JP7229539B2 - 高脂溶性ホスホラミダイトの製造 - Google Patents
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Description
一方、液相法によるオリゴヌクレオチドの合成は、操作が煩雑であり、また収率が低いことから、重合度の高いオリゴヌクレオチドを大量に且つ迅速に合成することは困難であるという欠点がある。
また、擬似固相保護基を用いた液相製造方法においても、ホスホラミダイトによる伸張後すぐに、非特許文献1と同様にカルボン酸有機塩基塩やアルコール等のクエンチ剤を加え、生成物の純度向上に成功している(特許文献2)。しかし、カルボン酸有機塩基塩やアルコールは無水酢酸と反応性が有り、追加の精製工程なしに無水酢酸によるキャッピングを行う事は困難であると容易に想像できる。特に、硫化前に無水酢酸、水等の使用により硫化効率が落ちる事も報告されている(非特許文献7)為、アルコール等を添加し、硫化する場合には、硫化効率の確認が不可欠である。
反応性が高い第1級アルコキシホスホラミダイト化合物のカラム精製は、通常の安価なアミン共存シリカゲルを用いるのではなく、高価なアミノシリカゲルの使用を要している(特許文献5)。ホスホラミダイト化合物の原料として使用可能なホスホロジアミダイト化合物を、反応混合液に貧溶媒(例えば、アルコール類、炭化水素類、ニトリル類)を加えて回収する方法が報告されている(特許文献6および7)。しかし、同様の手法が、反応性の高い第1級アルコキシホスホラミダイト化合物に用いることができるかどうかは予測しえず、更に原料アルコールの適切な選択が必要となると考えられる。
項[1] 式(I):
R1は、置換されていてもよいC6-C30アルキルオキシ基であり、該置換基は、C1-C3アルキル基、またはC3-C6シクロアルキル基から選ばれる少なくとも1つの基であり、
R2は各々独立して、置換されていてもよいC1-C6アルキル基であり、該置換基は、C1-C3アルキル基、またはC3-C6シクロアルキル基から選ばれる少なくとも1つの基であり、そして、
R3は、置換されていてもよいC6-C30アルキルオキシ基、置換されていてもよいC1-C8アルキルオキシ基、または置換されていてもよいC2-C8アルキニルオキシ基であり、ここで、置換されていてもよいC6-C30アルキルオキシ基における置換基は、C1-C3アルキル基、またはC3-C6シクロアルキル基から選ばれる少なくとも1つの基であり、置換されていてもよいC1-C8アルキルオキシ基、または置換されていてもよいC2-C8アルキニルオキシ基における置換基はシアノ基(CN)である。]
で示される化合物の製造方法であって、以下の工程:
(1)脂肪族アルコールおよび三価リン化合物を、活性化剤または有機塩基の存在下、有機溶媒中で反応する;
(2)得られた反応混合物を、水を用いて分液洗浄する;
(3)工程(2)後の有機層を回収し、濃縮する(但し、工程(1)で使用する有機溶媒がニトリル系溶媒の場合には、工程(2)~(3)は省略してもよい);
(4)工程(3)で得られた残渣を脂肪族炭化水素系溶媒中に溶解する(但し、工程(1)で使用する有機溶媒が脂肪族炭化水素系溶媒の場合には、工程(2)~(4)は省略してもよい);
(5)工程(4)で調製した脂肪族炭化水素系溶液を、ニトリル系溶媒を用いて分液洗浄する;
(6)工程(5)後の脂肪族炭化水素系溶液を回収して、ホスホラミダイト化合物を溶液として得る、
を含む、該製造方法。
項[2] 工程(4)で使用される脂肪族炭化水素系溶媒が、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、またはオクタンから少なくとも1つ選ばれ、そして工程(5)で使用されるニトリル系溶媒が、アセトニトリル、プロピオニトリル、またはベンゾニトリルから少なくとも1つ選ばれる、項[1]に記載の製造方法。
項[3-1] R3が、置換されていてもよいC1-C8アルキルオキシ基、または置換されていてもよいC2-C8アルキニルオキシ基であり、該置換基はシアノ基(CN)である、項[1]または項[2]に記載の製造方法。
項[3-2] R3が、置換されていてもよいC1-C8アルキルオキシ基である、項[1]または項[2]に記載の製造方法。
項[3-3] R1が、置換されていてもよいC10-C30の第1級または第2級のアルキルオキシ基であり、そして、R3が、-OCH2CH2CN、-OCH3または-OCH2CH3で示される基である、項[1]または項[2]記載の製造方法。
項[4] 各R2が共にi-プロピル基である、項[1]~項[3]のいずれか1項に記載の製造方法。
項[5] 式(I)で示される化合物が、下記式:
項[6] 工程(6)で得られる溶液が、H-ホスホネート化合物、ジアミダイト化合物を含まず、実質的に純粋なホスホラミダイト化合物の溶液である、項[1]~項[5]のいずれか1項に記載の製造方法。
項[7] 項[1]~項[6]のいずれか1項に記載の製造方法によって得られる化合物を含有する溶液、および適宜添加剤を含む、キャッピング反応用組成物。
項[8] ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドから選ばれる2つ以上の化合物をカップリング反応させた後の反応溶液を、適宜アクチベータの存在下、項[7]に記載のキャッピング反応用組成物と接触させる工程を含む、キャッピング方法。
項[9] 更に適宜、キャッピング反応工程後に、キャッピング副反応産物を求核剤と反応させることを含み、ここで、該求核剤は、アルコール、フェノール、カルボン酸、またはN-アルキルヒドロキシルアミンから選ばれる、項[8]に記載のキャッピング方法。
項[10] キャッピング反応工程後に有機塩基を添加し、その後に求核剤と反応させる工程を含む、項[9]に記載のキャッピング方法。
項[11]
工程(a):非極性溶媒中において、3’位水酸基もしくは核酸塩基を介して擬似固相保護基が修飾され且つ5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基でブロックされたn量体(ここで、nは、1以上の任意の整数を示す。)もしくは、n=0の場合、水酸基を2個以上持つリンカーの1つの水酸基が擬似固相保護基で修飾され且つ別の水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基でブロックされた化合物を、酸の単独もしくはカチオン捕捉剤の共存下で反応させて、水酸基の一時保護基をデブロックし、その後に極性溶媒を用いて該擬似固相保護基を含有する化合物を回収する工程(デブロックおよび晶析工程);
工程(b):工程(a)の回収物を乾燥後、非極性溶媒中において、3’位水酸基がホスホラミダイト化され且つ5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたm+1個重合オリゴヌクレオチド(ここで、mは、0以上の任意の整数を示す。)およびアクチベータを添加して、工程(a)で得られた水酸基の一時保護基がデブロックされた化合物(n個重合オリゴヌクレオチド)と、その5’位水酸基を介してホスファイトトリエステル結合により縮合させる工程(カップリング工程);
工程(c):工程(b)の反応液に、項[1]~[6]に記載のいずれか1項に記載の製造方法によって得られる高脂溶性ホスホラミダイト化合物を含有する溶液、または項[7]に記載のキャッピング反応用組成物を添加し、工程(b)において未反応であった化合物について、その5’位水酸基を介して該高脂溶性化合物のホスファイトトリエステル結合により縮合(キャッピング)させる工程(キャッピング反応工程);
工程(d):工程(c)のキャッピング副反応産物に求核剤を添加して反応させることを含み、ここで、該求核剤は、アルコール、フェノール、カルボン酸またはN-アルキルヒドロキシルアミンから選ばれる、工程(キャッピング反応の後処理工程);
工程(e):工程(d)の反応液に、酸化剤または硫化剤を添加して、工程(b)~(d)で得られたm+1+n量体のオリゴヌクレオチドのホスファイトトリエステル結合を、ホスフェートトリエステル結合またはチオホスフェートトリエステル結合にそれぞれ変換する工程(酸化または硫化反応の工程);
更に適宜、工程(f):工程(e)で得られた反応液に極性溶媒を添加して、m+1+n個重合オリゴヌクレオチドを沈殿させて、固液分離により取得する工程(単離工程);
更に適宜、工程(g):工程(f)で得られたm+1+n個重合オリゴヌクレオチドの保護基を全て除去する工程(脱保護工程);
を含む、オリゴヌクレオチドの製造方法。
項[12] 式(II):
R5は各々独立して、置換されていてもよいC6-C30のアルキル基であり、
R6は、置換されていてもよいC1-C6アルキル基、置換されていてもよいC3-C6シクロアルキル基、置換されていてもよい非芳香族性複素環式基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいヘテロアリール基、置換されていてもよいアラルキル基、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキル基から選ばれ、
R7は、置換されていてもよいC1-C6アルキレン基、または置換されていてもよいC1-C6アルキレンオキシ基であり、
R8は、置換されていてもよいC1-C6アルキレン基であり、あるいは、
R6およびR7は、R6が結合する窒素原子と一緒になって、置換されていてもよい非芳香族性複素環式基、または置換されていてもよいヘテロアリール基を形成してもよく、あるいは、
R6、R7およびR8は、R6が結合する窒素原子と一緒になって、置換されていてもよい非芳香族性複素環式基、置換されていてもよい非芳香族性複素環アルキル基、置換されていてもよいヘテロアリール基、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキル基を形成してもよく、そして、
*は、Lとの結合位置を示す]
で示される、擬似固相保護基。
項[13] 式(III):
Zは、項[12]に記載の式(II)で示される擬似固相保護基であり、
Lは、リンカーであり、
Baseは、各々独立して保護されていてもよい核酸塩基であり、
n個のEWGは、各々独立して電子吸引性基であり、
n個のR4は、各々独立して酸素原子または硫黄原子であり、
n個のRは、各々独立して水素原子、ハロゲン原子、保護基で置換されていてもよいヒドロキシ基、置換されていてもよいC1-C6アルコキシ基、4位炭素原子に架橋する有機基、または架橋構造型人工核酸基であり、
nは、0以上の任意の整数であり、そして、
Xは、酸により脱保護可能な一時保護基である]
で示される、ヌクレオチド化合物。
項[14] Lが、下記式:
*は疎水性基との結合位置、および**はリン原子との結合位置を示し、
Baseは、各々独立して保護されていてもよい核酸塩基であり、そして、
Rは、各々独立して水素原子、ハロゲン原子、保護基で置換されていてもよいヒドロキシ基、置換されていてもよいC1-C6アルコキシ基、4位炭素原子に架橋する有機基、または架橋構造型人工核酸基である]
から選ばれる項[13]に記載のヌクレオチド化合物。
本明細書および特許請求の範囲中で使用する用語の定義を示す。特に記述がない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。なお、本明細書において引用された全ての刊行物に記載されている構築物および方法論を、記載および開示する目的で、参照として本明細書に組み込まれる。
本発明の1態様によれば、本発明は、式(I):
R1は、置換されていてもよいC6-C30アルキルオキシ基であり、該置換基は、C1-C3アルキル基、またはC3-C6シクロアルキル基から選ばれる少なくとも1つの基であり、
R2は各々独立して、置換されていてもよいC1-C6アルキル基であり、該置換基は、C1-C3アルキル基、またはC3-C6シクロアルキル基から選ばれる少なくとも1つの基であり、そして、
R3は、置換されていてもよいC6-C30アルキルオキシ基、置換されていてもよいC1-C8アルキルオキシ基、または置換されていてもよいC1-C8アルキニルオキシ基であり、ここで、置換されていてもよいC6-C30アルキルオキシ基における置換基は、C1-C3アルキル基、またはC3-C6シクロアルキル基であり、置換されていてもよいC1-C8アルキルオキシ基、または置換されていてもよいC2-C8アルキニルオキシ基における置換基はシアノ基(CN)である。]
で示される化合物(以下、「本発明の高脂溶性ホスホラミダイト化合物」と呼称する)の製造方法であって、以下の工程:
(1)脂肪族アルコールおよび三価リン化合物を、活性化剤または有機塩基の存在下、有機溶媒中で反応する;
(2)得られた反応混合物を、水を用いて分液洗浄する;
(3)工程(2)後の有機層を回収し、濃縮する(但し、工程(1)で使用する有機溶媒がニトリル系溶媒の場合には、工程(2)~(3)は省略してもよい);
(4)工程(3)で得られた残渣を脂肪族炭化水素系溶媒中に溶解する(但し、工程(1)で使用する有機溶媒が脂肪族炭化水素系溶媒の場合には、工程(2)~(4)は省略してもよい);
(5)工程(4)で調製した脂肪族炭化水素系溶液を、ニトリル系溶媒を用いて分液洗浄する;
(6)工程(5)後の脂肪族炭化水素系溶液を回収して、ホスホラミダイト化合物を溶液として得る、
を含む、該製造方法(以下、「本発明の高脂溶性ホスホラミダイトの製造方法」と呼称する)を提供する。
工程(1)における、用語「脂肪族アルコール」とは、炭素数が6~30個の炭化水素脂肪族アルコール、好ましくは第1級または第2級の炭化水素脂肪族アルコールを意味し、具体的には、R1として定義する、芳香族環を含んでもよく、置換されていてもよいC6-C30アルキルオキシ基を供する脂肪族アルコールに対応する。好ましくは、炭素数がC8~C30個、より好ましくはC10~C30個、より一層好ましくはC10~C20個の長鎖の第1級または第2級の脂肪族アルコールが挙げられる。好適な1具体例としては、C18の脂肪族アルコール、特にC18の第1級脂肪族アルコールが挙げられる。
脂肪族アルコールと三価リン化合物との配合モル比は、例えば0.5~1.5モル当量を挙げられるが、好ましくは三価リン化合物が過剰量(例えば、1.1モル当量)である場合が挙げられる。
工程(2)において、工程(1)において得られた反応混合物を分液漏斗中に注ぎ、有機層を水(例えば、蒸留水)を用いて分液洗浄する。洗浄する水の量は、特に限定されるものではないが、工程(1)で使用した有機溶媒の量に対して容積比が0.1~5 v/vで使用することができる。
工程(2)の洗浄後の有機層を回収し、例えば減圧下でエバポレーター等を用いて有機溶媒を留去して、濃縮する。ここで、前記工程(1)で使用する有機溶媒がニトリル系溶媒の場合には、上記工程(2)~(3)を実施することを省くことができる。
工程(3)で得られた残渣に、脂肪族炭化水素系溶媒を添加して溶解させる。脂肪族炭化水素系溶媒の具体例としては、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、およびオクタン等が挙げられるが、これらに限定されない。ペンタン、ヘキサン、およびヘプタンが好ましく、特にヘプタンが好ましい。脂肪族炭化水素系溶媒の添加量は、反応生成物の高脂溶性ホスホラミダイト化合物の、使用する脂肪族炭化水素系溶媒に対する溶解度に応じて変わり得るが、溶解するのに適量であればよく、例えば、工程(1)で使用する脂肪族アルコールの1mmol当たり、約1~500倍mLが挙げられ、典型的には約1~10倍mLが挙げられる。ここで、前記工程(1)で使用する有機溶媒が脂肪族炭化水素系溶媒の場合には、上記工程(2)~(4)を実施することを省くことができる。
工程(4)で調製した脂肪族炭化水素系溶液を分液漏斗中に注ぎ、ニトリル系溶媒を用いて洗浄する。ニトリル系溶媒の具体例としては、脂肪族炭化水素系溶媒中の生成物の溶解液の有機層と分液で相分離する溶媒であれば、特に限定されるものではないが、例えば、含水アセトニトリル、アセトニトリル、プロピオニトリル、ベンゾニトリルを挙げられる。アセトニトリルが特に好ましい。洗浄するニトリル系溶媒の量は、特に限定されるものではないが、工程(1)で使用した有機溶媒の量に対して容積比が0.1~10 v/vで使用することができる。あるいは、工程(3)で使用した脂肪族炭化水素系溶媒の量に対して容積比が、0.1~10 v/vで使用することができる。洗浄回数は、1回に限定されるものでは無く、洗浄された脂肪族炭化水素系溶液の一部について31P NMR測定する事で、H-ホスホネート化合物、および/またはジアミダイト化合物の存在を確認することにより容易に洗浄回数を決定できる。
工程5の分液洗浄後に得た脂肪族炭化水素溶液を回収して、目的のホスホラミダイト化合物を溶液として得る。
得られた溶液は、溶存水を除くことで次の反応工程(例えば、キャッピング反応工程)に使用することができる。あるいは、得られた溶液を、必要に応じて、例えば減圧下でエバポレーター等を用いて濃縮して、次の反応工程に使用することができる。
本発明の1態様によれば、本発明は、本発明の高脂溶性ホスホラミダイトの製造方法によって製造した、高脂溶性ホスホラミダイト化合物を含有する溶液、または適宜添加剤(例えば、安定化剤)を加えた組成物をキャッピング反応用試薬(以下、「本発明のキャッピング反応用試薬」と呼称する)として用いるキャッピング方法(以下、「本発明のキャッピング反応」と呼称する)を提供する。以下に、キャッピング反応を反応スキームIとして示す。
反応スキームI
ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドから選ばれる2つ以上の化合物のカップリング反応後の反応溶液を、適宜アクチベータの存在下、本発明のキャッピング反応用試薬(つまり、本発明の高脂溶性ホスホラミダイトの製造方法で得られた高脂溶性ホスホラミダイト化合物を含有する溶液、または該溶液および適宜添加剤を含有する組成物)と接触させる工程(上記反応スキームI中の工程(c))、
を含むキャッピング方法(以下、「本発明のキャッピング方法」と呼称する)、を提供する。
工程(c)においては、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドから選ばれる2つ以上の化合物のカップリング反応後の反応溶液を、適宜アクチベータの存在下、本発明の高脂溶性ホスホラミダイトの製造方法で得られる高脂溶性ホスホラミダイト化合物を含有する溶液、または該溶液および適宜添加剤を含む組成物と接触させる工程を含む。
キャッピング試薬としての本発明の高脂溶性ホスホラミダイト化合物の使用量は、カップリング反応に用いる前記の式:HO-(N)n-L-Zで示されるn個重合のヌクレオシド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの量に対して、配合モル比が、例えば0.1~1.5モル当量、好ましくは0.1~0.5モル当量が挙げられる。
本発明のキャッピング方法は、更に必要に応じて、工程(c)のキャッピング反応工程後に、キャッピング副反応産物を求核剤と反応させる工程を含み得る。ここで、該求核剤の例としては、アルコール、フェノール、カルボン酸またはN-アルキルヒドロキシルアミンから選ばれる化合物が挙げられ、具体的にはエタノール、メタノール、N-ヒドロキシスクシンイミドが挙げられ、好ましくはエタノールが挙げられる。該求核剤の使用量は、キャッピング試薬としての本発明の高脂溶性ホスホラミダイト化合物の使用量に対して、配合モル比が、例えば0.1~100モル当量、好ましくは1~20モル当量が挙げられる。
本発明の1態様によれば、本発明は、本発明のキャッピング方法の工程を含むオリゴヌクレオチドの製造方法をも提供する。下記に、本発明のオリゴヌクレオチドの製造方法の代表的な模式図を反応スキームIIに示す。
反応スキームII
具体的には、適宜保護されたn個重合(つまり、n量体)オリゴヌクレオチドから、適宜保護されたn+1+m個重合(つまり、n+1+m量体)オリゴヌクレオチドへの製造方法について説明する。ここで、n=1の場合には、n量体のオリゴヌクレオチドは、「ヌクレオシド」を含み得て、またm=0の場合には、m+1量体のオリゴヌクレオチドは、「ヌクレオシド」を含み得る。
本発明のオリゴヌクレオチドの製造方法は、以下の工程(a)~(e)を含む。
工程(a)の反応スキーム1を下記に示す。
反応スキーム1
非極性溶媒中において、3’位水酸基もしくは核酸塩基が擬似固相保護基で修飾され且つ5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基でブロックされたn量体(ここで、nは、1以上の任意の整数を示す。)、もしくは、n=0の場合、水酸基を2個以上持つリンカーの1つの水酸基が擬似固相保護基で修飾され且つ別の水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基でブロックされた化合物、例えば上記X-(N)n-L-Zで示される化合物を、酸の単独もしくはカチオン捕捉剤の共存下で反応させて、水酸基の保護基をデブロックする工程(デブロック工程)、
その後に極性溶媒を用いて該擬似固相保護基を含有する化合物、例えば上記H-(N)n-L-Zで示される化合物を回収する工程(晶析工程)、
を含む。
酸の使用量は、n量体(オリゴ)ヌクレオチド1モルに対して、1~100モル使用することができ、好ましくは1~40モルが挙げられる。
工程(a)の回収物を乾燥後、非極性溶媒中において、3’位水酸基がホスホラミダイト化され且つ5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたm+1個重合(オリゴ)ヌクレオチド(ここで、mは、0以上の任意の整数を示す。)およびアクチベータを添加して、工程(a)で得られた5’位水酸基の保護基がデブロックされたn個重合(オリゴ)ヌクレオチドと、その5’位水酸基を介して亜リン酸トリエステル結合により縮合させる工程(カップリング工程)
を含む。
弱酸もしくは酸性中和塩の使用量は、反応基質としての、工程(a)で得られた5’位水酸基の保護基がデブロックされたn個重合(オリゴ)ヌクレオチドの1モルに対し、0.1~50モル当量使用することができ、例えば1~5モル当量が挙げられる。
該N-メチルイミダゾールの使用量は、工程(a)で得られた5’位水酸基の保護基がデブロックされたn個重合(オリゴ)ヌクレオチドの1モルに対し、0.1~10モル当量使用することができ、例えば0.1~1モル当量が挙げられる。
本発明の1態様によれば、工程(b)において未反応であった原料を、本発明の高脂溶性ホスホラミダイト化合物の製造法によって得られた高脂溶性ホスホラミダイト化合物と接触反応させて、キャッピング反応を行う工程を提供する。
また、本発明の1実施態様によれば、工程(c)のキャッピング反応後に、キャッピング副反応産物を求核剤と反応させる工程である、後処理工程を含んでもよい。
ここで、工程(c)における未反応原料としては例えば、工程(a)で得られた5’位水酸基がデブロックされたn量体(オリゴ)ヌクレオチド(例えば、反応スキーム1に示したHO-(N)n-L-Zで示される化合物)が挙げられる。
ここで、本発明における求核剤との反応とは、キャッピング副反応産物の処理を意図する反応である。従って、例えば文献(例えば、WO2017/104836A1)に記載されているようなカップリング反応工程後の反応液をクエンチすることを意図するものではない。
工程(d)の反応液に、酸化剤または硫化剤を添加して、工程(d)で得られたm+1+n量体のオリゴヌクレオチドのホスファイトトリエステル結合を、ホスフェートトリエステル結合又はチオホスフェートトリエステル結合にそれぞれ変換する工程(酸化または硫化反応の工程)
を提供する。
反応温度は、通常0~50℃である。反応時間は、通常0.2~1時間の範囲内である。
工程(f)における沈殿化および固液分離操作は、文献(例えば、WO2012/157723A1)中に記載の反応条件下で行うことができる。具体的に以下説明する。
適宜、工程(e)で得られた反応液に極性溶媒を添加して、m+1+n量体オリゴヌクレオチドを沈殿させて、固液分離により取得する工程(沈殿化および固液分離工程)を含み得る。
また、該極性溶媒は、生成物の極性溶媒中へのロスを最小限とするために、水を含んでいてもよい。極性溶媒に対する水の含量は、例えば0~10%(v/v)、好ましくは0~8%(v/v)が挙げられる。
工程(f)における沈殿化および固液分離操作は、文献(例えば、WO2012/157723A1)中に記載の反応条件下で行うことができる。具体的に以下説明する。
本発明の1実施態様によれば、本発明のオリゴヌクレオチドの製造方法は、更に
適宜、工程(g):工程(f)で得られたm+1+n個重合オリゴヌクレオチドの保護基を全て除去する工程を含み得る。
上記オリゴヌクレオチド製造方法の各工程の反応の進行は、一般的な液相有機合成反応の場合と同様の手法により、追跡・確認することができる。例えば、薄層シリカゲルクロマトグラフィー(TLC)および高速液体クロマトグラフィー(HPLC)等によって行うことができる。
本発明の1態様によれば、本発明のオリゴヌクレオチド製造方法は、擬似固相保護基を有するヌクレオチドを用いることにより、液相方法で行うことができる。
式(II):
R5は各々独立して、置換されていてもよいC6-C30アルキル基であり、
R6は、置換されていてもよいC1-C6アルキル基、置換されていてもよいC3-C6シクロアルキル基、置換されていてもよい非芳香族性複素環式基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいヘテロアリール基、置換されていてもよいアラルキル基、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキル基から選ばれ、
R7は、置換されていてもよいC1-C6アルキレン基または置換されていてもよいC1-C6アルキレンオキシ基であり、
R8は、置換されていてもよいC1-C6アルキレン基であり、あるいは、
R6およびR7は、R6が結合する窒素原子と一緒になって、置換されていてもよい非芳香族性複素環式基、または置換されていてもよいヘテロアリール基を形成してもよく、あるいは、
R6、R7およびR8は、R6が結合する窒素原子と一緒になって、置換されていてもよい非芳香族性複素環式基、置換されていてもよい非芳香族性複素環アルキル基、置換されていてもよいヘテロアリール基、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキル基を形成してもよく、そして、
*は、Lとの結合位置を示す]
で示される擬似固相保護基、
を提供する。
式(II)中、
各R5が独立して、置換されていてもよいC8-C24のアルキル基であり、
R6は、置換されていてもよいC1-C3アルキル基、置換されていてもよいC5-C6シクロアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいヘテロアリール基、または置換されていてもよいアラルキル基から選ばれ、
R7が、置換されていてもよいC1-C4アルキレン基であり、
R8が、置換されていてもよいC1-C2アルキレン基であり、あるいは、
R6およびR7が、R6が結合する窒素原子と一緒になって、置換されていてもよい非芳香族性複素環式基、または置換されていてもよいヘテロアリール基を形成してもよく、あるいは、
R6、R7およびR8が、R6が結合する窒素原子と一緒になって、置換されていてもよい非芳香族性複素環式基、または置換されていてもよい非芳香族性複素環アルキル基を形成してもよい、
擬似固相保護基が挙げられる。
*は、Lとの結合位置を示し;
**は、カルボニル基との結合位置を示し;
R6、R7およびR8は各々式(II)で定義する通りである)
で示される部分が、下記の構造式:
Zは、上記式(II)で示される擬似固相保護基であり、
Lは、リンカーであり、
Baseは、各々独立して保護されていてもよい核酸塩基であり、
n個のEWGは、各々独立して電子吸引性基であり、
n個のR4は、各々独立して酸素原子または硫黄原子であり、
n個のRは、各々独立して水素原子、ハロゲン原子、保護基で置換されていてもよいヒドロキシ基、置換されていてもよいC1-C6アルコキシ基、4位炭素原子に架橋する有機基、または架橋構造型人工核酸基であり、
nは、0以上の任意の整数であり、そして、
Xは、酸により脱保護可能な一時保護基である]
によって示されるヌクレオチドを提供する。
Lが、下記式:
Baseは、各々独立して保護されていてもよい核酸塩基であり、そして、
Rは、各々独立して水素原子、ハロゲン原子、保護基で置換されていてもよいヒドロキシ基、置換されていてもよいC1-C6アルコキシ基、4位炭素原子に架橋する有機基、または架橋構造型人工核酸基である]
からなる群のいずれか1つから選ばれる基であるリンカーが挙げられる。
1段階目
i)5’OH末端n量体を溶媒に溶解して、
ii)5’OH末端n量体、m+1-ホスホラミダイト化合物、および活性化剤を、溶媒中で反応させて、カップリング反応を行う。
反応の進行は、HO(Nps)n-SR(これは、HO(Nps)n-SRの消失による)の消失により確認する。
ii)カップリング反応後に、反応生成物を本発明のキャッピング反応用試薬と反応させてキャッピング反応を行う。
iv)キャッピング反応後に求核剤(例えば、エタノール等のアルコール)で処理して、カップリング粗生成物を得る。
v)有機塩基(例えばピリジンを)含む溶媒中で、該カップリング反応生成物と硫化試薬とを反応させる。次いで、反応生成物をホスファイト化合物と反応させた後、反応生成物をアルコール(例えば、メタノール)で晶析して、中間体DMT-(Nps)m+1+n-SRを得る。
2段階目
vi)得られた中間体DMT-(Nps) n+1-SRを、ピロールおよび酸と、ピリジンおよびアルコール(例えば、メタノール)を含む溶媒を用いて晶析して、目的物HO-(Nps) n+1-SRを得る。
1段階目
i)5’OH末端n量体を溶媒に溶解する。
ii)5’OH末端n量体、m+1-ホスホラミダイト化合物、および活性化剤を、溶媒中で反応させて、カップリング反応を行う。
反応の進行は、HO(Nps)n-SR(これは、HO(Nps)n-SRの消失による)の消失により確認する。
ii)カップリング反応後に、反応生成物を本発明のキャッピング反応用試薬と反応させてキャッピング反応を行う。
iv)キャッピング反応後に求核剤(例えば、エタノール等のアルコール)で処理して、カップリング粗生成物を得る。
v)有機塩基(例えばピリジン)を含む溶媒中で、該カップリング反応生成物と硫化試薬とを反応させる。次いで、反応生成物をホスファイト化合物と反応させた後、ピリジンおよびアルコール(例えば、メタノール)を含む溶媒を用いて晶析して、目的物HO-(Nps) n+1-SRを得る。
本発明の1態様によれば、本発明は、例えば(オリゴ)ヌクレオチドの製造及び精製のためのキットをも提供する。本発明のキットは、成分として少なくとも1つの本発明のキャッピング反応用試薬を含む。本発明の1実施態様によれば、本発明のキットは、(a)本発明のキャッピング反応用試薬;(b)求核剤;(c)少なくとも1つの(オリゴ)ヌクレオチド化合物、例えば、(オリゴ)ヌクレオチドのホスホラミダイト化合物;(d)少なくとも1つの伸張可能な(オリゴ)ヌクレオチド化合物;(e)オリゴヌクレオチドを伸張するのに用いる少なくとも1つの活性化剤;(f)少なくとも1つの緩衝液;(g)キット成分を用いて(オリゴ)ヌクレオチドを伸張するための操作説明を記載する添付文書;並びに、(h)キット成分を充填するための少なくとも1つの容器、を含む。ここで、「緩衝液」は、使用するキット成分に悪影響(例えば、キット成分の分解、反応の阻害)をもたらさない限り、通常使用されるものが挙げられる。
試薬は、適宜、市販のものを入手するか、あるいは公知の方法に従って製造した。また、各種測定機器は、通常使用される機器を用いて使用した。
実施例1
2-シアノエチル オクタデシル ジイソプロピルホスホラミダイトの製造
1H-NMR (400 MHz CDCl3); δ 0.88 (t, 3H, J = 7.2 Hz), 1.15-1.19 (m, 12H), 1.25-1.34 (m, 90H), 1.58-1.62 (m, 2H), 2.64 (t, 2H, J = 6.4 Hz), 3.55-3.65 (m, 4H), 3.80-3.85 (m, 2H)
31P-NMR (162 MHz CDCl3); δ 146.77
2-シアノエチル オクタデシル ジイソプロピルホスホラミダイトの製造(50 mmol scale)
アルゴン雰囲気下、オクタデカノール 13.52 g及びテトラゾール1.93 gに脱水ジクロロメタン60 mL、アセトニトリル40 mLを加えて撹拌し溶解させた後、3-(ビス(ジイソプロルピルアミノ)ホスフィノキシ)プロパンニトリル(17.5 mL)を滴下して加えて一時間撹拌した。該反応液をジクロロメタンで洗い込みながら分液ロートへ移し、水で洗浄を行い、有機層を減圧濃縮した。濃縮した反応混合物にヘキサンに溶解しアセトニトリルで洗浄操作を2回行なった。ヘキサン層はエバポレーターで減圧濃縮し、無色油状の2-シアノエチル オクタデシル ジイソプロピルホスホラミダイトを20.7g得た
2-シアノエチル オクタデシル ジイソプロピルホスホラミダイトの製造(三価リン化合物として2-シアノエチル ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを用いる場合)
アルゴン雰囲気下、オクタデカノール 811 mg及びジイソプロピルエチルアミン1.04 mLに脱水テトラヒドロフラン6 mLを加えて撹拌し溶解、氷冷した後、2-シアノエチル ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト(0.74 mL)を滴下して加えて一時間撹拌した。該反応液をジクロロメタンで洗い込みながら分液ロートへ移し、水で洗浄を行い、有機層を減圧濃縮した。濃縮した反応混合物にヘキサンに溶解しアセトニトリルで洗浄操作を2回行なった。ヘキサン層はエバポレーターで減圧濃縮し、無色油状の2-シアノエチル オクタデシル ジイソプロピルホスホラミダイトを1.08 g得た。
2-シアノエチル デシル ジイソプロピルホスホラミダイトの製造
1H-NMR (400 MHz CDCl3); δ 0.88 (t, 3H, J = 7.2 Hz), 1.15-1.19 (m, 12H), 1.25-1.34 (m, 14H), 1.58-1.62 (m, 2H), 2.64 (t, 2H, J = 6.4 Hz), 3.55-3.65 (m, 4H), 3.79-3.84 (m, 2H)
31P-NMR (162 MHz CDCl3); δ 146.75
2-シアノエチル オクチル ジイソプロピルホスホラミダイトの製造
2-シアノエチル ヘキシル ジイソプロピルホスホラミダイトの製造
2-シアノエチル 2’-オクチルドデカニル ジイソプロピルホスホラミダイトの製造
1H-NMR (400 MHz CDCl3); δ 0.88 (t, 6H, J =7.2 Hz), 1.16-1.19 (m, 12H), 1.2-1.4 (m, 32H), 1.54 (m, 1H), 2.63 (t, 2H, 6.4 Hz), 3.43-3.49 (m, 1H), 3.52-3.62 (m, 3H), 3.78-3.86 (m, 2H)
31P-NMR (162 MHz CDCl3); δ 146.90
Phy-CE-ホスホラミダイトの製造
1H-NMR (400 MHz CDCl3); δ 0.88-0.99 (m, 15H), 1.01-1.16 (m, 8H), 1.16-1.21 (m, 12H), 1.21-1.32 (m, 9H,), 1.32-1.45 (m, 4H), 1.49-1.55 (m, 2H), 1.55-1.73 (m, 1H), 2.64 (t, 2H, 6.4 Hz), 3.55-3.72 (m, 4H), 3.73-3.79 (m, 2H)
31P-NMR (162 MHz CDCl3); δ 147.13, 147.22
化合物I 8.12 gを脱水ジクロロメタン35 mlに溶解し、該溶液に、トリエチルアミン 14.9 mLおよび無水コハク酸 4.46 gを加えた。該混合物を室温にて終夜攪拌した後にメタノール 2.2 mLを加え、該混合物を更に終夜攪拌した。得られた混合溶液をリン酸トリエチルアミン緩衝液(pH 約6.8)で洗浄した後に、該混合液を減圧濃縮し、続いて減圧下で終夜留去することによって揮発成分を除いて、化合物IIを11.1 g得た。トリエチルアミンの存在比は1H NMR積分値から概算した。
1H-NMR (400 MHz CDCl3); δ 1.20 (t, 7.7H, J = 7.2 Hz), 2.58 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 2.68 (t, 2H, J = 6.8 Hz) , 2.94 (q, 5.1H, J = 7.2 Hz), 3.25 (t, 2H, J = 5.0 Hz), 3.79 (s, 6H), 4.23 (t, 2H, J = 5.0 Hz), 6.80-6.85 (m, 4H), 7.15-7.21 (m, 1H), 7.27-7.36 (m. 6H), 7.44-7.46 (m. 2H), 9.65 (brs, 1.9H)
化合物IIIの合成は特開2001-2533986に記載の方法に従い行った。
化合物III 15.7 g、化合物II 10.6 g、および脱水トルエン 100 mLの混合物を、減圧下濃縮乾固した。残渣に脱水クロロホルム100 mlを加え、更にジイソプロピルエチルアミン4.35 mL、HBTU 9.47gおよびDMAP 3.05 gを加えた。該混合物を45℃において一晩攪拌した。得られた反応混合物にメタノール 100 mLを加え、減圧下濃縮した。生じた固形物を濾過し、メタノール洗浄し、減圧下乾燥した。脱水トルエン100 mlとの混合物を、減圧下で濃縮乾固した。残渣に脱水クロロホルム 100 mLを加え、更に2,4,6-トリメチルピリジン 45 mL、1-メチルイミダゾール 30mLおよび無水酢酸 30 mLを加え、該混合物を一晩攪拌した。得られた反応混合物にメタノール 100mLを加え、減圧下濃縮した。生じた固形物を濾過し、メタノール洗浄し、減圧下乾燥して、目的物である化合物IVを22.67 g得た。NMR測定結果及びジメトキシトリチルカチオンによる定量(λ=498 ε=7.0*10-4) 725 umol/g(理論値704 umol/g)よりほぼ完全にエステル化されたと判断した。
1H-NMR (400 MHz CDCl3); δ 0.88 (t, 9 H, J = 7.0 Hz), 1.15-1.39 (m, 84H), 1.40-1.51 (m, 6H), 1.68-1.85 (m, 6H), 2.69 (s, 4H), 3.04(s, 3H) 3.27 (t, 2H, J = 5.0 Hz), 3.5-3.82 (m, 2H) 3.79 (s, 6H), 3.93-3.98 (m, 6H), 4.26 (t, 2H, J = 5.0 Hz), 4.30-4.43 (m, 2H), 6.57 (s, 2H), 6.80-6.85 (m, 4H), 7.17-7.22 (m, 1H), 7.26-7.34 (m. 6H), 7.42-7.46 (m. 2H)
化合物IV 19.8 gを550mL ジクロロメタンに溶解し、該溶解液にピロール12.8 mLおよびジクロロ酢酸18.3 mLを加えた。該混合物を室温にて15分間攪拌し、反応混合物にメタノール 332 mLおよびピリジン 26.8 mLを加えた。反応混合物を減圧下濃縮し、生じた固形物を濾過し、メタノール洗浄し、減圧下乾燥して、目的物である化合物Vを15.6 g得た。
1H-NMR (400 MHz CDCl3); δ 0.88 (t, 9 H, J = 6.8 Hz), 1.15-1.39 (m, 84H), 1.41-1.51 (m, 6H), 1.68-1.85 (m, 6H), 2.54 (brs, 1H), 2.66 (s, 4H), 3.05(s, 3H) 3.5-3.81 (m, 2H) 3.81 (dd, 2H, J = 9.2, 6.0 Hz), 3.94-3.99 (m, 6H), 4.23 (dd, 2H, J = 9.2, 6.0 Hz), 4.10-4.48 (m, 2H), 6.58 (s, 2H)
200mLナスフラスコ中の2-ヒドロキシエチル 2-(N-メチル-3,4,5-トリス(オクタデシル)ベンゾアミド)エチルスクシネート 3.39 g)に、脱水ジクロロメタン60mL、および化合物DMT-dT-アミダイト 3.35 gを加え溶解後、該溶解液にETT 879 mgを加え、該混合物を室温にて30分間撹拌した。15分後TLCによって基質の消失を確認した。該反応液に、2-シアノエチル オクタデシル ジイソプロピルホスホラミダイト424 uLを加え、反応混合物を15分間撹拌した。該反応混合物にエタノール 876 uLを加え、該混合物を室温にて10分間撹拌した。該混合物に、ピリジン:アセトニトリル=6:4(v/v)の混合溶液 (30 mL)および2-ブタノンペルオキシド(0.1 Mジクロロメタン溶液) 81 mLを加え、該混合物を室温にて15分間撹拌した。該反応混合物に、トリメチルホスファイト 658 uLを加え、該混合物を更に15分間撹拌した。得られた反応混合物をジクロロメタンで希釈後に、メタノール 150 mLを加え、混合物を減圧下濃縮した。生成した固形物を濾過し、メタノール洗浄することによって、中間体DMT-dTpo-SRを得た。
得られた中間体DMT-dTpo-SRを500 mL ナスフラスコ内でジクロロメタン 225 mLに溶解し、そこにピロール 5.2 mL、およびジクロロ酢酸 7.4 mLを加えた。該混合物を室温にて15分間撹拌し、その後にメタノール150 mLおよびピリジン8.70mLを加えた。該混合物を減圧下濃縮し、生成した固形物をろ過し、メタノール洗浄して減圧乾燥することで目的化合物HO-dTpo-SRを4.38 g得た。
1H-NMR (400 MHz CDCl3); δ 0.88 (t, 9H, J = 7.2 Hz), 1.2-1.4 (m, 84H), 1.4-1.5 (m, 6H), 1.60 (s, broad, 1H), 1.71-1.81 (m, 6H), 1.91 (s, 3H), 2.47-2.54 (m, 2H), 2.64-2.71 (m, 4H), 2.80 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 3.05 (s, 3H), 3.65-3.81 (m, 2H), 3.84-3.88 (m, 2H), 3.93-3.97 (m, 6H), 4.23-4.40 (m, 9H), 5.12-5.18 (m, 1H), 6.23 (t, 1H, J = 6.8 Hz), 6.58 (s, 2H), 7.52 (s, 1H), 8.14-8.18 (m, 0.5H), 8.52-8.58 (m. 0.5H)
31P-NMR (162 MHz CDCl3); δ -3.15, -3.07
化合物HO-dTpo-SR 1.49 gを100mLナスフラスコにおいて脱水ジクロロメタン20mL、および化合物DMT-mG-アミダイト 1.33 gを加え溶解後、該溶解液にETT 293 mgを加え、該混合物を室温にて一晩撹拌した。TLCによって基質の消失を確認した。該反応液に、2-シアノエチル オクタデシル ジイソプロピルホスホラミダイト141 uL加え、反応混合物を30分間撹拌した。該反応混合物にエタノール 292uLを加え、該混合物を室温にて10分間撹拌した。該混合物に、2-ブタノンペルオキシド(6.5 M) 0.55 mLを加え、該混合物を室温にて15分間撹拌した。該反応混合物に、トリメチルホスファイト 328 uLを加え、該混合物を更に15分間撹拌した。得られた反応混合物をジクロロメタン55mlで希釈した後に、ピロール 1.7 mL、およびトリフロロ酢酸 2.3 mLを加えた。該混合物を室温にて15分間撹拌し、その後にメタノール50 mLおよびピリジン4.8mLを加えた。該混合物を減圧下濃縮し、生成した固形物をろ過し、メタノール洗浄して減圧乾燥することで目的化合物HO-mGpo-dTpo-SRを2.00g(収率:定量)得た。
化合物HO-mGpo-dTpo-SR 2.00 g(max.1.00 mmol)を100mLナスフラスコにおいてアルゴン雰囲気下、脱水ジクロロメタン20mL、および化合物DMT-mA-アミダイト 1.35 gを加え溶解後、該溶解液にETT 293 mgを加え、該混合物を室温にて一晩撹拌した。TLCによって基質の消失を確認した。該反応液に、2-シアノエチル オクタデシル ジイソプロピルホスホラミダイト141 uLを加え、反応混合物を30分間撹拌した。該反応混合物にエタノール 292uLを加え、該混合物を室温にて10分間撹拌した。該混合物に、2,4,6-コリジン 714ul、DDTT 582 mgを加え、該混合物を室温にて45分間撹拌した。該反応混合物に、トリメチルホスファイト 328 uLを加え、該混合物を更に15分間撹拌した。得られた反応混合物をジクロロメタン55mlで希釈した後に、ピロール 1.7 mL、およびトリフルオロ酢酸 2.3 mLを加えた。該混合物を室温にて15分間撹拌し、その後にメタノール50 mLおよびピリジン4.8mLを加えた。該混合物を減圧下濃縮し、生成した固形物をろ過し、メタノール洗浄して減圧乾燥することで目的化合物HO-mAps-mGpo-dTpo-SRを2.42g得た。
化合物HO-mAps-mGpo-dTpo-SR 2.42 gを、100 mLナスフラスコにおいて、アルゴン雰囲気下、脱水ジクロロメタン20 mL、および化合物DMT-dC-アミダイト 1.27 gを加え、該溶解液にETT 293 mgを加え、該混合物を室温にて撹拌し、HPLCによって基質の消失を確認した後(約2時間後)に該反応液に、2-シアノエチル オクタデシル ジイソプロピルホスホラミダイト141 uLを加え、反応混合物を30分間撹拌した。反応終了後に、該反応混合物にエタノール 292 uLを加え、該混合物を室温にて10分間撹拌した。該混合物に、ピリジン:アセトニトリル=6:4(v/v)の混合溶液 (10 mL)およびDDTT 554 mgを加え、該混合物を室温にて45分間撹拌した。該反応混合物に、トリメチルホスファイト 219 uLを加え、該混合物を更に15分間撹拌した。得られた反応混合物をジクロロメタンで希釈後に、メタノール 55 mLを加え、混合物を減圧下濃縮した。生成した固形物を濾過し、メタノール洗浄することによって、目的化合物DMT-dCps-mAps-mGpo-dTpo-SRを3.15 g得た。
化合物DMT-dCps-mAps-mGpo-dTpo-SR 4 mgをバイアルに加え、28%アンモニア水500 uLを加えて55℃で8時間放置した。下記表2の条件下でのHPLCの分析の結果、純度98.5%であった。
MS (MALDI, TOF) Anal. Calc. for C64H77N15O28P5S2 : 1691.35. Found 1691.52
HPLC分析条件
2-ヒドロキシエチル 2-(N-メチル-3,4,5-トリス(オクタデシル)ベンゾアミド)エチルスクシネート 1.13 gを、100mLナスフラスコにおいてアルゴン雰囲気下、脱水ジクロロメタン20mL、および化合物MMT-mG-アミダイト 1.26 gを加え溶解後、該溶解液に5-エチルチオ-4H-テトラゾール(略ETT) 293 mgを加え、該混合物を室温にて一晩撹拌した。TLCによって基質の消失を確認した。該反応液に、2-シアノエチル オクタデシル ジイソプロピルホスホラミダイト141 uLを加え、反応混合物を30分間撹拌した。該反応混合物にエタノール 292uLを加え、該混合物を室温にて10分間撹拌した。該混合物に、ピリジン:アセトニトリル=6:4(v/v)の混合溶液 (10 mL)および3-((N,N-ジメチルアミノメチリデン)アミノ)-3H-1,2,4-ジチアゾール-5-チオン(DDTT)582 mgを加え、該混合物を室温にて45分間撹拌した。該反応混合物に、トリメチルホスファイト 218 uL (1.8 mmol)を加え、該混合物を更に15分間撹拌した後にメタノール50 mLを加えた。該混合物を減圧下濃縮し、生成した固形物をろ過し、メタノール洗浄して減圧乾燥することで目的化合物MMT-mGps-SRを1.93g得た。
1H-NMR (400 MHz CDCl3); δ 0.82-0.90 (m, 12H) , 0.95-0.97 (m, 3H)1.20-1.39 (m, 84H), 1.40-1.51 (m, 6H), 1.70-1.82 (m, 6H), 1.89-2.04 (m 1H), 2.57-2.70 (m, 5H), 2.72-2.89 (m, 1H), 3.05 (brs, 3H), 3.24-3.31 (m, 1H), 3.44 (s, 1.5H), 3.45 (s, 1.5H), 3.47-3.53 (m, 1H), 3.75-3.86 (m, 2H), 3.79 (s, 3H), 3.89-3.97 (m, 6H), 4.06-4.45 (m, 9H), 4.70-4.79 (m, 1H), 5.36-5.43 (m, 1H), 5.88 (d, 0.5H, J = 6.8 Hz), 5.90 (d, 0.5H, J = 8.0 Hz), 6.58 (s, 2H), 6.80-6.86 (m, 2H), 7.22-7.38 (m, 8H), 7.46-7.52 (m. 4H), 7.77 (s, 0.5H), 7.78 (s, 0.5H), 8.52 (brs, 0.5H), 8.61 (brs, 0.5H), 12.03 (s, 1H)
31P-NMR (162 MHz CDCl3); δ 67.85, 67.96
2-ヒドロキシエチル 2-(N-メチル-3,4,5-トリス(オクタデシル)ベンゾアミド)エチルスクシネート 0.56gを、100mLナスフラスコにおいてアルゴン雰囲気下、脱水ジクロロメタン10mL、および化合物MMT-mG-アミダイト 0.63 gを加え溶解後、該溶解液にETT 146 mgを加え、該混合物を室温にて一晩撹拌した。TLCによって基質の消失を確認した。該反応液に、ETT 98 mgを加え、2-シアノエチル オクタデシル ジイソプロピルホスホラミダイト353 uLを加え、反応混合物を30分間撹拌した。該混合物に、ピリジン:アセトニトリル=6:4(v/v)の混合溶液 (5 mL)およびDDTT 485 mgを加え、該混合物を室温にて45分間撹拌した。該反応混合物に、トリメチルホスファイト 137 uLを加え、該混合物を更に15分間撹拌した後にメタノール25 mLを加えた。該混合物を減圧下濃縮し、生成した固形物をろ過し、メタノール洗浄して減圧乾燥することで化合物MMT-mGps-SR及び化合物MMT-mG(psCap)ps-SRの混合物を0.98g得た。
化合物MMT-mGps-SR及び化合物MMT-mG(psCap)ps-SRの混合物
31P-NMR (162 MHz CDCl3); δ 67.85, 67.96, 71.43
MMT-mGps-SR 0.380gを50 mL ナスフラスコ内でジクロロメタン 15 mLに溶解し、そこにピロール 0.35 mL、およびトリフロロ酢酸 0.46 mLを加えた。該混合物を室温にて15分間撹拌し、その後にメタノール10 mLおよびピリジン0.97mLを加えた。該混合物を減圧下濃縮し、生成した固形物をろ過し、メタノール洗浄して減圧乾燥することで目的化合物HO-mGps-SRを0.320g得た。
1H-NMR (400 MHz CDCl3); δ 0.88 (t 9H, J = 6.8 Hz) 1.19-1.39 (m, 90H), 1.40-1.51 (m, 6H), 1.70-1.82 (m, 6H), 1.89-2.04 (m 1H), 2.58-2.73 (m, 5H), 2.75-2.85 (m, 2H), 3.07 (brs, 3H), 3.38 (s, 1.5H), 3.39 (s, 1.5H), 3.52-4.06 (m, 10H), 4.12-4.42 (m, 8H), 4.42-4.49 (m, 1H), 4.53-4.58 (m, 1H), 5.32 (dd, 1H, J = 10.8, 4.8 Hz), 5.87 (t, 1H, J = 8.0 Hz), 6.58 (s, 2H), 7.90-7.96 (m, 1H), 8.80-8.96 (m, 1H), 12.13 (s, 1H)
31P-NMR (162 MHz CDCl3); δ 67.55
化合物MMT-mGps-SR、およびMMT-mG(psCap)ps-SRの混合物0.380gから上記反応と同様にしてHO-mGps-SR、およびHO-mG(psCap)ps-SRの混合物を0.322g得た。
31P-NMR (162 MHz CDCl3); δ 51.81, 67.55, 67.13
NMR tube中でのグアニン6位O-高脂溶性アミダイト アダクトの求核剤による分解の観測
溶液A:0.057M MMT-mGps-SRのCDCl3溶液、及び溶液B:0.9M ETTのCDCl3溶液を調製した。
C18H37O-ホスホラミダイト22.1ulをNMRチューブに分注し、溶液A 437.5ulを加えよく混合後、溶液B 125ulを加え攪拌した。溶液B添加5分後、下記各々の化合物に特有の31Pシグナルについて31PNMRを測定した。
C18H37O-ホスホラミダイト-ETT adduct 由来のシグナル124.9ppmの積分値
MMT-mG(pCap)ps-SR由来のシグナル133.5ppmの積分値
C18H37O-ホスホラミダイト由来のシグナル146.6ppmの積分値
各々の積分値を商の分子にし、MMT-mGps-SR由来のシグナル68.5ppmの積分値を商の分母にした商の値を求め、以下の各種求核剤(ホスホラミダイトに対して2等量)を添加攪拌後5分後、31PNMRを測定し、各々に対応する商の値を比較する事により、それぞれの残存比をもとめた。尚、有機塩基2, 4, 6-コリジン(3等量)を加える場合には、各種求核剤を加える前に添加し、攪拌した。
結果を表3に示す。
この結果、酸性度の低い求核剤全てにおいて、効率よいmG(pCap)由来のシグナルの消失が確認された。また、予め有機塩基2, 4, 6-コリジンを添加し、ETT(酸)による活性化を弱めた状態でも効率よく、mG(pCap)由来のシグナルを消失できることが分かり、本反応が、求核剤がクエンチ剤として作用する反応ではないことを見出した。
キャッピングによる、N-1オリゴヌクレオチド副生成物の残存量および求核剤存在下における硫化効率の検証
キャッピング試薬の使用によるN-1オリゴヌクレオチド副生成物の生成の抑制、および求核剤の使用による硫化反応の効率の保持を調べるための反応式を、下記反応式VIIに示す。
反応式VII
化合物DMT-mUps-dTpo-SR 4 mgをバイアルに加え、28%アンモニア水500 uLを加えて、55℃で8時間放置して生じるDMT-mUps-dTpo-EtOHの溶液について、HPLCを用いて、別途核酸合成機で合成したDMT-mUpo-dTpo-EtOH及びDMT-dTps-EtOHを標品として、硫化効率およびN-1生成量を求めた。その結果、DMT-mUpo-dTpo-EtOH、DMT-dTps-EtOH(N-1副生成物)の生成量は目的硫化物DMT-mUps-dTpo-EtOHに対してともに0.1%以下であった。その結果、エタノール添加により硫化効率は落ちないこと及び、キャッピング剤添加により効率よくN-1の生成が抑制されていることが分かった。
無水酢酸キャッピングによるアデニン塩基のジアシル化の検証
無水酢酸を用いるキャッピングによる、アデニン塩基のジアシル化の生成を調べるための反応式を、下記反応式VIIIに示す。
反応式VIII
化合物DMT-dA 13.2g(carbosynth社製)を脱水ジクロロメタン100mLに溶解し、該溶液に、トリエチルアミン8.4mLおよび無水コハク酸 3.0gを加えた。該混合物を室温にて終夜攪拌し、該反応混合物にメタノール2.0mLを加え、該混合物を更に終夜攪拌した。得られた混合溶液をリン酸トリエチルアミン緩衝液(pH 約6.8)で洗浄し、該混合溶液を減圧濃縮し、続いて減圧下で終夜留去することによって揮発成分を除いて、DMT-dA-Suc17.7g を得た。トリエチルアミンの存在比は1H NMR積分値から概算した。
1H-NMR (400 MHz CDCl3); δ 1.19 (t, 9 H, J = 7.2 Hz), 2.54-2.75 (m, 5H), 2.92(q, 6H, d=7.2), 2.96-3.05 (m, 1H), 3.38-3.49 (m, 1H), 3.74(s, 6H) 4.33-4.38 (m, 1H), 5.52-5.58 (m, 1H), 6.53 (dd, 1H, J=8.4, 5.2 Hz), 6.75-6.83 (m, 4H), 7.16-7.32 (m, 5H), 7.36-7.41 (m. 2H), 7.50-7.56 (m. 2H), 7.57-7.64 (m. 1H), 8.00-8.06 (m. 2H), 8.19 (s. 1H), 8.73 (s. 1H), 9.03 (brs. 1H)
化合物III 15.7g、化合物DMT-dA-Suc 17.7g、に脱水クロロホルム 100mLを加え、更に該混合液にジイソプロピルエチルアミン4.33mL、 HBTU 9.42gおよびDMAP 3.04gを加えた。該混合物を45℃において一晩攪拌した。得られた反応混合物にメタノール 100mLを加え、該混合物を減圧下濃縮した。生じた固形物を濾過し、メタノール洗浄し、減圧下で乾燥して、固形物である化合物DMT-dA-Su-Rを27.9g得た。
1H-NMR (400 MHz CDCl3); δ 0.88 (t, 9 H, J = 6.4 Hz), 1.20-1.38 (m, 84H), 1.41-1.50 (m, 6H), 1.68-1.84 (m, 6H), 2.62-2.74(m, 5H), 2.99-3.12(m, 4H), 3.42-3.52 (m, 3H), 3.68-3.79 (m, 1H) 3.79 (s, 6H), 3.92-3.98 (m, 6H), 4.10-4.51 (m, 3H), 5.53-5.62 (m, 1H), 6.52 (dd, 1H J = 8.4, 5.6 Hz), 6.58 (s, 2H), 6.74-6.84 (m, 4H), 7.16-7.31 (m, 5H), 7.34-7.41 (m. 2H), 7.50-7.58 (m. 2H), 7.59-7.65 (m. 1H), 8.00-8.06 (m. 2H), 8.18 (s. 1H), 8.74 (s. 1H), 8.94(brs. 1H)
DMT-dA-Su-Rを27.9gに脱水クロロホルム100mLを加え、更に2,4,6-トリメチルピリジン 45mL、1-メチルイミダゾール 30mLおよび無水酢酸 30mLを加え、該混合物を一晩攪拌した。得られた反応混合物にメタノール 100mLを加え、減圧下濃縮した。生じた固形物を濾過し、メタノール洗浄し、減圧下乾燥して、化合物DMT-diacyl-dA-Su-Rおよび化合物 DMT-dA-Su-Rの混合物を27.8g得た。
8割程度のジアシル化された化合物DMT-diacyl-dA-Su-Rと、2割程度の原料化合物 DMT-dA-Su-Rの混合物であることが分かり、無水酢酸によるキャッピングでは、アデニン塩基のジアシル化生成物を含む混合物を生じることが分かった。このことから、オリゴヌクレオチド鎖長が長くなるに従い、オリゴヌクレオチド生成物の組成がより複雑化する事が容易に予想できる。この結果、無水酢酸によるキャッピング工程が、擬似固相保護基を用いた液相法によるオリゴヌクレオチドの製造に導入されると、カップリング工程において反応終点の確認、即ち反応効率の確認が困難に成ることが分かった。
Claims (6)
- 式(I):
R1は、置換されていてもよいC6-C30アルキルオキシ基であり、該置換基は、C1-C3アルキル基、またはC3-C6シクロアルキル基から選ばれる少なくとも1つの基であり、
R2は各々独立して、置換されていてもよいC1-C6アルキル基であり、該置換基は、C1-C3アルキル基、またはC3-C6シクロアルキル基から選ばれる少なくとも1つの基であり、そして、
R3は、置換されていてもよいC6-C30アルキルオキシ基、置換されていてもよいC1-C8アルキルオキシ基、または置換されていてもよいC2-C8アルキニルオキシ基であり、ここで、置換されていてもよいC6-C30アルキルオキシ基における置換基は、C1-C3アルキル基、またはC3-C6シクロアルキル基から選ばれる少なくとも1つの基であり、置換されていてもよいC1-C8アルキルオキシ基、または置換されていてもよいC2-C8アルキニルオキシ基における置換基はシアノ基(CN)である。]
で示される化合物の製造方法であって、以下の工程:
(1)脂肪族アルコールおよび三価リン化合物を、活性化剤または有機塩基の存在下、有機溶媒中で反応する;
(2)得られた反応混合物を、水を用いて分液洗浄する;
(3)工程(2)後の有機層を回収し、濃縮する(但し、工程(1)で使用する有機溶媒がニトリル系溶媒の場合には、工程(2)~(3)は省略してもよい);
(4)工程(3)で得られた残渣、または工程(1)で使用する有機溶媒がニトリル系溶媒の場合には、工程(1)で得られた反応混合物を脂肪族炭化水素系溶媒中に溶解する(但し、工程(1)で使用する有機溶媒が脂肪族炭化水素系溶媒の場合には、工程(2)~(4)は省略してもよい);
(5)工程(4)で調製した脂肪族炭化水素系溶液、または工程(1)で使用する有機溶媒が脂肪族炭化水素系溶媒の場合には、工程(1)で得られた反応混合物を、ニトリル系溶媒を用いて分液洗浄する;
(6)工程(5)後の脂肪族炭化水素系溶液を回収して、ホスホラミダイト化合物を溶液として得る、
を含む、該製造方法。 - 工程(4)で使用される脂肪族炭化水素系溶媒が、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、またはオクタンから少なくとも1つ選ばれ、そして工程(5)で使用されるニトリル系溶媒が、アセトニトリル、プロピオニトリル、またはベンゾニトリルから少なくとも1つ選ばれる、請求項1に記載の製造方法。
- R1が、置換されていてもよいC10-C30の第1級または第2級のアルキルオキシ基であり、そして、R3が、-OCH2CH2CN、-OCH3または-OCH2CH3で示される基である、請求項1または2記載の製造方法。
- 各R2が共にi-プロピル基である、請求項1~3のいずれか1項に記載の製造方法。
- 工程(6)で得られる溶液が、H-ホスホネート化合物、ジアミダイト化合物を含まず、実質的に純粋なホスホラミダイト化合物の溶液である、請求項1~5のいずれか1項に記載の製造方法。
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