ES2957683T3 - Procedimiento para la purificación de oligonucleótidos - Google Patents

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Abstract

La invención se refiere a un nuevo proceso para la purificación de oligonucleótidos que comprende la eliminación del grupo protector 5'hidroxi lábil en ácido en el extremo 5'-O-oligonucleótido del oligonucleótido mediante filtración de flujo tangencial con una solución tampón ácida. El proceso requiere menos pasos y permite un mayor grado de automatización. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento para la purificación de oligonucleótidos
La invención se refiere a un nuevo procedimiento para la purificación de oligonucleótidos que comprende la eliminación del grupo protector 5'hidroxi lábil al ácido en el extremo 5'-O-oligonucleótido del oligonucleótido por medio de filtración de flujo tangencial con una solución tampón ácida.
Típicamente, el oligonucleótido que se prepara por medio de síntesis en fase sólida, después de su escisión de la resina, todavía contiene una cantidad significativa de impurezas. Para monómeros estándar de una longitud de 15 a 20 unidades, la pureza de los PA se encuentra, en el mejor de los casos, en el intervalo de un 70 a un 80 %. Para monómeros modificados químicamente o para secuencias más largas, típicamente, el contenido de PA es aún menor.
Se han desarrollado procedimientos de separación selectiva para preparar oligonucleótidos de alta pureza que satisfacen las especificaciones de una aplicación terapéutica.
En un procedimiento, el oligonucleótido, después de su escisión de la resina, se deja con el grupo protector 5'hidroxi lábil al ácido en el extremo 5'-O-oligonucleótido. La hidrofobia de este grupo permite la aplicación de técnicas de cromatografía eficaces para la purificación.
Es una estrategia frecuente que el oligonucleótido en bruto pase a las siguientes etapas (por ejemplo, Krotzet al.,Organic Process Research & Development 2003, 7, 47-52)
a) cromatografía de fase inversa,
b) concentración y desalinización,
c) eliminación del grupo protector 5'hidroxi lábil al ácido en solución, y
d) otra concentración y desalinización.
Se halló que estos procedimientos conocidos necesitan un tiempo de funcionamiento sustancial debido al número de etapas de funcionamiento individuales de a) a d).
Se han descrito técnicas de filtración por membrana, tales como la filtración de flujo tangencial, para la purificación de moléculas de ARN mensajero en la publicación de patente internacional WO 2015/164773.
El objetivo de la invención era reducir el número de etapas, conseguir un mayor grado de automatización y, con ello, reducir el tiempo total de funcionamiento.
Se halló que el objetivo de la invención se podría alcanzar con el novedoso procedimiento para la purificación de oligonucleótidos como se explica anteriormente.
Las siguientes definiciones se exponen para ilustrar y definir el significado y alcance de los diversos términos usados para describir la invención en el presente documento.
El término grupo protector 5'hidroxi lábil al ácido se define como un grupo protector que se puede escindir con la ayuda de un ácido adecuado y que tiene un carácter hidrófobo.
Los grupos protectores 5'hidroxi lábiles al ácido típicos se seleccionan de 4,4'-dimetoxitritilo, 4-metoxitritilo, tritilo, 9-fenil-xanteno-9-, 9-(p-tolil)-xanteno-9-ilo o de terc-butildimetilsililo, preferentemente, de 4,4'-dimetoxitritilo, 4-metoxitritilo o tritilo o, incluso más preferentemente, de 4,4'-dimetoxitritilo.
El término oligonucleótido, como se usa en el presente documento, se define como se entiende en general por el experto en la técnica como una molécula que comprende dos o más nucleósidos enlazados covalentemente. Para su uso como un oligonucleótido terapéuticamente valioso, los oligonucleótidos se sintetizan típicamente para que tengan una longitud de 10 a 40 nucleótidos, preferentemente, una longitud de 10 a 25 nucleótidos.
Los oligonucleótidos pueden consistir en monómeros de nucleósidos de ADN, ARN o LNA opcionalmente modificados o combinaciones de los mismos.
Los monómeros de nucleósidos de LNA son nucleósidos modificados que comprenden un grupo conector (denominado birradical o puente) entre C2' y C4' del anillo glucídico de ribosa de un nucleótido. Estos nucleósidos también se denominan ácido nucleico con puente o ácido nucleico bicíclico (BNA) en la literatura.
Opcionalmente modificado, como se usa en el presente documento, se refiere a nucleósidos modificados en comparación con el nucleósido de ADN, ARN o LNA equivalente por la introducción de una o más modificaciones del resto de glúcido o del resto de base nitrogenada. En un modo de realización preferente, el nucleósido modificado comprende un resto de glúcido modificado y puede comprender, por ejemplo, uno o más nucleósidos sustituidos en 2' y/o uno o más nucleósidos de LNA. El término nucleósido modificado también se puede usar en el presente documento de manera intercambiable con el término "análogo nucleosídico" o "unidades" modificadas o "monómeros" modificados.
Por lo general, los nucleósidos de ADN, ARN o LNA se enlazan mediante un enlace internucleosídico fosfodiéster (P=O) y/o fosforotioato (P=S) que acopla covalentemente dos nucleósidos.
En consecuencia, en algunos oligonucleótidos, todos los enlaces internucleosídicos pueden consistir en un fosfodiéster (P=O), en otros oligonucleótidos, todos los enlaces internucleosídicos pueden consistir en un fosforotioato (P=S) o, en todavía otros oligonucleótidos, la secuencia de los enlaces internucleosídicos varía y comprende tanto internucleosídicos fosfodiéster (P=O) como fosforotioato (P=S).
Los restos de bases nitrogenadas se pueden indicar por el código de letras para cada base nitrogenada correspondiente, por ejemplo, A, T, G, C o U, en el que cada letra puede incluir opcionalmente bases nitrogenadas modificadas de función equivalente. Por ejemplo, en los oligonucleótidos ejemplificados, los restos de bases nitrogenadas se describen con letras mayúsculas A, T, G y MeC (5-metilcitosina) para el nucleósido de LNA y con letras minúsculas a, t, g, c y MeC para los nucleósidos de ADN. Las bases nitrogenadas modificadas incluyen, pero no se limitan a, bases nitrogenadas que portan grupos protectores tales como terc-butilfenoxiacetilo, fenoxiacetilo, benzoílo, acetilo, isobutirilo o dimetilformamidino (véase Wikipedia, Phosphoramidit-Synthese, https://de.wikipedia.org/wiki/Phosphoramidit-Synthese del 24 de marzo de 2016).
Preferentemente, el oligonucleótido consiste en monómeros de nucleósidos de ADN, ARN o LNA opcionalmente modificados o combinaciones de los mismos y tiene una longitud de 10 a 40, preferentemente, de 10 a 25 nucleótidos.
Los principios de la síntesis de oligonucleótidos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Oligonucleotide synthesis; Wikipedia, the free encyclopedia; https://en.wikipedia.org/wiki/Oligonucleotide synthesis, del 15 de marzo de 2016).
Hoy en día, la síntesis de oligonucleótidos a gran escala se lleva a cabo automáticamente usando sintetizadores controlados por ordenador.
Por lo general, la síntesis de oligonucleótidos es una síntesis en fase sólida, en la que el oligonucleótido que se ensambla se enlaza covalentemente, a través de su grupo hidroxi del extremo 3', a un material de soporte sólido y permanece fijado a él durante todo el transcurso del ensamblaje de la cadena. Los soportes adecuados son los soportes de poliestireno macroporoso disponibles comercialmente como el soporte Primer 5G de GE Healthcare o el soporte NittoPhase®HL de Kinovate.
En principio, la síntesis de oligonucleótidos es una adición escalonada de residuos nucleotídicos al extremo 5' de la cadena en crecimiento hasta que se ensambla la secuencia deseada.
Por lo general, cada adición se denomina ciclo sintético y, en principio, consiste en las reacciones químicas ai) desbloquear el grupo hidroxilo protegido en el soporte sólido,
a<2>) acoplar el primer nucleósido como fosforamidita activada con el grupo hidroxilo libre en el soporte sólido, a3) oxidar o sulfurar el nucleósido respectivo con enlaces P-glucosídicos para formar el respectivo fosfodiéster (P=O) o el respectivo fosforotioato (P=S);
a4) opcionalmente, añadir una caperuza a cualquier grupo hidroxilo sin reaccionar en el soporte sólido; as) desbloquear el grupo hidroxilo en 5' del primer nucleósido fijado al soporte sólido;
a6) acoplar el segundo nucleósido como fosforamidita activada para formar el respectivo dímero con enlaces P-glucosídicos;
a7) oxidar o sulfurar el dinucleósido respectivo con enlaces P-glucosídicos para formar el respectivo fosfodiéster (P=O) o el respectivo fosforotioato (P=S);
a8) opcionalmente, añadir una caperuza a cualquier grupo hidroxilo en 5' sin reaccionar;
ag) repetir las etapas anteriores de a5 a a8 hasta ensamblar la secuencia deseada.
La posterior escisión de la resina se puede realizar con amoníaco acuoso concentrado. Los grupos protectores del fosfato y la base nucleotídica también se eliminan dentro de este procedimiento de escisión.
El oligonucleótido en bruto después de la escisión se deja con el grupo protector 5'hidroxi lábil al ácido en el extremo 5'-0-oligonucleótido.
El procedimiento se caracteriza por la eliminación del grupo protector 5'hidroxi lábil al ácido en el extremo 5'-0-oligonucleótido por medio de filtración de flujo tangencial con una solución tampón ácida.
El término grupo protector 5'hidroxi lábil al ácido se define como anteriormente como un grupo protector que se puede escindir con la ayuda de un ácido adecuado y que tiene un carácter hidrófobo.
Los grupos protectores 5'hidroxi lábiles al ácido típicos se seleccionan de 4,4'-dimetoxitritilo, 4-metoxitritilo, tritilo, 9-fenil-xanteno-9-, 9-(p-tolil)-xanteno-9-ilo o de terc-butildimetilsililo, preferentemente, de 4,4'-dimetoxitritilo, 4-metoxitritilo o tritilo o, incluso más preferentemente, de 4,4'-dimetoxitritilo (DMT).
Un tampón ácido es una solución acuosa de un ácido débil y su base conjugada que se acidifica con un ácido protónico para llevar el pH al intervalo deseado.
Los tampones ácidos típicos son tampones de acetato o citrato que se componen de ácido acético o ácido cítrico como ácido débil y su sal de sodio como base conjugada.
El ácido protónico usado para la acidificación del tampón ácido se puede seleccionar de ácidos minerales acuosos, tales como ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico o ácido nítrico, pero, normalmente, de ácido clorhídrico acuoso.
El pH deseado oscila idealmente entre 2 y 6, preferentemente, entre 2,5 y 4,0, incluso más preferentemente, entre 2,8 y 3,5.
La solución tampón ácida también puede contener un disolvente orgánico polar prótico o aprótico en una cantidad del 5 % (V) al 50 % (V), preferentemente, en una cantidad del 20 % (V) al 40 % (V).
Los disolventes polares próticos adecuados son los alcoholes alifáticos primarios tales como metanol, etanol o i-propanol, preferentemente, etanol.
Los disolventes polares apróticos adecuados son acetonitrilo, dimetilsulfóxido o N-metil-2-pirrolidona, pero, preferentemente, acetonitrilo.
En un modo de realización preferente, el tampón ácido es un tampón de acetato que se acidifica con ácido clorhídrico acuoso hasta un pH en el intervalo de 2,8, a 3,5 y, posteriormente, se diluye con etanol para formar una solución tampón que contiene del 35 % (V) al 45 % (V) de etanol.
La concentración de acetato se puede seleccionar en el intervalo de 10 mmol/l a 1 mol/l, preferentemente, en el intervalo de 50 mmol/l a 250 mmol/l.
La filtración de flujo tangencial se caracteriza por que la alimentación pasa a través de la membrana filtrante (tangencialmente) a presión positiva con respecto al lado del permeado. Una proporción del material que es más pequeña que el tamaño de poro de la membrana pasa a través de la membrana como permeado o filtrado; todo lo demás se retiene en el lado de alimentación de la membrana como retenido.
Hay membranas adecuadas disponibles comercialmente, por ejemplo, de Merck Millipore bajo el nombre comercial Pellicon™ o de Sartorius bajo el nombre comercial Hydrosart™.
El procedimiento de la presente invención funciona convenientemente con membranas que tienen un peso molecular de corte (PMC) de ≤5 kDA, preferentemente, de ≤2,5 kDA, más preferentemente, de 0,5 a 2,5 kDA, incluso más preferentemente, de 1,8 a 2,2 kDA.
La filtración de flujo tangencial tiene lugar a una presión transmembranaria de 0,5 a 10,0 bar, más preferentemente, de 1,0 a 4 bar, incluso más preferentemente, de 1,5 a 2,0 bar.
El flujo, que describe el caudal por unidad de superficie, normalmente, se selecciona en el intervalo de 5 a 50 l/h*m2, preferentemente, en el intervalo de 9 a 15 l/h*m2
El contenido de oligonucleótidos en la solución tampón ácida se selecciona entre 1,0 mg/l y 100,0 mg/l, preferentemente, entre 5,0 mg/l y 50,0 mg/l.
En otro modo de realización de la invención, el procedimiento comprende además las siguientes etapas, que vienen después de la eliminación del grupo protector 5'hidroxi lábil al ácido en el extremo 5'-O-oligonucleótido del oligonucleótido:
• una etapa de neutralización que comprende la neutralización del retenido resultante con una base por medio de filtración de flujo tangencial; y
• una etapa de desalinización que comprende el lavado del retenido obtenido de la etapa de neutralización con agua o una mezcla de agua y un disolvente orgánico polar prótico o aprótico por medio de filtración de flujo tangencial; y
• opcionalmente, una liofilización del retenido obtenido de la etapa de desalinización.
Las bases adecuadas para la neutralización del retenido son bases inorgánicas acuosas tales como hidróxidos alcalinos acuosos como hidróxido de sodio acuoso o tampones alcalinos.
El lavado posterior del filtrado se puede realizar con agua o con una mezcla de agua y un disolvente orgánico polar prótico, seleccionado entre los alcoholes alifáticos primarios tales como metanol, etanol o i-propanol, preferentemente, etanol.
Típicamente, la etapa de desalinización tiene lugar con un gradiente, es decir, comenzando con una mezcla de agua y el disolvente orgánico polar prótico y terminando con agua.
Normalmente, la proporción de volumen de agua a disolvente orgánico polar prótico en la mezcla se encuentra entre 1:1 y 6:1, preferentemente, entre 4:1 y 3:2.
Los parámetros para la filtración de flujo tangencial durante la etapa de neutralización pero también para la de desalinización, es decir, la presión transmembranaria, el caudal de permeado y el tipo de membrana, típicamente, se corresponden con los parámetros descritos para la etapa anterior que comprende la eliminación del grupo protector 5'hidroxi lábil al ácido.
Después de la etapa de desalinización, el retenido obtenido se puede someter a una etapa de liofilización o a una purificación adicional tal como para la eliminación del disolvente residual del oligonucleótido.
En el modo de realización más preferente, el procedimiento se caracteriza por
• la eliminación del grupo protector 5'hidroxi lábil al ácido en el extremo 5'-O-oligonucleótido por medio de filtración de flujo tangencial con una solución tampón ácida
• una etapa de neutralización que comprende la neutralización del retenido resultante con una base por medio de filtración de flujo tangencial; y
• una etapa de desalinización que comprende el lavado del retenido obtenido de la etapa de neutralización con agua o una mezcla de agua y un disolvente orgánico polar prótico o aprótico por medio de filtración de flujo tangencial; y
• opcionalmente, una liofilización del retenido obtenido de la etapa de desalinización.
La etapa de desprotección, la etapa de neutralización y la etapa de desalinización son etapas secuenciales de la filtración de flujo tangencial, se pueden automatizar y llevar a cabo por el mismo aparato controlado por un programa informático, sin la intervención de ningún operario humano.
Como se explica anteriormente, el oligonucleótido después de su formación en la resina se escinde de la resina, normalmente, con amoníaco acuoso concentrado. Los grupos protectores en el fosfato y la base nucleotídica también se eliminan dentro de este procedimiento de escisión con la excepción del grupo protector 5'hidroxi lábil al ácido en el extremo 5'-O-oligonucleótido del oligonucleótido.
En un modo de realización preferente, el procedimiento comprende además la siguiente etapa, que viene antes de la eliminación del grupo protector 5'hidroxi lábil al ácido en el extremo 5'-O-oligonucleótido del oligonucleótido. Esta etapa anterior tiene como objetivo eliminar los truncados de menor longitud (no protegidos en 5') del oligonucleótido deseado. •
• Cromatografía de líquidos de alto rendimiento de fase inversa o cromatografía de intercambio aniónico del oligonucleótido en bruto obtenido después de la escisión de la resina y la desprotección del fosfato.
La cromatografía de intercambio aniónico se basa en la interacción competitiva de iones cargados de la solución de muestra con el medio tampón empleado. Se puede llevar a cabo con resinas de intercambio aniónico convencionales disponibles comercialmente, preferentemente, aquellas con grupo funcional de trimetilamonio. Estos materiales de fase se pueden obtener, por ejemplo, de GE Healthcare, Tosoh Bioscience, Bio-Rad o Merck. Se han logrado buenos resultados, en particular, con la resina de intercambio aniónico TSKgel Super Q-5PW (QAE), disponible de Tosoh Bioscience.
La cromatografía de fase inversa se puede llevar a cabo con materiales de fase tradicionales disponibles comercialmente, típicamente, materiales de fase C8 o C18, tales como sorbentes de gel de sílice modificado como fase estacionaria y disolventes orgánicos adecuados tales como acetonitrilo y, según sea aplicable, un tampón. Los materiales de fase de tipo gel de sílice modificado adecuados se pueden seleccionar de Kromasil™ C18, Kromasil™ C8, YMC Triart C18 e YMC Triart C8.
A modo de ilustración, el oligonucleótido se puede seleccionar del grupo que consiste en:
5'-(MeC*)T*T*(MeC *)t*t*c*t*a*t*c*t*a*(MeC *)g*c*A*T*-3'
en el que * representa puentes de fosforotioato; A,G,T y MeC (5-metilcitosina) son monómeros de nucleósidos de LNA y a,t,c,g son monómeros de nucleósidos de ADN.
Los compuestos descritos en el presente documento tienen las siguientes secuencias de bases nitrogenadas SEQ ID No. 1: cttctctatctacgcat'
Ejemplos
Abreviaturas:
ACN = acetonitrilo
Ac2O = anhídrido acético
VC = volumen de columna
DAC = ácido dicloroacético
DCM = diclorometano
DMT = 4,4'-dimetoxitritilo
EtOH = etanol
NaOAc = acetato de sodio
NMI = N-metil imidazol?
Ejemplo 1
a. Síntesis de5'-(MeC*)T*T*(MeC *)t*t*c*t*a*t*c*t*a*(MeC *)g*c*A*T*-3'
El compuesto del título se sintetizó como "DMT-on" con un ÁKTA oligopilot-100 en una escala de 1,9 mmol. Los resultados de la síntesis se dan en la tabla 1.
Tabla 1:Parámetros de síntesis para ÁKTA OP-100.
b. Escisión del soporte sólido y purificación por RP-HPLC
El material en bruto se escindió de la resina y se desprotegió disolviendo la resina seca en solución acuosa de amoníaco al 30 % (190 ml) y agitando a 65 °C durante 5 h. El soporte sólido se filtró y la solución acuosa se concentró por evaporación rotatoria hasta aproximadamente 60 ml. La solución se diluyó aún más con H<2>O hasta un volumen final de 100 ml y se añadió Na2CO3 sólido para obtener una solución 50 mM de Na2CO3(124 mg/ml de contenido de oligonucleótido en bruto). Una porción del material en bruto (80 ml) se purificó por RP-HPLC de acuerdo con los parámetros de la tabla 2.
Tabla 2:Parámetros de purificación por RP-HPLC.
c. Desprotección, desalinización y concentración de DMT por filtración de flujo tangencial
Las fracciones de la purificación de RP se agruparon para obtener 2,5 l (2 mg/ml de oligonucleótido) y se diluyeron con H<2>O hasta un volumen final de 4,2 l. El material se trató en una máquina de flujo cruzado ÁKTA equipada con dos casetes de corte de 2 kD. Hydrosart Sartocon (0,1 m2) para provocar la desprotección, concentración y filtración de flujo tangencial del DMT. Los parámetros del programa se describen en detalle en la tabla 3.
Tabla 3:Parámetros detallados para el programa de flujo cruzado ÁKTA.
La solución obtenida después del lavado se liofilizó para obtener 4,00 g delproducto del título(rendimiento total basado en la escala de síntesis del 42 %, pureza UV del 88 %).

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para la purificación de oligonucleótidos que comprende la eliminación de un grupo protector 5'hidroxi lábil al ácido en el extremo 5'-O-oligonucleótido del oligonucleótido por medio de filtración de flujo tangencial con una solución tampón ácida.
2. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que el grupo protector 5'hidroxi lábil al ácido se selecciona de 4,4'-dimetoxitritilo, 4-metoxitritilo, tritilo, 9-fenil-xanteno-9-, 9-(p-tolil)-xanteno-9-ilo o de terc-butildimetilsililo, preferentemente, de 4,4'-dimetoxitritilo.
3. Procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la solución tampón ácida tiene un pH en el intervalo de 2 a 6, preferentemente, de 2,5 a 4,0.
4. Procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el tampón ácido es una solución acuosa de un ácido débil y su base conjugada, que se acidifica con un ácido protónico para llevar el pH al intervalo deseado.
5. Procedimiento de la reivindicación 4, en el que el tampón ácido es un tampón de acetato y el ácido protónico es ácido clorhídrico.
6. Procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la solución tampón ácida contiene además un disolvente orgánico polar prótico o aprótico.
7. Procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la filtración de flujo tangencial tiene lugar a una presión transmembranaria de 0,5 a 10,0 bar.
8. Procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la filtración de flujo tangencial tiene lugar a una velocidad de flujo entre 5 y 50 l/h*m2
9. Procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la filtración de flujo tangencial tiene lugar con membranas que tienen un peso molecular de corte (PMC) de ≤5 kDA.
10. Procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el contenido de oligonucleótidos en la solución tampón ácida se selecciona entre 1,0 mg/l y 100,0 mg/l.
11. Procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el procedimiento comprende además las siguientes etapas, que vienen después de la eliminación del grupo protector 5'hidroxi lábil al ácido en el extremo 5'-O -oligonucleótido del oligonucleótido
a. una etapa de neutralización que comprende la neutralización del retenido resultante con una base por medio de filtración de flujo tangencial; y
b. una etapa de desalinización que comprende el lavado del retenido obtenido de la neutralización con agua o una mezcla de agua y un disolvente orgánico polar prótico o aprótico por medio de filtración de flujo tangencial; y c. opcionalmente, una liofilización del retenido obtenido de la etapa de desalinización.
12. Procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el procedimiento comprende además la siguiente etapa, que viene antes de la eliminación del grupo protector 5'hidroxi lábil al ácido en el extremo 5'-O -oligonucleótido del oligonucleótido
a. Cromatografía de líquidos de alto rendimiento de fase inversa o cromatografía de intercambio aniónico del oligonucleótido en bruto obtenido después de la escisión de la resina y la desprotección del fosfato.
13. Procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el oligonucleótido consiste en monómeros de nucleósidos de ADN, ARN o LNA opcionalmente modificados o combinaciones de los mismos y tiene una longitud de 10 a 40, preferentemente, de 10 a 25 nucleótidos.
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