JP7419354B2 - オリゴヌクレオチドの精製プロセス - Google Patents
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Description
本発明は、酸性緩衝溶液を用いるタンジェンシャルフローフィルトレーションにより、オリゴヌクレオチドの５’－Ｏ－オリゴヌクレオチド末端にて、酸不安定性５’ヒドロキシ保護基を除去することを含む、オリゴヌクレオチドを精製するための新規のプロセスに関する。
樹脂からの開裂の後、典型的には固相合成により調製されるオリゴヌクレオチドは、依然として相当量の不純物を含有している。１５～２０量体長の標準的なモノマーに関して、ＡＰＩ純度は、せいぜい７０～８０％の範囲内である。化学修飾モノマー、又はより長い配列に関して、ＡＰＩ含量は典型的には、更に少ない。
治療用途の規格を満たす、高純度のオリゴヌクレオチドを調製するために、選択的分離法が開発されている。
一方法において、オリゴヌクレオチドは、樹脂からの開裂後、５’－Ｏ－オリゴヌクレオチド末端にて、酸不安定性５’ヒドロキシ保護基と共に残る。この基の疎水性により、精製のための効果的なクロマトグラフィー技術の適用が可能となる。
粗オリゴヌクレオチドが以下のステップを経るのが、一般的な方法である（例えば、Ｋｒｏｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００３，７，４７－５２（非特許文献1））
ａ）逆相クロマトグラフィー
ｂ）濃縮及び脱塩、
ｃ）溶液中での酸不安定性５’ヒドロキシ保護基の除去、並びに
ｄ）更なる濃縮及び脱塩。
ａ）逆相クロマトグラフィー
ｂ）濃縮及び脱塩、
ｃ）溶液中での酸不安定性５’ヒドロキシ保護基の除去、並びに
ｄ）更なる濃縮及び脱塩。
この既知のプロセスは、単回操作ステップａ）～ｄ）の数が原因で、相当の操作時間が必要であることが発見された。
Ｋｒｏｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００３，７，４７－５２
本発明の目的は、ステップの数を減らし、より高度な自動化を達成し、これにより全体的な操作時間を減らすことであった。
本発明の目的は、前述で概略を述べた、オリゴヌクレオチドを精製するための新規のプロセスにより達成可能であることが発見された。
[本発明1001]
酸性緩衝溶液を用いるタンジェンシャルフローフィルトレーションにより、オリゴヌクレオチドの5’－Ｏ－オリゴヌクレオチド末端にて、酸不安定性5’ヒドロキシ保護基を除去することを含む、オリゴヌクレオチドの精製プロセス。
[本発明1002]
前記酸不安定性5’ヒドロキシ保護基が4，4’－ジメトキシトリチル、4－メトキシトリチル、トリチル、9－フェニル－キサンテン－9－、9－（ｐ－トリル）－キサンテン－9－イル、又はｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル、好ましくは4，4’－ジメトキシトリチルから選択される、本発明1001のプロセス。
[本発明1003]
前記酸性緩衝溶液が、2～6、好ましくは2．5～4．0の範囲のｐＨを有する、本発明1001～1003のいずれかのプロセス。
[本発明1004]
前記酸性緩衝液が、プロトン酸で酸性化されてｐＨを所望の範囲にされた、弱酸とその共役塩基の水溶液である、本発明1001～1004のいずれかのプロセス。
[本発明1005]
前記酸性緩衝液が酢酸緩衝液であり、前記プロトン酸が塩酸である、本発明1004のプロセス。
[本発明1006]
前記酸性緩衝溶液が更に、極性プロトン性又は極性非プロトン性有機溶媒を含有する、本発明1001～1005のいずれかのプロセス。
[本発明1007]
前記タンジェンシャルフローフィルトレーションが0．5～10．0バールの膜貫通圧により行われる、本発明1001～1006のいずれかのプロセス。
[本発明1008]
前記タンジェンシャルフローフィルトレーションが、5～50Ｌ／ｈ＊ｍ 2 のフラックス速度により行われる、本発明1001～1007のいずれかのプロセス。
[本発明1009]
前記タンジェンシャルフローフィルトレーションが、5ｋＤＡ以下の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する膜により行われる、本発明1001～1008のいずれかのプロセス。
[本発明1010]
前記酸性緩衝溶液中のオリゴヌクレオチド含量が、1．0ｍｇ／Ｌ～100．0ｍｇ／Ｌで選択される、本発明1001～1009のいずれかのプロセス。
[本発明1011]
前記プロセスが以下のステップを更に含み、これらは、前記オリゴヌクレオチドの5’－Ｏ－オリゴヌクレオチド末端にて、前記酸不安定性5’ヒドロキシ保護基を除去した後に行われる、本発明1001～1010のいずれかのプロセス：
ａ．得られる濾液を、タンジェンシャルフローフィルトレーションにより塩基を用いて中和することを含む中和ステップと、
ｂ．前記中和で得た前記濾液を、水、又は、水と極性プロトン性若しくは極性非プロトン性有機溶媒との混合物により、タンジェンシャルフローフィルトレーションによって洗浄することを含む脱塩ステップと、
ｃ．任意に、前記脱塩ステップから得た前記濾液の凍結乾燥。
[本発明1012]
前記プロセスが以下のステップを更に含み、これらは、前記オリゴヌクレオチドの5’－Ｏ－オリゴヌクレオチド末端にて、前記酸不安定性5’ヒドロキシ保護基を除去する前に行われる、本発明1001～1011のいずれかのプロセス：
ａ．樹脂からの開裂およびホスフェート脱保護後に得た粗オリゴヌクレオチドの逆相高速液体クロマトグラフィー又はアニオン交換クロマトグラフィー。
[本発明1013]
前記オリゴヌクレオチドが、任意に修飾されたＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくはＬＮＡヌクレオシドモノマー、又はこれらの組み合わせで構成され、10～40、好ましくは10～25ヌクレオチド長である、本発明1001～1012のいずれかのプロセス。
[本発明1001]
酸性緩衝溶液を用いるタンジェンシャルフローフィルトレーションにより、オリゴヌクレオチドの5’－Ｏ－オリゴヌクレオチド末端にて、酸不安定性5’ヒドロキシ保護基を除去することを含む、オリゴヌクレオチドの精製プロセス。
[本発明1002]
前記酸不安定性5’ヒドロキシ保護基が4，4’－ジメトキシトリチル、4－メトキシトリチル、トリチル、9－フェニル－キサンテン－9－、9－（ｐ－トリル）－キサンテン－9－イル、又はｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル、好ましくは4，4’－ジメトキシトリチルから選択される、本発明1001のプロセス。
[本発明1003]
前記酸性緩衝溶液が、2～6、好ましくは2．5～4．0の範囲のｐＨを有する、本発明1001～1003のいずれかのプロセス。
[本発明1004]
前記酸性緩衝液が、プロトン酸で酸性化されてｐＨを所望の範囲にされた、弱酸とその共役塩基の水溶液である、本発明1001～1004のいずれかのプロセス。
[本発明1005]
前記酸性緩衝液が酢酸緩衝液であり、前記プロトン酸が塩酸である、本発明1004のプロセス。
[本発明1006]
前記酸性緩衝溶液が更に、極性プロトン性又は極性非プロトン性有機溶媒を含有する、本発明1001～1005のいずれかのプロセス。
[本発明1007]
前記タンジェンシャルフローフィルトレーションが0．5～10．0バールの膜貫通圧により行われる、本発明1001～1006のいずれかのプロセス。
[本発明1008]
前記タンジェンシャルフローフィルトレーションが、5～50Ｌ／ｈ＊ｍ 2 のフラックス速度により行われる、本発明1001～1007のいずれかのプロセス。
[本発明1009]
前記タンジェンシャルフローフィルトレーションが、5ｋＤＡ以下の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する膜により行われる、本発明1001～1008のいずれかのプロセス。
[本発明1010]
前記酸性緩衝溶液中のオリゴヌクレオチド含量が、1．0ｍｇ／Ｌ～100．0ｍｇ／Ｌで選択される、本発明1001～1009のいずれかのプロセス。
[本発明1011]
前記プロセスが以下のステップを更に含み、これらは、前記オリゴヌクレオチドの5’－Ｏ－オリゴヌクレオチド末端にて、前記酸不安定性5’ヒドロキシ保護基を除去した後に行われる、本発明1001～1010のいずれかのプロセス：
ａ．得られる濾液を、タンジェンシャルフローフィルトレーションにより塩基を用いて中和することを含む中和ステップと、
ｂ．前記中和で得た前記濾液を、水、又は、水と極性プロトン性若しくは極性非プロトン性有機溶媒との混合物により、タンジェンシャルフローフィルトレーションによって洗浄することを含む脱塩ステップと、
ｃ．任意に、前記脱塩ステップから得た前記濾液の凍結乾燥。
[本発明1012]
前記プロセスが以下のステップを更に含み、これらは、前記オリゴヌクレオチドの5’－Ｏ－オリゴヌクレオチド末端にて、前記酸不安定性5’ヒドロキシ保護基を除去する前に行われる、本発明1001～1011のいずれかのプロセス：
ａ．樹脂からの開裂およびホスフェート脱保護後に得た粗オリゴヌクレオチドの逆相高速液体クロマトグラフィー又はアニオン交換クロマトグラフィー。
[本発明1013]
前記オリゴヌクレオチドが、任意に修飾されたＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくはＬＮＡヌクレオシドモノマー、又はこれらの組み合わせで構成され、10～40、好ましくは10～25ヌクレオチド長である、本発明1001～1012のいずれかのプロセス。
本明細書を説明するために使用する様々な用語の意味及び範囲を示し、画定するために、以下の定義を説明する。
用語「酸不安定性５’ヒドロキシ保護基」は、好適な酸の補助により開裂可能であり、疎水性を有する保護基として定義される。
典型的な酸不安定性５’ヒドロキシ保護基は、４，４’－ジメトキシトリチル、４－メトキシトリチル、トリチル、９－フェニル－キサンテン－９－、９－（ｐ－トリル）－キサンテン－９－イル、若しくはｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルから選択され、好ましくは４，４’－ジメトキシトリチル、４－メトキシトリチル、若しくはトリチルから選択され、又は更により好ましくは４，４’－ジメトキシトリチルから選択される。
本明細書で使用する場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、当業者により一般的に理解されるように、２つ以上の共有結合ヌクレオチドを含む分子として定義される。治療に有益なオリゴヌクレオチドとして使用するために、オリゴヌクレオチドは典型的には、１０～４０ヌクレオチド、好ましくは１０～２５ヌクレオチド長として合成される。
オリゴヌクレオチドは、任意に修飾されたＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくはＬＮＡヌクレオシドモノマー、又はこれらの組み合わせから構成されることができる。
ＬＮＡヌクレオシドモノマーとは、ヌクレオチドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’間に、リンカー基（ビラジカル又はブリッジと呼ばれる）を含む、修飾ヌクレオシドである。これらのヌクレオシドは、文献にて架橋核酸又は二環式核酸（ＢＮＡ）とも称されている。
本明細書で使用する場合、「任意に修飾された」とは、糖部分又はヌクレオ塩基部分に１つ以上の修飾を導入することにより、等価なＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＬＮＡヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを意味する。好ましい実施形態では、修飾ヌクレオシドは、修飾された糖部分を含み、例えば、１つ以上の２’置換ヌクレオシド及び／又は１つ以上のＬＮＡヌクレオシドを含むことができる。用語「修飾ヌクレオシド」はまた、用語「ヌクレオシド類似体」又は修飾「単位」又は修飾「モノマー」と互換的に使用されてもよい。
ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＬＮＡヌクレオシドは一般に、２つのヌクレオシドを互いに共有結合させる、ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）、及び／又はホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）ヌクレオシド間結合により結合されている。
したがって、いくつかのオリゴヌクレオチドにおいて、全てのヌクレオシド間結合がホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）から構成され得、他のオリゴヌクレオチドにおいて、全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）から構成され得、又は、更に他のオリゴヌクレオチドにおいて、ヌクレオシド間結合の配列は異なり、ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）及びホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）インターヌクレオシドの両方を含む。
核酸塩基部分は、各々の対応する核酸塩基の文字コード、例えばＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ又はＵにより示され、各文字は、等価な機能の修飾核酸塩基を場合により含み得る。例えば、例示したオリゴヌクレオチドにおいて、ヌクレオ塩基部分は、ＬＮＡヌクレオシドに関しては大文字Ａ、Ｔ、Ｇ、及びＭｅＣ（５－メチルシトシン）で、ＤＮＡヌクレオシドに関しては小文字ａ、ｔ、ｇ、ｃ、及びＭｅＣで、記載される。修飾ヌクレオ塩基としては、ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル、フェノキシアセチル、ベンゾイル、アセチル、イソブチリル、又はジメチルホルムアミジノなどの、保護基を有するヌクレオ塩基が挙げられるが、これらに限定されない（Ｗｉｋｉｐｅｄｉａ，Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔ－Ｓｙｎｔｈｅｓｅ，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｅ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔ－Ｓｙｎｔｈｅｓｅ ｏｆ Ｍａｒｃｈ ２４，２０１６を参照のこと）。
好ましくは、オリゴヌクレオチドは、任意に修飾されたＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくはＬＮＡヌクレオシドモノマー、又はこれらの組み合わせで構成され、１０～４０、好ましくは１０～２５ヌクレオチド長である。
オリゴヌクレオチド合成の原理は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｗｉｋｉｐｅｄｉａ，ｔｈｅ ｆｒｅｅ ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ；ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｏｆ Ｍａｒｃｈ １５，２０１６を参照のこと）。
より大規模なオリゴヌクレオチド合成は今日、コンピューターで制御する合成装置を用いて自動で実施される。
一般に、オリゴヌクレオチド合成は固相合成であり、組み立てられているオリゴヌクレオチドが、その３’末端ヒドロキシ基を介して、固体支持材料に共有結合し、連鎖組み立ての過程全体にわたり、結合したままである。好適な支持体は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＰｒｉｍｅｒ支持体５Ｇ、又はＫｉｎｏｖａｔｅ製のＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ支持体などの、市販されているマクロ孔質ポリスチレン支持体である。
オリゴヌクレオチド合成は原則として、ヌクレオチド残基を、所望の配列が組み立てられるまで、生長鎖の５’末端に段階的に付加するものである。
一般に、各付加は合成サイクルと呼ばれ、原則として
ａ１）固体支持体上で、保護ヒドロキシル基を脱ブロックすることと、
ａ２）固体支持体上で、第１のヌクレオシドを活性化ホスホラミダイトとして、遊離ヒドロキシル基と結合させることと、
ａ３）対応するＰ結合ヌクレオシドを酸化又は硫化して、対応するホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）又は対応するホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）を形成することと、
ａ４）任意に、あらゆる未反応ヒドロキシル基を固体支持体上でキャップすることと、
ａ５）固体支持体に結合した第１のヌクレオシドの５’ヒドロキシル基を脱ブロックすることと、
ａ６）第２のヌクレオシドを活性化ホスホラミダイトとして結合させ、対応するＰ結合二量体を形成することと、
ａ７）対応するＰ結合ジヌクレオシドを酸化又は硫化して、対応するホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）又は対応するホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）を形成することと、
ａ８）任意に、あらゆる未反応５’ヒドロキシル基をキャップすることと、
ａ９）前ステップａ５～ａ８を、所望の配列が組み立てられるまで繰り返すことと、の化学反応で構成される。
ａ１）固体支持体上で、保護ヒドロキシル基を脱ブロックすることと、
ａ２）固体支持体上で、第１のヌクレオシドを活性化ホスホラミダイトとして、遊離ヒドロキシル基と結合させることと、
ａ３）対応するＰ結合ヌクレオシドを酸化又は硫化して、対応するホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）又は対応するホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）を形成することと、
ａ４）任意に、あらゆる未反応ヒドロキシル基を固体支持体上でキャップすることと、
ａ５）固体支持体に結合した第１のヌクレオシドの５’ヒドロキシル基を脱ブロックすることと、
ａ６）第２のヌクレオシドを活性化ホスホラミダイトとして結合させ、対応するＰ結合二量体を形成することと、
ａ７）対応するＰ結合ジヌクレオシドを酸化又は硫化して、対応するホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）又は対応するホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）を形成することと、
ａ８）任意に、あらゆる未反応５’ヒドロキシル基をキャップすることと、
ａ９）前ステップａ５～ａ８を、所望の配列が組み立てられるまで繰り返すことと、の化学反応で構成される。
後に続く、樹脂からの開裂は、濃アンモニア水溶液を用いて実施することができる。ホスフェート及びヌクレオチド塩基上の保護基もまた、この開裂手順の中で除去される。
開裂後の粗オリゴヌクレオチドは、５’－Ｏ－オリゴヌクレオチド末端にて、酸不安定性５’ヒドロキシ保護基と共に残っている。
プロセスは、酸性緩衝溶液を用いるタンジェンシャルフローフィルトレーションにより、オリゴヌクレオチドの５’－Ｏ－オリゴヌクレオチド末端にて、酸不安定性５’ヒドロキシ保護基を除去することを特徴とする。
用語「酸不安定性５’ヒドロキシ保護基」は、好適な酸の補助により開裂可能であり、疎水性を有する保護基として上記のように定義される。
典型的な酸不安定性５’ヒドロキシ保護基は、４，４’－ジメトキシトリチル、４－メトキシトリチル、トリチル、９－フェニル－キサンテン－９－、９－（ｐ－トリル）－キサンテン－９－イル、若しくはｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル、好ましくは４，４’－ジメトキシトリチル、４－メトキシトリチル、若しくはトリチル、又は更により好ましくは４，４’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）から選択される。
酸性緩衝液とは、プロトン酸で酸性化されてｐＨを所望の範囲にされた、弱酸とその共役塩基の水溶液である。
典型的な酸性緩衝液は、弱酸としての酢酸又はクエン酸、及び共役塩基としてのそのナトリウム塩で構成される、酢酸又はクエン酸緩衝液である。
酸性緩衝液の酸性化に使用するためのプロトン酸は、塩酸（ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃ ａｃｉｄ）、リン酸、硫酸、又は硝酸、但し通常は塩酸（ａｑｕｅｏｕｓ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃ ａｃｉｄ）などの水性鉱酸から選択することができる。
所望のｐＨは理想的には２～６、好ましくは２．５～４．０、更により好ましくは２．８～３．５の範囲である。
酸性緩衝溶液は、５％（Ｖ）～５０％（Ｖ）の量、好ましくは２０％（Ｖ）～４０％（Ｖ）の量で、極性プロトン性又は極性非プロトン性有機溶媒もまた含有することができる。
好適な極性プロトン性溶媒は、メタノール、エタノール、又はｉ－プロパノールなどの一級脂肪族アルコール、好ましくはエタノールである。
好適な極性非プロトン性溶媒はアセトニトリル、ジメチルスルホキシド、又はＮ－メチル－２－ピロリドン、ただし好ましくはアセトニトリルである。
好ましい実施形態において、酸緩衝液は、塩酸により、２．８～３．５の範囲のｐＨまで酸性化された後、エタノールで希釈して、３５％（Ｖ）～４５％（Ｖ）エタノールを含有する緩衝溶液を形成した、酢酸緩衝液である。
酢酸の濃度は、１０ｍｍｏｌ／Ｌ～１ｍｏｌ／Ｌの範囲、好ましくは５０ｍｍｏｌ／Ｌ～２５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲から選択することができる。
タンジェンシャルフローフィルトレーションは、フィードが、浸透側に対して正圧にて、フィルター膜を（接線方向に）透過することを特徴とする。一定割合の、膜孔径よりも小さい材料が、浸透物又は濾液として膜を通過し、他のものは全て、膜のフィード側に濃縮物として保持される。
好適な膜は、例えば商品名Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（商標）にてＭｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから、又は、商品名Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ（商標）にてＳａｒｔｏｒｉｕｓから市販されている。
本発明のプロセスは便宜上、５ｋＤＡ以下の、好ましくは２．５ｋＤＡ以下の、より好ましくは０．５～２．５ｋＤＡの、更により好ましくは１．８～２．２ｋＤＡの、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する膜により機能する。
タンジェンシャルフローフィルトレーションは、０．５～１０．０バール、より好ましくは１．０～４バール、更により好ましくは１．５～２．０バールの膜貫通圧にて生じる。
単位面積当たりの流速を示すフラックスは通常、５～５０Ｌ／ｈ＊ｍ２の範囲、より好ましくは、９～１５Ｌ／ｈ＊ｍ２の範囲で選択される。
酸性緩衝溶液中のオリゴヌクレオチド含量は、１．０ｍｇ／Ｌ～１００．０ｍｇ／Ｌ、好ましくは５．０ｍｇ／Ｌ～５０．０ｍｇ／Ｌから選択される。
本発明の更なる実施形態において、プロセスは以下のステップを更に含み、これらは、オリゴヌクレオチドの５’－Ｏ－オリゴヌクレオチド末端にて、酸不安定性５’ヒドロキシ保護基を除去した後に行われるプロセスであって、
得られる濃縮物を、タンジェンシャルフローフィルトレーションにより塩基を用いて中和することを含む中和ステップと、
中和ステップで得た濃縮物を、水、又は、水と極性プロトン性若しくは極性非プロトン性有機溶媒との混合物により、タンジェンシャルフローフィルトレーションによって洗浄することを含む脱塩ステップと、
任意で、脱塩ステップから得た濃縮物を凍結乾燥すること。
得られる濃縮物を、タンジェンシャルフローフィルトレーションにより塩基を用いて中和することを含む中和ステップと、
中和ステップで得た濃縮物を、水、又は、水と極性プロトン性若しくは極性非プロトン性有機溶媒との混合物により、タンジェンシャルフローフィルトレーションによって洗浄することを含む脱塩ステップと、
任意で、脱塩ステップから得た濃縮物を凍結乾燥すること。
濃縮物を中和するための好適な塩基は、水酸化ナトリウム水溶液などのアルカリヒドロキシド水溶液、又はアルカリ性緩衝剤といった水性無機塩基である。
後に続く濾液の洗浄は、水、又は、水と、メタノール、エタノール、若しくはｉ－プロパノールなどの一級脂肪族アルコール、好ましくはエタノールから選択される極性プロトン性有機溶媒との混合物により行うことができる。
典型的には、脱塩ステップは勾配により行うことができる、即ち、水と、極性プロトン性有機溶媒との混合物で開始し、水で終了する。
混合物中の、極性プロトン性有機溶媒に対する水の体積比は、通常１：１～６：１、好ましくは４：１～３：２である。
中和中、及び更に、脱塩ステップの中の、タンジェンシャルフローフィルトレーションのパラメーター、即ち、膜貫通圧、浸透流速、及び膜の種類は、典型的には、酸不安定性５’ヒドロキシ保護基の除去を含む前述のステップで記載したパラメーターに対応する。
脱塩ステップの後、得た濃縮物を、例えばオリゴヌクレオチドから残留溶媒を除去するために、凍結乾燥ステップ、又は、更なる精製に通すことができる。
最も好ましい実施形態において、プロセスは、以下を特徴とする：
酸性緩衝溶液を用いるタンジェンシャルフローフィルトレーションにより、オリゴヌクレオチドの５’－Ｏ－オリゴヌクレオチド末端にて、酸不安定性５’ヒドロキシ保護基を除去することと、
得られる濃縮物を、タンジェンシャルフローフィルトレーションにより塩基を用いて中和することを含む中和ステップと、
中和ステップで得た濃縮物を、水、又は、水と極性プロトン性若しくは極性非プロトン性有機溶媒との混合物により、タンジェンシャルフローフィルトレーションによって洗浄することを含む脱塩ステップと、
任意で、脱塩ステップから得た濃縮物を凍結乾燥すること。
酸性緩衝溶液を用いるタンジェンシャルフローフィルトレーションにより、オリゴヌクレオチドの５’－Ｏ－オリゴヌクレオチド末端にて、酸不安定性５’ヒドロキシ保護基を除去することと、
得られる濃縮物を、タンジェンシャルフローフィルトレーションにより塩基を用いて中和することを含む中和ステップと、
中和ステップで得た濃縮物を、水、又は、水と極性プロトン性若しくは極性非プロトン性有機溶媒との混合物により、タンジェンシャルフローフィルトレーションによって洗浄することを含む脱塩ステップと、
任意で、脱塩ステップから得た濃縮物を凍結乾燥すること。
脱保護ステップ、中和ステップ、及び脱塩ステップは連続したタンジェンシャルフローフィルトレーションステップであり、あらゆる人のオペレーター介入を伴わずに、同じソフトウェアが制御する装置により自動化して実行することができる。
前述で概略を述べたとおり、オリゴヌクレオチドを、樹脂に形成した後で、通常は濃アンモニア水溶液により、樹脂から開裂させる。ホスフェート及びヌクレオチド塩基上の保護基もまた、オリゴヌクレオチドの５’－Ｏ－オリゴヌクレオチド末端における酸不安定性５’ヒドロキシ保護基という例外があるものの、この開裂手順で除去される。
好ましい実施形態において、プロセスは、オリゴヌクレオチドの５’－Ｏ－オリゴヌクレオチド末端にて、酸不安定性５’ヒドロキシ保護基の除去する前に行われる、以下のステップを更に含む。この前ステップは、所望のオリゴヌクレオチドの、長さの短い（５’保護されていない）切頭部を取り除くことを目的とする。
樹脂からの開裂およびホスフェート脱保護後に得た粗オリゴヌクレオチドの逆相高速液体クロマトグラフィー又はアニオン交換クロマトグラフィー。
アニオン交換クロマトグラフィーは、サンプル溶液の荷電したイオンの、用いる緩衝培地との競合相互作用をベースにしている。これは、従来の市販されているアニオン交換樹脂、好ましくは、トリメチルアンモニウム官能基化されたものによって、実施することができる。これらの相材料は例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ、又はＭｅｒｃｋから入手することができる。Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能な、アニオン交換樹脂ＴＳＫｇｅｌ Ｓｕｐｅｒ Ｑ－５ＰＷ（ＱＡＥ）を用いることで、特に良好な結果が達成されている。
例えば、固定相として修飾シリカゲル吸着剤などの従来の市販されている相材料、典型的にはＣ８又はＣ１８相材料、及びアセトニトリルなどの好適な有機溶媒、及び、適用可能である場合、緩衝液により、逆相クロマトグラフィーを実施することができる。好適な修飾シリカゲル型相材料は、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（商標）Ｃ１８、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（商標）Ｃ８、ＹＭＣ Ｔｒｉａｒｔ Ｃ１８、及びＹＭＣ Ｔｒｉａｒｔ Ｃ８から選択することができる。
例えば、オリゴヌクレオチドは、以下からなる群から選択することができる：
（式中、＊はホスホロチオエートブリッジを示し、Ａ、Ｇ、Ｔ、及びＭｅＣ（５－メチルシトシン）はＬＮＡヌクレオシドモノマーであり、ａ、ｔ、ｃ、ｇはＤＮＡヌクレオシドモノマーである）。
本明細書にて開示された化合物は、以下のヌクレオ塩基配列を有する。
配列番号１：ｃｔｔｃｔｃｔａｔｃｔａｃｇｃａｔ’
配列番号１：ｃｔｔｃｔｃｔａｔｃｔａｃｇｃａｔ’
略語：
ＡＣＮ＝アセトニトリル
Ａｃ２Ｏ＝酢酸無水物
ＣＶ＝カラム体積
ＤＡＣ＝ジクロロ酢酸
ＤＣＭ＝ジクロロメタン
ＤＭＴ＝４，４’－ジメトキシトリチル
ＥｔＯＨ＝エタノール
ＮａＯＡｃ＝酢酸ナトリウム
ＮＭＩ＝Ｎ－メチルイミダゾール？
ＡＣＮ＝アセトニトリル
Ａｃ２Ｏ＝酢酸無水物
ＣＶ＝カラム体積
ＤＡＣ＝ジクロロ酢酸
ＤＣＭ＝ジクロロメタン
ＤＭＴ＝４，４’－ジメトキシトリチル
ＥｔＯＨ＝エタノール
ＮａＯＡｃ＝酢酸ナトリウム
ＮＭＩ＝Ｎ－メチルイミダゾール？
実施例１
ａ．
の合成
表題化合物を、１．９ｍｍｏｌスケールでＡＫＴＡ ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ－１００を用いて、「ＤＭＴ－ｏｎ］として合成した。合成パラメーターを表１に示す。
ａ．
表題化合物を、１．９ｍｍｏｌスケールでＡＫＴＡ ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ－１００を用いて、「ＤＭＴ－ｏｎ］として合成した。合成パラメーターを表１に示す。
（表１）ＡＫＴＡ ＯＰ－１００の合成パラメーター。
ｂ．固体支持体からの開裂及びＲＰ－ＨＰＬＣ精製
粗物質を樹脂から開裂させ、乾燥樹脂を３０％アンモニア溶液（１９０ｍＬ）に溶解して、６５℃で５時間撹拌することにより、脱保護した。固体支持体を濾別し、水溶液を回転蒸発により約６０ｍＬまで濃縮した。溶液をＨ２Ｏで更に希釈して１００ｍＬの最終体積にし、固体Ｎａ２ＣＯ３を添加して、５０ｍＭのＮａ２ＣＯ３溶液（１２４ｍｇ／ｍＬの粗オリゴ含量）を得た。粗物質の一部（８０ｍＬ）を、表２のパラメーターに従い、ＲＰ－ＨＰＬＣで精製した。
粗物質を樹脂から開裂させ、乾燥樹脂を３０％アンモニア溶液（１９０ｍＬ）に溶解して、６５℃で５時間撹拌することにより、脱保護した。固体支持体を濾別し、水溶液を回転蒸発により約６０ｍＬまで濃縮した。溶液をＨ２Ｏで更に希釈して１００ｍＬの最終体積にし、固体Ｎａ２ＣＯ３を添加して、５０ｍＭのＮａ２ＣＯ３溶液（１２４ｍｇ／ｍＬの粗オリゴ含量）を得た。粗物質の一部（８０ｍＬ）を、表２のパラメーターに従い、ＲＰ－ＨＰＬＣで精製した。
（表２）ＲＰ－ＨＰＬＣ精製パラメーター。
ｃ．タンジェンシャルフローフィルトレーションによるＤＭＴ脱保護、脱塩、及び濃縮
ＲＰ精製からの画分をプールして２．５Ｌ（２ｍｇ／ｍＬのオリゴ）を得、Ｈ２Ｏで希釈して、４．２Ｌの最終体積にした。ＤＭＴ脱保護、濃縮、及びタンジェンシャルフローフィルトレーションをトリガーするために、材料を、２つの２ｋＤカットオフＨｙｄｒｏｓａｒｔ Ｓａｒｔｏｃｏｎカセット（０．１ｍ２）を装着したＡＫＴＡクロスフローマシンで処理した。プログラムパラメーターを、表３に詳細に記載する。
ＲＰ精製からの画分をプールして２．５Ｌ（２ｍｇ／ｍＬのオリゴ）を得、Ｈ２Ｏで希釈して、４．２Ｌの最終体積にした。ＤＭＴ脱保護、濃縮、及びタンジェンシャルフローフィルトレーションをトリガーするために、材料を、２つの２ｋＤカットオフＨｙｄｒｏｓａｒｔ Ｓａｒｔｏｃｏｎカセット（０．１ｍ２）を装着したＡＫＴＡクロスフローマシンで処理した。プログラムパラメーターを、表３に詳細に記載する。
（表３）ＡＫＴＡクロスフロープログラム用の、詳細のパラメーター。
すすぎ後に得た溶液を凍結乾燥して、４．００ｇの表題生成物を得た（合成スケールに基づく全収率：４２％、ＵＶ純度８８％）。
Claims (15)
- 酸性緩衝溶液を用いるタンジェンシャルフローフィルトレーションにより、オリゴヌクレオチドの５’－Ｏ－オリゴヌクレオチド末端にて、酸不安定性５’ヒドロキシ保護基を除去することを含む、オリゴヌクレオチドの精製プロセスであって、
前記酸不安定性５’ヒドロキシ保護基が、４，４’－ジメトキシトリチル、４－メトキシトリチル、トリチル、９－フェニル－キサンテン－９－、９－（ｐ－トリル）－キサンテン－９－イル、又はｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルから選択される、前記プロセス。 - 前記酸不安定性５’ヒドロキシ保護基が、４，４’－ジメトキシトリチルである、請求項１に記載のプロセス。
- 前記酸性緩衝溶液が、２～６の範囲のｐＨを有する、請求項１または２に記載のプロセス。
- 前記酸性緩衝溶液が、２．５～４．０の範囲のｐＨを有する、請求項３に記載のプロセス。
- 前記酸性緩衝液が、プロトン酸で酸性化されてｐＨを所望の範囲にされた、弱酸とその共役塩基の水溶液である、請求項１～４のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記酸性緩衝液が酢酸緩衝液であり、前記プロトン酸が塩酸である、請求項５に記載のプロセス。
- 前記酸性緩衝溶液が更に、極性プロトン性又は極性非プロトン性有機溶媒を含有する、請求項１～６のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記タンジェンシャルフローフィルトレーションが０．５～１０．０バールの膜貫通圧により行われる、請求項１～７のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記タンジェンシャルフローフィルトレーションが、５～５０Ｌ／ｈ＊ｍ２のフラックス速度により行われる、請求項１～８のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記タンジェンシャルフローフィルトレーションが、５ｋＤＡ以下の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する膜により行われる、請求項１～９のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記酸性緩衝溶液中のオリゴヌクレオチド含量が、１．０ｍｇ／Ｌ～１００．０ｍｇ／Ｌで選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記プロセスが以下のステップを更に含み、これらは、前記オリゴヌクレオチドの５’－Ｏ－オリゴヌクレオチド末端にて、前記酸不安定性５’ヒドロキシ保護基を除去した後に行われる、請求項１～１１のいずれか一項に記載のプロセス：
ａ．得られる濾液を、タンジェンシャルフローフィルトレーションにより塩基を用いて中和することを含む中和ステップと、
ｂ．前記中和で得た前記濾液を、水、又は、水と極性プロトン性若しくは極性非プロトン性有機溶媒との混合物により、タンジェンシャルフローフィルトレーションによって洗浄することを含む脱塩ステップと、
ｃ．任意に、前記脱塩ステップから得た前記濾液の凍結乾燥。 - 前記プロセスが以下のステップを更に含み、これらは、前記オリゴヌクレオチドの５’－Ｏ－オリゴヌクレオチド末端にて、前記酸不安定性５’ヒドロキシ保護基を除去する前に行われる、請求項１～１２のいずれか一項に記載のプロセス：
ａ．樹脂からの開裂およびホスフェート脱保護後に得た粗オリゴヌクレオチドの逆相高速液体クロマトグラフィー又はアニオン交換クロマトグラフィー。 - 前記オリゴヌクレオチドが、任意に修飾されたＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくはＬＮＡヌクレオシドモノマー、又はこれらの組み合わせで構成され、１０～４０ヌクレオチド長である、請求項１～１３のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記オリゴヌクレオチドが、１０～２５ヌクレオチド長である、請求項１４に記載のプロセス。
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