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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Polymere auf Morpholino-Basis.
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Hintergund
der Erfindung
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Polymere
welche hinsichtlich basenspezifischer Bindung an Polynukleotide
entworfen sind, besitzen ein signifikantes Potential sowohl für den in
vitro-Nachweis spezifischer genetischer Sequenzen, welche für Pathogene
charakteristisch sind, als auch für die in vivo-Inaktivierung
genetischer Sequenzen, welche viele Krankheiten – insbesondere virale Krankheiten – verursachen.
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Standardmäßige Ribo-
und Desoxyribonukleotid-Polymere sind in weitem Umfang sowohl zum
Nachweis komplementärer
genetischer Sequenzen als auch, noch kürzlicher, zur Inaktivierung
angezielter genetischer Sequenzen verwendet worden. Allerdings leiden
Standard-Polynukleotide
unter einer Anzahl von Beschränkungen,
wenn sie für
die basenspezifische Bindung an Zieloligonukleotide verwendet werden.
Diese Beschränkungen
schließen
(i) eingeschränkten
Durchtritt durch biologische Membranen, (ii) Nuklease-Empfindlichkeit,
(iii) eine Ziel-Bindung, welche gegenüber der Ionenkonzentration
empfindlich ist, und (iv) Anfälligkeit
gegenüber
zellulären
Strangtrennungsmechanismen, ein.
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Im
Prinzip können
die obenstehenden Einschränkungen
durch Entwerfen von Polynukleinsäure-Analogen überwunden
oder minimiert werden, in welchen die Basen entlang eines ungeladenen
Grundgerüsts
verbunden sind. Beispiele von ungeladenen Nukleinsäureanalogen
sind berichtet worden. Pitha et al. (1970a, b) haben eine Vielzahl
von homopolymeren Polynukleotidanalogen offenbart, in welchen das
normale Zucker-Phosphat-Grundgerüst
von Nukleinsäuren
durch ein Polyvinyl-Grundgerüst
ersetzt ist. Diese Nukleinsäureanaloge
wiesen berichtetermaßen
die erwarteten Watson/Crick-Paarungsspezifitäten mit komplemtären Polynukleotiden,
aber bei wesentlich verringerten Tm-Werten, auf (Pitha, 1970a).
Eine ernsthafte Beschränkung dieses
Vorgehens ist die Unfähigkeit,
Polymere durch sequenzielle Untereinheit-Anfügung
zu konstruieren, um Polymere mit einer gewünschten Basensequenz herzustellen.
Somit können
die Polymere nicht für
eine basenspezifische Bindung an ausgewählte Zielsequenzen verwendet
werden. Polynukleotid-Analoge, enthaltend ungeladene, aber stereoisomere,
Methylphosphonatbindungen zwischen den Desoxyribonukleosid-Untereinheiten,
sind ebenfalls berichtet worden (Miller, 1979, 1980; Jayaraman;
Murakami; Blake, 1985a, 1985b; Smith). Vor kürzerem wurde auch über eine
Vielzahl von analogen ungeladenen Phosphoramidat-verknüpften Oligonukleotidanalogen
berichtet (Froehler, 1988). Diese Polymere umfassen Desoxynukleoside,
verbunden durch die 3'-OH-Gruppe
einer Untereinheit und die 5'-OH-Gruppe einer anderen
Untereinheit über
eine ungeladene, chirale phosphorhaltige Gruppe. Von diesen Verbindungen
wurde gezeigt, an einzelsträngige
Polynukleotid-Zielsequenzen zu binden und diese selektiv zu blockieren.
Allerdings sind ungeladene phosphorverknüpfte Polynukleotidanaloge unter
Verwendung von Desoxyribonukleosid-Untereinheiten besonders kostspielig
und schwierig herzustellen; das Untereinheit-Ausgangsmaterial ist
ziemlich kostspielig und begrenzt verfügbar.
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Vor
kürzerem
sind Desoxyribonukleotid-Analoge mit ungeladenen und achiralen Untereinheit-Bindungen konstruiert
worden (Stirchak 1987). Diese ungeladenen achiralen Desoxyribonukleosid-abgeleiteten
Analoge werden, wie obenstehend erwähnt, durch die relativ hohen
Kosten der Ausgangsmaterialien eingeschränkt.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Es
ist ein allgemeines Ziel der Erfindung, ein zur sequenzspezifischen
Bindung an Polynukleotide fähiges
Polymer vorzusehen, welches viele der obenstehend angegebenen Probleme
und Einschränkungen,
die mit Polynukleotidanalog-Polymeren assoziiert sind, überwindet
oder minimiert.
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Die
Erfindung schließt
ein Polymer ein, das zur Sequenzbindung an ein einzelsträngiges Polynukleotid in
der Lage ist, umfassend Morpholino-Untereinheitsstrukturen der Form:
worin (i) die Strukturen
miteinander verbunden sind durch ungeladene, chirale Verknüpfungen,
welche den Morpholinostickstoff einer Untereinheit an den 5'-exozyklischen Kohlenstoff
einer angrenzenden Untereinheit binden, und (ii) P
i ein
Purin- oder Pyrimidinbasen-Paarungsrest
ist, welcher wirksam ist, durch basenspezifische Wasserstoffbindung
an einer Base in einem Polynukleotid zu binden,
und worin die
Verknüpfung
(i) gewählt
ist aus:
worin X F, CH
2R,
OCH
2R, -S-CH
2R oder
NR
1R
2 ist, wobei
jedes von R, R
1 und R
2 H,
CH
3 oder ein anderer Rest ist, welcher die
Zielbindung nicht stört,
Y
1 an den 5'-exozyklischen Kohlenstoff der Morpholino-Untereinheit
gebunden ist; Y
1 O, S, CH
2 oder
NR ist; und Z O oder S ist.
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Typischerweise
ist Z O, und Y1 ist O.
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Kurze Beschreibung
der Figuren
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Die 1 zeigt
eine grundsätzliche β-Morpholino-Ringstruktur,
welche durch ungeladene phosphorhaltige chirale Bindungen verknüpft ist,
wodurch das Polymer der vorliegenden Erfindung gebildet wird. Pi ist ein Purin- oder Pyrimidinbasen-Paarungsrest.
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Die 2 zeigt
mehrere exemplarische Purin- und Pyrimidinbasen-Paarungsreste (repräsentiert
als Pi der in 1 gezeigten
Ringstrukturen), worin X = H, CH3, F, Cl,
Br oder I. Typischerweise wird in dem Polymer der vorliegenden Erfindung
Pi aus den in 2 gezeigten
Gruppen gewählt.
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Die 3 zeigt
die Untereinheit, welche geeignet zur Bildung der Polymere ist,
worin X, Y und Z wie obenstehend definiert sind.
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Die 4 zeigt
ein wiederkehrendes Untereinheitssegment der Morpholino-basierenden
Polymere der Erfindung. X, Y und Z sind wie in der 3 beschaffen.
Pi und Pj sind Purin- oder Pyrimidinbasen-Paarungsreste.
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Die 5 zeigt
die Schritte in der Synthese mehrerer Typen der Morpholino-Untereinheiten
aus einem Ribonukleosid.
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Die 6 zeigt
eine alternative Synthese der grundlegenden Morpholino-Untereinheit.
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Die 7 zeigt die Bindungsweise für 2-Amin-enthaltende
Purine an polare Stellen der großen Furche von jeweiligen Zielbasenpaaren
(7a), und eine repräsentative Basensequenz eines
Doppelstrang-bindenden Polymeren (7b). In
der 7b bedeutet a = Adenin; c = Cytosin; g = Guanin;
t = Thymin; u = Uracil; D = 2,6-Diaminopurin oder 2-Aminopurin;
G = Guanin oder Thioguanin; | = Hochspezifitäts-Wasserstoffbindung; und
: = Wasserstoffbindung geringer Spezifität.
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Die 8 zeigt
zwei Verfahren zur Verknüpfung
von Morpholino-Untereinheiten durch eine Phosphoramidatbindung.
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Die 9 zeigt
die Auftragung der Wärmedenaturierung
für einen
(Morpholino)(C)6/Poly(G)-Komplex, wobei
das (Morpholino)(C)6-Polymer gemäß der vorliegenden
Erfindung konstruiert wurde.
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Die 10 veranschaulicht
die Verwendung eines Morpholino-Polymeren in einem diagnostischen Sonden-System.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Das
Polymer der vorliegenden Erfindung ist für basenspezifische Bindung
an eine Zielsequenz eines Polynukleotids entworfen.
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A. Morpholino-basierende
Untereinheiten
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Die 1 zeigt
die β-Morpholino-Ringstrukturen,
auf welchen die Polymeruntereinheiten basieren, wobei die Morpholino-Kohlenstoffatome
wie in der Stamm-Ribose numeriert sind.
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Wie
in der 1 ersichtlich, enthält die Ringstruktur ein 5'-Methylen, gebunden
an das 4'-Kohlenstoffatom in
der β-Orientierung.
Typischerweise ist das Polymer der vorliegenden Erfindung aus mindestens
3 Morpholino-Untereinheiten aufgebaut.
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Jede
Ringstruktur schließt
einen Purin- oder Pyrimidin-Rest, Pi, gebunden
an den Grundgerüst-Morpholino-Rest durch
eine Bindung in der β-Orientierung,
ein.
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Die
Purin-Wasserstoffbindungs-Reste oder -Basen schließen Purine
sowie purinartige planare Ringstrukturen mit einem 5-6-kondensierten
Ring ein, in welchem eines oder mehrere der Atome, wie N3, N7 oder
N9 durch ein geeignetes Atom ersetzt ist/sind, wie Kohlenstoff,
oder das C8 durch einen Stickstoff ersetzt ist. Die Pyrimidinreste
schließen
gleichermaßen
Pyrimidine als auch pyrimidinartige planare 6-gliedrige Ringe ein,
in denen eines oder mehrere der Atome, wie N1, durch ein geeignetes
Atom, wie Kohlenstoff, ersetzt ist. Bevorzugte Wasserstoffbindungs-Reste
in der Erfindung schließen
den in der 2 gezeigten Satz von Purinen
und Pyrimidinen ein. Jede Base schließt mindestens zwei Wasserstoffbindungs-Stellen,
welche spezifisch für
ein(e) Polynukleotid-Base oder -Basenpaar sind, ein. Falls die Polymere
für eine
sequenzspezifische Bindung an einzelsträngige Polynukleotide verwendet
werden, sind die Purinstrukturen 1 bis 3 zur Bindung an Thymin-
oder Uracil-Basen; die Strukturen 7-8 zur Bindung an Guaninbasen;
Strukturen 4-6 zur Bindung an Cytosinbasen; und die Strukturen 9
zur Bindung an Adeninbasen ausgelegt.
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Typischerweise
ist mindestens einer der Pi- oder Pj-Reste ein 2,6-Diaminopurin.
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Typischerweise
ist mindestens einer der Pi- oder Pj-Reste ein 5-Halogenuracil. Typischerweise
sind mindestens 70 % der Pi- oder Pj-Reste 2-Amin-enthaltende Purine.
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Die
Polymere der Erfindung sind auch effektiv zur Bindung an Wasserstoffbindungs-Stellen,
welche über
die große
Furche in doppelsträngigen
Polynukleotiden zugänglich
sind, welche hauptsächlich
Purinbasen in einem Strang und hauptsächlich Pyrimidinbasen im komplementären Strang
aufweisen, wie nachstehend erörtert
wird.
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Wegen
des ähnlichen
Typs und der Positionierung der zwei zentralen polaren Große-Furche-Stellen unter den
verschiedenen Basenpaaren von doppelsträngigen Nukleinsäuren (d.h.
das NH4 und O6 eines CG-Basenpaares, vorliegend in derselben H-Bindungsanordnung
wie das NH6 und O4 eines AT-Basenpaars) muß der H-Bindungs-Rest eines
doppelstrangbindenden Polymeren eine Wasserstoffbindung an das N7
seines Zielbasenpaares eingehen, um ein gegebenes Basenpaar in einem
genetischen Zieldoppelstrang eindeutig zu erkennen. In den Polymeren
der vorliegenden Erfindung, welche gegen doppelsträngige genetische
Sequenzen gerichtet sind, die vorwiegend Purine in einem Strang
und vorwiegend Pyrimidine in dem anderen Strang enthalten, enthalten
somit die Wasserstoffbindungs-Reste des Polymeren vorzugsweise Purine
mit einem Amin an der 2-Position, da dieses Amin geeignet für die H-Bindung
an das N7 des Zielbasenpaars positioniert ist. Genauer gesagt, ermöglichen
die Strukturen 2 und 3 von 2 eine spezifische
Bindung an ein TA- oder UA-Basenpaar, während die Strukturen 4 und
6 eine spezifische Bindung an ein CG-Basenpaar vorsehen. Zwei Basen,
welche besonders nützlich
in einem Doppelstrang-bindenden Polymer sind, sind 2,6-Diaminopurin
(Struktur 3) und Guanin (Struktur 4). Die 7A veranschaulicht
die Bindung dieser zwei Basen an die polaren Stellen der großen Furche
ihrer jeweiligen Zielbasenpaare in doppelsträngigen Nukleinsäuren. Die 7B veranschaulicht
eine repräsentative
Basensequenz eines Polymeren, entworfen zur Bindung einer genetischen
Zielsequenz im doppelsträngigen
Zustand.
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Die
Morpholino-Untereinheiten der vorliegenden Erfindung werden zur
Bildung von Polymeren durch Verknüpfen der Untereinheiten durch
stabile, chirale, ungeladene Verknüpfungen der Formel
vereinigt.
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Die
Auswahl von Untereinheit-Verknüpfungsgruppen
zur Verwendung bei der Polymersynthese wird von mehreren Erwägungen geleitet.
Das anfängliche
Screening vielversprechender Zwischen-Untereinheit-Verknüpfungen
(d.h. diejenigen Verknüpfungen,
welche der Vorhersage nach nicht unstabil sind und welche entweder
eine freie Rotaion um die Bindung erlauben oder welche in einer
einzigen Konformation vorliegen) beinhaltet typischerweise die Anwendung
von Raumerfüllungs-CPK
oder Computer-Molekülmodellen von
doppelsträngiger
DNA oder RNA. Die DNA- und RNA-Doppelstränge werden gemäß Parametern
konstruiert, welche durch Röntgenstrahlbeugung
von Oligodesoxyribonukleotiden in der B-Form und Oligoribonukleotid-enthaltenden
Doppelsträngen
in der A-Form bestimmt werden.
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In
jedem dieser konstruierten Doppelstränge wird eines der zwei Zucker-Phosphat-Grundgerüste entfernt,
und das prospektive Grundgerüst,
einschließlich
des Morpholino-Rings und der Zwischen-Untereinheit-Bindung, wird,
falls möglich,
auf den Stellen der Basen, von denen das ursprüngliche Zucker-Phosphat-Grundgerüst entfernt
worden ist, ersetzt. Jeder resultierende Polynukleotid/Polymer-Doppelstrang
wird dann hinsichtlich der Koplanarität der Watson/Crick-Basenpaare,
Verdrillungs- und Winkelspannung im prospektiven Bindungs-Polymergrundgerüst, dem
auf den Nukleinsäurestrang
ausgeübten
Grad an Verzerrung, und hinsichtlich Nicht-Bindungs-Wechselwirkungen
zwischen den Strängen
und innerhalb der Stränge
untersucht.
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Anfängliche
Untersuchungen dieses Typs, welche zur Unterstützung der Erfindung durchgeführt wurden,
zeigen, daß ein
Morpholino-basierendes Polymer eine bevorzugte Grundgerüst-Einheits-Länge (d.h.
die Zahl von Atomen in einer wiederkehrenden Grundgerüstkette
im Polymer) von 6 Atomen aufweist.
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Da
die Morpholinostruktur selbst 4 Atome zu jeder wiederkehrenden Grundgerüsteinheit
beiträgt,
steuern die Bindungen in dem sechs-atomigen wiederkehrenden Einheiten-Grundgerüst zwei
Atome zur Grundgerüstlänge bei.
In allen Fällen
ist die Bindung zwischen den Ringstrukturen (a) ungeladen, (b) chiral,
(c) stabil und muß (d)
die Annahme einer Konformation zulassen, welche geeignet zur Bindung
an das Ziel-Polynukleotid ist.
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Untereinheit-Grundgerüststrukturen,
welche in den obenstehenden Modellierungsuntersuchungen als annehmbar
beurteilt wurden, werden dann hinsichtlich der Durchführbarkeit
der Synthese überprüft. Die
tatsächliche
chemische Stabilität
der Zwischen-Untereinheit-Bindung wird oft mit Modell-Verbindungen
oder -Dimeren überprüft.
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Die 3 zeigt
den in der vorliegenden Erfindung verwendeten β-Morpholino-Untereinheittyp,
einschließlich
einer Verbindungsgruppe, welche den obenstehend aufgeführten Beschränkungen
und Anforderungen genügt.
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Die
in der 3 gezeigte Untereinheit ist für 6-atomige Wiederholungs-Einheits-Grundgerüste entworfen,
wie gezeigt in der 4. Die Y1-Gruppe,
welche das 5'-Morpholino-Kohlenstoffatom an
die Phosphorgruppe bindet, kann Schwefel, NR, wobei R wie obenstehend
definiert ist, CH2 oder vorzugsweise Sauerstoff
sein. Der X-Rest, welcher an dem Phosphor hängt, ist wie obenstehend definiert
beschaffen.
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In
dem Polymer der Erfindung ist die Verknüpfung typischerweise von folgender
Form:
worin P
j ein
Purin- oder Pyrimidinbasen-Paarungsrest ist, der wirksam ist, durch
basenspezifische Wasserstoffbindung an eine Base in einem Polynukleotid
zu binden.
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Eine
andere typische Verknüpfung
ist eine Verknüpfung
der Form:
worin P
j ein
Purin- oder Pyrimidinbasen-Paarungsrest ist, der wirksam ist, durch
basenspezifische Wasserstoffbindung an eine Base in einem Polynukleotid
zu binden.
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B. Untereinheit-Synthese
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Die
wirtschaftlichsten Ausgangsmaterialien für die Synthese von Morpholino-Untereinheiten
sind im allgemeinen Ribonukleoside. Typischerweise werden Ribonukleoside,
enthaltend Wasserstoffbindungs-Reste oder Basen (d.h. A, U, G, C),
synthetisiert, um einen vollständigen
Satz von Untereinheiten für
die Polymersynthese vorzusehen. Wo ein geeignetes Ribonukleosid
nicht verfügbar
ist, kann eine 1-Halogenribose oder, vorzugsweise, ein 1α-Bromglucose-Derivat an eine geeignete
Base gebunden werden, und dieses Nukleosidanalog dann zu der gewünschten β-Morpholino-Struktur über Periodat-Spaltung
und Schließen
des resultierenden Dialdehyds auf einem geeigneten Amin umgewandelt
werden.
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Aufgrund
der Reaktivität
der für
Untereinheit-Synthese, -Aktivierung und/oder -Kopplung verwendeten Verbindungen,
ist es im allgemeinen wünschenswert
und häufig
notwendig, die exozyklischen Ring-Stickstoffe der Basen zu schützen. Die
Auswahl dieser Schutzgruppen wird bestimmt durch (i) die relative
Reaktivität
des zu schützenden
Stickstoffs, (ii) den bei Untereinheit-Synthese und -Kopplung beteiligten
Typ von Reaktionen, und (iii) die Stabilität des vervollständigten
Polymers vor der Basen-Entschützung.
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Verfahren
zur Basenschützung
einer Anzahl von gewöhnlicheren
Ribonukleosiden sind im Beispiel 1 angegeben. Die in dem Beispiel
ausgeführten
Verfahren sind im allgemeinen zur Bildung von Nukleosiden mit Aminschutzgruppen
anwendbar. Für
die Nukleinsäurechemie
verwendete, standardmäßige Basenschutzgruppen
sind oftmals geeignet, wobei die folgenden Gruppen eingeschlossen
sind: Benzoyl für
das N4 von C; Benzoyl oder p-Nitrobenzoyl für das N6 von Adenin (A); Acetyl,
Phenylacetyl oder Isobutyryl für
das N2 von Guanin (G); und N2, N6-Bis(isobutyryl) für 2,6-Diaminopurin-Reste.
Diese Schutzgruppen können
nach dem Polymerzusammenbau durch Behandlung mit Ammoniumhydroxid
entfernt werden.
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Es
ist manchmal wünschenswert,
den Basenanteil der Morpholino-Untereinheit mit einer Gruppe zu schützen, welche
leicht durch etwas Anderes als eine nukleophile Base entfernt werden
kann. Geeignete Basenschutzgruppen, entfernbar durch eine starke
nicht-nukleophile Base über
einen β-Eliminierungs-Mechanismus,
schließen
ein: 2-(4-Nitrophenyl)ethoxycarbonyl oder 2-(Phenylsulfonyl)ethoxycarbonyl
für sowohl
das N4 von C als auch das N6 von A; und das 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
für das
N2 von G und das N2 und N6 von 2,6-Diaminopurin. Diese Gruppen können nach
dem Polymerzusammenbau durch Behandlung mit der starken nicht-nukleophilen
Base 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]-undec-7-en (DBU) unter strikt wasserfreien
Bedingungen entfernt werden.
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Die
Synthesen von repräsentativen
Morpholino-Untereinheiten sind insbesondere in den Beispielen 2-7
beschrieben. Unter Bezugnahme auf das in der 5 abgebildete
Syntheseschema wird ein Basen-geschütztes Ribonukleosid mit Natriumperiodat
behandelt, um ein vorübergehendes
2',3'-Dialdehyd zu bilden, welches
sich dann auf Ammoniak hin unter Bildung eines Morpholino-Rings
schließt,
der 2'- und 3'-Hydroxylgruppen
aufweist (numeriert wie in der Stamm-Ribose, siehe 1).
Die Verbindung wird dann mit Natriumcyanborhydrid behandelt, um
die Ring-Hydroxylgruppen zu reduzieren. Der Ringstickstoff wird
vorzugsweise durch Trityl-Derivatisierung oder durch eine Benzhydraloxycarbonyl-Gruppe
für die
anschließende
Untereinheit-Kopplung geschützt.
Die Schutzgruppe kann durch Umsetzen der Morpholino-Untereinheit mit
Tritylchlorid oder mit Nitrophenylbenzhydrylcarbonat oder durch
Umsetzen des Dialdehyds mit einem primären Amin, wie veranschaulicht
in 6 und beschrieben im Beispiel 3, angefügt werden.
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Die
Stereochemie des Nukleosid-Ausgangsmaterials wird beibehalten, solange
der pH-Wert der Reaktionsmischung im Iminium-Stadium nicht über etwa
10 oder unter etwa 4 hinausgehen gelassen wird.
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Die
obenstehende Synthese führt
zu einem Morpholino-Ring mit einem verfügbaren 5'-Hydroxyl.
Das 5'-Hydroxyl
kann in andere aktive Gruppen, einschließlich 5'-Amin und Sulfhydral, umgewandelt werden
(Beispiel 4).
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In
der obenstehenden Morpholino-Synthese kann eine Vielzahl von Stickstoffquellen
verwendet werden – wobei
insbesondere Ammoniak, Ammoniumhydroxid, Ammoniumcarbonat und Ammoniumbicarbonat eingeschloßen sind.
Die besten Ergebnisse werden erhalten, wenn die Reaktionslösung während der
Oxidations- und Morpholino-Ringschluß-Reaktionen nahe der Neutralität gehalten
wird. Dies kann durch kontinuierliches Titrieren der Reaktionsmischung
oder, noch zweckmäßiger, durch
Verwenden von Ammoniumbiborat als der Ammoniakquelle erfolgen. Wenn
die Lösung
zu sauer ist, ist die Produktausbeute gering, und wenn sie zu basisch
ist, werden Nebenprodukte (möglicherweise
aufgrund der Epimerisierung der 1'- und/oder 4'-Kohlenstoffe) hergestellt, welche schwierig
von dem gewünschten
Produkt zu trennen sind. Das Reduktionsmittel kann vor, während oder
nach dem Oxidationsschritt, mit geringem bemerkbaren Effekt auf
die Produktausbeute, zugesetzt werden.
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Ribonukleoside,
denen Basenschutzgruppen fehlen, können ebenfalls in wäßriger Lösung erfolgreich oxidiert,
einem Ringschluß unterworfen,
und reduziert werden, um den Morpholinoring zu erzeugen. Allerdings steigt
ohne Basenschutz die Anzahl und Menge unerwünschter Nebenprodukte häufig an,
insbesondere im Fall von Cytidin.
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Die
durch die obenstehenden Verfahren gebildeten Untereinheiten enthalten
ein 5'-OH, -SH oder -Amin,
welches modifiziert, umgesetzt und/oder aktiviert wird, wie nachstehend
beschrieben, um zur Kopplung an eine zweite Morpholino-Untereinheit
geeignet zu sein.
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C. Aktivierungs- und Kopplungsreaktionen
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Die
wie obenstehend hergestellten Untereinheiten werden in einer regulierten
sequenziellen Weise, häufig
durch Aktivieren des 5'-Hydroxyls
einer Untereinheit (welche einen geschützten Morpholino-Stickstoff aufweist)
und Kontaktieren dieser aktivierten Untereinheit mit einer anderen
Untereinheit, welche einen ungeschützten Morpholino-Stickstoff
aufweist, gekoppelt, wie beschrieben im Beispiel 5. Es wird erkannt
werden, daß verschiedene
Typen von Bindungen, wie diejenigen, welche nachstehend veranschaulicht
sind, bei der Konstruktion eines einzelnen Polymeren verwendet werden
können.
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Die
einfachsten Bindungspolymere vom Morpholino-Typ sind Carbamat-verknüpfte Polymere,
worin der Morpholino-Stickstoff durch ein Carbonyl an den 5'-Sauerstoff einer
anderen Untereinheit verknüpft
ist. Zur Unterstützung
der vorliegenden Erfindung durchgeführte Experimente zeigen, daß ein solches
Polymer wirksam an eine einzelsträngige DNA-Zielsequenz bindet.
Allerdings zeigte das Polymer in Bindungsuntersuchungen mit einem
RNA-Ziel eine ungewöhnliche
Bindung, wie verdeutlicht durch ein in hohem Maße atypisches Hypochromie-Profil
im Spektralbereich von 320 bis 230 nm und das Fehlen einer normalen
Wärmedenaturierung.
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Frühere Modellierungsuntersuchungen
zeigten, daß in
einem Carbamat-verknüpften
Polymer, gebunden an DNA, welche in einer B-Konformation vorliegt,
das Grundgerüst
des Polymeren eine angemessene Länge
für die
Bindung bereitstellt, und die Carbamat-Reste des Polymergrundgerüstes eine
nahezu planare Konformation einnehmen können. Dieses Modellierungs-Ergebnis stand in
guter Übereinstimmung
mit der effektiven Bindung der Carbamat-verknüpften Polymeren an DNA. Im
Gegensatz dazu legten ähnliche
Modellierungsuntersuchungen nahe, daß die Bindung des Carbamat-verknüpften Polymeren
an ein RNA-Ziel eines aus dem nachfolgenden erfordert: (i) die Carbamatbindung
des Polymeren nimmt eine im wesentlichen nicht-planare Konformation
ein, oder (ii) die RNA-Zielsequenz nimmt eine gespannte Konformation
ein, in welcher die Basen-Stapel-Wechselwirkungen ziemlich verschieden
von denjenigen in einer normalen A-Konformation sind. Diese Beobachtung
kann die atypische Bindung eines Carbamat-verknüpften Polymeren an eine RNA-Ziesequenz
erklären.
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Die
Modellierungsarbeiten zeigten fernerhin, daß das Ersetzen des Carbonyl-Zwischen-Untereinheit-Bindungsrests
entweder durch eine achirale sulfonylhaltige Zwischen-Untereinheit-Bindung oder durch eine
chirale phosphorhaltige Bindung eine zusätzliche Länge von etwa 0,32 Angström pro Zwischen-Untereinheit-Bindung
vorsehen wird. Derartige Bindungen würden auch eine größere Rotationsfreiheit
um die Schlüssel-Bindungen
sowie Bindungswinkel der Zwischen-Untereinheit-Bindung vorsehen,
welche kompatibel mit einer Oligomergrundgerüst-Konformation sind, die geeignet
für die
Paarung sowohl an RNA- als auch DNA-Zielsequenzen in ihren Standardkonformationen
ist.
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Die
Phosphoramid-Bindung in den in der 4 gezeigten
Polymeren der Erfindung (6-atomiges
Einheits-Längen-Grundgerüst) kann
gemäß den in
der 8 gezeigten und im Beispiel 5 ausführlich dargestellten Reaktionsschemen
gebildet werden. Das 5'-Hydroxyl
einer geschützten
Untereinheit (Struktur 4 von 5) wird
mit einer geeigneten phosphorhaltigen Verbindung, wie Dichlor-N,N-dimethylaminophosphat,
umgesetzt, was zu einer aktivierten Untereinheit führt. Die
Untereinheit wird dann mit einer zweiten Untereinheit mit einem ungeschützten Morpholino-Ring-Stickstoff
umgesetzt. Eine große
Zahl von Variationen sind in dem anhängigen X-Rest möglich, und,
wie im Beispiel 5 beschrieben, beeinflußt die Identität des X-Restes die Einfachheit der
Aktivierung und Kopplung, die Stabilität der resultierenden Bindung
und zu einem gewissen Ausmaß die Ziel-Bindungsaffinität.
-
In
dieser Synthese ist die P=O-Gruppe im wesentlichen mit der P=S-Gruppe
austauschbar; Reaktionen mit der Einen sind im allgemeinen auf die
Andere anwendbar.
-
Ein
alternatives Verfahren zur Bildung der Phosphoramidbindungen besteht
darin, Carbodiimid-Kopplung zu verwenden: ein beispielhaftes Carbodiimid
ist Dicyclohexylcarbodiimid (DCC). Carbodiimid-Kopplung wird in
Beispiel 5 beschrieben. Durch Nutzen einer Beobachtung von Smith
et al. (1958) kann das Carbodiimid-Reagenz auch verwendet werden,
um: (a) einen Phosphor-(oder Thiophosphor-)Verknüpfungsrest an eine Untereinheit
anzufügen;
oder (b) einen anhängenden
X-Rest an einen Phosphor-(oder Thiophosphor-)Verknüpfungsrest
zu binden.
-
Zusätzliche
Phosphoramidbindungen können
gebildet werden durch Umwandeln des 5'-Hydroxyls
in andere funktionelle Gruppen (z. B. SH, CH2,
NR), vor Aktivieren und Koppeln der Untereinheiten zu Polymeren.
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D. Zusammenbau von Polymeren
-
Nach
Auswählen
einer gewünschten
Polymerlänge
und Erkennungs-Rest-Sequenz (Richtlinien hierfür sind nachstehend angegeben)
wird das Polymer unter Anwendung der obenstehend beschriebenen allgemeinen
Verfahrensweisen zusammengesetzt. Ein Verfahren zum Polymerzusammenbauen
beinhaltet die anfängliche
Herstellung eines passenden Satzes von Oligomerblöcken und
dann die Verknüpfung
dieser Blöcke
unter Bildung des Polymers mit der letztendlichen Länge. Die
in der Polymersynthese verwendeten Oligomerblöcke müssen nicht von gleicher Größe sein.
Diese Blöcke
werden in Lösung
hergestellt, im wesentlichen gemäß den Kopplungsverfahren,
die unter Bezugnahme auf die Beispiele 6 und 7 beschrieben werden.
Das Beispiel 7 beschreibt eine derartige Blocksynthese unter Bildung
eines Pentameren.
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Ein
besonderer Vorteil dieses Block-Zusammenbauverfahrens besteht darin,
daß jegliche
Kopplungsfehler beim Zusammenbau des Vollängen-Polymeren Fehlsequenzen
erzeugen, welche leicht von dem gewünschten Polymer getrennt werden.
Das Beispiel 6 schildert ausführlich
den Zusammenbau eines einfachen Homopolymeren durch dieses Verfahren.
Das Beispiel 7 beschreibt die Herstellung eines Blocks, der geeignet zur
Verwendung in einem Heteropolymeren ist. Die Beispiele 8 und 9 beschreiben
den Zusammenbau von Blöcken
unter Bildung eines biologisch aktiven Heteropolymers. Somit beschreiben
die Beispiele 7, 8 und 9 zusammen eine Synthese-Vorgehensweise,
welche eine Kombination von Zusammenbauverfahren anwendet, worin
Oligomerblöcke
schrittweise in Lösung
zusammengebaut werden, und dann diese Oligomere zu Vollängen-Polymeren
verknüpft
werden.
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Typischerweise
ist das Polymer der Erfindung an einen festen Träger gebunden. Die Polymere
können durch
schrittweise Untereinheit-Addition auf einem festen Träger synthetisiert
werden, wie es in Beispiel 10 beschrieben wird.
-
Typischerweise
wird ein fester Träger,
wie Glasperlen, derivatisiert mit säurestabilen, langkettigen spaltbaren
Linkern bzw. Abstandhaltern als das Trägermaterial für Festphasensynthesen
verwendet und für die
Anheftung der/des ersten Untereinheit, oder Blocks von Untereinheiten,
vorbereitet, wie beschrieben in den Beispielen 9 und 10. Die Glasperlen
werden mit einer Untereinheit umgesetzt, welche im allgemeinen eine leicht
abspaltbare Schutzgruppe auf einem Stickstoff aufweist. Ob die Morpholino-Untereinheit
an den Träger über ihren
Morpholino-Stickstoff
oder eine Gruppe an der 5'-Position
verknüpft
ist, hängt
von der Richtung der Polymersynthese ab, d.h. an welche Gruppe die
nächste
Untereinheit gebunden werden wird.
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Nach
Kopplung der/des zweiten Untereinheit (oder Oligomers, welches in
Lösung
zusammengebaut werden kann) an den Träger können jegliche nicht-umgesetzten
nukleophilen Stellen durch Zusetzen eines geeigneten Verkappungsreagenz,
wie p-Nitrophenylacetat oder Essigsäureanhydrid, mit Kappen versehen
werden, und danach wird der Träger
gewaschen. Die Schutzgruppe auf dem Stickstoff der endständigen Untereinheit
wird entfernt, typischerweise durch Säurebehandlung, und nach der
Neutralisation wird der Träger
mit einem Überschuß der nächsten Untereinheit
(oder Polymereinheit) in der Sequenz umgesetzt, welche durch eines
der obenstehend angegebenen Verfahren aktiviert ist. Ein Merkmal
des Festphasen-Zusammenbauverfahrens unter Anwendung schrittweiser
Additionen von monomeren Untereinheiten ist die Notwendigkeit nach hohen
Kopplungseffizienzen bei jedem Untereinheit-Additionsschritt. Diese
hohe Kopplungseffizienz wird im allgemeinen durch Zusetzen eines Überschusses
der aktivierten Untereinheit erzielt, was die Anzahl von an den
Träger
gebundenen Ketten, welche einer Kettenverlängerung unterliegen, maximiert.
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Die
Kettenverlängerung
wird auf diese Weise fortgesetzt, unter wahlfreier Kappen-Abdeckung
von Fehlsequenzen nach jeder Untereinheitaddition, bis das Polymer
mit der gewünschten
Länge und
Sequenz erzielt wird.
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Nach
Addition der letzten Untereinheit kann der endständige Grundgerüstrest mit
einer geeigneten geladenen oder ungeladenen Gruppe umgesetzt werden,
wie beschrieben im Beispiel 6. Das Polymer wird dann vom Träger abgespalten,
z. B. durch Behandlung entweder mit Ammoniumhydroxid oder einer
nicht-nukleophilen Base, geeignet zur Bewirkung von β-Elimination
in dem Linker, der das Polymer an den Träger bindet. Die Basen werden
entschützt
und das Polymer wird gereinigt, wie nachstehend und in den Beispielen
6, 8, 9 und 10 beschrieben.
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E. Polymerverarbeitung
und -Reinigung
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In
Lösung
zusammengebaute Bindungspolymere (Beispiele 6 und 8) werden typischerweise
Basen-entschützt
durch Suspendieren in DMSO oder DMF und Aufschichten auf die Suspension
eines gleichen Volumens von konzentriertem Ammoniumhydroxid. Die
Präparation
wird verschlossen und dann unter Schütteln vermischt und 16 Stunden
lang bei 30°C
inkubiert. Die Aufarbeitung beinhaltet das Entfernen des Ammoniaks
unter verringertem Druck. Wenn eine Schutzgruppe (im allgemeinen
Trityl oder ein verwandter säurelabiler
Rest) vorhanden ist, wird diese Gruppe abgespalten, und die Rohpolymer-Präparation
wird zur Reinigung in dem passenden Puffer suspendiert.
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Durch
ein Festphasenverfahren zusammengebaute Bindungspolymere (Beispiele
9 und 10), wobei sie über
eine Esterbindung an den Träger
gebunden sind, können
von dem Träger
durch Suspendieren des getrockneten Trägers in DMSO, Aufschichten
auf ein gleiches Volumen an konzentriertem NH4OH,
festem Verschließen
und langsamem Bewegen während
16 Stunden bei 30°C
abgespalten werden. Das feste Trägermaterial
wird durch Filtration entfernt, und das Filtrat wird wie obenstehend
beschrieben behandelt.
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Alternativ
dazu können
Bindungspolymere, welche an den Träger über einen β-Eliminierungsempfindlichen
Linker gebunden sind, von dem Träger
abgespalten werden unter Verwendung einer starken nicht-nukleophilen
Base 1,8-Diazubicyclo(5.4.0.)undec-7-en (DBU) in DMF. Unter Verwendung
dieser Vorgehensweise kann man das Polymer freisetzen, wobei seine
Basen noch geschützt
sind, und somit ist das Polymer geeignet für eine weitere Modifikation
und/oder Struktur-Bestätigung
mittels Massenspektroskopie durch Beschuß mit schnellen Atomen.
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Die
Reinigung des Basen-entschützten
Polymeren wird vorzugsweise bei pH 2,5 oder pH 11 ausgeführt, abhängig vom
pK der Basenreste in dem Polymer. Bei pH 2,5 tragen Cytosin-, Adenin-
und 2,6-Diaminopurin-Reste eine positive Ladung, und Guanin trägt eine
teilweise positive Ladung. Bei pH 11 tragen Guanin, Uracil und Hypoxanthin
eine negative Ladung. Für
Polymere, in denen etwa 30 % oder mehr der Basenpaarungs-Reste bei
pH 2,5 ionisiert sind, kann die Reinigung durch Kationenaustausch
auf einer Säule
von S-Sepharose-"Fast-Flow" (Pharmacia) durchgeführt werden,
welche mit einem flachen NaCl-Gradienten, gepuffert bei pH 2,5,
entwickelt wird. Der Ausfluß wird
bei 254 nm überwacht
und in einem Fraktionensammler aufgefangen. Das Vollängenpolymer,
welches nach den kürzeren
Fehlsequenzen eluiert, kann auf einer Säule aus Polypropylen von Chromatographie-Güteklasse
(Polysciences Inc.) weiter gereinigt und entsalzt werden, wobei
mit einem wäßrigen Gradient
von Acetonitril oder Methanol eluiert wird, das mit Ameisensäure auf
pH 2,5 eingestellt ist, und wobei das Eluat bei 254 nm überwacht
wird. Die Fraktionen mit dem reinen Produkt werden neutralisiert
und unter verringertem Druck getrocknet. Salze können durch Lösen des
Polymeren in Trifluorethanol, Filtrieren und Verdampfen des Trifluorethanols
beseitigt werden.
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Für Polymere,
in welchen etwa 30 % oder mehr der Basenpaarungs-Reste bei pH 11
ionisiert sind, kann die Reinigung durchgeführt werden auf einer Anionenaustauschersäule von
Q-Sepharose-"Fast-Flow" (Pharmacia), entwickelt
mit einem wäßrigen pH
11-Gradient von NaCl. Das Vollängenpolymer,
welches nach kürzeren
Fehlsequenzen eluiert, wird auf einer Polypropylen-Säule, eluiert
mit einem wäßrigen pH
11-Gradient von Acetonitril, weiter gereinigt und entsalzt. Fraktionen,
die das reine Produkt enthalten, werden wie obenstehend verarbeitet.
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Die
obenstehend beschriebenen Reinigungsverfahren sollten so durchgeführt werden,
daß Polymere, welche
Adenin-Basenpaarungsreste enthalten, nicht für mehr als einige wenige Stunden
bei Raumtemperatur einem pH-Wert von 11 ausgesetzt werden, um mögliche Basen-Labilitäts-Probleme
zu vermeiden. Die Details der Reinigungsverfahren sind in den Beispielen
6, 8 und 9 angegeben.
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In
neutraler wäßriger Lösung können diese
Morpholino-Polymere eine geringere Löslichkeit, als erwünscht, aufweisen.
Folglich schließt
das Polymer der Erfindung typischerweise fernerhin einen Rest an
einem oder beiden Enden ein, welcher wirksam ist, um die Löslichkeit
des Polymeren in wäßrigem Medium
zu verstärken.
Typischerweise ist der Rest an einem oder beiden Enden Polyethylenglykol.
Für die
meisten der hierin offenbarten Polymertypen kann die Hinzufügung des
Restes bewerkstelligt werden durch Abspalten der endständigen Grundgerüst-Schutzgruppe von
dem vervollständigten
Polymer und Umsetzen des Polymers, wobei die Basen noch im geschützten Zustand
sind, mit einem Überschuß an Carbonyldiimidazol-aktiviertem Polyethylenglykol
(PEG). Danach wird das Bindungspolymer mit Ammoniumhydroxid behandelt,
um die basengeschützten
Gruppen zu entfernen, und das Polymer wird, wie obenstehend, gereinigt.
Der Spiegel an Solubilisierung wird durch die passende Wahl des
PEG-Materials ohne
weiteres eingestellt. Geeignete PEG-Fraktionen mit durchschnittlichen
Molekulargewichten von 200, 400, 600, 1000, 1540, 3400, 4000, 6000,
7500 und 18 500 Dalton sind im Handel erhältlich (z. B. Polysciences,
Inc.), wobei PEG 1000 oft die beste Solubilisierung ergibt. Der
solubilisierende Rest kann, falls gewünscht, über eine spaltbare Bindung
an das Polymer gebunden werden, um zu gestatten, daß das Polymer
von dem Solubilisierungsmittel freigesetzt wird, z. B. durch Esterase-
oder Peptidase-Enzyme.
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Es
ist davon auszugehen, daß das
Polymer gemäß bekannten
Verfahren weiter derivatisiert oder markiert werden kann. Zum Beispiel
kann das Polymer durch Herstellen der Polymer-Untereinheiten aus radioaktiv markierten
Ribonukleosiden oder durch Anheften einer radioak tiv markierten
Aminosäure
an ein Ende radioaktiv markiert werden. Das Polymer kann ohne weiteres,
z. B. unter Anwendung von Modifikationen der obenstehenden Untereinheit-Kopplungsreaktionen,
mit Enzymen, chromophoren Gruppen oder dergleichen, derivatisiert
werden, falls das Polymer als eine diagnostische Sonde verwendet
werden soll. Ferner kann das Polymer mit Biomolekülen derivatisiert
werden, welche dazu dienen, die Polymere zu spezifischen Geweben
oder Zelltypen zu lenken.
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F. Strukturelle Charakterisierung
-
Vollständig-geschützte Bindungspolymere
von mäßiger Größe (10 bis
20 Untereinheiten) ergeben oft ein starkes molekulares Ion in der
FAB (Beschuß mit
schnellen Atomen)-Massenspektroskopie,
was eine Schlüssel-Bestätigung der
Polymerlänge
bereitstellt.
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Ferner
liefert COSY-NMR (zweidimensionale korrelierte Spektroskopie) des
entschützten
und gereinigten Polymeren Informationen über das Verhältnis der
unterschiedlichen Basen-paarenden
Reste in dem Polymer sowie quantitative Informationen über das
Verhältnis
von Bindungspolymer zu irgendwelchen solubilisierenden Resten oder
einem anderen Typ zugehörigen
Resten, welche daran gebunden worden sein können.
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Die
Beweglichkeiten auf Ionenaustauscher-Säulen geben ebenfalls Informationen über die
Zahl von C + A-Basenpaarungs-Resten in einem Polymer, wenn die Reinigung
bei pH 2,5 ausgeführt
wird, und Informationen über
die Zahl von G + U-Resten, wenn die Reinigung bei pH 11 durchgeführt wird.
Die Struktur-Bestätigung
ist am einfachsten, wenn die Polymere aus Oligomerblöcken zusammengebaut
worden sind, wie in den Beispielen 6, 8 und 9, da dann jedwede Fehlsequenzen
sich noch wesentlicher von den Vollängen-Sequenzen unterscheiden.
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Die
UV-Profile der Polymere bei pH 1, 7 und 13 können Informationen über die
relative Nukleotidzusammensetzung des Polymeren geben.
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Die
Bewertung der Affinität
eines Morpholino-basierenden Polymers für seine Zielsequenz wird durch Untersuchen
der Schmelzkurve des Polymer/Ziel-Doppelstrangs durchgeführt, wie
veranschaulicht in Beispiel 6. Ferner können Vergleiche zwischen der
Schmelzkurve eines regulären
Nukleinsäuredoppelstrangs
(wie p(dC)6/p(dG)6)
und der Schmelzkurve eines Hybrid-Doppelstrangs, enthaltend ein entsprechendes
Morpholino-basierendes Polymer (wie (Morpholino C)6/p(dG)6) vorgenommen werden.
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Die
obenstehenden Charakterisierungsschritte sind bei einem Morpholino-basierenden
Phosphordiamidat-verknüpften
Poly(C)-Hexamer angewandt worden, wobei Y Sauerstoff ist, X N(CH3)2 ist und Z Sauerstoff ist,
wie beschrieben in Beispiel 6. Die Charakterisierung des Vollängen-Oligomers
wurde durch Protonen-NMR und Negativ-Ionen-FAB-Massenspektroskopie
erreicht. Mit diesen Morpholino-Oligomeren ist die Fragmentierung
der Oligomere in großem
Maße unterdrückt, so
daß wenig
Sequenzinformation erhältlich
ist. Allerdings ist das Eltern-Ionensignal ziemlich stark und gestattet
eine Bestätigung
der Zusammensetzung des Morpholino-Oligomers (siehe Beispiel 6).
Um die Wasserlöslichkeit
zu erhöhen,
wurde ein Polyethylenglykol(PEG)-Schwanz an die Oligomere angeheftet.
5 Äquivalente
von PEG 1000 wurden mit einem Äquivalent Bis(p-nitrophenyl)carbonat
behandelt, um monoaktiviertes PEG zu ergeben. Die Detritylierung
des Hexamers mit 1 %iger Essigsäure
in Trifluorethanol führte
zu einem freien Morpholino-Ringstickstoff. Die Behandlung des Hexameren,
enthaltend das freie Amin, mit aktiviertem PEG 1000 unter Standard-Kopplungsbedingungen führte zur
Anheftung des PEG-Schwanzes an das Hexamer. Die Basen wurden durch
Behandlung des "getailten" bzw. mit einem Schwanz
versehenen Hexameren mit konzentriertem Ammoniak während 24
Stunden entschützt.
Das getailte Hexamer wurde in einem Puffer von pH 2,5 aufgenommen
und durch Kationenaustauschchromatographie auf S-Sepharose-Fast-FlowTM gereinigt, wobei mit einem Kaliumchlorid-Gradienten
eluiert wurde. Nach der Neutralisierung wurde das Elutionsmittel
auf einer Polypropylen-Säule
entsalzt, wobei mit einem Wasser/Acetonitril-Gradienten eluiert
wurde. Man stellte fest, daß das
getailte Hexamer in einem Puffer von pH 7,5 frei löslich war.
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Die
Stabilität
von Komplexen des getailten Hexameren mit komplementären Nukleinsäuren wurde durch
Wärmedenaturierungsexperimente
untersucht. Differenz-Spektren zwischen gemischten und ungemischten
Proben des getailten Hexameren und dem ausgewählten Phosphodiester-Komplementär wurden von
14°C bis
85°C über den
Bereich von 320 bis 260 nm erhalten (siehe Beispiel 6). Bei 60 Mikromolar
C-Monomer und 60 Mikromolar G-Monomer ergab das Differenz-UV-Spektrum
des getailten Hexameren (morphC)6 mit Poly(dG)
einen Tm-Wert von 79°C. Das entsprechende (morphC)6 mit Poly(G) ergab einen Tm-Wert
von 51,5°C
(siehe Beispiel 6 und 9).
-
G. Diagnostische Anwendungen
-
Die
zielspezifischen Polymere der Erfindung können in einer Vielzahl von
diagnostischen Assays zum Nachweis von RNA oder DNA mit einer gegebenen
Zielsequenz verwendet werden.
-
Folglich
sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart
eines Polynukleotids mit einer gewählten Zielsequenz, in einer
Probe, vor, umfassend:
- – das Kontaktieren eines Polymeren
der Erfindung mit dem Polynukleotid, wobei das Polymer (i) eine
Reihe von Basen-paarenden Resten aufweist, die zur Bindung der gewählten Zielsequenz
in der Lage sind, und (ii) mit einer nachweisbaren Reportergruppe
markiert sind, und wobei das Umsetzen des Polymeren mit dem Polynukleotid
unter Bedingungen durchgeführt
wird, die wirksam sind, um die Bildung eines Hybridisierungskomplexes
zwischen dem Polymer und der Zielsequenz zu ermöglichen, und
- – das
Nachweisen der Anwesenheit der Reportergruppe.
-
In
einer allgemeinen Anwendung werden die Polymere markiert mit einer
geeigneten radioaktiven Markierung oder einer anderen nachweisbaren
Reportergruppe. Das Zielpolynukleotid, typischerweise ein einzelsträngiges Polynukleotid,
wie DNA oder RNA, welches an einen festen Träger gebunden werden kann, wird mit
dem Polymer unter Hybridisierungsbedingungen umgesetzt, annealen
bzw. anlagern gelassen, und dann wird die Probe hinsichtlich der
Anwesenheit der Polymer-Reportergruppe untersucht.
-
Der
diagnostische Assay kann gemäß Standardvorgehensweisen
bei geeigneter Anpassung der Hybridisierungsbedingungen durchgeführt werden,
um die Polymer-Hybridisierung mit der Zielregion zu gestatten. Ferner
kann das Polymer für
die Hybridisierung mit dem Ziel bei einer höheren Schmelztemperatur als
der komplementäre
Polynukleotidstrang ausgelegt werden, da die Polymerbindung keine
Grundgerüstladungs-Abstoßungseffekte
mit sich bringt. Deshalb kann das Polymer an das Ziel bei einer
Temperatur über
der normalen Polynukleotid-Schmelztemperatur binden: dies ist ein
Vorteil des Polymeren gegenüber
herkömmlichen
Oligonukleotidsonden. Diese Bindung bei erhöhter Temperatur minimiert das
Problem der Kompetition um die Bindung an das Ziel zwischen der
Sonde und irgendeinem entsprechenden einzelsträngigen Oligonukleotid, welches
in dem diagnostischen Gemisch vorhanden sein kann.
-
In
einem zweiten allgemeinen Typ der diagnostischen Anwendung werden
die Polymere an einen festen Träger
gebunden, und zwar für
den Einfang von Ziel-RNA oder -DNA an den Träger.
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Der
feste Träger,
z. B. polymere Mikroteilchen, kann hergestellt werden durch Binden
der Polymere an den Träger
gemäß den obenstehend
beschriebenen Verfahren oder durch herkömmliche Derivatisierungs-Vorgehensweisen.
Alternativ dazu kann, wo die Polymere auf einem festen Träger synthetisiert
werden, dieser Träger
auch als der Assay-Träger
dienen.
-
Gemäß eines
Merkmals dieses Assaysystems können
die Zielpolynukleotidmoleküle,
welche auf dem Träger
durch basenspezifische Bindung an die Polymere eingefangen werden,
auf der Grundlage ihrer Grundgerüst-Ladung
nachgewiesen werden, da die Träger-gebundenen
Poly mere selbst im wesentlichen ungeladen sind. Zu diesem Zweck
kann das Assay-System auch polykationische Reportermoleküle einschließen, welche entworfen
sind, um an das vollständig
geladene Analyt-Grundgerüst,
aber nicht an das ungeladene (oder im wesentlichen ungeladene) Polymergrundgerüst, unter
ausgewählten
Bindungsbedingungen zu binden.
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In
einer Ausführungsform
sind die Reportermoleküle
aus einem polykationischen Rest oder Schwanz aufgebaut, entworfen,
um elektrostatisch an ein vollständig
geladenes Polynukleotid unter Bedingungen zu binden, bei welchen
der Reporter nicht an das weniger geladene oder ungeladene Bindungspolymer
bindet, welches auf dem diagnostischen Reagenz getragen wird; eine
oder mehrere Reportergruppen können
an den Schwanz gebunden sein, angepaßt zur Erzeugung eines Signals,
durch das die Anwesenheit des Reporters nachgewiesen werden kann.
-
Verfahren
zur Bildung von polykationischen Molekülen und zur Anheftung von Reportermolekülen an kationische
Verbindungen sind bekannt.
-
Jedes
Reportermolekül
trägt eine
oder mehrere Reportergruppen, und jedes Polynukleotid kann passend
für eine
Bindung von typischerweise mehreren Tausend oder mehr Reportermolekülen sein.
Somit besitzt das System einen Amplifikations-Faktor hinsichtlich
des Reportersignals pro gebundenem Analytmolekül von mehreren Größenordnungen.
Darüber
hinaus besitzt das Verfahren den, obenstehend angegebenen, Vorteil, daß die Polynukleotid-Bindungsreaktion
unter Bedingungen durchgeführt
werden kann, bei welchen Bindungskompetition mit komplementären Nukleotidsträngen nicht
auftritt.
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Die
Entwurfs-Erwägungen,
welche bei der Herstellung eines Polynukleotid-Bindungspolymeren
zur Verwendung als ein diagnostisches Reagenz angewandt werden,
werden von der Natur des Zielanalyten und den Reaktionsbedingungen,
unter welchen der Analyt getestet werden soll, bestimmt. Als eine
erste Erwägung wird
eine nicht-homopolymere Zielbasensequenz gewählt, gegen welche das Polymer
gerichtet ist. Diese Zielsequenz ist im allgemeinen einzelsträngig und
vorzugsweise einzigartig für
den zu testenden Analyten.
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Die
Wahrscheinlichkeit des Auftretens einer gegebenen n-basigen Zielsequenz
ist ungefähr
(1/4)n. Demgemäß würde man von einer gegebenen
n-basigen Zielsequenz erwarten, ungefähr einmal in einem Polymer
vorzukommen, welches 4n Basen enthält. Deshalb
ist die Wahrscheinlichkeit P, daß eine gegebene n-basige Sequenz
in Polynukleotiden mit insgesamt N einmaligen Sequenz-Basen vorkommen
wird, ungefähr
P = N/4n. Zur Veranschaulichung ist die
Wahrscheinlichkeit P, daß eine
9-Basen-Zielsequenz in einem 20 Kilobasen großen Polynukleotid gefunden
wird, etwa 20 × 103/2 × 105 oder 0,08, die Wahrscheinlichkeit, daß eine 16-Basen-Zielsequenz
vorhanden sein wird, ist etwa 20 × 103/4,3 × 109 oder 0,0000047. Aus diesen Berechnungen
kann man ersehen, daß ein
Polymer mit 9-16 Erkennungsresten, spezifisch für eine definierte 9-16 Basen
große
Zielsequenz, hohe Spezifität
für die
Zielsequenz in einer Assaymischung haben sollte, welche nur virale
Genome enthält,
deren größte Komplexitäten etwa
400K an einmaligen Sequenzbasen entsprechen.
-
Ähnliche
Berechnungen zeigen, daß ein
Polymer von 12 bis 16 Untereinheiten eine angemessene Spezifität für eine virale
oder bakterielle Zielsequenz in einer Assaymischung, welche lediglich
virales und bakterielles genomisches Material enthält, vorsehen
kann; wobei die größten genomischen
Größen sich
auf etwa 5000 Kilobasen belaufen. Ein Polymer von 16 bis 22 Untereinheiten
kann angemessene Spezifität
für eine
Zielsequenz in einer Polynukleotidmischung vorsehen, welche genomisches
Säuger-DNA-Material
enthält;
wobei die genomischen Größen sich
auf etwa 5 Milliarden Basenpaare an einmaliger Sequenz-DNA belaufen.
-
Die
Polymer/Analyt-Bindungsaffinität
und insbesondere die Temperatur, bei der das Polymer eben an die
Zielsequenz bindet (die Schmelztemperatur oder Tm) können selektiv
gemäß den folgenden
Kriterien variiert werden: (a) Anzahl von Untereinheiten in dem
Polymer; (b) Anzahl von Wasserstoffbindungen, welche zwischen den
Basen-paarenden Resten und den entsprechenden komplementären Basen
der Analyt-Zielsequenz gebildet werden können; (c) Einheitslänge des
Polymergrundgerüsts;
(d) die besonderen Zwischen-Untereinheit-Bindungen; und (e) die
Konzentration von Denaturierungsmitteln, wie Formamid, welche die Schmelztemperatur
absenken.
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Aus
einer Reihe von Untersuchungen an Modell-Nukleinsäuredoppelsträngen ist
es bekannt, daß die Schmelztemperatur
von Oligonukleotid-Doppelsträngen
im Bereich von 10 bis 20 bp um ungefähr 3°C pro zusätzlichem Basenpaar, das durch
zwei Wasserstoffbindungen gebildet wird, und um etwa 6°C pro zusätzlichem Basenpaar,
daß durch
drei Wasserstoffbindungen gebildet wird, zunimmt. Deshalb kann die
Zielsequenzlänge, welche
ursprünglich
gewählt
wird, um eine hohe Bindungsspezifität mit dem Polymer zu gewährleisten,
verlängert
werden, damit eine gewünschte
Schmelztemperatur unter den gewählten
Assay-Bedingungen erreicht wird.
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Desweiteren
kann, wo die in der Konstruktion des Polymeren verwendeten Erkennungsreste
die Standard-Nukleinsäurebasen
sind, die Zielsequenz gewählt
werden, um einen hohen Prozentsatz an Guanin- plus Cytosinbasen
aufzuweisen, damit eine verhältnismäßig hohe
Polymer/Analyt-Schmelztemperatur erzielt wird. Um andererseits eine
geringere Schmelztemperatur zu erzielen, wird eine Zielsequenz gewählt, welche
einen relativ hohen Prozentsatz an Adenin- plus Thyminbasen enthält.
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Die
Bindungskomponenten in dem diagnostischen System, wie sie in dem
eben beschriebenen diagnostischen Verfahren mit einem festen Träger funktionieren,
sind in der 10 veranschaulicht. Hierbei
ist "S", das Assay-Reagenz,
der feste Träger
mit einer Anzahl von Bindungspolymeren, welche an seine Oberfläche über Abstandhalter-Arme,
gezeigt durch Sägezahn-Linien,
gebunden sind. In dem Assay-Vorgehen wird die Ziel-DNA in einzelsträngiger Form
mit den Träger-gebundenen
Polymeren unter Hybridisierungsbedingungen umgesetzt, und der feste
Träger
wird dann gewaschen, um nicht-hybridisiertes Nukleinsäurematerial
zu entfernen.
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Der
gewaschene Träger
wird dann mit dem Reporter unter Bedingungen umgesetzt, welche die
elektrostatische Bindung des kationischen Reporter-Rests an das
Ziel-DNA-Grundgerüst
begünstigen.
Der in der 10 gezeigte Reporter ist ein
dikationisches Molekül
mit einer Reportergruppe R.
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Nach
der Reaktion mit der Reporterlösung,
typischerweise während
einiger Sekunden bei Raumtemperatur, wird das Reagenz gewaschen,
um ungebundenen Reporter zu entfernen, und dann wird das Assay-Reagenz
hinsichtlich gebundenem Reporter untersucht. Eine Vorgehensweise
zur Bestimmung der mit dem Reagenz assoziierten Menge von Reporter,
insbesondere im Fall von fluoreszenten oder chromophoren Reportergruppen,
besteht darin, den Reporter mit einer Hochsalz-Lösung von dem Reagenz zu eluieren,
und dann das Eluat hinsichtlich des Reporters zu untersuchen.
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Das
Polymer der Erfindung kann eine sequenzspezifische Bindung an doppelsträngige Nukleinsäuren über basenpaarspezifische
Wasserstoffbindungs-Stellen eingehen, welche über die große Furche der Doppelhelix zugänglich sind.
Diese Bindung kann in einer Doppelstrangregion stattfinden, in der
mindestens 70 % der Basen auf einem Strang Purine sind, und ein
entsprechender Prozentsatz der Basen auf dem anderen Strang Pyrimidine
sind. Das Doppelstrang-Bindungspolymer
schließt
vorzugsweise 2,6-Diaminopurin-Wasserstoffbindungsreste für die Bindung
an T-A- oder U-A-Basenpaare und Guanin-Wasserstoffbindungsreste
für die
Bindung an C-G-Basenpaare ein, wie veranschaulicht in der 7. Für
diese spezielle Zielsequenzen kann das Polymer der Erfindung somit
für diagnostische
Assays der eben beschriebenen Typen verwendet werden, worin jedoch
die Ziel-Nukleinsäure
in nicht-denaturierter doppelsträngiger
Form vorliegt.
-
H. Andere Anwendungen
-
Die
Polymere der vorliegenden Erfindung können anstelle von Standard-RNA-
oder DNA-Oligomeren für eine Reihe
von standardmäßigen Laboratoriums-Vorgehensweisen
eingesetzt werden. Wie obenstehend erwähnt, können Morpholino-basierende
Polymere an einen festen Träger
fixiert und verwendet werden, um komplementäre Nukleinsäuresequenzen zu isolieren,
zum Beispiel zur Reinigung einer spezifischen mRNA aus einer Poly-A-Fraktion
(Goldberg et al.). Die vorliegenden Polymere sind vorteilhaft für solche
Anwendungen, da sie kostengünstig
und geradlinig aus aktivierten Untereinheiten herzustellen sind.
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Es
kann eine große
Zahl von Anwendungen in der Molekularbiologie für markierte Morpholino-basierende
Polymere gefunden werden. Morpholino-basierende Polymere können einfach
und effizient durch den im letzten Schritt der Polymersynthese erfolgenden
Einschluß einer
aktivierten und markierten Morpholino-basierenden Untereinheit oder,
vorzugsweise, eines 35S-markierten Methionins,
wie obenstehend angegeben, endmarkiert werden. Der zu verwendende
Markierungstyp ist abhängig
von der Endanwendung des Polymeren; solche Markierungen schließen radioaktive
(3H, 14C, 32P oder 35S) Nukleoside
oder Aminosäuren,
oder Biotin ein. Markierte Morpholino-basierende Oligonukleotid-Analoge
können
als effiziente Sonden beispielsweise bei Kolonie-Hybridisierung
(Grunstein et al.), RNA-Hybridisierungen (Thomas), DNA-Hybridisierungen (Southern)
und Genbank-Screening (Szostak et al.) wirken.
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Die
Polymere der Erfindung besitzen auch eine potenzielle Anwendung
als therapeutische "Antisense"-Mittel bzw. "Antisinn"-Mittel. Eine Anzahl
von ungeladenen Nukleinsäureanalogen,
welche fast isostrukturell mit DNA sind, sind als antivirale und
Anti-Krebs-Mittel verwendet worden. Morpholino-basierende Polymere der
vorliegenden Erfindung sind in vitro gegen HIV-I (Humanes Immunschwäche-Virus) getestet worden.
Es wurde gezeigt, daß ein
zur Primer-Bindungsstelle
von HIV-I (Myers et al.) komplementäres 16-mer die Synthese des
viralen P24-Proteins
um ungefähr
35 % verringert (Beispiele 8 und 9). In entsprechenden nicht-infizierten
Zellen verursachten die Morpholino-basierenden Polymere keine offensichtliche
Zelltoxizität.
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Die
Polymere der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls in vivo gegen
eine Augeninfektion mit HSV-I (Herpes Simplex Virus I) in Mäusen getestet
worden (Beispiel 10). Ein zu einer Splice-Verbindungsstelle in HSV-I komplementäres 12-mer
wurde hinsichtlich seiner Fähigkeit
getestet, in den Augen mit HSV-I infizierte Mäuse zu schützen. Unbehandelte Mäuse zeigten
5 Tage nach der Infektion eine Überlebensrate
von 65 %, wohingegen mit einer topischen Salbe, enthaltend das Morpholino-basierende
Polymer, behandelte Mäuse eine Überlebensrate
von 90 % aufwiesen.
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Zusätzlich zu
den obenstehend beschriebenen antiviralen Eigenschaften der Morpholino-basierenden Polymere
in vitro und in vivo, stellen die Polymere der vorliegenden Erfindung
mehrere Vorteile gegenüber
herkömmlicheren
Antisinn-Mitteln zur Verfügung.
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Zum
Ersten sind die Morpholino-Polymere weniger kostspielig zu synthetisieren
als Desoxyribonukleosid-abgeleitete Polymere. Dies beruht zum Teil
auf der Tatsache, daß die
bei der Polymersynthese verwendeten Morpholino-Untereinheiten aus
Ribonukleosiden, anstelle der selteneren und viel kostspieligeren
Desoxyribonukleoside, abgeleitet sind. Auch findet, wie obenstehend
angegeben, die Kopplungsreaktion zwischen einem Phosphor und einem
Amin einer zweiten Untereinheit unter relativ milden Bedingungen
statt, so daß Schützungs-Schritte
und andere Vorkehrungen, welche benötigt werden, um unerwünschte Reaktionen
zu vermeiden, vereinfacht werden. Dies steht im Gegensatz zur standardmäßigen Ribo-
und Desoxyribonukleotid-Polymersynthese, worin die Kopplung über eine
Phosphatesterbindung erfordert, daß die Kopplungsreagenzien in
hohem Maße
reaktiv sind und daß die
Reaktion unter stringenten Reaktions/Schützungs-Bedingungen durchgeführt wird.
Dieser Vorteil bei der Polymersynthese trifft selbstverständlich auch
auf diagnostische Anwendungen des Polymeren zu.
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Zum
Zweiten kann die Bindung des Polymeren an sein Ziel eine bessere
Ziel-Inaktivierung ergeben als mit Antisinn-Mitteln vom DNA-Typ,
weil der Morpholino-Polymer/Ziel-Doppelstrang nicht gegenüber Doppelstrang-Entwindungs-Mechanismen
in der Zelle anfällig
ist.
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Zum
Dritten ist das Morpholino-basierende Polymer auch stabiler innerhalb
der Zelle als DNA, RNA und ihre Thiophosphat-verknüpften Analoge,
weil die Morpholino-Polymergrundgerüst-Bindungen nicht anfällig gegenüber Spaltung durch zelluläre Nukleasen
sind.
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Zum
Vierten tritt das ungeladene Morpholino-Polymer, in therapeutischen
Anwendungen unter Beteiligung einer zellulären Aufnahme der Verbindung,
viel effizienter in die Zellen ein, als ein geladenes Oligonukleotid.
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Im
Kontext von therapeutischen Anwendungen können die Morpholino-Polymere
der vorliegenden Erfindung gegen doppelsträngige genetische Sequenzen
gerichtet sein, in welchen ein Strang vorwiegend Purine enthält und der
andere Strang vorwiegend Pyrimidine enthält, wie veranschaulicht in
der 7.
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Wenn
ferner eine Messenger-RNA von dem hauptsächlich Purin-haltigen Strang
der Doppelstrang-Zielsequenz codiert wird, besitzen die gegen den
Doppelstrang gerichteten Morpholino-Bindungspolymere auch das Potential
zur Inaktivierung der mRNA. Somit besitzt ein derartiges Polymer
das Potential zur Inaktivierung von genetischen Schlüsselsequenzen
eines Pathogens sowohl in einzelsträngigen als auch doppelsträngigen Formen.
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1981
ist es berichtet worden, daß kurze
(3 bis 7 Untereinheiten) Methylphosphonat-verknüpfte DNA-Analoge, komplementär zu Abschnitten
der Shine-Dalgarno-Konsensus-Sequenz von prokaryotischen mRNAs,
wirksam zur Zerstörung
der bakteriellen Proteinsynthese in Bakterienlysaten und in einem
speziellen permeablen Stamm von Bakterien waren. Allerdings versagten
derartige Mittel darin, die Proteinsynthese in normalen Bakterien
zu inhibieren (Jayaramon, 1981).
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Zur
Unterstützung
der vorliegenden Erfindung durchgeführte Experimente zeigen, daß Polymere
von 3 bis 5 Untereinheiten Länge
wirksam zur Blockierung der Proteinsynthese in normalen Bakterien
sein können, indem
eine Kombination von Basen verwendet wird, welche zu einer hohen
Zielbindungs-Affinität
führen.
Genauer gesagt, können
die folgenden Oligomere und Oligomer-Kombinationen die Proteinsynthese
in normalen intakten Bakterien stören (worin D für 2,6-Diaminopurin
oder Adenin steht; G Guanin ist; B 5-Bromuracil oder ein anderes
5-Halogenuracil
oder Uracil ist; und die Sequenzen mit ihrem 5'-Ende an der linken Seite gezeigt sind):
DGG, BDDG, DDGG; DGGD; GGDG; GDGG; DGGB; GGBG; GGAGG; GGDGG; und
die Kombinationen BDD + GGDG; DDG + GDGG; DGG + DGGB; GGD + GGBG;
BDDG + GDG; DDGG + DGG; DGGD + GGB; GGDG + GBG; BDD + GGDG + GBG.
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Die
Verwendung von kurzen Bindungs-vertsärkten Oligomeren zur Zerstörung der
biologischen Aktivität
einer RNA-Sequenz, welche eine Schlüsselrolle im Stoffwechsel einer
Zielklasse von Organismen spielt, aber keine entsprechend bedeutsame
Rolle in höheren
Organismen spielt, sollte in weitem Umfang auf eine Vielzahl von
pathogenen Organismen (z. B. Bakterien und Pilzen) anpassbar sein,
welche eine Zellwand besitzen, die den Eintritt von längeren Polymeren
ausschließt.
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Die
folgenden Beispiele veranschaulichen das Verfahren zur Untereinheit-
und Polymer-Synthese, und
Anwendungen der Polymerzusammensetzung der Erfindung.
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Beispiel 1
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Basenschützung von
Ribonucleosiden
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Die
folgenden Ribonucleoside wurden von Sigma Chemical Co. (S. Louis,
MO) erhalten:
Uridin, Guanosin, 5-Methyluridin, Adenosin, Cytidin,
5-Bromuridin und Inosin.
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2,6-Diamino-9-(B-D-ribofuranosyl)-9H-purin
(2,6-Diaminopurinribosid) wurde von Pfaltz und Bauer, Inc., Division
of Aceto Chemical Co., Inc. (Waterbury, CT) erhalten. Die folgenden
Nucleoside wurden durch die angegebenen Literaturverfahren hergestellt:
1-β-D-Ribofuranosyl)-2-pyrimidinon-(2-hydroxypyrimidinribosid)
wird durch die Vorgehensweise von Niedballa hergestellt.
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2-Amino-9-β-D-ribofuranosyl)-1,6-dihydro-6h-purin-6-thion
(Thioguanosin) wurde durch die Vorgehensweise von Fox hergestellt.
Dimethoxytritylchlorid, N6-Benzoyladenosin, N4-Benzoylcytidin und N2-Benzoylguanosin
wurden von Sigma Chemicals erhalten. 9-Fluorenylmethoxycarbonylchlorid (FMOC-Chlorid),
Trimethylchlorsilan, Isobuttersäureanhydrid,
4-Nitrobenzoylchlorid, Naphthalsäureanhydrid
und alle organischen Lösungsmittel
für die
Reaktionen und Chromatographie wurden von Aldrich Chemical Co. (Milwaukee,
WI) erhalten. Silicagel wurde von EM Science (Cherry Hill, NJ) erhalten.
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Wenn
eine Aktivierung der Untereinheiten unter Verwendung von dihalogenierten
elektrophilen (z. B. P(O) Cl2N(CH3)2 bewirkt wird,
werden häufig
bessere Ausbeuten an aktivierten Untereinheiten erhalten, unter Verwendung
von Schutzgruppen, welche keine sauren Protonen auf den exocyclischen
Purin- und Pyrimidinaminen zurücklassen.
Beispiele für
solche exocyclischen Amin-Reste sind wie folgt: das N6 von Adenin,
das N4 von Cytosin, das N2 von Guanin und das N2 und N6 von Diaminopurin.
Geeignete Schutzgruppen für
diesen Zweck schließen
die Naphthaloylgruppe (Dikshit) und die Amidingruppen, entwickelt
von McBride et al. (1986), ein. Darüber hinaus führt die
Verwendung von dihalogenierten Elektrophilen für die Untereinheitsaktivierung im
allgemeinen zu besseren Ergebnissen, wenn das O6 von Guanin-Resten geschützt wird;
dieser Schutz wird unter Verwendung der p-Nitrophenethylgruppe erreicht
(Trichtinger).
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Guanosin
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Um
Nebenreaktionen während
den Untereinheitsaktivierungen zu minimieren, ist es häufig wünschenswert,
den Guanin-Rest sowohl auf dem N2 als auch auf dem O6 unter Verwendung
der Vorgehensweise von Trichtinger et al. (1983) zu schützen.
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Das
N-2-9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Derivat von Guanosin wird durch die
untenstehende Vorgehensweise hergestellt, welche im allgemeinen
zum Schutz von Nucleosidaminogruppen ist: Guanosin (1 mMol) wird
in Pyridin (5 ml) suspendiert und mit Trimethylchlorsilan (5 mMol)
behandelt. Nachdem die Lösung 15
Minuten lang gerührt
wurde, wird 9-Fluorenylmethoxycarbonylchlorid (5 mMol) hinzugesetzt,
und die Lösung
wird bei Raumtemperatur 3 Stunden lang gehalten. Die Reaktion wird
in einem Eisbad gekühlt,
und Wasser (1 ml) hinzugesetzt. Nach dem Rühren für 5 Minuten wird konzentriertes
Ammoniak (1 ml) zugegeben, und die Reaktion wird 15 Minuten lang
gerührt.
Die Lösung
wird fast bis zur Trockne abgedampft, und der Rückstand wird in Chloroform
(10 ml) gelöst.
Diese Lösung
wird mit Natriumbicarbonatlösung
(5 ml, 10%) gewaschen, über
Natriumsulfat getrocknet und abgedampft. Der Rückstand wird in mehreren Malen
zusammen mit Toluol abgedampft, und das Produkt wird auf Silikagel
unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Methylenchlorid
(0 bis 50%) chromatographiert.
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N-2-Isobutyrylguanosin
wird durch die Methode von Letsinger hergestellt. Ein weiterer Schutz
des O6 mit einem Nitrophenethyl-Rest ist häufig wünschenswert und kann mittels
mehrerer Methoden durchgeführt werden
(Gait, 1984).
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N-2-Acetylguanosin
wird durch die Methode von Reese erhalten. N-2-Naphthaloylguanosin
wird durch die Methode von Dikshit erhalten; diese Referenz liefert
eine allgemeine Methode zum Schutz von Nucleosidamingruppen.
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Adenosin
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Das
N-6-2-(4-Nitrophenyl)ethoxycarbonyl-Derivat wird durch die Methode
von Himmelsbach hergestellt.
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N-6-(4-Nitrobenzoyl)adenosin
wird unter Verwendung der oben für
FMOC-Guanosin eingesetzten Verfahrensweise hergestellt, außer dass
4-Nitrobenzoylchlorid für
FMOC-Chlorid substituiert wird.
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Das
N-6-2-(Phenylsulfonyl)ethoxycarbonyl-Derivat wird durch die Verfahrensweise
für FMOC-Guanosin
hergestellt, außer
dass das 2-(Phenylsulfonyl)ethylchlorformiat (Balgobin) als Acylierungsmittel
verwendet wird, und N-Methylimidazol oder Pyridin als Lösungsmittel
verwendet wird.
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N-6-Naphthoyladenosin
wird durch die Methode von Dikshit hergestellt; diese Referenz liefert
eine allgemeine Methode zum Schutz von Nucleosidamingruppen.
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2,6-Diaminopurinribosid
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Das
N-2,N-6-Bis(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-Derivat von 2,6-Diaminopurinribosid
wird durch die für Guanosin
beschriebene allgemeine Vorgehensweise hergestellt.
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Das
N-2,N-6-Bis(isobutyryl)-Derivat wird durch die für Guanosin beschriebene allgemeine
Vorgehensweise hergestellt.
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Thioguanosin
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Das
N-2-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-Derivat von Thioguanosin wird durch
die für
Guanosin beschriebene allgemeine Verfahrensweise hergestellt.
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Uridin
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Um
unerwünschte
Nebenprodukte während
des Untereinheits-Aktivierungsschrittes zu minimieren, ist es manchmal
wünschenswert,
dass N3 des Uracil-Rests zu schützen.
5'-O-trityliertes
Uridin-2',3'-acetonid wird zu
dem N3-Anisoyl-Derivat mittels der Verfahrensweise von Kamimura
et al. (1983) umgewandelt. Das Produkt wird dann mit heißer 80%iger
Essigsäure
oder 0,1 N HCl in THF behandelt, um die Schutzgruppen auf dem Ribose-Rest
abzuspalten.
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Beispiel 2
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Synthese von 5'-OH-Morpholino-Untereinheiten
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Die
Schritte in dem Verfahren sind in 5 veranschaulicht,
mit Bezug auf in 5 gezeigte Strukturen.
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Das
Basen-geschützte
Ribonucleosid wird mit Periodat zu einem 2'-3'-Dialdehyd
(Struktur 1) oxidiert. Das Dialdehyd wird auf Ammoniak oder primärem Amin
geschlossen (Struktur 2), und die 2'- und 3'-Hydroxyle (nummeriert wie in der Stamm-Ribose)
werden durch Reduktion mit Cyanoborhydrid entfernt (Struktur 3).
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Ein
Beispiel dieses allgemeinen synthetischen Schemas wird unten mit
Bezug auf die Synthese einer Basen-geschützten Cytosin-(P1*)-Morpholino-Untereinheit
beschrieben. Zu 1,6 1 Methanol werden unter Rühren 0,1 Mol N4-Benzoylcytidin
und 0,105 Mol Natriumperiodat, gelöst in 100 ml Wasser, gegeben.
Nach 5 Minuten werden 0,12 Mol Ammoniumbiborat hinzugesetzt, und
die Mischung wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, gekühlt und
filtriert. Zu dem Filtrat werden 0,12 Mol Natriumcyanoborhydrid
hinzugesetzt. Nach 10 Minuten werden 0,20 Mol Toluolsulfonsäure hinzugegeben.
Nach weiteren 30 Minuten werden weitere 0,20 Mol Sulfonsäure hinzugegeben,
und die Mischung wird gekühlt
und filtriert. Das feste Präzipitat
wird mit zwei 500 ml großen
Portionen Wasser gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wodurch
man das Tosylatsalz des in Struktur 3 gezeigten freien Amins erhielt.
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Die
Verwendung einer mäßig starken
(pKa < 3) aromatischen
Säure,
wie Toluolsulfonsäure
oder 2-Naphthalinsulfonsäure,
führt zu
einer leichten Handhabung, signifikant verbesserten Ausbeuten und
einem hohen Ausmaß an
Produktreinheit.
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Die
Basen-geschützte
Morpholin-Untereinheit wird dann am Ringstickstoff des Morpholino-Rings unter Verwendung
von Tritylchlorid oder Benzylhydralnitrophenylcarbonat geschützt (Struktur
4). Alternativ kann das 5'-Hydroxyl
mit einer Trialkylsilylgruppe geschützt werden.
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Als
ein Beispiel eines Schutzschrittes werden zu 2 Litern Acetonitril
unter Rühren
0,1 Mol des Tosylatsalzes von oben, gefolgt von 0,26 Mol Triethylamin
und 0,15 Mol Tritylchlorid, hinzugesetzt. Die Mischung wird abgedeckt
und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt, woraufhin 100 ml Methanol
hinzugegeben wurden, gefolgt von einem Rühren für 15 Minuten. Nach dem Trocknen
durch Rotationsverdampfung wurden 400 ml Methanol hinzugegeben.
Nachdem der Feststoff gründlich
als eine Aufschlämmung
suspendiert worden war, wurden 5 ml Wasser hinzugegeben, wurde die
Mischung 30 Minuten lang gerührt
und filtriert. Der Feststoff wurde mit 1 Liter Wasser gewaschen,
filtriert und unter Vakuum getrocknet. Der Feststoff wurde in 500
ml Dichlormethan erneut suspendiert, filtriert und so lange rotationsverdampft,
bis eine Ausfällung
gerade anfing, woraufhin 1 Liter Hexan hinzugegeben wurde und 15
Minuten lang gerührt
wurde. Der Feststoff wurde mittels Filtration entfernt und unter
Vakuum getrocknet.
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Die
oben angegebene Vorgehensweise führt
zu der Basen-geschützten
Morpholino-Untereinheit, trityliert auf dem Morpholino-Stickstoff
und ein freies 5'-Hydroxyl
aufweisend (Struktur 4).
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Beispiel 3
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Alternative
Synthese von Morpholino-Untereinheiten
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Dieses
Beispiel beschreibt eine alternative Herstellung von einer Morpholino-Untereinheit,
enthaltend einen säurelabilen
Rest, der an dem Morpholino-Ring-Stickstoff gebunden ist. Die Schritte
werden in Bezug auf 6 beschrieben.
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Die
Untereinheit wird hergestellt durch Oxidieren eines Ribonucleosids
mit Periodat, wie in Beispiel 2, und Schließen des resultierenden Dealdehyds
(Struktur 1) auf dem primären
Amin 4,4'-Dimethoxybenzhydrylamin
(welches durch die Methode von Greenlee, 1984, hergestellt werden
kann), gepuffert mit Benzotriazol oder p-Nitrophenol. Die Reduktion
mit Natriumcyanoborhydrid, durchgeführt wie in Beispiel 2, führt zu einer Morpholino-Untereinheit
(Struktur 2) mit einer 4,4'-Dimethoxybenzhydrylgruppe
auf dem Morpholino-Stickstoff.
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Ein
Merkmal dieser Vorgehensweise ist, dass es besonders brauchbar ist
zur Herstellung von Morpholino-Untereinheiten aus Ribonucleosiden,
welche keine Schutzgruppe auf der Base (z. B. Uridin) aufweisen.
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Beispiel 4
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Umwandlung von 5'-Hydroxyl zu 5'-Amin und zu 5'-Sulfhydral
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Die
Schritte bei der Synthese sind mit Bezug auf die in 5 gezeigten
Strukturen beschrieben.
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A. Umwandlung zu dem Amin
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Das
5'-Hydroxyl der
doppelt geschützten
Morpholino-Untereinheit (Struktur 4, 5) kann
zu einem Amin-Untereinheit umgewandelt werden. Zu 500 ml DMSO werden
1,0 Mol Pyridin (Pyr), 0,5 Mol Trifluoressigsäure (TFA) und 0,1 Mol der Morpholino-Untereinheit
gegeben. Die Mischung wird solange gerührt, bis alle Komponenten gelöst sind,
und dann werden 0,5 Mol entweder von Diisopropylcarbodiimid (DIC)
oder von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) hinzugesetzt. Nach 2 Stunden
wird die Reaktionsmischung zu 8 Litern schnell gerührter Kochsalzlösung hinzugesetzt.
Diese Lösung
wird 30 Minuten lang gerührt
und dann filtriert. Der resultierende Feststoff wird kurz getrocknet,
mit 1 Liter eiskalten Hexanen gewaschen und filtriert. Der Feststoff wird
zu 0,2 Mol Natriumcyanoborhydrid in 1 Liter Methanol hinzugesetzt
und 10 Minuten lang gerührt.
Zu dieser Mischung werden 0,4 Mol Benzotriazol oder p-Nitrophenol hinzugegeben,
gefolgt von der Zugabe von 0,2 Mol Methylamin (40% in H2O).
Die Herstellung wird 4 Stunden bei Rautemperatur gerührt [Anmerkung:
Das Benzotriazol oder p-Nitrophenol puffert die Reaktionsmischung,
wodurch eine Racemisierung an dem 4'-Kohlenstoff
der Untereinheit in der Iminium-Stufe der reduktiven Alkylierung
verhindert wird.]. Schließlich
wird die Reaktionsmischung in 5 Liter Wasser gegossen, bis sich
ein gutes Präzipitat
gebildet hat, und der Feststoff (Struktur 6, 5) wird
gesammelt und getrocknet.
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B. Umwandlung zu dem Sulfhydral
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Das
5'-Hydroxyl der
doppelt geschützten
Morpholino-Untereinheit wird zu einem Sulfhydral wie folgt umgewandelt.
Ein Zehntel Mol der 5'-Hydroxyl-Untereinheit
(Struktur 4, 5) wird zu 1 Liter Pyridin hinzugesetzt,
gefolgt von der Zugabe von 0,12 Mol Toluolsulfonylchlorid. Diese
Lösung
wird 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, und die Reaktion führt zu dem
Produkt, wie es in Struktur 7 von 5 gezeigt
ist. Das Pydridin wird durch Rotationsverdampfung entfernt, und
zu dem Feststoff wird 0,5 Mol frisches Natriumhydrosulfid in 1 Liter
Methanol-DMF, enthaltend NaI, hinzugesetzt. Die Reaktionsmischung
wird bei Raumtemperatur über Nacht
gerührt.
Die Mischung wird zu 5 Liter Wasser hinzugegeben, 20 Minuten lang
gerührt,
und das resultierende feste Material wird mittels Filtration gesammelt
und getrocknet, wodurch man das Produkt erhielt, welches als Struktur
8 der 5 gezeigt ist.
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Beispiel 5
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Aktivierung
und Kopplung zum Erhalt von Phosphoramid-Verknüpfungen
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A. X = -CH3
-
Das
Beispiel 5A beschreibt die Aktivierung und Kopplung von einer 5'-Hydroxyl-Untereinheit,
hergestellt wie in Beispiel 2 oder 3, zu einer zweiten Untereinheit
mit einem freien Morpholino-Ring-Stickstoff, um eine Alkylphosphonamidat-Zwischenuntereinheit-Verknüpfung zu
bekommen. Das Beispiel wird mit Bezug auf Strukturen in 8 beschrieben,
worin X eine Alkylgruppe ist.
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1
mMol an 5'-Hydroxyl-Untereinheit,
basengeschützt
und trityliert auf dem Morpholino-Stickstoff (Struktur 4 von 5),
wird in 20 ml Dichlormethan gelöst.
Zu dieser Lösung
werden 4 mMol N-Ethylmorpholin und 1,1 mMol Methylphosphonsäuredichlorid,
für Z =
O (oder Methylthiophosphonsäuredichlorid,
für Z =
S) gegeben, gefolgt von der Zugabe von 1 mMol N-Methylimidazol.
Nach 1 Stunde wird die Reaktionslösung mit wässeriger NaH2PO4 gewaschen. Die aktivierte Untereinheit
wird durch Chromatographie auf Silikagel, entwickelt mit Ethylacetat,
gegeben (Struktur 2 von 8, worin X Methyl ist). Diese
aktivierte Untereinheit kann direkt an den Morpholino-Stickstoff
einer zweiten Untereinheit geknüpft
werden (Struktur 3), und zwar durch Mischen von diesen in DMF. Diese
Kopplungsreaktion führt
zu dem Dimer, wie es in Struktur 4 gezeigt ist (worin X -CH3 ist).
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Eine
alternative Vorgehensweise der Aktivierung und Kopplung beinhaltet
das Lösen
von 1 mMol von 5'-Hydroxyl-Untereinheit,
basengeschützt
und trityliert auf dem Morpholino-Stickstoff (Struktur 4 von 5),
in 20 ml Dichlormethan. Zu dieser Lösung werden 4 mMol N,N-Diethylanilin
und 0,1 mMol 4-Methoxypyridin-N-oxid hinzugesetzt. Nach der Auflösung werden
1,1 mMOl Methylphosphonsäuredichlorid,
für Z =
O (oder Methylthiophosphonsäuredichlorid,
für Z =
S), hinzugesetzt. Nach 2 Stunden wird das Produkt (Struktur 2 von 8,
worin X Methyl ist) durch Chromatographie auf Silikagel und der
Entwicklung mit 10% Aceton/90% Chloroform isoliert. 1 mMol dieser
aktivierten Untereinheit kann direkt an den Morpholino-Stickstoff
einer zweiten Untereinheit (Struktur 3) durch Mischen von diesen
in 1,5 mMol N,N-Diisopropylaminoethylisobutyrat (DIPAEIB) enthaltendem
Dichlormethan gemischt werden, wodurch man das als Struktur 4 gezeigte
Dimer erhielt (worin X -CH3 ist).
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Das
tertiäre
Amin/Ester, DIPAEIB, wird durch Mischen von 1,1 Mol Isobutyrylchlorid,
1 Mol N,N-Diisopropylaminoethanol und 1,5 Mol Pyridin unter Erhitzen
für 30
Minuten bei 110°C
hergestellt. Die Präparation wird
mit 0,5 Mol NaOH in 500 ml H2O gewaschen
und destilliert, wodurch man das gewünschte Amin/Ester, das bei
115°C bei
30 mmHg siedete, erhielt.
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Die
Alkylphosphonamidat-Zwischenuntereinheit-Verknüpfung (Struktur 4, in der X
-CH3 ist), ist gegenüber dem für die Basenentschützungen
verwendetes Ammoniak sehr stabil. Dagegen ist die Verknüpfung gegenüber relativ
starken Säuren
empfindlich. Zum Beispiel besitzt die Verknüpfung eine Halbwertszeit der
Spaltung von etwa 3 Stunden in 2%iger Dichloressigsäure in Dichlormethan.
Gleichwohl zeigt die Verknüpfung
keine nachweisbare Spaltung nach 18 Stunden in 2%iger Essigsäure in Trifluorethanol,
Bedingungen, die für
die Tritylierung des Morpholino-Stickstoffs geeignet sind.
-
B. X = -O-CH2CH3
-
Das
Beispiel 5B beschreibt die Aktivierung und Kopplung der 5'-Hydroxyl-Untereinheit,
hergestellt in Beispiel 2 oder 3, zu einer zweiten Untereinheit
mit einem freien Morpholino-Ring-Stickstoff,
wodurch man eine Phosphordiesteramid-Zwischenuntereinheit-Verknüpfung erhält. Das
Beispiel wird mit Bezug auf Strukturen in 8 beschrieben,
in denen X eine Alkoxidgruppe ist.
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1
mMol 5'-Hydroxyl-Untereinheit,
basengeschützt
und trityliert auf dem Morpholino-Stickstoff (Struktur 4 von 5),
wird in 80 ml Benzol suspendiert, und 2,2 mMol N-Methylimidazol
werden hinzugesetzt. Nachdem die Untereinheit aufgelöst war,
wurden 1,2 mMol Ethyldichlorphosphat, für Z = O (oder Ethyldichlorthiophosphat,
für Z =
S) hinzugesetzt. Nach 1 Stunde wird die Reaktionslösung mit
wässeriger
NaH2PO4 gewaschen.
Die aktivierte Untereinheit wird durch Chromatographie auf Silikagel
und der Entwicklung mit Ethylacetat, isoliert (Struktur 2 von 8,
worin X -O-CH2CH3 ist).
Diese aktivierte Untereinheit kann direkt an den Morpholino-Stickstoff
einer zweiten Untereinheit (Struktur 3) durch Mischen in DMF verknüpft werden.
Diese Kopplungsreaktion führt
zu dem als Struktur 4 gezeigten Dimer.
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Wenn
Ethyldichlorthiophosphat (Z = S) für die Aktivierung der Untereinheiten
verwendet wird, werden verbesserte Ausbeuten mit den folgenden Modifikationen
erhalten. 1 mMol 5'-Hydroxyl-Untereinheit,
basengeschützt
und trityliert auf dem Moropholino-Stickstoff (Struktur 4 von 5)
wird in 20 ml Chloroform suspendiert. Zu dieser Lösung werden
1 ml N-Methylimidazol
hinzugesetzt, gefolgt von der Zugabe von 1,6 ml Ethyldichilorthiophosphat
(Aldrich Chem. Co.). Nach 1 Stunde wird das Untereinheitsprodukt
durch Silikagel-Chromatographie, entwickelt mit 20% Aceton/80% Chloroform,
gereinigt. Diese aktivierte Untereinheit (Struktur 2, in der X -O-CH2-CH3 ist und Z Schwefel
ist), kann an den Morpholino-Stickstoff einer zweiten Untereinheit,
wie oben beschrieben, gekoppelt werden.
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Eine
alternative Vorgehensweise der Aktivierung und Kopplung beinhaltet
das Auflösen
von 1 mMol 5'-Hydroxyl-Untereinheit,
basengeschützt
und trityliert auf dem Morpholino-Stickstoff (Struktur 4 von 5),
in 20 ml Dichlormethan. Zu dieser Lösung werden 4 mMol N,N-Diethylanilin und
0,2 mMol 4-Methoxypyridin-N-oxid hinzugegeben. Nach der Auflösung werden
1,1 mMol Ethyldichlorphosphat, für
Z = O (oder Ethyldichlorthiophosphat, für Z = S), hinzugesetzt. Nach
1 Stunde wird das Produkt (Struktur 2 von 8, in der
X Ethoxy ist) mittels Chromatographie auf Silikagel unter Entwicklung
mit 10% Aceton/90% Chloroform isoliert. 1 mMol dieser aktivierten
Untereinheit kann direkt an den Morpholino-Stickstoff einer zweiten
Untereinheit geknüpft
werden (Struktur 3), und zwar unter Mischung von diesen in 1,5 mMol
N,N-Diisopropylaminoethylisobutyrat (DIPAEIB) enthaltendem Dichlormethan,
wodurch man das Dimer erhielt, welches als Struktur 4 angegeben
ist (in der X O-CH2-CH3 ist).
-
C. X = -F
-
Das
Beispiel 5C beschreibt die Kopplung einer 5'-Hydroxy-Untereinheit, hergestellt in
Beispiel 2 oder 3, an eine zweite Untereinheit mit einem freien
Morpholino-Ring-Stickstoff, um eine Fluorphosphoramidat-Zwischenuntereinheit-Verknüpfung zu
erhalten.
-
Das
Ausgangsmaterial ist 1 mMol 5'-Hydroxyl-Untereinheit,
basengeschützt
mit Gruppen, die durch ein β-Eliminierungsmechanismus
entfernbar sind, und trityliert auf dem Morpholino-Stickstoff (Struktur
4 von 5). Die Untereinheit wird in 20 ml Dichlormethan
gelöst,
wobei 6 mMol N-Methylimidazol hinzugegeben werden, gefolgt von der
Zugabe von 2,5 mMol Fluorphosphorsäure. 5 mMol DCC wird hinzugesetzt,
und die Lösung
wird 3 Stunden lang gerührt.
Die Reaktionslösung
wird mit wässerigem
NaH2PO4 gewaschen,
unjd die organische Phase wird unter reduziertem Druck getrocknet,
wodurch man Fluorphosphatsalz erhält. Das Produkt wird mittels
Silikagel-Chromatographie unter Entwicklung mit einer Methanol/Chloroform-Mischung
1 % Pyridin gereinigt, wodurch man das Pyridiniumsalz erhielt. Nach
dem Trocknen ist das gereinigte Produkt für die Kopplung an eine 5'-geschützte Untereinheit
mit einem freien Morpholino-Stickstoff unter Verwendung von DCC
in Dichlormethan geeignet.
-
Polymere,
die die Fluorphosphoramidat-Zwischenuntereinheit-Verknüpfung enthalten,
sollten keinen starken Nucleophilen, wie Ammoniak, ausgesetzt werden.
Folglich sollten Basen der Untereinheiten, die für das Zusammenbauen von solchen
Polymeren verwendet werden, mit Gruppen geschützt werden, welche ohne die
Verwendung von starken Nucleophilen gespalten werden können. Schutzgruppen,
die über
einen β-Eliminierungsmechanismus
abspaltbar sind, wie in Beispiel 1 beschrieben, sind für diesen
Zweck geeignet.
-
D. X = N(CH3)2
-
Das
Beispiel 5D beschreibt die Kopplung einer 5'-Hydroxyl-Untereinheit, hergestellt
wie in Beispiel 2 oder 3, an eine zweite Untereinheit mit einem
freien Morpholino-Ring-Stickstoff, wodurch man eine Phosphordiamidat-Zwischenuntereinheit-Verknüpfung erhielt.
Das Beispiel ist mit Bezug auf die Strukturen von 8 beschrieben,
in der X ein disubstituierter Stickstoff ist.
-
1
mMol 5'-Hydroxyl-Untereinheit,
basengeschützt
und trityliert auf dem Morpholino-Stickstoff (Struktur 4 von 5),
wird in 5 ml Dichlormethan gelöst.
6 mMol N-Ethylmorpholin und 2 mMol Dimethylaminodichlorphosphat
(OP(Cl)2N(CH3)2), für
Z = O (oder das Thiophosphat-Analog
für Z =
S), werden der Lösung
hinzugesetzt, gefolgt von der Zugabe von 0,5 mMol N-Methylimidazol. Nachdem
die Reaktion abgeschlossen ist (wie durch Dünnschicht-Chromatographie bestimmt), wird die
Reaktionslösung
mit wässeriger
NaH2PO4 gewaschen.
Die aktivierte Untereinheit wird durch Chromatographie auf Silikagel
unter Entwicklung mit Aceton/Chloroform isoliert (Struktur 2 in 8,
in der X -N-(CH3)2 ist).
Die aktivierte Untereinheit wird direkt an den Morpholino-Stickstoff
einer Untereinheit (Struktur 3) in DMF geknüpft, welches Triethylamin in
ausreichender Menge enthält,
um das in der Reaktion gebildete HCl zu neutralisieren, wodurch
man das Dimer erhält,
welches in Struktur 4 gezeigt ist.
-
Das
Dimethylaminodichlorphosphat (X ist -N-(CH3)2 und Z ist Sauerstoff), welches in der obenstehenden
Vorgehensweise verwendet wurde, wurde wie folgt hergestellt: Eine
Suspension, die 0,1 Mol Dimethylaminhydrochlorid in 0,2 Mol Phosphoroxychlorid
enthielt, wurde 12 Stunden refluxiert und dann destilliert (der Siedepunkt
beträgt
36°C bei
0,5 mmHg). Das Dimethylaminodichlorthiophosphat (X ist -N-(CH3)2 und Z ist Schwefel),
welches oben verwendet wurde, wurde wie folgt hergestellt: Eine
Suspension, die 0,1 Mol Dimethylaminhydrochlorid in 0,2 Mol Thiophosphoryl
enthielt, wurde 18 Stunden lang refluxiert und dann destilliert (Siedepunkt:
85°C bei
15 mmHg).
-
Eine
alternative Vorgehensweise der Aktivierung und Kopplung beinhaltet
das Auflösen
von 1 mMol 5'-Hydroxyl-Untereinheit,
basengeschützt
und trityliert auf dem Morpholino-Stickstoff (Struktur 4 von 5),
in 20 ml Dichlormethan. Zu dieser Lösung wurden 4 mMol N,N-Diethylanilin und
1 mMol 4-Methoxypyridin-N-oxid gegeben. Nach der Auflösung wurden
2 mMol Dimethylaminodichlorphosphat, für Z = O (oder Dimethylaminodichlorthiophosphat,
für Z =
S), hinzugesetzt. Nach 2 Stunden wurde das Produkt (Struktur 2 von 8,
in der X Dimethylamin ist) durch Chromatographie auf Silikagel unter
Entwicklung mit 10% Aceton/90% Chloroform isoliert. 1 mMol dieser
aktivierten Untereinheit kann direkt an den Morpholino-Stickstoff einer
zweiten Untereinheit (Struktur 3) durch Mischen von diesen in 1,5
mMol N,N- Diisopropylaminoethylisobutyrat
(DIPAEIB) enthaltendem Dichlormethan geknüpft werden, wodurch man das
Dimer erhielt, welches als Struktur 4 gezeigt ist (in der X -N-(CH3)2 ist).
-
Beispiel 6
-
Zusammenbau in der Lösungsphase
eines einfachen Prototyps von Morpholinopolymer mit struktureller
Bestätigung,
Entschützung,
Reinigung und Bestimmung seiner Bindung an eine Ziel-RNA-Sequenz
-
Dieses
Beispiel beschreibt die Herstellung, strukturelle Bestätigung und
Bestimmung der Ziel-Bindungsaffinität eines
einfachen Phosphordiamidat-verknüpften
Morpholinopolymeren.
-
Ein
Morpholinohexamer, bei dem alle Pi-Reste Cytosine sind, wird aus
dem in Beispiel 5D hergestellten Dimer zusammengebaut. Ein Drittel
dieser Dimer-Herstellung ist mit Trifluorethanol (TFE), enthaltend
2% Essigsäure,
detrityliert; das TFE wird dann unter reduziertem Druck entfernt.
Der Rückstand
wird mit Ether gewaschen, um jedwede restliche Essigsäure zu entfernen.
Die verbliebenen zwei Drittel der Dimer-Herstellung werden aktiviert
(wie in Beispiel 5D). Die Hälfte
des aktivierten Dimeren wird mit detrityliertem Dimer umgesetzt,
um ein Tetramer-Produkt zu erhalten, welches durch Silikagel-Chromatographie
unter Entwicklung mit 6% Methanol/94% Chloroform gereinigt wird.
Das Tetramer wird detrityliert und mit dem verbliebenen aktiviertem
Dimer umgesetzt, um ein Hexamer-Produkt zu erhalten, welches mittels
Silikagel-Chromatographie unter Entwicklung mit 10% Methanl/90%
Chloroform gereinigt wird.
-
Dieses
Phoshordiamidat-verknüpfte,
basengeschützte
5'-OH-Hexamer mit
einem Trityl-Rest auf dem Morpholino-Stickstoff wird als pd(mC)6-Trityl bezeichnet. Das Fast-Atom-Bombardment-Massenspektrum
mit negativen Ionen (3-Nitrobenzylalkohol-Matrix) zeigt: M – 1 = 2667,9
(100).
-
Dieses
pd(mC)6-Tritylpolymer wird als nächstes wie
oben detrityliert, gefolgt von einer Basenentschützung.
-
Wenn
es erwünscht
ist, eine Solubilisierungsgruppe an das Morpholinopolymer hinzuzufügen, kann dieses
bequem wie folgt durchgeführt
werden. Der N-terminale Morpholino-Stickstoff wird unter Verwendung von
2% Essigsäure
in Trifluorethanol detrityliert. Polyethylenglykol 1000 (von Polysciences
Inc., Warrington, Pennsylvania, USA) wird gründlich durch Auflösen in trockenem
DMF getrocknet und dann wird das Lösungsmittel unter Vakuum abgedampft.
Der Feststoff wird in einem minimalen Volumen von reinem trockenem
DMF und 0,5 Mol- Äquivalenten
(bezogen auf PEG 1000) von Bis(p-nitrophenyl)carbonat erneut suspendiert,
und 1 Mol-Äquivalent
TEA wird hinzugesetzt. Die Präparation
wird verschlossen und über
Nacht bei 30°C
inkubiert, wodurch man p-Nitrophenylcarbonat-aktiviertes PEG 1000
erhielt.
-
Das
Morpholinopolymer mit voller Länge,
welches detrityliert worden war, wurde zu einem beträchtlichen
molaren Überschuss
(im allgemeinen 10- bis 20-fach) an aktiviertem PEG 1000 hinzugesetzt
und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die gesamte Herstellung
wird dann mit konzentriertem Ammoniumhydroxid über Nacht bei 30°C behandelt.
Ammoniak wird dann unter reduziertem Druck entfernt. Eine Reinigung
wird durch Kationen-Austausch-Chromatographie, gefolgt von einem
Entsalzen auf einer Säule
von Polypropylen, gewaschen mit Wasser und dann eluiert mit Methanol,
erreicht.
-
Dieses
gereinigte schwanzförmige
(tailed) Hexamer pd(mC)6-PEG1000 zeigt ein
Absorptionsmaximum bei 267,1 nm in neutraler wässeriger Lösung, mit einer berechneten
molaren Extinktion von 42.800. In einer wässerigen Lösung bei einem pH-Wert von
1 zeigt das gleiche Material ein Absorptionsmaximum bei 275,7 nm,
mit einer berechneten molaren Extinktion von 77.100.
-
Um
die Ziel-Bindungsaffinität
des pd(mC)6-PEG 1000-Polymeren zu bestimmen,
werden 1 mg PolyG RNA (gekauft von Sigma Chem Co.) in entionisiertem
Wasser gelöst,
und 4 Volumina DMSO (spektrophotometrische Güteklasse von Aldrich Chem.
Co.) werden hinzugesetzt (Stammlösung
A). Das tailed Morpholinohexamer, pd(mC)6-PEG1000,
wird in DMSO spektrometrischer Güteklasse
(Stammlösung
B) gelöst.
Phosphatpuffer wird hergestellt, indem der pH-Wert von 0,05 N NaOH
auf 7,4 unter Verwendung von Phosphorsäure eingestellt wurde (Puffer
C).
-
Die
Stammlösungen
A und B werden bezüglich
ihrer tatsächlichen
Konzentration an Polymer mittels UV bestimmt; die Extinktion der
Stammlösung
A wird in 0,1 N NaOH gemessen, und die Stammlösung B wird in 0,1 N HCl gemessen.
Die Messungen dieser pH-Extremen minimieren die Basenstapelbildung
und andere Polymer-Wechselwirkungen, was zu Extinktionswerten führen kann,
welche nicht proportional zu den Monomerkomponenten sind. Die Stammlösungen A
und B werden mit Puffer C verdünnt,
wodurch man die Lösungen
mit einer Endkonzentration von 10 Mikromolar bezüglich Polymer erhielt. Die
erforderlichen Verdünnungen wurden
berechnet unter Verwendung von molaren Extinktionen von 65.000 für die Lösung A,
Poly(G), und 77.100 für
die Lösung
B, pd(mC)6-PEG1000.
-
Die
Bestimmung der Ziel-Bindungsaffinität wird in einem Spektrophotometer
mit einem Doppel-Strahl-Scanning und einem temperaturregulierten
Zellgehäuse
durchgeführt,
welches zwei Zellen im Referenzstrahl und zwei im Probenstrahl aufnehmen
kann.
-
Unter
Verwendung von vier eingepassten Quarzküvetten wird eine mit 0,5 ml
Poly(G), 60 Mikromolar in Bezug auf das G-Moomer und 0,5 ml Puffer
C befüllt,
und eine zweite wird mit 0,5 ml an 10 Mikromolaren pd(mC)6-PEG1000 und 0,5 ml Puffer C befüllt. Diese
zwei Küvetten
werden in den Referenzstrahl des temperaturregulierten Zellgehäuses gestellt.
Als nächstes
wird eine dritte Küvette
mit 1 ml Puffer C befüllt,
und eine vierte wird mit 0,5 ml Poly(G), 60 Mikromolar in Bezug
auf G-Monomer, und 0,5 ml 10 Mikromolar pd(mC)6-PEG1000
befüllt.
Diese zwei Küvetten
werden in den Probenstrahl des Zellgehäuses gestellt. Das Zellgehäuse wird
dann bei 50°C
erhitzt und langsam auf 14°C
abkühlen
gelassen, um eine vollständige
Paarung zwischen dem Polymer und seinem Ziel-Polynucleotid in der
vierten Küvette
sicherzustellen. Es wird dann Abtastung zwischen 320 nm und 240
nm vorgenommen, welche eine beträchtliche
Absorptionsdifferenz aufgrund einer hypochromischen Verschiebung
in der Polymer-Ziel-Mischung, zentriert um 273 nm, zeigt. Die Temperatur
des Zellhalters wird dann in Steigerungen von 2° auf 72°C erhöht, wobei Abtastungen nach
Erhöhung
von jeweils 2° vorgenommen
wurden.
-
Eine
Auftragung des Extinktionsunterschieds als eine Funktion der Temperatur
für den
Morpholinopolymer/RNA-Komplex ist in 9 gezeigt.
Die Schmelztemperatur Tm, bei der der Komplex zur Hälfte geschmolzen
war, liegt bei 51,5°C
für dieses
Morpholinopolymer/RNA.
-
Beispiel 7
-
Herstellung in der Lösungsphase
eines Phosphordiamidat-verknüpften
Oligomeren der Sequenz 5'-CGCCA
-
Dieses
Beispiel beschreibt den Zusammenbau eines kurzen Oligomeren, das
ein Phosphordiamidat-verknüpftes
Grundgerüst
enthält
(Struktur von 4, in der X N(CH3)2 ist, Y Sauerstoff ist und Z Sauerstoff ist.
Dieses Zusammenbauverfahren in Lösung
ist für
die Synthese von kurzen Oligomeren im großen Maßstab verwendbar, die für den anschließenden Zusammenbau
zu längeren
Oligomeren, wie in den Beispielen 8 und 9, geeignet sind.
-
A. Herstellung des Monomers
zur Verwendung am 5'-Ende
des Blocks
-
Eine
Morpholino-C-Untereinheit, enthaltend einen Tritylrest am Morpholino-Ring-Stickstoff
und aufweisend ein Methylamin auf dem 5'-Methylen (hergestellt wie in Beispiel
4), wird mit N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyloxy)succinimid (FMOC)
von Aldrich Chem. Co., Milwaukee, Wisconsin, USA, umgesetzt und
durch Silica-Gelchromatographie gereinigt.
-
B. Detritylierung
-
In
einen Trenntrichter gibt man 1 mMol der FMOC-derivatisierten C-Untereinheit,
hergestellt im obenstehenden Teil A, 18 ml Dichlormethan, 2 ml Trifluorethanol
und 0,4 g Caynessigsäure.
Nach 10 Minuten wird diese Lösung
mit wäßrigem NaHCO3 geteilt. Die organische Phase wird durch
Rotationsverdampfung entfernt. Zum verbleibenden Material werden
20 ml Acetonitril zugesetzt, und das Acetonitril wird durch Rotationsverdampfen
bis zur Trockenheit entfernt. Das verbleibende Material wird 1 Stunde
lang unter Vakuum getrocknet.
-
C. Aktivierung von anderen
Monomeren
-
5'-OH-Morpholino-Untereinheiten
von A, C und G, trityliert auf dem Morpholino-Ring-Stickstoff, werden wie
in Beispiel 2 hergestellt. Die A-, C- und G-Untereinheiten werden
durch Umwandlung in die Monochlorphosphoramidat-Form aktiviert,
wie in Beispiel 9D, aktiviert.
-
D. Erste Kopplung
-
Die
detritylierte FMOC-derivatisierte C-Untereinheit aus dem obenstehenden
Teil B wird in Kopplungslösung
(4 ml Dichlormethan, 2 ml Tetramethylensulfon und 0,3 ml DIPAEIB
(hergestellt wie in Beispiel 5)) suspendiert. Zu dieser Lösung wird
1 mMol der aktivierten G-Untereinheit,
hergestellt wie im obenstehenden Teil C, zugesetzt. Nach 30 Minuten
bei Raumtemperatur wird das Dichlormethan unter verringertem Druck
entfernt, und das Produkt wird durch Zusetzen von Wasser gefällt. Das
5'-FMOC-CG-Trityl-Dimer
wird durch Chromatographie auf Silica-Gel, entwickelt mit 5 % Methanol/95
% Chloroform, gereinigt.
-
E. Anschließende Kopplungen
-
Das
FMOC-CG-Tritylprodukt wird wie im obenstehenden Teil B detrityliert
und mit 1 mMol aktivierter C-Untereinheit aus dem obenstehenden
Teil C gekoppelt. Dieser Kopplungszyklus wird wiederholt, um die
verbleibenden C- und A-Untereinheiten anzufügen, wodurch man den gewünschten
Block: 5'-FMOC-CGCCA-Trityl
erhält.
Mit Zunahme der Länge
des Polymeren erfordert der Reinigungsschritt eine zunehmende Konzentration
an Methanol in der Silicagel-Chromatographie-Reinigung
des wachsenden Blocks.
-
F. Strukturbestätigung
-
Die
Struktur dieses Pentamerblocks wird am einfachsten durch NMR und
Massenspektroskopie durch Fastatom-Bombardment mit negativen Ionen
bestätigt.
In der Regel ist die vorherrschende Spezies in dem Massenspektrum
das Molekülion.
-
Beispiel 8
-
Lösungsphasen-Blockzusammenbau
eines Morpholino-Polymeren, gerichtet gegen die Primer-Bindungsstelle von
HIV-I
-
Dieses
Beispiel beschreibt die Verwendung von Oligomerblöcken, hergestellt
wie in Beispiel 7, zum Lösungsphasen-Zusammenbau
eines Morpholino-Polymeren, welches Phosphordiamidat-Zwischen-Untereinheit-Bindungen
enthält.
Die Verwendung von kurzen Oligomerblöcken anstelle von Monomeren
vereinfacht im großem
Maße die
Trennung des Endproduktes von Fehlsequenzen. Das in diesem Beispiel
synthetisierte Morpholino-Polymer besitzt eine Basensequenz, die
komplementär
zur Primerbindungsstelle von HIV-I (Myers et al.) ist.
-
A. Synthese von kurzen
Oligomerblöcken
-
Die
folgenden Oligomere werden wie im Beispiel 7 synthetisiert: 5'-FMOC-GUU-Trityl
(Block 1); 5'-FMOC-CGGG-Trityl
(Block 2); 5'-FMOC-CGCCA-Trityl
(Block 3); 5'-FMOC-CUGC-Trityl (Block 4).
-
B. Abspaltung des FMOC-Restes
-
1,1
Millimol von Block 4 wird in 20 ml DMF suspendiert, und 0,4 ml DBU
(1,8-Diazabicyclo[5.4.0.]undec-7-en) werden zugesetzt. Nach 20 Minuten
werden 200 ml Ether zugegeben, die Lösung wird gut gerührt und
filtriert. Das Filtrat wird in 20 ml Dichlormethan resuspendiert
und in vier 30 ml große
Zentrifugenröhrchen verteilt,
wonach man in jedes von diesen 25 ml Ether zusetzt, zur Vermischung
gut schüttelt
und diese zentrifugiert. Die Überstände werden
verworfen, und die Pellets unter verringertem Druck getrocknet.
-
C. Detritylierung und
Aktivierung
-
Als
nächstes
wird 1 mMol von Block 3, wie aus dem Beispiel 7, Teil B, detrityliert.
Nach Entfernen des Lösungsmittels
unter verringertem Druck wird das verbleibende Material in 20 ml
Dichlormethan suspendiert, gefolgt von Zugabe von 1,5 ml DIPAEIB
(hergestellt wie in Beispiel 5). Unter raschem Rühren werden 0,5 ml Ethyldichlorphosphat
zugesetzt. Nach 5 Minu ten wird diese Lösung in vier 30 ml große Zentrifugenröhrchen aufgeteilt.
Jedes Röhrchen
wird mit Ether gefüllt,
gründlich
geschüttelt
und zentrifugiert. Die Pellets werden in einem minimalen Volumen
Dichlormethan resuspendiert, gefolgt von der Zugabe von Ether. Die
Röhrchen
werden dann geschüttelt
und zentrifugiert. Dieses Waschvorgehen wird noch einmal wiederholt.
Das Pellet wird in Kopplungslösung
(10 ml Dichlormethan, 5 ml Tetramethylensulfon und 0,3 ml DIPAEIB
(hergestellt wie im Beispiel 5)) suspendiert.
-
D. Kopplung
-
Die
Lösung
des aktivierten Blocks 3 wird zum Block 4 zugegeben, von dem die
FMOC-Gruppe abgespalten
worden ist. Nach einer Stunde werden 0,5 ml Essigsäureanhydrid
zugesetzt, und die Lösung
wird 5 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Dichlormethan
wird unter verringertem Druck entfernt. Um das Produkt, 5'-FMOC-CGCCACUGC-Trityl, zu fällen, wird
Wasser zugesetzt. Nach Trocknen des Feststoffs unter Vakuum, um
alles restliche Essigsäureanhydrid
gründlich
zu entfernen, wird dieser in Dichlormethan resuspendiert. Dann wird
Ether zugesetzt, um das Produkt zu fällen. Das Produkt wird noch
einmal in Dichlormethan resuspendiert und erneut mit Ether gefällt.
-
Die
FMOC-Einheit wird von diesem 9-mer-Produkt entfernt, wie im obenstehenden
Teil B. Der Block 2 wird detrityliert und aktiviert, wie im obenstehenden
Teil C. Diese zwei Komponenten werden gekoppelt, wie obenstehend
beschrieben, wodurch man das 13-mer erhält: 5'-FMOC-CGGGCGCCACUGC-Trityl.
-
Der
FMOC-Rest wird von diesem 13-mer-Produkt abgespalten, wie im obenstehenden
Teil B. Der Block 1 wird detrityliert und aktiviert, wie im obenstehenden
Teil C. Diese zwei Komponenten werden gekoppelt, wie obenstehend
beschrieben, wodurch man das 16-mer erhält: 5'-FMOC-GUUCGGGCGCCACUGC-Trityl.
-
E. Entschützen
-
Die
FMOC- und Tritylreste werden entfernt, wie obenstehend, und das
Produkt wird in 20 ml DMF suspendiert, und 20 ml Ammoniumhydroxid
werden zugesetzt. Die Präparation
wird verschlossen und 18 Stunden lang bei 30°C inkubiert. Danach wird das
Lösungsmittel
durch Rotationsverdampfen entfernt, wodruch man eine Roh-Präparation
des 16-mers erhält:
5'-GUUCGGGCGCCACUGC.
-
F. Reinigung
-
Die
16-mer-Präparation
wird, bei einer Konzentration von 2 mg/ml in 0,05 N wäßrigem Methylamin, das
mit HCl auf pH 10,5 eingestellt ist (Lösungsmittel A), suspendiert.
Für die
Chromatographie zu verwendendes Wasser wird unter einem Absaugevakuum
entgast, und Methylamin wird zugesetzt, um eine Methylamin-Endkonzentration
von 0,05 N zu ergeben. Zu dieser Lösung wird HCl gegeben, um den
pH auf 10,5 einzustellen. Eine entsprechende Lösung von pH 10,5 wird zu 1
N in KCl hergestellt (Lösungmittel
B). Lösungsmittel
A wird 1:1, bezogen auf Volumen, mit Acetonitril oder Methanol von
chromatographischer Güteklasse vermischt,
wodurch man das Lösungsmittel
C erhält.
-
Bis
zu 100 mg des Polymeren werden in 50 ml Lösungsmittel A auf eine Chromatographiesäule (5 cm Durchmesser
und 15 cm Länge)
geladen, welche mit dem Anionenaustauscher-Träger Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia)
gepackt ist. Die Säule
wird gründlich
mit Lösungsmittel
A gewaschen und mit einem linearen Gradient, welcher von 100 % Lösungsmittel
A bis zu 100 % Lösungsmittel
B reicht, über
30 Minuten hinweg unter Verwendung einer Fließgeschwindigkeit von etwa 30
ml/Minute eluiert. Das Elutionsmittel wird bei 254 nm überprüft. Das
16-mer dieses Beispiels eluierte festgestelltermaßen bei
etwa 0,35 N KCl. Das gewünschte Bindungspolymer
ist im allgemeinen der letzte und der größte Peak, welcher aus der Säule eluiert.
Wenn das Polymer durch Block-Zusammenbauen hergestellt wird, werden
oft Grundlinien-Trennungen
erzielt. Wenn die Peak-Formen unsymmetrisch sind, besteht ein Problem
im allgemeinen eher in der Unlöslichkeit
des Bindungspolymeren denn als in einem Kapazitätsmangel der chromatographischen
Packung. Ein derartiges Problem kann oft gelöst werden durch Verringern
der in einem gegebenen Lauf geladenen Menge an Bindungspolymer.
Wenn die Peaks symmetrisch sind, aber eine Grundlinien-Trennung
nicht erzielt wird, kann eine Verbesserung üblicherweise durch Eluieren
unter Verwendung eines flacheren Gradienten erhalten werden.
-
Das
Elutionsmittel, welches das Polymer enthält, wird ferner durch Laden
auf eine Säule
von äquivalenter
Größe, gepackt
mit 35-Mikrometer-Polypropylen von chromatographischer Güteklasse
(Kat.-Nr. 4342 von Polysciences, Inc.), gereinigt und entsalzt.
Die Säule
wird gründlich
mit Lösungsmittel
A gewaschen. Wenn eine Grundlinien-Trennung in der vorausgehenden
Kationenaustausch-Chromatographie erzielt wurde, dann wird reines
Produkt durch Eluieren mit dem Lösungsmittel
C erhalten. Wenn jedoch eine Grundlinien-Trennung nicht erzielt
wurde, wird das Produkt mit einem linearen Gradient eluiert, der
von 100 % Lösungsmittel
A bis zu 100 % Lösungsmittel
C reicht. Es wurde festgestellt, daß das 16-mer in diesem Beispiel
eluiert, wenn sich die Konzentration von Acetonitril auf etwa 25
Vol.-% belief.
-
G. Sequenz-Bestätigung
-
Eine
Massenspektrum-Analyse des Vollängenpolymers
im vollständig
geschützten
Zustand, wie früher
beschrieben, kann dazu dienen, sowohl die Polymerlänge als
auch die Basenzusammensetzung zu bestätigen, aber sie liefert keine
Information über
die Untereinheit-Sequenz. Ein Verfahren zum Erhalten von Sequenzinformation
erfolgt aus den Fragmentierungs-Mustern von Desoxyribonukleinsäuren und
Carbamat-verknüpften
Desoxyribonukleiosid-abgeleiteten Polymeren (Griffin et al.). Allerdings
sind viele Morpholino-basierende Polymere der vorliegenden Erfindung
im vollständig
geschützten
Zustand resistent gegen Fragmentierung und ergeben vorwiegend das
Molekülion
mit nur minimalen Fragmenten.
-
Ein
alternatives Verfahren zur Bestätigung
der Sequenz eines Morpholino-basierenden Polymeren besteht darin,
einen kleinen Teil des wachsenden Polymeren nach Kopplung jedes
Oligomerblockes zu entnehmen und eine Massenspektrum-Analyse anzuwenden,
um die Verlängerung
des Polymeren zu verfolgen. Dieses Verfahren ist anwendbar, außer in den
seltenen Fällen,
in welchen zwei in der Synthese verwendete Blöcke zufälligerweise exakt die gleiche
Masse besitzen.
-
Ein
bevorzugtes, aber indirektes, Verfahren, um bei der Bestätigung der
Richtigkeit der Polymer-Untereinheitsequenz zu helfen, besteht darin,
das Morpholino-Polymer mit seiner komplementären DNA (deren Sequenz durch
etablierte Verfahren bestätigt
werden kann) und mit DNA-Sequenzen, welche resultiert haben könnten, wenn
die Blöcke
in der falschen Reihenfolge zusammengebaut wären, zu paaren. Die Paarung
zwischen dem Polymer und der DNA kann durch Prüfen hinsichtlich einer hypochromen
Verschiebung im Wellenlängenbereich
von 240 bis 290 nm ausgewertet werden (untersucht wie im Beispiel
6). Eine derartige Verschiebung findet nur zwischen dem Polymer
und seiner komplementären
Sequenz statt. Der Polymer/DNA-Doppelstrang kann auch von jedwedem
teilweise fehlgepaartem Doppelstrang durch langsames Erhöhen der
Temperatur während Überprüfung der
Extinktion im Bereich von 240 nm bis 290 nm unterschieden werden.
Der perfekte Doppelstrang wird eine Schmelztemperatur (entsprechend
einer 50%igen Reduktion in der Hypochromie) von im allgemeinen 10
Grad oder mehr überhalb
derjenigen von irgendeinem fehlgepaarten Doppelstrang aufweisen.
-
H. Überprüfen der Zielbindungs-Affinität
-
Das
16-mer dieses Beispiels, bei Paarung mit seiner komplementären DNA,
bindet festgestelltermaßen
an DNA, wenn die Stränge
antiparallel sind, aber nicht, wenn sie parallel sind (wie nachstehend
veranschaulicht).
-
-
Es
wurde festgestellt, daß das
antiparallele, gebundene Strang-Molekül eine Tm (bestimmt wie beschrieben
im Beispiel 6) von 63°C
aufweist, wenn jeder Strang bei einer Konzentration von 3 Mikromolar
vorhanden war.
-
I. Überprüfung der biologischen Aktivität
-
Das
16-mer dieses Beispiels wurde hinsichtlich seiner Fähigkeit
getestet, die Synthese des viralen P24-Proteins in humanen Zellen,
welche mit HIV-I – dem
AIDS-Virus – infiziert
waren, zu inhibieren. Vorläufige Ergebnisse
zeigen, daß wenn
das 16-mer-Polymer dieses Beispiels, welches komplementär zur Primerbindungsstelle
von HIV-I ist, bei einer Konzentration von 6 Mikromolar zu HIV-I-infizierten
Zellen zugesetzt wird, das Polymer eine 35%ige Verringerung der
Synthese des viralen P24-Proteins verursacht. Ferner verursacht das
Polymer bei Konzentrationen von 6 und 19 Mikromolar keine nachweisbare
Zelltoxizität
in nicht-infizierten Zellen.
-
Beispiel 9
-
Festphasen-Blockzusammenbau
von Morpholino-Polymer, gerichtet gegen die Primerbindungsstelle
von HIV-I
-
Dieses
Beispiel beschreibt die Verwendung von Oligomerblöcken, hergestellt
wie in Beispiel 7, für
den Festphasenzusammenbau eines Morpholino-Polymeren, enthaltend
Phosphordiamidat-Zwischen-Untereinheit-Bindungen.
Der Festphasenzusammenbau sieht ein schnelles Verfahren zum Zusammenbau
längerer Bindungspolymere
vor. Die Verwendung von kurzen Oligomerblöcken anstelle von Monomeren
vereinfacht die Trennung des Endproduktes von Fehlsequenzen in großem Maße.
-
A. Anheftung eines spaltbaren
Linkers an einen festen Träger
-
Ein
mMol Bis[2-(succinimidooxycarbonyloxy)ethyl]sulfon (Pierce Chemical
Co. of Rockford, Illinois, USA) wird in 10 ml DMF gelöst und zu
3 g eines geeigneten festen Trägers
mit primären
Aminfunktionen zugesetzt: z. B. Glas, Aminopropyl, Katalog-Nr. G4643
von Sigma Chem. Co., St. Louis, MO, USA – 500 Angström Porengröße, 200-400
mesh, Amingehalt von 81 Mikromol/g. Nach 2 Stunden wird die Aufschlämmung von
Glasperlen in eine Säule
gegeben (vorzugsweise etwa 1,5 cm Durchmesser), die Säule gründlich mit
Dichlormethan gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Dieser an den
Glasträger
gebundene Linker ist gegenüber
den sauren Bedingungen, welche für
Detritylierungen angewandt werden, stabil, kann aber leicht über einen β-Eliminierungs-Mechanismen
unter Verwendung einer starken nicht-nukleophilen Base, wie 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en
(DBU), abgespalten werden.
-
B. Synthese von kurzen
Oligomerblöcken
-
Die
folgenden Oligomere werden wie im Beispiel 7 synthetisiert: 5'-FMOC-GUU-Trityl
(Block 1); 5'-FMOC-CGGG-Trityl
(Block 2); 5'-FMOC-CGCCA-Trityl
(Block 3); 5'-FMOC-CUGC-Trityl (Block 4).
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C. Addition des ersten
Blocks an den Träger-gebundenen
Linker
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Ein
Millimol von Block 1-Oligomer wird in 20 ml DMF suspendiert, und
0,4 ml DBU (1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en)
werden zugegeben. Nach 5 Minuten werden 200 ml Ether zugegeben,
die Suspension wird gut gerührt
und filtriert. Das Filtrat wird in 20 ml Dichlormethan resuspendiert
und in vier 30 ml große
Zentrifugen-Röhrchen
verteilt. In jedes Röhrchen
werden 25 ml Ether zugegeben, gut geschüttelt, und zentrifugiert. Die Überstande
werden verworfen und die Pellets werden unter vermindertem Druck
getrocknet. Dieses Oligomer wird in 12 ml DMF resuspendiert und
auf die Säule
von festem Synthese-Träger,
hergestellt im obenstehenden Teil A, gegeben. Das Bett aus Glasperlen
wird periodisch bewegt, um gründlichen
Zugang des Oligomerblocks zu allen internen Oberflächen der
Perlen zu gewähren.
Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wird die Säule gründlich mit Dichlormethan gewaschen.
Der ungebundene Oligomerblock, vorhanden in der Waschung, kann zurückgewonnen
und wiederverwendet werden.
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D. Detritylierung und
Aktivierung
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Der
Träger-gebundene
Oligomerblock wird durch langsames Hindurchleiten einer Lösung, welche
aus 88 ml Dichlormethan, 10 ml Trifluorethanol und 2 g Cyanessigsäure aufgebaut
ist, durch die Säule
detrityliert. Die Säule
wird mit 40 ml Dichlormethan gewaschen, gefolgt von 40 ml 1 % N-Ethylmorpholin
in Dichlormethan. Die Säule
wird dann mit 50 ml Dichlormethan gewaschen. Das Ende des gebundenen
Oligomer wird durch langsames Hindurchleiten von 100 ml Dichlormethan,
enthaltend 5 ml DIPAEIB (hergestellt wie in Beispiel 5) und 3 ml
Ethyldichlorphosphat, durch die Säule aktiviert. Die Säule wird
dann mit 100 ml Chloroform gewaschen.
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E. Addition von nachfolgenden
Blöcken
an trägergebundenes
Oligomer
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Ein
Millimol von Oligomerblock 2 wird in 20 ml DMF suspendiert, und
0,4 ml DBU (1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en)
werden zu der Suspension zugegeben. Nach 5 Minuten werden 200 ml
Ether zugegeben, die Suspension wird gut gerührt und filtriert. Das Filtrat
wird in 20 ml Dichlormethan resuspendiert und in vier 30 ml große Zentrifugen-Röhrchen verteilt.
In jedes Röhrchen
werden 25 ml Ether zugegeben. Die Röhrchen werden gut geschüttelt und
zentrifugiert. Die Überstande
werden verworfen und die Pellets werden unter vermindertem Druck
getrocknet. Das Oligomer wird in Kopplungslösung (8 ml Dichlormethan, 4
ml Tetramethylensulfon und 0,5 ml DIPAEIB (hergestellt wie in Beispiel
5)) resuspendiert. Diese Lösung
wird langsam in das Bett der Synthesesäule eingeführt, bis nur 1 bis 2 ml des
Volumens über
dem Säulenbett
verbleiben. Der Träger
wird periodisch bewegt, um gründlichen
Zugang der Kopplungslösung
zu allen internen Poren-Oberflächen der
Perlen zu gewähren.
Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wird die Säule gründlich mit Dichlormethan gewaschen.
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Die
Blöcke
3 und 4 werden auf die gleiche Weise, wie obenstehend beschrieben,
angefügt.
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F. Abspaltung vom Träger
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Eine
Lösung
zur Abspaltung des Linkers (bezogen auf Volumen: 6 Teile Diethylmalonat;
12 Teile DBU; 41 Teile Tetramethylensulfon; und 41 Teile Dichlormethan)
wird langsam durch die Säule
laufen gelassen, während
das Elutionsmittel bei 290 nm mittels einer Fließzelle von 1 mm Pfadlänge überwacht
wird. Das Elutionsmittel wird aufgefangen, bis das gesamte Polymer
eluiert ist (im allgemeinen etwa 30 Minuten). Das Dichlormethan
wird unter vermindertem Druck entfernt. Zum verbleibenden Material
wird wäßriges NaH2PO4, ausreichend
zur Neutralisierung des DBU, zugesetzt, und dann wird ein großes Volumen
an Wasser zugegeben, um das Polymer zu fällen. Das feste Produkt wird
gesammelt und getrocknet.
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G. Struktur-Charakterisierung,
Entschützung,
Reinigung und Testen
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Das
vollständig
geschützte
16-mer-Produkt wird entschützt,
gereinigt und analysiert, wie beschrieben im Beispiel 8. Nach Entschützen und
Reinigung zeigt das 16-mer-Polymer dieses Beispiels im wesentlichen die
gleiche Tm mit seiner Ziel-DNA und im wesentlichen die gleiche biologische
Aktivität
wie das 16-mer-Polymer, das wie im Beispiel 8 beschrieben hergestellt
wurde.
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Beispiel 10
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Schrittweise Festphasensynthese
eines Morpholino-Polymeren, gerichtet gegen eine Splice-Verbindungsstelle
in Herpes simplex I
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Dieses
Beispiel beschreibt den schrittweisen Zusammenbau eines Polymeren,
enthaltend ein Phosphoramidat-verknüpftes Grundgerüst (Struktur
von 4, worin X N(CH3)2 ist, Y Sauerstoff ist und Z Sauerstoff ist)
auf einem festen Träger.
Dieses Polymer mit der Sequenz 5'-CGUUCCUCCUGC ist
gegen eine Splice-Verbindungsstelle in dem Virus Herpes simplex
I (Atencio et al.) gerichtet.
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A. Bindung eines spaltbaren
Linkers an einen festen Träger
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Ein
spaltbarer Linker wird an den festen Träger gebunden, wie beschrieben
im Beispiel 9, Teil A.
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B. Kopplung des ersten
Monomeren an den Träger.
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Ein
mMol einer Morpholino-C-Untereinheit, enthaltend eine Tritylgruppe
auf dem Morpholino-Ring-Stickstoff, und mit einem Methylamin auf
dem 5'-Methylen
(hergestellt wie in Beispiel 4), wird in 12 ml DMF suspendiert und
auf eine Säule
gegeben, die als fester Synthese-Träger hergestellt
wurde, wie beschrieben in Beispiel 9, Teil A). Das Bett aus Glassperlen
wird periodisch bewegt, um gründlichen
Zugang der ersten Untereinheit zu allen internen Oberflächen der
Perlen zu gewähren.
Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wird die Säule gründlich mit Dichlormethan gewaschen.
Ungebundene Untereinheiten, welche in der Waschung vorhanden sein
können,
können
zurückgewonnen
und wiederverwendet werden.
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C. Kopplungszyklus
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a. Detritylierung
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Die
Träger-gebundene
Untereinheit wird detrityliert durch langsames Hindurchleiten einer
Lösung, welche
aus 88 ml Dichlormethan, 10 ml Trifluorethanol und 2 g Cyanessigsäure besteht,
durch die Säule.
Die Säule
wird mit 40 ml Dichlormethan, gefolgt von 40 ml 1 % N-Ethylmorpholin in
Dichlormethan, und schließlich mit
100 ml chloroform gewaschen.
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b. Addition einer Untereinheit
an die wachsende Kette
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Ein
mMol Untereinheit (hergestellt wie in Beispiel 2 und aktiviert mit
N,N-Dimethylaminodichlorphosphat, wie beschrieben in Beispiel 5,
Teil D) wird in Kopplungslösung
(8 ml Dichlormethan, 4 ml Tetramethylensulfon und 0,5 ml DIPAEIB
(hergestellt wie in Beispiel 5)) sus pendiert. Diese Lösung wird
langsam in das Bett der Synthesesäule eingeführt, bis nur 1 bis 2 ml des
Volumens über
dem Säulenbett
verbleiben. Der Träger wird
periodisch bewegt, um gründlichen
Zugang der Kopplungslösung
zu allen internen Poren-Oberflächen
der Perlen zu gewähren.
Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wird die Säule gründlich mit Dichlormethan gewaschen.
Jede ungebundene Untereinheit in dieser Waschung kann zurückgewonnen
und wiederverwendet werden.
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c. Kappen-Abdeckung von
nicht umgesetzten Kettenenden
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Fünfzig Milliliter
Dichlormethan, enthaltend 2 ml Essigsäure und 2 ml DIPAEIB (hergestellt
wie in Beispiel 5), werden auf eine Säule gegeben. Die Säule wird
mit 100 ml Methanol, enthaltend 2 ml DIPAEIB, gewaschen, gefolgt
von einer Waschung unter Verwendung von 200 ml Dichlormethan.
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Unter
Anwendung dieses Kopplungs-Zyklus (umfassend die obenstehenden Schritte
a, b und c) werden die Untereinheiten G, U, U, C, C, U, C, C, U,
G und C in dieser Reihenfolge angefügt.
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D. Abspaltung vom Träger
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Das
vervollständigte
Polymer wird vom Träger
abgespalten, wie beschrieben in Beispiel 9.
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E. Struktur-Charakterisierung,
Entschützung,
Reinigung und Testen
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Das
vollständig
geschützte
12-mer-Produkt wird entschützt,
gereinigt und analysiert, wie im Beispiel 8 beschrieben. Nach Entschützen und
Reinigung wurde festgestellt, dass das gegen Herpes gerichtete 12-mer-Polymer,
hergestellt wie oben, eine Tm (bestimmt wie in Beispiel 6 beschrieben)
von 47°C
aufweist, wenn es mit seiner komplementären DNA gepaart wird (die zwei
Stränge
antiparallel): jeder Strang war in einer 2 mikromolaren Konzentration
vorhanden.
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F. Vorläufige Bewertung
der biologischen Aktivität
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Das
12-mer dieses Beispiels wurde hinsichtlich seiner Fähigkeit
getestet, Mäuse
zu schützen,
die von dem Zielvirus, Herpes simplex Virus I (HSV I), infiziert
waren. Mäuse,
die im Auge mit HSV I infiziert waren, zeigten 5 Tage nach der Infektion
ein Überleben
von 65 %. Wenn Herpes-infizierte Mäuse mit einer topischen Salbe
behandelt wurden, welche 0,3 mMolar des in diesem Beispiel beschriebenen
12-mers enthielt, wurde das Überleben
5 Tage nach der Infektion auf 90 % erhöht.