JP2022009923A - オリゴヌクレオチドの製造方法、およびヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
【課題】縮合を効率的に行うことができるオリゴヌクレオチドの製造方法を提供すること。
【解決手段】(1)非極性溶媒中、5’位水酸基が保護されていないヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)等と、5’位水酸基が保護されたヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)とを縮合させて、ホスファイトトリエステル体(c)を含む反応液を得る工程;(3)ホスファイトトリエステル体(c)を酸化または硫化し、5’位水酸基が保護されたオリゴヌクレオチド(d)を含む反応液を得る工程;(4)オリゴヌクレオチド(d)を脱保護し、5’位水酸基が保護されていないオリゴヌクレオチド(e)を含む反応液を得る工程;および(6)オリゴヌクレオチド(e)を含む反応液に極性溶媒を添加し、オリゴヌクレオチド(e)を固液分離または抽出により精製する工程を含むオリゴヌクレオチドの製造方法。
【選択図】なし
【解決手段】(1)非極性溶媒中、5’位水酸基が保護されていないヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)等と、5’位水酸基が保護されたヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)とを縮合させて、ホスファイトトリエステル体(c)を含む反応液を得る工程;(3)ホスファイトトリエステル体(c)を酸化または硫化し、5’位水酸基が保護されたオリゴヌクレオチド(d)を含む反応液を得る工程;(4)オリゴヌクレオチド(d)を脱保護し、5’位水酸基が保護されていないオリゴヌクレオチド(e)を含む反応液を得る工程;および(6)オリゴヌクレオチド(e)を含む反応液に極性溶媒を添加し、オリゴヌクレオチド(e)を固液分離または抽出により精製する工程を含むオリゴヌクレオチドの製造方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、オリゴヌクレオチドの製造方法、および前記製造方法で有効に使用し得るヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに関する。
オリゴヌクレオチドの製造方法として、現在、ホスホロアミダイト法を用いた固相法が汎用されている(非特許文献1)。固相法はプロセス最適化がなされ自動化も進んでおり、スピード面で有利であるが、設備制約上スケールアップに制限があるという欠点がある。また、液相法によるオリゴヌクレオチドの製造方法も検討されてきたが、液相法は、操作が煩雑であり、収率も低いため、多重合度のオリゴヌクレオチドを大量且つ迅速に合成することは困難であるという欠点がある。
近年、固相法と液相法のそれぞれの欠点を解消しようとする試みとして、疎水性基結合ヌクレオシドを用いる製造方法(特許文献1)、または3’位の水酸基が特定の有機基で保護されたヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドを用いる製造方法(特許文献2)等が開示されている。
上述の特許文献2には、以下の工程(i)~(iv):
(i)ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの5’位水酸基の保護基(例えば、ジメトキシトリチル基)の除去(脱保護)、
(ii)脱保護で得られたヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドと、3’位水酸基がホスホロアミダイト化され、且つ5’位水酸基が保護されたヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドとの縮合、
(iii)縮合で得られたホスファイトトリエステル体の酸化または硫化、および
(iv)酸化または硫化で得られた、5’位水酸基が保護されたオリゴヌクレオチドの固液分離
を含むオリゴヌクレオチドの製造方法が記載されている。上述の工程(i)~(iv)を繰り返すことによって、オリゴヌクレオチド鎖を伸長させることができる。
(i)ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの5’位水酸基の保護基(例えば、ジメトキシトリチル基)の除去(脱保護)、
(ii)脱保護で得られたヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドと、3’位水酸基がホスホロアミダイト化され、且つ5’位水酸基が保護されたヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドとの縮合、
(iii)縮合で得られたホスファイトトリエステル体の酸化または硫化、および
(iv)酸化または硫化で得られた、5’位水酸基が保護されたオリゴヌクレオチドの固液分離
を含むオリゴヌクレオチドの製造方法が記載されている。上述の工程(i)~(iv)を繰り返すことによって、オリゴヌクレオチド鎖を伸長させることができる。
S. L. Beaucage, D. E. Bergstorm, G. D. Glick, R. A. Jones, Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry; John Wiley & Sons (2000)
本発明の目的は、縮合を効率的に行うことができるオリゴヌクレオチドの製造方法を提供することにある。
本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、特許文献2に記載の工程順序を変更し、
(I)5’位水酸基が保護されておらず、且つ3’位水酸基等の少なくとも一つの基が保護基で保護されたヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)等と、3’位水酸基または3’位アミノ基がホスホロアミダイト化され、且つ5’位水酸基が保護されたヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)との縮合、
(II)縮合で得られたホスファイトトリエステル体(c)の酸化または硫化、
(III)酸化または硫化で得られたオリゴヌクレオチド(d)の5’位水酸基の保護基の除去(脱保護)、および
(IV)脱保護で得られた、5’位水酸基が保護されていないオリゴヌクレオチド(e)の固液分離または抽出による精製
を行うことによって、効率的に縮合を行い得ることを見出した。
(I)5’位水酸基が保護されておらず、且つ3’位水酸基等の少なくとも一つの基が保護基で保護されたヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)等と、3’位水酸基または3’位アミノ基がホスホロアミダイト化され、且つ5’位水酸基が保護されたヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)との縮合、
(II)縮合で得られたホスファイトトリエステル体(c)の酸化または硫化、
(III)酸化または硫化で得られたオリゴヌクレオチド(d)の5’位水酸基の保護基の除去(脱保護)、および
(IV)脱保護で得られた、5’位水酸基が保護されていないオリゴヌクレオチド(e)の固液分離または抽出による精製
を行うことによって、効率的に縮合を行い得ることを見出した。
特許文献2に記載の工程(i)~(iv)の繰返しでは、脱保護(工程(i))の後に縮合(工程(ii))が行われるが、上述の工程(I)~(IV)の繰返しでは、固液分離または抽出(工程(IV))の後に縮合(工程(I))が行われる。そのため、上述の工程(I)~(IV)を含む製造方法では、脱保護で生ずる不純物が縮合時に存在せず、効率的に縮合を行うことができる。以上のような知見に基づく本発明は以下の通りである。
[1] 以下の工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むオリゴヌクレオチドの製造方法:
(1)非極性溶媒中、
5’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基、3’位水酸基および3’位アミノ基、並びにデオキシリボース残基の3’位水酸基および3’位アミノ基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)、或いは
5’位水酸基が保護されておらず、3’位リン酸基の一つの水酸基が-OLn1-OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、-OLn1-OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)
を含む反応液に、
3’位水酸基または3’位アミノ基がホスホロアミダイト化され、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)
を添加して、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)とヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)とを縮合させ、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイトトリエステル体(c)を含む反応液を得る工程;
(3)ホスファイトトリエステル体(c)を含む反応液に酸化剤または硫化剤を添加して、ホスファイトトリエステル体(c)を酸化または硫化し、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたオリゴヌクレオチド(d)を含む反応液を得る工程;
(4)酸化または硫化後の反応液に酸を添加して5’位水酸基の一時保護基を除去し、5’位水酸基が保護されていないオリゴヌクレオチド(e)を含む反応液を得る工程;および
(6)オリゴヌクレオチド(e)を含む反応液に極性溶媒を添加し、オリゴヌクレオチド(e)を固液分離または抽出により精製する工程。
(1)非極性溶媒中、
5’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基、3’位水酸基および3’位アミノ基、並びにデオキシリボース残基の3’位水酸基および3’位アミノ基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)、或いは
5’位水酸基が保護されておらず、3’位リン酸基の一つの水酸基が-OLn1-OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、-OLn1-OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)
を含む反応液に、
3’位水酸基または3’位アミノ基がホスホロアミダイト化され、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)
を添加して、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)とヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)とを縮合させ、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイトトリエステル体(c)を含む反応液を得る工程;
(3)ホスファイトトリエステル体(c)を含む反応液に酸化剤または硫化剤を添加して、ホスファイトトリエステル体(c)を酸化または硫化し、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたオリゴヌクレオチド(d)を含む反応液を得る工程;
(4)酸化または硫化後の反応液に酸を添加して5’位水酸基の一時保護基を除去し、5’位水酸基が保護されていないオリゴヌクレオチド(e)を含む反応液を得る工程;および
(6)オリゴヌクレオチド(e)を含む反応液に極性溶媒を添加し、オリゴヌクレオチド(e)を固液分離または抽出により精製する工程。
[2] 工程(1)で、
5’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および3’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の3’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)、或いは
5’位水酸基が保護されておらず、3’位リン酸基の一つの水酸基が-OLn1-OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、-OLn1-OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)、並びに
3’位水酸基がホスホロアミダイト化され、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)
を使用する前記[1]に記載の製造方法。
5’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および3’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の3’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)、或いは
5’位水酸基が保護されておらず、3’位リン酸基の一つの水酸基が-OLn1-OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、-OLn1-OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)、並びに
3’位水酸基がホスホロアミダイト化され、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)
を使用する前記[1]に記載の製造方法。
[3] 工程(1)で、
5’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および3’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の3’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(a)、並びに
3’位水酸基がホスホロアミダイト化され、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(b)
を使用する前記[1]に記載の製造方法。
5’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および3’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の3’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(a)、並びに
3’位水酸基がホスホロアミダイト化され、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(b)
を使用する前記[1]に記載の製造方法。
[4] 工程(1)の後および工程(3)の前に、さらに以下の工程(2)を含む前記[1]~[3]のいずれか一つに記載の製造方法:
(2)縮合後の反応液にクエンチ剤を添加する工程。
[5] 工程(2)で使用するクエンチ剤が、アルコール類、フェノール類およびアミン類から選ばれる少なくとも一つである前記[4]に記載の製造方法。
(2)縮合後の反応液にクエンチ剤を添加する工程。
[5] 工程(2)で使用するクエンチ剤が、アルコール類、フェノール類およびアミン類から選ばれる少なくとも一つである前記[4]に記載の製造方法。
[6] 工程(1)の後および工程(4)の前の反応液に、カルボン酸および有機塩基の混合物、無機酸またはアミン類を添加し、工程(3)において、硫化剤として5-[(N,N-ジメチルアミノメチリデン)アミノ]-3H-1,2,4-ジチアゾール-3-チオンを反応液に添加する前記[1]~[5]のいずれか一つに記載の製造方法。
[7] 有機塩基が有する塩基性窒素原子の量が、カルボン酸が有するカルボキシ基1モルに対して1~2モルである前記[6]に記載の製造方法。
[7] 有機塩基が有する塩基性窒素原子の量が、カルボン酸が有するカルボキシ基1モルに対して1~2モルである前記[6]に記載の製造方法。
[8] 工程(3)で使用する硫化剤が、3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン-1,1-ジオキシド、3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン、フェニルアセチルジスルフィド、テトラエチルチウラムジスルフィド、ジペンタメチレンチウラムテトラスルフィド、フェニル-3H-1,2,4-ジチアゾール-3-オン、3-アミノ-1,2,4-ジチアゾール-5-チオンおよび硫黄から選ばれる少なくとも一つである前記[1]~[5]のいずれか一つに記載の製造方法。
[9] 工程(3)で使用する酸化剤が、ヨウ素、(1S)-(+)-(10-カンファニルスルホニル)オキサジリジン、tert-ブチルヒドロペルオキシド、2-ブタノンペルオキシド、1,1-ジヒドロペルオキシシクロドデカン、ビス(トリメチルシリル)ペルオキシドおよびm-クロロ過安息香酸から選ばれる少なくとも一つである前記[1]~[5]のいずれか一つに記載の製造方法。
[9] 工程(3)で使用する酸化剤が、ヨウ素、(1S)-(+)-(10-カンファニルスルホニル)オキサジリジン、tert-ブチルヒドロペルオキシド、2-ブタノンペルオキシド、1,1-ジヒドロペルオキシシクロドデカン、ビス(トリメチルシリル)ペルオキシドおよびm-クロロ過安息香酸から選ばれる少なくとも一つである前記[1]~[5]のいずれか一つに記載の製造方法。
[10] 一時保護基が、ジメトキシトリチル基またはモノメトキシトリチル基である前記[1]~[9]のいずれか一つに記載の製造方法。
[11] 非極性溶媒が、ハロゲン系溶媒、芳香族系溶媒、エステル系溶媒および脂肪族系溶媒から選ばれる少なくとも一つである前記[1]~[10]のいずれか一つに記載の製造方法。
[12] 工程(4)で使用する酸が、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、塩酸、酢酸およびp-トルエンスルホン酸から選ばれる少なくとも一つである前記[1]~[11]のいずれか一つに記載の製造方法。
[13] 酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基が、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基を有するか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を有する前記[1]~[12]のいずれか一つに記載の製造方法。
[11] 非極性溶媒が、ハロゲン系溶媒、芳香族系溶媒、エステル系溶媒および脂肪族系溶媒から選ばれる少なくとも一つである前記[1]~[10]のいずれか一つに記載の製造方法。
[12] 工程(4)で使用する酸が、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、塩酸、酢酸およびp-トルエンスルホン酸から選ばれる少なくとも一つである前記[1]~[11]のいずれか一つに記載の製造方法。
[13] 酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基が、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基を有するか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を有する前記[1]~[12]のいずれか一つに記載の製造方法。
[14] 工程(6)が、オリゴヌクレオチド(e)を含む反応液に極性溶媒を添加し、オリゴヌクレオチド(e)を固液分離により精製する工程である前記[1]~[13]のいずれか一つに記載の製造方法。
[15] 工程(6)で使用する極性溶媒が、ニトリル系溶媒である前記[1]~[14]のいずれか一つに記載の製造方法。
[15] 工程(6)で使用する極性溶媒が、ニトリル系溶媒である前記[1]~[14]のいずれか一つに記載の製造方法。
[16] 工程(4)の後および工程(6)の前に、さらに以下の工程(5)を含む前記[1]~[15]のいずれか一つに記載の製造方法:
(5)オリゴヌクレオチド(e)を含む反応液に塩基を添加して中和する工程。
[17] 工程(5)で使用する塩基が、ピリジン、2,4,6-トリメチルピリジン、ベンズイミダゾール、1,2,4-トリアゾール、N-フェニルイミダゾール、2-アミノ-4,6-ジメチルピリミジン、1,10-フェナントロリン、イミダゾール、N-メチルイミダゾール、2-クロロベンズイミダゾール、2-ブロモベンズイミダゾール、2-メチルイミダゾール、2-フェニルベンズイミダゾール、N-フェニルベンズイミダゾールおよび5-ニトロベンズイミダゾールから選ばれる少なくとも一つである前記[16]に記載の製造方法。
(5)オリゴヌクレオチド(e)を含む反応液に塩基を添加して中和する工程。
[17] 工程(5)で使用する塩基が、ピリジン、2,4,6-トリメチルピリジン、ベンズイミダゾール、1,2,4-トリアゾール、N-フェニルイミダゾール、2-アミノ-4,6-ジメチルピリミジン、1,10-フェナントロリン、イミダゾール、N-メチルイミダゾール、2-クロロベンズイミダゾール、2-ブロモベンズイミダゾール、2-メチルイミダゾール、2-フェニルベンズイミダゾール、N-フェニルベンズイミダゾールおよび5-ニトロベンズイミダゾールから選ばれる少なくとも一つである前記[16]に記載の製造方法。
[18] 工程(6)の後に、さらに以下の工程(7)を含む前記[1]~[17]のいずれか一つに記載の製造方法:
(7)得られたオリゴヌクレオチドの保護基を全て除去した後、保護されていないオリゴヌクレオチドを単離する工程。
(7)得られたオリゴヌクレオチドの保護基を全て除去した後、保護されていないオリゴヌクレオチドを単離する工程。
[19] 工程(4)の一時保護基の除去反応をカチオン捕捉剤の存在下で行うか、または一時保護基の除去反応後に反応液にカチオン捕捉剤を添加する前記[1]~[18]のいずれか一つに記載の製造方法。
[20] カチオン捕捉剤が、ピロール、2-メチルピロール、3-メチルピロール、2,3-ジメチルピロール、2,4-ジメチルピロール、インドール、3-メチルインドール,4-メチルインドール、5-メチルインドール、6-メチルインドール、7-メチルインドール、5,6-ジメチルインドール、6,7-ジメチルインドール、2-メチルフラン、2,3-ジメチルフラン、2-メチル-3-(メチルチオ)フラン、およびメントフランから選ばれる少なくとも一つである前記[19]に記載の製造方法。
[20] カチオン捕捉剤が、ピロール、2-メチルピロール、3-メチルピロール、2,3-ジメチルピロール、2,4-ジメチルピロール、インドール、3-メチルインドール,4-メチルインドール、5-メチルインドール、6-メチルインドール、7-メチルインドール、5,6-ジメチルインドール、6,7-ジメチルインドール、2-メチルフラン、2,3-ジメチルフラン、2-メチル-3-(メチルチオ)フラン、およびメントフランから選ばれる少なくとも一つである前記[19]に記載の製造方法。
[21] 以下の工程(1’)、(3’)、(4’)および(6’)を含むオリゴヌクレオチドの製造方法:
(1’)非極性溶媒中、
3’位水酸基または3’位アミノ基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および5’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の5’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)、或いは
3’位水酸基または3’位アミノ基が保護されておらず、5’位リン酸基の一つの水酸基が-OLn1-OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、-OLn1-OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)
を含む反応液に、
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基または3’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
を添加して、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)とヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)とを縮合させ、3’位水酸基または3’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイトトリエステル体(c’)を含む反応液を得る工程;
(3’)ホスファイトトリエステル体(c’)を含む反応液に酸化剤または硫化剤を添加して、ホスファイトトリエステル体(c’)を酸化または硫化し、3’位水酸基または3’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたオリゴヌクレオチド(d’)を含む反応液を得る工程;
(4’)酸化または硫化後の反応液に酸を添加して3’位水酸基または3’位アミノ基の一時保護基を除去し、3’位水酸基または3’位アミノ基が保護されていないオリゴヌクレオチド(e’)を含む反応液を得る工程;および
(6’)オリゴヌクレオチド(e’)を含む反応液に極性溶媒を添加し、オリゴヌクレオチド(e’)を固液分離または抽出により精製する工程。
(1’)非極性溶媒中、
3’位水酸基または3’位アミノ基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および5’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の5’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)、或いは
3’位水酸基または3’位アミノ基が保護されておらず、5’位リン酸基の一つの水酸基が-OLn1-OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、-OLn1-OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)
を含む反応液に、
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基または3’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
を添加して、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)とヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)とを縮合させ、3’位水酸基または3’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイトトリエステル体(c’)を含む反応液を得る工程;
(3’)ホスファイトトリエステル体(c’)を含む反応液に酸化剤または硫化剤を添加して、ホスファイトトリエステル体(c’)を酸化または硫化し、3’位水酸基または3’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたオリゴヌクレオチド(d’)を含む反応液を得る工程;
(4’)酸化または硫化後の反応液に酸を添加して3’位水酸基または3’位アミノ基の一時保護基を除去し、3’位水酸基または3’位アミノ基が保護されていないオリゴヌクレオチド(e’)を含む反応液を得る工程;および
(6’)オリゴヌクレオチド(e’)を含む反応液に極性溶媒を添加し、オリゴヌクレオチド(e’)を固液分離または抽出により精製する工程。
[22] 工程(1’)で、
3’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および5’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の5’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)、或いは
3’位水酸基が保護されておらず、5’位リン酸基の一つの水酸基が-OLn1-OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、-OLn1-OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)、並びに
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
を使用する前記[21]に記載の製造方法。
3’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および5’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の5’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)、或いは
3’位水酸基が保護されておらず、5’位リン酸基の一つの水酸基が-OLn1-OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、-OLn1-OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)、並びに
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
を使用する前記[21]に記載の製造方法。
[23] 工程(1’)で、
3’位水酸基が保護されておらず、5’位リン酸基の一つの水酸基が-OLn1-OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、-OLn1-OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)、並びに
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
を使用する前記[21]に記載の製造方法。
3’位水酸基が保護されておらず、5’位リン酸基の一つの水酸基が-OLn1-OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、-OLn1-OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)、並びに
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
を使用する前記[21]に記載の製造方法。
[24] 工程(1’)で、
3’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および5’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の5’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(a’)、並びに
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
を使用する前記[21]に記載の製造方法。
3’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および5’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の5’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(a’)、並びに
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
を使用する前記[21]に記載の製造方法。
[25] 工程(1’)の後および工程(3’)の前に、さらに以下の工程(2’)を含む前記[21]~[24]のいずれか一つに記載の製造方法:
(2’)縮合後の反応液にクエンチ剤を添加する工程。
[26] 工程(2’)で使用するクエンチ剤が、アルコール類、フェノール類およびアミン類から選ばれる少なくとも一つである前記[25]に記載の製造方法。
(2’)縮合後の反応液にクエンチ剤を添加する工程。
[26] 工程(2’)で使用するクエンチ剤が、アルコール類、フェノール類およびアミン類から選ばれる少なくとも一つである前記[25]に記載の製造方法。
[27] 工程(1’)の後および工程(4’)の前の反応液に、カルボン酸および有機塩基の混合物、無機酸またはアミン類を添加し、工程(3’)において、硫化剤として5-[(N,N-ジメチルアミノメチリデン)アミノ]-3H-1,2,4-ジチアゾール-3-チオンを反応液に添加する前記[21]~[26]のいずれか一つに記載の製造方法。
[28] 有機塩基が有する塩基性窒素原子の量が、カルボン酸が有するカルボキシ基1モルに対して1~2モルである前記[27]に記載の製造方法。
[28] 有機塩基が有する塩基性窒素原子の量が、カルボン酸が有するカルボキシ基1モルに対して1~2モルである前記[27]に記載の製造方法。
[29] 工程(3’)で使用する硫化剤が、3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン-1,1-ジオキシド、3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン、フェニルアセチルジスルフィド、テトラエチルチウラムジスルフィド、ジペンタメチレンチウラムテトラスルフィド、フェニル-3H-1,2,4-ジチアゾール-3-オン、3-アミノ-1,2,4-ジチアゾール-5-チオンおよび硫黄から選ばれる少なくとも一つである前記[21]~[26]のいずれか一つに記載の製造方法。
[30] 工程(3’)で使用する酸化剤が、ヨウ素、(1S)-(+)-(10-カンファニルスルホニル)オキサジリジン、tert-ブチルヒドロペルオキシド、2-ブタノンペルオキシド、1,1-ジヒドロペルオキシシクロドデカン、ビス(トリメチルシリル)ペルオキシドおよびm-クロロ過安息香酸から選ばれる少なくとも一つである前記[21]~[26]のいずれか一つに記載の製造方法。
[30] 工程(3’)で使用する酸化剤が、ヨウ素、(1S)-(+)-(10-カンファニルスルホニル)オキサジリジン、tert-ブチルヒドロペルオキシド、2-ブタノンペルオキシド、1,1-ジヒドロペルオキシシクロドデカン、ビス(トリメチルシリル)ペルオキシドおよびm-クロロ過安息香酸から選ばれる少なくとも一つである前記[21]~[26]のいずれか一つに記載の製造方法。
[31] 水酸基の一時保護基が、ジメトキシトリチル基またはモノメトキシトリチル基である前記[21]~[30]のいずれか一つに記載の製造方法。
[32] 非極性溶媒が、ハロゲン系溶媒、芳香族系溶媒、エステル系溶媒および脂肪族系溶媒から選ばれる少なくとも一つである前記[21]~[31]のいずれか一つに記載の製造方法。
[33] 工程(4’)で使用する酸が、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、塩酸、酢酸およびp-トルエンスルホン酸から選ばれる少なくとも一つである前記[21]~[32]のいずれか一つに記載の製造方法。
[34] 酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基が、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基を有するか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を有する前記[21]~[33]のいずれか一つに記載の製造方法。
[32] 非極性溶媒が、ハロゲン系溶媒、芳香族系溶媒、エステル系溶媒および脂肪族系溶媒から選ばれる少なくとも一つである前記[21]~[31]のいずれか一つに記載の製造方法。
[33] 工程(4’)で使用する酸が、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、塩酸、酢酸およびp-トルエンスルホン酸から選ばれる少なくとも一つである前記[21]~[32]のいずれか一つに記載の製造方法。
[34] 酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基が、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基を有するか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を有する前記[21]~[33]のいずれか一つに記載の製造方法。
[35] 工程(6’)が、オリゴヌクレオチド(e’)を含む反応液に極性溶媒を添加し、オリゴヌクレオチド(e’)を固液分離により精製する工程である前記[21]~[34]のいずれか一つに記載の製造方法。
[36] 工程(6’)で使用する極性溶媒が、ニトリル系溶媒である前記[21]~[35]のいずれか一つに記載の製造方法。
[36] 工程(6’)で使用する極性溶媒が、ニトリル系溶媒である前記[21]~[35]のいずれか一つに記載の製造方法。
[37] 工程(4’)の後および工程(6’)の前に、さらに以下の工程(5’)を含む前記[21]~[36]のいずれか一つに記載の製造方法:
(5’)オリゴヌクレオチド(e’)を含む反応液に塩基を添加して中和する工程。
[38] 工程(5’)で使用する塩基が、ピリジン、2,4,6-トリメチルピリジン、ベンズイミダゾール、1,2,4-トリアゾール、N-フェニルイミダゾール、2-アミノ-4,6-ジメチルピリミジン、1,10-フェナントロリン、イミダゾール、N-メチルイミダゾール、2-クロロベンズイミダゾール、2-ブロモベンズイミダゾール、2-メチルイミダゾール、2-フェニルベンズイミダゾール、N-フェニルベンズイミダゾールおよび5-ニトロベンズイミダゾールから選ばれる少なくとも一つである前記[37]に記載の製造方法。
(5’)オリゴヌクレオチド(e’)を含む反応液に塩基を添加して中和する工程。
[38] 工程(5’)で使用する塩基が、ピリジン、2,4,6-トリメチルピリジン、ベンズイミダゾール、1,2,4-トリアゾール、N-フェニルイミダゾール、2-アミノ-4,6-ジメチルピリミジン、1,10-フェナントロリン、イミダゾール、N-メチルイミダゾール、2-クロロベンズイミダゾール、2-ブロモベンズイミダゾール、2-メチルイミダゾール、2-フェニルベンズイミダゾール、N-フェニルベンズイミダゾールおよび5-ニトロベンズイミダゾールから選ばれる少なくとも一つである前記[37]に記載の製造方法。
[39] 工程(6’)の後に、さらに以下の工程(7’)を含む前記[21]~[38]のいずれか一つに記載の製造方法:
(7’)得られたオリゴヌクレオチドの保護基を全て除去した後、保護されていないオリゴヌクレオチドを単離する工程。
(7’)得られたオリゴヌクレオチドの保護基を全て除去した後、保護されていないオリゴヌクレオチドを単離する工程。
[40] 工程(4’)の一時保護基の除去反応をカチオン捕捉剤の存在下で行うか、または一時保護基の除去反応後に反応液にカチオン捕捉剤を添加する前記[21]~[39]のいずれか一つに記載の製造方法。
[41] カチオン捕捉剤が、ピロール、2-メチルピロール、3-メチルピロール、2,3-ジメチルピロール、2,4-ジメチルピロール、インドール、3-メチルインドール、4-メチルインドール、5-メチルインドール、6-メチルインドール、7-メチルインドール、5,6-ジメチルインドール、6,7-ジメチルインドール、2-メチルフラン、2,3-ジメチルフラン、2-メチル-3-(メチルチオ)フラン、およびメントフランから選ばれる少なくとも一つである前記[40]に記載の製造方法。
[41] カチオン捕捉剤が、ピロール、2-メチルピロール、3-メチルピロール、2,3-ジメチルピロール、2,4-ジメチルピロール、インドール、3-メチルインドール、4-メチルインドール、5-メチルインドール、6-メチルインドール、7-メチルインドール、5,6-ジメチルインドール、6,7-ジメチルインドール、2-メチルフラン、2,3-ジメチルフラン、2-メチル-3-(メチルチオ)フラン、およびメントフランから選ばれる少なくとも一つである前記[40]に記載の製造方法。
[42] 式(a-II):
[式中、
mは、0以上の整数を示し;
m個のBaseは、それぞれ独立して、保護されていてもよい核酸塩基を示し;
m+1個のXは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、または2位炭素原子および4位炭素原子と結合する2価の有機基を示し;
m個のR10は、それぞれ独立して、酸素原子または硫黄原子を示し;
m個のRp1は、それぞれ独立して、リン酸基の保護基を示し;
Lは、単結合、または式(a1)若しくは(a1’):
mは、0以上の整数を示し;
m個のBaseは、それぞれ独立して、保護されていてもよい核酸塩基を示し;
m+1個のXは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、または2位炭素原子および4位炭素原子と結合する2価の有機基を示し;
m個のR10は、それぞれ独立して、酸素原子または硫黄原子を示し;
m個のRp1は、それぞれ独立して、リン酸基の保護基を示し;
Lは、単結合、または式(a1)若しくは(a1’):
(式中、
*は、Yとの結合位置を示し;
**は、酸素原子との結合位置を示し;
R1およびR2は、それぞれ独立して、C1-22炭化水素基を示し;
L1は、置換されていてもよい2価のC1-22炭化水素基を示し;
L2は、単結合を示すか、または***C(=O)N(R3)-R4-N(R5)****(式中、***は、L1との結合位置を示し、****は、C=Oとの結合位置を示し、R4は、C1-22アルキレン基を示し、R3およびR5は、それぞれ独立して、水素原子若しくはC1-22アルキル基を示すか、またはR3およびR5が一緒になって、環を形成していてもよい。)で表される基を示す。)で表される基を示し;
Yは、単結合、酸素原子、またはNR(Rは、水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。)を示し;および
Zは、式(a2)、式(a2’)または式(a2”):
*は、Yとの結合位置を示し;
**は、酸素原子との結合位置を示し;
R1およびR2は、それぞれ独立して、C1-22炭化水素基を示し;
L1は、置換されていてもよい2価のC1-22炭化水素基を示し;
L2は、単結合を示すか、または***C(=O)N(R3)-R4-N(R5)****(式中、***は、L1との結合位置を示し、****は、C=Oとの結合位置を示し、R4は、C1-22アルキレン基を示し、R3およびR5は、それぞれ独立して、水素原子若しくはC1-22アルキル基を示すか、またはR3およびR5が一緒になって、環を形成していてもよい。)で表される基を示す。)で表される基を示し;
Yは、単結合、酸素原子、またはNR(Rは、水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。)を示し;および
Zは、式(a2)、式(a2’)または式(a2”):
[式中、
*は、結合位置を示し;
R6は、水素原子であるか、あるいはRbが、下記式(a3)で表される基である場合には、環Aまたは環BのR6は、R8と一緒になって単結合または-O-を示して、環Aまたは環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;
kは、1~4の整数を示し;
k個のQは、それぞれ独立して、-O-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-C(=O)NH-または-NHC(=O)-を示し;
k個のR7は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
環Aおよび環Bは、それぞれ独立して、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく;
Raは、水素原子を示し;および
Rbは、水素原子、または式(a3):
*は、結合位置を示し;
R6は、水素原子であるか、あるいはRbが、下記式(a3)で表される基である場合には、環Aまたは環BのR6は、R8と一緒になって単結合または-O-を示して、環Aまたは環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;
kは、1~4の整数を示し;
k個のQは、それぞれ独立して、-O-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-C(=O)NH-または-NHC(=O)-を示し;
k個のR7は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
環Aおよび環Bは、それぞれ独立して、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく;
Raは、水素原子を示し;および
Rbは、水素原子、または式(a3):
(式中、
*は、結合位置を示し;
jは、0~4の整数を示し;
j個のQは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
j個のR9は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
R8は、水素原子を示すか、または環Aまたは環BのR6と一緒になって単結合または-O-を示して、環Aまたは環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;および
環Cは、j個のQR9に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。)で表される基を示すか、或いは
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成する。]で表される基を示す。
R11は、メチル基を示し、R12およびR13は、それぞれ独立にC1-5アルキル基を示すか、またはR11およびR12が一緒になって、それらが結合する炭素原子および窒素原子と共に5員または6員の含窒素炭化水素環を形成していてもよい。]
で表されるヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド。
[43] Rp1が、-CH2CH2WG(式中、WGは、電子吸引性基を示す。)で表される基である前記[42]に記載のヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド。
[44] R11がメチル基であり、R12およびR13が、それぞれ独立にC1-5アルキル基である前記[42]または[43]に記載のヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド。
[45] mが0である前記[42]~[44]のいずれか一つに記載のヌクレオシド。
*は、結合位置を示し;
jは、0~4の整数を示し;
j個のQは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
j個のR9は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
R8は、水素原子を示すか、または環Aまたは環BのR6と一緒になって単結合または-O-を示して、環Aまたは環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;および
環Cは、j個のQR9に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。)で表される基を示すか、或いは
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成する。]で表される基を示す。
R11は、メチル基を示し、R12およびR13は、それぞれ独立にC1-5アルキル基を示すか、またはR11およびR12が一緒になって、それらが結合する炭素原子および窒素原子と共に5員または6員の含窒素炭化水素環を形成していてもよい。]
で表されるヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド。
[43] Rp1が、-CH2CH2WG(式中、WGは、電子吸引性基を示す。)で表される基である前記[42]に記載のヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド。
[44] R11がメチル基であり、R12およびR13が、それぞれ独立にC1-5アルキル基である前記[42]または[43]に記載のヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド。
[45] mが0である前記[42]~[44]のいずれか一つに記載のヌクレオシド。
[46] 式(a-IV):
[式中、
mは、0以上の整数を示し;
m+1個のBaseは、それぞれ独立して、保護されていてもよい核酸塩基を示し;
m+1個のXは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、または2位炭素原子および4位炭素原子と結合する2価の有機基を示し;
m個のR10は、それぞれ独立して、酸素原子または硫黄原子を示し;
m個のRp1は、それぞれ独立して、リン酸基の保護基を示し;
Lは、単結合、または式(a1)若しくは(a1’):
mは、0以上の整数を示し;
m+1個のBaseは、それぞれ独立して、保護されていてもよい核酸塩基を示し;
m+1個のXは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、または2位炭素原子および4位炭素原子と結合する2価の有機基を示し;
m個のR10は、それぞれ独立して、酸素原子または硫黄原子を示し;
m個のRp1は、それぞれ独立して、リン酸基の保護基を示し;
Lは、単結合、または式(a1)若しくは(a1’):
(式中、
*は、Yとの結合位置を示し;
**は、酸素結合との結合位置を示し;
R1およびR2は、それぞれ独立して、C1-22炭化水素基を示し;
L1は、置換されていてもよい2価のC1-22炭化水素基を示し;
L2は、単結合を示すか、または***C(=O)N(R3)-R4-N(R5)****(式中、***は、L1との結合位置を示し、****は、C=Oとの結合位置を示し、R4は、C1-22アルキレン基を示し、R3およびR5は、それぞれ独立して、水素原子若しくはC1-22アルキル基を示すか、またはR3およびR5が一緒になって、環を形成していてもよい。)で表される基を示す。)で表される基を示し;
Yは、単結合、酸素原子、またはNR(Rは、水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。)を示し;および
Z’は、式(a2”):
*は、Yとの結合位置を示し;
**は、酸素結合との結合位置を示し;
R1およびR2は、それぞれ独立して、C1-22炭化水素基を示し;
L1は、置換されていてもよい2価のC1-22炭化水素基を示し;
L2は、単結合を示すか、または***C(=O)N(R3)-R4-N(R5)****(式中、***は、L1との結合位置を示し、****は、C=Oとの結合位置を示し、R4は、C1-22アルキレン基を示し、R3およびR5は、それぞれ独立して、水素原子若しくはC1-22アルキル基を示すか、またはR3およびR5が一緒になって、環を形成していてもよい。)で表される基を示す。)で表される基を示し;
Yは、単結合、酸素原子、またはNR(Rは、水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。)を示し;および
Z’は、式(a2”):
[式中、
*は、結合位置を示し;
R6は、水素原子であるか、あるいはRbが、下記式(a3)で表される基である場合には、R8と一緒になって単結合または-O-を示して、環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;
kは、1~4の整数を示し;
k個のQは、それぞれ独立して、-O-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-C(=O)NH-または-NHC(=O)-を示し;
k個のR7は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
環Bは、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく;
Raは、水素原子を示し;および
Rbは、水素原子、または式(a3):
*は、結合位置を示し;
R6は、水素原子であるか、あるいはRbが、下記式(a3)で表される基である場合には、R8と一緒になって単結合または-O-を示して、環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;
kは、1~4の整数を示し;
k個のQは、それぞれ独立して、-O-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-C(=O)NH-または-NHC(=O)-を示し;
k個のR7は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
環Bは、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく;
Raは、水素原子を示し;および
Rbは、水素原子、または式(a3):
(式中、
*は、結合位置を示し;
jは、0~4の整数を示し;
j個のQは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
j個のR9は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
R8は、水素原子を示すか、またはR6と一緒になって単結合または-O-を示して、環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;および
環Cは、j個のQR9に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。)で表される基を示すか、或いは
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成する。]で表される基を示す。]
で表されるヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド。
[47] Rp1が、-CH2CH2WG(式中、WGは、電子吸引性基を示す。)で表される基である前記[46]に記載のヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド。
[48] mが0である前記[46]または[47]に記載のヌクレオシド。
*は、結合位置を示し;
jは、0~4の整数を示し;
j個のQは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
j個のR9は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
R8は、水素原子を示すか、またはR6と一緒になって単結合または-O-を示して、環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;および
環Cは、j個のQR9に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。)で表される基を示すか、或いは
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成する。]で表される基を示す。]
で表されるヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド。
[47] Rp1が、-CH2CH2WG(式中、WGは、電子吸引性基を示す。)で表される基である前記[46]に記載のヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド。
[48] mが0である前記[46]または[47]に記載のヌクレオシド。
[49] 式(I):
[式中、
mは、0以上の整数を示し;
m+1個のBaseは、それぞれ独立して、保護されていてもよい核酸塩基を示し;
m+1個のXは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、または2位炭素原子および4位炭素原子と結合する2価の有機基を示し;
m個のR10は、それぞれ独立して、酸素原子または硫黄原子を示し;
m個のRp1は、それぞれ独立して、リン酸基の保護基を示し;
Rn1およびRn2の一つが水素原子を示し、残りの一つが式(II):
mは、0以上の整数を示し;
m+1個のBaseは、それぞれ独立して、保護されていてもよい核酸塩基を示し;
m+1個のXは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、または2位炭素原子および4位炭素原子と結合する2価の有機基を示し;
m個のR10は、それぞれ独立して、酸素原子または硫黄原子を示し;
m個のRp1は、それぞれ独立して、リン酸基の保護基を示し;
Rn1およびRn2の一つが水素原子を示し、残りの一つが式(II):
{式中、
*は、結合位置を示し;
R10は、酸素原子または硫黄原子を示し;
Rp1は、リン酸基の保護基を示し;
Ln1は有機基を示し;
Lは、単結合、または式(a1)若しくは(a1’):
*は、結合位置を示し;
R10は、酸素原子または硫黄原子を示し;
Rp1は、リン酸基の保護基を示し;
Ln1は有機基を示し;
Lは、単結合、または式(a1)若しくは(a1’):
(式中、
*は、Yとの結合位置を示し;
**は、酸素原子との結合位置を示し;
R1およびR2は、それぞれ独立して、C1-22炭化水素基を示し;
L1は、置換されていてもよい2価のC1-22炭化水素基を示し;
L2は、単結合を示すか、または***C(=O)N(R3)-R4-N(R5)****(式中、***は、L1との結合位置を示し、****は、C=Oとの結合位置を示し、R4は、C1-22アルキレン基を示し、R3およびR5は、それぞれ独立して、水素原子若しくはC1-22アルキル基を示すか、またはR3およびR5が一緒になって、環を形成していてもよい。)で表される基を示す。)で表される基を示し;
Yは、単結合、酸素原子、またはNR(Rは、水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。)を示し;および
Zは、式(a2)、式(a2’)または式(a2”):
*は、Yとの結合位置を示し;
**は、酸素原子との結合位置を示し;
R1およびR2は、それぞれ独立して、C1-22炭化水素基を示し;
L1は、置換されていてもよい2価のC1-22炭化水素基を示し;
L2は、単結合を示すか、または***C(=O)N(R3)-R4-N(R5)****(式中、***は、L1との結合位置を示し、****は、C=Oとの結合位置を示し、R4は、C1-22アルキレン基を示し、R3およびR5は、それぞれ独立して、水素原子若しくはC1-22アルキル基を示すか、またはR3およびR5が一緒になって、環を形成していてもよい。)で表される基を示す。)で表される基を示し;
Yは、単結合、酸素原子、またはNR(Rは、水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。)を示し;および
Zは、式(a2)、式(a2’)または式(a2”):
[式中、
*は、結合位置を示し;
R6は、水素原子であるか、あるいはRbが、下記式(a3)で表される基である場合には、環Aまたは環BのR6は、R8と一緒になって単結合または-O-を示して、環Aまたは環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;
kは、1~4の整数を示し;
k個のQは、それぞれ独立して、-O-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-C(=O)NH-または-NHC(=O)-を示し;
k個のR7は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
環Aおよび環Bは、それぞれ独立して、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく;
Raは、水素原子を示し;および
Rbは、水素原子、または式(a3):
*は、結合位置を示し;
R6は、水素原子であるか、あるいはRbが、下記式(a3)で表される基である場合には、環Aまたは環BのR6は、R8と一緒になって単結合または-O-を示して、環Aまたは環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;
kは、1~4の整数を示し;
k個のQは、それぞれ独立して、-O-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-C(=O)NH-または-NHC(=O)-を示し;
k個のR7は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
環Aおよび環Bは、それぞれ独立して、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく;
Raは、水素原子を示し;および
Rbは、水素原子、または式(a3):
(式中、
*は、結合位置を示し;
jは、0~4の整数を示し;
j個のQは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
j個のR9は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
R8は、水素原子を示すか、または環Aまたは環BのR6と一緒になって単結合または-O-を示して、環Aまたは環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;および
環Cは、j個のQR9に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。)で表される基を示すか、或いは
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成する。]で表される基を示す。}で表される基を示す。]
で表されるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
[50] Rn1が式(II)で表される基であり、Rn2が水素原子である前記[49]に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
[51] Ln1がエチレン基である前記[49]または[50]に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
[52] mが0である前記[49]~[51]のいずれか一つに記載のヌクレオチド。
*は、結合位置を示し;
jは、0~4の整数を示し;
j個のQは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
j個のR9は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
R8は、水素原子を示すか、または環Aまたは環BのR6と一緒になって単結合または-O-を示して、環Aまたは環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;および
環Cは、j個のQR9に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。)で表される基を示すか、或いは
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成する。]で表される基を示す。}で表される基を示す。]
で表されるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
[50] Rn1が式(II)で表される基であり、Rn2が水素原子である前記[49]に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
[51] Ln1がエチレン基である前記[49]または[50]に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
[52] mが0である前記[49]~[51]のいずれか一つに記載のヌクレオチド。
本発明のオリゴヌクレオチドの製造方法によれば、縮合を効率的に行うことができる。
[用語]
文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと同様または同等の任意の方法および材料は、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及したすべての刊行物および特許は、例えば、記載された発明に関連して使用されうる刊行物に記載されている、構築物および方法論を記載および開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。
文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと同様または同等の任意の方法および材料は、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及したすべての刊行物および特許は、例えば、記載された発明に関連して使用されうる刊行物に記載されている、構築物および方法論を記載および開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。
本明細書において、オリゴヌクレオチドの構成単位となる「ヌクレオシド」とは、核酸塩基が糖(例えば、2-デオキシリボース、リボース、2位炭素原子および4位炭素原子が2価の有機基により結合された2-デオキシリボースまたはリボースなど)の1位にN-グリコシド化により結合された化合物を意味する。
本明細書における「糖」は、水酸基がアミノ基に置き換わったアミノ糖、および2位水酸基がハロゲン原子に置き換わったリボースも包含する。
本明細書における「糖」は、水酸基がアミノ基に置き換わったアミノ糖、および2位水酸基がハロゲン原子に置き換わったリボースも包含する。
2位炭素原子および4位炭素原子が2価の有機基により結合された2-デオキシリボースまたはリボースとしては、例えば、以下の化合物が挙げられる。
アミノ糖としては、例えば、以下に示すような3位水酸基がアミノ基に置き換わった2-デオキシリボース、3位水酸基がアミノ基に置き換わったリボース、および3位水酸基がアミノ基に、2位水酸基がハロゲンに置き換わったリボースが挙げられる(下記式中、Xsはハロゲン原子を示す。)。
本明細書中、「リン酸基」は、-O-P(O)(OH)2だけでなく、酸素原子が硫黄原子またはNHに置き換わった基(例えば、-O-P(S)(OH)2、-NH-P(O)(OH)2、-NH-P(S)(OH)2)も包含する。また、リン酸基中の水酸基(-OH)が-ORp(式中、Rpは、リン酸基の保護基などの有機基を示す)に置き換わった基(例えば、保護されたリン酸基)も、「リン酸基」に包含される。
本明細書中、「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドにリン酸基が結合した化合物を意味する。3’位水酸基または5’位水酸基がリン酸基に置き換わったヌクレオチドとしては、例えば、下記式に示す化合物が挙げられる(下記式中、Rm1およびRm2は、それぞれ独立して、水素原子または有機基(但し、ヌクレオシド残基を除く)を示し、Xmは、水素原子、水酸基またはハロゲン原子を示す。)。
本明細書中、「オリゴヌクレオチド」とは、ヌクレオシドにヌクレオチドが1個以上連結した化合物を意味する。なお、「オリゴヌクレオチド」には、リン酸基の酸素原子が硫黄原子に置き換わったホスホロチオエート型のオリゴヌクレオチド、リン酸基の-O-が-NH-に置き換わったオリゴヌクレオチド、リン酸基中の水酸基(-OH)が-ORp(式中、Rpは有機基を示す)に置き換わったオリゴヌクレオチドも包含される。本発明におけるオリゴヌクレオチドのヌクレオシドの数は特に限定されないが、好ましくは3~50、より好ましくは5~30である。
本明細書中、「3’位アミノ基」とは、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの3’位の炭素原子に結合したアミノ基を意味する。
本明細書中、「5’位アミノ基」とは、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの5’位の炭素原子に結合したアミノ基を意味する。
本明細書中、「5’位アミノ基」とは、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの5’位の炭素原子に結合したアミノ基を意味する。
本明細書中、「3’位リン酸基」とは、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの3’位の炭素原子に結合したリン酸基を意味する。
本明細書中、「5’位リン酸基」とは、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの5’位の炭素原子に結合したリン酸基を意味する。
本明細書中、「5’位リン酸基」とは、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの5’位の炭素原子に結合したリン酸基を意味する。
本明細書中、「核酸塩基」とは、核酸の合成に使用されるものであれば特に制限されず、例えば、シトシル基、ウラシル基、チミニル基等のピリミジン塩基、アデニル基、グアニル基等のプリン塩基を挙げることができる。また、「保護されていてもよい核酸塩基」とは、例えば、アミノ基を有する核酸塩基であるアデニル基、グアニル基、またはシトシル基において、アミノ基が保護されていてもよいことを意味し、核酸塩基のアミノ基が、ヌクレオチドの5’位の脱保護条件に耐え得る保護基により保護されている核酸塩基が好ましい。
アミノ基の保護基としては、特に限定されず、例えば、グリーンズ・プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス(Greene’s PROTECTIVE GROUPS in ORGANIC SYNTHESIS)、第4版、ウィリー・インターサイエンス(Wiley-Interscience)出版(2006年)等に記載されている保護基を挙げることができる。該保護基の具体例としては、ピバロイル基、ピバロイロキシメチル基、アセチル基、トリフルオロアセチル基、フェノキシアセチル基、4-イソプロピルフェノキシアセチル基、4-tert-ブチルフェノキシアセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、(2-ヘキシル)デカノイル基、ジメチルホルムアミジニル基、1-(ジメチルアミノ)エチリデン基、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基を挙げることができる。これらの中でも、アセチル基、フェノキシアセチル基、4-イソプロピルフェノキシアセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、(2-ヘキシル)デカノイル基、ジメチルホルムアミジニル基、および1-(ジメチルアミノ)エチリデン基が好ましい。
核酸塩基のカルボニル基も保護されていてもよい。例えば、フェノール、2,5-ジクロロフェノール、3-クロロフェノール、3,5-ジクロロフェノール、2-ホルミルフェノール、2-ナフトール、4-メトキシフェノール、4-クロロフェノール、2-ニトロフェノール、4-ニトロフェノール、4-アセチルアミノフェノール、ペンタフルオロフェノール、4-ピバロイロキシベンジルアルコール、4-ニトロフェネチルアルコール、2-(メチルスルホニル)エタノール、2-(フェニルスルホニル)エタノール、2-シアノエタノール、2-(トリメチルシリル)エタノール、ジメチルカルバミン酸クロライド、ジエチルカルバミン酸クロライド、エチルフェニルカルバミン酸クロライド、1-ピロリジンカルボン酸クロライド、4-モルホリンカルボン酸クロライド、ジフェニルカルバミン酸クロライド等を反応させて、核酸塩基のカルボニル基を保護することができる。ここで、カルボニル基の保護基については、特に導入しなくてもよい場合がある。
核酸塩基には、上記した基の他に、核酸塩基が任意の置換基(例えば、ハロゲン原子、アルキル基、アラルキル基、アルコキシ基、アシル基、アルコキシアルキル基、水酸基、アミノ基、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ等)により任意の位置に1~3個置換されている修飾核酸塩基(例えば、8-ブロモアデニル基、8-ブロモグアニル基、5-ブロモシトシル基、5-ヨードシトシル基、5-ブロモウラシル基、5-ヨードウラシル基、5-フルオロウラシル基、5-メチルシトシル基、8-オキソグアニル基、ヒポキサンチニル基等)も包含される。
本明細書中、「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子である。
本明細書中、「アルキル(基)」は、直鎖状または分岐鎖状のいずれでもよい。「アルキル(基)」としては、炭素数1以上のアルキル基が挙げられ、特に炭素数範囲の限定がない場合には、好ましくはC1-10アルキル基であり、より好ましくはC1-6アルキル基、さらに好ましくはC1-5アルキル基である。炭素数範囲の限定がない場合の好適な具体例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられ、特にメチル、エチルが好ましい。
本明細書中、「Ca-b」とは、炭素数がa以上b以下(a、bは整数を示す)を意味する。
本明細書中、「Ca-b」とは、炭素数がa以上b以下(a、bは整数を示す)を意味する。
本明細書中、「アラルキル(基)」としては、C7-20アラルキル基が挙げられ、好ましくはC7-16アラルキル基(C6-10アリール-C1-6アルキル基)である。好適な具体例としては、ベンジル、1-フェニルエチル、2-フェニルエチル、1-フェニルプロピル、ナフチルメチル、1-ナフチルエチル、1-ナフチルプロピル等が挙げられ、特にベンジルが好ましい。
本明細書中、「アルコキシ(基)」は、直鎖状または分岐鎖状のいずれでもよい。「アルコキシ(基)」としては、炭素数1以上のアルコキシ基が挙げられ、特に炭素数範囲の限定がない場合には、好ましくはC1-10アルコキシ基であり、より好ましくはC1-6アルコキシ基である。炭素数範囲の限定がない場合の好適な具体例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ等が挙げられ、特にメトキシ、エトキシが好ましい。
本明細書中、「アシル(基)」は、直鎖状または分岐鎖状のいずれでもよい。「アシル(基)」としては、例えば、C1-6アルカノイル基、C7-13アロイル基等が挙げられる。具体的には、例えば、ホルミル、アセチル、n-プロピオニル、イソプロピオニル、n-ブチリル、イソブチリル、ピバロイル、バレリル、ヘキサノイル、ベンゾイル、ナフトイル、レブリニル等が挙げられ、これらはそれぞれ置換されていてもよい。
本明細書中、「アルケニル(基)」は、直鎖状または分岐鎖状のいずれでもよい。「アルケニル(基)」としては、例えば、C2-6アルケニル基等が挙げられる。具体的には、例えば、ビニル、1-プロペニル、アリル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル等が挙げられる。中でも、C2-4アルケニル基が好ましい。
本明細書中、「アルキニル(基)」は、直鎖状または分岐鎖状のいずれでもよい。「アルキニル(基)」としては、例えば、C2-6アルキニル基等が挙げられる。具体的には、例えば、エチニル、1-プロピニル、2-プロピニル、1-ブチニル、2-ブチニル、3-ブチニル、1-ペンチニル、2-ペンチニル、3-ペンチニル、4-ペンチニル、1-ヘキシニル、2-ヘキシニル、3-ヘキシニル、4-ヘキシニル、5-ヘキシニル等が挙げられる。中でも、C2-4アルキニル基が好ましい。
本明細書中、「シクロアルキル(基)」は、環状アルキル基を意味し、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル等が挙げられる。中でも、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等のC3-6シクロアルキル基が好ましく、シクロヘキシルが特に好ましい。
本明細書中、「アリール(基)」は、芳香族性を示す単環式あるいは多環式(縮合)の炭化水素基を意味し、具体的には、例えば、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、ビフェニリル、2-アンスリル等のC6-14アリール基等が挙げられる。中でもC6-10アリール基がより好ましく、フェニルが特に好ましい。
本明細書中、「炭化水素基」としては、例えば、脂肪族炭化水素基、芳香脂肪族炭化水素基、単環式飽和炭化水素基および芳香族炭化水素基等が挙げられ、具体的には、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基等の1価基およびそれらから誘導される2価基である。
本明細書中、「C6-14炭化水素環」としては、例えば、C6-10シクロアルカン、C6-10シクロアルケン、C6-14芳香族炭化水素環が挙げられる。
該「C6-10シクロアルカン」としては、例えば、シクロヘキサン、シクロヘプタン、シクロオクタンが挙げられる。
該「C6-10シクロアルケン」としては、例えば、シクロヘキセン、シクロヘプテン、シクロオクテンが挙げられる。
該「C6-14芳香族炭化水素環」としては、例えば、ベンゼン、ナフタレンが挙げられる。
該「C6-10シクロアルカン」としては、例えば、シクロヘキサン、シクロヘプタン、シクロオクタンが挙げられる。
該「C6-10シクロアルケン」としては、例えば、シクロヘキセン、シクロヘプテン、シクロオクテンが挙げられる。
該「C6-14芳香族炭化水素環」としては、例えば、ベンゼン、ナフタレンが挙げられる。
本明細書中、「アルキレン(基)」は、直鎖状または分岐鎖状のいずれでもよい。「アルキレン(基)」としては、炭素数1以上のアルキレン基が挙げられ、特に炭素数範囲の限定がない場合には、好ましくはC1-10アルキレン基であり、より好ましくはC1-6アルキレン基である。好適な具体例としては、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレンが挙げられ、特にメチレン、エチレンが好ましい。
本明細書中、「リンカー」としては、例えば、-O-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-C(=O)NH-、-NHC(=O)-、-S-、-SO-、-SO2-、-Si(R’)(R”)O-、-Si(R’)(R”)-(R’、R”は、それぞれ独立して、水素原子またはC1-22炭化水素基を示す。)等が挙げられる。
本明細書中、「リンカー」としては、例えば、-O-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-C(=O)NH-、-NHC(=O)-、-S-、-SO-、-SO2-、-Si(R’)(R”)O-、-Si(R’)(R”)-(R’、R”は、それぞれ独立して、水素原子またはC1-22炭化水素基を示す。)等が挙げられる。
本明細書中、「置換されていてもよい」における「置換基」には、前記のハロゲン原子、アルキル基、アラルキル基、アルコキシ基、アシル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基の他、水酸基、ニトロ基、シアノ基、グアニジル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基(アルコキシ部は前記アルコキシ基と同様)、スルホ基、ホスホ基、アルキルチオ基(アルキル部は前記アルキル基と同様)、アルキルスルフィニル基(アルキル部は前記アルキル基と同様)、アルキルスルホニル基(アルキル部は前記アルキル基と同様)、アミノ基、モノアルキルアミノ基(アルキル部は前記アルキル基と同様)、ジアルキルアミノ基(アルキル部は前記アルキル基と同様)、オキソ基などが包含される。
[オリゴヌクレオチドの製造方法]
本発明の製造方法は、3’末端から5’末端への方向にオリゴヌクレオチド鎖の伸長を行う態様(以下「3’-5’合成」と略称することがある)および5’末端から3’末端への方向にオリゴヌクレオチド鎖の伸長を行う態様(以下「5’-3’合成」と略称することがある)の両方を包含する。まず、3’-5’合成である本発明の製造方法から説明する。
本発明の製造方法は、3’末端から5’末端への方向にオリゴヌクレオチド鎖の伸長を行う態様(以下「3’-5’合成」と略称することがある)および5’末端から3’末端への方向にオリゴヌクレオチド鎖の伸長を行う態様(以下「5’-3’合成」と略称することがある)の両方を包含する。まず、3’-5’合成である本発明の製造方法から説明する。
3’-5’合成
3’-5’合成である本発明の製造方法は、以下の工程(1)、(3)、(4)および(6)を含む。この製造方法は、必要に応じて、さらに以下の工程(2)、(5)および(7)を含んでいてもよい。
(1)非極性溶媒中、
5’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基、3’位水酸基および3’位アミノ基、並びにデオキシリボース残基の3’位水酸基および3’位アミノ基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)、或いは
5’位水酸基が保護されておらず、3’位リン酸基の一つの水酸基が-OLn1-OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、-OLn1-OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)
を含む反応液に、
3’位水酸基または3’位アミノ基がホスホロアミダイト化され、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)
を添加して、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)とヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)とを縮合させ、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイトトリエステル体(c)を含む反応液を得る工程;
(2)必要に応じて、縮合後の反応液にクエンチ剤を添加する工程;
(3)ホスファイトトリエステル体(c)を含む反応液に酸化剤または硫化剤を添加して、ホスファイトトリエステル体(c)を酸化または硫化し、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたオリゴヌクレオチド(d)を含む反応液を得る工程;
(4)酸化または硫化後の反応液に酸を添加して5’位水酸基の一時保護基を除去し、5’位水酸基が保護されていないオリゴヌクレオチド(e)を含む反応液を得る工程;
(5)必要に応じて、オリゴヌクレオチド(e)を含む反応液に塩基を添加して中和する工程;
(6)オリゴヌクレオチド(e)を含む反応液に極性溶媒を添加し、オリゴヌクレオチド(e)を固液分離または抽出により精製する工程;および
(7)必要に応じて、得られたオリゴヌクレオチドの保護基を全て除去した後、保護されていないオリゴヌクレオチドを単離する工程。
3’-5’合成である本発明の製造方法は、以下の工程(1)、(3)、(4)および(6)を含む。この製造方法は、必要に応じて、さらに以下の工程(2)、(5)および(7)を含んでいてもよい。
(1)非極性溶媒中、
5’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基、3’位水酸基および3’位アミノ基、並びにデオキシリボース残基の3’位水酸基および3’位アミノ基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)、或いは
5’位水酸基が保護されておらず、3’位リン酸基の一つの水酸基が-OLn1-OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、-OLn1-OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)
を含む反応液に、
3’位水酸基または3’位アミノ基がホスホロアミダイト化され、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)
を添加して、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)とヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)とを縮合させ、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイトトリエステル体(c)を含む反応液を得る工程;
(2)必要に応じて、縮合後の反応液にクエンチ剤を添加する工程;
(3)ホスファイトトリエステル体(c)を含む反応液に酸化剤または硫化剤を添加して、ホスファイトトリエステル体(c)を酸化または硫化し、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたオリゴヌクレオチド(d)を含む反応液を得る工程;
(4)酸化または硫化後の反応液に酸を添加して5’位水酸基の一時保護基を除去し、5’位水酸基が保護されていないオリゴヌクレオチド(e)を含む反応液を得る工程;
(5)必要に応じて、オリゴヌクレオチド(e)を含む反応液に塩基を添加して中和する工程;
(6)オリゴヌクレオチド(e)を含む反応液に極性溶媒を添加し、オリゴヌクレオチド(e)を固液分離または抽出により精製する工程;および
(7)必要に応じて、得られたオリゴヌクレオチドの保護基を全て除去した後、保護されていないオリゴヌクレオチドを単離する工程。
工程(1)、(3)、(4)および(6)(好ましくは工程(1)~(6))のサイクルを繰り返すことによって、オリゴヌクレオチド鎖を伸長させることができる。なお、工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むオリゴヌクレオチドの製造方法は、本発明に包含される。
工程(1)(縮合)
本工程は、5’位水酸基が保護されておらず、3’位水酸基等の少なくとも一つが、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護されたヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)と、3’位水酸基または3’位アミノ基がホスホロアミダイト化され、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)とを縮合させて、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイトトリエステル体(c)を得る工程である。
本工程は、5’位水酸基が保護されておらず、3’位水酸基等の少なくとも一つが、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護されたヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)と、3’位水酸基または3’位アミノ基がホスホロアミダイト化され、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)とを縮合させて、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイトトリエステル体(c)を得る工程である。
本工程の好ましい態様では、
5’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および3’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の3’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)、或いは
5’位水酸基が保護されておらず、3’位リン酸基の一つの水酸基が-OLn1-OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、-OLn1-OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)、並びに
3’位水酸基がホスホロアミダイト化され、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)
が使用される。
5’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および3’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の3’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)、或いは
5’位水酸基が保護されておらず、3’位リン酸基の一つの水酸基が-OLn1-OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、-OLn1-OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)、並びに
3’位水酸基がホスホロアミダイト化され、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)
が使用される。
Ln1の有機基とは、炭化水素基、または炭化水素基中の炭素原子がヘテロ原子で置き換わった基を意味する。ヘテロ原子としては、例えば、酸素原子、窒素原子、硫黄原子等が挙げられる。また、有機基は、水酸基、アミノ基、オキソ基(=O)等の置換基を有していてもよい。有機基が有し得る水酸基およびアミノ基は、保護基で保護されていることが好ましい。有機基の形状は、鎖状(直鎖状または分岐鎖状)、環状またはこれらの組合せのいずれでもよい。
有機基は、細胞に対して機能性を有する基を有していてもよい。細胞に対して機能性を有する基は、有機基の主鎖または側鎖の末端に結合していることが好ましい。細胞に対して機能性を有する基としては、例えば、「化合物の脂溶性を向上させることによって、化合物の細胞膜透過性を向上させる基」、「細胞膜受容体を介して細胞内への化合物の取込みを向上させる基」等が挙げられる。「化合物の脂溶性を向上させることによって、化合物の細胞膜透過性を向上させる基」としては、例えば、コレステロール残基、トコフェロール残基等が挙げられる。「細胞膜受容体を介して細胞内への化合物の取込みを向上させる基」としては、例えば、N-アセチルガラクトサミン残基等が挙げられる。
-OLn1-OHの具体例としては、以下のものが挙げられる(下記式中の*は、リン原子との結合位置を示し、Acはアセチル基を示す。)。
Ln1は、好ましくはC2-6アルキレン基、より好ましくはエチレン基である。
本工程のより好ましい態様では、
5’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および3’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の3’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(a)、並びに
3’位水酸基がホスホロアミダイト化され、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(b)
が使用される。
5’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および3’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の3’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(a)、並びに
3’位水酸基がホスホロアミダイト化され、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(b)
が使用される。
本工程で使用するヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)の溶液中の濃度は、それらが溶媒に溶解していれば特に限定されないが、好ましくは1~30重量%である。
ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)、置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)およびヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)のアミノ基は、上述の保護基で保護されていることが好ましい。該保護基としては、セチル基、フェノキシアセチル基、4-イソプロピルフェノキシアセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、(2-ヘキシル)デカノイル基、ジメチルホルムアミジニル基、および1-(ジメチルアミノ)エチリデン基が好ましい。ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)およびヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)が複数のアミノ基を有する場合、アミノ基の保護基は1種のみでもよく、2種以上でもよい。
ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)は、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基、3’位水酸基および3’位アミノ基、並びにデオキシリボース残基の3’位水酸基および3’位アミノ基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護されている。ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)は、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の3’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の3’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、前記保護基で保護されていることが好ましく、リボース残基の3’位水酸基またはデオキシリボース残基の3’位水酸基が、前記保護基で保護されていることがより好ましい。
置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)は、-OLn1-OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護されている。
ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)および置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)が有する「酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基」、並びにヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)が有していてもよい「酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基」は、それぞれ独立して、工程(6)(固液分離または抽出)を効率的に行うために、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基を有するか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を有する保護基(以下「アンカー」と略称することがある)であることが好ましい。
アンカーは、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)および置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)(場合によりヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b))に疎水性を付与して、非極性溶媒に対する溶解性を向上させる。また極性溶媒に対する溶解性を低下させることもできる。このようなアンカーで保護されたヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)および置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)は、非極性溶媒の液相中で縮合反応を行うことができ、その後の工程(6)で反応液に極性溶媒を添加することによって、アンカーで保護されたオリゴヌクレオチド(e)が沈殿し、その固液分離を行うことができる。または工程(6)で反応液に極性溶媒を添加して、極性溶媒-非極性溶媒間で分層させ、非極性溶媒にオリゴヌクレオチド(e)を移行させることにより、その抽出を行うことができる。このようなアンカーとしては、例えば、特許文献1、特許文献2および国際公開第2013/122236号に記載されているものを使用することができる。
工程(6)で固液分離による精製を行う場合、アンカーは、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基を有する保護基であることが好ましく、工程(6)で抽出による精製を行う場合、アンカーは、分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を有する保護基であることが好ましい。
まず、固液分離のために好適なアンカーについて説明する。固液分離のために好適なアンカーとしては、例えば、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基がリンカーを介して結合したC6-14炭化水素環を有する保護基が挙げられる。
前記炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基は、好ましくは直鎖状のC10-40アルキル基および直鎖状のC10-40アルケニル基から選ばれる基であり、より好ましくは直鎖状のC10-40アルキル基であり、さらに好ましくは直鎖状のC10-30アルキル基であり、特に好ましくは直鎖状のC12-28アルキル基であり、最も好ましくは直鎖状のC14-26アルキル基である。
前記リンカーは、好ましくは-O-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-C(=O)NH-、-NHC(=O)-、-S-、-SO-、-SO2-、および-Si(R’)(R”)O-、-Si(R’)(R”)-(R’、R”は、それぞれ独立して、水素原子またはC1-22炭化水素基を示す。)から選ばれ、より好ましくは-O-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-C(=O)NH-および-NHC(=O)-から選ばれ、より好ましくは-O-である。
前記C6-14炭化水素環は、好ましくはベンゼン環、ナフタレン環およびシクロヘキサン環から選ばれ、より好ましくはベンゼン環およびシクロヘキサン環から選ばれ、さらに好ましくはベンゼン環である。
固液分離のために好適なアンカーは、好ましくは、直鎖状のC10-40アルキル基が単結合または-O-を介して結合した炭化水素基が-O-を介して結合したベンゼン環を有する保護基である。
次に、抽出のために好適なアンカーについて説明する。「分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基」における「分岐鎖」としては、直鎖状または分岐鎖状の飽和脂肪族炭化水素基であり、C1-6アルキル基が好ましく、C1-4アルキル基がより好ましく、メチル基またはエチル基が一層好ましい。また、該「分岐鎖」は、1個以上のハロゲン原子で置換されていてもよい。
「分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基」における「脂肪族炭化水素基」とは、直鎖状の飽和または不飽和の脂肪族炭化水素基であり、C2-300アルキル基(好ましくは、C3-100アルキル基、より好ましくは、C3-60アルキル基)、C2-300アルケニル基(好ましくは、C3-100アルケニル基、より好ましくは、C3-60アルケニル基)またはC2-300アルキニル基(好ましくは、C3-100アルキニル基、より好ましくは、C3-60アルキニル基)である。
「分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基」における「分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基」の部位は、特に限定されず、末端に存在しても(1価基)、それ以外の部位に存在してもよい(例えば2価基)。
「分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基」としては、例えば、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基(ラウリル基)、トリデシル基、ミリスチル基、セチル基、ステアリル基、アラキル基、ベヘニル基、オレイル基、リノリル基、リグノセリル基等の分岐異性体であって、1以上の分岐鎖を有する1価基およびそれらから誘導される2価基が挙げられる。「分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基」は、好ましくは、3,7,11-トリメチルドデシル基、3,7,11,15-テトラメチルヘキサデシル基(以下、2,3-ジヒドロフィチル基ということもある。)、2,2,4,8,10,10-ヘキサメチルウンデカン-5-イル基等である。
「分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基」中に「分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基」が複数存在する場合には、その各々は同一のものであっても、異なるものであってもよい。
「分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基」中の「分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基」以外の部位は任意に設定することができる。例えば-O-、-S-、-CO-、-NH-、-COO-、-OCONH-、-CONH-、-NHCO-、炭化水素基(1価基または2価基)等の部位を有していてもよい。「炭化水素基」としては、例えば、脂肪族炭化水素基、芳香脂肪族炭化水素基、単環式飽和炭化水素基および芳香族炭化水素基等が挙げられ、具体的には、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基等の1価基およびそれらから誘導される2価基が用いられる。「アルキル基」としては、C1-6アルキル基が好ましく、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。「アルケニル基」としては、C2-6アルケニル基が好ましく、例えば、ビニル、1-プロペニル、アリル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル等が挙げられる。「アルキニル基」としては、C2-6アルキニル基が好ましく、例えば、エチニル、プロパルギル、1-プロピニル等が挙げられる。「シクロアルキル基」としては、C3-6シクロアルキル基が好ましく、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルが挙げられる。「アリール基」は、C6-14アリール基が好ましく、例えば、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、ビフェニリル、2-アンスリル等が挙げられる。中でもC6-10アリール基がより好ましく、フェニルが特に好ましい。「アラルキル基」としては、C7-20アラルキル基が好ましく、例えば、ベンジル、1-フェニルエチル、2-フェニルエチル、1-フェニルプロピル、ナフチルメチル、1-ナフチルエチル、1-ナフチルプロピル等が挙げられる。中でも、C7-16アラルキル基(C6-10アリール-C1-6アルキル基)がより好ましく、ベンジルが特に好ましい。該「炭化水素基」は、ハロゲン原子(塩素原子、臭素原子、フッ素原子、ヨウ素原子)、オキソ基等から選択される置換基で置換されていてもよい。
「分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基」における「総炭素数」は、14以上、好ましくは16以上、より好ましくは18以上であり、300以下、好ましくは200以下、より好ましくは160以下である。また、「分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基」における分岐鎖の数は特に制限されないが、2以上が好ましく、3以上がより好ましく、4以上がより好ましく、8以上がより好ましく、10以上がさらに好ましい。この分岐鎖の数が多いほど、オリゴヌクレオチド鎖が長鎖になった場合でも、分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を有するアンカーで保護されたヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドは、有機溶媒(特に、非極性溶媒)に対して良好に溶解する。
「分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基」としては、式(A):
[式中、
*は、隣接原子との結合位置を示し;
R14およびR15は、それぞれ独立して、水素原子またはC1-4アルキル基を示し;および
X1は、単結合またはC1-4アルキレン基を示す。
但し、R14およびR15が共に水素原子であることはない。]
で表される同一または異なる2価の基を有する基が好ましい。
*は、隣接原子との結合位置を示し;
R14およびR15は、それぞれ独立して、水素原子またはC1-4アルキル基を示し;および
X1は、単結合またはC1-4アルキレン基を示す。
但し、R14およびR15が共に水素原子であることはない。]
で表される同一または異なる2価の基を有する基が好ましい。
式(A)で表される2価の基を有する基としては、例えば、下記式(B)~(D)のいずれかで表される基が挙げられる。なお、式(B)~(D)における各記号の定義中の炭素数、繰り返し単位の数(m1、n0~n2)等は便宜上示されたものであって、総炭素数が14以上(好ましくは16以上、より好ましくは18以上)、300以下(好ましくは200以下、より好ましくは160以下)になるよう上記した定義の範囲内で適宜変更することができる。以下、式(B)~(D)について、順に説明する。
式(B)は、以下の通りである。
[式中、
*は、隣接原子との結合位置を示し;
R16およびR17は、水素原子を示すか、または一緒になって=Oを示し;
n0は、2~40の整数を示し;
n0個のR18およびR19は、それぞれ独立して、水素原子またはC1-4アルキル基を示し;
n0個のX2は、それぞれ独立して、単結合またはC1-4アルキレン基を示し;
R20は、水素原子またはC1-4アルキル基を示し;および
R21は、C1-4アルキル基を示す。
但し、R18およびR19が共に水素原子であることはなく、且つn0が2の場合には、R20はC1-4アルキル基を示す。]
*は、隣接原子との結合位置を示し;
R16およびR17は、水素原子を示すか、または一緒になって=Oを示し;
n0は、2~40の整数を示し;
n0個のR18およびR19は、それぞれ独立して、水素原子またはC1-4アルキル基を示し;
n0個のX2は、それぞれ独立して、単結合またはC1-4アルキレン基を示し;
R20は、水素原子またはC1-4アルキル基を示し;および
R21は、C1-4アルキル基を示す。
但し、R18およびR19が共に水素原子であることはなく、且つn0が2の場合には、R20はC1-4アルキル基を示す。]
式(B)の基としては、
R16およびR17は、共に水素原子であり;
n0は、2~40の整数であり;
n0個のR18およびR19は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基またはエチル基であり;
n0個のX2は、それぞれ独立して、単結合、メチレン基またはエチレン基であり;および
R20は、水素原子、メチル基またはエチル基である
基(但し、R18およびR19が共に水素原子であることはなく、且つn0が2の場合には、R20はメチルまたはエチル基を示す。)が好ましい。
R16およびR17は、共に水素原子であり;
n0は、2~40の整数であり;
n0個のR18およびR19は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基またはエチル基であり;
n0個のX2は、それぞれ独立して、単結合、メチレン基またはエチレン基であり;および
R20は、水素原子、メチル基またはエチル基である
基(但し、R18およびR19が共に水素原子であることはなく、且つn0が2の場合には、R20はメチルまたはエチル基を示す。)が好ましい。
より好適な式(B)の基は、ミリスチル基、セチル基、ステアリル基、アラキル基、ベヘニル基等の炭素数14~160の分岐異性体であり、中でも2,3-ジヒドロフィチル基、3,7,11-トリメチルドデシル基、2,2,4,8,10,10-ヘキサメチル-5-ドデカノイル基が特に好ましい。
式(C)は、以下の通りである。
[式中、
*は、隣接原子との結合位置を示し;
m1個のOR22は、それぞれ独立して、式(B)で表される基により置換された水酸基を示し;および
m1は、1~3の整数を示す。]
なお、式(C)中の「式(B)で表される基」は、その*がO(即ち、隣接原子)との結合位置を示すこと以外は上述した通りである。
*は、隣接原子との結合位置を示し;
m1個のOR22は、それぞれ独立して、式(B)で表される基により置換された水酸基を示し;および
m1は、1~3の整数を示す。]
なお、式(C)中の「式(B)で表される基」は、その*がO(即ち、隣接原子)との結合位置を示すこと以外は上述した通りである。
式(C)の基において、R22は、ミリスチル基、セチル基、ステアリル基、アラキル基、ベヘニル基等の炭素数14~30の分岐異性体である基がより好ましく、中でも2,3-ジヒドロフィチル基、3,7,11-トリメチルドデシル基が特に好ましい。
式(D)は、以下の通りである。
[式中、
*は、Qとの結合位置を示し;
n1は、1~10の整数を示し;
n2は、1~10の整数を示し;
n1個のR26およびR27は、それぞれ独立して、水素原子またはC1-4アルキル基を示し;
n1個のX3は、それぞれ独立して、単結合またはC1-4アルキレン基を示し;
n2個のR28およびR29は、それぞれ独立して、水素原子またはC1-4アルキル基を示し;
n2個のX5は、それぞれ独立して、単結合またはC1-4アルキレン基を示し;
X4は、単結合またはC1-4アルキレン基を示し;および
R23、R24、R25、R30、R31およびR32は、それぞれ独立して、水素原子またはC1-4アルキル基を示す。
但し、R26およびR27、および/またはR28およびR29が共に水素原子であることはなく、且つn1+n2が2の場合には、R23、R24およびR25の2個以上がそれぞれ独立して、C1-4アルキル基を示すか、またはR30、R31およびR32の2個以上がそれぞれ独立して、C1-4アルキル基を示す。]
*は、Qとの結合位置を示し;
n1は、1~10の整数を示し;
n2は、1~10の整数を示し;
n1個のR26およびR27は、それぞれ独立して、水素原子またはC1-4アルキル基を示し;
n1個のX3は、それぞれ独立して、単結合またはC1-4アルキレン基を示し;
n2個のR28およびR29は、それぞれ独立して、水素原子またはC1-4アルキル基を示し;
n2個のX5は、それぞれ独立して、単結合またはC1-4アルキレン基を示し;
X4は、単結合またはC1-4アルキレン基を示し;および
R23、R24、R25、R30、R31およびR32は、それぞれ独立して、水素原子またはC1-4アルキル基を示す。
但し、R26およびR27、および/またはR28およびR29が共に水素原子であることはなく、且つn1+n2が2の場合には、R23、R24およびR25の2個以上がそれぞれ独立して、C1-4アルキル基を示すか、またはR30、R31およびR32の2個以上がそれぞれ独立して、C1-4アルキル基を示す。]
式(D)の基としては、
n1は、1~5の整数であり;
n2は、1~5の整数であり;
n1個のR26およびR27は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基またはエチル基であり;
n1個のX3は、それぞれ独立して、単結合、メチレン基またはエチレン基であり;
n2個のR28およびR29は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基またはエチル基であり;
n2個のX5は、それぞれ独立して、単結合、メチレン基またはエチレン基であり;
X4は、単結合、メチレン基またはエチレン基であり;および
R23、R24、R25、R30、R31およびR32は、それぞれ独立して、水素原子またはC1-4アルキル基である
基(但し、R26およびR27、および/またはR28およびR29が共に水素原子であることはなく、且つn1+n2が2の場合には、R23、R24およびR25の2個以上がそれぞれ独立して、C1-4アルキル基を示すか、またはR30、R31およびR32の2個以上がそれぞれ独立して、C1-4アルキル基を示す。)がより好ましい。
n1は、1~5の整数であり;
n2は、1~5の整数であり;
n1個のR26およびR27は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基またはエチル基であり;
n1個のX3は、それぞれ独立して、単結合、メチレン基またはエチレン基であり;
n2個のR28およびR29は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基またはエチル基であり;
n2個のX5は、それぞれ独立して、単結合、メチレン基またはエチレン基であり;
X4は、単結合、メチレン基またはエチレン基であり;および
R23、R24、R25、R30、R31およびR32は、それぞれ独立して、水素原子またはC1-4アルキル基である
基(但し、R26およびR27、および/またはR28およびR29が共に水素原子であることはなく、且つn1+n2が2の場合には、R23、R24およびR25の2個以上がそれぞれ独立して、C1-4アルキル基を示すか、またはR30、R31およびR32の2個以上がそれぞれ独立して、C1-4アルキル基を示す。)がより好ましい。
特に好適な式(D)の基としては、
n1は、1~5の整数であり;
n2は、1~5の整数であり;
n1個のR26およびR27は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基であり;
n1個のX3は、それぞれ独立して、単結合またはメチレン基であり;
n2個のR28およびR29は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基であり;
n2個のX5は、それぞれ独立して、単結合またはメチレン基であり;
X4は、単結合またはメチレン基であり;および
R23、R24、R25、R31、R31およびR32は、メチル基である
基(但し、R26およびR27、および/またはR28およびR29が、共に水素原子であることはない)が挙げられる。
n1は、1~5の整数であり;
n2は、1~5の整数であり;
n1個のR26およびR27は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基であり;
n1個のX3は、それぞれ独立して、単結合またはメチレン基であり;
n2個のR28およびR29は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基であり;
n2個のX5は、それぞれ独立して、単結合またはメチレン基であり;
X4は、単結合またはメチレン基であり;および
R23、R24、R25、R31、R31およびR32は、メチル基である
基(但し、R26およびR27、および/またはR28およびR29が、共に水素原子であることはない)が挙げられる。
「分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基」の具体例として、以下の基が挙げられる。各基中の*は結合位置を示し;式中のn3は、3以上の整数を示し;n4は、該基の総炭素数が14以上300以下になるように適宜設定され得る。
「分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基」の好ましい具体例として、以下の基が挙げられる:
3,7,11,15-テトラメチルヘキサデシル基(別名:2,3-ジヒドロフィチル基);
3,7,11-トリメチルドデシル基;
2,2,4,8,10,10-ヘキサメチル-5-ドデカノイル基;
3,4,5-トリ(3’,7’,11’,15’-テトラメチルヘキサデシルオキシ)ベンジル基;および
3,5-ジ(3’,7’,11’,15’-テトラメチルヘキサデシルオキシ)ベンジル基。
3,7,11,15-テトラメチルヘキサデシル基(別名:2,3-ジヒドロフィチル基);
3,7,11-トリメチルドデシル基;
2,2,4,8,10,10-ヘキサメチル-5-ドデカノイル基;
3,4,5-トリ(3’,7’,11’,15’-テトラメチルヘキサデシルオキシ)ベンジル基;および
3,5-ジ(3’,7’,11’,15’-テトラメチルヘキサデシルオキシ)ベンジル基。
アンカーは、より好ましくは、下記式(g-I)で表される基(以下「アンカー(g-I)」と略称することがある。)である。
**L-Y-Z (g-I)
[式中、
**は保護される基との結合位置を示し;
Lは、単結合、または式(a1)若しくは(a1’):
**L-Y-Z (g-I)
[式中、
**は保護される基との結合位置を示し;
Lは、単結合、または式(a1)若しくは(a1’):
(式中、
*は、Yとの結合位置を示し;
**は前記と同義であり;
R1およびR2は、それぞれ独立して、C1-22炭化水素基を示し;
L1は、置換されていてもよい2価のC1-22炭化水素基を示し;
L2は、単結合を示すか、または***C(=O)N(R3)-R4-N(R5)****(式中、***は、L1との結合位置を示し、****は、C=Oとの結合位置を示し、R4は、C1-22アルキレン基を示し、R3およびR5は、それぞれ独立して、水素原子若しくはC1-22アルキル基を示すか、またはR3およびR5が一緒になって、環を形成していてもよい。)で表される基を示す。)で表される基を示し;
Yは、単結合、酸素原子、またはNR(Rは、水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。)を示し;および
Zは、式(a2)、式(a2’)または式(a2”):
*は、Yとの結合位置を示し;
**は前記と同義であり;
R1およびR2は、それぞれ独立して、C1-22炭化水素基を示し;
L1は、置換されていてもよい2価のC1-22炭化水素基を示し;
L2は、単結合を示すか、または***C(=O)N(R3)-R4-N(R5)****(式中、***は、L1との結合位置を示し、****は、C=Oとの結合位置を示し、R4は、C1-22アルキレン基を示し、R3およびR5は、それぞれ独立して、水素原子若しくはC1-22アルキル基を示すか、またはR3およびR5が一緒になって、環を形成していてもよい。)で表される基を示す。)で表される基を示し;
Yは、単結合、酸素原子、またはNR(Rは、水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。)を示し;および
Zは、式(a2)、式(a2’)または式(a2”):
[式中、
*は、結合位置を示し;
R6は、水素原子であるか、あるいはRbが、下記式(a3)で表される基である場合には、環Aまたは環BのR6は、R8と一緒になって単結合または-O-を示して、環Aまたは環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;
kは、1~4の整数を示し;
k個のQは、それぞれ独立して、-O-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-C(=O)NH-または-NHC(=O)-を示し;
k個のR7は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
環Aおよび環Bは、それぞれ独立して、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく;
Raは、水素原子を示し;および
Rbは、水素原子、または式(a3):
*は、結合位置を示し;
R6は、水素原子であるか、あるいはRbが、下記式(a3)で表される基である場合には、環Aまたは環BのR6は、R8と一緒になって単結合または-O-を示して、環Aまたは環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;
kは、1~4の整数を示し;
k個のQは、それぞれ独立して、-O-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-C(=O)NH-または-NHC(=O)-を示し;
k個のR7は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
環Aおよび環Bは、それぞれ独立して、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく;
Raは、水素原子を示し;および
Rbは、水素原子、または式(a3):
(式中、
*は、結合位置を示し;
jは、0~4の整数を示し;
j個のQは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
j個のR9は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
R8は、水素原子を示すか、または環Aまたは環BのR6と一緒になって単結合または-O-を示して、環Aまたは環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;および
環Cは、j個のQR9に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。)で表される基を示すか、或いは
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成する。]で表される基を示す。]
*は、結合位置を示し;
jは、0~4の整数を示し;
j個のQは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
j個のR9は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
R8は、水素原子を示すか、または環Aまたは環BのR6と一緒になって単結合または-O-を示して、環Aまたは環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;および
環Cは、j個のQR9に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。)で表される基を示すか、或いは
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成する。]で表される基を示す。]
式(a2)、式(a2’)および式(a2”)中のR7、並びに式(a3)中のR9が有する炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基は、それぞれ独立して、好ましくは直鎖状のC10-40アルキル基および直鎖状のC10-40アルケニル基から選ばれる基であり、より好ましくは直鎖状のC10-40アルキル基であり、さらに好ましくは直鎖状のC10-30アルキル基であり、特に好ましくは直鎖状のC12-28アルキル基であり、最も好ましくは直鎖状のC14-26アルキル基である。
式(a2)、式(a2’)および式(a2”)中のR7、並びに式(a3)中のR9が有するリンカーは、それぞれ独立して、好ましくは-O-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-C(=O)NH-または-NHC(=O)-であり、より好ましくは-O-である。
式(a2)、式(a2’)および式(a2”)中のR7、並びに式(a3)中のR9が有するリンカーは、それぞれ独立して、好ましくは-O-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-C(=O)NH-または-NHC(=O)-であり、より好ましくは-O-である。
式(a2)、式(a2’)および式(a2”)中のR7、並びに式(a3)中のR9の「炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基」は、好ましくは、直鎖状のC10-40アルキル基、1~3個の直鎖状のC10-40アルキル基が-O-を介して結合したベンジル基、または1~3個の直鎖状のC10-40アルキル基が-O-を介して結合したシクロヘキシルメチル基である。
式(a2)、式(a2’)および式(a2”)中のR7、並びに式(a3)中のR9の一態様である「分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基」は、それぞれ独立して、好ましくは上記式(A)で表される2価の基を有する基であり、より好ましくは上記式(B)~(D)のいずれかで表される基であり、さらに好ましくは上記式(B)で表される基であり、特に好ましくは2,3-ジヒドロフィチル基、3,7,11-トリメチルドデシル基、または2,2,4,8,10,10-ヘキサメチル-5-ドデカノイル基である。
式(a2)、式(a2’)、式(a2”)および式(a3)中のQは、好ましくは-O-、-C(=O)NH-または-NHC(=O)-であり、より好ましくは-O-である。
式(g-I)において、式(a1)で表されるLの好ましい態様は、
L1が、2価のC1-22炭化水素基、またはCH2-O-1,4-フェニレン-O-CH2であり;および
L2が、単結合であるか、または***C(=O)N(R3)-R4-N(R5)****(式中、***は、L1との結合位置を示し、****は、C=Oとの結合位置を示し、R4は、C1-6アルキレン基を示し、R3およびR5は、それぞれ独立して水素原子、若しくは置換されていてもよいC1-6アルキル基を示すか、またはR3およびR5が一緒になって、置換されていてもよいC1-6アルキレン基を形成していてもよい。)で表される基である、
基である。
L1が、2価のC1-22炭化水素基、またはCH2-O-1,4-フェニレン-O-CH2であり;および
L2が、単結合であるか、または***C(=O)N(R3)-R4-N(R5)****(式中、***は、L1との結合位置を示し、****は、C=Oとの結合位置を示し、R4は、C1-6アルキレン基を示し、R3およびR5は、それぞれ独立して水素原子、若しくは置換されていてもよいC1-6アルキル基を示すか、またはR3およびR5が一緒になって、置換されていてもよいC1-6アルキレン基を形成していてもよい。)で表される基である、
基である。
式(a1)で表されるLの別の好ましい態様は、
L1が、2価のC1-22炭化水素基であり;および
L2が単結合である
基である。
L1が、2価のC1-22炭化水素基であり;および
L2が単結合である
基である。
式(a1)で表されるLの別の好ましい態様は、
L1が、エチレン基であり;および
L2が、***C(=O)N(R3)-R4-N(R5)****(式中、***は、L1との結合位置を示し、****は、C=Oとの結合位置を示し、R4は、C1-22アルキレン基を示し、R3およびR5は、それぞれ独立して、水素原子若しくはC1-22アルキル基を示すか、またはR3およびR5が一緒になって、環を形成していてもよい。)で表される基を示す。)で表される基である
基である。
L1が、エチレン基であり;および
L2が、***C(=O)N(R3)-R4-N(R5)****(式中、***は、L1との結合位置を示し、****は、C=Oとの結合位置を示し、R4は、C1-22アルキレン基を示し、R3およびR5は、それぞれ独立して、水素原子若しくはC1-22アルキル基を示すか、またはR3およびR5が一緒になって、環を形成していてもよい。)で表される基を示す。)で表される基である
基である。
式(a1)で表されるLの別の好ましい態様は、
L1が、エチレン基であり;および
L2が、***C(=O)N(R3)-R4-N(R5)****(式中、***は、L1との結合位置を示し、****は、C=Oとの結合位置を示し、N(R3)-R4-N(R5)部分が、1,4-ピペラジンジイル基を形成する。)で表される基である
基である。
L1が、エチレン基であり;および
L2が、***C(=O)N(R3)-R4-N(R5)****(式中、***は、L1との結合位置を示し、****は、C=Oとの結合位置を示し、N(R3)-R4-N(R5)部分が、1,4-ピペラジンジイル基を形成する。)で表される基である
基である。
式(a1)で表されるLの別の好ましい態様は、
L1が、エチレン基であり;および
L2が、***C(=O)N(R3)-R4-N(R5)****(式中、***は、L1との結合位置を示し、****は、C=Oとの結合位置を示し、R4は、ペンチレン基、またはヘキシレン基を示し、R3およびR5は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基を示す。)で表される基である
基である。
L1が、エチレン基であり;および
L2が、***C(=O)N(R3)-R4-N(R5)****(式中、***は、L1との結合位置を示し、****は、C=Oとの結合位置を示し、R4は、ペンチレン基、またはヘキシレン基を示し、R3およびR5は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基を示す。)で表される基である
基である。
式(a1)で表されるLの特に好ましい態様は、入手が容易で安価なスクシニル基である。
次に、式(g-I)において式(a1’)で表されるLについて説明する。
式(a1’)中のL1は、好ましくは2価のC6-10芳香族炭化水素基であり、より好ましくはフェニレン基である。
式(a1’)中のL2は、好ましくは単結合である。
式(a1’)中のL1およびL2の好ましい組合せとしては、L1が2価のC6-10芳香族炭化水素基であり、L2が単結合である、組合せである。式(a1’)中のL1およびL2のより好ましい組合せとしては、L1がフェニレン基であり、L2が単結合である、組合せである。
式(a1’)中のR1およびR2は、それぞれ独立して、好ましくはC1-22アルキル基であり、より好ましくはC1-10アルキル基である。
式(a1’)中のL1は、好ましくは2価のC6-10芳香族炭化水素基であり、より好ましくはフェニレン基である。
式(a1’)中のL2は、好ましくは単結合である。
式(a1’)中のL1およびL2の好ましい組合せとしては、L1が2価のC6-10芳香族炭化水素基であり、L2が単結合である、組合せである。式(a1’)中のL1およびL2のより好ましい組合せとしては、L1がフェニレン基であり、L2が単結合である、組合せである。
式(a1’)中のR1およびR2は、それぞれ独立して、好ましくはC1-22アルキル基であり、より好ましくはC1-10アルキル基である。
式(a1’)で表されるLの好ましい態様は、
R1およびR2が、それぞれ独立して、C1-22アルキル基であり;
L1が、2価のC6-10芳香族炭化水素基であり;および
L2が、単結合である
基である。
R1およびR2が、それぞれ独立して、C1-22アルキル基であり;
L1が、2価のC6-10芳香族炭化水素基であり;および
L2が、単結合である
基である。
式(a1’)で表されるLの別の好ましい態様は、
R1およびR2が、それぞれ独立して、C1-10アルキル基であり;
L1が、フェニレン基であり;および
L2が、単結合である
基である。
R1およびR2が、それぞれ独立して、C1-10アルキル基であり;
L1が、フェニレン基であり;および
L2が、単結合である
基である。
式(g-I)におけるYがNRである場合、前記Rは、好ましくは、水素原子、C1-6アルキル基またはC7-16アラルキル基であり、より好ましくは水素原子、メチル、エチルまたはベンジルであり、さらに好ましくは水素原子である。Yは、好ましくは単結合、酸素原子またはNRであり、より好ましくは単結合または酸素原子である。
式(g-I)におけるZは、好ましくは、式(a2)または式(a2”)で表される基であり、より好ましくは式(a2”)で表される基である。式(a2)で表されるZ(即ち、ベンジル基の構造)を有するアンカーに比べて、式(a2”)で表されるZ(即ち、シクロヘキシルメチル基の構造)を有するアンカーを使用することにより、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)等の非極性溶媒に対する溶解性を飛躍的に向上することができる。それによって、本発明の製造方法をより高濃度で実行でき、生産性が大きく向上する。
式(a2)において、R6は水素原子であることが好ましい。また、式(a2)において、RaおよびRbが、水素原子であるか、または一緒になってオキソ基を形成することが好ましい。
式(a2)で表されるZの、固液分離のために好ましい態様は、
RaおよびRbが、水素原子であり;
R6が、水素原子であり;
kが、1~3の整数であり;
k個のQが、-O-であり;および
k個のR7が、それぞれ独立して、直鎖状のC10-40アルキル基である、
基である。
RaおよびRbが、水素原子であり;
R6が、水素原子であり;
kが、1~3の整数であり;
k個のQが、-O-であり;および
k個のR7が、それぞれ独立して、直鎖状のC10-40アルキル基である、
基である。
式(a2)で表されるZの、固液分離のために好ましい別の態様は、
RaおよびRbが、水素原子であり;
R6が、水素原子であり;
kが、1~3の整数であり;
k個のQが、-O-であり;
k個のR7が、それぞれ独立して、1~3個の直鎖状のC10-40アルキル基が-O-を介して結合したベンジル基、または1~3個の直鎖状のC10-40アルキル基が-O-を介して結合したシクロヘキシルメチル基であり;および
環Aが、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい、
基である。
RaおよびRbが、水素原子であり;
R6が、水素原子であり;
kが、1~3の整数であり;
k個のQが、-O-であり;
k個のR7が、それぞれ独立して、1~3個の直鎖状のC10-40アルキル基が-O-を介して結合したベンジル基、または1~3個の直鎖状のC10-40アルキル基が-O-を介して結合したシクロヘキシルメチル基であり;および
環Aが、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい、
基である。
式(a2)で表されるZの、固液分離のために好ましい別の態様は、
Raが、水素原子であり;および
Rbが、式(a3)(式中、*は結合位置であり、jが、0~3の整数であり、j個のQが、-O-であり、j個のR9が、それぞれ独立して、直鎖状のC10-40アルキル基であり、R6およびR8が、共に水素原子である。)で表される基である、
基である。
Raが、水素原子であり;および
Rbが、式(a3)(式中、*は結合位置であり、jが、0~3の整数であり、j個のQが、-O-であり、j個のR9が、それぞれ独立して、直鎖状のC10-40アルキル基であり、R6およびR8が、共に水素原子である。)で表される基である、
基である。
式(a2)で表されるZの、固液分離のために好ましい別の態様は、
Raが、水素原子であり;および
Rbが、式(a3)(式中、*は結合位置であり、jが、0~3の整数であり、j個のQが、-O-であり、j個のR9が、それぞれ独立して、直鎖状のC10-40アルキル基であり、R8は、R6と一緒になって単結合または-O-を示して、環Aおよび環Cと共に縮合環を形成する。)で表される基である、
基である。
Raが、水素原子であり;および
Rbが、式(a3)(式中、*は結合位置であり、jが、0~3の整数であり、j個のQが、-O-であり、j個のR9が、それぞれ独立して、直鎖状のC10-40アルキル基であり、R8は、R6と一緒になって単結合または-O-を示して、環Aおよび環Cと共に縮合環を形成する。)で表される基である、
基である。
式(a2)で表されるZの、固液分離のために好ましい別の態様は、
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成し;
R6が、水素原子であり;
kが、1~3の整数であり;
k個のQが、-O-であり;および
k個のR7が、それぞれ独立して、直鎖状のC10-40アルキル基である、
基である。
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成し;
R6が、水素原子であり;
kが、1~3の整数であり;
k個のQが、-O-であり;および
k個のR7が、それぞれ独立して、直鎖状のC10-40アルキル基である、
基である。
式(a2)で表されるZの、固液分離のために好ましい別の態様は、
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成し;
R6が、水素原子であり;
kが、1~3の整数であり;
k個のQが、-O-であり;
k個のR7が、それぞれ独立して、1~3個の直鎖状のC10-40アルキル基が-O-を介して結合したベンジル基、または1~3個の直鎖状のC10-40アルキル基が-O-を介して結合したシクロヘキシルメチル基であり;および
環Aが、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい、
基である。
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成し;
R6が、水素原子であり;
kが、1~3の整数であり;
k個のQが、-O-であり;
k個のR7が、それぞれ独立して、1~3個の直鎖状のC10-40アルキル基が-O-を介して結合したベンジル基、または1~3個の直鎖状のC10-40アルキル基が-O-を介して結合したシクロヘキシルメチル基であり;および
環Aが、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい、
基である。
式(a2”)において、R6は水素原子であることが好ましい。また、式(a2”)において、RaおよびRbが、水素原子であるか、または一緒になってオキソ基を形成することが好ましい。
式(a2”)で表されるZの、固液分離のために好ましい態様は、
RaおよびRbが、水素原子であり;
R6が、水素原子であり;
kが、1~3の整数であり;
k個のQが、-O-であり;および
k個のR7が、それぞれ独立して、直鎖状のC10-40アルキル基である、
基である。
RaおよびRbが、水素原子であり;
R6が、水素原子であり;
kが、1~3の整数であり;
k個のQが、-O-であり;および
k個のR7が、それぞれ独立して、直鎖状のC10-40アルキル基である、
基である。
式(a2”)で表されるZの、固液分離のために好ましい別の態様は、
RaおよびRbが、水素原子であり;
R6が、水素原子であり;
kが、1~3の整数であり;
k個のQが、-O-であり;
k個のR7が、それぞれ独立して、1~3個の直鎖状のC10-40アルキル基が-O-を介して結合したベンジル基、または1~3個の直鎖状のC10-40アルキル基が-O-を介して結合したシクロヘキシルメチル基であり;および
環Bが、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい、
基である。
RaおよびRbが、水素原子であり;
R6が、水素原子であり;
kが、1~3の整数であり;
k個のQが、-O-であり;
k個のR7が、それぞれ独立して、1~3個の直鎖状のC10-40アルキル基が-O-を介して結合したベンジル基、または1~3個の直鎖状のC10-40アルキル基が-O-を介して結合したシクロヘキシルメチル基であり;および
環Bが、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい、
基である。
式(a2”)で表されるZの、固液分離のために好ましい別の態様は、
Raが、水素原子であり;
Rbが、式(a3)(式中、*は結合位置であり、jが、0~3の整数であり、j個のQが、-O-であり、j個のR9が、それぞれ独立して、C10-40アルキル基であり、R6およびR8が、共に水素原子である。)で表される基である、
基である。
Raが、水素原子であり;
Rbが、式(a3)(式中、*は結合位置であり、jが、0~3の整数であり、j個のQが、-O-であり、j個のR9が、それぞれ独立して、C10-40アルキル基であり、R6およびR8が、共に水素原子である。)で表される基である、
基である。
式(a2”)で表されるZの、固液分離のために好ましい別の態様は、
Raが、水素原子であり;
Rbが、式(a3)(式中、*は結合位置であり、jが、0~3の整数であり、j個のQが、-O-であり、j個のR9が、それぞれ独立して、直鎖状のC10-40アルキル基であり、R8は、R6と一緒になって単結合または-O-を示して、環Bおよび環Cと共に縮合環を形成する。)で表される基である、
基である。
Raが、水素原子であり;
Rbが、式(a3)(式中、*は結合位置であり、jが、0~3の整数であり、j個のQが、-O-であり、j個のR9が、それぞれ独立して、直鎖状のC10-40アルキル基であり、R8は、R6と一緒になって単結合または-O-を示して、環Bおよび環Cと共に縮合環を形成する。)で表される基である、
基である。
式(a2”)で表されるZの、固液分離のために好ましい別の態様は、
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成し;
R6が、水素原子であり;
kが、1~3の整数であり;
k個のQが、-O-であり;および
k個のR7が、それぞれ独立して、直鎖状のC10-40アルキル基である、
基である。
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成し;
R6が、水素原子であり;
kが、1~3の整数であり;
k個のQが、-O-であり;および
k個のR7が、それぞれ独立して、直鎖状のC10-40アルキル基である、
基である。
式(a2”)で表されるZの、固液分離のために好ましい別の態様は、
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成し;
R6が、水素原子であり;
kが、1~3の整数であり;
k個のQが、-O-であり;
k個のR7が、それぞれ独立して、1~3個の直鎖状のC10-40アルキル基が-O-を介して結合したベンジル基、または1~3個の直鎖状のC10-40アルキル基が-O-を介して結合したシクロヘキシルメチル基であり;および
環Bが、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい、
基である。
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成し;
R6が、水素原子であり;
kが、1~3の整数であり;
k個のQが、-O-であり;
k個のR7が、それぞれ独立して、1~3個の直鎖状のC10-40アルキル基が-O-を介して結合したベンジル基、または1~3個の直鎖状のC10-40アルキル基が-O-を介して結合したシクロヘキシルメチル基であり;および
環Bが、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい、
基である。
固液分離のために好適なアンカー(g-I)は、好ましくは、
Lが、スクシニル基であるか、または式(a1’)で表される基(式(a1’)中、R1およびR2が、それぞれ独立して、C1-10アルキル基であり、L1が、2価のフェニレン基であり、L2が、単結合である。)であり、および
Y-Zが、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)ベンジルオキシ基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンジルオキシ基、3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンジルオキシ基、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルアミノ基、2,4-ビス(ドコシルオキシ)ベンジルアミノ基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)ベンジルアミノ基、ビス(4-ドコシルオキシフェニル)メチルアミノ基、4-メトキシ-2-[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンジルアミノ基、4-メトキシ-2-[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]ベンジルアミノ基、2,4-ビス(ドデシルオキシ)ベンジルアミノ基、フェニル(2,3,4-トリス(オクタデシルオキシ)フェニル)メチルアミノ基、ビス[4-(12-ドコシルオキシドデシルオキシ)フェニル]メチルアミノ基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンジルアミノ基、3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンジルアミノ基、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、2,4-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、ビス(4-ドコシルオキシシクロへキシル)メチルアミノ基、4-メトキシ-2-[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、4-メトキシ-2-[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、2,4-ビス(ドデシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、フェニル(2,3,4-トリス(オクタデシルオキシ)シクロへキシル)メチルアミノ基、ビス[4-(12-ドコシルオキシドデシルオキシ)シクロへキシル]メチルアミノ基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、または3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基である
基であるか、または
L-Yが、単結合またはスクシニル-1,4-ピペラジンジイル基であり、および
Zが、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンゾイル基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)ベンゾイル基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンゾイル基、または3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンゾイル基である
基である。
Lが、スクシニル基であるか、または式(a1’)で表される基(式(a1’)中、R1およびR2が、それぞれ独立して、C1-10アルキル基であり、L1が、2価のフェニレン基であり、L2が、単結合である。)であり、および
Y-Zが、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)ベンジルオキシ基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンジルオキシ基、3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンジルオキシ基、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルアミノ基、2,4-ビス(ドコシルオキシ)ベンジルアミノ基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)ベンジルアミノ基、ビス(4-ドコシルオキシフェニル)メチルアミノ基、4-メトキシ-2-[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンジルアミノ基、4-メトキシ-2-[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]ベンジルアミノ基、2,4-ビス(ドデシルオキシ)ベンジルアミノ基、フェニル(2,3,4-トリス(オクタデシルオキシ)フェニル)メチルアミノ基、ビス[4-(12-ドコシルオキシドデシルオキシ)フェニル]メチルアミノ基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンジルアミノ基、3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンジルアミノ基、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、2,4-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、ビス(4-ドコシルオキシシクロへキシル)メチルアミノ基、4-メトキシ-2-[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、4-メトキシ-2-[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、2,4-ビス(ドデシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、フェニル(2,3,4-トリス(オクタデシルオキシ)シクロへキシル)メチルアミノ基、ビス[4-(12-ドコシルオキシドデシルオキシ)シクロへキシル]メチルアミノ基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、または3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基である
基であるか、または
L-Yが、単結合またはスクシニル-1,4-ピペラジンジイル基であり、および
Zが、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンゾイル基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)ベンゾイル基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンゾイル基、または3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンゾイル基である
基である。
固液分離のために好適なアンカー(g-I)は、より好ましくは、
Lが、スクシニル基であり、および
Y-Zが、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)ベンジルオキシ基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンジルオキシ基、3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンジルオキシ基、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルアミノ基、2,4-ビス(ドコシルオキシ)ベンジルアミノ基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)ベンジルアミノ基、ビス(4-ドコシルオキシフェニル)メチルアミノ基、4-メトキシ-2-[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンジルアミノ基、4-メトキシ-2-[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]ベンジルアミノ基、2,4-ビス(ドデシルオキシ)ベンジルアミノ基、フェニル(2,3,4-トリス(オクタデシルオキシ)フェニル)メチルアミノ基、ビス[4-(12-ドコシルオキシドデシルオキシ)フェニル]メチルアミノ基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンジルアミノ基、3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンジルアミノ基、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、2,4-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、ビス(4-ドコシルオキシシクロへキシル)メチルアミノ基、4-メトキシ-2-[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、4-メトキシ-2-[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、2,4-ビス(ドデシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、フェニル(2,3,4-トリス(オクタデシルオキシ)シクロへキシル)メチルアミノ基、ビス[4-(12-ドコシルオキシドデシルオキシ)シクロへキシル]メチルアミノ基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、または3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基である
基であるか、または
L-Yが、単結合またはスクシニル-1,4-ピペラジンジイル基であり、および
Zが、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンゾイル基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)ベンゾイル基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンゾイル基、または3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンゾイル基である。
Lが、スクシニル基であり、および
Y-Zが、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)ベンジルオキシ基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンジルオキシ基、3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンジルオキシ基、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルアミノ基、2,4-ビス(ドコシルオキシ)ベンジルアミノ基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)ベンジルアミノ基、ビス(4-ドコシルオキシフェニル)メチルアミノ基、4-メトキシ-2-[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンジルアミノ基、4-メトキシ-2-[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]ベンジルアミノ基、2,4-ビス(ドデシルオキシ)ベンジルアミノ基、フェニル(2,3,4-トリス(オクタデシルオキシ)フェニル)メチルアミノ基、ビス[4-(12-ドコシルオキシドデシルオキシ)フェニル]メチルアミノ基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンジルアミノ基、3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンジルアミノ基、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、2,4-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、ビス(4-ドコシルオキシシクロへキシル)メチルアミノ基、4-メトキシ-2-[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、4-メトキシ-2-[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、2,4-ビス(ドデシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、フェニル(2,3,4-トリス(オクタデシルオキシ)シクロへキシル)メチルアミノ基、ビス[4-(12-ドコシルオキシドデシルオキシ)シクロへキシル]メチルアミノ基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、または3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基である
基であるか、または
L-Yが、単結合またはスクシニル-1,4-ピペラジンジイル基であり、および
Zが、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンゾイル基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)ベンゾイル基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンゾイル基、または3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンゾイル基である。
固液分離のために好適なアンカー(g-I)は、さらに好ましくは、
Lが、スクシニル基であり、および
Y-Zが、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ基、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、2,4-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、4-メトキシ-2-[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、4-メトキシ-2-[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、2,4-ビス(ドデシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、または3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基である
基であるか、または
L-Yが、単結合またはスクシニル-1,4-ピペラジンジイル基であり、および
Zが、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンゾイル基である
基である。
Lが、スクシニル基であり、および
Y-Zが、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ基、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、2,4-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、4-メトキシ-2-[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、4-メトキシ-2-[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、2,4-ビス(ドデシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、または3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基である
基であるか、または
L-Yが、単結合またはスクシニル-1,4-ピペラジンジイル基であり、および
Zが、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンゾイル基である
基である。
固液分離のために好適なアンカー(g-I)は、特に好ましくは、
Lが、スクシニル基であり、および
Y-Zが、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ基、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基またはフェニル(2,3,4-トリス(オクタデシルオキシ)フェニル)メチルアミノ基である
基であるか、または
L-Yが、スクシニル-1,4-ピペラジンジイル基であり、および
Zが、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンゾイル基である
基である。
Lが、スクシニル基であり、および
Y-Zが、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ基、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基またはフェニル(2,3,4-トリス(オクタデシルオキシ)フェニル)メチルアミノ基である
基であるか、または
L-Yが、スクシニル-1,4-ピペラジンジイル基であり、および
Zが、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンゾイル基である
基である。
固液分離のために好適なアンカー(g-I)は、最も好ましくは、
Lが、スクシニル基であり、および
Y-Zが、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ基、または3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基である
基であるか、または
L-Yが、スクシニル-1,4-ピペラジンジイル基であり、および
Zが、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンゾイル基である
基である。
Lが、スクシニル基であり、および
Y-Zが、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ基、または3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基である
基であるか、または
L-Yが、スクシニル-1,4-ピペラジンジイル基であり、および
Zが、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンゾイル基である
基である。
抽出のために好適なアンカー(g-I)は、好ましくは、2-{2,4-ジ(2’,3’-ジヒドロフィチルオキシ)ベンジルアミノカルボニル}エチルカルボニル基;3,5-ジ(2’,3’-ジヒドロフィチルオキシ)ベンジルオキシスクシニル基;4-(2’,3’-ジヒドロフィチルオキシ)ベンジルオキシスクシニル基;2-{1-[(2-クロロ-5-(2’,3’-ジヒドロフィチルオキシ)フェニル)]ベンジルアミノカルボニル}エチルカルボニル基;3,4,5-トリ(2’,3’-ジヒドロフィチルオキシ)ベンジルオキシスクシニル基;2-{3,4,5-トリ(2’,3’-ジヒドロフィチルオキシ)ベンジルアミノカルボニル}エチルカルボニル基;2-{4-(2’,3’-ジヒドロフィチルオキシ)ベンジルアミノカルボニル}エチルカルボニル基;2-{2-[3’,4’,5’-トリ(2”,3”-ジヒドロフィチルオキシ)ベンジルオキシ]-4-メトキシベンジルアミノカルボニル}エチルカルボニル基;2-{4-(2’,3’-ジヒドロフィチルオキシ)-2-メトキシベンジルアミノカルボニル}エチルカルボニル基;4-(2’,3’-ジヒドロフィチルオキシ)-2-メチルベンジルオキシスクシニル基;2-{4-(2’,3’-ジヒドロフィチルオキシ)-2-メチルベンジルアミノカルボニル}エチルカルボニル基;4-[2,2,4,8,10,10-ヘキサメチル-5-ドデカノイルアミノ]ベンジルオキシスクシニル基;2-{4-[2,2,4,8,10,10-ヘキサメチル-5-ドデカノイルアミノ]ベンジルアミノカルボニル}エチルカルボニル基;4-(3,7,11-トリメチルドデシルオキシ)ベンジルオキシスクシニル基;2-{4-(3,7,11-トリメチルドデシルオキシ)ベンジルアミノカルボニル}エチルカルボニル基;2-{3,5-ジ(2’,3’-ジヒドロフィチルオキシ)ベンジルアミノカルボニル}エチルカルボニル基;2-{1-[2,3,4-トリ(2’,3’-ジヒドロフィチルオキシ)フェニル]ベンジルアミノカルボニル}エチルカルボニル基;2-{1-[4-(2’,3’-ジヒドロフィチルオキシ)フェニル]-4’-(2’,3’-ジヒドロフィチルオキシ)ベンジルアミノカルボニル}エチルカルボニル基;3,4,5-トリス[3,4,5-トリ(2’,3’-ジヒドロフィチルオキシ)ベンジル]ベンジルオキシスクシニル基;または2-{3,4,5-トリス[3,4,5-トリ(2’,3’-ジヒドロフィチルオキシ)ベンジル]ベンジルアミノカルボニル}エチルカルボニル基である。
アンカーを形成するために用いられる式:Z-Y-Hで表されるアルコール化合物またはアミン化合物は、例えば、以下の工程またはそれに準じた工程によって製造することができる。
[式中のQ’は、-O-、-S-、-C(=O)O-または-NH-を示し、Rgは、水素原子、ORh基(ここで、RhはC1-6アルキル基等のアルキル基、ベンジル基等のアラルキル基等を示す。)または式(a3):
(式中の各記号は、前記と同意義である。)
で表される基を示し、Y1はハロゲン原子等の脱離基を示し、他の記号は、前記と同義である。]
で表される基を示し、Y1はハロゲン原子等の脱離基を示し、他の記号は、前記と同義である。]
工程(a)
本工程は、式(IV)で表される化合物(以下、化合物(IV)と略称する。)のQ’H(ここで、Q’は、-O-、-S-、-C(=O)O-または-NH-を示す。)にR7を導入することにより、式(IVa)で表される化合物(以下、化合物(IVa)と略称する。)を製造する工程である。この反応は、Q’が、-O-、-S-または-NH-の場合、反応に影響を及ぼさない溶媒中、塩基の存在下または非存在下で、R7に対応するハロゲン化物(塩化物、臭化物またはヨウ化物)、R7に対応するカルボン酸若しくは酸ハロゲン化物またはR7に対応するアルキルスルホニルオキシ化物(例えば、メタンスルホニルオキシ化物等)若しくはアリールスルホニルオキシ化物(例えば、p-トルエンスルホニルオキシ化物等)を用いて行われる。また、Q’が-O-の場合、化合物(IV)とR7に対応する水酸化物をトリフェニルホスフィンおよびアゾジカルボン酸ジイソプロピル存在下で反応させる光延反応条件下で、この反応を行うこともできる。さらにQ’が-C(=O)O-の場合、例えば、化合物(IV)とR7に対応するアミン若しくは水酸化物を後述する縮合剤の存在下で反応させることにより化合物(IVa)を合成することができる。
本工程は、式(IV)で表される化合物(以下、化合物(IV)と略称する。)のQ’H(ここで、Q’は、-O-、-S-、-C(=O)O-または-NH-を示す。)にR7を導入することにより、式(IVa)で表される化合物(以下、化合物(IVa)と略称する。)を製造する工程である。この反応は、Q’が、-O-、-S-または-NH-の場合、反応に影響を及ぼさない溶媒中、塩基の存在下または非存在下で、R7に対応するハロゲン化物(塩化物、臭化物またはヨウ化物)、R7に対応するカルボン酸若しくは酸ハロゲン化物またはR7に対応するアルキルスルホニルオキシ化物(例えば、メタンスルホニルオキシ化物等)若しくはアリールスルホニルオキシ化物(例えば、p-トルエンスルホニルオキシ化物等)を用いて行われる。また、Q’が-O-の場合、化合物(IV)とR7に対応する水酸化物をトリフェニルホスフィンおよびアゾジカルボン酸ジイソプロピル存在下で反応させる光延反応条件下で、この反応を行うこともできる。さらにQ’が-C(=O)O-の場合、例えば、化合物(IV)とR7に対応するアミン若しくは水酸化物を後述する縮合剤の存在下で反応させることにより化合物(IVa)を合成することができる。
塩基としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、水素化ナトリウム、水素化カリウム、カリウム tert-ブトキシド等のアルカリ金属塩;ピリジン、トリエチルアミン、N,N-ジメチルアニリン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン等のアミン類等が挙げられ、中でも炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、水素化ナトリウム等が好ましい。
溶媒としては、例えば、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類;テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類;ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド類;クロロホルム、ジクロロメタン等のハロゲン化炭化水素類;アセトニトリル等のニトリル類、N-メチルピロリドン等あるいはそれらの混合物が挙げられ、中でも、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、トルエン、N-メチルピロリドン等が好ましい。
反応温度は、50~150℃が好ましく、60~130℃がより好ましい。反応時間は、2~30時間が好ましく、3~10時間がより好ましい。
工程(b)
本工程は、化合物(IVa)を還元することにより、式(I-a)で表される化合物(以下、化合物(I-a)と略称する。)を製造する工程である。この還元反応は、還元剤を用いる方法により行うことができる。
本工程は、化合物(IVa)を還元することにより、式(I-a)で表される化合物(以下、化合物(I-a)と略称する。)を製造する工程である。この還元反応は、還元剤を用いる方法により行うことができる。
この還元反応に用いる還元剤としては、例えば、金属水素化物(水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ジブチルアルミニウム、水素化アルミニウム、水素化アルミニウムリチウム等)等が挙げられ、中でも、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ジブチルアルミニウム等が好ましい。
この反応は、反応に影響を及ぼさない溶媒中で行われる。溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール等のアルコール類;ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類;トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類;あるいはそれらの混合物が挙げられ、中でもテトラヒドロフラン、トルエン等が好ましい。反応温度は、0~100℃が好ましく、30~70℃がより好ましい。反応時間は、1~24時間が好ましく、2~5時間がより好ましい。
工程(c)
本工程は、化合物(IVa)(式(IVa)中、Rgは、水素原子またはORh基ではない。)を、上記工程(b)と同様の方法により還元する工程である。
本工程は、化合物(IVa)(式(IVa)中、Rgは、水素原子またはORh基ではない。)を、上記工程(b)と同様の方法により還元する工程である。
工程(d-1)
本工程は、化合物(IVa)(式(IVa)中、Rgは水素原子である)を、オキシム化することにより、式(I’-a)で表される化合物(以下、化合物(I’-a)と略称する。)を製造する工程である。
本工程は、化合物(IVa)(式(IVa)中、Rgは水素原子である)を、オキシム化することにより、式(I’-a)で表される化合物(以下、化合物(I’-a)と略称する。)を製造する工程である。
このオキシム化反応は、反応に影響を及ぼさない溶媒中、塩基存在下で化合物(IVa)とヒドロキシルアミンの酸付加塩とを反応させることにより行われる。
ヒドロキシルアミンの酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩等の鉱酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩等の有機酸塩等が挙げられるが、塩酸塩が特に好ましい。
かかる塩基としては、例えば、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウムなどのアルカリ金属塩;ピリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N,N-ジメチルアニリン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エンなどの有機アミン類等が挙げられ、中でも、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン等が好ましい。
溶媒としては、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン等のハロゲン溶媒;トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類;テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類;および/または、それらの混合物が挙げられ、中でも、ジクロロメタン、クロロホルム、トルエン等が好ましい。反応温度は、10~100℃が好ましく、20~60℃でがより好ましい。反応時間は、0.5~30時間が好ましく、2~20時間がより好ましい。
工程(d-2)
本工程は、化合物(I’-a)を、パラジウム-炭素、ラネーニッケル等の金属触媒存在下の接触水素添加反応、または前記工程(b)と同様の金属水素化物等の還元剤により還元することにより、式(I-b)で表される化合物(以下、化合物(I-b)と略称する。)を製造する工程である。
本工程は、化合物(I’-a)を、パラジウム-炭素、ラネーニッケル等の金属触媒存在下の接触水素添加反応、または前記工程(b)と同様の金属水素化物等の還元剤により還元することにより、式(I-b)で表される化合物(以下、化合物(I-b)と略称する。)を製造する工程である。
化合物(I-b)は、工程(d-3)、工程(d-4)および工程(d-5)を経て製造することもできる。
工程(d-3)
本工程は、化合物(I-a)を、例えば塩化アセチル、塩化チオニル等のクロル化剤、または、例えば臭化アセチル、三臭化リン、ジフェニルホスフィン/臭素等のブロム化剤を用いてハロゲン化することにより、式(I’-b)で表される化合物(以下、化合物(I’-b)と略称する。)を製造する工程である。
本工程は、化合物(I-a)を、例えば塩化アセチル、塩化チオニル等のクロル化剤、または、例えば臭化アセチル、三臭化リン、ジフェニルホスフィン/臭素等のブロム化剤を用いてハロゲン化することにより、式(I’-b)で表される化合物(以下、化合物(I’-b)と略称する。)を製造する工程である。
溶媒としては、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン等のハロゲン化炭化水素類;トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類;テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類;それらの混合物が挙げられ、中でも、クロロホルム、テトラヒドロフラン、トルエン等が好ましい。反応温度は、10~150℃が好ましく、30~80℃がより好ましい。反応時間は、0.5~30時間が好ましく、2~20時間がより好ましい。
工程(d-4)
本工程は、化合物(I’-b)をアジ化ナトリウム等のアジド化剤を用いてアジド化することにより、式(I’-c)で表される化合物(以下、化合物(I’-c)と略称する。)を製造する工程である。この反応は、反応に影響を及ぼさない溶媒中、化合物(I’-b)をアジド化剤と反応させることにより行われる。
本工程は、化合物(I’-b)をアジ化ナトリウム等のアジド化剤を用いてアジド化することにより、式(I’-c)で表される化合物(以下、化合物(I’-c)と略称する。)を製造する工程である。この反応は、反応に影響を及ぼさない溶媒中、化合物(I’-b)をアジド化剤と反応させることにより行われる。
溶媒としては、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン等のハロゲン化炭化水素類;トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類;テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類;N,N-ジメチルホルムアミド等のアミド類;それらの混合物が挙げられ、中でも、クロロホルム、N,N-ジメチルホルムアミド等が好ましい。反応温度は、10~150℃が好ましく、20~100℃がより好ましい。反応時間は、0.5~30時間が好ましく、2~20時間がより好ましい。
工程(d-5)
本工程は、化合物(I’-c)をアミノ化することにより、化合物(I-b)を製造する工程である。この反応は、反応に影響を及ぼさない溶媒中、水存在下、化合物(I’-c)をトリフェニルホスフィンと反応させるか、接触水素化還元により行われる。
本工程は、化合物(I’-c)をアミノ化することにより、化合物(I-b)を製造する工程である。この反応は、反応に影響を及ぼさない溶媒中、水存在下、化合物(I’-c)をトリフェニルホスフィンと反応させるか、接触水素化還元により行われる。
トリフェニルホスフィンの使用量としては、化合物(I’-c)1モルに対して、好ましくは1~10モル、特に好ましくは1~5モルである。水の使用量は、化合物(I’-c)1モルに対して、好ましくは1~10モル、特に好ましくは1~5モルである。
溶媒としては、例えば、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類;テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類;および、それらの混合物が挙げられ、中でも、トルエン、テトラヒドロフラン等が好ましい。反応温度は、10~150℃が好ましく、20~100℃でがより好ましい。反応時間は、0.5~30時間が好ましく、2~20時間がより好ましい。
工程(d-6)
本工程は、化合物(I’-b)をRNH2(Rは前記と同義である)と反応させることにより、Yが-NHR基である式(I-c)で表される化合物(以下、化合物(I-c)と略称する。)を製造する工程である。本工程は、反応に影響を及ぼさない溶媒中、必要により、例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン等の第3級アミン等の塩基の存在下、化合物(I’-b)をR-NH2で表されるアミンと反応させることにより行われる。
本工程は、化合物(I’-b)をRNH2(Rは前記と同義である)と反応させることにより、Yが-NHR基である式(I-c)で表される化合物(以下、化合物(I-c)と略称する。)を製造する工程である。本工程は、反応に影響を及ぼさない溶媒中、必要により、例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン等の第3級アミン等の塩基の存在下、化合物(I’-b)をR-NH2で表されるアミンと反応させることにより行われる。
溶媒としては、例えば、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類;テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類;および、クロロホルム、ジクロロメタン等のハロゲン溶媒または、それらの混合物が挙げられ、中でも、トルエン、テトラヒドロフラン、クロロホルム等が好ましい。反応温度は、10~100℃が好ましく、20~60℃がより好ましい。反応時間は、0.5~30時間が好ましく、2~20時間がより好ましい。
工程(d-7)
本工程は、化合物(I-d)を-CONH2基または-OCONH2基を有する化合物と反応させた後、塩基で処理することにより、化合物(I-e)を製造する工程である。化合物(I-d)と-CONH2基または-OCONH2基を有する化合物との反応は、反応に影響を及ぼさない溶媒中、酸触媒下で行われる。
本工程は、化合物(I-d)を-CONH2基または-OCONH2基を有する化合物と反応させた後、塩基で処理することにより、化合物(I-e)を製造する工程である。化合物(I-d)と-CONH2基または-OCONH2基を有する化合物との反応は、反応に影響を及ぼさない溶媒中、酸触媒下で行われる。
酸触媒としては、例えば、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トルエンスルホン酸等が挙げられ、中でもメタンスルホン酸、トルエンスルホン酸が好ましい。酸触媒の使用量は、化合物(I-d)1モルに対して、好ましくは0.05~0.5モル、特に好ましくは0.1~0.3モルである。
-CONH2基または-OCONH2基を有する化合物としては、例えば、Fmoc-NH2、HCONH2、CF3CONH2、AcNH2、EtOCONH2、Cbz-NH2等が挙げられ、中でもFmoc-NH2、EtOCONH2等が好ましい。ここで、「Fmoc-」とは、9-フルオレニルメトキシカルボニル基(以下、Fmoc基ともいう。)を意味し、「Cbz-」は、ベンジルオキシカルボニル基(以下、Cbz基ともいう。)を意味する。
なお、工程(a)の原料として使用する試薬[すなわち、R7に対応する水酸化物、ハロゲン化物、アルキルスルホニルオキシ化物(例えば、メタンスルホニルオキシ化物等)またはアリールスルホニルオキシ化物(例えば、p-トルエンスルホニルオキシ化物等)、以下「工程(a)の試薬」と略称する。]は、市販品を用いることができる。また、工程(a)の試薬は、例えば、
(1)R7に対応する水酸化物のハロゲン化、アルキルスルホニルオキシ化またはアリールスルホニルオキシ化により、或いは
(2)R7に対応する不飽和水酸化物の還元反応(例えば、白金-炭素(Pt/C)、パラジウム-炭素(Pd/C)、ロジウム-炭素(Rh/C)、ラネーニッケル等の金属触媒の存在下での接触水素添加反応等)、およびそれに続くハロゲン化、アルキルスルホニルオキシ化またはアリールスルホニルオキシ化により、
製造することができる。
(1)R7に対応する水酸化物のハロゲン化、アルキルスルホニルオキシ化またはアリールスルホニルオキシ化により、或いは
(2)R7に対応する不飽和水酸化物の還元反応(例えば、白金-炭素(Pt/C)、パラジウム-炭素(Pd/C)、ロジウム-炭素(Rh/C)、ラネーニッケル等の金属触媒の存在下での接触水素添加反応等)、およびそれに続くハロゲン化、アルキルスルホニルオキシ化またはアリールスルホニルオキシ化により、
製造することができる。
工程(a)の試薬の製造において、ヒドロキシル基から脱離基への変換に用いる試薬としては、例えば、塩化チオニル、N-クロロスクシンイミド(NCS)等のクロロ化剤、臭化水素酸、臭化アセチル、N-ブロモスクシンイミド(NBS)、三臭化リン、ジフェニルホスフィン/臭素等のブロモ化剤等のハロゲン化剤の他、塩化メタンスルホニル、塩化トリフルオロメタンスルホニル等のアルキルスルホニル化剤、塩化ベンゼンスルホニル、塩化p-トルエンスルホニル等のアリールスルホニル化剤等が挙げられ、中でも、ハロゲン化剤である塩化チオニル、臭化水素酸等が好ましい。
この反応は、反応に影響を及ぼさない溶媒中で行われ、溶媒としては、例えば、水;クロロホルム、ジクロロメタンなどのハロゲン化炭化水素類;ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素類;アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類;テトラヒドロフラン、1,4-ジオキサン、ジエチルエーテルなどのエーテル類が挙げられ、中でも水、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類が好ましい。反応温度は、10~120℃が好ましく、50~100℃がより好ましい。反応時間は、1~72時間が好ましく、3~24時間がより好ましい。
前記Q’が単結合であるZ-Y-Hで表される化合物は、例えば、以下の方法によっても製造することができる。すなわち、ベンゼン環上へのR7の導入は、
(1)R7に対応するハロゲン化物(塩化物、臭化物、またはヨウ化物)、R7に対応するカルボン酸若しくは酸ハロゲン化物を用いるフリーデルクラフツ反応、
(2)上記化合物(IV)に対応する化合物(但し、Q’Hが-CHO基に置き換わった化合物)をWittig反応により増炭させた後に、接触水素添加等する方法、または
(3)金属触媒を使用したクロスカップリング等の慣用の有機合成反応
によって行うことができる。
(1)R7に対応するハロゲン化物(塩化物、臭化物、またはヨウ化物)、R7に対応するカルボン酸若しくは酸ハロゲン化物を用いるフリーデルクラフツ反応、
(2)上記化合物(IV)に対応する化合物(但し、Q’Hが-CHO基に置き換わった化合物)をWittig反応により増炭させた後に、接触水素添加等する方法、または
(3)金属触媒を使用したクロスカップリング等の慣用の有機合成反応
によって行うことができる。
なお、上記各スキーム中、R7で示される有機基の炭素数やハロゲン原子の種類、反応試薬等は便宜上示されたものであって、上記した定義の範囲内で適宜変更することができる。
本工程で使用するヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)としては、例えば、下記式(a-I)で表される化合物(即ち、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド)が挙げられる。
[式中、
mは、0以上の整数を示し;
m+1個のBaseは、それぞれ独立して、保護されていてもよい核酸塩基を示し;
m+1個のXは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、または2位炭素原子および4位炭素原子と結合する2価の有機基を示し;
m+1個のXn1は、それぞれ独立して、酸素原子またはNHを示し;
m個のR10は、それぞれ独立して、酸素原子または硫黄原子を示し;
m個のRp1は、それぞれ独立して、リン酸基の保護基を示し;
L、YおよびZは、前記と同義である。]
mは、0以上の整数を示し;
m+1個のBaseは、それぞれ独立して、保護されていてもよい核酸塩基を示し;
m+1個のXは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、または2位炭素原子および4位炭素原子と結合する2価の有機基を示し;
m+1個のXn1は、それぞれ独立して、酸素原子またはNHを示し;
m個のR10は、それぞれ独立して、酸素原子または硫黄原子を示し;
m個のRp1は、それぞれ独立して、リン酸基の保護基を示し;
L、YおよびZは、前記と同義である。]
以下では、式(a-I)で表される化合物を「化合物(a-I)」と略称することがある。他の式で表される化合物も同様に略称することがある。
核酸塩基のアミノ基は、保護基で保護されていることが好ましい。該保護基としては、アセチル基、フェノキシアセチル基、4-イソプロピルフェノキシアセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、(2-ヘキシル)デカノイル基、ジメチルホルムアミジニル基、および=NC(R11)-N(R12)(R13)基(式中、R11は、メチル基を示し、R12およびR13は、それぞれ独立してC1-5アルキル基を示すか、またはR11およびR12が一緒になって、それらが結合する炭素原子および窒素原子と共に5員または6員の含窒素炭化水素環を形成していてもよい。)が好ましい。なお、前記=NC(R11)-N(R12)(R13)基としては、例えば、1-(ジメチルアミノ)エチリデン基が挙げられる。化合物(a-I)が複数のアミノ基を有する場合、アミノ基の保護基は1種のみでもよく、2種以上でもよい。
mが0である場合、化合物(a-I)はヌクレオシドであり、mが1以上である場合、化合物(a-I)はオリゴヌクレオチドである。mは、49以下が好ましく、29以下がより好ましく、19以下がさらに好ましく、4以下が特に好ましく、2以下が最も好ましい。
Xのハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子が好ましく、フッ素原子がより好ましい。
Xの保護されていてもよい水酸基の保護基としては、特に限定されず、例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス(PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS)、第3版、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ(JOHN WILLY&SONS)出版(1999年)等に記載されている任意の保護基を挙げることができる。具体的には、メチル基、ベンジル基、p-メトキシベンジル基、tert-ブチル基、メトキシメチル基、メトキシエチル基、2-テトラヒドロピラニル基、エトキシエチル基、シアノエチル基、シアノエトキシメチル基、フェニルカルバモイル基、1,1-ジオキソチオモルホリン-4-チオカルバモイル基、アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、tert-ブチルジメチルシリル基、[(トリイソプロピルシリル)オキシ]メチル(Tom)基、1-(4-クロロフェニル)-4-エトキシピペリジン-4-イル(Cpep)基等を挙げることができる。保護されていてもよい水酸基の保護基は、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、またはtert-ブチルジメチルシリル基であることが好ましく、経済性および入手の容易さの観点から、tert-ブチルジメチルシリル基であることが特に好ましい。
Xの「2位炭素原子および4位炭素原子と結合する2価の有機基」としては、ヌクレオシドの2位炭素原子および4位炭素原子と結合する限り特に限定はない。この2価の有機基としては、例えば、置換されていてもよいC2-7アルキレン基、並びに-O-、-NR33-(R33は水素原子またはC1-6アルキル基を示す)、-S-、-CO-、-COO-、-OCONR34-(R34は水素原子またはC1-6アルキル基を示す)および-CONR35-(R35は水素原子またはC1-6アルキル基を示す)から選ばれる2価のリンカーと、置換されていてもよいC1-7アルキレン基とから構成される2価の有機基等が挙げられる。C1-7アルキレン基およびC2-7アルキレン基が有していてもよい置換基としては、例えば、メチリデン基(CH2=)が挙げられる。
「2位炭素原子および4位炭素原子と結合する2価の有機基」としては、置換されていてもよいC2-7アルキレン基、-ORi-(Riは4位炭素原子と結合するC1-6アルキレン基を示す)、-O-NR33-Rj-(Rjは4位炭素原子と結合するC1-6アルキレン基を示し、R33は前記と同義を示す)、-O-Rk-O-Rl-(RkはC1-6アルキレン基を示し、Rlは4位炭素原子と結合架橋するC1-6アルキレン基を示す)が好ましく、-ORi-(Riは前記と同義を示す)、-O-NR33-Rj-(RjおよびR33は前記と同義を示す)、-O-Rk-O-Rl-(RkおよびRlは前記と同義を示す)がより好ましい。Ri、Rj、RkおよびRlで示されるC1-6アルキレン基としては、それぞれ独立して、メチレン基またはエチレン基が好ましい。
「2位炭素原子および4位炭素原子と結合する2価の有機基」としては、-O-CH2-、-O-CH2-CH2-、-O-NR33-CH2-(R33は前記と同義を示す)、-O-CH2-O-CH2-がより好ましく、-O-CH2-、-O-CH2-CH2-、-O-NH-CH2-、-O-N(CH3)-CH2-、-O-CH2-O-CH2-(それぞれ、左側が2位炭素原子に結合し、右側が4位炭素原子に結合する。)がさらに好ましい。
m+1個のXは、それぞれ独立して、好ましくは水素原子、ハロゲン原子、または保護されていてもよい水酸基であり、より好ましくは水素原子または保護されていてもよい水酸基である。
Rp1のリン酸基の保護基としては、塩基性条件下で除去可能であり、リン酸基の保護基として用いられるものであれば、特に限定はされないが、-CH2CH2WG(WGは、電子吸引性基を示す。)で表される基が好ましい。
WGの電子吸引性基としては、例えば、シアノ基、ニトロ基等が挙げられ、好ましくはシアノ基である。
WGの電子吸引性基としては、例えば、シアノ基、ニトロ基等が挙げられ、好ましくはシアノ基である。
m個のRp1は、好ましくは、それぞれ独立して-CH2CH2WGで表される基である。
m+1個のXn1は、好ましくは酸素原子である。
L、YおよびZの説明は、前記の通りである。
m+1個のXn1は、好ましくは酸素原子である。
L、YおよびZの説明は、前記の通りである。
化合物(a-I)は、好ましくは下記式(a-i)で表される化合物である(下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである)。
化合物(a-I)は、自体公知の方法またはこれに準ずる方法で製造することができる。例えば、mが0であり、Xn1が酸素原子であり、Lがスクシニル基である化合物(a-I)は、例えば、次式のように、まず、塩基存在下で5’位水酸基が一時保護基Q”により保護されたヌクレオシド(i)とコハク酸無水物とを反応させて、ヌクレオシド(ii)を合成し、次いで、縮合剤の存在下、得られたヌクレオシド(ii)と化合物Z-Y-Hとを縮合させて、3’位および5’位水酸基が保護されたヌクレオシドを合成した後、一時保護基Q”を酸で除去することによって、製造することができる。
ヌクレオシド(i)からヌクレオシド(ii)への転化反応は、反応に不活性な溶媒中で行うのが有利である。このような溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、ジクロロメタン、1,2-ジクロロエタン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン系溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族系溶媒、またはペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン等の脂肪族系溶媒、またはジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル等のエーテル系溶媒、およびこれらの混合溶媒が好ましい。中でもジクロロメタン、またはクロロホルムが特に好ましい。
ヌクレオシド(ii)の合成に使用される塩基としては、特に限定されないが、有機塩基が好ましく、トリエチルアミンがより好ましい。
ヌクレオシド(iii)を合成するための縮合反応は、反応に不活性な溶媒中で行うのが有利である。このような溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、ジクロロメタン、1,2-ジクロロエタン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン系溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族系溶媒、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン等の脂肪族系溶媒、またはこれらの組合せが好ましい。中でもジクロロメタン、クロロホルムが特に好ましい。
ヌクレオシド(ii)とZ-Y-Hとの縮合反応に使用する縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、N-エチル-N’-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミドおよびその塩酸塩(EDC・HCl)、ヘキサフルオロリン酸(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリピロリジノホスホニウム(PyBop)、O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート(TBTU)、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-5-クロロ-1H-ベンゾトリアゾリウム-3-オキシド ヘキサフルオロホスフェート(HCTU)、O-ベンゾトリアゾール-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート(HBTU)等が挙げられる。中でもHBTU、HCTU、N-エチル-N’-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミドおよびその塩酸塩(EDC・HCl)が好ましい。
縮合剤の使用量は、ヌクレオシド(ii)1モルに対して、例えば1~10モル、好ましくは1~5モルである。また、Z-Y-Hの使用量は、ヌクレオシド(ii)1モルに対して、例えば1~10モル、好ましくは1~5モルである。反応温度は、反応が進行しさえすれば特に限定されないが、-10℃~50℃が好ましく、0℃~30℃がより好ましい。反応時間は、例えば30分~70時間である。
ヌクレオシド(iii)の一時保護基Qの除去(脱保護)は、本発明の工程(4)と同様にして行うことができる。
Lがスクシニル基以外である化合物(a-I)も、上記合成法におけるコハク酸無水物に代えて、対応する酸無水物、対応するジカルボン酸ハライド、対応するジカルボン酸の活性エステル等を用いて、同様の反応を行うことにより合成することができる。また、Xn1がNHである化合物(a-I)は、上記合成法におけるヌクレオシド(i)に代えて3’位水酸基がアミノ基であるヌクレオシドを用いて、同様の反応を行うことにより合成することができる。また、mが1以上である化合物(a-I)は、mが0である化合物(a-I)を出発原料として用いて5’末端伸長プロセスを繰り返すことによって合成することができる。
化合物(a-i)の中で、式(a-II)で表される化合物(即ち、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド)が好ましい。
[式中、
m、m個のBase、m+1個のX、m個のR10、m個のRp1、L、YおよびZは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
R11は、メチル基を示し、R12およびR13は、それぞれ独立してC1-5アルキル基を示すか、またはR11およびR12が一緒になって、それらが結合する炭素原子および窒素原子と共に5員または6員の含窒素炭化水素環を形成していてもよい。]
m、m個のBase、m+1個のX、m個のR10、m個のRp1、L、YおよびZは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
R11は、メチル基を示し、R12およびR13は、それぞれ独立してC1-5アルキル基を示すか、またはR11およびR12が一緒になって、それらが結合する炭素原子および窒素原子と共に5員または6員の含窒素炭化水素環を形成していてもよい。]
式(a-II)において、m個のRp1が、それぞれ独立して-CH2CH2WGで表される基であることが好ましい。
式(a-II)において、mが0であることが好ましい。即ち、化合物(a-II)の中で、式(a-III)で表される化合物(即ち、ヌクレオシド)が好ましい(下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである)。
式(a-II)において、mが0であることが好ましい。即ち、化合物(a-II)の中で、式(a-III)で表される化合物(即ち、ヌクレオシド)が好ましい(下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである)。
式(a-II)および式(a-III)において、R11がメチル基であり、R12およびR13は、それぞれ独立してC1-5アルキル基であることが好ましく、R11、R12およびR13が、メチル基であることがより好ましい。
式(a-II)および式(a-III)における他の記号の説明は、前記の通りである。
式(a-II)および式(a-III)における他の記号の説明は、前記の通りである。
本発明において、最初の残基がアデニンを核酸塩基として有するオリゴヌクレオチドを製造する場合、出発物質であるヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)として化合物(a-II)(特に、化合物(a-III))を使用することで、ブランチ体の生成等を抑制できる。ここで、ブランチ体とは、目的化合物の核酸塩基におけるアミノ基の保護基が脱落し、該アミノ基とモノマーとが結合して生成した副生成物をいう。
また、化合物(a-i)の中で、式(a-IV)で表される化合物(即ち、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド)が好ましい。
[式中、
m、m+1個のBase、m+1個のX、m個のR10、m個のRp1、LおよびYは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
Z’は、式(a2”):
m、m+1個のBase、m+1個のX、m個のR10、m個のRp1、LおよびYは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
Z’は、式(a2”):
[式中、
*は、結合位置を示し;
R6は、水素原子であるか、あるいはRbが、下記式(a3)で表される基である場合には、R8と一緒になって単結合または-O-を示して、環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;
kは、1~4の整数を示し;
k個のQは、それぞれ独立して、-O-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-C(=O)NH-または-NHC(=O)-を示し;
k個のR7は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
環Bは、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく;
Raは、水素原子を示し;および
Rbは、水素原子、または式(a3):
*は、結合位置を示し;
R6は、水素原子であるか、あるいはRbが、下記式(a3)で表される基である場合には、R8と一緒になって単結合または-O-を示して、環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;
kは、1~4の整数を示し;
k個のQは、それぞれ独立して、-O-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-C(=O)NH-または-NHC(=O)-を示し;
k個のR7は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
環Bは、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく;
Raは、水素原子を示し;および
Rbは、水素原子、または式(a3):
(式中、*は、結合位置を示し;
jは、0~4の整数を示し;
j個のQは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
j個のR9は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
R8は、水素原子を示すか、またはR6と一緒になって単結合または-O-を示して、環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;および
環Cは、j個のQR9に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。)で表される基を示すか、或いは
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成する。]で表される基を示す。]
jは、0~4の整数を示し;
j個のQは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
j個のR9は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
R8は、水素原子を示すか、またはR6と一緒になって単結合または-O-を示して、環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;および
環Cは、j個のQR9に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。)で表される基を示すか、或いは
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成する。]で表される基を示す。]
式(a-IV)において、m個のRp1が、それぞれ独立して-CH2CH2WGで表される基であることが好ましい。
式(a-IV)において、mが0であることが好ましい。
式(a-IV)における他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物(a-IV)の中で、下記式(a-V)で表される化合物(即ち、ヌクレオシド)が好ましい(下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである)。
式(a-IV)において、mが0であることが好ましい。
式(a-IV)における他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物(a-IV)の中で、下記式(a-V)で表される化合物(即ち、ヌクレオシド)が好ましい(下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである)。
化合物(a-I)の中でも、アンカー中に式(a2”)で表されるZ’(即ち、シクロヘキシルメチル基の構造)を有する化合物(a-IV)(特に、化合物(a-V))は、アンカー中に式(a2)で表されるZ(即ち、ベンジル基の構造)を有する他の化合物(a-I)に比べて、非極性溶媒に対する溶解性が高い。そのため、化合物(a-IV)(特に、化合物(a-V))を使用することによって、本発明の製造方法をより高濃度で実行でき、生産性が大きく向上する。式(a2”)で表されるZ’の説明は、上述の式(a2”)で表されるZの説明と同じである。
式(a-IV)および(a-V)において、
Lが、スクシニル基であるか、または式(a1’)で表される基(式(a1’)中、R1およびR2が、それぞれ独立して、C1-10アルキル基であり、L1が、2価のフェニレン基であり、L2が、単結合である。)であり、および
Y-Z’が、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、2,4-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、4-メトキシ-2-[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、4-メトキシ-2-[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、2,4-ビス(ドデシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、または3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基である
組合せが、固液分離のために好ましい。
Lが、スクシニル基であるか、または式(a1’)で表される基(式(a1’)中、R1およびR2が、それぞれ独立して、C1-10アルキル基であり、L1が、2価のフェニレン基であり、L2が、単結合である。)であり、および
Y-Z’が、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、2,4-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、4-メトキシ-2-[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、4-メトキシ-2-[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、2,4-ビス(ドデシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、または3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基である
組合せが、固液分離のために好ましい。
式(a-IV)および(a-V)において、
Lが、スクシニル基であり、および
Y-Z’が、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、2,4-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、4-メトキシ-2-[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、4-メトキシ-2-[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、2,4-ビス(ドデシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、または3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基である
組合せが、固液分離のためにより好ましい。
Lが、スクシニル基であり、および
Y-Z’が、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、2,4-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、4-メトキシ-2-[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、4-メトキシ-2-[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、2,4-ビス(ドデシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、または3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基である
組合せが、固液分離のためにより好ましい。
式(a-IV)および(a-V)において、
Lが、スクシニル基であり、および
Y-Z’が、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、または3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基である
組合せが、固液分離のためにさらに好ましい。
Lが、スクシニル基であり、および
Y-Z’が、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5-ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5-ビス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、または3,4,5-トリス[3’,4’,5’-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基である
組合せが、固液分離のためにさらに好ましい。
式(a-IV)および(a-V)において、
Lが、スクシニル基であり、および
Y-Z’が、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基である
組合せが、固液分離のために特に好ましい。
Lが、スクシニル基であり、および
Y-Z’が、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基である
組合せが、固液分離のために特に好ましい。
また、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)としては、例えば、下記式(a-VI)で表される化合物(即ち、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド)が挙げられる。
[式中、
m+1個のBase1の少なくとも一つは、-L-Y-Zで保護されている核酸塩基を示し、残りは保護されていてもよい核酸塩基を示し;
m個のXn1は、それぞれ独立して、酸素原子またはNHを示し;
Xn2は、保護されている水酸基またはアミノ基を示し;
m、m+1個のX、m個のR10、m個のRp1、L、YおよびZは、それぞれ独立して、前記と同義である。]
m+1個のBase1の少なくとも一つは、-L-Y-Zで保護されている核酸塩基を示し、残りは保護されていてもよい核酸塩基を示し;
m個のXn1は、それぞれ独立して、酸素原子またはNHを示し;
Xn2は、保護されている水酸基またはアミノ基を示し;
m、m+1個のX、m個のR10、m個のRp1、L、YおよびZは、それぞれ独立して、前記と同義である。]
式(a-VI)中、m+1個のBase1の少なくとも一つは、-L-Y-Zで保護されている核酸塩基である。核酸塩基および-L-Y-Zの説明は、前記の通りである。
また、保護されていてもよい核酸塩基の説明も、前記の通りである。
また、保護されていてもよい核酸塩基の説明も、前記の通りである。
保護されている水酸基(Xn2)の保護基としては、特に限定されず、例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス(PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS)、第3版、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ(JOHN WILLY&SONS)出版(1999年)等に記載されている任意の保護基を挙げることができる。具体的には、メチル基、ベンジル基、p-メトキシベンジル基、tert-ブチル基、メトキシエチル基、、エトキシエチル基、シアノエチル基、シアノエトキシメチル基、フェニルカルバモイル基、1,1-ジオキソチオモルホリン-4-チオカルバモイル基、アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、tert-ブチルジメチルシリル基、[(トリイソプロピルシリル)オキシ]メチル(Tom)基、1-(4-クロロフェニル)-4-エトキシピペリジン-4-イル(Cpep)基等を挙げることができる。水酸基の保護基は、好ましくは、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基またはtert-ブチルジメチルシリル基であり、経済性および入手の容易さの観点から、より好ましくはtert-ブチルジメチルシリル基である。なお、水酸基の保護および脱保護は周知であり、例えば上述のプロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシスに記載の方法によって行うことができる。
保護されているアミノ基(Xn2)の保護基としては、特に限定されず、例えば、グリーンズ・プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス(Greene’s PROTECTIVE GROUPS in ORGANIC SYNTHESIS)、第4版、ウィリー・インターサイエンス(Wiley-Interscience)出版(2006年)等に記載されている保護基を挙げることができる。各保護基の具体例としては、ピバロイル基、ピバロイロキシメチル基、アセチル基、トリフルオロアセチル基、フェノキシアセチル基、4-イソプロピルフェノキシアセチル基、4-tert-ブチルフェノキシアセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、(2-ヘキシル)デカノイル基、ジメチルホルムアミジニル基、1-(ジメチルアミノ)エチリデン基、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基を挙げることができる。アミノ基の保護基は、好ましくは、アセチル基、フェノキシアセチル基、4-イソプロピルフェノキシアセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、(2-ヘキシル)デカノイル基、ジメチルホルムアミジニル基、または1-(ジメチルアミノ)エチリデン基である。なお、アミノ基の保護および脱保護は周知であり、例えば上述のプロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシスに記載の方法によって行うことができる。
式(a-VI)中のm個のXn1は、好ましくは酸素原子である。
式(a-VI)中のXn2は、好ましくは保護されている水酸基である。
式(a-VI)中のm個のRp1は、好ましくは、それぞれ独立して-CH2CH2WGで表される基である。
式(a-VI)中の他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物(a-VI)は、好ましくは下記式(a-vi)で表される化合物である。
式(a-VI)中のXn2は、好ましくは保護されている水酸基である。
式(a-VI)中のm個のRp1は、好ましくは、それぞれ独立して-CH2CH2WGで表される基である。
式(a-VI)中の他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物(a-VI)は、好ましくは下記式(a-vi)で表される化合物である。
[式中、
Rn4は、水酸基の保護基を示し;
m、m+1個のBase1、m+1個のX、m個のR10、m個のRp1、L、YおよびZは、それぞれ独立して、前記と同義である。]
Rn4は、水酸基の保護基を示し;
m、m+1個のBase1、m+1個のX、m個のR10、m個のRp1、L、YおよびZは、それぞれ独立して、前記と同義である。]
式(a-vi)中のRn4の説明は、Xn2における水酸基の保護基の説明と同じである。
式(a-vi)中の他の記号の説明は、前記の通りである。
式(a-vi)中の他の記号の説明は、前記の通りである。
また、置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)としては、例えば、下記式(a-VII)で表される化合物が挙げられる。
[式中、
m+1個のXn1は、それぞれ独立して、酸素原子またはNHを示し;
Ln1は有機基を示し;
m、m+1個のBase、m+1個のX、m+1個のR10、m+1個のRp1、L、YおよびZは、それぞれ独立して、前記と同義である。]
m+1個のXn1は、それぞれ独立して、酸素原子またはNHを示し;
Ln1は有機基を示し;
m、m+1個のBase、m+1個のX、m+1個のR10、m+1個のRp1、L、YおよびZは、それぞれ独立して、前記と同義である。]
式(a-VII)中のLn1は、好ましくはC2-6アルキレン基、より好ましくはエチレン基である。
式(a-VII)中のm+1個のXn1は、好ましくは酸素原子である。
式(a-VII)中のm+1個のRp1は、好ましくは、それぞれ独立して-CH2CH2WGで表される基である。
式(a-VII)中の他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物(a-VII)は、好ましくは下記式(a-vii)で表される化合物である(下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである)。
式(a-VII)中のm+1個のXn1は、好ましくは酸素原子である。
式(a-VII)中のm+1個のRp1は、好ましくは、それぞれ独立して-CH2CH2WGで表される基である。
式(a-VII)中の他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物(a-VII)は、好ましくは下記式(a-vii)で表される化合物である(下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである)。
化合物(a-VII)は、自体公知の方法またはこれに準ずる方法で製造することができる。mが0であり、Xn1が酸素原子であり、Lがスクシニル基である化合物(a-VII)は、例えば、以下のような工程によって製造することができる。
(i)化合物Z-Y-Hとコハク酸無水物とを縮合させて、Z-Y-CO(CH2)2COOHを製造する、
(ii)得られたZ-Y-CO(CH2)2COOHを、縮合剤の存在下、式:HO-Ln1-OQ”で表される化合物(前記式中、Q”は一時保護基を示し、Ln1は有機基を示す。)と縮合させた後、脱保護して、Z-Y-CO(CH2)2CO-O-Ln1-OHを製造する、
(iii)得られたZ-Y-CO(CH2)2CO-O-Ln1-OHにホスホロアミダイト化されたヌクレオシドを反応させて、mが0であり、Xn1が酸素原子であり、Lがスクシニル基である化合物(a-VII)を製造する。
上述のような縮合反応および脱保護反応は当業者にとって周知であり、当業者は、適宜条件を設定して行うことができる。
(i)化合物Z-Y-Hとコハク酸無水物とを縮合させて、Z-Y-CO(CH2)2COOHを製造する、
(ii)得られたZ-Y-CO(CH2)2COOHを、縮合剤の存在下、式:HO-Ln1-OQ”で表される化合物(前記式中、Q”は一時保護基を示し、Ln1は有機基を示す。)と縮合させた後、脱保護して、Z-Y-CO(CH2)2CO-O-Ln1-OHを製造する、
(iii)得られたZ-Y-CO(CH2)2CO-O-Ln1-OHにホスホロアミダイト化されたヌクレオシドを反応させて、mが0であり、Xn1が酸素原子であり、Lがスクシニル基である化合物(a-VII)を製造する。
上述のような縮合反応および脱保護反応は当業者にとって周知であり、当業者は、適宜条件を設定して行うことができる。
Lがスクシニル基以外である化合物(a-VII)も、コハク酸無水物に代えて、対応する酸無水物、対応するジカルボン酸ハライド、対応するジカルボン酸の活性エステル等を用いて、同様の反応を行うことにより製造することができる。また、Xn1がNHである化合物(a-VII)は、3’位アミノ基がホスホロアミダイト化されたヌクレオシドを用いて、同様の反応を行うことにより製造することができる。また、mが1以上である化合物(a-VII)は、mが0である化合物(a-VII)を出発原料として用いて伸長プロセスを繰り返すことによって製造することができる。
本工程で使用するヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)は、好ましくは化合物(a-I)、化合物(a-VI)または化合物(a-VII)であり、より好ましくは化合物(a-i)、化合物(a-vi)または化合物(a-vii)であり、より一層好ましくは化合物(a-i)または化合物(a-vi)であり、さらに好ましくは化合物(a-i)であり、さらに一層好ましくは化合物(a-II)または化合物(a-IV)であり、特に好ましくは化合物(a-III)または化合物(a-V)である。
本工程で使用するヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)は、5’位水酸基が一時保護基で保護されている。水酸基の一時保護基としては、酸性条件下で脱保護が可能であり、且つ水酸基の保護基として用いられるものであれば、特に限定はされないが、例えば、トリチル基、9-(9-フェニル)キサンテニル基、9-フェニルチオキサンテニル基、1,1-ビス(4-メトキシフェニル)-1-フェニルメチル基(ジメトキシトリチル基)等のビス(C1-6アルコキシ)トリチル基、1-(4-メトキシフェニル)-1,1-ジフェニルメチル基(モノメトキシトリチル基)等のモノ(C1-18アルコキシ)トリチル基等を挙げることができる。これらの中でも、脱保護のしやすさ、入手の容易さの観点から、水酸基の一時保護基は、モノメトキシトリチル基またはジメトキシトリチル基であることが好ましく、ジメトキシトリチル基であることがより好ましい。
ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)は、ホスホロアミダイト化試薬を反応させる公知の方法(例えば、M. H. Caruthers et al., Method in Enzymology 1987, 154, 287-313; S. L. Beaucage and M. H. Caruthers, Tetrahedron Letters 1981, 22, 1859-1862)に従い合成することができる。ホスホロアミダイト化試薬は市販されており、容易に入手することができる。例えば、ジクロロメタン等のハロゲン系溶媒中で、3’位アミノ基を有するヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)と、2-シアノエチル N,N-ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトとを反応させることによって、3’位アミノ基がホスホロアミダイト化されたヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)を合成することができる。
ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)の製造方法の一例として、以下、3’位水酸基を有するホスホロアミダイトされた化ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)(以下「化合物(b)」と略称することがある)から、3’位水酸基がホスホロアミダイト化されたヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)(以下「ホスホロアミダイト化された化合物(b)」と略称することがある)を製造する方法を説明する。
この製造方法は、三価のリン上に二つの窒素置換基を有するホスフィチル化剤前駆体をモノ選択的に活性化してホスフィチル化剤とし、該ホスフィチル化剤を用いて、塩基存在下、化合物(b)の3’位水酸基をホスフィチル化する反応を含む。即ち、この製造方法は、以下の工程(P1)および工程(P2)を含むホスホロアミダイト化された化合物(b)の製造方法である。
(P1)溶媒中で、下記式(p1):
(P1)溶媒中で、下記式(p1):
[式中、
Xp1は、酸素原子または硫黄原子を示し;
Rp2は、芳香環、水酸基の保護基またはチオール基の保護基を示し;
Rp3およびRp4は、それぞれ独立してアルキル基を示し、該アルキル基は、隣接する窒素原子と一緒になって環を形成してもよい。]
で表されるホスフィチル化剤前駆体に活性化剤を作用させて、下記式(p2):
Xp1は、酸素原子または硫黄原子を示し;
Rp2は、芳香環、水酸基の保護基またはチオール基の保護基を示し;
Rp3およびRp4は、それぞれ独立してアルキル基を示し、該アルキル基は、隣接する窒素原子と一緒になって環を形成してもよい。]
で表されるホスフィチル化剤前駆体に活性化剤を作用させて、下記式(p2):
[式中、
Zaは活性化剤に由来する基を示し;
他の記号は、前記と同義である。]
で表されるホスフィチル化剤を調製する工程、および
(P2)溶媒中で、化合物(b)に、塩基の存在下、工程(P1)で得られたホスフィチル化剤を作用させて、化合物(b)の3’位水酸基をホスフィチル化する工程
Zaは活性化剤に由来する基を示し;
他の記号は、前記と同義である。]
で表されるホスフィチル化剤を調製する工程、および
(P2)溶媒中で、化合物(b)に、塩基の存在下、工程(P1)で得られたホスフィチル化剤を作用させて、化合物(b)の3’位水酸基をホスフィチル化する工程
工程(P1)
式(p1)中、Rp2の芳香環としては、フェニル、4-ニトロフェニル、2,4-ジニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル、ペンタクロロフェニル、2-ブロモフェニル、4-ブロモフェニル、2-メチルフェニル、2,6-ジメチルフェニル等が挙げられ、好ましくは4-ニトロフェニルである。
式(p1)中、Rp2の芳香環としては、フェニル、4-ニトロフェニル、2,4-ジニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル、ペンタクロロフェニル、2-ブロモフェニル、4-ブロモフェニル、2-メチルフェニル、2,6-ジメチルフェニル等が挙げられ、好ましくは4-ニトロフェニルである。
式(p1)中、Rp2における水酸基の保護基またはチオール基の保護基としては、例えば、C1-6アルキル基(例、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、s-ブチル、t-ブチル、ペンチル、イソペンチル);シアノ化C1-6アルキル基(例、2-シアノエチル、2-シアノ-1,1-ジメチルエチル);置換シリル基で置換されたエチル基(例、2-メチルジフェニルシリルエチル、2-トリメチルシリルエチル、2-トリフェニルシリルエチル);ハロゲン化C1-6アルキル基(例、2,2,2-トリクロロエチル、2,2,2-トリブロモエチル、2,2,2-トリフルオロエチル);C2-6アルケニル基(例、エテニル、1-プロペニル、2-プロペニル、1-メチル-2-プロペニル、1-メチル-1-プロペニル);C3-6シクロアルキル基(例、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル);シアノ化C1-6アルケニル基(例、2-シアノブテニル);C7-11アラルキル基(例、ベンジル、α-ナフチルメチル、β-ナフチルメチル);C6-10アリール基(例、フェニル、インデニル、ナフチル)が挙げられ、より好ましくはシアノ化C1-6アルキル基であり、特に好ましくは2-シアノエチルである。
式(p1)中、Rp3およびRp4は、それぞれ独立してアルキル基を示すが、該アルキル基は隣接する窒素原子と一緒になって環(例、ピロリジン)を形成してもよい。Rp3およびRp4は、好ましくは、いずれもイソプロピル基である。
ホスフィチル化剤前駆体としては、下記化合物が特に好ましい。
ホスフィチル化剤前駆体としては、下記化合物が特に好ましい。
活性化剤をホスフィチル化剤前駆体に作用させることで、ホスフィチル化剤が得られる。
活性化剤は、ホスホロアミダイト上のアミンを置換して、水酸基等との反応性置換基を付与し得る酸である。具体的には、pKa 5以上の弱酸性活性化剤、より好ましくはpKa 5以上のアゾール系化合物およびそのC上置換体から選ばれる少なくとも1種である。アゾール系化合物としては、テトラゾール、トリアゾール、イミダゾール等が挙げられ、C上置換体としては、ジシアノイミダゾール、ビス(トリフルオロメチル)イミダゾール、ジクロロイミダゾール等のハロゲン原子でジ置換された化合物が用いられる。特に好ましくはジシアノイミダゾールおよびジクロロイミダゾールである。
活性化剤は、ホスホロアミダイト上のアミンを置換して、水酸基等との反応性置換基を付与し得る酸である。具体的には、pKa 5以上の弱酸性活性化剤、より好ましくはpKa 5以上のアゾール系化合物およびそのC上置換体から選ばれる少なくとも1種である。アゾール系化合物としては、テトラゾール、トリアゾール、イミダゾール等が挙げられ、C上置換体としては、ジシアノイミダゾール、ビス(トリフルオロメチル)イミダゾール、ジクロロイミダゾール等のハロゲン原子でジ置換された化合物が用いられる。特に好ましくはジシアノイミダゾールおよびジクロロイミダゾールである。
式(p2)において、Zaは活性化剤に由来する基であり、例えば活性化剤から水素原子を1つ除いた基であり、活性化剤としてジシアノイミダゾールを用いた場合、Zaはジシアノイミダゾリルであり、活性化剤としてジクロロイミダゾールを用いた場合、Zaはジクロロイミダゾリルである。
本工程で使用する溶媒は、ホスフィチル化剤前駆体を溶解し、活性化剤が難溶性となるものであれば特に限定されないが、酸性または塩基性の官能基を通常有さない。ここで「難溶性」とは、溶媒中の活性化剤の濃度が6μM以下であることを目安とする。具体的には、トルエン、ベンゼン、o-キシレン、m-キシレン、p-キシレン、エチルベンゼン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、tert-ブチルメチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、四塩化炭素等が挙げられ、好ましくはトルエン、シクロヘキサン、特に好ましくはトルエンである。
本工程の反応温度および反応時間は、基質・生成物が析出しない限り特に限定されないが、それぞれ、通常、40℃以下、好ましくは0~30℃、より好ましくは5~15℃、特に好ましくは10℃程度であり、通常0.5~24時間、好ましくは1~12時間、より好ましくは1~6時間である。
活性化剤とホスフィチル化剤前駆体との使用量は、ホスフィチル化剤前駆体が活性化される限り特に限定されないが、ホスフィチル化剤前駆体に対して、通常過剰量で、好ましくは1.5~10モル当量で用いられる。過剰量の活性化剤をホスフィチル化剤前駆体に溶媒中で作用させることで、ホスフィチル化剤前駆体を活性化すると同時に、ホスフィチル化時に副生するジイソプロピルアミンを活性化剤との塩として沈殿させる。従って、必要に応じて、工程(P1)と下記工程(P2)との間に、沈殿等の不溶物を分離する工程を実施することができ、また、実施することが好ましい。
工程(P2)
本工程では、溶媒中で、化合物(b)に、塩基の存在下、工程(P1)で得られたホスフィチル化剤を作用させて、化合物(b)の3’位水酸基をホスフィチル化し、ホスホロアミダイト化された化合物(b)を製造する。
本工程では、溶媒中で、化合物(b)に、塩基の存在下、工程(P1)で得られたホスフィチル化剤を作用させて、化合物(b)の3’位水酸基をホスフィチル化し、ホスホロアミダイト化された化合物(b)を製造する。
本工程で使用する溶媒としては、工程(P1)で使用した溶媒と同様のもの(例えば、トルエン)を用いることができる。また、本工程で使用する溶媒として、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム等が挙げられる。トルエンとジクロロメタンの混合溶媒が好ましい。
本工程で使用する塩基は、反応により生じた酸(活性化剤)の中和に十分な塩基性を有し、且つリン酸上の脱シアノエチルを引き起こさずP-N結合を形成しない塩基が選択される。そのような塩基としては、具体的には、pKa 5~8の塩基、好ましくは、コリジン、N-メチルモルホリン、ジエチルアニリン等が用いられる。pKa 8より高い塩基を用いると脱シアノ化が顕著となり、pKa 5未満の塩基を用いると反応の進行に伴い再生した活性化剤の捕捉が不十分となり副生物が生じる。
工程(P2)では、ホスフィチル化剤前駆体は添加してもしなくてもよいが、添加することが好ましい。
ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)としては、例えば、下記式(b-I)で表される化合物(即ち、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド)が挙げられる。
[式中、
qは、0以上の整数を示し;
q+1個のBase2は、それぞれ独立して、-L-X-Zおよび核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよい核酸塩基を示し;
q+1個のX、q+1個のRp1、q個のR10、L、XおよびZは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
q+1個のXn1は、それぞれ独立して、酸素原子またはNHを示し;
Q”は、酸性条件下で除去可能な水酸基の一時保護基を示し;
R36およびR37は、それぞれ独立して、アルキル基を示すか、または隣接する窒素原子と一緒になって形成する5または6員の飽和環状アミノ基を示し、かかる飽和環状アミノ基は、窒素原子の他に環構成原子として酸素原子または硫黄原子を1個有していてもよい。]
qは、0以上の整数を示し;
q+1個のBase2は、それぞれ独立して、-L-X-Zおよび核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよい核酸塩基を示し;
q+1個のX、q+1個のRp1、q個のR10、L、XおよびZは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
q+1個のXn1は、それぞれ独立して、酸素原子またはNHを示し;
Q”は、酸性条件下で除去可能な水酸基の一時保護基を示し;
R36およびR37は、それぞれ独立して、アルキル基を示すか、または隣接する窒素原子と一緒になって形成する5または6員の飽和環状アミノ基を示し、かかる飽和環状アミノ基は、窒素原子の他に環構成原子として酸素原子または硫黄原子を1個有していてもよい。]
R36およびR37は、それぞれ独立して、好ましくはC1-10アルキル基であるか、または隣接する窒素原子と一緒になって形成する5または6員の飽和環状アミノ基であり、より好ましくはC1-10アルキル基であり、さらに好ましくはC1-6アルキル基である。
酸性条件下で除去可能な水酸基の一時保護基の説明は、前記の通りである。Q”は、好ましくはモノメトキシトリチル基またはジメトキシトリチル基であり、より好ましくはジメトキシトリチル基である。
式(b-I)中の核酸塩基のアミノ基は、保護基で保護されていることが好ましい。該保護基としては、-L-X-Zおよび核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基が挙げられる。L、XおよびZの説明は、前記の通りである。核酸合成に用いられる保護基としては、アセチル基、フェノキシアセチル基、4-イソプロピルフェノキシアセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、(2-ヘキシル)デカノイル基、ジメチルホルムアミジニル基、および=NC(R11)-N(R12)(R13)基(式中、R11は、メチル基を示し、R12およびR13は、それぞれ独立してC1-5アルキル基を示すか、またはR11およびR12が一緒になって、それらが結合する炭素原子および窒素原子と共に5員または6員の含窒素炭化水素環を形成していてもよい。)が好ましい。なお、前記=NC(R11)-N(R12)(R13)基としては、例えば1-(ジメチルアミノ)エチリデン基が挙げられる。化合物(b-I)が複数のアミノ基を有する場合、アミノ基の保護基は1種のみでもよく、2種以上でもよい。
qが0である場合、化合物(b-I)はヌクレオシドであり、qが1以上である場合、化合物(b-I)はオリゴヌクレオチドである。本工程で使用する化合物(b-I)において、qは、49以下が好ましく、29以下がより好ましく、19以下がさらに好ましく、4以下が特に好ましく、2以下が最も好ましい。
q+1個のXは、それぞれ独立して、好ましくは水素原子、ハロゲン原子、または保護されていてもよい水酸基であり、より好ましくは水素原子または保護されていてもよい水酸基である。
Base2は、それぞれ独立して、好ましくは核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよい核酸塩基である。
q+1個のRp1は、それぞれ独立して、好ましくはCH2CH2WGで表される基である。
q+1個のXn1は、好ましくは酸素原子である。
L、XおよびZの説明は、前記の通りである。
化合物(b-I)は、好ましくは下記式(b-i)で表される化合物である。
Base2は、それぞれ独立して、好ましくは核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよい核酸塩基である。
q+1個のRp1は、それぞれ独立して、好ましくはCH2CH2WGで表される基である。
q+1個のXn1は、好ましくは酸素原子である。
L、XおよびZの説明は、前記の通りである。
化合物(b-I)は、好ましくは下記式(b-i)で表される化合物である。
[式中、
q+1個のBase3は、それぞれ独立して、核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい核酸塩基を示し、
q、q+1個のX、q+1個のRp1、q個のR10、Q”、R36およびR37は、それぞれ独立して、前記と同義である。]
q+1個のBase3は、それぞれ独立して、核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい核酸塩基を示し、
q、q+1個のX、q+1個のRp1、q個のR10、Q”、R36およびR37は、それぞれ独立して、前記と同義である。]
式(b-i)中、核酸合成に用いられる保護基、q、q+1個のX、q+1個のRp1、q個のR10、Q”、R36およびR37の説明は、前記の通りである。
本工程で使用するヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)とヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)との組合せは、
好ましくは化合物(a-I)、化合物(a-VI)または化合物(a-VII)と化合物(b-I)との組合せであり、
より好ましくは化合物(a-i)、化合物(a-vi)または化合物(a-vii)と化合物(b-i)との組合せであり、
より一層好ましくは化合物(a-i)または化合物(a-vi)と化合物(b-i)との組合せであり、
さらに好ましくは化合物(a-i)と化合物(b-i)との組合せであり、
さらに一層好ましくは化合物(a-II)または化合物(a-IV)と化合物(b-i)との組合せであり、
特に好ましくは化合物(a-III)または化合物(a-V)と化合物(b-i)との組合せである。
好ましくは化合物(a-I)、化合物(a-VI)または化合物(a-VII)と化合物(b-I)との組合せであり、
より好ましくは化合物(a-i)、化合物(a-vi)または化合物(a-vii)と化合物(b-i)との組合せであり、
より一層好ましくは化合物(a-i)または化合物(a-vi)と化合物(b-i)との組合せであり、
さらに好ましくは化合物(a-i)と化合物(b-i)との組合せであり、
さらに一層好ましくは化合物(a-II)または化合物(a-IV)と化合物(b-i)との組合せであり、
特に好ましくは化合物(a-III)または化合物(a-V)と化合物(b-i)との組合せである。
本工程の縮合反応の進行が遅い場合には、縮合剤(例えば、ピリジン・トリフルオロ酢酸塩、テトラゾール、5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール、4,5-ジシアノイミダゾール等)を添加してもよい。
本工程は、非極性溶媒中で行われる。非極性溶媒としては、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、1,2-ジクロロエタン等のハロゲン系溶媒;ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン等の芳香族系溶媒;酢酸エチル、酢酸イソプロピル等のエステル系溶媒;ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、オクタン、ノナン、シクロヘキサン等の脂肪族系溶媒;ジエチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、tert-ブチルメチルエーテル等の非極性エーテル系溶媒が挙げられる。非極性溶媒は、1種のみを使用してもよく、2種以上を併用してもよい。非極性溶媒としては、ハロゲン系溶媒、芳香族系溶媒、エステル系溶媒、脂肪族系溶媒、およびこれらの組合せが好ましく;ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、ノナン、シクロヘキサン、酢酸エチル、酢酸イソプロピルおよびこれらの組合せがより好ましく;クロロホルム、ジクロロメタン、トルエン、およびこれらの組合せがさらに好ましい。本工程以降の工程で用いられる非極性溶媒も同様である。
本工程におけるヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)の使用量は、本工程におけるヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)使用量1モルに対して、例えば1~10モル、好ましくは1~5モルである。
本工程における反応温度は、反応が進行しさえすれば特に限定されないが、0℃~100℃が好ましく、20℃~50℃がより好ましい。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、例えば5分~24時間である。
工程(2)(ホスホロアミダイト化されたヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)のクエンチ)
本発明では、工程(1)(縮合)の後に工程(3)(酸化または硫化)および工程(4)(脱保護)を行う。そのため、工程(3)および(4)の際の副生成物の生成を抑制するために、工程(3)の前にヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)をクエンチすることが好ましい。そのため、本発明の製造方法は、縮合後の反応液にクエンチ剤を添加する工程(2)を含むことが好ましい。
本発明では、工程(1)(縮合)の後に工程(3)(酸化または硫化)および工程(4)(脱保護)を行う。そのため、工程(3)および(4)の際の副生成物の生成を抑制するために、工程(3)の前にヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)をクエンチすることが好ましい。そのため、本発明の製造方法は、縮合後の反応液にクエンチ剤を添加する工程(2)を含むことが好ましい。
オリゴヌクレオチド製法の分野において、ホスホロアミダイト化されたヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドのクエンチ剤として公知のものを、本工程におけるクエンチ剤として使用することができる。クエンチ剤は、1種のみを使用してもよく、2種以上を併用してもよい。クエンチ剤としては、例えば、アルコール類、フェノール類およびアミン類が挙げられる。
クエンチ剤として使用し得るアルコール類としては、例えば、メタノール、2-プロパノール、t-ブタノール、2,2,2,-トリフルオロエタノール、テトラヒドロフルフリルアルコール、フルフリルアルコール、2,3-O-イソプロピリデン-D-リボフラノース、3’-O-トリイソプロピルシリル-チミジン等のハロゲン化されていてもよい1価アルコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール等のハロゲン化されていてもよい多価アルコールが挙げられる。
クエンチ剤として使用し得るフェノール類としては、例えば、4-ニトロフェノールやペンタフルオロフェノールが挙げられる。クエンチ剤として使用し得るアミン類としては、例えば、モルホリンが挙げられる。
クエンチ剤は、好ましくは、アルコール類およびアミン類から選ばれる少なくとも一つであり、より好ましくはメタノール、2-プロパノール、t-ブタノール、2,2,2-トリフルオロエタノール、テトラヒドロフルフリルアルコール、およびモルホリンから選ばれる少なくとも一つである。工程(4)(脱保護)の脱保護時に、オリゴヌクレオチド(e)の核酸塩基におけるアミノ基の保護基の脱落を防止するために、クエンチ剤は、さらに好ましくは、2-プロパノール、t-ブタノールおよび2,2-トリフルオロエタノールから選ばれる少なくとも一つである。
本工程におけるクエンチ剤の使用量は、工程(1)におけるヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)の使用量1モルに対して、好ましくは1~20モル、より好ましくは1~10モル、さらに好ましくは1~5モルである。
クエンチ剤の添加後の反応液の温度は、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)がクエンチできさえすれば特に限定されないが、5℃~40℃が好ましく、15℃~30℃がより好ましい。クエンチ剤の添加後の反応液の撹拌時間は、使用するクエンチ剤の種類、温度等によって異なるが、例えば10分~3時間である。
工程(3)(酸化または硫化)
本工程は、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイトトリエステル体(c)に酸化剤または硫化剤を反応させることにより、そのホスファイトトリエステル結合をホスフェートトリエステル結合またはチオホスフェートトリエステル結合へと変換させて、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたオリゴヌクレオチド(d)を得る工程である。酸化剤を使用する場合、その1種のみを使用してもよく、2種以上を併用してもよい。また、硫化剤を使用する場合も、その1種のみを使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
本工程は、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイトトリエステル体(c)に酸化剤または硫化剤を反応させることにより、そのホスファイトトリエステル結合をホスフェートトリエステル結合またはチオホスフェートトリエステル結合へと変換させて、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたオリゴヌクレオチド(d)を得る工程である。酸化剤を使用する場合、その1種のみを使用してもよく、2種以上を併用してもよい。また、硫化剤を使用する場合も、その1種のみを使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
本工程で使用する酸化剤としては、他の部位を酸化することなく、ホスファイトトリエステル結合を、ホスフェートトリエステル結合に酸化する能力がありさえすれば、特に限定されないが、ヨウ素、(1S)-(+)-(10-カンファニルスルホニル)オキサジリジン、tert-ブチルヒドロペルオキシド(TBHP)、2-ブタノンペルオキシド、1,1-ジヒドロペルオキシシクロドデカン、ビス(トリメチルシリル)ペルオキシドおよびm-クロロ過安息香酸から選ばれる少なくとも一つを使用することが好ましい。
良好な酸化反応が達成できるという観点から、酸化剤は、好ましくは、ヨウ素、(1S)-(+)-(10-カンファニルスルホニル)オキサジリジン、tert-ブチルヒドロペルオキシド、2-ブタノンペルオキシドおよび1,1-ジヒドロペルオキシシクロドデカンから選ばれる少なくとも一つであり、より好ましくは、ヨウ素、(1S)-(+)-(10-カンファニルスルホニル)オキサジリジン、tert-ブチルヒドロペルオキシド、および2-ブタノンペルオキシドから選ばれる少なくとも一つであり、さらに好ましくは、ヨウ素およびtert-ブチルヒドロペルオキシドから選ばれる少なくとも一つであり、特に好ましくはヨウ素である。かかる酸化剤は、0.05~2Mの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することができる。かかる希釈溶媒としては、反応に不活性な溶媒であれば特に限定されないが、ピリジン、THF、ジクロロメタン、水、またはこれらの組合せを挙げることができる。中でも、例えば、ヨウ素/水/ピリジン-THFあるいはヨウ素/ピリジン-酢酸、過酸化剤(TBHP)/ジクロロメタンまたはtert-ブチルヒドロペルオキシド/ノナンを用いるのが好ましい。
本工程に使用する硫化剤としては、ホスファイトトリエステル結合を、チオホスフェートトリエステル結合に変換しうる能力がありさえすれば、特に限定されないが、5-[(N,N-ジメチルアミノメチリデン)アミノ]-3H-1,2,4-ジチアゾール-3-チオン(DDTT)、3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン-1,1-ジオキシド(Beaucage試薬)、3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン、フェニルアセチルジスルフィド(PADS)、テトラエチルチウラムジスルフィド(TETD)、3-アミノ-1,2,4-ジチアゾール-5-チオン(ADTT)、硫黄が好ましい。
良好な反応が進行しうるという観点で、5-[(N,N-ジメチルアミノメチリデン)アミノ]-3H-1,2,4-ジチアゾール-3-チオン、3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン-1,1-ジオキシド、3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン、フェニルアセチルジスルフィドがより好ましく、5-[(N,N-ジメチルアミノメチリデン)アミノ]-3H-1,2,4-ジチアゾール-3-チオン、3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン-1,1-ジオキシドがさらに好ましく、5-[(N,N-ジメチルアミノメチリデン)アミノ]-3H-1,2,4-ジチアゾール-3-チオンが特に好ましい。かかる硫化剤は、0.05~2Mの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することができる。かかる希釈溶媒としては、反応に不活性な溶媒であれば特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、ピリジンまたはこれら任意の混合溶媒が挙げられる。
酸化剤または硫化剤の使用量は、ホスファイトトリエステル体(c)1モルに対し、例えば1~50モル、好ましくは1~5モルである。
反応温度は、反応が進行しさえすれば特に限定されないが、0℃~100℃が好ましく、20℃~50℃がより好ましい。反応時間は、ホスファイトトリエステル体(c)の種類、使用する酸化剤または硫化剤の種類、反応温度等によって異なるが、例えば1分~3時間である。
工程(3)(酸化または硫化)の後に、固液分離を行わずに、工程(4)(脱保護)を行う本発明の製造方法では、硫化剤として5-[(N,N-ジメチルアミノメチリデン)アミノ]-3H-1,2,4-ジチアゾール-3-チオン(DDTT)を使用すると、DDTTの分解物が、工程(4)の際に5’位水酸基に付加する副反応が生じ、その後の縮合反応を阻害することを本発明者らは見出した。この問題を解決するため、本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、工程(3)でDDTTを使用する場合、工程(1)の後および工程(4)の前の反応液に、カルボン酸および有機塩基の混合物(中和塩)、無機酸またはアミン類を添加すれば、前記副反応を抑制し得ることを見出した。前記カルボン酸、有機塩基、無機酸およびアミン類は、いずれも、1種のみを使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
前記混合物中のカルボン酸は、好ましくは、酢酸、クロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ジフルオロ酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸等のハロゲン原子で置換されていてもよいC2-5カルボン酸であり、より好ましくはハロゲン原子で置換されていてもよい酢酸であり、さらに好ましくは酢酸である。
前記混合物中の有機塩基は、好ましくは、ピリジン、2,4,6-トリメチルピリジン、イミダゾール、N-メチルイミダゾール等の1~3個のC1-3アルキル基で置換されていてもよいピリジンおよび1~3個のC1-3アルキル基で置換されてもよいイミダゾールから選ばれる少なくとも一つであり、より好ましくは1~3個のC1-3アルキル基で置換されていてもよいピリジンであり、さらに好ましくは2,4,6-トリメチルピリジンである。
前記混合物中、有機塩基の量がカルボン酸の量と同量以上であることが好ましい。前記混合物中、有機塩基が有する塩基性窒素原子の量は、カルボン酸が有するカルボキシ基1モルに対して、より好ましくは1~5モル、さらに好ましくは1~2モル、特に好ましくは1モルである。なお、有機塩基としてイミダゾールを使用する場合、その3位の窒素原子のみを塩基性窒素原子として数える。
前記混合物の使用量は、その混合物に含まれるカルボン酸の量(即ち、中和塩の量)に基づき定められる。このカルボン酸の量は、工程(3)におけるDDTTの使用量1モルに対して、好ましくは1~10モル、より好ましくは1~5モル、さらに好ましくは1~3モルである。
上述のカルボン酸および有機塩基の混合物(中和塩)の代わりに、無機酸を添加することによっても、前記副反応を抑制することができる。無機酸としては、例えば、塩酸、フッ化水素酸、臭化水素酸が挙げられる。これらの中で、塩酸、フッ化水素酸が好ましく、塩酸がより好ましい。無機酸の使用量は、工程(3)におけるDDTTの使用量1モルに対して、好ましくは1.0~20モル、より好ましくは1.5~10モル、さらに好ましくは2.0~5.0モルである。
上述のカルボン酸および有機塩基の混合物(中和塩)の代わりに、アミン類を添加することによっても、前記副反応を抑制することができる。アミン類としては、例えば、アニリン、2-クロロアニリン、3-クロロアニリン、2,4-ジクロロアニリン、2-フルオロアニリン、4-メトキシアニリン、4-ニトロアニリン、2,6-ジクロロアニリン、2,6-ジメチルアニリンが挙げられる。これらの中で、2-クロロアニリン、2,6-ジメチルアニリンが好ましく、2,6-ジメチルアニリンがより好ましい。アミン類の使用量は、工程(3)におけるDDTTの使用量1モルに対して、好ましくは1.0~20モル、より好ましくは1.5~10モル、さらに好ましくは2.0~5.0モルである。
工程(4)(脱保護)
本工程は、オリゴヌクレオチド(d)の一時保護基を酸によって除去し、5’位水酸基が保護されていないオリゴヌクレオチド(e)を得る工程である。酸は、1種のみを使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
本工程は、オリゴヌクレオチド(d)の一時保護基を酸によって除去し、5’位水酸基が保護されていないオリゴヌクレオチド(e)を得る工程である。酸は、1種のみを使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
本工程に使用する酸としては、良好な脱保護が達成できさえすれば特に限定されないが、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、塩酸、酢酸、p-トルエンスルホン酸等を使用することが好ましい。良好な反応を達成できるという観点で、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸がより好ましく、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸がさらに好ましく、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸がさらに一層好ましく、トリフルオロ酢酸が特に好ましい。これら酸は、前記非極性溶媒で希釈しても構わない。また、前記酸を使用する際には、特定の塩基を組み合わせて、酸性度を適宜調整して使用しても構わない。本工程における酸の使用量は、オリゴヌクレオチド(d)1モルに対し、例えば1~100モル、好ましくは1~40モルである。
本工程の反応温度は、反応が進行しさえすれば特に限定されないが、-10℃~50℃が好ましく、0℃~40℃がより好ましい。反応時間は、使用するオリゴヌクレオチド(d)、酸の種類および非極性溶媒の種類、反応温度等により異なるが、例えば5分~5時間である。
本工程において、オリゴヌクレオチド(d)の5’位水酸基の一時保護基の除去反応中、または除去反応後に、カチオン捕捉剤を使用することが好ましい。即ち、一時保護基の除去反応をカチオン捕捉剤の存在下で行うか、または一時保護基の除去反応後に反応液にカチオン捕捉剤を添加することが好ましい。カチオン捕捉剤は、1種のみを使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
カチオン捕捉剤としては、除去された一時保護基による再保護(原料戻り)や脱保護された官能基への副反応が進行しなければ、特に限定されないが、ピロール、2-メチルピロール、3-メチルピロール、2,3-ジメチルピロール、2,4-ジメチルピロール等のピロール誘導体;インドール、3-メチルインドール、4-メチルインドール、5-メチルインドール、6-メチルインドール、7-メチルインドール、5,6-ジメチルインドール、6,7-ジメチルインドール等のインドール誘導体;2-メチルフラン、2,3-ジメチルフラン、2-メチル-3-(メチルチオ)フラン、メントフラン等のフラン誘導体を使用することができる。良好なカチオン捕捉効果が得られるという観点で、ピロール、2-メチルピロール、3-メチルピロール、2,3-ジメチルピロール、2,4-ジメチルピロール、インドール、3-メチルインドール、4-メチルインドール、5-メチルインドール、6-メチルインドール、7-メチルインドール、5,6-ジメチルインドール、6,7-ジメチルインドール、2-メチルフラン、2,3-ジメチルフラン、2-メチル-3-(メチルチオ)フラン、メントフランが好ましく、ピロール、3-メチルピロール、2,4-ジメチルピロール、インドール、4-メチルインドール、5-メチルインドール、6-メチルインドール、7-メチルインドール、5,6-ジメチルインドール、6,7-ジメチルインドールがより好ましく、ピロール、3-メチルピロール、インドールがさらに好ましく、ピロール、インドールがさらに一層好ましく、ピロールが特に好ましい。本工程におけるカチオン捕捉剤の使用量は、オリゴヌクレオチド(d)1モルに対し、例えば1~50モル、好ましくは5~20モルである。
工程(5)(中和)
工程(4)(脱保護)の後に、工程(4)で使用した酸を中和するため、反応液に塩基を添加してもよい。但し、本発明の製造方法では、工程(4)の後に、必要に応じて、工程(6)(固液分離または抽出)および洗浄を行うことによって、工程(4)で使用した酸をオリゴヌクレオチド(e)から除去することが可能である。そのため、工程(5)は必須ではない。
工程(4)(脱保護)の後に、工程(4)で使用した酸を中和するため、反応液に塩基を添加してもよい。但し、本発明の製造方法では、工程(4)の後に、必要に応じて、工程(6)(固液分離または抽出)および洗浄を行うことによって、工程(4)で使用した酸をオリゴヌクレオチド(e)から除去することが可能である。そのため、工程(5)は必須ではない。
本工程において、塩基は1種のみを使用してもよく、2種以上を併用してもよい。使用する塩基としては、有機塩基が好ましい。有機塩基としては、ピリジン、2,4,6-トリメチルピリジン、ベンズイミダゾール、1,2,4-トリアゾール、N-フェニルイミダゾール、2-アミノ-4,6-ジメチルピリミジン、1,10-フェナントロリン、イミダゾール、N-メチルイミダゾール、2-クロロベンズイミダゾール、2-ブロモベンズイミダゾール、2-メチルイミダゾール、2-フェニルベンズイミダゾール、N-フェニルベンズイミダゾール、5-ニトロベンズイミダゾールが好ましく、ピリジン、2,4,6-トリメチルピリジン、ベンズイミダゾール、1,2,4-トリアゾール、N-フェニルイミダゾール、N-メチルイミダゾール、2-アミノ-4,6-ジメチルピリミジン、1,10-フェナントロリンがより好ましく、ピリジン、2,4,6-トリメチルピリジン、ベンズイミダゾール、1,2,4-トリアゾール、N-フェニルイミダゾールがさらに好ましく、ピリジン、2,4,6-トリメチルピリジン、ベンズイミダゾール、1,2,4-トリアゾールが特に好ましく、ピリジン、2,4,6-トリメチルピリジン、ベンズイミダゾールが最も好ましい。
本工程における塩基の使用量は、工程(4)における酸の使用量1モルに対し、例えば1~10モルであり、好ましくは1~3モルである。
工程(6)(固液分離または抽出)
本工程は、オリゴヌクレオチド(e)を含む反応液に極性溶媒を添加し、オリゴヌクレオチド(e)を沈殿させて精製するか(固液分離)、または反応液に極性溶媒を添加し、極性溶媒-非極性溶媒間で分層させ、非極性溶媒層にオリゴヌクレオチド(e)を移行させて精製する(抽出)工程である。固液分離および抽出のいずれの場合も、極性溶媒は、1種のみを使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
本工程は、オリゴヌクレオチド(e)を含む反応液に極性溶媒を添加し、オリゴヌクレオチド(e)を沈殿させて精製するか(固液分離)、または反応液に極性溶媒を添加し、極性溶媒-非極性溶媒間で分層させ、非極性溶媒層にオリゴヌクレオチド(e)を移行させて精製する(抽出)工程である。固液分離および抽出のいずれの場合も、極性溶媒は、1種のみを使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
まず固液分離から説明する。固液分離で使用する極性溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール系溶媒;アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル系溶媒;アセトン、2-ブタノン等のケトン系溶媒;1,4-ジオキサン、テトラヒドロフラン等の極性エーテル系溶媒;ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、N-メチルピペリドン等のアミド系溶媒、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒;水等、並びにこれらの混合溶媒が挙げられる。これらの中でも、ニトリル系溶媒が好ましく、アセトニトリルがより好ましい。
オリゴヌクレオチド(e)の回収率を高めるために、固液分離における極性溶媒の添加量は、反応液中に含まれる非極性溶媒1mLに対して、好ましくは1~20mL、より好ましくは1~10mL、さらに好ましくは1~5mLである。
極性溶媒は、オリゴヌクレオチド(e)の極性溶媒中へのロスを最小限とするために水を含んでいてもよい。この場合、極性溶媒中の水の含有量は、1~10%(v/v)が好ましく、3~8%(v/v)がより好ましい。水の含有量が低すぎる場合は、オリゴヌクレオチド(e)の極性溶媒中へのロスが増える場合があり、水の含有量が高すぎる場合は、不純物の極性溶媒中への除去が不十分となる傾向がある。
オリゴヌクレオチド(e)の回収率を高めるために、WO2016/117663に記載されているような沈殿促進剤(例えば、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル 2,2-ジメチルプロパノエート)を使用してもよい。
次に抽出について説明する。抽出の操作は、特に限定されないが、好ましくは、オリゴヌクレオチド(e)を含む反応液に極性溶媒を添加して、極性溶媒-非極性溶媒間で分層させ、非極性溶媒層にオリゴヌクレオチド(e)を移行させることによって行われる。この抽出によって、残存する原料、副生成物等の不純物を極性溶媒層に移行させ、除去することができる。
抽出で使用される極性溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール系溶媒、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル系溶媒、アセトン、2-ブタノン等のケトン系溶媒、1,4-ジオキサン、テトラヒドロフラン等の極性エーテル系溶媒、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピペリドン等のアミド系溶媒、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒、水等、並びにこれら2種以上の混合溶媒が挙げられる。中でも、アミド系溶媒、ニトリル系溶媒、およびこれらの組合せが好ましく、アセトニトリル、N,N-ジメチルホルムアミド、N-メチルピペリドン、およびこれらの組合せがより好適に使用される。これらの中でも、ニトリル系溶媒が好ましく、アセトニトリルがより好ましい。
抽出で使用される極性溶媒は、非極性溶媒との分層性を向上させるために水を含んでいてもよい。この場合、極性溶媒中の水の含有量は、1~10%(v/v)が好ましく、3~8%(v/v)がより好ましい。水の含有量が低すぎる場合は、分層性があまり向上しない場合があり、水の含有量が高すぎる場合は、不純物の極性溶媒に対する溶解度が下がり、その除去効率が低下する傾向がある。
抽出のために必要に応じて、極性溶媒と共に、非極性溶媒を反応液に添加してもよい。非極性溶媒は、1種のみを使用してもよく、2種以上を併用してもよい。必要に応じて添加される非極性溶媒としては、クロロホルム、ジクロロメタン、1,2-ジクロロエタン等のハロゲン系溶媒;ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン等の芳香族系溶媒;酢酸エチル、酢酸イソプロピル等のエステル系溶媒;ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、オクタン、ノナン、シクロヘキサン等の脂肪族系溶媒;ジエチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、tert-ブチルメチルエーテル等の非極性エーテル系溶媒が挙げられる。これらの中でも、芳香族系溶媒、脂肪族系溶媒、またはこれらの組合せが好ましく、ベンゼン、トルエン、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、ノナン、シクロヘキサンまたは、これらの組合せ等が好ましく、トルエン、ヘプタン、ノナンまたは、これらの組合せがより好ましく、トルエン、ヘプタンまたは、これらの組合せがさらに好ましく、ヘプタンが特に好ましい。
極性溶媒-非極性溶媒間で分層後に、極性溶媒層を除く操作によって、不純物を除去することができる。極性溶媒層を除いた非極性溶媒層に、さらに極性溶媒を添加し、攪拌し、分層させた後、極性溶媒を除く操作を行うことによって、さらに不純物の量を低減させてもよい。
1回の抽出操作のために用いられる極性溶媒の量は、非極性溶媒1mLに対して、好ましくは0.1~10mL、より好ましくは0.2~5mL、さらに好ましくは0.2~1mLである。
得られた非極性溶媒層を濃縮することによって、オリゴヌクレオチド(e)を単離することができる。
工程(7)(脱保護および単離)
本発明の製造方法は、工程(6)(固液分離または抽出)の後に、得られたオリゴヌクレオチドの保護基を全て除去した後、保護されていないオリゴヌクレオチドを単離する工程を含んでいてもよい。脱保護の方法としては、例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス(PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS)、第3版、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ(JOHN WILLY&SONS)出版(1999年)等に記載されている脱保護方法に従い、オリゴヌクレオチドの全ての保護基を除去する工程を行うことができる。具体的には、アンカー、および核酸塩基の保護基であるフェノキシアセチル基、アセチル基等、リン酸骨格を保護しているシアノエチル基等は、アンモニア水、アンモニア水/エタノール溶液、またはアンモニア水とメチルアミン水溶液の混合液で処理することにより、全て除去することができる。また、5’水酸基の保護基は、工程(4)で使用される酸またはそれらを適宜希釈した溶液で処理することにより除去することができる。保護されていない(即ち、保護基を有さない)オリゴヌクレオチドは酵素により容易に分解されやすいため、空気清浄度管理下で、保護されていないオリゴヌクレオチドを単離することが好ましい。
本発明の製造方法は、工程(6)(固液分離または抽出)の後に、得られたオリゴヌクレオチドの保護基を全て除去した後、保護されていないオリゴヌクレオチドを単離する工程を含んでいてもよい。脱保護の方法としては、例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス(PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS)、第3版、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ(JOHN WILLY&SONS)出版(1999年)等に記載されている脱保護方法に従い、オリゴヌクレオチドの全ての保護基を除去する工程を行うことができる。具体的には、アンカー、および核酸塩基の保護基であるフェノキシアセチル基、アセチル基等、リン酸骨格を保護しているシアノエチル基等は、アンモニア水、アンモニア水/エタノール溶液、またはアンモニア水とメチルアミン水溶液の混合液で処理することにより、全て除去することができる。また、5’水酸基の保護基は、工程(4)で使用される酸またはそれらを適宜希釈した溶液で処理することにより除去することができる。保護されていない(即ち、保護基を有さない)オリゴヌクレオチドは酵素により容易に分解されやすいため、空気清浄度管理下で、保護されていないオリゴヌクレオチドを単離することが好ましい。
上記各工程における反応の進行の確認は、いずれも一般的な液相有機合成反応と同様の方法を適用できる。即ち、薄層シリカゲルクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を用いて反応を追跡することができる。
5’-3’合成
5’-3’合成である本発明の製造方法は、以下の工程(1’)、(3’)、(4’)および(6’)を含む。この製造方法は、必要に応じて、さらに以下の工程(2’)、(5’)および(7’)を含んでいてもよい。
(1’)非極性溶媒中、
3’位水酸基または3’位アミノ基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および5’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の5’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)、或いは
3’位水酸基または3’位アミノ基が保護されておらず、5’位リン酸基の一つの水酸基が-OLn1-OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、-OLn1-OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)
を含む反応液に、
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基または3’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
を添加して、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)とヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)とを縮合させ、3’位水酸基または3’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイトトリエステル体(c’)を含む反応液を得る工程;
(2’)必要に応じて、縮合後の反応液にクエンチ剤を添加する工程;
(3’)ホスファイトトリエステル体(c’)を含む反応液に酸化剤または硫化剤を添加して、ホスファイトトリエステル体(c’)を酸化または硫化し、3’位水酸基または3’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたオリゴヌクレオチド(d’)を含む反応液を得る工程;
(4’)酸化または硫化後の反応液に酸を添加して3’位水酸基または3’位アミノ基の一時保護基を除去し、3’位水酸基または3’位アミノ基が保護されていないオリゴヌクレオチド(e’)を含む反応液を得る工程;
(5’)必要に応じて、オリゴヌクレオチド(e’)を含む反応液に塩基を添加して中和する工程;
(6’)必要に応じて、オリゴヌクレオチド(e’)を含む反応液に極性溶媒を添加し、沈殿したオリゴヌクレオチド(e’)を得る工程;および
(7’)必要に応じて、得られたオリゴヌクレオチドの保護基を全て除去した後、保護されていないオリゴヌクレオチドを単離する工程。
5’-3’合成である本発明の製造方法は、以下の工程(1’)、(3’)、(4’)および(6’)を含む。この製造方法は、必要に応じて、さらに以下の工程(2’)、(5’)および(7’)を含んでいてもよい。
(1’)非極性溶媒中、
3’位水酸基または3’位アミノ基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および5’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の5’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)、或いは
3’位水酸基または3’位アミノ基が保護されておらず、5’位リン酸基の一つの水酸基が-OLn1-OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、-OLn1-OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)
を含む反応液に、
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基または3’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
を添加して、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)とヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)とを縮合させ、3’位水酸基または3’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイトトリエステル体(c’)を含む反応液を得る工程;
(2’)必要に応じて、縮合後の反応液にクエンチ剤を添加する工程;
(3’)ホスファイトトリエステル体(c’)を含む反応液に酸化剤または硫化剤を添加して、ホスファイトトリエステル体(c’)を酸化または硫化し、3’位水酸基または3’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたオリゴヌクレオチド(d’)を含む反応液を得る工程;
(4’)酸化または硫化後の反応液に酸を添加して3’位水酸基または3’位アミノ基の一時保護基を除去し、3’位水酸基または3’位アミノ基が保護されていないオリゴヌクレオチド(e’)を含む反応液を得る工程;
(5’)必要に応じて、オリゴヌクレオチド(e’)を含む反応液に塩基を添加して中和する工程;
(6’)必要に応じて、オリゴヌクレオチド(e’)を含む反応液に極性溶媒を添加し、沈殿したオリゴヌクレオチド(e’)を得る工程;および
(7’)必要に応じて、得られたオリゴヌクレオチドの保護基を全て除去した後、保護されていないオリゴヌクレオチドを単離する工程。
工程(1’)、(3’)、(4’)および(6’)(好ましくは工程(1’)~(6’))のサイクルを繰り返すことによって、オリゴヌクレオチド鎖を伸長させることができる。なお、工程(1’)、(3’)および(4’)を含むオリゴヌクレオチドの製造方法は、本発明に包含される。
5’-3’合成である本発明の製造方法の説明は、3’位水酸基または3’位アミノ基が保護されていないヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)と、5’位水酸基がホスホロアミダイト化されているヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)とを使用して、3’位水酸基または3’位アミノ基が保護されていないオリゴヌクレオチド(e’)を製造すること以外は、上述の3’-5’合成である本発明の製造方法の説明と、基本的に同じである。言い換えると、3’位水酸基または3’アミノ基および5’位水酸基の保護等の態様が入れ替わっていること以外は、工程(1’)~(7’)、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)、置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)、ホスファイトトリエステル体(c’)、オリゴヌクレオチド(d’)およびオリゴヌクレオチド(e’)の説明は、上述の工程(1)~(7)、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)、置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)、ホスファイトトリエステル体(c)、オリゴヌクレオチド(d)およびオリゴヌクレオチド(e)の説明と、基本的に同じである。5’-3’合成について、3’-5’合成と異なる点を以下で説明する
工程(1’)(縮合)
本工程で使用するヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)は、酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され3’位水酸基または3’位アミノ基を有する。水酸基の一時保護基の説明は、工程(1)での説明と同じである。
本工程で使用するヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)は、酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され3’位水酸基または3’位アミノ基を有する。水酸基の一時保護基の説明は、工程(1)での説明と同じである。
アミノ基の一時保護基としては、例えば、トリチル基、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基等が挙げられる。これらの中で、トリチル基およびモノメトキシトリチル基が好ましい。
本工程の好ましい態様では、
3’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および5’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の5’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)、或いは
3’位水酸基が保護されておらず、5’位リン酸基の一つの水酸基が-OLn1-OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、-OLn1-OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)、並びに
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
が使用される。
3’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および5’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の5’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)、或いは
3’位水酸基が保護されておらず、5’位リン酸基の一つの水酸基が-OLn1-OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、-OLn1-OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)、並びに
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
が使用される。
本工程のより好ましい態様では、
3’位水酸基が保護されておらず、5’位リン酸基の一つの水酸基が-OLn1-OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、-OLn1-OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)、並びに
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
が使用される。
3’位水酸基が保護されておらず、5’位リン酸基の一つの水酸基が-OLn1-OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、-OLn1-OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)、並びに
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
が使用される。
本工程のより好ましい別の態様では、
3’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および5’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の5’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(a’)、並びに
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
が使用される。
3’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および5’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の5’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(a’)、並びに
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
が使用される。
ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)が有する3’位水酸基と、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)が有するホスホロアミダイト化された5’位水酸基との縮合は、工程(1)と同様に行うことができる。そのため、工程(1’)の縮合の説明は、「ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)」を「ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)」に置き換え、「ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)」を「ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)」に置き換えたこと以外、工程(1)の説明と同じである。
ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)が有する3’位アミノ基と、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)が有するホスホロアミダイト化された5’位水酸基との縮合も、工程(1)の縮合と同様に行うことができる。そのため、工程(1’)の縮合の説明は、「ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)」を「ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)」に置き換え、「ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)」を「ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)」に置き換えたこと以外、工程(1)の説明と同じである。
ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)としては、例えば、下記式(a-I’)で表される化合物(即ち、ヌクレオシド、またはオリゴヌクレオチド)が挙げられる。
[式中、
m、m+1個のBase、m+1個のX、m個のR10、m個のRp1、L、YおよびZは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
m個のXn1は、それぞれ独立して、酸素原子またはNHを示し;
Xn3は、水酸基またはアミノ基を示す。]
m、m+1個のBase、m+1個のX、m個のR10、m個のRp1、L、YおよびZは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
m個のXn1は、それぞれ独立して、酸素原子またはNHを示し;
Xn3は、水酸基またはアミノ基を示す。]
式(a-I’)中のm個のXn1は、好ましくは酸素原子である。
式(a-I’)中のXn3は、好ましくは水酸基である。
式(a-I’)中のm個のRp1は、好ましくは、それぞれ独立して-CH2CH2WGで表される基である。
式(a-I’)中の他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物(a-I’)は、好ましくは下記式(a-i’)で表される化合物である(下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである)。
式(a-I’)中のXn3は、好ましくは水酸基である。
式(a-I’)中のm個のRp1は、好ましくは、それぞれ独立して-CH2CH2WGで表される基である。
式(a-I’)中の他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物(a-I’)は、好ましくは下記式(a-i’)で表される化合物である(下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである)。
化合物(a-i’)の中で、式(a-II’)で表される化合物(即ち、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド)が好ましい(下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである)。
式(a-II’)において、m個のRp1が、それぞれ独立して-CH2CH2WGで表される基であることが好ましい。
式(a-II’)において、mが0であることが好ましい。
式(a-II’)における他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物(a-II’)の中で、下記式(a-III’)で表される化合物(即ち、ヌクレオシド)が好ましい(下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである)。
式(a-II’)において、mが0であることが好ましい。
式(a-II’)における他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物(a-II’)の中で、下記式(a-III’)で表される化合物(即ち、ヌクレオシド)が好ましい(下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである)。
また、化合物(a-i’)の中で、下記式(a-IV’)で表される化合物(即ち、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド)が好ましい(下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである)。
式(a-IV’)において、m個のRp1が、それぞれ独立して-CH2CH2WGで表される基であることが好ましい。
式(a-IV’)において、mが0であることが好ましい。
式(a-IV’)における他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物(a-IV’)の中で、下記式(a-V’)で表される化合物(即ち、ヌクレオシド)が好ましい(下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである)。
式(a-IV’)において、mが0であることが好ましい。
式(a-IV’)における他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物(a-IV’)の中で、下記式(a-V’)で表される化合物(即ち、ヌクレオシド)が好ましい(下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである)。
また、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)としては、例えば、下記式(a-VI’)で表される化合物(即ち、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド)が挙げられる。
[式中、
m+1個のBase1の少なくとも一つは、-L-Y-Zで保護されている核酸塩基を示し、残りは保護されていてもよい核酸塩基を示し;
m個のXn1は、それぞれ独立して、酸素原子またはNHを示し;
Xn3は、水酸基またはアミノ基を示し;
Rn4は、水酸基の保護基を示し;
m、m+1個のX、m個のR10、m個のRp1、L、YおよびZは、それぞれ独立して、前記と同義である。]
m+1個のBase1の少なくとも一つは、-L-Y-Zで保護されている核酸塩基を示し、残りは保護されていてもよい核酸塩基を示し;
m個のXn1は、それぞれ独立して、酸素原子またはNHを示し;
Xn3は、水酸基またはアミノ基を示し;
Rn4は、水酸基の保護基を示し;
m、m+1個のX、m個のR10、m個のRp1、L、YおよびZは、それぞれ独立して、前記と同義である。]
式(a-VI’)中のm個のXn1は、好ましくは酸素原子である。
式(a-VI’)中のXn3は、好ましくは水酸基である。
式(a-VI’)中のm個のRp1は、好ましくは、それぞれ独立して-CH2CH2WGで表される基である。
式(a-VI’)中の他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物(a-VI’)は、好ましくは下記式(a-vi’)で表される化合物である(下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである)。
式(a-VI’)中のXn3は、好ましくは水酸基である。
式(a-VI’)中のm個のRp1は、好ましくは、それぞれ独立して-CH2CH2WGで表される基である。
式(a-VI’)中の他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物(a-VI’)は、好ましくは下記式(a-vi’)で表される化合物である(下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである)。
また、置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)としては、例えば、下記式(a-VII’)で表される化合物が挙げられる。
[式中、
m+1個のXn1は、それぞれ独立して、酸素原子またはNHを示し;
Xn3は、水酸基またはアミノ基を示し;
Ln1は有機基を示し;
m、m+1個のBase、m+1個のX、m+1個のR10、m+1個のRp1、L、YおよびZは、それぞれ独立して、前記と同義である。]
m+1個のXn1は、それぞれ独立して、酸素原子またはNHを示し;
Xn3は、水酸基またはアミノ基を示し;
Ln1は有機基を示し;
m、m+1個のBase、m+1個のX、m+1個のR10、m+1個のRp1、L、YおよびZは、それぞれ独立して、前記と同義である。]
式(a-VII’)中のXn3は、好ましくは水酸基である。
式(a-VII’)中のm+1個のRp1は、好ましくは、それぞれ独立して-CH2CH2WGで表される基である。
式(a-VII’)中の他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物(a-VII’)は、好ましくは下記式(a-vii’)で表される化合物である(下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである)。
式(a-VII’)中のm+1個のRp1は、好ましくは、それぞれ独立して-CH2CH2WGで表される基である。
式(a-VII’)中の他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物(a-VII’)は、好ましくは下記式(a-vii’)で表される化合物である(下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである)。
本工程で使用するヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)は、好ましくは化合物(a-I’)、化合物(a-VI’)または化合物(a-VII’)であり、より好ましくは化合物(a-i’)、化合物(a-vi’)または化合物(a-vii’)であり、さらに好ましくは化合物(a-i’)または化合物(a-vii’)であり、特に好ましくは化合物(a-vii’)である。
ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)としては、例えば、下記式(b-I’)で表される化合物(即ち、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド)が挙げられる。
[式中、
q+1個のBase2は、それぞれ独立して、-L-X-Zおよび核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよい核酸塩基を示し;
q個のXn1は、それぞれ独立して、酸素原子またはNHを示し;
Xn4は、酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されている水酸基またはアミノ基を示し;
q、q+1個のX、q+1個のRp1、q個のR10、R36、R37およびQ”は、それぞれ独立して、前記と同義である。]
q+1個のBase2は、それぞれ独立して、-L-X-Zおよび核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよい核酸塩基を示し;
q個のXn1は、それぞれ独立して、酸素原子またはNHを示し;
Xn4は、酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されている水酸基またはアミノ基を示し;
q、q+1個のX、q+1個のRp1、q個のR10、R36、R37およびQ”は、それぞれ独立して、前記と同義である。]
式(b-I’)中の水酸基の一時保護基およびアミノ基の一時保護基の説明は、前記の通りである。Xn4は、好ましくは酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されている水酸基である。
式(b-I’)中のq+1個のRp1は、好ましくは、それぞれ独立して-CH2CH2WGで表される基である。
式(b-I’)中の他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物(b-I’)は、好ましくは下記式(b-i’)で表される化合物である(下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである)。
式(b-I’)中のq+1個のRp1は、好ましくは、それぞれ独立して-CH2CH2WGで表される基である。
式(b-I’)中の他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物(b-I’)は、好ましくは下記式(b-i’)で表される化合物である(下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである)。
3’位水酸基および5’位水酸基の保護等の態様が入れ替わっていること以外は、上述の化合物(a-I’)~化合物(a-vii’)並びに化合物(b-I’)および(b-i’)の説明は、上述の化合物(a-I)~化合物(a-vii)並びに化合物(b-I)および(b-i)の説明と、基本的に同じである。
本工程で使用するヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)とヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)との組合せは、
好ましくは化合物(a-I’)、化合物(a-VI’)または化合物(a-VII’)と化合物(b-I’)との組合せであり、
より好ましくは化合物(a-i’)、化合物(a-vi’)または化合物(a-vii’)と化合物(b-i’)との組合せであり、
さらに好ましくは化合物(a-i’)または化合物(a-vii’)と化合物(b-i’)との組合せであり、
特に好ましくは化合物(a-vii’)と化合物(b-i’)との組合せである。
好ましくは化合物(a-I’)、化合物(a-VI’)または化合物(a-VII’)と化合物(b-I’)との組合せであり、
より好ましくは化合物(a-i’)、化合物(a-vi’)または化合物(a-vii’)と化合物(b-i’)との組合せであり、
さらに好ましくは化合物(a-i’)または化合物(a-vii’)と化合物(b-i’)との組合せであり、
特に好ましくは化合物(a-vii’)と化合物(b-i’)との組合せである。
工程(4’)(脱保護)
本工程は、オリゴヌクレオチド(d’)の3’位水酸基または3’位アミノ基の一時保護基を酸によって除去し、3’位水酸基または3’位アミノ基が保護されていないオリゴヌクレオチド(e’)を得る工程である。酸は、1種のみを使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
本工程は、オリゴヌクレオチド(d’)の3’位水酸基または3’位アミノ基の一時保護基を酸によって除去し、3’位水酸基または3’位アミノ基が保護されていないオリゴヌクレオチド(e’)を得る工程である。酸は、1種のみを使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
水酸基の一時保護基の除去の説明は、工程(1)での説明と同じである。
アミノ基の一時保護基の除去に使用する酸としては、良好な脱保護が達成できさえすれば特に限定されないが、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、塩酸、酢酸、p-トルエンスルホン酸等を使用することが好ましい。これら酸は、前記非極性溶媒で希釈しても構わない。アミノ基の一時保護基の除去における酸の使用量は、オリゴヌクレオチド(d’)1モルに対し、例えば1~100モル、好ましくは1~40モルである。アミノ基の一時保護基の除去のための反応温度は、反応が進行しさえすれば特に限定されないが、-10℃~50℃が好ましく、0℃~40℃がより好ましい。アミノ基の一時保護基の反応時間は、使用するオリゴヌクレオチド(d’)、酸の種類および非極性溶媒の種類、反応温度等により異なるが、例えば5分~5時間である。
アミノ基の一時保護基の除去に使用する酸としては、良好な脱保護が達成できさえすれば特に限定されないが、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、塩酸、酢酸、p-トルエンスルホン酸等を使用することが好ましい。これら酸は、前記非極性溶媒で希釈しても構わない。アミノ基の一時保護基の除去における酸の使用量は、オリゴヌクレオチド(d’)1モルに対し、例えば1~100モル、好ましくは1~40モルである。アミノ基の一時保護基の除去のための反応温度は、反応が進行しさえすれば特に限定されないが、-10℃~50℃が好ましく、0℃~40℃がより好ましい。アミノ基の一時保護基の反応時間は、使用するオリゴヌクレオチド(d’)、酸の種類および非極性溶媒の種類、反応温度等により異なるが、例えば5分~5時間である。
オリゴヌクレオチド
工程(6)または(6’)(固液分離または抽出)により得られたオリゴヌクレオチド(e)または(e’)、或いは工程(7)または(7’)(脱保護および単離)により得られた保護されていないオリゴヌクレオチドは、さらに有機合成反応を施すことにより、所望の誘導体へと導くこともできる。本発明の製造方法によって得られたオリゴヌクレオチドは、人体用または動物用の医薬品(RNA、DNA、オリゴ核酸医薬、等)、機能性食品、特定保健食品、食品、化成品、生体用や工業用の高分子材料等の各種用途に使用することができる。
工程(6)または(6’)(固液分離または抽出)により得られたオリゴヌクレオチド(e)または(e’)、或いは工程(7)または(7’)(脱保護および単離)により得られた保護されていないオリゴヌクレオチドは、さらに有機合成反応を施すことにより、所望の誘導体へと導くこともできる。本発明の製造方法によって得られたオリゴヌクレオチドは、人体用または動物用の医薬品(RNA、DNA、オリゴ核酸医薬、等)、機能性食品、特定保健食品、食品、化成品、生体用や工業用の高分子材料等の各種用途に使用することができる。
ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド
本発明は、上述の工程(1)または工程(1’)で使用し得る、下記式(I)で表される化合物(即ち、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド)を提供する。
本発明は、上述の工程(1)または工程(1’)で使用し得る、下記式(I)で表される化合物(即ち、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド)を提供する。
[式中、
m、m+1個のBase、m+1個のX、m個のR10、およびm個のRp1は、それぞれ独立して、前記と同義であり;
Rn1およびRn2の一つが水素原子を示し、残りの一つが式(II)で表される基を示す(下記式中の記号の定義は、前記の通りである)。]
m、m+1個のBase、m+1個のX、m個のR10、およびm個のRp1は、それぞれ独立して、前記と同義であり;
Rn1およびRn2の一つが水素原子を示し、残りの一つが式(II)で表される基を示す(下記式中の記号の定義は、前記の通りである)。]
式(I)中、Rn1が式(II)で表される基であり、Rn2が水素原子であることが好ましい。
式(I)および(II)中のm+1個のRp1は、好ましくは、それぞれ独立して-CH2CH2WGで表される基である。
式(II)中のLn1は、好ましくはC2-6アルキレン基、より好ましくはエチレン基である。
式(I)中のmは、好ましくは0である。
式(I)および式(II)中の他の記号の説明は、前記の通りである。
式(I)および(II)中のm+1個のRp1は、好ましくは、それぞれ独立して-CH2CH2WGで表される基である。
式(II)中のLn1は、好ましくはC2-6アルキレン基、より好ましくはエチレン基である。
式(I)中のmは、好ましくは0である。
式(I)および式(II)中の他の記号の説明は、前記の通りである。
なお、Rn1が水素原子であり、且つRn2が式(II)で表される基である化合物(I)は、上述の化合物(a-vii)に対応する。また、Rn1が式(II)で表される基であり、且つRn2が水素原子である化合物(I)は、上述の化合物(a-vii’)に対応する。
出発物質として化合物(I)を使用して得られるオリゴヌクレオチドは、3’位または5’位に修飾されたリン酸基を有する。このような修飾されたオリゴヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼに対する耐性を向上させる働きがあることが知られている(Bioorganic & Medicinal Chemistry 1997, 5, 2235-2243.)。
以下、実施例等を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例等によって制限を受けるものではなく、上記・下記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
後述の実施例等で使用する略号の意味は、以下の通りである。
また、後述の実施例等で使用するrAOMe(Bz)-CE ホスホロアミダイト等を、以下では、ホスホロアミダイトモノマーと総称することがある。
後述の実施例等で使用する略号の意味は、以下の通りである。
DMTr:4,4’-ジメトキシトリチル
TOB:3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ
SUC:スクシニル
Ac-TOB:3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル アセテート
HO-dA-SUC-TOB:N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート
HO-dT-SUC-TOB:デオキシチミジン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート
HO-U-SUC-TOB:2’-O-メチル-ウリジン-3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート
MeOC(O)-TOB:メチル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンゾエート
HO-(CH2)2-SUC-TOB:3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル 2-ヒドロキシエチル スクシネート
CSO:(1S)-(+)-(10-カンファニルスルホニル)オキサジリジン
DBU:1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン
DDTT:5-[(N,N-ジメチルアミノメチリデン)アミノ]-3H-1,2,4-ジチアゾール-3-チオン
DPTT:ジペンタメチレンチウラムテトラスルフィド
PADS:フェニルアセチルジスルフィド
rAOMe(Bz)-CE ホスホロアミダイト:5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-N6-ベンゾイル-2’-O-メチル-アデノシン-3’-[O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
2’-OMe-rA(Bz)-CE ホスホロアミダイト:5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-N6-ベンゾイル-2’-O-メチル-アデノシン-3’-[O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
dG-CE ホスホロアミダイト:5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-N2-イソブチリル-デオキシアデノシン-3’-[O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
dT-CE ホスホロアミダイト:5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
U-CE ホスホロアミダイト:5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-2’-O-メチル-ウリジン-3’-[O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
dT-5’-CE ホスホロアミダイト:3’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)デオキシチミジン-5’-[O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
Cm(Bz)-CE ホスホロアミダイト:5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-N4-ベンゾイル-2’-O-メチル-シチジン-3’-[O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
GMOE(iBu)-CE ホスホロアミダイト:5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-N2-イソブチリル-2’-O-メトキシエチル-グアノシン-3’-[O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
AMOE(Bz)-CE ホスホロアミダイト:5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-N6-ベンゾイル-2’-O-メトキシエチル-アデノシン-3’-[O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
TMOE-CE ホスホロアミダイト:5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-2’-O-メトキシエチル-チミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
2’F-U-CE ホスホロアミダイト:5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-2’-フルオロ-ウリジン-3’-[O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
2’F-G-CE ホスホロアミダイト:5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-N2-イソブチリル-2’-フルオロ-グアノシン-3’-[O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
N4-ベンゾイル-5-Me-dC-CE ホスホロアミダイト:5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-N4-ベンゾイル-2’-デオキシ-5-メチルシチジン-3’-[O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
後述の実施例等で使用する略号の意味は、以下の通りである。
DMTr:4,4’-ジメトキシトリチル
TOB:3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ
SUC:スクシニル
Ac-TOB:3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル アセテート
HO-dA-SUC-TOB:N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート
HO-dT-SUC-TOB:デオキシチミジン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート
HO-U-SUC-TOB:2’-O-メチル-ウリジン-3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート
MeOC(O)-TOB:メチル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンゾエート
HO-(CH2)2-SUC-TOB:3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル 2-ヒドロキシエチル スクシネート
CSO:(1S)-(+)-(10-カンファニルスルホニル)オキサジリジン
DBU:1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン
DDTT:5-[(N,N-ジメチルアミノメチリデン)アミノ]-3H-1,2,4-ジチアゾール-3-チオン
DPTT:ジペンタメチレンチウラムテトラスルフィド
PADS:フェニルアセチルジスルフィド
rAOMe(Bz)-CE ホスホロアミダイト:5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-N6-ベンゾイル-2’-O-メチル-アデノシン-3’-[O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
2’-OMe-rA(Bz)-CE ホスホロアミダイト:5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-N6-ベンゾイル-2’-O-メチル-アデノシン-3’-[O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
dG-CE ホスホロアミダイト:5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-N2-イソブチリル-デオキシアデノシン-3’-[O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
dT-CE ホスホロアミダイト:5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
U-CE ホスホロアミダイト:5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-2’-O-メチル-ウリジン-3’-[O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
dT-5’-CE ホスホロアミダイト:3’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)デオキシチミジン-5’-[O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
Cm(Bz)-CE ホスホロアミダイト:5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-N4-ベンゾイル-2’-O-メチル-シチジン-3’-[O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
GMOE(iBu)-CE ホスホロアミダイト:5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-N2-イソブチリル-2’-O-メトキシエチル-グアノシン-3’-[O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
AMOE(Bz)-CE ホスホロアミダイト:5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-N6-ベンゾイル-2’-O-メトキシエチル-アデノシン-3’-[O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
TMOE-CE ホスホロアミダイト:5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-2’-O-メトキシエチル-チミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
2’F-U-CE ホスホロアミダイト:5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-2’-フルオロ-ウリジン-3’-[O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
2’F-G-CE ホスホロアミダイト:5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-N2-イソブチリル-2’-フルオロ-グアノシン-3’-[O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
N4-ベンゾイル-5-Me-dC-CE ホスホロアミダイト:5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-N4-ベンゾイル-2’-デオキシ-5-メチルシチジン-3’-[O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
実施例1:ホスホロチオエート2量体(2’-O-メチル-ウリジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル 2’-O-メチル-ウリジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブにHO-U-SUC-TOB(82.2mg,66.0μmol)とMeOC(O)-TOB(100mg,106μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(37.8mg,197μmol)とU-CE ホスホロアミダイト(150mg,197μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1時間撹拌した。反応液に2,2,2-トリフルオロエタノール(70.3μL,983μmol)を加え、室温で15分間撹拌した後、PADS(178mg,590μmol)を加え、室温で2時間撹拌した。5-メトキシインドール(193mg,1.31mmol)とトリフルオロ酢酸(45.2μL,590μmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6-トリメチルピリジン(85.5μL,649μmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(10mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(2’-O-メチル-ウリジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル 2’-O-メチル-ウリジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(197mg,収率95%)。
実施例2:ホスホロチオエート20量体(配列番号1:5’-TCCCGCCTGTGACATGCATT-3’)の液中連続合成
(1)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
(1)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
アルゴン雰囲気下、200mL四口フラスコにHO-dT-SUC-TOB(619mg,0.500mmol)とAcO-TOB(773mg,0.808mmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(2.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(1.12g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に2,2,2-トリフルオロエタノール(1.07mL,15.0mmol)を加え、室温で15分間撹拌した後、さらに酢酸(172μL,3.00mmol)と2,4,6-トリメチルピリジン(594μL,4.50mmol)の混合物を加えて、15分間室温で撹拌した。DDTT(340mg,1.65mmol)を加え、室温で30分間撹拌した後、5-メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(689μL,9.00mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6-トリメチルピリジン(1.31mL,9.90mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(789mg,収率98%)。
(2)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート19量体の合成
上記(1)と同様の操作をさらに18回繰返して、19量体(デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-ベンゾイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-ベンゾイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を得た(2.78g)。
上記(1)と同様の操作をさらに18回繰返して、19量体(デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-ベンゾイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-ベンゾイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を得た(2.78g)。
(3)3’位水酸基がアンカーで保護され、5’位水酸基がDMTr基で保護されたホスホロチオエート20量体の合成
アルゴン雰囲気下、200mL四口フラスコに上記(2)で得られた19量体(2.78g)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(2.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(287mg,1.49mmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(1.11g,1.49mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。DDTT(338mg,1.64mmol)を加え、室温で30分間撹拌した後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過後、乾燥して、20量体(5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-アセチル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-アセチル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-アセチル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホリル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホリル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を白色固体として得た(2.79g)。
アルゴン雰囲気下、200mL四口フラスコに上記(2)で得られた19量体(2.78g)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(2.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(287mg,1.49mmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(1.11g,1.49mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。DDTT(338mg,1.64mmol)を加え、室温で30分間撹拌した後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過後、乾燥して、20量体(5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-アセチル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-アセチル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-アセチル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホリル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホリル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を白色固体として得た(2.79g)。
(4)DMTr基の除去
アルゴン雰囲気下、100mL二口フラスコに、上記(3)で得られた20量体(1.00g)を入れ、脱水ジクロロメタン(10m)に溶解させた。5-メトキシインドール(245mg,1.66mmol)とトリフルオロ酢酸(100μL,1.31mmol)を加え、室温で1.5時間撹拌した後、2,4,6-トリメチルピリジン(190μL,1.44mmol)により中和した後、アセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、DMTr基が除去された20量体(デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-アセチル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-アセチル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-アセチル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホリル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を白色固体として得た(867mg)。
アルゴン雰囲気下、100mL二口フラスコに、上記(3)で得られた20量体(1.00g)を入れ、脱水ジクロロメタン(10m)に溶解させた。5-メトキシインドール(245mg,1.66mmol)とトリフルオロ酢酸(100μL,1.31mmol)を加え、室温で1.5時間撹拌した後、2,4,6-トリメチルピリジン(190μL,1.44mmol)により中和した後、アセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、DMTr基が除去された20量体(デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-アセチル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-アセチル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-アセチル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホリル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を白色固体として得た(867mg)。
(5)脱保護
上記(4)で得られた20量体(20mg)と30重量%アンモニア水(5.00mL)の混合物をオートクレーブに入れて、55℃で16時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物であるデオキシチミジン-3’-ホスホロチオニル-デオキシシチジン-3’-ホスホロチオニル-デオキシシチジン-3’-ホスホロチオニル-デオキシシチジン-3’-ホスホロチオニル-デオキシグアノシン-3’-ホスホロチオニル-デオキシシチジン-3’-ホスホロチオニル-デオキシシチジン-3’-ホスホロチオニル-デオキシチミジン-3’-ホスホロチオニル-デオキシグアノシン-3’-ホスホロチオニル-デオキシチミジン-3’-ホスホロチオニル-デオキシグアノシン-3’-ホスホロチオニル-デオキシアデノシン-3’-ホスホロチオニル-デオキシシチジン-3’-ホスホロチオニル-デオキシアデノシン-3’-ホスホロチオニル-デオキシチミジン-3’-ホスホロチオニル-デオキシグアノシン-3’-ホスホロチオニル-デオキシシチジン-3’-ホスホロチオニル-デオキシアデノシン-3’-ホスホロチオニル-デオキシチミジン-3’-ホスホロチオニル-デオキシチミジンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0-10min;5 to 60%、λ=260nm):Rt=6.87min(83.3area%);TOF/MS:6646.05
上記(4)で得られた20量体(20mg)と30重量%アンモニア水(5.00mL)の混合物をオートクレーブに入れて、55℃で16時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物であるデオキシチミジン-3’-ホスホロチオニル-デオキシシチジン-3’-ホスホロチオニル-デオキシシチジン-3’-ホスホロチオニル-デオキシシチジン-3’-ホスホロチオニル-デオキシグアノシン-3’-ホスホロチオニル-デオキシシチジン-3’-ホスホロチオニル-デオキシシチジン-3’-ホスホロチオニル-デオキシチミジン-3’-ホスホロチオニル-デオキシグアノシン-3’-ホスホロチオニル-デオキシチミジン-3’-ホスホロチオニル-デオキシグアノシン-3’-ホスホロチオニル-デオキシアデノシン-3’-ホスホロチオニル-デオキシシチジン-3’-ホスホロチオニル-デオキシアデノシン-3’-ホスホロチオニル-デオキシチミジン-3’-ホスホロチオニル-デオキシグアノシン-3’-ホスホロチオニル-デオキシシチジン-3’-ホスホロチオニル-デオキシアデノシン-3’-ホスホロチオニル-デオキシチミジン-3’-ホスホロチオニル-デオキシチミジンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0-10min;5 to 60%、λ=260nm):Rt=6.87min(83.3area%);TOF/MS:6646.05
実施例3:脱保護後の酸の中和(工程(5))を行わない液中連続合成
(1)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブ中にHO-dT-SUC-TOB(100mg,81μmol)とMeOC(O)-TOB(100mg,106μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(4.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(46.6mg,242μmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(181mg,242μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に2,2,2-トリフルオロエタノール(86.6μL,1.21mmol)を加え、室温で15分間撹拌した。さらに酢酸(13.9μL,242μmol)と2,4,6-トリメチルピリジン(31.9μL,242μmol)の混合物と、DDTT(54.7mg,267μmol)を加え、室温で30分間撹拌した後、5-メトキシインドール(238mg,1.62mmol)とトリフルオロ酢酸(55.7μL,727μmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。反応液中にアセトニトリル(10mL)を添加し、析出した固体を、アセトニトリル(20mL)で洗浄しながらキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、減圧乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(222mg,収率96%)。
(1)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブ中にHO-dT-SUC-TOB(100mg,81μmol)とMeOC(O)-TOB(100mg,106μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(4.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(46.6mg,242μmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(181mg,242μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に2,2,2-トリフルオロエタノール(86.6μL,1.21mmol)を加え、室温で15分間撹拌した。さらに酢酸(13.9μL,242μmol)と2,4,6-トリメチルピリジン(31.9μL,242μmol)の混合物と、DDTT(54.7mg,267μmol)を加え、室温で30分間撹拌した後、5-メトキシインドール(238mg,1.62mmol)とトリフルオロ酢酸(55.7μL,727μmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。反応液中にアセトニトリル(10mL)を添加し、析出した固体を、アセトニトリル(20mL)で洗浄しながらキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、減圧乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(222mg,収率96%)。
(2)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート3量体の合成
上記(1)と同様の操作をさらに1回繰返して、3量体(N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホリル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホリル-デオキシチミジン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を得た(251mg,収率89%)。
上記(1)と同様の操作をさらに1回繰返して、3量体(N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホリル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホリル-デオキシチミジン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を得た(251mg,収率89%)。
実施例4:ホスホロチオエート2量体の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブ中にHO-dT-SUC-TOB(100mg,81μmol)とMeOC(O)-TOB(100mg,106μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(5.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(46.6mg,242μmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(181mg,242μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に2,2,2-トリフルオロエタノール(86.6μL,1.21mmol)を加え、室温で15分間撹拌した。さらにDPTT(28.0mg,73.0μmol)を加え、室温で30分間撹拌した後、5-メトキシインドール(234mg,1.62mmol)とトリフルオロ酢酸(55.7μL,727μmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。2,4,6-トリメチルピリジン(105μL,800μmol)で反応液を中和後、トリエチルホスファイト(8.6μL,73.0μmol)を加えて、室温で15分間撹拌した後に、反応液中にアセトニトリル(10mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(222mg,収率88%)。
実施例5:ホスホロチオエート2量体の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブ中にHO-dT-SUC-TOB(80.3mg,65.0μmol)とMeOC(O)-TOB(99.0mg,105μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(37.4mg,195μmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(145mg,195μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に2,2,2-トリフルオロエタノール(69.5μmL,973μmol)を加え、室温で15分間撹拌した。さらにPADS(177mg,584μmol)を加え、室温で30分間撹拌した後、5-メトキシインドール(191mg,1.30mmol)とトリフルオロ酢酸(44.7μL,584μmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。反応液を2,4,6-トリメチルピリジン(84.6μL,642μml)で中和した後、アセトニトリル(10mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(73.3mg,85%)。
TOF/MS:1557.0116
TOF/MS:1557.0116
実施例6:ホスホロチオエート2量体の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブ中にデオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシル-1-メチル]スクシネート(500mg,0.402mmol)と3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシル-1-カルボン酸メチル(500mg,0.528mmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(4.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.4mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(116mg,0.603mmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(449mg,0.603mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に2,2,2-トリフルオロエタノール(129μL,1.81mmol)を加え、室温で15分間撹拌した。さらにDPTT(54.1mg,0.141mmol)を加え、室温で30分間撹拌した後、5-メトキシインドール(1.18g,8.04mmol)とトリフルオロ酢酸(115μL,1.51mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。2,4,6-トリメチルピリジン(218μL,1.66mmol)で反応液を中和後、反応液中にアセトニトリル(20mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシル-1-メチル]スクシネート)を白色固体として得た(1.15g,収率100%)。
実施例7:ホスホロチオエート2量体の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブ中にデオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンゾイルピペラジン]スクシネート(100mg,76.0μmmol)と3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシル-1-カルボン酸メチル(100mg,0.106mmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.3mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(43.7mg,227μmol)と2’-OMe-rA(Bz)-CE ホスホロアミダイト(202mg,0.227mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にモルホリン(99.0μL,1.14mmol)を加え、室温で15分間撹拌した。さらに(2R,8aS)-(+)-(カンファリルスルホニル)オキサジリジン(54.7mg,0.239mmol)を加え、室温で1時間撹拌した後、5-メトキシインドール(223mg,1.52mmol)とトリフルオロ酢酸(34.8μL,0.455mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。2,4,6-トリメチルピリジン(65.9μL,500μmol)で反応液を中和後、反応液中にアセトニトリル(10mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(N6-ベンゾイル-2’-O-メチル-アデノシン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンゾイルピペラジン]スクシネート)を白色固体として得た(214mg,収率89%)。
実施例8:ジヌクレオチドの合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブ中に3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート(100mg,81.0μmmol)と3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)フェニル-1-カルボン酸メチル(100mg,0.106mmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(5.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(46.6mg,242μmol)とdG-CE ホスホロアミダイト(204mg,0.242mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にモルホリン(106μL,1.21mmol)を加え、室温で15分間撹拌した。さらにヨウ素(64.6mg,0.254mmol)、2,4,6-トリメチルピリジン(83.8μL,0.636mmol)、および水(6.60μL,0.364mmol)の混合溶液を加え、室温で1時間撹拌した後、5-メトキシインドール(238mg,1.62mmol)とトリフルオロ酢酸(55.7μL,0.727mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。2,4,6-トリメチルピリジン(105μL,800μmol)で反応液を中和した後、反応液中にアセトニトリル(10mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、ジヌクレオチド(N2-イソブチリル-デオキシアデノシン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホリル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(209mg,収率88%)。
試験例1:クエンチ剤の検討
(1)反応液の調製
アルゴン雰囲気下、HO-dT-SUC-TOB(100mg,80.8μmol)とMeOC(O)-TOB(100mg,106μmol)を脱水ジクロロメタン(4.0mL)に溶解させた。この溶液に脱水アセトニトリル(0.5mL)中に溶解させて調製したdG-CE ホスホロアミダイト(204mg,242μmol)と5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(46.5mg,242μmol)の混合物を加えて、室温で30分間撹拌した。反応終了を薄層クロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール=10/1(体積比))で確認した後、表1に示す種類および量のクエンチ剤を加えて室温で30分間撹拌し、次いで表1に示す酸化剤(254μmol,ホスホロアミダイトモノマーに対して1.05モル当量)を添加して室温で1時間撹拌して、反応液を調製した。
(1)反応液の調製
アルゴン雰囲気下、HO-dT-SUC-TOB(100mg,80.8μmol)とMeOC(O)-TOB(100mg,106μmol)を脱水ジクロロメタン(4.0mL)に溶解させた。この溶液に脱水アセトニトリル(0.5mL)中に溶解させて調製したdG-CE ホスホロアミダイト(204mg,242μmol)と5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(46.5mg,242μmol)の混合物を加えて、室温で30分間撹拌した。反応終了を薄層クロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール=10/1(体積比))で確認した後、表1に示す種類および量のクエンチ剤を加えて室温で30分間撹拌し、次いで表1に示す酸化剤(254μmol,ホスホロアミダイトモノマーに対して1.05モル当量)を添加して室温で1時間撹拌して、反応液を調製した。
(2)試験液の調製(分析のための前処理)
得られた反応液(50μL)を1.5mLバイアル瓶の中に分取し、テトラヒドロフラン(450μL)で希釈した後、DBU(20μL)を入れて、30秒間撹拌して、試験液を調製した。
得られた反応液(50μL)を1.5mLバイアル瓶の中に分取し、テトラヒドロフラン(450μL)で希釈した後、DBU(20μL)を入れて、30秒間撹拌して、試験液を調製した。
(3)分析
得られた試験液を、LC-TOF MS(Agilent6230)により質量分析した。観測された各化合物(目的化合物および副生成物)のアバンダンスをもとに、下記式により副生成物の量を算出した。
ブランチ体の量(%)
=(ブランチ体のアバンダンス/目的化合物のアバンダンス)×100
リン酸トリエステル切断体の量(%)
=(リン酸トリエステル切断体のアバンダンス/目的化合物のアバンダンス)×100
ここで、目的化合物とは、反応液中に含まれる目的のオリゴヌクレオチドを指し、ブランチ体とは、目的化合物の核酸塩基におけるアミノ基の保護基が脱落し、該アミノ基とモノマーとが結合して生成した副生成物を指し、リン酸トリエステル切断体とは、目的化合物のリン酸トリエステルが切断して生成した副生成物を指す。結果を表1に示す。
得られた試験液を、LC-TOF MS(Agilent6230)により質量分析した。観測された各化合物(目的化合物および副生成物)のアバンダンスをもとに、下記式により副生成物の量を算出した。
ブランチ体の量(%)
=(ブランチ体のアバンダンス/目的化合物のアバンダンス)×100
リン酸トリエステル切断体の量(%)
=(リン酸トリエステル切断体のアバンダンス/目的化合物のアバンダンス)×100
ここで、目的化合物とは、反応液中に含まれる目的のオリゴヌクレオチドを指し、ブランチ体とは、目的化合物の核酸塩基におけるアミノ基の保護基が脱落し、該アミノ基とモノマーとが結合して生成した副生成物を指し、リン酸トリエステル切断体とは、目的化合物のリン酸トリエステルが切断して生成した副生成物を指す。結果を表1に示す。
表1に示されるように、酸化剤としてCSOを用い、クエンチ剤として、モルホリン、テトラヒドロフルフリルアルコール、ジエチレングリコール、エチレングリコールを用いた場合に、ブランチ体およびリン酸トリエステル切断体の生成が効果的に抑制されることが確認された。
試験例2:クエンチ剤の検討
(1)反応液の調製
アルゴン雰囲気下、HO-dT-SUC-TOB(100mg,80.8μmol)を脱水ジクロロメタン(4.0mL)に溶解させた後、rAOMe(Bz)-CE ホスホロアミダイト(215mg,242μmol)と5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(46.5mg,242μmol)の脱水アセトニトリル(0.5mL)混合溶液を加えて、室温で1時間撹拌した。反応終了を薄層クロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール=10/1(体積比))で確認した後、表2に示す種類および量のクエンチ剤を加えて室温で30分間撹拌し、次いでCSO(58.2mg,254μmol)を加えて室温で1時間撹拌した。さらに反応液に5-メトキシインドール(238mg,1.62mmol)とトリフルオロ酢酸(92.5μL,1.21mmol)を加えて室温で18時間撹拌し、反応液を調製した。
(1)反応液の調製
アルゴン雰囲気下、HO-dT-SUC-TOB(100mg,80.8μmol)を脱水ジクロロメタン(4.0mL)に溶解させた後、rAOMe(Bz)-CE ホスホロアミダイト(215mg,242μmol)と5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(46.5mg,242μmol)の脱水アセトニトリル(0.5mL)混合溶液を加えて、室温で1時間撹拌した。反応終了を薄層クロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール=10/1(体積比))で確認した後、表2に示す種類および量のクエンチ剤を加えて室温で30分間撹拌し、次いでCSO(58.2mg,254μmol)を加えて室温で1時間撹拌した。さらに反応液に5-メトキシインドール(238mg,1.62mmol)とトリフルオロ酢酸(92.5μL,1.21mmol)を加えて室温で18時間撹拌し、反応液を調製した。
(2)試験液の調製および分析
試験例1と同様にして、調製した試験液を質量分析し、観測された各化合物(目的化合物および副生成物)のアバンダンスをもとに、下記式により副生成物の量を算出した。
+1量体の量(%)
=(+1量体のアバンダンス/目的化合物のアバンダンス)×100
塩基部脱保護体の量(%)
=(塩基部脱保護体のアバンダンス/目的化合物のアバンダンス)×100
ここで、+1量体とは、目的化合物にさらに余分なモノマーが一つ結合して生成した副生成物を指し、塩基部脱保護体とは、目的化合物の核酸塩基におけるアミノ基の保護基が脱落して生成した副生成物を指す。結果を表2に示す。
試験例1と同様にして、調製した試験液を質量分析し、観測された各化合物(目的化合物および副生成物)のアバンダンスをもとに、下記式により副生成物の量を算出した。
+1量体の量(%)
=(+1量体のアバンダンス/目的化合物のアバンダンス)×100
塩基部脱保護体の量(%)
=(塩基部脱保護体のアバンダンス/目的化合物のアバンダンス)×100
ここで、+1量体とは、目的化合物にさらに余分なモノマーが一つ結合して生成した副生成物を指し、塩基部脱保護体とは、目的化合物の核酸塩基におけるアミノ基の保護基が脱落して生成した副生成物を指す。結果を表2に示す。
表2に示されるように、クエンチ剤として、テトラヒドロフルフリルアルコール、ジエチレングリコール、エチレングリコールを用いた場合に、+1量体および塩基部脱保護体の生成が効果的に抑制されることが確認された。
試験例3:クエンチ剤の検討
(1)反応液の調製
後述の参考例1~11に示すようにして、反応液を調製した。
(1)反応液の調製
後述の参考例1~11に示すようにして、反応液を調製した。
(2)試験液の調製および分析
試験例2と同様にして、調製した試験液を質量分析し、+1量体の量および塩基部脱保護体の量を算出した。結果を表3に示す。
試験例2と同様にして、調製した試験液を質量分析し、+1量体の量および塩基部脱保護体の量を算出した。結果を表3に示す。
表3に示されるように、クエンチ剤としてメタノール、t-ブタノール、2,2,2-トリフルオロエタノール、2-プロパノールを用いた場合に、+1量体の生成抑制効果があることが認められた。さらに、t-ブタノール、2,2,2-トリフルオロエタノール、2-プロパノールを用いた場合に、塩基部脱保護体の生成も抑制されることが確認された。また、+1量体および塩基部脱保護体の生成抑制効果が認められたアルコールと共に、酢酸と2,4,6-トリメチルピリジンとの中和塩を共存させた場合も、副生成物の生成が抑制されることが確認された。
試験例4:未反応原料の検討
(1)反応液の調製
後述の参考例12~15に示すようにして、反応液を調製した。
(1)反応液の調製
後述の参考例12~15に示すようにして、反応液を調製した。
(2)試験液の調製
参考例12~15で得られた反応液に、表4に示す種類および量のクエンチ剤および中和塩を添加した。この反応液(50μL)を1.5mLバイアル瓶の中に分取し、DDTT(2.5mg,12μmol)を入れた後、30秒間振盪した。次いで、テトラヒドロフラン(450μL)で希釈した後、DBU(20μL)を入れて30秒間撹拌して、試験液を調製した。
参考例12~15で得られた反応液に、表4に示す種類および量のクエンチ剤および中和塩を添加した。この反応液(50μL)を1.5mLバイアル瓶の中に分取し、DDTT(2.5mg,12μmol)を入れた後、30秒間振盪した。次いで、テトラヒドロフラン(450μL)で希釈した後、DBU(20μL)を入れて30秒間撹拌して、試験液を調製した。
(3)分析
得られた試験液を、LC-TOFMS(Agilent6230)により質量分析した。観測された各化合物(目的化合物および未反応原料)のアバンダンス(m/z=2)をもとに、下記式により、未反応原料の量を算出した。
未反応原料の量(%)=(未反応原料のアバンダンス/目的化合物のアバンダンス)×100
ここで、未反応原料とは、反応液の調製の際に使用したホスホロアミダイトモノマーを指す。
得られた試験液を、LC-TOFMS(Agilent6230)により質量分析した。観測された各化合物(目的化合物および未反応原料)のアバンダンス(m/z=2)をもとに、下記式により、未反応原料の量を算出した。
未反応原料の量(%)=(未反応原料のアバンダンス/目的化合物のアバンダンス)×100
ここで、未反応原料とは、反応液の調製の際に使用したホスホロアミダイトモノマーを指す。
表4に示されるように、t-ブタノールまたは2,2,2-トリフルオロエタノールおよび酢酸と2,4,6-トリメチルピリジンとの中和塩を共存させることにより、縮合反応時に未反応原料が残ることなく、効果的に縮合反応が進行することが確認された。
試験例5:ホスホロチオエート10量体の純度の検討
後述の参考例16~20で得られたホスホロチオエート10量体をHPLC分析し、得られた10量体の純度(面積%)を算出した。使用したクエンチ剤、中和塩および10量体の純度(面積%)の結果を表5に示す。
後述の参考例16~20で得られたホスホロチオエート10量体をHPLC分析し、得られた10量体の純度(面積%)を算出した。使用したクエンチ剤、中和塩および10量体の純度(面積%)の結果を表5に示す。
表5に示されるように、2,2,2-トリフルオロエタノールまたはt-ブタノールおよび酢酸および2,4,6-トリメチルピリジンの中和塩を用いた場合に、10量体の純度が高くなることが確認された。
参考例1(実施例9):反応液の調製
(1)2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO-dT-SUC-TOB(619mg,500μmol)とAc-TOB(619mg,648μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(1.12g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にメタノール(608μL,15.0mmol)を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(340mg,1.65mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(345μL,4.50mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6-トリメチルピリジン(654μL,4.95mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(762mg,収率95%)。
(1)2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO-dT-SUC-TOB(619mg,500μmol)とAc-TOB(619mg,648μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(1.12g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にメタノール(608μL,15.0mmol)を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(340mg,1.65mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(345μL,4.50mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6-トリメチルピリジン(654μL,4.95mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(762mg,収率95%)。
(2)3量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(1)で得られた2量体(762mg,473μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(273mg,1.42mmol)とdA-CE ホスホロアミダイト(1.22g,1.42mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にメタノール(575μL,14.2mmol)を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(321mg,1.56mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.39g,9.46mmol)とトリフルオロ酢酸(326μL,4.26mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。
なお、参考例1は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(1)で得られた2量体(762mg,473μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(273mg,1.42mmol)とdA-CE ホスホロアミダイト(1.22g,1.42mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にメタノール(575μL,14.2mmol)を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(321mg,1.56mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.39g,9.46mmol)とトリフルオロ酢酸(326μL,4.26mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。
なお、参考例1は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
参考例2(実施例10):反応液の調製
(1)2量体の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブにHO-dT-SUC-TOB(80.4mg,64.9μmol)とAc-TOB(99.6mg,104μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(37.4mg,195μmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(145mg,195μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にメタノール(39.5μL,975μmol)を加えた後、酢酸(22.3μL,390μmol)と2,4,6-トリメチルピリジン(77.0μL,585μmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(44.0mg,215μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(89.6μL,1.17mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6-トリメチルピリジン(170μL,1.29mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(10mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(104mg,収率99%)。
(1)2量体の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブにHO-dT-SUC-TOB(80.4mg,64.9μmol)とAc-TOB(99.6mg,104μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(37.4mg,195μmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(145mg,195μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にメタノール(39.5μL,975μmol)を加えた後、酢酸(22.3μL,390μmol)と2,4,6-トリメチルピリジン(77.0μL,585μmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(44.0mg,215μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(89.6μL,1.17mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6-トリメチルピリジン(170μL,1.29mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(10mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(104mg,収率99%)。
(2)3量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(1)で得られた2量体(104mg,64.2μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(37.5mg,195μmol)とdA-CE ホスホロアミダイト(165mg,195μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にメタノール(39.5μL,975μmol)を加えた後、酢酸(22.3μL,390μmol)と2,4,6-トリメチルピリジン(77.0μL,585μmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(44.0mg,214μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(158mg,1.07mmol)とトリフルオロ酢酸(74.7μL,975μmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。
なお、参考例2は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(1)で得られた2量体(104mg,64.2μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(37.5mg,195μmol)とdA-CE ホスホロアミダイト(165mg,195μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にメタノール(39.5μL,975μmol)を加えた後、酢酸(22.3μL,390μmol)と2,4,6-トリメチルピリジン(77.0μL,585μmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(44.0mg,214μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(158mg,1.07mmol)とトリフルオロ酢酸(74.7μL,975μmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。
なお、参考例2は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
参考例3(実施例11):反応液の調製
(1)2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO-dT-SUC-TOB(618mg,499μmol)とAc-TOB(618mg,646μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(1.11g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に酢酸(857μL,15.0mmol)とピリジン(1.82mL,22.4mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(338mg,1.65mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(344μL,4.49mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6-トリメチルピリジン(653μL,4.94mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(753mg,収率94%)。
(1)2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO-dT-SUC-TOB(618mg,499μmol)とAc-TOB(618mg,646μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(1.11g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に酢酸(857μL,15.0mmol)とピリジン(1.82mL,22.4mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(338mg,1.65mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(344μL,4.49mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6-トリメチルピリジン(653μL,4.94mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(753mg,収率94%)。
(2)3量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(1)で得られた2量体(753mg,468μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(270mg,1.40mmol)とdA-CE ホスホロアミダイト(1.20g,1.40mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に酢酸(402μL,7.01mmol)とピリジン(567μL,7.01mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(317mg,1.54mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.38g,9.35mmol)とトリフルオロ酢酸(322μL,4.21mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。
なお、参考例3は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(1)で得られた2量体(753mg,468μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(270mg,1.40mmol)とdA-CE ホスホロアミダイト(1.20g,1.40mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に酢酸(402μL,7.01mmol)とピリジン(567μL,7.01mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(317mg,1.54mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.38g,9.35mmol)とトリフルオロ酢酸(322μL,4.21mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。
なお、参考例3は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
参考例4(実施例12):反応液の調製
(1)2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO-dT-SUC-TOB(619mg,500μmol)とAc-TOB(770mg,807μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(1.12g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に酢酸(172μL,3.00mmol)とN-メチルイミダゾール(178μL,2.25mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(339mg,1.65mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(574μL,7.50mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらにN-メチルイミダゾール(653μL,8.25mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(792mg,98%)。
(1)2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO-dT-SUC-TOB(619mg,500μmol)とAc-TOB(770mg,807μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(1.12g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に酢酸(172μL,3.00mmol)とN-メチルイミダゾール(178μL,2.25mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(339mg,1.65mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(574μL,7.50mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらにN-メチルイミダゾール(653μL,8.25mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(792mg,98%)。
(2)3量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(1)で得られた2量体(792mg,492μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(284mg,1.48mmol)とdA-CE ホスホロアミダイト(1.27g,1.48mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に酢酸(169μL,2.95mmol)とN-メチルイミダゾール(175μL,2.21mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(333mg,1.62mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.45g,9.83mmol)とトリフルオロ酢酸(565μL,7.37mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。
なお、参考例4は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(1)で得られた2量体(792mg,492μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(284mg,1.48mmol)とdA-CE ホスホロアミダイト(1.27g,1.48mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に酢酸(169μL,2.95mmol)とN-メチルイミダゾール(175μL,2.21mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(333mg,1.62mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.45g,9.83mmol)とトリフルオロ酢酸(565μL,7.37mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。
なお、参考例4は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
参考例5(実施例13):反応液の調製
(1)2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO-dT-SUC-TOB(619mg,500μmol)とAc-TOB(770mg,807μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(1.12g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にメタノール(608μL,15.0mmol)を加えた後、酢酸(172μL,3.00mmol)とN-メチルイミダゾール(356μL,4.50mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(339mg,1.65mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(689μL,9.00mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらにN-メチルイミダゾール(784μL,9.90mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(779mg,収率97%)。
(1)2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO-dT-SUC-TOB(619mg,500μmol)とAc-TOB(770mg,807μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(1.12g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にメタノール(608μL,15.0mmol)を加えた後、酢酸(172μL,3.00mmol)とN-メチルイミダゾール(356μL,4.50mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(339mg,1.65mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(689μL,9.00mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらにN-メチルイミダゾール(784μL,9.90mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(779mg,収率97%)。
(2)3量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(1)で得られた2量体(779mg,483μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(279mg,1.45mmol)とdA-CE ホスホロアミダイト(1.24g,1.45mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にメタノール(588μL,14.5mmol)を加えた後、酢酸(166μL,2.90mmol)とN-メチルイミダゾール(344μL,4.35mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(328mg,1.60mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.42g,9.67mmol)とトリフルオロ酢酸(666μL,8.70mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。
なお、参考例5は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(1)で得られた2量体(779mg,483μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(279mg,1.45mmol)とdA-CE ホスホロアミダイト(1.24g,1.45mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にメタノール(588μL,14.5mmol)を加えた後、酢酸(166μL,2.90mmol)とN-メチルイミダゾール(344μL,4.35mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(328mg,1.60mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.42g,9.67mmol)とトリフルオロ酢酸(666μL,8.70mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。
なお、参考例5は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
参考例6(実施例14)および参考例13(実施例15):反応液の調製
(1)2量体の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブにHO-dT-SUC-TOB(80.3mg,65.0μmol)とAc-TOB(100mg,105μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(37.4mg,195μmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(145mg,195μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にt-ブタノール(186μL,1.95mmol)を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(44.0mg,214μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(94.6mg,642μmol)とトリフルオロ酢酸(44.7μL,584μmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6-トリメチルピリジン(84.6μL,642μmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(10mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(104mg,収率100%)。
(1)2量体の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブにHO-dT-SUC-TOB(80.3mg,65.0μmol)とAc-TOB(100mg,105μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(37.4mg,195μmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(145mg,195μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にt-ブタノール(186μL,1.95mmol)を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(44.0mg,214μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(94.6mg,642μmol)とトリフルオロ酢酸(44.7μL,584μmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6-トリメチルピリジン(84.6μL,642μmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(10mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(104mg,収率100%)。
(2)3量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(1)で得られた2量体(104mg,65.0μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(37.3mg,194μmol)とdA-CE ホスホロアミダイト(167mg,194μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。なお、この時点で得られた反応液を、参考例13の反応液として上記試験例4で使用した。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(1)で得られた2量体(104mg,65.0μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(37.3mg,194μmol)とdA-CE ホスホロアミダイト(167mg,194μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。なお、この時点で得られた反応液を、参考例13の反応液として上記試験例4で使用した。
上記のようにして得られた反応液にt-ブタノール(186μL,1.94mmol)を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(43.9mg,214μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(94.3mg,641μmol)とトリフルオロ酢酸(44.6μL,583μmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。なお、この時点で得られた反応液を、参考例6の反応液として上記試験例3で使用した。
なお、参考例6および参考例13は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
なお、参考例6および参考例13は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
参考例7(実施例16)および参考例14(実施例17):反応液の調製
(1)2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO-dT-SUC-TOB(619mg,500μmol)とAc-TOB(772mg,808μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(1.12g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にt-ブタノール(1.43mL,15.0mmol)を加えた後、酢酸(173μL,3.00mmol)と2,4,6-トリメチルピリジン(594μL,4.50mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(339mg,1.65mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(689μL,8.99mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6-トリメチルピリジン(1.31mL,9.89mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(798mg,収率99%)。
(1)2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO-dT-SUC-TOB(619mg,500μmol)とAc-TOB(772mg,808μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(1.12g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にt-ブタノール(1.43mL,15.0mmol)を加えた後、酢酸(173μL,3.00mmol)と2,4,6-トリメチルピリジン(594μL,4.50mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(339mg,1.65mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(689μL,8.99mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6-トリメチルピリジン(1.31mL,9.89mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(798mg,収率99%)。
(2)3量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(1)で得られた2量体(798mg,495μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(286mg,1.49mmol)とdA-CE ホスホロアミダイト(1.27g,1.49mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。なお、この時点で得られた反応液を、参考例14の反応液として上記試験例4で使用した。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(1)で得られた2量体(798mg,495μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(286mg,1.49mmol)とdA-CE ホスホロアミダイト(1.27g,1.49mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。なお、この時点で得られた反応液を、参考例14の反応液として上記試験例4で使用した。
上記のようにして得られた反応液にt-ブタノール(1.42mL,14.8mmol)を加えた後、酢酸(171μL,2.97mmol)と2,4,6-トリメチルピリジン(589μL,4.46mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(335mg,1.63mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.46g,9.90mmol)とトリフルオロ酢酸(569μL,7.43mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。なお、この時点で得られた反応液を、参考例7の反応液として上記試験例3で使用した。
なお、参考例7および参考例14は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
なお、参考例7および参考例14は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
参考例8(実施例18):反応液の調製
(1)2量体の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブにHO-dT-SUC-TOB(80.3g,65.0μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(37.4mg,195μmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(145mg,195μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に2-プロパノール(74.8μL,974μmol)を加えた後、酢酸(22.2μL,390μmol)と2,4,6-トリメチルピリジン(77.1μL,585μmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(44.0mg,214μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(94.6mg,643μmol)とトリフルオロ酢酸(44.7μL,584μmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6-トリメチルピリジン(84.6μL,643μmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(10mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(101mg,収率98%)。
(1)2量体の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブにHO-dT-SUC-TOB(80.3g,65.0μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(37.4mg,195μmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(145mg,195μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に2-プロパノール(74.8μL,974μmol)を加えた後、酢酸(22.2μL,390μmol)と2,4,6-トリメチルピリジン(77.1μL,585μmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(44.0mg,214μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(94.6mg,643μmol)とトリフルオロ酢酸(44.7μL,584μmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6-トリメチルピリジン(84.6μL,643μmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(10mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(101mg,収率98%)。
(2)3量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(1)で得られた2量体(101mg,63.0μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(36.3mg,189μmol)とdA-CE ホスホロアミダイト(162mg,189μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に2-プロパノール(72.5μL,944μmol)を加えた後、酢酸(10.8μL,189μmol)と2,4,6-トリメチルピリジン(37.3μL,283μmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(42.6mg,208μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(91.7mg,623μmol)とトリフルオロ酢酸(43.4μL,566μmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。
なお、参考例8は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(1)で得られた2量体(101mg,63.0μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(36.3mg,189μmol)とdA-CE ホスホロアミダイト(162mg,189μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に2-プロパノール(72.5μL,944μmol)を加えた後、酢酸(10.8μL,189μmol)と2,4,6-トリメチルピリジン(37.3μL,283μmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(42.6mg,208μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(91.7mg,623μmol)とトリフルオロ酢酸(43.4μL,566μmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。
なお、参考例8は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
参考例9(実施例19)および参考例15(実施例20):反応液の調製
(1)2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO-dT-SUC-TOB(180mg,64.9μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(37.4mg,195μmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(145mg,195μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に2,2,2-トリフルオロエタノール(140μL,1.95mmol)を加えた後、酢酸(22.3μL,390μmol)と2,4,6-トリメチルピリジン(77.0μL,585μmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(44.0mg,215μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(189mg,1.17mmol)とトリフルオロ酢酸(89.6μL,1.17mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6-トリメチルピリジン(170μL,1.29mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(10mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(104mg,収率99%)。
(1)2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO-dT-SUC-TOB(180mg,64.9μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(37.4mg,195μmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(145mg,195μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に2,2,2-トリフルオロエタノール(140μL,1.95mmol)を加えた後、酢酸(22.3μL,390μmol)と2,4,6-トリメチルピリジン(77.0μL,585μmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(44.0mg,215μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(189mg,1.17mmol)とトリフルオロ酢酸(89.6μL,1.17mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6-トリメチルピリジン(170μL,1.29mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(10mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(104mg,収率99%)。
(2)3量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(1)で得られた2量体(101mg,62.5μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(36.1mg,188μmol)とdA-CE ホスホロアミダイト(161mg,188μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。なお、この時点で得られた反応液を、参考例15の反応液として上記試験例4で使用した。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(1)で得られた2量体(101mg,62.5μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(36.1mg,188μmol)とdA-CE ホスホロアミダイト(161mg,188μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。なお、この時点で得られた反応液を、参考例15の反応液として上記試験例4で使用した。
上記のようにして得られた反応液に2,2,2-トリフルオロエタノール(134μL,1.88mmol)を加えた後、酢酸(21.5μL,376μmol)と2,4,6-トリメチルピリジン(74.3μL,564μmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(42.5mg,207μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(147mg,1.00mmol)とトリフルオロ酢酸(72.0μL,910μmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。なお、この時点で得られた反応液を、参考例9の反応液として上記試験例3で使用した。
なお、参考例9および参考例15は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
なお、参考例9および参考例15は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
参考例10:反応液の調製
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブにHO-dA-SUC-TOB(182mg,60.5μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(35.0mg,182μmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(135mg,182μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に2,2,2-トリフルオロエタノール(65.3μL,910μmol)を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(41.1mg,200μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(88.4mg,600μmol)とトリフルオロ酢酸(41.8μL,546μmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブにHO-dA-SUC-TOB(182mg,60.5μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(35.0mg,182μmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(135mg,182μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に2,2,2-トリフルオロエタノール(65.3μL,910μmol)を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(41.1mg,200μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(88.4mg,600μmol)とトリフルオロ酢酸(41.8μL,546μmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。
参考例11:反応液の調製
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブにHO-dA-SUC-TOB(182mg,60.5μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(35.0mg,182μmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(135mg,182μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にt-ブタノール(87.0μL,910μmol)を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(41.1mg,200μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(88.4mg,600μmol)とトリフルオロ酢酸(41.8μL,546μmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブにHO-dA-SUC-TOB(182mg,60.5μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(35.0mg,182μmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(135mg,182μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にt-ブタノール(87.0μL,910μmol)を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(41.1mg,200μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(88.4mg,600μmol)とトリフルオロ酢酸(41.8μL,546μmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。
参考例12(実施例21):反応液の調製
(1)2量体の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブにHO-dT-SUC-TOB(80.3mg,65.0μmol)とAc-TOB(100mg,105μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(37.4mg,195μmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(145mg,195μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に2,2,2-トリフルオロエタノール(69.6μL,973μmol)を加えた後、DDTT(44.0mg,214μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(94.6mg,642μmol)とトリフルオロ酢酸(44.7μL,584μmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6-トリメチルピリジン(84.6μL,642μmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(10mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(98.3mg,収率94%)。
(1)2量体の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブにHO-dT-SUC-TOB(80.3mg,65.0μmol)とAc-TOB(100mg,105μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(37.4mg,195μmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(145mg,195μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に2,2,2-トリフルオロエタノール(69.6μL,973μmol)を加えた後、DDTT(44.0mg,214μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(94.6mg,642μmol)とトリフルオロ酢酸(44.7μL,584μmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6-トリメチルピリジン(84.6μL,642μmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(10mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(98.3mg,収率94%)。
(2)3量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(1)で得られた2量体(98.3mg,61.0μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(35.2mg,183μmol)とdA-CE ホスホロアミダイト(157mg,183μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。
なお、参考例12は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(1)で得られた2量体(98.3mg,61.0μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(35.2mg,183μmol)とdA-CE ホスホロアミダイト(157mg,183μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。
なお、参考例12は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
参考例16(実施例22):ホスホロチオエート10量体(配列番号2:5’-GACATGCATT-3’)の液中連続合成
(1)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO-dT-SUC-TOB(619mg,500μmol)とAc-TOB(619mg,648μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(1.12g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にメタノール(608μL,15.0mmol)を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(340mg,1.65mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(345μL,4.50mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6-トリメチルピリジン(654μL,4.95mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(762mg,収率95%)。
(1)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO-dT-SUC-TOB(619mg,500μmol)とAc-TOB(619mg,648μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(1.12g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にメタノール(608μL,15.0mmol)を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(340mg,1.65mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(345μL,4.50mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6-トリメチルピリジン(654μL,4.95mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(762mg,収率95%)。
(2)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート9量体の合成
上記(1)と同様の操作をさらに7回繰返して、9量体(N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホリル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を得た(2.03g)。
上記(1)と同様の操作をさらに7回繰返して、9量体(N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホリル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を得た(2.03g)。
(3)3’位水酸基がアンカーで保護され、5’位水酸基がDMTr基で保護されたホスホロチオエート10量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(2)の9量体(2.03g)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(2.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(228mg,1.19mmol)とdG-CE ホスホロアミダイト(1.00g,1.19mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。DDTT(338mg,1.64mmol)を加え、室温で30分間撹拌した後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過後、乾燥して、10量体(5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を白色固体として得た(2.28g)。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(2)の9量体(2.03g)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(2.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(228mg,1.19mmol)とdG-CE ホスホロアミダイト(1.00g,1.19mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。DDTT(338mg,1.64mmol)を加え、室温で30分間撹拌した後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過後、乾燥して、10量体(5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を白色固体として得た(2.28g)。
(4)脱保護
上記(3)で得られた10量体(20mg)と30重量%アンモニア水(5.00mL)の混合物をオートクレーブに入れて、55℃で16時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物であるデオキシグアニジル-[3’→5’]-デオキシアデニリル-[3’→5’]-デオキシシチジニル-[3’→5’]-デオキシアデニリル-[3’→5’]-デオキシチミジニル-[3’→5’]-デオキシグアニジル-[3’→5’]-デオキシシチジニル-[3’→5’]-デオキシアデニリル-[3’→5’]-デオキシチミジニル-[3’→5’]-デオキシチミジンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0-10min;5 to 60%、λ=260nm):Rt=6.61、6.75min(41.3+41.3%);
TOF/MS:3471.489
なお、参考例16は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
上記(3)で得られた10量体(20mg)と30重量%アンモニア水(5.00mL)の混合物をオートクレーブに入れて、55℃で16時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物であるデオキシグアニジル-[3’→5’]-デオキシアデニリル-[3’→5’]-デオキシシチジニル-[3’→5’]-デオキシアデニリル-[3’→5’]-デオキシチミジニル-[3’→5’]-デオキシグアニジル-[3’→5’]-デオキシシチジニル-[3’→5’]-デオキシアデニリル-[3’→5’]-デオキシチミジニル-[3’→5’]-デオキシチミジンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0-10min;5 to 60%、λ=260nm):Rt=6.61、6.75min(41.3+41.3%);
TOF/MS:3471.489
なお、参考例16は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
参考例17(実施例23):ホスホロチオエート10量体(配列番号2:5’-GACATGCATT-3’)の液中連続合成
(1)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO-dT-SUC-TOB(619mg,500μmol)とAc-TOB(619mg,648μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(2.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(1.12g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にメタノール(608μL,15.0mmol)を加え、室温で15分間撹拌した。その後、別途調製した酢酸(172μL,3.00mmol)と2,4,6-トリメチルピリジン(595μL,4.50mmol)の混合物を加え、さらにDDTT(339mg,1.65mmol)を加えて室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(689μL,9.00mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。2,4,6-トリメチルピリジン(654μL,4.95mmol)を加えて中和し、アセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(765mg,収率95%)。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO-dT-SUC-TOB(619mg,500μmol)とAc-TOB(619mg,648μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(2.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(1.12g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にメタノール(608μL,15.0mmol)を加え、室温で15分間撹拌した。その後、別途調製した酢酸(172μL,3.00mmol)と2,4,6-トリメチルピリジン(595μL,4.50mmol)の混合物を加え、さらにDDTT(339mg,1.65mmol)を加えて室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(689μL,9.00mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。2,4,6-トリメチルピリジン(654μL,4.95mmol)を加えて中和し、アセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(765mg,収率95%)。
(2)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート9量体の合成
上記(1)と同様の操作をさらに7回繰返して、9量体(N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を得た(2.18g)。
上記(1)と同様の操作をさらに7回繰返して、9量体(N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を得た(2.18g)。
(3)3’位水酸基がアンカーで保護され、5’位水酸基がDMTr基で保護されたホスホロチオエート10量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(2)で得られた9量体(2.18g)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(2.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(272mg,1.42mmol)とdG-CE ホスホロアミダイト(1.19g,1.42mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。DDTT(320mg,1.56mmol)を加え、室温で30分間撹拌した後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過後、乾燥して、10量体(5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホリル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を白色固体として得た(2.39g)。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(2)で得られた9量体(2.18g)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(2.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(272mg,1.42mmol)とdG-CE ホスホロアミダイト(1.19g,1.42mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。DDTT(320mg,1.56mmol)を加え、室温で30分間撹拌した後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過後、乾燥して、10量体(5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホリル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を白色固体として得た(2.39g)。
(4)脱保護
上記(3)で得られた10量体(20mg)と30重量%アンモニア水(5.00mL)の混合物をオートクレーブに入れて、55℃で16時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物であるデオキシグアニジル-[3’→5’]-デオキシアデニリル-[3’→5’]-デオキシシチジニル-[3’→5’]-デオキシアデニリル-[3’→5’]-デオキシチミジニル-[3’→5’]-デオキシグアニジル-[3’→5’]-デオキシシチジニル-[3’→5’]-デオキシアデニリル-[3’→5’]-デオキシチミジニル-[3’→5’]-デオキシチミジンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0-10min;5 to 60%、λ=260nm):Rt=7.06、7.19min(41.1+42.3%);
TOF/MS:3471.49
なお、参考例17は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
上記(3)で得られた10量体(20mg)と30重量%アンモニア水(5.00mL)の混合物をオートクレーブに入れて、55℃で16時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物であるデオキシグアニジル-[3’→5’]-デオキシアデニリル-[3’→5’]-デオキシシチジニル-[3’→5’]-デオキシアデニリル-[3’→5’]-デオキシチミジニル-[3’→5’]-デオキシグアニジル-[3’→5’]-デオキシシチジニル-[3’→5’]-デオキシアデニリル-[3’→5’]-デオキシチミジニル-[3’→5’]-デオキシチミジンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0-10min;5 to 60%、λ=260nm):Rt=7.06、7.19min(41.1+42.3%);
TOF/MS:3471.49
なお、参考例17は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
参考例18(実施例24):ホスホロチオエート10量体(配列番号2:5’-GACATGCATT-3’)の液中連続合成
(1)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO-dT-SUC-TOB(617.5mg,499μmol)とAc-TOB(619mg,648μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(1.12g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に別途調製した酢酸(857μL,15.0mmol)と脱水ピリジン(1.82mL,22.5mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(338mg,1.65mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(345μL,4.50mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6-トリメチルピリジン(653μL,4.94mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(753mg,収率94%)。
(1)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO-dT-SUC-TOB(617.5mg,499μmol)とAc-TOB(619mg,648μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(1.12g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に別途調製した酢酸(857μL,15.0mmol)と脱水ピリジン(1.82mL,22.5mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(338mg,1.65mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(345μL,4.50mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6-トリメチルピリジン(653μL,4.94mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(753mg,収率94%)。
(2)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート9量体の合成
上記(1)と同様の操作をさらに7回繰返して、9量体(N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を得た(1.41g)。
上記(1)と同様の操作をさらに7回繰返して、9量体(N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を得た(1.41g)。
(3)3’位水酸基がアンカーで保護され、5’位水酸基がDMTr基で保護されたホスホロチオエート10量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(2)で得られた9量体(1.41g)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(2.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(159mg,829μmol)とdG-CE ホスホロアミダイト(696mg,829μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。DDTT(187mg,912μmol)を加え、室温で30分間撹拌した後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過後、乾燥して、10量体(5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を白色固体として得た(1.51g)。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(2)で得られた9量体(1.41g)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(2.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(159mg,829μmol)とdG-CE ホスホロアミダイト(696mg,829μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。DDTT(187mg,912μmol)を加え、室温で30分間撹拌した後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過後、乾燥して、10量体(5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を白色固体として得た(1.51g)。
(4)脱保護
上記(3)で得られた10量体(20mg)と30重量%アンモニア水(5.00mL)の混合物をオートクレーブに入れて、55℃で16時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物であるデオキシグアニジル-[3’→5’]-デオキシアデニリル-[3’→5’]-デオキシシチジニル-[3’→5’]-デオキシアデニリル-[3’→5’]-デオキシチミジニル-[3’→5’]-デオキシグアニジル-[3’→5’]-デオキシシチジニル-[3’→5’]-デオキシアデニリル-[3’→5’]-デオキシチミジニル-[3’→5’]-デオキシチミジンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0-10min;5 to 60%、λ=260nm):Rt=7.32、7.47min(40.3area%+39.7area%);TOF/MS:3471.493
なお、参考例18は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
上記(3)で得られた10量体(20mg)と30重量%アンモニア水(5.00mL)の混合物をオートクレーブに入れて、55℃で16時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物であるデオキシグアニジル-[3’→5’]-デオキシアデニリル-[3’→5’]-デオキシシチジニル-[3’→5’]-デオキシアデニリル-[3’→5’]-デオキシチミジニル-[3’→5’]-デオキシグアニジル-[3’→5’]-デオキシシチジニル-[3’→5’]-デオキシアデニリル-[3’→5’]-デオキシチミジニル-[3’→5’]-デオキシチミジンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0-10min;5 to 60%、λ=260nm):Rt=7.32、7.47min(40.3area%+39.7area%);TOF/MS:3471.493
なお、参考例18は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
参考例19(実施例25):ホスホロチオエート10量体(配列番号2:5’-GACATGCATT-3’)の液中連続合成
(1)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO-dT-SUC-TOB(619mg,500μmol)とAc-TOB(619mg,648μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(2.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(1.12g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に2,2,2-トリフルオロエタノール(1.09mL,15.0mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した。その後、別途調製した酢酸(172μL,3.00mmol)と2,4,6-トリメチルピリジン(595μL,4.50mmol)の混合物を加え、さらにDDTT(339mg,1.65mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(345μL,4.50mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6-トリメチルピリジン(653μL,4.94mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(788mg,収率98%)。
(1)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO-dT-SUC-TOB(619mg,500μmol)とAc-TOB(619mg,648μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(2.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(1.12g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に2,2,2-トリフルオロエタノール(1.09mL,15.0mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した。その後、別途調製した酢酸(172μL,3.00mmol)と2,4,6-トリメチルピリジン(595μL,4.50mmol)の混合物を加え、さらにDDTT(339mg,1.65mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(345μL,4.50mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6-トリメチルピリジン(653μL,4.94mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(788mg,収率98%)。
(2)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート9量体の合成
上記(1)と同様の操作をさらに7回繰返して、9量体(N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を得た(1.97g)。
上記(1)と同様の操作をさらに7回繰返して、9量体(N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を得た(1.97g)。
(3)3’位水酸基がアンカーで保護され、5’位水酸基がDMTr基で保護されたホスホロチオエート10量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(2)の化合物(1.97g)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(2.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(222mg,1.16mmol)とdG-CE ホスホロアミダイト(972mg,1.16mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。DDTT(261mg,1.27mmol)を加え、室温で30分間撹拌した後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過後、乾燥して、10量体(5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を白色固体として得た(2.21g)。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(2)の化合物(1.97g)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(2.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(222mg,1.16mmol)とdG-CE ホスホロアミダイト(972mg,1.16mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。DDTT(261mg,1.27mmol)を加え、室温で30分間撹拌した後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過後、乾燥して、10量体(5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を白色固体として得た(2.21g)。
(4)脱保護
上記(3)で得られた10量体(20mg)と30重量%アンモニア水(5.00mL)の混合物をオートクレーブに入れて、55℃で16時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物であるデオキシグアニジル-[3’→5’]-デオキシアデニリル-[3’→5’]-デオキシシチジニル-[3’→5’]-デオキシアデニリル-[3’→5’]-デオキシチミジニル-[3’→5’]-デオキシグアニジル-[3’→5’]-デオキシシチジニル-[3’→5’]-デオキシアデニリル-[3’→5’]-デオキシチミジニル-[3’→5’]-デオキシチミジンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0-10min;5 to 60%、λ=260nm):Rt=7.36、7.48min(48.8area%+44.8area%);TOF/MS:3471.495
なお、参考例19は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
上記(3)で得られた10量体(20mg)と30重量%アンモニア水(5.00mL)の混合物をオートクレーブに入れて、55℃で16時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物であるデオキシグアニジル-[3’→5’]-デオキシアデニリル-[3’→5’]-デオキシシチジニル-[3’→5’]-デオキシアデニリル-[3’→5’]-デオキシチミジニル-[3’→5’]-デオキシグアニジル-[3’→5’]-デオキシシチジニル-[3’→5’]-デオキシアデニリル-[3’→5’]-デオキシチミジニル-[3’→5’]-デオキシチミジンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0-10min;5 to 60%、λ=260nm):Rt=7.36、7.48min(48.8area%+44.8area%);TOF/MS:3471.495
なお、参考例19は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
参考例20(実施例26):ホスホロチオエート10量体(配列番号2:5’-GACATGCATT-3’)の液中連続合成
(1)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO-dT-SUC-TOB(619mg,500μmol)とAc-TOB(619mg,648μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(2.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(1.12g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にt-ブタノール(1.43mL,15.0mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した。その後、別途調製した酢酸(173μL,3.00mmol)と2,4,6-トリメチルピリジン(594μL,4.50mmol)の混合物を加え、さらにDDTT(339mg,1.65mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(689μL,8.99mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6-トリメチルピリジン(1.31mL,9.89mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(798mg,収率99%)。
(1)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO-dT-SUC-TOB(619mg,500μmol)とAc-TOB(619mg,648μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(2.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT-CE ホスホロアミダイト(1.12g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にt-ブタノール(1.43mL,15.0mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した。その後、別途調製した酢酸(173μL,3.00mmol)と2,4,6-トリメチルピリジン(594μL,4.50mmol)の混合物を加え、さらにDDTT(339mg,1.65mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5-メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(689μL,8.99mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6-トリメチルピリジン(1.31mL,9.89mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(798mg,収率99%)。
(2)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート9量体の合成
上記(1)と同様の操作をさらに7回繰返して、9量体(N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を得た(1.93g)。
上記(1)と同様の操作をさらに7回繰返して、9量体(N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を得た(1.93g)。
(3)3’位水酸基がアンカーで保護され、5’位水酸基がDMTr基で保護されたホスホロチオエート10量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(2)で得られた9量体(1.93g)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(2.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(218mg,1.13mmol)とdG-CE ホスホロアミダイト(950mg,1.13mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。DDTT(256mg,1.23mmol)を加え、室温で30分間撹拌した後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過後、乾燥して、10量体(5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホリル-デオキシチミジン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を白色固体として得た(2.14g)。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(2)で得られた9量体(1.93g)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(2.0mL)に溶かして調製した5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(218mg,1.13mmol)とdG-CE ホスホロアミダイト(950mg,1.13mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。DDTT(256mg,1.23mmol)を加え、室温で30分間撹拌した後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過後、乾燥して、10量体(5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N2-イソブチリル-デオキシグアノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-(2-ヘキシル)デカノイル-デオキシシチジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N6-ベンゾイル-デオキシアデノシン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン 3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホリル-デオキシチミジン 3’-イル 3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を白色固体として得た(2.14g)。
(4)脱保護
上記(3)で得られた10量体(20mg)と30重量%アンモニア水(5.00mL)の混合物をオートクレーブに入れて、55℃で16時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物であるデオキシグアニジル-[3’→5’]-デオキシアデニリル-[3’→5’]-デオキシシチジニル-[3’→5’]-デオキシアデニリル-[3’→5’]-デオキシチミジニル-[3’→5’]-デオキシグアニジル-[3’→5’]-デオキシシチジニル-[3’→5’]-デオキシアデニリル-[3’→5’]-デオキシチミジニル-[3’→5’]-デオキシチミジンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0-10min;5 to 60%、λ=260nm):Rt=6.95、7.08min(44.3area%+42.7area%);TOF/MS:3471.493
なお、参考例20は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
上記(3)で得られた10量体(20mg)と30重量%アンモニア水(5.00mL)の混合物をオートクレーブに入れて、55℃で16時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物であるデオキシグアニジル-[3’→5’]-デオキシアデニリル-[3’→5’]-デオキシシチジニル-[3’→5’]-デオキシアデニリル-[3’→5’]-デオキシチミジニル-[3’→5’]-デオキシグアニジル-[3’→5’]-デオキシシチジニル-[3’→5’]-デオキシアデニリル-[3’→5’]-デオキシチミジニル-[3’→5’]-デオキシチミジンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0-10min;5 to 60%、λ=260nm):Rt=6.95、7.08min(44.3area%+42.7area%);TOF/MS:3471.493
なお、参考例20は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
実施例27:ホスホロチオエート2量体(5’-TT-3’)の合成
(1)5’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート単量体の合成
(1)5’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート単量体の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブにHO-(CH2)2-SUC-TOB(84.6mg,80μmol)、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル 2,2-ジメチルプロパノエート(84.6mg,84.8μmol)、およびdT-5’-CE ホスホロアミダイト(179mg,240μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(4.0mL)および脱水アセトニトリル(0.4mL)の混合溶媒に溶解させた。得られた溶液に、5-エチルチオ-1H-テトラゾール(31.2mg,240μmol)を加えて、室温で1時間撹拌した。反応液に、2,2,2-トリフルオロエタノール(87.4μL,1.20mmol)を加え、室温で30分間撹拌した後、2,6-ジメチルアニリン(152μL,1.236mmol)、DDTT(51.7mg,252μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。さらに2,3-ジメチルフラン(127μL,1.20mmol)を加えた後、脱水ジクロロメタン(368μL)に溶解したトリフルオロ酢酸(184μL,2.40mmol)の溶液を滴下しながら加え、室温で1時間撹拌した。2,4,6-トリメチルピリジン(666μL,5.04mmol)を添加して、中和した後、反応液にアセトニトリル(17mL)を添加し、析出した固体を濾過し、乾燥して、単量体(5’-{[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]スクシニルオキシ-エチル-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル}-デオキシチミジン)を白色固体として得た(106mg,収率92%)。
(2)5’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブに上記(1)で得られた単量体(85.9mg,60.0μmol)、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル 2,2-ジメチルプロパノエート(63.4mg,63.5μmol)、およびdT-5’-CE ホスホロアミダイト(134mg,180μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)および脱水アセトニトリル(0.3mL)の混合溶媒に溶解させた。得られた溶液に5-エチルチオ-1H-テトラゾール(23.4mg,180μmol)を加えて、室温で1時間撹拌した。反応液に、2,2,2-トリフルオロエタノール(65.6μL,900μmol)を加え、室温で30分撹拌した後、2,6-ジメチルアニリン(114μL,927μmol)、DDTT(38.8mg,189μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。2,3-ジメチルフラン(94.9μL,900μmol)を加えた後、脱水ジクロロメタン(276μL)に溶解したトリフルオロ酢酸(138μL,1.80mmol)の溶液を反応液に滴下し、室温で1時間撹拌した。2,4,6-トリメチルピリジン(500μL,3.78mmol)を加えた後、反応液にアセトニトリル(13mL)を添加し、析出した固体を濾過し、乾燥して、2量体(5’-{[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]スクシニルオキシ-エチル-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル}-デオキシチミジン)を白色固体として得た(107mg,収率99%)。
(3)脱保護
上記(2)で得られた2量体(3.01mg)と30重量%アンモニア水(5.0mL)の混合物をオートクレーブに入れて、65℃で4時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物である5’-[O-(2-ヒドロキシエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン-3’-ホスホロチオニル-デオキシチミジンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0-10min;5 to 30%、λ=260nm):Rt=1.49min(99.3area%);TOF/MS:702.09
上記(2)で得られた2量体(3.01mg)と30重量%アンモニア水(5.0mL)の混合物をオートクレーブに入れて、65℃で4時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物である5’-[O-(2-ヒドロキシエチル)]ホスホロチオニル-デオキシチミジン-3’-ホスホロチオニル-デオキシチミジンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0-10min;5 to 30%、λ=260nm):Rt=1.49min(99.3area%);TOF/MS:702.09
実施例28:縮合後のクエンチ(工程(2))を行わない液中連続合成
(1)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
(1)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブに2’-O-メチル-ウリジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート(104mg,83.3μmol)、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル 2,2-ジメチルプロパノエート(105mg,106μmol)、およびCm(Bz)-CE ホスホロアミダイト(216mg,250μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(4.2mL)および脱水アセトニトリル(0.4mL)の混合溶媒に溶解させた。得られた溶液に、5-エチルチオ-1H-テトラゾール(32.6mg,250μmol)を加えて、室温で1時間撹拌した。反応液に2,6-ジメチルアニリン(78.8μL,639μmol)、DDTT(53.8mg,263μmol)を加えて、室温で1時間撹拌した。2,3-ジメチルフラン(132μL,1.25mmol)を加えた後、脱水ジクロロメタン(255μL)に溶解したトリフルオロ酢酸(191μL,2.50mmol)の溶液を滴下しながら加え、室温で1時間撹拌した。反応液に2,4,6-トリメチルピリジン(463μL,3.50mmol)を加えた後、アセトニトリル(18mL)を添加し、析出した固体を濾過し、乾燥して、2量体(N4-ベンゾイル-2’-O-メチル-シチジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-2’-O-メチル-ウリジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(140mg,収率96%)。
(2)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート3量体の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブに上記(1)で得られた2量体(130mg,74.5μmol)、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル 2,2-ジメチルプロパノエート(94.5mg,94.8μmol)、およびCm(Bz)-CE ホスホロアミダイト(186mg,224μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(4.2mL)および脱水アセトニトリル(0.4mL)の混合溶媒に溶解させた。得られた溶液に、5-エチルチオ-1H-テトラゾール(29.2mg,224μmol)を加えて、室温で1時間撹拌した。反応液に2,6-ジメチルアニリン(78.8μL,639μmol)、DDTT(48.3mg,235μmol)を加えて、室温で1時間撹拌した。2,3-ジメチルフラン(118μL,1.12mmol)を加えた後、脱水ジクロロメタン(255μL)に溶解したトリフルオロ酢酸(172μL,2.24mmol)の溶液を滴下しながら加え、室温で1時間撹拌した。反応液に2,4,6-トリメチルピリジン(463μL,3.50mmol)を加えた後、アセトニトリル(18mL)を添加し、析出した固体を濾過し、乾燥して、3量体(N4-ベンゾイル-2’-O-メチル-シチジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-ベンゾイル-2’-O-メチル-シチジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル-N4-ベンゾイル-2’-O-メチル-ウリジン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(153mg,収率92%)。
(3)脱保護
上記(2)で得られた3量体(3.01mg)と30重量%アンモニア水(5.0mL)の混合物をオートクレーブに入れて、65℃で4時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物である2’-O-メチル-シチジン-3’-ホスホロチオニル-2’-O-メチル-シチジン-3’-ホスホロチオニル-2’-O-メチル-ウリジンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0-10min;5 to 30%、λ=260nm):Rt=1.72、1.98min(47.9+50.6area%);TOF/MS:928.11
上記(2)で得られた3量体(3.01mg)と30重量%アンモニア水(5.0mL)の混合物をオートクレーブに入れて、65℃で4時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物である2’-O-メチル-シチジン-3’-ホスホロチオニル-2’-O-メチル-シチジン-3’-ホスホロチオニル-2’-O-メチル-ウリジンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0-10min;5 to 30%、λ=260nm):Rt=1.72、1.98min(47.9+50.6area%);TOF/MS:928.11
実施例29:ホスホロチオエート4量体(5’-TAGT-3’)の液中連続合成
(1)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
(1)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブにデオキシチミジン-3’-イル-N-[2,3,4-トリス(オクタデシルオキシ)ベンズヒドリル]スクシナメート(49.8mg,37.9μmol)、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル 2,2-ジメチルプロパノエート(49.8mg,49.9μmol)、およびGMOE(iBu)-CE ホスホロアミダイト(104mg,114μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(1.9mL)および脱水アセトニトリル(0.6mL)の混合溶媒に溶解させた。得られた溶液に、5-エチルチオ-1H-テトラゾール(14.8mg,114μmol)を加えて、室温で1.5時間撹拌した。反応液に、2,2,2-トリフルオロエタノール(41.4μL,570μmol)を加えて、室温で30分間撹拌した後、2,6-ジメチルアニリン(72.2μL,586μmol)およびDDTT(24.5mg,119μmol)を加えて、室温で1時間撹拌した。さらに、2,3-ジメチルフラン(60.0μL,570μmol)を加えた後、脱水ジクロロメタン(174μL)に溶解したトリフルオロ酢酸(87.1μL,1.14mmol)の溶液を滴下しながら加え、室温で1時間撹拌した。2,4,6-トリメチルピリジン(316μL,2.39mmol)で中和した後、反応液にアセトニトリル(8.0mL)を添加し、析出した固体を濾過し、乾燥して、2量体(N2-イソブチリル-2’-O-メトキシエチル-グアノシン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-N-[2,3,4-トリス(オクタデシルオキシ)ベンズヒドリル]スクシナメート)を白色固体として得た(69.9mg,収率99%)。
(2)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート3量体の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブに上記(1)で得られた2量体(63.5mg,34.2μmol)および3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル 2,2-ジメチルプロパノエート(44.9mg,45.0μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(1.7mL)および脱水アセトニトリル(0.5mL)の混合溶媒に溶解させた後、AMOE(Bz)-CE ホスホロアミダイト(112mg,120μmol)と5-エチルチオ-1H-テトラゾール(15.6mg,120μmol)を加えて、室温で1時間撹拌した。反応液に、2,2,2-トリフルオロエタノール(43.6μL,595μmol)を加えて、室温で30分間撹拌した後、2,6-ジメチルアニリン(75.9μL,571μmol)およびDDTT(25.8mg,126μmol)を加えて、室温で1時間撹拌した。2,3-ジメチルフラン(63.1μL,595μmol)を加えた後、脱水ジクロロメタン(183μL)に溶解したトリフルオロ酢酸(91.7μL,1.20mmol)の溶液を滴下しながら加えた後、室温で1時間撹拌した。2,4,6-トリメチルピリジン(332μL,2.51mmol)で中和した後、反応液にアセトニトリル(8.0mL)を添加し、析出した固体を濾過し、乾燥して、3量体(N6-ベンゾイル-2’O-メトキシエチル-アデノシン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル N2-イソブチリル-2’-O-メトキシエチル-グアノシン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-N-[2,3,4-トリス(オクタデシルオキシ)ベンズヒドリル]スクシナメート)を白色固体として得た(69.9mg,収率85%)。
(3)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート4量体の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブに上記(2)で得られた3量体(62.7mg,26.0μmol)および3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル 2,2-ジメチルプロパノエート(34.0mg,34.1μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(1.3mL)および脱水アセトニトリル(0.4mL)の混合溶媒に溶解させた後、TMOE-CE ホスホロアミダイト(63.8mg,78.0μmol)および5-エチルチオ-1H-テトラゾール(10.1mg,78.0μmol)を加えて、室温で1時間撹拌した。反応液に、2,2,2-トリフルオロエタノール(28.4μL,390μmol)を加え、室温で30分間撹拌した後、2,6-ジメチルアニリン(49.4μL,401μmol)およびDDTT(16.8mg,82.0μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。2,3-ジメチルフラン(41.0μL,390μmol)を加えた後、脱水ジクロロメタン(119μL)に溶解したトリフルオロ酢酸(59.6μL,780μmol)の溶液を滴下しながら加え、室温で1時間撹拌した。2,4,6-トリメチルピリジン(216μL,1.64mmol)、水(2μL)を加え、室温で1時間撹拌した後、反応液にアセトニトリル(6mL)を添加し、析出した固体を濾過し、乾燥して、4量体(2’-O-メトキシエチル-チミジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル N6-ベンゾイル-2’-O-メトキシエチル-アデノシン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル N2-イソブチリル-2’-O-メトキシエチル-グアノシン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン-3’-イル-N-[2,3,4-トリス(オクタデシルオキシ)ベンズヒドリル]スクシナメート)を白色固体として得た(58.9mg,収率79.2%)。
(4)脱保護
上記(3)で得られた4量体(3.10mg)と30重量%アンモニア水(5.0mL)の混合物をオートクレーブに入れて、65℃で4時間加熱した後、氷浴にて冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物である2’-O-メトキシエチル-チミジン-3’-ホスホロチオニル-2’-O-メトキシエチル-アデノシン-3’-ホスホロチオニル-2’-O-メトキシエチル-グアノシン-3’-ホスホロチオニル-デオキシチミジンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0-10min;5 to 30%、λ=260nm):Rt=4.42,4.49min(31.0+66.7area%);TOF/MS:1458.30
上記(3)で得られた4量体(3.10mg)と30重量%アンモニア水(5.0mL)の混合物をオートクレーブに入れて、65℃で4時間加熱した後、氷浴にて冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物である2’-O-メトキシエチル-チミジン-3’-ホスホロチオニル-2’-O-メトキシエチル-アデノシン-3’-ホスホロチオニル-2’-O-メトキシエチル-グアノシン-3’-ホスホロチオニル-デオキシチミジンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0-10min;5 to 30%、λ=260nm):Rt=4.42,4.49min(31.0+66.7area%);TOF/MS:1458.30
実施例30:核酸塩基部がアンカーで保護された原料を用いた3量体の合成
(1)核酸塩基部がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
(1)核酸塩基部がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブにN4-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]スクシニル-3’-O-(1,1-ジメチルエチル)ジメチルシリル-デオキシシチジン(100mg,80.0μmol)、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル 2,2-ジメチルプロパノエート(100mg,100μmol)、および2’F-U-CE ホスホロアミダイト(180mg,240μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(4.0mL)および脱水アセトニトリル(0.4mL)の混合溶媒に溶解させた。得られた溶液に、5-エチルチオ-1H-テトラゾール(31.2mg,240μmol)を加えて、室温で1時間撹拌した後、反応液に2,2,2-トリフルオロエタノール(87.4μL,1.20mmol)を加えて、室温で30分間撹拌した後、2,6-ジメチルアニリン(152μL,1.24mmol)、DDTT(51.7mg,252μmol)を加えて、室温で1時間撹拌した。さらに2,3-ジメチルフラン(127μL,1.20mmol)を加えた後、脱水ジクロロメタン(368μL)中に溶解したトリフルオロ酢酸(184μL,2.40mmol)および2,6-ジメチルアニリン(3.0μL,20μmol)の混合溶液を滴下しながら加え、室温で1時間撹拌した。反応液に2,4,6-トリメチルピリジン(666μL,5.04mmol)を加えた後、アセトニトリル(17mL)を添加し、析出した固体を濾過し、乾燥して、2量体(2’-フルオロ-ウリジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル N4-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]スクシニル-3’-O-(1,1-ジメチルエチル)ジメチルシリル-デオキシシチジン)を白色固体として得た(127mg,収率98%)。
(2)核酸塩基部がアンカーで保護されたホスホロチオエート3量体の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブに上記(1)で得られた2量体(114mg,70.0μmol)、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル 2,2-ジメチルプロパノエート(87.5mg,87.7μmol)および2’F-G-CE ホスホロアミダイト(180mg,210μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.5mL)および脱水アセトニトリル(0.3mL)の混合溶媒に溶解させた。得られた溶液に、5-エチルチオ-1H-テトラゾール(27.3mg,210μmol)を加えて、室温で1時間撹拌した。反応液に、2,2,2-トリフルオロエタノール(76.5μL,1.05mmol)を加え、室温で30分間撹拌した後、2,6-ジメチルアニリン(133μL,1.08mmol)、DDTT(45.3mg,220μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。さらに2,3-ジメチルフラン(111μL,1.05mmol)を加え、脱水ジクロロメタン(321μL)に溶解したトリフルオロ酢酸(161μL,2.10mmol)および2,6-ジメチルアニリン(2.6μL,20μmol)の混合溶液を滴下しながら加え、室温で1時間撹拌した。反応液に2,4,6-トリメチルピリジン(583μL,4.41mmol)を加えた後、アセトニトリル(15mL)を添加し、析出した固体を濾過し、乾燥して、3量体(N2-イソブチリル-2’-フルオロ-グアノシン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル 2’-フルオロ-ウリジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル N4-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]スクシニル-3’-O-(1,1-ジメチルエチル)ジメチルシリル-デオキシシチジン)を白色固体として得た(139mg,収率94%)。
10mLシュレンクチューブに上記(2)で得られた2量体(110mg,50.0μmol)および3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル 2,2-ジメチルプロパノエート(62.5mg,62.6μmol)を入れ、ジクロロメタン(2.0mL)およびテトラヒドロフラン(4.0mL)の混合溶媒に溶解させた。得られた溶液に、トリエチルアミントリヒドロフルオリド(196μL,1.20mmol)およびピリジン(193μL,2.40mmol)を加えて、室温で16時間撹拌した。反応液にアセトニトリル(20mL)を添加し、析出した固体を濾過し、乾燥して、3量体(N2-イソブチリル-2’-フルオロ-グアノシン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル 2’-フルオロ-ウリジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル N4-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]スクシニル-デオキシシチジン)を白色固体として得た(100mg,収率96%)。
(4)脱保護
上記(3)でで得られた3量体(3.12mg)と30重量%アンモニア水(5.0mL)の混合物をオートクレーブに入れて、65℃で4時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物である2’-フルオロ-グアノシン-3’-ホスホロチオニル-2’-フルオロ-ウリジン-3’-ホスホロチオニル-デオキシシチジンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0-10min;5 to 30%、λ=260nm):Rt=1.15、1.40min(11.2+85.1area%);TOF/MS:914.11
上記(3)でで得られた3量体(3.12mg)と30重量%アンモニア水(5.0mL)の混合物をオートクレーブに入れて、65℃で4時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物である2’-フルオロ-グアノシン-3’-ホスホロチオニル-2’-フルオロ-ウリジン-3’-ホスホロチオニル-デオキシシチジンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0-10min;5 to 30%、λ=260nm):Rt=1.15、1.40min(11.2+85.1area%);TOF/MS:914.11
実施例31:ホスホロチオエート3量体の合成
(1)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
(1)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブにN6-[1-(ジメチルアミノ)エチリデン]-デオキシアデノシン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート(105mg,80.0μmol)、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル 2,2-ジメチルプロパノエート(105mg,106μmol)、およびU-CE ホスホロアミダイト(183mg,240μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(4.0mL)および脱水アセトニトリル(0.4mL)の混合溶媒に溶解させた。得られた溶液に、5-エチルチオ-1H-テトラゾール(31.2mg,240μmol)を加えて、室温で1時間撹拌した。反応液に、2,2,2-トリフルオロエタノール(87.4μL,1.20mmol)を加え、室温で30分撹拌した後、2,6-ジメチルアニリン(152μL,1.24mol)およびDDTT(51.7mg,252μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。さらに2,3-ジメチルフラン(127μL,1.20mmol)を加えた後、脱水ジクロロメタン(368μL)に溶解したトリフルオロ酢酸(184μL,2.40mmol)の溶液を滴下しながら加え、室温で1時間撹拌した。反応液に2,4,6-トリメチルピリジン(666μL,5.04mmol)を加えた後、アセトニトリル(17mL)を添加し、析出した固体を濾過し、乾燥して、2量体(2’-O-メチル-ウリジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル N6-[1-(ジメチルアミノ)エチリデン]-デオキシアデノシン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として定量的に得た。
(2)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート3量体の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブに上記(1)で得られた化合物(119mg,70.0μmol)、3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル 2,2-ジメチルプロパノエート(92.2mg,92.4μmol)およびN4-ベンゾイル-5-Me-dC-CE ホスホロアミダイト(178mg,210μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(4.0mL)および脱水アセトニトリル(0.4mL)の混合溶媒に溶解させた。得られた溶液に、5-エチルチオ-1H-テトラゾール(27.3mg,210μmol)を加えて、室温で1時間撹拌した。反応液に、2,2,2-トリフルオロエタノール(76.5μL,1.05mmol)を加え、室温で30分撹拌した後、2,6-ジメチルアニリン(133μL,1.08mol)およびDDTT(45.3mg,221μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。さらに2,3-ジメチルフラン(111μL,1.05mmol)を加えた後、脱水ジクロロメタン(322μL)に溶解したトリフルオロ酢酸(161μL,2.10mmol)の溶液を滴下しながら加え、室温で1時間撹拌した。反応液に2,4,6-トリメチルピリジン(583μL,4.41mmol)を加えた後、アセトニトリル(17mL)を添加し、析出した固体を濾過し、乾燥して、3量体(N4-ベンゾイル-5-メチル-デオキシシチジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル 2’-O-メチル-ウリジン-3’-[O-(2-シアノエチル)]ホスホロチオニル N6-[1-(ジメチルアミノ)エチリデン]-デオキシアデノシン-3’-イル-[3,4,5-トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(131mg,収率85%)。
(3)脱保護
上記(2)で得られた3量体(3.02mg)と30重量%アンモニア水(5.0mL)の混合物をオートクレーブに入れて、65℃で4時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物である5-メチル-デオキシシチジン-3’-ホスホロチオニル-2’-O-メチル-ウリジン-3’-ホスホロチオニル-デオキシアデノシンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0-10min;5 to 30%、λ=260nm):Rt=1.92、2.23min(14.8+75.6area%);TOF/MS: 906.17
上記(2)で得られた3量体(3.02mg)と30重量%アンモニア水(5.0mL)の混合物をオートクレーブに入れて、65℃で4時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物である5-メチル-デオキシシチジン-3’-ホスホロチオニル-2’-O-メチル-ウリジン-3’-ホスホロチオニル-デオキシアデノシンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0-10min;5 to 30%、λ=260nm):Rt=1.92、2.23min(14.8+75.6area%);TOF/MS: 906.17
本発明のオリゴヌクレオチドの製造方法によれば、縮合を効率的に行うことができる。本発明の製造方法によって得られたオリゴヌクレオチドは、人体用または動物用の医薬品(RNA、DNA、オリゴ核酸医薬等)、機能性食品、特定保健用食品、食品、化成品、生体用や工業用の高分子材料等の各種用途に使用することができる。
本願は、日本で出願された特願2015-245564号を基礎としており、その内容は本願明細書に全て包含される。
Claims (52)
- 以下の工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むオリゴヌクレオチドの製造方法:
(1)非極性溶媒中、
5’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基、3’位水酸基および3’位アミノ基、並びにデオキシリボース残基の3’位水酸基および3’位アミノ基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)、或いは
5’位水酸基が保護されておらず、3’位リン酸基の一つの水酸基が-OLn1-OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、-OLn1-OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)
を含む反応液に、
3’位水酸基または3’位アミノ基がホスホロアミダイト化され、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)
を添加して、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)とヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)とを縮合させ、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイトトリエステル体(c)を含む反応液を得る工程;
(3)ホスファイトトリエステル体(c)を含む反応液に酸化剤または硫化剤を添加して、ホスファイトトリエステル体(c)を酸化または硫化し、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたオリゴヌクレオチド(d)を含む反応液を得る工程;
(4)酸化または硫化後の反応液に酸を添加して5’位水酸基の一時保護基を除去し、5’位水酸基が保護されていないオリゴヌクレオチド(e)を含む反応液を得る工程;および
(6)オリゴヌクレオチド(e)を含む反応液に極性溶媒を添加し、オリゴヌクレオチド(e)を固液分離または抽出により精製する工程。 - 工程(1)で、
5’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および3’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の3’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)、或いは
5’位水酸基が保護されておらず、3’位リン酸基の一つの水酸基が-OLn1-OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、-OLn1-OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)、並びに
3’位水酸基がホスホロアミダイト化され、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)
を使用する請求項1に記載の製造方法。 - 工程(1)で、
5’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および3’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の3’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(a)、並びに
3’位水酸基がホスホロアミダイト化され、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(b)
を使用する請求項1に記載の製造方法。 - 工程(1)の後および工程(3)の前に、さらに以下の工程(2)を含む請求項1~3のいずれか一項に記載の製造方法:
(2)縮合後の反応液にクエンチ剤を添加する工程。 - 工程(2)で使用するクエンチ剤が、アルコール類、フェノール類およびアミン類から選ばれる少なくとも一つである請求項4に記載の製造方法。
- 工程(1)の後および工程(4)の前の反応液に、カルボン酸および有機塩基の混合物、無機酸またはアミン類を添加し、工程(3)において、硫化剤として5-[(N,N-ジメチルアミノメチリデン)アミノ]-3H-1,2,4-ジチアゾール-3-チオンを反応液に添加する請求項1~5のいずれか一項に記載の製造方法。
- 有機塩基が有する塩基性窒素原子の量が、カルボン酸が有するカルボキシ基1モルに対して1~2モルである請求項6に記載の製造方法。
- 工程(3)で使用する硫化剤が、3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン-1,1-ジオキシド、3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン、フェニルアセチルジスルフィド、テトラエチルチウラムジスルフィド、ジペンタメチレンチウラムテトラスルフィド、フェニル-3H-1,2,4-ジチアゾール-3-オン、3-アミノ-1,2,4-ジチアゾール-5-チオンおよび硫黄から選ばれる少なくとも一つである請求項1~5のいずれか一項に記載の製造方法。
- 工程(3)で使用する酸化剤が、ヨウ素、(1S)-(+)-(10-カンファニルスルホニル)オキサジリジン、tert-ブチルヒドロペルオキシド、2-ブタノンペルオキシド、1,1-ジヒドロペルオキシシクロドデカン、ビス(トリメチルシリル)ペルオキシドおよびm-クロロ過安息香酸から選ばれる少なくとも一つである請求項1~5のいずれか一項に記載の製造方法。
- 一時保護基が、ジメトキシトリチル基またはモノメトキシトリチル基である請求項1~9のいずれか一項に記載の製造方法。
- 非極性溶媒が、ハロゲン系溶媒、芳香族系溶媒、エステル系溶媒および脂肪族系溶媒から選ばれる少なくとも一つである請求項1~10のいずれか一項に記載の製造方法。
- 工程(4)で使用する酸が、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、塩酸、酢酸およびp-トルエンスルホン酸から選ばれる少なくとも一つである請求項1~11のいずれか一項に記載の製造方法。
- 酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基が、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基を有するか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を有する請求項1~12のいずれか一項に記載の製造方法。
- 工程(6)が、オリゴヌクレオチド(e)を含む反応液に極性溶媒を添加し、オリゴヌクレオチド(e)を固液分離により精製する工程である請求項1~13のいずれか一項に記載の製造方法。
- 工程(6)で使用する極性溶媒が、ニトリル系溶媒である請求項1~14のいずれか一項に記載の製造方法。
- 工程(4)の後および工程(6)の前に、さらに以下の工程(5)を含む請求項1~15のいずれか一項に記載の製造方法:
(5)オリゴヌクレオチド(e)を含む反応液に塩基を添加して中和する工程。 - 工程(5)で使用する塩基が、ピリジン、2,4,6-トリメチルピリジン、ベンズイミダゾール、1,2,4-トリアゾール、N-フェニルイミダゾール、2-アミノ-4,6-ジメチルピリミジン、1,10-フェナントロリン、イミダゾール、N-メチルイミダゾール、2-クロロベンズイミダゾール、2-ブロモベンズイミダゾール、2-メチルイミダゾール、2-フェニルベンズイミダゾール、N-フェニルベンズイミダゾールおよび5-ニトロベンズイミダゾールから選ばれる少なくとも一つである請求項16に記載の製造方法。
- 工程(6)の後に、さらに以下の工程(7)を含む請求項1~17のいずれか一項に記載の製造方法:
(7)得られたオリゴヌクレオチドの保護基を全て除去した後、保護されていないオリゴヌクレオチドを単離する工程。 - 工程(4)の一時保護基の除去反応をカチオン捕捉剤の存在下で行うか、または一時保護基の除去反応後に反応液にカチオン捕捉剤を添加する請求項1~18のいずれか一項に記載の製造方法。
- カチオン捕捉剤が、ピロール、2-メチルピロール、3-メチルピロール、2,3-ジメチルピロール、2,4-ジメチルピロール、インドール、3-メチルインドール、4-メチルインドール、5-メチルインドール、6-メチルインドール、7-メチルインドール、5,6-ジメチルインドール、6,7-ジメチルインドール、2-メチルフラン、2,3-ジメチルフラン、2-メチル-3-(メチルチオ)フラン、およびメントフランから選ばれる少なくとも一つである請求項19に記載の製造方法。
- 以下の工程(1’)、(3’)、(4’)および(6’)を含むオリゴヌクレオチドの製造方法:
(1’)非極性溶媒中、
3’位水酸基または3’位アミノ基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および5’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の5’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)、或いは
3’位水酸基または3’位アミノ基が保護されておらず、5’位リン酸基の一つの水酸基が-OLn1-OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、-OLn1-OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)
を含む反応液に、
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基または3’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
を添加して、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)とヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)とを縮合させ、3’位水酸基または3’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイトトリエステル体(c’)を含む反応液を得る工程;
(3’)ホスファイトトリエステル体(c’)を含む反応液に酸化剤または硫化剤を添加して、ホスファイトトリエステル体(c’)を酸化または硫化し、3’位水酸基または3’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたオリゴヌクレオチド(d’)を含む反応液を得る工程;
(4’)酸化または硫化後の反応液に酸を添加して3’位水酸基または3’位アミノ基の一時保護基を除去し、3’位水酸基または3’位アミノ基が保護されていないオリゴヌクレオチド(e’)を含む反応液を得る工程;および
(6’)オリゴヌクレオチド(e’)を含む反応液に極性溶媒を添加し、オリゴヌクレオチド(e’)を固液分離または抽出により精製する工程。 - 工程(1’)で、
3’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および5’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の5’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)、或いは
3’位水酸基が保護されておらず、5’位リン酸基の一つの水酸基が-OLn1-OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、-OLn1-OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)、並びに
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
を使用する請求項21に記載の製造方法。 - 工程(1’)で、
3’位水酸基が保護されておらず、5’位リン酸基の一つの水酸基が-OLn1-OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、-OLn1-OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)、並びに
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
を使用する請求項21に記載の製造方法。 - 工程(1’)で、
3’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および5’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の5’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(a’)、並びに
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
を使用する請求項21に記載の製造方法。 - 工程(1’)の後および工程(3’)の前に、さらに以下の工程(2’)を含む請求項21~24のいずれか一項に記載の製造方法:
(2’)縮合後の反応液にクエンチ剤を添加する工程。 - 工程(2’)で使用するクエンチ剤が、アルコール類、フェノール類およびアミン類から選ばれる少なくとも一つである請求項25に記載の製造方法。
- 工程(1’)の後および工程(4’)の前の反応液に、カルボン酸および有機塩基の混合物、無機酸またはアミン類を添加し、工程(3’)において、硫化剤として5-[(N,N-ジメチルアミノメチリデン)アミノ]-3H-1,2,4-ジチアゾール-3-チオンを反応液に添加する請求項21~26のいずれか一項に記載の製造方法。
- 有機塩基が有する塩基性窒素原子の量が、カルボン酸が有するカルボキシ基1モルに対して1~2モルである請求項27に記載の製造方法。
- 工程(3’)で使用する硫化剤が、3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン-1,1-ジオキシド、3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン、フェニルアセチルジスルフィド、テトラエチルチウラムジスルフィド、ジペンタメチレンチウラムテトラスルフィド、フェニル-3H-1,2,4-ジチアゾール-3-オン、3-アミノ-1,2,4-ジチアゾール-5-チオンおよび硫黄から選ばれる少なくとも一つである請求項21~26のいずれか一項に記載の製造方法。
- 工程(3’)で使用する酸化剤が、ヨウ素、(1S)-(+)-(10-カンファニルスルホニル)オキサジリジン、tert-ブチルヒドロペルオキシド、2-ブタノンペルオキシド、1,1-ジヒドロペルオキシシクロドデカン、ビス(トリメチルシリル)ペルオキシドおよびm-クロロ過安息香酸から選ばれる少なくとも一つである請求項21~26のいずれか一項に記載の製造方法。
- 水酸基の一時保護基が、ジメトキシトリチル基またはモノメトキシトリチル基である請求項21~30のいずれか一項に記載の製造方法。
- 非極性溶媒が、ハロゲン系溶媒、芳香族系溶媒、エステル系溶媒および脂肪族系溶媒から選ばれる少なくとも一つである請求項21~31のいずれか一項に記載の製造方法。
- 工程(4’)で使用する酸が、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、塩酸、酢酸およびp-トルエンスルホン酸から選ばれる少なくとも一つである請求項21~32のいずれか一項に記載の製造方法。
- 酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基が、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基を有するか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を有する請求項21~33のいずれか一項に記載の製造方法。
- 工程(6’)が、オリゴヌクレオチド(e’)を含む反応液に極性溶媒を添加し、オリゴヌクレオチド(e’)を固液分離により精製する工程である請求項21~34のいずれか一項に記載の製造方法。
- 工程(6’)で使用する極性溶媒が、ニトリル系溶媒である請求項21~35のいずれか一項に記載の製造方法。
- 工程(4’)の後および工程(6’)の前に、さらに以下の工程(5’)を含む請求項21~36のいずれか一項に記載の製造方法:
(5’)オリゴヌクレオチド(e’)を含む反応液に塩基を添加して中和する工程。 - 工程(5’)で使用する塩基が、ピリジン、2,4,6-トリメチルピリジン、ベンズイミダゾール、1,2,4-トリアゾール、N-フェニルイミダゾール、2-アミノ-4,6-ジメチルピリミジン、1,10-フェナントロリン、イミダゾール、N-メチルイミダゾール、2-クロロベンズイミダゾール、2-ブロモベンズイミダゾール、2-メチルイミダゾール、2-フェニルベンズイミダゾール、N-フェニルベンズイミダゾールおよび5-ニトロベンズイミダゾールから選ばれる少なくとも一つである請求項37に記載の製造方法。
- 工程(6’)の後に、さらに以下の工程(7’)を含む請求項21~38のいずれか一項に記載の製造方法:
(7’)得られたオリゴヌクレオチドの保護基を全て除去した後、保護されていないオリゴヌクレオチドを単離する工程。 - 工程(4’)の一時保護基の除去反応をカチオン捕捉剤の存在下で行うか、または一時保護基の除去反応後に反応液にカチオン捕捉剤を添加する請求項21~39のいずれか一項に記載の製造方法。
- カチオン捕捉剤が、ピロール、2-メチルピロール、3-メチルピロール、2,3-ジメチルピロール、2,4-ジメチルピロール、インドール、3-メチルインドール、4-メチルインドール、5-メチルインドール、6-メチルインドール、7-メチルインドール、5,6-ジメチルインドール、6,7-ジメチルインドール、2-メチルフラン、2,3-ジメチルフラン、2-メチル-3-(メチルチオ)フラン、およびメントフランから選ばれる少なくとも一つである請求項40に記載の製造方法。
- 式(a-II):
mは、0以上の整数を示し;
m個のBaseは、それぞれ独立して、保護されていてもよい核酸塩基を示し;
m+1個のXは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、または2位炭素原子および4位炭素原子と結合する2価の有機基を示し;
m個のR10は、それぞれ独立して、酸素原子または硫黄原子を示し;
m個のRp1は、それぞれ独立して、リン酸基の保護基を示し;
Lは、単結合、または式(a1)若しくは(a1’):
*は、Yとの結合位置を示し;
**は、酸素原子との結合位置を示し;
R1およびR2は、それぞれ独立して、C1-22炭化水素基を示し;
L1は、置換されていてもよい2価のC1-22炭化水素基を示し;
L2は、単結合を示すか、または***C(=O)N(R3)-R4-N(R5)****(式中、***は、L1との結合位置を示し、****は、C=Oとの結合位置を示し、R4は、C1-22アルキレン基を示し、R3およびR5は、それぞれ独立して、水素原子若しくはC1-22アルキル基を示すか、またはR3およびR5が一緒になって、環を形成していてもよい。)で表される基を示す。)で表される基を示し;
Yは、単結合、酸素原子、またはNR(Rは、水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。)を示し;および
Zは、式(a2)、式(a2’)または式(a2”):
*は、結合位置を示し;
R6は、水素原子であるか、あるいはRbが、下記式(a3)で表される基である場合には、環Aまたは環BのR6は、R8と一緒になって単結合または-O-を示して、環Aまたは環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;
kは、1~4の整数を示し;
k個のQは、それぞれ独立して、-O-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-C(=O)NH-または-NHC(=O)-を示し;
k個のR7は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
環Aおよび環Bは、それぞれ独立して、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく;
Raは、水素原子を示し;および
Rbは、水素原子、または式(a3):
*は、結合位置を示し;
jは、0~4の整数を示し;
j個のQは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
j個のR9は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
R8は、水素原子を示すか、または環Aまたは環BのR6と一緒になって単結合または-O-を示して、環Aまたは環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;および
環Cは、j個のQR9に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。)で表される基を示すか、或いは
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成する。]で表される基を示す。
R11は、メチル基を示し、R12およびR13は、それぞれ独立にC1-5アルキル基を示すか、またはR11およびR12が一緒になって、それらが結合する炭素原子および窒素原子と共に5員または6員の含窒素炭化水素環を形成していてもよい。]
で表されるヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド。 - Rp1が、-CH2CH2WG(式中、WGは、電子吸引性基を示す。)で表される基である請求項42に記載のヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド。
- R11がメチル基であり、R12およびR13が、それぞれ独立にC1-5アルキル基である請求項42または43に記載のヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド。
- mが0である請求項42~44のいずれか一項に記載のヌクレオシド。
- 式(a-IV):
mは、0以上の整数を示し;
m+1個のBaseは、それぞれ独立して、保護されていてもよい核酸塩基を示し;
m+1個のXは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、または2位炭素原子および4位炭素原子と結合する2価の有機基を示し;
m個のR10は、それぞれ独立して、酸素原子または硫黄原子を示し;
m個のRp1は、それぞれ独立して、リン酸基の保護基を示し;
Lは、単結合、または式(a1)若しくは(a1’):
*は、Yとの結合位置を示し;
**は、酸素結合との結合位置を示し;
R1およびR2は、それぞれ独立して、C1-22炭化水素基を示し;
L1は、置換されていてもよい2価のC1-22炭化水素基を示し;
L2は、単結合を示すか、または***C(=O)N(R3)-R4-N(R5)****(式中、***は、L1との結合位置を示し、****は、C=Oとの結合位置を示し、R4は、C1-22アルキレン基を示し、R3およびR5は、それぞれ独立して、水素原子若しくはC1-22アルキル基を示すか、またはR3およびR5が一緒になって、環を形成していてもよい。)で表される基を示す。)で表される基を示し;
Yは、単結合、酸素原子、またはNR(Rは、水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。)を示し;および
Z’は、式(a2”):
*は、結合位置を示し;
R6は、水素原子であるか、あるいはRbが、下記式(a3)で表される基である場合には、R8と一緒になって単結合または-O-を示して、環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;
kは、1~4の整数を示し;
k個のQは、それぞれ独立して、-O-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-C(=O)NH-または-NHC(=O)-を示し;
k個のR7は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
環Bは、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく;
Raは、水素原子を示し;および
Rbは、水素原子、または式(a3):
*は、結合位置を示し;
jは、0~4の整数を示し;
j個のQは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
j個のR9は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
R8は、水素原子を示すか、またはR6と一緒になって単結合または-O-を示して、環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;および
環Cは、j個のQR9に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。)で表される基を示すか、或いは
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成する。]で表される基を示す。]
で表されるヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド。 - Rp1が、-CH2CH2WG(式中、WGは、電子吸引性基を示す。)で表される基である請求項46に記載のヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド。
- mが0である請求項46または47に記載のヌクレオシド。
- 式(I):
mは、0以上の整数を示し;
m+1個のBaseは、それぞれ独立して、保護されていてもよい核酸塩基を示し;
m+1個のXは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、または2位炭素原子および4位炭素原子と結合する2価の有機基を示し;
m個のR10は、それぞれ独立して、酸素原子または硫黄原子を示し;
m個のRp1は、それぞれ独立して、リン酸基の保護基を示し;
Rn1およびRn2の一つが水素原子を示し、残りの一つが式(II):
{式中、
*は、結合位置を示し;
R10は、酸素原子または硫黄原子を示し;
Rp1は、リン酸基の保護基を示し;
Ln1は有機基を示し;
Lは、単結合、または式(a1)若しくは(a1’):
*は、Yとの結合位置を示し;
**は、酸素原子との結合位置を示し;
R1およびR2は、それぞれ独立して、C1-22炭化水素基を示し;
L1は、置換されていてもよい2価のC1-22炭化水素基を示し;
L2は、単結合を示すか、または***C(=O)N(R3)-R4-N(R5)****(式中、***は、L1との結合位置を示し、****は、C=Oとの結合位置を示し、R4は、C1-22アルキレン基を示し、R3およびR5は、それぞれ独立して、水素原子若しくはC1-22アルキル基を示すか、またはR3およびR5が一緒になって、環を形成していてもよい。)で表される基を示す。)で表される基を示し;
Yは、単結合、酸素原子、またはNR(Rは、水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。)を示し;および
Zは、式(a2)、式(a2’)または式(a2”):
*は、結合位置を示し;
R6は、水素原子であるか、あるいはRbが、下記式(a3)で表される基である場合には、環Aまたは環BのR6は、R8と一緒になって単結合または-O-を示して、環Aまたは環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;
kは、1~4の整数を示し;
k個のQは、それぞれ独立して、-O-、-C(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-C(=O)NH-または-NHC(=O)-を示し;
k個のR7は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
環Aおよび環Bは、それぞれ独立して、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく;
Raは、水素原子を示し;および
Rbは、水素原子、または式(a3):
*は、結合位置を示し;
jは、0~4の整数を示し;
j個のQは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
j個のR9は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
R8は、水素原子を示すか、または環Aまたは環BのR6と一緒になって単結合または-O-を示して、環Aまたは環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;および
環Cは、j個のQR9に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。)で表される基を示すか、或いは
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成する。]で表される基を示す。}で表される基を示す。]
で表されるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。 - Rn1が式(II)で表される基であり、Rn2が水素原子である請求項49に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
- Ln1がエチレン基である請求項49または50に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
- mが0である請求項49~51のいずれか一項に記載のヌクレオチド。
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Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005070859A1 (ja) * | 2004-01-27 | 2005-08-04 | Takeshi Wada | フルオラス担体およびそれを用いたオリゴヌクレオチド誘導体の製造方法 |
JP2010275254A (ja) * | 2009-05-29 | 2010-12-09 | Tokyo Univ Of Agriculture & Technology | 疎水性基結合ヌクレオシド、疎水性基結合ヌクレオシド溶液、及び疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法 |
JP2012111728A (ja) * | 2010-11-26 | 2012-06-14 | Nokodai Tlo Kk | 高分散性液相支持体を用いたオリゴヌクレオチド合成法 |
WO2012157723A1 (ja) * | 2011-05-17 | 2012-11-22 | 味の素株式会社 | オリゴヌクレオチドの製造方法 |
WO2013122236A1 (ja) * | 2012-02-17 | 2013-08-22 | 味の素株式会社 | 塩基部保護オリゴヌクレオチド |
US20130267697A1 (en) * | 2012-02-17 | 2013-10-10 | Ajinomoto Co., Inc. | Oligonucleotide with protected base |
WO2013179412A1 (ja) * | 2012-05-30 | 2013-12-05 | 北海道システム・サイエンス株式会社 | 高分散性液相支持体を用いたオリゴヌクレオチド合成法 |
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JP2010275254A (ja) * | 2009-05-29 | 2010-12-09 | Tokyo Univ Of Agriculture & Technology | 疎水性基結合ヌクレオシド、疎水性基結合ヌクレオシド溶液、及び疎水性基結合オリゴヌクレオチド合成方法 |
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WO2012157723A1 (ja) * | 2011-05-17 | 2012-11-22 | 味の素株式会社 | オリゴヌクレオチドの製造方法 |
WO2013122236A1 (ja) * | 2012-02-17 | 2013-08-22 | 味の素株式会社 | 塩基部保護オリゴヌクレオチド |
US20130267697A1 (en) * | 2012-02-17 | 2013-10-10 | Ajinomoto Co., Inc. | Oligonucleotide with protected base |
WO2013179412A1 (ja) * | 2012-05-30 | 2013-12-05 | 北海道システム・サイエンス株式会社 | 高分散性液相支持体を用いたオリゴヌクレオチド合成法 |
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Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
KIM SHOKAKU, ET AL.: "Liquid-Phase RNA Synthesis by Using Alkyl-Chain-Soluble Support", CHEMISTRY - A EUROPEAN JOURNAL, vol. Vol.19(26), JPN6017009379, 2013, pages 8615 - 8620, ISSN: 0004978003 * |
SHOJI TAKAO, ET AL.: "Synthesis of conjugated oligonucleotide in solution phase using alkyl-chain-soluble support", CHEMISTRY LETTERS, vol. Vol.43(8), JPN6017009381, 2014, pages 1251 - 1253, ISSN: 0004978004 * |
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