JP7220439B1 - キメラ分子の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
核酸医薬における薬剤戦略として、例えば、疾患進行に関与するメッセンジャーRNA(mRNA)やマイクロRNA(miRNA)、エスアイRNA(siRNA)などを標的とし、塩基配列選択的に標的を認識し、複合体を形成することで標的RNAの機能を抑制し治療効果を発現するアンチセンス核酸(ASO)が知られている。これら核酸医薬が有効に薬効発現するためには、1)高い生体内安定性、2)標的核酸への高い特異性と複合体安定性、が求められ、天然型DNA/RNAに化学修飾を施した修飾オリゴ核酸/人工オリゴ核酸の開発が精力的に研究されている。
固相合成法は、プロセス最適化がなされ自動化も進んでいるが、本質的に不均一系であり、その低い反応性を補うため、例えば6~10当量以上の大過剰量の試薬を用いる必要があり、コスト面で改善の余地がある。また、単離精製に高度な技術を要するほか、反応用固相樹脂に対する官能基の担持量の限界からスケールアップが難しく、ラボスケールには向くが、工業化を見据えると固相合成法の適用は困難であると言わざるを得ない。
しかし、特許文献1で報告されるような、代表的にはリボ核酸(RNA)やデオキシリボ核酸(DNA)と、ペプチド核酸(PNA)やペプチドリボ核酸(PRNA)とを任意に組み合わせて融合したキメラ分子の製造方法としては、固相合成法による製造方法しか知られていない。
すなわち、これまで同種分子同士を結合させる手法に関しては液相合成法による報告はあったものの、RNAやDNAに対してPNAやPRNAを融合させたPNA-DNA構造、あるいはPNAやPRNAに対してRNAやDNAを融合させたDNA-PNA構造の構築については、現状では少なくとも一部の工程を固相合成法に頼る他ない。
主鎖骨格が中性又は陽イオン性である第1の核酸又はその誘導体と、主鎖骨格が陰イオン性である第2の核酸又はその誘導体とが、少なくとも一つずつ融合したキメラ分子の製造方法であって、
前記製造方法が、水酸基を有する第1のキメラ分子前駆体の前記水酸基を介した、前記第2の核酸又はその誘導体の導入による第2のキメラ分子前駆体の準備、
必要に応じて、前記第2のキメラ分子前駆体の脱保護、及び
前記第2のキメラ分子前駆体又は脱保護された前記第2のキメラ分子前駆体への、前記第1の核酸又はその誘導体の導入を含み、
前記水酸基を有する第1のキメラ分子前駆体は、脂溶性アンカーを含み、
前記第2の核酸又はその誘導体は、保護されていてもよいアミノ基を有し、
第2のキメラ分子前駆体の前記脱保護が、前記第2のキメラ分子前駆体に導入された前記第2の核酸又はその誘導体の保護された前記アミノ基の脱保護であり、
第1の核酸又はその誘導体の前記導入は、前記第2の核酸又はその誘導体の前記アミノ基を介した導入であり、
第2のキメラ分子前駆体の前記準備、第2のキメラ分子前駆体の前記脱保護、及びキメラ分子の前記製造が、いずれも液相合成法により行われることを特徴とする製造方法。
前記第1の核酸がPNA、PRNA、PNA/PRNA、若しくはLNAであり、前記第2の核酸がRNA若しくはDNAであることが好ましい。
前記第1の核酸がPNAであり、前記第2の核酸がDNAであることが好ましい。
キメラ分子が、第2の核酸又はその誘導体の5’末端に第1の核酸又はその誘導体が結合している部分を有することが好ましい。
前記第1のキメラ分子前駆体が、後述する特定の式で表される化合物であることが好ましい。
前記第2の核酸又はその誘導体が、後述する特定の式で表される化合物であることが好ましい。
前記保護されていてもよいアミノ基が保護されたアミノ基であり、前記保護されたアミノ基の保護基が置換されていてもよいトリチル基であることが好ましい。
前記第1の核酸又はその誘導体が、後述する特定の式で表される化合物であることが好ましい。
この方法を利用することにより、オリゴRNAやオリゴDNAにPNA構造を融合させた、若しくはこの構造にさらにPNA構造を結合させたPNA-DNA構造;あるいは、DNA-PNA構造にさらにPNA構造を融合させた、若しくはこの構造にさらにPNA構造を結合させたPNA-DNA-PNA構造の液相合成法による製造が可能となる。
本発明の製造方法の目的物であるキメラ分子は、複数の核酸が結合しており、その任意の一部が第1の核酸であって、残りの部分が第2の核酸であってよい。
複数の核酸が結合するキメラ分子において、その核酸の総数における第1の核酸と第2の核酸の個数の比率は、特に制限されないが、第1の核酸の個数:第2の核酸の個数として、1:10~10:1であってよく、好ましくは1:3~3:1であり、より好ましくは1:2~2:1である。
標的核酸としては、本発明の製造方法の目的物であるキメラ分子が結合できる標的配列を有する核酸又はその誘導体であれば特に制限はないが、RNA又はDNAが好ましく、キメラ分子を医薬組成物の有効成分として用いる場合には、標的核酸は、医薬組成物を用いて治療する疾患の原因となるたんぱく質をコードするRNA又はDNA、及び疾患に関連するmRNA、miRNA又はsiRNAであることが好ましい。
本明細書において、「ハロゲン」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨードを意味し、好ましくはフルオロ、クロロ、ブロモである。
中性の主鎖骨格としては、特に制限されないが、例えば、アミド骨格(代表的には、N-(2-アミノエチル)グリシンを単位とする骨格)が挙げられる。アミド骨格を有する核酸又はその誘導体としては、例えば、PNA又はその誘導体、PRNA又はその誘導体、PNAとPRNAとの組み合わせ(以下、「PNA/PRNA」とも言う。)又はその誘導体が挙げられる。
PNA/PRNAにおいて、PNAにおけるPRNAの結合位置は、PNAのいずれの位置でもよく、PNAの途中に結合されていてもよい。例えば、PNA-PRNA-PNAのような組み合わせであってもよい。
キメラ分子において、第1の核酸は、第2の核酸の3’末端及び5’末端のいずれに結合していてもよい。第2の核酸の5’末端に第1の核酸が結合している部分が少なくとも1つあることが好ましい。あるいは、第2の核酸の5’末端に第1の核酸が結合している部分が少なくとも1つあることが必要である。
PNAとDNAとの融合体としては、DNAの5’-位側にPNAが融合したキメラ分子(以下、「PNA-DNAキメラ分子」とも言う。)、DNAの3’-位側にPNAが融合したキメラ分子(以下、「DNA-PNAキメラ分子」とも言う。)が挙げられ、PNA-DNAキメラ分子が好ましい。
PNA/PRNAとDNAとの融合体としては、DNAの5’-位側にPNA/PRNAが融合したキメラ分子(以下、「PNA/PRNA-DNAキメラ分子」若しくは「PRPD」とも言う。)、DNAの3’-位側にPNA/PRNAが融合したキメラ分子(以下、「DNA-PNA/PRNAキメラ分子」若しくは「DPRP」とも言う。)が挙げられ、PRPDが好ましい。
・第1の核酸を手掛かりとした(好ましくは、第1の核酸のN末端を介した)、第1の核酸の伸長、
・第1の核酸を手掛かりとした(好ましくは、第1の核酸のN末端を介した)、第2の核酸の伸長、
・第2の核酸を手掛かりとした(好ましくは、第2の核酸の5’-位を介した)、第1の核酸の伸長、及び、
・第2の核酸を手掛かりとした(好ましくは、第2の核酸の5’-位を介した)、第2の核酸の伸長、
を組み合わせることにより、第1の核酸及び第2の核酸が任意の順序で組み合わせられたキメラ分子を製造することができる。
これらのうち、第1の核酸を手掛かりとした第1の核酸の伸長、第1の核酸を手掛かりとした第2の核酸の伸長、及び第2の核酸を手掛かりとした第2の核酸の伸長については、固相合成法を含めた公知の方法を採用することができる。
例えば、第1の核酸を手掛かりとした第2の核酸の伸長は、F. Bergmann,et al.、Tetrahedron Lett.、1995、36(38)、6823-6826に記載の方法若しくは国際公開第2017/086397号に記載の方法、又はこれらに準じた方法を採用することができる。
例えば、第2の核酸を手掛かりとした第2の核酸の伸長は、前述の特許文献2及び7に記載の方法若しくはこれに準じた方法を採用することができる。
(1)水酸基を有する第1のキメラ分子前駆体の水酸基を介した、第2の核酸の導入、
(2)必要に応じた、第2のキメラ分子前駆体の脱保護、及び
(3)第2のキメラ分子前駆体又は脱保護された第2のキメラ分子前駆体への、第1の核酸の導入。
以下、本発明の製造方法について説明する。必要に応じて第1の核酸としてPNA、第2の核酸としてDNAを用いた、PNA-DNAキメラ分子(DNAの5’-位側にPNAが融合したキメラ分子)の製造を例とする。
本工程は、第1のキメラ分子前駆体が有する水酸基を足掛かりとして、第2の核酸を導入する工程である。その結果、第2のキメラ分子前駆体が製造される。
第1のキメラ分子前駆体は、第2の核酸を導入するための水酸基を有することに加え、反応後の溶液に特定の溶媒を加えることにより目的物を固化させて回収の容易化に資する脂溶性アンカーを含む。
第2の核酸の導入の後、導入された第2の核酸を手掛かりとして第1の核酸を導入するため、第2の核酸は5’-位に保護されていてもよいアミノ基を有する。
求核攻撃を受ける第2の核酸のリン原子は3価であることが好ましい。この場合、1つの結合手にはデオキシリボース(RNAの場合にはリボース)の3’-位の酸素原子が置換し、別の1つの結合手には脱離基が置換し、残る1つの結合手には、最終的に-O-を生じさせることができる基が置換している。
2位に電子吸引基が置換したエトキシ基のような、弱塩基条件下、-O-を生じさせることができる基は、最終的に脂溶性アンカーの切り離しの際に脱離させることができる。また、弱塩基条件下、酸素原子から脱離する基は、本工程の第1のキメラ分子前駆体からの求核攻撃の際には必要な官能基であるが、それ以外の工程においては、脱離していても、脱離していなくてもよく、積極的に脱離させても、反応条件に起因して脱離してしまってもよい。
アミノ基の保護基としては、酸性条件下で除去できる基であれば特に制限されず、例えば、ウッツ(P.G.M.Wuts)及びグリーン(T.W.Greene)著、「Greene‘s Protective Groups in Organic Synthesis(第4版、2006年)」に記載の基が挙げられ、置換されていてもよいトリチル基が好ましい。置換されていてもよいトリチル基としては、トリチル基(Tr)、p-メトキシフェニルジフェニルメチル基(MMTr)や、ジ(p-メトキシフェニル)フェニルメチル基(DMTr)が挙げられ、MMTrがより好ましい。
2以上の第2の核酸が結合した化合物を本工程における第2の核酸として用いる場合、第2の核酸が有する保護されていてもよいアミノ基は当該2以上の第2の核酸が結合した化合物の5’-末端に存する第2の核酸のみが有していればよく、5’-末端に存する第2の核酸以外の第2の核酸は、それぞれ酸素原子を介して結合していてよい。
AGは、保護されていてもよいアミノ基を示し;
Baseは、塩基部(それぞれ同一でも異なっていてもよい。)を示し;
NR2は、弱酸性条件下、リン原子への酸素原子の求核置換反応に用いられる脱離基を示し;
LVは、酸素原子から脱離する基を示す。
なお、デオキシリボースはそれぞれ独立して2’-位に保護されていてもよい水酸基を有していてもよい。
本発明のキメラ分子の製造方法においては、脂溶性アンカーを構造の一部として含む出発原料を用いるため、脂溶性アンカーを構造の一部として含むキメラ分子が製造されうる。本発明のキメラ分子の製造方法によって製造された脂溶性アンカーを構造の一部として含むキメラ分子から脂溶性アンカーを切り離すことにより、脂溶性アンカーを構造の一部として含まないキメラ分子が製造されてもよい。脂溶性アンカーは、キメラ分子の製造においては切り離されず、その一方で任意の段階で切り離すことができることが好ましい。脂溶性アンカーは、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能であることが好ましい。
脂肪族炭化水素基は直鎖状であることが好ましく;直鎖状であって、不飽和結合を有していないことがより好ましく;直鎖状であって、不飽和結合及びエーテル性酸素原子を有していないことがさらに好ましい。
炭素数10~40の脂肪族炭化水素基の炭素数としては、10~30が好ましく、12~28がより好ましく、14~22がさらに好ましく、16~20が特に好ましい。
炭素数10~40の脂肪族炭化水素基としては、炭素数14~22の直鎖状アルキル基が好ましく、炭素数16~20の直鎖状アルキル基がより好ましく、炭素数17~19の直鎖状アルキル基がさらに好ましく、炭素数18の直鎖状アルキル基が特に好ましい。
Rは、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数1~6のアルキル基を示し;
NAは、それぞれ独立に、第1の核酸又は第2の核酸を含む構造と結合する位置を示す。
Rとしては、水素原子であることが好ましい。
例えば、式(ii)のように、NAで示される第1の核酸又は第2の核酸を含む構造と結合する位置が窒素原子である場合、第1の核酸であるPNA若しくはPRNAのカルボニル炭素と結合してアミド結合を形成していることが好ましい。
第1のキメラ分子前駆体Aは、例えば、以下の構造を有する。
Baseは、塩基部を示す。
なお、デオキシリボースは2’-位に保護されていてもよい水酸基を有していてもよい。
第1のキメラ分子前駆体Bは、例えば、以下の構造を有する。
Xは、単結合を示すか、又はXに結合する酸素原子とリン原子との結合を介する1以上の第1の核酸及び/又は第2の核酸を示す。
なお、デオキシリボースはそれぞれ独立して2’-位に保護されていてもよい水酸基を有していてもよい。
第1のキメラ分子前駆体Cは、例えば、以下の構造を有する。
Yは、単結合を示すか、又はYに結合する窒素原子とリン原子との結合を介する1以上の第1の核酸及び/又は第2の核酸を示す。
なお、デオキシリボースはそれぞれ独立して2’-位に保護されていてもよい水酸基を有していてもよい。
また、反応溶媒全体に占める非極性溶媒の割合が50体積%以上であれば、極性溶媒を組み合わせてもよい。極性溶媒としては、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類;1,4-ジオキサン、テトラヒドロフラン等の極性エーテル類;ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド等のアミド類;これらの任意の組み合わせ;が挙げられる。
反応における基質濃度は、使用する試薬の種類や量によって適宜変更することができる。例えば、第1のキメラ分子前駆体の反応溶液中濃度が、0.01~0.2mol/L、好ましくは0.02~0.1mol/L、より好ましくは0.025~0.08mol/L、さらに好ましくは0.03~0.05mol/Lとなるように溶媒の使用量を調整することができる。
リン原子の酸化若しくはチオ酸化は常法を採用することができる。例えば、前述の特許文献7の、ホスファイトトリエステル結合をホスフェートトリエステル結合又はチオホスフェートトリエステル結合へと変換する工程を参照できる。
酸化剤若しくはチオ酸化剤の使用量は、第2のキメラ分子前駆体、若しくは前工程における第1のキメラ分子前駆体の使用モル数あたり、例えば、1~50モル、好ましくは1~10モル、より好ましくは2~5モルである。
極性溶媒としては、汎用性やコスト面から、アセトニトリル、メタノールが好ましく用いられ、メタノールを用いることが特に好ましい。
目的物をろ過により回収するために反応終了後に反応溶液に添加される極性溶媒の量は、反応における基質濃度にもよるが、例えば、使用した反応溶媒の総量(体積)に対して、5~50倍量、好ましくは5~30倍量、より好ましくは8~20倍量、さらに好ましくは10~15倍量である。
前述の工程で得た第2のキメラ分子前駆体は、導入された第2の核酸に由来する、保護されていてもよいアミノ基を有する。次工程においてこのアミノ基を介して第1の核酸を導入するため、保護されていてもよいアミノ基が、保護されたアミノ基である場合、アミノ基の脱保護が必要である。
アミノ基の脱保護は、使用した保護基に応じて適宜条件を変更することができる。具体的には、前述の「Greene‘s Protective Groups in Organic Synthesis(第4版、2006年)」に記載の方法を採用することができる。
使用できる酸としては、特に制限されないが、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸等のハロゲノ酢酸類;メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸等のスルホン酸類;が挙げられる。良好な結果が得られる点から、ハロゲノ酢酸類が好ましく、トリクロロ酢酸が特に好ましい。
酸の使用量は、第2のキメラ分子前駆体の使用モル数あたり、例えば、1~100モル、好ましくは5~80モル、より好ましくは10~60モル、さらに好ましくは20~50モルである。
酸素原子から脱離する基の脱離は、常法を採用することができる。弱塩基条件下、酸素原子から脱離する基の脱離は、例えば、De Napoli et al.、Chem.Commun.、2005、2586-2588、U.Pradere et al.、Chem.Rev.、2014、114、9154-9218を参照できる。
本工程は、第2のキメラ分子前駆体が有するアミノ基を足掛かりとして、第1の核酸を導入する工程である。その結果、キメラ分子が製造される。
第1の核酸としては、Fmoc型PNAモノマーに代表されるN末端が保護されたPNAモノマーを使用できる。なお、Fmoc型PNAモノマー中のFmoc(フルオレニルメトキシカルボニル)中のフルオレニル基は、Fmocの除去に際して反応性を調整するため、任意の置換位置に1~2個の置換基を有していてもよい。置換基としては電子吸引基が好ましく、例えば、ハロゲン、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、カルボニル(カルボキシ、アルキルオキシカルボニル、ジアルキルカルバモイル、アルキルカルボニル)が挙げられる。
PGは、隣接するアミノ基の保護基を示し;
Baseは、塩基部(それぞれ同一でも異なっていてもよい。)を示す。
縮合剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、1,1’-カルボニルジイミダゾール、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスファート、(1-シアノ-2-エトキシ-2-オキソエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノ-モルホリノ-カルベニウムヘキサフルオロホスファート(COMU)、ジフェニルリン酸アジド、オキシ塩化リンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、COMUが好ましい。
また、有機塩基;又は、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム等の無機塩基;の存在下で反応を行うことが、反応を円滑に進行させる上で有利な場合がある。例えば、N,N-ジイソプロピルエチルアミンが好ましい。
有機塩基、好ましくは有機塩基としてN,N-ジイソプロピルエチルアミンを用いる場合、第2のキメラ分子前駆体の使用モル数に対して、1~10当量、好ましくは1.5~8当量、より好ましくは1.5~5当量、さらに好ましくは2~4当量、特に好ましくは2~3当量用いることができる。また、第2のキメラ分子前駆体のリン酸バックボーンの数に対して、1~10倍モル量、好ましくは1.5~5倍モル量、より好ましくは2~4倍モル量、さらに好ましくは2.5~3倍モル量用いることができる。
反応における基質濃度は、使用する試薬の種類や量によって適宜変更することができる。例えば、第1のキメラ分子前駆体の反応溶液中濃度が、0.01~0.2mol/L、好ましくは0.02~0.1mol/L、より好ましくは0.025~0.08mol/L、さらに好ましくは0.03~0.05mol/Lとなるように溶媒の使用量を調整することができる。
その場合、導入された第1の核酸のアミノ基の保護基を除去し、当該アミノ基を手掛かりとして、第1の核酸又は第2の核酸を導入することができる。
導入された第1の核酸のアミノ基の保護基がFmocである場合、例えば、2体積%の1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン(DBU)と2体積%のピペリジンとの溶液、例えばテトラヒドロフラン(THF)溶液を作用させる方法が挙げられる。
第2の核酸の導入は、F. Bergmann,et al.、Tetrahedron Lett.、1995、36(38)、6823-6826に記載の方法若しくはこれに準じた方法、又は国際公開第2017/086397号に記載の方法若しくはこれに準じた方法を採用することができる。
前述のように、脂溶性アンカーは、キメラ分子の製造においては切り離されず、その一方で任意の段階で切り離すことができることが好ましい。脂溶性アンカーは、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能であることが好ましい。
脂溶性アンカーが式(i)や式(ii)で示される脂溶性アンカーである場合、前述の特許文献2及び7に記載の方法若しくはこれに準じた方法により切り離すことができる。例えば、極性溶媒、好ましくはエタノール中、水酸化アンモニウム水溶液を作用させることにより、脂溶性アンカーの残渣が沈殿し、上澄みから目的物であるキメラ分子を単離することができる。なお、導入された第2の核酸のリン酸部位に、弱塩基条件下、酸素原子から脱離する基(LVで示した基)が脱離せず残っていたり、導入された第1の核酸のアミノ基の保護基(例えばFmoc)が除去されず残っていたりした場合、これらの基も脱離したキメラ分子が得られる。
NMRデータは既存文献に記載のデータと一致した(S. Kim, et al., Eur. J. Chem., 2013, 19, 8615-8620)。
NMRデータは既存文献に記載のデータと一致した(H. Tamiaki, et al., Bull. Chem. Soc. Jpn., 2001, 74, 733-738)。
NMRデータは既存文献に記載のデータと一致した(P. Kumar, et al., Nucleosides Nucleotides, 1993, 12, 565-584; C. Johnston, et al., Chemistry-Methods, 2021, 1, 1-8)。
13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 172.10, 171.91, 163.42, 158.87, 153.32, 150.28, 144.25, 138.32, 135.58, 135.31, 135.19, 130.53, 130.18, 128.23, 128.16, 127.35, 113.42, 111.71, 107.11, 87.32, 84.43, 84.05, 75.95, 73.53, 69.22, 67.29, 63.81, 55.35, 37.94, 32.03, 30.43, 29.87, 29.83, 29.77, 29.73, 29.55, 29.51, 29.47, 29.16, 29.03, 26.23, 22.79, 14.23, 11.65 ppm.
HRESIMS calcd. for C96H150N2NaO13, 1562.1030 [M+Na]+; found 1562.1060.
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 172.11, 172.03, 163.46, 153.29, 150.33, 138.23, 136.48, 130.64, 111.45, 107.16, 86.26, 85.08, 77.31, 75.19, 73.57, 69.24, 67.20, 62.65, 37.16, 32.02, 30.41, 29.86, 29.82, 29.76, 29.72, 29.54, 29.50, 29.47, 29.18, 29.14, 26.22, 22.79, 14.22, 12.68 ppm.
HRESIMS calcd. for C75H132N2NaO11, 1259.9724 [M+Na]+; found 1259.9734.
13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 172.11, 163.85, 163.65, 158.94, 153.33, 150.49, 144.05, 138.34, 136.60, 135.85, 135.73, 135.19, 135.04, 130.51, 130.22, 128.24, 128.17, 127.44, 116.59, 116.44, 116.26, 113.45, 111.88, 111.71, 111.45, 107.15, 87.43, 86.40, 86.27, 85.67, 85.10, 84.39, 82.48, 79.12, 75.17, 74.00, 73.88, 73.58, 73.56, 69.27, 67.69, 67.30, 63.30, 62.61, 62.48, 62.08, 55.38, 39.01, 38.47, 37.16, 36.76, 36.53, 32.02, 30.44, 29.86, 29.82, 29.76, 29.73, 29.55, 29.52, 29.46, 29.18, 29.02, 26.23, 22.78, 19.81, 19.71, 19.67, 14.20, 12.61, 12.53, 11.78 ppm.
31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ -1.86, -1.94, -2.09, -2.15 ppm.
HRESIMS calcd. for C109H166N5NaO20P, 1920.1790 [M+Na]+; found 1920.1878.
13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 172.14, 163.76, 153.33, 150.47, 138.35, 136.67, 135.87, 130.51, 116.59, 111.87, 111.41, 107.12, 86.47, 86.34, 85.70, 82.56, 79.14, 74.02, 73.88, 73.58, 69.27, 67.65, 67.30, 62.61, 62.10, 62.00, 38.46, 37.15, 36.53, 32.02, 30.44, 29.86, 29.82, 29.76, 29.73, 29.55, 29.52, 29.46, 29.04, 26.23, 22.78, 19.86, 19.82, 14.20, 12.66, 12.61, 12.53, 1.10 ppm.
31P NMR (243 MHz, CDCl3) δ -1.86, -1.94 ppm.
HRESIMS calcd. for C88H148N5NaO18P, 1617.0450 [M+Na]+; found 1617.0467.
31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ -1.95 ppm.
MALDI-TOF-MS calcd. for C111H169N9O23P, 2028.587 [M-H]-; found 2028.657.
Claims (9)
- PNA、PRNA、PNA/PRNA、若しくはLNAである第1の核酸、又はその誘導体と、RNA若しくはDNAである第2の核酸、又はその誘導体とが、少なくとも一つずつ融合したキメラ分子の製造方法であって、
前記第1の核酸の誘導体は、前記第1の核酸に結合している塩基部のハロゲン化誘導体、脱アミノ誘導体、若しくは酸素原子に代えて硫黄原子を有する誘導体であり、
前記第2の核酸の誘導体は、前記第2の核酸に結合している塩基部のハロゲン化誘導体、脱アミノ誘導体、若しくは酸素原子に代えて硫黄原子を有する誘導体、又はホスホロチオエート型DNA若しくはRNA、ホスホロジチオエート型DNA若しくはRNA、モルホリノ型核酸であり、
前記塩基部は、核酸に結合しているウラシル、シトシン、チミン、アデニン、グアニン、プリン環若しくはピリミジン環を意味し、
前記製造方法が、水酸基を有する第1のキメラ分子前駆体のRNA若しくはDNAの5’位の水酸基を介した、前記第2の核酸又はその誘導体の導入による第2のキメラ分子前駆体の準備、
過酸化物を用いた、前記第2のキメラ分子前駆体のリン原子の酸化、
必要に応じて、前記第2のキメラ分子前駆体の脱保護、及び
前記第2のキメラ分子前駆体又は脱保護された前記第2のキメラ分子前駆体への、前記第1の核酸又はその誘導体の導入を含み、
前記第1のキメラ分子前駆体が、式(1)
前記第2の核酸が、式(4)
第2のキメラ分子前駆体の前記脱保護が、前記第2のキメラ分子前駆体に導入された前記第2の核酸又はその誘導体の保護された前記アミノ基の脱保護であり、
第1の核酸又はその誘導体の前記導入は、前記第2の核酸又はその誘導体の前記アミノ基を介した導入であり、
前記第1の核酸が、式(5)
第2のキメラ分子前駆体の前記準備、第2のキメラ分子前駆体の前記脱保護、及びキメラ分子の前記製造が、いずれも液相合成法により行われることを特徴とする製造方法。 - 前記第1の核酸がPNAであり、前記第2の核酸がDNAである、請求項1に記載の製造方法。
- 前記第1の核酸又はその誘導体がPNAであり、前記第2の核酸又はその誘導体がDNAである、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 前記過酸化物が、tert-ブチルヒドロペルオキシド、又はメタクロロ過安息香酸であり、用いられる前記過酸化物の使用量が、第2のキメラ分子前駆体の使用モル数あたり2~5モル、若しくは第2のキメラ分子前駆体の準備に用いた第1のキメラ分子前駆体の使用モル数あたり2~5モルである、請求項1~3のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記式(1)及び前記式(2)における前記リンカーが-O-であり、前記炭素数6~14の芳香族炭化水素環がベンゼン環であり、前記Rが水素原子である、請求項1~4のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記式(4)における前記LVが2-シアノエチル基である、請求項1~5のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記式(4)の前記AGにおける、前記保護されていてもよいアミノ基が保護されたアミノ基であり、前記保護されたアミノ基の保護基がトリチル基、p-メトキシフェニルジフェニルメチル基、又はジ(p-メトキシフェニル)フェニルメチル基である、請求項1~6のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記式(5)の前記PGにおける、前記隣接するアミノ基の保護基が、フルオレニル基がハロゲン、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、カルボキシ、アルキルオキシカルボニル、ジアルキルカルバモイル、及びアルキルカルボニルからなる群より選択される基で置換されていてもよいフルオレニルメトキシカルボニル基;トリチル基;p-メトキシフェニルジフェニルメチル基;ジ(p-メトキシフェニル)フェニルメチル基;又はフタルイミド型保護基である、請求項1~7のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記式(1)、前記式(2)、前記式(4)におけるデオキシリボースの2’-位に置換することが許容される保護されていてもよい水酸基が、保護されていない水酸基である、請求項1に記載の製造方法。
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