JPWO2017104836A1 - オリゴヌクレオチドの製造方法、およびヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
Description
(i)ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの5’位水酸基の保護基(例えば、ジメトキシトリチル基)の除去(脱保護)、
(ii)脱保護で得られたヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドと、3’位水酸基がホスホロアミダイト化され、且つ5’位水酸基が保護されたヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドとの縮合、
(iii)縮合で得られたホスファイトトリエステル体の酸化または硫化、および
(iv)酸化または硫化で得られた、5’位水酸基が保護されたオリゴヌクレオチドの固液分離
を含むオリゴヌクレオチドの製造方法が記載されている。上述の工程(i)〜(iv)を繰り返すことによって、オリゴヌクレオチド鎖を伸長させることができる。
(I)5’位水酸基が保護されておらず、且つ3’位水酸基等の少なくとも一つの基が保護基で保護されたヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)等と、3’位水酸基または3’位アミノ基がホスホロアミダイト化され、且つ5’位水酸基が保護されたヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)との縮合、
(II)縮合で得られたホスファイトトリエステル体(c)の酸化または硫化、
(III)酸化または硫化で得られたオリゴヌクレオチド(d)の5’位水酸基の保護基の除去(脱保護)、および
(IV)脱保護で得られた、5’位水酸基が保護されていないオリゴヌクレオチド(e)の固液分離または抽出による精製
を行うことによって、効率的に縮合を行い得ることを見出した。
(1)非極性溶媒中、
5’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基、3’位水酸基および3’位アミノ基、並びにデオキシリボース残基の3’位水酸基および3’位アミノ基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)、或いは
5’位水酸基が保護されておらず、3’位リン酸基の一つの水酸基が−OLn1−OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、−OLn1−OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)
を含む反応液に、
3’位水酸基または3’位アミノ基がホスホロアミダイト化され、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)
を添加して、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)とヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)とを縮合させ、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイトトリエステル体(c)を含む反応液を得る工程;
(3)ホスファイトトリエステル体(c)を含む反応液に酸化剤または硫化剤を添加して、ホスファイトトリエステル体(c)を酸化または硫化し、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたオリゴヌクレオチド(d)を含む反応液を得る工程;
(4)酸化または硫化後の反応液に酸を添加して5’位水酸基の一時保護基を除去し、5’位水酸基が保護されていないオリゴヌクレオチド(e)を含む反応液を得る工程;および
(6)オリゴヌクレオチド(e)を含む反応液に極性溶媒を添加し、オリゴヌクレオチド(e)を固液分離または抽出により精製する工程。
5’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および3’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の3’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)、或いは
5’位水酸基が保護されておらず、3’位リン酸基の一つの水酸基が−OLn1−OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、−OLn1−OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)、並びに
3’位水酸基がホスホロアミダイト化され、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)
を使用する前記[1]に記載の製造方法。
5’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および3’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の3’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(a)、並びに
3’位水酸基がホスホロアミダイト化され、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(b)
を使用する前記[1]に記載の製造方法。
(2)縮合後の反応液にクエンチ剤を添加する工程。
[5] 工程(2)で使用するクエンチ剤が、アルコール類、フェノール類およびアミン類から選ばれる少なくとも一つである前記[4]に記載の製造方法。
[7] 有機塩基が有する塩基性窒素原子の量が、カルボン酸が有するカルボキシ基1モルに対して1〜2モルである前記[6]に記載の製造方法。
[9] 工程(3)で使用する酸化剤が、ヨウ素、(1S)−(+)−(10−カンファニルスルホニル)オキサジリジン、tert−ブチルヒドロペルオキシド、2−ブタノンペルオキシド、1,1−ジヒドロペルオキシシクロドデカン、ビス(トリメチルシリル)ペルオキシドおよびm−クロロ過安息香酸から選ばれる少なくとも一つである前記[1]〜[5]のいずれか一つに記載の製造方法。
[11] 非極性溶媒が、ハロゲン系溶媒、芳香族系溶媒、エステル系溶媒および脂肪族系溶媒から選ばれる少なくとも一つである前記[1]〜[10]のいずれか一つに記載の製造方法。
[12] 工程(4)で使用する酸が、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、塩酸、酢酸およびp−トルエンスルホン酸から選ばれる少なくとも一つである前記[1]〜[11]のいずれか一つに記載の製造方法。
[13] 酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基が、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基を有するか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を有する前記[1]〜[12]のいずれか一つに記載の製造方法。
[15] 工程(6)で使用する極性溶媒が、ニトリル系溶媒である前記[1]〜[14]のいずれか一つに記載の製造方法。
(5)オリゴヌクレオチド(e)を含む反応液に塩基を添加して中和する工程。
[17] 工程(5)で使用する塩基が、ピリジン、2,4,6−トリメチルピリジン、ベンズイミダゾール、1,2,4−トリアゾール、N−フェニルイミダゾール、2−アミノ−4,6−ジメチルピリミジン、1,10−フェナントロリン、イミダゾール、N−メチルイミダゾール、2−クロロベンズイミダゾール、2−ブロモベンズイミダゾール、2−メチルイミダゾール、2−フェニルベンズイミダゾール、N−フェニルベンズイミダゾールおよび5−ニトロベンズイミダゾールから選ばれる少なくとも一つである前記[16]に記載の製造方法。
(7)得られたオリゴヌクレオチドの保護基を全て除去した後、保護されていないオリゴヌクレオチドを単離する工程。
[20] カチオン捕捉剤が、ピロール、2−メチルピロール、3−メチルピロール、2,3−ジメチルピロール、2,4−ジメチルピロール、インドール、3−メチルインドール,4−メチルインドール、5−メチルインドール、6−メチルインドール、7−メチルインドール、5,6−ジメチルインドール、6,7−ジメチルインドール、2−メチルフラン、2,3−ジメチルフラン、2−メチル−3−(メチルチオ)フラン、およびメントフランから選ばれる少なくとも一つである前記[19]に記載の製造方法。
(1’)非極性溶媒中、
3’位水酸基または3’位アミノ基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および5’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の5’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)、或いは
3’位水酸基または3’位アミノ基が保護されておらず、5’位リン酸基の一つの水酸基が−OLn1−OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、−OLn1−OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)
を含む反応液に、
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基または3’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
を添加して、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)とヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)とを縮合させ、3’位水酸基または3’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイトトリエステル体(c’)を含む反応液を得る工程;
(3’)ホスファイトトリエステル体(c’)を含む反応液に酸化剤または硫化剤を添加して、ホスファイトトリエステル体(c’)を酸化または硫化し、3’位水酸基または3’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたオリゴヌクレオチド(d’)を含む反応液を得る工程;
(4’)酸化または硫化後の反応液に酸を添加して3’位水酸基または3’位アミノ基の一時保護基を除去し、3’位水酸基または3’位アミノ基が保護されていないオリゴヌクレオチド(e’)を含む反応液を得る工程;および
(6’)オリゴヌクレオチド(e’)を含む反応液に極性溶媒を添加し、オリゴヌクレオチド(e’)を固液分離または抽出により精製する工程。
3’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および5’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の5’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)、或いは
3’位水酸基が保護されておらず、5’位リン酸基の一つの水酸基が−OLn1−OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、−OLn1−OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)、並びに
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
を使用する前記[21]に記載の製造方法。
3’位水酸基が保護されておらず、5’位リン酸基の一つの水酸基が−OLn1−OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、−OLn1−OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)、並びに
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
を使用する前記[21]に記載の製造方法。
3’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および5’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の5’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(a’)、並びに
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
を使用する前記[21]に記載の製造方法。
(2’)縮合後の反応液にクエンチ剤を添加する工程。
[26] 工程(2’)で使用するクエンチ剤が、アルコール類、フェノール類およびアミン類から選ばれる少なくとも一つである前記[25]に記載の製造方法。
[28] 有機塩基が有する塩基性窒素原子の量が、カルボン酸が有するカルボキシ基1モルに対して1〜2モルである前記[27]に記載の製造方法。
[30] 工程(3’)で使用する酸化剤が、ヨウ素、(1S)−(+)−(10−カンファニルスルホニル)オキサジリジン、tert−ブチルヒドロペルオキシド、2−ブタノンペルオキシド、1,1−ジヒドロペルオキシシクロドデカン、ビス(トリメチルシリル)ペルオキシドおよびm−クロロ過安息香酸から選ばれる少なくとも一つである前記[21]〜[26]のいずれか一つに記載の製造方法。
[32] 非極性溶媒が、ハロゲン系溶媒、芳香族系溶媒、エステル系溶媒および脂肪族系溶媒から選ばれる少なくとも一つである前記[21]〜[31]のいずれか一つに記載の製造方法。
[33] 工程(4’)で使用する酸が、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、塩酸、酢酸およびp−トルエンスルホン酸から選ばれる少なくとも一つである前記[21]〜[32]のいずれか一つに記載の製造方法。
[34] 酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基が、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基を有するか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を有する前記[21]〜[33]のいずれか一つに記載の製造方法。
[36] 工程(6’)で使用する極性溶媒が、ニトリル系溶媒である前記[21]〜[35]のいずれか一つに記載の製造方法。
(5’)オリゴヌクレオチド(e’)を含む反応液に塩基を添加して中和する工程。
[38] 工程(5’)で使用する塩基が、ピリジン、2,4,6−トリメチルピリジン、ベンズイミダゾール、1,2,4−トリアゾール、N−フェニルイミダゾール、2−アミノ−4,6−ジメチルピリミジン、1,10−フェナントロリン、イミダゾール、N−メチルイミダゾール、2−クロロベンズイミダゾール、2−ブロモベンズイミダゾール、2−メチルイミダゾール、2−フェニルベンズイミダゾール、N−フェニルベンズイミダゾールおよび5−ニトロベンズイミダゾールから選ばれる少なくとも一つである前記[37]に記載の製造方法。
(7’)得られたオリゴヌクレオチドの保護基を全て除去した後、保護されていないオリゴヌクレオチドを単離する工程。
[41] カチオン捕捉剤が、ピロール、2−メチルピロール、3−メチルピロール、2,3−ジメチルピロール、2,4−ジメチルピロール、インドール、3−メチルインドール、4−メチルインドール、5−メチルインドール、6−メチルインドール、7−メチルインドール、5,6−ジメチルインドール、6,7−ジメチルインドール、2−メチルフラン、2,3−ジメチルフラン、2−メチル−3−(メチルチオ)フラン、およびメントフランから選ばれる少なくとも一つである前記[40]に記載の製造方法。
mは、0以上の整数を示し;
m個のBaseは、それぞれ独立して、保護されていてもよい核酸塩基を示し;
m+1個のXは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、または2位炭素原子および4位炭素原子と結合する2価の有機基を示し;
m個のR10は、それぞれ独立して、酸素原子または硫黄原子を示し;
m個のRp1は、それぞれ独立して、リン酸基の保護基を示し;
Lは、単結合、または式(a1)若しくは(a1’):
*は、Yとの結合位置を示し;
**は、酸素原子との結合位置を示し;
R1およびR2は、それぞれ独立して、C1−22炭化水素基を示し;
L1は、置換されていてもよい2価のC1−22炭化水素基を示し;
L2は、単結合を示すか、または***C(=O)N(R3)−R4−N(R5)****(式中、***は、L1との結合位置を示し、****は、C=Oとの結合位置を示し、R4は、C1−22アルキレン基を示し、R3およびR5は、それぞれ独立して、水素原子若しくはC1−22アルキル基を示すか、またはR3およびR5が一緒になって、環を形成していてもよい。)で表される基を示す。)で表される基を示し;
Yは、単結合、酸素原子、またはNR(Rは、水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。)を示し;および
Zは、式(a2)、式(a2’)または式(a2”):
*は、結合位置を示し;
R6は、水素原子であるか、あるいはRbが、下記式(a3)で表される基である場合には、環Aまたは環BのR6は、R8と一緒になって単結合または−O−を示して、環Aまたは環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;
kは、1〜4の整数を示し;
k個のQは、それぞれ独立して、−O−、−C(=O)−、−C(=O)O−、−OC(=O)−、−C(=O)NH−または−NHC(=O)−を示し;
k個のR7は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
環Aおよび環Bは、それぞれ独立して、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく;
Raは、水素原子を示し;および
Rbは、水素原子、または式(a3):
*は、結合位置を示し;
jは、0〜4の整数を示し;
j個のQは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
j個のR9は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
R8は、水素原子を示すか、または環Aまたは環BのR6と一緒になって単結合または−O−を示して、環Aまたは環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;および
環Cは、j個のQR9に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。)で表される基を示すか、或いは
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成する。]で表される基を示す。
R11は、メチル基を示し、R12およびR13は、それぞれ独立にC1−5アルキル基を示すか、またはR11およびR12が一緒になって、それらが結合する炭素原子および窒素原子と共に5員または6員の含窒素炭化水素環を形成していてもよい。]
で表されるヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド。
[43] Rp1が、−CH2CH2WG(式中、WGは、電子吸引性基を示す。)で表される基である前記[42]に記載のヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド。
[44] R11がメチル基であり、R12およびR13が、それぞれ独立にC1−5アルキル基である前記[42]または[43]に記載のヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド。
[45] mが0である前記[42]〜[44]のいずれか一つに記載のヌクレオシド。
mは、0以上の整数を示し;
m+1個のBaseは、それぞれ独立して、保護されていてもよい核酸塩基を示し;
m+1個のXは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、または2位炭素原子および4位炭素原子と結合する2価の有機基を示し;
m個のR10は、それぞれ独立して、酸素原子または硫黄原子を示し;
m個のRp1は、それぞれ独立して、リン酸基の保護基を示し;
Lは、単結合、または式(a1)若しくは(a1’):
*は、Yとの結合位置を示し;
**は、酸素結合との結合位置を示し;
R1およびR2は、それぞれ独立して、C1−22炭化水素基を示し;
L1は、置換されていてもよい2価のC1−22炭化水素基を示し;
L2は、単結合を示すか、または***C(=O)N(R3)−R4−N(R5)****(式中、***は、L1との結合位置を示し、****は、C=Oとの結合位置を示し、R4は、C1−22アルキレン基を示し、R3およびR5は、それぞれ独立して、水素原子若しくはC1−22アルキル基を示すか、またはR3およびR5が一緒になって、環を形成していてもよい。)で表される基を示す。)で表される基を示し;
Yは、単結合、酸素原子、またはNR(Rは、水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。)を示し;および
Z’は、式(a2”):
*は、結合位置を示し;
R6は、水素原子であるか、あるいはRbが、下記式(a3)で表される基である場合には、R8と一緒になって単結合または−O−を示して、環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;
kは、1〜4の整数を示し;
k個のQは、それぞれ独立して、−O−、−C(=O)−、−C(=O)O−、−OC(=O)−、−C(=O)NH−または−NHC(=O)−を示し;
k個のR7は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
環Bは、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく;
Raは、水素原子を示し;および
Rbは、水素原子、または式(a3):
*は、結合位置を示し;
jは、0〜4の整数を示し;
j個のQは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
j個のR9は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
R8は、水素原子を示すか、またはR6と一緒になって単結合または−O−を示して、環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;および
環Cは、j個のQR9に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。)で表される基を示すか、或いは
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成する。]で表される基を示す。]
で表されるヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド。
[47] Rp1が、−CH2CH2WG(式中、WGは、電子吸引性基を示す。)で表される基である前記[46]に記載のヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド。
[48] mが0である前記[46]または[47]に記載のヌクレオシド。
mは、0以上の整数を示し;
m+1個のBaseは、それぞれ独立して、保護されていてもよい核酸塩基を示し;
m+1個のXは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、または2位炭素原子および4位炭素原子と結合する2価の有機基を示し;
m個のR10は、それぞれ独立して、酸素原子または硫黄原子を示し;
m個のRp1は、それぞれ独立して、リン酸基の保護基を示し;
Rn1およびRn2の一つが水素原子を示し、残りの一つが式(II):
*は、結合位置を示し;
R10は、酸素原子または硫黄原子を示し;
Rp1は、リン酸基の保護基を示し;
Ln1は有機基を示し;
Lは、単結合、または式(a1)若しくは(a1’):
*は、Yとの結合位置を示し;
**は、酸素原子との結合位置を示し;
R1およびR2は、それぞれ独立して、C1−22炭化水素基を示し;
L1は、置換されていてもよい2価のC1−22炭化水素基を示し;
L2は、単結合を示すか、または***C(=O)N(R3)−R4−N(R5)****(式中、***は、L1との結合位置を示し、****は、C=Oとの結合位置を示し、R4は、C1−22アルキレン基を示し、R3およびR5は、それぞれ独立して、水素原子若しくはC1−22アルキル基を示すか、またはR3およびR5が一緒になって、環を形成していてもよい。)で表される基を示す。)で表される基を示し;
Yは、単結合、酸素原子、またはNR(Rは、水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。)を示し;および
Zは、式(a2)、式(a2’)または式(a2”):
*は、結合位置を示し;
R6は、水素原子であるか、あるいはRbが、下記式(a3)で表される基である場合には、環Aまたは環BのR6は、R8と一緒になって単結合または−O−を示して、環Aまたは環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;
kは、1〜4の整数を示し;
k個のQは、それぞれ独立して、−O−、−C(=O)−、−C(=O)O−、−OC(=O)−、−C(=O)NH−または−NHC(=O)−を示し;
k個のR7は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
環Aおよび環Bは、それぞれ独立して、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく;
Raは、水素原子を示し;および
Rbは、水素原子、または式(a3):
*は、結合位置を示し;
jは、0〜4の整数を示し;
j個のQは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
j個のR9は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
R8は、水素原子を示すか、または環Aまたは環BのR6と一緒になって単結合または−O−を示して、環Aまたは環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;および
環Cは、j個のQR9に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。)で表される基を示すか、或いは
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成する。]で表される基を示す。}で表される基を示す。]
で表されるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
[50] Rn1が式(II)で表される基であり、Rn2が水素原子である前記[49]に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
[51] Ln1がエチレン基である前記[49]または[50]に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
[52] mが0である前記[49]〜[51]のいずれか一つに記載のヌクレオチド。
文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと同様または同等の任意の方法および材料は、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及したすべての刊行物および特許は、例えば、記載された発明に関連して使用されうる刊行物に記載されている、構築物および方法論を記載および開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。
本明細書における「糖」は、水酸基がアミノ基に置き換わったアミノ糖、および2位水酸基がハロゲン原子に置き換わったリボースも包含する。
本明細書中、「5’位アミノ基」とは、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの5’位の炭素原子に結合したアミノ基を意味する。
本明細書中、「5’位リン酸基」とは、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの5’位の炭素原子に結合したリン酸基を意味する。
本明細書中、「Ca−b」とは、炭素数がa以上b以下(a、bは整数を示す)を意味する。
該「C6−10シクロアルカン」としては、例えば、シクロヘキサン、シクロヘプタン、シクロオクタンが挙げられる。
該「C6−10シクロアルケン」としては、例えば、シクロヘキセン、シクロヘプテン、シクロオクテンが挙げられる。
該「C6−14芳香族炭化水素環」としては、例えば、ベンゼン、ナフタレンが挙げられる。
本明細書中、「リンカー」としては、例えば、−O−、−C(=O)−、−C(=O)O−、−OC(=O)−、−C(=O)NH−、−NHC(=O)−、−S−、−SO−、−SO2−、−Si(R’)(R”)O−、−Si(R’)(R”)−(R’、R”は、それぞれ独立して、水素原子またはC1−22炭化水素基を示す。)等が挙げられる。
本発明の製造方法は、3’末端から5’末端への方向にオリゴヌクレオチド鎖の伸長を行う態様(以下「3’−5’合成」と略称することがある)および5’末端から3’末端への方向にオリゴヌクレオチド鎖の伸長を行う態様(以下「5’−3’合成」と略称することがある)の両方を包含する。まず、3’−5’合成である本発明の製造方法から説明する。
3’−5’合成である本発明の製造方法は、以下の工程(1)、(3)、(4)および(6)を含む。この製造方法は、必要に応じて、さらに以下の工程(2)、(5)および(7)を含んでいてもよい。
(1)非極性溶媒中、
5’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基、3’位水酸基および3’位アミノ基、並びにデオキシリボース残基の3’位水酸基および3’位アミノ基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)、或いは
5’位水酸基が保護されておらず、3’位リン酸基の一つの水酸基が−OLn1−OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、−OLn1−OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)
を含む反応液に、
3’位水酸基または3’位アミノ基がホスホロアミダイト化され、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)
を添加して、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)とヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)とを縮合させ、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイトトリエステル体(c)を含む反応液を得る工程;
(2)必要に応じて、縮合後の反応液にクエンチ剤を添加する工程;
(3)ホスファイトトリエステル体(c)を含む反応液に酸化剤または硫化剤を添加して、ホスファイトトリエステル体(c)を酸化または硫化し、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたオリゴヌクレオチド(d)を含む反応液を得る工程;
(4)酸化または硫化後の反応液に酸を添加して5’位水酸基の一時保護基を除去し、5’位水酸基が保護されていないオリゴヌクレオチド(e)を含む反応液を得る工程;
(5)必要に応じて、オリゴヌクレオチド(e)を含む反応液に塩基を添加して中和する工程;
(6)オリゴヌクレオチド(e)を含む反応液に極性溶媒を添加し、オリゴヌクレオチド(e)を固液分離または抽出により精製する工程;および
(7)必要に応じて、得られたオリゴヌクレオチドの保護基を全て除去した後、保護されていないオリゴヌクレオチドを単離する工程。
本工程は、5’位水酸基が保護されておらず、3’位水酸基等の少なくとも一つが、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護されたヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)と、3’位水酸基または3’位アミノ基がホスホロアミダイト化され、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)とを縮合させて、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイトトリエステル体(c)を得る工程である。
5’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および3’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の3’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)、或いは
5’位水酸基が保護されておらず、3’位リン酸基の一つの水酸基が−OLn1−OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、−OLn1−OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)、並びに
3’位水酸基がホスホロアミダイト化され、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)
が使用される。
5’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および3’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の3’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(a)、並びに
3’位水酸基がホスホロアミダイト化され、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(b)
が使用される。
*は、隣接原子との結合位置を示し;
R14およびR15は、それぞれ独立して、水素原子またはC1−4アルキル基を示し;および
X1は、単結合またはC1−4アルキレン基を示す。
但し、R14およびR15が共に水素原子であることはない。]
で表される同一または異なる2価の基を有する基が好ましい。
*は、隣接原子との結合位置を示し;
R16およびR17は、水素原子を示すか、または一緒になって=Oを示し;
n0は、2〜40の整数を示し;
n0個のR18およびR19は、それぞれ独立して、水素原子またはC1−4アルキル基を示し;
n0個のX2は、それぞれ独立して、単結合またはC1−4アルキレン基を示し;
R20は、水素原子またはC1−4アルキル基を示し;および
R21は、C1−4アルキル基を示す。
但し、R18およびR19が共に水素原子であることはなく、且つn0が2の場合には、R20はC1−4アルキル基を示す。]
R16およびR17は、共に水素原子であり;
n0は、2〜40の整数であり;
n0個のR18およびR19は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基またはエチル基であり;
n0個のX2は、それぞれ独立して、単結合、メチレン基またはエチレン基であり;および
R20は、水素原子、メチル基またはエチル基である
基(但し、R18およびR19が共に水素原子であることはなく、且つn0が2の場合には、R20はメチルまたはエチル基を示す。)が好ましい。
*は、隣接原子との結合位置を示し;
m1個のOR22は、それぞれ独立して、式(B)で表される基により置換された水酸基を示し;および
m1は、1〜3の整数を示す。]
なお、式(C)中の「式(B)で表される基」は、その*がO(即ち、隣接原子)との結合位置を示すこと以外は上述した通りである。
*は、Qとの結合位置を示し;
n1は、1〜10の整数を示し;
n2は、1〜10の整数を示し;
n1個のR26およびR27は、それぞれ独立して、水素原子またはC1−4アルキル基を示し;
n1個のX3は、それぞれ独立して、単結合またはC1−4アルキレン基を示し;
n2個のR28およびR29は、それぞれ独立して、水素原子またはC1−4アルキル基を示し;
n2個のX5は、それぞれ独立して、単結合またはC1−4アルキレン基を示し;
X4は、単結合またはC1−4アルキレン基を示し;および
R23、R24、R25、R30、R31およびR32は、それぞれ独立して、水素原子またはC1−4アルキル基を示す。
但し、R26およびR27、および/またはR28およびR29が共に水素原子であることはなく、且つn1+n2が2の場合には、R23、R24およびR25の2個以上がそれぞれ独立して、C1−4アルキル基を示すか、またはR30、R31およびR32の2個以上がそれぞれ独立して、C1−4アルキル基を示す。]
n1は、1〜5の整数であり;
n2は、1〜5の整数であり;
n1個のR26およびR27は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基またはエチル基であり;
n1個のX3は、それぞれ独立して、単結合、メチレン基またはエチレン基であり;
n2個のR28およびR29は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基またはエチル基であり;
n2個のX5は、それぞれ独立して、単結合、メチレン基またはエチレン基であり;
X4は、単結合、メチレン基またはエチレン基であり;および
R23、R24、R25、R30、R31およびR32は、それぞれ独立して、水素原子またはC1−4アルキル基である
基(但し、R26およびR27、および/またはR28およびR29が共に水素原子であることはなく、且つn1+n2が2の場合には、R23、R24およびR25の2個以上がそれぞれ独立して、C1−4アルキル基を示すか、またはR30、R31およびR32の2個以上がそれぞれ独立して、C1−4アルキル基を示す。)がより好ましい。
n1は、1〜5の整数であり;
n2は、1〜5の整数であり;
n1個のR26およびR27は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基であり;
n1個のX3は、それぞれ独立して、単結合またはメチレン基であり;
n2個のR28およびR29は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基であり;
n2個のX5は、それぞれ独立して、単結合またはメチレン基であり;
X4は、単結合またはメチレン基であり;および
R23、R24、R25、R31、R31およびR32は、メチル基である
基(但し、R26およびR27、および/またはR28およびR29が、共に水素原子であることはない)が挙げられる。
3,7,11,15−テトラメチルヘキサデシル基(別名:2,3−ジヒドロフィチル基);
3,7,11−トリメチルドデシル基;
2,2,4,8,10,10−ヘキサメチル−5−ドデカノイル基;
3,4,5−トリ(3’,7’,11’,15’−テトラメチルヘキサデシルオキシ)ベンジル基;および
3,5−ジ(3’,7’,11’,15’−テトラメチルヘキサデシルオキシ)ベンジル基。
**L−Y−Z (g−I)
[式中、
**は保護される基との結合位置を示し;
Lは、単結合、または式(a1)若しくは(a1’):
*は、Yとの結合位置を示し;
**は前記と同義であり;
R1およびR2は、それぞれ独立して、C1−22炭化水素基を示し;
L1は、置換されていてもよい2価のC1−22炭化水素基を示し;
L2は、単結合を示すか、または***C(=O)N(R3)−R4−N(R5)****(式中、***は、L1との結合位置を示し、****は、C=Oとの結合位置を示し、R4は、C1−22アルキレン基を示し、R3およびR5は、それぞれ独立して、水素原子若しくはC1−22アルキル基を示すか、またはR3およびR5が一緒になって、環を形成していてもよい。)で表される基を示す。)で表される基を示し;
Yは、単結合、酸素原子、またはNR(Rは、水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。)を示し;および
Zは、式(a2)、式(a2’)または式(a2”):
*は、結合位置を示し;
R6は、水素原子であるか、あるいはRbが、下記式(a3)で表される基である場合には、環Aまたは環BのR6は、R8と一緒になって単結合または−O−を示して、環Aまたは環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;
kは、1〜4の整数を示し;
k個のQは、それぞれ独立して、−O−、−C(=O)−、−C(=O)O−、−OC(=O)−、−C(=O)NH−または−NHC(=O)−を示し;
k個のR7は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
環Aおよび環Bは、それぞれ独立して、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく;
Raは、水素原子を示し;および
Rbは、水素原子、または式(a3):
*は、結合位置を示し;
jは、0〜4の整数を示し;
j個のQは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
j個のR9は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
R8は、水素原子を示すか、または環Aまたは環BのR6と一緒になって単結合または−O−を示して、環Aまたは環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;および
環Cは、j個のQR9に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。)で表される基を示すか、或いは
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成する。]で表される基を示す。]
式(a2)、式(a2’)および式(a2”)中のR7、並びに式(a3)中のR9が有するリンカーは、それぞれ独立して、好ましくは−O−、−C(=O)−、−C(=O)O−、−OC(=O)−、−C(=O)NH−または−NHC(=O)−であり、より好ましくは−O−である。
L1が、2価のC1−22炭化水素基、またはCH2−O−1,4−フェニレン−O−CH2であり;および
L2が、単結合であるか、または***C(=O)N(R3)−R4−N(R5)****(式中、***は、L1との結合位置を示し、****は、C=Oとの結合位置を示し、R4は、C1−6アルキレン基を示し、R3およびR5は、それぞれ独立して水素原子、若しくは置換されていてもよいC1−6アルキル基を示すか、またはR3およびR5が一緒になって、置換されていてもよいC1−6アルキレン基を形成していてもよい。)で表される基である、
基である。
L1が、2価のC1−22炭化水素基であり;および
L2が単結合である
基である。
L1が、エチレン基であり;および
L2が、***C(=O)N(R3)−R4−N(R5)****(式中、***は、L1との結合位置を示し、****は、C=Oとの結合位置を示し、R4は、C1−22アルキレン基を示し、R3およびR5は、それぞれ独立して、水素原子若しくはC1−22アルキル基を示すか、またはR3およびR5が一緒になって、環を形成していてもよい。)で表される基を示す。)で表される基である
基である。
L1が、エチレン基であり;および
L2が、***C(=O)N(R3)−R4−N(R5)****(式中、***は、L1との結合位置を示し、****は、C=Oとの結合位置を示し、N(R3)−R4−N(R5)部分が、1,4−ピペラジンジイル基を形成する。)で表される基である
基である。
L1が、エチレン基であり;および
L2が、***C(=O)N(R3)−R4−N(R5)****(式中、***は、L1との結合位置を示し、****は、C=Oとの結合位置を示し、R4は、ペンチレン基、またはヘキシレン基を示し、R3およびR5は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基を示す。)で表される基である
基である。
式(a1’)中のL1は、好ましくは2価のC6−10芳香族炭化水素基であり、より好ましくはフェニレン基である。
式(a1’)中のL2は、好ましくは単結合である。
式(a1’)中のL1およびL2の好ましい組合せとしては、L1が2価のC6−10芳香族炭化水素基であり、L2が単結合である、組合せである。式(a1’)中のL1およびL2のより好ましい組合せとしては、L1がフェニレン基であり、L2が単結合である、組合せである。
式(a1’)中のR1およびR2は、それぞれ独立して、好ましくはC1−22アルキル基であり、より好ましくはC1−10アルキル基である。
R1およびR2が、それぞれ独立して、C1−22アルキル基であり;
L1が、2価のC6−10芳香族炭化水素基であり;および
L2が、単結合である
基である。
R1およびR2が、それぞれ独立して、C1−10アルキル基であり;
L1が、フェニレン基であり;および
L2が、単結合である
基である。
RaおよびRbが、水素原子であり;
R6が、水素原子であり;
kが、1〜3の整数であり;
k個のQが、−O−であり;および
k個のR7が、それぞれ独立して、直鎖状のC10−40アルキル基である、
基である。
RaおよびRbが、水素原子であり;
R6が、水素原子であり;
kが、1〜3の整数であり;
k個のQが、−O−であり;
k個のR7が、それぞれ独立して、1〜3個の直鎖状のC10−40アルキル基が−O−を介して結合したベンジル基、または1〜3個の直鎖状のC10−40アルキル基が−O−を介して結合したシクロヘキシルメチル基であり;および
環Aが、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい、
基である。
Raが、水素原子であり;および
Rbが、式(a3)(式中、*は結合位置であり、jが、0〜3の整数であり、j個のQが、−O−であり、j個のR9が、それぞれ独立して、直鎖状のC10−40アルキル基であり、R6およびR8が、共に水素原子である。)で表される基である、
基である。
Raが、水素原子であり;および
Rbが、式(a3)(式中、*は結合位置であり、jが、0〜3の整数であり、j個のQが、−O−であり、j個のR9が、それぞれ独立して、直鎖状のC10−40アルキル基であり、R8は、R6と一緒になって単結合または−O−を示して、環Aおよび環Cと共に縮合環を形成する。)で表される基である、
基である。
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成し;
R6が、水素原子であり;
kが、1〜3の整数であり;
k個のQが、−O−であり;および
k個のR7が、それぞれ独立して、直鎖状のC10−40アルキル基である、
基である。
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成し;
R6が、水素原子であり;
kが、1〜3の整数であり;
k個のQが、−O−であり;
k個のR7が、それぞれ独立して、1〜3個の直鎖状のC10−40アルキル基が−O−を介して結合したベンジル基、または1〜3個の直鎖状のC10−40アルキル基が−O−を介して結合したシクロヘキシルメチル基であり;および
環Aが、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい、
基である。
RaおよびRbが、水素原子であり;
R6が、水素原子であり;
kが、1〜3の整数であり;
k個のQが、−O−であり;および
k個のR7が、それぞれ独立して、直鎖状のC10−40アルキル基である、
基である。
RaおよびRbが、水素原子であり;
R6が、水素原子であり;
kが、1〜3の整数であり;
k個のQが、−O−であり;
k個のR7が、それぞれ独立して、1〜3個の直鎖状のC10−40アルキル基が−O−を介して結合したベンジル基、または1〜3個の直鎖状のC10−40アルキル基が−O−を介して結合したシクロヘキシルメチル基であり;および
環Bが、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい、
基である。
Raが、水素原子であり;
Rbが、式(a3)(式中、*は結合位置であり、jが、0〜3の整数であり、j個のQが、−O−であり、j個のR9が、それぞれ独立して、C10−40アルキル基であり、R6およびR8が、共に水素原子である。)で表される基である、
基である。
Raが、水素原子であり;
Rbが、式(a3)(式中、*は結合位置であり、jが、0〜3の整数であり、j個のQが、−O−であり、j個のR9が、それぞれ独立して、直鎖状のC10−40アルキル基であり、R8は、R6と一緒になって単結合または−O−を示して、環Bおよび環Cと共に縮合環を形成する。)で表される基である、
基である。
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成し;
R6が、水素原子であり;
kが、1〜3の整数であり;
k個のQが、−O−であり;および
k個のR7が、それぞれ独立して、直鎖状のC10−40アルキル基である、
基である。
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成し;
R6が、水素原子であり;
kが、1〜3の整数であり;
k個のQが、−O−であり;
k個のR7が、それぞれ独立して、1〜3個の直鎖状のC10−40アルキル基が−O−を介して結合したベンジル基、または1〜3個の直鎖状のC10−40アルキル基が−O−を介して結合したシクロヘキシルメチル基であり;および
環Bが、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい、
基である。
Lが、スクシニル基であるか、または式(a1’)で表される基(式(a1’)中、R1およびR2が、それぞれ独立して、C1−10アルキル基であり、L1が、2価のフェニレン基であり、L2が、単結合である。)であり、および
Y−Zが、3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ基、3,5−ビス(ドコシルオキシ)ベンジルオキシ基、3,5−ビス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンジルオキシ基、3,4,5−トリス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンジルオキシ基、3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルアミノ基、2,4−ビス(ドコシルオキシ)ベンジルアミノ基、3,5−ビス(ドコシルオキシ)ベンジルアミノ基、ビス(4−ドコシルオキシフェニル)メチルアミノ基、4−メトキシ−2−[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンジルアミノ基、4−メトキシ−2−[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]ベンジルアミノ基、2,4−ビス(ドデシルオキシ)ベンジルアミノ基、フェニル(2,3,4−トリス(オクタデシルオキシ)フェニル)メチルアミノ基、ビス[4−(12−ドコシルオキシドデシルオキシ)フェニル]メチルアミノ基、3,5−ビス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンジルアミノ基、3,4,5−トリス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンジルアミノ基、3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5−ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5−ビス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、3,4,5−トリス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、2,4−ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、3,5−ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、ビス(4−ドコシルオキシシクロへキシル)メチルアミノ基、4−メトキシ−2−[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、4−メトキシ−2−[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、2,4−ビス(ドデシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、フェニル(2,3,4−トリス(オクタデシルオキシ)シクロへキシル)メチルアミノ基、ビス[4−(12−ドコシルオキシドデシルオキシ)シクロへキシル]メチルアミノ基、3,5−ビス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、または3,4,5−トリス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基である
基であるか、または
L−Yが、単結合またはスクシニル−1,4−ピペラジンジイル基であり、および
Zが、3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンゾイル基、3,5−ビス(ドコシルオキシ)ベンゾイル基、3,5−ビス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンゾイル基、または3,4,5−トリス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンゾイル基である
基である。
Lが、スクシニル基であり、および
Y−Zが、3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ基、3,5−ビス(ドコシルオキシ)ベンジルオキシ基、3,5−ビス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンジルオキシ基、3,4,5−トリス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンジルオキシ基、3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルアミノ基、2,4−ビス(ドコシルオキシ)ベンジルアミノ基、3,5−ビス(ドコシルオキシ)ベンジルアミノ基、ビス(4−ドコシルオキシフェニル)メチルアミノ基、4−メトキシ−2−[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンジルアミノ基、4−メトキシ−2−[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]ベンジルアミノ基、2,4−ビス(ドデシルオキシ)ベンジルアミノ基、フェニル(2,3,4−トリス(オクタデシルオキシ)フェニル)メチルアミノ基、ビス[4−(12−ドコシルオキシドデシルオキシ)フェニル]メチルアミノ基、3,5−ビス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンジルアミノ基、3,4,5−トリス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンジルアミノ基、3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5−ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5−ビス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、3,4,5−トリス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、2,4−ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、3,5−ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、ビス(4−ドコシルオキシシクロへキシル)メチルアミノ基、4−メトキシ−2−[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、4−メトキシ−2−[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、2,4−ビス(ドデシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、フェニル(2,3,4−トリス(オクタデシルオキシ)シクロへキシル)メチルアミノ基、ビス[4−(12−ドコシルオキシドデシルオキシ)シクロへキシル]メチルアミノ基、3,5−ビス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、または3,4,5−トリス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基である
基であるか、または
L−Yが、単結合またはスクシニル−1,4−ピペラジンジイル基であり、および
Zが、3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンゾイル基、3,5−ビス(ドコシルオキシ)ベンゾイル基、3,5−ビス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンゾイル基、または3,4,5−トリス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ]ベンゾイル基である。
Lが、スクシニル基であり、および
Y−Zが、3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ基、3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5−ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5−ビス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、3,4,5−トリス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、2,4−ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、3,5−ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、4−メトキシ−2−[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、4−メトキシ−2−[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、2,4−ビス(ドデシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、3,5−ビス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、または3,4,5−トリス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基である
基であるか、または
L−Yが、単結合またはスクシニル−1,4−ピペラジンジイル基であり、および
Zが、3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンゾイル基である
基である。
Lが、スクシニル基であり、および
Y−Zが、3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ基、3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基またはフェニル(2,3,4−トリス(オクタデシルオキシ)フェニル)メチルアミノ基である
基であるか、または
L−Yが、スクシニル−1,4−ピペラジンジイル基であり、および
Zが、3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンゾイル基である
基である。
Lが、スクシニル基であり、および
Y−Zが、3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ基、または3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基である
基であるか、または
L−Yが、スクシニル−1,4−ピペラジンジイル基であり、および
Zが、3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンゾイル基である
基である。
で表される基を示し、Y1はハロゲン原子等の脱離基を示し、他の記号は、前記と同義である。]
本工程は、式(IV)で表される化合物(以下、化合物(IV)と略称する。)のQ’H(ここで、Q’は、−O−、−S−、−C(=O)O−または−NH−を示す。)にR7を導入することにより、式(IVa)で表される化合物(以下、化合物(IVa)と略称する。)を製造する工程である。この反応は、Q’が、−O−、−S−または−NH−の場合、反応に影響を及ぼさない溶媒中、塩基の存在下または非存在下で、R7に対応するハロゲン化物(塩化物、臭化物またはヨウ化物)、R7に対応するカルボン酸若しくは酸ハロゲン化物またはR7に対応するアルキルスルホニルオキシ化物(例えば、メタンスルホニルオキシ化物等)若しくはアリールスルホニルオキシ化物(例えば、p−トルエンスルホニルオキシ化物等)を用いて行われる。また、Q’が−O−の場合、化合物(IV)とR7に対応する水酸化物をトリフェニルホスフィンおよびアゾジカルボン酸ジイソプロピル存在下で反応させる光延反応条件下で、この反応を行うこともできる。さらにQ’が−C(=O)O−の場合、例えば、化合物(IV)とR7に対応するアミン若しくは水酸化物を後述する縮合剤の存在下で反応させることにより化合物(IVa)を合成することができる。
本工程は、化合物(IVa)を還元することにより、式(I−a)で表される化合物(以下、化合物(I−a)と略称する。)を製造する工程である。この還元反応は、還元剤を用いる方法により行うことができる。
本工程は、化合物(IVa)(式(IVa)中、Rgは、水素原子またはORh基ではない。)を、上記工程(b)と同様の方法により還元する工程である。
本工程は、化合物(IVa)(式(IVa)中、Rgは水素原子である)を、オキシム化することにより、式(I’−a)で表される化合物(以下、化合物(I’−a)と略称する。)を製造する工程である。
本工程は、化合物(I’−a)を、パラジウム−炭素、ラネーニッケル等の金属触媒存在下の接触水素添加反応、または前記工程(b)と同様の金属水素化物等の還元剤により還元することにより、式(I−b)で表される化合物(以下、化合物(I−b)と略称する。)を製造する工程である。
本工程は、化合物(I−a)を、例えば塩化アセチル、塩化チオニル等のクロル化剤、または、例えば臭化アセチル、三臭化リン、ジフェニルホスフィン/臭素等のブロム化剤を用いてハロゲン化することにより、式(I’−b)で表される化合物(以下、化合物(I’−b)と略称する。)を製造する工程である。
本工程は、化合物(I’−b)をアジ化ナトリウム等のアジド化剤を用いてアジド化することにより、式(I’−c)で表される化合物(以下、化合物(I’−c)と略称する。)を製造する工程である。この反応は、反応に影響を及ぼさない溶媒中、化合物(I’−b)をアジド化剤と反応させることにより行われる。
本工程は、化合物(I’−c)をアミノ化することにより、化合物(I−b)を製造する工程である。この反応は、反応に影響を及ぼさない溶媒中、水存在下、化合物(I’−c)をトリフェニルホスフィンと反応させるか、接触水素化還元により行われる。
本工程は、化合物(I’−b)をRNH2(Rは前記と同義である)と反応させることにより、Yが−NHR基である式(I−c)で表される化合物(以下、化合物(I−c)と略称する。)を製造する工程である。本工程は、反応に影響を及ぼさない溶媒中、必要により、例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン等の第3級アミン等の塩基の存在下、化合物(I’−b)をR−NH2で表されるアミンと反応させることにより行われる。
本工程は、化合物(I−d)を−CONH2基または−OCONH2基を有する化合物と反応させた後、塩基で処理することにより、化合物(I−e)を製造する工程である。化合物(I−d)と−CONH2基または−OCONH2基を有する化合物との反応は、反応に影響を及ぼさない溶媒中、酸触媒下で行われる。
(1)R7に対応する水酸化物のハロゲン化、アルキルスルホニルオキシ化またはアリールスルホニルオキシ化により、或いは
(2)R7に対応する不飽和水酸化物の還元反応(例えば、白金−炭素(Pt/C)、パラジウム−炭素(Pd/C)、ロジウム−炭素(Rh/C)、ラネーニッケル等の金属触媒の存在下での接触水素添加反応等)、およびそれに続くハロゲン化、アルキルスルホニルオキシ化またはアリールスルホニルオキシ化により、
製造することができる。
(1)R7に対応するハロゲン化物(塩化物、臭化物、またはヨウ化物)、R7に対応するカルボン酸若しくは酸ハロゲン化物を用いるフリーデルクラフツ反応、
(2)上記化合物(IV)に対応する化合物(但し、Q’Hが−CHO基に置き換わった化合物)をWittig反応により増炭させた後に、接触水素添加等する方法、または
(3)金属触媒を使用したクロスカップリング等の慣用の有機合成反応
によって行うことができる。
mは、0以上の整数を示し;
m+1個のBaseは、それぞれ独立して、保護されていてもよい核酸塩基を示し;
m+1個のXは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、または2位炭素原子および4位炭素原子と結合する2価の有機基を示し;
m+1個のXn1は、それぞれ独立して、酸素原子またはNHを示し;
m個のR10は、それぞれ独立して、酸素原子または硫黄原子を示し;
m個のRp1は、それぞれ独立して、リン酸基の保護基を示し;
L、YおよびZは、前記と同義である。]
WGの電子吸引性基としては、例えば、シアノ基、ニトロ基等が挙げられ、好ましくはシアノ基である。
m+1個のXn1は、好ましくは酸素原子である。
L、YおよびZの説明は、前記の通りである。
m、m個のBase、m+1個のX、m個のR10、m個のRp1、L、YおよびZは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
R11は、メチル基を示し、R12およびR13は、それぞれ独立してC1−5アルキル基を示すか、またはR11およびR12が一緒になって、それらが結合する炭素原子および窒素原子と共に5員または6員の含窒素炭化水素環を形成していてもよい。]
式(a−II)において、mが0であることが好ましい。即ち、化合物(a−II)の中で、式(a−III)で表される化合物(即ち、ヌクレオシド)が好ましい(下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである)。
式(a−II)および式(a−III)における他の記号の説明は、前記の通りである。
m、m+1個のBase、m+1個のX、m個のR10、m個のRp1、LおよびYは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
Z’は、式(a2”):
*は、結合位置を示し;
R6は、水素原子であるか、あるいはRbが、下記式(a3)で表される基である場合には、R8と一緒になって単結合または−O−を示して、環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;
kは、1〜4の整数を示し;
k個のQは、それぞれ独立して、−O−、−C(=O)−、−C(=O)O−、−OC(=O)−、−C(=O)NH−または−NHC(=O)−を示し;
k個のR7は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
環Bは、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく;
Raは、水素原子を示し;および
Rbは、水素原子、または式(a3):
jは、0〜4の整数を示し;
j個のQは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
j個のR9は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
R8は、水素原子を示すか、またはR6と一緒になって単結合または−O−を示して、環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;および
環Cは、j個のQR9に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。)で表される基を示すか、或いは
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成する。]で表される基を示す。]
式(a−IV)において、mが0であることが好ましい。
式(a−IV)における他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物(a−IV)の中で、下記式(a−V)で表される化合物(即ち、ヌクレオシド)が好ましい(下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである)。
Lが、スクシニル基であるか、または式(a1’)で表される基(式(a1’)中、R1およびR2が、それぞれ独立して、C1−10アルキル基であり、L1が、2価のフェニレン基であり、L2が、単結合である。)であり、および
Y−Z’が、3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5−ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5−ビス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、3,4,5−トリス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、2,4−ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、3,5−ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、4−メトキシ−2−[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、4−メトキシ−2−[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、2,4−ビス(ドデシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、3,5−ビス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、または3,4,5−トリス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基である
組合せが、固液分離のために好ましい。
Lが、スクシニル基であり、および
Y−Z’が、3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5−ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5−ビス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、3,4,5−トリス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、2,4−ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、3,5−ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、4−メトキシ−2−[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、4−メトキシ−2−[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、2,4−ビス(ドデシルオキシ)シクロヘキシルメチルアミノ基、3,5−ビス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基、または3,4,5−トリス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルアミノ基である
組合せが、固液分離のためにより好ましい。
Lが、スクシニル基であり、および
Y−Z’が、3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5−ビス(ドコシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基、3,5−ビス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基、または3,4,5−トリス[3’,4’,5’−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ]シクロヘキシルメチルオキシ基である
組合せが、固液分離のためにさらに好ましい。
Lが、スクシニル基であり、および
Y−Z’が、3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)シクロヘキシルメチルオキシ基である
組合せが、固液分離のために特に好ましい。
m+1個のBase1の少なくとも一つは、−L−Y−Zで保護されている核酸塩基を示し、残りは保護されていてもよい核酸塩基を示し;
m個のXn1は、それぞれ独立して、酸素原子またはNHを示し;
Xn2は、保護されている水酸基またはアミノ基を示し;
m、m+1個のX、m個のR10、m個のRp1、L、YおよびZは、それぞれ独立して、前記と同義である。]
また、保護されていてもよい核酸塩基の説明も、前記の通りである。
式(a−VI)中のXn2は、好ましくは保護されている水酸基である。
式(a−VI)中のm個のRp1は、好ましくは、それぞれ独立して−CH2CH2WGで表される基である。
式(a−VI)中の他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物(a−VI)は、好ましくは下記式(a−vi)で表される化合物である。
Rn4は、水酸基の保護基を示し;
m、m+1個のBase1、m+1個のX、m個のR10、m個のRp1、L、YおよびZは、それぞれ独立して、前記と同義である。]
式(a−vi)中の他の記号の説明は、前記の通りである。
m+1個のXn1は、それぞれ独立して、酸素原子またはNHを示し;
Ln1は有機基を示し;
m、m+1個のBase、m+1個のX、m+1個のR10、m+1個のRp1、L、YおよびZは、それぞれ独立して、前記と同義である。]
式(a−VII)中のm+1個のXn1は、好ましくは酸素原子である。
式(a−VII)中のm+1個のRp1は、好ましくは、それぞれ独立して−CH2CH2WGで表される基である。
式(a−VII)中の他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物(a−VII)は、好ましくは下記式(a−vii)で表される化合物である(下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである)。
(i)化合物Z−Y−Hとコハク酸無水物とを縮合させて、Z−Y−CO(CH2)2COOHを製造する、
(ii)得られたZ−Y−CO(CH2)2COOHを、縮合剤の存在下、式:HO−Ln1−OQ”で表される化合物(前記式中、Q”は一時保護基を示し、Ln1は有機基を示す。)と縮合させた後、脱保護して、Z−Y−CO(CH2)2CO−O−Ln1−OHを製造する、
(iii)得られたZ−Y−CO(CH2)2CO−O−Ln1−OHにホスホロアミダイト化されたヌクレオシドを反応させて、mが0であり、Xn1が酸素原子であり、Lがスクシニル基である化合物(a−VII)を製造する。
上述のような縮合反応および脱保護反応は当業者にとって周知であり、当業者は、適宜条件を設定して行うことができる。
(P1)溶媒中で、下記式(p1):
Xp1は、酸素原子または硫黄原子を示し;
Rp2は、芳香環、水酸基の保護基またはチオール基の保護基を示し;
Rp3およびRp4は、それぞれ独立してアルキル基を示し、該アルキル基は、隣接する窒素原子と一緒になって環を形成してもよい。]
で表されるホスフィチル化剤前駆体に活性化剤を作用させて、下記式(p2):
Zaは活性化剤に由来する基を示し;
他の記号は、前記と同義である。]
で表されるホスフィチル化剤を調製する工程、および
(P2)溶媒中で、化合物(b)に、塩基の存在下、工程(P1)で得られたホスフィチル化剤を作用させて、化合物(b)の3’位水酸基をホスフィチル化する工程
式(p1)中、Rp2の芳香環としては、フェニル、4−ニトロフェニル、2,4−ジニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル、ペンタクロロフェニル、2−ブロモフェニル、4−ブロモフェニル、2−メチルフェニル、2,6−ジメチルフェニル等が挙げられ、好ましくは4−ニトロフェニルである。
ホスフィチル化剤前駆体としては、下記化合物が特に好ましい。
活性化剤は、ホスホロアミダイト上のアミンを置換して、水酸基等との反応性置換基を付与し得る酸である。具体的には、pKa 5以上の弱酸性活性化剤、より好ましくはpKa 5以上のアゾール系化合物およびそのC上置換体から選ばれる少なくとも1種である。アゾール系化合物としては、テトラゾール、トリアゾール、イミダゾール等が挙げられ、C上置換体としては、ジシアノイミダゾール、ビス(トリフルオロメチル)イミダゾール、ジクロロイミダゾール等のハロゲン原子でジ置換された化合物が用いられる。特に好ましくはジシアノイミダゾールおよびジクロロイミダゾールである。
本工程では、溶媒中で、化合物(b)に、塩基の存在下、工程(P1)で得られたホスフィチル化剤を作用させて、化合物(b)の3’位水酸基をホスフィチル化し、ホスホロアミダイト化された化合物(b)を製造する。
qは、0以上の整数を示し;
q+1個のBase2は、それぞれ独立して、−L−X−Zおよび核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよい核酸塩基を示し;
q+1個のX、q+1個のRp1、q個のR10、L、XおよびZは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
q+1個のXn1は、それぞれ独立して、酸素原子またはNHを示し;
Q”は、酸性条件下で除去可能な水酸基の一時保護基を示し;
R36およびR37は、それぞれ独立して、アルキル基を示すか、または隣接する窒素原子と一緒になって形成する5または6員の飽和環状アミノ基を示し、かかる飽和環状アミノ基は、窒素原子の他に環構成原子として酸素原子または硫黄原子を1個有していてもよい。]
Base2は、それぞれ独立して、好ましくは核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよい核酸塩基である。
q+1個のRp1は、それぞれ独立して、好ましくはCH2CH2WGで表される基である。
q+1個のXn1は、好ましくは酸素原子である。
L、XおよびZの説明は、前記の通りである。
化合物(b−I)は、好ましくは下記式(b−i)で表される化合物である。
q+1個のBase3は、それぞれ独立して、核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい核酸塩基を示し、
q、q+1個のX、q+1個のRp1、q個のR10、Q”、R36およびR37は、それぞれ独立して、前記と同義である。]
好ましくは化合物(a−I)、化合物(a−VI)または化合物(a−VII)と化合物(b−I)との組合せであり、
より好ましくは化合物(a−i)、化合物(a−vi)または化合物(a−vii)と化合物(b−i)との組合せであり、
より一層好ましくは化合物(a−i)または化合物(a−vi)と化合物(b−i)との組合せであり、
さらに好ましくは化合物(a−i)と化合物(b−i)との組合せであり、
さらに一層好ましくは化合物(a−II)または化合物(a−IV)と化合物(b−i)との組合せであり、
特に好ましくは化合物(a−III)または化合物(a−V)と化合物(b−i)との組合せである。
本発明では、工程(1)(縮合)の後に工程(3)(酸化または硫化)および工程(4)(脱保護)を行う。そのため、工程(3)および(4)の際の副生成物の生成を抑制するために、工程(3)の前にヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)をクエンチすることが好ましい。そのため、本発明の製造方法は、縮合後の反応液にクエンチ剤を添加する工程(2)を含むことが好ましい。
本工程は、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイトトリエステル体(c)に酸化剤または硫化剤を反応させることにより、そのホスファイトトリエステル結合をホスフェートトリエステル結合またはチオホスフェートトリエステル結合へと変換させて、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたオリゴヌクレオチド(d)を得る工程である。酸化剤を使用する場合、その1種のみを使用してもよく、2種以上を併用してもよい。また、硫化剤を使用する場合も、その1種のみを使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
本工程は、オリゴヌクレオチド(d)の一時保護基を酸によって除去し、5’位水酸基が保護されていないオリゴヌクレオチド(e)を得る工程である。酸は、1種のみを使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
工程(4)(脱保護)の後に、工程(4)で使用した酸を中和するため、反応液に塩基を添加してもよい。但し、本発明の製造方法では、工程(4)の後に、必要に応じて、工程(6)(固液分離または抽出)および洗浄を行うことによって、工程(4)で使用した酸をオリゴヌクレオチド(e)から除去することが可能である。そのため、工程(5)は必須ではない。
本工程は、オリゴヌクレオチド(e)を含む反応液に極性溶媒を添加し、オリゴヌクレオチド(e)を沈殿させて精製するか(固液分離)、または反応液に極性溶媒を添加し、極性溶媒−非極性溶媒間で分層させ、非極性溶媒層にオリゴヌクレオチド(e)を移行させて精製する(抽出)工程である。固液分離および抽出のいずれの場合も、極性溶媒は、1種のみを使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
本発明の製造方法は、工程(6)(固液分離または抽出)の後に、得られたオリゴヌクレオチドの保護基を全て除去した後、保護されていないオリゴヌクレオチドを単離する工程を含んでいてもよい。脱保護の方法としては、例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス(PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS)、第3版、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ(JOHN WILLY&SONS)出版(1999年)等に記載されている脱保護方法に従い、オリゴヌクレオチドの全ての保護基を除去する工程を行うことができる。具体的には、アンカー、および核酸塩基の保護基であるフェノキシアセチル基、アセチル基等、リン酸骨格を保護しているシアノエチル基等は、アンモニア水、アンモニア水/エタノール溶液、またはアンモニア水とメチルアミン水溶液の混合液で処理することにより、全て除去することができる。また、5’水酸基の保護基は、工程(4)で使用される酸またはそれらを適宜希釈した溶液で処理することにより除去することができる。保護されていない(即ち、保護基を有さない)オリゴヌクレオチドは酵素により容易に分解されやすいため、空気清浄度管理下で、保護されていないオリゴヌクレオチドを単離することが好ましい。
5’−3’合成である本発明の製造方法は、以下の工程(1’)、(3’)、(4’)および(6’)を含む。この製造方法は、必要に応じて、さらに以下の工程(2’)、(5’)および(7’)を含んでいてもよい。
(1’)非極性溶媒中、
3’位水酸基または3’位アミノ基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および5’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の5’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)、或いは
3’位水酸基または3’位アミノ基が保護されておらず、5’位リン酸基の一つの水酸基が−OLn1−OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、−OLn1−OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)
を含む反応液に、
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基または3’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
を添加して、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)とヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)とを縮合させ、3’位水酸基または3’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイトトリエステル体(c’)を含む反応液を得る工程;
(2’)必要に応じて、縮合後の反応液にクエンチ剤を添加する工程;
(3’)ホスファイトトリエステル体(c’)を含む反応液に酸化剤または硫化剤を添加して、ホスファイトトリエステル体(c’)を酸化または硫化し、3’位水酸基または3’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたオリゴヌクレオチド(d’)を含む反応液を得る工程;
(4’)酸化または硫化後の反応液に酸を添加して3’位水酸基または3’位アミノ基の一時保護基を除去し、3’位水酸基または3’位アミノ基が保護されていないオリゴヌクレオチド(e’)を含む反応液を得る工程;
(5’)必要に応じて、オリゴヌクレオチド(e’)を含む反応液に塩基を添加して中和する工程;
(6’)必要に応じて、オリゴヌクレオチド(e’)を含む反応液に極性溶媒を添加し、沈殿したオリゴヌクレオチド(e’)を得る工程;および
(7’)必要に応じて、得られたオリゴヌクレオチドの保護基を全て除去した後、保護されていないオリゴヌクレオチドを単離する工程。
本工程で使用するヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)は、酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され3’位水酸基または3’位アミノ基を有する。水酸基の一時保護基の説明は、工程(1)での説明と同じである。
3’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および5’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の5’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)、或いは
3’位水酸基が保護されておらず、5’位リン酸基の一つの水酸基が−OLn1−OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、−OLn1−OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)、並びに
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
が使用される。
3’位水酸基が保護されておらず、5’位リン酸基の一つの水酸基が−OLn1−OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、−OLn1−OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)、並びに
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
が使用される。
3’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および5’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の5’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(a’)、並びに
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
が使用される。
m、m+1個のBase、m+1個のX、m個のR10、m個のRp1、L、YおよびZは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
m個のXn1は、それぞれ独立して、酸素原子またはNHを示し;
Xn3は、水酸基またはアミノ基を示す。]
式(a−I’)中のXn3は、好ましくは水酸基である。
式(a−I’)中のm個のRp1は、好ましくは、それぞれ独立して−CH2CH2WGで表される基である。
式(a−I’)中の他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物(a−I’)は、好ましくは下記式(a−i’)で表される化合物である(下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである)。
式(a−II’)において、mが0であることが好ましい。
式(a−II’)における他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物(a−II’)の中で、下記式(a−III’)で表される化合物(即ち、ヌクレオシド)が好ましい(下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである)。
式(a−IV’)において、mが0であることが好ましい。
式(a−IV’)における他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物(a−IV’)の中で、下記式(a−V’)で表される化合物(即ち、ヌクレオシド)が好ましい(下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである)。
m+1個のBase1の少なくとも一つは、−L−Y−Zで保護されている核酸塩基を示し、残りは保護されていてもよい核酸塩基を示し;
m個のXn1は、それぞれ独立して、酸素原子またはNHを示し;
Xn3は、水酸基またはアミノ基を示し;
Rn4は、水酸基の保護基を示し;
m、m+1個のX、m個のR10、m個のRp1、L、YおよびZは、それぞれ独立して、前記と同義である。]
式(a−VI’)中のXn3は、好ましくは水酸基である。
式(a−VI’)中のm個のRp1は、好ましくは、それぞれ独立して−CH2CH2WGで表される基である。
式(a−VI’)中の他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物(a−VI’)は、好ましくは下記式(a−vi’)で表される化合物である(下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである)。
m+1個のXn1は、それぞれ独立して、酸素原子またはNHを示し;
Xn3は、水酸基またはアミノ基を示し;
Ln1は有機基を示し;
m、m+1個のBase、m+1個のX、m+1個のR10、m+1個のRp1、L、YおよびZは、それぞれ独立して、前記と同義である。]
式(a−VII’)中のm+1個のRp1は、好ましくは、それぞれ独立して−CH2CH2WGで表される基である。
式(a−VII’)中の他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物(a−VII’)は、好ましくは下記式(a−vii’)で表される化合物である(下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである)。
q+1個のBase2は、それぞれ独立して、−L−X−Zおよび核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよい核酸塩基を示し;
q個のXn1は、それぞれ独立して、酸素原子またはNHを示し;
Xn4は、酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されている水酸基またはアミノ基を示し;
q、q+1個のX、q+1個のRp1、q個のR10、R36、R37およびQ”は、それぞれ独立して、前記と同義である。]
式(b−I’)中のq+1個のRp1は、好ましくは、それぞれ独立して−CH2CH2WGで表される基である。
式(b−I’)中の他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物(b−I’)は、好ましくは下記式(b−i’)で表される化合物である(下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである)。
好ましくは化合物(a−I’)、化合物(a−VI’)または化合物(a−VII’)と化合物(b−I’)との組合せであり、
より好ましくは化合物(a−i’)、化合物(a−vi’)または化合物(a−vii’)と化合物(b−i’)との組合せであり、
さらに好ましくは化合物(a−i’)または化合物(a−vii’)と化合物(b−i’)との組合せであり、
特に好ましくは化合物(a−vii’)と化合物(b−i’)との組合せである。
本工程は、オリゴヌクレオチド(d’)の3’位水酸基または3’位アミノ基の一時保護基を酸によって除去し、3’位水酸基または3’位アミノ基が保護されていないオリゴヌクレオチド(e’)を得る工程である。酸は、1種のみを使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
アミノ基の一時保護基の除去に使用する酸としては、良好な脱保護が達成できさえすれば特に限定されないが、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、塩酸、酢酸、p−トルエンスルホン酸等を使用することが好ましい。これら酸は、前記非極性溶媒で希釈しても構わない。アミノ基の一時保護基の除去における酸の使用量は、オリゴヌクレオチド(d’)1モルに対し、例えば1〜100モル、好ましくは1〜40モルである。アミノ基の一時保護基の除去のための反応温度は、反応が進行しさえすれば特に限定されないが、−10℃〜50℃が好ましく、0℃〜40℃がより好ましい。アミノ基の一時保護基の反応時間は、使用するオリゴヌクレオチド(d’)、酸の種類および非極性溶媒の種類、反応温度等により異なるが、例えば5分〜5時間である。
工程(6)または(6’)(固液分離または抽出)により得られたオリゴヌクレオチド(e)または(e’)、或いは工程(7)または(7’)(脱保護および単離)により得られた保護されていないオリゴヌクレオチドは、さらに有機合成反応を施すことにより、所望の誘導体へと導くこともできる。本発明の製造方法によって得られたオリゴヌクレオチドは、人体用または動物用の医薬品(RNA、DNA、オリゴ核酸医薬、等)、機能性食品、特定保健食品、食品、化成品、生体用や工業用の高分子材料等の各種用途に使用することができる。
本発明は、上述の工程(1)または工程(1’)で使用し得る、下記式(I)で表される化合物(即ち、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド)を提供する。
m、m+1個のBase、m+1個のX、m個のR10、およびm個のRp1は、それぞれ独立して、前記と同義であり;
Rn1およびRn2の一つが水素原子を示し、残りの一つが式(II)で表される基を示す(下記式中の記号の定義は、前記の通りである)。]
式(I)および(II)中のm+1個のRp1は、好ましくは、それぞれ独立して−CH2CH2WGで表される基である。
式(II)中のLn1は、好ましくはC2−6アルキレン基、より好ましくはエチレン基である。
式(I)中のmは、好ましくは0である。
式(I)および式(II)中の他の記号の説明は、前記の通りである。
後述の実施例等で使用する略号の意味は、以下の通りである。
DMTr:4,4’−ジメトキシトリチル
TOB:3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシ
SUC:スクシニル
Ac−TOB:3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル アセテート
HO−dA−SUC−TOB:N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−イル 3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート
HO−dT−SUC−TOB:デオキシチミジン 3’−イル 3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート
HO−U−SUC−TOB:2’−O−メチル−ウリジン−3’−イル 3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート
MeOC(O)−TOB:メチル 3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンゾエート
HO−(CH2)2−SUC−TOB:3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル 2−ヒドロキシエチル スクシネート
CSO:(1S)−(+)−(10−カンファニルスルホニル)オキサジリジン
DBU:1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]−7−ウンデセン
DDTT:5−[(N,N−ジメチルアミノメチリデン)アミノ]−3H−1,2,4−ジチアゾール−3−チオン
DPTT:ジペンタメチレンチウラムテトラスルフィド
PADS:フェニルアセチルジスルフィド
rAOMe(Bz)−CE ホスホロアミダイト:5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N6−ベンゾイル−2’−O−メチル−アデノシン−3’−[O−(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト
2’−OMe−rA(Bz)−CE ホスホロアミダイト:5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N6−ベンゾイル−2’−O−メチル−アデノシン−3’−[O−(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト
dG−CE ホスホロアミダイト:5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N2−イソブチリル−デオキシアデノシン−3’−[O−(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト
dT−CE ホスホロアミダイト:5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)デオキシチミジン−3’−[O−(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト
U−CE ホスホロアミダイト:5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−O−メチル−ウリジン−3’−[O−(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト
dT−5’−CE ホスホロアミダイト:3’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)デオキシチミジン−5’−[O−(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト
Cm(Bz)−CE ホスホロアミダイト:5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N4−ベンゾイル−2’−O−メチル−シチジン−3’−[O−(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト
GMOE(iBu)−CE ホスホロアミダイト:5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N2−イソブチリル−2’−O−メトキシエチル−グアノシン−3’−[O−(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト
AMOE(Bz)−CE ホスホロアミダイト:5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N6−ベンゾイル−2’−O−メトキシエチル−アデノシン−3’−[O−(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト
TMOE−CE ホスホロアミダイト:5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−O−メトキシエチル−チミジン−3’−[O−(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト
2’F−U−CE ホスホロアミダイト:5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−フルオロ−ウリジン−3’−[O−(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト
2’F−G−CE ホスホロアミダイト:5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N2−イソブチリル−2’−フルオロ−グアノシン−3’−[O−(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト
N4−ベンゾイル−5−Me−dC−CE ホスホロアミダイト:5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N4−ベンゾイル−2’−デオキシ−5−メチルシチジン−3’−[O−(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト
(1)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
上記(1)と同様の操作をさらに18回繰返して、19量体(デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−ベンゾイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N2−イソブチリル−デオキシグアノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−ベンゾイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N2−イソブチリル−デオキシグアノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N2−イソブチリル−デオキシグアノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N2−イソブチリル−デオキシグアノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−イル 3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を得た(2.78g)。
アルゴン雰囲気下、200mL四口フラスコに上記(2)で得られた19量体(2.78g)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(2.0mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(287mg,1.49mmol)とdT−CE ホスホロアミダイト(1.11g,1.49mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。DDTT(338mg,1.64mmol)を加え、室温で30分間撹拌した後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過後、乾燥して、20量体(5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−アセチル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−アセチル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N2−イソブチリル−デオキシグアノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−アセチル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N2−イソブチリル−デオキシグアノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N2−イソブチリル−デオキシグアノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホリル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N2−イソブチリル−デオキシグアノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホリル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−イル 3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を白色固体として得た(2.79g)。
アルゴン雰囲気下、100mL二口フラスコに、上記(3)で得られた20量体(1.00g)を入れ、脱水ジクロロメタン(10m)に溶解させた。5−メトキシインドール(245mg,1.66mmol)とトリフルオロ酢酸(100μL,1.31mmol)を加え、室温で1.5時間撹拌した後、2,4,6−トリメチルピリジン(190μL,1.44mmol)により中和した後、アセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、DMTr基が除去された20量体(デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−アセチル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−アセチル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N2−イソブチリル−デオキシグアノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−アセチル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N2−イソブチリル−デオキシグアノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホリル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N2−イソブチリル−デオキシグアノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N2−イソブチリル−デオキシグアノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−イル 3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を白色固体として得た(867mg)。
上記(4)で得られた20量体(20mg)と30重量%アンモニア水(5.00mL)の混合物をオートクレーブに入れて、55℃で16時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物であるデオキシチミジン−3’−ホスホロチオニル−デオキシシチジン−3’−ホスホロチオニル−デオキシシチジン−3’−ホスホロチオニル−デオキシシチジン−3’−ホスホロチオニル−デオキシグアノシン−3’−ホスホロチオニル−デオキシシチジン−3’−ホスホロチオニル−デオキシシチジン−3’−ホスホロチオニル−デオキシチミジン−3’−ホスホロチオニル−デオキシグアノシン−3’−ホスホロチオニル−デオキシチミジン−3’−ホスホロチオニル−デオキシグアノシン−3’−ホスホロチオニル−デオキシアデノシン−3’−ホスホロチオニル−デオキシシチジン−3’−ホスホロチオニル−デオキシアデノシン−3’−ホスホロチオニル−デオキシチミジン−3’−ホスホロチオニル−デオキシグアノシン−3’−ホスホロチオニル−デオキシシチジン−3’−ホスホロチオニル−デオキシアデノシン−3’−ホスホロチオニル−デオキシチミジン−3’−ホスホロチオニル−デオキシチミジンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0−10min;5 to 60%、λ=260nm):Rt=6.87min(83.3area%);TOF/MS:6646.05
(1)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブ中にHO−dT−SUC−TOB(100mg,81μmol)とMeOC(O)−TOB(100mg,106μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(4.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(46.6mg,242μmol)とdT−CE ホスホロアミダイト(181mg,242μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に2,2,2−トリフルオロエタノール(86.6μL,1.21mmol)を加え、室温で15分間撹拌した。さらに酢酸(13.9μL,242μmol)と2,4,6−トリメチルピリジン(31.9μL,242μmol)の混合物と、DDTT(54.7mg,267μmol)を加え、室温で30分間撹拌した後、5−メトキシインドール(238mg,1.62mmol)とトリフルオロ酢酸(55.7μL,727μmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。反応液中にアセトニトリル(10mL)を添加し、析出した固体を、アセトニトリル(20mL)で洗浄しながらキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、減圧乾燥して、2量体(デオキシチミジン−3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン−3’−イル−[3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(222mg,収率96%)。
上記(1)と同様の操作をさらに1回繰返して、3量体(N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホリル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホリル−デオキシチミジン 3’−イル 3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を得た(251mg,収率89%)。
TOF/MS:1557.0116
(1)反応液の調製
アルゴン雰囲気下、HO−dT−SUC−TOB(100mg,80.8μmol)とMeOC(O)−TOB(100mg,106μmol)を脱水ジクロロメタン(4.0mL)に溶解させた。この溶液に脱水アセトニトリル(0.5mL)中に溶解させて調製したdG−CE ホスホロアミダイト(204mg,242μmol)と5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(46.5mg,242μmol)の混合物を加えて、室温で30分間撹拌した。反応終了を薄層クロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール=10/1(体積比))で確認した後、表1に示す種類および量のクエンチ剤を加えて室温で30分間撹拌し、次いで表1に示す酸化剤(254μmol,ホスホロアミダイトモノマーに対して1.05モル当量)を添加して室温で1時間撹拌して、反応液を調製した。
得られた反応液(50μL)を1.5mLバイアル瓶の中に分取し、テトラヒドロフラン(450μL)で希釈した後、DBU(20μL)を入れて、30秒間撹拌して、試験液を調製した。
得られた試験液を、LC−TOF MS(Agilent6230)により質量分析した。観測された各化合物(目的化合物および副生成物)のアバンダンスをもとに、下記式により副生成物の量を算出した。
ブランチ体の量(%)
=(ブランチ体のアバンダンス/目的化合物のアバンダンス)×100
リン酸トリエステル切断体の量(%)
=(リン酸トリエステル切断体のアバンダンス/目的化合物のアバンダンス)×100
ここで、目的化合物とは、反応液中に含まれる目的のオリゴヌクレオチドを指し、ブランチ体とは、目的化合物の核酸塩基におけるアミノ基の保護基が脱落し、該アミノ基とモノマーとが結合して生成した副生成物を指し、リン酸トリエステル切断体とは、目的化合物のリン酸トリエステルが切断して生成した副生成物を指す。結果を表1に示す。
(1)反応液の調製
アルゴン雰囲気下、HO−dT−SUC−TOB(100mg,80.8μmol)を脱水ジクロロメタン(4.0mL)に溶解させた後、rAOMe(Bz)−CE ホスホロアミダイト(215mg,242μmol)と5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(46.5mg,242μmol)の脱水アセトニトリル(0.5mL)混合溶液を加えて、室温で1時間撹拌した。反応終了を薄層クロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール=10/1(体積比))で確認した後、表2に示す種類および量のクエンチ剤を加えて室温で30分間撹拌し、次いでCSO(58.2mg,254μmol)を加えて室温で1時間撹拌した。さらに反応液に5−メトキシインドール(238mg,1.62mmol)とトリフルオロ酢酸(92.5μL,1.21mmol)を加えて室温で18時間撹拌し、反応液を調製した。
試験例1と同様にして、調製した試験液を質量分析し、観測された各化合物(目的化合物および副生成物)のアバンダンスをもとに、下記式により副生成物の量を算出した。
+1量体の量(%)
=(+1量体のアバンダンス/目的化合物のアバンダンス)×100
塩基部脱保護体の量(%)
=(塩基部脱保護体のアバンダンス/目的化合物のアバンダンス)×100
ここで、+1量体とは、目的化合物にさらに余分なモノマーが一つ結合して生成した副生成物を指し、塩基部脱保護体とは、目的化合物の核酸塩基におけるアミノ基の保護基が脱落して生成した副生成物を指す。結果を表2に示す。
(1)反応液の調製
後述の参考例1〜11に示すようにして、反応液を調製した。
試験例2と同様にして、調製した試験液を質量分析し、+1量体の量および塩基部脱保護体の量を算出した。結果を表3に示す。
(1)反応液の調製
後述の参考例12〜15に示すようにして、反応液を調製した。
参考例12〜15で得られた反応液に、表4に示す種類および量のクエンチ剤および中和塩を添加した。この反応液(50μL)を1.5mLバイアル瓶の中に分取し、DDTT(2.5mg,12μmol)を入れた後、30秒間振盪した。次いで、テトラヒドロフラン(450μL)で希釈した後、DBU(20μL)を入れて30秒間撹拌して、試験液を調製した。
得られた試験液を、LC−TOFMS(Agilent6230)により質量分析した。観測された各化合物(目的化合物および未反応原料)のアバンダンス(m/z=2)をもとに、下記式により、未反応原料の量を算出した。
未反応原料の量(%)=(未反応原料のアバンダンス/目的化合物のアバンダンス)×100
ここで、未反応原料とは、反応液の調製の際に使用したホスホロアミダイトモノマーを指す。
後述の参考例16〜20で得られたホスホロチオエート10量体をHPLC分析し、得られた10量体の純度(面積%)を算出した。使用したクエンチ剤、中和塩および10量体の純度(面積%)の結果を表5に示す。
(1)2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO−dT−SUC−TOB(619mg,500μmol)とAc−TOB(619mg,648μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT−CE ホスホロアミダイト(1.12g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にメタノール(608μL,15.0mmol)を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(340mg,1.65mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5−メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(345μL,4.50mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6−トリメチルピリジン(654μL,4.95mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン−3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン−3’−イル−[3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(762mg,収率95%)。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(1)で得られた2量体(762mg,473μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(273mg,1.42mmol)とdA−CE ホスホロアミダイト(1.22g,1.42mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にメタノール(575μL,14.2mmol)を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(321mg,1.56mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5−メトキシインドール(1.39g,9.46mmol)とトリフルオロ酢酸(326μL,4.26mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。
なお、参考例1は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
(1)2量体の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブにHO−dT−SUC−TOB(80.4mg,64.9μmol)とAc−TOB(99.6mg,104μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(37.4mg,195μmol)とdT−CE ホスホロアミダイト(145mg,195μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にメタノール(39.5μL,975μmol)を加えた後、酢酸(22.3μL,390μmol)と2,4,6−トリメチルピリジン(77.0μL,585μmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(44.0mg,215μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5−メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(89.6μL,1.17mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6−トリメチルピリジン(170μL,1.29mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(10mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン−3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン−3’−イル−[3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(104mg,収率99%)。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(1)で得られた2量体(104mg,64.2μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(37.5mg,195μmol)とdA−CE ホスホロアミダイト(165mg,195μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にメタノール(39.5μL,975μmol)を加えた後、酢酸(22.3μL,390μmol)と2,4,6−トリメチルピリジン(77.0μL,585μmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(44.0mg,214μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5−メトキシインドール(158mg,1.07mmol)とトリフルオロ酢酸(74.7μL,975μmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。
なお、参考例2は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
(1)2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO−dT−SUC−TOB(618mg,499μmol)とAc−TOB(618mg,646μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT−CE ホスホロアミダイト(1.11g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に酢酸(857μL,15.0mmol)とピリジン(1.82mL,22.4mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(338mg,1.65mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5−メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(344μL,4.49mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6−トリメチルピリジン(653μL,4.94mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン−3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン−3’−イル−[3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(753mg,収率94%)。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(1)で得られた2量体(753mg,468μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(270mg,1.40mmol)とdA−CE ホスホロアミダイト(1.20g,1.40mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に酢酸(402μL,7.01mmol)とピリジン(567μL,7.01mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(317mg,1.54mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5−メトキシインドール(1.38g,9.35mmol)とトリフルオロ酢酸(322μL,4.21mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。
なお、参考例3は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
(1)2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO−dT−SUC−TOB(619mg,500μmol)とAc−TOB(770mg,807μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT−CE ホスホロアミダイト(1.12g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に酢酸(172μL,3.00mmol)とN−メチルイミダゾール(178μL,2.25mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(339mg,1.65mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5−メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(574μL,7.50mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらにN−メチルイミダゾール(653μL,8.25mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン−3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン−3’−イル−[3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(792mg,98%)。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(1)で得られた2量体(792mg,492μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(284mg,1.48mmol)とdA−CE ホスホロアミダイト(1.27g,1.48mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に酢酸(169μL,2.95mmol)とN−メチルイミダゾール(175μL,2.21mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(333mg,1.62mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5−メトキシインドール(1.45g,9.83mmol)とトリフルオロ酢酸(565μL,7.37mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。
なお、参考例4は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
(1)2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO−dT−SUC−TOB(619mg,500μmol)とAc−TOB(770mg,807μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT−CE ホスホロアミダイト(1.12g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にメタノール(608μL,15.0mmol)を加えた後、酢酸(172μL,3.00mmol)とN−メチルイミダゾール(356μL,4.50mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(339mg,1.65mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5−メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(689μL,9.00mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらにN−メチルイミダゾール(784μL,9.90mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン−3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン−3’−イル−[3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(779mg,収率97%)。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(1)で得られた2量体(779mg,483μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(279mg,1.45mmol)とdA−CE ホスホロアミダイト(1.24g,1.45mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にメタノール(588μL,14.5mmol)を加えた後、酢酸(166μL,2.90mmol)とN−メチルイミダゾール(344μL,4.35mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(328mg,1.60mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5−メトキシインドール(1.42g,9.67mmol)とトリフルオロ酢酸(666μL,8.70mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。
なお、参考例5は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
(1)2量体の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブにHO−dT−SUC−TOB(80.3mg,65.0μmol)とAc−TOB(100mg,105μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(37.4mg,195μmol)とdT−CE ホスホロアミダイト(145mg,195μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にt−ブタノール(186μL,1.95mmol)を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(44.0mg,214μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5−メトキシインドール(94.6mg,642μmol)とトリフルオロ酢酸(44.7μL,584μmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6−トリメチルピリジン(84.6μL,642μmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(10mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン−3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン−3’−イル−[3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(104mg,収率100%)。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(1)で得られた2量体(104mg,65.0μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(37.3mg,194μmol)とdA−CE ホスホロアミダイト(167mg,194μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。なお、この時点で得られた反応液を、参考例13の反応液として上記試験例4で使用した。
なお、参考例6および参考例13は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
(1)2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO−dT−SUC−TOB(619mg,500μmol)とAc−TOB(772mg,808μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT−CE ホスホロアミダイト(1.12g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にt−ブタノール(1.43mL,15.0mmol)を加えた後、酢酸(173μL,3.00mmol)と2,4,6−トリメチルピリジン(594μL,4.50mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(339mg,1.65mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5−メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(689μL,8.99mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6−トリメチルピリジン(1.31mL,9.89mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン−3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン−3’−イル−[3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(798mg,収率99%)。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(1)で得られた2量体(798mg,495μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(286mg,1.49mmol)とdA−CE ホスホロアミダイト(1.27g,1.49mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。なお、この時点で得られた反応液を、参考例14の反応液として上記試験例4で使用した。
なお、参考例7および参考例14は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
(1)2量体の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブにHO−dT−SUC−TOB(80.3g,65.0μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(37.4mg,195μmol)とdT−CE ホスホロアミダイト(145mg,195μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に2−プロパノール(74.8μL,974μmol)を加えた後、酢酸(22.2μL,390μmol)と2,4,6−トリメチルピリジン(77.1μL,585μmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(44.0mg,214μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5−メトキシインドール(94.6mg,643μmol)とトリフルオロ酢酸(44.7μL,584μmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6−トリメチルピリジン(84.6μL,643μmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(10mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン−3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン−3’−イル−[3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(101mg,収率98%)。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(1)で得られた2量体(101mg,63.0μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(36.3mg,189μmol)とdA−CE ホスホロアミダイト(162mg,189μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に2−プロパノール(72.5μL,944μmol)を加えた後、酢酸(10.8μL,189μmol)と2,4,6−トリメチルピリジン(37.3μL,283μmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(42.6mg,208μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5−メトキシインドール(91.7mg,623μmol)とトリフルオロ酢酸(43.4μL,566μmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。
なお、参考例8は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
(1)2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO−dT−SUC−TOB(180mg,64.9μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(37.4mg,195μmol)とdT−CE ホスホロアミダイト(145mg,195μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に2,2,2−トリフルオロエタノール(140μL,1.95mmol)を加えた後、酢酸(22.3μL,390μmol)と2,4,6−トリメチルピリジン(77.0μL,585μmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(44.0mg,215μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5−メトキシインドール(189mg,1.17mmol)とトリフルオロ酢酸(89.6μL,1.17mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6−トリメチルピリジン(170μL,1.29mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(10mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン−3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン−3’−イル−[3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(104mg,収率99%)。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(1)で得られた2量体(101mg,62.5μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(36.1mg,188μmol)とdA−CE ホスホロアミダイト(161mg,188μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。なお、この時点で得られた反応液を、参考例15の反応液として上記試験例4で使用した。
なお、参考例9および参考例15は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブにHO−dA−SUC−TOB(182mg,60.5μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(35.0mg,182μmol)とdT−CE ホスホロアミダイト(135mg,182μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に2,2,2−トリフルオロエタノール(65.3μL,910μmol)を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(41.1mg,200μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5−メトキシインドール(88.4mg,600μmol)とトリフルオロ酢酸(41.8μL,546μmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブにHO−dA−SUC−TOB(182mg,60.5μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(35.0mg,182μmol)とdT−CE ホスホロアミダイト(135mg,182μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にt−ブタノール(87.0μL,910μmol)を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(41.1mg,200μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5−メトキシインドール(88.4mg,600μmol)とトリフルオロ酢酸(41.8μL,546μmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。
(1)2量体の合成
アルゴン雰囲気下、10mLシュレンクチューブにHO−dT−SUC−TOB(80.3mg,65.0μmol)とAc−TOB(100mg,105μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(37.4mg,195μmol)とdT−CE ホスホロアミダイト(145mg,195μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に2,2,2−トリフルオロエタノール(69.6μL,973μmol)を加えた後、DDTT(44.0mg,214μmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5−メトキシインドール(94.6mg,642μmol)とトリフルオロ酢酸(44.7μL,584μmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6−トリメチルピリジン(84.6μL,642μmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(10mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン−3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン−3’−イル−[3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(98.3mg,収率94%)。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(1)で得られた2量体(98.3mg,61.0μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(3.0mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(0.5mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(35.2mg,183μmol)とdA−CE ホスホロアミダイト(157mg,183μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌し、反応液を調製した。
なお、参考例12は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
(1)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO−dT−SUC−TOB(619mg,500μmol)とAc−TOB(619mg,648μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT−CE ホスホロアミダイト(1.12g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にメタノール(608μL,15.0mmol)を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(340mg,1.65mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5−メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(345μL,4.50mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6−トリメチルピリジン(654μL,4.95mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン−3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン−3’−イル−[3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(762mg,収率95%)。
上記(1)と同様の操作をさらに7回繰返して、9量体(N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N2−イソブチリル−デオキシグアノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホリル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−イル 3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を得た(2.03g)。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(2)の9量体(2.03g)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(2.0mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(228mg,1.19mmol)とdG−CE ホスホロアミダイト(1.00g,1.19mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。DDTT(338mg,1.64mmol)を加え、室温で30分間撹拌した後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過後、乾燥して、10量体(5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N2−イソブチリル−デオキシグアノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N2−イソブチリル−デオキシグアノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−イル 3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を白色固体として得た(2.28g)。
上記(3)で得られた10量体(20mg)と30重量%アンモニア水(5.00mL)の混合物をオートクレーブに入れて、55℃で16時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物であるデオキシグアニジル−[3’→5’]−デオキシアデニリル−[3’→5’]−デオキシシチジニル−[3’→5’]−デオキシアデニリル−[3’→5’]−デオキシチミジニル−[3’→5’]−デオキシグアニジル−[3’→5’]−デオキシシチジニル−[3’→5’]−デオキシアデニリル−[3’→5’]−デオキシチミジニル−[3’→5’]−デオキシチミジンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0−10min;5 to 60%、λ=260nm):Rt=6.61、6.75min(41.3+41.3%);
TOF/MS:3471.489
なお、参考例16は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO−dT−SUC−TOB(619mg,500μmol)とAc−TOB(619mg,648μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(2.0mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT−CE ホスホロアミダイト(1.12g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にメタノール(608μL,15.0mmol)を加え、室温で15分間撹拌した。その後、別途調製した酢酸(172μL,3.00mmol)と2,4,6−トリメチルピリジン(595μL,4.50mmol)の混合物を加え、さらにDDTT(339mg,1.65mmol)を加えて室温で1時間撹拌した。その後、5−メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(689μL,9.00mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。2,4,6−トリメチルピリジン(654μL,4.95mmol)を加えて中和し、アセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン−3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン−3’−イル−[3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(765mg,収率95%)。
上記(1)と同様の操作をさらに7回繰返して、9量体(N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N2−イソブチリル−デオキシグアノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−イル 3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を得た(2.18g)。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(2)で得られた9量体(2.18g)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(2.0mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(272mg,1.42mmol)とdG−CE ホスホロアミダイト(1.19g,1.42mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。DDTT(320mg,1.56mmol)を加え、室温で30分間撹拌した後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過後、乾燥して、10量体(5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N2−イソブチリル−デオキシグアノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホリル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N2−イソブチリル−デオキシグアノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−イル 3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を白色固体として得た(2.39g)。
上記(3)で得られた10量体(20mg)と30重量%アンモニア水(5.00mL)の混合物をオートクレーブに入れて、55℃で16時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物であるデオキシグアニジル−[3’→5’]−デオキシアデニリル−[3’→5’]−デオキシシチジニル−[3’→5’]−デオキシアデニリル−[3’→5’]−デオキシチミジニル−[3’→5’]−デオキシグアニジル−[3’→5’]−デオキシシチジニル−[3’→5’]−デオキシアデニリル−[3’→5’]−デオキシチミジニル−[3’→5’]−デオキシチミジンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0−10min;5 to 60%、λ=260nm):Rt=7.06、7.19min(41.1+42.3%);
TOF/MS:3471.49
なお、参考例17は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
(1)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO−dT−SUC−TOB(617.5mg,499μmol)とAc−TOB(619mg,648μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(3.0mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT−CE ホスホロアミダイト(1.12g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に別途調製した酢酸(857μL,15.0mmol)と脱水ピリジン(1.82mL,22.5mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した後、DDTT(338mg,1.65mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5−メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(345μL,4.50mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6−トリメチルピリジン(653μL,4.94mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン−3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン−3’−イル−[3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(753mg,収率94%)。
上記(1)と同様の操作をさらに7回繰返して、9量体(N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N2−イソブチリル−デオキシグアノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−イル 3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を得た(1.41g)。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(2)で得られた9量体(1.41g)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(2.0mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(159mg,829μmol)とdG−CE ホスホロアミダイト(696mg,829μmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。DDTT(187mg,912μmol)を加え、室温で30分間撹拌した後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過後、乾燥して、10量体(5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N2−イソブチリル−デオキシグアノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N2−イソブチリル−デオキシグアノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−イル 3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を白色固体として得た(1.51g)。
上記(3)で得られた10量体(20mg)と30重量%アンモニア水(5.00mL)の混合物をオートクレーブに入れて、55℃で16時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物であるデオキシグアニジル−[3’→5’]−デオキシアデニリル−[3’→5’]−デオキシシチジニル−[3’→5’]−デオキシアデニリル−[3’→5’]−デオキシチミジニル−[3’→5’]−デオキシグアニジル−[3’→5’]−デオキシシチジニル−[3’→5’]−デオキシアデニリル−[3’→5’]−デオキシチミジニル−[3’→5’]−デオキシチミジンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0−10min;5 to 60%、λ=260nm):Rt=7.32、7.47min(40.3area%+39.7area%);TOF/MS:3471.493
なお、参考例18は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
(1)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO−dT−SUC−TOB(619mg,500μmol)とAc−TOB(619mg,648μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(2.0mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT−CE ホスホロアミダイト(1.12g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液に2,2,2−トリフルオロエタノール(1.09mL,15.0mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した。その後、別途調製した酢酸(172μL,3.00mmol)と2,4,6−トリメチルピリジン(595μL,4.50mmol)の混合物を加え、さらにDDTT(339mg,1.65mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5−メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(345μL,4.50mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6−トリメチルピリジン(653μL,4.94mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン−3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン−3’−イル−[3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(788mg,収率98%)。
上記(1)と同様の操作をさらに7回繰返して、9量体(N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N2−イソブチリル−デオキシグアノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−イル 3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を得た(1.97g)。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(2)の化合物(1.97g)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(2.0mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(222mg,1.16mmol)とdG−CE ホスホロアミダイト(972mg,1.16mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。DDTT(261mg,1.27mmol)を加え、室温で30分間撹拌した後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過後、乾燥して、10量体(5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N2−イソブチリル−デオキシグアノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N2−イソブチリル−デオキシグアノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−イル 3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を白色固体として得た(2.21g)。
上記(3)で得られた10量体(20mg)と30重量%アンモニア水(5.00mL)の混合物をオートクレーブに入れて、55℃で16時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物であるデオキシグアニジル−[3’→5’]−デオキシアデニリル−[3’→5’]−デオキシシチジニル−[3’→5’]−デオキシアデニリル−[3’→5’]−デオキシチミジニル−[3’→5’]−デオキシグアニジル−[3’→5’]−デオキシシチジニル−[3’→5’]−デオキシアデニリル−[3’→5’]−デオキシチミジニル−[3’→5’]−デオキシチミジンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0−10min;5 to 60%、λ=260nm):Rt=7.36、7.48min(48.8area%+44.8area%);TOF/MS:3471.495
なお、参考例19は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
(1)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコにHO−dT−SUC−TOB(619mg,500μmol)とAc−TOB(619mg,648μmol)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(2.0mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(288mg,1.50mmol)とdT−CE ホスホロアミダイト(1.12g,1.50mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。反応液にt−ブタノール(1.43mL,15.0mmol)の混合物を加え、室温で15分間撹拌した。その後、別途調製した酢酸(173μL,3.00mmol)と2,4,6−トリメチルピリジン(594μL,4.50mmol)の混合物を加え、さらにDDTT(339mg,1.65mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。その後、5−メトキシインドール(1.47g,10.0mmol)とトリフルオロ酢酸(689μL,8.99mmol)を順次加え、室温で1.5時間撹拌した。さらに2,4,6−トリメチルピリジン(1.31mL,9.89mmol)を加えた後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥して、2量体(デオキシチミジン−3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル デオキシチミジン−3’−イル−[3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル]スクシネート)を白色固体として得た(798mg,収率99%)。
上記(1)と同様の操作をさらに7回繰返して、9量体(N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N2−イソブチリル−デオキシグアノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−イル 3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を得た(1.93g)。
アルゴン雰囲気下、300mL四口フラスコに上記(2)で得られた9量体(1.93g)を入れ、脱水ジクロロメタン(25mL)に溶解させた。得られた溶液に、脱水アセトニトリル(2.0mL)に溶かして調製した5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(218mg,1.13mmol)とdG−CE ホスホロアミダイト(950mg,1.13mmol)の混合溶液を加えた後、室温で1.5時間撹拌した。DDTT(256mg,1.23mmol)を加え、室温で30分間撹拌した後、反応液中にアセトニトリル(150mL)を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過後、乾燥して、10量体(5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N2−イソブチリル−デオキシグアノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N2−イソブチリル−デオキシグアノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N4−(2−ヘキシル)デカノイル−デオキシシチジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−N6−ベンゾイル−デオキシアデノシン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン 3’−[O−(2−シアノエチル)]ホスホリル−デオキシチミジン 3’−イル 3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジル スクシネート)を白色固体として得た(2.14g)。
上記(3)で得られた10量体(20mg)と30重量%アンモニア水(5.00mL)の混合物をオートクレーブに入れて、55℃で16時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物であるデオキシグアニジル−[3’→5’]−デオキシアデニリル−[3’→5’]−デオキシシチジニル−[3’→5’]−デオキシアデニリル−[3’→5’]−デオキシチミジニル−[3’→5’]−デオキシグアニジル−[3’→5’]−デオキシシチジニル−[3’→5’]−デオキシアデニリル−[3’→5’]−デオキシチミジニル−[3’→5’]−デオキシチミジンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0−10min;5 to 60%、λ=260nm):Rt=6.95、7.08min(44.3area%+42.7area%);TOF/MS:3471.493
なお、参考例20は、上記2量体の合成において工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むため、本発明の一態様である。
(1)5’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート単量体の合成
上記(2)で得られた2量体(3.01mg)と30重量%アンモニア水(5.0mL)の混合物をオートクレーブに入れて、65℃で4時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物である5’−[O−(2−ヒドロキシエチル)]ホスホロチオニル−デオキシチミジン−3’−ホスホロチオニル−デオキシチミジンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0−10min;5 to 30%、λ=260nm):Rt=1.49min(99.3area%);TOF/MS:702.09
(1)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
上記(2)で得られた3量体(3.01mg)と30重量%アンモニア水(5.0mL)の混合物をオートクレーブに入れて、65℃で4時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物である2’−O−メチル−シチジン−3’−ホスホロチオニル−2’−O−メチル−シチジン−3’−ホスホロチオニル−2’−O−メチル−ウリジンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0−10min;5 to 30%、λ=260nm):Rt=1.72、1.98min(47.9+50.6area%);TOF/MS:928.11
(1)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
上記(3)で得られた4量体(3.10mg)と30重量%アンモニア水(5.0mL)の混合物をオートクレーブに入れて、65℃で4時間加熱した後、氷浴にて冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物である2’−O−メトキシエチル−チミジン−3’−ホスホロチオニル−2’−O−メトキシエチル−アデノシン−3’−ホスホロチオニル−2’−O−メトキシエチル−グアノシン−3’−ホスホロチオニル−デオキシチミジンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0−10min;5 to 30%、λ=260nm):Rt=4.42,4.49min(31.0+66.7area%);TOF/MS:1458.30
(1)核酸塩基部がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
上記(3)でで得られた3量体(3.12mg)と30重量%アンモニア水(5.0mL)の混合物をオートクレーブに入れて、65℃で4時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物である2’−フルオロ−グアノシン−3’−ホスホロチオニル−2’−フルオロ−ウリジン−3’−ホスホロチオニル−デオキシシチジンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0−10min;5 to 30%、λ=260nm):Rt=1.15、1.40min(11.2+85.1area%);TOF/MS:914.11
(1)3’位水酸基がアンカーで保護されたホスホロチオエート2量体の合成
上記(2)で得られた3量体(3.02mg)と30重量%アンモニア水(5.0mL)の混合物をオートクレーブに入れて、65℃で4時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルター(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)により反応液中の不溶物を除去した後、凍結乾燥し、目的物である5−メチル−デオキシシチジン−3’−ホスホロチオニル−2’−O−メチル−ウリジン−3’−ホスホロチオニル−デオキシアデノシンを得た。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm column、flow rate 1.0mL/min、8mM TEA+100mM HFIP、MeOH、gradient:0−10min;5 to 30%、λ=260nm):Rt=1.92、2.23min(14.8+75.6area%);TOF/MS: 906.17
Claims (52)
- 以下の工程(1)、(3)、(4)および(6)を含むオリゴヌクレオチドの製造方法:
(1)非極性溶媒中、
5’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基、3’位水酸基および3’位アミノ基、並びにデオキシリボース残基の3’位水酸基および3’位アミノ基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)、或いは
5’位水酸基が保護されておらず、3’位リン酸基の一つの水酸基が−OLn1−OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、−OLn1−OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)
を含む反応液に、
3’位水酸基または3’位アミノ基がホスホロアミダイト化され、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)
を添加して、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)とヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)とを縮合させ、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイトトリエステル体(c)を含む反応液を得る工程;
(3)ホスファイトトリエステル体(c)を含む反応液に酸化剤または硫化剤を添加して、ホスファイトトリエステル体(c)を酸化または硫化し、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたオリゴヌクレオチド(d)を含む反応液を得る工程;
(4)酸化または硫化後の反応液に酸を添加して5’位水酸基の一時保護基を除去し、5’位水酸基が保護されていないオリゴヌクレオチド(e)を含む反応液を得る工程;および
(6)オリゴヌクレオチド(e)を含む反応液に極性溶媒を添加し、オリゴヌクレオチド(e)を固液分離または抽出により精製する工程。 - 工程(1)で、
5’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および3’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の3’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a)、或いは
5’位水酸基が保護されておらず、3’位リン酸基の一つの水酸基が−OLn1−OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、−OLn1−OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α)、並びに
3’位水酸基がホスホロアミダイト化され、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b)
を使用する請求項1に記載の製造方法。 - 工程(1)で、
5’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および3’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の3’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(a)、並びに
3’位水酸基がホスホロアミダイト化され、5’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(b)
を使用する請求項1に記載の製造方法。 - 工程(1)の後および工程(3)の前に、さらに以下の工程(2)を含む請求項1〜3のいずれか一項に記載の製造方法:
(2)縮合後の反応液にクエンチ剤を添加する工程。 - 工程(2)で使用するクエンチ剤が、アルコール類、フェノール類およびアミン類から選ばれる少なくとも一つである請求項4に記載の製造方法。
- 工程(1)の後および工程(4)の前の反応液に、カルボン酸および有機塩基の混合物、無機酸またはアミン類を添加し、工程(3)において、硫化剤として5−[(N,N−ジメチルアミノメチリデン)アミノ]−3H−1,2,4−ジチアゾール−3−チオンを反応液に添加する請求項1〜5のいずれか一項に記載の製造方法。
- 有機塩基が有する塩基性窒素原子の量が、カルボン酸が有するカルボキシ基1モルに対して1〜2モルである請求項6に記載の製造方法。
- 工程(3)で使用する硫化剤が、3H−1,2−ベンゾジチオール−3−オン−1,1−ジオキシド、3H−1,2−ベンゾジチオール−3−オン、フェニルアセチルジスルフィド、テトラエチルチウラムジスルフィド、ジペンタメチレンチウラムテトラスルフィド、フェニル−3H−1,2,4−ジチアゾール−3−オン、3−アミノ−1,2,4−ジチアゾール−5−チオンおよび硫黄から選ばれる少なくとも一つである請求項1〜5のいずれか一項に記載の製造方法。
- 工程(3)で使用する酸化剤が、ヨウ素、(1S)−(+)−(10−カンファニルスルホニル)オキサジリジン、tert−ブチルヒドロペルオキシド、2−ブタノンペルオキシド、1,1−ジヒドロペルオキシシクロドデカン、ビス(トリメチルシリル)ペルオキシドおよびm−クロロ過安息香酸から選ばれる少なくとも一つである請求項1〜5のいずれか一項に記載の製造方法。
- 一時保護基が、ジメトキシトリチル基またはモノメトキシトリチル基である請求項1〜9のいずれか一項に記載の製造方法。
- 非極性溶媒が、ハロゲン系溶媒、芳香族系溶媒、エステル系溶媒および脂肪族系溶媒から選ばれる少なくとも一つである請求項1〜10のいずれか一項に記載の製造方法。
- 工程(4)で使用する酸が、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、塩酸、酢酸およびp−トルエンスルホン酸から選ばれる少なくとも一つである請求項1〜11のいずれか一項に記載の製造方法。
- 酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基が、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基を有するか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を有する請求項1〜12のいずれか一項に記載の製造方法。
- 工程(6)が、オリゴヌクレオチド(e)を含む反応液に極性溶媒を添加し、オリゴヌクレオチド(e)を固液分離により精製する工程である請求項1〜13のいずれか一項に記載の製造方法。
- 工程(6)で使用する極性溶媒が、ニトリル系溶媒である請求項1〜14のいずれか一項に記載の製造方法。
- 工程(4)の後および工程(6)の前に、さらに以下の工程(5)を含む請求項1〜15のいずれか一項に記載の製造方法:
(5)オリゴヌクレオチド(e)を含む反応液に塩基を添加して中和する工程。 - 工程(5)で使用する塩基が、ピリジン、2,4,6−トリメチルピリジン、ベンズイミダゾール、1,2,4−トリアゾール、N−フェニルイミダゾール、2−アミノ−4,6−ジメチルピリミジン、1,10−フェナントロリン、イミダゾール、N−メチルイミダゾール、2−クロロベンズイミダゾール、2−ブロモベンズイミダゾール、2−メチルイミダゾール、2−フェニルベンズイミダゾール、N−フェニルベンズイミダゾールおよび5−ニトロベンズイミダゾールから選ばれる少なくとも一つである請求項16に記載の製造方法。
- 工程(6)の後に、さらに以下の工程(7)を含む請求項1〜17のいずれか一項に記載の製造方法:
(7)得られたオリゴヌクレオチドの保護基を全て除去した後、保護されていないオリゴヌクレオチドを単離する工程。 - 工程(4)の一時保護基の除去反応をカチオン捕捉剤の存在下で行うか、または一時保護基の除去反応後に反応液にカチオン捕捉剤を添加する請求項1〜18のいずれか一項に記載の製造方法。
- カチオン捕捉剤が、ピロール、2−メチルピロール、3−メチルピロール、2,3−ジメチルピロール、2,4−ジメチルピロール、インドール、3−メチルインドール、4−メチルインドール、5−メチルインドール、6−メチルインドール、7−メチルインドール、5,6−ジメチルインドール、6,7−ジメチルインドール、2−メチルフラン、2,3−ジメチルフラン、2−メチル−3−(メチルチオ)フラン、およびメントフランから選ばれる少なくとも一つである請求項19に記載の製造方法。
- 以下の工程(1’)、(3’)、(4’)および(6’)を含むオリゴヌクレオチドの製造方法:
(1’)非極性溶媒中、
3’位水酸基または3’位アミノ基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および5’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の5’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)、或いは
3’位水酸基または3’位アミノ基が保護されておらず、5’位リン酸基の一つの水酸基が−OLn1−OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、−OLn1−OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)
を含む反応液に、
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基または3’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
を添加して、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)或いは置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)とヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)とを縮合させ、3’位水酸基または3’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイトトリエステル体(c’)を含む反応液を得る工程;
(3’)ホスファイトトリエステル体(c’)を含む反応液に酸化剤または硫化剤を添加して、ホスファイトトリエステル体(c’)を酸化または硫化し、3’位水酸基または3’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたオリゴヌクレオチド(d’)を含む反応液を得る工程;
(4’)酸化または硫化後の反応液に酸を添加して3’位水酸基または3’位アミノ基の一時保護基を除去し、3’位水酸基または3’位アミノ基が保護されていないオリゴヌクレオチド(e’)を含む反応液を得る工程;および
(6’)オリゴヌクレオチド(e’)を含む反応液に極性溶媒を添加し、オリゴヌクレオチド(e’)を固液分離または抽出により精製する工程。 - 工程(1’)で、
3’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および5’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の5’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(a’)、或いは
3’位水酸基が保護されておらず、5’位リン酸基の一つの水酸基が−OLn1−OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、−OLn1−OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)、並びに
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
を使用する請求項21に記載の製造方法。 - 工程(1’)で、
3’位水酸基が保護されておらず、5’位リン酸基の一つの水酸基が−OLn1−OH(式中、Ln1は有機基を示す。)に置き換わっており、−OLn1−OHの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(α’)、並びに
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
を使用する請求項21に記載の製造方法。 - 工程(1’)で、
3’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の2’位水酸基および5’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の5’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(a’)、並びに
5’位水酸基がホスホロアミダイト化され、3’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(b’)
を使用する請求項21に記載の製造方法。 - 工程(1’)の後および工程(3’)の前に、さらに以下の工程(2’)を含む請求項21〜24のいずれか一項に記載の製造方法:
(2’)縮合後の反応液にクエンチ剤を添加する工程。 - 工程(2’)で使用するクエンチ剤が、アルコール類、フェノール類およびアミン類から選ばれる少なくとも一つである請求項25に記載の製造方法。
- 工程(1’)の後および工程(4’)の前の反応液に、カルボン酸および有機塩基の混合物、無機酸またはアミン類を添加し、工程(3’)において、硫化剤として5−[(N,N−ジメチルアミノメチリデン)アミノ]−3H−1,2,4−ジチアゾール−3−チオンを反応液に添加する請求項21〜26のいずれか一項に記載の製造方法。
- 有機塩基が有する塩基性窒素原子の量が、カルボン酸が有するカルボキシ基1モルに対して1〜2モルである請求項27に記載の製造方法。
- 工程(3’)で使用する硫化剤が、3H−1,2−ベンゾジチオール−3−オン−1,1−ジオキシド、3H−1,2−ベンゾジチオール−3−オン、フェニルアセチルジスルフィド、テトラエチルチウラムジスルフィド、ジペンタメチレンチウラムテトラスルフィド、フェニル−3H−1,2,4−ジチアゾール−3−オン、3−アミノ−1,2,4−ジチアゾール−5−チオンおよび硫黄から選ばれる少なくとも一つである請求項21〜26のいずれか一項に記載の製造方法。
- 工程(3’)で使用する酸化剤が、ヨウ素、(1S)−(+)−(10−カンファニルスルホニル)オキサジリジン、tert−ブチルヒドロペルオキシド、2−ブタノンペルオキシド、1,1−ジヒドロペルオキシシクロドデカン、ビス(トリメチルシリル)ペルオキシドおよびm−クロロ過安息香酸から選ばれる少なくとも一つである請求項21〜26のいずれか一項に記載の製造方法。
- 水酸基の一時保護基が、ジメトキシトリチル基またはモノメトキシトリチル基である請求項21〜30のいずれか一項に記載の製造方法。
- 非極性溶媒が、ハロゲン系溶媒、芳香族系溶媒、エステル系溶媒および脂肪族系溶媒から選ばれる少なくとも一つである請求項21〜31のいずれか一項に記載の製造方法。
- 工程(4’)で使用する酸が、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、塩酸、酢酸およびp−トルエンスルホン酸から選ばれる少なくとも一つである請求項21〜32のいずれか一項に記載の製造方法。
- 酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基が、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基を有するか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を有する請求項21〜33のいずれか一項に記載の製造方法。
- 工程(6’)が、オリゴヌクレオチド(e’)を含む反応液に極性溶媒を添加し、オリゴヌクレオチド(e’)を固液分離により精製する工程である請求項21〜34のいずれか一項に記載の製造方法。
- 工程(6’)で使用する極性溶媒が、ニトリル系溶媒である請求項21〜35のいずれか一項に記載の製造方法。
- 工程(4’)の後および工程(6’)の前に、さらに以下の工程(5’)を含む請求項21〜36のいずれか一項に記載の製造方法:
(5’)オリゴヌクレオチド(e’)を含む反応液に塩基を添加して中和する工程。 - 工程(5’)で使用する塩基が、ピリジン、2,4,6−トリメチルピリジン、ベンズイミダゾール、1,2,4−トリアゾール、N−フェニルイミダゾール、2−アミノ−4,6−ジメチルピリミジン、1,10−フェナントロリン、イミダゾール、N−メチルイミダゾール、2−クロロベンズイミダゾール、2−ブロモベンズイミダゾール、2−メチルイミダゾール、2−フェニルベンズイミダゾール、N−フェニルベンズイミダゾールおよび5−ニトロベンズイミダゾールから選ばれる少なくとも一つである請求項37に記載の製造方法。
- 工程(6’)の後に、さらに以下の工程(7’)を含む請求項21〜38のいずれか一項に記載の製造方法:
(7’)得られたオリゴヌクレオチドの保護基を全て除去した後、保護されていないオリゴヌクレオチドを単離する工程。 - 工程(4’)の一時保護基の除去反応をカチオン捕捉剤の存在下で行うか、または一時保護基の除去反応後に反応液にカチオン捕捉剤を添加する請求項21〜39のいずれか一項に記載の製造方法。
- カチオン捕捉剤が、ピロール、2−メチルピロール、3−メチルピロール、2,3−ジメチルピロール、2,4−ジメチルピロール、インドール、3−メチルインドール、4−メチルインドール、5−メチルインドール、6−メチルインドール、7−メチルインドール、5,6−ジメチルインドール、6,7−ジメチルインドール、2−メチルフラン、2,3−ジメチルフラン、2−メチル−3−(メチルチオ)フラン、およびメントフランから選ばれる少なくとも一つである請求項40に記載の製造方法。
- 式(a−II):
[式中、
mは、0以上の整数を示し;
m個のBaseは、それぞれ独立して、保護されていてもよい核酸塩基を示し;
m+1個のXは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、または2位炭素原子および4位炭素原子と結合する2価の有機基を示し;
m個のR10は、それぞれ独立して、酸素原子または硫黄原子を示し;
m個のRp1は、それぞれ独立して、リン酸基の保護基を示し;
Lは、単結合、または式(a1)若しくは(a1’):
(式中、
*は、Yとの結合位置を示し;
**は、酸素原子との結合位置を示し;
R1およびR2は、それぞれ独立して、C1−22炭化水素基を示し;
L1は、置換されていてもよい2価のC1−22炭化水素基を示し;
L2は、単結合を示すか、または***C(=O)N(R3)−R4−N(R5)****(式中、***は、L1との結合位置を示し、****は、C=Oとの結合位置を示し、R4は、C1−22アルキレン基を示し、R3およびR5は、それぞれ独立して、水素原子若しくはC1−22アルキル基を示すか、またはR3およびR5が一緒になって、環を形成していてもよい。)で表される基を示す。)で表される基を示し;
Yは、単結合、酸素原子、またはNR(Rは、水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。)を示し;および
Zは、式(a2)、式(a2’)または式(a2”):
[式中、
*は、結合位置を示し;
R6は、水素原子であるか、あるいはRbが、下記式(a3)で表される基である場合には、環Aまたは環BのR6は、R8と一緒になって単結合または−O−を示して、環Aまたは環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;
kは、1〜4の整数を示し;
k個のQは、それぞれ独立して、−O−、−C(=O)−、−C(=O)O−、−OC(=O)−、−C(=O)NH−または−NHC(=O)−を示し;
k個のR7は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
環Aおよび環Bは、それぞれ独立して、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく;
Raは、水素原子を示し;および
Rbは、水素原子、または式(a3):
(式中、
*は、結合位置を示し;
jは、0〜4の整数を示し;
j個のQは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
j個のR9は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
R8は、水素原子を示すか、または環Aまたは環BのR6と一緒になって単結合または−O−を示して、環Aまたは環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;および
環Cは、j個のQR9に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。)で表される基を示すか、或いは
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成する。]で表される基を示す。
R11は、メチル基を示し、R12およびR13は、それぞれ独立にC1−5アルキル基を示すか、またはR11およびR12が一緒になって、それらが結合する炭素原子および窒素原子と共に5員または6員の含窒素炭化水素環を形成していてもよい。]
で表されるヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド。 - Rp1が、−CH2CH2WG(式中、WGは、電子吸引性基を示す。)で表される基である請求項42に記載のヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド。
- R11がメチル基であり、R12およびR13が、それぞれ独立にC1−5アルキル基である請求項42または43に記載のヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド。
- mが0である請求項42〜44のいずれか一項に記載のヌクレオシド。
- 式(a−IV):
[式中、
mは、0以上の整数を示し;
m+1個のBaseは、それぞれ独立して、保護されていてもよい核酸塩基を示し;
m+1個のXは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、または2位炭素原子および4位炭素原子と結合する2価の有機基を示し;
m個のR10は、それぞれ独立して、酸素原子または硫黄原子を示し;
m個のRp1は、それぞれ独立して、リン酸基の保護基を示し;
Lは、単結合、または式(a1)若しくは(a1’):
(式中、
*は、Yとの結合位置を示し;
**は、酸素結合との結合位置を示し;
R1およびR2は、それぞれ独立して、C1−22炭化水素基を示し;
L1は、置換されていてもよい2価のC1−22炭化水素基を示し;
L2は、単結合を示すか、または***C(=O)N(R3)−R4−N(R5)****(式中、***は、L1との結合位置を示し、****は、C=Oとの結合位置を示し、R4は、C1−22アルキレン基を示し、R3およびR5は、それぞれ独立して、水素原子若しくはC1−22アルキル基を示すか、またはR3およびR5が一緒になって、環を形成していてもよい。)で表される基を示す。)で表される基を示し;
Yは、単結合、酸素原子、またはNR(Rは、水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。)を示し;および
Z’は、式(a2”):
[式中、
*は、結合位置を示し;
R6は、水素原子であるか、あるいはRbが、下記式(a3)で表される基である場合には、R8と一緒になって単結合または−O−を示して、環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;
kは、1〜4の整数を示し;
k個のQは、それぞれ独立して、−O−、−C(=O)−、−C(=O)O−、−OC(=O)−、−C(=O)NH−または−NHC(=O)−を示し;
k個のR7は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
環Bは、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく;
Raは、水素原子を示し;および
Rbは、水素原子、または式(a3):
(式中、
*は、結合位置を示し;
jは、0〜4の整数を示し;
j個のQは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
j個のR9は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
R8は、水素原子を示すか、またはR6と一緒になって単結合または−O−を示して、環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;および
環Cは、j個のQR9に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。)で表される基を示すか、或いは
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成する。]で表される基を示す。]
で表されるヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド。 - Rp1が、−CH2CH2WG(式中、WGは、電子吸引性基を示す。)で表される基である請求項46に記載のヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド。
- mが0である請求項46または47に記載のヌクレオシド。
- 式(I):
[式中、
mは、0以上の整数を示し;
m+1個のBaseは、それぞれ独立して、保護されていてもよい核酸塩基を示し;
m+1個のXは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、または2位炭素原子および4位炭素原子と結合する2価の有機基を示し;
m個のR10は、それぞれ独立して、酸素原子または硫黄原子を示し;
m個のRp1は、それぞれ独立して、リン酸基の保護基を示し;
Rn1およびRn2の一つが水素原子を示し、残りの一つが式(II):
{式中、
*は、結合位置を示し;
R10は、酸素原子または硫黄原子を示し;
Rp1は、リン酸基の保護基を示し;
Ln1は有機基を示し;
Lは、単結合、または式(a1)若しくは(a1’):
(式中、
*は、Yとの結合位置を示し;
**は、酸素原子との結合位置を示し;
R1およびR2は、それぞれ独立して、C1−22炭化水素基を示し;
L1は、置換されていてもよい2価のC1−22炭化水素基を示し;
L2は、単結合を示すか、または***C(=O)N(R3)−R4−N(R5)****(式中、***は、L1との結合位置を示し、****は、C=Oとの結合位置を示し、R4は、C1−22アルキレン基を示し、R3およびR5は、それぞれ独立して、水素原子若しくはC1−22アルキル基を示すか、またはR3およびR5が一緒になって、環を形成していてもよい。)で表される基を示す。)で表される基を示し;
Yは、単結合、酸素原子、またはNR(Rは、水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。)を示し;および
Zは、式(a2)、式(a2’)または式(a2”):
[式中、
*は、結合位置を示し;
R6は、水素原子であるか、あるいはRbが、下記式(a3)で表される基である場合には、環Aまたは環BのR6は、R8と一緒になって単結合または−O−を示して、環Aまたは環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;
kは、1〜4の整数を示し;
k個のQは、それぞれ独立して、−O−、−C(=O)−、−C(=O)O−、−OC(=O)−、−C(=O)NH−または−NHC(=O)−を示し;
k個のR7は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
環Aおよび環Bは、それぞれ独立して、k個のQR7に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく;
Raは、水素原子を示し;および
Rbは、水素原子、または式(a3):
(式中、
*は、結合位置を示し;
jは、0〜4の整数を示し;
j個のQは、それぞれ独立して、前記と同義であり;
j個のR9は、それぞれ独立して、炭素数10以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を1以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が14以上300以下である有機基を示し;
R8は、水素原子を示すか、または環Aまたは環BのR6と一緒になって単結合または−O−を示して、環Aまたは環Bおよび環Cと共に縮合環を形成していてもよく;および
環Cは、j個のQR9に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。)で表される基を示すか、或いは
RaおよびRbが、一緒になってオキソ基を形成する。]で表される基を示す。}で表される基を示す。]
で表されるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。 - Rn1が式(II)で表される基であり、Rn2が水素原子である請求項49に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
- Ln1がエチレン基である請求項49または50に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
- mが0である請求項49〜51のいずれか一項に記載のヌクレオチド。
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