BR112021003998A2 - processo para a purificação de oligonucleotídeos - Google Patents
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Abstract
PROCESSO PARA A PURIFICAÇÃO DE OLIGONUCLEOTÍDEOS. A invenção se refere a um novo processo para a purificação de oligonucleotídeos que compreende a remoção do grupo protetor 5'hidroxi lábil a ácido no terminal 5'-O-oligonucleotídeo do oligonucleotídeo por meio de filtração de fluxo tangencial com uma solução tampão ácida. O processo requer menos etapas e permite um maior grau de automação.
Description
[0001] A invenção se refere a um novo processo para a purificação de oligonucleotídeos que compreende a remoção do grupo protetor 5'hidroxi lábil a ácido no terminal 5'-O-oligonucleotídeo do oligonucleotídeo por meio de filtração de fluxo tangencial com uma solução tampão ácida.
[0002] O oligonucleotídeo que é tipicamente preparado via síntese em fase sólida, após sua clivagem da resina, ainda contém uma quantidade significativa de impurezas. Para monômeros padrão de comprimento de 15 a 20 meros, a pureza API está, na melhor das hipóteses, na faixa de 70 a 80%. Para monômeros quimicamente modificados ou para sequências mais longas, o conteúdo de API é normalmente ainda menor.
[0003] Métodos de separação seletiva foram desenvolvidos para preparar oligonucleotídeos de pureza alta que satisfaçam as especificações de uma aplicação terapêutica.
[0004] Em um método, o oligonucleotídeo, após a sua clivagem da resina, é deixado com o grupo protetor 5'hidroxi lábil a ácido no terminal 5'- O-oligonucleotídeo. A hidrofobicidade deste grupo permite a aplicação de técnicas cromatográficas eficazes para purificação.
[0005] É estratégia comum que o oligonucleotídeo bruto esteja passando pelas seguintes etapas (por exemplo Krotz et al, Organic Process Research & Development 2003, 7, 47-52): a) cromatografia de fase reversa; b) concentração e dessalinização; c) remoção do grupo protetor 5'hidroxi lábil a ácido em solução; e d) maior concentração e dessalinização.
[0006] Verificou-se que estes processos conhecidos requerem um tempo de operação substancial devido ao número de etapas de operação simples a) a d).
[0007] O objetivo da invenção era reduzir o número de etapas, atingir um maior grau de automação e com isso reduzir o tempo total de operação.
[0008] Verificou-se que o objetivo da invenção poderia ser alcançado com o novo processo para a purificação de oligonucleotídeos conforme descrito acima.
[0009] As seguintes definições são apresentadas para ilustrar e definir o significado e o escopo dos vários termos usados para descrever a invenção neste documento.
[00010] O termo grupo protetor 5'hidroxi lábil a ácido é definido como um grupo de proteção que é clivável com a ajuda de um ácido adequado e que tem um caráter hidrofóbico.
[00011] Grupos protetores 5'hidroxi lábil a ácido típicos são selecionados a partir de 4,4'-dimetoxitritil, 4-metoxitritil, tritil, 9-fenil-xanten-9-, 9- (p-tolil)-xanten-9-il ou de terc-butildimetilsilil, preferencialmente de 4,4'- dimetoxitritil, 4-metoxitritil ou tritil ou ainda mais preferencialmente de 4,4'- dimetoxitritil.
[00012] O termo oligonucleotídeo, conforme utilizado neste documento, é definido como é geralmente entendido pelo técnico no assunto como uma molécula compreendendo dois ou mais nucleotídeos ligados covalentemente. Para uso como um oligonucleotídeo terapeuticamente valioso, os oligonucleotídeos são tipicamente sintetizados como 10 a 40 nucleotídeos, preferencialmente 10 a 25 nucleotídeos de comprimento.
[00013] Os oligonucleotídeos podem consistir em monômeros de nucleosídeo de DNA, RNA ou LNA opcionalmente modificados ou combinações dos mesmos.
[00014] Os monômeros de nucleosídeo LNA são nucleosídeos modificados que compreendem um grupo ligante (referido como um birradical ou uma ponte) entre C2' e C4' do anel de açúcar ribose de um nucleotídeo.
Esses nucleosídeos também são denominados ácido nucleico em ponte ou ácido nucleico bicíclico (BNA) na literatura.
[00015] Opcionalmente modificado, conforme utilizado neste documento, se refere a nucleosídeos modificados em comparação com o nucleosídeo de DNA, RNA ou LNA equivalente pela introdução de uma ou mais modificações da fração de açúcar ou da fração de base do núcleo. Em uma modalidade preferida, o nucleosídeo modificado compreende uma fração de açúcar modificada e pode, por exemplo, compreender um ou mais nucleosídeos substituídos em 2' e/ou um ou mais nucleosídeos de LNA. O termo nucleosídeo modificado também pode ser usado neste documento de forma intercambiável com o termo "análogo de nucleosídeo" ou "unidades" modificadas ou "monômeros" modificados.
[00016] Os nucleosídeos de DNA, RNA ou LNA são, em regra, ligados por uma ligação internucleosídica fosfodiéster (P=O) e/ou fosforotioato (P=S) que acopla covalentemente dois nucleosídeos.
[00017] Consequentemente, em alguns oligonucleotídeos todas as ligações internucleosídicas podem consistir em um fosfodiéster (P=O), em outros oligonucleotídeos todas as ligações internucleosídicas podem consistir em um fosforotioato (P=S) ou ainda em outros oligonucleotídeos a sequência de ligações internucleosídicas variam e compreendem ambos fosfodiester (P=O) e internucleosídeo de fosforotioato (P=S).
[00018] As porções de nucleobase podem ser indicadas pelo código de letra para cada nucleobase correspondente, por exemplo, A, T, G, C ou U, em que cada letra pode incluir opcionalmente nucleobases modificadas de função equivalente. Por exemplo, nos oligonucleotídeos exemplificados, as frações de nucleobase são descritas com letras maiúsculas A, T, G e MeC (5-
metil citosina) para o nucleosídeo de LNA e com letras minúsculas a, t, g, c e MeC para nucleosídeos de DNA. Nucleobases modificadas incluem, mas não estão limitadas a, nucleobases carregando grupos protetores, como terc.butilfenoxiacetil, fenoxiacetil, benzoil, acetil, isobutiril ou dimetilformamidino (ver Wikipedia, Phosphoramidit-Synthese, https://de.wikipedia.org/wiki/Phosphoramidit-Synthese de 24 de março de 2016).
[00019] De preferência, o oligonucleotídeo consiste em monômeros de nucleosídeo de DNA, RNA ou LNA opcionalmente modificados ou combinações dos mesmos e tem 10 a 40, de preferência 10 a 25 nucleotídeos de comprimento.
[00020] Os princípios da síntese de oligonucleotídeos são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Síntese de oligonucleotídeos; Wikipedia, a enciclopédia livre; https://en.wikipedia.org/wiki/Oligonucleotide síntese, de 15 de março de 2016).
[00021] A síntese de oligonucleotídeos em larga escala hoje em dia é realizada automaticamente usando sintetizadores controlados por computador.
[00022] Como regra, a síntese de oligonucleotídeos é uma síntese de fase sólida, em que o oligonucleotídeo sendo montado é covalentemente ligado, por meio de seu grupo hidroxila terminal 3', a um material de suporte sólido e permanece ligado a ele durante todo o curso da montagem da cadeia.
Os suportes adequados são os suportes de poliestireno macroporoso disponíveis comercialmente, como o suporte Primer 5G da GE Healthcare ou o suporte NittoPhase®HL da Kinovate.
[00023] A síntese de oligonucleotídeos em princípio é uma adição gradual de resíduos de nucleotídeos ao terminal 5' da cadeia em crescimento até que a sequência desejada seja montada.
[00024] Como regra, cada adição é referida como um ciclo sintético e, em princípio, consiste nas reações químicas: a1) desbloquear o grupo hidroxila protegido no suporte sólido, a2) acoplar o primeiro nucleosídeo como fosforamidita ativada com o grupo hidroxila livre no suporte sólido, a3) oxidar ou sulfurar o respectivo nucleosídeo ligado em P para formar o respectivo fosfodiéster (P=O) ou o respectivo fosforotioato (P=S); a4) opcionalmente, tampar quaisquer grupos hidroxila que não reagiram no suporte sólido; a5) desbloquear o grupo hidroxila 5' do primeiro nucleosídeo ligado ao suporte sólido; a6) acoplar o segundo nucleosídeo como fosforamidita ativada para formar o respectivo dímero ligado em P; a7) oxidar ou sulfurar o respectivo dinucleosídeo ligado em P para formar o respectivo fosfodiéster (P=O) ou o respectivo fosforotioato (P=S); a8) opcionalmente, tampar quaisquer grupos hidroxila 5' que não reagiram; e a9) repetir as etapas anteriores de 5 a 8 até que a sequência desejada seja montada.
[00025] A clivagem subsequente da resina pode ser realizada com amônia aquosa concentrada. Os grupos protetores no fosfato e na base de nucleotídeo também são removidos neste procedimento de clivagem.
[00026] O oligonucleotídeo bruto após a clivagem é deixado com o grupo protetor 5'hidroxi lábil a ácido no terminal 5'-O-oligonucleotídeo.
[00027] O processo é caracterizado pela remoção do grupo protetor 5'hidroxi lábil a ácido, no terminal 5'-O-oligonucleotídeo do oligonucleotídeo por meio de filtração de fluxo tangencial com uma solução tampão ácida.
[00028] O termo grupo protetor 5'hidroxi lábil a ácido é conforme definido acima como um grupo de proteção que é clivável com a ajuda de um ácido adequado e que tem um caráter hidrofóbico.
[00029] Grupos protetores 5'hidroxi lábil a ácido típicos são selecionados a partir de 4,4'-dimetoxitritil, 4-metoxitritil, tritil, 9-fenil-xanten-9-, 9- (p-tolil)-xanten-9-il ou de terc- butildimetilsilil, preferencialmente de 4,4'- dimetoxitritil, 4-metoxitritil ou tritil ou ainda mais preferencialmente de 4,4'- dimetoxitritil (DMT).
[00030] Um tampão ácido é uma solução aquosa de um ácido fraco e sua base conjugada que é acidificada com um ácido protônico para trazer o pH para a faixa desejada.
[00031] Tampões ácidos típicos são tampões de acetato ou citrato que são compostos de ácido acético ou ácido cítrico como ácido fraco e seu sal de sódio como base conjugada.
[00032] O ácido protônico usado para acidificação do tampão ácido pode ser selecionado a partir de ácidos minerais aquosos, tais como ácido clorídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico ou ácido nítrico, mas geralmente a partir de ácido clorídrico aquoso.
[00033] O pH desejado varia idealmente entre 2 a 6, preferencialmente entre 2,5 a 4,0, ainda mais preferencialmente entre 2,8 e 3,5.
[00034] A solução tampão ácida também pode conter um solvente prótico polar ou aprótico polar orgânico em uma quantidade de 5% (V) a 50% (V), de preferência em uma quantidade de 20% (V) a 40% (V).
[00035] Os solventes próticos polares adequados são os álcoois alifáticos primários, tais como metanol, etanol ou i-propanol, de preferência etanol.
[00036] Os solventes apróticos polares adequados são acetonitrila, dimetilsulfóxido ou N-metil-2-pirrolidona, mas preferivelmente acetonitrila.
[00037] Em uma modalidade preferida, o tampão ácido é um tampão acetato que é acidificado com ácido clorídrico aquoso a um pH na faixa de 2,8. a 3,5 e subsequentemente diluída com etanol para formar uma solução tampão contendo 35% (V) a 45% (V) de etanol.
[00038] A concentração de acetato pode ser selecionada na faixa de 10 mmol/l a 1 mol/l, de preferência na faixa de 50 mmol/l a 250 mmol/l.
[00039] A filtração de fluxo tangencial é caracterizada pela alimentação ser passada através da membrana do filtro (tangencialmente) em pressão positiva em relação ao lado do permeado. Uma proporção do material que é menor do que o tamanho do poro da membrana passa através da membrana como permeado ou filtrado; todo o resto é retido no lado da alimentação da membrana como retentato.
[00040] As membranas adequadas estão disponíveis comercialmente, por exemplo na Merck Millipore sob o nome comercial PelliconTM ou na Sartorius sob o nome comercial HydrosartTM.
[00041] O processo da presente invenção funciona convenientemente com membranas tendo um peso molecular de corte (MWCO) de ≤ 5kDA, preferencialmente de ≤ 2,5 kDA, mais preferencialmente de 0,5 a 2,5 kDA, ainda mais preferencialmente de 1,8 a 2,2 kDA.
[00042] A filtração de fluxo tangencial ocorre a uma pressão transmembranar de 0,5 a 10,0 bar, mais preferencialmente de 1,0 a 4 bar, ainda mais preferencialmente de 1,5 a 2,0 bar.
[00043] O fluxo, que descreve a taxa de fluxo por unidade de área, é normalmente selecionado na faixa de 5 a 50 l/h*m 2, de preferência na faixa de 9 a 15 l/h*m2.
[00044] O teor de oligonucleotídeo na solução tampão ácida é selecionado entre 1,0 mg/l e 100,0 mg/l, de preferência entre 5,0 mg/l e 50,0 mg/l.
[00045] Em uma outra modalidade da invenção, o processo compreende ainda as seguintes etapas, que vêm após a remoção do grupo protetor 5'hidroxi lábil a ácido no terminal 5'-O-oligonucleotídeo do oligonucleotídeo: • uma etapa de neutralização que compreende a neutralização do retentato resultante com uma base via filtração de fluxo tangencial; e • uma etapa de dessalinização que compreende a lavagem do retentato obtido da etapa de neutralização com água ou uma mistura de água e um solvente orgânico prótico polar ou aprótico polar por filtração de fluxo tangencial; e • opcionalmente, uma liofilização do retentato obtido a partir da etapa de dessalinização.
[00046] As bases adequadas para a neutralização do retentato são bases inorgânicas aquosas, tais como hidróxidos alcalinos aquosos, como hidróxido de sódio aquoso ou tampões alcalinos.
[00047] A lavagem subsequente do filtrado pode ocorrer com água ou uma mistura de água e um solvente orgânico prótico polar, selecionado a partir dos álcoois alifáticos primários, tais como metanol, etanol ou i-propanol, preferencialmente etanol.
[00048] Normalmente, a etapa de dessalinização ocorre com um gradiente, ou seja, começando com uma mistura de água e o solvente orgânico prótico polar e terminando com água.
[00049] A proporção de volume de água para solvente orgânico prótico polar na mistura é geralmente entre 1:1 e 6:1, preferencialmente 4:1 a 3:2.
[00050] Os parâmetros para a filtração de fluxo tangencial durante a neutralização, mas também para a etapa de dessalinização, ou seja, a pressão da transmembrana, a taxa de fluxo de permeado e o tipo de membrana normalmente correspondem aos parâmetros descritos para a etapa anterior, que compreende a remoção do grupo protetor 5'hidroxi lábil a ácido.
[00051] Após a etapa de dessalinização, o retentato obtido pode ser submetido a uma etapa de liofilização ou a uma purificação adicional, tal como para a remoção de solvente residual do oligonucleotídeo.
[00052] Na modalidade mais preferida, o processo é caracterizado por: • a remoção do grupo protetor 5'hidroxi lábil a ácido no terminal 5'-O- oligonucleotídeo do oligonucleotídeo por meio de filtração de fluxo tangencial com uma solução tampão ácida; • uma etapa de neutralização que compreende a neutralização do retentato resultante com uma base via filtração de fluxo tangencial; e • uma etapa de dessalinização que compreende a lavagem do retentato obtido da etapa de neutralização com água ou uma mistura de água e um solvente orgânico prótico polar ou aprótico polar por filtração de fluxo tangencial; e • opcionalmente, uma liofilização do retentato obtido a partir da etapa de dessalinização.
[00053] A etapa de desproteção, a etapa de neutralização e a etapa de dessalinização são etapas de filtração de fluxo tangencial sequencial, podem ser automatizadas e realizadas pelo mesmo aparelho controlado por software, sem qualquer intervenção humana do operador.
[00054] Conforme descrito acima, o oligonucleotídeo após sua formação na resina é clivado da resina, geralmente com amônia aquosa concentrada. Os grupos protetores no fosfato e na base de nucleotídeo também são removidos dentro deste procedimento de clivagem com a exceção do grupo protetor 5'hidroxi lábil a ácido no terminal 5'-O- oligonucleotídeo do oligonucleotídeo.
[00055] Em uma modalidade preferida, o processo compreende ainda o seguinte passo que vem antes da remoção do grupo protetor 5'hidroxi lábil a ácido no terminal 5'-O-oligonucleotídeo do oligonucleotídeo. Esta etapa anterior visa remover truncados de comprimento mais curto (não protegidos em 5') do oligonucleotídeo desejado: • Cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa ou cromatografia de troca aniônica do oligonucleotídeo bruto obtido após a clivagem formam a resina e a desproteção de fosfato.
[00056] A cromatografia de troca aniônica é baseada na interação competitiva de íons carregados da solução de amostra com o meio tampão empregado. Pode ser realizada com resinas de troca aniônica convencionais, comercialmente disponíveis, de preferência aquelas com funcionalização com trimetilamônio. Esses materiais de fase podem ser obtidos, por exemplo, na GE Healthcare, Tosoh Bioscience, Bio-Rad ou Merck. Bons resultados particulares foram alcançados com a resina de troca aniônica TSKgel Super Q-5PW (QAE), disponível na Tosoh Bioscience.
[00057] A cromatografia de fase reversa pode ser realizada com materiais de fase tradicionais, comercialmente disponíveis, normalmente materiais de fase C8 ou C18, como sorventes de sílica gel modificados como fase estacionária e solventes orgânicos adequados, como acetonitrila e, se aplicável, um tampão. Os materiais de fase do tipo sílica gel modificados adequados podem ser selecionados a partir de Kromasil™C18, Kromasil™C8, YMC Triart C18 e YMC Triart C8.
[00058] A título de ilustração, o oligonucleotídeo pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em: 5'-(MeC*)T*T*( MeC *)t*t*c*t*a*t*c*t*a*( MeC *)g*c*A*T*-3' em que * representa pontes fosforotioato; A,G,T e MeC (5-metil citosina) são monômeros de nucleosídeo LNA e a,t,c,g são monômeros de nucleosídeo de DNA.
[00059] Os compostos divulgados neste documento têm as seguintes sequências de nucleobases: SEQ ID No. 1: cttctctatctacgcat'
EXEMPLOS ABREVIAÇÕES: ACN = acetonitrila Ac2O = anidrido de ácido acético CV = volume da coluna DAC = ácido dicloroacético DCM = diclorometano DMT = 4,4'-dimetoxitritil EtOH = etanol NaOAc = acetato de sódio NMI = N-metil imidazol? EXEMPLO 1 A. SINTESE DE 5'-(MEC*)T*T*( MEC *)T*T*C*T*A*T*C*T*A*( MEC *)G*C*A*T*-3'
[00060] O composto do título foi sintetizado como “DMT-on” utilizando um ÄKTA oligopilot-100 numa escala de 1,9 mmol. Os parâmetros de síntese são fornecidos na Tabela 1.
TABELA 1: PARÂMETROS DE SÍNTESE PARA ÄKTA OP-100.
Etapa do processo Parâmetro Ponto de Ajuste Concentração de amidita LNA-C 0,2 M DCM/ACN 1:1 Concentração de outras amiditas 0,2 M ACN Amitida Eq. para suporte 1,5 eq Acoplamento Ativador BTT
Etapa do processo Parâmetro Ponto de Ajuste
Conc. ativadora 0,3 M em ACN
% Volume de solução ativadora 65%
Tempo de reciclagem 10,0 min (LNA) 7,5 min (DNA)
Taxa de fluxo de lavagem do 24 mL/min acoplamento
Volume de lavagem de acoplamento 12 mL
Tiolação Reagente Hidreto de xantano
Concentração 0,1 M em ACN/piridina 1:1
Volume 2 CV
Reciclar ou fluir através Fluir através
Taxa de fluxo de pressão 17 mL/min
Volume de pressão 1 CV
Volume de lavagem ACN 8,5 mL
Coluna de Síntese Escala 1,9 mmol
Suporte NittoPhase UnyLinker
Peso de suporte 4,6 g
Suporte de carregamento 0,417 mmol/g
Etapa do processo Parâmetro Ponto de Ajuste
Diâmetro da Coluna 44 mm
Volume da Coluna 48 mL
Detrilação Reagente 3% DCA
Modo de controle UV
Monitoramento de UV 350 nm
Taxa de fluxo de detrilação 400 cm/h
Lavagem ACN 96 mL
Taxa de fluxo de lavagem ACN 7 bar
Lavagem ACN 96 mL
Taxa de fluxo de lavagem ACN 15 bar
Tampar Reagentes Cap A: 20% v/v NMI em ACN
Cap B: 30% v/v lutidina, 20% v/v Ac2O em ACN
Volume de carga 96 mL (1:1 Cap A/Cap B)
Taxa de fluxo de carga 120 mL/min
Tempo de contato 0,8 min
Volume de pressão/lavagem ACN 216 mL
Etapa do processo Parâmetro Ponto de Ajuste Volume de pressão/lavagem ACN 144 mL Lavagem Pós-Síntese Solvente de lavagem ACN Volume de lavagem 288 mL Tempo da lavagem 3 minutos Lavagem DEA pós- Solução 20% v/v em ACN síntese (na coluna e no sintetizador) Fluir através ou reciclar Fluir através Volume 235 mL Tempo de contato 30 minutos Lavagem de coluna Solvente de lavagem ACN final Volume de lavagem 288 mL Tempo da lavagem 3 minutos B. CLIVAGEM DO SUPORTE SÓLIDO E PURIFICAÇÃO RP-HPLC
[00061] O material bruto foi clivado da resina e desprotegido por dissolução da resina seca em solução aquosa de amônia a 30% (190 mL) e agitação a 65°C durante 5h. O suporte sólido foi removido por filtração e a solução aquosa foi concentrada por evaporação rotativa até aproximadamente 60 mL. A solução foi ainda mais diluída com H2O para um volume final de 100 ml e Na2CO 3 foi adicionada para obter uma solução 50 mM de Na 2CO3 (124 mg/mL de conteúdo de oligo bruto). Uma porção do material bruto (80 mL) foi purificada por RP-HPLC de acordo com o parâmetro na Tabela 2.
TABELA 2: PARÂMETROS DE PURIFICAÇÃO RP-HPLC Parâmetro de Processo Ponto de Ajuste Tipo de coluna Preparativo para YMC Triart C18 Temperatura da coluna 23°C Composição da solução de Teor total de oligo de 124 mg/mL em 50 mM de Na2CO3 alimentação Volume total da solução de 80 mL alimentação Volume por injeção 4 mL Solvente de eluição A 50 mM de Na2CO3 Solvente de eluição B ACN Gradiente Tempo (min) A (%) B (%) 0 95 5 3 85 15 15 75 25 17 75 25 17,10 10 90 20 10 90 20,10 95 5
Tamanho da fração 48 mL C. DESPROTEÇÃO, DESSALINIZAÇÃO E CONCENTRAÇÃO DE DMT POR FILTRAÇÃO DE
[00062] As frações de purificação por RP foram reunidas para se obter 2,5 L (2 mg/mL de oligo) e foram diluídas com H 2O para um volume final de 4,2 L. O material foi tratado com uma máquina de ÄKTA crossflow equipada com dois 2 kD cassetes Hydrosart Sartocon (0,1 m2) para desencadear a desproteção, concentração e filtração de fluxo tangencial de DMT. Os parâmetros do programa são descritos em detalhes na Tabela 3.
TABELA 3: PARÂMETROS DETALHADOS PARA O PROGRAMA ÄKTA CROSSFLOW Etapa do processo Detalhes da Etapa
1. Concentração 4,2 L concentrado para 0,2 L
2. Diluição de EtOH Diluir com 80 mL de EtOH
3. Desprotetação Filtração de fluxo tangencial com 5,5 L de tampão de desproteção [NaOAc 100 mM, acidificado a pH 3 com HCl + 40% EtOH] Teor de oligonucleotídeo: 18mg/l Pressão da transmembrana: 1,5 bar Fluxo permeado: 20 ml/min Fluxo: 12L/h*m2 Tempo total: 4,8 horas
4. Neutralização Filtração de fluxo tangencial com 130 mL de 0,1 M NaOH Pressão da transmembrana: 1,5 bar Fluxo do permeado: 20 ml/min.
Fluxo: 12L/h*m2 Tempo total: 6 minutos
5. Dessalinização Filtração tangencial de fluxo com 3,0 L de H2O/EtOH (4:1) Tempo total: 2,4 horas (H2O/EtOH 4/1) Pressão da transmembrana: 1,5 bar Fluxo permeado de 20 mL/min.
[00063] A solução obtida após o enxágue foi liofilizada para obter 4,00 g do produto do título (rendimento global com base na escala de síntese 42%, pureza UV 88%).
Claims (13)
1. PROCESSO PARA A PURIFICAÇÃO DE OLIGONUCLEOTÍDEOS, caracterizado por compreender a remoção de um grupo protetor 5'hidroxi lábil a ácido no terminal 5'-O-oligonucleotídeo do oligonucleotídeo por meio de filtração de fluxo tangencial com uma solução tampão ácida.
2. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo grupo protetor 5'hidroxi lábil a ácido ser selecionado a partir de 4,4'-dimetoxitritil, 4-metoxitritil, tritil, 9-fenil-xanten-9-, 9-(p-tolil)-xanten-9-il ou de terc-butildimetilsilil, de preferência de 4,4'-dimetoxitritil.
3. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela solução tampão ácida ter um pH na faixa de 2 a 6, de preferência de 2,5 a 4,0.
4. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo tampão ácido ser uma solução aquosa de um ácido fraco e sua base conjugada que é acidificada com um ácido protônico para trazer o pH para a faixa desejada.
5. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo tampão ácido ser um tampão de acetato e o ácido protônico ser o ácido clorídrico.
6. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela solução tampão ácida conter adicionalmente um solvente orgânico aprótico polar ou prótico polar.
7. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela filtração de fluxo tangencial ocorrer a uma pressão transmembrana de 0,5 a 10,0 bar.
8. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pela filtração de fluxo tangencial ocorrer a uma taxa de fluxo entre 5 e 50 l/h*m2.
9. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pela filtração de fluxo tangencial ocorrer com membranas com um peso molecular de corte (MWCO) de ≤ 5 kDA.
10. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo teor de oligonucleotídeo na solução tampão ácida ser selecionado entre 1,0 mg/l e 100,0 mg/l.
11. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por compreender ainda as seguintes etapas, que vêm após a remoção do grupo protetor 5'hidroxi lábil a ácido no terminal 5'-O-oligonucleotídeo do oligonucleotídeo: a. uma etapa de neutralização que compreende a neutralização do filtrado resultante com uma base via filtração de fluxo tangencial; e b. uma etapa de dessalinização que compreende a lavagem do filtrado obtido da neutralização com água ou uma mistura de água e uma etapa de solvente orgânico aprótico polar ou prótico polar via filtração de fluxo tangencial; e c. opcionalmente, uma liofilização do filtrado obtido a partir da etapa de dessalinização.
12. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por compreender ainda a seguinte etapa, que vêm antes da remoção do grupo protetor 5'hidroxi lábil a ácido no terminal 5'-O-oligonucleotídeo do oligonucleotídeo: a. Cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa ou cromatografia de troca aniônica do oligonucleotídeo bruto obtido após a clivagem formam a resina e a desproteção de fosfato.
13. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo oligonucleotídeo consistir em monômeros de nucleosídeo de DNA, RNA ou LNA opcionalmente modificados ou combinações dos mesmos e tem 10 a 40, de preferência 10 a 25 nucleotídeos de comprimento.
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