JP7419354B2 - オリゴヌクレオチドの精製プロセス - Google Patents
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Description
a)逆相クロマトグラフィー
b)濃縮及び脱塩、
c)溶液中での酸不安定性5’ヒドロキシ保護基の除去、並びに
d)更なる濃縮及び脱塩。
[本発明1001]
酸性緩衝溶液を用いるタンジェンシャルフローフィルトレーションにより、オリゴヌクレオチドの5’-O-オリゴヌクレオチド末端にて、酸不安定性5’ヒドロキシ保護基を除去することを含む、オリゴヌクレオチドの精製プロセス。
[本発明1002]
前記酸不安定性5’ヒドロキシ保護基が4,4’-ジメトキシトリチル、4-メトキシトリチル、トリチル、9-フェニル-キサンテン-9-、9-(p-トリル)-キサンテン-9-イル、又はtert-ブチルジメチルシリル、好ましくは4,4’-ジメトキシトリチルから選択される、本発明1001のプロセス。
[本発明1003]
前記酸性緩衝溶液が、2~6、好ましくは2.5~4.0の範囲のpHを有する、本発明1001~1003のいずれかのプロセス。
[本発明1004]
前記酸性緩衝液が、プロトン酸で酸性化されてpHを所望の範囲にされた、弱酸とその共役塩基の水溶液である、本発明1001~1004のいずれかのプロセス。
[本発明1005]
前記酸性緩衝液が酢酸緩衝液であり、前記プロトン酸が塩酸である、本発明1004のプロセス。
[本発明1006]
前記酸性緩衝溶液が更に、極性プロトン性又は極性非プロトン性有機溶媒を含有する、本発明1001~1005のいずれかのプロセス。
[本発明1007]
前記タンジェンシャルフローフィルトレーションが0.5~10.0バールの膜貫通圧により行われる、本発明1001~1006のいずれかのプロセス。
[本発明1008]
前記タンジェンシャルフローフィルトレーションが、5~50L/h*m 2 のフラックス速度により行われる、本発明1001~1007のいずれかのプロセス。
[本発明1009]
前記タンジェンシャルフローフィルトレーションが、5kDA以下の分子量カットオフ(MWCO)を有する膜により行われる、本発明1001~1008のいずれかのプロセス。
[本発明1010]
前記酸性緩衝溶液中のオリゴヌクレオチド含量が、1.0mg/L~100.0mg/Lで選択される、本発明1001~1009のいずれかのプロセス。
[本発明1011]
前記プロセスが以下のステップを更に含み、これらは、前記オリゴヌクレオチドの5’-O-オリゴヌクレオチド末端にて、前記酸不安定性5’ヒドロキシ保護基を除去した後に行われる、本発明1001~1010のいずれかのプロセス:
a.得られる濾液を、タンジェンシャルフローフィルトレーションにより塩基を用いて中和することを含む中和ステップと、
b.前記中和で得た前記濾液を、水、又は、水と極性プロトン性若しくは極性非プロトン性有機溶媒との混合物により、タンジェンシャルフローフィルトレーションによって洗浄することを含む脱塩ステップと、
c.任意に、前記脱塩ステップから得た前記濾液の凍結乾燥。
[本発明1012]
前記プロセスが以下のステップを更に含み、これらは、前記オリゴヌクレオチドの5’-O-オリゴヌクレオチド末端にて、前記酸不安定性5’ヒドロキシ保護基を除去する前に行われる、本発明1001~1011のいずれかのプロセス:
a.樹脂からの開裂およびホスフェート脱保護後に得た粗オリゴヌクレオチドの逆相高速液体クロマトグラフィー又はアニオン交換クロマトグラフィー。
[本発明1013]
前記オリゴヌクレオチドが、任意に修飾されたDNA、RNA、若しくはLNAヌクレオシドモノマー、又はこれらの組み合わせで構成され、10~40、好ましくは10~25ヌクレオチド長である、本発明1001~1012のいずれかのプロセス。
a1)固体支持体上で、保護ヒドロキシル基を脱ブロックすることと、
a2)固体支持体上で、第1のヌクレオシドを活性化ホスホラミダイトとして、遊離ヒドロキシル基と結合させることと、
a3)対応するP結合ヌクレオシドを酸化又は硫化して、対応するホスホジエステル(P=O)又は対応するホスホロチオエート(P=S)を形成することと、
a4)任意に、あらゆる未反応ヒドロキシル基を固体支持体上でキャップすることと、
a5)固体支持体に結合した第1のヌクレオシドの5’ヒドロキシル基を脱ブロックすることと、
a6)第2のヌクレオシドを活性化ホスホラミダイトとして結合させ、対応するP結合二量体を形成することと、
a7)対応するP結合ジヌクレオシドを酸化又は硫化して、対応するホスホジエステル(P=O)又は対応するホスホロチオエート(P=S)を形成することと、
a8)任意に、あらゆる未反応5’ヒドロキシル基をキャップすることと、
a9)前ステップa5~a8を、所望の配列が組み立てられるまで繰り返すことと、の化学反応で構成される。
得られる濃縮物を、タンジェンシャルフローフィルトレーションにより塩基を用いて中和することを含む中和ステップと、
中和ステップで得た濃縮物を、水、又は、水と極性プロトン性若しくは極性非プロトン性有機溶媒との混合物により、タンジェンシャルフローフィルトレーションによって洗浄することを含む脱塩ステップと、
任意で、脱塩ステップから得た濃縮物を凍結乾燥すること。
酸性緩衝溶液を用いるタンジェンシャルフローフィルトレーションにより、オリゴヌクレオチドの5’-O-オリゴヌクレオチド末端にて、酸不安定性5’ヒドロキシ保護基を除去することと、
得られる濃縮物を、タンジェンシャルフローフィルトレーションにより塩基を用いて中和することを含む中和ステップと、
中和ステップで得た濃縮物を、水、又は、水と極性プロトン性若しくは極性非プロトン性有機溶媒との混合物により、タンジェンシャルフローフィルトレーションによって洗浄することを含む脱塩ステップと、
任意で、脱塩ステップから得た濃縮物を凍結乾燥すること。
(式中、*はホスホロチオエートブリッジを示し、A、G、T、及びMeC(5-メチルシトシン)はLNAヌクレオシドモノマーであり、a、t、c、gはDNAヌクレオシドモノマーである)。
配列番号1:cttctctatctacgcat’
ACN=アセトニトリル
Ac2O=酢酸無水物
CV=カラム体積
DAC=ジクロロ酢酸
DCM=ジクロロメタン
DMT=4,4’-ジメトキシトリチル
EtOH=エタノール
NaOAc=酢酸ナトリウム
NMI=N-メチルイミダゾール?
粗物質を樹脂から開裂させ、乾燥樹脂を30%アンモニア溶液(190mL)に溶解して、65℃で5時間撹拌することにより、脱保護した。固体支持体を濾別し、水溶液を回転蒸発により約60mLまで濃縮した。溶液をH2Oで更に希釈して100mLの最終体積にし、固体Na2CO3を添加して、50mMのNa2CO3溶液(124mg/mLの粗オリゴ含量)を得た。粗物質の一部(80mL)を、表2のパラメーターに従い、RP-HPLCで精製した。
RP精製からの画分をプールして2.5L(2mg/mLのオリゴ)を得、H2Oで希釈して、4.2Lの最終体積にした。DMT脱保護、濃縮、及びタンジェンシャルフローフィルトレーションをトリガーするために、材料を、2つの2kDカットオフHydrosart Sartoconカセット(0.1m2)を装着したAKTAクロスフローマシンで処理した。プログラムパラメーターを、表3に詳細に記載する。
Claims (15)
- 酸性緩衝溶液を用いるタンジェンシャルフローフィルトレーションにより、オリゴヌクレオチドの5’-O-オリゴヌクレオチド末端にて、酸不安定性5’ヒドロキシ保護基を除去することを含む、オリゴヌクレオチドの精製プロセスであって、
前記酸不安定性5’ヒドロキシ保護基が、4,4’-ジメトキシトリチル、4-メトキシトリチル、トリチル、9-フェニル-キサンテン-9-、9-(p-トリル)-キサンテン-9-イル、又はtert-ブチルジメチルシリルから選択される、前記プロセス。 - 前記酸不安定性5’ヒドロキシ保護基が、4,4’-ジメトキシトリチルである、請求項1に記載のプロセス。
- 前記酸性緩衝溶液が、2~6の範囲のpHを有する、請求項1または2に記載のプロセス。
- 前記酸性緩衝溶液が、2.5~4.0の範囲のpHを有する、請求項3に記載のプロセス。
- 前記酸性緩衝液が、プロトン酸で酸性化されてpHを所望の範囲にされた、弱酸とその共役塩基の水溶液である、請求項1~4のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記酸性緩衝液が酢酸緩衝液であり、前記プロトン酸が塩酸である、請求項5に記載のプロセス。
- 前記酸性緩衝溶液が更に、極性プロトン性又は極性非プロトン性有機溶媒を含有する、請求項1~6のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記タンジェンシャルフローフィルトレーションが0.5~10.0バールの膜貫通圧により行われる、請求項1~7のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記タンジェンシャルフローフィルトレーションが、5~50L/h*m2のフラックス速度により行われる、請求項1~8のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記タンジェンシャルフローフィルトレーションが、5kDA以下の分子量カットオフ(MWCO)を有する膜により行われる、請求項1~9のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記酸性緩衝溶液中のオリゴヌクレオチド含量が、1.0mg/L~100.0mg/Lで選択される、請求項1~10のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記プロセスが以下のステップを更に含み、これらは、前記オリゴヌクレオチドの5’-O-オリゴヌクレオチド末端にて、前記酸不安定性5’ヒドロキシ保護基を除去した後に行われる、請求項1~11のいずれか一項に記載のプロセス:
a.得られる濾液を、タンジェンシャルフローフィルトレーションにより塩基を用いて中和することを含む中和ステップと、
b.前記中和で得た前記濾液を、水、又は、水と極性プロトン性若しくは極性非プロトン性有機溶媒との混合物により、タンジェンシャルフローフィルトレーションによって洗浄することを含む脱塩ステップと、
c.任意に、前記脱塩ステップから得た前記濾液の凍結乾燥。 - 前記プロセスが以下のステップを更に含み、これらは、前記オリゴヌクレオチドの5’-O-オリゴヌクレオチド末端にて、前記酸不安定性5’ヒドロキシ保護基を除去する前に行われる、請求項1~12のいずれか一項に記載のプロセス:
a.樹脂からの開裂およびホスフェート脱保護後に得た粗オリゴヌクレオチドの逆相高速液体クロマトグラフィー又はアニオン交換クロマトグラフィー。 - 前記オリゴヌクレオチドが、任意に修飾されたDNA、RNA、若しくはLNAヌクレオシドモノマー、又はこれらの組み合わせで構成され、10~40ヌクレオチド長である、請求項1~13のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記オリゴヌクレオチドが、10~25ヌクレオチド長である、請求項14に記載のプロセス。
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