhydride, benzoic anhydride, or in addition to the aforementioned condensing agent, triethylammonium salt of methyl-H-phosphonate, triethylammonium salt of ethyl-H-phosphonate, isopropyl- It can be carried out in a conventional manner using ammonium salts of alkyl-H-phosphonates such as triethylammonium salt of H-phosphonate and triethylammonium salt of 2-cyanoethyl-H-phosphonate.
  • the capping reaction is a reaction for converting a hydroxy group of a compound having a hydroxy group remaining after a coupling reaction or an oxidation reaction into a substituent that cannot extend a nucleoside or oligonucleotide.
  • the capping reaction may be performed after step c1 described later.
  • the capping reaction is preferably performed after step b1 or step c1.
  • step c1 or step a is performed. Before step c1 or step a, if necessary, liquid separation treatment, solvent distillation, substitution to the solvent used in step c1 or step a, step e, and n + p polymerization oligonucleotide (iva or ivb) Isolation and the like can be performed. Moreover, the reaction solution of the process b1 can also be used for the following process c1 as it is.
  • step b2 which is a coupling step by the phosphoramidite method will be described.
  • the solvent used in step b2 include the same low-polarity solvents as in step a. Of these, dichloromethane, toluene and the like are preferable, and dichloromethane is particularly preferable.
  • nitrile solvents such as acetonitrile and propionitrile
  • ketone solvents such as acetone and 2-butanone
  • Amide solvent such as 1,4-dioxane, tetrahydrofuran; sulfoxide solvent such as dimethyl sulfoxide; n-polymerized oligonucleotide from which temporary protecting group R at 5′-position or 3′-position has been removed
  • polar solvent amide solvents, nitrile solvents, and combinations thereof are preferable, acetonitrile, N, N-dimethylformamide, N-methylpiperidone, and combinations thereof are more preferable, and acetonitrile is particularly preferable.
  • the polar solvent is a p-polymerized oligonucleotide (va or vb) in which the 3′-position or 5′-position hydroxy group is phosphoramidated and the 5′-position or 3′-position hydroxy group is substituted with a temporary protecting group R,
  • a solution such as a condensing agent may be added.
  • the amount of p-polymerized oligonucleotide (va or vb) used in step b2 was obtained in 1 mol of deprotected form (nia or iib) of n-polymerized oligonucleotide obtained in step a or in step c2.
  • it is 1 to 10 moles, more preferably 1 to 5 moles, still more preferably 1 to 3 moles, and even more preferably, with respect to 1 mole of the hydroxy form of the n + p polymerized oligonucleotide (viii or viiib). Is 1 to 1.6 moles.
  • the condensing agent used in step b2 is not particularly limited as long as the coupling reaction proceeds satisfactorily, and examples thereof include condensing agents usually used in the phosphoramidite method. Specifically, 1H-tetrazole, Diisopropylammonium tetrazole, 5- (ethylthio) -1H-tetrazole, 5-benzoylmercapto-1H-tetrazole, 4,5-dicyanoimidazole, 4,5-dichloroimidazole, hydroxybenzotriazole, 1-hydroxy-6-nitrobenzotriazole And pyridine / trifluoroacetate and imidazolinium / trifluoromethanesulfonate. Of these, 1H-tetrazole is preferred.
  • the condensing agent used in step b2 is 1 mol of the n-polymerized oligonucleotide obtained in step a (ia or iib) or n + p polymerized oligonucleotide (viii or viiib) obtained in step c2.
  • the amount is 1 to 200 mol, preferably 1 to 100 mol, more preferably 1 to 50 mol, and still more preferably 2 to 10 mol, with respect to 1 mol of the hydroxy compound.
  • the reaction temperature in step b2 is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but is preferably ⁇ 10 ° C. to 60 ° C., more preferably 0 ° C. to 50 ° C., further preferably 0 ° C. to 30 ° C., and 20 ° C. to 30 ° C. Even more preferred.
  • the reaction time varies depending on the type of n-polymerized oligonucleotide used, the type of solvent, the type of nucleophile, the type of condensing agent, the reaction temperature, etc., but is preferably 1 minute to 48 hours, and 2 minutes to 36 hours. More preferred is 5 minutes to 24 hours.
  • the obtained solution is subjected to a capping reaction as necessary.
  • the capping reaction may be carried out using an acid anhydride such as acetic anhydride, benzoic anhydride, or in addition to the aforementioned condensing agent, triethylammonium salt of methyl-H-phosphonate, triethylammonium salt of ethyl-H-phosphonate, isopropyl- It can be carried out in a conventional manner using ammonium salts of alkyl-H-phosphonates such as triethylammonium salt of H-phosphonate and triethylammonium salt of 2-cyanoethyl-H-phosphonate.
  • step c2 or step a is performed.
  • n + p-polymerized oligonucleotides are obtained by performing replacement with the solvent used in step c2 or step a or performing step e by liquid separation treatment and solvent evaporation as necessary. Can be isolated.
  • the reaction solution of the process b2 can also be used for the following process c2 as it is.
  • the conversion step is step c1
  • the coupling step is a phosphoramidite method
  • the conversion step is step c2.
  • the n + p polymerization oligonucleotide (iva or ivb) obtained in the step b1 or the n polymerization oligonucleotide obtained in the step a is reacted with a reagent that modifies the phosphorus atom, thereby polymerizing the n + p polymerization oligonucleotides.
  • the phosphite diester bond of an oligonucleotide is converted to a phosphodiester bond, a thiophosphate diester bond, an aminophosphate diester bond, a boranophosphate diester bond, a phosphotriester bond or thiophosphate-O, O, S-tri This is a step of converting into an ester bond.
  • step c2 the n + p polymerization oligonucleotide (via or vib) obtained in step b2 or the n polymerization oligonucleotide obtained in step a is reacted with a reagent that modifies the phosphorus atom, thereby polymerizing the n + p polymerization oligonucleotides.
  • This is a step of converting a phosphite triester bond of an oligonucleotide (via or vib) into a phosphotriester bond or a thiophosphate triester bond.
  • Step c2 in the phosphoramidite method of Method A is represented by the following Scheme 8 (in Scheme 8, each symbol is as defined above, but R is a hydrogen atom after Step a).
  • Step c2 in the phosphoramidite method of Method B is represented by the following Scheme 10 (in Scheme 10, each symbol has the same definition as above, but in the case after Step a, R is a hydrogen atom).
  • step c1 which is a step of converting a phosphite diester bond in the H-phosphonate method, will be described.
  • Step c1 is performed after step c or step a without isolating the n + p polymerization oligonucleotide obtained in step b1 (iva or ivb) or the n polymerization oligonucleotide obtained in step a (ia or iib).
  • a reagent for modifying a phosphorus atom can be directly added.
  • an oxidizing agent, a sulfurizing agent, an amidite agent or a boron agent is used as a reagent for modifying the phosphorus atom.
  • the step c1 may be performed by isolating the n + p polymerized oligonucleotide (iva or ivb) obtained in the step b1 or the n polymerized oligonucleotide (iaa or iib) obtained in the step a.
  • step c1 Specific examples of the solvent used in step c1 include the same solvents as in step a, and are appropriately selected depending on the oxidizing agent, sulfiding agent, amidating agent or boronating agent used.
  • the “oxidant” used in step c1 is not particularly limited as long as it has the ability to oxidize a phosphite diester bond to a phosphodiester bond without oxidizing other sites, but iodine, (1S) — (+)-(10-camphanylsulfonyl) oxaziridine, tert-butyl hydroperoxide (TBHP), 2-butanone peroxide, 1,1-dihydroperoxycyclododecane, bis (trimethylsilyl) peroxide, m-chloroperbenzoic acid are preferred. .
  • Iodine, tert-butyl hydroperoxide, and 2-butanone peroxide are more preferable, and iodine is particularly preferable from the viewpoint that an oxidation reaction with a good yield or reaction rate can be achieved.
  • Such an oxidizing agent can be used by diluting with an appropriate solvent so as to have a concentration of 0.05 to 2M.
  • a diluting solvent is not particularly limited as long as it is an inert solvent for the reaction, and examples thereof include pyridine, tetrahydrofuran [THF], dichloromethane, water, or a mixed solvent thereof.
  • step c1 it is preferable to use a mixed solution of iodine / water / pyridine or a mixed solution of iodine / water / pyridine / THF.
  • the reaction solvent in step c1 is the same as the dilution solvent.
  • the “sulfurizing agent” used in step c1 is not particularly limited as long as it has the ability to convert a phosphite diester bond to a thiophosphate diester bond.
  • ADTT 3-amino-1,2,4-dithiazole -5-thione
  • DDTT 3-((N, N
  • elemental sulfur and ADTT are more preferable, and elemental sulfur is particularly preferable.
  • a sulfurizing agent can be used by diluting with a suitable solvent so as to have a concentration of 0.05 to 2M.
  • a diluting solvent is not particularly limited as long as it is inert to the reaction, and examples thereof include dichloromethane, acetonitrile, pyridine, and a mixed solvent thereof.
  • the reaction solvent in step c1 is the same as the dilution solvent.
  • the reagent for converting the phosphite diester bond to the “phosphate triester bond” is not particularly limited as long as it has the conversion ability, but the corresponding alcohol compound, carbon tetrachloride, iodine, odor Carbon trichloride, N-chlorosuccinimide, trichloroisocyanuric acid, sodium hypochlorite, 3,3-dichloro-5,5-dimethylhydantoin, N, N'-dichlorobis (2,4,6-trichlorophenyl) An oxidizing agent such as urea is preferred.
  • the solvent for the conversion reaction is not particularly limited as long as it is an inert solvent for the reaction, and examples thereof include dichloromethane, pyridine, and mixed solvents thereof, preferably dichloromethane or pyridine, and more preferably pyridine.
  • the reagent for converting a phosphite diester bond to a “thiophosphoric acid-O, O, S-triester bond” is not particularly limited as long as it has the conversion ability.
  • examples thereof include succinic sulfiding agents and morpholine dione sulfiding agents.
  • the solvent for the conversion reaction is not particularly limited as long as it is an inert solvent for the reaction, and examples thereof include dichloromethane, pyridine, and mixed solvents thereof, preferably dichloromethane or pyridine, and more preferably pyridine.
  • N- (C1-40 alkylthio) phthalimide N- (C3-6 cycloalkylthio) phthalimide, N—corresponding to the desired “thiophosphoric acid-O, O, S-triester bond” (C6-10 arylthio) phthalimide, N- (5-10 membered heteroarylthio) phthalimide, N- (aralkylthio) phthalimide and N- (heteroaralkylthio) phthalimide.
  • the target “thiophosphoric acid-O, O, S-triester bond” includes a substituent such as a halogen atom, a cyano group, or a C1-6 alkyl group
  • a substituent such as a halogen atom, a cyano group, or a C1-6 alkyl group
  • the N- (C1-40 alkylthio) phthalimide N- (C3-6 cycloalkylthio) phthalimide, N- (C6-10 arylthio) phthalimide, N- (5-10 membered heteroarylthio) phthalimide, N- (aralkylthio) phthalimide and N- (heteroaralkylthio) Sulfiding agents containing those substituents in the corresponding part of phthalimide can be used.
  • phthalimide-based sulfurizing agent examples include N- ⁇ (2-cyanoethyl) thio ⁇ phthalimide, N- (methylthio) phthalimide, N- (ethylthio) phthalimide, N- (propylthio) phthalimide, N- (isopropylthio).
  • Phthalimide N- (butylthio) phthalimide, N- (tert-butylthio) phthalimide, N- (cyclohexylthio) phthalimide, N- (dodecylthio) phthalimide, N- (benzylthio) phthalimide, N- (phenylthio) phthalimide, N- ⁇ (P-chlorophenyl) thio ⁇ phthalimide, N- ⁇ (p-methylphenyl) thio ⁇ phthalimide, N- ⁇ (2-benzothiazolyl) thio ⁇ phthalimide, N- ⁇ (2-methylphenyl) thio ⁇ phthalimide, N- ⁇ (2-Ethylphenyl) thio ⁇ Phthalimide, N- ⁇ (2-isopropylphenyl) thio ⁇ phthalimide, N- ⁇ (2-tert-butylphenyl) thio ⁇ phthalimide, N--
  • succinic sulfiding agents include N- (C1-40 alkylthio) succinimide and N- (C3-6 cycloalkylthio) succinic acid corresponding to the target “thiophosphoric acid-O, O, S-triester bond”. Acid imides, N- (C6-10 arylthio) succinimides, N- (5-10 membered heteroarylthio) succinimides, N- (aralkylthio) succinimides and N- (heteroaralkylthio) succinimides Etc.
  • the target “thiophosphate-O, O, S-triester bond” includes a substituent such as a halogen atom, a cyano group, or a C1-6 alkyl group
  • the N- (C1-40 alkylthio) succinate Acid imide, N- (C3-6 cycloalkylthio) succinimide, N- (C6-10 arylthio) succinimide, N- (5-10 membered heteroarylthio) succinimide, N- (aralkylthio) succinate Sulfiding agents containing those substituents at the corresponding moieties of acid imides and N- (heteroaralkylthio) succinimides can be used.
  • succinimide-containing sulfiding agent examples include N- ⁇ (2-cyanoethyl) thio ⁇ succinimide, N- (methylthio) succinimide, N- (ethylthio) succinimide, N- (propylthio).
  • N- (C1-40 alkylthio) morpholine-3,5-dione, N- (C3-6) corresponding to the target “thiophosphoric acid-O, O, S-triester bond” is used.
  • the target “thiophosphoric acid-O, O, S-triester bond” includes a substituent such as a halogen atom, a cyano group, or a C1-6 alkyl group
  • morpholine dione-based sulfurizing agent examples include N- ⁇ (2-cyanoethyl) thio ⁇ morpholine-3,5-dione, N- (methylthio) morpholine-3,5-dione, and N- (ethylthio) morpholine.
  • a person skilled in the art can use a phthalimide sulfiding agent, a succinimide sulfiding agent, and a morpholine dione sulfiding agent by a known synthesis method (phthalimide sulfiding agent and morpholine dione sulfiding agent: Tetrahedron, 1997, 53, pp. 14411- 14416, succinimide type sulfiding agent: J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 2002, pages 2619-2633).
  • the reagent for converting a phosphite diester bond to a “thiophosphoric acid-O, O, S-triester bond” is preferably a phthalimide-based sulfurizing agent, and particularly preferably N- ⁇ (2-cyanoethyl ) Thio ⁇ phthalimide.
  • the “amidizing agent” used in step c1 is not particularly limited as long as it has the ability to convert a phosphite diester bond to an aminophosphate diester bond, but the corresponding amine compound, carbon tetrachloride, iodine, bromide Carbon trichloride, N-chlorosuccinimide, trichloroisocyanuric acid, sodium hypochlorite, 3,3-dichloro-5,5-dimethylhydantoin, N, N'-dichlorobis (2,4,6-trichlorophenyl) urea
  • An oxidizing agent such as
  • the solvent for the conversion reaction is not particularly limited as long as it is an inert solvent for the reaction, and examples thereof include dichloromethane, pyridine, and mixed solvents thereof, preferably dichloromethane or pyridine, and more preferably pyridine.
  • the “boronating agent” used in step c1 is not particularly limited as long as it has the ability to convert a phosphite diester bond to a boranophosphate diester bond, but borohydride (BH 3 ), BH 3 -THF complex, BH 3 -dimethyl sulfide complex, BH 3 -pyridine complex and the like are preferable.
  • the solvent for the conversion reaction is not particularly limited as long as it is an inert solvent for the reaction, and examples thereof include dichloromethane, pyridine, and mixed solvents thereof, preferably dichloromethane or pyridine, and more preferably pyridine.
  • the amount of the reagent that modifies the phosphorus atom is 1 mol of n + p polymerized oligonucleotide (iva or ivb) obtained in step b1 or 1 mol of n polymerized oligonucleotide (iii or iib) obtained in step a.
  • 1 to 50 mol is preferable, more preferably 1 to 15 mol, still more preferably 1 to 10 mol, and even more preferably 1 to 7 mol.
  • the reaction temperature is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but is preferably ⁇ 10 ° C. to 60 ° C., more preferably 0 ° C. to 50 ° C., and further preferably 20 ° C. to 30 ° C.
  • the reaction time is the type of n + p polymerization oligonucleotide (iva or ivb) obtained in step b1 or n polymerization oligonucleotide (ia or iib) obtained in step a and the type of reagent for modifying the phosphorus atom used.
  • it is preferably 1 minute to 24 hours, more preferably 10 minutes to 12 hours, and even more preferably 30 minutes to 6 hours.
  • the oxidizing agent and the sulfiding agent may induce an undesirable side reaction after the reaction or in the subsequent step.
  • a reducing agent is used after the reaction. A quench process can be performed.
  • a trivalent phosphorus reagent for example, trialkyl phosphite such as trimethyl phosphite, triethyl phosphite, tris (2-carboxyethyl) phosphine; dimethyl phosphite, phosphorus phosphite
  • a dialkyl phosphite such as diethyl acid
  • a reducing agent such as sodium thiosulfate.
  • the capping reaction may be carried out using an acid anhydride such as acetic anhydride, benzoic anhydride, or in addition to the aforementioned condensing agent, triethylammonium salt of methyl-H-phosphonate, triethylammonium salt of ethyl-H-phosphonate, isopropyl- It can be carried out in a conventional manner using ammonium salts of alkyl-H-phosphonates such as triethylammonium salt of H-phosphonate and triethylammonium salt of 2-cyanoethyl-H-phosphonate.
  • the capping reaction may be performed after step b1 described above. When step c1 is performed after step a, the capping reaction is not
  • step c2 which is a conversion step of a phosphorous acid triester bond in the phosphoramidite method will be described.
  • Step c2 is performed after step b2 or step a without isolating the n + p polymerization oligonucleotide (via or vib) obtained in step b2 or the n polymerization oligonucleotide (iaa or iib) obtained in step a.
  • a reagent for modifying a phosphorus atom can be directly added.
  • an oxidizing agent or a sulfurizing agent is used as a reagent for modifying the phosphorus atom.
  • An oxidizing agent or a sulfurizing agent can be used to convert a phosphate triester bond or a thiophosphate triester bond.
  • Step c2 may be performed by isolating the n + p polymerization oligonucleotide (via or vib) obtained in step b2 or the n polymerization oligonucleotide (ia or iib) obtained in step a.
  • step c2 Specific examples of the solvent used in step c2 include the same solvents as in step a, and are appropriately selected depending on the oxidizing agent and sulfiding agent used.
  • the “oxidant” used in step c2 is not particularly limited as long as it has the ability to oxidize a phosphite triester bond to a phosphotriester bond without oxidizing other sites, but iodine, (1S )-(+)-(10-camphanylsulfonyl) oxaziridine, tert-butyl hydroperoxide (TBHP), 2-butanone peroxide, 1,1-dihydroperoxycyclododecane, bis (trimethylsilyl) peroxide, m-chloroperbenzoic acid Is preferred.
  • Iodine, tert-butyl hydroperoxide, and 2-butanone peroxide are more preferable, and iodine is particularly preferable from the viewpoint that an oxidation reaction with a good yield or reaction rate can be achieved.
  • Such an oxidizing agent can be used by diluting with an appropriate solvent so as to have a concentration of 0.05 to 2M.
  • a diluting solvent is not particularly limited as long as it is an inert solvent for the reaction, and examples thereof include pyridine, tetrahydrofuran [THF], dichloromethane, water, or a mixed solvent thereof.
  • step c2 it is preferable to use a mixed solvent of iodine / water / pyridine or a mixed solvent of iodine / water / pyridine / THF.
  • the reaction solvent in step c2 is the same as the dilution solvent.
  • the “sulfurizing agent” used in step c2 is not particularly limited as long as it has the ability to convert a phosphite triester bond to a thiophosphate triester bond.
  • ADTT 3-amino-1,2,4 -Dithiazole-5-thione
  • DDTT 3-((N, N
  • Such a sulfurizing agent can be used by diluting with a suitable solvent so as to have a concentration of 0.05 to 2M.
  • a diluting solvent is not particularly limited as long as it is inert to the reaction, and examples thereof include dichloromethane, acetonitrile, pyridine, and a mixed solvent thereof.
  • the reaction solvent in step c2 is the same as the dilution solvent.
  • the amount of the reagent that modifies the phosphorus atom is 1 mol of n + p polymerization oligonucleotide (via or vib) obtained in step b2 or 1 mol of n polymerization oligonucleotide (iii or iib) obtained in step a.
  • 1 to 50 mol is preferable, more preferably 1 to 15 mol, still more preferably 1 to 10 mol, and even more preferably 1 to 7 mol.
  • the oxidizing agent and the sulfurizing agent may induce an undesirable side reaction after the reaction or in the next step and after, and in order to suppress the side reaction, a quenching treatment can be performed using a reducing agent after the reaction.
  • a quenching treatment can be performed using a reducing agent after the reaction.
  • the reducing agent include trivalent phosphorus reagents (for example, trialkyl phosphites such as trimethyl phosphite, triethyl phosphite, tris (2-carboxyethyl) phosphine; dimethyl phosphite, diethyl phosphite). Dialkyl phosphite), sodium thiosulfate and the like.
  • the quenching process can be omitted.
  • the capping reaction may be carried out using an acid anhydride such as acetic anhydride, benzoic anhydride, or in addition to the aforementioned condensing agent, triethylammonium salt of methyl-H-phosphonate, triethylammonium salt of ethyl-H-phosphonate, isopropyl- It can be carried out in a conventional manner using ammonium salts of alkyl-H-phosphonates such as triethylammonium salt of H-phosphonate and triethylammonium salt of 2-cyanoethyl-H-phosphonate.
  • the capping reaction may be performed after step b2 described above. When performing step c2 after step a, the capping reaction is not performed
  • Step e is a step of precipitating the oligonucleotide by mixing the reaction solution obtained in any of steps a to c and a polar solvent, and obtaining it by solid-liquid separation.
  • polar solvents in step e include alcohol solvents such as methanol, ethanol and isopropanol n-butanol; nitrile solvents such as acetonitrile and propionitrile; ketone solvents such as acetone and 2-butanone; N, N— Amide solvents such as dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, and N-methylpiperidone; sulfoxide solvents such as dimethyl sulfoxide; water, and a mixed solvent of two or more of these.
  • alcohol solvents such as methanol, ethanol and isopropanol n-butanol
  • nitrile solvents such as acetonitrile and propionitrile
  • ketone solvents such as acetone and 2-butanone
  • N N— Amide solvents such as dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, and N-methylpiperidone
  • sulfoxide solvents such as dimethyl sulfoxide
  • the polar solvent in step e is preferably an alcohol solvent or a nitrile solvent, more preferably an alcohol solvent having 1 to 6 carbon atoms or a nitrile solvent having 1 to 6 carbon atoms, particularly preferably methanol or acetonitrile. is there.
  • step e When performing step e using the reaction solution obtained in step c, quenching of the reagent that modifies the phosphorus atom by using the above-mentioned reducing agent as a solution added to the precipitation solvent methanol or acetonitrile. At the same time, step e can be performed.
  • the target oligonucleotide can be obtained with high purity and high yield by repeating steps a to c and e as desired.
  • Step f (Deprotection and oligonucleotide isolation step)
  • the oligonucleotide can be isolated by performing deprotection according to the types and properties of the basic protecting group, the temporary protecting group and the pseudo solid phase protecting group.
  • Deprotection methods include, for example, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, 3rd edition, JOHN WILLY & SONS publication (1999), etc.
  • the step of removing the protecting group of the oligonucleotide can be carried out according to the deprotection method described in.
  • a pseudo solid phase protecting group and basic protecting groups such as benzoyl group, isobutyryl group, phenoxyacetyl group, acetyl group, levulinyl group, phosphite diester bond, phosphate diester bond or thiophosphate diester bond
  • the protected 2-cyanoethyl group which is a basic protecting group, can be removed by treatment with aqueous ammonia, aqueous ammonia / ethanol solution, or a mixture of aqueous ammonia and aqueous methylamine.
  • the temporary protecting group at the 5′-position or 3′-position can be removed by treatment with the fluorine reagent, acid or base used in step a, or a solution obtained by appropriately diluting them. Also, according to the deprotection method described in Journal of the Chemical Society Parkin Transaction 1, 2002, pages 2619-2633, DBU [1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene] and trimethylsilyl After treating with chloride to remove 2-cyanoethyl group or the like protecting the phosphodiester bond or thiophosphoric acid diester bond, pseudo-solid phase protecting group with ammonia water, benzoyl group, isobutyryl group as basic protecting group A method of removing a phenoxyacetyl group, an acetyl group, a levulinyl group, or the like can also be used.
  • a method of removing a basic protecting group such as benzoyl group, isobutyryl group, phenoxyacetyl group, acetyl group, levulinyl group, etc. with an inorganic base (potassium carbonate or the like) can also be used.
  • the phosphodiester bond substituted with the basic protecting group can be obtained by, for example, the method described in Journal of the Chemical Society Parkin Transaction 1, 1999, pages 1477 to 1486 ((E) -2-nitrobenzaldoxime, pyridine It can be converted into a phosphodiester bond by deprotection with an oxime compound such as -2-aldoxime and a base such as 1,1,3,3-tetramethylguanidine and DBU.
  • a thiophosphate diester bond substituted with a basic protecting group that can be deprotected by ⁇ elimination, such as a 2-cyanoethyl group, can be converted to a thiophosphate diester bond by deprotection under the basic conditions.
  • a basic protecting group that can be deprotected by ⁇ elimination such as a 2-cyanoethyl group
  • the bonds included in the thiophosphate-O, O, S-triester bond include, for example, Journal of the Chemical Society Parkin Transaction 1, 1999, page 1477. It can be converted to a phosphodiester bond by deprotection by the method described on page -1486 (eg, the method of treating with the oxime compound and the base). Since an oligonucleotide having no protecting group is easily degraded by an enzyme, it is preferable to isolate the oligonucleotide under air cleanliness control.
  • C6-10 arylaminocarbonyl group 5-10 membered heteroarylaminocarbonyl group, C6-10 arylsulfonylaminocarbonyl group, mono C1-6 alkylaminocarbonyl group, aralkylaminocarbonyl group, etc. are present in water. It can be removed by heating under. At this time, ammonia water may be used.
  • the confirmation of the progress of the reaction in the above steps a to c and f can apply the same method as a general liquid phase organic synthesis reaction. That is, the reaction can be followed using thin layer silica gel chromatography, high performance liquid chromatography or the like.
  • the oligonucleotide obtained from step e or step f can be further led to a desired oligonucleotide derivative by subjecting it to an organic synthesis reaction.
  • H-phosphonate using an oligonucleotide produced using any one of H-phosphonate method A, phosphoramidite method A, H-phosphonate method B and phosphoramidite method B Oligonucleotides can also be prepared using any one of method A, phosphoramidite method A, H-phosphonate method B and phosphoramidite method B.
  • a condensate (iva, via, ivb or vib) by the phosphite diester bond or phosphite triester bond after the coupling step, or a converted product of the phosphite diester bond or phosphite triester bond (via) , Viii, viib or viii)) can be used as a compound represented by formula (ia or ib) in scheme 1 or 2 to carry out step a in method A or method B.
  • oligonucleotides are pharmaceuticals for various humans or animals (RNA, DNA, oligonucleotide drugs, etc.), functional foods, specified health foods, foods, chemicals, biopolymer materials, industrial polymers It can be used for various applications such as materials.
  • the starting material in the oligonucleotide production method is a known functional group transformation method (eg, Comprehensive Organic Transformations) such as existing oxidation, reduction, hydrolysis, esterification reaction, amide condensation, etc. 2nd edition (Comprehensive Organic Transformations, Second Edition), by RC Larock, Wiley-VCH (1999), etc.)
  • a nucleoside in which a nucleobase is bonded to a ribose bridged at the 2′-position and the 4′-position with —CSNR 14 — R 14 represents a hydrogen atom or a C 1-6 alkyl group
  • R 13 represents a hydrogen atom or a C 1-6 alkyl group
  • a protection reaction and a deprotection reaction are performed as necessary using a thiocarbonylating reagent (eg, Lawson reagent) from a nucleoside having a structure bridged by Can be synthesized.
  • a thiocarbonylating reagent eg, Lawson
  • a nucleoside or oligonucleotide into which a pseudo solid phase protecting group has been introduced can be produced by the following method, but the following production method is an example of a general production method, and the pseudo solid phase according to the present embodiment is used.
  • the method for producing a nucleoside or the like into which a phase protecting group has been introduced is not limited.
  • the nucleoside or oligonucleotide into which the pseudo solid phase protecting group represented by the formula (I) is introduced is, for example, an alkyl halide represented by the following formula (X-1) and the nucleoside or oligonucleotide nucleobase in a solvent. It can obtain by making it react.
  • W means a halogen atom, and other symbols are the same as defined above.
  • a base (potassium carbonate, triethylamine, etc.) is used for the reaction between the alkyl halide represented by the formula (X-1) and the nucleoside or oligonucleotide.
  • Solvents include halogen solvents such as chloroform, dichloromethane and 1,2-dichloroethane; aromatic solvents such as benzene, toluene, xylene and mesitylene; ester solvents such as ethyl acetate and isopropyl acetate; hexane, pentane, heptane, Aliphatic solvents such as octane, nonane, cyclohexane; ether solvents such as tetrahydrofuran, diethyl ether, cyclopentyl methyl ether, tert-butyl methyl ether; N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrroli
  • the alkyl halide represented by the formula (X-1) is represented by the following formula (X-2) And a chloromethanesulfonic acid chloride in a solvent (a method described in International Publication No. 2014-144285), a carboxylic acid represented by the formula (X-2), paraformaldehyde and It can be produced by reacting zinc chloride in a solvent (Method of Journal of Medicinal Chemistry, 2009, Vol. 52, pp. 771-778).
  • an arbitrary bond among the bond between L 1 and L 2 , the bond between L 2 and L 3 and the bond between L 3 and L 4 is formed using the above functional group conversion method or the like.
  • a pseudo solid phase protecting group can be introduced step by step.
  • L 2 is —COO—, —CON (R 2 ) —, OCO— or —N (R 2 ) CO—
  • the ester bond or amide bond contained in L 2 is converted into the above functional group conversion method or the like.
  • a pseudo solid phase protecting group can be introduced stepwise.
  • L 4 is —COO—, —CON (R 2 ) —, OCO— or —N (R 2 ) CO—.
  • R 2 is the same as defined above.
  • the carboxylic acid or acid halide is a known functional group transformation method such as oxidation, reduction, hydrolysis, etc. (for example, Comprehensive Organic Transformations 2nd Edition (Comprehensive Organic Transformations, Second) Edition), R. C. Larock, Wiley-VCH (1999), etc.).
  • nucleoside or oligonucleotide represented by (iii), (iii), (va) or (vb) is obtained according to a known method.
  • the compound (iii) or (iiib) having a hydroxy group substituted with a hydroxyphosphinyl group is a compound in which the 5 ′ position of (iii) is a hydroxy group or the 3 ′ position of (iiib) is a hydroxy group, respectively.
  • H-phosphonation reagent examples include phosphorous acid, diaryl phosphites (such as diphenyl phosphite), and ammonium salts of aryl-H-phosphonates (phenyl-H— Phosphonate triethylammonium salt, p-toluyl-H-phosphonate triethylammonium salt, etc.), phosphorus halides (2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one, phosphorus trichloride, etc.) ) And the like.
  • the 5′-position of (va) is a hydroxy group, respectively.
  • a known method (MH Caruthers et al., Method in Enzymology 1987, 154, 287-313; SL) in which a compound or a compound having a hydroxy group at the 3 ′ position of (vb) is reacted in a solvent Beaucage and MH Caruthers, Tetrahedron Letters 1981, 22, 1859-1862.).
  • the solvent include the same solvents as in step a.
  • Examples of the phosphoramidite forming reagent include 2-cyanoethyldiisopropylchlorophosphoramidite, 2-cyanoethyl-N, N, N ′, N′-tetraisopropyl phosphorodiamidite and the like. Is mentioned.
  • the nucleoside represented by (iii), (iiib), (va) or (vb) in which p is 1 can also be purchased.
  • NMR nuclear magnetic resonance spectrum
  • MS mass spectrometry
  • MS was measured by ESI (electrospray ionization) method under the following condition 1 unless otherwise specified.
  • ESI + means ESI positive ion mode
  • ESI ⁇ means ESI negative ion mode.
  • Condition 1 Device: AB SCIEX TripleTOF 5600
  • Aqueous layer 10 mM ammonium formate aqueous solution
  • the mixing ratio of the organic layer and the aqueous layer was linearly changed to 90/10 in 10 minutes after the start of measurement at 50/50. Thereafter, the mixing ratio of the organic layer and the aqueous layer was fixed to 90/10 for 5 minutes.
  • Step 1 Synthesis of Compound 1 Under a nitrogen atmosphere, 3,4,5-tris (octadecyloxy) benzoic acid (synthesized according to the method described in International Publication No. 2014-077292) (3.0 g, 3.2 mmol) , Sodium carbonate (1.1 g, 10 mmol), and tetra-n-butylammonium hydrogen sulfate (0.13 g, 0.38 mmol) in a mixed solution of dichloromethane (71 g) / water (30 g) at room temperature with chloromethylsulfonyl chloride ( 0.39 mL, 3.9 mmol) was added, and the mixture was stirred for 2 hours and 42 minutes.
  • dichloromethane 71 g
  • water 30 g
  • chloromethylsulfonyl chloride 0.39 mL, 3.9 mmol
  • Step 2 Synthesis of Compound 2 Under a nitrogen atmosphere, Compound 1 (1.0 g, 1.1 mmol) and 5′-O-tert-butyldimethylsilyl-3′-O-levulinyldeoxythymidine (0.71 g, 1 .6 mmol) in N, N-dimethylformamide (DMF) (50 mL), potassium carbonate (0.21 g, 1.5 mmol) was added at 70 ° C. and stirred for 2 hours and 5 minutes. Further, potassium carbonate (0.91 g 6. mmol) was added and stirred for 2 hours 44 minutes.
  • DMF N, N-dimethylformamide
  • Step 3 Synthesis of Compound 3 Under a nitrogen atmosphere, 1.0M tetrabutylammonium was added to a solution of compound 2 (0.94 g, 0.67 mmol) and acetic acid (0.41 mL, 7.2 mmol) in THF (10 mL) at 30 ° C. Fluoride (TBAF) / THF solution (3.5 mL, 3.5 mmol) was added and stirred for 4 hours and 2 minutes. Thereafter, the reaction mixture was added to methanol (100 g), and the precipitated solid was filtered to obtain compound 3 (0.85 g, yield 99%) as a yellow solid.
  • TBAF Fluoride
  • Test example (stability evaluation of deoxythymidine with a pseudo-solid phase protecting group at position 3 of thymine)
  • FIG. 1 shows the time-dependent change in the HPLC relative area of each compound when the HPLC relative area of each compound at time 0 is defined as 100%.
  • compound means a compound
  • time means time
  • HPLC peak area means HPLC relative area.
  • FIG. 1 shows that compound 3 is more stable than compound 4.
  • Nucleoside or oligonucleotide having a pseudo solid phase protecting group having high stability by the nucleobase part can be provided, and a novel method for producing an oligonucleotide capable of mass synthesis can be provided. Therefore, the present invention can be applied to the production of oligonucleotides such as siRNA, antisense nucleic acids and vaccine adjuvants, and is extremely useful in fields such as genome drug discovery and gene diagnosis / treatment.

Abstract

単離が容易で保存安定性が高いヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドを用いる、オリゴヌクレオチドの新規製造方法を提供する。　核酸塩基部に安定性の高い擬似固相保護基を有し、５'位又は３'位がヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの当該５'－ヒドロキシ基又は３'－ヒドロキシ基を、３'位又は５'位が反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドと反応させる、カップリング工程を含むオリゴヌクレオチドの製造方法である。

Description

オリゴヌクレオチドの製造方法
　本発明は、新規オリゴヌクレオチドの製造方法、並びに安定性が高い擬似固相保護基を核酸塩基部に有するヌクレオシド化合物及びオリゴヌクレオチド化合物に関する。
　ゲノム創薬や遺伝子診断・治療などの最先端バイオ関連研究の急速な進歩・発展に伴い、近年、ＤＮＡプローブ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ及びアンチセンスＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドが盛んに利用されている。このようなオリゴヌクレオチドの化学合成方法として、ホスホロアミダイト法、Ｈ－ホスホネート法などが知られている。
　現在では、ホスホロアミダイト法による固相合成法のプロセス最適化及び自動化が進んでいるため、該合成法がスピード面で有利であり、最も汎用されている。しかし、固相合成法は、設備制約上スケールアップに制限があり、試薬及び原料を過剰に必要とする。また、固相合成法では、反応の進行状況の確認、中間体構造の解析等が困難である。
　工業的なスケール（例えば数ｋｇ）でオリゴヌクレオチドを供給するために、液相合成法が検討されている。例えば、５’方向にヌクレオチドを伸長する、擬似固相保護基等を用いる液相合成法が報告されている（例えば、特許文献１、２参照）。
　３’方向へも、５’方向へもヌクレオチドを伸長できる液相合成法として、擬似固相保護基を核酸塩基部に導入した合成法が報告されている（例えば、特許文献３参照）。
国際公開第２０１２－１５７７２３号 特許第５５４８８５２号 国際公開第２０１４－０７７２９２号
　特許文献３に報告されている擬似固相保護基は、アミド結合によりヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの核酸塩基部に結合しているが、核酸塩基の種類によって安定性が低い場合がある。ヌクレオチドを伸長する製造において、核酸塩基部から擬似固相保護基が脱離した場合、目的とするオリゴヌクレオチドの収率は低下するため、より安定で大量製造可能な新規なオリゴヌクレオチドの製造方法が求められていた。
　本発明の目的は、新規オリゴヌクレオチドの製造方法、並びに安定性が高い擬似固相保護基を核酸塩基部に有するヌクレオシド化合物及びオリゴヌクレオチド化合物を提供することにある。
　このような課題を解決するために本発明者らは鋭意研究した結果、核酸塩基部の窒素原子若しくは酸素原子への、擬似固相保護基の結合部分を、メチレンオキシ基とすることにより、上記課題が解決できることを見出し、本発明を完成させた。
　本発明は以下を含む。
１．　下記式（ＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
［式中、＊は、核酸塩基との結合位置を示し、
　Ｒ１は、それぞれ独立して、Ｃ１－４０アルキル基、Ｃ２－４０アルケニル基又はＣ２－４０アルキニル基であり、ｓは、１から５の整数であり、
　Ｌ１及びＬ３は、それぞれ独立して、単結合、Ｃ１－６アルキレン基、Ｃ２－６アルケニレン基又はＣ２－６アルキニレン基であり、
　Ｌ２及びＬ４は、それぞれ独立して、単結合、－ＣＯＯ－若しくは－ＯＣＯ－、－ＣＯＮ（Ｒ２）－若しくは－Ｎ（Ｒ２）ＣＯ－（式中Ｒ２は、水素原子、Ｃ１－６アルキル基、Ｃ１－６ハロアルキル基、Ｃ２－６アルケニル基又はＣ２－６ハロアルケニル基を示す）、－Ｃ（Ｏ）－又は－Ｏ－であり、
　Ｌ５及びＬ６は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１－６アルキル基、Ｃ１－６ハロアルキル基、Ｃ２－６アルケニル基、Ｃ２－６ハロアルケニル基、又は置換基を有していてもよいフェニル基である］で表される保護基で置換された核酸塩基を少なくとも１つ有し、
　５’位又は３’位がヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの当該５’－ヒドロキシ基又は３’－ヒドロキシ基を、
　３’位又は５’位が反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドと反応させるカップリング工程を含む、オリゴヌクレオチドの製造方法。
２．　前記カップリング工程の前に、前記式（ＩＩ）で表される保護基で置換された核酸塩基を少なくとも１つ有し、５’位又は３’位に一時保護基で置換されたヒドロキシ基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの当該一時保護基を除去して、前記５’位又は３’位がヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドを生成する反応を含む、脱一時保護基工程を更に含む、１．に記載の製造方法。
３．　前記式（ＩＩ）で表される保護基で置換された核酸塩基を少なくとも１つ有し、５’位又は３’位がヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドが、３’位又は５’位に基本保護基で置換されたヒドロキシ基を有する、１．又は２．に記載の製造方法。
４．　前記３’位又は５’位が反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドが、５’位又は３’位に一時保護基で置換されたヒドロキシ基を有する、１．から３．のいずれか１つに記載の製造方法。
５．　前記カップリング工程において、前記式（ＩＩ）で表される保護基で置換された核酸塩基を少なくとも１つ有し、５’位がヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの当該５’－ヒドロキシ基を、
　３’位が反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドと反応させる、１．から４．のいずれか１つに記載の製造方法。
６．　前記カップリング工程において、前記式（ＩＩ）で表される保護基で置換された核酸塩基を少なくとも１つ有し、３’位がヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの当該３’－ヒドロキシ基を、
　５’位が反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドと反応させる、１．から４．のいずれか１つに記載の製造方法。
７．　前記反応性リン含有基が、ヒドロキシホスフィニル基であり、カップリング工程が亜リン酸ジエステル結合を形成する、１．から６．のいずれか１つに記載の製造方法。
８．　前記カップリング工程の後に、前記亜リン酸ジエステル結合を、リン酸ジエステル結合、チオリン酸ジエステル結合、ボラノリン酸ジエステル結合、アミノリン酸ジエステル結合、リン酸トリエステル結合又はチオリン酸－Ｏ，Ｏ，Ｓ－トリエステル結合に変換する反応を含む、亜リン酸ジエステル結合の変換工程を更に含む、７．に記載の製造方法。
９．　前記反応性リン含有基が、置換されたヒドロキシ（ジアルキルアミノ）ホスフィノ基であり、カップリング工程が亜リン酸トリエステル結合を形成する、１．から６．のいずれか１つに記載の製造方法。
１０．　前記カップリング工程の後に、前記亜リン酸トリエステル結合を、リン酸トリエステル結合又はチオリン酸トリエステル結合に変換する反応を含む、亜リン酸トリエステル結合の変換工程を更に含む、９．に記載の製造方法。
１１．　少なくとも１つの工程の反応後に、反応液と極性溶媒とを混合して沈殿物を生成させ、生成した沈殿物を固液分離により取得する精製工程を更に含む、１．から１０．のいずれか１つに記載の製造方法。
１２．　前記極性溶媒が炭素数１から６のアルコール溶媒又は炭素数１から６のニトリル溶媒である、１１．に記載の製造方法。
１３．　前記一時保護基が、ｔｅｒｔ-ブチルジメチルシリル基、トリチル基、モノメトキシトリチル基又はジメトキシトリチル基であり、前記基本保護基が、レブリニル基又は３－ベンゾイルプロピオニル基である、３．から１２．のいずれか１つに記載の製造方法。
１４．　前記一時保護基が、レブリニル基又は３－ベンゾイルプロピオニル基であり、前記基本保護基が、ｔｅｒｔ-ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔｅｒｔ-ブチルジフェニルシリル基、トリチル基、モノメトキシトリチル基又はジメトキシトリチル基である、３．から１２．のいずれか１つに記載の製造方法。
１５．前記式（ＩＩ）で表される保護基、並びに存在する場合は、前記基本保護基及び前記一時保護基を除去する、全脱保護工程を更に含む、１．から１４．のいずれか１つに記載の製造方法。
１６．　下記式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
［式中、ｎは、１以上の任意の整数であり、
　ＢａｓｅＺは、それぞれ独立して、核酸塩基、基本保護基で置換された核酸塩基又は下記式（ＩＩ）で表される保護基で置換された核酸塩基であり、少なくとも１つのＢａｓｅＺは、下記式（ＩＩ）で表される保護基で置換された核酸塩基であり、
　Ｘは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、無置換若しくは置換されたヒドロキシ基又は４’位炭素原子に架橋する有機基であり、
　Ｙは、それぞれ独立して、水素原子、無置換若しくは置換されたヒドロキシ基、無置換若しくは置換されたスルファニル基、水素化ホウ素基、又は置換されたアミノ基であり、
　Ｒは、水素原子、基本保護基又は一時保護基であり、
　Ｚは、水素原子、基本保護基又は一時保護基であり、
　Ｖは、それぞれ独立して、酸素原子又は硫黄原子であり、
式（ＩＩ）が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
（式中、＊は、核酸塩基部との結合位置を示し、
　Ｒ１は、それぞれ独立して、Ｃ１－４０アルキル基、Ｃ２－４０アルケニル基又はＣ２－４０アルキニル基であり、ｓは、１から５の整数であり、
　Ｌ１及びＬ３は、それぞれ独立して、単結合、Ｃ１－６アルキレン基、Ｃ２－６アルケニレン基又はＣ２－６アルキニレン基であり、
　Ｌ２及びＬ４は、それぞれ独立して、単結合、－ＣＯＯ－若しくは－ＯＣＯ－、－ＣＯＮ（Ｒ２）－若しくは－Ｎ（Ｒ２）ＣＯ－（式中Ｒ２は、水素原子、Ｃ１－６アルキル基、Ｃ１－６ハロアルキル基、Ｃ２－６アルケニル基又はＣ２－６ハロアルケニル基を示す）、－Ｃ（Ｏ）－又は－Ｏ－であり、
　Ｌ５及びＬ６は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１－６アルキル基、Ｃ１－６ハロアルキル基、Ｃ２－６アルケニル基、Ｃ２－６ハロアルケニル基、又は置換基を有していてもよいフェニル基である）で表され、
　２以上の前記式（ＩＩ）で表される保護基を有する場合、それぞれの式（ＩＩ）で表される保護基は同一でも異なっていてもよい］で表される化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
１７．　ｎが、１から３０の整数である、１６．に記載の化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
１８．　前記式（ＩＩ）で表される保護基が置換する核酸塩基が、それぞれ独立して、チミン又はウラシルである、１６．又は１７．に記載の化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
１９．　Ｘが、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基、又は基本保護基で置換されたヒドロキシ基である、１６．から１８．のいずれか１つに記載の化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
２０．　Ｘが、水素原子である、１９．に記載の化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
２１．　Ｙが、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基又は基本保護基で置換されたヒドロキシ基である、１６．から２０．のいずれか１つに記載の化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
２２．　Ｙが、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基又はシアノ基で置換されたＣ１－６アルキル基で置換されたヒドロキシ基である、２１．に記載の化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
２３．　Ｒが、水素原子又は一時保護基であり、Ｚが、基本保護基である、１６．から２２．のいずれか１つに記載の化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
２４．　前記一時保護基が、ｔｅｒｔ-ブチルジメチルシリル基、トリチル基、モノメトキシトリチル基又はジメトキシトリチル基であり、前記基本保護基が、レブリニル基又は３－ベンゾイルプロピオニル基である、２３．に記載の化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
２５．　Ｚが、水素原子又は一時保護基であり、Ｒが、基本保護基である、１６．から２２．のいずれか１つに記載の化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
２６．　前記一時保護基が、レブリニル基又は３－ベンゾイルプロピオニル基であり、前記基本保護基が、ｔｅｒｔ-ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔｅｒｔ-ブチルジフェニルシリル基、トリチル基、モノメトキシトリチル基又はジメトキシトリチル基である、２５．に記載の化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
２７．下記式（ＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
［式中、＊は、ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの核酸塩基部との結合位置を示し、
　Ｒ１は、それぞれ独立して、Ｃ１－４０アルキル基、Ｃ２－４０アルケニル基又はＣ２－４０アルキニル基であり、ｓは、１から５の整数であり、
　Ｌ１及びＬ３は、それぞれ独立して、単結合、Ｃ１－６アルキレン基、Ｃ２－６アルケニレン基又はＣ２－６アルキニレン基であり、
　Ｌ２及びＬ４は、それぞれ独立して、単結合、－ＣＯＯ－若しくは－ＯＣＯ－、－ＣＯＮ（Ｒ２）－若しくは－Ｎ（Ｒ２）ＣＯ－（式中Ｒ２は、水素原子、Ｃ１－６アルキル基、Ｃ１－６ハロアルキル基、Ｃ２－６アルケニル基又はＣ２－６ハロアルケニル基を示す）、－Ｃ（Ｏ）－又は－Ｏ－であり、
　Ｌ５及びＬ６は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１－６アルキル基、Ｃ１－６ハロアルキル基、Ｃ２－６アルケニル基、Ｃ２－６ハロアルケニル基、又は置換基を有していてもよいベンゼン環である］で表される擬似固相保護基。
２８．　核酸塩基部にヒドロキシ基又はアミノ基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドを、
下記式（Ｘ－１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
（式中、Ｗは、ハロゲン原子であり、
　Ｒ１は、それぞれ独立して、Ｃ１－４０アルキル基、Ｃ２－４０アルケニル基又はＣ２－４０アルキニル基であり、ｓは、１から５の整数であり、
　Ｌ１及びＬ３は、それぞれ独立して、単結合、Ｃ１－６アルキレン基、Ｃ２－６アルケニレン基又はＣ２－６アルキニレン基であり、
　Ｌ２及びＬ４は、それぞれ独立して、単結合、－ＣＯＯ－若しくは－ＯＣＯ－、－ＣＯＮ（Ｒ２）－若しくは－Ｎ（Ｒ２）ＣＯ－（式中Ｒ２は、水素原子、Ｃ１－６アルキル基、Ｃ１－６ハロアルキル基、Ｃ２－６アルケニル基又はＣ２－６ハロアルケニル基を示す）、－Ｃ（Ｏ）－又は－Ｏ－であり、
　Ｌ５及びＬ６は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１－６アルキル基、Ｃ１－６ハロアルキル基、Ｃ２－６アルケニル基又はＣ２－６ハロアルケニル基である）で表されるハロゲン化アルキル化合物と反応させ、
　核酸塩基部に、下記式（ＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
（式中、＊は、ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの核酸塩基部との結合位置を示し、
　Ｒ１、Ｌ１及びＬ３、Ｌ２及びＬ４、Ｌ５及びＬ６、は上記と同じである）で表される擬似固相保護基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドを製造する方法。
　本発明により、より安定性が高い擬似固相保護基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドを提供することが可能となった。また該ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの大量合成に使用できる。
試験例１で評価した、実施例１で得られた化合物３（チミン３位に擬似固相保護基が結合したデオキシチミジン）の安定性を示す図である。
　以下、本発明について詳細に説明する。
　特に記述がない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。
　「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
　尚、本明細書中「ｎ－」はノルマル、「ｉ－」はイソ、「ｓ－」及び「ｓｅｃ－」はセカンダリー、「ｔ－」及び「ｔｅｒｔ－」はターシャリーを意味し、「Ｐｈ」はフェニル、「Ｐｙ」はピリジル又はピリジン、「Ｍｅ」はメチル、「Ｅｔ」はエチル、「Ｂｕ」はブチル、「Ｂｎ」はベンジル、「Ｂｏｃ」はターシャリーブトキシカルボニル、「ＴＢＳ」はターシャリーブチルジメチルシリル、「ＴＩＰＳ」はトリイソプロピルシリル、「ＴＢＤＰＳ」は、ターシャリーブチルジフェニルシリル、「ＤＭＴｒ」は４，４’－ジメトキシトリチルを意味し、「ｒ．ｔ．」は室温を意味する。
　「－ＣＯＯ－」、「－ＯＣＯ－」、「－ＣＯＮ（Ｒ２）－」、「－Ｎ（Ｒ２）ＣＯ－」、「－ＣＯ－」、「－ＣＳ－」、「－ＯＣＯＮ（Ｒ１２）－」、「－ＣＯＮ（Ｒ１３）－」及び「－ＣＳＮ（Ｒ１４）－」は、それぞれ、「－Ｃ（Ｏ）Ｏ－」、「－ＯＣ（Ｏ）－」、「－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２）－」、「－Ｎ（Ｒ２）Ｃ（Ｏ）－」、「－Ｃ（Ｏ）－」、「－Ｃ（Ｓ）－」、「－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１２）－」、「－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１３）－」及び「－Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ１４）－」と同義である。
　本明細書中、「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子である。
　本発明において「アルキル基」は、直鎖若しくは分岐状の、飽和脂肪族炭化水素の１価の基を意味する。「Ｃ１－６アルキル基」とは、炭素数が１から６のアルキル基を意味し、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基が挙げられる。「Ｃ１－４０アルキル基」とは、炭素数が１から４０のアルキル基を意味し、上記「Ｃ１－６アルキル基」の例に加え、デシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基、ドコシル基、トリアコンチル基、テトラコンチル基、及びそれらの異性体等が挙げられる。
　同様に「Ｃ１０－３０アルキル基」とは、炭素数が１０から３０のアルキル基を意味し、「Ｃ１５－２５アルキル基」とは、炭素数が１５から２５のアルキル基を意味し、「Ｃ１５－２０アルキル基」とは、炭素数が１５から２０のアルキル基を意味し、それらの具体例は、上記「Ｃ１－４０アルキル基」の例に含まれる。
　本発明において「アルケニル基」は、任意の位置に１以上の二重結合を有する、直鎖若しくは分岐状の、不飽和脂肪族炭化水素の１価の基を意味する。「Ｃ２－６アルケニル基」とは、炭素数が２から６のアルケニル基を意味し、例えば、エテニル基（ビニル基）、１－プロペニル基、２－プロペニル基（アリル基）、イソプロペニル基、１－ブテニル基、２－ブテニル基、３－ブテニル基（ホモアリル基）、４－ペンテニル基、５－ヘキセニル基等が挙げられる。「Ｃ２－４０アルケニル基」とは、炭素数が２から４０のアルケニル基を意味し、上記「Ｃ２－６アルケニル基」の例に加え、２－デセニル基、１０－デセニル基、１８－オクタデセニル基、２０－イコセニル基、３０－トリアコンテニル基、４０－テトラコンテニル基、及びそれらの異性体等が挙げられる。
　同様に「Ｃ１０－３０アルケニル基」とは、炭素数が１０から３０のアルケニル基を意味し、それらの具体例は、上記「Ｃ２－４０アルケニル基」の例に含まれる。
　本発明において「アルキニル基」は、任意の位置に１以上の三重結合を有する、直鎖若しくは分岐状の、不飽和脂肪族炭化水素の１価の基を意味する。「Ｃ２－６アルキニル基」とは、炭素数が２から６のアルキニル基を意味し、例えば、エチニル基、１－プロピニル基、２－プロピニル基、１－ブチニル基、２－ブチニル基、３－ブチニル基、４－ペンチニル基、５－ヘキシニル基等が挙げられる。「Ｃ２－４０アルキニル基」とは、炭素数が２から４０のアルキニル基を意味し、上記「Ｃ２－６アルキニル基」の例に加え、１０－デシニル基、１８－オクタデシニル基、２０－イコシニル基、３０－トリアコンチニル基、４０－テトラコンチニル基等が挙げられる。
　「Ｃ１－６アルキレン基」とは、前記「Ｃ１－６アルキル基」から任意の位置の水素原子を１個取り除いた２価の基を意味し、例えば、メチレン基、エチレン基（エタンジイル基）、プロパン－１，３－ジイル基、プロパン－２，２－ジイル基、２，２－ジメチル－プロパン－１，３－ジイル基、ヘキサン－１，６－ジイル基、３－メチルブタン－１，２－ジイル基などが挙げられる。
　「Ｃ２－６アルキレン基」とは、前記「Ｃ１－６アルキレン基」のうち、炭素数が２から６の直鎖又は分枝状の２価の基を意味し、例えば、エチレン基（エタンジイル基）、プロパン－１，３－ジイル基、プロパン－２，２－ジイル基、ヘキサン－１，６－ジイル基、３－メチルブタン－１，２－ジイル基などが挙げられる。
　「Ｃ２－６アルケニレン基」とは、前記「Ｃ２－６アルケニル基」から任意の位置の水素原子を１個取り除いた２価の基を意味し、例えば、エテン－１，１－ジイル基、エテン－１，２－ジイル基、プロペン－１，１－ジイル基、プロペン－１，２－ジイル基、プロペン－１，３－ジイル基、ブタ－１－エン－１，４－ジイル基、ブタ－１－エン－１，３－ジイル基、ブタ－２－エン－１，４－ジイル基、ブタ－１，３－ジエン－１，４－ジイル基、ペンタ－２－エン－１，５－ジイル基、ヘキサ－３－エン－１，６－ジイル基、ヘキサ－２，４－ジエン－１，６－ジイル基などが挙げられる。
　「Ｃ２－６アルキニレン基」とは、前記「Ｃ２－６アルキニル基」から任意の位置の水素原子を１個取り除いた２価の基を意味し、例えば、エチン－１，２－ジイル基、プロピン－１，３－ジイル基、ブタ－１－イン－１，４－ジイル基、ブタ－１－イン－１，３－ジイル基、ブタ－２－イン－１，４－ジイル基、ペンタ－２－イン－１，５－ジイル基、ペンタ－２－イン－１，４－ジイル基、ヘキサ－３－イン－１，６－ジイル基などが挙げられる。
　「Ｃ１－６ハロアルキル基」とは、１以上の前記「ハロゲン原子」で前記「Ｃ１－６アルキル基」の任意の位置の水素原子が置換された基を意味し、例えば、モノフルオロメチル基、モノフルオロエチル基、モノフルオロプロピル基、２，２，３，３，３－ペンタフルオロプロピル基、モノクロロメチル基、トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基、２，２，２－トリフルオロエチル基、２，２，２－トリクロロエチル基、１，２－ジブロモエチル基及び１，１，１－トリフルオロプロパン－２－イル基等が挙げられる。
　「Ｃ２－６ハロアルケニル基」とは、１以上の前記「ハロゲン原子」で前記「Ｃ２－６アルケニル基」の任意の位置の水素原子が置換された基を意味する。
　「Ｃ３－６シクロアルキル基」とは、環を構成する炭素原子数が３乃至６個である、単環式、縮合多環式、橋架け環式又はスピロ環式の脂肪族炭化水素から任意の位置の水素原子を１個取り除いた１価の基を意味し、具体例としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などが挙げられる。
　「Ｃ１－６アルコキシ基」とは、前記「Ｃ１－６アルキル基」が、オキシ基（－Ｏ－）に結合した基を意味する。
　「Ｃ１－６ハロアルコキシ基」とは、前記「Ｃ１－６ハロアルキル基」が、オキシ基（－Ｏ－）に結合した基を意味する。
　「モノＣ１－６アルキルアミノ基」とは、１つの前記Ｃ１－６アルキル基がアミノ基に結合した基を意味し、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、ｎ－プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ｎ－ブチルアミノ基、イソブチルアミノ基、ｓｅｃ－ブチルアミノ基、ｔｅｒｔ－ブチルアミノ基、ｎ－ペンチルアミノ基、イソペンチルアミノ基、ネオペンチルアミノ基、ｎ－ヘキシル基アミノ及びイソヘキシルアミノ基等が挙げられる。
　「ジＣ１－６アルキルアミノ基」とは、同一又は異なる２個の前記「Ｃ１－６アルキル基」がアミノ基に結合した基を意味し、例えば、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジ－ｎ－プロピルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジ－ｎ－ブチルアミノ基、ジイソブチルアミノ基、ジ－ｔ－ブチルアミノ基、ジ－ｎ－ペンチルアミノ基、ジ－ｎ－ヘキシルアミノ基、Ｎ－エチル－Ｎ－メチルアミノ基、Ｎ－メチル－Ｎ－ｎ－プロピルアミノ基、Ｎ－イソプロピル－Ｎ－メチルアミノ基、Ｎ－ｎ－ブチル－Ｎ－メチルアミノ基、Ｎ－イソブチル－Ｎ－メチルアミノ基、Ｎ－t－ブチル－Ｎ－メチルアミノ基、Ｎ－メチル－Ｎ－ｎ－ペンチルアミノ基、Ｎ－ｎ－ヘキシル－Ｎ－メチルアミノ基、Ｎ－エチル－Ｎ－ｎ－プロピルアミノ基、Ｎ－エチル－Ｎ－イソプロピルアミノ基、Ｎ－ｎ－ブチル－Ｎ－エチルアミノ基、Ｎ－エチル－Ｎ－イソブチルアミノ基、Ｎ－t－ブチル－Ｎ－エチルアミノ基、Ｎ－エチル－Ｎ－ｎ－ペンチルアミノ基、Ｎ－エチル－Ｎ－ｎ－ヘキシルアミノ基などが挙げられる。
　「Ｃ１－６アルコキシカルボニル基」、「モノＣ１－６アルキルアミノカルボニル基」及び「ジＣ１－６アルキルアミノカルボニル基」等は、それぞれ前記「Ｃ１－６アルコキシ基」、「モノＣ１－６アルキルアミノ基」及び「ジＣ１－６アルキルアミノ基」が、カルボニル基（－Ｃ（Ｏ）－）に結合した基を意味する。
　「Ｃ１－６アルコキシＣ１－６アルキル基」とは、１つの前記Ｃ１－６アルコキシ基が、前記「Ｃ１－６アルキル基」の任意の位置に置換した基を意味し、メトキシメチル基、メトキシエチル基、エトキシエチル基等が挙げられる。
　「Ｃ１－６アルキルスルホニル基」及び「Ｃ１－６ハロアルキルスルホニル基」は、それぞれ前記「Ｃ１－６アルキル基」及び「Ｃ１－６ハロアルキル基」が、スルホニル基に結合した基を意味する。
　「Ｃ６－１０アリール基」とは、環を構成する原子が全て炭素原子であり、炭素原子数が６乃至１０個である、単環式又は二環式の芳香族炭化水素から任意の位置の水素原子を１個取り除いた１価の基を意味し、具体例としては、フェニル基及びナフチル基等が挙げられる。
　「５－１０員ヘテロアリール基」とは、環を構成する原子の数が５乃至１０個であり、環を構成する原子中に１乃至５個のヘテロ原子（該へテロ原子は、窒素原子、酸素原子又は硫黄原子を意味し、２個以上の場合は、同一でも異なっていてもよい。）を含有する単環式又は縮合多環式の芳香族複素環化合物から任意の位置の水素原子を１個取り除いた１価の基を意味する。
　単環式の「５－１０員ヘテロアリール基」としては、２－チエニル基、３－チエニル基、２－フリル基、３－フリル基、２－ピラニル基、３－ピラニル基、４－ピラニル基、１－ピロリル基、２－ピロリル基、３－ピロリル基、１－イミダゾリル基、２－イミダゾリル基、４－イミダゾリル基、１－ピラゾリル基、３－ピラゾリル基、４－ピラゾリル基、５－ピラゾリル基、２－チアゾリル基、４－チアゾリル基、５－チアゾリル基、３－イソチアゾリル基、４－イソチアゾリル基、５－イソチアゾリル基、１，２，４－トリアゾール－１－イル基、１，２，４－トリアゾール－３－イル基、１，２，４－トリアゾール－５－イル基、１，２，３－トリアゾール－１－イル基、１，２，３－トリアゾール－４－イル基、１，２，３－トリアゾール－５－イル基、２－オキサゾリル基、４－オキサゾリル基、５－オキサゾリル基、３－イソオキサゾリル基、４－イソオキサゾリル基、５－イソオキサゾリル基、２－ピリジル基、３－ピリジル基、４－ピリジル基、２－ピラジニル基、２－ピリミジニル基、４－ピリミジニル基、５－ピリミジニル基、３－ピリダジニル基、４－ピリダジニル基、１，３，４－オキサジアゾール－２－イル基、１，３，４－チアジアゾール－２－イル基、１，２，４－オキサジアゾール－３－イル基、１，２，４－オキサジアゾール－５－イル基、１，２，４－チアジアゾール－３－イル基、１，２，４－チアジアゾール－５－イル基、１，２，５－オキサジアゾール－３－イル基及び１，２，５－チアジアゾール－３－イル基等が挙げられる。
　縮合多環式の「５－１０員ヘテロアリール基」としては、２－ベンゾフラニル基、３－ベンゾフラニル基、４－ベンゾフラニル基、５－ベンゾフラニル基、６－ベンゾフラニル基、７－ベンゾフラニル基、１－イソベンゾフラニル基、４－イソベンゾフラニル基、５－イソベンゾフラニル基、２－ベンゾチエニル基、３－ベンゾチエニル基、４－ベンゾチエニル基、５－ベンゾチエニル基、６－ベンゾチエニル基、７－ベンゾチエニル基、１－イソベンゾチエニル基、４－イソベンゾチエニル基、５－イソベンゾチエニル基、２－ベンゾチアゾリル基、４－ベンゾチアゾリル基、５－ベンゾチアゾリル基、６－ベンゾチアゾリル基、７－ベンゾチアゾリル基、２－クロメニル基、３－クロメニル基、４－クロメニル基、５－クロメニル基、６－クロメニル基、７－クロメニル基、８－クロメニル基、１－インドリジニル基、２－インドリジニル基、３－インドリジニル基、５－インドリジニル基、６－インドリジニル基、７－インドリジニル基、８－インドリジニル基、１－イソインドリル基、２－イソインドリル基、４－イソインドリル基、５－イソインドリル基、１－インドリル基、２－インドリル基、３－インドリル基、４－インドリル基、５－インドリル基、６－インドリル基、７－インドリル基、１－インダゾリル基、２－インダゾリル基、４－インダゾリル基、５－インダゾリル基、６－インダゾリル基、７－インダゾリル基、２－プリニル基、６－プリニル基、７－プリニル基、８－プリニル基、２－キノリル基、３－キノリル基、４－キノリル基、５－キノリル基、６－キノリル基、７－キノリル基、８－キノリル基、１－イソキノリル基、３－イソキノリル基、４－イソキノリル基、５－イソキノリル基、６－イソキノリル基、７－イソキノリル基、８－イソキノリル基、１－フタラジニル基、５－フタラジニル基、６－フタラジニル基、２，７－ナフチリジン－１－イル基、２，７－ナフチリジン－３－イル基、２，７－ナフチリジン－４－イル基、２，６－ナフチリジン－１－イル基、２，６－ナフチリジン－３－イル基、２，６－ナフチリジン－４－イル基、１，８－ナフチリジン－２－イル基、１，８－ナフチリジン－３－イル基、１，８－ナフチリジン－４－イル基、１，７－ナフチリジン－２－イル基、１，７－ナフチリジン－３－イル基、１，７－ナフチリジン－４－イル基、１，７－ナフチリジン－５－イル基、１，７－ナフチリジン－６－イル基、１，７－ナフチリジン－８－イル基、１，６－ナフチリジン－２－イル基、１，６－ナフチリジン－３－イル基、１，６－ナフチリジン－４－イル基、１，６－ナフチリジン－５－イル基、１，６－ナフチリジン－７－イニル基、１，６－ナフチリジン－８－イル基、１，５－ナフチリジン－２－イル基、１，５－ナフチリジン－３－イル基、１，５－ナフチリジン－４－イル基、２－キノキサリニル基、５－キノキサリニル基、６－キノキサリニル基、２－キナゾリニル基、４－キナゾリニル基、５－キナゾリニル基、６－キナゾリニル基、７－キナゾリニル基、８－キナゾリニル基、３－シンノリニル基、４－シンノリニル基、５－シンノリニル基、６－シンノリニル基、７－シンノリニル基、８－シンノリニル基、２－プテリジニル基、４－プテリジニル基、６－プテリジニル基及び７－プテリジニル基等が挙げられる。
　「アラルキル基」とは、前記「Ｃ１－６アルキル基」の任意の位置の水素原子が、前記「Ｃ６－１０アリール基」によって置き換えられた１価の基を意味する。
　「ヘテロアラルキル基」とは、前記「Ｃ１－６アルキル基」の任意の位置の水素原子が、前記「５－１０員ヘテロアリール基」によって置き換えられた１価の基を意味する。
　「Ｃ６－１０アリールメチル基」とは、１つの前記「Ｃ６－１０アリール基」がメチル基に結合した基を意味する。
　「ジＣ６－１０アリールメチル基」とは、２つの前記「Ｃ６－１０アリール基」がメチル基に結合した基を意味する。
　「アシル基」とは、１つの前記「Ｃ１－６アルキル基」、「Ｃ６－１０アリール基」又は「アラルキル基」がカルボニル基（－ＣＯ－）に結合した基を意味する。ここで、前記「Ｃ１－６アルキル基」又は「アラルキル基」のメチレン基は、置き換えられていないか、又は－Ｏ－、－ＮＲ１１－（Ｒ１１は水素原子又はＣ１－６アルキル基を示す）、－Ｓ－、－ＣＯ－、－ＣＳ－、－ＣＯＯ－、－ＯＣＯＮＲ１２－（Ｒ１２は水素原子又はＣ１－６アルキル基を示す）、－ＣＯＮＲ１３－（Ｒ１３は水素原子又はＣ１－６アルキル基を示す）及び－ＣＳＮＲ１４－（Ｒ１４は水素原子又はＣ１－６アルキル基を示す）から選ばれる基で置き換えられている。「アシル基」としては、アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、レブリニル基、３－ベンゾイルプロピオニル基等が挙げられる。
　「Ｃ６－１０アリールスルホニル基」は、前記「Ｃ６－１０アリール基」が、スルホニル基に結合した基を意味する。
　「Ｃ６－１０アリールアミノカルボニル基」、「５－１０員ヘテロアリールアミノカルボニル基」、「Ｃ６－１０アリールスルホニルアミノカルボニル基」及び「アラルキルアミノカルボニル基」は、それぞれ前記「Ｃ６－１０アリール基」、「５－１０員ヘテロアリール基」及び「Ｃ６－１０アリールスルホニル基」及び「アラルキル基」が、アミノカルボニル（Ｈ２Ｎ－Ｃ（Ｏ）－）基の窒素原子に置換した基を意味する。
　また「アミノカルボニル基」は、本明細書において「カルバモイル基」と互換可能に使用され、例えば「モノＣ１－６アルキルカルバモイル基」及び「ジＣ１－６アルキルカルバモイル基」は、それぞれ上記「モノＣ１－６アルキルアミノカルボニル基」及び「ジＣ１－６アルキルアミノカルボニル基」と同義であり、「Ｎ－（Ｃ６－１０アリール）カルバモイル基」、「Ｎ－（５－１０員ヘテロアリール）カルバモイル基」、「Ｎ－（Ｃ６－１０アリールスルホニル）カルバモイル基」及び「Ｎ－アラルキルカルバモイル基」は、それぞれ上記「Ｃ６－１０アリールアミノカルボニル基」、「５－１０員ヘテロアリールアミノカルボニル基」、「Ｃ６－１０アリールスルホニルアミノカルボニル基」及び「アラルキルアミノカルボニル基」と同義である。
　「３－１１員含窒素非芳香族ヘテロ環基」とは、少なくとも１個以上の窒素原子を含有する、環を構成する原子数が３乃至１１個である単環式、縮合多環式（該縮合多環式では、非芳香族環が非芳香族環又は芳香族環に縮合していてもよい。）、橋架け環式又はスピロ環式の非芳香族性の複素環化合物から、任意の位置の水素原子を１個取り除いた１価の基を意味し、アゼチジニル基、ピロリジニル基、２－オキソピロリジニル基、ピペリジニル基、３－オキソピペリジニル基、ピペラジニル基、モルホリノ基、チオモルホリノ基、ホモモルホリノ基、ホモピペラジノ基等が挙げられる。
　「反応性リン含有基」とは、リン原子を含有する基であり、リン酸ジエステル構造、チオリン酸ジエステル構造、リン酸トリエステル構造又はチオリン酸トリエステル構造が含まれるヌクレオシド間結合を形成するために有用な基を意味し、例えば、ヒドロキシホスフィニル基、置換されたヒドロキシ（ジアルキルアミノ）ホスフィノ基等が挙げられる。当該分野で公知の反応性リン含有基を本発明に用いることができる。
　前記「ヒドロキシ（ジアルキルアミノ）ホスフィノ基」とは、ヒドロキシ基及び前記「ジＣ１－６アルキルアミノ基」により、ホスフィノ基の水素原子が置き換えられている基を意味する。ここで、該ジＣ１－６アルキルアミノ基は、それらが結合する窒素原子と一緒に３－１１員含窒素非芳香族ヘテロ環基を形成していてもよい。
　「置換されたヒドロキシ（ジアルキルアミノ）ホスフィノ基」とは、前記「ヒドロキシ（ジアルキルアミノ）ホスフィノ基」が有する、リン原子に結合したヒドロキシ基の水素原子が、Ｃ１－６アルキル基等により置き換えられていることを意味する。
　ここで、前記Ｃ１－６アルキル基等は、無置換であるか又はハロゲン原子及びシアノ基からなる群から選択される１つ以上の置換基により、置換されている。
　「置換されたヒドロキシ（ジアルキルアミノ）ホスフィノ基」としては、例えば、シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ基等が挙げられる。
　「Ｃ１－４０アルキルチオ基」、「Ｃ３－６シクロアルキルチオ基」、「Ｃ６－１０アリールチオ基」、「５－１０員ヘテロアリールチオ基」、「アラルキルチオ基」及び「ヘテロアラルキルチオ基」等は、それぞれ前記「Ｃ１－４０アルキル基」、「Ｃ３－６シクロアルキル基」、「Ｃ６－１０アリール基」、「５－１０員ヘテロアリール基」、「アラルキル基」及び「ヘテロアラルキル基」が、チオ基（－Ｓ－）に結合した基を意味する。
　本明細書において、オリゴヌクレオチドの構成単位となる「ヌクレオシド」とは、核酸塩基が糖（例えば、リボース、２’－デオキシリボース、２’位と４’位が架橋したリボース、２’位と３’位が架橋したリボース等）の１’位にＮ－グリコシド化により結合された化合物を意味する。当業者は、オリゴヌクレオチドの構成単位となる「ヌクレオシド」に使用される糖を、認識できる。
　ここで、前記リボース及び２’－デオキシリボースは、無置換であるか又は、Ｃ１－６アルキル基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アミノ基、基本保護基で置換されたヒドロキシ基、基本保護基で置換されたアミノ基からなる群から選択される１つ以上の置換基で置換されている。また、前記Ｃ１－６アルキル基は、無置換であるか、ハロゲン原子、Ｃ１－６アルコキシカルボニル基、モノＣ１－６アルキルアミノカルボニル基及びジＣ１－６アルキルアミノカルボニル基等から独立して選択される１つ以上の置換基で置換されている。前記Ｃ１－６アルコキシカルボニル基、モノＣ１－６アルキルアミノカルボニル基及びジＣ１－６アルキルアミノカルボニル基等は、無置換であるか又は、モノアルキルアミノ基、ジＣ１－６アルキルアミノ基、Ｃ６－１０アリール基、５－１０員ヘテロアリール基又は３－１１員含窒素非芳香族ヘテロ環基により置換されている。また、リボースの２’位ヒドロキシ基は、無置換であるか又は基本保護基で置換されている。前記基本保護基で置換されたアミノ基の基本保護基としては、後述する核酸塩基における「アミノ基の基本保護基」と同様の基が挙げられる。
　２’位と４’位が架橋したリボースとは、ヌクレオシドの２’位と４’位とが架橋基を介して架橋されている限り限定されないが、例えば、２’位と４’位とが、Ｃ２－６アルキレン基［該アルキレン基は無置換であるか、又はＣ１－６アルキル基で置換されている。また、該アルキレン基の１若しくは２つのメチレン基は、置き換えられていないか、又は－Ｏ－、－ＮＲ１１－（Ｒ１１は水素原子又はＣ１－６アルキル基を示す）、－Ｓ－、－ＣＯ－、－ＣＳ－、－ＣＯＯ－、－ＯＣＯＮＲ１２－（Ｒ１２は水素原子又はＣ１－６アルキル基を示す）、－ＣＯＮＲ１３－（Ｒ１３は水素原子又はＣ１－６アルキル基を示す）及び－ＣＳＮＲ１４－（Ｒ１４は水素原子又はＣ１－６アルキル基を示す）から選ばれる基で置き換えられている］で架橋されたリボースが挙げられる。具体例としては、下記式の化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　ヌクレオシドの糖は、好ましくは、リボース又は２’－デオキシリボースであり、特に好ましくは２’－デオキシリボースである。
　本明細書において、「核酸塩基」とは、核酸の合成に使用されるものであれば特に制限されず、例えば、シトシル基、ウラシル基、チミニル基、５－メチルシトシル基等のピリミジン塩基、アデニル基、グアニル基等のプリン塩基を挙げることができる。また、「基本保護基で置換された核酸塩基」とは、例えば、アミノ基を有する核酸塩基であるアデニル基、グアニル基、又はシトシル基において、アミノ基が基本保護基で置換されていること、ヒドロキシ基を有する核酸塩基である場合においてヒドロキシ基が基本保護基で置換されていること、スルファニル基を有する核酸塩基である場合においてスルファニル基が基本保護基で置換されていること、又はカルボニル基を有する核酸塩基において、その環に置換されているアミノ基又はヒドロキシ基と共役してカルボニル基がヒドロキシ基の形になって該ヒドロキシ基が基本保護基で置換されていること等を意味し、３’位又は５’位における一時保護基の脱保護条件に耐え得る保護基により保護されている核酸塩基が好ましい。
　前記核酸塩基における「アミノ基の基本保護基」としては、特に限定されず、例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS）、第３版、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（JOHN WILLY & SONS）出版（1999年）等に記載されている保護基を挙げることができる。かかる「アミノ基の基本保護基」の具体例としては、例えば、ピバロイル基、ピバロイロキシメチル基、トリフルオロアセチル基、フェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、アセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、ジメチルホルムアミジニル基、ジメチルアセトアミジニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基等を挙げることができる。これらの中でも、フェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、アセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、及びジメチルホルムアミジニル基が好ましい。
　また、前記核酸塩基における「アミノ基の基本保護基」の具体例としては、Ｃ６－１０アリールアミノカルボニル基、５－１０員ヘテロアリールアミノカルボニル基、Ｃ６－１０アリールスルホニルアミノカルボニル基、モノＣ１－６アルキルアミノカルボニル基、アラルキルアミノカルボニル基等のアミノカルボニル型保護基を挙げることができる。
　Ｃ６－１０アリールアミノカルボニル基としては、フェニルアミノカルボニル基（ここで、フェニルアミノカルボニル基は、無置換であるか、又はハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１－６アルキルスルホニル基、Ｃ１－６ハロアルキルスルホニル基、Ｃ１－６アルコキシ基、Ｃ１－６ハロアルコキシ基、Ｃ１－６アルキル基、Ｃ２－６アルケニル基、Ｃ１－６ハロアルキル基及びＣ２－６ハロアルケニル基からなる群から選択される少なくとも１つの置換基で置換されている）等が挙げられる。
　前記アミノカルボニル型保護基のＣ６－１０アリールは、好ましくは、フェニル、２－ニトロフェニル、２－トリフルオロメチルフェニル、３－トリフルオロメチルフェニル、４－トリフルオロメチルフェニル、２－クロロフェニル、２－フルオロフェニル、２－メチルフェニル、２－シアノフェニル、２－トリフルオロメトキシフェニル、２－クロロ－６－トリフルオロメチルフェニル、２－クロロ－４－トリフルオロメチルフェニル、２，６－ジクロロフェニル、２，６－ジフルオロフェニル、２，６－ジメチルフェニル、ペンタフルオロフェニル、２－メトキシフェニル、２，３－ジメトキシフェニル、２，４－ジメトキシフェニル、２，５－ジメトキシフェニル、２，６－ジメトキシフェニル、３，４，５－トリメトキシフェニル、２，３，４－トリメトキシフェニル、２，４，５－トリメトキシフェニル、２，４，６－トリメトキシフェニルである。
　前記５－１０員ヘテロアリールアミノカルボニル基は、好ましくは、２－ピリジルアミノカルボニル基、３－ピリジルアミノカルボニル基、４－ピリジルアミノカルボニル基である。
　前記Ｃ６－１０アリールスルホニルアミノカルボニル基は、好ましくは、Ｎ－（ｐ－トルエンスルホニル）アミノカルボニル基、ベンゼンスルホニルアミノカルボニル基である。
　前記モノＣ１－６アルキルアミノカルボニル基は、好ましくは、エチルアミノカルボニル基である。
　前記アラルキルアミノカルボニル基は、好ましくは、ベンジルアミノカルボニル基等を挙げることができる。
　アデニル基のアミノ基の保護基は、好ましくは、フェニルアミノカルボニル基（該フェニルアミノカルボニル基は、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１－６アルキルスルホニル基、Ｃ１－６ハロアルキルスルホニル基及びＣ１－６ハロアルキル基からなる群から選択される少なくとも１つの置換基で置換されている）又は、ピリジルアミノカルボニル基であり、さらに好ましくは、２－ニトロフェニルアミノカルボニル基、２－トリフルオロメチルフェニルアミノカルボニル基、ペンタフルオロフェニルアミノカルボニル基、２－クロロ－６－トリフルオロメチルフェニルアミノカルボニル基、２－クロロ－４－トリフルオロメチルフェニルアミノカルボニル基、３－ピリジルアミノカルボニル基、又は４－ピリジルアミノカルボニル基であり、特に好ましくは、２－クロロ－６－トリフルオロメチルフェニルアミノカルボニル基である。
　シトシル基及び５－メチルシトシル基のアミノ基の保護基は、好ましくは、フェニルアミノカルボニル基（該フェニルアミノカルボニル基は、無置換であるか、又は少なくとも１つのＣ１－６アルコキシ基若しくはＣ１－６ハロアルコキシ基で置換されている）又はピリジルアミノカルボニル基であり、より好ましくは、フェニルアミノカルボニル基、２，３－ジメトキシフェニルアミノカルボニル基、２，４－ジメトキシフェニルアミノカルボニル基、２，５－ジメトキシフェニルアミノカルボニル基、３－ピリジルアミノカルボニル基、又は４－ピリジルアミノカルボニル基であり、さらに好ましくは、フェニルアミノカルボニル基、２，３－ジメトキシフェニルアミノカルボニル基、２，４－ジメトキシフェニルアミノカルボニル基又は２，５－ジメトキシフェニルアミノカルボニル基であり、特に好ましくは、フェニルアミノカルボニル基である。
　前記核酸塩基における「ヒドロキシ基の基本保護基」としては、特に限定されず、例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS）、第３版、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（JOHN WILLY & SONS）出版（1999年）等に記載されている任意の保護基を挙げることができる。具体的には、Ｃ１－６アルキル基（メチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基等）、Ｃ６－１０アリールメチル基（ベンジル基、ｐ－メトキシベンジル基等）、Ｃ１－６アルコキシＣ１－６アルキル基（メトキシメチル基、メトキシエチル基、シアノエトキシメチル基、エトキシエチル基等）、２－テトラヒドロピラニル基、シアノエチル基、カルバモイル基（フェニルカルバモイル基、１，１－ジオキソチオモルホリン－４－チオカルバモイル基等）、アシル基（アセチル基、ピバロイル基、イソブチリル基、ベンゾイル基、フェノキシアセチル基、レブリニル基、３－ベンゾイルプロピオニル基等）、シリル基（トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル基等）、［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル基（Ｔｏｍ基）、１－（４－クロロフェニル）－４－エトキシピペリジン－４－イル基（Ｃｐｅｐ基）等を挙げることができる。これらの中でも、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基又はｐ－メトキシベンジル基が好ましい。
　前記核酸塩基における「スルファニル基の基本保護基」としては、「ヒドロキシ基の基本保護基」と同様の保護基に加えて、ジスルフィド結合を形成する保護基を挙げることができる。
　また、核酸塩基のカルボニル基が共役してヒドロキシ基の形になって保護されているとき、例えば、フェノール、２，５－ジクロロフェノール、３－クロロフェノール、３，５－ジクロロフェノール、２－ホルミルフェノール、２－ナフトール、４－メトキシフェノール、４－クロロフェノール、２－ニトロフェノール、４－ニトロフェノール、４－アセチルアミノフェノール、ペンタフルオロフェノール、４－ピバロイロキシベンジルアルコール、４－ニトロフェネチルアルコール、２－（メチルスルホニル）エタノール、２－（フェニルスルホニル）エタノール、２－シアノエタノール、２－（トリメチルシリル）エタノール、ジメチルカルバミン酸クロリド、ジエチルカルバミン酸クロリド、エチルフェニルカルバミン酸クロリド、１－ピロリジンカルボン酸クロリド、４－モルホリンカルボン酸クロリド、ジフェニルカルバミン酸クロリド等を反応させて、カルボニル基を保護することが出来る。
　また、該「核酸塩基」には、上記の基の他に、核酸塩基が任意の置換基（例えば、ハロゲン原子、Ｃ１－６アルキル基、アラルキル基、Ｃ１－６アルコキシ基、アシル基、Ｃ１－６アルコキシＣ１－６アルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基、モノＣ１－６アルキルアミノ基、ジＣ１－６アルキルアミノ基、カルボキシ基、シアノ基、ニトロ基等）により任意の位置に１から３個置換されている修飾核酸塩基（例えば、８－ブロモアデニル基、８－ブロモグアニル基、５－ブロモシトシル基、５－ヨードシトシル基、５－ブロモウラシル基、５－ヨードウラシル基、５－フルオロウラシル基、５－メチルシトシル基、８－オキソグアニル基、ヒポキサンチニル基等）及びデメチル化された修飾核酸塩基（例えば、チミンの５－デメチル化）等も包含される。また、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリ－（２０１６年、５９巻、２１号、９６４５－９６６７頁）、メディシナル・ケミストリー・コミュニケーションズ（２０１４年、５巻、１４５４－１４７１頁）、フューチャー・メディシナル・ケミストリー（２０１１年、３巻、３号、３３９－３６５頁）等に、ヌクレオチドにおける塩基部分の修飾の例が開示されており、これらを用いることができる。
〔伸長反応サイクル〕
　本明細書中「伸長反応サイクル」は、擬似固相保護基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの３’－ヒドロキシ基又は５’－ヒドロキシ基を、反応性リン含有基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドと反応させ、擬似固相保護基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドと、反応性リン含有基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドとの結合体を得る反応サイクルを意味する。
　伸長反応サイクルは、例えば、擬似固相保護基で置換された核酸塩基を少なくとも１つ有し、３’位又は５’位に一時保護基で置換されたヒドロキシ基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの一時保護基を除去して３’位又は５’位がヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドを生成する反応を含む工程と、生成したヒドロキシ基を、反応性リン含有基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドと反応させ、これらが亜リン酸ジエステル結合又は亜リン酸トリエステル結合等を介して結合したオリゴヌクレオチドを得る工程と、を含む。
〔擬似固相保護基〕
　本発明に使用される擬似固相保護基とは、該保護基を反応基質が有することにより、反応基質及び反応生成物が低極性溶媒に可溶化し、液相中の反応が可能であると共に、一定以上の極性溶媒の添加により反応生成物又は反応基質が沈殿し、固液分離が可能となる保護基であって、５’位ヒドロキシ基若しくは３’位ヒドロキシ基の下記一時保護基を除去する条件では安定な保護基である。擬似固相保護基を有する反応基質を使用することにより、反応性と後処理の簡便性とを両立することができる。
　本発明に使用される擬似固相保護基としては、下記式（ＩＩ）で表される基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
［式中、＊は、核酸塩基との結合位置を示し、
　Ｒ１は、それぞれ独立して、Ｃ１－４０アルキル基、Ｃ２－４０アルケニル基又はＣ２－４０アルキニル基であり、ｓは、１から５の整数であり、
　Ｌ１及びＬ３は、それぞれ独立して、単結合、Ｃ１－６アルキレン基、Ｃ２－６アルケニレン基又はＣ２－６アルキニレン基であり、
　Ｌ２及びＬ４は、それぞれ独立して、単結合、－ＣＯＯ－若しくは－ＯＣＯ－、－ＣＯＮ（Ｒ２）－若しくは－Ｎ（Ｒ２）ＣＯ－（式中Ｒ２は、水素原子、Ｃ１－６アルキル基、Ｃ１－６ハロアルキル基、Ｃ２－６アルケニル基又はＣ２－６ハロアルケニル基を示す）、－Ｃ（Ｏ）－又は－Ｏ－であり、
　Ｌ５及びＬ６は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１－６アルキル基、Ｃ１－６ハロアルキル基、Ｃ２－６アルケニル基、Ｃ２－６ハロアルケニル基、又は置換基を有していてもよいフェニル基である。］
　ここで、Ｌ２が、－ＣＯＯ－又は－Ｏ－であり、Ｌ４が、－ＯＣＯ－又は－Ｏ－であるとき、Ｌ３は、Ｃ１－６アルキレン基、Ｃ２－６アルケニレン基又はＣ２－６アルキニレン基であることが好ましい。また、Ｌ１が、Ｃ１－６アルキレン基、Ｃ２－６アルケニレン基又はＣ２－６アルキニレン基であり、Ｌ２が、単結合であるとき、Ｌ３は、単結合であることが好ましい。
　本発明に使用される擬似固相保護基の代表的な例としては、例えば、
｛［３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル］オキシ｝メチル基、及び
２－［Ｎ－メチル－３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンズアミド］エトキシスクシニルオキシメチル基（［（３－｛２－［Ｎ－メチル－３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）ベンズアミド］エトキシカルボニル｝プロパノイル）オキシ］メチル基）
などが挙げられる。
〔一時保護基〕
　本発明に使用される一時保護基とは、５’位ヒドロキシ基若しくは３’位ヒドロキシ基を保護する保護基であり、前記「伸長反応サイクル」において脱保護される保護基である。脱保護された５’位ヒドロキシ基若しくは３’位ヒドロキシ基は、伸長反応サイクルにおいて、別のヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの反応性リン含有基との結合に利用される。一時保護基は、例えば、以下の文献に記載されるような保護基が挙げられる。
　Protective Groups in Organic Synthesis, Greene T. W. and Wuts P.G.M., published by Wiley Interscience, 1999及びProtecting Groups, Kocienski P. J., 1994, Georg Thieme Verlag。
〔基本保護基〕
　本発明に使用される基本保護基とは、核酸塩基中のアミノ基、カルボニル基、ヒドロキシ基若しくはスルファニル基、又は２’位ヒドロキシ基若しくはアミノ基、３’位ヒドロキシ基若しくは５’位ヒドロキシ基、又はリン酸ジエステル結合、チオリン酸ジエステル結合若しくは亜リン酸ジエステル結合のヒドロキシ基、又はチオリン酸ジエステル結合のスルファニル基を保護する保護基であり、前記「伸長反応サイクル」においては脱保護されず、かつ前記「擬似固相保護基」が有する機能は有さない一般的な保護基である。基本保護基は、例えば、以下の文献に記載される保護基が挙げられる。
　Protective Groups in Organic Synthesis, Greene T. W. and Wuts P.G.M., published by Wiley Interscience, 1999及びProtecting Groups, Kocienski P. J., 1994, Georg Thieme Verlag。
　擬似固相保護基、一時保護基、又は基本保護基により置換された官能基（ヒドロキシ基、アミノ基、スルファニル基等）とは、官能基が有する水素原子が当該保護基により置き換えられた基を意味する。
　擬似固相保護基又は基本保護基により置換された核酸塩基とは、核酸塩基が有する官能基（ヒドロキシ基、アミノ基、スルファニル基等）の水素原子が当該保護基により置き換えられた核酸塩基を意味する。前記核酸塩基が有する官能基には、共役することにより生成する官能基も含まれる。
　「基本保護基で置換されたリン酸ジエステル結合」は、リン酸ジエステル結合がヒドロキシ基を有するとき、当該ヒドロキシ基が基本保護基で置換されていることを意味し、「リン酸トリエステル結合」に包含される。
　「基本保護基で置換された亜リン酸ジエステル結合」は、亜リン酸ジエステル結合がヒドロキシ基を有するとき、当該ヒドロキシ基が基本保護基で置換されていることを意味し、「亜リン酸トリエステル結合」に包含される。
　「基本保護基で置換されたチオリン酸ジエステル結合」は、チオリン酸ジエステル結合がヒドロキシ基又はスルファニル基を有するとき、当該ヒドロキシ基又はスルファニル基が基本保護基で置換されていることを意味し、それぞれ「チオリン酸トリエステル結合」、「チオリン酸－Ｏ，Ｏ，Ｓ－トリエステル結合」に包含される。
　本明細書中「４’位炭素原子に架橋する有機基」は、糖の２’位と４’位とを架橋する有機基を意味し、特に限定されないが、例えば、Ｃ２－６アルキレン基［該アルキレン基は無置換であるか、又はＣ１－６アルキル基で置換されている。ここで、該アルキレン基の１若しくは２つのメチレン基は、置き換えられていないか、又は－Ｏ－、－ＮＲ１１－（Ｒ１１は水素原子又はＣ１－６アルキル基を示す）、－Ｓ－、－ＣＯ－、－ＣＳ－、－ＣＯＯ－、－ＯＣＯＮＲ１２－（Ｒ１２は水素原子又はＣ１－６アルキル基を示す）、－ＣＯＮＲ１３－（Ｒ１３は水素原子又はＣ１－６アルキル基を示す）及び－ＣＳＮＲ１４－（Ｒ１４は水素原子又はＣ１－６アルキル基を示す）から選ばれる基で置き換えられている］である架橋基を意味する。
〔オリゴヌクレオチドの製造方法〕
　次に、本発明にかかるオリゴヌクレオチドの製造方法（以下、「本発明の製造方法」ともいう。）について説明する。具体的には、擬似固相保護基で置換された核酸塩基を少なくとも１つ有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチド（以下、「ｎ個重合オリゴヌクレオチド」ともいう）から、ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチド（以下、「ｐ個重合オリゴヌクレオチド」ともいう）で伸長され、擬似固相保護基で置換された核酸塩基を少なくとも１つ有するオリゴヌクレオチド（以下、「ｎ＋ｐ個重合オリゴヌクレオチド」ともいう）を製造する方法について説明する。なお、ｎ個重合オリゴヌクレオチドとは、ｎ個のヌクレオシドがリン含有基を介して結合したオリゴヌクレオチドを意味し、ｎ＝１の場合、ｎ個重合オリゴヌクレオチドはヌクレオシドと解され、ｐ個重合オリゴヌクレオチドについても同様である。
　ここで、ｎ個重合オリゴヌクレオチドが、２以上の核酸塩基部を有する場合、それぞれの核酸塩基部は同一であっても異なっていてもよく、ｎ個重合オリゴヌクレオチドが、２以上の擬似固相保護基を有する場合、それぞれの擬似固相保護基は同一であっても異なっていてもよく、ｎ個重合オリゴヌクレオチドが、２以上の基本保護基を有する場合、それぞれの基本保護基は同一であっても異なっていてもよく、ｎ個重合オリゴヌクレオチドが、２以上の４’位炭素原子に架橋する有機基を有する場合、それぞれの４’位炭素原子に架橋する有機基は同一であっても異なっていてもよい。
　ｐ個重合オリゴヌクレオチドについても同様である。
　オリゴヌクレオチドの製造方法は、擬似固相保護基で置換された核酸塩基を少なくとも１つ有し、５’位又は３’位がヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの当該５’－ヒドロキシ基又は３’－ヒドロキシ基を、３’位又は５’位が反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの当該３’位又は５’位の反応性リン含有基と反応させる、カップリング工程を含む。
　またオリゴヌクレオチドの製造方法は、前記カップリング工程を含む伸長反応サイクルを少なくとも１つ含む。
　オリゴヌクレオチドの製造方法は、Ｈ－ホスホネート法を用いても、ホスホロアミダイト法を用いてもよい。
　オリゴヌクレオチドの製造方法は、好ましくは以下の工程ａから工程ｃを伸長反応サイクルに含む。なお、工程ａから工程ｃの順番は、工程ａ、工程ｂ、工程ｃの順か、工程ａ、工程ｃ、工程ｂの順に行う。好ましい順は、工程ａ、工程ｂ、工程ｃの順である。
（工程ａ）
　工程ａは、擬似固相保護基で置換された核酸塩基を少なくとも１つ有し、かつ伸長末端のヒドロキシ基が一時保護基で置換されたヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの一時保護基を除去してヒドロキシ基とすることを含む脱一時保護基工程である。
（工程ｂ）
　工程ｂは、前記一時保護基が除去されたヒドロキシ基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドに対して、反応性リン含有基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドを添加して、そのヒドロキシ基を介して亜リン酸ジエステル結合又は亜リン酸トリエステル結合により縮合させることを含むカップリング工程である。
　工程ｂ１は、Ｈ－ホスホネート法の場合の工程ｂである。工程ｂ１では、前記反応性リン含有基は、ヒドロキシホスフィニル基であり、亜リン酸ジエステル結合が形成される。
　工程ｂ２は、ホスホロアミダイト法の場合の工程ｂである。工程ｂ２では、前記反応性リン含有基は、置換されたヒドロキシ（ジアルキルアミノ）ホスフィノ基であり、亜リン酸トリエステル結合が形成される。
（工程ｃ）
　工程ｃは、前記形成された亜リン酸ジエステル結合又は亜リン酸トリエステル結合を、変換することを含む、変換工程である。
　工程ｃ１は、前記工程ｂ１で形成された亜リン酸ジエステル結合を、リン酸ジエステル結合、チオリン酸ジエステル結合、アミノリン酸ジエステル結合、ボラノリン酸ジエステル結合、リン酸トリエステル結合又はチオリン酸－Ｏ，Ｏ，Ｓ－トリエステル結合等へと変換することを含む、亜リン酸ジエステル結合の変換工程である。
　工程ｃ２は、前記工程ｂ２で形成された亜リン酸トリエステル結合を、リン酸トリエステル結合又はチオリン酸トリエステル結合等へと変換することを含む、亜リン酸トリエステル結合の変換工程である。
　ここで、前記アミノリン酸ジエステル結合のアミノ基は、１若しくは２個のＣ１－６アルキル基で置換されている。
　前記リン酸トリエステル結合は、リン酸ジエステル結合の１つのヒドロキシ基の水素原子が基本保護基等によって置き換えられた基であり、例えば、Ｃ１－４０アルキル基、Ｃ３－６シクロアルキル基、Ｃ６－１０アリール基、５－１０員ヘテロアリール基、アラルキル基又はヘテロアラルキル基等によって置き換えられた結合が挙げられる。
　前記亜リン酸トリエステル結合は、亜リン酸ジエステル結合の１つのヒドロキシ基の水素原子が基本保護基等によって置き換えられた基であり、例えば、Ｃ１－４０アルキル基、Ｃ３－６シクロアルキル基、Ｃ６－１０アリール基、５－１０員ヘテロアリール基、アラルキル基又はヘテロアラルキル基等によって置き換えられた結合が挙げられる。
　チオリン酸－Ｏ，Ｏ，Ｓ－トリエステル結合は、チオリン酸ジエステル結合の１つのスルファニル基の水素原子が基本保護基等によって置き換えられた基であり、Ｃ１－４０アルキル基、Ｃ３－６シクロアルキル基、Ｃ６－１０アリール基、５－１０員ヘテロアリール基、アラルキル基又はヘテロアラルキル基等によって置き換えられた結合である。
　ここで、前記リン酸トリエステル結合、前記亜リン酸トリエステル結合及びチオリン酸－Ｏ，Ｏ，Ｓ－トリエステル結合における前記Ｃ１－４０アルキル基は、無置換であるか又は、ハロゲン原子、シアノ基等によって置換されている。前記Ｃ３－６シクロアルキル基、前記Ｃ６－１０アリール基、前記５－１０員ヘテロアリール基、前記アラルキル基及び前記ヘテロアラルキル基は、無置換であるか又は、Ｃ１－６アルキル基、ハロゲン原子、シアノ基等によって置換されている。
　Ｈ－ホスホネート法の場合、オリゴヌクレオチドの製造方法は、工程ａ、工程ｂ１及び工程ｃ１を伸長反応サイクルに含む。工程ａ、工程ｂ１及び工程ｃ１の順は、この順か、又は工程ａ、工程ｃ１、工程ｂ１の順であり、好ましくは、工程ａ、工程ｂ１、工程ｃ１の順である。
　ホスホロアミダイト法の場合、オリゴヌクレオチドの製造方法は、工程ａ、工程ｂ２及び工程ｃ２をこの順に伸長反応サイクルに含む。工程ａ、工程ｂ２及び工程ｃ２の順は、この順か、又は工程ａ、工程ｃ２、工程ｂ２の順であり、好ましくは、工程ａ、工程ｂ２、工程ｃ２の順である。
　工程ａに用いる擬似固相保護基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドに含まれるヌクレオシド数ｎは、１以上の任意の整数であれば特に限定されないが、好ましくは、１から５０であり、より好ましくは１から３０であり、更に好ましくは１から１０であり、更により好ましくは１から５であり、更により好ましくは１又は２であり、特に好ましくは１、つまりヌクレオシドを用いることが特に好ましい。
　工程ｂに用いる反応性リン含有基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドに含まれるヌクレオシド数ｐは、１以上の任意の整数であれば特に限定されないが、好ましくは、１から５０であり、より好ましくは１から３０であり、更に好ましくは１から５であり、更により好ましくは１又は２であり、特に好ましくは１、つまりヌクレオシドを用いることが特に好ましい。
　なお、工程ｃで得られた反応混合物を、そのまま工程ａに使用することもできる。また、工程ｃの反応後に適宜昇温などを行うことで、同時に工程ａを行うこともできる。
　オリゴヌクレオチドの製造方法は、更に、下記工程ｅを含むことにより、簡便かつ効果的に過剰原料や副生物を除去してヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドを精製することができる。
（工程ｅ）
　工程ｅは、工程ａから工程ｃのいずれかで得られた反応混合物と極性溶媒とを混合して、擬似固相保護基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドを沈殿させて、固液分離により取得する分離工程である。
　Ｈ－ホスホネート法の場合、工程ａ、工程ｂ１及び工程ｃ１のいずれかで得られた反応混合物と極性溶媒とを混合して、擬似固相保護基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドを沈殿させて、固液分離により取得する。
　ホスホロアミダイト法の場合、工程ａ、工程ｂ２及び工程ｃ２のいずれかで得られた反応混合物と極性溶媒とを混合して、擬似固相保護基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドを沈殿させて、固液分離により取得する。
　なお、工程ｅは、擬似固相保護基を用いない通常の液相合成法にも、固相合成法にも存在し得ない、擬似固相保護基を用いる液相合成法に特有の工程である。
　前記反応混合物と極性溶媒とを混合する際、反応混合物に極性溶媒を添加してもよく、極性溶媒に反応混合物を添加してもよい。好ましくは、極性溶媒に反応混合物を添加する。
　伸長反応サイクルに含まれる工程ｅの数は、特に制限されない。工程ｅは、工程ａから工程ｃのいずれの工程の後にも、行うことができる。
　工程ｅは、工程ａから工程ｃの各工程の後に、それぞれ独立して、例えば０～５回含まれ、好ましくは０～３回含まれ、より好ましくは０～２回含まれ、さらに好ましくは０又は１回含まれる。ここで、工程ａ～ｃの後の少なくとも１つに、１回以上の工程ｅが含まれる。
　伸長反応サイクルには、１から３回の工程ｅが含まれることが好ましい。工程ｅは、伸長反応サイクル中に、工程ａの後、工程ｂの後及び工程ｃの後の少なくとも１つに、１回含まれることが、副生物発生を厳格に管理・制御でき、高純度のオリゴヌクレオチドに導けるという観点で好ましい。工程ｅは、伸長反応サイクル中に、工程ａの後に１回含まれるか、工程ｃの後に１回含まれるか、又は工程ａ及び工程ｃの後にそれぞれ１回含まれることが、より好ましい。
　原料の当量管理と反応を制御することによって副生物の発生量を制御できる状況であれば、工程ａから工程ｃを基本単位として実施した後、工程ｅを行うことが好ましい。
　オリゴヌクレオチドの製造方法は、更に、工程ｆを含んでいてもよい。これにより、所望のオリゴヌクレオチドを単離・製造することができる。
（工程ｆ）
　工程ｆは、工程ａから工程ｃ及び工程ｅで得られたオリゴヌクレオチドの基本保護基、一時保護基及び擬似固相保護基を除去する脱保護工程であり、全脱保護工程とも言うことができる。
　オリゴヌクレオチドの製造方法はオリゴヌクレオチドの伸長方向によって、主に方法Ａ又は方法Ｂに分類される。方法Ａでは、５’位のヒドロキシ基を工程ａから工程ｃにより変換し、５’位にヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドを伸長する。方法Ｂでは、３’位のヒドロキシ基を工程ａから工程ｃにより変換し、３’位にヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドを伸長する。
　方法Ａは、
　前記式（ＩＩ）で表される擬似固相保護基で置換された核酸塩基を少なくとも１つ有し、３’位に基本保護基で置換されたヒドロキシ基を有し、５’位に一時保護基で置換されたヒドロキシ基を有する第一ヌクレオシド又は第一オリゴヌクレオチドの一時保護基を除去して５’－ヒドロキシ基を生成する反応を含む脱一時保護基工程（工程ａ）と、
　生成した５’－ヒドロキシ基と、３’位に反応性リン含有基を有し、５’位に一時保護基で置換されたヒドロキシ基を有する第二ヌクレオシド又は第二オリゴヌクレオチドの３’－ヒドロキシ基を反応させて、亜リン酸ジエステル結合又は亜リン酸トリエステル結合を形成して、第一ヌクレオシド又は第一オリゴヌクレオチドと、第二ヌクレオシド又は第二オリゴヌクレオチドとの結合体を得る反応を含むカップリング工程（工程ｂ）と、
　結合体の亜リン酸ジエステル結合を、リン酸ジエステル結合、チオリン酸ジエステル結合、ボラノリン酸ジエステル結合、アミノリン酸ジエステル結合、リン酸トリエステル結合、又はチオリン酸－Ｏ，Ｏ，Ｓ－トリエステル結合に変換する反応、あるいは
　結合体の亜リン酸トリエステル結合を、リン酸トリエステル結合、又はチオリン酸トリエステル結合に変換する反応を含む変換工程（工程ｃ）と、を含むオリゴヌクレオチドの製造方法である。
　方法Ｂは、
　前記式（ＩＩ）で表される擬似固相保護基で置換された核酸塩基を少なくとも１つ有し、５’位に基本保護基で置換されたヒドロキシ基を有し、３’位に一時保護基で置換されたヒドロキシ基を有する第三ヌクレオシド又は第三オリゴヌクレオチドの一時保護基を除去して３’－ヒドロキシ基を生成する反応を含む脱一時保護基工程（工程ａ）と、
　生成した３’－ヒドロキシ基と、５’位に反応性リン含有基を有し、３’位に一時保護基で置換されたヒドロキシ基を有する第四ヌクレオシド又は第四オリゴヌクレオチドの５’－ヒドロキシ基を反応させて、亜リン酸ジエステル結合又は亜リン酸トリエステル結合を形成して、第三ヌクレオシド又は第三オリゴヌクレオチドと、第四ヌクレオシド又は第四オリゴヌクレオチドとの結合体を得る反応を含むカップリング工程（工程ｂ）と、
　結合体の亜リン酸ジエステル結合を、リン酸ジエステル結合、チオリン酸ジエステル結合、ボラノリン酸ジエステル結合、アミノリン酸ジエステル結合、リン酸トリエステル結合、又はチオリン酸－Ｏ，Ｏ，Ｓ－トリエステル結合に変換する反応、あるいは
　結合体の亜リン酸トリエステル結合を、リン酸トリエステル結合、又はチオリン酸トリエステル結合に変換する反応を含む変換工程（工程ｃ）と、を含むオリゴヌクレオチドの製造方法である。
　方法Ａ、Ｂいずれにおいても、カップリング工程が亜リン酸ジエステル結合を形成する場合（即ち、Ｈ－ホスホネート法の場合）、該亜リン酸ジエステル結合は、変換工程においてリン酸ジエステル結合、チオリン酸ジエステル結合、ボラノリン酸ジエステル結合、アミノリン酸ジエステル結合、リン酸トリエステル結合、又はチオリン酸－Ｏ，Ｏ，Ｓ－トリエステル結合に変換される。カップリング工程が亜リン酸トリエステル結合を形成する場合（即ち、ホスホロアミダイト法の場合）、該亜リン酸トリエステル結合は、リン酸トリエステル結合、又はチオリン酸トリエステル結合に変換される。
　以下に、工程ａから工程ｃ、工程ｅ及び工程ｆについて順に詳細に説明する。
（工程ａ）（脱一時保護基工程）
　まず、方法Ａ又は方法Ｂのそれぞれの場合の工程ａをスキーム１又は２に示す。
　方法Ａにおける工程ａは、低極性溶媒中において、５’位ヒドロキシ基がフッ素試薬、酸又は塩基で除去可能な一時保護基Ｒで置換されたｎ個重合オリゴヌクレオチド（ｉａ）（式中、ｎは、１以上の任意の整数を示し、ｎ＝１の場合は、ヌクレオシドを示す。）の一時保護基Ｒを、フッ素試薬、酸又は塩基の添加により除去する工程（脱一時保護基工程）である（スキーム１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　スキーム中、ｎは、１以上の任意の整数を示し、Ｂａｓｅｚは、それぞれ独立して、核酸塩基、基本保護基で置換された核酸塩基又は擬似固相保護基で置換された核酸塩基を示し、Ｒは、一時保護基を示し、Ｘは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、無置換若しくは置換されたヒドロキシ基又は４’位炭素原子に架橋する有機基を示し、Ｖは、それぞれ独立して、酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｙは、それぞれ独立して、水素原子、無置換若しくは置換されたヒドロキシ基、無置換若しくは置換されたスルファニル基、水素化ホウ素基、置換されたアミノ基を示し、Ｚは、基本保護基を示す。ここで、Ｖが硫黄原子のとき、該硫黄原子が結合するリン原子に結合するＹは、置換されたヒドロキシ基を示す。
ここで、少なくとも１つのＢａｓｅＺは、擬似固相保護基で置換された核酸塩基である。
　ここで、スキーム１中化合物（ｉａ）又は（ｉｉａ）が、２以上の核酸塩基部を有する場合、それぞれの核酸塩基部は同一であっても異なっていてもよく、（ｉａ）又は（ｉｉａ）が、２以上の擬似固相保護基を有する場合、それぞれの擬似固相保護基は同一であっても異なっていてもよく、（ｉａ）又は（ｉｉａ）が、２以上の基本保護基を有する場合、それぞれの基本保護基は同一であっても異なっていてもよく、ｎ個重合オリゴヌクレオチドが、２以上の４’位炭素原子に架橋する有機基を有する場合、それぞれの４’位炭素原子に架橋する有機基は同一であっても異なっていてもよい。
　方法Ｂにおける工程ａは、低極性溶媒中において、３’位ヒドロキシ基がフッ素試薬、酸又は塩基で除去可能な一時保護基Ｒで置換されたｎ個重合オリゴヌクレオチド（ｉｂ）（式中、ｎは、１以上の任意の整数を示し、ｎ＝１の場合は、ヌクレオシドを示す。）の一時保護基Ｒを、フッ素試薬、酸又は塩基の添加により除去する工程（脱一時保護基工程）である（スキーム２）。なお、スキーム中、ｎ、Ｂａｓｅｚ、Ｒ、Ｘ、Ｖ、Ｙ及びＺは、スキーム１における定義に同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　擬似固相保護基は、少なくとも１つのＢａｓｅＺに含まれることが好ましい。
　Ｂａｓｅｚに含まれる本発明の擬似固相保護基は、下記式（ＩＩ）で表される基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　式中、＊は、核酸塩基との結合位置を示し、
　Ｒ１は、それぞれ独立して、Ｃ１－４０アルキル基、Ｃ２－４０アルケニル基又はＣ２－４０アルキニル基であり、ｓは、１から５の整数であり、
　Ｌ１及びＬ３は、それぞれ独立して、単結合、Ｃ１－６アルキレン基、Ｃ２－６アルケニレン基又はＣ２－６アルキニレン基であり、
　Ｌ２及びＬ４は、それぞれ独立して、単結合、－ＣＯＯ－若しくは－ＯＣＯ－、－ＣＯＮ（Ｒ２）－若しくは－Ｎ（Ｒ２）ＣＯ－（式中Ｒ２は、水素原子、Ｃ１－６アルキル基、Ｃ１－６ハロアルキル基、Ｃ２－６アルケニル基又はＣ２－６ハロアルケニル基を示す）、－Ｃ（Ｏ）－又は－Ｏ－であり、
　Ｌ５及びＬ６は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１－６アルキル基、Ｃ１－６ハロアルキル基、Ｃ２－６アルケニル基、Ｃ２－６ハロアルケニル基、又は置換基を有していてもよいフェニル基である。
　擬似固相保護基は、好ましくは下記式（ＩＩａ）で表される基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　式中、＊は、核酸塩基部との結合位置を示し、Ｒ１は、それぞれ独立して、Ｃ１－４０アルキル基、Ｃ２－４０アルケニル基又はＣ２－４０アルキニル基であり、ｓは、１から５の整数であり、Ｌ５及びＬ６は、それぞれ独立して、水素原子又はＣ１－６アルキル基である。
　Ｂａｓｅｚに含まれる擬似固相保護基は、さらにより好ましくは、下記式（ＩＩＩ）で表される基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　式中、＊は、核酸塩基との結合位置を示し、Ｒ１は、Ｃ１－４０アルキル基、Ｃ２－４０アルケニル基又はＣ２－４０アルキニル基であり、ｓは、１から５の整数である。
　Ｂａｓｅｚに含まれる、式（ＩＩ）、式（ＩＩａ）又は式（ＩＩＩ）で表される擬似固相保護基のＲ１は、好ましくは、Ｃ１０－３０アルキル基又はＣ１０－３０アルケニル基であり、より好ましくはＣ１０－３０アルキル基であり、さらに好ましくは、Ｃ１５－２５アルキル基であり、さらにより好ましくはＣ１５－２０アルキル基であり、特に好ましくは、オクタデシル基である。
　Ｂａｓｅｚに含まれる、式（ＩＩ）、式（ＩＩａ）又は式（ＩＩＩ）で表される擬似固相保護基のｓは、好ましくは、２から４の整数であり、より好ましくは３である。
　式（ＩＩ）、式（ＩＩａ）又は式（ＩＩＩ）において、ｓが２から５であるとき、それぞれのＲ１は、同一であっても異なっていてもよい。
　本発明の擬似固相保護基は、チミン又はウラシルに導入された場合に、特に有用である。
　Ｂａｓｅｚにおける、核酸塩基、基本保護基で置換された核酸塩基又は擬似固相保護基で置換された核酸塩基の核酸塩基は、好ましくは、シトシン、ウラシル、チミン、５－メチルシトシン、アデニン及びグアニンから独立して選択され、より好ましくは、チミン又はウラシルから独立して選択され、特に好ましくはチミンである。
　オリゴヌクレオチドの伸長末端のヒドロキシ基に用いることができる一時保護基Ｒは、フッ素試薬、酸又は塩基で脱保護可能であり、ヒドロキシ基の保護基として用いられるものであれば、特に限定はされない。フッ素試薬で脱保護可能な一時保護基Ｒとしては、シリル基（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリメチルシリル基等）が挙げられる。酸で脱保護可能な一時保護基Ｒとしては、キサンテニル基（９－（９－フェニル）キサンテニル基、９－フェニルチオキサンテニル基等）、Ｃ１－６アルコキシＣ１－６アルキル基（１－メトキシ－１－メチルエチル基、１，３－ジオキソラン－２－イル基、１，３－ベンゾジオキソール－２－イル基等）、アルキルチオアルキル基（１，３－ジチオラン－２－イル基、１，３－ベンゾジチオール－２－イル基）、Ｃ１－６アルコキシカルボニル基（ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル基等）、及びトリアリールメチル基（トリチル基、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基等）等が挙げられる。塩基で脱保護可能な一時保護基Ｒとしては、レブリニル基、３－ベンゾイルプロピオニル基が挙げられる。好ましくは、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、トリチル基、９－（９－フェニル）キサンテニル基、９－フェニルチオキサンテニル基、１，１－ビス（４－メトキシフェニル）－１－フェニルメチル基（ジメトキシトリチル基）、１－（４－メトキシフェニル）－１，１－ジフェニルメチル基（モノメトキシトリチル基）である。これらの中でも、脱保護のしやすさ、入手の容易さの観点から、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基であることが好ましく、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、ジメトキシトリチル基がより好ましく、ジメトキシトリチル基が特に好ましい。
　Ｘは、好ましくは水素原子、無置換若しくは置換されたヒドロキシ基又は４’位炭素原子に架橋する有機基である。Ｘにおける「置換されたヒドロキシ基」は、好ましくは基本保護基で置換されたヒドロキシ基である。「基本保護基で置換されたヒドロキシ基」の基本保護基としては、例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS）、第３版、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（JOHN WILLY & SONS）出版（1999年）等に記載されている保護基を挙げることができる。具体的には、Ｃ１－６アルキル基（メチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基等）、Ｃ６－１０アリールメチル基（ベンジル基、ｐ－メトキシベンジル基等）、ジＣ６－１０アリールメチル基（ジフェニルメチル基等）、Ｃ１－６アルコキシＣ１－６アルキル基（メトキシメチル基、メトキシエチル基、エトキシエチル基、シアノエトキシメチル基等）、２－テトラヒドロピラニル基、シアノエチル基、カルバモイル基（フェニルカルバモイル基、１，１－ジオキソチオモルホリン－４－チオカルバモイル基等）、アシル基（アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、レブリニル基、３－ベンゾイルプロピオニル基等）、シリル基（トリイソプロピルシリル基、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル基等）、［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル（Ｔｏｍ）基、１－（４－クロロフェニル）－４－エトキシピペリジン－４－イル（Ｃｐｅｐ）基等を挙げることができる。これらの中でもｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、又はｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル基であることが好ましく、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基であることがより好ましい。その他の態様として、レブリニル基又は３－ベンゾイルプロピオニル基が好ましく、レブリニル基がより好ましい。
　　Ｘは、より好ましくは、水素原子、ヒドロキシ基、又はＣ１－６アルキル基、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基若しくはｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル基で置換されたヒドロキシ基であり、さらに好ましくは水素原子、又はＣ１－６アルキル基若しくはトリイソプロピルシリル基で置換されたヒドロキシ基である。ここで、前記Ｃ１－６アルキル基は、無置換であるか、Ｃ１－６アルコキシカルボニル基、モノＣ１－６アルキルアミノカルボニル基、ジＣ１－６アルキルアミノカルボニル基からなる群から選ばれる基で置換されている。Ｘは、特に好ましくは、水素原子である。
　その他の態様として、Ｘはより好ましくは、Ｃ２－６アルキレン基（該アルキレン基は無置換であるか、又はメチル基で置換されている。ここで、該アルキレン基の１若しくは２つのメチレン基は、置き換えられていないか、又は－Ｏ－、－ＮＲ１１－（Ｒ１１は水素原子又はメチル基を示す）、－ＣＯ－、－ＣＳ－、－ＣＯＯ－、－ＯＣＯＮＲ１２－（Ｒ１２は水素原子又はメチル基を示す）、－ＣＯＮＲ１３－（Ｒ１３は水素原子又はメチル基を示す）及び－ＣＳＮＲ１４－（Ｒ１４は水素原子又はメチル基を示す）から選ばれる基で置き換えられている）で表される４’位炭素原子に架橋する有機基である。Ｘはより好ましくは、エチレン基（該エチレン基の１若しくは２つのメチレン基は、置き換えられていないか、又は－Ｏ－、－ＣＯＮＲ１３－（Ｒ１３は水素原子又はメチル基を示す）及び－ＣＳＮＲ１４－（Ｒ１４は水素原子又はメチル基を示す）から選ばれる基で置き換えられている）で表される４’位炭素原子に架橋する有機基である。
　Ｚにおける基本保護基としては、Ｘにおける「基本保護基で置換されたヒドロキシ基」の基本保護基として挙げられたものが挙げられる。
　中でもｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル基、レブリニル基又は３－ベンゾイルプロピオニル基が好ましく、レブリニル基又は３－ベンゾイルプロピオニル基がより好ましく、レブリニル基が更に好ましい。
　Ｘ及びＺにおける基本保護基には、一時保護基を脱保護する条件で脱保護されない保護基を用いることができる。例えば、酸で脱保護される一時保護基を用いる場合、前記一時保護基に挙げられたものの内、酸では脱保護されず塩基又はフッ素試薬で脱保護される保護基を、基本保護基として用いることができる。逆に、塩基で脱保護される一時保護基を用いる場合、前記一時保護基に挙げられたものの内、塩基では脱保護されず酸又はフッ素試薬で脱保護される保護基を、基本保護基として用いることができる。また、フッ素試薬で脱保護される一時保護基を用いる場合、前記一時保護基に挙げられたものの内、フッ素試薬では脱保護されず酸又は塩基で脱保護される保護基を、基本保護基として用いることができる。当業者は上記保護基を適宜選択することができる。
　例えば、Ｘ及びＺにおける基本保護基がレブリニル基又は３－ベンゾイルプロピオニル基等である場合、一時保護基は、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、トリエチルシリル基等のシリル基、又はトリチル基、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基等のトリアリールメチル基であることが好ましい。
　一時保護基がレブリニル基又は３－ベンゾイルプロピオニル基等である場合、Ｘ及びＺにおける基本保護基は、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、トリエチルシリル基等のシリル基、又はトリチル基、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基等のトリアリールメチル基であることが好ましい。特に方法Ｂの場合に、レブリニル基又は３－ベンゾイルプロピオニル基等が一時保護基として用いられる。
　ｎは、工程ａに用いる擬似固相保護基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドに含まれるヌクレオシド数ｎとも言うことができ、その好ましい態様は、前述の通りである。
　Ｖは、好ましくは酸素原子である。
　Ｙは、それぞれ独立して、水素原子、無置換若しくは置換されたヒドロキシ基、無置換若しくは置換されたスルファニル基、水素化ホウ素基、又は置換されたアミノ基を示す。置換されたヒドロキシ基は、後述する工程ｃで変換される「リン酸トリエステル結合」においてヒドロキシ基を置き換える基と同様である。置換されたスルファニル基は、後述する工程ｃで変換される「チオリン酸－Ｏ，Ｏ，Ｓ－トリエステル結合」においてスルファニル基を置き換える基と同様である。置換されたアミノ基は、後述する工程ｃで変換される「アミノリン酸ジエステル結合」においてアミノ基を置き換える基と同様である。
　Ｙを含めたリン含有基は、例えば以下の構造（又は、以下の構造に塩を付した構造）を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　Ｖが酸素原子であるとき、該酸素原子が結合するリン原子に結合するＹは、それぞれ独立して、好ましくは、水素原子、無置換若しくは置換されたヒドロキシ基、又は無置換若しくは置換されたスルファニル基であり、より好ましくは、水素原子、又は無置換若しくは置換されたヒドロキシ基であり、さらに好ましくは、水素原子、ヒドロキシ基又は２－シアノエトキシ基であり、さらにより好ましくは、ヒドロキシ基又は２－シアノエトキシ基である。
　Ｖが硫黄原子であるとき、該硫黄原子が結合するリン原子に結合するＹは、それぞれ独立して、好ましくは、置換されたヒドロキシ基であり、より好ましくは、２－シアノエトキシ基である。
　工程ａは、反応に影響を及ぼさない溶媒中で行われる。当該溶媒における溶解度が高い程、優れた反応性が期待できるため、目的とする化合物の溶解度の高い低極性溶媒を選択することが好ましい。具体的には、クロロホルム、ジクロロメタン、１，２－ジクロロエタン等のハロゲン系溶媒；ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン等の芳香族系溶媒；酢酸エチル、酢酸イソプロピル等のエステル系溶媒；ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、オクタン、ノナン、シクロヘキサン等の脂肪族系溶媒；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル等のエーテル系溶媒が挙げられる。これらの溶媒は２種以上を任意の割合で混合して用いてもよい。また、上記低極性溶媒に、ピリジンなどの含窒素芳香族系溶媒、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル系溶媒、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドン等のアミド系溶媒等の極性溶媒を、ｎ個重合オリゴヌクレオチドが溶解し得る限り、任意の割合で混合して用いてもよい。中でも、工程ａに用いる溶媒は、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２－ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、ノナン、シクロヘキサン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、テトラヒドロフラン、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、又は、これらの組合せが好ましく、ジクロロメタン、テトラヒドロフランがより好ましく、テトラヒドロフランが特に好ましい。
　工程ａにおけるｎ個重合オリゴヌクレオチドの溶媒中の濃度は、溶解していれば特に限定されないが、好ましくは１から３０重量％である。
　工程ａに使用されるフッ素試薬、酸又は塩基としては、一時保護基の良好な脱保護が達成できれば特に限定されない。当業者は、一時保護基の種類に応じて、適切なフッ素試薬、酸又は塩基を選択できる。
　フッ素試薬としては、フッ化水素のピリジン塩、テトラブチルアンモニウムフルオリド、フッ化水素のトリエチルアミン塩、フッ化水素酸、フッ化アンモニウム、フッ化アンモニウムのフッ化水素付加体、フッ化カリウム又はフッ化カリウムのフッ化水素付加体が好ましく、中でも、フッ化水素のピリジン塩又はテトラブチルアンモニウムフルオリドがより好ましく、テトラブチルアンモニウムフルオリドが特に好ましい。
　酸としては、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、塩酸、酢酸、硝酸アンモニウムセリウム、ホスホン酸又はリン酸が好ましく、中でも、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、塩酸、酢酸又は硝酸アンモニウムセリウムがより好ましく、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸又は酢酸がさらに好ましく、酢酸が特に好ましい。また、塩化水素（水溶液、１，４－ジオキサン溶液等）も好ましく、塩化水素－１，４－ジオキサン溶液が特に好ましい。
　塩基としては、ヒドラジン誘導体（ヒドラジン一水和物、ヒドラジン酢酸塩、硫酸ヒドラジニウム、メチルヒドラジン、イソプロピルヒドラジン塩酸塩、ｔｅｒｔ－ブチルヒドラジン、アセトヒドラジド、メチルカルバゼート、フェニルヒドラジン、ｐ－トルエンスルホニルヒドラジン、シクロペンチルヒドラジン塩酸塩、シクロヘキシルヒドラジン塩酸塩、ベンジルヒドラジン塩酸塩、２，２，２－トリフルオロエチルヒドラジン（７０％水溶液）及び２－シアノエチルヒドラジン等）、ジアミン誘導体（エチレンジアミン等のエチレンジアミン誘導体等）、ヒドロキシルアミン誘導体（ヒドロキシルアミン塩酸塩等）、アミノアルコール誘導体（エタノールアミン、Ｎ－メチルエタノールアミン等のエタノールアミン誘導体等）、及び無機塩基（炭酸カリウム等）等が挙げられる。塩基としては、ヒドラジン誘導体が好ましく、ヒドラジン一水和物又はメチルヒドラジンがより好ましい。
　これらフッ素試薬、酸及び塩基は、上記低極性溶媒で希釈して使用することができる。　また、フッ素試薬、酸及び塩基以外では、Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ　Ｌ－２、Ｃｈｉｒａｚｙｍｅ　Ｌ－５等の酵素により脱保護することも可能である。
　工程ａにおけるフッ素試薬、酸又は塩基の使用量は、ｎ個重合オリゴヌクレオチド１モルに対し、１から１００モル使用することができ、好ましくは１から４０モルであり、より好ましくは１から２０モルであり、さらに好ましくは１から１０モルであり、さらにより好ましくは、１から８モルである。中でも下限は、好ましくは、２モルであり、より好ましくは、３モルであり、さらにより好ましくは、４モルである。
　工程ａの反応温度は、反応が進行すれば特に限定されないが、－３０℃から６０℃が好ましく、－１０℃から５０℃がより好ましく、２０℃から４０℃がさらに好ましい。反応時間は、使用するｎ個重合オリゴヌクレオチドの種類、フッ素試薬、酸又は塩基の種類、溶媒の種類、反応温度等により異なるが、５分間から５０時間が好ましく、５分間から１２時間がより好ましく、３０分間から６時間がより好ましい。
　脱保護剤として使用されるフッ素試薬、酸又は塩基が、後述する工程ｂのカップリング反応中に存在すると、ｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｉｉｉ）又は（ｖ）の５’位若しくは３’位ヒドロキシ基の一時保護基Ｒの脱保護を誘発するため、クエンチ処理によって除去されることが必要である。クエンチ処理は、脱保護剤がフッ素試薬又は酸である場合、ケイ素試薬又は有機塩基により行い、脱保護剤が前記塩基である場合、ケトン化合物により行う。
　クエンチ処理に使用されるケイ素試薬としては、前記フッ素試薬をクエンチすることができるものであれば特に限定されないが、ヘキサメチルジシロキサン［ＴＭＳ２Ｏ］、トリメチルシリルクロリド［ＴＭＳＣｌ］、ヘキサメチルジシラザン、トリメチルシリルブロミド、トリメチルシリルヨージド、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート、トリエチルシリルクロリド、トリイソプロピルシリルクロリド、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルクロリド、ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリルクロリド、フェニルジメチルシリルクロリド、ジフェニルメチルシリルクロリド、トリフェニルシリルクロリドが好ましく、ＴＭＳ２Ｏ、ＴＭＳＣｌがより好ましく、ＴＭＳ２Ｏが特に好ましい。
　クエンチ処理に使用される有機塩基としては、前出の酸を中和することができるものであれば特に限定されないが、ピリジン、２，４，６－トリメチルピリジン、ベンズイミダゾール、１，２，４－トリアゾール、Ｎ－フェニルイミダゾール、２－アミノ－４，６－ジメチルピリミジン、１，１０－フェナントロリン、イミダゾール、Ｎ－メチルイミダゾール、２－クロロベンズイミダゾール、２－ブロモベンズイミダゾール、２－メチルイミダゾール、２－フェニルベンズイミダゾール、Ｎ－フェニルベンズイミダゾール、５－ニトロベンズイミダゾールが好ましく、ピリジン、２，４，６－トリメチルピリジン、ベンズイミダゾール、１，２，４－トリアゾール、Ｎ－フェニルイミダゾール、Ｎ－メチルイミダゾール、２－アミノ－４，６－ジメチルピリミジン、１，１０－フェナントロリンがより好ましく、ピリジンが特に好ましい。
　クエンチ処理に使用されるケトン化合物としては、前出の塩基を消費することができるものであれば特に限定されないが、アセチルアセトン、アセトン等が挙げられ、好ましくは、アセチルアセトンである。
　工程ａにおけるクエンチ処理に使用されるケイ素試薬、有機塩基又はケトン化合物の使用量は、フッ素試薬、酸又は塩基１モルに対し、例えば０．０１から１００モルであり、好ましくは０．１から５０モルであり、より好ましくは１から２０モルであり、さらに好ましくは１から３モルである。
　工程ａ、それに続く工程ｂ（工程ｂ１又は工程ｂ２）又は工程ｃ（工程ｃ１又は工程ｃ２）を液相で連続化して行うためには、工程ａにおける一時保護基Ｒの脱保護反応中、又は脱保護反応後に、カチオン捕捉剤を添加することが好ましい。工程ａと、工程ｂ又は工程ｃを連続化しない場合には、カチオン捕捉剤を添加してもよく、しなくてもよい。
　カチオン捕捉剤としては、除去された保護基Ｒによる再保護（原料戻り）や脱保護された官能基への副反応が進行しなければ、特に限定されないが、ピロール、２－メチルピロール、３－メチルピロール、２，３－ジメチルピロール、２，４－ジメチルピロール等のピロール誘導体；インドール、４－メチルインドール、５－メチルインドール、５－メトキシインドール、６－メチルインドール、７－メチルインドール、５，６－ジメチルインドール、６，７－ジメチルインドール等のインドール誘導体を使用することができる。良好なカチオン捕捉効果が得られるという観点で、ピロール、３－メチルピロール、２，４－ジメチルピロール、インドール、４－メチルインドール、５－メチルインドール、６－メチルインドール、７－メチルインドール、５，６－ジメチルインドール、６，７－ジメチルインドールが好ましく、ピロール、３－メチルピロール、インドールがより好ましく、ピロール、インドールが更に好ましく、インド―ルが特に好ましい。
　前記カチオン捕捉剤の使用量は、ｎ個重合オリゴヌクレオチド（ｉａ又はｉｂ）１モルに対し、例えば１から５０モルであり、好ましくは１から１５モルであり、より好ましくは、１から５モルである。
　工程ａの後に、工程ｂ又は工程ｃが実施される。工程ｂ又は工程ｃの前に、必要に応じて分液処理、溶媒留去によって、工程ｂで用いられる溶媒への置換、工程ｅを行いｎ個重合オリゴヌクレオチドの５’位ヒドロキシ基の脱保護体（ｉｉａ）若しくは３’位ヒドロキシ基の脱保護体（ｉｉｂ）の単離等を行うことができる。
（工程ｂ）（カップリング工程）
　まず、方法Ａ又は方法Ｂのそれぞれの場合について、Ｈ－ホスホネート法の工程ｂ（工程ｂ１）及びホスホロアミダイト法の工程ｂ（工程ｂ２）をスキーム３から６に示す。
　方法ＡのＨ－ホスホネート法における工程ｂ１は、前記方法Ａにおける工程ａで得られたｎ個重合オリゴヌクレオチドの５’位ヒドロキシ基体（ｉｉａ）と、５’位ヒドロキシ基が一時保護基Ｒにより保護され、かつ３’位にヒドロキシホスフィニル基で置換されたヒドロキシ基を持つｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｉｉｉａ）（式中、ｐは、１以上の任意の整数を示し、ｐ＝１の場合は、ヌクレオシドを示す。）と、を縮合させる工程である（スキーム３）。工程ｃ１の後の場合は、前記方法Ａにおける工程ｃ１で得られたｎ＋ｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｖｉｉａ）の５’位ヒドロキシ基体と、前記ｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｉｉｉａ）と、を縮合させる工程である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　式中、ｐは、１以上の任意の整数を示し、化合物（ｉｉｉａ）におけるＢａｓｅは、それぞれ独立して、核酸塩基又は基本保護基で置換された核酸塩基を意味し、他の記号は前記定義と同義である。２以上の核酸塩基部を有する場合、及び２以上の基本保護基を有する場合も前記定義と同様である。
　方法Ａのホスホロアミダイト法における工程ｂ２は、前記方法Ａにおける工程ａで得られたｎ個重合オリゴヌクレオチドの５’位ヒドロキシ基体（ｉｉａ）と、５’位ヒドロキシ基が一時保護基Ｒにより保護され、かつ３’位に、置換されたヒドロキシ（ジアルキルアミノ）ホスフィノ基で置換されたヒドロキシ基を持つｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｖａ）（式中、ｐは、１以上の任意の整数を示し、ｐ＝１の場合は、ヌクレオシドを示す。）と、を縮合させる工程である（スキーム４）。工程ｃ２の後の場合は、前記方法Ａにおける工程ｃ２で得られたｎ＋ｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｖｉｉｉａ）の５’位ヒドロキシ基体と、前記ｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｖａ）と、を縮合させる工程である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　スキーム４中、ｎ、Ｂａｓｅｚ、Ｒ、Ｘ、Ｖ、Ｙ、Ｚ、ｐ及びＢａｓｅは、スキーム３における定義に同じであり、Ｐｒは、ジアルキルアミノ基を示す。ここで、該２つのアルキル基は、それらが結合する窒素原子と一緒に３－１１員含窒素非芳香族ヘテロ環基を形成してもよい。
　方法ＢのＨ－ホスホネート法における工程ｂ１は、前記方法Ｂにおける工程ａで得られたｎ個重合オリゴヌクレオチドの３’位ヒドロキシ基体（ｉｉｂ）と、３’位ヒドロキシ基が一時保護基Ｒにより保護され、かつ５’位にヒドロキシホスフィニル基で置換されたヒドロキシ基を持つｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｉｉｉｂ）（式中、ｐは、１以上の任意の整数を示し、ｐ＝１の場合は、ヌクレオシドを示す。）と、を縮合させる工程である（スキーム５）。なお、スキーム５中、各記号は、スキーム３中の定義に同義である。工程ｃ１の後の場合は、前記方法Ｂにおける工程ｃ１で得られたｎ＋ｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｖｉｉｂ）の３’位ヒドロキシ基体と、前記ｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｉｉｉｂ）と、を縮合させる工程である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　方法Ｂのホスホロアミダイト法における工程ｂ２は、前記方法Ｂにおける工程ａで得られたｎ個重合オリゴヌクレオチドの３’位ヒドロキシ基体（ｉｉｂ）と、３’位ヒドロキシ基が一時保護基Ｒにより保護され、かつ５’位に、置換されたヒドロキシ（ジアルキルアミノ）ホスフィノ基で置換されたヒドロキシ基を持つｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｖｂ）（式中、ｐは、１以上の任意の整数を示し、ｐ＝１の場合は、ヌクレオシドを示す。）と、を縮合させる工程である（スキーム６）。なお、スキーム６中、各記号は、スキーム４中の定義に同義である。工程ｃ２の後の場合は、前記方法Ｂにおける工程ｃ２で得られたｎ＋ｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｖｉｉｉｂ）の３’位ヒドロキシ基体と、前記ｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｖｂ）と、を縮合させる工程である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　スキーム３から６において、ｐは、工程ｂに用いる反応性リン含有基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドに含まれるヌクレオシド数ｐと言うことができ、その好ましい態様は、前述の通りである。
　スキーム３から６において、Ｂａｓｅにおける、核酸塩基又は基本保護基で置換された核酸塩基の核酸塩基は、好ましくは、シトシン、ウラシル、チミン、５－メチルシトシン、アデニン及びグアニンから独立して選択され、より好ましくは、チミン又はウラシルから独立して選択され、特に好ましくはチミンである。
　スキーム４及び６において、Ｐｒは、ジアルキルアミノ基であり、該２つのアルキル基は、それらが結合する窒素原子と一緒に３－１１員含窒素非芳香族ヘテロ環基を形成してもよい。Ｐｒは、好ましくは、ジＣ１－６アルキルアミノ基又はモルホリノ基であり、より好ましくはジイソプロピルアミノ基である。
　次に、Ｈ－ホスホネート法によるカップリング工程である、工程ｂ１について、説明する。
　工程ｂ１で用いられる溶媒は、具体的には、前記工程ａと同様の溶媒が挙げられる。中でも、ピリジン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、トルエン等が好ましく、ピリジンが特に好ましい。
　工程ｂ１でピリジンなどの含窒素芳香族系溶媒以外の溶媒を用いる場合は、ピリジンなどの求核剤を添加することが好ましい。求核剤としては、良好なカップリング反応が達成できれば特に限定されないが、具体的には、ピリジン、２，６－ジ－ｔｅｒｔ－ブチルピリジン、２－ピコリン、３－ピコリン、４－ピコリン、３，４－ルチジン，２，６－ルチジン、２，４－ルチジン、３，５－ルチジン、２，４，６－コリジン、４－アセチルピリジン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノピリジン、２－シアノピリジン、３－シアノピリジン、４－シアノピリジン、２－クロロピリジン、３－クロロピリジン、４－クロロピリジン、２－メトキシピリジン、３－メトキシピリジン、４－メトキシピリジン、ピコリン酸エチル、ニコチン酸エチル、イソニコチン酸エチルなどのピリジン系求核剤；（Ｓ，Ｓ）－２，６－ビス（４－イソプロピル－２－オキサゾリン－２－イル）ピリジン、（Ｒ，Ｒ）－２，６－ビス（４－フェニル－２－オキサゾリン－２－イル）ピリジンなどのＰｙｂｏｘ系求核剤、キノリン、キニン、キニジン、シンコニンなどのキノリン系求核剤、Ｎ－メチルイミダゾール、ピリミジン、２－メチルピラジン、３－メチルピリダジン、１，１０－フェナントロリンなどの含窒素芳香族系求核剤（上記ピリジン系求核剤は除く）；４－メトキシピリジン－Ｎ－オキシドなどのＮ－オキシド系求核剤；Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリンなどのアニリン系求核剤；１，３－ジ－ｔｅｒｔ－ブチルイミダゾール－２－イリデン、１，３－ジメシチルイミダゾール－２－イリデンなどのＮ－ヘテロサイクリックカルベン系求核剤；トリフェニルホスフィン、亜リン酸トリメチルなどのリン系求核剤；トリエチルアミン、１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタンなどの脂肪族アミン系求核剤などが挙げられる。中でも、ピリジン、２－ピコリン、４－ピコリン、３，４－ルチジン，２，６－ルチジン、２，４，６－コリジン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノピリジン、３－メトキシピリジン、４－メトキシピリジン、（Ｓ，Ｓ）－２，６－ビス（４－イソプロピル－２－オキサゾリン－２－イル）ピリジン、（Ｒ，Ｒ）－２，６－ビス（４－フェニル－２－オキサゾリン－２－イル）ピリジン、キノリン、キニジン、Ｎ－メチルイミダゾール、３－メチルピリダジン及び４－メトキシピリジン－Ｎ－オキシドが好ましく、ピリジン、２－ピコリン、４－ピコリン、３，４－ルチジン，２，６－ルチジン、２，４，６－コリジン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノピリジン、３－メトキシピリジン及び４－メトキシピリジンがより好ましく、ピリジンが特に好ましい。
　工程ｂ１に使用される前記求核剤は、工程ａで得られたｎ個重合オリゴヌクレオチドのヒドロキシ体（ｉｉａ又はｉｉｂ）１モル又は工程ｃ１で得られたｎ＋ｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｖｉｉａ又はｖｉｉｂ）のヒドロキシ体１モルに対し、例えば１～１００モル、好ましくは１～２０モル、さらに好ましくは１～１０モルである。
　工程ｂ１に使用されるｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｉｉｉａ又はｉｉｉｂ）の使用量は、工程ａで得られたｎ個重合オリゴヌクレオチドのヒドロキシ体（ｉｉａ又はｉｉｂ）１モル又は工程ｃ１で得られたｎ＋ｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｖｉｉａ又はｖｉｉｂ）のヒドロキシ体１モルに対し、好ましくは１から１０モルであり、より好ましくは１から５モルであり、さらに好ましくは１から３モルであり、特に好ましくは１から１．６モルである。
　工程ｂ１に使用される縮合剤は、カップリング反応が良好に進行すれば特に限定されないが、Ｈ－ホスホネート法において通常使用される縮合剤を挙げることができ、具体的には、２，２－ジメチルブチリルクロリド、イソブチリルクロリド、ピバロイルクロリド、アセチルクロリド、１－アダマンチルクロリド、クロロリン酸ジフェニル、２，４，６－トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド、２－（ベンゾイルトリアゾール－１－イルオキシ）－１，３－ジメチル－２－ピロリジン－１－イル－１，３，２－ジアザホスホリジリニウム　ヘキサフルオロホスフェート［ＢＯＭＰ］、ビス（２－オキソ－３－オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロリド［ＢｏｐＣｌ］、ベンゾイルクロリド、無水安息香酸、炭酸ジフェニル、炭酸ジ－ｐ－ニトロフェニル、炭酸ビスペンタフルオロフェニル等が挙げられる。中でも、２，２－ジメチルブチリルクロリド、イソブチリルクロリド、１－アダマンチルクロリド、クロロリン酸ジフェニル、２，４，６－トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド、ビス（２－オキソ－３－オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロリド又は炭酸ビスペンタフルオロフェニルが好ましく、２，２－ジメチルブチリルクロリド、イソブチリルクロリドがより好ましく、２，２－ジメチルブチリルクロリドが特に好ましい。
　工程ｂ１に使用される縮合剤は、工程ａで得られたｎ個重合オリゴヌクレオチドのヒドロキシ体（ｉｉａ又はｉｉｂ）１モル又は工程ｃ１で得られたｎ＋ｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｖｉｉａ又はｖｉｉｂ）のヒドロキシ体１モルに対し、例えば１から２００モルであり、好ましくは１から５０モルであり、より好ましくは１から１０モルであり、さらに好ましくは４から６モルである。
　工程ｂ１の反応温度は、反応が進行すれば特に限定されないが、－１０℃から６０℃が好ましく、０℃から５０℃がより好ましく、０℃から３０℃がさらに好ましく、２０℃から３０℃がさらにより好ましい。反応時間は、使用するｎ個重合オリゴヌクレオチドの種類、溶媒の種類、求核剤の種類、縮合剤の種類、反応温度等により異なるが、１分間から１２時間が好ましく、２分間から６時間がより好ましく、５分間から３時間が更に好ましい。
　工程ｂ１の反応の後に、スキーム３又は５中、式（ｉｉａ又はｉｉｂ）で表される化合物又はその塩が残存している場合には、必要に応じて、得られた溶液をキャッピング反応に付してもよい。キャッピング反応は、無水酢酸、無水安息香酸などの酸無水物を用いて、又は前述の縮合剤に加えて、メチル－Ｈ－ホスホネートのトリエチルアンモニウム塩、エチル－Ｈ－ホスホネートのトリエチルアンモニウム塩、イソプロピル－Ｈ－ホスホネートのトリエチルアンモニウム塩及び２－シアノエチル－Ｈ－ホスホネートのトリエチルアンモニウム塩などのアルキル－Ｈ－ホスホネートのアンモニウム塩を用いて、通常の方法により実施することができる。
　なお、キャッピング反応とは、カップリング反応、酸化反応後に残存したヒドロキシ基を有する化合物のヒドロキシ基を、ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドを伸長できない置換基に変換する反応である。
　キャッピング反応は、後述する工程ｃ１の後に実施してもよい。キャッピング反応は、工程ｂ１又は工程ｃ１の後に実施することが好ましい。
　工程ｂ１の後には、工程ｃ１又は工程ａが実施される。工程ｃ１又は工程ａの前に、必要に応じて分液処理、溶媒留去によって、工程ｃ１又は工程ａで用いられる溶媒への置換、工程ｅを行いｎ＋ｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｉｖａ又はｉｖｂ）の単離等を行うことができる。また、工程ｂ１の反応溶液をそのまま、次の工程ｃ１に用いることもできる。
　次に、ホスホロアミダイト法によるカップリング工程である、工程ｂ２について、説明する。
　工程ｂ２で用いられる溶媒は、具体的には、前記工程ａと同様の低極性溶媒が挙げられる。中でも、ジクロロメタン、トルエン等が好ましく、ジクロロメタンが特に好ましい。
　また、上記低極性溶媒に、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル系溶媒；アセトン、２－ブタノン等のケトン系溶媒；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドン等のアミド系溶媒；１，４－ジオキサン、テトラヒドロフラン等の極性エーテル系溶媒；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒を、５’位又は３’位ヒドロキシ基の一時保護基Ｒが除去されたｎ個重合オリゴヌクレオチド（ｉｉａ又はｉｉｂ）が溶解し得る限り、適宜の割合で混合して用いてもよい。　この場合、極性溶媒としては、アミド系溶媒、ニトリル系溶媒、及びこれらの組合せが好ましく、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ－メチルピペリドン、及びこれらの組合せがより好ましく、アセトニトリルが特に好ましい。
　極性溶媒は、３’位又は５’位ヒドロキシ基がホスホロアミダイト化され、かつ５’位又は３’位ヒドロキシ基が一時保護基Ｒにより置換されたｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｖａ又はｖｂ）、及び縮合剤等の溶液として添加してもよい。
　工程ｂ２に使用されるｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｖａ又はｖｂ）の使用量は、工程ａで得られたｎ個重合オリゴヌクレオチドの脱保護体（ｉｉａ又はｉｉｂ）１モル又は工程ｃ２で得られたｎ＋ｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｖｉｉｉａ又はｖｉｉｉｂ）のヒドロキシ体１モルに対し、好ましくは１から１０モルであり、より好ましくは１から５モルであり、さらに好ましくは１から３モルであり、さらにより好ましくは１から１．６モルである。
　工程ｂ２に使用される縮合剤は、カップリング反応が良好に進行すれば特に限定されないが、ホスホロアミダイト法において通常使用される縮合剤を挙げることができ、具体的には、１Ｈ－テトラゾール、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾール、５－（エチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール、５－ベンゾイルメルカプト－１Ｈ－テトラゾール、４，５－ジシアノイミダゾール、４，５－ジクロロイミダゾール、ヒドロキシベンゾトリアゾール、１－ヒドロキシ－６－ニトロベンゾトリアゾール、ピリジン・トリフルオロ酢酸塩及びイミダゾリニウム・トリフルオロメタンスルホン酸塩等が挙げられる。中でも、１Ｈ－テトラゾールが好ましい。
　工程ｂ２に使用される縮合剤は、工程ａで得られたｎ個重合オリゴヌクレオチドの脱保護体（ｉｉａ又はｉｉｂ）１モル又は工程ｃ２で得られたｎ＋ｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｖｉｉｉａ又はｖｉｉｉｂ）のヒドロキシ体１モルに対し、例えば１から２００モルであり、好ましくは１から１００モルであり、より好ましくは１から５０モルであり、さらにより好ましくは２から１０モルである。
　工程ｂ２の反応温度は、反応が進行すれば特に限定されないが、－１０℃から６０℃が好ましく、０℃から５０℃がより好ましく、０℃から３０℃がさらに好ましく、２０℃から３０℃がさらにより好ましい。反応時間は、使用するｎ個重合オリゴヌクレオチドの種類、溶媒の種類、求核剤の種類、縮合剤の種類、反応温度等により異なるが、１分間から４８時間が好ましく、２分間から３６時間がより好ましく、５分間から２４時間が更に好ましい。
　工程ｂ２の反応の後に、スキーム４又は６中、式（ｉｉａ又はｉｉｂ）で表される化合物又はその塩が残存している場合には、必要に応じて、得られた溶液をキャッピング反応に付してもよい。キャッピング反応は、無水酢酸、無水安息香酸などの酸無水物を用いて、又は前述の縮合剤に加えて、メチル－Ｈ－ホスホネートのトリエチルアンモニウム塩、エチル－Ｈ－ホスホネートのトリエチルアンモニウム塩、イソプロピル－Ｈ－ホスホネートのトリエチルアンモニウム塩及び２－シアノエチル－Ｈ－ホスホネートのトリエチルアンモニウム塩などのアルキル－Ｈ－ホスホネートのアンモニウム塩を用いて、通常の方法により実施することができる。
　工程ｂ２の後には、工程ｃ２又は工程ａが実施される。工程ｃ２又は工程ａの前に、必要に応じて分液処理、溶媒留去によって、工程ｃ２又は工程ａで用いられる溶媒への置換や、工程ｅを行いｎ＋ｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｖｉａ又はｖｉｂ）の単離等を行うことができる。また、工程ｂ２の反応溶液をそのまま、次の工程ｃ２に用いることもできる。
（工程ｃ）（変換工程）
　カップリング工程がＨ－ホスホネート法の場合、変換工程は工程ｃ１であり、カップリング工程がホスホロアミダイト法の場合、変換工程は工程ｃ２である。
　工程ｃ１は、工程ｂ１で得られたｎ＋ｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｉｖａ又はｉｖｂ）又は工程ａで得られたｎ個重合オリゴヌクレオチドに、リン原子を修飾する試薬を反応させることにより、該ｎ＋ｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｉｖａ又はｉｖｂ）の亜リン酸ジエステル結合をリン酸ジエステル結合、チオリン酸ジエステル結合、アミノリン酸ジエステル結合、ボラノリン酸ジエステル結合、リン酸トリエステル結合又はチオリン酸－Ｏ，Ｏ，Ｓ－トリエステル結合へと変換する工程である。
　工程ｃ２は、工程ｂ２で得られたｎ＋ｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｖｉａ又はｖｉｂ）又は工程ａで得られたｎ個重合オリゴヌクレオチドに、リン原子を修飾する試薬を反応させることにより、該ｎ＋ｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｖｉａ又はｖｉｂ）の亜リン酸トリエステル結合をリン酸トリエステル結合又はチオリン酸トリエステル結合へと変換する工程である。
　方法ＡのＨ－ホスホネート法における工程ｃ１は下記スキーム７（スキーム７中、各記号は、前記定義と同義であるが、工程ａ後の場合、Ｒは水素原子である）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　方法Ａのホスホロアミダイト法における工程ｃ２は下記スキーム８（スキーム８中、各記号は、前記定義と同義であるが、工程ａ後の場合、Ｒは水素原子である）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　方法ＢのＨ－ホスホネート法おける工程ｃ１は下記スキーム９（スキーム９中、各記号は、前記定義と同義であるが、工程ａ後の場合、Ｒは水素原子である）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　方法Ｂのホスホロアミダイト法における工程ｃ２は下記スキーム１０（スキーム１０中、各記号は、前記定義と同義であるが、工程ａ後の場合、Ｒは水素原子である）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　次に、Ｈ－ホスホネート法における、亜リン酸ジエステル結合の変換工程である、工程ｃ１について説明する。
　工程ｃ１は、工程ｂ１で得られたｎ＋ｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｉｖａ又はｉｖｂ）又は工程ａで得られたｎ個重合オリゴヌクレオチド（ｉｉａ又はｉｉｂ）を単離することなく、工程ｃ又は工程ａ後の反応混合物に、リン原子を修飾する試薬を直接添加するだけで行うことができる。リン原子を修飾する試薬としては、酸化剤、硫化剤、アミダイト化剤又はホウ素化剤が使用される。酸化剤又は硫化剤を使用して、リン酸ジエステル結合、チオリン酸ジエステル結合、リン酸トリエステル結合、又はチオリン酸－Ｏ，Ｏ，Ｓ－トリエステル結合へ変換することが好ましく、リン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合へ変換することがより好ましく、リン酸ジエステル結合へ変換することがさらに好ましい。工程ｃ１は、工程ｂ１で得られたｎ＋ｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｉｖａ又はｉｖｂ）又は工程ａで得られたｎ個重合オリゴヌクレオチド（ｉｉａ又はｉｉｂ）を単離して行ってもよい。
　工程ｃ１で用いられる溶媒は、具体的には、前記工程ａと同様の溶媒が挙げられ、使用する酸化剤、硫化剤、アミダイト化剤又はホウ素化剤によって適宜選択される。
　工程ｃ１に使用される「酸化剤」は、他の部位を酸化することなく、亜リン酸ジエステル結合をリン酸ジエステル結合に酸化する能力があれば、特に限定されないが、ヨウ素、（１Ｓ）－（＋）－（１０－カンファニルスルホニル）オキサジリジン、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド（ＴＢＨＰ）、２－ブタノンペルオキシド、１，１－ジヒドロペルオキシシクロドデカン、ビス（トリメチルシリル）ペルオキシド、ｍ－クロロ過安息香酸が好ましい。収率又は反応速度が良好な酸化反応を達成できるという観点で、ヨウ素、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド、２－ブタノンペルオキシドがより好ましく、ヨウ素が特に好ましい。かかる酸化剤は、０．０５から２Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することができる。かかる希釈溶媒としては、反応に不活性な溶媒であれば特に限定されないが、ピリジン、テトラヒドロフラン［ＴＨＦ］、ジクロロメタン、水、又はこれらの混合溶媒を挙げることができる。中でも、例えば、ヨウ素／水／ピリジンの混合溶液若しくはヨウ素／水／ピリジン／ＴＨＦの混合溶液を用いることが好ましい。
　工程ｃ１で前記酸化剤を使用する場合、工程ｃ１の反応溶媒は、前記希釈溶媒と同様である。
　工程ｃ１に使用される「硫化剤」は、亜リン酸ジエステル結合をチオリン酸ジエステル結合に変換しうる能力があれば、特に限定されないが、単体硫黄、３－アミノ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオン（ＡＤＴＴ）、３－（（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ）－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオン（ＤＤＴＴ）、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン－１，１－ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン、フェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）、テトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）、Ｎ－（ベンゾイルチオ）－スクシンイミドが好ましい。収率又は反応速度が良好な反応が進行しうるという観点で、単体硫黄、ＡＤＴＴがより好ましく、単体硫黄が特に好ましい。かかる硫化剤は、０．０５から２Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することができる。かかる希釈溶媒としては、反応に不活性な溶媒であれば特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、ピリジン又はこれらの混合溶媒が挙げられる。
　工程ｃ１で前記硫化剤を使用する場合、工程ｃ１の反応溶媒は、前記希釈溶媒と同様である。
　亜リン酸ジエステル結合を、「リン酸トリエステル結合」へ変換する際の試薬は、その変換能力を有していれば、特に限定されないが、対応するアルコール化合物と、四塩化炭素、ヨウ素、臭化三塩化炭素、Ｎ－クロロコハク酸イミド、トリクロロイソシアヌル酸、次亜塩素酸ナトリウム、３，３－ジクロロ－５，５－ジメチルヒダントイン、Ｎ，Ｎ’－ジクロロビス（２，４，６－トリクロロフェニル）尿素などの酸化剤が好ましい。前記変換反応の溶媒としては、反応に不活性な溶媒であれば特に限定されないが、ジクロロメタン、ピリジン又はこれらの混合溶媒が挙げられ、好ましくはジクロロメタン又はピリジンであり、より好ましくはピリジンである。
　亜リン酸ジエステル結合を、「チオリン酸－Ｏ，Ｏ，Ｓ－トリエステル結合」へ変換する際の試薬は、その変換能力を有していれば、特に限定されないが、フタルイミド系硫化剤、含コハク酸系硫化剤及びモルホリンジオン系硫化剤等が挙げられる。前記変換反応の溶媒としては、反応に不活性な溶媒であれば特に限定されないが、ジクロロメタン、ピリジン又はこれらの混合溶媒が挙げられ、好ましくはジクロロメタン又はピリジンであり、より好ましくはピリジンである。
　フタルイミド系硫化剤としては、目的の「チオリン酸－Ｏ，Ｏ，Ｓ－トリエステル結合」に対応する、Ｎ－（Ｃ１－４０アルキルチオ）フタルイミド、Ｎ－（Ｃ３－６シクロアルキルチオ）フタルイミド、Ｎ－（Ｃ６－１０アリールチオ）フタルイミド、Ｎ－（５－１０員ヘテロアリールチオ）フタルイミド、Ｎ－（アラルキルチオ）フタルイミド及びＮ－（ヘテロアラルキルチオ）フタルイミド等が挙げられる。ここで、目的の「チオリン酸－Ｏ，Ｏ，Ｓ－トリエステル結合」が、ハロゲン原子、シアノ基、Ｃ１－６アルキル基等の置換基を含む場合、前記Ｎ－（Ｃ１－４０アルキルチオ）フタルイミド、Ｎ－（Ｃ３－６シクロアルキルチオ）フタルイミド、Ｎ－（Ｃ６－１０アリールチオ）フタルイミド、Ｎ－（５－１０員ヘテロアリールチオ）フタルイミド、Ｎ－（アラルキルチオ）フタルイミド及びＮ－（ヘテロアラルキルチオ）フタルイミドの対応する部分にそれらの置換基を含む硫化剤を使用することができる。フタルイミド系硫化剤としては、具体的には、Ｎ－｛（２－シアノエチル）チオ｝フタルイミド、Ｎ－（メチルチオ）フタルイミド、Ｎ－（エチルチオ）フタルイミド、Ｎ－（プロピルチオ）フタルイミド、Ｎ－（イソプロピルチオ）フタルイミド、Ｎ－（ブチルチオ）フタルイミド、Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブチルチオ）フタルイミド、Ｎ－（シクロヘキシルチオ）フタルイミド、Ｎ－（ドデシルチオ）フタルイミド、Ｎ－（ベンジルチオ）フタルイミド、Ｎ－（フェニルチオ）フタルイミド、Ｎ－｛（ｐ－クロロフェニル）チオ｝フタルイミド、Ｎ－｛（ｐ－メチルフェニル）チオ｝フタルイミド、Ｎ－｛（２－ベンゾチアゾリル)チオ｝フタルイミド、Ｎ－｛（２－メチルフェニル）チオ｝フタルイミド、Ｎ－｛（２－エチルフェニル）チオ｝フタルイミド、Ｎ－｛（２－イソプロピルフェニル）チオ｝フタルイミド、Ｎ－｛（２－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）チオ｝フタルイミド、Ｎ－｛（３－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）チオ｝フタルイミド、Ｎ－｛（４－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）チオ｝フタルイミド、Ｎ－｛（２－メチル－５－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）チオ｝フタルイミド、Ｎ－｛（２－メトキシフェニル）チオ｝フタルイミド、Ｎ－｛（３－メトキシフェニル）チオ｝フタルイミド、Ｎ－｛（４－メトキシフェニル）チオ｝フタルイミド、Ｎ－｛（２，５－ジメトキシフェニル）チオ｝フタルイミド、Ｎ－｛（３，４－ジメトキシフェニル）チオ｝フタルイミド、Ｎ－｛（２－フルオロフェニル）チオ｝フタルイミド、Ｎ－｛（２－クロロフェニル）チオ｝フタルイミド、Ｎ－｛（２－ブロモフェニル）チオ｝フタルイミド、Ｎ－｛（２，６－ジメチルフェニル）チオ｝フタルイミド及びＮ－｛（２，６－ジクロロフェニル）チオ｝フタルイミド等が挙げられる。
　コハク酸系硫化剤としては、目的の「チオリン酸－Ｏ，Ｏ，Ｓ－トリエステル結合」に対応する、Ｎ－（Ｃ１－４０アルキルチオ）コハク酸イミド、Ｎ－（Ｃ３－６シクロアルキルチオ）コハク酸イミド、Ｎ－（Ｃ６－１０アリールチオ）コハク酸イミド、Ｎ－（５－１０員ヘテロアリールチオ）コハク酸イミド、Ｎ－（アラルキルチオ）コハク酸イミド及びＮ－（ヘテロアラルキルチオ）コハク酸イミド等が挙げられる。ここで、目的の「チオリン酸－Ｏ，Ｏ，Ｓ－トリエステル結合」が、ハロゲン原子、シアノ基、Ｃ１－６アルキル基等の置換基を含む場合、前記Ｎ－（Ｃ１－４０アルキルチオ）コハク酸イミド、Ｎ－（Ｃ３－６シクロアルキルチオ）コハク酸イミド、Ｎ－（Ｃ６－１０アリールチオ）コハク酸イミド、Ｎ－（５－１０員ヘテロアリールチオ）コハク酸イミド、Ｎ－（アラルキルチオ）コハク酸イミド及びＮ－（ヘテロアラルキルチオ）コハク酸イミドの対応する部分にそれらの置換基を含む硫化剤を使用することができる。含コハク酸イミド硫化剤としては、具体的には、Ｎ－｛（２－シアノエチル）チオ｝コハク酸イミド、Ｎ－（メチルチオ）コハク酸イミド、Ｎ－（エチルチオ）コハク酸イミド、Ｎ－（プロピルチオ）コハク酸イミド、Ｎ－（イソプロピルチオ）コハク酸イミド、Ｎ－（ブチルチオ）コハク酸イミド、Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブチルチオ）コハク酸イミド、Ｎ－（シクロヘキシルチオ）コハク酸イミド、Ｎ－（ドデシルチオ）コハク酸イミド、Ｎ－（ベンジルチオ）コハク酸イミド、Ｎ－（フェニルチオ）コハク酸イミド、Ｎ－｛（ｐ－クロロフェニル）チオ｝コハク酸イミド、Ｎ－｛（ｐ－メチルフェニル）チオ｝コハク酸イミド、Ｎ－｛（２－ベンゾチアゾリル)チオ｝コハク酸イミド、Ｎ－｛（２－メチルフェニル）チオ｝コハク酸イミド、Ｎ－｛（２－エチルフェニル）チオ｝コハク酸イミド、Ｎ－｛（２－イソプロピルフェニル）チオ｝コハク酸イミド、Ｎ－｛（２－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）チオ｝コハク酸イミド、Ｎ－｛（３－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）チオ｝コハク酸イミド、Ｎ－｛（４－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）チオ｝コハク酸イミド、Ｎ－｛（２－メチル－５－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）チオ｝コハク酸イミド、Ｎ－｛（２－メトキシフェニル）チオ｝コハク酸イミド、Ｎ－｛（３－メトキシフェニル）チオ｝コハク酸イミド、Ｎ－｛（４－メトキシフェニル）チオ｝コハク酸イミド、Ｎ－｛（２，５－ジメトキシフェニル）チオ｝コハク酸イミド、Ｎ－｛（３，４－ジメトキシフェニル）チオ｝コハク酸イミド、Ｎ－｛（２－フルオロフェニル）チオ｝コハク酸イミド、Ｎ－｛（２－クロロフェニル）チオ｝コハク酸イミド、Ｎ－｛（２－ブロモフェニル）チオ｝コハク酸イミド、Ｎ－｛（２，６－ジメチルフェニル）チオ｝コハク酸イミド及びＮ－｛（２，６－ジクロロフェニル）チオ｝コハク酸イミド等が挙げられる。
　モルホリンジオン系硫化剤としては、目的の「チオリン酸－Ｏ，Ｏ，Ｓ－トリエステル結合」に対応する、Ｎ－（Ｃ１－４０アルキルチオ）モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－（Ｃ３－６シクロアルキルチオ）モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－（Ｃ６－１０アリールチオ）モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－（５－１０員ヘテロアリールチオ）モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－（アラルキルチオ）モルホリン－３，５－ジオン及びＮ－（ヘテロアラルキルチオ）モルホリン－３，５－ジオン等が挙げられる。ここで、目的の「チオリン酸－Ｏ，Ｏ，Ｓ－トリエステル結合」が、ハロゲン原子、シアノ基、Ｃ１－６アルキル基等の置換基を含む場合、前記Ｎ－（Ｃ１－４０アルキルチオ）モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－（Ｃ３－６シクロアルキルチオ）モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－（Ｃ６－１０アリールチオ）モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－（５－１０員ヘテロアリールチオ）モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－（アラルキルチオ）モルホリン－３，５－ジオン及びＮ－（ヘテロアラルキルチオ）モルホリン－３，５－ジオンの対応する部分にそれらの置換基を含む硫化剤を使用することができる。モルホリンジオン系硫化剤としては、具体的には、Ｎ－｛（２－シアノエチル）チオ｝モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－（メチルチオ）モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－（エチルチオ）モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－（プロピルチオ）モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－（イソプロピルチオ）モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－（ブチルチオ）モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブチルチオ）モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－（シクロヘキシルチオ）モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－（ドデシルチオ）モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－（ベンジルチオ）モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－（フェニルチオ）モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－｛（ｐ－クロロフェニル）チオ｝モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－｛（ｐ－メチルフェニル）チオ｝モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－｛（２－ベンゾチアゾリル)チオ｝モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－｛（２－メチルフェニル）チオ｝モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－｛（２－エチルフェニル）チオ｝モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－｛（２－イソプロピルフェニル）チオ｝モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－｛（２－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）チオ｝モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－｛（３－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）チオ｝モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－｛（４－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）チオ｝モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－｛（２－メチル－５－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）チオ｝モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－｛（２－メトキシフェニル）チオ｝モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－｛（３－メトキシフェニル）チオ｝モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－｛（４－メトキシフェニル）チオ｝モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－｛（２，５－ジメトキシフェニル）チオ｝モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－｛（３，４－ジメトキシフェニル）チオ｝モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－｛（２－フルオロフェニル）チオ｝モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－｛（２－クロロフェニル）チオ｝モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－｛（２－ブロモフェニル）チオ｝モルホリン－３，５－ジオン、Ｎ－｛（２，６－ジメチルフェニル）チオ｝モルホリン－３，５－ジオン及びＮ－｛（２，６－ジクロロフェニル）チオ｝モルホリン－３，５－ジオン等が挙げられる。
　当業者は、フタルイミド系硫化剤、コハク酸イミド系硫化剤及びモルホリンジオン系硫化剤を、公知の合成法（フタルイミド系硫化剤及びモルホリンジオン系硫化剤：Tetrahedron，1997年，53巻, 14411頁－14416頁、コハク酸イミド系硫化剤：J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 2002年, 2619頁－2633頁）を利用して、同様に製造できる。
　亜リン酸ジエステル結合を、「チオリン酸－Ｏ，Ｏ，Ｓ－トリエステル結合」へ変換する際の試薬は、好ましくは、フタルイミド系硫化剤であり、特に好ましくは、Ｎ－｛（２－シアノエチル）チオ｝フタルイミドである。
　工程ｃ１に使用する「アミダイト化剤」は、亜リン酸ジエステル結合をアミノリン酸ジエステル結合に変換しうる能力があれば、特に限定されないが、対応するアミン化合物と、四塩化炭素、ヨウ素、臭化三塩化炭素、Ｎ－クロロコハク酸イミド、トリクロロイソシアヌル酸、次亜塩素酸ナトリウム、３，３－ジクロロ－５，５－ジメチルヒダントイン、Ｎ，Ｎ’－ジクロロビス（２，４，６－トリクロロフェニル）尿素などの酸化剤が好ましい。前記変換反応の溶媒としては、反応に不活性な溶媒であれば特に限定されないが、ジクロロメタン、ピリジン又はこれらの混合溶媒が挙げられ、好ましくはジクロロメタン又はピリジンであり、より好ましくはピリジンである。
　工程ｃ１に使用する「ホウ素化剤」は、亜リン酸ジエステル結合をボラノリン酸ジエステル結合に変換しうる能力があれば、特に限定されないが、水素化ホウ素（ＢＨ３）、ＢＨ３－ＴＨＦ錯体、ＢＨ３－ジメチルスルフィド錯体、ＢＨ３－ピリジン錯体などが好ましい。前記変換反応の溶媒としては、反応に不活性な溶媒であれば特に限定されないが、ジクロロメタン、ピリジン又はこれらの混合溶媒が挙げられ、好ましくはジクロロメタン又はピリジンであり、より好ましくはピリジンである。
　リン原子を修飾する試薬の使用量は、工程ｂ１で得られたｎ＋ｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｉｖａ若しくはｉｖｂ）１モル又は工程ａで得られたｎ個重合オリゴヌクレオチド（ｉｉａ又はｉｉｂ）１モルに対し、１から５０モルが好ましく、より好ましくは１から１５モルであり、さらに好ましくは１から１０モルであり、さらにより好ましくは１から７モルである。
　反応温度は、反応が進行すれば特に限定されないが、－１０℃から６０℃が好ましく、０℃から５０℃がより好ましく、２０℃から３０℃がさらに好ましい。反応時間は、工程ｂ１で得られたｎ＋ｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｉｖａ若しくはｉｖｂ）又は工程ａで得られたｎ個重合オリゴヌクレオチド（ｉｉａ又はｉｉｂ）の種類、使用するリン原子を修飾する試薬の種類、反応温度等によって異なるが、好ましくは１分間から２４時間であり、より好ましくは、１０分間から１２時間であり、更に好ましくは、３０分間から６時間である。
　酸化剤や硫化剤を用いる場合、該酸化剤及び硫化剤は反応後又は次工程以降で望まない副反応を誘発する可能性があり、該副反応を抑制するため、反応後に還元剤を用いてクエンチ処理を行うことができる。具体的には、還元剤として、３価のリン試薬（例えば、亜リン酸トリメチル、亜リン酸トリエチル、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン等の亜リン酸トリアルキル；亜リン酸ジメチル、亜リン酸ジエチルなどの亜リン酸ジアルキル）、又はチオ硫酸ナトリウム等の還元剤を用いる。前記クエンチ処理は、省略することも可能である。
　工程ｂ１の後に工程ｃ１を行う際、工程ｃ１の反応の後に、スキーム３又は５中、式（ｉｉａ又はｉｉｂ）で表される化合物又はその塩が残存している場合には、必要に応じて、得られた溶液をキャッピング反応に付してもよい。キャッピング反応は、無水酢酸、無水安息香酸などの酸無水物を用いて、又は前述の縮合剤に加えて、メチル－Ｈ－ホスホネートのトリエチルアンモニウム塩、エチル－Ｈ－ホスホネートのトリエチルアンモニウム塩、イソプロピル－Ｈ－ホスホネートのトリエチルアンモニウム塩及び２－シアノエチル－Ｈ－ホスホネートのトリエチルアンモニウム塩などのアルキル－Ｈ－ホスホネートのアンモニウム塩を用いて、通常の方法により実施することができる。
　キャッピング反応は、前述する工程ｂ１の後に実施してもよい。
　工程ａの後に工程ｃ１を行う際には、工程ｃ１の後には、前記キャッピング反応を実施しない。
　次に、ホスホロアミダイト法における、亜リン酸トリエステル結合の変換工程である、工程ｃ２について、説明する。
　工程ｃ２は、工程ｂ２で得られたｎ＋ｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｖｉａ又はｖｉｂ）又は工程ａで得られたｎ個重合オリゴヌクレオチド（ｉｉａ又はｉｉｂ）を単離することなく、工程ｂ２又は工程ａ後の反応混合物に、リン原子を修飾する試薬を直接添加するだけで行うことができる。リン原子を修飾する試薬としては、酸化剤又は硫化剤が使用される。酸化剤又は硫化剤を使用して、リン酸トリエステル結合、チオリン酸トリエステル結合変換することができる。工程ｃ２は、工程ｂ２で得られたｎ＋ｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｖｉａ又はｖｉｂ）又は工程ａで得られたｎ個重合オリゴヌクレオチド（ｉｉａ又はｉｉｂ）を単離して行ってもよい。
　工程ｃ２で用いられる溶媒は、具体的には、前記工程ａと同様の溶媒が挙げられ、使用する酸化剤、硫化剤によって適宜選択される。
　工程ｃ２に使用される「酸化剤」は、他の部位を酸化することなく、亜リン酸トリエステル結合をリン酸トリエステル結合に酸化する能力があれば、特に限定されないが、ヨウ素、（１Ｓ）－（＋）－（１０－カンファニルスルホニル）オキサジリジン、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド（ＴＢＨＰ）、２－ブタノンペルオキシド、１，１－ジヒドロペルオキシシクロドデカン、ビス（トリメチルシリル）ペルオキシド、ｍ－クロロ過安息香酸が好ましい。収率又は反応速度が良好な酸化反応を達成できるという観点で、ヨウ素、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド、２－ブタノンペルオキシドがより好ましく、ヨウ素が特に好ましい。かかる酸化剤は、０．０５から２Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することができる。かかる希釈溶媒としては、反応に不活性な溶媒であれば特に限定されないが、ピリジン、テトラヒドロフラン［ＴＨＦ］、ジクロロメタン、水、又はこれらの混合溶媒を挙げることができる。中でも、例えば、ヨウ素／水／ピリジンの混合溶媒若しくはヨウ素／水／ピリジン／ＴＨＦの混合溶媒を用いることが好ましい。
　工程ｃ２で前記酸化剤を使用する場合、工程ｃ２の反応溶媒は、前記希釈溶媒と同様である。
　工程ｃ２に使用される「硫化剤」は、亜リン酸トリエステル結合をチオリン酸トリエステル結合に変換しうる能力があれば、特に限定されないが、単体硫黄、３－アミノ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオン（ＡＤＴＴ）、３－（（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ）－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオン（ＤＤＴＴ）、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン－１，１－ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン、フェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）、テトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）、Ｎ－（ベンゾイルチオ）－スクシンイミドが好ましい。収率又は反応速度が良好な反応が進行しうるという観点で、単体硫黄、ＡＤＴＴがより好ましく、単体硫黄が特に好ましい。かかる硫化剤は、０．０５から２Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することができる。かかる希釈溶媒としては、反応に不活性な溶媒であれば特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、ピリジン又はこれらの混合溶媒が挙げられる。
　工程ｃ２で前記硫化剤を使用する場合、工程ｃ２の反応溶媒は、前記希釈溶媒と同様である。
　リン原子を修飾する試薬の使用量は、工程ｂ２で得られたｎ＋ｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｖｉａ若しくはｖｉｂ）１モル又は工程ａで得られたｎ個重合オリゴヌクレオチド（ｉｉａ又はｉｉｂ）１モルに対し、１から５０モルが好ましく、より好ましくは１から１５モルであり、さらに好ましくは１から１０モルであり、さらにより好ましくは１から７モルである。
　反応温度は、反応が進行すれば特に限定されないが、－１０℃から６０℃が好ましく、０℃から５０℃がより好ましく、２０℃から３０℃がさらに好ましい。反応時間は、工程ｂ２で得られたｎ＋ｐ個重合オリゴヌクレオチド（ｖｉａ若しくはｖｉｂ）又は工程ａで得られたｎ個重合オリゴヌクレオチド（ｉｉａ又はｉｉｂ）の種類、使用するリン原子を修飾する試薬の種類、反応温度等によって異なるが、好ましくは１分間から２４時間であり、より好ましくは、１０分間から１２時間であり、更に好ましくは、３０分間から６時間である。
　該酸化剤及び硫化剤は反応後又は次工程以降で望まない副反応を誘発する可能性があり、該副反応を抑制するため、反応後に還元剤を用いてクエンチ処理を行うことができる。還元剤としては、例えば、３価のリン試薬（例えば、亜リン酸トリメチル、亜リン酸トリエチル、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン等の亜リン酸トリアルキル；亜リン酸ジメチル、亜リン酸ジエチル等の亜リン酸ジアルキル）、チオ硫酸ナトリウム等が用いられる。前記クエンチ処理は、省略することも可能である。
　工程ｂ２の後に工程ｃ２を行う際、工程ｃ２の反応の後に、スキーム４又は６中、式（ｉｉａ又はｉｉｂ）で表される化合物又はその塩が残存している場合には、必要に応じて、得られた溶液をキャッピング反応に付してもよい。キャッピング反応は、無水酢酸、無水安息香酸などの酸無水物を用いて、又は前述の縮合剤に加えて、メチル－Ｈ－ホスホネートのトリエチルアンモニウム塩、エチル－Ｈ－ホスホネートのトリエチルアンモニウム塩、イソプロピル－Ｈ－ホスホネートのトリエチルアンモニウム塩及び２－シアノエチル－Ｈ－ホスホネートのトリエチルアンモニウム塩などのアルキル－Ｈ－ホスホネートのアンモニウム塩を用いて、通常の方法により実施することができる。
　キャッピング反応は、前述する工程ｂ２の後に実施してもよい。
　工程ａの後に工程ｃ２を行う際には、工程ｃ２の後には、前記キャッピング反応を実施しない。
（工程ｅ）（沈殿化及び固液分離工程）
　工程ｅは、工程ａから工程ｃのいずれかで得られた反応溶液と極性溶媒とを混合することによりオリゴヌクレオチドを沈殿させて、固液分離により取得する工程である。
　工程ｅにおける極性溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノールｎ－ブタノール等のアルコール系溶媒；アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル系溶媒；アセトン、２－ブタノン等のケトン系溶媒；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピペリドン等のアミド系溶媒；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒；水、ならびにこれら２種以上の混合溶媒が用いられる。工程ｅにおける極性溶媒は、好ましくはアルコール系溶媒、ニトリル系溶媒であり、より好ましくは、炭素数１から６のアルコール溶媒又は炭素数１から６のニトリル溶媒であり、特に好ましくはメタノール又はアセトニトリルである。
　工程ｃで得られた反応溶液を用いて工程ｅを行う場合、前述の還元剤を、沈殿化溶媒であるメタノールやアセトニトリルに加えた溶液として使用することにより、リン原子を修飾する試薬のクエンチ処理と同時に工程ｅを行うことができる。
　本発明のオリゴヌクレオチドの製造方法は、上記工程ａから工程ｃ及び工程ｅを所望の回数繰返すことで高純度かつ高収率で目的のオリゴヌクレオチドを得ることができる。
（工程ｆ）（脱保護・オリゴヌクレオチド単離工程）
　オリゴヌクレオチドの製造方法においては、工程ｅの後に、基本保護基、一時保護基及び擬似固相保護基の種類と性質に応じて、脱保護を行い、オリゴヌクレオチドを単離することができる。脱保護の方法としては、例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS）、第３版、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（JOHN WILLY & SONS）出版（1999年）等に記載されている脱保護方法に従い、オリゴヌクレオチドの保護基を除去する工程を行うことができる。具体的には、擬似固相保護基、ならびに基本保護基であるベンゾイル基、イソブチリル基、フェノキシアセチル基、アセチル基、レブリニル基等、亜リン酸ジエステル結合、リン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合を保護している基本保護基である２－シアノエチル基等は、アンモニア水、アンモニア水／エタノール溶液、又はアンモニア水とメチルアミン水溶液の混合液で処理することにより、除去することができる。また、５’位又は３’位ヒドロキシ基の一時保護基は、工程ａで使用されるフッ素試薬、酸又は塩基、又はそれらを適宜希釈した溶液で処理することにより除去することができる。また、ジャーナルオブザケミカルソサイエティー　パーキントランザクション１、２００２年、２６１９頁－２６３３頁に記載されている脱保護方法に従い、ＤＢＵ［１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン］及びトリメチルシリルクロリドで処理して、リン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合を保護している２－シアノエチル基等を除去した後に、アンモニア水で擬似固相保護基、ならびに基本保護基であるベンゾイル基、イソブチリル基、フェノキシアセチル基、アセチル基、レブリニル基等を除去する方法を用いることもできる。また、無機塩基（炭酸カリウム等）で基本保護基であるベンゾイル基、イソブチリル基、フェノキシアセチル基、アセチル基、レブリニル基等を除去する方法を用いることもできる。
　基本保護基で置換されたリン酸ジエステル結合は、例えば、ジャーナルオブザケミカルソサイエティー　パーキントランザクション１、１９９９、１４７７頁－１４８６頁に記載されている方法（（Ｅ）－２－ニトロベンズアルドキシム、ピリジン－２－アルドキシムなどのオキシム化合物及び、１、１、３、３－テトラメチルグアニジン、ＤＢＵ等の塩基で処理する方法）で脱保護することにより、リン酸ジエステル結合へ変換することができる。２－シアノエチル基等、β脱離によって脱保護可能な基本保護基で置換されたチオリン酸ジエステル結合は、前記塩基性条件下での脱保護により、チオリン酸ジエステル結合へ変換できる。その他の基本保護基で置換されたチオリン酸ジエステル結合のうち、チオリン酸－Ｏ，Ｏ，Ｓ－トリエステル結合に包含される結合は、例えば、ジャーナルオブザケミカルソサイエティー　パーキントランザクション１、１９９９、１４７７頁－１４８６頁に記載されている方法（前記オキシム化合物及び前記塩基で処理する方法等）で脱保護することにより、リン酸ジエステル結合へ変換できる。
　保護基を有しないオリゴヌクレオチドは、酵素により容易に分解されやすいため、空気清浄度管理下でオリゴヌクレオチドを単離することが好ましい。
　基本保護基のうちＣ６－１０アリールアミノカルボニル基、５－１０員ヘテロアリールアミノカルボニル基、Ｃ６－１０アリールスルホニルアミノカルボニル基、モノＣ１－６アルキルアミノカルボニル基、アラルキルアミノカルボニル基等は、水存在下加熱することで除去することができる。この時、アンモニア水を用いてもよい。
　上記工程ａから工程ｃ及び工程ｆにおける反応の進行の確認は、いずれも一般的な液相有機合成反応と同様の方法を適用できる。すなわち、薄層シリカゲルクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を用いて反応を追跡することができる。
　工程ｅ又は工程ｆより得られたオリゴヌクレオチドは、更に有機合成反応を施すことにより、所望のオリゴヌクレオチド誘導体へと導くこともできる。Ｈ－ホスホネート法の方法Ａ、ホスホロアミダイト法の方法Ａ、Ｈ－ホスホネート法の方法Ｂ及びホスホロアミダイト法の方法Ｂのいずれかを使用して製造されたオリゴヌクレオチドを用いて、Ｈ－ホスホネート法の方法Ａ、ホスホロアミダイト法の方法Ａ、Ｈ－ホスホネート法の方法Ｂ及びホスホロアミダイト法の方法Ｂのいずれかを使用してオリゴヌクレオチドを製造することもできる。
　前記カップリング工程後の亜リン酸ジエステル結合又は亜リン酸トリエステル結合による縮合体（ｉｖａ、ｖｉａ、ｉｖｂ又はｖｉｂ）、又はその亜リン酸ジエステル結合又は亜リン酸トリエステル結合の変換体（ｖｉｉａ、ｖｉｉｉａ、ｖｉｉｂ又はｖｉｉｉｂ）を、スキーム１又は２中、式（ｉａ又はｉｂ）で表される化合物として用い、方法Ａ又は方法Ｂにおける工程ａを実施することができる。
　製造されたオリゴヌクレオチドは、各種人体用又は動物用の医薬品（ＲＮＡ、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド医薬、等）、機能性食品、特定保健食品、食品、化成品、生体用高分子材料、工業用高分子材料等の各種用途に使用することができる。
　オリゴヌクレオチドの製造方法における出発物質は、既存の酸化、還元、加水分解、エステル化反応、アミド縮合等、一般的に知られている官能基変換法（例えば、コンプリヘンシブ・オーガニック・トランスフォーメーションズ第2版（Comprehensive Organic Transformations, Second Edition）、ラロック（R. C. Larock）著、ワイリー－ブイシーエイチ（Wiley-VCH）（1999年）など参照）を行うことにより製造できる。
　例えば、２’位と４’位が－ＣＳＮＲ１４－（Ｒ１４は水素原子又はＣ１－６アルキル基を示す）で架橋したリボースに、核酸塩基が結合したヌクレオシドは、対応する－ＣＯＮＲ１３－（Ｒ１３は水素原子又はＣ１－６アルキル基を示す）で架橋した構造を有するヌクレオシド等から、チオカルボニル化試薬（例えばローソン試薬等）を用いて、必要に応じて保護反応及び脱保護反応を行って、合成することができる。
　擬似固相保護基が導入されたヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドは以下に示す方法によって製造することができるが、下記製造方法は一般的な製造方法の一例を示すものであり、本実施形態に係る擬似固相保護基が導入されたヌクレオシド等の製造方法を限定するものではない。
　前記式（Ｉ）に示される擬似固相保護基が導入されたヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドは、例えば、下記式（Ｘ－１）に示されるアルキルハライドと、ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの核酸塩基とを溶媒中で反応させることにより得ることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　式（Ｘ－１）中、Ｗは、ハロゲン原子を意味し、その他の記号は前記定義に同じである。
　前記式（Ｘ－１）に示されるアルキルハライドと、ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの反応には、塩基（炭酸カリウム、トリエチルアミン等）が用いられる。溶媒としては、クロロホルム、ジクロロメタン、１，２－ジクロロエタン等のハロゲン系溶媒；ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン等の芳香族系溶媒；酢酸エチル、酢酸イソプロピル等のエステル系溶媒；ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、オクタン、ノナン、シクロヘキサン等の脂肪族系溶媒；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル等のエーテル系溶媒；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドン等のアミド系溶媒等が挙げられる。
　前記式（Ｘ－１）に示されるアルキルハライドは、下記式（Ｘ－２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
に示されるカルボン酸とクロロメタンスルホン酸クロリドを溶媒中で反応させることにより（国際公開第２０１４－１４４２８５号に記載の方法）、また前記式（Ｘ－２）に示されるカルボン酸、パラホルムアルデヒド及び塩化亜鉛を溶媒中で反応させることにより（ジャーナルオブメディシナルケミストリー、２００９年、５２巻、７７１頁－７７８頁の方法）、製造できる。
　また、Ｌ１とＬ２の間の結合、Ｌ２とＬ３の間の結合、Ｌ３とＬ４の間の結合の内、任意の結合を、上記官能基変換法等を用いて形成させ、段階的に擬似固相保護基を導入することもできる。また、Ｌ２が、－ＣＯＯ－、－ＣＯＮ（Ｒ２）－、ＯＣＯ－又は－Ｎ（Ｒ２）ＣＯ－である場合、Ｌ２が含むエステル結合又はアミド結合を、上記官能基変換法等を用いて形成させ、段階的に擬似固相保護基を導入することもできる。Ｌ４が、－ＣＯＯ－、－ＣＯＮ（Ｒ２）－、ＯＣＯ－又は－Ｎ（Ｒ２）ＣＯ－である場合も同様である。ここで、Ｒ２は前記定義に同じである。
　当該カルボン酸若しくは酸ハライドは、既存の酸化、還元、加水分解等、一般的に知られている官能基変換法（例えば、コンプリヘンシブ・オーガニック・トランスフォーメーションズ第2版（Comprehensive Organic Transformations, Second Edition）、ラロック（R. C. Larock）著、ワイリー－ブイシーエイチ（Wiley-VCH）（1999年）など参照）を行うことにより製造できる。
　カップリング工程で使用されるｐ個重合オリゴヌクレオチドである、スキーム３から６中、（ｉｉｉａ）、（ｉｉｉｂ）、（ｖａ）又は（ｖｂ）で表されるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドは、公知の方法に従い、合成できる。
　ヒドロキシホスフィニル基で置換されたヒドロキシ基を有する化合物（ｉｉｉａ）又は（ｉｉｉｂ）は、それぞれ、（ｉｉｉａ）の５’位がヒドロキシ基である化合物又は（ｉｉｉｂ）の３’位がヒドロキシ基である化合物に、溶媒中、Ｈ－ホスホネート化試薬を反応させる公知の方法（Colin B. Reese et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 2002, 2619-2633.）に従い、製造することができる。溶媒としては工程ａと同様の溶媒が挙げられ、Ｈ－ホスホネート化試薬としては、亜リン酸、亜リン酸ジアリール（亜リン酸ジフェニルなど）、アリール－Ｈ－ホスホネートのアンモニウム塩（フェニル－Ｈ－ホスホネートのトリエチルアンモニウム塩、ｐ－トルイル－Ｈ－ホスホネートのトリエチルアンモニウム塩など）、ハロゲン化リン（２－クロロ－４Ｈ－１，３，２－ベンゾジオキサホスホリン－４－オン、三塩化リンなど）などが挙げられる。
　３’位又は５’位が置換されたヒドロキシ（ジアルキルアミノ）ホスフィノ基で置換されたヒドロキシ基を有する化合物（ｖａ）又は（ｖｂ）は、それぞれ、（ｖａ）の５’位がヒドロキシ基である化合物又は（ｖｂ）の３’位がヒドロキシ基である化合物に、溶媒中、ホスホロアミダイト化試薬を反応させる公知の方法（M. H. Caruthers et al., Method in Enzymology 1987, 154, 287-313; S. L. Beaucage and M. H. Caruthers, Tetrahedron Letters 1981, 22, 1859-1862.）に従い、製造することができる。溶媒としては工程ａと同様の溶媒が挙げられ、ホスホロアミダイト化試薬としては、２－シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイト等が挙げられる。
　ｐが１である（ｉｉｉａ）、（ｉｉｉｂ）、（ｖａ）又は（ｖｂ）で表されるヌクレオシドは、購入することもできる。
　次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例中、ＮＭＲは核磁気共鳴スペクトルを、ＭＳは質量分析を意味する。
　１Ｈ－ＮＭＲデータが記載されている場合には、３００ＭＨｚ（ＪＮＭ－ＥＣＰ３００；日本電子（ＪＥＯＬ）社製、又はＪＮＭ－ＥＣＸ３００；日本電子（ＪＥＯＬ）社製）で測定し、テトラメチルシランを内部標準としたシグナルの化学シフトδ（単位：ｐｐｍ）（分裂パターン、積分値）を表す。「ｓ」はシングレット、「ｄ」はダブレット、「ｔ」はトリプレット、「ｑ」はカルテット、「ｍ」はマルチプレット、「ｂｒ　ｓ」はブロード、「ＣＤＣｌ３」は重クロロホルムを意味する。
　３１Ｐ－ＮＭＲデータが記載されている場合には、ＪＮＭ－ＥＣＸ３００；日本電子（ＪＥＯＬ）社製）で測定したシグナルの化学シフトδ（単位：ｐｐｍ）を表す。
　ＭＳは、特に記述がない場合は、以下の条件１で、ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）法を用いて測定した。「ＥＳＩ＋」はＥＳＩ正イオンモード、「ＥＳＩ－」はＥＳＩ負イオンモードを意味する。
条件１：
　装置：ＡＢ　ＳＣＩＥＸ　ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ　５６００
　カラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ　ＰＦＰ（２．６μｍ、２．１×７５ｍｍ）
　カラム温度：４０℃
　溶離液組成：
　　有機層：テトラヒドロフラン／アセトニトリル＝１／１（体積比）
　　水層：１０ｍＭ　ギ酸アンモニウム水溶液
有機層と水層の混合比を５０／５０で測定開始後、１０分間で９０／１０に直線的に変えた。その後５分間、有機層と水層の混合比を９０／１０に固定した。
　流速：０．５０ｍＬ／ｍｉｎ、
　検出波長：２６０ｎｍ
　シリカゲルカラムクロマトグラフィーでの精製は、特に記述がない場合は、山善製Ｈｉ－Ｆｌａｓｈカラムを用いた。
参考合成例１　（５’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル－３’－Ｏ－レブリニルデオキシチミジンの合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　窒素雰囲気下、５’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルデオキシチミジン(Apollo Scientific Ltd社製)（５．３ｇ、１５ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．１７ｇ、１．４ｍｍｏｌ）及びレブリン酸（２．８ｇ、２４ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（３８ｇ）溶液に、室温で１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ・ＨＣｌ）（４．６ｇ、２４ｍｍｏｌ）を加え、１５時間１３分撹拌した。次いで反応混合物に酢酸（１．５ｇ、２６ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２．６ｇ、１９ｍｍｏｌ）の水（３８ｇ）溶液を加えて５分間撹拌し、酢酸エチル（３７ｇ）を加えて１４分間撹拌し、分液した。得られた有機層の溶媒を減圧下留去し、５’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル－３’－Ｏ－レブリニルデオキシチミジン（６．９ｇ、定量的）をうすいオレンジ色固体として得た。
１Ｈ－ＮＭＲ：（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ０．１３（ｓ，６Ｈ），０．９３（ｓ，９Ｈ），１．９２（ｄ，３Ｈ），２．０５－２．１５（ｍ，１Ｈ），２．２１（ｓ，３Ｈ），２．３９－２．４５（ｍ，１Ｈ），２．５８－２．６２（ｍ，２Ｈ），２．７６－２．８１（ｍ，２Ｈ），３．９０－３．９１（ｍ，２Ｈ），４．０９９－４．１０３（ｍ，１Ｈ），５．２６（ｄ、１Ｈ），６．３７（ｑ，１Ｈ），７．５５（ｄ，１Ｈ），９．３４（ｂｒ　ｓ，１Ｈ）． 
実施例１（チミン３位に擬似固相保護基が結合したヌクレオシドの合成）：化合物３の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
工程１　化合物１の合成
　窒素雰囲気下、３，４，５－トリス（オクタデシルオキシ）安息香酸（国際公開第２０１４－０７７２９２号に記載の方法に準じて合成した）（３．０ｇ、３．２ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（１．１ｇ、１０ｍｍｏｌ）、及び硫酸水素テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（０．１３ｇ、０．３８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（７１ｇ）／水（３０ｇ）混合溶液に、室温でクロロメチルスルホニルクロリド（０．３９ｍＬ、３．９ｍｍｏｌ）を加え、２時間４２分撹拌した。さらにクロロメチルスルホニルクロリド（６０μＬ、０．６０ｍｍｏｌ）を加えて１８分間撹拌した後に、反応混合物を４０℃に昇温して１０分間撹拌した。撹拌を停止して分液し、得られた水層はジクロロメタンで再抽出を行った。得られた有機層を合わせて、溶媒を減圧下留去し、残渣にアセトニトリル（７０ｇ）を加えて析出した固体をろ過し、化合物１を白色固体（３．１６ｇ、定量的）として得た。
１Ｈ－ＮＭＲ：（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ０．８６－０．９０（ｍ，９Ｈ），１．２６－１．８４（ｍ，９６Ｈ），３．９９－４．０５（ｍ，６Ｈ），５．９３－６．０１（ｍ，２Ｈ），７．２７－７．３６（ｍ，２Ｈ）． 
工程２　化合物２の合成
　窒素雰囲気下、化合物１（１．０ｇ、１．１ｍｍｏｌ）、及び５’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル－３’－Ｏ－レブリニルデオキシチミジン（０．７１ｇ、１．６ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（５０ｍＬ）溶液に、７０℃で炭酸カリウム（０．２１ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を加えて２時間５分撹拌し、さらに炭酸カリウム（０．９１ｇ、６．ｍｍｏｌ）を加えて２時間４４分撹拌した。その後、反応混合物をアセトニトリル（２０１ｇ）に加え、析出した固体をろ過し、化合物３（１．０１ｇ、収率６９％）を黄色固体として得た。
１Ｈ－ＮＭＲ：（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ０．１４（ｓ，６Ｈ），０．８６－０．９３（ｍ，１８Ｈ），１．２６－１．８１（ｍ，９６Ｈ），２．１３－２．４３（ｍ，５Ｈ），２．５６－２．６０（ｍ，２Ｈ），２．７４－２．７９（ｍ，２Ｈ），３．９２－４．１２（ｍ，９Ｈ），５．２６（ｄ，１Ｈ），６．２２（ｑ，２Ｈ），６．４２（ｑ，１Ｈ），７．２２（ｓ，２Ｈ），７．５９（ｓ，１Ｈ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）：［Ｍ＋Ｈ］＋　１３９４．０８２７．
工程３　化合物３の合成
　窒素雰囲気下、化合物２（０．９４ｇ、０．６７ｍｍｏｌ）、及び酢酸（０．４１ｍＬ、７．２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液に、３０℃で１．０Ｍ　テトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）／ＴＨＦ溶液（３．５ｍＬ、３．５ｍｍｏｌ）を加え、４時間２分撹拌した。その後、反応混合物をメタノール（１００ｇ）に加え、析出した固体をろ過し、化合物３（０．８５ｇ、収率９９％）を黄色固体として得た。
１Ｈ－ＮＭＲ：（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ０．８８（ｔ，９Ｈ），１．２６－１．８１（ｍ，９６Ｈ），２．２０（ｓ，３Ｈ），２．３９－２．４４（ｍ，２Ｈ），２．５８－２．６０（ｍ，２Ｈ），２．７６－２．７８（ｍ，２Ｈ），３．９３（ｔ，３Ｈ），３．９６－４．０１（ｍ，６Ｈ），４．１１（ｄ、１Ｈ），５．３４－５．３８（ｍ，１Ｈ），６．２１（ｑ，２Ｈ），６．３２（ｔ，１Ｈ），７．２１（ｓ，２Ｈ），７．６１（ｄ、１Ｈ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）：［Ｍ＋Ｈ］＋　１２７９．９９５０．
試験例　（チミン３位に擬似固相保護基を持つデオキシチミジンの安定性評価）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　チミン３位に擬似固相保護基を持つデオキシチミジンとして、化合物３及び化合物４（それぞれ７ｍｇ；化合物４は国際公開第２０１４－０７７２９２号に記載の方法に準じて合成した）をピリジン（０．５０ｍＬ）に溶解させ、水（６０μＬ）を加えて、７０℃で撹拌し、一定時間経過後にＨＰＬＣ分析を行った。０時間の時点でのそれぞれの化合物のＨＰＬＣ相対面積を１００％としたときの、該化合物のＨＰＬＣ相対面積の経時変化を、図１に示す。なお、図１中、「ｃｏｍｐｏｕｎｄ」は化合物を、「ｔｉｍｅ」は時間を、「ＨＰＬＣ　ｐｅａｋ　ａｒｅａ」は、ＨＰＬＣ相対面積を意味する。
　図１から、化合物４と比較して、化合物３の方が安定であることが分かる。
実施例２（ホスホロアミダイト法による合成）：化合物５の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　窒素雰囲気下、化合物３（５１ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）及び５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）デオキシチミジン－３’－（２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト）(Glen Research社製)（１４４ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１．５ｍＬ）及びアセトニトリル（０．５ｍＬ）の混合溶液に、２５℃で１Ｈ－テトラゾール（１４ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を加え、１時間２３分撹拌した。その後、０．１Ｍのヨウ素を含む、ピリジン、ＴＨＦ及び水の溶液（２．０ｍＬ、０．２０ｍｍｏｌ）を加え、４６分間撹拌した。その後、反応混合物をアセトニトリル（２５ｇ）に加え、析出した固体をろ過し、化合物５（６５ｍｇ、収率８４％）を白色固体として得た。
１Ｈ－ＮＭＲ：（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ０．８８（ｔ，９Ｈ），１．２０－２．００（ｍ，９８Ｈ），２．１７－２．７５（ｍ，１７Ｈ），３．３７－３．４１（ｍ，１Ｈ），３．５１－３．５７（ｍ，１Ｈ），３．７８－３．７９（ｍ，６Ｈ），３．９５－４．０４（ｍ，６Ｈ），４．０８－４．３８（ｍ，６Ｈ），５．１７－５．３０（ｍ，２Ｈ），６．１５－６．２５（ｍ，２Ｈ），６．３４－６．４２（ｍ，２Ｈ），６．８０－７．４１（ｍ，１５Ｈ），７．５３－７．５５（ｍ，１Ｈ），８．３２－８．３７（ｍ，２Ｈ）．
３１Ｐ－ＮＭＲ：（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ－２．００、－１．９３．
ＭＳ（ＥＳＩ）：［Ｍ－Ｈ］－　１９３７．２００６．
実施例３（Ｈ－ホスホネート法による合成）：化合物６の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
　窒素雰囲気下、化合物３（４９ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）及び５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）デオキシチミジン－３’－Ｈ－ホスホネートのトリエチルアミン塩（ChemGenes社製）（４２ｍｇ、０．０５９ｍｍｏｌ）のピリジン（１．０ｍＬ）溶液に、２５℃で２，２－ジメチルブチリルクロリド（２７μＬ、０．２０ｍｍｏｌ）を加え、２７分間撹拌した。その後０．１Ｍのヨウ素を含む、ピリジン、ＴＨＦ及び水の溶液（０．５９ｍＬ、０．０５９ｍｍｏｌ）を加え、４２分間撹拌した。その後、反応混合物をアセトニトリル（２６ｇ）に加え、析出した固体をろ過し、化合物６（６２ｍｇ、収率８８％）を淡いオレンジ色固体として得た。
１Ｈ－ＮＭＲ：（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ０．８８（ｔ，９Ｈ），１．２０－１．８３（ｍ，９６Ｈ），１．８７（ｄ，３Ｈ），１．９５（ｄ，３Ｈ），２．１９（ｓ，３Ｈ），２．２３－２．７９（ｍ，８Ｈ），３．７９（ｓ，６Ｈ），３．８１－４．３０（ｍ，１２Ｈ），５．１０－５．３９（ｍ，２Ｈ），６．０９－６．４５（ｍ，４Ｈ）、６．７９－７．３５（ｍ，１５Ｈ）、７．５０（ｓ，１Ｈ）、７．６２（ｓ，１Ｈ）．
３１Ｐ－ＮＭＲ：（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ－１．０２．
ＭＳ（ＥＳＩ）：［Ｍ－Ｈ］－　１８８４．１６３０．
実施例４（Ｈ－ホスホネート法による合成）：化合物７の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
　窒素雰囲気下、化合物３（３９ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）及び５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）デオキシチミジン－３’－Ｈ－ホスホネートのトリエチルアミン塩（３３ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）のピリジン（１．０ｍＬ）溶液に、２５℃で２，２－ジメチルブチリルクロリド（２０μＬ、０．１５ｍｍｏｌ）を加え、２９分間撹拌した。その後０．０５Ｍのヨウ素を含む、ピリジン及び水の溶液（３．０ｍＬ、０．１５ｍｍｏｌ）を加え、１時間１２分撹拌した。その後、水（１１８μＬ、６．６ｍｍｏｌ）を加えて７０℃に昇温し、２１時間５０分撹拌した。室温に冷却し、反応混合物をアセトニトリル（２１ｇ）に加え、析出した固体をろ過し、化合物７（３６ｍｇ、収率７７％）を茶色固体として得た。
１Ｈ－ＮＭＲ：（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ０．８８（ｔ，９Ｈ）、１．０８－２．００（ｍ，１０２Ｈ），２．１３－２．７６（ｍ，１１Ｈ），３．７９－４．５０（ｍ，１２Ｈ），５．０２（ｓ，１Ｈ），５．３８（ｓ，１Ｈ），５．９６－６．３４（ｍ，３Ｈ），６．４１（ｓ，１Ｈ），７．２０（ｓ，２Ｈ），７．５３（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｓ，１Ｈ）．
３１Ｐ－ＮＭＲ：（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）δ－０．９５．
ＭＳ（ＥＳＩ）：［Ｍ－Ｈ］－　１５８２．０３７８．
　核酸塩基部により安定性が高い擬似固相保護基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドを提供し、大量合成に対応できるオリゴヌクレオチドの新規製造方法を提供できるようになった。したがって、本発明は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、ワクチンのアジュバントなどのオリゴヌクレオチドの製造に適用することができ、ゲノム創薬や遺伝子診断・治療などの分野において極めて有用なものである。

Claims (28)

  1. 　下記式（ＩＩ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    ［式中、＊は、核酸塩基との結合位置を示し、
    　Ｒ１は、それぞれ独立して、Ｃ１－４０アルキル基、Ｃ２－４０アルケニル基又はＣ２－４０アルキニル基であり、ｓは、１から５の整数であり、
    　Ｌ１及びＬ３は、それぞれ独立して、単結合、Ｃ１－６アルキレン基、Ｃ２－６アルケニレン基又はＣ２－６アルキニレン基であり、
    　Ｌ２及びＬ４は、それぞれ独立して、単結合、－ＣＯＯ－若しくは－ＯＣＯ－、－ＣＯＮ（Ｒ２）－若しくは－Ｎ（Ｒ２）ＣＯ－（式中Ｒ２は、水素原子、Ｃ１－６アルキル基、Ｃ１－６ハロアルキル基、Ｃ２－６アルケニル基又はＣ２－６ハロアルケニル基を示す）、－Ｃ（Ｏ）－又は－Ｏ－であり、
    　Ｌ５及びＬ６は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１－６アルキル基、Ｃ１－６ハロアルキル基、Ｃ２－６アルケニル基、Ｃ２－６ハロアルケニル基、又は置換基を有していてもよいフェニル基である］で表される保護基で置換された核酸塩基を少なくとも１つ有し、
    　５’位又は３’位がヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの当該５’－ヒドロキシ基又は３’－ヒドロキシ基を、
    　３’位又は５’位が反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドと反応させるカップリング工程を含む、オリゴヌクレオチドの製造方法。
  2. 　前記カップリング工程の前に、前記式（ＩＩ）で表される保護基で置換された核酸塩基を少なくとも１つ有し、５’位又は３’位に一時保護基で置換されたヒドロキシ基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの当該一時保護基を除去して、前記５’位又は３’位がヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドを生成する反応を含む、脱一時保護基工程を更に含む、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記式（ＩＩ）で表される保護基で置換された核酸塩基を少なくとも１つ有し、５’位又は３’位がヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドが、３’位又は５’位に基本保護基で置換されたヒドロキシ基を有する、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　前記３’位又は５’位が反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドが、５’位又は３’位に一時保護基で置換されたヒドロキシ基を有する、請求項１から３のいずれか１つに記載の製造方法。
  5. 　前記カップリング工程において、前記式（ＩＩ）で表される保護基で置換された核酸塩基を少なくとも１つ有し、５’位がヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの当該５’－ヒドロキシ基を、
    　３’位が反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドと反応させる、請求項１から４のいずれか１つに記載の製造方法。
  6. 　前記カップリング工程において、前記式（ＩＩ）で表される保護基で置換された核酸塩基を少なくとも１つ有し、３’位がヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの当該３’－ヒドロキシ基を、
    　５’位が反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドと反応させる、請求項１から４のいずれか１つに記載の製造方法。
  7. 　前記反応性リン含有基が、ヒドロキシホスフィニル基であり、カップリング工程が亜リン酸ジエステル結合を形成する、請求項１から６のいずれか１つに記載の製造方法。
  8. 　前記カップリング工程の後に、前記亜リン酸ジエステル結合を、リン酸ジエステル結合、チオリン酸ジエステル結合、ボラノリン酸ジエステル結合、アミノリン酸ジエステル結合、リン酸トリエステル結合又はチオリン酸－Ｏ，Ｏ，Ｓ－トリエステル結合に変換する反応を含む、亜リン酸ジエステル結合の変換工程を更に含む、請求項７に記載の製造方法。
  9. 　前記反応性リン含有基が、置換されたヒドロキシ（ジアルキルアミノ）ホスフィノ基であり、カップリング工程が亜リン酸トリエステル結合を形成する、請求項１から６のいずれか１つに記載の製造方法。
  10. 　前記カップリング工程の後に、前記亜リン酸トリエステル結合を、リン酸トリエステル結合又はチオリン酸トリエステル結合に変換する反応を含む、亜リン酸トリエステル結合の変換工程を更に含む、請求項９に記載の製造方法。
  11. 　少なくとも１つの工程の反応後に、反応液と極性溶媒とを混合して沈殿物を生成させ、生成した沈殿物を固液分離により取得する精製工程を更に含む、請求項１から１０のいずれか１つに記載の製造方法。
  12. 　前記極性溶媒が炭素数１から６のアルコール溶媒又は炭素数１から６のニトリル溶媒である、請求項１１に記載の製造方法。
  13. 　前記一時保護基が、ｔｅｒｔ-ブチルジメチルシリル基、トリチル基、モノメトキシトリチル基又はジメトキシトリチル基であり、前記基本保護基が、レブリニル基又は３－ベンゾイルプロピオニル基である、請求項３から１２のいずれか１つに記載の製造方法。
  14. 　前記一時保護基が、レブリニル基又は３－ベンゾイルプロピオニル基であり、前記基本保護基が、ｔｅｒｔ-ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔｅｒｔ-ブチルジフェニルシリル基、トリチル基、モノメトキシトリチル基又はジメトキシトリチル基である、請求項３から１２のいずれか１つに記載の製造方法。
  15. 　前記式（ＩＩ）で表される保護基、並びに存在する場合は、前記基本保護基及び前記一時保護基を除去する、全脱保護工程を更に含む、請求項１から１４のいずれか１つに記載の製造方法。
  16. 　下記式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    ［式中、ｎは、１以上の任意の整数であり、
    　ＢａｓｅＺは、それぞれ独立して、核酸塩基、基本保護基で置換された核酸塩基又は下記式（ＩＩ）で表される保護基で置換された核酸塩基であり、少なくとも１つのＢａｓｅＺは、下記式（ＩＩ）で表される保護基で置換された核酸塩基であり、
    　Ｘは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、無置換若しくは置換されたヒドロキシ基又は４’位炭素原子に架橋する有機基であり、
    　Ｙは、それぞれ独立して、水素原子、無置換若しくは置換されたヒドロキシ基、無置換若しくは置換されたスルファニル基、水素化ホウ素基、又は置換されたアミノ基であり、
    　Ｒは、水素原子、基本保護基又は一時保護基であり、
    　Ｚは、水素原子、基本保護基又は一時保護基であり、
    　Ｖは、それぞれ独立して、酸素原子又は硫黄原子であり、
    式（ＩＩ）が
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    （式中、＊は、核酸塩基部との結合位置を示し、
    　Ｒ１は、それぞれ独立して、Ｃ１－４０アルキル基、Ｃ２－４０アルケニル基又はＣ２－４０アルキニル基であり、ｓは、１から５の整数であり、
    　Ｌ１及びＬ３は、それぞれ独立して、単結合、Ｃ１－６アルキレン基、Ｃ２－６アルケニレン基又はＣ２－６アルキニレン基であり、
    　Ｌ２及びＬ４は、それぞれ独立して、単結合、－ＣＯＯ－若しくは－ＯＣＯ－、－ＣＯＮ（Ｒ２）－若しくは－Ｎ（Ｒ２）ＣＯ－（式中Ｒ２は、水素原子、Ｃ１－６アルキル基、Ｃ１－６ハロアルキル基、Ｃ２－６アルケニル基又はＣ２－６ハロアルケニル基を示す）、－Ｃ（Ｏ）－又は－Ｏ－であり、
    　Ｌ５及びＬ６は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１－６アルキル基、Ｃ１－６ハロアルキル基、Ｃ２－６アルケニル基、Ｃ２－６ハロアルケニル基、又は置換基を有していてもよいフェニル基である）で表され、
    　２以上の前記式（ＩＩ）で表される保護基を有する場合、それぞれの式（ＩＩ）で表される保護基は同一でも異なっていてもよい］で表される化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
  17. 　ｎが、１から３０の整数である、請求項１６に記載の化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
  18. 　前記式（ＩＩ）で表される保護基が置換する核酸塩基が、それぞれ独立して、チミン又はウラシルである、請求項１６又は１７に記載の化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
  19. 　Ｘが、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基、又は基本保護基で置換されたヒドロキシ基である、請求項１６から１８のいずれか１つに記載の化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
  20. 　Ｘが、水素原子である、請求項１９に記載の化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
  21. 　Ｙが、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基又は基本保護基で置換されたヒドロキシ基である、請求項１６から２０のいずれか１つに記載の化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
  22. 　Ｙが、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基又はシアノ基で置換されたＣ１－６アルキル基で置換されたヒドロキシ基である、請求項２１に記載の化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
  23. 　Ｒが、水素原子又は一時保護基であり、Ｚが、基本保護基である、請求項１６から２２のいずれか１つに記載の化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
  24. 　前記一時保護基が、ｔｅｒｔ-ブチルジメチルシリル基、トリチル基、モノメトキシトリチル基又はジメトキシトリチル基であり、前記基本保護基が、レブリニル基又は３－ベンゾイルプロピオニル基である、請求項２３に記載の化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
  25. 　Ｚが、水素原子又は一時保護基であり、Ｒが、基本保護基である、請求項１６から２２のいずれか１つに記載の化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
  26. 　前記一時保護基が、レブリニル基又は３－ベンゾイルプロピオニル基であり、前記基本保護基が、ｔｅｒｔ-ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔｅｒｔ-ブチルジフェニルシリル基、トリチル基、モノメトキシトリチル基又はジメトキシトリチル基である、請求項２５に記載の化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
  27. 下記式（ＩＩ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    ［式中、＊は、ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの核酸塩基部との結合位置を示し、
    　Ｒ１は、それぞれ独立して、Ｃ１－４０アルキル基、Ｃ２－４０アルケニル基又はＣ２－４０アルキニル基であり、ｓは、１から５の整数であり、
    　Ｌ１及びＬ３は、それぞれ独立して、単結合、Ｃ１－６アルキレン基、Ｃ２－６アルケニレン基又はＣ２－６アルキニレン基であり、
    　Ｌ２及びＬ４は、それぞれ独立して、単結合、－ＣＯＯ－若しくは－ＯＣＯ－、－ＣＯＮ（Ｒ２）－若しくは－Ｎ（Ｒ２）ＣＯ－（式中Ｒ２は、水素原子、Ｃ１－６アルキル基、Ｃ１－６ハロアルキル基、Ｃ２－６アルケニル基又はＣ２－６ハロアルケニル基を示す）、－Ｃ（Ｏ）－又は－Ｏ－であり、
    　Ｌ５及びＬ６は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１－６アルキル基、Ｃ１－６ハロアルキル基、Ｃ２－６アルケニル基、Ｃ２－６ハロアルケニル基、又は置換基を有していてもよいベンゼン環である］で表される擬似固相保護基。
  28. 　核酸塩基部にヒドロキシ基又はアミノ基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドを、
    下記式（Ｘ－１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    （式中、Ｗは、ハロゲン原子であり、
    　Ｒ１は、それぞれ独立して、Ｃ１－４０アルキル基、Ｃ２－４０アルケニル基又はＣ２－４０アルキニル基であり、ｓは、１から５の整数であり、
    　Ｌ１及びＬ３は、それぞれ独立して、単結合、Ｃ１－６アルキレン基、Ｃ２－６アルケニレン基又はＣ２－６アルキニレン基であり、
    　Ｌ２及びＬ４は、それぞれ独立して、単結合、－ＣＯＯ－若しくは－ＯＣＯ－、－ＣＯＮ（Ｒ２）－若しくは－Ｎ（Ｒ２）ＣＯ－（式中Ｒ２は、水素原子、Ｃ１－６アルキル基、Ｃ１－６ハロアルキル基、Ｃ２－６アルケニル基又はＣ２－６ハロアルケニル基を示す）、－Ｃ（Ｏ）－又は－Ｏ－であり、
    　Ｌ５及びＬ６は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１－６アルキル基、Ｃ１－６ハロアルキル基、Ｃ２－６アルケニル基又はＣ２－６ハロアルケニル基である）で表されるハロゲン化アルキル化合物と反応させ、
    　核酸塩基部に、下記式（ＩＩ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
    （式中、＊は、ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの核酸塩基部との結合位置を示し、
    　Ｒ１、Ｌ１及びＬ３、Ｌ２及びＬ４、Ｌ５及びＬ６、は上記と同じである）で表される擬似固相保護基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドを製造する方法。
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