CN107207555B - 沉淀促进剂以及使用其的沉淀方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供沉淀促进剂，其是具有一个以上的碳原子数为10以上的直链脂族烃基、并且所述脂族烃基的碳原子总数为20以上的有机化合物。本发明的沉淀促进剂用于使被具有一个以上的碳原子数为10以上的脂族烃基的有机基团保护的有机化合物从溶剂中沉淀。

Description

沉淀促进剂以及使用其的沉淀方法
技术领域
本发明涉及可用于使溶液中的有机化合物(例如寡核苷酸、肽等)沉淀的沉淀促进剂以及使用其的沉淀方法。
背景技术
寡核苷酸的合成方法包括磷酸三酯法、H-膦酸酯法、亚磷酰胺法(phosphoramidite method)等，而使用亚磷酰胺法的固相合成(固相方法)是目前最广泛使用的方法。此外，作为肽的合成方法，固相合成是广泛使用的。固相方法就速度 方面而言是有利的，因为已对工艺进行优化并且已取得自动化进展。然而，与其相 关的缺陷在于：由于设备限制而限制了规模放大，使用过量的试剂和起始材料，并 且难以在中间步骤中确定反应进展状态、分析中间体结构等。另一方面，还已对通 过液相方法的寡核苷酸和肽的合成方法进行了研究。然而，由于操作复杂且收率低， 难以大规模快速合成长寡核苷酸和肽。
近年来，在解决固相方法和液相方法的各自缺陷的尝试中，在液相方法中，已 报道使用被具有一个或多个长链脂族烃基的有机基团(假固相保护基，pseudo solid phaseprotecting group)保护的核苷的寡核苷酸合成方法(专利文献1和2)和使用具有 假固相保护基的肽的肽合成方法(专利文献3、4和5)。在这些合成方法中，例如， 通过如下方式回收目标产物：通过向溶解于非极性溶剂中的具有疏水假固相保护基 的寡核苷酸或肽中添加极性溶剂以让这些化合物从非极性溶剂和极性溶剂的混合溶 剂中沉淀(固液分离)。
[文献清单]
[专利文献]
专利文献1：WO 2012/157723
专利文献2：WO 2014/189142
专利文献3：WO 2010/104169
专利文献4：WO 2010/113939
专利文献5：WO 2011/078295
发明内容
[发明要解决的问题]
在使用这种假固相保护基的有机化合物如寡核苷酸、肽等的液相合成中，期望 更有效地使这些化合物从溶剂中沉淀以提高所述化合物的回收率。
本发明已经注意到上述情形并旨在当使具有假固相保护基的有机化合物从溶剂中沉淀时提高所述有机化合物的回收率。
[用于解决问题的手段]
本发明的发明人已经进行深入研究，试图达到上述目的并发现通过使用特定沉淀促进剂可促进具有疏水基或假固相保护基的有机化合物的沉淀，并且可提高其回 收率。以这些发现为基础的本发明如下所述。
[1]沉淀促进剂，其用于使被有机基团保护的有机化合物从溶剂中沉淀，所述有机基团具有一个以上的碳原子数为10以上的脂族烃基，其中，
所述沉淀促进剂是，具有一个以上的碳原子数为10以上的直链脂族烃基、并且 所述沉淀促进剂所具有的所述脂族烃基的碳原子总数为20以上的有机化合物。
[2]上述[1]的沉淀促进剂，其中，沉淀促进剂所具有的碳原子数为10以上的直 链脂族烃基是选自直链C10-40烷基和直链C10-40烯基的基团。
[3]上述[1]或[2]的沉淀促进剂，其中，有机基团所具有的碳原子数为10以上的脂族烃基是直链型。
[4]上述[1]或[2]的沉淀促进剂，其中，有机基团所具有的碳原子数为10以上的脂族烃基是选自直链C10-40烷基和直链C10-40烯基的基团。
[5]上述[1]-[4]中任一项的沉淀促进剂，该沉淀促进剂为
(1)具有一个以上的式(G)所示结构的有机化合物；或者
(2)经由选自-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NH-和-NHC(＝O)-中的 基团而具有一个以上的直链C10-40烷基，并且进一步任选取代的C1-10烷烃，
其中，所述式(G)为：
Figure BDA0001356701560000021
式中，
R1各自独立地表示直链C10-40烷基；
X1各自独立地表示单键、-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NH-或 -NHC(＝O)-；
环A1表示任选取代的C3-14烃环；
n表示1至4的整数。
[6]上述[1]-[4]中任一项的沉淀促进剂，该沉淀促进剂为
(1)式(I)所示的化合物；或者
(2)经由选自-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NH-和-NHC(＝O)-中的 基团而具有一个以上的直链C10-40烷基，并且进一步任选取代的C1-10烷烃，
其中，所述式(I)为：
Figure BDA0001356701560000031
式中，
R1各自独立地表示直链C10-40烷基；
X1各自独立地表示单键、-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NH-或 -NHC(＝O)-；
环A1和环B1各自独立地表示任选取代的C3-14烃环；
X2各自独立地表示-(CH2)p-、-(CH2)p-O-(CH2)q-、-(CH2)p-C(＝O)-(CH2)q-、 -(CH2)p-C(＝O)O-(CH2)q-、-(CH2)p-OC(＝O)-(CH2)q-、-(CH2)p-C(＝O)NH-(CH2)q-或 -(CH2)p-NHC(＝O)-(CH2)q-，其中p和q各自独立地表示0至3的整数；
X3表示单键、-(CH2)r-O-、-(CH2)r-C(＝O)-、-(CH2)r-C(＝O)O-、-(CH2)r-OC(＝O)-、-(CH2)r-C(＝O)NH-或-(CH2)r-NHC(＝O)-，其中r表示0至3的整数；
R2表示氢原子、任选取代的C3-8环烷基、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的C6-14芳基、任选取代的单环杂环基或三(C1-6烷基)甲硅烷基；
n和m各自独立地表示1至4的整数；
当m为1时，m’表示0或1；当m为2、3或4时，m’表示1。
[7]上述[6]的沉淀促进剂，其中，R2为氢原子、任选取代的C3-8环烷基、任选取 代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的C6-14芳基 或任选取代的单环杂环基。
[8]上述[1]-[4]中任一项的沉淀促进剂，该沉淀促进剂为式(II)所示的化合物，
Figure BDA0001356701560000032
式中，
R1各自独立地表示直链C10-40烷基；
X1各自独立地表示单键、-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NH-或 -NHC(＝O)-；
环A2和环B1各自独立地表示任选取代的C3-14烃环；
X2各自独立地表示-(CH2)p-、-(CH2)p-O-(CH2)q-、-(CH2)p-C(＝O)-(CH2)q-、 -(CH2)p-C(＝O)O-(CH2)q-、-(CH2)p-OC(＝O)-(CH2)q-、-(CH2)p-C(＝O)NH-(CH2)q-或 -(CH2)p-NHC(＝O)-(CH2)q-，其中p和q各自独立地表示0至3的整数；
X3表示单键、-(CH2)r-O-、-(CH2)r-C(＝O)-、-(CH2)r-C(＝O)O-、-(CH2)r-OC(＝O)-、-(CH2)r-C(＝O)NH-或-(CH2)r-NHC(＝O)-，其中r表示0至3的整数；
R2表示氢原子、任选取代的C3-8环烷基、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的C6-14芳基、任选取代的单环杂环基或三(C1-6烷基)甲硅烷基；
m表示1至4的整数；
当m为1时，m’表示0或1；当m为2、3或4时，m’表示1。
[9]上述[8]的沉淀促进剂，其中，R2为氢原子、任选取代的C3-8环烷基、任选取 代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的C6-14芳基 或任选取代的单环杂环基。
[10]上述[5]-[9]中任一项的沉淀促进剂，其中，C3-14烃环选自苯环和环己烷环。
[11]上述[1]-[10]中任一项的沉淀促进剂，其中，有机基团表示式(III)所示的基团，
**L-Y-Z (III)
式中，
**表示与被保护的基团的键合位置；
L表示单键、或者式(a1)或(a1’)所示的基团：
Figure BDA0001356701560000041
式中，
*表示与Y的键合位置；
**与前述的定义相同；
R8和R9各自独立地表示C1-22烃基；
L1表示二价C1-22烃基；并且
L2表示单键，或者表示**C(＝O)N(R2’)-R1’-N(R3)***所示的基团，式中**表示与L1的键合位置，***表示与C＝O的键合位置，R1’表示C1-22亚烷基，R2’和R3各自独立 地表示氢原子或C1-22烷基，或者R2’和R3任选地一起形成环；
Y表示单键、氧原子或NR，其中R表示氢原子、烷基或芳烷基；以及
Z表示式(a2)、式(a2’)或式(a2”)所示的基团：
Figure BDA0001356701560000051
式中，
*表示键合位置；
R4为氢原子，或者当Rb为下述式(a3)所示的基团时，R4任选地与环C的R6一起 表示单键或-O-、并与环A或环B及环C一起形成稠环；
k个Q各自独立地表示-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NH-或 -NHC(＝O)-；
k个R5各自独立地表示经由单键或连接基键合有碳原子数为10以上的脂族烃基的烃基；
k表示1至4的整数；
环A和环B各自独立地除了具有k个QR5以外，任选地进一步具有取代基，所述 取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的 C1-6烷氧基；
Ra表示氢原子、或任选被卤素原子取代的苯基；以及
Rb表示氢原子、或式(a3)所示的基团：
Figure BDA0001356701560000052
式中，*表示键合位置；
j表示0至4的整数；
j个Q各自独立地表示与前述相同的含义；
j个R7各自独立地表示经由单键或连接基键合有碳原子数为10以上的脂族烃基的烃基；
R6表示氢原子，或者任选地与环A或环B的R4一起表示单键或-O-、并且与环A 或环B及环C一起形成稠环；并且
环C除了具有j个OR7以外，任选地进一步具有取代基，所述取代基选自卤素原 子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基，或者
Ra和Rb一起形成羰基(oxo group)。
[12]上述[11]的沉淀促进剂，其中，Z为式(a2)或式(a2’)所示的基团，稠环为芴环或呫吨环，k个R5各自独立地为经由单键或连接基键合有碳原子数为10以上的 直链脂族烃基的烃基，j个R7各自独立地为经由单键或连接基键合有碳原子数为10 以上的直链脂族烃基的烃基，并且Ra为氢原子、或者Ra和Rb一起形成羰基。
[13]上述[11]或[12]的沉淀促进剂，其中，L为式(a1)所示的基团，L1表示二价C1-22烃基，并且L2表示单键。
[14]上述[11]或[12]的沉淀促进剂，其中，L为式(a1’)所示的基团，L1表示亚苯基，并且L2表示单键。
[15]上述[11]-[14]中任一项的沉淀促进剂，其中，Y为氧原子。
[16]上述[11]-[15]中任一项的沉淀促进剂，其中，Z为式(a2)所示的基团，R4为氢原子。
[17]上述[11]-[16]中任一项的沉淀促进剂，其中，Z为式(a2)所示的基团，Ra和Rb为氢原子。
[18]上述[11]或[12]的沉淀促进剂，其中，L和Y为单键，Z为式(a2)所示的基团，R4为氢原子，并且Ra和Rb一起形成羰基。
[19]上述[1]-[18]中任一项的沉淀促进剂，其中，被有机基团保护的有机化合物为任选地进一步被核酸合成中所用的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸，或者 任选地进一步被肽合成中所用的保护基保护的氨基酸或肽。
[20]上述[1]-[18]中任一项的沉淀促进剂，其中，被有机基团保护的有机化合物为任选地进一步被核酸合成中所用的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸。
[21]上述[1]-[18]中任一项的沉淀促进剂，其中，被有机基团保护的有机化合物为核苷或寡核苷酸，
所述核苷或寡核苷酸中，选自核酸碱基的氨基和亚氨基、核糖残基的2’位和3’ 位羟基、以及脱氧核糖残基的3’位羟基中的至少一个基团被有机基团保护，并且其 它基团任选地进一步被核酸合成中所用的保护基保护。
[22]上述[1]-[21]中任一项的沉淀促进剂，其中，溶剂是包含极性溶剂的溶剂。
[23]上述[22]的沉淀促进剂，其中，包含极性溶剂的溶剂是极性溶剂和非极性溶剂的混合溶剂。
[24]上述[22]或[23]的沉淀促进剂，其中，极性溶剂为乙腈。
[25]上述[1]-[24]中任一项的沉淀促进剂，其中，使用相对于被有机基团保护的有机化合物为0.1摩尔当量以上的所述沉淀促进剂，使被有机基团保护的有机化合 物沉淀。
[26]沉淀混合物，其包含上述[1]-[25]中任一项的沉淀促进剂、以及被具有一 个以上的碳原子数为10以上的脂族烃基的有机基团保护的有机化合物。
[27]上述[26]的沉淀混合物，其中，有机基团所具有的碳原子数为10以上的脂 族烃基是直链型。
[28]使被具有一个以上的碳原子数为10以上的脂族烃基的有机基团保护的有 机化合物从溶剂中沉淀的方法，该方法使用上述[1]-[25]中任一项的沉淀促进剂。
[29]上述[28]的方法，其中，溶剂是包含极性溶剂的溶剂。
[30]上述[29]的方法，其中，极性溶剂为乙腈。
[31]上述[28]-[30]中任一项的方法，其中，有机基团所具有的碳原子数为10以上的脂族烃基是直链型。
[32]寡核苷酸的制备方法，该方法包括：在非极性溶剂中包含寡核苷酸和上述[1]-[25]中任一项的沉淀促进剂的反应液中添加极性溶剂，从反应液中分离包含寡核 苷酸和沉淀促进剂的沉淀混合物的步骤，
所述寡核苷酸中，至少一个基团被具有一个以上的碳原子数为10以上的脂族烃基的有机基团保护、并且其它基团任选地进一步被核酸合成中所用的保护基保护。
[33]上述[32]的制备方法，其中，极性溶剂为乙腈。
[34]上述[32]或[33]的制备方法，其中，有机基团所具有的碳原子数为10以上的脂族烃基是直链型。
[35]上述[32]-[34]中任一项的制备方法，该方法通过亚磷酰胺法进行。
[36]寡核苷酸的制备方法，其是利用亚磷酰胺法的寡核苷酸的制备方法，所述亚磷酰胺法中进行一次或重复多次包括下述步骤(1)至(3)的制备循环，
其中，在第一次循环中包含下述步骤(4)，在各循环中包含下述步骤(5)，并且在除最终循环外的各循环中包含下述步骤(6)，
(1)在非极性溶剂中包含核苷或寡核苷酸的反应液中添加酸，将5’位羟基的临时保护基脱保护，利用碱进行中和，得到包含5’位羟基游离体的反应液的步骤，
所述核苷或寡核苷酸中，选自核酸碱基的氨基和亚氨基、核糖残基的2’位和3’ 位羟基、以及脱氧核糖残基的3’位羟基中的至少一个基团被具有一个以上的碳原子 数为10以上的脂族烃基的有机基团保护，5’位羟基被在酸性条件下可除去的临时保 护基保护，并且其它基团任选地进一步被核酸合成中所用的保护基保护；
(2)在非极性溶剂中包含5’位羟基游离体的反应液中添加核苷或寡核苷酸，得到包含亚磷酸三酯化合物的反应液的步骤，
所述核苷或寡核苷酸中，3’位羟基被亚磷酰胺化，并且5’位羟基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，并且其它基团任选地进一步被核酸合成中所用的保护基 保护；
(3)在非极性溶剂中包含亚磷酸三酯化合物的反应液中添加氧化剂或硫化剂，得到包含寡核苷酸的反应液的步骤，
所述寡核苷酸中，选自核酸碱基的氨基和亚氨基、核糖残基的2’位和3’位羟基、以及脱氧核糖残基的3’位羟基中的至少一个基团被具有一个以上的碳原子数为10 以上的脂族烃基的有机基团保护，并且5’位羟基被在酸性条件下可除去的临时保护 基保护，并且其它基团任选地进一步被核酸合成中所用的保护基保护；
(4)在步骤(1)之前、步骤(1)和(2)之间、步骤(2)和(3)之间、以及步骤(3)之后的任 何时候，在反应液中加入上述[1]-[25]中任一项的沉淀促进剂的步骤；
(5)在步骤(4)之后且为步骤(1)和(2)之间、步骤(2)和(3)之间、以及步骤(3)之后的 任何时候，在包含沉淀促进剂的反应液中添加极性溶剂，从反应液中分离包含5’位 羟基游离体、亚磷酸三酯化合物或寡核苷酸、和沉淀促进剂的沉淀混合物的步骤；
(6)在步骤(5)中得到的沉淀混合物中加入非极性溶剂，制成反应液的步骤。
[37]上述[36]的制备方法，其中，极性溶剂为乙腈。
[38]上述[36]或[37]的制备方法，其中，有机基团所具有的碳原子数为10以上的脂族烃基是直链型。
[39]上述[36]-[38]中任一项的方法，其中，步骤(5)和(6)在步骤(3)之后执行。
[40]上述[36]-[39]中任一项的方法，该方法进一步包含下述步骤(7)：
(7)除去寡核苷酸的全部保护基，分离寡核苷酸的步骤。
[41]上述[36]-[40]中任一项的方法，其中，非极性溶剂是选自卤系溶剂、芳族 系溶剂、酯系溶剂、脂族系溶剂、以及它们的组合中的溶剂。
[发明的效果]
使用本发明的沉淀促进剂，可促进具有假固相保护基(其为疏水基)的有机化合物从溶剂中沉淀，并可提高其回收率。
具体实施方式
[术语]
除非在文中另外指明，在本说明书中使用的任何技术术语和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。与本说明书所描述的 那些方法和材料相似或等效的任何方法和材料均可用于本发明的实施或试验中，并 且优选的方法和材料在后文进行记载。本说明书引用的所有出版物和专利通过引用 的方式引入本文中，以便描述和公开在例如关于所述发明有用的出版物中所描述的 构建产品和方法论。
在本说明书中，将为寡核苷酸的构成单元的“核苷”是指这样的化合物，其中通 过N-苷化使核酸碱基与糖(例如，其中2-脱氧核糖、核糖、核糖环或脱氧核糖环的2 位碳原子和4位碳原子通过二价有机基团键合的核糖或脱氧核糖等)的1’位键合。其 中核糖环或脱氧核糖环的2位碳原子和4位碳原子通过二价有机基团键合的核糖或 脱氧核糖实例包括以下化合物。
Figure RE-GDA0001356701620000011
在本说明书中，“核苷酸”是指其中磷酸基与核苷键合的化合物。
在本说明书中，“寡核苷酸”是指其中一个或多个核苷酸与核苷键合的化合物。 尽管对本发明中的寡核苷酸的核苷的数目没有特别限定，它优选为3–50，更优选 为5–30。
在本说明书中，“核苷”和“核苷酸”包括具有替代核糖残基或脱氧核糖残基的吗啉残基的吗啉代核苷和吗啉代核苷酸。
在本说明书中，“吗啉代核苷”是下式(1)所示的化合物。在本说明书中，式(1)所示的吗啉代核苷称为吗啉代核苷(1)。其它式所示的化合物也可以相同方式提及。
Figure RE-GDA0001356701620000012
其中碱基表示任选被保护的核酸碱基。
吗啉代核苷(1)可以按照本身公知的方法(例如WO91/09033A1中描述的方法)或者与其类似的方法进行制备。具体而言，如以下方案所示，利用高碘酸钠等使相应 核糖核苷(2)氧化开环以形成相应2’,3’-二醛(3)，利用氨使该二醛(3)闭环以形成2’,3’- 二羟基吗啉代核苷(4)，和利用还原剂(例如氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠等) 将该二羟基吗啉代核苷(4)还原，由此可得到吗啉代核苷(1)。
Figure BDA0001356701560000101
在本说明书中，吗啉代核苷的位置编号(1’、2’等)对应作为原料核糖核苷(2)的核糖的碳原子的位置编号。在本说明书中，按照核酸化学的惯例，将吗啉代寡核苷酸 的具有游离5’位羟基一侧的末端的吗啉代核苷称为“5’-末端”、相反侧的末端的吗啉 代核苷称为“3’-末端”。
在本说明书中，对“核酸碱基”没有特别限制，只要其可用于合成核酸即可，并 且包括例如嘧啶碱基如胞嘧啶基、尿嘧啶基、胸腺嘧啶基等，以及嘌呤碱基如腺嘌 呤基、鸟嘌呤基等。“任选被保护的核酸碱基”是指，例如在腺嘌呤基、鸟嘌呤基或 胞嘧啶基(其为具有氨基的核酸碱基)中，氨基可被保护，优选其中核酸碱基的氨基 被可耐受核苷酸的5’位的脱保护条件或吗啉代核苷酸的吗啉环氮原子的脱保护条件 的保护基保护的核酸碱基。所述“氨基的保护基”没有特别限制，其实例包括Greene 的有机合成中的保护基(Greene'sPROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS)，第4版，Wiley-Interscience，2006等中描述的保护基。该“氨基的保 护基”的具体实例包括新戊酰基、新戊酰氧甲基、三氟乙酰基、苯氧基乙酰基、4- 异丙基苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、乙酰基、苯甲酰基、异丁酰基、二 甲基甲脒基、9-芴甲氧羰基等。其中，优选苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、 乙酰基、苯甲酰基、异丁酰基以及二甲基甲脒基。另外，核酸碱基的羰基任选被保 护，例如可通过使苯酚、2,5-二氯苯酚、3-氯苯酚、3,5-二氯苯酚、2-甲酰基苯酚、 2-萘酚、4-甲氧基苯酚、4-氯苯酚、2-硝基苯酚、4-硝基苯酚、4-乙酰基氨基苯酚、 五氟苯酚、4-新戊酰氧基苯甲醇、4-硝基苯乙醇、2-(甲磺酰基)乙醇、2-(苯磺酰基) 乙醇、2-氰基乙醇、2-(三甲基甲硅烷基)乙醇、二甲基氨基甲酰氯、二乙基氨基甲酰 氯、乙基苯基氨基甲酰氯、1-吡咯烷碳酰氯、4-吗啉碳酰氯、二苯基氨基甲酰氯等 进行反应来保护羰基。在一些情况下，无需特别引入羰基的保护基。此外，除了上 述基团之外，该“核酸碱基”还包括修饰的核酸碱基(例如，8-溴腺嘌呤基、8-溴鸟嘌 呤基、5-溴胞嘧啶基、5-碘胞嘧啶基、5-溴尿嘧啶基、5-碘尿嘧啶基、5-氟尿嘧啶基、 5-甲基胞嘧啶基、8-氧代鸟嘌呤基、次黄嘌呤基(hypoxanthinyl)等)，其是在任意位置 被任意1至3个取代基(例如，卤素原子、烷基、芳烷基、烷氧基、酰基、烷氧基烷基、羟基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基、硝基等)取代的核酸碱基。
在本说明书中，“卤素原子”是指氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。
在本说明书中，“烷基(基团)”的实例包括具有一个或多个碳原子的直链或支链烷基。当未特别限制碳数时，其优选为C1-10烷基，更优选为C1-6烷基。当未特别限制 碳数时，优选为例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、 戊基、己基等，特别优选为甲基、乙基。
在本说明书中，“Ca-b”是指碳数为a以上且b以下(a、b各自表示整数)。
在本说明书中，“芳烷基(基团)”的实例包括C7-20芳烷基，优选C7-16芳烷基(C6-10芳基-C1-6烷基)。优选的具体实例包括苄基、1-苯基乙基、2-苯基乙基、1-苯基丙基、 萘基甲基、1-萘基乙基、1-萘基丙基等，特别优选苄基。
在本说明书中，“烷氧基(基团)”的实例包括具有一个或多个碳原子的烷氧基。当未特别限制碳数时，它优选为C1-10烷氧基，更优选为C1-6烷氧基。当未特别限制碳 数时，优选为甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、 叔丁氧基、戊氧基、己氧基等，特别优选为甲氧基、乙氧基。
在本说明书中，“酰基(基团)”的实例包括直链或支链C1-6烷酰基、C7-13芳酰基 等。其具体实例包括甲酰基、乙酰基、正丙酰基、异丙酰基、正丁酰基、异丁酰基、 新戊酰基、戊酰基、己酰基、苯甲酰基、萘酰基、乙酰丙酰基(levulinyl)等，其每个 任选地被取代。
在本说明书中，作为“烯基(基团)”，优选直链或支链C2-6烯基等。其实例包括乙 烯基、1-丙烯基、烯丙基、异丙烯基、丁烯基、异丁烯基等。其中，优选C2-4烯基。
在本说明书中，作为“炔基(基团)”，优选包括C2-6炔基等。其优选实例包括乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、 3-戊炔基、4-戊炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、5-己炔基等。其 中，优选C2-4炔基。
在本说明书中，“环烷基(基团)”是指环状烷基，其实例包括环丙基、环丁基、环 戊基、环己基、环庚基、环辛基等。其中，优选C3-6环烷基如环丙基、环丁基、环 戊基、环己基等，特别优选环己基。
在本说明书中，“芳基(基团)”是指芳族单环烃基或多环(稠合)烃基。其具体实例包括C6-14芳基如苯基、1-萘基、2-萘基、联苯基、2-蒽基等等。其中，更优选C6-10芳基，特别优选苯基。
在本说明书中，“烃基”的实例包括脂族烃基、芳族脂族烃基、单环饱和烃基、 芳族烃基等。其具体实例包括一价基团，例如烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、 芳烷基等和由它们衍生的二价基团。
在本说明书中，“三烷基甲硅烷基(基团)”中的三个烷基可相同或不同。所述烷基可独立地为直链和支链中的任一种。作为“三烷基甲硅烷基(基团)”，优选三(C1-6烷 基)甲硅烷基，例如可提及三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、 叔丁基二甲基甲硅烷基。
在本说明书中，“亚烷基(基团)”可为直链和支链中的任一种。作为“亚烷基(基团)”，可提及具有一个或多个碳原子的亚烷基。当未特别限制碳数时，其优选为C1-10亚烷基，更优选为C1-6亚烷基。具体的优选实例包括亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚 丁基、亚戊基和亚己基，特别优选亚甲基和亚乙基。
在本说明书中，“连接基”的实例包括-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、 -C(＝O)NH-、-NHC(＝O)-、-S-、-SO-、-SO2-、-Si(R)(R’)O-、-Si(R)(R’)-(R、R’各自 独立地为氢原子或C1-22烃基)等。
在本说明书中，“任选取代”中的“取代基”包括上述卤素原子、烷基、芳烷基、 烷氧基、酰基、烯基、炔基、环烷基、芳基以及羟基、硝基、氰基、胍基、羧基、 烷氧基羰基(烷氧基部分与上述烷氧基相同)、磺基(sulfo group)、磷酰基(phospho group)、烷基硫基(烷基部分与上述烷基相同)、烷基亚硫酰基(烷基部分与上述烷基 相同)、烷基磺酰基(烷基部分与上述烷基相同)、氨基、单烷基氨基(烷基部分与上述 烷基相同)、二烷基氨基(烷基部分与上述烷基相同)、羰基(oxo group)、酰基氨基(酰 基部分与上述酰基相同)等。
在本说明书中，“C3-14烃环”(包括“任选取代的C3-14烃环”中的“C3-14烃环”)的实 例包括C3-10环烷烃、C3-10环烯烃、C6-14芳族烃环。
该“C3-10环烷烃”的实例包括环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷、环庚烷、环辛 烷。
该“C3-10环烯烃”的实例包括环丙烯、环丁烯、环戊烯、环己烯、环庚烯、环辛 烯。
该“C6-14芳族烃环”的实例包括苯、萘。
在本说明书中，“单环杂环基”(包括“任选取代的单环杂环基”中的“单环杂环基”)的实例包括单环芳族杂环基和单环非芳族杂环基，各自包含1–4个选自氮原子、硫 原子和氧原子的杂原子作为除了碳原子以外的构成环的原子。
该“单环芳族杂环基”的实例包括5或6元单环芳族杂环基如噻吩基、呋喃基、 吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、吡啶基、吡嗪 基、嘧啶基、哒嗪基、1,2,4-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,3,4-噻二 唑基、三唑基、四唑基、三嗪基等。
该“单环非芳族杂环基”的实例包括3至8元单环非芳族杂环基如氮丙啶基、环 氧乙烷基、硫杂环丙烷基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、四氢噻 吩基、四氢呋喃基，吡咯啉基、吡咯烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、噁唑啉基、噁唑 烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、噻唑啉基、噻唑烷基、四氢异噻唑基、四氢噁唑基、 四氢异噁唑基、哌啶基、哌嗪基、四氢吡啶基、二氢吡啶基、二氢噻喃基、四氢嘧 啶基、四氢哒嗪基、二氢吡喃基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、吗啉基(例如，吗啉-4- 基)、硫代吗啉基、氮杂环庚烷基(azepanyl)、二氮杂环庚烷基、氮杂
Figure BDA0001356701560000132
基(azepinyl)、 氧杂环庚烷基、氮杂环辛烷基(azocanyl)、二氮杂环辛烷基(diazocanyl)等。
[沉淀促进剂]
本发明的沉淀促进剂是具有一个以上的碳原子数为10以上的直链脂族烃基、且所述脂族烃基的碳原子总数为20以上的有机化合物，所述沉淀促进剂用于使被具有 一个以上的碳原子数为10以上的脂族烃基的有机基团(下文中有时称为“本发明的假 固相保护基”)保护的有机化合物从溶剂中沉淀。本发明的沉淀促进剂可使用仅一种， 或其两种或多种可组合使用。
上述溶剂优选为包含极性溶剂的溶剂，更优选极性溶剂和非极性溶剂的混合溶剂。上述极性溶剂优选为乙腈。
本发明的沉淀促进剂所具有的碳原子数为10以上的直链脂族烃基的碳原子总 数需要为20以上，优选为22以上。当该碳原子总数低于20时，液相中的被假固相 保护基保护的有机化合物不能充分沉淀，且该有机化合物的回收率降低。尽管未特 别限制上限，该碳原子总数优选不超过220，更优选不超过100，进一步优选不超过 70。
本发明的沉淀促进剂所具有的碳原子数为10以上的直链脂族烃基优选为选自 直链C10-40烷基和直链C10-40烯基的基团，更优选为直链C10-40烷基，进一步优选为 直链C10-30烷基，特别优选为直链C12-28烷基，最优选为直链C14-26烷基。本发明的 沉淀促进剂所具有的碳原子数为10以上的直链脂族烃基的数目优选为1–12，更优 选为1–9。
本发明的沉淀促进剂的一个实施方案为具有一个以上的下式(G)所示结构的有机化合物：
Figure BDA0001356701560000131
式中，
R1各自独立地表示直链C10-40烷基；
X1各自独立地表示单键、-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NH- 或-NHC(＝O)-；
环A1表示任选取代的C3-14烃环；
n表示1至4的整数。
在式(G)中，X1的键合方向对应上述化学式的方向。例如，当X1为-C(＝O)O-时， 其在-C(＝O)O-的左侧与R1键合，并在-C(＝O)O-的右侧与环A1键合。
当式(G)中存在多个R1时，它们可相同或不同。同样适用于X1。
本发明的沉淀促进剂的一个优选实施方案是下式(I)所示的化合物。“式(I)所示的 化合物”有时缩写为“化合物(I)”。其它式所示的化合物也可类似地缩写。
Figure BDA0001356701560000141
式中，
R1各自独立地表示直链C10-40烷基；
X1各自独立地表示单键、-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NH-或 -NHC(＝O)-；
环A1和环B1各自独立地表示任选取代的C3-14烃环；
X2各自独立地表示-(CH2)p-、-(CH2)p-O-(CH2)q-、-(CH2)p-C(＝O)-(CH2)q-、 -(CH2)p-C(＝O)O-(CH2)q-、-(CH2)p-OC(＝O)-(CH2)q-、-(CH2)p-C(＝O)NH-(CH2)q-或 -(CH2)p-NHC(＝O)-(CH2)q-，其中p和q各自独立地表示0至3的整数；
X3表示单键、-(CH2)r-O-、-(CH2)r-C(＝O)-、-(CH2)r-C(＝O)O-、-(CH2)r-OC(＝O)-、-(CH2)r-C(＝O)NH-或-(CH2)r-NHC(＝O)-，其中r表示0至3的整数；
R2表示氢原子、任选取代的C3-8环烷基、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的C6-14芳基、任选取代的单环杂环基或三(C1-6烷基)甲硅烷基(优选氢原子、任选取代的C3-8环烷基、任选取代的C1-6烷基、任选 取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的C6-14芳基或任选取代的单环杂 环基)；
n和m各自独立地表示1至4的整数；
当m为1时，m’表示0或1；当m为2、3或4时，m’表示1。
在式(I)中，X1、X2和X3的键合方向各自对应上述化学式的方向。例如，当X3为-(CH2)r-O-时，它在-(CH2)r-O-的左侧与环B1键合、并在-(CH2)r-O-的右侧与R2键 合。
当式(I)中存在多个R1时，它们可相同或不同。同样适用于X1、环A1和X2。
本发明的沉淀促进剂的更优选的一个实施方案是下式(II)所示的化合物。
Figure BDA0001356701560000151
式中，
R1各自独立地表示直链C10-40烷基；
X1各自独立地表示单键、-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NH-或 -NHC(＝O)-；
环A2和环B1各自独立地表示任选取代的C3-14烃环；
X2各自独立地表示-(CH2)p-、-(CH2)p-O-(CH2)q-、-(CH2)p-C(＝O)-(CH2)q-、 -(CH2)p-C(＝O)O-(CH2)q-、-(CH2)p-OC(＝O)-(CH2)q-、-(CH2)p-C(＝O)NH-(CH2)q-或 -(CH2)p-NHC(＝O)-(CH2)q-，其中p和q各自独立地表示0至3的整数；
X3表示单键、-(CH2)r-O-、-(CH2)r-C(＝O)-、-(CH2)r-C(＝O)O-、-(CH2)r-OC(＝O)-、-(CH2)r-C(＝O)NH-或-(CH2)r-NHC(＝O)-，其中r表示0至3的整数；
R2表示氢原子、任选取代的C3-8环烷基、任选取代的C1-6烷基、任选取代的 C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的C6-14芳基、任选取代的单环杂环基或 三(C1-6烷基)甲硅烷基(优选氢原子、任选取代的C3-8环烷基、任选取代的C1-6烷基、 任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的C6-14芳基或任选取代的单 环杂环基)；
m表示1至4的整数；
当m为1时，m’表示0或1；当m为2、3或4时，m’表示1。
在式(II)中，X1、X2和X3的键合方向各自对应上述化学式的方向。例如，当X3为-(CH2)r-O-时，它在-(CH2)r-O-的左侧与环B1键合、并在-(CH2)r-O-的右侧与R2键 合。
当式(II)中存在多个R1时，它们可相同或不同。同样适用于X1。当式(II)中存在 多个环A2时，它们可相同或不同。同样适用于X2。
当存在多个R1时，它们可相同或不同。各R1独立地优选为直链C10-30烷基，更 优选为直链C12-28烷基，进一步优选为直链C14-26烷基。
在本发明的一个实施方案中，R2优选为氢原子、任选取代的C3-8环烷基、任选 取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的C6-14芳基或任选取代的单环杂环基，更优选为氢原子、任选取代的C1-6烷基、任选取代 的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基或任选取代的C6-14芳基，进一步优选为氢原子或 任选取代的C1-6烷基，特别优选为氢原子或C1-6烷基。
在本发明的另一实施方案中，R2优选为氢原子、任选取代的C1-6烷基、任选取 代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基或任选取代的C6-14芳基、任选取代的3-8元单 环非芳族杂环基或三(C1-6烷基)甲硅烷基，更优选为氢原子或任选取代的C1-6烷基或 3-8元单环非芳族杂环基或三(C1-6烷基)甲硅烷基，进一步优选为氢原子、任选被C1-6烷酰基氨基(例如，乙酰氨基)取代的C1-6烷基或3-8元单环非芳族杂环基(例如，吗 啉-4-基)或三(C1-6烷基)甲硅烷基(例如，三异丙基甲硅烷基)。
X1各自独立地优选为单键、-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-OC(＝O)-，更优选为-O-、-C(＝O)O-或-OC(＝O)-，进一步优选为-O-。
X2各自独立地优选为-(CH2)p-、-(CH2)p-O-(CH2)q-、-(CH2)p-C(＝O)-(CH2)q-、 -(CH2)p-C(＝O)O-(CH2)q-或-(CH2)p-OC(＝O)-(CH2)q-(p和q各自独立地为0–3的整 数)，更优选为-(CH2)p-、-(CH2)p-O-(CH2)q-、-(CH2)p-C(＝O)-(CH2)q-、 -(CH2)p-C(＝O)O-(CH2)q-或-(CH2)p-OC(＝O)-(CH2)q-(p和q各自独立地为0–3的整 数)，进一步优选为单键、-(CH2)p-O-(CH2)q-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-(CH2)q-或 -(CH2)p-OC(＝O)-(p和q各自独立地为0或1的整数)。
X3优选为单键、-(CH2)r-O-、-(CH2)r-C(＝O)-、-(CH2)r-C(＝O)O-或-(CH2)r-OC(＝O)- (r为0–3的整数)，更优选为单键、-(CH2)r-C(＝O)-、-(CH2)r-C(＝O)O-或-(CH2)r-OC(＝O)- (r为0–3的整数)，进一步优选为单键、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-OC(＝O)-。
n优选为1–3的整数。
m优选为1–3的整数，更优选为1或3。
C3-14烃环优选选自苯环和环己烷环，更优选为苯环。
优选的化合物(I)是这样的化合物，其中：
R1各自独立地为直链C10-30烷基；
X1各自独立地为单键、-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-OC(＝O)-；
环A2和环B1各自独立地为苯环或环己烷环；
X2各自独立地为-(CH2)p-、-(CH2)p-O-(CH2)q-、-(CH2)p-C(＝O)-(CH2)q-、 -(CH2)p-C(＝O)O-(CH2)q-或-(CH2)p-OC(＝O)-(CH2)q-(p和q各自独立地为0–3的整 数)；
X3为单键、-(CH2)r-O-、-(CH2)r-C(＝O)-、-(CH2)r-C(＝O)O-或-(CH2)r-OC(＝O)-(r为0–3的整数)；
R2为氢原子、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔 基、任选取代的C6-14芳基、任选取代的3-8元单环非芳族杂环基或三(C1-6烷基)甲 硅烷基；
n为1-3的整数；
m为1-3的整数；和
当m为1时，m’为0或1；当m为2或3时，m’为1。
在此实施方案中，更优选R2为氢原子、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基或任选取代的C6-14芳基。
更优选化合物(I)是这样的化合物，其中：
R1各自独立地为直链C12-28烷基；
X1各自独立地为-O-、-C(＝O)O-或-OC(＝O)-；
环A2和环B1各自独立地为苯环或环己烷环；
X2各自独立地为-(CH2)p-、-(CH2)p-O-(CH2)q-、-(CH2)p-C(＝O)-(CH2)q-、 -(CH2)p-C(＝O)O-(CH2)q-或-(CH2)p-OC(＝O)-(CH2)q-(p和q各自独立地为0–3的整 数)；
X3为单键、-(CH2)r-C(＝O)-、-(CH2)r-C(＝O)O-或-(CH2)r-OC(＝O)-(r为0–3的整数)；
R2为氢原子、任选取代的C1-6烷基或3-8元单环非芳族杂环基或三(C1-6烷基) 甲硅烷基；
n为1-3的整数；
m为1-3的整数；和
当m为1时，m’为0或1；当m为2或3时，m’为1。
在此实施方案中，更优选R2为氢原子或任选取代的C1-6烷基。
还更优选的化合物(I)是这样的化合物，其中：
R1各自独立地为直链C12-28烷基；
X1各自独立地为-O-、-C(＝O)O-或-OC(＝O)-；
环A2和环B1各自独立地为苯环或环己烷环；
X2各自独立地为-(CH2)p-、-(CH2)p-O-(CH2)q-、-(CH2)p-C(＝O)-(CH2)q-、 -(CH2)p-C(＝O)O-(CH2)q-或-(CH2)p-OC(＝O)-(CH2)q-(p和q各自独立地为0–3的整 数)；
X3为单键、-(CH2)r-C(＝O)-、-(CH2)r-C(＝O)O-或-(CH2)r-OC(＝O)-(r为0–3的整数)；
R2为氢原子、任选被C1-6烷酰基氨基(例如，乙酰基氨基)取代的C1-6烷基或3-8 元单环非芳族杂环基(例如，吗啉-4-基)或三(C1-6烷基)甲硅烷基(例如，三异丙基甲 硅烷基)；
n为1-3的整数；
m为1-3的整数；和
当m为1时，m’为0或1；当m为2或3时，m’为1。
进一步优选的化合物(I)是这样的化合物，其中：
R1各自独立地为直链C14-26烷基；
X1为-O-；
环A2和环B1各自独立地为苯环或环己烷环；
X2各自独立地为单键、-(CH2)p-O-(CH2)q-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-(CH2)q-或 -(CH2)p-OC(＝O)-(p和q各自独立地为0或1的整数)；
X3为单键、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-OC(＝O)-；
R2为氢原子、任选被C1-6烷酰基氨基(例如，乙酰基氨基)取代的C1-6烷基或3-8 元单环非芳族杂环基(例如，吗啉-4-基)或三(C1-6烷基)甲硅烷基(例如，三异丙基甲 硅烷基)；
n为1-3的整数；
m为1或3；和
当m为1时，m’为0或1；当m为3时，m’为1。
在上述进一步优选的化合物(I)中，更优选R2为氢原子或C1-6烷基。
在上述进一步优选的化合物(I)中，进一步更优选当m为1且m’为0时，X2各 自独立地为单键、-C(＝O)O-(CH2)q-或-(CH2)p-OC(＝O)-(p和q各自独立地为0或1的 整数)，R2为C1-6烷基。
在上述进一步优选的化合物(I)中，进一步更优选当m为1或3且m’为1时， X2各自独立地为-(CH2)p-O-(CH2)q-或-C(＝O)-(p和q各自独立地为0或1的整数)， X3为单键或-C(＝O)O-，且R2为氢原子或C1-6烷基。
特别优选的化合物(I)是这样的化合物，其中：
R1各自独立地为直链C14-26烷基；
X1为-O-；
环A2和环B1各自为苯环；
X2各自独立地为单键、-(CH2)p-O-(CH2)q-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-(CH2)q-或 -(CH2)p-OC(＝O)-(p和q各自独立地为0或1的整数)；
X3为单键、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-OC(＝O)-；
R2为氢原子或C1-6烷基；
n为1-3的整数；
m为1或3；和
当m为1时，m’为0或1；当m为3时，m’为1。
在上述特别优选的化合物(I)中，更优选当m为1且m’为0时，X2为单键、 -C(＝O)O-(CH2)q-或-(CH2)p-OC(＝O)-(p和q各自独立地为0或1的整数)，且R2为 C1-6烷基。
在上述特别优选的化合物(I)中，更优选当m为1或3且m’为1时，X2为 -(CH2)p-O-(CH2)q-或-C(＝O)-(p和q各自独立地为0或1的整数)，且X3为单键或 -C(＝O)O-。
优选的化合物(II)为这样的化合物，其中：
R1各自独立地为直链C10-30烷基；
X1各自独立地为单键、-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-OC(＝O)-；
环A2和环B1各自独立地为苯环或环己烷环；
X2各自独立地为-(CH2)p-、-(CH2)p-O-(CH2)q-、-(CH2)p-C(＝O)-(CH2)q-、 -(CH2)p-C(＝O)O-(CH2)q-或-(CH2)p-OC(＝O)-(CH2)q-(p和q各自独立地为0–3的整 数)；
X3为单键、-(CH2)r-O-、-(CH2)r-C(＝O)-、-(CH2)r-C(＝O)O-或-(CH2)r-OC(＝O)-(r为0–3的整数)；
R2为氢原子、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔 基、任选取代的C6-14芳基、任选取代的3-8元单环非芳族杂环基或三(C1-6烷基)甲 硅烷基；
m为1-3的整数；和
当m为1时，m’为0或1；当m为2或3时，m’为1。
在此实施方案中，更优选R2为氢原子、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基或任选取代的C6-14芳基。
更优选的化合物(II)是这样的化合物，其中：
R1各自独立地为直链C12-28烷基；
X1各自独立地为-O-、-C(＝O)O-或-OC(＝O)-；
环A2和环B1各自独立地为苯环或环己烷环；
X2各自独立地为-(CH2)p-、-(CH2)p-O-(CH2)q-、-(CH2)p-C(＝O)-(CH2)q-、 -(CH2)p-C(＝O)O-(CH2)q-或-(CH2)p-OC(＝O)-(CH2)q-(p和q各自独立地为0–3的整 数)；
X3为单键、-(CH2)r-C(＝O)-、-(CH2)r-C(＝O)O-或-(CH2)r-OC(＝O)-(r为0–3的整数)；
R2为氢原子、任选取代的C1-6烷基或3-8元单环非芳族杂环基或三(C1-6烷基) 甲硅烷基；
m为1-3的整数；和
当m为1时，m’为0或1；当m为2或3时，m’为1。
在此实施方案中，更优选R2为氢原子或任选取代的C1-6烷基。
还更优选的化合物(II)是这样的化合物，其中：
R1各自独立地为直链C12-28烷基；
X1各自独立地为-O-、-C(＝O)O-或-OC(＝O)-；
环A2和环B1各自独立地为苯环或环己烷环；
X2各自独立地为-(CH2)p-、-(CH2)p-O-(CH2)q-、-(CH2)p-C(＝O)-(CH2)q-、 -(CH2)p-C(＝O)O-(CH2)q-或-(CH2)p-OC(＝O)-(CH2)q-(p和q各自独立地为0–3的整 数)；
X3为单键、-(CH2)r-C(＝O)-、-(CH2)r-C(＝O)O-或-(CH2)r-OC(＝O)-(r为0–3的整数)；
R2为氢原子、任选被C1-6烷酰基氨基(例如，乙酰氨基)取代的C1-6烷基或3-8 元单环非芳族杂环基(例如，吗啉-4-基)或三(C1-6烷基)甲硅烷基(例如，三异丙基甲 硅烷基)；
m为1-3的整数；和
当m为1时，m’为0或1；当m为2或3时，m’为1。
进一步优选的化合物(II)为这样的化合物，其中：
R1各自独立地为直链C14-26烷基；
X1为-O-；
环A2和环B1各自为苯环或环己烷环；
X2各自独立地为单键、-(CH2)p-O-(CH2)q-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-(CH2)q-或 -(CH2)p-OC(＝O)-(p和q各自独立地为0或1的整数)；
X3为单键、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-OC(＝O)-；
R2为氢原子、任选被C1-6烷酰基氨基(例如，乙酰氨基)取代的C1-6烷基或3-8 元单环非芳族杂环基(例如，吗啉-4-基)或三(C1-6烷基)甲硅烷基(例如，三异丙基甲 硅烷基)；
m为1或3；和
当m为1时，m’为0或1；当m为3时，m’为1。
在上述进一步优选的化合物(II)中，更优选R2为氢原子或C1-6烷基。
在上述进一步优选的化合物(II)中，进一步更优选当m为1且m’为0时，X2各 自独立地为单键、-C(＝O)O-(CH2)q-或-(CH2)p-OC(＝O)-(p和q各自独立地为0或1的 整数)，且R2为C1-6烷基。
在上述进一步优选的化合物(II)中，进一步更优选当m为1或3且m’为1时， X2各自独立地为-(CH2)p-O-(CH2)q-或-C(＝O)-(p和q各自独立地为0或1的整数)， X3为单键或-C(＝O)O-，且R2为氢原子或C1-6烷基。
特别优选的化合物(II)是这样的化合物，其中：
R1各自独立地为直链C14-26烷基；
X1为-O-；
环A2和环B1各自为苯环；
X2各自独立地为单键、-(CH2)p-O-(CH2)q-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-(CH2)q-或 -(CH2)p-OC(＝O)-(p和q各自独立地为0或1的整数)；
X3为单键、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-OC(＝O)-；
R2为氢原子或C1-6烷基；
m为1或3；和
当m为1时，m’为0或1；当m为3时，m’为1。
在上述特别优选的化合物(II)中，更优选当m为1且m’为0时，X2为单键、 -C(＝O)O-(CH2)q-或-(CH2)p-OC(＝O)-(p和q各自独立地为0或1的整数)，且R2为 C1-6烷基。
在上述特别优选的化合物(II)中，更优选当m为1或3且m’为1时，X2为 -(CH2)p-O-(CH2)q-或-C(＝O)-(p和q各自独立地为0或1的整数)，且X3为单键或 -C(＝O)O-。
上述化合物(I)中包括的具体实例包括下式(IV-a)-(IV-n)所示的化合物。在所述具体实例中，优选化合物(IV-a)-化合物(IV-l)，更优选化合物(IV-a)-化合物(IV-j)， 进一步优选化合物(IV-a)-化合物(IV-g)，特别优选化合物(IV-a)-化合物(IV-e)，最优 选化合物(IV-a)和化合物(IV-b)。
Figure BDA0001356701560000211
Figure BDA0001356701560000221
本发明的沉淀促进剂的另一实施方案为经由选自-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、 -OC(＝O)-、-C(＝O)NH-和-NHC(＝O)-中的基团而具有一个以上的直链C10-40烷基、并 且进一步任选取代的C1-10烷烃(下文中有时被称为“烷烃化合物”)。
C1-10烷烃可为直链或支链。C1-10烷烃的碳数优选为1–8，更优选为2–6，进 一步优选为3–6。
烷烃化合物所具有的直链C10-40烷基优选为直链C10-30烷基，更优选为直链C12-28烷基，进一步优选为直链C14-26烷基。烷烃化合物所具有的直链C10-40烷基的数目优 选为2–6，更优选为2–4，进一步优选为3或4。
将直链C10-40烷基和C1-10烷烃键合的基团优选为选自-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-和-OC(＝O)-中的基团，更优选为-O-。
优选的烷烃化合物为经由选自-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-和-OC(＝O)-中的基团而具有2–6个的直链C10-30烷基并进而任选取代的C1-8烷烃。更优选的烷烃化合物为 经由-O-而具有2–4个的直链C10-30烷基并进而任选取代的C2-6烷烃。进一步优选 的烷烃化合物为经由-O-而具有3或4个的直链C14-26烷基并进而任选取代的C3-6烷 烃。
烷烃化合物的具体实例包括下式(V-a)或(V-b)所示的化合物：
Figure BDA0001356701560000231
[本发明的沉淀促进剂的制备方法]
例如，其中X1为-O-、m为1且m’为0的化合物(I)可如下制备：通过使用下式 中所示的具有卤素原子(Xa)的化合物(IA-1)将化合物(IA-2)的羟基烷基化来制备。烷 基化是有机合成领域中众所周知的，本领域普通技术人员可通过合适地设定针对其 的条件进行烷基化。
Figure BDA0001356701560000232
其中Xa为卤素原子(优选氯离子或溴离子)，且其它符号如上所定义。
例如，其中X2为-CH2-O-且m’为1的化合物(I)可如下制备：通过使用下式中所 示的具有卤素原子(Xa)的化合物(IA-3)将化合物(IB)的羟基烷基化来制备。
Figure BDA0001356701560000233
其中各符号如上所定义。
本发明的其它沉淀促进剂也可按照本身已知的方法(例如，烷基化、酯化、酰胺 化等)或与其类似的方法由起始化合物制备。作为起始化合物，可使用商业上可获得 的产品，或可使用按照本身已知的方法或与其类似的方法制备的化合物。
[本发明的假固相保护基]
本发明的沉淀促进剂用于使被具有一个以上的碳原子数为10以上的脂族烃基 的有机基团(即，本发明的假固相保护基)保护的有机化合物从包含该化合物的溶剂 中沉淀。本发明的假固相保护基和被所述假固相保护基保护的有机化合物的具体实 例包括WO2012/157723、WO 2012/157723、WO 2014/189142、JP-A-2010-116418 等中公开的核苷、核苷酸等，和WO 2010/104169、WO 2010/113939、WO 2011/078295、WO 2012/029794、JP-A-2009-185063、JP-A-2010-275254等中公开的 氨基酸、肽等。本发明的假固相保护基优选为在酸性条件下不被除去但在碱性条件 下可被除去的有机基团。
本发明的假固相保护基的一个实施方案为例如，具有C6-14芳族烃环的有机基 团，所述C6-14芳族烃环经由连接基与“经由单键或连接基键合有碳原子数为10以 上的脂族烃基的烃基”键合。作为上述烃基，可重述上述那些，且优选脂族烃基、 芳脂族烃基(例如，苄基)和其中单环饱和烃基与脂族烃基键合的基团(例如，环己基 甲基)。“经由单键或连接基键合有碳原子数为10以上的脂族烃基的烃基”还包括“碳 原子数为10以上的脂族烃基”本身(即，“经由单键键合有脂族烃基的脂族烃基”)。
尽管本发明的假固相保护基所具有的碳原子数为10以上的脂族烃基可为直链 或支链，它优选为直链以充分发挥本发明的沉淀促进剂的效果。碳原子数为10以上 的脂族烃基更优选为选自直链C10-40烷基和直链C10-40烯基的基团，还更优选为直链 C10-40烷基，进一步优选为直链C10-30烷基，特别优选为直链C12-28烷基，且最优选 为直链C14-26烷基。
上述连接基优选选自-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NH-、-NHC(＝O)-、 -S-、-SO-、-SO2-、-Si(R)(R’)O-、-Si(R)(R’)-(R、R’各自独立地为氢原子或C1-22烃基)，更优选选自-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NH-和-NHC(＝O)-，且 更优选为-O-。
上述C6-14芳族烃环优选选自苯环和萘环，且更优选为苯环。
上述“C6-14芳族烃环，其经由连接基与‘经由单键或连接基键合有碳原子数为 10以上的脂族烃基的烃基’键合”优选为“C6-14芳族烃环，其经由连接基与碳原子数 为10以上的直链脂族烃基键合”，更优选为“C6-14芳族烃环，其经由连接基与选自直 链C10-40烷基和直链C10-40烯基的基团键合”，还更优选为“C6-14芳族烃环，其经由连 接基与直链C10-40烷基键合”，进一步优选为“C6-14芳族烃环，其经由连接基与直链 C10-30烷基键合”，特别优选为“C6-14芳族烃环，其经由连接基与直链C12-28烷基键合”， 且最优选“C6-14芳族烃环，其经由连接基与直链C14-26烷基键合”。在这些基团中， 所述连接基优选为-O-。在这些基团中，所述C6-14芳族烃环优选为苯环。
上述假固相保护基优选为“具有苯环的有机基团，所述苯环经由-O-与‘经由单 键或-O-键合有直链C10-40烷基的烃基’键合”，更优选为“具有苯环的有机基团，所 述苯环经由-O-与直链C10-40烷基键合”，进一步优选为“具有苯环的有机基团，所述 苯环经由-O-与直链C10-30烷基键合”，特别优选为“具有苯环的有机基团，所述苯环 经由-O-与直链C12-28烷基键合”，最优选为“具有苯环的有机基团，所述苯环经由-O- 与直链C14-26烷基键合”。
本发明的假固相保护基为，例如，下式(III)所示的基团(下文中被称为“假固相保护基(III)”)：
**L-Y-Z (III)
式中，
**表示与被保护的基团的键合位置；
L表示单键、或者式(a1)或(a1’)所示的基团：
Figure BDA0001356701560000251
式中，
*表示与Y的键合位置；
**与前述的定义相同；
R8和R9各自独立地表示C1-22烃基；
L1表示二价C1-22烃基；并且
L2表示单键，或者表示**C(＝O)N(R2’)-R1’-N(R3)***所示的基团，式中**表示与L1的键合位置，***表示与C＝O的键合位置，R1’表示C1-22亚烷基，R2’和R3各自独立 地表示氢原子或C1-22烷基，或者R2’和R3任选地一起形成环；
Y表示单键、氧原子或NR，其中R表示氢原子、烷基或芳烷基；以及
Z表示式(a2)、式(a2’)或式(a2”){优选式(a2)或式(a2’)}所示的基团：
Figure BDA0001356701560000252
式中，
*表示键合位置；
R4为氢原子，或者当Rb为下述式(a3)所示的基团时，R4任选地与环C的R6一起 表示单键或-O-、并与环A或环B及环C一起形成稠环(优选芴环或呫吨环)；
k个Q各自独立地表示-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NH-或 -NHC(＝O)-；
k个R5各自独立地表示经由单键或连接基键合有碳原子数为10以上的脂族烃基的烃基(优选经由单键或连接基键合有碳原子数为10以上的直链脂族烃基的烃基)；
k表示1至4的整数；
环A和环B各自独立地除了具有k个QR5以外，任选地进一步具有取代基，所述 取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的 C1-6烷氧基；
Ra表示氢原子、或任选被卤素原子取代的苯基(优选氢原子)；以及
Rb表示氢原子、或式(a3)所示的基团：
Figure BDA0001356701560000261
式中，*表示键合位置；
j表示0至4的整数；
j个Q各自独立地表示与前述相同的含义；
j个R7各自独立地表示经由单键或连接基键合有碳原子数为10以上的脂族烃基的烃基(优选经由单键或连接基键合有碳原子数为10以上的直链脂族烃基的烃基)；
R6表示氢原子，或者任选地与环A或环B的R4一起表示单键或-O-、并且与环A 或环B及环C一起形成稠环(优选芴环或呫吨环)；并且
环C除了具有j个OR7以外，任选地进一步具有取代基，所述取代基选自卤素原 子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基，或者
Ra和Rb一起形成羰基。
被假固相保护基(III)保护的基团的实例包括羟基、氨基、羧基。
式(a2)、式(a2’)和式(a2”)中的R5、以及式(a3)中的R7所具有的碳原子数为10以上的脂族烃基各自独立地优选为选自直链C10-40烷基和直链C10-40烯基的基团，更优 选为直链C10-40烷基，进一步优选为直链C10-30烷基，特别优选为直链C12-28烷基， 最优选为直链C14-26烷基。
式(a2)、式(a2’)和式(a2”)中的R5、以及式(a3)中的R7所具有的连接基各自独立地优选为-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NH-或-NHC(＝O)-，更优选为 -O-。
式(a2)、式(a2’)和式(a2”)中的R5、以及式(a3)中的R7(即，经由单键或连接基键合有碳原子数为10以上的脂族烃基的烃基)各自独立地优选为选自直链C10-40烷基和 直链C10-40烯基的基团，更优选为直链C10-40烷基，进一步优选为直链C10-30烷基， 特别优选为直链C12-28烷基，最优选为直链C14-26烷基。
式(a2)、式(a2’)、式(a2”)和式(a3)中的Q为优选-O-。
在式(III)中，式(a1)所示的L的优选实施方案为这样的基团，其中：
L1为二价C1-22烃基或CH2-O-1,4-亚苯基-O-CH2；和
L2为单键，或**C(＝O)N(R2’)-R1’-N(R3)***所示的基团，其中**表示与L1的键合位置，***表示与C＝O的键合位置，R1’为C1-6亚烷基，R2’和R3各自独立地为氢原子或 任选取代的C1-6烷基，或R2’和R3任选地一起形成任选取代的C1-6亚烷基键。
式(a1)所示的L的另一优选实施方案为这样的基团，其中：
L1为二价C1-22烃基；和
L2为单键。
式(a1)所示的L的另一优选实施方案为这样的基团，其中：
L1为亚乙基；和
L2为**C(＝O)N(R2’)-R1’-N(R3)***所示的基团，其中**表示与L1的键合位置，***表示与C＝O的键合位置，R1’为C1-22亚烷基，R2’和R3各自独立地为氢原子或C1-22烷基，或R2’和R3任选地一起形成环。
式(a1)所示的L的另一优选实施方案为这样的基团，其中：
L1为亚乙基；和
L2为**C(＝O)N(R2’)-R1’-N(R3)***所示的基团，其中**表示与L1的键合位置，***表示与C＝O的键合位置，并且N(R2’)-R1’-N(R3)部分形成哌嗪二基(例如，1,4-哌嗪二 基)。
式(a1)所示的L的另一优选实施方案为这样的基团，其中：
L1为亚乙基；和
L2为**C(＝O)N(R2’)-R1’-N(R3)***所示的基团，其中**表示与L1的键合位置，***表示与C＝O的键合位置，R1’为亚戊基或亚己基，且R2’和R3各自独立地为氢原子或 甲基。
式(a1)所示的L的特别优选的实施方案是琥珀酰基，其可以低成本容易地获得。
现在，解释式(III)中式(a1’)所示的L。
式(a1’)中的L1优选为二价C6-10芳族烃基，更优选为亚苯基。
式(a1’)中的L2优选为单键。
式(a1’)中L1和L2的优选组合是L1为二价C6-10芳族烃基和L2为单键的组合。 式(a1’)中L1和L2的更优选组合是L1为亚苯基和L2为单键的组合。
式(a1’)中R8和R9各自独立地优选为C1-22烷基，更优选为C1-10烷基。
式(a1’)所示的L的优选实施方案为这样的基团，其中：
R8和R9各自独立地为C1-22烷基；
L1为二价C6-10芳族烃基；和
L2为单键。
式(a1’)所示的L的另一优选实施方案为这样的基团，其中：
R8和R9各自独立地为C1-10烷基；
L1为亚苯基；和
L2为单键。
式(III)中的Y为单键、氧原子或NR(R为氢原子、烷基或芳烷基)。当Y为单键 时，L为单键，Z为式(a2)所示的基团，R4为氢原子，并且Ra和Rb优选一起形成羰 基。
式(III)中的Y优选为氧原子或NR(R为氢原子、烷基或芳烷基)，R优选为氢原 子、C1-6烷基或C7-16芳烷基，更优选为氢原子、甲基、乙基或苄基，特别优选为氢 原子。Y特别优选为氧原子。
式(III)中的Z优选为式(a2)或式(a2’)所示的基团，更优选为式(a2)所示的基团。在式(a2)中，R4优选为氢原子。在式(a2)中，Ra和Rb各自优选为氢原子。
式(a2)所示的Z的优选实施方案为这样的基团，其中：
Ra和Rb各自为氢原子；
R4为氢原子；
k为1-3的整数；
k个Q各自为-O-；和
k个R5各自独立地为直链C10-40烷基。
当Z为此实施方案时，更优选L为琥珀酰基，或式(a1’)所示的基团(在式(a1’) 中，R8和R9各自独立地为C1-10烷基、L1为二价亚苯基，L2为单键)，且Y为氧原 子，或L-Y为单键，并且进一步优选L为琥珀酰基，或式(a1’)所示的基团(在式(a1’) 中，R8和R9各自独立地为C1-10烷基，L1为二价亚苯基，且L2为单键)，且Y为氧 原子。
式(a2)所示的Z的另一优选实施方案为这样的基团，其中：
Ra和Rb各自为氢原子；
R4为氢原子；
k为1–3的整数；
k个Q各自为-O-；和
k个R5各自独立地为经由-O-键合有1至3个直链C10-40烷基的苄基、或经由-O- 键合有1至3个直链C10-40烷基的环己基甲基；并且
环A除了具有k个QR5以外，任选地进一步具有取代基，所述取代基选自卤素 原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基。
当Z为此实施方案时，更优选L为琥珀酰基或式(a1’)所示的基团(在式(a1’)中，R8和R9各自独立地为C1-10烷基，L1为二价亚苯基，且L2为单键)，且Y为氧原子， 或L-Y为单键，并且进一步优选L为琥珀酰基或式(a1’)所示的基团(在式(a1’)中， R8和R9各自独立地为C1-10烷基，L1为二价亚苯基，且L2为单键)，且Y为氧原子。
式(a2)所示的Z的另一优选实施方案为这样的基团，其中：
Ra和R4各自为氢原子；和
Rb为式(a3)所示的基团，其中*为键合位置，j为0–3的整数，j个Q为-O-，j个 R7各自独立地为C10-40烷基，R6为氢原子。
当Z为此实施方案时，更优选L为琥珀酰基或式(a1’)所示的基团(在式(a1’)中，R8和R9各自独立地为C1-10烷基，L1为二价亚苯基，且L2为单键)，且Y为氧原子， 或L-Y为单键，并且进一步优选L为琥珀酰基或式(a1’)所示的基团(在式(a1’)中， R8和R9各自独立地为C1-10烷基，L1为二价亚苯基，且L2为单键)，且Y为氧原子。
式(a2)所示的Z的还有另一优选实施方案为这样的基团，其中：
Ra为氢原子；和
Rb为式(a3)所示的基团，其中*为键合位置，j为0–3的整数，j个Q为-O-，j个 R7各自独立地为直链C10-40烷基，且R6与环A的R4一起形成单键或-O-，由此环A 和环C一起形成芴环或呫吨环。
当Z为此实施方案时，更优选L为琥珀酰基或式(a1’)所示的基团(在式(a1’)中，R8和R9各自独立地为C1-10烷基，L1为二价亚苯基，且L2为单键)，且Y为氧原子， 或L-Y为单键，并且进一步优选L为琥珀酰基或式(a1’)所示的基团(在式(a1’)中， R8和R9各自独立地为C1-10烷基，L1为二价亚苯基，且L2为单键)，并且Y为氧原 子。
式(a2)所示的Z的另一优选实施方案为这样的基团，其中：
Ra和Rb一起形成羰基；
R4为氢原子；
k为1–3的整数；
k个Q为-O-；且
k个R5各自独立地为直链C10-40烷基。
当Z为此实施方案时，更优选L-Y为单键或琥珀酰-1,4-哌嗪二基，并且进一步 优选L-Y为单键。
式(a2)所示的Z的另一优选实施方案为这样的基团，其中：
Ra和Rb一起形成羰基；
R4为氢原子；
k为1–3的整数；
k个Q各自为-O-；并且
k个R5各自独立地为经由-O-键合有1至3个直链C10-40烷基的苄基、或经由-O- 键合有1至3个直链C10-40烷基的环己基甲基；和
环A除了具有k个QR5以外，任选地进一步具有取代基，所述取代基选自卤素 原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基。
当Z为此实施方案时，更优选L-Y为单键或琥珀酰-1,4-哌嗪二基，并且进一步 优选L-Y为单键。
假固相保护基(III)优选为在酸性条件下不被除去但在碱性条件下可被除去的基团。
具有碳原子数为10以上的直链脂族烃基的假固相保护基(III)(其用于保护羟基)的具体实例1包括
这样的基团，其中：
L为琥珀酰基或式(a1’)所示的基团(式(a1’)中，R8和R9各自独立地为C1-10烷基、L1为二价亚苯基，且L2为单键)，并且Y-Z为3,4,5-三(十八烷氧基)苄氧基、2,4-二(十 八烷氧基)苄氧基、2,4-二(二十二烷氧基)苄氧基、3,5-二(二十二烷氧基)苄氧基、3,5- 双[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄氧基、3,4,5-三[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)苄氧基] 苄氧基、3,4,5-三(十八烷氧基)苄基氨基、2,4-二(二十二烷氧基)苄基氨基、3,5-二(二 十二烷氧基)苄基氨基、双(4-二十二烷氧基苯基)甲基氨基、4-甲氧基-2-[3’,4’,5’-三(十 八烷氧基)苄氧基]苄基氨基、4-甲氧基-2-[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]苄基氨基、2,4-双(十二烷氧基)苄基氨基、苯基(2,3,4-三(十八烷氧基)苯基)甲基氨基、双 [4-(12-二十二烷氧基十二烷氧基)苯基]甲基氨基、3,5-双[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄基氨基、3,4,5-三[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄基氨基、3,4,5-三(十八烷氧基)环己基甲氧基、3,5-二(二十二烷氧基)环己基甲氧基、3,5-双[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲氧基、3,4,5-三[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲氧基、3,4,5-三(十八烷氧基)环己基甲基氨基、2,4-二(二十二烷氧基)环己基甲 基氨基、3,5-二(二十二烷氧基)环己基甲基氨基、双(4-二十二烷氧基苯基)甲基氨基、 4-甲氧基-2-[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、4-甲氧基 -2-[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、2,4-双(十二烷氧基)环己 基甲基氨基、苯基(2,3,4-三(十八烷氧基)苯基)甲基氨基、双[4-(12-二十二烷氧基十二 烷氧基)苯基]甲基氨基、3,5-双[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨 基、或3,4,5-三[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基；
这样的基团，其中：
L-Y为琥珀酰-1,4-哌嗪二基，并且Z为3,4,5-三(十八烷氧基)苯甲酰基、2,4-二(十 八烷氧基)苯甲酰基、2,4-二(二十二烷氧基)苯甲酰基、3,5-二(二十二烷氧基)苯甲酰基、3,5-双[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苯甲酰基、或3,4,5-三[3’,4’,5’-三(十八烷 氧基)苄氧基]苯甲酰基；和
这样的基团，其中：
L-Y为单键，并且Z为(3,5-双二十二烷氧基苯基)二苯基甲基或双(4-氯苯基)(3,5- 双二十二烷氧基苯基)甲基。
具有碳原子数为10以上的直链脂族烃基的假固相保护基(III)(其用于保护氨基或亚氨基)的具体实例2包括这样的基团，其中L-Y为单键，且Z为3,4,5-三(十八烷 氧基)苯甲酰基、2,4-二(十八烷氧基)苯甲酰基、2,4-二(二十二烷氧基)苯甲酰基、3,5- 二(二十二烷氧基)苯甲酰基、3,5-双[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苯甲酰基、3,4,5- 三[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苯甲酰基、(3,5-双二十二烷氧基苯基)二苯基甲基、 或双(4-氯苯基)(3,5-双二十二烷氧基苯基)甲基。
具有碳原子数为10以上的直链脂族烃基的假固相保护基(III)(其用于保护羧基)的具体实例3包括这样的基团，其中L-Y为单键，并且Z为3,4,5-三(十八烷氧基) 苄基、2,4-二(十八烷氧基)苄基、2,4-二(二十二烷氧基)苄基、3,5-二(二十二烷氧基) 苄基、3,5-双[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄基、3,4,5-三[3’,4’,5’-三(十八烷氧基) 苄氧基]苄基、(3,5-双二十二烷氧基苯基)二苯基甲基、或双(4-氯苯基)(3,5-双二十二 烷氧基苯基)甲基。
具有碳原子数为10以上的支链脂族烃基的假固相保护基(III)(其用于保护羟基)的具体实例4包括这样的基团，其中L为琥珀酰基或式(a1’)所示的基团(在式(a1’) 中，R8和R9各自独立地为C1-10烷基，L1为二价亚苯基，且L2为单键)，且Y-Z为 4-(2’,3’-二氢植基氧基)苄氧基、4-(3,7,11-三甲基十二烷氧基)苄氧基、4-[2,2,4,8,10,10- 六甲基-5-十二酰基氨基]苄氧基、4-(2’,3’-二氢植基氧基)-2-甲基苄氧基、4-(2’,3’-二 氢植基氧基)-2-甲氧基苄氧基、2,4-二(2’,3’-二氢植基氧基)苄氧基、3,5-二(2’,3’-二氢 植基氧基)苄氧基、2-[3’,4’,5’-三(2”,3”-二氢植基氧基)苄氧基]-4-甲氧基苄氧基、3,4,5- 三(2’,3’-二氢植基氧基)苄氧基、3,4,5-三[3,4,5-三(2’,3’-二氢植基氧基)苄氧基]苄氧 基、2,4-二(2-癸基十四烷氧基)苄氧基、4-(2’,3’-二氢植基氧基)苄基氨基、4-(3,7,11- 三甲基十二烷氧基)苄基氨基、4-[2,2,4,8,10,10-六甲基-5-十二酰基氨基]苄基氨基、 4-(2’,3’-二氢植基氧基)-2-甲基苄基氨基、4-(2’,3’-二氢植基氧基)-2-甲氧基苄基氨基、 2,4-二(2’,3’-二氢植基氧基)苄基氨基、3,5-二(2’,3’-二氢植基氧基)苄基氨基、 2-[3’,4’,5’-三(2”,3”-二氢植基氧基)苄氧基]-4-甲氧基苄基氨基、3,4,5-三(2’,3’-二氢植 基氧基)苄基氨基、3,4,5-三[3,4,5-三(2’,3’-二氢植基氧基)苄氧基]苄基氨基、{[(2-氯 -5-(2’,3’-二氢植基氧基)苯基)]苯基甲基}氨基、{[2,3,4-三(2’,3’-二氢植基氧基)苯基]苯基甲基}氨基、或{双[4-(2’,3’-二氢植基氧基)苯基]甲基}氨基。
在此，2,3-二氢植基是指3,7,11,15-四甲基十六烷基。同样适用于2’,3’-二氢植基 和2”,3”-二氢植基。
具有碳原子数为10以上的支链脂族烃基的假固相保护基(III)(其用于保护氨基或亚氨基)的具体实例5包括这样的基团，其中L-Y为单键，且Z为4-(2’,3’-二氢植 基氧基)苯甲酰基、4-(3,7,11-三甲基十二烷氧基)苯甲酰基、4-[2,2,4,8,10,10-六甲基-5- 十二酰基氨基]苯甲酰基、4-(2’,3’-二氢植基氧基)-2-甲基苯甲酰基、4-(2’,3’-二氢植 基氧基)-2-甲氧基苯甲酰基、2,4-二(2’,3’-二氢植基氧基)苯甲酰基、3,5-二(2’,3’-二氢 植基氧基)苯甲酰基、2-[3’,4’,5’-三(2”,3”-二氢植基氧基)苄氧基]-4-甲氧基苯甲酰基、3,4,5-三(2’,3’-二氢植基氧基)苯甲酰基、3,4,5-三[3,4,5-三(2’,3’-二氢植基氧基)苄氧基] 苯甲酰基、或2,4-二(2-癸基十四烷氧基)苯甲酰基。
具有碳原子数为10以上的支链脂族烃基的假固相保护基(III)(其用于保护羧基)的具体实例6包括这样的基团，其中L-Y为单键，且Z为4-(2’,3’-二氢植基氧基) 苄基、4-(3,7,11-三甲基十二烷氧基)苄基、4-[2,2,4,8,10,10-六甲基-5-十二酰基氨基] 苄基、4-(2’,3’-二氢植基氧基)-2-甲基苄基、4-(2’,3’-二氢植基氧基)-2-甲氧基苄基、 2,4-二(2’,3’-二氢植基氧基)苄基、3,5-二(2’,3’-二氢植基氧基)苄基、2-[3’,4’,5’-三 (2”,3”-二氢植基氧基)苄氧基]-4-甲氧基苄基、3,4,5-三(2’,3’-二氢植基氧基)苄基、 3,4,5-三[3,4,5-三(2’,3’-二氢植基氧基)苄氧基]苄基、或2,4-二(2-癸基十四烷氧基)苄 基。
假固相保护基(III)优选为上述假固相保护基(III)的具体实例1-具体实例6的任一 种，更优选为具体实例1-具体实例3的任一种。
假固相保护基(III)还更优选
这样的基团，其中L为琥珀酰基或式(a1’)所示的基团(式(a1’)中，R8和R9各自 独立地为C1-10烷基，L1为二价亚苯基，L2为单键)，且Y-Z为3,4,5-三(十八烷氧基) 苄氧基、2,4-二(十八烷氧基)苄氧基、2,4-二(二十二烷氧基)苄氧基、3,5-二(二十二烷 氧基)苄氧基、3,5-双[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄氧基、3,4,5-三[3’,4’,5’-三(十 八烷氧基)苄氧基]苄氧基、3,4,5-三(十八烷氧基)苄基氨基、2,4-二(二十二烷氧基)苄 基氨基、3,5-二(二十二烷氧基)苄基氨基、二(4-二十二烷氧基苯基)甲基氨基、4-甲 氧基-2-[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄基氨基、4-甲氧基-2-[3’,4’,5’-三(十八烷氧 基)环己基甲氧基]苄基氨基、2,4-二(十二烷氧基)苄基氨基、苯基(2,3,4-三(十八烷氧 基)苯基)甲基氨基、双[4-(12-二十二烷氧基十二烷氧基)苯基]甲基氨基、3,5-双 [3’,4’,5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄基氨基、或3,4,5-三[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)苄氧 基]苄基氨基；
这样的基团，其中L-Y为琥珀酰-1,4-哌嗪二基，并且Z为3,4,5-三(十八烷氧基)苯甲酰基、2,4-二(十八烷氧基)苯甲酰基、2,4-二(二十二烷氧基)苯甲酰基、3,5-二(二 十二烷氧基)苯甲酰基、3,5-双[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苯甲酰基、或3,4,5- 三[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苯甲酰基；或
这样的基团，其中L-Y为单键，并且Z为3,4,5-三(十八烷氧基)苯甲酰基、2,4- 二(十八烷氧基)苯甲酰基、2,4-二(二十二烷氧基)苯甲酰基、3,5-二(二十二烷氧基)苯 甲酰基、3,5-双[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苯甲酰基、或3,4,5-三[3’,4’,5’-三(十 八烷氧基)苄氧基]苯甲酰基。
假固相保护基(III)进一步优选
这样的基团，其中L为琥珀酰基或式(a1’)所示的基团(式(a1’)中，R8和R9各自 独立地为C1-10烷基，L1为二价亚苯基，L2为单键)，并且Y-Z为3,4,5-三(十八烷氧 基)苄氧基、3,5-二(二十二烷氧基)苄氧基、3,5-双[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄 氧基、3,4,5-三[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄氧基、3,4,5-三(十八烷氧基)苄基氨 基、2,4-二(二十二烷氧基)苄基氨基、3,5-二(二十二烷氧基)苄基氨基、二(4-二十二 烷氧基苯基)甲基氨基、4-甲氧基-2-[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄基氨基、4-甲 氧基-2-[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]苄基氨基、2,4-二(十二烷氧基)苄基氨 基、苯基(2,3,4-三(十八烷氧基)苯基)甲基氨基、双[4-(12-二十二烷氧基十二烷氧基) 苯基]甲基氨基、3,5-双[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄基氨基、或3,4,5-三[3’,4’,5’- 三(十八烷氧基)苄氧基]苄基氨基；或
这样的基团，其中L-Y为单键，并且Z为3,4,5-三(十八烷氧基)苯甲酰基。
假固相保护基(III)特别优选为
这样的基团，其中L为琥珀酰基，并且Y-Z为3,4,5-三(十八烷氧基)苄氧基、3,5-二(二十二烷氧基)苄氧基、3,5-双[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄氧基、3,4,5-三[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄氧基、3,4,5-三(十八烷氧基)苄基氨基、2,4-二(二十二烷氧基)苄基氨基、3,5-二(二十二烷氧基)苄基氨基、二(4-二十二烷氧基苯基)甲 基氨基、4-甲氧基-2-[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄基氨基、4-甲氧基-2-[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]苄基氨基、2,4-二(十二烷氧基)苄基氨基、苯基(2,3,4- 三(十八烷氧基)苯基)甲基氨基、双[4-(12-二十二烷氧基十二烷氧基)苯基]甲基氨基、 3,5-双[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄基氨基、或3,4,5-三[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄基氨基；或
这样的基团，其中L-Y为单键，并且Z为3,4,5-三(十八烷氧基)苯甲酰基。
假固相保护基(III)最优选为这样的基团，其中L为琥珀酰基，并且Y-Z为3,4,5-三(十八烷氧基)苄氧基、3,5-二(二十二烷氧基)苄氧基、3,5-双[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄氧基、3,4,5-三[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄氧基、3,4,5-三(十八烷 氧基)苄基氨基、2,4-二(二十二烷氧基)苄基氨基、3,5-二(二十二烷氧基)苄基氨基、二(4-二十二烷氧基苯基)甲基氨基、4-甲氧基-2-[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄基氨基、4-甲氧基-2-[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]苄基氨基、2,4-二(十二烷氧基)苄基氨基、苯基(2,3,4-三(十八烷氧基)苯基)甲基氨基、双[4-(12-二十二烷氧基 十二烷氧基)苯基]甲基氨基、3,5-双[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄基氨基、或 3,4,5-三[3’,4’,5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄基氨基。
用于形成假固相保护基的化合物可通过本身已知的方法(例如，上述专利文献1或2中所述的方法、酯化、甲硅烷基化等)或与其类似的方法制备。例如，用于形成 假固相保护基的式：Z-Y-H所示的醇化合物或胺化合物可通过以下步骤或与其类似 的步骤制备。
Figure BDA0001356701560000341
其中Q’为-O-、-S-、-C(＝O)O-或-NH-，Rg为氢原子、ORh基团(其中Rh为烷基 如C1-6烷基等、芳烷基如苄基等，以及类似基团)或式(a3)所示的基团：
Figure BDA0001356701560000342
其中各符号如上所定义，
Y1为离去基团如卤素原子等，并且其它符号如上所定义。
步骤(a)
在此步骤中，将R5引入式(X)所示的化合物的Q’H(其中Q’为-O-、-S-、-C(＝O)O-或-NH-)中以制备式(X-a)所示的化合物。当Q’为-O-、-S-或-NH-时，使用对应于R5的卤化物(氯化物，溴化物或碘化物)、对应于R5的羧酸或酰卤或对应于R5的烷基磺 酰氧基化产物(例如，甲烷磺酰氧基化产物等)或芳基磺酰氧基化产物(例如，对甲苯 磺酰氧基化产物等)，在存在或不存在碱的情况下，在不影响反应的溶剂中进行该反 应。此外，当Q’为-O-时，该反应可在光延(Mitsunobu)反应条件下进行，其中使 化合物(X)与对应于R5的氢氧化物在三苯基膦和偶氮二羧酸二异丙酯的存在下进行 反应。此外，当Q’为-C(＝O)O-时，例如，化合物(X-a)可通过使化合物(X)与对应于 R5的胺或氢氧化物在缩合剂的存在下进行反应来合成。
碱的实例包括碱金属盐如碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、叔丁醇钾等；碱金属氢 化物如氢化钠、氢化钾等；胺如吡啶、三乙胺、N,N-二甲基苯胺、1,8-二氮杂二环 [5.4.0]-7-十一碳烯等，以及类似物，其中优选碳酸钠、碳酸钾、氢化钠等。
溶剂的实例包括芳族烃如甲苯、二甲苯等；醚如四氢呋喃、二噁烷等；酰胺如 二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺等；卤代烃如氯仿、二氯甲烷等；腈如乙腈等、N-甲 基吡咯烷酮等或其混合物，其中，优选的是二甲基甲酰胺、四氢呋喃、甲苯、N-甲 基吡咯烷酮等。
反应温度优选为50-150℃，更优选为60-130℃。反应时间优选为2-30hr，更优 选为3-10hr。
步骤(b)
在此步骤中，将化合物(X-a)还原，得到由式(XI-a)所示的化合物。可通过使用 还原剂的方法进行此还原反应。
待用于此还原反应的还原剂的实例包括金属氢化物(硼氢化钠、硼氢化锂、氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、二丁基氢化铝、氢化铝、氢化铝锂等)等，其中， 优选的是硼氢化钠、二丁基氢化铝等。
此反应在不影响反应的溶剂中进行。溶剂的实例包括醇如甲醇、乙醇等；醚如 二乙醚、四氢呋喃、二噁烷等；芳族烃如甲苯、二甲苯等；及其混合物，其中，优 选的是四氢呋喃、甲苯等。反应温度优选为0-100℃，更优选为30-70℃。反应时 间优选为1-24hr，更优选为2-5hr。
步骤(c)
在此步骤中，通过与上述步骤(b)类似的方法将化合物(X-a)(其中Rg不是氢原子或ORh基团)还原。
步骤(d-1)
在此步骤中，将化合物(X-a)(其中Rg为氢原子)肟化以制备式(XI’-a)所示的化合物。
该肟化反应通过如下进行：使化合物(X-a)与羟胺的酸加成盐在碱的存在下在不影响反应的溶剂中进行反应。
羟胺的酸加成盐的实例包括无机酸盐如盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐等；有机酸盐 如乙酸盐、三氟乙酸盐、甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐等以及类似物， 特别优选为盐酸盐。
所述碱的实例包括碱金属盐如氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钾等；有 机胺如吡啶、三乙胺、二异丙基乙胺、N,N-二甲基苯胺、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一 碳-7-烯等以及类似物，其中，优选的是三乙胺、二异丙基乙胺等。
溶剂的实例包括卤代烃如氯仿、二氯甲烷等；芳族烃如甲苯、二甲苯等；醚如 四氢呋喃、二噁烷等；和/或其混合物，其中，优选的是二氯甲烷、氯仿、甲苯等。
反应温度优选为10-100℃，更优选为20-60℃。反应时间优选为0.5-30hr， 更优选为2-20hr。
步骤(d-2)
在此步骤中，通过将化合物(XI’-a)利用在诸如钯-碳、阮内镍等金属催化剂存在下的催化氢化反应、或利用与上述步骤(b)中的那些类似的诸如金属氢化物等还原剂 来进行还原，以制备由式(XI-b)所示的化合物。
化合物(XI-b)也可通过步骤(d-3)、步骤(d-4)和步骤(d-5)制备。
步骤(d-3)
在此步骤中，将化合物(XI-a)用例如氯化剂如乙酰氯、亚硫酰氯等或溴化剂如乙酰溴、三溴化磷、二苯基膦/溴等进行卤化，以制备由式(XI’-b)表示的化合物。
溶剂的实例包括卤代烃如氯仿、二氯甲烷等；芳族烃如甲苯、二甲苯等；醚如 四氢呋喃、二噁烷等；及其混合物，其中，优选的是氯仿、四氢呋喃、甲苯等。反 应温度优选为10-150℃，更优选为30-80℃。反应时间优选为0.5-30hr，更优选 为2-20hr。
步骤(d-4)
在此步骤中，将化合物(XI’-b)用诸如叠氮化钠等叠氮化剂进行叠氮化，以制备由式(XI’-c)所示的化合物。此反应通过使化合物(XI’-b)与叠氮化剂在不影响反应的 溶剂中反应来进行。
溶剂的实例包括卤代烃如氯仿、二氯甲烷等；芳族烃如甲苯、二甲苯等；醚如 四氢呋喃、二噁烷等；酰胺如N,N-二甲基甲酰胺等；及其混合物，其中，优选的是 氯仿、N,N-二甲基甲酰胺等。反应温度优选为10-150℃，更优选为20-100℃。反 应时间优选为0.5-30hr，更优选为2-20hr。
步骤(d-5)
在此步骤中，将化合物(XI’-c)胺化，以制备化合物(XI-b)。此反应通过在不影响反应的溶剂中在水的存在下使化合物(XI’-c)与三苯基膦反应或者通过催化氢化还原 来进行。
待使用的三苯基膦的量，相对于每1mol化合物(XI’-c)优选为1-10mol，特别优 选为1-5mol。待使用的水的量，相对于每1mol化合物(XI’-c)优选为1-10mol，特 别优选为1-5mol。
溶剂的实例包括芳族烃如甲苯、二甲苯等；醚如四氢呋喃、二噁烷等；及其混 合物，其中，优选的是甲苯、四氢呋喃等。反应温度优选为10-150℃，更优选为20 -100℃。反应时间优选为0.5-30hr，更优选为2-20hr。
步骤(d-6)
在此步骤中，使化合物(XI’-b)与RNH2(R如上所定义)反应，以制备由式(XI-c)(其中Y为-NHR基团)表示的化合物。在此步骤中，使化合物(XI’-b)与由R-NH2所示的 胺，在(必要时)例如碱如叔胺等(三乙胺、二异丙基乙胺等)的存在下，在不影响反应 的溶剂中进行反应。
溶剂的实例包括芳族烃如甲苯、二甲苯等；醚如四氢呋喃、二噁烷等；以及卤 代烃如氯仿、二氯甲烷等及其混合物，其中，优选的是甲苯、四氢呋喃、氯仿等。 反应温度优选为10-100℃，更优选为20-60℃。反应时间优选为0.5-30hr，更优 选为2-20hr。
步骤(d-7)
在此步骤中，使化合物(XI-d)与具有-CONH2基团或-OCONH2基团的化合物反 应，然后用碱处理，以制备化合物(XI-e)。化合物(XI-d)与具有-CONH2基团或 -OCONH2基团的化合物的反应在酸催化剂下在不影响反应的溶剂中进行。
酸催化剂的实例包括甲磺酸、三氟甲磺酸、甲苯磺酸等，其中，优选的是甲磺 酸、甲苯磺酸。待使用的酸催化剂的量，相对于每1mol化合物(XI-d)优选为0.05-0.5 mol，特别优选为0.1-0.3mol。
具有-CONH2基团或-OCONH2基团的化合物的实例包括Fmoc-NH2、HCONH2、 CF3CONH2、AcNH2、EtOCONH2、Cbz-NH2等，其中，优选的是Fmoc-NH2、EtOCONH2等。如本文中所使用的，“Fmoc-”是指9-芴甲氧基羰基(在下文中也称为Fmoc基团)， “Cbz-”是指苄氧基羰基(在下文中也称为Cbz基团)。
作为待用作步骤(a)的原料的试剂[即，对应于R5的氢氧化物、卤化物、烷基磺 酰氧基化产物(例如甲磺酰氧基化产物等)或芳基磺酰氧基化产物(例如对甲苯磺酰氧 基化产物等)，在下文中简称为“步骤(a)的试剂”]，可使用商业上可获得的产品。此 外，步骤(a)的试剂可通过例如以下方式制备：
(1)对应于R5的氢氧化物的卤化、烷基磺酰氧基化或芳基磺酰氧基化，或
(2)对应于R5的不饱和氢氧化物的还原反应(例如在金属催化剂如铂-碳(Pt/C)、钯-碳(Pd/C)、铑-碳(Rh/C)、阮内镍等的存在下的催化氢化反应等)，随后卤化、烷基 磺酰氧基化或芳基磺酰氧基化。
在步骤(a)的试剂的制备中，用于由羟基转换成离去基团的试剂的实例包括卤化剂例如氯化剂(亚硫酰氯、N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)等)、溴化剂(氢溴酸、乙酰溴、 N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、三溴化磷、二苯基膦/溴等)等，除此之外，还包括烷基磺 酰化剂(如甲磺酰氯、三氟甲磺酰氯等)、芳基磺酰化剂(如苯磺酰氯、对甲苯磺酰氯 等)以及类似物，其中，优选的是卤化剂如亚硫酰氯、氢溴酸等。
此反应在不影响反应的溶剂中进行，且所述溶剂的实例包括水；卤代烃如氯仿、二氯甲烷等；芳族烃如苯、甲苯、二甲苯等；腈如乙腈、丙腈等；醚如四氢呋喃、 1,4-二噁烷、二乙醚等，其中，优选的是水、卤代烃如氯仿等。反应温度优选为10- 120℃，更优选为50-100℃。反应时间优选为1-72hr，更优选为3-24hr。
由式：Z-Y-H(其中Q’为单键)所示的化合物还可通过例如以下方法来制备。即， 苯环上R5的引入可通以下方式来进行：
(1)使用对应于R5的卤化物(氯化物、溴化物或碘化物)、或对应于R5的羧酸或 酰卤的弗瑞德-克来福特(Friedel-Crafts)反应，
(2)包括使对应于上述化合物(X)的化合物(其中Q’H被-CHO基团置换的化合物)通过维蒂希(Wittig)反应而碳同系化(carbon homologation)，然后催化氢化等的方法，或
(3)使用金属催化剂的交叉偶联等的常规使用的有机合成反应。
在上述每种方案中，反应试剂等为了方便起见而示出，并且可在上述定义的范 围内适当变化。
[本发明的被假固相保护基保护的有机化合物]
被具有一个以上的碳原子数为10以上的脂族烃基的有机基团(本发明的假固相保护基)保护的有机化合物没有特别限制，只要它可从溶剂中沉淀即可，并且可使用 具有官能团如羟基(-OH)、硫基(-SH)、羧基(-COOH)、氨基(-NHR)、亚氨基(-NH-)、 羧酰胺基(-CONHR”)(其中R”为氢原子或烃基)等(其中所述官能团被本发明的假固 相保护基保护)的有机化合物(下文中有时称为“被保护的有机化合物”)。被保护的有 机化合物可进一步被不同于所述假固相保护基的保护基(例如，用于核酸合成的保护 基)保护。被保护的有机化合物的实例包括WO 2012/157723、WO 2012/157723、WO 2014/189142、JP-A-2010-116418、WO 2010/104169、WO 2010/113939、WO 2011/078295、WO 2012/029794、JP-A-2009-185063、JP-A-2010-275254等中公开的 核苷、核苷酸、氨基酸、肽等。
优选的被保护的有机化合物是任选进一步被用于核酸合成的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸，或任选进一步被用于肽合成的保护基保护的氨基酸或肽。 优选的是，在上述核苷、核苷酸或寡核苷酸中，选自核酸碱基的氨基和亚氨基、核 糖残基的2’位和3’位羟基、以及脱氧核糖残基的3’位羟基中的至少一个基团被本发 明的假固相保护基保护。当上述核苷、核苷酸或寡核苷酸为吗啉代核苷、吗啉代核 苷酸或吗啉代寡核苷酸时，吗啉残基的5’位羟基而不是上述羟基可被假固相保护基 保护。
更优选的被保护的有机化合物是核苷或寡核苷酸，其中选自核酸碱基的氨基和亚氨基、核糖残基的2’位和3’位羟基、脱氧核糖残基的3’位羟基、以及吗啉残基的 5’位羟基中的至少一个基团被本发明的假固相保护基保护，且其它基团任选进一步 被用于核酸合成的保护基保护。
进一步优选的被保护的有机化合物是核苷或寡核苷酸，其中选自核酸碱基的氨基和亚氨基、核糖残基的2’位和3’位羟基、以及脱氧核糖残基的3’位羟基中的至少 一个基团被本发明的假固相保护基保护，且其它基团任选进一步被用于核酸合成的 保护基保护。
特别优选的被保护的有机化合物是核苷或寡核苷酸，其中选自核酸碱基的氨基和亚氨基、核糖残基的3’位羟基、以及脱氧核糖残基的3’位羟基中的至少一个基团 被本发明的假固相保护基保护，且其它基团任选进一步被用于核酸合成的保护基保 护。
最优选的被保护的有机化合物是核苷或寡核苷酸，其中核糖残基的3’位羟基或脱氧核糖残基的3’位羟基被本发明的假固相保护基保护，且其它基团任选进一步被 用于核酸合成的保护基保护。
[沉淀]
本发明还提供通过使用本发明的沉淀促进剂使被保护的有机化合物从溶剂中沉淀的方法(下文中有时被称为“本发明的沉淀方法”)以及通过这种方法获得的沉淀混 合物，所述沉淀混合物包含所述沉淀促进剂和所述被保护的有机化合物。上述溶剂 优选为包含极性溶剂的溶剂，更优选极性溶剂和非极性溶剂的混合溶剂。
由于假固相保护基(其为疏水基团)，被本发明的假固相保护基保护的有机化合物在非极性溶剂中显示提高的溶解性并在极性溶剂中显示降低的溶解性。被这种假 固相保护基保护的有机化合物例如通过将极性溶剂添加到所述有机化合物溶解于非 极性溶剂中的溶液中来沉淀，以实现固液分离。本发明的沉淀促进剂可促进被假固 相保护基保护的有机化合物从溶剂中沉淀，并可提高其回收率。此外，还可通过在 获得目标产物(即被假固相保护基保护的有机化合物)之后除去假固相保护基来获得 脱保护的有机化合物。
所述极性溶剂的实例包括醇溶剂如甲醇、乙醇、异丙醇等；腈溶剂如乙腈、丙 腈等；酮溶剂如丙酮、2-丁酮等；极性醚溶剂如1,4-二噁烷、四氢呋喃等；酰胺溶 剂如二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基哌啶酮等；亚砜溶剂如二甲基亚砜等； 水等。极性溶剂可使用仅一种或可组合使用其中的两种或多种。作为极性溶剂，特 别优选乙腈。在寡核苷酸的合成中，从沉淀效率方面来看，当甲醇用作极性溶剂时 有回收率提高的趋势。由于甲醇抑制亚磷酰胺法中的偶联反应，需要将甲醇从沉淀 的寡核苷酸中完全除去。然而，干燥花费长时间并且成问题的是难以判断甲醇是否 残留在体系中。另一方面，乙腈有降低沉淀效率的趋势，但是不会抑制亚磷酰胺法 中的偶联反应。因此，使用乙腈而沉淀的寡核苷酸不要求严格干燥和残留溶剂的判 断。使用本发明的沉淀促进剂，目标产品可以高产率沉淀并回收，即使在使用乙腈 时。
所述非极性溶剂的实例包括卤系溶剂如氯仿、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷等；芳族系溶剂如苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯等；酯系溶剂如乙酸乙酯、乙酸异丙酯等； 脂族系溶剂如己烷、戊烷、庚烷、辛烷、壬烷、环己烷等；非极性醚溶剂如二乙醚、 环戊基甲基醚、叔丁基甲基醚等。非极性溶剂可使用仅一种或可组合使用其中的两 种或多种。作为非极性溶剂，优选卤系溶剂、芳族系溶剂、酯系溶剂、脂族系溶剂 及它们的组合；更优选二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、苯、甲苯、二甲苯、均三甲 苯、己烷、戊烷、庚烷、壬烷、环己烷、乙酸乙酯、乙酸异丙酯及它们的组合；更 优选氯仿、二氯甲烷、甲苯及它们的组合。
为了使被保护的有机化合物充分沉淀，待使用的本发明的沉淀促进剂的量相对于所述被保护的有机化合物优选不低于0.1摩尔当量，更优选不低于0.5摩尔当量， 进一步优选不低于1摩尔当量。尽管上限没有特别限定，从成本方面考虑，待使用 的本发明的沉淀促进剂的量相对于所述被保护的有机化合物优选不超过10摩尔当 量，更优选不超过5摩尔当量，进一步优选不超过2.5摩尔当量。
包含极性溶剂(优选乙腈)的溶剂中的极性溶剂的量，相对每1mL除极性溶剂以 外的溶剂，优选不低于0.5mL，更优选不低于1mL，进一步优选不低于2mL，优 选不超过20mL，更优选不超过10mL，进一步优选不超过8mL，以提高被保护的 有机化合物的回收率。所述极性溶剂的量是使被保护的有机化合物沉淀时的优选范 围。例如，将包含被保护的有机化合物和除极性溶剂以外的溶剂的溶液浓缩后，在 上述范围内添加极性溶剂，可使有机化合物沉淀。此外，制备包含被保护的有机化 合物、除极性溶剂以外的溶剂、和极性溶剂的溶液，使得所述极性溶剂的量低于上 述下限，对其进行浓缩，以将所述极性溶剂的量调节至不低于上述下限，从而可使 有机化合物沉淀。
被保护的有机化合物的沉淀时的温度优选不低于-10℃，更优选不低于0℃，进 一步优选不低于5℃，优选不超过40℃，更优选不超过30℃，进一步优选不超过25 ℃。
在调节至上述优选的温度之后，被保护的有机化合物的悬浮液的放置时间(即用于沉淀的时间)优选不低于5min，更优选不低于15min，进一步优选不低于30min， 优选不超过72hr，更优选不超过16hr，进一步优选不超过3hr。
[寡核苷酸的制备方法]
本发明的沉淀方法对于寡核苷酸的制备方法特别有用。因此，本发明还提供包括本发明的沉淀方法的寡核苷酸的制备方法。这种制备方法的实例包括包含以下步骤 的方法：在包含寡核苷酸和本发明的沉淀促进剂的反应液中添加极性溶剂(优选乙 腈)，从反应液中分离包含寡核苷酸和沉淀促进剂的沉淀混合物的步骤，所述寡核苷 酸中，至少一个基团被本发明的假固相保护基保护、并且其它基团任选地进一步被 核酸合成中所用的保护基保护。本发明的寡核苷酸的制备方法优选通过亚磷酰胺法 进行。
本发明的寡核苷酸的制备方法的优选实施方案是寡核苷酸的制备方法，包括通过亚磷酰胺法进行一次或重复多次包括下述步骤(1)至(3)的制备循环，其中，在第一次 循环中包含下述步骤(4)，在各循环中包含下述步骤(5)，并且在除最终循环外的各循 环中包含下述步骤(6)，
(1)在非极性溶剂中包含核苷或寡核苷酸(下文中有时被称为“含有临时保护基的核苷或寡核苷酸”)的反应液中添加酸，将5’位羟基的临时保护基脱保护，利用碱进 行中和，得到包含5’位羟基游离体的反应液的步骤(脱保护步骤)，
所述核苷或寡核苷酸中，选自核酸碱基的氨基和亚氨基、核糖残基的2’位和3’ 位羟基、以及脱氧核糖残基的3’位羟基中的至少一个基团被本发明的假固相保护基 保护，5’位羟基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，并且其它基团任选地进 一步被核酸合成中所用的保护基保护；
(2)在非极性溶剂中包含5’位羟基游离体的反应液中添加核苷或寡核苷酸(下文中有时被称为“亚磷酰胺化的核苷或寡核苷酸”)，得到包含亚磷酸三酯化合物的反应 液的步骤(缩合步骤)，
所述核苷或寡核苷酸中，3’位羟基被亚磷酰胺化，并且5’位羟基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，并且其它基团任选地进一步被核酸合成中所用的保护基 保护；
(3)在非极性溶剂中包含亚磷酸三酯化合物的反应液中添加氧化剂或硫化剂，得到包含寡核苷酸(下文中有时被称为“生成物寡核苷酸”)的反应液的步骤(氧化或硫化 步骤)，
所述寡核苷酸中，选自核酸碱基的氨基和亚氨基、核糖残基的2’位和3’位羟基、以及脱氧核糖残基的3’位羟基中的至少一个基团被本发明的假固相保护基保护，并 且5’位羟基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，并且其它基团任选地进一步 被核酸合成中所用的保护基保护；
(4)在步骤(1)之前、步骤(1)和(2)之间、步骤(2)和(3)之间、以及步骤(3)之后的任 何时候，在反应液中加入本发明的沉淀促进剂的步骤(沉淀促进剂的添加步骤)；
(5)在步骤(4)之后，且为步骤(1)和(2)之间、步骤(2)和(3)之间、以及步骤(3)之后 的任何时候，在包含沉淀促进剂的反应液中添加极性溶剂(优选乙腈)，从反应液中 分离包含5’位羟基游离体、亚磷酸三酯化合物或寡核苷酸、和沉淀促进剂的沉淀混 合物的步骤(沉淀和固液分离步骤)；
(6)在步骤(5)中得到的沉淀混合物中加入非极性溶剂，制成反应液的步骤(溶解步骤)。
下面按照以上顺序解释各步骤。
步骤(1)(脱保护步骤)
在此步骤中，通过添加酸从含有临时保护基的核苷或寡核苷酸中将临时保护基脱保护，以得到5’位羟基游离体。这里，临时保护基是指在本发明的假固相保护基 不被除去的酸性条件下可被除去的保护基。
此步骤在非极性溶剂中进行。作为非极性溶剂，可提及上述非极性溶剂。同样 适用于在此步骤之后的步骤中将使用的非极性溶剂。
尽管在此步骤中含有临时保护基的核苷或寡核苷酸在溶液中的浓度没有特别限制，只要它们溶解于溶剂中即可，其优选为1-30wt％。
尽管对待用于此步骤中的酸没有特别限制，只要可实现良好的脱保护即可，优 选使用三氟乙酸、二氯乙酸、三氟甲磺酸、三氯乙酸、甲磺酸、盐酸、乙酸、对甲 苯磺酸等。由于可实现良好的反应，更优选三氟乙酸、二氯乙酸、三氟甲磺酸、三 氯乙酸，进而优选三氟乙酸、二氯乙酸、三氟甲磺酸，还更优选三氟乙酸、三氟甲 磺酸，特别优选三氟乙酸。可以用上述非极性溶剂稀释这些酸。当使用上述酸时， 其可在使用之前与特定的碱组合以适当地调节酸度。待用于此步骤中的酸的量，相 对于每1mol含有临时保护基的核苷或寡核苷酸，例如为1至100mol，优选为1至 40mol。
尽管对此步骤中的反应温度没有特别限制，只要反应进行即可，但其优选为-10℃至50℃，更优选为0℃至40℃。反应时间根据待使用的含有临时保护基的核苷或 寡核苷酸、酸的种类、非极性溶剂的种类、反应温度等而变化，但其例如为5min- 5hr。
为了在溶液中连续进行此步骤、随后的缩合步骤和氧化或硫化步骤，优选在此 步骤中，在含有临时保护基的核苷或寡核苷酸的5’位羟基的临时保护基的除去反应 过程中、或者除去反应之后，使用阳离子清除剂。
尽管对阳离子清除剂没有特别限制，只要不会被已除去的临时保护基再保护(返回到起始材料)并且不会对已脱保护的官能团进行副反应即可，可使用吡咯衍生物如 吡咯、2-甲基吡咯、3-甲基吡咯、2,3-二甲基吡咯、2,4-二甲基吡咯等；以及吲哚衍 生物如吲哚、4-甲基吲哚、5-甲基吲哚、6-甲基吲哚、7-甲基吲哚、5,6-二甲基吲哚、 6,7-二甲基吲哚等。由于可以获得良好的阳离子捕捉效果，因此优选吡咯、3-甲基吡 咯、2,4-二甲基吡咯、吲哚、4-甲基吲哚、5-甲基吲哚、6-甲基吲哚、7-甲基吲哚、 5,6-二甲基吲哚、6,7-二甲基吲哚，更优选吡咯、3-甲基吡咯、吲哚，进一步优选吡 咯、吲哚，特别优选吡咯。
待用于此步骤中的阳离子清除剂的量，相对于每1mol含有临时保护基的核苷或寡核苷酸，例如为1-50mol，优选为5-20mol。
当作为下一步骤的缩合步骤中存在待用作脱保护剂的酸时，它引发步骤(2)中使用的亚磷酰胺化的核苷或寡核苷酸的临时保护基的脱保护。因此，该酸需要被中和 并除去。
在此步骤中，有机碱优选用于该酸的中和。作为有机碱，优选吡啶、2,4,6-三甲 基吡啶、苯并咪唑、1,2,4-三唑、N-苯基咪唑、2-氨基-4,6-二甲基嘧啶、1,10-菲咯啉、 咪唑、N-甲基咪唑、2-氯苯并咪唑、2-溴苯并咪唑、2-甲基咪唑、2-苯基苯并咪唑、 N-苯基苯并咪唑、5-硝基苯并咪唑，更优选吡啶、2,4,6-三甲基吡啶、苯并咪唑、1,2,4- 三唑、N-苯基咪唑、N-甲基咪唑、2-氨基-4,6-二甲基嘧啶、1,10-菲咯啉，进一步优 选吡啶、2,4,6-三甲基吡啶、苯并咪唑、1,2,4-三唑、N-苯基咪唑，特别优选吡啶、 2,4,6-三甲基吡啶、苯并咪唑、1,2,4-三唑，并且最优选吡啶、2,4,6-三甲基吡啶、苯 并咪唑。
待用于此步骤中的碱的量，相对于每1mol酸，例如为1-10mol，优选为1-3 mol。
在此步骤中，酸和有机碱的特别优选的组合是三氟乙酸与吡啶、三氟乙酸和 2,4,6-三甲基吡啶、或三氟甲磺酸和苯并咪唑。
对待用于此步骤中的含有临时保护基的核苷或寡核苷酸中所含的临时保护基没有特别限制，只要其可在酸性条件下脱保护且可用作羟基保护基即可。可提及例如 三苯甲基、9-(9-苯基)呫吨基、9-苯硫基呫吨基、二(C1-6烷氧基)三苯甲基如1,1-双(4- 甲氧基苯基)-1-苯基甲基(二甲氧基三苯甲基)等、单(C1-18烷氧基)三苯甲基如1-(4-甲 氧基苯基)-1,1-二苯基甲基(单甲氧基三苯甲基)等及类似基团。其中，考虑到脱保护 的容易程度和容易获得性，临时保护基优选为单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲 基，更优选二甲氧基三苯甲基。
待用于此步骤中的含有临时保护基的核苷或寡核苷酸中，选自核酸碱基的氨基和亚氨基、核糖残基的3’位羟基、以及脱氧核糖残基的3’位羟基中的至少一个基团 优选被本发明的假固相保护基保护，并且核糖残基的3’位羟基或脱氧核糖残基的3’ 位羟基更优选被本发明的假固相保护基保护。
待用于此步骤中的含有临时保护基的核苷或寡核苷酸进一步优选为下式(VI)所示的化合物：
Figure BDA0001356701560000431
其中：
m”为不低于0的整数，
m”+1个碱基各自独立地为任选被保护的核酸碱基，
Q’为在酸性条件下可除去的临时保护基，
m”+1个X各自独立地为氢原子、卤素原子、任选被保护的羟基、或与核糖环 或脱氧核糖环的2位碳原子和4位碳原子键合的二价有机基团(优选氢原子、卤素原 子或任选被保护的羟基)，
m”个R10各自独立地为氧原子或硫原子，
m”个WG各自独立地为吸电子基团，和
L-Y-Z如上所定义。
当m”为0时，化合物(VI)为含有临时保护基的核苷；而当m”为1以上时，化合 物(VI)为含有临时保护基的寡核苷酸。在式(VI)中，m”优选不超过49，更优选不超 过29，进一步优选不超过19，特别优选不超过4，最优选不超过2。
作为式(VI)中的卤素原子，优选氟原子、氯离子，并且更优选氟原子。
尽管对式(VI)中“任选被保护的羟基”的保护基没有特别限制，可提及例如,PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS,第3版，JOHN WILLY&SONS (1999)等中描述的任何保护基。具体地，可提及甲基、苄基、对甲氧基苄基、叔丁 基、甲氧基甲基、甲氧基乙基、2-四氢吡喃基、乙氧基乙基、氰乙基、氰乙氧基甲 基、苯基氨甲酰基、1,1-二氧代硫代吗啉-4-硫代氨甲酰基、乙酰基、新戊酰基、苯 甲酰基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲 硅烷基、[(三异丙基甲硅烷基)氧基]甲基(Tom)、1-(4-氯苯基)-4-乙氧基哌啶-4-基(Cpep) 等。其中，优选三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、或叔丁基二甲基甲硅烷基。 就经济效率和容易获得性方面而言，特别优选叔丁基二甲基甲硅烷基。
在式(VI)中，对“与核糖环或脱氧核糖环的2位碳原子和4位碳原子键合的二价 有机基团”没有特别限制，只要它与相同核糖环或脱氧核糖环的2位碳原子和4位碳 原子键合即可。所述二价有机基团的实例包括任选取代的C2-7亚烷基、以及由选自 -O-、-NR13-(R13为氢原子或C1-6烷基)、-S-、-CO-、-COO-、-OCONR14-(R14为氢原 子或C1-6烷基)和-CONR15-(R15为氢原子或C1-6烷基)的二价连接基和任选取代的C1-7亚烷基形成的二价有机基团等。C1-7亚烷基和C2-7亚烷基任选具有的取代基的实例 包括亚甲基(CH2＝)。
作为“与2位碳原子和4位碳原子键合的二价有机基团”，优选任选取代的C2-7亚烷基、-ORi-(Ri为与4位碳原子键合的C1-6亚烷基)、-O-NR13-Rj-(Rj为与4位碳 原子键合的C1-6亚烷基，且R13如上所定义)、-O-Rk-O-Rl-(Rk为C1-6亚烷基，且Rl 为与4位碳原子键合并交联的C1-6亚烷基)，并且更优选-ORi-(Ri如上所定义)、 -O-NR13-Rj-(Rj和R13如上所定义)、-O-Rk-O-Rl-(Rk和Rl如上所定义)。Ri、Rj、Rk 或Rl的C1-6亚烷基各自独立地优选为亚甲基或亚乙基。
作为“与2位碳原子和4位碳原子键合的二价有机基团”，更优选-O-CH2-、 -O-CH2-CH2-、-O-NR13-CH2-(R13如上所定义)、-O-CH2-O-CH2-，并且进一步优选 -O-CH2-、-O-CH2-CH2-、-O-NH-CH2-、-O-N(CH3)-CH2-、-O-CH2-O-CH2-(其中左侧 与2位碳原子键合，而右侧与4位碳原子键合)。
在式(VI)中，m”+1个X各自独立地优选为氢原子、卤素原子或任选被保护的羟 基，更优选为氢原子或任选被保护的羟基。
m”个R10各自优选为氧原子。
WG的吸电子基团的实例包括氰基、硝基等，优选氰基。
化合物(VI)可通过本身已知的方法(例如，上述专利文献1或2中描述的方法、 酯化、甲硅烷基化等)或与其类似的方法合成。例如，其中m”为0且L为琥珀酰基 的化合物(VI)可通过例如，如下式中所示，使其中5’位羟基被临时保护基保护的核 苷(a)与琥珀酸酐在碱存在下反应以得到其中琥珀酸被引入3’位羟基的化合物(b)，接 着在缩合剂的存在下使所得的化合物(b)与Z-Y-H的脱水缩合来合成。
Figure BDA0001356701560000451
由核苷(a)向化合物(b)的转化反应有利地在对所述反应呈惰性的溶剂中进行。尽管对这种溶剂没有特别限制，只要反应进行即可，优选卤系溶剂如二氯甲烷、1,2- 二氯乙烷、氯仿、四氯化碳等、芳族系溶剂如苯、甲苯、二甲苯等、脂族系溶剂如 戊烷、己烷、庚烷、辛烷等、醚系溶剂如二乙醚、四氢呋喃、环戊基甲基醚等以及 它们的混合溶剂。其中，特别优选为二氯甲烷或氯仿。
尽管对待用于化合物(VI)的合成的碱没有特别限制，优选有机碱，且更优选三 乙胺等。
用于化合物(VI)的合成的脱水缩合反应有利地在对所述反应呈惰性的溶剂中进行。尽管对此类溶剂没有特别限制，只要反应进行即可，优选卤系溶剂如二氯甲烷、 1,2-二氯乙烷、氯仿、四氯化碳等、芳族系溶剂如苯、甲苯、二甲苯等、或脂族系溶 剂如戊烷、己烷、庚烷、辛烷等以及它们的组合。其中，特别优选二氯甲烷、氯仿。
化合物(b)与Z-Y-H的缩合反应中所用的缩合剂的实例包括二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、N-乙基-N’-3-二甲基氨丙基碳二亚胺及其盐酸盐 (EDCHCl)、六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻(PyBop)、O-(苯并三唑-1- 基)-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)、1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-5-氯-1H-苯 并三唑鎓-3-氧化物六氟磷酸盐(HCTU)、O-苯并三唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐 (HBTU)等。其中，优选HBTU、HCTU、N-乙基-N’-3-二甲基氨丙基碳二亚胺及其盐 酸盐(EDCHCl)。
待使用的缩合剂的量，相对于每1mol化合物(b)，例如为1至10mol，优选为 1至5mol。待使用的Z-Y-H的量，相对于每1mol化合物(b)，为1至10mol，优选 为1至5mol。尽管对反应温度没有特别限制，只要反应进行即可，它优选为-10℃ 至50℃，更优选为0℃至30℃。反应时间例如为30min至70hr。
其中L不是琥珀酰基的化合物(VI)也可通过进行与上述合成方法类似的反应来合成，不同的是使用相应酸酐、相应二羧酸卤化物、相应二羧酸的活化酯等来代替 琥珀酸酐。此外，其中m”为1以上的化合物(VI)可使用其中m”为0的化合物(VI) 作为起始原料通过重复5’末端延伸过程来合成。
步骤(2)(缩合步骤)
在此步骤中，使步骤(1)中获得的5’位羟基游离体和亚磷酰胺化的核苷或寡核 苷酸缩合以得到亚磷酸三酯化合物。
待用于此步骤中的亚磷酰胺化的核苷或寡核苷酸可通过已知方法(M.H.Caruthers等，Method in Enzymology 1987，154，287-313；S.L.Beaucage和M.H.Caruthers，Tetrahedron Letters 1981，22，1859-1862)合成，所述方法包括使亚磷酰 胺化试剂反应。亚磷酰胺化试剂是商业上可获得的且可容易地获得。
待用于此步骤中的亚磷酰胺化的核苷或寡核苷酸优选为下式(VII)所示的化合物：
Figure BDA0001356701560000461
其中
q’为不低于0的整数；
R11和R12各自独立地为烷基、或与相邻氮原子一起形成的5或6元饱和环氨基。 所述饱和环氨基任选具有1个氧原子或硫原子作为除了氮原子以外的环构成原子； 和
其它符号如上所定义。
当q’为0时，化合物(VII)是亚磷酰胺化的核苷，当q’为1以上时，化合物(VII) 是亚磷酰胺化的寡核苷酸。在此步骤中待使用的化合物(VII)中，q’优选不超过49， 更优选不超过29，进一步优选不超过19，特别优选不超过4，并且最优选不超过2。
当此步骤中的缩合反应进行缓慢时，可加入缩合剂(例如，吡啶-三氟乙酸盐、 四唑、5-苄硫基-1H-四唑、4,5-二氰基咪唑等)。
在此步骤中，当反应液的酸度变高时，可发生临时保护基脱去的副反应。因此， 优选添加N-甲基咪唑以抑制反应液的酸化。待加入以调节酸度的N-甲基咪唑的量， 相对于每1mol用于中和的有机碱，优选为0.1至1mol，更优选为0.5mol左右。
与步骤(1)类似，此步骤在非极性溶剂中进行。非极性溶剂的解释与步骤(1)中相同。
此步骤中待使用的亚磷酰胺化的核苷或寡核苷酸的量，相对于每1mol步骤(1) 中获得的5’位羟基游离体，例如为1-10mol，优选为1-5mol。
尽管对此步骤中的反应温度没有特别限制，只要反应进行即可，优选为0℃- 100℃，且更优选为20℃-50℃。尽管反应时间根据待使用的原料的种类、反应温度 等而变化，它例如为5min至24hr。
步骤(3)(氧化或硫化步骤)
在此步骤中，使步骤(2)中获得的亚磷酸三酯化合物与氧化剂或硫化剂反应以将其亚磷酸三酯键转化成磷酸三酯键或硫代磷酸三酯键，以得到生成物寡核苷酸。
尽管对待用于此步骤中的“氧化剂”没有特别限制，只要其可将亚磷酸三酯键氧化为磷酸三酯键而不氧化其它部分即可，优选使用碘、(1S)-(+)-10-樟脑磺哑嗪 ((1S)-(+)-(10-camphorsulfonyl)oxaziridine)、叔丁基过氧化氢(TBHP)、过氧化2-丁酮、 1,1-二氢过氧环十二烷、双(三甲基甲硅烷基)过氧化物、间氯过苯甲酸。由于可实现 良好的氧化反应，因此更优选碘、(1S)-(+)-10-樟脑磺哑嗪、叔丁基过氧化氢，过氧 化2-丁酮、1,1-二氢过氧环十二烷，进一步优选碘、(1S)-(+)-10-樟脑磺哑嗪、叔丁 基过氧化氢、过氧化2-丁酮，还更优选碘、叔丁基过氧化氢，特别优选为碘。该氧 化剂可在用合适溶剂稀释以达到0.05至2M的浓度之后使用。尽管对该稀释溶剂没 有特别限制，只要其对反应呈惰性即可，可提及吡啶、THF、二氯甲烷、水或它们 的组合。其中，优选使用例如碘/水/吡啶-THF或碘/吡啶-乙酸、过氧化物(TBHP)/二 氯甲烷或叔丁基过氧化氢/壬烷。
对待用于此步骤中的“硫化剂”没有特别限制，只要其可将亚磷酸三酯键转化成硫代磷酸三酯键即可，优选使用3-[(N,N-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3H-1,2,4-二噻唑 -5-硫酮(DDTT)、3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物(Beaucage试剂)、3H-1,2-苯 并二硫醇-3-酮、苯乙酰二硫化物(PADS)、二硫化四乙基秋兰姆(TETD)、3-氨基-1,2,4- 二噻唑-5-硫酮(ADTT)、硫。由于可进行良好的反应，更优选3-[(N,N-二甲基氨基亚 甲基)氨基]-3H-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(DDTT)、3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物 (Beaucage试剂)、3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮、苯乙酰二硫化物(PADS)，进一步优选 3-[(N,N-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3H-1,2,4-二噻唑-5-硫酮、3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮 -1,1-二氧化物，并且特别优选3-[(N,N-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3H-1,2,4-二噻唑-5- 硫酮。该硫化剂可在用合适溶剂稀释以获得0.05至2M的浓度之后使用。尽管对该 稀释溶剂没有特别限制，只要其对反应呈惰性即可，可提及例如二氯甲烷、乙腈、 吡啶或它们的任意混合溶剂。
待使用的氧化剂或硫化剂的量，相对每1mol步骤(2)中获得的亚磷酸三酯化合物，例如为1至50mol，优选为1至5mol。
尽管对反应温度没有特别限制，只要反应进行即可，优选为0℃至100℃，并且 更优选为20℃至50℃。尽管反应时间根据亚磷酸三酯化合物的种类、待使用的氧化 剂或硫化剂的种类、反应温度等而变化，它为1min至3hr。
步骤(4)(沉淀促进剂的添加步骤)
在此步骤中，在步骤(5)之前，且为步骤(1)之前、步骤(1)和(2)之间、步骤(2)和(3)之间、以及步骤(3)之后的任何时候，在反应液中加入本发明的沉淀促进剂，以促 进步骤(5)(沉淀和固液分离步骤)中的沉淀，所述步骤(5)中，通过在步骤(1)(脱保护步 骤)和步骤(2)(缩合步骤)之间、步骤(2)和步骤(3)(氧化或硫化步骤)之间、步骤(3)之后 的任何时候，在反应液中添加极性溶剂(优选乙腈)使沉淀的寡核苷酸从反应液分离。
在此步骤中，可添加仅一种本发明的沉淀促进剂或可添加其中的两种或多种。 在此步骤中待使用的本发明的沉淀促进剂的量，相对于起始步骤(1)中所用的含有临 时保护基的核苷或寡核苷酸，优选不低于0.1摩尔当量，更优选不低于0.5摩尔当量， 进一步优选不低于1摩尔当量。尽管对其上限没有特别限制，从成本方面来看，待 使用的本发明的沉淀促进剂的量，相对于起始步骤(1)中所用的含有临时保护基的核 苷或寡核苷酸，优选不超过10摩尔当量，更优选不超过5摩尔当量，进一步优选不 超过2.5摩尔当量。
步骤(5)(沉淀和固液分离步骤)
在此步骤中，在步骤(4)(沉淀促进剂的添加步骤)之后，且为步骤(1)(脱保护步骤) 和步骤(2)(缩合步骤)之间、步骤(2)和步骤(3)(氧化或硫化步骤)之间、步骤(3)之后的 任何时候，在含有沉淀促进剂的反应液中添加极性溶剂(优选乙腈)，以从反应液中 分离包含步骤(1)中获得的5’位羟基游离体、步骤(2)中获得的亚磷酸三酯化合物或步 骤(3)中获得的生成物寡核苷酸(下文中，5’位羟基游离体、亚磷酸三酯化合物和生成 物寡核苷酸有时被统称为“目标产物”)和沉淀促进剂的沉淀混合物。
作为极性溶剂，可提及上述极性溶剂。作为待用于此步骤中的极性溶剂，特别 优选乙腈。
为了提高目标产物的回收率，待用于此步骤中的极性溶剂(优选乙腈)的量，相 对于每1mL含目标产物的反应液中所含的非极性溶剂，优选不低于0.5mL，更优 选不低于1mL，进一步优选不低于2mL，优选不超过20mL，更优选不超过10mL， 进一步优选不超过8mL。
当使用乙腈时，它可包含水以使乙腈中的目标产物的损失最小化。在这种情况下，乙腈中水的含量优选为1-10％(v/v)，更优选为3-8％(v/v)。当水含量太低时， 乙腈中的目标产物的损失会提高，并且当水含量太高时，进入乙腈中的不必要物质 的除去会不充分。
步骤(6)(溶解步骤)
在此步骤中，在步骤(5)(沉淀和固液分离步骤)中得到的沉淀混合物中加入非极性溶剂，制成反应液。在此步骤中，可重复包括上述步骤(1)-(3)的制备循环。
可用于此步骤中的非极性溶剂的解释与步骤(1)中的解释相同。尽管对此步骤中获得的反应液中沉淀混合物的浓度没有特别限制，只要该沉淀混合物溶解于所述非 极性溶剂中即可，它优选为1-30wt％。
在本发明的寡核苷酸的制备方法中，步骤(5)(沉淀和固液分离步骤)和步骤(6)(溶 解步骤)优选在步骤(3)(氧化或硫化步骤)之后执行。
本发明的寡核苷酸的制备方法可包含以下步骤(7)：
(7)除去寡核苷酸的全部保护基，分离寡核苷酸(下文中有时被称为“非被保护的寡核苷酸”)的步骤(脱保护和分离步骤)。
步骤(7)(脱保护和分离步骤)
在本发明的寡核苷酸的制备方法中，根据保护基的种类和性质，优选在步骤(5)之后进行脱保护，并分离寡核苷酸。作为脱保护的方法，例如根据PROTECTIVE GROUPS INORGANIC SYNTHESIS，第3版，JOHN WILLY&SONS(1999)等中描述 的脱保护方法，可进行将寡核苷酸的全部保护基除去的步骤。具体地，本发明的假 固相保护基、以及核酸碱基的保护基如苯氧基乙酰基、乙酰基、和保护磷酸骨架的 氰乙基等，都可用氨水、氨水/乙醇溶液、或氨水和甲胺水溶液的混合液进行处理， 从而全部除去。此外，5’羟基的保护基可通过用步骤(1)中所用的酸或将这种酸适当 稀释后的溶液进行处理来除去。由于没有保护基的寡核苷酸容易被酶降解，因此优 选在合适的空气清洁度控制下分离寡核苷酸。
可通过与常规液相有机合成反应类似的方法来确定上述各步骤的反应进展。即，可通过薄层硅胶色谱法、高效液相色谱法等来跟踪反应。
由步骤(5)(沉淀和固液分离步骤)获得的5’位羟基游离体、亚磷酸三酯化合物或生成物寡核苷酸、或由步骤(7)(脱保护和分离步骤)获得的非被保护的寡核苷酸，也 可通过进一步经过有机合成反应而产生所需的衍生物。由本发明所制备的寡核苷酸 等可用于各种用途，例如用于人或动物的各种药品(RNA、DNA、寡核酸药物等)、 食品(功能性食品、特定保健用食品)、化学产品、生物体或工业用的高分子材料等。
[实施例]
下文通过参照实施例对本发明进行更详细地说明，这些实施例不应理解为限制本发明的范围。除非另外指明，下面描述的溶剂比例表示体积比。除非另外指明， 本发明中使用的试剂、设备和材料可商购获得。在本说明书中，当通过缩写表示如 氨基酸等时，各表示基于IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature的缩 写或本领域的常规缩写。
实施例等中所用的基团和化合物的缩写如下。
Me：甲基
DMTr：4,4’-二甲氧基三苯甲基
TBDMS：叔丁基二甲基甲硅烷基
Boc：叔丁氧基羰基
Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
Trt：三苯甲基
TOB：3,4,5-三(十八烷氧基)苄基
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
HBTU：O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐
参考例1：在溶液中连续合成硫代磷酸酯(phosphorthioate)二聚体
Figure BDA0001356701560000501
在氩气气氛下，将5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)脱氧胸苷-3’-基[3,4,5-三(十八 烷氧基)苄基]琥珀酸酯(504mg,327μmol)溶解于二氯甲烷(7.5mL)中，加入吡咯 (213μL,3.27mmol)、三氟乙酸(292μL,3.93mmol)并将混合物在室温下搅拌15 min，并通过薄层色谱法确认反应完成。用吡啶(316μL,3.93mmol)、1-甲基咪唑(156 μL,1.96mmol)中和反应混合物，然后添加4,5-二氰基咪唑(116mg,982mmol)、 5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)脱氧胸苷-3’-[O-(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺 (609mg,818μmol)在乙腈中的溶液，并将混合物在室温下搅拌60min，通过薄层色 谱法确认反应完成。此外，添加3-[(N,N-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3H-1,2,4-二噻唑-5- 硫酮(184mg,898μmol)并将混合物在室温下搅拌30min。将甲醇(100mL)添加至反 应液中，将沉淀的固体使用桐山(Kiriyama)漏斗抽滤后进行干燥，以得到呈白色固体 状的5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)脱氧胸苷-3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基 (phosphorothionyl)脱氧胸苷-3’-基[3,4,5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯(567mg,产 率91％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝0.88(t,9H,J＝6.8Hz,Ar-CH3 ),1.28(br,s,90H,(CH2 )15), 1.30(s,3H,N1 5-CH3 ),1.46(s,3H,N2 5-CH3 ),1.73(m,6H,Ar-OCH2CH2 ),2.28(m,2H,2’1-H), 2.41(m,2H,2’2-H),2.68(m,2H,5’1-H和m,4H,琥珀酰-CH2 CH2 ),3.44(m,2H,5’2-H),3.79(s,6H,DMTr-OCH3 ),3.95(m,6H,Ar-OCH2 ),4.10(m,1H,4’1-H),4.31(m,4H,氰乙基 -CH2 CH2 和m,1H,4’2-H),5.01(s,2H,Ar-CH2-琥珀酰),5.26(m,1H,3’1-H), 5.32(m,1H,3’2-H),6.27(m,1H,1’1-H),6.38(m,1H,1’2-H),6.53(s,2H,Ar-H), 6.84-7.29(m,13H,DMTr-Ar-H),7.29(m,1H,N1 6-H),7.56(m,1H,N2 6-H)
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝0.88(t,9H,Ar-CH3 ),1.28(br,s,90H,(CH2 )15), 1.30(s,3H,N1 5-CH3 ),1.46(s,3H,N2 5-CH3 ),1.73(m,6H,Ar-OCH2CH2 ),2.41(m,2H,2’2-H), 2.68(m,2H,2’1-H和m,4H,琥珀酰-CH2 CH2 ),2.77(m,2H,5’1-H),3.44(m,2H,5’2-H), 3.79(s,6H,DMTr-OCH3 ),3.95(m,6H,Ar-OCH2 ),4.17(m,1H,4’1-H),4.31(m,4H,氰乙基 -CH2 CH2 andm,1H,4’2-H),5.01(s,2H,Ar-CH2 -琥珀酰),5.33(m,1H,3’1-H and m,1H,3’2-H),6.27(m,1H,1’1-H),6.38(m,1H,1’2-H),6.53(s,2H,Ar-H), 6.84-7.29(m,13H,DMTr-Ar-H),7.29(m,1H,N1 6-H),7.56(m,1H,N2 6-H)
参考例2:在溶液中连续合成硫代磷酸酯五聚体
将与参考例1的操作类似的操作重复4次以得到5’-O-(4,4-二甲氧基三苯甲 基)-N2-异丁酰-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-N4-苯甲酰-脱氧胞苷3’-[O-(2- 氰乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷 3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷-3’-基[3,4,5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯(1.94g)。
参考例3:在溶液中连续合成硫代磷酸酯十聚体
将与参考例1的操作类似的操作重复9次以得到5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-N2-异丁酰-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰-脱氧腺苷 3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-N4-苯甲酰-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基 -N6-苯甲酰-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代 磷酰基-N2-异丁酰-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-N4-苯甲酰-脱氧胞苷 3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱 氧胸苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-基3,4,5-三(十八烷氧基)苄基琥 珀酸酯(1.41g)。
参考例4：在溶液中连续合成硫代磷酸酯二十聚体
将与参考例1的操作类似的操作重复19次以得到5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-N4-苯甲酰-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-N4-苯甲酰-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-N4-苯甲酰-脱氧胞 苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-N2-异丁酰-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基 -N4-苯甲酰-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-N4-苯甲酰-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰 乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-N2-异丁酰-脱氧鸟苷 3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-N2-异丁酰-脱 氧鸟苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷 酰基-N4-苯甲酰-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰-脱氧腺苷 3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-N2-异丁酰-脱 氧鸟苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-N4-苯甲酰-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷 酰基-N6-苯甲酰-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰乙基)] 硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-基3,4,5-三(十八烷氧基)苄基琥珀酸酯(1.61g)。
比较例1：3,4,5-三(16-甲基十七烷-1-基氧基)苯甲酸甲酯的合成
(1)16-甲基十七烷-1-基溴的合成
Figure BDA0001356701560000521
将16-甲基十七烷-1-基醇(5.00g,18.5mmol)溶解于氢溴酸(50mL)中，添加浓硫酸(84μL,1.59mmol)，并将混合物在100℃搅拌16hr。通过薄层色谱法确认反应完 成，然后将反应液冷却至室温，并添加己烷(150mL)。将反应液用饱和碳酸氢钠水 溶液(100mL)洗涤两次，并用饱和盐水(50mL)洗涤一次。然后将有机层用硫酸镁干 燥并通过短硅胶柱色谱法(己烷)纯化，以得到目标化合物(5.56g,产率90％)。
(2)3,4,5-三(16-甲基十七烷-1-基氧基)苯甲酸甲酯的合成
Figure BDA0001356701560000522
将3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯(1.03g,5.57mmol)、16-甲基-十七烷基溴(5.56g,16.7 mmol)、碳酸钾(3.85g,27.9mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(50.0mL)中，并将混合 物在110℃下搅拌16hr。通过薄层色谱法确认反应完成后，将反应液冷却至室温， 并添加乙酸乙酯(200mL)。将有机层用水(100mL)洗涤两次，用饱和碳酸氢钠水溶液 (100mL)洗涤1次，用饱和盐水(100mL)洗涤1次，然后用硫酸钠干燥并减压浓缩， 以得到目标化合物(4.66g,产率88％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝0.83-0.90(m,18H,-CH3 ),1.05-1.51(m,81H, -O-CH2-CH2-(CH2 )13-CH(CH3)2),1.70-1.84(m,6H,-O-CH2-CH2 -(CH2)13-CH(CH3)2),3.88 (s,3H,C(O)OCH3 ),3.99-4.02(m,6H,Ar-OCH2 ),7.25(s,2H,Ar-H)
比较例2：4-十八烷氧基苯甲酸甲酯的合成
Figure BDA0001356701560000531
在氩气气氛下，将碳酸钾(2.72g,19.7mmol)、4-羟基苯甲酸甲酯(1.00g,6.57mmol)、1-溴十八烷(2.63g,7.88mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(60mL)中，并将混 合物在90℃下搅拌16hr。通过薄层色谱法确认反应完成后，将乙酸乙酯(100mL) 和四氢呋喃(20mL)添加至反应液中，将有机层用水(100mL)洗涤3次并用饱和盐水 (100mL)洗涤1次。然后减压蒸发有机层。向浓缩的残余物中添加乙酸乙酯(50mL)， 通过加热至70℃使混合物溶解后，冷却至5℃，以得到目标化合物(2.61g,产率 98％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝0.88(t,3H,J＝6.8Hz,-CH2CH2(CH2)15CH3 ),1.26-1.49(m,30H,-CH2CH2(CH2)15 CH3),1.76-1.83(m,2H,-CH2CH2 (CH2)15CH3),3.88(s,3H, -C(O)OCH3 ),4.00(t,2H,J＝6.4Hz,-CH2 CH2(CH2)15CH3),6.90(d,2H,J＝9.2Hz,Ar-H),7.98 (d,2H,J＝9.2Hz,Ar-H)
实施例1：3,5-双(十八烷氧基)苯甲酸甲酯的合成
Figure BDA0001356701560000532
在氩气气氛下，将碳酸钾(19.9g,144mmol)、3,5-二羟基苯甲酸甲酯(3.60g,21.4mmol)、1-溴十八烷(15.5g,46.7mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(200mL)中，并将 混合物在70℃下搅拌16hr。通过薄层色谱法确认反应完成后，将反应液倒入水(800 mL)中以进行沉淀，得到固体。将所得固体溶解于二氯甲烷(200mL)中，通过甲醇(400 mL)使固体沉淀后，通过过滤收集并干燥以得到目标化合物(13.9g,产率97％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝0.88(t,6H,J＝6.6Hz,-OCH2CH2(CH2)15CH3 ),1.25 -1.55(m,76H,-OCH2CH2(CH2 )15CH3),1.77(m,4H,-OCH2CH2 (CH2)15CH3),3.89(s,3H,C(O )O-CH3 ),3.96(t,4H,J＝6.6Hz,-OCH2 CH2(CH2)15CH3),6.63(s,1H,Ar-H),7.15(s,2H,Ar-H)
实施例2：3,5-双(二十二烷氧基)苯甲酸甲酯的合成
Figure BDA0001356701560000533
在氩气气氛下，将碳酸钾(20.0g,145mmol)、3,5-二羟基苯甲酸甲酯(3.60g,21.4mmol)、1-溴二十二烷(17.9g,46.0mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(200mL)中，并 将混合物在70℃下搅拌16hr。通过薄层色谱法确认反应完成后，将反应液倒入水 (1.00L)中以进行沉淀，得到固体。将所得固体溶解于二氯甲烷(500mL)中，通过甲 醇(400mL)使固体沉淀后，通过过滤收集并干燥以得到目标化合物(16.1g,产率 96％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝0.88(t,6H,J＝6.6Hz,-CH3 ),1.25-1.55(m,76H, -OCH2CH2(CH2 )19CH3),1.77(m,4H,-OCH2CH2 (CH2)19CH3),3.89(s,3H,C(O)O-CH3 ),3.96 (t,4H,J＝6.6Hz,-OCH2 CH2(CH2)19CH3),6.63(s,1H,Ar-H),7.15(s,2H,Ar-H)
实施例3：2,3,4-三(十八烷氧基)二苯甲酮
Figure BDA0001356701560000541
在氩气气氛下，将碳酸钾(4.35g,31.5mmol)、2,3,4-三羟基二苯甲酮(1.61g,7.00mmol)、1-溴十八烷(7.32g,22.0mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(30mL)中，并将混 合物在80℃下搅拌16hr。通过薄层色谱法确认反应完成后，将反应液倒入水(200mL) 中以进行沉淀，得到固体。将所得固体溶解于二氯甲烷(200mL)中，通过甲醇(300mL) 使固体沉淀后，通过过滤收集并干燥以得到目标化合物(6.31g,产率91％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝0.88(t,9H,J＝6.7Hz,-CH 3),1.11-1.55(m,90H, -O-CH2CH2(CH2 )15CH3),1.74-1.87(m,4H,-O-CH2CH2 (CH2)15CH3),3.88(t,2H,J＝6.6Hz,-O -CH2 CH2(CH2)15CH3),3.99(t,2H,J＝6.6Hz,-O-CH2 CH2(CH2)15CH3),4.02(t,2H,J＝6.6Hz,-O -CH2 CH2(CH2)15CH3),6.69(d,1H,J＝8.6Hz,Ar-H),7.12(d,1H,J＝8.6Hz,Ar-H),7.41(m,2H,Ar-H),7.53(m,1H,Ar-H),7.77(m,2H,Ar-H)
实施例4：3,4,5-三(十八烷氧基)甲苯的合成
Figure BDA0001356701560000542
在氢气气氛下，将2-三(十八烷氧基)苄氧基-4-甲氧基-苯甲醛肟(487mg,470 μmol)溶解于THF(40mL)和甲醇(10mL)的混合溶剂中，添加10wt％Pd/C(53.3mg) 后，将混合物在室温下搅拌64hr。通过薄层色谱法确认反应完成后，将反应液通过 硅藻土过滤，并将乙腈(200mL)添加至滤液以使固体沉淀。将固体通过过滤收集并 干燥以得到目标化合物(391mg,产率93％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝0.88(t,9H,J＝6.6Hz,-OCH2CH2(CH2)19CH3 ), 1.26-1.80 (m,96H,-OCH2CH2 (CH2 )19CH3),2.27(s,3H,Ar-Me),3.89-3.96(m,6H,-OCH2 CH2(CH2)19CH3),6.35(s,2H,Ar-H)
实施例5：3,4,5-三[3,4,5-三(十八烷氧基)苄氧基]苯甲酸甲酯的合成
Figure BDA0001356701560000551
在氩气气氛下，将碳酸钾(1.39g,10.1mmol)、3,5-羟基苯甲酸甲酯(181mg,1.00mmol)、3,4,5-三(十八烷氧基)苄基氯(2.81g,3.01mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(20 mL)中，并将混合物在70℃搅拌18hr。通过薄层色谱法确认反应完成后，将反应液 倒入水(50mL)中以进行沉淀，得到固体。将所得固体溶解于二氯甲烷(50mL)中，并 通过乙腈(200mL)使固体沉淀后，通过过滤收集并干燥以得到目标产物的粗产物。 通过硅胶柱色谱法(二氯甲烷/己烷(体积比)＝1/2-1/1)将所得粗产物纯化以得到目标 化合物(2.31g,81％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝0.88(t,9H,J＝7.0Hz,-O(CH2)17CH3 ),1.25-1.74 (m,291H,-OCH2(CH2 +N5-CH3 )16CH3),3.75(m,6H,-OCH2 (CH2)16CH3),3.90(s,3H, -C(O)OCH3 ),3.86-3.94(2m,12H,-OCH2 (CH2)16CH3),5.02(s,6H,3×-H2C-Ar),6.59(s,2H,Ar -H),6.62(s,4H,Ar-H),7.38(s,2H,Ar-H)
实施例6：3,4,5-三(十八烷氧基)苯甲酸甲酯的合成
Figure BDA0001356701560000552
将1-溴十八烷(64.0g,192mmol)、碳酸钾(79.6g,576mmol)、3,4,5-三羟基苯甲 酸甲酯(11.0g,60.0mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(600mL)中，并将混合物在90 ℃搅拌16hr。通过薄层色谱法(己烷/二氯甲烷(体积比)＝2/1和二氯甲烷/甲醇(体积 比)＝9/1)确认反应完成后，将反应液倒入水(2.00L)中，使固体沉淀，然后进行过滤 并干燥。将干燥的固体溶解于二氯甲烷(500mL)中，添加乙腈(1.50L)以使固体沉淀。 通过过滤收集固体，并干燥以得到目标化合物(56.7g,100％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝0.88(t,9H,J＝6.8Hz,-OCH2(CH2)16CH3 ),1.21-1.51(m,90H,-O-CH2CH2(CH2)15 CH3),1.70-,6H,-O-CH2-CH2-(CH 2)15 -CH3),3.89(s,3H,C(O)OCH 3),3.99-4.03(m,6H,Ar-OCH2 ),4.99(s,2H,Ar-H),7.25(s,2H,Ar-H)
实施例7：乙酸3,4,5-三(十八烷氧基)苄酯的合成
(1)3,4,5-三(十八烷氧基)苄基醇的合成
Figure BDA0001356701560000561
在氩气气氛下，将3,4,5-三(十八烷氧基)苯甲酸甲酯(10.0g,10.6mmol)溶解于四氢呋喃(150mL)中，添加氢化铝锂(810mg,21.3mmol)，并将混合物在室温下搅拌 30min。通过薄层色谱法确认反应完成后，用4M氢氧化钠水溶液(6.0mL)骤冷 (quench)，并过滤反应液。向滤液中添加甲醇(500mL)以使固体沉淀，其通过过滤收 集并干燥以得到目标化合物(9.65g,产率99％)。
(2)乙酸3,4,5-三(十八烷氧基)苄酯的合成
Figure BDA0001356701560000562
将3,4,5-三(十八烷氧基)苄基醇(10.0g,10.5mmol)、乙酸酐(9.90mL,105mmol)、吡啶(8.40mL,105mmol)、4-二甲基氨基吡啶(128mg,1.05mmol)溶解于二氯甲烷 (100mL)中，并将混合物在室温下搅拌5min。通过薄层色谱法确认反应完成后，添 加乙腈(500mL)以使固体沉淀，其通过过滤收集。通过硅胶柱色谱法(己烷/二氯甲烷 ＝2/1-1/1)纯化所得固体以定量得到呈白色固体状的目标化合物(10.4g)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝0.88(t,9H,J＝6.8Hz,-CH3 ),1.26-1.50(m,90H, -O-CH2-CH2-(CH2)15 CH3),1.70-1.83(m,6H,-O-CH2-CH2 -(CH2)15-CH3),2.10(s,3H,C(O)C H3 ),3.92-3.98(m,6H,Ar-OCH2 ),4.99(s,2H,Ar-CH2 ),6.54(s,2H,Ar-H)
实施例8：1,2,3-三(十八烷氧基)丙烷的合成
Figure BDA0001356701560000563
在氩气气氛下，将碳酸钾(12.4g,90.0mmol)、甘油(921mg,10.0mmol)、1-溴十 八烷(11.0g,33.0mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(100mL)中，并将混合物在110℃ 搅拌16hr。通过薄层色谱法确认反应完成后，将反应液倒入水(400mL)中以进行沉 淀，得到固体。通过硅胶柱色谱法(二氯甲烷)纯化所得固体以得到目标化合物(4.30g, 51％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝0.88(t,9H,J＝6.8Hz,-CH2(CH2)16CH3 ),1.18-1.36(m,95H,-CH2CH2(CH2)15 CH3,HC(CH2 )2),1.53-1.62(m,6H,-CH2CH2 (CH2)15CH3),3.62-3.66( m,6H,-CH2 (CH2)16CH3)
实施例9：1,3-二(十八烷氧基)-2,2-二(十八烷氧基甲基)丙烷的合成
Figure BDA0001356701560000571
在氩气气氛下，将碳酸钾(6.10g,44.1mmol)、季戊四醇(501mg,3.67mmol)、 1-溴十八烷(5.50g,16.5mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(35mL)中，并将混合物在 110℃搅拌16hr。通过薄层色谱法确认反应完成后，将反应液倒入水(400mL)中以 进行沉淀，得到固体。将所得固体溶解于二氯甲烷(200mL)中，并通过甲醇(300mL) 使固体沉淀后，通过过滤收集并干燥以得到目标化合物(3.57g,85％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝0.88(t,J＝6.8Hz,12H,-CH2(CH2)16CH3 ),1.17-1.36(m, 128H,-CH2CH2(CH2)16 CH3),1.53-1.60(m,8H,-C(CH2)4 ),3.62-3.66(m,8H,-CH2 (CH2)16CH3)
实施例10：4-二十二烷氧基苯甲酸甲酯的合成
Figure BDA0001356701560000572
在氩气气氛下，将碳酸钾(1.36g,9.85mmol)、4-羟基苯甲酸甲酯(500mg,3.29mmol)、1-溴十八烷(1.28g,3.62mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(30mL)中，并将混 合物在90℃搅拌16hr。通过薄层色谱法确认反应完成后，将反应液倒入水(400mL) 中以进行沉淀，得到固体。将所得固体溶解于70℃的乙酸乙酯(50mL)中之后，冷却 至室温以使晶体沉淀，然后其通过过滤收集并干燥以得到目标化合物(1.37g,91％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝0.88(t,3H,J＝6.8Hz,-CH2CH2(CH2)15CH3 ),1.26-1.58(m,38H,-CH2CH2(CH2)19 CH3),1.76-1.83(m,2H,-CH2CH2 (CH2)19CH3),3.88(s,3H, -C(O)OCH3 ),4.00(t,2H,J＝6.4Hz,-CH2 CH2(CH2)15CH3),6.90(d,2H,J＝9.5Hz,Ar-H),7.98(d,2H,J＝9.5Hz,Ar-H)
实施例11：3,4,5-三(十八烷氧基)环己烷羧酸甲酯的合成
Figure BDA0001356701560000573
将环己烷添加至3,4,5-三(十八烷氧基)苯甲酸甲酯(1.00g,10.6mmol)中，添加5％铑-碳(0.8g)，并且在80℃和10atm下进行氢还原16hr。在氢还原后向混合物 中添加四氢呋喃(10mL)并过滤掉催化剂。将滤液浓缩，将甲醇(8mL)添加至浓缩的 溶液中，并搅拌混合物。所得沉淀物通过过滤收集，并干燥以得到目标化合物(820mg, 产率82％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝0.89(9H,t,J＝6.9Hz,C17H34-Me),1.25-1.44(90H,m),1.52-1.60(6H,m),1.86-1.94(4H,m),2.23(1H,m),3.09-3.14(2H,m),3,41-3.47(4H,m),3.64-3. 68(5H,m),3.86(1H,s)
实施例12：2,4-二(二十二烷氧基)苯甲酸甲酯的合成
Figure BDA0001356701560000581
在氩气气氛下，将碳酸钾(29.9g,217mmol)、2,4-二羟基苯甲酸甲酯(3.65g,21.7mmol)、1-溴二十二烷(17.33g,44.5mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(150mL)中，并 将混合物在70℃搅拌16hr。通过薄层色谱法确认反应完成后，将反应液倒入水(1.00 L)中以进行沉淀，得到固体。将所得固体溶解于二氯甲烷(500mL)中，并通过甲醇(400 mL)使固体沉淀后，通过过滤收集并干燥以得到目标化合物(16.7g,产率98％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝0.88(t,6H,J＝6.6Hz,-CH3 ),1.13-1.56(m,76H, -OCH2CH2(CH2 )19CH3),1.81(m,4H,-OCH2CH2 (CH2)19CH3),3.89(s,3H,C(O)O-CH3 ),4.02 (dd,4H,J＝6.6,14.8Hz,-OCH2 CH2(CH2)19CH3),6.63(s,1H,Ar-H),7.15(s,2H,Ar-H)
实施例13：新戊酰基氧基甲基-3,4,5-三(十八烷氧基)苯的合成
Figure BDA0001356701560000582
在氩气气氛下，将3,4,5-三(十八烷氧基)苄基醇(2.73g,2.99mmol)溶解于二氯甲烷(25mL)中，然后依次添加三乙胺(1.67mL,12.0mmol)、新戊酰氯(781μL,6.00 mmol)、4-二甲基氨基吡啶(7.32mg,600μmol)，并将混合物在室温下搅拌7hr。通 过薄层色谱法确认反应完成，将乙腈(125mL)添加至反应液中以使固体沉淀，其通 过过滤收集。将所得固体在减压下干燥以定量地得到呈白色固体状的目标化合物 (2.80g)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝0.879(t,J＝7.06Hz,9H),1.23(s,9H),1.24-1.40 (m,84H),1.40-1.52(m,6H),1.70-1.81(m,6H),3.92(t,J＝6.8Hz,2H),3.95(t,J＝6.8Hz,4H),5.01(s,2H),6.51(s,2H)
实施例14：(2S)-2-(乙酰基氨基)-4-甲基戊酰基氧基甲基-3,4,5-三(十八烷氧 基)苯的合成
Figure BDA0001356701560000583
将3,4,5-三(十八烷氧基)苄基醇(1.83g,2.00mmol)、N-乙酰基亮氨酸(700mg,4.09mmol)、2,6-二甲基氨基吡啶(2.58mg,20.0μmol)溶解于二氯甲烷(20mL)中，然 后添加二异丙基乙胺(1.16mL,6.79mmol)和HBTU(1.90g,5.00mmol)，并将混合物 在室温下搅拌15hr后，在40℃进一步搅拌21hr。将反应液过滤后，将乙腈(100mL) 添加至滤液中以使固体沉淀，其通过过滤收集。将所得固体减压干燥以得到呈白色 固体状的目标化合物(1.97g)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ＝0.879(t,J＝7.06Hz,9H),0.913(d,J＝3.2Hz,3H),0.929 (d,J＝3.2Hz,3H),1.22-1.40(m,84H),1.40-1.52(m,7H),2.02(s,3H),1.60-1.82(m,8H),3.94 (t,J＝6.4Hz,2H),3.95(t,J＝6.8Hz,4H),4.684(ddd,J＝13.6,4.8,4.8Hz,1H),5.024(d,12.4Hz), 5.082(d,12.4Hz),5.817(d,8.4Hz),6.52(s,2H)
实施例15：三异丙基甲硅烷氧基甲基-3,4,5-三(十八烷氧基)苯的合成
Figure BDA0001356701560000591
在氩气气氛下，将3,4,5-三(十八烷氧基)苄基醇(4.57g,5.00mmol)和咪唑(1.36g, 20.0mmol)溶解于二氯甲烷(40mL)和N,N-二甲基甲酰胺(10mL)的混合溶剂中，添加 三异丙基甲硅烷基氯(2.12mL,10.0mmol)并将混合物在40℃搅拌6hr。在冷却至室 温之后，将乙腈(250mL)添加至反应液中以使固体沉淀，其通过过滤收集。将所得 固体减压干燥以得到呈白色固体状的目标化合物(5.23g)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝0.879(t,J＝7.06Hz,9H), 1.09(d,18H,6.0Hz),1.12-1.20 (m,3H),1.22-1.40(m,84H),1.40-1.52(m,6H),1.70-1.82(m,6H),3.91(t,J＝6.8Hz,2H),3.97 (t,J＝6.8Hz,4H),4.75(s,2H),6.56(s,2H)
实施例16：4-(3,4,5-三(十八烷氧基)苯甲酰)-吗啉的合成
Figure BDA0001356701560000592
在氩气气氛下，将3,4,5-三(十八烷氧基)苯甲酸(5.00g,5.39mmol)溶解于二氯甲烷(50mL)中，然后依次添加HBTU(6.13g,16.2mmol)、吗啉(1.31mL,16.2mmol) 和二异丙基乙胺(2.90mL,16.2mmol)，并将混合物在室温下搅拌18hr。通过薄层色 谱法(己烷/二氯甲烷/乙酸乙酯＝25/50/25)确认反应的终点后，将乙腈(250mL)添加至 反应液中以使固体沉淀，其通过过滤收集。通过硅胶柱色谱法(二氯甲烷/甲醇＝100/0 -95/5)纯化所得固体，以得到呈白色固体状的目标化合物(5.18g)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝0.879(t,J＝6.8Hz,9H),1.26-1.47(m,84H),1.42-1.53 (m,6H),1.71-1.80(m,6H),3.69(m,8H),3.95(m,6H),6.51(s,2H)
试验例1
作为被沉淀物，使用参考例2中合成的五聚体或参考例4中合成的二十聚体， 研究沉淀促进剂的添加量与被沉淀物的回收率之间的关系。将表1和2中所示量的 被沉淀物和实施例6中合成的沉淀促进剂(3,4,5-三(十八烷氧基)苯甲酸甲酯)溶解于 二氯甲烷(2mL)中，然后用表1和2中所示量的乙腈使固体沉淀，所得固体通过使 用桐山漏斗(21m/m)和滤纸(No-5A)通过过滤收集，用乙腈(20mL)将固体洗涤后进行 减压干燥。从所用被沉淀物(即参考例2的五聚体或参考例4的二十聚体)的量和所 用沉淀促进剂的量、以及回收的干燥后的被沉淀物和沉淀促进剂的混合物的量计算 的回收率(＝100x(回收的干燥后的被沉淀物和沉淀促进剂的混合物的量(mg))/(所用 被沉淀物的量(mg)+所用沉淀促进剂的量(mg)))显示于表1和2中。
表1
Figure BDA0001356701560000601
*1实施例6的沉淀促进剂相对于参考例2的五聚体的摩尔当量
表2
Figure BDA0001356701560000602
*1实施例6的沉淀促进剂相对于参考例4的二十聚体的摩尔当量
试验例2
作为被沉淀物，使用参考例3中合成的十聚体，研究沉淀促进剂的种类与被沉 淀物的回收率之间的关系。将表3中所示量的参考例3的十聚体和任一比较例1及 2及实施例1–12中合成的沉淀促进剂溶解于二氯甲烷(0.5mL)中，然后用乙腈(2.5 mL)使固体沉淀，所得固体通过使用桐山漏斗(21m/m)和滤纸(No-5A)通过过滤收集， 用乙腈(2.0mL)将固体洗涤后进行减压干燥。从所用被沉淀物(即参考例3的十聚体) 的量和所用沉淀促进剂的量、以及回收的干燥后的被沉淀物和沉淀促进剂的量计算 的回收率(＝100x(回收的干燥后的被沉淀物和沉淀促进剂的混合物的量(mg))/(所用 被沉淀物的量(mg)+所用沉淀促进剂的量(mg)))显示于表3中。
表3
Figure BDA0001356701560000611
*1各沉淀促进剂相对于参考例3的十聚体的摩尔当量
如表3中所示，使用实施例1–12的沉淀促进剂，可促进参考例3的十聚体的沉 淀且可提高其回收率。另一方面，当使用具有支链脂族烃基的比较例1的沉淀促进 剂、及具有直链脂族烃基但该基团的碳原子总数低于20的比较例2的沉淀促进剂时， 与没有使用这些沉淀促进剂的情形相比，参考例3的十聚体的回收率降低。
试验例3
作为被沉淀物，使用参考例2中合成的五聚体，研究沉淀促进剂的种类与被沉 淀物的回收率之间的关系。将表4中所示量的参考例2的五聚体和任一实施例13– 15中合成的沉淀促进剂溶解于二氯甲烷中。在24℃下经3min将表4中所示量的乙 腈在搅拌下滴加至所得溶液以使固体沉淀，得到浆料。使所得浆料在冰浴中静置10 min，并且将沉淀的固体通过使用25Φ桐山漏斗和5C滤纸通过过滤收集，并用表4 中所示量的乙腈洗涤所得固体。将所得固体减压干燥过夜。从所用被沉淀物(即参考 例2的五聚体)的量和所用沉淀促进剂的量、以及回收的干燥后的被沉淀物和沉淀促 进剂的混合物的量计算的回收率(＝100x(回收的干燥后的被沉淀物和沉淀促进剂的 混合物的量(mg))/(所用被沉淀物的量(mg)+所用沉淀促进剂的量(mg)))显示于表4 中。
表4
Figure BDA0001356701560000621
*1各沉淀促进剂相对于参考例2的五聚体的摩尔当量
试验例4
作为被沉淀物，使用参考例4中合成的二十聚体，研究沉淀促进剂的种类与被 沉淀物的回收率之间的关系。将表5中所示量的参考例2的五聚体和任一实施例13 –15中合成的沉淀促进剂溶解于二氯甲烷中。在24℃下经3min将乙腈(10.5mL)在 搅拌下滴加至所得溶液以使固体沉淀，得到浆料。使所得浆料在冰浴中静置10min， 并且将沉淀的固体通过使用25Φ桐山漏斗和5C滤纸通过过滤收集，并用乙腈(5.0mL) 洗涤所得固体。将所得固体减压干燥过夜。从所用被沉淀物(即参考例4的二十聚体) 的量和所用沉淀促进剂的量、以及回收的干燥后的被沉淀物和沉淀促进剂的混合物 的量计算的回收率(＝100x(回收的干燥后的被沉淀物和沉淀促进剂的混合物的量 (mg))/(所用被沉淀物的量(mg)+所用沉淀促进剂的量(mg)))显示于表5中。
表5
Figure BDA0001356701560000622
*1各沉淀促进剂相对于参考例4的二十聚体的摩尔当量
试验例5
首先，不使用沉淀促进剂进行肽的回收试验。具体地，将其中羧基被3,4,5-三(十八烷氧基)苄基(TOB)保护的肽(H-Lys(Boc)-Pro-Pro-Ala-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Pro-Arg(Pbf)-OTOB,435mg,0.166mmol)溶解于氯仿(10mL)中。将所得溶液减压浓缩， 并从溶液中除去约5mL氯仿以得到浓缩物。将乙腈(20mL)添加至该浓缩物以使固 体沉淀。该沉淀物通过过滤收集并减压干燥以得到干燥的肽。从所用肽的量以及回 收的干燥后的肽的量计算的回收率(＝100x(回收的干燥后的肽的量(mg))/(所用肽的 量(mg)))为71％。
接着，使用3,4,5-三(十八烷氧基)苄基醇作为沉淀促进剂，除此以外采用与上述相同的方式进行肽的回收试验。具体地，将其中羧基被3,4,5-三(十八烷氧基)苄基 (TOB)保护的肽(H-Lys(Boc)-Pro-Pro-Ala-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Pro-Arg(Pbf)-OTOB,435mg,0.166mmol)和3,4,5-三(十八烷氧基)苄基醇(200mg,0.22mmol)溶解于氯仿 (10mL)中。将所得溶液减压浓缩，并从溶液中除去约5mL氯仿以得到浓缩物。将 乙腈(20mL)添加至该浓缩物以使固体沉淀。该沉淀物通过过滤收集并减压干燥以得 到干燥的肽和沉淀促进剂的混合物。从所用肽的量和所用沉淀促进剂的量、以及回 收的干燥后的肽和沉淀促进剂的混合物的量计算的回收率(＝100x(回收的干燥后的 肽和沉淀促进剂的混合物的量(mg))/(所用肽的量(mg)+所用沉淀促进剂的量(mg)))为 97％。
实施例17:通过使用沉淀促进剂在溶液中连续合成硫代磷酸酯二聚体
在氩气气氛下，将5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)脱氧胸苷-3’-基[3,4,5-三(十八 烷氧基)苄基]琥珀酸酯(1.85g,1.2mmol)、乙酸3,4,5-三(十八烷氧基)苄酯(1.86g,1.20 mmol，其为实施例7中合成的沉淀促进剂)溶解于二氯甲烷(40mL)中，添加吲哚(1.40g,12.0mmol)和三氟乙酸(88.9μL,1.20mmol)，并将混合物在室温下搅拌2hr，通过 薄层色谱法确认反应完成。用1-甲基咪唑(99.7μL,1.26mmol)中和反应混合物后， 添加4,5-二氰基咪唑(476mg,4.03mmol)、5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)脱氧胸苷 -3’-[O-(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(2.00g,2.69mmol)在乙腈中的溶液，并 将混合物在室温下搅拌60min，通过薄层色谱法确认反应的完成。此外，添加 3-[(N,N-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3H-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(608mg,2.96mmol)并将 混合物在室温下搅拌30min。然后添加乙酸酐(56.6μL,0.60mmol)、2,4,6-三甲基吡 啶(79.1μL,0.60mmol)、1-甲基咪唑(47.5μL,0.60mmol)并将混合物在室温下搅拌15 min。将乙腈(200mL)添加至反应液中，将沉淀的固体使用桐山漏斗抽滤后进行干燥 以得到呈白色固体状的5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-脱氧胸苷-3’-[O-(2-氰乙基)]硫 代磷酰基脱氧胸苷-3’-基[3,4,5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯(4.150g,产率 99.8％)。
实施例18：通过使用沉淀促进剂在溶液中连续合成硫代磷酸酯二十聚体(序列： 5’-TCCCGCCTGTGACATGCATT-3’)
(1)键合有假固相保护基的硫代磷酸酯二十聚体的合成
将与实施例17的操作类似的操作重复19次以得到5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-N4-苯甲酰-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-N4-苯甲酰-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-N4-苯甲酰-脱氧胞苷 3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-N2-异丁酰-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-N4- 苯甲酰-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-N4-苯甲酰-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰乙 基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-N2-异丁酰-脱氧鸟苷 3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-N2-异丁酰-脱 氧鸟苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷 酰基-N4-苯甲酰-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰-脱氧腺苷 3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-N2-异丁酰-脱 氧鸟苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-N4-苯甲酰-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷 酰基-N6-苯甲酰-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰乙基)] 硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-基3,4,5-三(十八烷氧基)苄基琥珀酸酯(8.55g)。
(2)硫代磷酸酯二十聚体的合成(脱保护)和纯化
将上述(1)中合成的化合物(100mg,10.3μmol)和30wt％氨水(5.00mL)放入高压釜中，在65℃加热4hr后，通过针头式过滤器(WHATMAN25mmGD/XPTFE0.45 μm)过滤不溶物质。滤液进一步用0.1M乙酸铵水溶液(50mL)稀释并经过C-18柱纯 化，将所得到的洗脱液冷冻干燥以得到目标产物：脱氧胸苷基-[3’→5’]-脱氧胞苷基 -[3’→5’]-脱氧胞苷基-[3’→5’]-脱氧胞苷基-[3’→5’]-脱氧胍基 (deoxyguanidyl)-[3’→5’]-脱氧胞苷基-[3’→5’]-脱氧胞苷基-[3’→5’]-脱氧胸苷基 -[3’→5’]-脱氧胍基-[3’→5’]-脱氧胸苷基-[3’→5’]-脱氧胍基-[3’→5’]-脱氧腺苷酰 -[3’→5’]-脱氧胞苷基-[3’→5’]-脱氧腺苷酰-[3’→5’]-脱氧胸苷基-[3’→5’]-脱氧胍基 -[3’→5’]-脱氧胞苷基-[3’→5’]-脱氧腺苷酰-[3’→5’]-脱氧胸苷基-[3’→5’]-脱氧胸苷。
HPLC(shodex ODP(
Figure BDA0001356701560000642
),流速0.5mL/min，15mM TEA+20mM HFIP/MeOH＝95/5,15mM TEA+20mM HFIP/MeOH＝50/50梯度：0-7.4min；0-60％, 7.5-11min；100％,λ＝254nm):Rt＝6.26min(73％)；
TOF/MS:6344.59[M-H]-
实施例19:通过使用沉淀促进剂在溶液中连续合成硫代磷酸酯二聚体
Figure BDA0001356701560000641
在氩气气氛下，将5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)脱氧胸苷-3’-基-二异丙基 -4-[3,4,5-三(十八烷氧基)苄氧基羰基]苯基硅烷(330mg,200μmol)和乙酸3,4,5-三(十 八烷氧基)苄基酯(290mg,303μmol，其为实施例7中合成的沉淀促进剂)溶解于二氯 甲烷(5.0mL)中，添加吲哚(469mg,4.00mmol)、三氟乙酸(30.6μL,400μmol)并将混 合物在室温下搅拌2hr，通过薄层色谱法确认反应的完成。用1-甲基咪唑(34.8μL, 439μmol)中和反应混合物后，添加5-苄硫基-1H-四唑(115mg,600μmol)、5’-O-(4,4’- 二甲氧基三苯甲基)脱氧胸苷-3’-[O-(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(447mg, 600μmol)在乙腈中溶液，并将混合物在室温下搅拌60min，通过薄层色谱法确认反 应的完成。此外，添加3-[(N,N-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3H-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(136 mg,662μmol)并将混合物在室温下搅拌30min。然后将乙腈(30mL)添加至反应液 中，将沉淀的固体使用桐山漏斗抽滤后进行干燥以得到呈白色固体状的5’-O-(4,4’- 二甲氧基三苯甲基)-脱氧胸苷-3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3’-基[3,4,5-三 (十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯(398mg,产率98％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝0.88(t,9H,J＝6.6Hz,-CH3),1.00-1.07(m,12H, -Si-CH-(CH3)2 ),1.21-2.00(m,96H,-OCH2(CH2)15 CH3),2.35-2.50(m,3H,2’-H),2.56-2.60 (m,2H,2’-H+5’-H),2.71(m,1H,5’-H),3.41-3.46(m,2H,5’-H),3.78(s,6H,DMTr-OCH3 ),3.93-3.99(m,6H,-OCH2 (CH2)15CH3),4.11-4.30(m,6H,3’-H,4’-H,-CH2 CH2 CN),4.51-4.60(m,1H,4’-H),5.24(s,2H,Ar-CH2-O-),5.32(m,1H,3’-H),6.28(m,1H,1H’-H),6.36(m,1H,1H’-H),6.64(s,2H,Ar-H),6.84(m,4H,DMTr-H),7.22-7.63(m,11H,-Si-Ar,DMTr-H),8.05-8.08(m,2H,-Si-Ar),8.58-8.95(m,2H,N3-H)
实施例20：通过使用沉淀促进剂在溶液中连续合成硫代磷酸酯二聚体
Figure BDA0001356701560000651
在氩气气氛下，将5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-N3-3,4,5-三(十八烷氧基)苯甲 酰-脱氧胸苷-3’-基-叔丁基-二甲基硅烷(312mg,199μmol)和乙酸3,4,5-三(十八烷氧基)苄基酯(287mg,300μmol，其为实施例7中合成的沉淀促进剂)溶解于二氯甲烷 (5.0mL)中，添加吲哚(466mg,3.98mmol)、三氟乙酸(30.6μL,398μmol)并将混合物 在室温下搅拌2hr，通过薄层色谱法确认反应的完成。用1-甲基咪唑(34.8μL,439 μmol)中和反应混合物后，添加5-苄硫基-1H-四唑(115mg,600μmol)、5’-O-(4,4’-二 甲氧基三苯甲基)脱氧胸苷-3’-[O-(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(447g,600 μmol)在乙腈中的溶液，并将混合物在室温下搅拌60min，通过薄层色谱法确认反应 的完成。此外，添加3-[(N,N-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3H-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(136 mg,662μmol)并将混合物在室温下搅拌30min。然后将乙腈(30mL)添加至反应液 中，将沉淀的固体使用桐山漏斗抽滤后进行干燥以得到呈白色固体状的5’-O-(4,4’- 二甲氧基三苯甲基)-脱氧胸苷-3’-[O-(2-氰乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3’-基[3,4,5-三 (十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯(382mg,产率99％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝-0.01(S,3H,Si-CH3),0.00(S,3H,Si-CH3),0.75-0.81(m,18H,-OCH2(CH2)15CH3 +Si-C(CH3)3 ),1.05-1.73(m,90H,-OCH2(CH2)15 CH3),2.08(m, 1H,2’-H),2.22(m,1H,2’-H),2.34(m,1H,2’-H),2.53-2.62(m,2H,2’-H+5’-H),2.70(t,1H, J＝6.0Hz,5’-H),3.25-3.51(m,2H,5’-H),3.71(d,6H,J＝1.3Hz,DMTr-OCH3),3.87-3.98(m,7H,-OCH2 (CH2)15CH3+3’-H),4.10-4.33(m,6H,-CH2 CH2 CN+2×4’-H),5.25(dt,1H, J＝7.9,15.3Hz,3’-H),6.17(td,1H,J＝2.2,6.6Hz,1’-H),6.30(dd,J＝5.4,8.8,23.6Hz,1’-H),6.76 (s,2H,Ar-H),6.78(s,2H,DMTr-H),7.05-7.39(m,11H,DMTr-Ar-H),7.39(s,1H,N6-H), 7.47(d,1H,J＝8.0Hz,N6-H),8.45(m,1H,N3-H)
[产业适用性]
使用本发明的沉淀促进剂，当使被具有一个以上的碳原子数为10以上的脂族烃基的有机基团保护的有机化合物从溶剂中沉淀时，可提高该有机化合物的回收率。 因此，本发明的沉淀促进剂可用于所述有机化合物的合成、特别是寡核苷酸的合成。
本申请以在日本申请的专利申请号2015-009720作为基础，其内容全部包含于 本说明书中。
Figure IDA0001356701630000011

Claims (23)

1.使被有机基团保护的有机化合物从溶剂中沉淀的方法，该方法使用沉淀促进剂，其中，
所述溶剂是包含极性溶剂的溶剂，
所述沉淀促进剂是，
(1)式(II)所示的化合物，
Figure FDA0003166442630000011
式中，
R1各自独立地为直链C10-30烷基；
X1各自独立地为单键、-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-OC(＝O)-；
环A2和环B1各自独立地为苯环或环己烷环；
X2各自独立地为-(CH2)p-、-(CH2)p-O-(CH2)q-、-(CH2)p-C(＝O)-(CH2)q-、-(CH2)p-C(＝O)O-(CH2)q-或-(CH2)p-OC(＝O)-(CH2)q-，其中p和q各自独立地为0-3的整数；
X3为单键、-(CH2)r-O-、-(CH2)r-C(＝O)-、-(CH2)r-C(＝O)O-或-(CH2)r-OC(＝O)-，其中r为0-3的整数；
R2为氢原子、任选被C1-6烷酰基氨基取代的C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-14芳基、3-8元单环非芳族杂环基或三(C1-6烷基)甲硅烷基；
m为1-3的整数；和
当m为1时，m’为0或1；当m为2或3时，m’为1，
或者
(2)经由选自-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-和-OC(＝O)-中的基团而具有3～6个的直链C10-30烷基的C1-8烷烃，
所述有机基团是式(III)所示的基团，
**L-Y-Z (III)
式中，
**表示与被保护的基团的键合位置；
L表示单键、或者式(a1)或(a1’)所示的基团：
Figure FDA0003166442630000021
式中，
*表示与Y的键合位置；
**与前述的定义相同；
R8和R9各自独立地表示C1-22烃基；
L1表示二价C1-22烃基；并且
L2表示单键，或者表示**C(＝O)N(R2’)-R1’-N(R3)***所示的基团，式中**表示与L1的键合位置，***表示与C＝O的键合位置，R1’表示C1-22亚烷基，R2’和R3各自独立地表示氢原子或C1-22烷基；
Y表示单键、氧原子或NR，其中R表示氢原子、烷基或C7-16芳烷基；以及
Z表示式(a2)、式(a2’)或式(a2”)所示的基团：
Figure FDA0003166442630000022
式中，
*表示键合位置；
R4为氢原子，或者当Rb为下述式(a3)所示的基团时，R4任选地与环C的R6一起表示单键或-O-、并与环A或环B及环C一起形成稠环，所述稠环为芴环或呫吨环；
k个Q各自独立地表示-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NH-或-NHC(＝O)-；
k个R5各自独立地表示直链C10-40烷基；
k表示1至4的整数；
环A和环B各自独立地除了具有k个QR5以外，任选地进一步具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基；
Ra表示氢原子、或任选被卤素原子取代的苯基；以及
Rb表示氢原子、或式(a3)所示的基团：
Figure FDA0003166442630000031
式中，*表示键合位置；
j表示0至4的整数；
j个Q各自独立地表示与前述相同的含义；
j个R7各自独立地表示经由单键或连接基键合有碳原子数为10以上的脂族烃基的烃基；
R6表示氢原子，或者任选地与环A或环B的R4一起表示单键或-O-、并且与环A或环B及环C一起形成稠环；并且
环C除了具有j个QR7以外，任选地进一步具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基，或者Ra和Rb一起形成羰基，
所述有机化合物为任选地进一步被核酸合成中所用的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸，或者任选地进一步被肽合成中所用的保护基保护的氨基酸或肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，R2为氢原子、任选被C1-6烷酰基氨基取代的C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-14芳基或3-8元单环非芳族杂环基。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，Z为式(a2)或式(a2’)所示的基团，k个R5各自独立地为直链C10-40烷基，j个R7各自独立地为经由单键或连接基键合有碳原子数为10以上的直链脂族烃基的烃基，并且Ra为氢原子、或者Ra和Rb一起形成羰基。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，L为式(a1)所示的基团，L1表示二价C1-22烃基，并且L2表示单键。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，L为式(a1’)所示的基团，L1表示亚苯基，并且L2表示单键。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，Y为氧原子。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，Z为式(a2)所示的基团，R4为氢原子。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，Z为式(a2)所示的基团，Ra和Rb各自为氢原子。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，L和Y各自为单键，Z为式(a2)所示的基团，R4为氢原子，并且Ra和Rb一起形成羰基。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述有机化合物为任选地进一步被核酸合成中所用的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，被有机基团保护的有机化合物为核苷或寡核苷酸，所述核苷或寡核苷酸中，选自核酸碱基的氨基和亚氨基、核糖残基的2’位和3’位羟基、以及脱氧核糖残基的3’位羟基中的至少一个基团被有机基团保护，并且其它基团任选地进一步被核酸合成中所用的保护基保护。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，包含极性溶剂的溶剂是极性溶剂和非极性溶剂的混合溶剂。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，极性溶剂为乙腈。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，使用相对于被有机基团保护的有机化合物为0.1摩尔当量以上的所述沉淀促进剂，使被有机基团保护的有机化合物沉淀。
15.沉淀混合物，其包含沉淀促进剂、以及被有机基团保护的有机化合物，其中，
所述沉淀促进剂是，
(1)式(II)所示的化合物，
Figure FDA0003166442630000041
式中，
R1各自独立地为直链C10-30烷基；
X1各自独立地为单键、-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-OC(＝O)-；
环A2和环B1各自独立地为苯环或环己烷环；
X2各自独立地为-(CH2)p-、-(CH2)p-O-(CH2)q-、-(CH2)p-C(＝O)-(CH2)q-、-(CH2)p-C(＝O)O-(CH2)q-或-(CH2)p-OC(＝O)-(CH2)q-，其中p和q各自独立地为0-3的整数；
X3为单键、-(CH2)r-O-、-(CH2)r-C(＝O)-、-(CH2)r-C(＝O)O-或-(CH2)r-OC(＝O)-，其中r为0-3的整数；
R2为氢原子、任选被C1-6烷酰基氨基取代的C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-14芳基、3-8元单环非芳族杂环基或三(C1-6烷基)甲硅烷基；
m为1-3的整数；和
当m为1时，m’为0或1；当m为2或3时，m’为1，
或者
(2)经由选自-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-和-OC(＝O)-中的基团而具有3～6个的直链C10-30烷基的C1-8烷烃，
所述有机基团是式(III)所示的基团，
**L-Y-Z (III)
式中，
**表示与被保护的基团的键合位置；
L表示单键、或者式(a1)或(a1’)所示的基团：
Figure FDA0003166442630000051
式中，
*表示与Y的键合位置；
**与前述的定义相同；
R8和R9各自独立地表示C1-22烃基；
L1表示二价C1-22烃基；并且
L2表示单键，或者表示**C(＝O)N(R2’)-R1’-N(R3)***所示的基团，式中**表示与L1的键合位置，***表示与C＝O的键合位置，R1’表示C1-22亚烷基，R2’和R3各自独立地表示氢原子或C1-22烷基；
Y表示单键、氧原子或NR，其中R表示氢原子、烷基或C7-16芳烷基；以及
Z表示式(a2)、式(a2’)或式(a2”)所示的基团：
Figure FDA0003166442630000052
式中，
*表示键合位置；
R4为氢原子，或者当Rb为下述式(a3)所示的基团时，R4任选地与环C的R6一起表示单键或-O-、并与环A或环B及环C一起形成稠环，所述稠环为芴环或呫吨环；
k个Q各自独立地表示-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NH-或-NHC(＝O)-；
k个R5各自独立地表示直链C10-40烷基；
k表示1至4的整数；
环A和环B各自独立地除了具有k个QR5以外，任选地进一步具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基；
Ra表示氢原子、或任选被卤素原子取代的苯基；以及
Rb表示氢原子、或式(a3)所示的基团：
Figure FDA0003166442630000061
式中，*表示键合位置；
j表示0至4的整数；
j个Q各自独立地表示与前述相同的含义；
j个R7各自独立地表示经由单键或连接基键合有碳原子数为10以上的脂族烃基的烃基；
R6表示氢原子，或者任选地与环A或环B的R4一起表示单键或-O-、并且与环A或环B及环C一起形成稠环；并且
环C除了具有j个QR7以外，任选地进一步具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基，或者Ra和Rb一起形成羰基，
所述有机化合物为任选地进一步被核酸合成中所用的保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸，或者任选地进一步被肽合成中所用的保护基保护的氨基酸或肽。
16.寡核苷酸的制备方法，该方法包括：在非极性溶剂中包含至少一个基团被有机基团保护且其它基团任选地进一步被核酸合成中所用的保护基保护的寡核苷酸和沉淀促进剂的反应液中添加极性溶剂，从反应液中分离包含寡核苷酸和沉淀促进剂的沉淀混合物的步骤，
其中，所述沉淀促进剂是，
(1)式(II)所示的化合物，
Figure FDA0003166442630000062
式中，
R1各自独立地为直链C10-30烷基；
X1各自独立地为单键、-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-OC(＝O)-；
环A2和环B1各自独立地为苯环或环己烷环；
X2各自独立地为-(CH2)p-、-(CH2)p-O-(CH2)q-、-(CH2)p-C(＝O)-(CH2)q-、-(CH2)p-C(＝O)O-(CH2)q-或-(CH2)p-OC(＝O)-(CH2)q-，其中p和q各自独立地为0-3的整数；
X3为单键、-(CH2)r-O-、-(CH2)r-C(＝O)-、-(CH2)r-C(＝O)O-或-(CH2)r-OC(＝O)-，其中r为0-3的整数；
R2为氢原子、任选被C1-6烷酰基氨基取代的C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-14芳基、3-8元单环非芳族杂环基或三(C1-6烷基)甲硅烷基；
m为1-3的整数；和
当m为1时，m’为0或1；当m为2或3时，m’为1，
或者
(2)经由选自-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-和-OC(＝O)-中的基团而具有3～6个的直链C10-30烷基的C1-8烷烃，
并且，所述有机基团是式(III)所示的基团，
**L-Y-Z (III)
式中，
**表示与被保护的基团的键合位置；
L表示单键、或者式(a1)或(a1’)所示的基团：
Figure FDA0003166442630000071
式中，
*表示与Y的键合位置；
**与前述的定义相同；
R8和R9各自独立地表示C1-22烃基；
L1表示二价C1-22烃基；并且
L2表示单键，或者表示**C(＝O)N(R2’)-R1’-N(R3)***所示的基团，式中**表示与L1的键合位置，***表示与C＝O的键合位置，R1’表示C1-22亚烷基，R2’和R3各自独立地表示氢原子或C1-22烷基；
Y表示单键、氧原子或NR，其中R表示氢原子、烷基或C7-16芳烷基；以及
Z表示式(a2)、式(a2’)或式(a2”)所示的基团：
Figure FDA0003166442630000081
式中，
*表示键合位置；
R4为氢原子，或者当Rb为下述式(a3)所示的基团时，R4任选地与环C的R6一起表示单键或-O-、并与环A或环B及环C一起形成稠环，所述稠环为芴环或呫吨环；
k个Q各自独立地表示-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NH-或-NHC(＝O)-；
k个R5各自独立地表示直链C10-40烷基；
k表示1至4的整数；
环A和环B各自独立地除了具有k个QR5以外，任选地进一步具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基；
Ra表示氢原子、或任选被卤素原子取代的苯基；以及
Rb表示氢原子、或式(a3)所示的基团：
Figure FDA0003166442630000082
式中，*表示键合位置；
j表示0至4的整数；
j个Q各自独立地表示与前述相同的含义；
j个R7各自独立地表示经由单键或连接基键合有碳原子数为10以上的脂族烃基的烃基；
R6表示氢原子，或者任选地与环A或环B的R4一起表示单键或-O-、并且与环A或环B及环C一起形成稠环；并且
环C除了具有j个QR7以外，任选地进一步具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基，或者Ra和Rb一起形成羰基。
17.根据权利要求16所述的制备方法，其中，极性溶剂为乙腈。
18.根据权利要求16所述的制备方法，该方法通过亚磷酰胺法进行。
19.寡核苷酸的制备方法，其是利用亚磷酰胺法的寡核苷酸的制备方法，所述亚磷酰胺法中进行一次或重复多次包括下述步骤(1)至(3)的制备循环，
其中，在第一次循环中包含下述步骤(4)，在各循环中包含下述步骤(5)，并且在除最终循环外的各循环中包含下述步骤(6)，
(1)在非极性溶剂中包含核苷或寡核苷酸的反应液中添加酸，将5’位羟基的临时保护基脱保护，利用碱进行中和，得到包含5’位羟基游离体的反应液的步骤，
所述核苷或寡核苷酸中，选自核酸碱基的氨基和亚氨基、核糖残基的2’位和3’位羟基、以及脱氧核糖残基的3’位羟基中的至少一个基团被有机基团保护，5’位羟基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，并且其它基团任选地进一步被核酸合成中所用的保护基保护；
(2)在非极性溶剂中包含5’位羟基游离体的反应液中添加核苷或寡核苷酸，得到包含亚磷酸三酯化合物的反应液的步骤，
所述核苷或寡核苷酸中，3’位羟基被亚磷酰胺化，并且5’位羟基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，并且其它基团任选地进一步被核酸合成中所用的保护基保护；
(3)在非极性溶剂中包含亚磷酸三酯化合物的反应液中添加氧化剂或硫化剂，得到包含寡核苷酸的反应液的步骤，
所述寡核苷酸中，选自核酸碱基的氨基和亚氨基、核糖残基的2’位和3’位羟基、以及脱氧核糖残基的3’位羟基中的至少一个基团被所述有机基团保护，并且5’位羟基被所述在酸性条件下可除去的临时保护基保护，并且其它基团任选地进一步被所述核酸合成中所用的保护基保护；
(4)在步骤(1)之前、步骤(1)和(2)之间、步骤(2)和(3)之间、以及步骤(3)之后的任何时候，在反应液中加入沉淀促进剂的步骤；
(5)在步骤(4)之后且为步骤(1)和(2)之间、步骤(2)和(3)之间、以及步骤(3)之后的任何时候，在包含沉淀促进剂的反应液中添加极性溶剂，从反应液中分离包含5’位羟基游离体、亚磷酸三酯化合物或寡核苷酸、和沉淀促进剂的沉淀混合物的步骤；
(6)在步骤(5)中得到的沉淀混合物中加入非极性溶剂，制成反应液的步骤，
所述沉淀促进剂是，
(1)式(II)所示的化合物，
Figure FDA0003166442630000101
式中，
R1各自独立地为直链C10-30烷基；
X1各自独立地为单键、-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-或-OC(＝O)-；
环A2和环B1各自独立地为苯环或环己烷环；
X2各自独立地为-(CH2)p-、-(CH2)p-O-(CH2)q-、-(CH2)p-C(＝O)-(CH2)q-、-(CH2)p-C(＝O)O-(CH2)q-或-(CH2)p-OC(＝O)-(CH2)q-，其中p和q各自独立地为0-3的整数；
X3为单键、-(CH2)r-O-、-(CH2)r-C(＝O)-、-(CH2)r-C(＝O)O-或-(CH2)r-OC(＝O)-，其中r为0–3的整数；
R2为氢原子、任选被C1-6烷酰基氨基取代的C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-14芳基、3-8元单环非芳族杂环基或三(C1-6烷基)甲硅烷基；
m为1-3的整数；和
当m为1时，m’为0或1；当m为2或3时，m’为1，
或者
(2)经由选自-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-和-OC(＝O)-中的基团而具有3～6个的直链C10-30烷基的C1-8烷烃，
并且，所述有机基团是式(III)所示的基团，
**L-Y-Z (III)
式中，
**表示与被保护的基团的键合位置；
L表示单键、或者式(a1)或(a1’)所示的基团：
Figure FDA0003166442630000102
式中，
*表示与Y的键合位置；
**与前述的定义相同；
R8和R9各自独立地表示C1-22烃基；
L1表示二价C1-22烃基；并且
L2表示单键，或者表示**C(＝O)N(R2’)-R1’-N(R3)***所示的基团，式中**表示与L1的键合位置，***表示与C＝O的键合位置，R1’表示C1-22亚烷基，R2’和R3各自独立地表示氢原子或C1-22烷基；
Y表示单键、氧原子或NR，其中R表示氢原子、烷基或C7-16芳烷基；以及
Z表示式(a2)、式(a2’)或式(a2”)所示的基团：
Figure FDA0003166442630000111
式中，
*表示键合位置；
R4为氢原子，或者当Rb为下述式(a3)所示的基团时，R4任选地与环C的R6一起表示单键或-O-、并与环A或环B及环C一起形成稠环，所述稠环为芴环或呫吨环；
k个Q各自独立地表示-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NH-或-NHC(＝O)-；
k个R5各自独立地表示直链C10-40烷基；
k表示1至4的整数；
环A和环B各自独立地除了具有k个QR5以外，任选地进一步具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基；
Ra表示氢原子、或任选被卤素原子取代的苯基；以及
Rb表示氢原子、或式(a3)所示的基团：
Figure FDA0003166442630000112
式中，*表示键合位置；
j表示0至4的整数；
j个Q各自独立地表示与前述相同的含义；
j个R7各自独立地表示经由单键或连接基键合有碳原子数为10以上的脂族烃基的烃基；
R6表示氢原子，或者任选地与环A或环B的R4一起表示单键或-O-、并且与环A或环B及环C一起形成稠环；并且
环C除了具有j个QR7以外，任选地进一步具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基，或者Ra和Rb一起形成羰基。
20.根据权利要求19所述的制备方法，其中，极性溶剂为乙腈。
21.根据权利要求19所述的制备方法，其中，步骤(5)和(6)在步骤(3)之后执行。
22.根据权利要求19所述的制备方法，该方法进一步包含下述步骤(7)：
(7)除去寡核苷酸的全部保护基，分离寡核苷酸的步骤。
23.根据权利要求19所述的制备方法，其中，非极性溶剂是选自卤系溶剂、芳族系溶剂、酯系溶剂、脂族系溶剂、以及它们的组合中的溶剂。
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